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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ - UFC
FACULDADE DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E
FARMACOLOGIA
CID FREITAS CAVALCANTE
ESTUDO DO EFEITO DA FRAÇÃO NÃO
DIALISÁVEL DO LÁTEX DE Calotropis procera (Ait) R. Br
EM MODELOS EXPERIMENTAIS DE INFLAMAÇÃO, COM
ÊNFASE EM ARTRITE
FORTALEZA
2007
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CID FREITAS CAVALCANTE
ESTUDO DO EFEITO DA FRAÇÃO NÃO
DIALISÁVEL DO LÁTEX DE Calotropis procera (Ait) R. Br
EM MODELOS EXPERIMENTAIS DE INFLAMAÇÃO, COM
ÊNFASE EM ARTRITE
Dissertação submetida à Coordenação do
Programa de Pós-Graduação em
Farmacologia, da Universidade Federal do
Ceará, como requisito parcial para obtenção
do grau de Mestre em Farmacologia.
Orientador: Prof. Dr. Marcus Raimundo Vale
FORTALEZA
2007
C364e Cavalcante, Cid Freitas
Estudo do efeito da fração não dialisável do látex
de Calotropis procera (Ait) R. Br. em modelos experi-
mentais de inflamação / Cid Freitas Cavalcante;
orientador: Marcus Raimundo Vale . – Fortaleza,
2007.
89f. il.
Dissertação – Universidade Federal do Ceará.
Faculdade de Medicina, 2007.
1. Artrite 2. Látex 3. Calotropis 4. Zimosan 5.
Peritonite I. Vale, Marcus Raimundo (Orient.) II. Título
CDD: 616.722
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CID FREITAS CAVALCANTE
ESTUDO DO EFEITO DA FRAÇÃO NÃO
DIALISÁVEL DO LÁTEX DE Calotropis procera (Ait) R. Br
EM MODELOS EXPERIMENTAIS DE INFLAMAÇÃO, COM
ÊNFASE EM ARTRITE
Dissertação submetida à Coordenação do
Programa de Pós-Graduação em
Farmacologia, da Universidade Federal do
Ceará, como requisito parcial para obtenção
do grau de Mestre em Farmacologia.
Aprovada em 23/07/07
BANCA EXAMINADORA
____________________________________
Prof. Dr. Marcus Raimundo Vale (orientador)
Universidade Federal do Ceará - UFC
____________________________________
Prof. Dr. Carlos Maurício de Castro Costa
Universidade Federal do Ceará - UFC
____________________________________
Prof. Dr. Marcio Viana Ramos
Universidade Federal do Ceará - UFC
.
A Deus, minha família,
amigos e todos aqueles
que acreditaram.
AGRADECIMENTOS
Aos meus pais e meus irmãos, por tudo o que representam na minha vida e pelo
apoio incondicional.
Ao meu orientador, Prof. Marcus Vale, por ter me iniciado na pesquisa científica e me
acompanhado com toda a paciência ao longo desses anos.
À Profa. Nylane Nunes Alencar, exemplo de dedicação à pesquisa e aos seus
estudantes.
À Priscila, pela ajuda incomensurável no sentido de tornar este trabalho realidade.
À Carla, Cibele, Mirela, Cíntia, Márcia, Elmadan, Ítalo e a todos que ajudaram a tocar
este projeto pra frente.
Aos Colegas de pós, Flávio, Jozy, Ingrid, Carol, Michael e Mário por compartilharem
os momentos difíceis dessa caminhada.
À Patrícia, pela amizade e conselhos valiosos.
Aos professores da pós-graduação, pelos conhecimentos transmitidos.
À Profa. Mariana Vale, pela grande colaboração e dedicação nos experimentos e
conhecimentos repassados.
Ao Prof. Ronaldo Ribeiro e o LAFICA, que gentilmente cederam a estrutura física e
boa parte dos equipamentos necessários aos experimentos.
Ao Prof. Márcio Viana e seus colaboradores pelo fornecimento do látex e pela ajuda
científica.
À Profa. Gerly Anne, pela cordial cooperação em parte importante do trabalho.
Ao Ivan do Departamento de Morfologia pelos cortes histológicos.
A todos os funcionários do Departamento de Fisiologia e Farmacologia que direta ou
indiretamente participaram dessa jornada.
7
RESUMO
Estudo do efeito da fração não dialisável do látex de Calotropis procera (Ait) R.
Br em modelos experimentais de inflamação, com ênfase em artrite. CID
FREITAS CAVALCANTE. Orientador: Marcus Raimundo Vale. Dissertação de
Mestrado. Programa de Pós-Graduação em Farmacologia da Faculdade de Medicina
da Universidade Federal do Ceará. Departamento de Fisiologia e Farmacologia,
UFC, 2007.
Tendo em vista a prevalência de doenças inflamatórias reumáticas tais como a artrite
reumatóide em nosso meio e a necessidade constante de novas terapias alternativas
às drogas esteróides e não esteroidais, que apresentam tantos efeitos nocivos em
uso prolongado, decidimos investigar a ação do látex de Calotropis procera em
modelos experimentais de inflamação, com foco na artrite. O látex dessa planta da
família Asclepiadaceae, vastamente encontrada no Nordeste brasileiro, tem efeitos
sabidamente antiinflamatórios em algumas situações, notadamente a sua fração
protéica majoritária, não dialisável (FNDL), menos tóxica e desprovida de borracha. A
fração foi obtida a partir de um protocolo estabelecido por nossos colaboradores, que,
em suma envolve várias etapas de centrifugação e diálise até o produto final
liofilizado. Utilizamos ratos Wistar machos com peso entre 230 e 280g e
camundongos, Balb/c e Swiss, pesando entre 18 e 35g, em grupos de seis indivíduos
nos quais um controle, outro sham em que foi induzido o evento inflamatório (artrite
por Zy - AZy, artrite induzida por antígeno - AIA ou peritonite infecciosa - PI) e o
experimental no qual foi tratado com FNDL. O grupo AZy foi submetido a teste de
incapacitação articular pelo modelo de tempo de suspensão da pata (TSP) e, após
sacrifício, à contagem de células total e diferencial no lavado articular, estudo
histopatológico da articulação, avaliação de permeabilidade vascular, dosagem de
ADA e TNF-α. Os resultados foram expressos em média ± e.p.m. e comparados em
testes estatísticos ANOVA/Bonferroni, admitindo-se P<0.05 para significância. A
FNDL inibiu o TSP na AZy com efeito máximo na dose de 3mg/kg no t = 4h. Houve
também redução significativa da permeabilidade vascular, nos níveis séricos de TNF-
α e de ADA, e melhora no quadro histopatológico. Também reduziu o influxo celular
sinovial na AZy e AIA, sobretudo de neutrófilos. Na PI, inibiu a migração celular e os
níveis de ADA. Dessa forma, os resultados confirmaram o efeito antiinflamatório da
FNDL nestes modelos de artrite e peritonite e sugeriram um possível mecanismo de
ação relacionado a um aumento da adenosina, por conta da redução dos níveis de
ADA, ou por inibição do TNF-α. Por fim procedemos a avaliação da toxicidade da
droga em tratamento crônico, constatando que a dose de 10mg/Kg apresenta bons
efeitos farmacológicos sem alterações significativas nos parâmetros selecionados.
8
ABSTRACT
Study of the effect of the non-dialyzable fraction of Calotropis procera (Ait) R.
Br latex in experimental models of inflammation, with emphasis in arthritis. CID
FREITAS CAVALCANTE. Promoter: Marcus Raimundo Vale. Master of Science
Dissertation. Post-Graduation in Pharmacology of Federal University of Ceará.
Department of Physiology and Pharmacology, UFC, 2007.
The objective of this dissertation was to investigate the effect of the latex from
Calotropis procera in experimental models of inflammation, with special focus on
arthritis. The plant belongs to Asclepiadaceae family and is largely found in Northeast
of Brazil. The plant latex presents clear anti-inflammatory effects, which is kept by its
non-dialyzable protein fraction (NDPF), a less toxic and rubber free fraction. NDPF
was obtained according to a procedure established by our group, which, in short,
involves several steps of centrifugation and dialysis. Male Wistar rats (230 – 280g)
and Balb/c and Swiss male mice (18 – 35g) were organized in groups of 6 animals: a
control group (no treatment), a sham group, in which only the inflammatory event was
induced (arthritis by zymosan – AZy), an antigen-induced arthritis group (AIA), an
infectious peritonitis group (IP) and an experimental group, treated with NDPF. The
AZy group was submitted to an articular incapacitation test to measure the paw
elevation time (PET, in seconds) and, after sacrifice, total and differential cell count in
the intra-articular fluid, histopathological study of the articulation, vascular
permeabilization, ADA and TNF-α assays. The results were expressed in means +
S.E.M. and significative differences were accepted if p<0.05 (ANOVA/Bonferroni).
NDPF inhibited PET in AZy with a maximum effect in the dose of 3mg/kg, at 4h after
inflammation induction. There was also a significative reduction of vascular
permeability, TNF-α and ADA serum levels and an improvement of the
histopathological profile. NDPF also reduced the intra-articular influx of cells in AZy
and AIA, especially of neutrophils. In IP, NDPF inhibited the cellular migration and the
levels of ADA. So, the results confirmed the expected anti-inflammatory effect of
NDPF in arthritis and peritonitis models and suggested a possible mechanism of
action involving either an increase of adenosine concentration due to the reduction of
ADA levels or an inhibition of TNF-α or both events. Finally, the NDPF chronical
toxicity was evaluated confirming that the dose of 10mg/Kg presents well defined
pharmacological effects without significant alterations on the animal parameters. The
characteristics of NDPF open an interesting possibility for alternative therapy to
substitute the toxic effects of steroidal and some non-steroidal drugs, used in
rheumatoid diseases, so prevalent among our population.
9
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 - Aspecto da planta Calotropis procera.
FIGURA 2 - Fotografia do sistema utilizado para o teste de incapacitação articular
em ratos – gentilmente cedido pelo LAFICA – UFC.
FIGURA 3 - Esquema da desaminação da adenosina pela ADA
FIGURA 4- Efeito do tratamento com FNDL sobre o influxo de neutrófilos à cavidade
articular de ratos submetidos à indução da artrite por zymosan (AZy).
FIGURA 5 - Efeito do tratamento com FNDL sobre o tempo de suspensão da pata
(TSP) de ratos submetidos à indução da artrite por zymosan (AZy).
FIGURA 6 - Curso temporal do tratamento com FNDL sobre o tempo de suspensão
da pata (TSP) de ratos submetidos à indução da artrite por zymosan (AZy).
FIGURA 7 - Efeito do tratamento com FNDL sobre a atividade da ADA na cavidade
articular de ratos submetidos à indução da artrite por zymosan (AZy).
FIGURA 8 - Efeito do tratamento com FNDL sobre a permeabilidade vascular em
ratos submetidos à indução de artrite por zymosan (AZy).
FIGURA 9 - Efeito do tratamento com FNDL sobre os níveis de TNF - α na cavidade
articular de ratos submetidos à indução da artrite por zymosan (AZy).
FIGURA 10 - Efeito do tratamento com FNDL sobre o quadro histopatológico da
articulação de ratos submetidos à indução da artrite por zymosan (AZy).
FIGURA 11 - Fotografias mostrando o aspecto da microscopia óptica do tecido
sinovial comparando os grupos tratados com FNDL (10 e 30mg/kg) e o grupo não
tratado (zymosan) (aumento de 40X)
FIGURA 12 - Efeito do tratamento com FNDL sobre o influxo de neutrófilos à
cavidade articular de camundongos submetidos à indução da artrite por antígeno
(mBSA).
FIGURA 13 - Efeito do tratamento via endovenosa com FNDL sobre o influxo de
neutrófilos à cavidade peritoneal de camundongos submetidos à indução de
peritonite infecciosa.
10
FIGURA 14 - Efeito do tratamento via endovenosa com FNDL sobre a atividade da
ADA na cavidade peritoneal de camundongos submetidos à indução de peritonite
infecciosa.
FIGURA 15 - Efeito da aplicação via endovenosa de FNDL por sete dias sobre a
função renal.
FIGURA 16 - Efeito da aplicação via endovenosa de FNDL por sete dias sobre as
transaminases hepáticas.
FIGURA 17 - Efeito da aplicação via endovenosa de FNDL por sete dias sobre o
leucograma.
FIGURA 18 - Efeito da aplicação via endovenosa de FNDL por sete dias sobre o
peso dos órgãos.
11
LISTA DE ABREVIATURAS
% - por cento
< menor
A
1
– receptor de adenosina tipo A
1
A
2A
– receptor de adenosina tipo A
2A
A
2B
– receptor de adenosina tipo A
2B
A
3
– receptor de adenosina tipo A
3
ACF – adjuvante completo de Freund
ADA - adenosina desaminase
ADA1 – adenosina desaminase isoenzima tipo 1
ADA2 – adenosina desaminase isoenzima tipo 2
AE – Azul de Evans
AIA – Artrite induzida por antígeno
AICAR – enzima 5-aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleotide
AIF – adjuvante incompleto de Freund
AMPc - Adenosina Monofosfato Cíclico
APCs – células apresentadoras de antígenos
AR - Artrite Reumatóide
AZy – Artrite induzida por zymosan
C3a – terceiro componente do sistema complemento ativado
C5a – quinto componente do sistema complemento ativado
cm – centímetro (s)
COX - ciclooxigenase
Da – Dalton (s)
DAINES – drogas antiinflamatórias não esteroidais.
DMARD – drogas anti-reumáticas modificadoras da artrite reumatóide
DTH – reação de hipersensibilidade do tipo tardia
e.v.- Via endovenosa
EDTA – ácido etilenodiamino tetracético
epm – erro padrão da média
12
FDL – Fração dialisável do látex de Calotropis procera
FNDL – Fração não dialisável do látex de Calotropis procera
g – grama
h – hora (s)
i.a. - Via Intra-articular
i.p. - Via Intraperitoneal
IA - Incapacitação Articular
IASP – International association for the study of pain
IC - Influxo Celular
IFN- γ - Interferon γ
IL– Interleucina
kDa – kilodalton (s)
kg – kilograma
l – litro (s)
LPS - Lipopolissacarídeo de bactéria
LTB
4
- Leucotrieno B
4
mBSA – albumina bovina sérica metilada
mg – miligrama (s)
MHC – complexo de histocompatibilidade maior
min – minuto (s)
ml – mililitro (s)
mm – milímetro (s)
mM - milimolar
mm
2
– milímetro (s) quadrado (s)
mm
3
– milímetro (s) cúbico (s)
MTX – metotrexate
nm – nanômetro (s)
NO - Óxido Nítrico
o
C – graus Celsius
PAF - Fator de Ativação Plaquetária
PBS – salina fostato tamponada
13
pg – picograma (s)
PI – Peritonite infecciosa por ligadura e punção cecal.
PMNs - Polimorfonucleares
q.s.p. – quantidade suficiente para
RL - Fração da borracha do látex de Calotropis procera
rpm – rotações por minuto
s – segundo (s)
s.c.- Via subcutânea
TGF-β - Fator de Transformação de Crescimento β
Th1 – linfócitos T helper 1
TLR-4 – Toll Like Receptor tipo 4
TNF- α - Fator de Necrose Tumoral α
TSP – tempo de suspensão da pata
U – unidade (s)
UFC – Universidade Federal do Ceará
v/v – volume por volume
x g – quantidade de vezes a força gravitacional da Terra
Zy – Zymosan
µg – micrograma (s)
µl – microlitro (s)
14
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS....................................................................................................9
LISTA DE ABREVIATURAS.......................................................................................11
1. INTRODUÇÃO.......................................................................................................16
1.1. Fração não dialisável do látex de Calotropis procera (FNDL)......................16
1.2. Inflamação.........................................................................................................22
1.3. Artrite reumatóide.............................................................................................28
1.4. Adenosina e adenosina desaminase (ADA)...................................................30
1.5. Modelos experimentais de artrite................................................................... 31
1.6. Peritonite infecciosa .........................................................................................34
2. MATERIAIS E MÉTODOS.....................................................................................35
2.1. Animais ..............................................................................................................35
2.2. Aparelhos e instrumentos laboratoriais .........................................................35
2.3. Soluções, drogas e reagentes.........................................................................36
2.4. Protocolo experimental....................................................................................38
2.4.1. Modelo de artrite induzida por zymosan (AZy)...........................................38
2.4.2. Modelo de artrite induzida por antígeno mBSA (AIA)................................43
2.4.3. Modelo de peritonite infecciosa (PI)............................................................44
2.4.4. Teste de toxicidade da FNDL.......................................................................45
2.5. Análise estatística............................................................................................46
3. RESULTADOS......................................................................................................47
3.1. A FNDL reduz o influxo de neutrófilos na artrite induzida
por Zy em ratos.......................................................................................................47
3.2. A FNDL reduz o tempo de suspensão da pata na artrite induzida
por Zy em ratos.......................................................................................................48
3.3. A FNDL reduz a atividade da ADA na artrite induzida
por Zy em ratos......................................................................................................50
3.4. A FNDL reduz a permeabilidade vascular na artrite induzida
por Zy em ratos.......................................................................................................51
3.5. A FNDL reduz o nível de TNF - α na artrite induzida
por Zy em ratos.......................................................................................................52
15
3.6. A FNDL melhora os escores da avaliação histopatológica
na artrite por Zy em ratos.....................................................................................53
3.7. A FNDL reduz o influxo de neutrófilos na artrite induzida
por antígeno mBSA (AIA) em camundongos pré-imunizados...........................55
3.8. A FNDL inibe a migração de neutrófilos na peritonite
infecciosa em camundongos................................................................................56
3.9. A FNDL reduz a atividade da ADA no lavado peritoneal
na peritonite infecciosa em camundongos..........................................................57
3.10. A FNDL não apresenta parâmetros laboratoriais de
toxicidade na dose de 10 mg/kg...........................................................................58
4. DISCUSSÃO........................................................................................................61
5. CONCLUSÕES....................................................................................................69
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...................................................................70
16
1. INTRODUÇÃO
1.1. Fração não dialisável do látex de Calotropis procera (FNDL)
Látex
Na natureza o sucesso dos vegetais deve-se em grande parte pelos inúmeros
mecanismos de defesa desenvolvidos, compensando a sua imobilidade e falta de um
sistema imune circulatório. Dentre essas sofisticadas e, por vezes, inusitadas
estratégias de proteção destaca-se a defesa mecânica e química contra a invasão de
patógenos e insetos a partir de sistemas de canais que contêm várias secreções, tal
como os laticíferos, resinas e mucilagens (Farrell et al, 1991). No caso de plantas
que produzem látex, este sofre um processo de agregação progressiva que lembra o
processo de coagulação sanguínea, no que concerne ao aspecto físico de
aprisionamento de moléculas em uma malha formada progressivamente. Este
processo é comum ocorrer após a planta sofrer algum dano mecânico, o que leva a
liberação do fluido laticífero, impedindo que a área injuriada seja penetrada por
patógenos. O látex também tem uma ação adesiva que pode imobilizar pequenos
insetos ou mesmo uma lagarta (Moursy, 1997). Entretanto, além deste efeito
mecânico, a composição química do látex parece também funcionar como uma
ferramenta de defesa, neste caso agindo no combate a fungos e a vírus por meio de
suas substâncias constituintes (Pereira et al., 1999). A presença de proteínas
relacionadas à defesa contra patógenos, como glucanases e quitinases (Van Loon &
Van Sttrien, 1999), proteinases (Dubey & Jaganadham, 2002; Abraham & Joshi,
1979; Glazer & Smith, 1971; Sgarbieri et al, 1964) e inibidores de proteinases
(Sritanyarat et al., 2006; Monti et al., 2004) no látex de várias espécies sugere que
essa secreção poderia agir como uma defesa da planta contra o ataque de insetos e
patógenos.
Látex é um termo geralmente usado para descrever um líquido com aspecto
leitoso que é exudado de plantas que sofreram algum dano mecânico. Naqueles já
estudados, em geral, são compostos de um soro, que contém em solução ou
suspensão uma variedade de substâncias e/ou componentes celulares, entre os
17
quais núcleos, mitocôndrias, ribossomos bem como ácidos nucléicos (Lynn &
Clevette-Radford, 1986 b). A capacidade para formar látex é encontrada em plantas
crescidas em diversos habitats e diferentes características morfológicas como ervas,
arbustos e árvores. Cerca de 12.000-35.000 espécies, pertencentes a 900 gêneros
de aproximadamente 12 famílias, maioria dicotiledônea, formam látex. Látex também
pode ser produzido por fungos, como dos gêneros Lactaria e Peziza.
Embora o látex tenha na maioria das vezes um aspecto leitoso, como em
Hevea e Calotropis, ele pode ser amarelo ou laranja, como em plantas da família
Papaveraceae, marrom amarelado, em Cannabis, ou pode ser límpido como em
Morus e Nerium oleander (Metcalfe,1967). O látex é um exudado citoplasmático de
células especializadas, denominadas de laticíferos. Os laticíferos são classificados
como articulados e não articulados. Os articulados consistem de cadeias
longitudinais de muitas células em que as paredes celulares que separam as células
individuais permanecem intactas, enquanto os laticíferos não articulados surgem de
uma simples célula que cresce importunamente dentro dos espaços intracelulares,
eventualmente ramificando-se nos tecidos das plantas de um modo similar as hifas
de um fungo (Rudall, 1987).
Função Biológica dos Laticíferos
Várias funções têm sido atribuídas aos laticíferos. Uma delas é que eles
formam um tecido de secreção, mas a vantagem para a planta de estocar látex ainda
é duvidosa, pois a enorme quantidade de energia envolvida na síntese de borracha
ou de outros componentes do látex não parece ser recuperável. Considerando que o
látex foi encontrado em plantas do semi-árido, foi sugerido que os laticíferos podem
ser uma reserva de água. Porém, nem todas as plantas que contêm látex estão
restritas a regiões secas. Possivelmente, a justificativa mais aceita da presença de
látex é seu envolvimento na defesa da planta (Rudall, 1987). Esse papel de defesa
tem sido defendido através de estudos, principalmente, do látex de Hevea
brasiliensis, em que foram encontradas várias proteínas relacionadas com a defesa
da planta ou que em testes de atividade biológica tenha demonstrado toxicidade
18
contra patógenos como: a heveína (Lynn & Clevette-Radford, 1986b), as quitinases e
as proteínas que se ligam à quitina (Jekel et. al.,1991).
Composição bioquímica do látex
Além de componentes celulares, essa secreção é composta por uma grande
variedade de substâncias de baixa densidade, como proteínas, terpenos,
carbonatos, alcalóides, vitaminas, carboidratos, lipídios e aminoácidos (Morcelle, et.
al., 2004).
O látex possui uma grande diversidade de proteínas. Sendo especialmente
rico em enzimas com atividades proteolíticas. Relata-se a ocorrência de inúmeras
proteinases no látex de diversas espécies do gênero Euphorbia. Denominadas de
euphorbainas, estas proteinases são classificadas como sendo do tipo serínicas
(Lynn & Clevette-Radford, 1987b). No látex de Hevea brasiliensis, relata-se também
a ocorrência de proteases similares que foram denominadas de heveminas (Lynn &
Clevette-Radford, 1986b), o mesmo constata-se no látex de Elaeophorbia drupifera
(Lynn & Clevette-Radford, 1985, 1987b) e de Carica papaya, também estudada pelo
seu conteúdo de proteinases do tipo cisteínicas, tais como: papaína e
quimopapaínas (McKee & Smith, 1986; Jacquet et al, 1989). Também têm sido
estudadas no látex de plantas, especialmente em H. brasiliensis, outros tipos de
proteínas, como: lectinas, quitinases (Jekel et. al.,1991), beta-1,3- glucanases (Chey
& Cheung, 1995), lisozimas, proteínas inativadoras de ribossomos (RIPs),
glicosidases (Giordani & Lafon, 1993), amilases (Lynn & Clevette-Radford, 1987a),
inibidores de proteinases (Archer, 1983; Lin & Lu, 1994) dentre outros. O termo látex
é frequentemente associado à borracha. Praticamente todos os produtos
industrializados derivados da borracha são fabricados a partir de uma fração do látex
extraído da planta Hevea brasiliensis, a seringueira. Isto inclui desde os pneus dos
automóveis até a chupeta usada para crianças. A substância presente no látex que
apresenta a característica de elasticidade da borracha é um polímero de isopreno. O
poli – cis- isopreno é formado pela ação combinada de várias atividades enzimáticas
presentes no fluido laticífero. Poliisoprenos constituem proporcionalmente a principal
porção da maioria dos fluidos laticíferos e dão a estes a característica colante do
19
látex recém exsudado, assim como é a sua agregação em rede que promove o efeito
tipo coagulante observado ocorrer progressivamente quando o látex é exsudado e
entra em contato com o ar. Embora plantas laticíferas sejam um atraente modelo
biológico para estudo, investigações sobre as propriedades bioquímicas e
fisiológicas de látex são ainda limitadas em bases de dados bibliográficos. Em
particular, a caracterização bioquímica, isolamento e purificação de proteínas, bem
como de outros compostos presentes nesta secreção não são amplamente descritos
na literatura. No que se refere à planta C. procera, esta caracterização foi alvo de
estudo de nossos colaboradores (Freitas, 2006). No que diz respeito a suas
propriedades medicinais, não são poucos os relatos de atividades farmacológicas
detectadas em seu látex.
Investigar aspectos funcionais e farmacológicos do látex de C. procera é de
cunho bastante relevante, principalmente considerando ser esta uma planta muito
comum no Ceará.
Descrição e Características da Planta Calotropis procera (Ait.) R. Br.
C. procera (Ait.) R. Br., pertencente à família Asclepiadaceae, é um arbusto
perene, ereto, pouco ramificado podendo alcançar 3,5 metros de altura, mas
geralmente ficando com menor porte quando ocorre em solo de baixa fertilidade.
Ramos, folhas, pedúnculos e frutos são recobertos por cerosidade, mais intensa nas
partes mais novas. Intensa presença de látex branco, que flui abundantemente
quando se rompem os tecidos. Possui sistema radicular muito desenvolvido, com
raiz principal pivotante. Folhas simples, sésseis, geralmente opostas, com limbo
carnoso de formato ovalado ou oblongo, de ápice agudo, com 10 - 30 cm de
comprimento por 7 - 15 cm de largura; nervuras bem desenvolvidas, sendo a central
proeminente na face dorsal; superfícies lisas e glabras, de coloração verde-clara. As
folhas estão presentes mais na parte elevada da planta, sendo que as inferiores se
desprendem gradualmente. Inflorescências em pedúnculos carnosos e cilíndricos,
terminais e axilares, em cuja extremidade encontram-se umbelas de flores
pediceladas. As flores são actinormorfas e hermafroditas, cálice envolvente, com
cinco lobos agudos, pouco perceptível por estar ajustado sobre a corola e
20
apresentar-se com a mesma textura e coloração. Os frutos são cápsulas infladas,
globosas ou mangiformes, com até 12 cm de comprimento por 8 cm de largura, de
parede externa carnosa, fina, com uma linha de sutura longitudinal; superfície lisa e
glabra, de coloração verde, com depósito de cerosidade esbranquiçada. Sementes
ovóides, com base arredondada e ápice agudo, achatadas, com 5 - 7 mm de
comprimento por 3 - 4 mm de largura, com superfície pouco rugosa, de coloração
castanha; no ápice um grande número de filamentos sedosos, prateados, com até 5
cm de comprimento. Embrião axial, espatulado grande. (Ferreira & Gomes, 1974)
Multiplica-se apenas por sementes sendo disseminadas pelo vento (Lorenzi & Matos,
2002). O seu nome é derivado de Asclépios, Deus grego da medicina, do grego
“kalos” = belo, “tropis” = barco e procera do latin “procerus” = alto, esbelto. Ela é
provavelmente nativa da Índia, mas é encontrada em quase todas as regiões
tropicais semiáridas da América, inclusive no Brasil, desde o Nordeste até o norte de
Minas Gerais. A planta C. procera possui vários nomes populares de acordo com a
região onde se encontra: algodão-de-seda e seda (PE), flor-de-seda, ciúme e
hortência (CE), paininha-de-seda (SP) e leiteiro (SP, MG). (Figura 1)
Na medicina tradicional da Índia, a planta C. procera tem sido usada para
combater várias doenças incluindo leprose, úlceras e tumores. Também tem sido
usada como purgativo e anti-helmíntico (Kirtikar & Basu, 1935). Suas folhas e raízes
são utilizadas para aliviar a dor em diferentes condições (The Wealth of India, 1992).
Além disso, seu látex demonstrou diversas atividades biológicas como: hemólise de
células sangüíneas e atividade anti-plasmodial (Sharma et al, 2001); atividade
antidiarréica (Kumar et al., 2001); atividade antifertilidade em ratos (Kamath & Rana,
2002); atividade analgésica (Soares et al., 2005; Dewan et al., 2000); atividade
esquistossomosicida (Sharma & Sharma, 2000); atividade antiinflamatória (Kumar &
Basu, 1994; Alencar et al., 2004); pró-inflamatória (Singh et al., 2000) e
antibacteriana (Larhsini et al., 1999).
21
Figura 1. Aspecto da planta Calotropis procera
Frações do Látex de C procera
Entre os componentes do látex de C. procera, o principal constituinte é a
borracha, representando 85 % da matéria seca, enquanto as proteínas solúveis
representam 10 %. Tendo em vista a toxicidade do componente poliisopreno, a
borracha, surgiu o interesse de fracionar o látex. O protocolo de fracionamento do
látex de Calotropis procera foi desenvolvido no Departamento de Bioquímica e
Biologia Molecular da UFC, pelo grupo do Prof.Márcio Viana, sendo esta parte
constituinte de outro trabalho de dissertação. Este procedimento foi mostrado ser
muito eficiente em separar as proteínas totais do látex de metabólitos de baixa
massa molecular e principalmente da borracha.
A partir de procedimentos simples de centrifugação e diálise, dispomos de
duas frações razoavelmente livres desse constituinte, as quais podemos denominar
fração dialisável (FDL) e fração não dialisável (FNDL) (Alencar et al., 2006). A FNDL,
obtida após diálise contra água e centrifugação, apresentou um valor médio de 8,18
22
mg/ml e após liofilização 71,33 % de proteínas solúveis. Essa fração é constituída de
proteínas com diversas massas moleculares, variando de 10-95 kDa, prevalecendo
as de aproximadamente 25-30 kDa. Esta riqueza protéica foi determinada a partir de
eletroforese em gel de poliacrilamida e espectrometria de massa por nosso grupo
(Alencar et al., 2006).
A FDL apresenta atividade inflamatória, como avaliada em recentes estudos
(Alencar et al., 2006), induzindo peritonite em ratos, cuja migração celular de
neutrófilos é revertida por corticóide, anti-histamínico e inibidores de TNF-α, mas não
por inibidores da COX. A FNDL por sua vez, apresenta uma ação claramente
antiinflamatória, como avaliada neste estudo, revertendo inclusive a ação da FDL na
migração celular e em outros ensaios com edema de pata, cistite hemorrágica e
peritonite induzida por carragenina (Alencar et al., 2004). A FNDL apresenta ainda
efeitos antinociceptivos centrais e periféricos, independentes do sistema opióide
(Soares et al., 2005) e provoca resposta alérgica quando injetado em camundongos
por via subcutânea (Ramos et al, 2007).
1.2. Inflamação
Generalidades
A resposta inflamatória consiste numa série de eventos celulares e humorais
desencadeados por um tecido vivo vascularizado, na tentativa de combater a
agressão de um agente estranho, em geral exógeno ao organismo. Essa reação
pode resultar em cura e eliminação do patógeno, com ou sem efeitos seqüelares,
como cicatrização e fibrose, ou evoluir para um processo crônico, se a substância
nociva persistir.
Em certas ocasiões, o agente desencadeador da inflamação pode ser
endógeno, como no caso dos distúrbios auto-imunes, situação na qual a resposta
inflamatória tende a ser prejudicial.
A grande maioria das patologias conhecidas envolve em menor ou maior grau
respostas inflamatórias, desde infecções a neoplasias, com peculiaridades para cada
tipo de agente agressor e local do evento. Este geralmente se inicia em um ambiente
23
restrito, como uma cavidade articular, a pele ou o cérebro, por exemplo, ou se
dissemina por contigüidade, por brônquios, por vasos linfáticos e outros ou pela
corrente sanguínea, situação na qual pode desencadear uma resposta inflamatória
sistêmica grave. Dessa forma, reveste-se de fundamental importância a
compreensão dos eventos inflamatórios para cada situação específica onde ocorrem,
como exemplo da artrite aqui estudada, e como se desencadeia e evolui o processo,
quais os mediadores implicados e assim de que forma intervir farmacologicamente.
Dentre os eventos inflamatórios gerais que podem ser facilmente avaliados
em um modelo experimental, tendo em vista a caracterização de uma droga como
pró-inflamatória ou antiinflamatória, destacam-se a migração celular, a dor
inflamatória e a permeabilidade vascular. Os mecanismos e mediadores envolvidos
nesses eventos variam, dependendo do local e da etiopatogenia de cada processo
inflamatório particular. Assim, drogas que inibem a inflamação, no caso, por
exemplo, de uma artrite, podem não fazê-lo plenamente ou parcialmente no caso de
uma serosite, ou mesmo numa artrite desencadeada por um estímulo diferente. Por
vezes, desempenha até um papel contrário, pró-inflamatório. Existem, obviamente,
outros aspectos complexos quanto à ação das drogas, sobretudo no que diz respeito
às vias de administração, sua biodisponibilidade, metabolismo e excreção. (Cotran et
al., 2000; Rang & Dale,2004; Gilman et al., 2004; Katzung, 2003)
Migração celular
A migração celular é um processo complexo dependente das populações
celulares envolvidas e de seu estado de ativação, bem como da forma de interação
celular com o endotélio, sendo essa última controlada pela expressão de moléculas
de adesão e de quimiocinas na superfície endotelial. Conforme Seely et. al. (2003), a
migração de células ocorre através de uma seqüência de etapas, assim
denominadas: marginação, rolagem e aderência; transmigração através do endotélio
(diapedese) e migração nos tecidos intersticiais em direção a um estímulo
quimiotáxico (quimiotaxia)
No fluxo sangüíneo normal, leucócitos encontram-se deslocados em
direção ao endotélio devido à disposição dos eritrócitos numa coluna axial central
24
(Schmid-Schonbein et al., 1980). Esse deslocamento, associado a uma redução na
velocidade do fluxo sangüíneo pelo aumento da permeabilidade vascular na fase
inicial da inflamação, permite que um maior número de leucócitos assuma essa
posição periférica, facilitando assim a marginação leucocitária. Posteriormente,
leucócitos rolam lentamente sobre o endotélio, aí aderindo transitoriamente
(rolagem) e, em seguida, aderem firmemente (aderência). Os leucócitos firmemente
aderidos inserem pseudópodos entre as células endoteliais, transpondo as junções
interendoteliais e a membrana basal, atingindo o espaço extravascular e dirigindo-se
ao foco inflamatório (Seely et al., 2003). Além dessa migração através das junções
endoteliais, leucócitos podem migrar para a área inflamada através de vacúolos
endoteliais, em um processo ativo que ocorre em tecidos especializados como o
cérebro e o timo, com crescentes evidências desse processo em outros tecidos.
Após o extravasamento, leucócitos são atraídos para o sítio inflamatório por
um processo de quimiotaxia, definido como uma locomoção orientada ao longo de
um gradiente químico. Através de quimioreceptores localizados na membrana
plasmática leucocitária, essas células respondem à quimiotaxia, migrando em
direção ao local de maior concentração desses agentes quimiotáxicos (Seely et al.,
2003). Dentre as moléculas quimiotáxicas primárias para neutrófilos, eosinófilos e
monócitos, destacam-se: produtos bacterianos; componentes do sistema
complemento (C5a e C3a); calicreína e ativador de plasminogênio; fibrinopeptídeos;
produtos de degradação da fibrina; produtos da via da lipoxigenase, principalmente
leucotrieno B4 (LTB4); fatores quimiotáxicos de neutrófilos e eosinófilos liberados de
mastócitos; fator quimiotáxico liberado de neutrófilo e, por último, citocinas,
principalmente aquelas da família das quimiocinas. Embora não seja quimiotáxica
“per se”, a histamina pode facilitar a quimiotaxia (McCance & Huether, 1998).
A eficácia das drogas anti-reumáticas modificadoras da doença (DMARD) no
tratamento da artrite reumatóide está, geralmente, associada a sua habilidade de
diminuir o influxo de neutrófilos para as articulações inflamadas (Kraan et al., 2000).
Assim, estratégias para limitar a migração e/ou ativação de neutrófilos têm recebido
atenção como potenciais alternativos para o tratamento de artrites. Entretanto, tal
como as drogas antiinflamatórias não-esteroidais (DAINES), as DMARD apresentam
efeitos colaterais com o uso em longo prazo.
25
Dor inflamatória
A dor constitui uma das principais estratégias de sobrevivência do ser vivo,
alertando-o quanto a existência de um fator prejudicial à sua integridade física ou
funcional, permitindo-lhe desencadear mecanismos de prevenção e defesa contra o
agente agressor.
A dor pode ser mais bem entendida como sendo uma “experiência sensorial e
emocional desagradável, que é associada ou descrita em termos de lesões teciduais.
A dor é sempre subjetiva. Cada indivíduo utiliza a palavra dor de acordo com o
aprendizado frente a suas experiências prévias. É uma sensação desagradável
localizada em uma parte do corpo” (definição da International Association for the
Study of Pain – IASP )
Dessa forma, a dor apresenta dois componentes principais: o afetivo que é
comportamental e subjetivo e o nociceptivo, que é sensorial e discriminativo, e que
por ter um substrato anátomo-fisiológico mais bem definido pode ser facilmente
reproduzido e estudado experimentalmente.
A nocicepção (percepção do nocivo, do latim) refere-se à recepção de sinais
pelo SNC evocados pela ativação de receptores sensoriais periféricos, que
transmitem a informação a partir de potenciais de ação. Esses chamados
nociceptores são suscetíveis a diversos estímulos, físicos ou químicos, podendo ser
influenciados por mediadores provenientes da resposta inflamatória. Vale lembrar
que a dor inflamatória pode ser nociceptiva, quando há integridade das vias
sensitivas ou estar relacionada a outras modalidades de dor, como a dor
neuropática, que ocorre quando há lesão neural central ou periférica devido ao
estímulo inflamatório.
Dependendo da natureza do mediador, este poderá ativar o receptor ou
sensibilizá-lo, ou seja, diminuir seu limiar de excitação, neste caso denominado
mediador hiperalgésico ou ainda ambas as coisas. (Millan, 1999)
Dentre os mediadores hiperalgésicos as citocinas merecem destaque, a partir
da sua liberação por macrófagos residentes, notadamente IL-1 e TNF - α (Ferreira et
al., 1988, Cunha et al., 1992a), os quais agem indiretamente pelo estímulo a
26
liberação de eicosanóides e simpaticomiméticos. A ação do TNF - α foi comprovada
pela inibição da nocicepção pela talidomida em diversos modelos experimentais,
inclusive na artrite induzida por zymosan (Vale, 2003). O TNF - α é uma citocina
singular, pois exerce um papel pivô ao desencadear uma cascata de citocinas, sendo
um dos primeiros mediadores secretados em resposta a um estímulo nocivo (Fong &
Lowry, 1990, Cunha et al., 1992a), e um dos principais responsáveis pela liberação
de mediadores hiperalgésicos em eventos agudos, já que o aumento dos seus níveis
é detectado 15 a 30 min após um estímulo inflamatório.
Diante dessa abrangência e da sua importância em eventos agudos, foi
interessante para o presente estudo avaliar o comportamento do TNF - α no modelo
de artrite induzida por zymosan sobre a influência farmacológica da FNDL.
Permeabilidade Vascular
A inflamação pode ser compreendida como eventos vasculares e celulares
atuando concomitantemente. O aumento da permeabilidade vascular, como definiu
Collins, é “o marco da inflamação aguda” (Cotran et al., 1999). Esse aumento ocorre
a partir de alterações no calibre e fluxo dos vasos quando ocorre um estímulo lesivo,
iniciando-se com vasodilatação e aumento do fluxo sanguíneo. Isto explica o calor e
rubor da inflamação. Em seguida ocorre estase do fluxo, proporcionando a
marginação leucocitária, ou seja, que os leucócitos migrem para próximo do
endotélio, facilitando a interação entre eles. A partir daí, alterações no endotélio são
decisivas para o aumento da permeabilidade. Vários mecanismos estão implicados,
como o surgimento de lacunas, seja por contração endotelial ou por reorganização
do citoesqueleto. Ambos estão implicados na inflamação e são responsivos a
mediadores como a histamina e citocinas (TNF - α, IL-1) liberados por células.
Outros mecanismos são o aumento da transcitose e lesão direta do endotélio.
O efeito final será um extravasamento de líquido rico em proteínas e células
de defesa do sangue, formando um exsudato, que exerce uma pressão
coloidosmótica importante no ambiente extravascular, promovendo maior acúmulo
27
de líquido neste espaço. Diferencia-se, portanto, do transudato, que é apenas efeito
do desequilíbrio das pressões hidrostáticas entre os dois meios.
Nota-se assim, que o aumento da permeabilidade vascular é um dos primeiros
e fundamentais eventos da inflamação e que está intimamente relacionado à
migração celular, já que facilita a marginação leucocitária e, por conseguinte a
interação com o endotélio e a diapedese. (Cotran et al., 1999)
Citocinas
Citocinas são glicopeptídeos produzidos e secretados por diferentes tipos
celulares em virtude de variados estímulos. Exercem sua função ligando-se a
receptores específicos de células alvo, em diversas situações críticas, como defesa,
reparo e crescimento do organismo. As classes mais conhecidas incluem as
interleucinas, os interferons, os fatores de necrose tumoral, os fatores estimulantes
de colônia e fatores de crescimento (Hopkins, 1990). Dependendo do caráter do
evento e da necessidade do organismo, determinada citocina pode ter uma função
chave em uma situação e em outra ter pouca expressão. Dessa forma, uma citocina
pode ser importante na fisiopatologia de uma inflamação em uma cavidade articular,
mas ser apenas mera coadjuvante em uma peritonite, por exemplo. Essa variedade
em parte explica a necessidade de se avaliar a efetividade de um fármaco em
situações específicas.
Dentre as citocinas pró-inflamatórias, destacamos o fator de necrose tumoral
alfa (TNF-α) que apresenta papel chave em diversos processos, como a inflamação,
imuno-modulação, crescimento, angiogênese, citotoxidade e dor (Aggarwal &
Natarajan, 1996; Taylor et al., 2004; Ferreira et al., 1988; Cunha et al., 1992a). Está
bem descrito na literatura, a participação do TNF-α no recrutamento de neutrófilos
para o sítio inflamatório (Canetti et al., 2001; Saunders et al., 2005). Embora, o TNF-
α não seja considerado um fator quimiotático clássico, uma vez que não induz
migração de neutrófilos in vitro, ele promove a síntese e liberação de fatores
quimiotáticos, como as quimiocinas, tanto pelas células endoteliais quanto pelas
células residentes (Faccioli et al.,1990).
28
Diversos estudos demonstraram a participação do TNF-α na migração de
neutrófilos em diversos modelos de reação inflamatória, tais como a artrite
reumatóide induzida por colágeno do tipo II e em doenças inflamatórias humanas,
como a doença inflamatória intestinal e a artrite reumatóide (Beck & Wallace, 1997;
Canetti et al., 2001). Deste modo, terapias com anticorpo neutralizante para o TNF-α
e com receptores solúveis do TNF-α estão sendo utilizadas para reduzir a
inflamação em pacientes com artrite reumatóide ou com doença inflamatória
intestinal (Wooley et al., 1993; Reimold, 2002; Fleischmann & Shealy, 2003).
1.3. Artrite reumatóide
Definição
A artrite reumatóide (AR) constitui a mais freqüente das artropatias
inflamatórias, depois da osteoartrite, com uma prevalência estimada em 1% da
população mundial acometendo preferencialmente o sexo feminino (Hochberg &
Spector, 1990; Markenson, 1991; Spector, 1990). É uma doença inflamatória crônica
sistêmica que afeta principalmente as articulações, apresentando-se usualmente
como uma poliartrite simétrica, sendo os sintomas iniciais a dor e rigidez articulares,
progredindo para destruição e deformidade da articulação, e conseqüente
incapacidade funcional.
Etiopatogenia
A AR é caracterizada por infiltrado de neutrófilos, células T, células B e
macrófagos na sinóvia e fluido nos espaços peri-articulares (Harris Jr, 1990).
Estudos têm sugerido a participação de fatores genéticos, ambientais e imunológicos
no desenvolvimento da AR (Heliovaara et al., 1993; Karlson et al., 1999; Silman et
al., 1996). Sua etiopatogenia é complexa, envolvendo a participação de uma
resposta imuno-inflamatória, com a liberação de mediadores inflamatórios, incluindo
citocinas (TNF- α, IL-1, IL-2 e IL-6) e eicosanóides, que contribuem para a
29
perpetuação e progressão da sinovite. De fato, estudos mostraram aumento na
produção de citocinas por sinoviócitos e células mononucleares do sangue periférico
de pacientes com AR, espontaneamente ou após estímulo in vitro (Harris Jr, 1990;
Brennan et al., 1992).
Além disso, estudos têm demonstrado que os neutrófilos desempenham um
papel crucial na artrite, onde eles regulam e orquestram não apenas a resposta
inflamatória aguda, mas também a inflamação crônica e regulação imune (Kasama et
al., 2005).
Recentemente, estudos sobre o mecanismo de ação antiinflamatória do
metotrexate revelaram uma importante ação da adenosina como modulador dos
eventos inflamatórios na AR (Cronstein, 1997)
Dentre os vários aspectos envolvidos na AR, avaliamos o efeito da FNDL na
migração celular, na dor inflamatória articular, na produção de TNF- α, na
permeabilidade vascular e na atividade da adenosina desaminase, vislumbrando-se
uma possível relação com a adenosina.
Drogas utilizadas na terapêutica da AR
O metotrexate constitui ainda hoje a droga de primeira linha no tratamento da
AR e, portanto, principal droga antiinflamatória modificadora da AR (DMARD) em uso
clínico. Inicialmente a droga foi desenvolvida como inibidor da enzima folato
redutase, passo fundamental no processo de proliferação celular, detendo atividades
anti-neoplásicas. Contudo, baixas doses da droga exibem diversos efeitos
antiinflamatórios já bem caracterizados sobre neutrófilos e macrófagos, os quais se
acredita desempenharem papel central na fisiopatologia da AR e sinovite inflamatória
(Cronstein et al., 1991; Cronstein,1997; Genestier et al., 1998; Hu et al.,1988) .
Uma das hipóteses mais aceitas sobre a ação antiinflamatória de baixas
doses do MTX na AR é a de Chan & Cronstein, 2002. Segundo eles, o MTX aumenta
a expressão da enzima AICAR transformilase, em um dos passos da sua ação sobre
a síntese de purinas. Esta enzima, entre outras ações, reduz a atividade da ADA,
30
que desta forma promove o aumento da adenosina. Esta é disponibilizada
extracelularmente e exerce seus efeitos via receptores ligados à proteína G.
No caso especifico da adenosina liberada nestas situações, parece haver uma
ação preferencial sobre os receptores A
2
, o qual aumenta o AMPc intracelular, que
leva, entre outras ações, à inibição na secreção de TNF- α (Kreckler et al., 2006). A
piora na resposta clínica de pacientes com AR em uso de cafeína, um antagonista
não-seletivo dos receptores de adenosina, reforça esta hipótese (Silke et al., 2001).
Em 1993, Cronstein et al. mostraram que um antagonista específico do receptor A
2A
como também a administração de ADA revertia os efeitos antiinflamatórios do MTX
em um modelo de inflamação induzido por carragenina.
1.4. Adenosina e adenosina desaminase (ADA)
A adenosina é um nucleosídeo purina que vem se estabelecendo como
importante agente antiinflamatório, devido sua potente ação supressora em
virtualmente todas as células do sistema imunológico (Hasko & Cronstein, 2004). Já
está bem estudado, por exemplo, que a adenosina inibe a adesão de neutrófilos
(Cronstein et al, 1986; Firenstein et al, 1995; Bouma et al., 1996), liberação de
citocinas pró-inflamatórias (Bouma et al., 1996; Parmely et al, 1993), síntese de
LTB4 (Krump et al, 1996) e liberação de histamina pelos basófilos (Marone et al,
1979). Possui quatro subtipos de receptores conhecidos, A
1
, A
2A
, A
2B
e A
3
, todos
ligados à proteína G, dos quais os subtipos A
2
são os mais implicados na modulação
da inflamação, via AMPc, com um papel crítico na inibição da produção de ânion
superóxido, desgranulação e adesão de neutrófilos (Hasko & Cronstein, 2004) e na
inibição da liberação de TNF- α por macrófagos (Kreckler et al., 2006). Seus níveis
intra e extra-celulares são modulados principalmente pela adenosina desaminase
(ADA) (Cronstein et al., 1995).
A adenosina desaminase (ADA) que catalisa a desaminação da adenosina e
2’deoxi-adenosina tem um papel fundamental no desenvolvimento e funções do
sistema imunológico, como por exemplo na maturação dos monócitos (Fischer, et al.,
1976). Já está muito bem estabelecido, em número relevante de publicações, que a
31
ADA tem sua atividade aumentada em inúmeras doenças infecciosas tais como
hepatite e tuberculose (Krawczynski et al., 1965; Raczynska et al., 1966; Goldberg et
al., 1966; Nishikawa et al, 1986; Pushpakon, 1990) e alguns tipos de câncer (Durak
et al., 1994a; Durak et al, 1994b; Namiot et al., 1994). A determinação dos níveis de
ADA no líquido pleural ou ascítico é largamente utilizada para o diagnóstico da
tuberculose. (Piras et al., 1978; Riquelme et al., 2006)
No Homem ADA é encontrada sob duas formas: uma tissular (ADA1) e outra
sérica (ADA2) (Gakis et al., 1989; Van der Weyden & Kelley, 1976). Gakis et al.
(1989), formularam a hipótese de que os altos níveis de ADA sérica poderiam ser o
reflexo de sua liberação pelo sistema monocítico-macrofágico nas doenças causadas
por microorganismos intracelulares, daí sua utilidade no diagnóstico da tuberculose.
Dentre outros estudos realizados em nosso laboratório, foi demonstrado o
aumento dos seus níveis na Artrite Encefalite Caprina, virose muito comum que
acomete os rebanhos brasileiros (Rodrigues, 2001) indicando uma possível utilização
da ADA como ferramenta auxiliar de diagnóstico dessa doença.
1.5. Modelos experimentais de artrite
O fato da AR ter uma etiopatogenia complexa e não inteiramente entendida,
limita a reprodução de um modelo experimental em animais que possibilite uma
avaliação fidedigna de novas terapêuticas. Contudo, alguns modelos empregados
são bastante semelhantes à doença humana, permitindo o estudo de eventos
comuns, como a permeabilidade vascular, a migração celular, a dor e a hiperplasia
sinovial (Harris Jr, 1990).
Dentre os vários modelos utilizados, destacam-se a artrite induzida por
adjuvante, a artrite induzida por antígeno, a artrite induzida por colágeno, a artrite
induzida por imunocomplexos e a artrite induzida por zymosan.
A artrite induzida por adjuvante ocorre a partir da injeção intradérmica de uma
suspensão em óleo de Mycobacterium tuberculosis ou butyricum mortos pelo calor
(Chang et al., 1980). Nesse modelo a reação inflamatória leva à formação do pannus
e evolui com erosão da cartilagem e do osso subcondral. A impossibilidade de
32
determinação do início da inflamação, da sistematização das lesões, afetando
inclusive cartilagem elástica, e a restrição a uma cepa de ratos são limitações desse
modelo, quando comparado à AR em humanos.
A artrite induzida por colágeno é desencadeada pela injeção de colágeno tipo
II emulsificado em adjuvante incompleto de Freund (Heymer et al, 1982). O início da
artrite se dá em torno do 16º dia após a imunização, com desenvolvimento de
anquilose (Brahn, 1991). As limitações principais são a especificidade ao antígeno de
indução e a dificuldade em se estabelecer o início da lesão, o que limita a
observação do efeito de intervenções farmacológicas.
Na artrite induzida por imunocomplexos, ratos são submetidos à injeção intra-
articular de um anticorpo (p.ex. anti-soro albumina bovina) seguida da injeção
sistêmica do respectivo antígeno (soro-albumina bovina). Ocorre, então, deposição
de complexo antígeno-anticorpo na sinóvia, assim como presença de intenso
infiltrado celular, liberação de eicosanóides e síntese de TNF-α no líquido sinovial
(Rocha et al, 1997). O caráter auto-limitado da reação é o problema mais importante
nesse modelo, ao lado da relativa benignidade da evolução, contrastando com a AR
humana.
Artrite induzida por zymosan
O zymosan (Zy) é um polissacarídeo derivado da parede celular do fungo
Saccharomyces cerevisae que induz reação inflamatória quando injetado em tecidos,
como na cavidade peritoneal (Doherty et al., 1985), na pele (Ridger et al., 1997;
Greenacre et al., 2001) ou intra-articularmente (Gado & Gigler, 1991). Os
mecanismos são múltiplos, incluindo ativação da via alternativa do sistema
complemento, degranulação de mastócitos de aminas vasoativas como serotonina e
histamina, geração de produtos do metabolismo do ácido araquidônico e estimulação
de macrófagos e neutrófilos na liberação de mediadores inflamatórios (Tadimeti et
al., 1994; Ajuebor et al., 1998; Coates & McColl, 2001; Kolaczkowska et al., 2001).
A fase aguda da artrite induzida por zymosan (AZy) caracteriza-se pelo
aumento da permeabilidade vascular, edema e intenso influxo celular (IC) de
33
neutrófilos na cavidade articular (Rocha et al., 1999), com posterior sinovite
progressiva, infiltrado mononuclear e ativação de fibroblastos, assemelhando-se ao
pannus reumatóide (Keystone et al 1977; Gegout et al., 1994). Outros estudos
apontam a degradação da cartilagem articular e do osso subcondral na fase crônica
da artrite por zymosan (Gegout et al., 1995; Bezerra et al., 2004) .
Em face a tais similaridades, associado ao seu baixo custo e praticidade, o
modelo de artrite induzida por zymosan foi utilizado nesse trabalho para o estudo da
FNDL sobre a migração celular aguda, permeabilidade vascular, dor inflamatória,
níveis de TNF - α e adenosina desaminase e alterações histológicas locais.
Artrite induzida por antígeno (mBSA)
A artrite induzida por antígeno consiste na sensibilização prévia do animal a
um antígeno, com posterior indução a partir da injeção intra-articular da substância
antigênica (p.ex. soro-albumina bovina) (Dumonde & Glynn, 1962). Nesse caso, é
possível determinar precisamente o início da artrite, demonstrando-se a expressão
de anticorpos na membrana sinovial (Jasin & Ziff, 1969), presença do fator
reumatóide (Heymer et al, 1982) e ainda a presença de depósitos de
imunocomplexos e complemento nos tecidos avasculares, semelhante à AR
humana.
Esse modelo tem muitas características histológicas da artrite reumatóide
humana. É desenvolvido através da imunização e desafio com um antígeno
conhecido como a albumina bovina sérica metilada (mBSA). Essa proteína, a mBSA,
é comumente utilizada na forma de antígeno solúvel associado ao adjuvante de
Freund, o qual é usado para dirigir a resposta imune para um padrão de resposta
Th1. Ademais, o tipo de resposta observada em modelos de imunização e desafio
com o antígeno é uma reação de hipersensibilidade do tipo tardia (DTH), iniciada
após a apresentação do antígeno por células apresentadoras de antígenos (APCs),
via MHC, a linfócitos T, desencadeando a resposta imune e a produção de citocinas
(Gallin, 1993).
34
O modelo de imunização e desafio com mBSA permite a indução de uma DTH
na articulação (Brackertz et al., 1977; de Hooge et al., 2001). Dessa forma, a
articulação de camundongos, representa um local ideal para o estudo de reações
inflamatórias, visto que na artrite reumatóide existe um grande infiltrado de
neutrófilos e linfócitos T CD4
+
para as articulações. Este modelo tem sido
extensivamente usado para elucidar os mecanismos patogênicos importantes na
artrite reumatóide, podendo levar a identificação de alvos para intervenção
terapêutica.
1.6. Peritonite infecciosa
O processo de peritonite infecciosa induzida por ligadura e punção cecal
desencadeia uma extensa ativação das células de defesa a nível focal e sistêmico.
Esse modelo foi originalmente estabelecido por Wichterman (1980) e utilizado no
presente trabalho.
Nosso grupo já demonstrou que o influxo celular para a cavidade peritoneal
ocorre com pico às 12h após a indução e que há aumento nos níveis de atividade da
adenosina desaminase (ADA) no lavado peritoneal. Este modelo já foi por nós
utilizado com sucesso na avaliação antiinflamatória de outras drogas, como as
lectinas (Alencar et al., 2005). Em outra dissertação de mestrado do nosso grupo
definimos o perfil isoenzimático da ADA no líquido peritoneal, fígado e baço durante
a evolução da infecção (Luna, 2001).
Os resultados obtidos até agora nos animaram a continuar o estudo de
possíveis agentes antiinflamatórios em modelos de peritonite, desta feita verificando
os efeitos da fração não dialisável do látex de C procera.
35
2. MATERIAIS E MÉTODOS
2.1 Animais
Foram utilizados ratos Wistar machos, pesando entre 230 e 280 gramas
(artrite por zymosan), camundongos Balb/c machos, pesando entre 18 e 22 gramas
(artrite induzida por antígeno) e camundongos Swiss machos pesando 25 e 35
gramas (peritonite infecciosa), sempre em grupos de 6 animais. Os ratos e os
camundongos Swiss foram fornecidos pelo biotério central do Campus do Pici-UFC e
os camundongos Balb/c pela Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da
Universidade de São Paulo (FMRP-USP) e mantidos no biotério setorial do
Departamento de Fisiologia e Farmacologia da UFC e Departamento de
Farmacologia da FMRP-USP, respectivamente, em condições controladas de
temperatura (21ºC), sob um ciclo de claro/escuro de 12/12 horas, com livre acesso à
água e alimentação. Todos os procedimentos foram realizados seguindo as diretrizes
preconizadas pelo Manual sobre Cuidados e Usos de Animais de Laboratório
(Colégio Brasileiro de Experimentação Animal, 2003), com todo o esforço possível no
sentido de minimizar o número e o sofrimento dos animais utilizados.
2.2. Aparelhos e instrumentos laboratoriais
- Aparelho para medir incapacitação articular (elaborado pelo prof. Marcus R Vale e
cedido pelo LAFICA)
- Autoclave
- Balança para pesagem de animais
- Balança analítica
- Beckers
- Câmera digital (Coolpix 4500, Roper Scientific, Japão)
- Câmara de Neubauer 0.100/0.0025 mm2
- Centrífuga
- Espectofotômetro
- Lâminas e lamínulas para microscopia
36
- Material cirúrgico (tesoura, pinças anatômica e dente de rato)
- Microscópio óptico binocular (Nikon)
- Micropipetas automáticas (GILSON)
- Ponteiras para pipetas automáticas (SIGMA)
- Tubos Eppendorf 1.5ml (GIBCO)
- Tubos de ensaio de vidro (PIREX)
- Tubos Falcon
- Ultracentrífuga (Amicon corporation)
2.3. Soluções, drogas e reagentes
Todos os reagentes utilizados apresentavam grau de pureza e propriedades
analíticas adequadas e as drogas utilizadas foram:
- Ácido tri-cloroacético (10%)
- Adenosina (Sigma, EUA)
- Adjuvante de Freund (Sigma, EUA)
- Albumina bovina sérica metilada (mBSA)(Sigma, St Louis, MO, EUA)
- Anticorpo monoclonal (mAb) anti-TNF-α (purificado do soro de carneiro; Peprotec)
- Azul de Evans 2,5% (Neo-química)
- Corante Panótico Rápido (LaborClin; Produtos para Laboratório Ltda, Pinhais, PR,
Brasil)
- Éter etílico (Syth)
- Fenol/nitroprussiato de sódio (1% / 5mg%)
- Formamida
- Formol
- Heparina (Cristália- Brasil).
- Hidrato de cloral 10% (REAGEN - Brasil);
- Hipoclorito alcalino (0,08% em NaOH, 12,5mN)
- Peróxido de hidrogênio (Smith)
Salina heparinizada
Solução salina 0,9% estéril................................................................100 mL
Heparina.............................................................................................100 mL
37
- Solução 1:5000 do conjugado avidina-horseradish peroxidase (DAKO A/S,
Denmark)
- Solução de Turk
Ácido acético glacial (Reagen) ..........................................................20,0ml
Violeta genciana (Reagen) ...................................................................2,0ml
Água destilada.................................................................................1000,0ml
- Solução de Tampão Salina-fosfato (PBS):
Cloreto de Sódio (NaCl, Merck)..............................................................8,0 g
Cloreto de Potássio (KCl, Merck)............................................................0,2 g
Fosfato de Sódio dibásico (Na
2
HPO
4
, Merck).......................................1,15 g
Fosfato de Potássio monobásico (KH
2
PO
4
, Merck).................................0,2 g
Água deionizada Milli-Q q.s.p.....................................................................1L
- Solução de PBS-Tween (Merck)
- Solução de H
2
SO
4
a 1M
- Solução salina 0,9% estéril (Cristália Brasil)
- Substrato dihidroclorido de 1,2-fenilenodiamina (ortofenileno diamina, OPD, Sigma)
- Tampão fosfato pH 7.2
- Zymosan A (from Saccharamyces cerevisiae, Sigma Chemical Co., St Louis, USA),
dissolvido em salina
2.4. Protocolo experimental
2.4.1. Modelo de artrite induzida por zymosan (AZy)
Indução
Sob leve anestesia com éter etílico, ratos Wistar foram submetidos à indução
da AZy por meio da injeção intra-articular, no joelho direito, de 1mg de zymosan
dissolvidos em 50 µL de solução salina estéril, apirogênica (Keystone et al.,1977). O
grupo controle negativo foi submetido apenas à administração de salina no joelho
direito.
38
Tratamento com a fração não dialisável do látex de Calotropis procera (FNDL)
A FNDL foi administrada nas doses de 3, 5, 10, 30 e 100mg/kg; e.v., em um
volume de 500µL, diluída em salina – 30 min antes e 2h depois da aplicação do
zymosan na articulação. Nos protocolos de avaliação da permeabilidade vascular e
dosagem de citocinas, foi administrada a dose que apresentou melhor efeito no teste
de incapacitação articular (3mg/Kg).
Teste de incapacitação articular
Para esta abordagem foi utilizado o modelo desenvolvido por Tonussi e
Ferreira (1992), modificado posteriormente (Viana et al., 1998; Rocha et al., 1999) e
adaptado para este estudo. O modelo consiste em fazer os ratos deambularem, após
prévio treinamento de adaptação, em uma roda de piso metálico (cilindro de
alumínio, 30cm de diâmetro por 50cm de largura) em movimento giratório a uma
velocidade de 3 rpm. Sapatilhas metálicas eram colocadas 30 min antes em ambas
as patas traseiras do animal, sendo a direita, local de injeção intra-articular do Zy,
conectada à porta de dados de um microcomputador. Ao tocar a sapatilha no piso
metálico, fecha-se um circuito, e ao final de 60 s, o computador registrava então o
tempo de suspensão da pata (TSP), ou seja, o tempo em que o animal permaneceu
com a pata levantada sem tocar o piso (Figura 2). O TSP é tomado antes da injeção
do Zy e após, de hora em hora, até a quinta hora. O aumento do TSP é então
interpretado como nocicepção, ou seja, incapacidade pela dor do animal deambular
sobre a roda.
39
Figura 2. Fotografia do sistema utilizado para o teste de incapacitação articular
em ratos – gentilmente cedido pelo LAFICA - UFC
Coleta do lavado articular
Após 6h da indução da AZy, os animais foram sacrificados, sob anestesia
(hidrato de cloral 10% – 100uL/30g de animal; i.p.), por exsangüinação, com
posterior lavagem da cavidade articular. Essa foi realizada através de duas injeções
intra-articulares, seguidas de aspiração, de 200µL de salina heparinizada (100µL de
salina estéril apirogênica/ 100µL de heparina). O fluído articular foi utilizado com as
seguintes finalidades: contagem total e diferencial de leucócitos, determinação da
atividade da ADA e dosagem de citocinas. Para as duas últimas a coleta foi realizada
em banho de gelo, as amostras centrifugadas a 3000 xg, a 4ºC, por 10 minutos e os
sobrenadantes obtidos foram estocados a -20ºC para posterior análise.
40
Avaliação da migração de neutrófilos para a cavidade articular induzida por Zy
Amostras do lavado articular foram utilizadas para contagem total e diferencial
dos leucócitos. Alíquotas de 20 µL do lavado articular foram diluídas em líquido de
Turk, na proporção de 1:2, sendo a contagem total dos leucócitos realizada em
câmara de Neubauer, com o auxílio de microscópio óptico (aumento de 40x) e
contador manual e expressa como número de leucócitos x 10
4
/cavidade articular.
As lâminas para contagem diferencial foram preparadas por citocentrifugação
de uma alíquota de 50 µL do lavado articular e coradas pelo corante panótico rápido
(LaborClin; Produtos para Laboratório Ltda, Pinhais, PR, Brasil). As células foram
examinadas em microscópio óptico através da objetiva de imersão em óleo (aumento
de 100 x), sendo contadas 100 células por lâmina. A quantificação dos neutrófilos
presentes na cavidade articular foi calculada pela percentagem dessas células
contadas nos esfregaços e pela quantidade de células totais obtidas na contagem
total. Os resultados foram expressos como número de neutrófilos x 10
4
/cavidade.
Ensaio da ADA
Após centrifugação do lavado articular foram utilizados 20µL do sobrenadante
como fonte da enzima para determinação da atividade da ADA através do método de
Giusti (1974). Este ensaio é baseado na análise da amônia formada durante a
desaminação da adenosina (21mM) pela ADA (Figura durante 60 minutos de
incubação a 37ºC em tampão fosfato 50mM, pH7,2. Para a quantificação da amônia
foram adicionados 600µl de fenol/nitroprussiato de sódio (1% / 5mg%) e 600µl de
hipoclorito alcalino (0,08% em NaOH, 12,5mN). Após 30 minutos adicionais de
incubação a 37ºC os tubos são analisados em espectrofotômetro sob 628nm. Os
resultados foram expressos em unidades por litro (U/L) do sobrenadante.
41
+ H
2
O + NH
3
ADA
Adenosina Inosina
Figura 3 – Esquema da desaminação da adenosina pela ADA
Dosagem de citocinas (TNF-α)
O ensaio para determinação da concentração de TNF-α foi realizado baseado
em protocolo já descrito (Taktak et al., 1991). Brevemente, placas de microtitulação
(96 poços) foram recobertas com 50 µL de “PBS coating buffer” contendo 2,0 µg/mL
do anticorpo monoclonal (mAb) anti-TNF-α (purificado do soro de carneiro;
Peprotec). A placa foi incubada “overnight” a 4
o
C. Após esse período, a placa foi
lavada de 3 a 5 vezes com PBS contendo 0,1% Tween 20 (PBS-T; 200 µL/poço), e
em seguida foram incubadas com 50 µL de solução de bloqueio (1% de albumina
bovina em “PBS coating buffer”) durante 2h em temperatura ambiente. A placa foi
lavada conforme descrito acima e, em seguida adicionou-se (triplicata) dos fluídos
articulares e TNF-α (Peprotec) em concentrações decrescentes diluídas em PBS-
Tween (o primeiro ponto da curva-padrão de TNF-α foi de 2000pg/mL). A placa foi
novamente coberta e mantida “overnight” a 4
o
C. No terceiro dia a placa foi lavada por
três vezes e adicionada com anticorpo biotinilado anti-TNF-α (1:1000 em solução de
lavagem contendo 1% de soro de cabra, Peprotec).
Após 1 h de incubação à temperatura ambiente, a placa foi lavada e em
seguida adicionou-se 50 µL de uma solução 1:5000 do conjugado avidina-
horseradish peroxidase (DAKO A/S, Denmark) diluída em PBS-T. Após incubação
por 30 minutos, a placa foi lavada e incubada com 50 µL do substrato dihidroclorido
de 1,2-fenilenodiamina (ortofenileno diamina, OPD, Sigma) diluído em tampão e
adicionado com 0,4 µL de H
2
O
2
30% por mL.
42
Após o desenvolvimento da cor, a reação foi interrompida pela adição de 75
µL de solução “stop” (H
2
SO
4
– 1M). A medida da absorbância foi determinada a 490
nm. Os resultados foram expressos em pg/mL de TNF-α com base na curva padrão
obtida.
Permeabilidade vascular
A avaliação da permeabilidade vascular foi feita através do método
quantitativo de extravasamento do Azul de Evans (AE), que se baseia na capacidade
deste corante em ligar-se à albumina sérica (Kwan et al., 1996). O corante é
administrado e.v. pela veia peniana do rato na dose de 25mg/Kg, a 2,5%, 30 min
antes do sacrifício. Em seguida a articulação do joelho no qual foi injetado Zy ou
salina é retirada, pesada e imergida em 2ml de formamida, sendo incubada por 12h
a 56ºC. Após esse período as articulações são desprezadas e a quantidade de AE
extravasado é determinada indiretamente na solução através da leitura das
absorbâncias em espectrofotômetro (630nm). A relação das absorbâncias com as
concentrações de AE extravasado é obtida através da utilização de uma curva
padrão do corante. A quantidade de Azul de Evans foi expressa por mg AE/100mg
de articulação.
Análise histopatológica
A região da articulação fêmur-tibial foi isolada e imersa em formol tamponado
a 10%, para fixação durante 24 horas. Em seguida os tecidos foram descalcificados
em ácido tri-cloroacético (10%) por aproximadamente 18 horas. Esses tecidos foram
então desidratados e incluídos em blocos de parafina. Cortes de 6 µm de espessura
foram dispostos em lâmina de microscopia. As lâminas foram coradas segundo a
técnica de coloração com hematoxilina e eosina. Os cortes foram analisados em
microscópio (Nikon, Japão) com aumento de 40x e 1000x, as imagens foram
captadas por câmera digital (Coolpix 4500, Roper Scientific, Japão) armazenadas em
computador e editadas utilizando o software Adobe Photo Shop 9.0.
43
A avaliação histopatológica da amostra de tecido sinovial foi realizada por um
patologista e classificada segundo a metodologia descrita por Pothoulakis et al.
(1994) seguindo a seguinte escala:
Escala de 0 a 3:
0 - ausência de edema/ destruição tecidual/ infiltrado inflamatório/ espessamento da
membrana sinovial.
1- edema leve/ infiltrado inflamatório moderado misto (poucos neutrófilos)/ pouco
espessamento da membrana sinovial/ arquitetura preservada.
2- edema moderado/ infiltrado celular inflamatório / adipócitos íntegros/ sem
destruição da arquitetura.
3- presença de edema/ destruição tecidual/ infiltrado celular inflamatório misto
(polimorfo e mononuclear)/ espessamento da membrana.
2.4.2. Modelo de artrite induzida por antígeno (AIA)
Procedimento de imunização e desafio com mBSA
Camundongos Balb/c foram imunizados, através de injeção subcutânea (s.c.),
com uma emulsão contendo 200 µL de volumes iguais de PBS e adjuvante completo
de Freund (ACF), na qual estavam dissolvidos 500 µg de mBSA. No 7º e 14º dia
após a primeira imunização foram administrados (s.c.) reforços da emulsão com
adjuvante incompleto de Freund (AIF). Os animais falso-imunizados receberam o
mesmo tratamento aplicado aos demais, porém sem a administração de mBSA. No
21º dia, os animais imunizados foram desafiados com mBSA (10 µg/cavidade)
através de injeção intra-articular (articulação fêmoro-tibial).
44
Tratamento com a fração não dialisável do látex de Calotropis procera (FNDL)
A FNDL foi administrada nas doses de 3, 10, 30mg/kg; e.v., em volume de
100uL, diluída em salina – 30 min antes e 6h depois do desafio com mBSA na
articulação.
Coleta do lavado articular
Os camundongos foram sacrificados 24 horas após o desafio para a avaliação
da migração de neutrófilos. Para tal, foi coletado o lavado intra-articular com 5 µl de
PBS contendo EDTA (1 mM, duas vezes) e estes diluídos em 90 µL de PBS
contendo EDTA (1 mM). A partir do lavado articular foram feitas a contagem total e
diferencial dos leucócitos.
2.4.3. Modelo de Peritonite Infecciosa
Indução da peritonite infecciosa
O modelo de peritonite infecciosa foi baseado na ligadura e perfuração do
ceco dos animais (Wichterman et al., 1980). A cirurgia foi realizada em camundongos
Swiss, sob anestesia leve com éter. Após laparotomia mediana, as fezes são
ordenhadas para o ceco seguido de ligadura do trato cecal, sem prejuízo para o
trânsito intestinal. A bolsa assim formada foi perfurada em dois locais com agulha
hipodérmica nº 21, para permitir o extravasamento de material fecal para a cavidade
abdominal. O corte cirúrgico foi então suturado. A partir desse momento, o animal foi
mantido com água “ad libitum”. As coletas de líquido peritoneal foram realizadas 12
horas após a indução da peritonite, período correspondente ao pico do processo
inflamatório agudo (Alencar et al., 2005). Os animais controle sofreram os mesmos
processos, exceto pela não perfuração do ceco.
45
Tratamento com a fração não dialisável do látex de Calotropis procera (FNDL)
A FNDL foi administrada na dose de 10 mg/Kg; i.v., em volume de 100uL,
diluída em salina estéril, imediatamente após e 6h depois da cirurgia de ligadura e
perfuração do ceco.
Coleta do lavado peritoneal
Foi administrada à cavidade peritoneal 3 ml de salina heparinizada seguida de
leve massagem O lavado peritoneal foi coletado para posterior contagem total e
diferencial de células e determinação da atividade da ADA seguindo a mesma
metodologia descrita no modelo de artrite induzida por zymosan
2.4.4. Teste de toxicidade
Ratos Wistar foram submetidos a aplicações diárias via endovenosa da FNDL
na doses de 10 mg/Kg, correspondente a 3 vezes o valor da menor dose efetiva
(3mg/kg), durante sete dias, em volume de 100 µL. O grupo controle recebeu
aplicação diária de salina (100 µL) por sete dias.
Ao final do sétimo dia, os animais foram sacrificados e o sangue coletado para
realização de testes laboratoriais padronizados. A função hepática dos animais foi
avaliada através da dosagem da atividade sérica das aminotransferases (TGO e
TGP). A função renal através das dosagens de creatinina e uréia. As dosagens
foram realizadas por automação no laboratório de Bioquímica do Hospital
Universitário Walter Cantídio, utilizando “kits” específicos para cada substância.
Além disso, no final do tratamento, órgãos vitais (fígado, baço, rim e coração)
foram pesados e o resultado das massas expresso por / 100g de animal. Foi
realizado também leucograma dos animais.
46
2.5. Análise estatística
Na comparação dos grupos foi utilizada análise de variância (ANOVA)
complementada com teste t de Bonferroni (comparações múltiplas) ou teste t de
Student (comparação entre duas amostras) para amostras não pareadas. Para
avaliação dos escores histopatológicos foi utilizado o teste de Kruskal-Wallis para
comparação de medianas. Os resultados foram expressos como média ± erro padrão
da média (E.P.M.) e as diferenças foram consideradas estatisticamente significantes
para valores de P<0.05.
47
3. RESULTADOS
3.1. A FNDL de Calotropis procera reduz o influxo de neutrófilos na artrite
induzida por Zy em ratos
A figura 3 ilustra a ação da FNDL administrada e.v. 30 min e 2h após a
indução da artrite por Zy na migração celular, analisada no fluido articular coletado
após 6h de aplicação do Zy, com redução significativa e máxima já na dose de
3mg/Kg (p<0.05) em comparação ao grupo que recebeu apenas salina endovenosa.
O efeito persiste nas demais doses testadas, de 5 a 100mg/Kg.
Sal C 3 5 10 30 100
0
100
200
300
400
500
*
*
*
*
FNDL (mg/Kg; i.v.)
Zymosan (i.a.)
#
neutrófilos x 10
4
/cavidade
artucular
*
Figura 4 - Efeito do tratamento com FNDL sobre o influxo de neutrófilos à cavidade articular de
ratos submetidos à indução da artrite por zymosan (AZy). Ratos Wistar receberam uma injeção
intra-articular de zymosan (1mg) no joelho direito, sendo sacrificados, sob anestesia, após 6h da
indução da AZy. FNDL (3, 5,10,30 e 100mg/Kg) foi administrada via endovenosa por veia peniana, em
cada grupo de 6 animais, 30 minutos antes e 2h após a AZy. A contagem total e diferencial de células
foi realizada no lavado articular. O grupo controle AZy (C) representa os animais que receberam Zy
i.a. e salina e.v. e o grupo (Sal) os animais que receberam salina i.a. As barras representam a média
± EPM do número de neutrófilos x 10
4
/cavidade
de 6 animais por grupo. *p<0,05 representa a
significância estatística em relação ao grupo C e # p<0,05 em relação ao sal. (ANOVA- Teste de
Bonferroni)
48
3.2. A FNDL de Calotropis procera reduz o tempo de suspensão da pata na
artrite induzida por Zy em ratos.
A FNDL, como ilustrado na figura 4, mostrou-se efetiva em reduzir
significativamente (p<0.05) o TSP no período de observação de 4h após a injeção
intra-articular de Zy em todas as doses testadas.
Sal C 3 5 10 30 100
0
10
20
30
Zymosan i.a.
FNDL i.v.
*
*
*
*
*
#
A
TSP (s)
Figura 5 - Efeito do tratamento com FNDL sobre o tempo de suspensão da pata (TSP) de ratos
submetidos à indução da artrite por zymosan (AZy). Ratos Wistar receberam uma injeção intra-
articular de zymosan (1mg) no joelho direito, sendo submetidos a caminhar em uma roda de avaliação
de incapacitação articular por 1 minuto, na quarta hora após a indução da AZy. FNDL (3, 5, 10,30 e
100mg/Kg) foi administrada via endovenosa por veia peniana, em cada grupo de 6 animais, 30
minutos antes e 2h após a AZy. O grupo controle AZy (C) representa os animais que receberam Zy
i.a. e salina e.v. e o grupo (Sal) os animais que receberam salina i.a. As barras representam a média
do TPS em segundos ± EPM
de 6 animais por grupo. *p<0,05 representa a significância estatística
em relação ao grupo C e # p<0,05 em relação ao sal. (ANOVA- Teste de Bonferroni)
49
Na dose de 3mg/Kg a FNDL reduziu significativamente o TSP em todos os períodos
de observação, da segunda à quinta hora. (Figura 5)
0 1 2 3 4 5 6
0
5
10
15
20
25
30
35
Sal
C
3
5
10
30
100
*
*
**
*
Tempo em horas
B
TSP (s)
Figura 6 – Curso temporal do tratamento com FNDL sobre o tempo de suspensão da pata (TSP)
de ratos submetidos à indução da artrite por zymosan (AZy). Ratos Wistar receberam uma
injeção intra-articular de zymosan (1mg) no joelho direito, sendo submetidos a caminhar em uma roda
de avaliação de incapacitação articular por 1 minuto, a cada hora, até a quinta hora após a indução da
AZy. FNDL (3, 5, 10,30 e 100mg/Kg) foi administrada via endovenosa por veia peniana, em cada
grupo de 6 animais, 30 minutos antes e 2h após a AZy. O grupo controle AZy (C) representa os
animais que receberam Zy i.a. e salina e.v. e o grupo (Sal) os animais que receberam salina i.a. Os
dados representam a média do TPS em segundos ± EPM de 6 animais por grupo. *p<0,05 representa
a significância estatística em relação ao grupo C. (ANOVA - Teste de Bonferroni)
50
3.3. A FNDL de Calotropis procera reduz a atividade da ADA na artrite induzida
por Zy em ratos.
A figura 6 mostra o efeito da FNDL aplicada via endovenosa sobre a atividade
da adenosina desaminase no fluido sinovial, após 6h da injeção intra-articular do Zy,
observando-se uma redução significativa em todas as doses testadas (p<0.05),
quando comparado ao grupo tratado apenas com salina endovenosa.
C 3 5 10 30 100
0
10
20
30
40
50
60
Zymosan i.a.
FNDL i.v.
*
*
*
*
*
Atividade da ADA/UI
Figura 7 - Efeito do tratamento com FNDL sobre a atividade da ADA na cavidade articular de
ratos submetidos à indução da artrite por zymosan (AZy). Ratos Wistar receberam uma injeção
intra-articular de zymosan (1mg) no joelho direito, sendo sacrificados, sob anestesia, após 6h da
indução da AZy. FNDL (3, 5, 10, 30 e 100mg/Kg) foi administrada via endovenosa por veia peniana,
em cada grupo de 6 animais, 30 minutos antes e 2h após a AZy. O grupo controle AZy (C) representa
os animais que receberam Zy i.a. e salina e.v. As barras representam a média ± EPM da atividade da
ADA no lavado articular em U/L de 6 animais por grupo. *p<0,05 representa a significância estatística
em relação ao grupo controle (ANOVA/Bonferroni).
51
3.4. A FNDL de Calotropis procera reduz a permeabilidade vascular na
artrite induzida por Zy em ratos.
O extravasamento de Azul de Evans na cavidade articular induzido por
zymosan foi inibido significativamente (p<0.05) pela FNDL, na dose de 3mg/kg, como
ilustrado na figura 7.
sal C FNDL
0.0
2.5
5.0
7.5
10.0
12.5
Zymosan i.a.
*
#
i.v
mg de azul de Evans/100mg
de articulação
Figura 8 - Efeito do tratamento com FNDL sobre a permeabilidade vascular em ratos
submetidos à indução de artrite por zymosan (AZy). Ratos Wistar receberam uma injeção intra-
articular de zymosan (1mg) no joelho direito, sendo sacrificados, sob anestesia, após 6h da indução
da AZy. FNDL (3 mg/kg) foi administrado via endovenosa por veia peniana, em um grupo de 6
animais, 30 minutos antes e 2h após a AZy. Azul de Evans (AE), 25mg/kg diluído em salina, foi
administrado via endovenosa a todos os grupos 30 min antes do sacrifício. A articulação foi extraída e
incubada em formamida por 12h/56°C. A absorbância do sobrenadante foi medida por
espectrofotometria a 630nm e comparada a uma curva padrão de AE. O grupo controle AZy (C)
representa os animais que receberam Zy i.a. e salina e.v. e o grupo (Sal) os animais que receberam
salina i.a. As barras representam a média ± EPM
de AE extravasado em mg/100mg de articulação
de 6 animais por grupo. # p<0,05 representa a significância estatística em relação ao grupo C e
*p<0,05 em relação ao sal. (ANOVA - Teste de Bonferroni)
52
3.5. A FNDL de Calotropis procera reduz o nível de TNF - α na artrite induzida
por Zy em ratos.
A FNDL, na dose antiinflamatória mais baixa efetiva, 3mg/Kg, reduziu
significativamente (p<0.05) os níveis de TNF – α no lavado articular dos animais com
artrite induzida por Zy, após 6h da indução (Figura 8).
0
50
100
150
200
250
300
350
*
#
Sal
C
FNDL (3mg/Kg)
Zymosan i.a.
TNF-
α
(pg/mL)
Figura 9 - Efeito do tratamento com FNDL sobre os níveis de TNF - α na cavidade articular de
ratos submetidos à indução da artrite por zymosan (AZy). Ratos Wistar receberam uma injeção
intra-articular de zymosan (1mg) no joelho direito, sendo sacrificados, sob anestesia, após 6h da
indução da AZy. FNDL (3 mg/Kg) foi administrada via endovenosa por veia peniana, em um grupo de
6 animais, 30 minutos antes e 2h após a AZy. Os níveis de TNF - α no lavado articular foram
expressos em pg/mL. O grupo controle AZy (C) representa os animais que receberam Zy i.a. e salina
e.v. e o grupo (Sal) os animais que receberam salina i.a. As barras representam a média ± EPM
dos
níveis de TNF - α em pg/mL no lavado articular de 6 animais por grupo. *p<0,05 representa a
significância estatística em relação ao grupo controle (ANOVA/Bonferroni).
53
3.6. A FNDL de Calotropis procera melhora os escores da avaliação
histopatológica na artrite por Zy em ratos.
A FNDL induziu uma redução do edema e do infiltrado inflamatório, diminuição
do espessamento sinovial e preservação da arquitetura, como mostrado nas figuras
9 e 10.
GRUPOS Avaliação microscópica
salina 2,5 (3-1)
FNDL 10 *1 (2-1)
FNDL 30 *1 (1-1)
FNDL 100 *1 (2-1)
Figura 10 - Efeito do tratamento com FNDL sobre o quadro histopatológico da articulação de
ratos submetidos à indução da artrite por zymosan (AZy). Ratos Wistar receberam uma injeção
intra-articular de zymosan (1mg) no joelho direito, sendo sacrificados, sob anestesia, após 6h da
indução da AZy. FNDL (10,30 e 100mg/Kg) foi administrado via endovenosa por veia peniana, em
cada grupo de 6 animais, 30 minutos antes e 2h após a AZy. Uma amostra da articulação do joelho
foi extraída, armazenada em formol 10% por 24 h e depois em álcool a 70% e preparada para análise
histopatológica. O grupo salina representa animais que receberam salina e.v. Os dados representam
a mediana dos escores de 6 animais por grupo. *p<0,05 quando comparado ao grupo não tratado
(ANOVA/Kruskal-Wallis).
54
Zymosan
FNDL 10mg/kg
FNDL 30mg/kg
Figura 11 – Fotografias mostrando o aspecto da microscopia óptica em cortes histológicos
corados pela técnica de hematoxilina-eosina do tecido sinovial comparando grupos tratados
com FNDL (10 e 30mg/kg) e o grupo não tratado (zymosan) (aumento de 40X)
55
3.7. A FNDL de Calotropis procera reduz o influxo de neutrófilos na artrite
induzida por mBSA em camundongos pré-imunizados.
Na artrite induzida por antígeno, a FNDL mostrou-se plenamente eficaz
(p<0.05) em inibir a migração de neutrófilos para a cavidade articular, após 24h do
desafio com mBSA (Figura 11).
0
2
4
6
8
10
12
14
- - C 3 10 30
FNDL (mg/kg)
mBSA (10 µg/cavidade)
mBSA PBS
FI IM
*
#
*
*
neutrófilos x 10
4
/ cavidade articular
Figura 12 - Efeito do tratamento com FNDL sobre o influxo de neutrófilos à cavidade articular
de camundongos submetidos à indução da artrite por antígeno (mBSA) - AIA. Camundongos
Balb/c foram imunizados via s.c., com uma emulsão contendo 200 µL de volumes iguais de PBS e
adjuvante completo de Freund (ACF), na qual estava dissolvida 500 µg de mBSA, com reforço no 7º e
14º dias, sendo desafiados no 21º dia com mBSA 10µg i.a. no joelho e sacrificados, sob anestesia,
após 24h do desafio. FNDL (3, 10 e 30 mg/Kg) foi administrado via endovenosa, em cada grupo de 6
animais, 30 minutos antes e 6h após o desafio. A contagem total e diferencial de células foi realizada
no lavado articular. O grupo FI corresponde aos animais falso-imunizados; o grupo PBS recebeu PBS
i.a. no momento do desafio e o grupo C representa animais desafiados que receberam salina e.v. As
barras representam a média ± EPM do número de neutrófilos x 10
4
/cavidade
de 6 animais por grupo.
*p<0,05 representa a significância estatística em relação ao grupo C e # p<0,05 em relação ao PBS.
(ANOVA-Bonferroni)
56
3.8. A FNDL de Calotropis procera inibe a migração de neutrófilos na peritonite
infecciosa em camundongos.
Na dose de 10 mg/kg, a FNDL inibiu significativamente (p<0.05) o influxo de
neutrófilos para a cavidade peritoneal em camundongos submetidos à peritonite por
ligadura e punção cecal. (Figura 12)
controle sham peritonite FNDL
0
5000
10000
*
*
*
Neutrófilos
Figura 13 - Efeito do tratamento via endovenosa com FNDL sobre o influxo de neutrófilos à
cavidade peritoneal de camundongos submetidos à indução de peritonite infecciosa.
Camundongos Swiss foram submetidos a laparotomia exploradora com ligadura cecal e formação de
bolsa de fezes, seguida de punção do ceco com agulha 21G , duas vezes. FNDL (10 mg/Kg) foi
administrado via endovenosa, em cada grupo de 6 animais, logo após o término da cirurgia. A
contagem total e diferencial de células foi realizada no lavado peritoneal. Os animais sham foram
operados, mas sem ligadura e punção cecal. O grupo controle não sofreu qualquer intervenção
cirúrgica. As barras representam a média ± EPM do número de células/mm
3
de 6 animais por grupo.
*p<0,05 quando comparado ao grupo não tratado (ANOVA/Bonferroni).
57
3.9. A FNDL de Calotropis procera reduz a atividade da ADA no lavado
peritoneal na peritonite infecciosa em camundongos.
Na dose de 10 mg/kg, a FNDL reduziu significativamente (p<0.05) a atividade
da ADA no lavado peritoneal em camundongos submetidos à peritonite por ligadura
e punção cecal. (Figura 13)
Controle Sham Peritonite FNDL
0
10
20
30
*
*
*
Atividade da ADA (U/L)
Figura 14 - Efeito do tratamento via endovenosa com FNDL sobre a atividade da ADA na
cavidade peritoneal de camundongos submetidos à indução de peritonite infecciosa.
Camundongos Swiss foram submetidos a laparotomia exploradora com ligadura cecal e formação de
bolsa de fezes, seguida de punção do ceco com agulha 21G , duas vezes. FNDL (10 mg/Kg) foi
administrado via endovenosa, em cada grupo de 6 animais, logo após o término da cirurgia. A
dosagem de ADA foi expressa em U/L no lavado peritoneal. Os animais sham foram operados, mas
sem ligadura e punção cecal. O grupo controle não sofreu qualquer intervenção cirúrgica. Os dados
representam a média ± EPM. *p<0,05 quando comparado ao grupo não tratado(ANOVA/Bonferroni).
58
3.10. A FNDL de Calotropis procera não apresenta parâmetros laboratorias de
toxicidade na dose de 10 mg/kg.
Na dose de 10mg/kg, a FNDL não altera significativamente os parâmetros de
função renal (creatinina e uréia) e de integridade hepática, expressa pelas
aminotransferases. Também não houve alteração importante no leucograma ou no
peso de órgãos selecionados. (figuras 14, 15, 16 e 17)
sham FNDL sham FNDL
0
25
50
Uréia
Creatinina
(x 10)
mg/dl
Figura 15 - Efeito da aplicação via endovenosa de FNDL por sete dias sobre a função renal.
Ratos Wistar foram submetidos a aplicações diárias de FNDL e.v. via peniana (10mg/kg) em volume
de 100 µL., por sete dias. No sétimo dia os animais foram sacrificados e o sangue colhido para
dosagem padronizada de uréia e creatinina Os valores foram expressos em mg/dL para a uréia e
mg/dL X 10 para creatinina. O grupo sham recebeu apenas 100 µL de salina e.v. diariamente por sete
dias. Os dados representam a média ± EPM. *p<0,05 quando comparado ao grupo não tratado
(ANOVA/Bonferroni).
59
sham FNDL sham FNDL
0
100
200
TGO
TGP
U/L
Figura 16 - Efeito da aplicação via endovenosa de FNDL por sete dias sobre as transaminases
hepáticas. Ratos Wistar foram submetidos a aplicações diárias de FNDL e.v. via peniana (10mg/kg)
em volume de 100 µL., por sete dias. No sétimo dia os animais foram sacrificados e o sangue colhido
para dosagem padronizada de TGO e TGP. Os valores foram expressos em U/L. O grupo sham
recebeu apenas 100 µL de salina e.v. diariamente por sete dias. Os dados representam a média ±
EPM. *p<0,05 quando comparado ao grupo não tratado (ANOVA/Bonferroni).
sham FNDL sham FNDL
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
TOTAL
PMN
céls/mm
3
Figura 17 - Efeito da aplicação via endovenosa de FNDL por sete dias sobre o leucograma.
Ratos Wistar foram submetidos a aplicações diárias de FNDL e.v. via peniana (10mg/kg) em volume
de 100 µL., por sete dias. No sétimo dia os animais foram sacrificados e o sangue colhido para
contagem total e diferencial de células. Os valores foram expressos em céls/mm
3
. O grupo sham
recebeu apenas 100 µL de salina e.v. diariamente por sete dias. Os dados representam a média ±
EPM. *p<0,05 quando comparado ao grupo não tratado (ANOVA/Bonferroni).
60
0
1
2
3
4
Figado
Coracao
Baco
Rim
sham
FNDL
g/100g de animal
Figura 18 - Efeito da aplicação via endovenosa de FNDL por sete dias sobre o peso fresco dos
órgãos. Ratos Wistar foram submetidos a aplicações diárias de FNDL e.v. via peniana (10mg/kg) em
volume de 100 µL., por sete dias. No sétimo dia os animais foram sacrificados e extraídos fígado,
baço, rins e coração para pesagem. Os valores foram expressos g/100g de peso do animal. O grupo
sham recebeu apenas 100 µL de salina e.v. diariamente por sete dias. Os dados representam a média
± EPM. *p<0,05 quando comparado ao grupo não tratado (ANOVA/Bonferroni).
61
4. DISCUSSÃO
O presente estudo foi desenvolvido com o intuito de investigar a ação de uma
fração não dialisável do látex de Calotropis procera sobre modelos de artrite
experimental e peritonite infecciosa. Tal iniciativa partiu do conhecimento prévio da
efetividade dessa fração em outros modelos experimentais de inflamação (Alencar et
al., 2004 e 2006) e do interesse de buscar alternativas terapêuticas para
enfermidades que envolvem a resposta inflamatória, particularmente a artrite
reumatóide. É importante ressaltar que a planta Calotropis procera é comum e
disponível na flora brasileira, sobretudo nordestina.
De fato, a artrite reumatóide é uma das doenças reumáticas mais comuns e
das que mais acarreta morbidade e incapacidade funcional, por conta da sua
cronicidade e difícil tratamento. Hoje, o arsenal de drogas empregado em sua
terapêutica baseia-se em antiinflamatórios gerais, como os DAINES e corticóides,
principalmente para alívio dos sintomas e as chamadas drogas anti-reumáticas
modificadoras da AR (DARMD), que realmente causam algum impacto sobre a
evolução da doença. Dentre estas destacam-se o metotrexate, um fármaco cuja
atividade antiinflamatória e imunomoduladora deve-se sobretudo a sua ação sobre a
maior disponibilização de adenosina (Chan & Cronstein, 2002), e os inibidores do
TNF - α , como o infliximab e o etanercept. (Maini et al., 1999; Weinblatt et al., 1999),
extremamente caros. Contudo, nenhuma delas esta isenta de efeitos colaterais, que
contribuem para a morbidade da doença. Também não representam ainda uma
solução definitiva, tendo em vista a etiopatogenia complexa da AR.
Dessa forma, é interessante a perspectiva de novos agentes menos
dispendiosos e tóxicos no tratamento da AR, nos despertando para o látex de C
procera, cuja fração não dialisável (FNDL), isolada por nossos colaboradores,
apresenta propriedades antiinflamatórias já constatadas pelo nosso grupo (Alencar et
al., 2004).
O isolamento dessa fração mostrou ser fundamental, tendo em vista a
toxicidade do componente poliisopreno, a borracha, do látex seco. Além disso,
62
facilita a busca específica por moléculas constituintes que sejam responsáveis pela
atividade biológica encontrada.
A partir de procedimentos simples de centrifugação e diálise, dispomos de
duas frações razoavelmente livres desse constituinte, as quais denominamos fração
dialisável (FDL) e fração não dialisável (FNDL), além da fração da borracha (RL)
(Alencar et al., 2006; Freitas, 2006).
A FNDL, obtida após diálise contra água e centrifugação é constituída de
proteínas com diversas massas moleculares, variando de 10-95 kDa, prevalecendo
as de aproximadamente 25-30 kDa, com um teor médio de 8,18 mg/ml e após
liofilização 71,33 % de proteínas solúveis. Esta riqueza protéica foi determinada a
partir de eletroforese em gel de poliacrilamida e espectrometria de massa por nossos
colaboradores (Alencar et al., 2006), além da comprovação de diversas atividades
enzimáticas (Freitas, 2006).
Os modelos utilizados são provavelmente os que melhor mimetizam
experimentalmente o eventos característicos da AR, sendo de fácil reprodutibilidade,
aspectos inflamatórios importantes envolvidos, como a migração celular,
permeabilidade vascular e dor inflamatória.
Com efeito, demonstramos inequivocamente que a FNDL foi capaz de inibir a
migração celular, notadamente de neutrófilos, que são as principais células
recrutadas para o sítio inflamatório nessa fase aguda, após 6 horas de indução da
artrite por zymosan em todas as doses utilizadas e na artrite por mBSA, após 24h de
indução, na dose de 3mg/kg.
A importância desse resultado nos remete ao fato de que nos estágios iniciais
de diversos processos inflamatórios, a célula predominante e primeiramente
recrutada ao foco inflamatório é o neutrófilo (Kubes, 1993; Rossi & Hellewell; 1994).
A migração dos neutrófilos das vênulas pós-capilares até a área lesada é um
processo multimediado, resultante da liberação por células residentes de fatores
quimiotáticos, tais como TNF-α, IL-1-β, PAF, LTB
4
e diversas quimiocinas (Munder et
al., 1993; Binder et al., 1999; Lee et al., 2002). A liberação destes fatores leva a um
aumento nas interações entre os neutrófilos e as células endoteliais com
conseqüente recrutamento destes leucócitos. Este leucócito polimorfonuclear é
63
responsável pela liberação de metabólitos tóxicos do oxigênio, nitrogênio, proteases
e óxido nítrico, os quais, além de serem essenciais para a defesa do hospedeiro
contra microrganismos invasores, também podem causar danos ao próprio tecido do
hospedeiro, adjacente ao local inflamado. Neste sentido, a artrite reumatóide, uma
doença inflamatória de origem imune, é caracterizada pela presença excessiva de
neutrófilos no fluido sinovial das articulações afetadas (Harris, 1990; Firestein, 2003),
sugerindo que parte do dano tecidual observado seja conseqüência da liberação de
substâncias tóxicas por neutrófilos emigrados. Ademais, durante recidivas da artrite
reumatóide ocorre um novo influxo de neutrófilos. O recrutamento de neutrófilos para
o fluido sinovial ocorre como resultado da produção de mediadores quimiotáxicos por
macrófagos ativados, fibroblastos sinoviais e outras células na articulação inflamada
(ver adiante).
Em recente estudo (Soares et al., 2005), a FNDL inibiu, de maneira dose
dependente, as contorções abdominais em camundongos induzidas por ácido
acético e principalmente a segunda fase do teste da formalina, sugerindo que a sua
atividade antinociceptiva é essencialmente de caráter antiinflamatório. Além disso,
observou que a fração atua independente do sistema opióide, já que o naloxone não
reverteu o efeito.
No presente estudo, evidenciamos também o efeito protetor da FNDL sobre a
dor inflamatória, expresso pela redução da incapacidade articular no tempo de
suspensão da pata, com pico de ação às 4h após a indução da artrite por Zy.
Curiosamente, em baixas doses (3mg/kg), a FNDL reduziu significativamente o TSP
em todos os períodos de observação. Esses dados corroboram a atividade
antinociceptiva da FNDL
A FNDL também inibiu significativamente o extravasamento de Azul de Evans
para a cavidade articular na artrite induzida por zymosan, na dose de 3mg/kg. Em
2004, Alencar et al. mostraram que a FNDL inibia o edema de pata induzido por
carragenina, mas não o por dextran. Ou seja, a FNDL deve inibir o aumento da
permeabilidade vascular mediada por células, já que o edema da carragenina é
dependente das células que migram para o sítio inflamatório, diferentemente do
dextran.
64
Esses eventos são considerados gerais, sendo decorrentes de diversos
mecanismos e mediadores inflamatórios, sendo difícil especificar por qual deles
estaria atuando a FNDL neste caso. Contudo, são reconhecidos alguns mediadores
comumente envolvidos em todas estas situações, destacando-se os produtos da
degradação do ácido araquidônico e as citocinas. Frequentemente, as cascatas
enzimáticas, produção e desgranulação e outros processos que disponibilizam estes
mediadores são intercambiáveis e se retroalimentam. Por exemplo, um estímulo
pode desencadear a liberação de histamina e em seguida envolver prostaglandinas
ou aumento de citocinas. (Rang & Dale, 2003)
Dentre as citocinas mais implicadas e considerada peça chave no
desencadeamento de eventos inflamatórios destaca-se o TNF - α , como descrito
anteriormente (Aggarwal e Natarajan, 1996; Taylor e cols., 2004). Vale relembrar sua
importância na fisiopatogenia da AR, sendo crítico seu papel no recrutamento de
neutrófilos para o sítio inflamatório (Canetti et al., 2001; Saunders et al., 2005), tanto
que as drogas neutralizadoras do TNF - α são a última geração de fármacos em
desenvolvimento para o tratamento da doença. (Maini et al., 1999; Fleischmann e
Shealy, 2003).
O TNF - α também é mediador na disfunção da barreira endotelial e, portanto
no aumento da permeabilidade vascular (Neumann et al., 2005).
Além disso, sua ação como mediador hiperalgésico merece destaque, a partir
da sua liberação por macrófagos residentes (Ferreira et al., 1988, Cunha et al.,
1992), agindo indiretamente pelo estímulo a liberação de eicosanóides e
simpaticomiméticos. A ação do TNF – α foi comprovada pela inibição da nocicepção
pela talidomida em diversos modelos experimentais, inclusive na artrite induzida por
zymosan (Vale, 2003).
Dessa forma, observamos ainda que a FNDL reduziu significativamente os
níveis de TNF – α no lavado articular da AZy. Essa ação, se diretamente
relacionada, poderia explicar todas as outras, já que a redução do TNF – α
acarretaria também em inibição da migração celular, da permeabilidade vascular e
da dor inflamatória.
65
Outra ação interessante da FNDL neste estudo foi a redução nos níveis de
adenosina desaminase no fluido sinovial da artrite induzida por zymosan. A redução
da atividade da ADA proporciona uma maior disponibilidade de adenosina, o seu
principal substrato (Cronstein et al., 1995).
A adenosina, como já descrito, é importante agente antiinflamatório, devido
sua potente ação supressora em virtualmente todas as células do sistema
imunológico (Hasko & Cronstein, 2004). Atua em quatro receptores ligados a
proteína G reconhecidos até o momento, sendo os subtipos A
2
os mais implicados
na modulação da inflamação. Já foi estabelecido que a adenosina inibe a produção
de ânion superóxido, desgranulação e adesão de neutrófilos (Firenstein et al, 1995;
Bouma et al., 1996; Hasko & Cronstein, 2004), liberação de citocinas pró
inflamatórias (Bouma et al., 1996; Parmely et al, 1993), síntese de LTB4 (Krump et
al, 1996), liberação de histamina pelos basófilos (Marone et al, 1979) e na inibição da
liberação de TNF – α por macrófagos (Kreckler et al., 2006).
Curiosamente, o metotrexate, principal droga antiinflamatória modificadora da
doença (DMARD) utilizada no tratamento da AR, desempenha sua função
justamente pela ação da adenosina, por conta de uma inibição indireta da ADA
(Chan & Cronstein, 2002). O MTX foi desenvolvido inicialmente como antagonista
específico do folato, detendo assim características anti-proliferativas, de inibição da
síntese de purinas e pirimidinas, que poderiam ser aproveitadas na AR, passando a
ser administrado em baixas doses com excelentes efeitos antiinflamatórios já bem
caracterizados sobre neutrófilos e macrófagos, os quais se acredita desempenharem
papel central na fisiopatologia da AR e sinovite inflamatória (Cronstein et al., 1991;
Cronstein,1997; Genestier et al., 1998; Hu et al.,1988). Contudo a reposição de ácido
fólico melhora os efeitos colaterais sem interferir na ação do MTX, indicando,
portanto, que a sua atividade antiinflamatória não está relacionada à sua
característica anti-proliferativa primordial (Ortiz et al., 2000, Shiroky, 1997).
A hipótese mais investigada e aceita até o momento é que o MTX em baixas
doses é capaz ainda de aumentar a expressão da enzima AICAR, passo importante
no ciclo do folato, a qual reduz a atividade da ADA, o que promove o aumento da
adenosina (Chan & Cronstein, 2002). A piora na resposta clínica de pacientes com
66
AR em uso de cafeína, um antagonista não-seletivo dos receptores de adenosina,
reforça esta hipótese (Silke et al., 2001). Em 1993, Cronstein et al. mostraram que
um antagonista específico do receptor A
2A
, como também a administração de ADA,
revertia os efeitos antiinflamatórios do MTX em um modelo de inflamação induzido
por carragenina.
A semelhança entre a FNDL e o MTX não consiste apenas na redução dos
níveis de ADA, mas também é notável que ambas atuem com grande efetividade em
baixas doses. De fato, a dose mais baixa utilizada de FNDL, 3mg/kg foi a única
capaz de reduzir o TSP da segunda à quinta hora na AZy, enquanto as outras doses
só o fizeram na quarta hora. No IC houve a mesma tendência, apesar de não ter
havido diferença estatisticamente significativa entre as doses, na AZy. Tanto foi a
sua eficácia que a dose de 3mg/kg foi escolhida como inicial na avaliação da
permeabilidade vascular e no impacto sobre o quadro histopatológico na AZy, como
também no estudo do IC na AIA, mostrando-se mais uma vez efetiva.
É importante ressaltar que uma das ações mais importantes da adenosina é
inibição na secreção de TNF- α (Kreckler et al., 2006), a partir de uma ação
preferencial sobre os receptores A
2
, o qual aumenta o AMPc intracelular.
Ora, é inevitável então correlacionar a ação da FNDL com uma inibição da
ADA e consequentemente aumento da adenosina, já que isto explicaria todos os
resultados encontrados até então comentados. Porém, essa relação seria direta,
como no caso do MTX?
O mecanismo de ação da FNDL ainda não foi elucidado. Contudo algumas
hipóteses já foram lançadas.
Em recente estudo de 2006, Alencar et al. testaram o efeito da fração
dialisável (FDL) e não dialisável (FNDL) do látex de C procera, constatando que a
FDL apresentava uma ação pró-inflamatória ao induzir migração celular para
cavidade peritoneal após injeção i.p. Essa atividade era revertida pela talidomida
(inibidor de TNF – α), meclizina (antagonista específico da histamina) e por
glicocorticóides (dexametasona), como também pela FNDL, mas não por inibidores
da COX (indometacina e celecoxib). Dessa forma, foi proposto que a atividade
inflamatória da FDL poderia estar relacionada a um aumento na produção de
67
histamina, como já havia sido suscitado por Shivkar e Kumar (2003), de TNF – α, ou
de produtos da degradação do ácido araquidônico não relativos à via da
cicloxigenase. Por conseqüência, é de se esperar que a ação antiinflamatória da
FNDL esteja também relacionada a algum desses mecanismos ou outros que ainda
não tinham sido avaliados.
Pelo que foi exposto acima, os resultados nos encorajam a sugerir e
prosseguir investigação quanto a um possível mecanismo de ação da FNDL
relacionado a uma inibição da síntese de TNF – α, direta ou indiretamente, como já
havia sido suscitado, ou por meio de um mecanismo originalmente aqui proposto, por
meio de inibição da ADA e liberação de adenosina, cuja via mais conhecida até o
momento é aquela associada ao MTX.
De qualquer forma, o simples fato da FNDL inibir os principais eventos
inflamatórios da AR e o principal mediador implicado, o TNF – α, além de reduzir a
atividade da ADA, à semelhança do MTX, tornam a droga especialmente
interessante como ferramenta terapêutica no manejo da AR, demandando novos
experimentos relacionados à artrite.
Outro resultado importante da FNDL digno de nota foi a melhora no quadro
histopatológico na sinovite por zymosan, expresso por menor infiltrado inflamatório e
edema, redução do espessamento sinovial, preservando a arquitetura do tecido. Esta
ação demonstra um caráter protetor da articulação, contudo podendo ser explicado
simplesmente pela inibição da inflamação. Seria interessante avaliar, a posteriori, se
a FNDL desempenharia um papel protetor a longo prazo, em um experimento
crônico, o que melhor a caracterizaria como uma droga modificadora da evolução da
sinovite.
A FNDL mostrou-se efetiva também em reduzir o influxo de neutrófilos para
cavidade abdominal na peritonite infecciosa em camundongos, bem como os níveis
de ADA no fluido peritoneal, mais uma vez comprovando seu efeito antiinflamatório
em outro modelo experimental.
No caso da peritonite infecciosa por ligadura e punção cecal, outra via de
estímulo inflamatório que deve ser lembrada é a do LPS, tendo em vista tratar-se de
68
uma infecção polimicrobiana com envolvimento de bactérias Gram negativas que
liberam LPS. Este ativa macrófagos, neutrófilos e células endoteliais através do
receptor TLR-4 (Ingalls et al., 1999), favorecendo a produção de citocinas como o
TNF – α e IL-1β. Novamente, como na artrite, as citocinas, notadamente o TNF – α,
orquestram os demais eventos inflamatórios, como a migração celular, a dor
inflamatória e o aumento da permeabilidade vascular.
Infelizmente este modelo de peritonite não pôde ser plenamente aproveitado
até agora, tendo em vista a dificuldade de técnica do modelo em camundongos,
principalmente no que diz respeito ao procedimento anestésico durante o ato
cirúrgico. Dessa forma, obtivemos poucos resultados fidedignos, apenas com a dose
de 10mg/kg.
A maioria dos estudos de inflamação com látex de outras plantas na literatura
geralmente mostram atividade pró-inflamatória (Gupta et al., 1994), sendo poucos os
relatos de ação antiinflamatória, constituindo outro aspecto relevante deste trabalho.
Diante da comprovação do efeito antiinflamatório da FNDL nestes modelos de
artrite e peritonite infecciosa, por mecanismos que precisam ainda ser mais
profundamente investigados, resta também saber qual componente desta fração
seria o responsável por essa atividade.
Considerando que a FNDL é rica em proteínas solúveis e desprovida de
borracha e pequenos metabólitos, é sugestivo que as moléculas envolvidas sejam de
natureza protéica. Essa hipótese já havia sido suscitada por Alencar et al. (2004), já
que a atividade antiinflamatória sobre a cistite hemorrágica, edema de pata e
peritonite induzidas por carragenina foi abolida pelo aquecimento da amostra.
O fato de aparentemente ser mais efetiva em baixas doses é intrigante e
consiste em outro indicador favorável a uma proteína. Para exercer uma atividade
biológica, a partir de uma ligação a um alvo, como um receptor celular, as proteínas
necessitam atuar em estado solúvel. Sendo assim, como a quantidade de volume
administrado de FNDL diluído em salina neste estudo foi constante, doses mais
baixas proporcionam boa solubilidade enquanto doses maiores acarretam em
saturação da solução.
69
Novos procedimentos de fracionamento, como a cromatografia, nos
proporcionarão a possibilidade de limitar e caracterizar melhor a molécula
responsável pelo efeito antiinflamatório da FNDL
Por fim, observamos ainda que na dose de 10 mg/kg, administrada
diariamente por uma semana, a FNDL não incitou alterações significativas no
leucograma, na função renal, na integridade hepática e no peso de órgãos
selecionados. Isso sugere que, nesta dose, a FNDL é uma droga segura, não
apresentando parâmetros de toxicidade. Isto vem a fortalecer a idéia de que a
toxicidade do látex de Calotropis procera está relacionada à borracha ou a moléculas
de baixo peso molecular, como aventado em estudo de 2007 (Ramos et al).
70
5. CONCLUSÕES
- A Fração Não-Dialisável do Látex de Calotropis procera (FNDL) inibiu a
migração celular nos modelos experimentais de artrite (AZy e AIA) e
peritonite infecciosa;
- A FNDL apresenta atividade antinociceptiva no modelo de artrite por
zymosan;
- A FNDL inibiu o aumento da permeabilidade vascular na AZy;
- A FNDL reduziu os níveis de TNF –α na AZy;
- A FNDL reduziu os níveis de ADA na AZy e PI;
- A FNDL induziu melhora no quadro histopatológico da AZy;
- A FNDL apresenta atividade antiinflamatória nos modelos AZy, AIA e
PI;
- Essa atividade está relacionada, direta ou indiretamente, a um
antagonismo ao TNF –α e, possivelmente, a um aumento dos níveis de
adenosina no sítio inflamatório;
- O componente da FNDL responsável pelos seus efeitos
antiinflamatórios é de provável natureza protéica;
- Em doses farmacológicas em ratos, a FNDL não apresentou sinais de
toxicidade.
71
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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