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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL
FACULDADE DE MEDICINA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS MÉDICAS:
PEDIATRIA
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CRISTINA DE CARVALHO DORNELLES
TESE DE DOUTORADO
Porto Alegre, Brasil
2008
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL
FACULDADE DE MEDICINA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS MÉDICAS:
PEDIATRIA
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Cristina de Carvalho Dornelles
Orientador: Prof. Dr. Sady Selaimen da Costa
Co-Orientadora: Profª Drª Luíse Meurer
A apresentação dessa tese é exigência do Programa de
Pós-Graduação em Ciências Médicas: Pediatria, da
Universidade Federal do Rio Grande do Sul, para a
obtenção do título de Doutora.
Porto Alegre, Brasil
2008
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Catalogação Biblioteca FAMED/HCPA
D713a Dornelles, Cristina de Carvalho
Angiogênese e metaloproteinases 2 e 9 : estudo comparativo entre
colesteatoma adquiridos de pacientes pediátricos e adultos / Cristina de
Carvalho Dornelles ; orient. Sady Selaimen da Costa ; co-orient. Luíse
Meurer. – 2008.
155 f.
Tese (doutorado) – Universidade Federal Rio Grande do Sul.
Faculdade de Medicina. Programa de Pós-Graduação em Ciências
Médicas: Pediatria. Porto Alegre, BR-RS, 2008.
1. Colesteatoma 2. Criança 3. Adulto 4. Neovascularização
patológica 5. Metaloproteases I. Costa, Sady Selaimen da II. Meurer,
Luíse III. Título.
NLM: QZ 275
“Pois o que Heu tenho de valor, Heu te dou, é o meu amor, é teu...”Hélder dos Santos Corrêa
“Se consegui ver tão longe, é por que me apoiei nos ombros de outros homens” Isaac Newton
Dedico essa tese aos meus grandes amores: Manuella e Nathálie, pois sem a compreensão
delas, ao aceitarem minha ausência nesses anos, mais este grande passo em minha vida não teria sido
possível.
Também dedico ao meu eterno e confuso amor: Beto
Minha vida teve muitos marcos em 2008, porém a morte de minha filha foi o derradeiro,
fundamental e crucial momento de virada em minha vida, por isto esta tese é para ela!
Nathálie: te amei, te amo e sempre amarei.
Agradecimentos
Ao Prof. Dr. Sady Selaimen da Costa, orientador dessa tese, por todo seu apoio,
compreensão e exigência; por sua instigante sede de conhecimento; mas, principalmente,
por sua confiança e amizade.
À Profª Drª Luíse Meurer, co-orientadora, por sua prestimosa ajuda e interesse, mas,
sobretudo, por ter se tornado uma amiga fiel.
À Profª Drª Newra Telechea Rotta, pelos inestimáveis conselhos, pela dedicação ao
ensino e por sua paixão à educação, no sentido mais amplo que este substantivo possa ter.
Ao Prof. Arnaldo Linden, por ser uma fonte de inspiração a muitos pesquisadores da
otologia.
Aos médicos Dr. Celso Dall´Igna, Prof. Dr. Oswaldo Laércio Cruz, Prof. Dr. Luís
Lavinsky e Simão Piltcher, pelo auxílio na coleta das amostras.
Ao Prof. Dr. Carlos Thadeu Cerski, por sua importante contribuição na montagem e
desenvolvimento do projeto.
vii
Ao Prof. Dr. João Carlos Prolla, pela gentileza e hospitalidade, as quais muito
contribuíram para a execução do projeto.
Às minhas filhas, razões de minha existência, luzes de minha vida, paixões eternas.
À minha mãe, Helena Costa de Carvalho, in memorian, por ter sido a pessoa que
segurou minha mão quando eu estava perdida e solitária.
À minha irmã, Ceres Carvalho Marzano, por ser meu exemplo de vida.
Ao doce Hélder dos Santos Corrêa - Deco, por sempre dizer-me o quanto sou
especial, ou melhor “mais que especial”, por ficar sempre ao meu lado, por ter aparecido e
ancorado em meu porto, por amar-me e deixar-se ser amado, simplesmente por existir e
deixar este mundo mais belo e gracioso.
À amiga Josiane Spolavori Lopes, por ter vindo a este mundo para me encontrar e
me acompanhar, por me entender num olhar e me amar apesar de todos os meus defeitos.
À amiga Paola Feltz Amaro, meu anjo particular, que encanta a tudo e a todos com
seu carinho e seu sorriso contagiante.
À amiga Letícia Petersen Schmidt Rosito, por ser um ancoradouro seguro na horas
de turbulência
À amiga Lílian Sander - Binha, por ser meu ombro, por me dar seu sorriso, por
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derramar lágrimas ao meu lado.
À amiga Lisiane Segato Kruse, por sua inestimável contribuição à elaboração de
textos e artigos, pelo grande estímulo e confiança e, principalmente, pelas frutíferas horas
dedicadas à discussão de assuntos “científicos”.
À acadêmica de medicina Andréia Argenta, amiga, companheira, por seu auxílio
indispensável em todos os nossos trabalhos.
Ao amigo Andrei Roberto da Silva, pelos auxílios, acadêmicos e extra-acadêmicos.
Aos, atuais e passados, Residentes do Serviço de Otorrinolaringologia do Hospital de
Clínicas de Porto Alegre, pela dedicação na coleta das amostras utilizadas neste trabalho.
Aos funcionários do Serviço de Otorrinolaringologia e do Serviço de Patologia do
Hospital de Clínicas de Porto Alegre, por sua ajuda.
Aos serviços de Patologia e Otorrinolaringologia do Hospital de Clínicas de Porto
Alegre, pela cedência de suas instalações.
À Comissão de Seleção do Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas:
Pediatria, pela confiança em mim depositada.
Ao Grupo de Pesquisa e Pós-Graduação do Hospital de Clínicas de Porto Alegre e ao
Fundo de Investimento à Pesquisa e Eventos, pelo apoio e financiamento concedido.
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Aos pacientes que aceitaram participar dessa pesquisa, pois sem eles nenhuma
dessas páginas estaria escrita.
A todas as pessoas que, direta ou indiretamente, contribuíram para a execução dessa
pesquisa.
x
Sumário
PARTE I - PRESSUPOSTOS TEÓRICOS
Revisão da Literatura...............................................................................................
1.1 O Vocábulo............................................................................................
1.2 Definição................................................................................................
1.3 Epidemiologia........................................................................................
1.4 Classificação..........................................................................................
1.5 Etiopatogênese.......................................................................................
1.6 Estrutura.................................................................................................
1.7 Biologia do Colesteatoma......................................................................
1.8 Angiogênese e Densidade Microvadcular: Marcadores de inflamação.
1.9 Poder de Erosão Óssea...........................................................................
1.10 Colágeno e Metaloproteinases.............................................................
1.11 Metaloproteinases................................................................................
PARTE II - A PESQUISA
Justificativa..............................................................................................................
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Objetivos..................................................................................................................
3.1 Objetivo Geral.......................................................................................
3.2 Objetivos Específicos............................................................................
Métodos...................................................................................................................
4.1 Delineamento.........................................................................................
4.2 Pacientes................................................................................................
4.3 Processo de Amostragem.......................................................................
4.3.1 Cálculo de Tamanho da Amostra............................................
4.3.2 Critérios de Inclusão...............................................................
4.3.3 Critérios de Exclusão..............................................................
4.4 Colesteatomas........................................................................................
4.5 Descrição Histológica............................................................................
4.6 Medição da Perimatriz...........................................................................
4.7 Imunoistoquímica..................................................................................
4.8 Considerações Éticas.............................................................................
4.9 Análise Estatística..................................................................................
Resultados................................................................................................................
5.1 Dados Epidemiológicos.........................................................................
5.2 Dados Histológicos................................................................................
5.3 Dados Imunoistoquímicos.....................................................................
Discussão.................................................................................................................
Conclusões...............................................................................................................
Referências Bibligráficas.........................................................................................
Anexos......................................................................................................................
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xii
Lista de Abreviaturas
Å - Angstron
β-FGF – Fator de Crescimento de Fibroblastos
AOMC-HCPA – Ambulatório de Otite Média Crônica no Hospital de Clínicas de Porto
Alegre
CD11a - molécula que faz parte da integrina LFA-1 (leukocyte function-associated antigen-1)
presente na superfície de leucócitos
CD11b - integrina leucocitária
CD14 - marcador de monócito
CD19 - antígeno linfocitário
CD22 - antigénio de superfície de linfócitos B
CD25 - antígeno linfocitário
CD3 - antígeno linfocitário
CD31 - marcador de células endoteliais
CD34 - marcador de células endoteliais
CD44 - receptor para ácido hialurônico
CD45 - antígeno comum leucocitário
CD51 – receptor de integrina
CD68 – marcador de macrófagos
xiii
Ck 16 – Citoqueratina 16
dB - decibel
DNA – Ácido Desoxirribonucléico
EFG – Fator de Crescimento Epitelial
HE – Coloração Histológica em Hematoxilina-Eosina
HLA-DR - molécula do complexo de histocompatibilidade
IGF - Fator de Crescimento Semelhante à Insulina
IL-1 – Interlecucina 1
IL-1α - Interleucina 1 alfa
IL-6 – Interlecucina 6
IL-8 – Interlecucina 8
Ki 67 – Antígeno Nuclear
M-CSF - Fator Estimulante de Colônias de Macrófagos
ME – Microscópio Eletrônico
MIB1 – marcador de proliferação celular
µm – Micrômetro
MMP – Metaloproteinases
MMP2 - Metaloproteinase 2
MMP9 - Metaloproteinase 9
MO – Microscopia Óptica
MT1MMP – Metaloproteinase Trans-membrana
NKCA - Células Natural Killer
NO – Óxido Nítrico
OCL – Orelha Contra Lateral
OMC – Otite Média Crônica
xiv
OMCC – Otite Média Crônica Colesteatomatosa
OMCNC – Otite Média Crônica Não-Colesteatomatosa
OPG - Osteoprotegerina
OPGL - Ligante de Osteoprotegerina
PCR – Reação em Cadeia de Polimerase
PDGF - Factor de Crescimento Derivado da Plaqueta
PGE
2
- Prostaglandina E2
proMMP – pró-enzima de metaloproteinase
183
RWTNNFREY - sítio catalítico da metaloproteinase 1
S156C – mutante de substituição de uma serotonina por uma cisteina na posição 156 na
TIMP-3
S181C – mutante de substituição de uma serotonina por uma cisteina na posição 181 na
TIMP-3
SPSS – Statistical Package for Social Science
Terminação C – Terminação Carboxila
Terminação N – Terminação Amino
TGF – Fator de Crescimento Tumoral
TGFβ - Fator de Transformação de Crescimento-beta
TIMP – inibidor tecidual de metaloproteinase
TNF – Fator de Necrose Tumoral
VEGF – Fator de Crescimento do Endotélio Vascular
xv
Lista de Figuras
Figura 1: Cortes histológicos de espécimes de colesteatomas, corados em hematoxilina-
eosina, mostrando a variabilidade da espessura da perimatriz. A e B - Perimatriz ausente
(400x), C e D - Perimatriz muito estreita (200x), E e F – Perimatriz expessa (100x)..............
8
Figura 2: Otoscopias de dois pacientes do AOMC-HCPA. Em A: Otite Média Crônica Não-
Colesteatomatosa. Em B: Otite Média Crônica Colesteatomatosa............................................
15
Figura 3: Cortes transversais de colesteatomas corados em Picrossírios. A – perimatriz; B –
matriz; C – conteúdo cístico......................................................................................................
26
Figura 4: ativação seqüencial de proMMP. A proMMP é secretada como zimogene inativa e
pode ser ativada por proteinases (caminho superior) ou por agentes de não proteolíticos
(caminho inferior). A atividade plena resulta da remoção da sobra do propeptídeo por
processamento intermolecular. Adaptado de Nagase et al. (2006)...........................................
29
Figura 5: Resumo dos diferentes tipos de células que produzem MMP e TIMP. A matriz do
colesteatoma pode desencadear a resposta imunológica com ativação de diferentes células
na perimatriz, tais como macrófagos, fibroblastos, e leucócitos, liberando citocinas, tal
como a interleucina-1 (IL-1) e o Fator de Necrose Tumoral (TNF α). As células
imunológicas, ativadas, também podem liberar tanto MMP como TIMP. Sob condições
fisiológicas, há um equilíbrio de MMP/TIMP. Reações inflamatórias levam a uma
desigualdade entre MMP e para TIMP, podendo levar à remodelação da matriz extracelular.
32
Figura 6: Imagem digitalizada de lâmina, com corte transversal de colesteatoma, corada em
Hematoxilina-Eosina. Podemos ver suas três partes constituintes: A – perimatriz, B –
matriz, C – conteúdo cístico. Aumento: 100x...........................................................................
41
xvi
Figura 7: Nessa imagem podemos ver a mesma amostra corada em HE (A), Picrossírios
(B). CD31 (C), MMP2 (D), MMP9 (E). Aumento: 40x (A e B), 200x (C e D)........................
43
Figura 8: Imagem capturada no programa ImagePro Plus, representando o módulo de
medição. Aumento: 100x...........................................................................................................
45
Figura 9: Imagem capturada no programa ImagePro Plus, representando o módulo de
quantificação da MMP9. Aumento: 200x..................................................................................
47
Figura 10: Fluxograma da inclusão e distribuição da amostra.................................................. 51
Figura 11: Colesteatomas representativos da amostra, ilustrando seus constituintes
histológicos. 1 – Perimatriz, 2 – Matriz, 3 – Conteúdo Cístico. A – Colesteatoma
epitimpânico, proveniente de paciente do gênero feminino, com 44 anos de idade.
Histologicamente apresenta-se como epitélio escamosos estratificado, queratinizado, com
média de três camadas de células. Perimatriz ausente. Aumento: 200x. B – Colesteatoma
epitimpânico, proveniente de paciente do gênero masculino, com 37 anos de idade.
Histologicamente apresenta-se como epitélio escamoso estratificado, queratinizado, com
média de seis camadas de células. Perimatriz estreita, fibrótica, com raros linfócitos.
Ausência de granuloma. Aumento: 200x. C – Colesteatoma mesotimpânico, proveniente de
paciente do gênero feminino, com 35 anos de idade. Histologicamente apresenta-se como
epitélio escamoso estratificado, queratinizado, com média de quatro camadas de células.
Perimatriz muito estreita, sem fibrose e sem infiltrado inflamatório. Aumento: 200x. D -
Colesteatoma mesotimpânico, proveniente de paciente do gênero masculino, com 16 anos
de idade. Histologicamente apresenta-se como epitélio escamoso estratificado,
queratinizado, com média de seis camadas de células. Perimatriz estreita e delicada, sem
fibrose e com infiltrado inflamatório discreto. Aumento: 200x. E - Colesteatoma
epitimpânico, proveniente de paciente do gênero feminino, com 11 anos de idade.
Histologicamente apresenta-se como epitélio escamoso estratificado, queratinizado, com
xvii
média de doze camadas de células epiteliais. A perimatriz exibe fibrose densa, infiltrado
inflamatório crônico acentuado e está delimitada em seu plano profundo por epitélio
cubóide simples. Aumento: 50x. F - Colesteatoma mesotimpânico, proveniente de paciente
do gênero feminino, com sete anos de idade. Histologicamente apresenta-se como epitélio
escamoso estratificado, queratinizado, com média de treze camadas de células. Perimatriz
mostra fibrose discreta com infiltrado inflamatório acentuado e exsudação neutrocitária,
estando delimitada em seu plano profundo por epitélio cubóide simples. Ausência de
granulomas. Aumento: 50x........................................................................................................
52
Figura 12: Colesteatoma marcado com CD 31. Aumento: 200x...............................................
55
Figura 13: Colesteatoma marcado com MMP2 no citoplasma. Aumento: 200x................... 56
Figura 14: Colesteatoma marcado com MMP2 no núcleo. Aumento: 200x.......................... 57
Figura 15: Colesteatoma marcado com MMP9 no citoplasma. Aumento: 200x................... 58
Figura 16: Representação esquemática de possíveis eventos decorrentes de uma retração
timpânica, com o toque dessa na cadeia ossicular.....................................................................
69
Figura 17: Hipótese de patogênese dos colesteatomas adquiridos............................................ 77
xviii
Lista de Tabelas
Tabela 1: Comparação dos grupos pediátrico e adultos quanto às características
histomorfológicas do colesteatoma......................................................................................
54
Tabela 2: Comparação das variáveis estudas entre os grupos Pediátrico e Adulto............ 58
Tabela 3: Correlações encontradas entre as variáveis estudadas........................................ 59
xix
Lista de Quadros
Quadro 1: Principais hipóteses para a etiopatogênese dos colesteatomas............... 4
xx
Anexos
Anexo 1: Protocolo de 1ª Consulta no Ambulatório de Otite Média Crônica do HCPA....... 94
Anexo 2: Termo de Consentimento Livre e Informado..........................................................
96
Anexo 3: Carta de Aprovação do Grupo de Pesquisa e Pós-Graduação do HCPA................ 97
Anexo 4: Descrição demográfica da amostra........................................................................
98
Anexo 5: Artigo para publicação: Comparison of acquired cholesteatomas in adult and
pediatric patients using MMP2 and MMP9 markers for immunohistochemistry analysis.....
100
Anexo 6: Carta de recebimento do artigo para publicação..................................................... 128
Anexo 7: CD com coleção histológica................................................................................... 129
xxi
Resumo
A quantificação da angiogênese e das metaloproteinases pode ser útil na avaliação do
comportamento dos colesteatomas, como marcadores de sua agressividade. Objetivo:
Comparar os marcadores CD31, MMP2 e MMP9 entre pacientes pediátricos e adultos.
Método: transversal. Grupos pediátricos(até 18 anos) e adultos(a partir de 19 anos). Coletados
120 colesteatomas, fixados em formol a 10%, preparadas cinco lâminas, de cada amostra, por
técnicas histológicas habituais, observados: número de vasos sangüíneos(CD 31), marcação
com MMP2 e MMP9, número de células na matriz e espessura na perimatriz. Dados
analisados no SPSS através coeficiente Spearman e Mann-Whitney. Resultados: Colesteatomas
distribuídos igualmente: 60 pediátricos(11,77±3,57anos); 60 adultos(38,29±14,51anos).
CD31pediátrico 7(4 a 11), CD31adulto 4(0 a 10) (P=0,044). MMP2citoplasmática pediátrico
1(0 a 3), MMP2citoplasmática adulto 0(0 a 1) (P=0,006). MMP2nuclear pediátrico 0(0 a 1),
MMP2nuclear adulto 0(0 a 1) (P=0,056). MMP9 pediátrico 2(0 a 4), MMP9 adulto 0(0 a 4)
(P=0,049). Ao correlacionarmos o número de vasos sangüíneos e das metaloproteinases com a
espessura da perimatriz. Conclusões: Os colesteatomas pediátricos apresentam um grau
inflamatório mais exacerbado, produzem mais metaloproteinases, fatores estes, que
conjugados, poderiam caracterizar os colesteatomas pediátricos como mais agressivos que os
colesteatomas adultos.
Palavras-Chave: Colesteatoma, Perimatriz, Inflamação, Angiogênese, Metaloproteinases
xxii
Abstract
Cholesteatoma is an epidermal cyst with three distinct components: matrix, perimatrix
and cystic content. The clinical significance of cholesteatoma lies in its association with
potential intracranial complications due to bone destruction. Objective: To compare
histological and immunohistochemistry analysis between pediatric and adult acquired.
Methods: Cross-sectional study. The patients were divided in two groups, according to their
age: 60 adults(>18 years old) and 60 children(until 18 years old). They were fixed in formol
10%. Five slides from each sample were prepared using standard histology techniques. Slides
were analyzed according to average number of blood vessels (CD31), MMP2 and MMP9
positivity and thickness of the perimatrix. Data was analyzed using Mann-Whitney and
Fisher's exact tests, with P values<0.05 considered significant. Results: Perimatrix thickness
was 78(34-217); CD31 was 6(0-11), cytoplasmic MMP2 positivity was 0(0-2), nuclear
MMP2 positivity was 0(0-1); MMP9 positivity was 2(0-4). Statistical difference, between
children and adults, was found in perimatrix thickness(P=0.014); blood vessels(P=0.044);
cytoplasmic MMP2(P=0.006), nuclear MMP2(P=0.056); MMP9(P=0.049). Conclusions:
Pediatric cholesteatomas have a thicker perimatrix, a greater degree of inflammation, and
produce more metalloproteinases than those of adult patients, we can suggest, with the
combination of these factors, that cholesteatoma is more aggressive in children than in adults.
KEY WORDS: Cholesteatoma, Perimatrix, Inflammation, Angiogenesis, Metalloproteinases
xxiii
Introdução
O colesteatoma é uma doença caracterizada pela presença de epitélio escamoso
estratificado queratinizado no interior de qualquer área pneumatizada do osso temporal
(Schuknecht, 1974). Histologicamente, é constituído por matriz (epitélio), perimatriz (tecido
conjuntivo subepitelial) e conteúdo cístico (lamelas de queratina) (Lim e Saund, 1972).
Os colesteatomas têm sido tema de numerosos estudos clínicos, cirúrgicos histológicos
e experimentais com o objetivo de desvendar suas múltiplas características etipatogênicas
e,assim, abortar o seu desenvolvimento ou, quando estabelecido, aprimorar o seu tratamento
(Albino et al., 1998b; Aumente et al., 1996; Axon et al., 1999; Bernal-Sprenkelsen et al.,
2001; Bollmann et al., 1991; Broekaert et al., 1992; Bujia et al., 1996a; Bujia et al., 1996b;
Chao e Shen, 1996; Chole et al., 2001a; Chole et al., 2001b; Chole et al., 2002; Costa et al.,
1992; Cruz et al., 2003; Cureoglu, 2004; Darrouzedt et al., 2000; Desloge et al., 1997b;
Dornelles et al., 2002; Edelstein, 1989; Ergun et al., 1994; Glasscock et al., 1981; Goycoolea
et al., 1999; Hamzei et al., 2003; Hildmann e Sudhoff, 1999; Hueb, 1997; Jahnke e Falk,
1976; Jansen, 1978; Junh e Paparella, 1976; Kim e Chung, 1999; Lim e Saunders, 1972; Lino
et al., 1998; Marcato et al., 1991; Mayot et al., 1991; Milewski et al., 1998b; Mitrovic, 1991;
Palva et al., 1997; Palva et al., 2000; Pereira, 1997; Pereira et al., 2002; Quaranta et al., 1986;
Rignér et al., 1991; Scheibe et al., 2002; Schmidt e Hellstrom, 1994; Sheehy, 1978; Sheehy,
1985; Sien, 1996; Stankovic, 2003; Sudhoff et al., 1996; Sudhoff et al., 2000; Sudhoff e Tos,
xxiv
2000; Tomita, 2000; Toner e Smyth, 1990; Tos, 1983; Vartiainen, 1993).Ainda assim, apesar
desta verdadeira enxurrada de publicações acerca desta doença, várias questões restam em
aberto. Como exemplo, muito ainda se discute sobre as possíveis diferenças estruturais entre
os colesteatomas que se desenvolvem na populações pediátrica e adulta. Estas interrogações
obviamente extrapolam a esfera do simples conhecimento da ultra-estrutura desta prevalente
patologia com implicações profundas e críticas na sua abordagem clínica e cirúrgica.
A literatura é pródiga em estampar estas dúvidas e uma revisão cuidadosa não revela
uma uniformidade de pensamentos e condutas. Ao contrário, as controvérsias sobejam quando
o foco da discussão é direcionado à procura da melhor abordagem cirúrgica em crianças com
colesteatoma. Jansen (1978), Sheehy (1978) e Glasscock (1981) preferem técnicas cirúrgicas
mais conservadoras, com o objetivo de preservação anatômica e funcional das estruturas da
orelha média. Jahnke e Falk (1976) e Palva et al. (1997) são favoráveis a um manejo mais
agressivo para evitar a ocorrência de doença residual ou recorrente e as complicações
associadas.
A discussão quanto ao manejo dos colesteatomas está acompanhada de resultados
conflitantes em estudos a respeito do comportamento clínico destes, em crianças, quando
comparados com os de adultos (Jansen, 1978; Sheehy, 1978; Glasscock, 1981; Jahnke e Falk,
1976; Palva et al., 1997). Muitos autores sugerem que os colesteatomas pediátricos sejam
mais agressivos, mostrando uma alta atividade proliferativa e com incidência mais alta de
recorrência (Edelstein et al., 1988; Galsscock, 1981; Palva et al., 1997), porém outros
reportam baixas taxas de complicação e menores índices de expansão (Sanna et al., 1994;
Sheehy, 1978; Tos, 1983). Iwanaga e Yamamoto (1986) sugeriram que o potencial invasivo
dos colesteatomas poderia estar diretamente relacionado à atividade colagenolítica da
perimatriz. Para Quaranta et al. (1986), a patogenia do colesteatoma em crianças está
intimamente ligada a essa hipótese, visto que, para estes autores, aparentemente, a otite média
xxv
crônica colesteatomatosa é mais agressiva quando ocorre na infância do que quando em
adultos. Porém, Hildmann e Sudhoff (1999) sugeriram que as complicações, a destruição
ossicular e o comportamento biológico dos colesteatomas possam estar relacionados mais
com o estado de pneumatização da mastóide, com a duração da doença e com o grau de
inflamação, do que com a idade do paciente. Essa controvérsia persiste porque, até o
momento, foram encontradas poucas diferenças histológicas e bioquímicas, porém não
conclusivas, que justifiquem essas aparentes divergências clínicas entre as faixas etárias.
Outras questões fundamentais, ainda sem respostas, estão relacionadas à patogênese
dos colesteatomas. Qual a origem do epitélio escamoso estratificado? Qual a influência do
comportamento invasivo e proliferativo da epiderme? Muitos trabalhos (Bernal-Sprekelsen et
al., 2001; Broekaert et al., 1992; Bujia et al., 1996a; Chao e Shen, 1996; Chole et al., 2002;
Cureoglu, 2004; Durko e Kaczmarczyk, 2004; Ergun et al., 1994; Goycoolea et al., 1999;
Hamzei et al., 2003; Hassmann-Poznanska et al., 2003; Jacob et al., 2001; Kuijpers et al.,
1996; Lepercque et al., 1993; Marenda e Audfemorte, 1995; Milewski et al., 1998b; Nair et
al., 2004; Pereira, 1997; Pereira et al., 2002; Shinoda e Huang, 1995; Sudhoff et al., 1996;
Sudhoff e Tos, 2000; Sudhoff et al., 2004; Tanaka et al., 1998; Tomita, 2000) tentaram, sem
sucesso, responder plenamente a essas interrogações. Acreditamos que um dos caminhos para
esclarecê-las poderá ser encontrado no conhecimento aprofundado das características
bioquímicas e biofísicas dos colesteatomas.
Meu interesse em estudar os colesteatomas iniciou-se com a implantação, no ano de
2000, do Ambulatório de Otite Média Crônica no Hospital de Clínicas de Porto Alegre
(AOMC-HCPA).
Especificamente, o tema dessa tese surgiu durante a realização de minha dissertação
de mestrado (Dornelles et al., 2006) na qual encontrei evidências de que há correlação inversa
entre o tamanho da perimatriz, medida em micrômetros, com a idade do paciente na data da
xxvi
cirurgia, e uma correlação direta da perimatriz com o número médio de camadas celulares na
matriz. Essas correlações levam-nos a pensar na existência de um estado proliferativo mais
acentuado nos colesteatomas pediátricos. Também foi encontrado que o grau de inflamação
na perimatriz apresentava correlação com a espessura da perimatriz, ou seja, o grau de
inflamação era mais acentuado quanto mais jovem era o paciente à data da cirurgia.
Sendo assim, busco com esta tese aprofundar a análise desses dados, pois a
confirmação dessa hipótese indicaria uma maior agressividade dos colesteatomas pediátricos.
Além da polêmica em torno do comportamento biológico dos colesteatomas na infância,
inexistem, ainda, dados comparativos consistentes, entre crianças e adultos, acerca dos seus
componentes histológicos, ultra-estruturas e bioquímicos.
Na tentativa de acrescentar subsídios a essa discussão, decidi dedicar-me a esse
projeto que tem como objetivo correlacionar, através da análise imunoistoquímica, o estado
inflamatório da perimatriz de colesteatomas adquiridos com a idade do paciente à data da
cirurgia.
PARTE I – PRESSUPOSTOS TEÓRICOS
1.
Revisão da Literatura
1.1 O Vocábulo
A palavra “colesteatoma” foi utilizada pela primeira vez pelo anatomista alemão
Johannes Mueller, em 1838 (aput Cruz e Costa, 1999). As raízes deste vocábulo significam
cole – colesterol; esteado – gordura; oma – tumor, ou seja, um tumor onde estão presentes
tecido gorduroso e cristais de colesterol. Etimologicamente, este termo é completamente
incorreto, sendo, inclusive, considerado o segundo termo mais errôneo em otologia (em
primeiro está o “neurinoma do acústico”, visto que, na verdade, trata-se de um Schwanoma do
nervo vestibular) (Costa et al., 1992). O uso dessa denominação é inadequado porque o
colesteatoma origina-se de epitélio escamoso queratinizado da membrana timpânica e/ou do
conduto auditivo externo, sem presença de cristais de colesterol ou gordura na sua estrutura,
além de sua natureza tumoral ser totalmente discutível.
Outras denominações foram sugeridas, como tumor peroláceo, por Cruveilhier, em
1829; margaritoma, por Craigie, em 1891, colesteatoma epidérmico por Cushing, em 1922,
2
epidermóide por Critchley e Ferguson, em 1928 e queratoma, por Shuknecht, em 1974; todos
estes termos, apesar de mais adequados e descritivos, não são empregados e o vocábulo
colesteatoma é consagrado entre os otologistas (Cruz e Costa, 1999).
1.2 Definição
Os colesteatomas foram definidos por Friedmann, em 1959, como estruturas císticas
revestidas por epitélio escamoso estratificado, repousando sobre um estroma fibroso de
espessura variável, o qual pode conter alguns elementos do forro mucoso original.
Mais simplesmente, Schuknecht, em 1974, define-os como acúmulo de queratina
esfoliada dentro da orelha média ou de qualquer área pneumatizada do osso temporal,
nascendo a partir de um epitélio escamoso queratinizado.
1.3 Epidemiologia
A incidência anual de colesteatomas está em torno de 3 por 100.000 em crianças e 9
por 100.000 em adultos, sendo mais predominante no gênero masculino (Tos et al. 1989;
Kemppaien et al., 1999; Potsic et al., 1997; Quantin et al., 2002).
Dados epidemiológicos mostram uma alta prevalência do colesteatoma entre os
caucasianos, seguidos pelos descentes do povo africano, sendo raramente visto em asiáticos.
De acordo com Ratnesar (1977), essa prevalência é bem mais baixa nos esquimós Inuit,
sugerindo que suas características anatomomorfológicas poderiam facilitar a aeração da
orelha média e prevenir as seqüelas das otites crônicas.
3
No Ambulatório de Otite Média Crônica no Hospital de Clínicas de Porto Alegre
(AOMC-HCPA), dos 700 pacientes acompanhados desde agosto de 2007, 30% eram
portadores de Otite Média Crônica Colesteatomatosa (OMCC), apresentando-se
bilateralmente em 12% da amostra total. Dos pacientes com OMCC, 45% tinham até 18 anos,
considerados, portanto, pediátricos. Quanto ao gênero, encontramos 70% de homens
(Dornelles et al., 2004a).
1.4 Classificação
Habitualmente, os colesteatomas são classificados como congênitos e adquiridos,
sendo esses subdivididos em primários e secundários.
Os congênitos são restos epiteliais, encontrados, geralmente, em orelhas com
membranas timpânicas intactas e sem história prévia de infecções (Derlacki e Clemis, 1965).
De acordo com Valvassori (1974), são encontrados em quatro regiões do osso temporal:
tímpano-mastoideo, ápice petroso, ângulo pontocerebelar e forame jugular. Há ainda uma
quinta localização, descrita por Sobol (1980), o qual relatou a existência de pequenas pérolas
epiteliais entre as camadas da membrana timpânica.
Os colesteatomas adquiridos primários seriam decorrentes de retrações timpânicas,
que acumulariam epitélio descamado e perderiam seu poder de autolimpeza. Já os secundários
seriam formados a partir da migração do epitélio através de uma perfuração marginal na
membrana timpânica (Costa e Dornelles, 2006)
Um profundo entendimento sobre a patogênese do colesteatoma da orelha média é
particularmente importante, visto que sua natureza destrutiva é responsável por muitas das
complicações. A tendência de erosão óssea dos colesteatomas e a falta de um tratamento não-
4
cirúrgico justificam a importância da investigação dos mecanismos básicos relacionados ao
desenvolvimento da otite média crônica colesteatomatosa.
1.5 Etiopatogênese
Ferlito (1997) descreve que seriam necessárias três condições predisponentes para o
desenvolvimento de um colesteatoma: a) o encontro de dois epitélios diferentes na fenda
auditiva; b) a destruição crônica da camada submucosa da orelha média pelos processos
infeccioso e inflamatório; c) o processo de cicatrização ou fase de proliferação.
Porém, a etiopatogênese dos colesteatomas é ainda muito discutida, havendo,
basicamente, seis hipóteses principais (Quadro 1), as quais geram controvérsia há mais de 100
anos.
Quadro 1: Principais hipóteses para a etiopatogênese dos colesteatomas
Hipótese Autor Ano
Colesteatomas congênitos Korner e Virchow 1863
Metaplasia Wendt 1873
Migração Habermann
Bezold
1889
1889
Invaginação Bezold 1908
Hiperplasia Manasse 1917
Implantação Schöer 1958
Adaptado de Cruz e Costa, 1999
Existem diversos estudos a respeito da patogênese dos colesteatomas, porém ainda
resta muito a ser esclarecido (Sculerati e Bluestone, 1989). Conforme observações no AOMC-
HCPA, e vários trabalhos deste grupo (Dornelles et al., 2002; Dornelles et al., 2003;
Dornelles et al., 2004a; Hemb et al., 2003; Schweiger et al., 2003; Matter et al., 2003;
5
Schmidt et al., 2002; Costa, Petersen e Dornelles, 2007), essas hipóteses, individualmente,
não explicariam a patogênese de todos os colesteatomas.
É inequívoca a existência de colesteatomas congênitos e o surgimento de
colesteatomas por invaginação e por implantação, mas essas situações não poderiam ser
responsáveis por todos os casos de OMCC. Acreditamos que a patogênese dos colesteatomas,
na verdade, envolveria várias dessas hipóteses agregadas (Quadro 1), podendo haver a
interposição de duas ou mais delas em um mesmo paciente.
Em conseqüência dessa constatação, parece-nos que a hipótese do continuum,
postulada pelo Dr. Michael Paparella, em 1970, aproxima-se de uma concepção multifatorial,
mais abrangente de patogênese. Segundo essa, a otite média pareceria existir ao longo de uma
série contínua de eventos epiteliais e subepiteliais, onde, após um insulto inicial, uma otite
serosa ou purulenta tornar-se-ia seromucóide, mucóide e, finalmente, caso não houvesse
regressão espontânea ou terapêutica do quadro, sobreviria a cronificação (Costa, 1991).
Podemos dizer, baseados nessa hipótese, que o colesteatoma é a apoteose de uma única
patologia da orelha média, a otite média crônica, e não, portanto, um evento isolado
(Dornelles et al., 2006).
1.6 Estrutura
O colesteatoma, macroscopicamente, é uma lesão cística redonda ou oval com
configuração e tamanho variáveis. Ferlito et al. (1997) caracterizaram o colesteatoma como
um cisto epidermóide, de crescimento independente e progressivo, com destruição dos tecidos
adjacentes, em especial o tecido ósseo, com tendência a recorrer.
O advento da microscopia eletrônica de transmissão possibilitou muitos avanços no
6
conhecimento da estrutura celular. Utilizando esse instrumento, em 1972, Lim e Saunders
apresentaram uma descrição histológica detalhada dos colesteatomas. Descreveram que o
colesteatoma possui um epitélio escamoso estratificado queratinizado, com as quatro camadas
idênticas às da epiderme normal (basal, espinhosa, granulosa e córnea), células de Langerhans
(em maior quantidade do que na epiderme normal) e grânulos querato-hialinos. Chamaram
este epitélio de matriz do colesteatoma. Observaram, ainda, a presença de um tecido
conjuntivo, contendo fibras colágenas, fibrócitos e células inflamatórias, que foi denominado
de perimatriz, a qual estava em contato, na maioria dos casos, com uma camada de células
escamosas ou cilíndricas ciliadas, remanescentes da mucosa original da orelha média. Em
alguns casos, apesar de a perimatriz estar ausente à microscopia óptica, fazia-se presente
quando estudada com o microscópio eletrônico de transmissão, mostrando-se extremamente
fina, com as fibras colágenas praticamente ausentes e contendo cristais de carbonato de
cálcio. Já em trabalho realizado por Paludetti et al. (1989), os autores descrevem a perimatriz
como um tecido de granulação ou tecido conectivo subepitelial inflamado.
Segundo Milewski et al. (1998b), o crescimento de um colesteatoma poderia requerer
angiogênese no tecido conjuntivo da perimatriz, e que, células e substâncias da cascata de
cicatrização poderiam ter um importante papel no desenvolvimento e crescimento dos
colesteatomas. Esses processos envolveriam o fator de crescimento fibroblástico b (b-FGF), o
qual, segundo esses autores, poderia estimular a produção de metaloproteinase (MMP).
Sugeriram, ainda, que a persistência da inflamação causaria um processo permanente de
cicatrização na perimatriz, a proliferação de fibroblastos (tecido de granulação) e do epitélio
(matriz).
Ferlito et al. (1997) descrevem a perimatriz como a porção mais periférica do
colesteatoma, constituída de tecido de granulação ou tecido conjuntivo subepitelial
inflamatório, com linfócitos, histiócitos e neutrófilos. Sprekelsen et al. (2001) afirmam que a
7
matriz e a perimatriz, em tecidos normais ou patológicos, são formadas por colágeno tipo IV,
tenascina, fibronectina, b-FGF e metaloproteinases. Segundo Jacob et al. (2001), o
incremento na proliferação da matriz do colesteatoma seria resultado do processo de
inflamação, sugerindo que a perimatriz seria o principal fator para o crescimento dos
colesteatomas.
Resumidamente, podemos definir a perimatriz como uma rede inflamatória que
envolve o colesteatoma. A Figura 1, a seguir, apresenta cortes histológicos de colesteatomas,
onde podemos ver seus componentes estruturais: a perimatriz, a matriz e o conteúdo cístico.
8
Figura 1: Cortes histológicos de espécimes de colesteatomas, corados em hematoxilina-
eosina, mostrando a variabilidade da espessura da perimatriz. A e B - Perimatriz ausente
(400x), C e D - Perimatriz muito fina (200x), E e F – Perimatriz espessa (100x).
Foi com o intuito de buscar algumas respostas para as indagações acerca da
patogênese da OMCC que realizamos o estudo histológico dos colesteatomas, bem como a
comparação dos achados entre as faixas etárias (Dornelles et al., 2006). Para tanto, foram
coletados os dados do número médio de camadas celulares e presença de hiperplasia na
A
C
E
B
D
F
9
matriz; espessura e epitélio delimitante da perimatriz, fibrose, inflamação e granuloma na
perimatriz.
Dornelles et al. (2006) encontraram uma grande variabilidade na espessura da
perimatriz dos colesteatomas, tanto intrapacientes, ou seja, num mesmo espécime
encontramos regiões mais delgadas do que outras; quanto interpacientes. Ao microscópio
óptico, as espessuras médias variaram desde expressivamente delicadas, por nós consideradas
igual a zero, até extremamente espessas (1.926 micrômetros). Nesse estudo, dentre os 57
colesteatomas da amostra, foram encontrados apenas quatro com perimatriz tão fina que não
puderam ser medidas, sendo consideradas com espessura igual a zero, havendo mais casos de
ausência no grupo de adultos (13, 35, 37 e 53 anos). Além disso, ao utilizar o coeficiente de
Spearman entre a idade do paciente à cirurgia e a espessura da perimatriz, foram encontradas
correlações moderadas e inversas, fato que demonstra que a espessura da perimatriz diminui
conforme aumenta a idade do paciente.
Pereira et al. (2002) também confirmaram encontrarem diferenças na espessura da
perimatriz dos colesteatomas de sua amostra, observando que um número significativamente
maior de colesteatomas provenientes de adultos apresentava perimatriz visível à microscopia
óptica.
As funções fisiológicas das macromoléculas da perimatriz estão relacionadas com
adesão, migração, crescimento e diferenciação celulares (Olszewska et al., 2004). A partir
dessas características, e considerando que a ação das metaloproteinases pode ser um dos
fatores envolvidos na erosão óssea, universalmente encontrada nas otites médias
colesteatomatosas e que clinicamente esta doença poderia ser mais agressiva em crianças do
que em adultos, buscamos, através de medidas objetivas, verificar se havia correlação da
espessura da perimatriz com a idade do paciente à cirurgia. Uma diminuição dessa, em
10
crianças, poderia ser explicada por uma menor quantidade das fibras de colágeno, causada,
por sua vez, pela ação de metaloproteinases.
Através das descrições da estrutura dos colesteatomas relatadas (Lim e Saunders,
1972;
Paludetti et al., 1989; Ferlito et al., 1997; Sprekelsen et al., 2001;
Dornelles et al., 2006)
constata-se que a perimatriz é constituída por vários outros elementos, além das fibras de
colágeno, é nessa região do colesteatoma que também encontramos as células inflamatórias.
A inflamação, que geralmente acompanha o quadro clínico de pacientes com colesteatoma,
representa uma seqüência de complexos e inter-relacionados eventos decorrentes de lesão
tecidual, podendo ser induzida por diferentes estímulos (Olszewska et al., 2004). A resposta
inflamatória é essencial para reparar e restaurar a estrutura e função do tecido lesado; em
situações onde haja a persistência do estímulo inflamatório, essa resposta pode tornar-se
crônica, resultando em alteração patológica no comportamento tecidual (Wysocki et al.,
1998).
1.7 Biologia do Colesteatoma
O estudo das células, em microscopia óptica e eletrônica, pode dar a impressão
enganosa de que essas são estruturas estáticas. Porém, ao contrário, muitos processos e
movimentos estão constantemente acontecendo na intimidade celular, ocorrendo em alguns
tecidos de forma mais rápida, em outros mais vagarosamente. É fácil compreender que, à
medida que as células vão se diferenciando, paralelamente vão adquirindo certas
particularidades estruturais e fisiológicas.
Os epitélios são tecidos com vida limitada, com renovação constante, decorrente de
uma atividade mitótica contínua. A velocidade dessa reposição celular é variável, podendo ser
de dois a 50 dias, dependendo do tecido considerado (Junqueira e Carneiro, 1985).
11
Já o tecido conjuntivo, constituinte da perimatriz do colesteatoma, apresenta um
processo de crescimento mais complexo, pois é formado por diversos tipos de células –
fibroblastos, macrófagos, mastócitos, plasmócitos, leucócitos – separadas por abundante
material intercelular. A riqueza desse material é uma das suas características mais
importantes. Constitui-se por uma parte com estrutura microscópica definida – fibras do
conjuntivo – e por outra não estruturada – substância fundamental amorfa (Junqueira e
Carneiro, 1985). Por toda essa complexidade, é de se esperar que o processo de renovação
desse tecido seja bastante elaborado.
Dentre os três constituintes do colesteatoma, a perimatriz é a que possui
histomorfologia mais variável; também é o local onde encontra-se o processo inflamatório e a
produção de enzimas osteolíticas; constitui-se na verdadeira interface entre o colestetomas e a
orelha média, chamada por Dornelles et al. (2006) de “campo de batalha”.
O colesteatoma poderia ser resultado de um descontrole da proliferação celular
(Ferlito et al., 1997) decorrente de uma desordem no controle do crescimento celular,
compreendendo uma série de complexos e dinâmicos eventos envolvendo componentes
celulares e extracelulares com alterações em seu comportamento biológico, como
desregulação dos queratinócitos (Vennix et al., 1996), os quais apresentam um crescimento
hiperproliferativo e alterações na diferenciação celular. Determinar a existência de defeitos na
sua biologia, bioquímica e genética é crítico para o conhecimento da sua patogênese.
A capacidade de invasão, migração, alteração na diferenciação, proliferação e
recorrência dos colesteatomas é muito similar às neoplasias, porém há relutância, entre os
pesquisadores, em aceitar o enquadramento dos colesteatomas nessa categoria (Desloge et al.,
1997a; Albino et al., 1998b). Para os colesteatomas serem considerados uma lesão neoplásica
é necessário a evidência de instabilidade genética; esta pode ser manifestada através de
alterações no DNA ou de anormalidades cromossômicas específicas. Em 1995, Shinoda e
12
Huang detectaram a proteína p53 em colesteatomas, sugerindo que estes poderiam ser
tumorais. Porém, Desloge et al. (1997a) demonstraram não haver alterações no DNA,
descartando, assim, essa hipótese.
Como as pesquisas citadas não indicam nenhuma instabilidade genética dessas lesões,
devemos investigar uma outra possível razão para o desenvolvimento da OMCC, sendo
necessário perguntar sobre a origem do epitélio escamoso queratinizado nos colesteatomas.
Para estudar essa questão, muitas investigações utilizando análise imunoistoquímica têm sido
realizadas para comparar a localização de marcadores de diferenciação nos colesteatomas e na
pele do canal auditivo externo. Devido às propriedades apresentadas pelas citoqueratinas,
essas têm sido consideradas, por alguns investigadores como um dos melhores instrumentos
para este propósito (Bujia et al., 1993; Kuijpers et al., 1996; Vernnix et al., 1996).
As citoqueratinas são proteínas que constituem uma das duas categorias de filamentos
intermediários, localizados no citoplasma das células epiteliais; possuem vinte subclasses,
sendo sua expressão dependente do tipo de epitélio e do seu estágio de diferenciação (Moll et
al., 1982). Pereira (1997), Albino et al. (1998b) e Kim e Chung (1999) relatam que a matriz
dos colesteatomas expressa citoqueratina 16 (CK16) nas camadas suprabasais, sendo que a
expressão deste filamento protéico é característica de epitélios hiperproliferativos. Lepercque
et al. (1993) descrevem que a CK16 não aparece no epitélio normal, a não ser em áreas sob
pressão e atrito, ou no epitélio de revestimento dos folículos pilosos. Segundo Broekaert et al.
(1992), a CK16 é expressa em regiões específicas, como o anel timpânico e as regiões medial
e inferior do meato acústico externo. A presença de CK16 na matriz do colesteatoma poderia
indicar seu comportamento hiperproliferativo, semelhante ao de algumas doenças
epidérmicas, mesmo que o aspecto histológico do colesteatoma seja igual ao da epiderme
normal. De acordo com Albino et al. (1998a), o colesteatoma forma-se como decorrência da
tentativa de reparar uma lesão, o que poderia explicar a presença de CK16, caracterizando
13
este epitélio como imaturo com predomínio de proliferação celular. Kujipers et al. (1996)
analisaram o padrão de citoqueratinas e sugeriram que a matriz do colesteatoma não é
resultado de uma mudança metaplásica. Em seu estudo, encontraram um epitélio semelhante
ao da membrana timpânica e ao da pele do canal auditivo externo, mas em diferentes estágios
de proliferação, dependendo do grau de inflamação presente.
Um sinal característico dos colesteatomas é a infiltração da perimatriz por células do
sistema imune. Piltcher (2000), em sua tese sobre citocinas na otite média crônica com
efusão, afirma que, além dos já conhecidos fatores de risco, como a disfunção tubária e as
infecções, muitas pesquisas sobre otite média têm-se direcionado ao estudo dos diferentes
componentes da resposta inflamatória. O ponto fundamental é se a inflamação deve ser
considerada apenas como um processo de defesa ou se ela tem papel na perpetuação da otite
média crônica colesteatomatosa.
Milewski (1998a) sugeriu que as citocinas inflamatórias, os fibroblastos e os
macrófagos seriam os responsáveis pela origem, crescimento e destruição óssea dos
colesteatomas. Várias citocinas e fatores de crescimento poderiam estar envolvidos no
mecanismo de proliferação e desenvolvimento do epitélio do colesteatoma (Aumente et al.,
1996; Bujia et al., 1996b).
Tomita (2000) afirma que existem várias hipóteses de que os fatores de crescimento e
as citocinas, presentes nos colesteatomas, induzam a ativação de genes, como o c-myc,
causando a desregulação da proliferação celular. Sudhoff et al. (1997) investigaram a
distribuição e expressão do fator de crescimento tumoral (TGF-alfa), do fator de crescimento
epitelial (EGF-R) e do oncogene c-myc em células epiteliais normais da orelha média e em
colesteatomas. Estes fatores foram encontrados na matriz de colesteatomas, porém não em
células normais. Além da regulação autócrina do epitélio, pela produção de fator de
14
crescimento epitelial (EGF), a hiperproliferação do colesteatoma poderia depender da
interação do tecido subepitelial e das mudanças inflamatórias que ocorrem nessa doença.
Uma característica comum na patogênese dos vários tipos de colesteatomas é a
presença de bactérias. A presença de bactérias poderia promover um vínculo crítico entre o
colesteatoma e o hospedeiro, impedindo que o epitélio neoformado concluísse o seu processo
de diferenciação, o que o deixaria em um estado quiescente, minimamente proliferativo, sem
ser migratório ou invasivo nessa etapa (Chole e Faddis, 2002). As interações entre células
inflamatórias e o epitélio do colesteatoma poderiam ser responsáveis pela indução das
características biológicas aberrantes dessa doença.
Chole e Faddis (2002) estudaram, por microscopia eletrônica de transmissão, 24
colesteatomas humanos e 22 de esquilo da Mongólia (gerbil). Das amostras provenientes de
humanos, 16 apresentaram achados histológicos consistentes com bactérias em biofilme,
enquanto no material de gerbil, 21 mostraram evidências dessa forma. Esse achado poderia
estar relacionado com a atividade dos colesteatomas, principalmente com as infecções
persistentes ou recorrentes e com sua resistência aos antimicrobianos tópicos e sistêmicos. Os
autores sugeriram que a matriz do colesteatoma é um meio ideal para o desenvolvimento de
um misto de biofilme microbiológico. Estes autores afirmam, ainda, que as bactérias com
biofilme são resistentes aos antibióticos por mecanismos diferentes dos usados por bactérias
planctônicas, porém o exato mecanismo de resistência das colônias de bactérias em biofilme é
desconhecido.
Os estudos publicados até agora apresentam alguns dados a respeito da biologia dos
colesteatomas, porém muitas dúvidas persistem. Como anteriormente referido, os
colesteatomas apresentam características neoplásicas (invasão, migração, alteração na
diferenciação), mas, até o momento, não foi encontrada nenhuma comprovação de
instabilidades genéticas na sua estrutura, fato que descarta a possibilidade de enquadrá-los
15
como neoplasia. Uma possível resposta para suas características de agressividade e
crescimento descontrolado dos colesteatomas seja a hiperproliferação da matriz. Além desse
fato, citocinas relacionadas às células inflamatórias da perimatriz, representam um forte
candidato ao papel de ator principal dessa trama intrincada de mecanismos. Todas essas
hipóteses levam-nos a considerar a complexidade envolvida na biologia dos colesteatomas e,
conseqüentemente, ao emaranhado de eventos relacionados a sua patogênese.
Neste ponto instiga-nos uma indagação: qual seria o papel das características
intrínsecas dos indivíduos na patogênese dos colesteatomas? Na Figura 2 podemos ver duas
otoscopias digitais. Em A está representada uma OMCNC e em B, uma OMCC.
Figura 2: Otoscopias de dois pacientes do AOMC-HCPA. Em A: Otite Média Crônica Não-
Colesteatomatosa. Em B: Otite Média Crônica Colesteatomatosa
As semelhanças entre essas duas imagens são impressionantes, fato que não ocorre
somente nestas fotos, mas que também é constante na prática clínica. Entretanto, é de se
questionar por que no primeiro paciente o processo, até esse momento, se estabilizou em uma
A B
16
retração severa, porém seca, e não se desenvolveu o colesteatoma, como no segundo
paciente? Apesar dos muitos estudos já citados, os mecanismos que levariam ao surgimento
de um colesteatoma ainda não foram bem determinados.
Sabemos que, para o desenvolvimento do colesteatoma, uma das condições
necessárias é o encontro de dois epitélios dentro da orelha média (Ferlito, 1997); parece-nos
claro, porém, que esta condição é insuficiente.
Uma evidência de que há inúmeros fatores, intrínsecos e extrínsecos, envolvidos na
patogênese dos colesteatomas são os trabalhos experimentais com animais. Apesar de serem
submetidos às mesmas condições, as cobaias não apresentam uma incidência plena de
colesteatomas. Wright et al. (1985) conseguiram 39%; Wolfman e Chole (1986), 40,6%;
Vassali et al. (1988), 54,1%; Huang et al. (1988), 76,1%; de Jove et al. (1990), 75%;
Meyerhoff et al. (1990), 66,6%; Sobol (1980), 53,5%; Pownell et al. (1994), 50%; Schimdt e
Hellstrom (1994), 89,5%; White et al. (1995), 70,6% e Hueb (1997), 53,5%.
Dentre estes trabalhos, o de Hueb (1997) apresenta muitos dados interessantes sobre o
tema dessa tese. Esse autor realizou um estudo experimental com chinchilas, tendo como
objetivo o estabelecimento de um novo modelo animal para o desenvolvimento de
colesteatoma através de uma perfuração timpânica, utilizando uma “ponte facilitadora” para a
migração do epitélio ao interior da orelha média e um irritante tecidual (estímulo
inflamatório). Nesse procedimento, em quase metade dos animais (46,5%) houve fechamento
da perfuração da membrana timpânica através da migração de células do epitélio escamoso
sobre a efusão organizada. Nos animais com maior sobrevida, observou-se a recuperação da
orelha média, após a interrupção do estímulo inflamatório. Hueb (1997) relata, ainda, que a
presença de colesteatoma ocorreu, predominantemente, na bula timpânica anterior, região
onde foi observada uma reação inflamatória mais intensa.
17
Parece-nos claro o envolvimento da inflamação na patogênese da OMCC, pois a
persistência dessa poderia perpetuar o processo de cicatrização e proliferação epitelial na
matriz do colesteatoma (Milewsky, 1998). Tomita (2000) afirma que a inflamação foi um
fenômeno constante, na sua amostra em estudo, e sugere que essa talvez se constitua no único
parâmetro que possa ser correlacionado com o caráter agressivo dos colesteatomas.
No caso da otite média crônica, as defesas do sistema imune, provenientes da mucosa
da orelha média, são recrutadas e contribuem para a patogênese do colesteatoma (Mayot et
al., 1991), podendo a inflamação da perimatriz contribuir para o comportamento aberrante do
colesteatoma (Palva, 1997). Alguns autores acreditam que haja a necessidade do tecido
inflamatório de granulação (perimatriz) para que ocorra a erosão óssea, característica na otite
média crônica colesteatomatosa (Swartz, 1984; Mafee, 1993; Jung, 2002).
O papel desempenhado pela perimatriz no estabelecimento da agressividade dos
colesteatomas já havia sido aventado por Quaranta et al. (1986), tendo esses autores sugerido
que as diferenças clínicas dos colesteatomas entre crianças e adultos poderiam estar
relacionadas às características histomorfológicas da perimatriz, e que esta exerceria um
importante papel na desenvolvimento do colesteatoma. Corroborando essa hipótese, Jacob et
al. (2001) sugeriram que o crescimento do colesteatoma não seria estimulado pela matriz, mas
sim decorrente do processo inflamatório. A persistência da inflamação causaria um processo
contínuo de cicatrização na perimatriz, com conseqüente aumento no nível das citocinas
(moléculas de inflamação e da resposta imune).
A existência de citocinas nos colesteatomas foi comprovada com a imunolocalização
de cinco diferentes tipos dessas moléculas na perimatriz (Marenda e Aufdermorte, 1995). As
citocinas, dentre outros fatores, poderiam ser responsáveis pelo crescimento do colesteatoma
e pela destruição óssea por esse causada (Milewski, 1998a; Michaels, 1989 e Ferlito, 1997).
Baseados nos achados de Lazarus et al. (1969), os quais sugeriram que a atividade química da
18
perimatriz tem um papel na absorção óssea, Gantz et al. (1979), demonstraram que as células
mononucleares inflamatórias produzem enzimas colagenolíticas. A importância da perimatriz
na reabsorção óssea também foi destacada por Abramson et al. (1975), tendo sido esses
autores os primeiros a sugerir que o potencial de infiltração dos colesteatomas estaria
correlacionado com atividades quimioenzimáticas da perimatriz.
1.8 Angiogênese e Densidade Microvascular: Marcadores de Inflamação
Um processo inflamatório pode ser quantificado, indiretamente, pela angiogênese, que
consiste na formação de novos capilares a partir de vasos sanguíneos pré-existentes. Esste
processo depende da proliferação de células endoteliais, que são as células de revestimento
dos vasos sanguíneos (Meurer, 2003; Folkman, 1986; Folkman, 1990; Folkman, 1995a).
A angiogênese é fundamental para o desenvolvimento normal e a homeostasia dos
tecidos. Existe nos tecidos normais do organismo em resposta a certos estímulos fisiológicos.
Por exemplo, ocorre durante o processo inicial de cicatrização de uma ferida, em sua forma
fisiológica, é essencial ao desenvolvimento tecidual, reprodução e cicatrização de feridas
(Folkman, 1986; Folkman, 1990; Folkman, 1995a).
No entanto, ao contrário destes processos auto-limitados e controlados no tempo, a
angiogênese patológica intervém ativamente na patogênese de certas doenças, incluindo
artrites, doenças de foro dermatológico, neo-vascularizações oculares e neoplasias malignas.
Nessas condições patológicas, a angiogênese persiste durante meses ou anos, e raramente
termina espontaneamente. Teoriza-se que, nos tumores malignos, as células endoteliais se
encontram em estado dormente durante algum tempo e que, em presença de certos fatores e
estímulos apropriados, passam a uma fase de crescimento ativo com a resultante neo-
vascularização (Meurer, 2003).
19
Está demonstrado que o crescimento progressivo dos tumores e a eventual migração
de células tumorais para zonas distantes, são mecanismos dependentes, em larga escala, da
angiogênese. O aparecimento de atividade angiogênica num tumor é um processo
independente que ocorre naturalmente, e é um dos vários estágios de evolução das doenças
oncogênicas ou pré-oncogênicas (Folkman, 1971). As neoplasias crescem de forma avascular
até atingir um a dois milímetros de diâmetro, obtendo oxigênio e nutrientes por difusão
passiva. Em dado momento, adquirem o fenótipo angiogênico, e começam a recrutar vasos
maduros adjacentes, que passam a emitir brotamentos vasculares que, então, permeiam o
tumor (Kerbel, 2000).
Teorias fisiopatológicas sobre a angiogênese (Dameron et al., 1994; Folkman, 1995b;
Folkman, 1996; Hanahan e Folkman, 1996; Iliopoulos et al., 1996; Volpert et al., 1995)
salientam o fato dessa depender, em última análise, de um equilíbrio delicado entre fatores
estimuladores e fatores inibidores. De acordo com esse princípio, a angiogênese pode ser o
resultado de um excesso de atividade dos fatores estimuladores ou de uma redução da
atividade dos fatores inibidores da neo-vascularização. Cao et al. (1996) consideram, por
exemplo, que em condições de hipóxia, células normais reagem induzindo a formação de
VEGF, um fator pró-angiogênico. Para Folkman (1996), o estado de dormência poderia ser
atribuído a um balanço do fenômeno de neoformação vascular, prevalecendo o efeito
antiangiogênico. Através de estudo experimental, Folkman (1986) conseguiu caracterizar a
chamada angiostatina, que tem grande capacidade de inibir a proliferação de células
endoteliais (Thompson, 2001; von Bulow et al., 2001).
Os reguladores positivos da angiogênese podem-se dividir, esquematicamente, em
dois grandes subgrupos: os fatores de crescimento e as citocinas. Foram identificadas dezenas
dessas moléculas, e em algumas a seqüência genética já é conhecida, e a respectiva clonagem
já é possível. Entre os fatores de crescimento salientam-se o fator de crescimento fibroblástico
20
básico (bFGF), o fator de crescimento derivado das plaquetas (PDGF), o fator de crescimento
vascular endotelial (VEGF), fatores de crescimento semelhantes à insulina (IGF), e fatores
estimulantes da multiplicação de granulócitos e monócitos (GM-CSF). Entre as citocinas,
destaca-se a interleucina 6 (IL-6) e a interleucina 8 (IL-8).
Embora a quantificação da angiogênese tenha sido realizada mais extensamente no
estudo de neoplasias, compreendendo a maioria dos tipos tumorais, muitos apresentam
resultados contraditórios (Meurer, 2003), além do que estudos em colesteatomas são escassos.
A metodologia proposta por Vermeulen et al., em 1996, para a quantificação da
angiogênese, e que têm mostrado bons resultados, inclui a seleção de zonas com grande
proliferação vascular, chamadas de hot spot, na margem invasiva do tumor (Meurer, 2003).
Os cortes, corados pelo CD31 seriam observados em pequenos aumentos, e estas zonas, uma
vez reconhecidas, seriam submetidas à contagem em grande aumento, de 200 vezes (Meurer,
2003). Neste método, células endoteliais, ou grupos de células endoteliais, claramente
separados de microvasos adjacentes devem ser considerados como microvasos e contados
(Vermeulen et al., 1996). Esta metodologia está amplamente baseada no estudo de Weidner et
al. (1991) em carcinomas mamários, onde a contagem de vasos mostrou-se como possível
fator preditor de doença metastática.
Uma alternativa para este exaustivo método foi testada por Fox et al., em 1995, na
qual, após a seleção do hot spot, uma ocular contendo 25 pontos aleatórios é rodada de
maneira que o máximo de pontos está sobre ou dentro de vasos, e estes são contados. Esta
metodologia foi chamada de contagem de pontos de Chalkley. Os resultados obtidos messa
metodologia obtiveram boa correlação com a contagem por análise de imagem e com a
contagem manual, mostrou-se como fator preditor independente de prognóstico (Fox et al.,
1995).
Kuczkowski et al. (2004) apresentaram os resultados de uma avaliação
21
imunomorfológica de 31 colesteatomas, divididos em três grupos (quatro congênitos, 19
adquiridos primários, oito adquiridos secundários). Utilizaram o anticorpo CD31, para
quantificar tecido vascular nos três tipos de colesteatomas, tanto na matriz como na
perimatriz, não encontrando diferença de angiogênese entre os grupos.
Olszewska et al. (2004b), utilizando outro marcador de angiogênese (CD34) fizeram
uma comparação entre colesteatomas, tecido de granulação e pele normal e encontraram a
angiogênese aumentada nos colesteatomas.
1.9 Poder de Erosão Óssea
Conforme Fisch (1984), as complicações causadas pelos colestetomas podem ser
divididas em dois grupos: as intracraniais – meningites, abcessos e trombose do seio venoso –
e as do osso temporal – mastoidite, fístula labiríntica, paralisia do nervo facial, labirintites e
destruição ossicular.
Os colesteatomas apresentam grande poder de erosão óssea (Sadé e Halevy, 1974;
Bretlau et al., 1982). Usualmente atingem a cadeia ossicular e, menos freqüentemente, os
ossos do crânio, inclusive o osso mais rígido do corpo humano, a cápsula ótica, o que
demonstra sua forte ação destrutiva sobre o tecido ósseo. A destruição parcial ou total dos
ossículos é observada em cerca de 80% dos pacientes com colesteatoma, ao passo que na otite
média crônica não-colesteatomatosa há erosão da cadeia ossicular em aproximadamente 20%
dos casos (Chole, 1997; Costa, 1991). Os mecanismos que levam a esse aumento na
degradação óssea e invasão ainda estão em investigação (Dornelles et al., 2002).
Segundo Swartz (1984), a destruição ossicular é a mais comum entre as complicações
dos colesteatomas, sendo que o tipo de destruição depende da sua origem e do seu modo de
22
expansão. Segundo seus dados, a cadeia ossicular está intacta em apenas 26% dos
colestetomas aticais, sendo o processo longo da bigorna a região mais afetada, seguida pelo
corpo da bigorna e a cabeça do martelo. Já os colesteatomas da parte tensa apresentam um
poder de erosão de 90%.
Sadé e Berco (1974) realizaram exame histológico em 80 ossículos, obtidos em
cirurgia, sendo 41 desses provenientes de pacientes com OMCNC, e 39 de OMCC. A erosão
óssea foi encontrada em 42,5% dos ossículos de pacientes sem colesteatoma e em 84% dos
pacientes com colesteatoma, sendo essa diferença estatisticamente significativa (P<0,0001).
Em estudo de Prescott (1999), foram acompanhadas 81 crianças com Otite Média Crônica
Colesteatomatosa; de um total de 96 colesteatomas (15 bilaterais), havia apenas 19 cadeias
ossiculares íntegras, 23 apresentavam erosão no martelo com a supraestrutura intacta, 51 com
erosão no martelo e perda da supraestrutura, três não foram descritos.
Sadé e Fuchs (1994) compararam os achados da erosão ossicular em adultos (idade ≥
14 anos) com aqueles achados em crianças (idade ≤ 13 anos). O percentual de destruição do
estribo e do martelo foram similares nos dois grupos; já a bigorna apresentou destruição
significativamente maior em adultos. Também a paralisia do nervo facial e a fístula labiríntica
apresentaram percentual maior nos adultos. Dornelles et al. (2002) realizaram um estudo de
descrições dos achados, da orelha média, no trans-operatório de 55 pacientes com Otite Média
Crônica, acompanhados no AOMC-HCPA. Desses pacientes, 49% tinham diagnóstico de
Otite Média Crônica Colesteatomatosa (OMCC). No conjunto da amostra, havia algum
envolvimento da cadeia ossicular em 66%, sendo que, na OMCC, este índice era de 96% e na
OMCNC caía para 37%. A presença de colesteatoma estava associada à existência de dois ou
mais ossículos afetados, assim como à maior prevalência de ausência ou erosão dos ossículos.
Esses achados indicam que a maioria dos pacientes com OMC, submetidos à intervenção
cirúrgica, possuem algum acometimento da cadeia ossicular, e que a freqüência e a extensão
23
do comprometimento estavam muito mais relacionados com a presença de colesteatoma.
Nesse trabalho (Dornelles et al., 2002) a idade foi categorizada como: crianças até 18 anos e
adultos a partir de 19 anos; quando analisado o conjunto da cadeia ossicular, observado no
trans-operatório de pacientes com otite média crônica colesteatomatosa, foi encontrado 100%
de comprometimento nas crianças e 92% nos adultos. Quando comparados os ossículos,
separadamente, havia 30% de alterações no martelo, 30% no estribo e 90% na bigorna, sem
diferenças entre adultos e crianças (Dornelles et al., 2002).
A absorção óssea é estimulada por uma variedade de fatores, incluindo a inflamação, a
pressão local, citoqueratinas específicas e queratina (Olszewska et al., 2004). O conceito
enzimático, no qual enzimas de origem epitelial são consideradas as responsáveis pela
destruição óssea, foi definido por Abramson (1969, 1971a, 1971b e 1976), o qual demonstrou
a presença de metaloproteinases e hidrolases no colesteatoma, hipótese posteriormente
confirmada por Thompsen (1977). Ferlito et al. (1997) sugeriram que a propriedade destrutiva
dos colesteatomas, a erosão óssea, é causada pela produção de metaloproteinases pelos
componentes dos tecidos epitelial escamoso e fibroso (matriz e perimatriz, respectivamente).
Não está bem demonstrado, ainda, se o osso mineralizado possa ser absorvido pela
colagenase. À hipótese de reabsorção óssea por ação bioquímica, exclusivamente exercida por
enzimas colagenolíticas, foram incorporados, posteriormente, outros agentes, como o fator de
necrose tumoral (TNF), as interleucinas (IL-1α) e as prostaglandinas (PGE
2
) (Minotti,1996;
Kurihara,1991; Hansen et al., 2001).
Hamsei et al. (2003) analisaram 21 colesteatomas, através de reação em cadeia de
polimerase (PCR), imunoistoquímica e histologia, com o objetivo de investigar os fatores de
estimulação e diferenciação de osteoclastos em colesteatomas, utilizando pele do meato
acústico externo como controle. A análise imunoistoquímica demonstrou uma elevação de
células precursoras de osteoclastos e macrófagos nos colesteatomas. A análise da perimatriz
24
demonstrou que, nesta região do colesteatoma, há todos os fatores necessários para a
osteoclastogênese e para a estimulação da reabsorção óssea.
Peek et al. (2003) estudaram a concentração de lipopolissacarídeos (componente da
membrana de bactérias Gram-negativas – Schorder et al., 2004) em colesteatomas e
compararam com os nível encontrados em amostras de pacientes com otite média crônica
não-colesteatomatosa. Encontraram concentrações mais altas em pacientes com colesteatoma
e sugeriram que estes resultados estariam correlacionados com os altos índices de absorção
óssea.
Dornelles et al. (2005b) utilizando a escala proposta por Saleh e Mills (1999)
encontraram que havia algum envolvimento da cadeia ossicular, em pacientes com OMCC,
em 98% dos casos. O ossículo mais freqüentemente afetado era a bigorna, seguida pelo
estribo e pelo martelo. Quando correlacionaram o grau de comprometimento da cadeia
ossicular com a idade do paciente à cirurgia, a espessura da perimatriz e o grau histológico de
inflamação não foram detectadas correlações com nenhuma das variáveis analisadas. Os
achados desses autores sugerem que é, praticamente, universal o acometimento da cadeia
ossicular na otite média crônica colesteatomatosa, mas que o estado dos ossículos não tinha,
ao menos naquele momento, correlação com os achados histológicos dos colesteatomas
estudados (Dornelles et al., 2005b).
1.10 Colágeno e Metaloproteinases
O colágeno é a proteína formadora das fibras colágenas, sendo a mais abundante
proteína do reino animal e o principal constituinte dos ossos, peles e tecidos conectivos de
todos os mamíferos. No ser humano, representa 30% do conteúdo protéico total do corpo. É
25
sintetizado por diversos tipos de células, como os fibroblastos, osteoblastos, e condrócitos.
Essa proteína tem como principal função impedir a deformação dos tecidos, mantendo sua
forma estrutural. Suas fibras são responsáveis, além de outras funções, pela estrutura de
tendões e ligamentos (Junqueira e Carneiro, 1985).
O nome colágeno deve-se ao fato de que, quando fervida em água, forma uma
substância que pode ser usada como cola. Essas fibras são birrefringentes, brancas e
constituídas por moléculas alongadas e paralelas; possuem uma estriação transversal típica,
fato que possibilita sua fácil identificação nas micrografias eletrônicas (Kramer et al., 2001).
A molécula de colágeno apresenta-se em forma de bastão, formado por uma tríplice hélice,
com cerca de 3.000 Å de comprimento e 15 Å de diâmetro (Okuyama et al., 1981). A
estabilidade dessa tríplice hélice é mantida por pontes de hidrogênio entre os filamentos e por
um efeito estérico de suas prolinas e hidroxiprolinas (Berisio et al., 2002). Em condições
laboratoriais, o colágeno é obtido a partir da hidrólise enzimática de matérias-primas
colágenas selecionadas, onde, através de processos bioquímicos, se quebra a estrutura original
da molécula, resultando, assim, num produto completamente solúvel em água fria, sem as
características geleificantes da gelatina e de sabor e odor neutros (Stryer, L., 1996).
Em otologia, materiais compostos de colágeno são utilizados como esponjas
degradáveis que, depois de umedecidas, têm uma apresentação gelatinosa, sendo utilizadas
como um suporte-base para os enxertos nas cirurgias,
em cubos, empregadas como um
legítimo colchão de apoio ao enxerto, ou em pequenas tiras ou “trilhos” (Dornelles et al.,
2003).
A degradação do colágeno, na matriz extracelular, é obtida por uma família de
metaloproteinases (MMP) que clivam suas fibras intactas em fragmentos menores que podem
ser fagocitados e, subseqüentemente, degradados por enzimas lisossômicas até seus
aminoácidos constituintes (Champe e Harvey, 1996).
26
Wysocki et al. (1998) sugeriram que altos níveis de metaloproteinase aumentariam a
degradação de componentes moleculares essenciais ao processo cicatricial e, também, que a
diminuição dessas enzimas, em feridas, impediria a cronicidade das lesões e as dificuldades
de cicatrização. Os fibroblastos são induzidos, pela interleucina-1 (IL1) e pela linfatoxina
(TNF), a produzirem metaloproteinases, as quais são mediadoras de eventos importantes de
proteção e regeneração de tecidos lesados, mas que, em condições especiais, podem estar
envolvidas em destruição de tecido sadio (Wysocki et al., 1998).
Como já mencionado anteriormente, o colesteatoma é um cisto epidermóide, tendo
como um dos fatores de significância clínica sua associação com uma progressiva destruição
óssea. A possibilidade de que o colesteatoma possua uma substância capaz da lise óssea foi
sugerida por Lautensclager, em 1927. Em 1969, Abramson demonstrou a capacidade dos
colesteatomas de produzirem metaloproteinase.
A perimatriz possui, em sua composição, fibras de colágeno, além de outros
elementos. Na Figura 3, apresentamos uma imagem digital de cortes transversais de
colesteatomas corados em Picrossírus, a qual cora as fibras dessa proteína em bordô (A),
contrastando com a coloração verde do epitélio(B). Nessa figura, podemos perceber a grande
quantidade de colágeno na estrutura da perimatriz.
Figura 3: Cortes transversais de colesteatomas corados em Picrossírios.
A – perimatriz; B – matriz; C – conteúdo cístico
B
A
200x
400x
C
B
A
C
27
A menor espessura da perimatriz nos colesteatomas pediátricos, poderiam estar
relacionados a atividade de metaloproteinases, se nesses espécimes houvesse uma diminuição
das fibras colágenas. Confirmando-se esses achados, bem como uma maior quantidade de
enzimas colagenolíticas, ou uma ação diferencial dessas em crianças, estaríamos mais
próximos de uma explicação sobre o porquê de que o colesteatoma pediátrico poderia ser
mais agressivo.
1.11 Metaloproteinases
A matriz extracelular desenvolve papel crucial no desenvolvimento e na manutenção
da arquitetura tecidual, é composta por colágenos, lamininas, fibronectina, vitronectina e
proteoglicanos (Yoon et al., 2003). A degradação da matriz extracelular leva à perda da
integridade tecidual, fato que é fundamental em processos fisiológicos, tais como:
remodelação óssea, implantação trofoblástica e cicatrização, porém esse mesmo fenômeno
está envolvido em processos inflamatórios (Kraien e Korem, 2000).
Proteinases participam de todas as etapas do processo de degradação da matriz
extracelular, sendo essenciais para a interação das células com o meio circundante (Yoon et
al., 2003). Existem diversas famílias de enzimas que atuam nesse processo, destaca-se, por
sua participação em praticamente todos os passos da degradação dos componentes da matriz
extracelular: a família de metaloproteinases (MMP).
As MMP constituem uma família de endopeptidases, com atividade hidrolítica de
amplo espectro para as proteínas extracelulares.
A atividade da maioria de metaloproteinase é muito baixa ou insignificante nos tecidos
normais, sendo a expressão é transcripcionalmente controlada por citocinas inflamatórias,
28
fatores de crescimento, hormônios, interação célula–célula e célula-matriz (Nagase e
Woessner, 1999).
As MMP são proteínas extracelulares, mas estudos recentes indicaram que MMP 1
(Limb et al., 2005), MMP 2 (Kwan et al., 2004) e MMP 11 (Luo et al., 2002) também são
achados intracelularmente e podem agir em proteínas de intracelulares.
Uma MMP típica consiste num pró-peptídeo de, aproximadamente, 80 aminoácidos,
um sítio catalítico metaloproteinase, em torno de 170 aminoácidos, um peptídeo de ligação
com comprimentos variáveis e uma hemopexina, sítio aproximado de 200 aminoácidos (Bode
et al., 1993).
As MMP podem ser ativadas (Figura 4) por proteinases ou por ativação química, in
vitro (Nagase, 1997). A ativação das MMP é seqüencial em muitos casos, um ataque
proteolítico inicial ocorre com a expossiçào da região de dobra entre a primeira e a segunda
hélices do propeptídeo. A clivagem específica da região de ligação é determinada por uma
seqüência específica encontrada em cada MMP. Apenas uma parte do propeptídeo é
removida, o que, provavelmente, desestabiliza o restante do propeptídeo, incluindo a
interação cisteína-zinco, o que permite o processamento intermolecular, ativando,
parcialmente, as MMP intermediárias (Suzuki et al., 1990; Nagase et al., 1990), sendo o passo
final nessa ativação conduzido por uma outra MMP.
29
Figura 4: ativação seqüencial de proMMP. A proMMP é secretada como zimogene inativa
e pode ser ativada por proteinases (caminho superior) ou por agentes de não proteolíticos
(caminho inferior). A atividade plena resulta da remoção da sobra do propeptídeo por
processamento intermolecular. Adaptado de Nagase et al. (2006).
A maioria das proMMP são secretadas nas células e ativadas extracelularmente. A
proMMP 2 não é prontamente ativado por proteinases em geral. A ativação principal da
proMMP 2 acontece na superfície da célula e é mediada por MT-MMP. Isto inclui MT1MMP,
MT5 MMP (Llano et al., 1999; Pei, 1999) MT3 MMP (Takino et al., 1995) MT2 MMP
(Butler et al., 1997), e MT6 MMP (Velasco et al., 2000). A MT4 MMP não ativa a proMMP
2 (English et al., 2000).
Uma importante função das MMP pensa-se ser a remoção da matriz extracelular na
reabsorção tecidual. No entanto, a matriz extracelular não é simplesmente um arcabouço
extracelular; também age como um reservatório de moléculas biologicamente ativas, tal como
fatores de crescimento (Sternlicht et al., 2001). Alguns componentes da matriz extracelular
podem expressar funções biológicas críticas na proteólise. A degradação de componentes da
matriz extracelular, por MMP, pode alterar tanto o comportamento celular como os fenótipos.
Por exemplo, a degradação do colágeno tipo I por colagenase é associado com ativação de
30
osteoclastos (Holliday et al., 1997), migração de queeratinócitos durante re-epiteliazação
(Pilcher et al., 1997), e apoptose de células epiteliais (Lei et al., 1996). A clivagem da MMP 2
e da MT1MMP da cadeia de laminina 5 expõe um sítio crítico pró-migratório, promovendo a
migração de células normais no cérebro (Giannelli et al., 1997; Koshikawa et al., 2000). A
clivagem de CD44 por MT1MMP está associada com migração de célula (Kajita et al., 2001).
A MMP 2 expressa em células Schwann de nervos periféricos degrada proteoglicanos de
sulfato de condroitina acarretando neurite (Krekoski et al., 2002). Portanto, a função das
MMP é muito mais complexa e sutil que uma simples degradação, adicione-mos a esse um
jamais explorado número de proteínas que não são da matriz extracelular, mas também são
substratos de MMP e exercem atividades biológicas (McCawley e Matrisian, 2001; Sternlicht
e Werb, 2001), a complexidade do papel de MMP em saúde e doença parece evidente.
As MMP interferem umas com as outras à medida em que muitas delas podem ativar
outras pro-enzimas, o que sugere que a ativação controlada das mesmas pode envolver uma
cascata, englobando diferentes membros da família das MMP (Cawston, 1998).
As células endoteliais sintetizam várias MMP: MMP1, MMP2, MMP9 e MT1MMP.
Dentre estas a MMP2 , MMP9 e a MT1MMP foram descritas como exercendo importante
papel na angiogênese (Stetler-Stevenson, 1999).
A angiogênese envolve proliferação e migração de células endoteliais, remodelamento
da matriz extracelular, formação tubular, recrutamento de estruturas adjacentes para a
sustentação dos neovasos, anastomoses e desenvolvimento de membrana basal (Ramsden,
2000). As metaloproteinases participam desde a ruptura da membrana basal vascular até a
proliferação endotelial, sendo parte de sua ação sobre moléculas pró-angiogênicas como a
família dos fatores de crescimento endotelial vascular, e angiogênicas como a angiostatina
(Yoon et al., 2003).
31
Nguyen et al. (2001) postularam um modelo para o papel das MMP2 e MMP9 na
angiogênese. A MMP2, constitutivamante secretada pelas células endoteliais, seria ativada
através de uma cascata de ações enzimáticas a partir da trombina.
As metaloproteinases, em especial a MMP 2, são enzimas capazes de causar erosão
óssea (Morales et al., 2007). As MMP são produzidas na matriz dos colesteatomas, tendo sua
ação na perimatriz (Figura 5).
32
Figura 5: Resumo dos diferentes tipos de células que produzem MMP e TIMP. A matriz do
colesteatoma pode desencadear a resposta imunológica com ativação de diferentes células na
perimatriz, tais como macrófagos, fibroblastos, e leucócitos, liberando citocinas, como a
interleucina-1 (IL-1) e o Fator de Necrose Tumoral (TNF α). As células imunológicas,
ativadas, também podem liberar tanto MMP como TIMP. Sob condições fisiológicas, há um
equilíbrio de MMP/TIMP. Reações inflamatórias levam a uma desigualdade entre MMP e
para TIMP, e isto pode levar à remodelação da matriz extracelular.
Naim et al. (2004) afirmam que as metaloproteinases podem ser caracterizadas como
"escavadoras-destruidoras" da matriz extracellular, as quais permitem o remodelamento do
tecido normal e contribuem para a destruição de tecido patológico. Estes autores estudaram 12
33
espécimes de colesteatomas obtidos durante a remoção cirúrgica e utilizaram tecido do meato
acústico externo normal, como controle. O material foi marcado com os anticorps para MMP-
2 e MMP-9. O imunoestadiamento para metaloproteinases estava aumentado em todas as
camadas do colesteatoma, entretanto, a pele do meato acústico externo apresentou
imunoestadiamento moderado. Os mesmos autores (Naim et al., 2004) sugeriram que as
metaloproteinases poderiam modular o balanço entre o crescimento e a apoptose celulares,
garantindo a integridade do tecido. As circunstâncias desequilibradas, tais como descritos
pelos autores (Naim et al., 2004), poderiam resultar em descamação e acúmulo não reguladas
de queratinócitos inoperantes, crescimento invasivo e defeituoso no tecido adjacente, e a
perda do controle do crescimento.
Naim et al. (2005), estudando um sistema antagonista das metaloproteinases,
encontraram que somente as camadas basais dos espécimes de colesteatoma foram marcadas,
já as camadas suprabasais mostraram imunoestadiamento diminuído ou negativo, entretanto,
na pele do meato acústico externo, todas as camadas estavam homogeneamente positivas.
Esses autores (Naim et al., 2005) sugeriram que o equilíbrio entre fatores desintegradores e
estabilizadores no tecido normal, estaria perturbado no tecido inflamado e/ou neoplásico.
Em 1996, Gohlke et al. descreveram a metaloproteinase 2, uma colagenase produzida
no núcleo de células, estando esta relacionada, em vários aspectos, com a progressão de
tumores, incluindo crescimento, invasão, metástase e angiogênese. Segundo Sun e Hemler
(2001) a MMP2, são enzimas proteolíticas capazes de degradar componentes conectivos dos
tecidos e estão envolvidas nas interações extracelulares.
Schonermark et al. (1996) demonstraram que a invasão de tecidos pelo colesteatoma
estava relacionada à MMP2, Banerjee et al. (1997) demonstraram a presença de MMP2 em
colesteatomas. Zhu et al. (2001) observaram que há estreita relação entre colesteatomas e
metaloproteinases (MMP2 e MMP9); concluíram que a desordem entre as metaloproteinases
34
e seus inibidores, foram uma das razões pela absorção óssea causada tanto por câncer de
orelha média quanto por colesteatoma.
Para Bernal-Sprekelsen et al. (2001) o epitélio do colesteatoma é caracterizado por
uma falta de regulação no queratinócito, acompanhado por destruição dos ossículos e outras
partes do osso temporal. Através de métodos imunoistoquímicos perceberam que
metaloproteinases e o fator de crescimento básico de fibroblastos poderiam explicar
atividades destrutivas e proliferativas do colesteatoma na orelha média. Ainda nesse trabalho,
Bernal-Sprekelsen et al. (2001) conseguiram demonstrar alterações na membrana basal de
colesteatomas acompanhada da presença de MMP e uma linear imunoreatividade para
colágeno tipo IV e laminina. Os autores concluem dizendo que as MMP podem ter um
importante papel na manutenção da atividade proliferativa e na agressividade dos
colesteatomas.
Em 2003, Wilmoth et al. descrevem que as MMP são conhecidas por participarem da
fisiologia normal do metabolismo do colágeno, mas também estão associadas com a absorção
patológica da matriz extracelular de processos inflamatórios crônicos de pele, tumor e
metástases. Djonov et al. (2001) correlacionaram a presença de MMP2 com a progressão do
câncer de mana para fenótipos mais agressivos e com a indiferenciação celular.
Todas as MMP são inibidas e reguladas por uma família específica de proteínas, que
se denominam inibidores teciduais de metaloproteinases - TIMP (Matrisian,1990; Nguyen et
al., 2001). Atualmente são conhecidos quatro membros da família das TIMP, os quais são
capazes de se ligar e inibir a atividade de todos os membros da família das MMP.
(McCawley e Matrisian, 2000).
A interrupção da homeostase MMP-TIMP, pode desencadear um processo patológico,
ou seja, a maior quantidade de metaloproteinases, poderia contribuir para o processo de
absorção óssea. Neste sentido, a quantificação das metaloproteinases pode ser útil na
35
avaliação do comportamento dos colesteatomas, como marcadores de sua agressividade. O
entendimento da complexidade das MMP, em termos de suas atividades biológicas, ainda é
incipiente, algumas questões são paradoxais, por exemplo como podem exibir efeitos pró e
anti inflamatórios, ou pró e anti angiogênicas? (Nagase et al., 2006).
PARTE II – A PESQUISA
2.
Justificativa
Existem controvérsias quanto às características clínicas dos colesteatomas pediátricos.
Alguns autores sugerem que, na infância, a otite média crônica colesteatomatosa seria mais
agressiva e teria um prognóstico menos favorável do que em adultos (Glasscock, 1981; Ruah,
1992; Bujia et al., 1996, Palva et al., 1997; Sudhoff et al., 2000). Porém, ainda não há
achados histológicos, bioquímicos e/ou biofísicos, conclusivos que confirmem essa hipótese.
Após a comparação histológica dos colesteatomas, em especial da perimatriz, entre
pacientes pediátricos e adultos, Dornelles et al. (2006) encontraram fortes evidências de que o
processo inflamatório nos colesteatomas pediátricos seria mais exuberante. A análise
imunoistoquímica auxiliará a determinar, com maior precisão, o grau de inflamação, bem
como sua correlação com a idade do paciente à data da cirurgia. Ao mesmo tempo que a
quantificação das metaloproteinases na perimatriz poderá nos auxiliar a saber se a espessura
da perimatriz está relacionada ao seu grau inflamatório ou a quantidade de fibras de colágeno
da sua estrutura.
Estes dados poderão acrescentar subsídios para a determinação da maior agressividade
ou não da OMCC em crianças.
3.
Objetivos
3.1 Objetivo Geral
Descrever, histologicamente, a perimatriz dos colesteatomas adquiridos de crianças e
adultos vistos à microscopia óptica.
3.2 Objetivos Específicos
1 - Correlacionar a espessura da perimatriz, medida em micrômetros (µm), com a
idade do paciente na data da cirurgia.
2 - Correlacionar a espessura da perimatriz, medida em micrômetros (µm), com grau
histológico de inflamação.
3 - Correlacionar a espessura da perimatriz com os anticorpos de CD31, MMP2
citoplasmática e nuclear e MMP9
4 - Correlacionar o grau histológico de inflamação com os anticorpos de CD31,
MMP2 citoplasmática e nuclear e MMP9
5- Correlacionar a idade do paciente à cirurgia com os anticorpos de CD31, MMP2
citoplasmática e nuclear e MMP9
4.
Métodos
4.1 Delineamento
Estudo transversal, comparativo e contemporâneo, onde o fator em estudo foram os
colesteatomas, e o desfecho foram componentes histológicos e imunoistoquímicos da
perimatriz e da matriz dos colesteatomas adquiridos.
4.2 Pacientes
Os pacientes incluídos neste estudo foram provenientes do Ambulatório de Otite
Média Crônica do Hospital de Clínicas de Porto Alegre (AOMC-HCPA), com diagnóstico de
otite média crônica colesteatomatosa, não havendo discriminação quanto a sexo e etnia. Os
pacientes foram separados em dois grupos: pediátrico, constituídos por pacientes na faixa
entre 0 e 18 anos, 11 meses e 30 dias; e adulto, com pacientes a partir de 19 anos (conforme a
40
Convenção das Nações Unidas sobre os Direitos da Criança, 1989), sendo considerada a idade
do paciente à data da cirurgia.
No AOMC-HCPA, na primeira consulta, foram coletados: dados básicos de
identificação (nome, sexo, data de nascimento, data da consulta, número do prontuário,
telefone de contato) e motivo do encaminhamento para o Serviço de Otorrinolaringologia. Foi
realizada anamnese dirigida, acumetria com diapasão de 512 Hz, teste de Rinne, teste de
Weber e otoscopia das duas orelhas. No Anexo 1, encontra-se o modelo do protocolo de
primeira consulta do AOMC-HCPA.
Ainda nessa consulta inicial, foi realizada uma filmagem das duas orelhas para análise
das doenças, discussão da patogênese e arquivo. Essas imagens foram captadas através do
Vídeo Digital Recorder e armazenadas em CD.
Conforme a rotina do Serviço de Otorrinolaringologia e a disponibilidade de horários,
os pacientes foram encaminhados para cirurgia. Durante o ato cirúrgico é preenchido
protocolo detalhado de onde são extraídos os dados sobre o estado da cadeia ossicular e a via
de formação dos colesteatomas.
4.3 Processo de Amostragem
4.3.1 Cálculo do Tamanho da Amostra
Com base no trabalho de Dornelles (2004), considerando-se α = 0,05, β = 0,10 e um
tamanho de efeito padronizado de 0,70, foi calculado um número total de 90 pacientes, sendo
45 de cada grupo. Este tamanho de amostra é suficiente para encontrar uma correlação igual
ou maior que 0,50, entre a idade do paciente à data da cirurgia e a espessura da perimatriz.
41
4.3.2 Critérios de Inclusão
A inclusão dos pacientes neste estudo obedeceu dois critérios:
1. Diagnóstico de Otite Média Crônica Colesteatomatosa
2. Presença histológica de matriz e perimatriz no colesteatoma coletado.
Para auxiliar o entendimento do segundo critério de inclusão, caso clássico de
representação histológica da presença de matriz e perimatriz no material processado pode ser
visto na Figura 6, a seguir. Em A, vê-se a perimatriz constituída por tecido conjuntivo
subepitelial, contendo fibras colágenas, elásticas, fibroblastos e células inflamatórias. A
matriz está identificada pela letra B, sendo um epitélio semelhante ao da epiderme da pele
normal. O conteúdo cístico, formado por queratina, é visualizado na região identificada pela
letra C.
Figura 6: Imagem digitalizada de lâmina, com corte transversal de colesteatoma,
corada em Hematoxilina-Eosina. Podemos ver suas três partes
constituintes: A – perimatriz, B – matriz, C – conteúdo cístico. Aumento:
100x
C
B
A
42
4.3.3 Critério de Exclusão
Foram critérios de exclusão:
1 - o diagnóstico de colesteatoma congênito;
2 – a não reatividade aos anticorpos após a terceira coloração.
4.4 Colesteatomas
Os colesteatomas foram coletados, no período de maio de 2003 a março de 2007, pelo
cirurgião otologista em locais específicos da orelha média, sendo eles no mesotímpano, no
ático e sobre o canal semicircular lateral. Estes locais foram selecionados para tentar garantir
que as amostras coletadas, as quais deveriam ter no mínimo 5 milímetros, tivessem matriz e
perimatriz. O material coletado foi imediatamente fixado em formol a 10% e posteriormente
processado pelas técnicas histológicas habituais, com inclusão em parafina.
Foram preparadas cinco lâminas para análise de cada amostra de colesteatoma (Figura
7). As lâminas foram coradas em Hematoxilina-Eosina (HE), Picrossírius (Sirius Red),
Anticorpo CD31, Anticorpo MMP2, Anticorpo MMP9 e analisadas em microscópio óptico.
A coloração em HE foi utilizada para avaliar a integridade histológica do colesteatoma
(presença de matriz e perimatriz), além da obtenção das descrições histológicas dos
componentes dos colesteatomas; a de Picrossírios serviu para a medição da espessura da
perimatriz, pois nela as fibras de colágenos coram-se em bordô, facilitando a delimitação do
campo a ser medido. As lâminas com o anticorpo CD31 foram utilizadas para a contagem
total de vasos. As amostras com as metaloproteinases (MMP2 e MMP9) foram utilizadas para
a quantificação de metaloproteinases.
43
Figura 7: Nessa imagem podemos ver a mesma amostra corada em HE (A), Picrossírios (B),
MMP2 citoplasmática (C), MMP2 nuclear (D), MMP9 (E), CD31 (F). Aumento:
40x (A e B), 200x (C a F)
A
B
C
D
E
F
44
4.5 Descrição Histológica
Todas as descrições foram realizadas pela mesma patologista, de maneira “cega”,
sendo observados os seguintes constituintes: número médio de camadas celulares da matriz,
presença de hiperplasia na matriz, espessura e epitélio delimitante da perimatriz, fibrose e
granuloma na perimatriz.
O número médio de camadas celulares da matriz foi obtido pela contagem dessas, em
cinco campos diferentes, e coletado de maneira contínua. Os dados de hiperplasia na matriz, o
epitélio delimitante da perimatriz, fibrose e granuloma na perimatriz foram coletados de
maneira qualitativa do tipo sim ou não.
4.6 Medição da Perimatriz
Após a avaliação da lâmina em HE, com a confirmação da integridade histológica das
amostras, era feita a segunda lâmina em Picrossírios (Figura 3B), a qual foi utilizada para a
medida da espessura da perimatriz.
As lâminas com cortes transversais de colesteatoma foram analisadas no microscópio
Olympus modelo BX40, acoplado a uma câmera digital Sony, conectada a um
microcomputador com placa de captura de imagens, para a obtenção das imagens digitais do
material. A leitura foi “cega” e controlada pela pesquisadora.
A espessura da perimatriz, medida em micrômetros, foi obtida através de análise de
imagens computadorizadas, utilizando-se o software ImagePro Plus (Figura 8, a seguir).
45
Figura 8: Imagem capturada no programa ImagePro Plus, representando o módulo de
medição. Aumento: 100x
De cada amostra foram realizadas 20 medidas da espessura da perimatriz. Dessas
medidas, foram obtidas a média, a mediana, o tamanho mínimo, o tamanho máximo, o delta
(tamanho máximo – tamanho mínimo) e a soma, sendo esses os parâmetros utilizados para as
comparações entre os grupos.
Para a obtenção das 20 medidas de espessura, a lâmina foi percorrida em toda a sua
extensão, sendo digitalizadas quantas imagens fossem necessárias para retratarmos a
variabilidade intrapacientes.
Os dados coletados foram registrados em planilhas do aplicativo Excel.
46
4.7 Imunoistoquímica
Os mesmos colesteatomas utilizados para os cortes com coloração em Picrossírios
foram submetidos à técnica de imonuistoquímica utilizada na rotina do Serviço de Patologia,
a qual consiste na desparafinização e reidratação, recuperação antigênica, inativação de
peroxidase endógena e bloqueio das reações inespecíficas.
Para a contagem do número médio de vasos sangüíneos foi preparada a terceira lâmina
utilizado-se o anticorpo anti-CD31 primário (clone JC7OA, Dako Cytomation, Carpinteria,
CA, USA). O material foi encubado por 12 horas, a quatro graus Celsius, na diluição 1:40,
seguido de aplicação do complexo estreptavidina-biotina-peroxidase (LSAB, Dako) e
revelação com diaminobenzidina tetraidroclorido (Kit DAB, Dako).
A leitura das lâminas foi realizada sob microscopia óptica com aumento de 200 vezes,
por duas observadoras independentes (sendo uma delas professora do Departamento de
Patologia da FAMED-UFRGS e a outra sendo a própria pesquisadora). Todas as lâminas
passaram por uma leitura “cega” e controlada pela pesquisadora.
O número médio de vasos sangüíneos na perimatriz foi coletado de maneira contínua,
obtida pela contagem de pontos de Chalkley, onde uma grade, contendo 25 pontos, é colocada
sobre a imagem digitalizada e são contados todos os pontos que coincidam com os vasos
marcados (Figura 9). Foram realizadas de duas a cinco imagens, dependendo do tamanho dos
colesteatomas, com o número de vasos contados em cada imagem foi obtida a média. As áreas
da perimatriz com óbvio tecido de granulação foram evitadas na captura das imagens. A
leitura das lâminas foi realizada por duas observadoras independentes (uma aluna do
Departamento de Patologia da FAMED-UFRGS e segunda a própria pesquisadora), a variável
final foi a média de todas as leituras realizadas em cada lâmina.
47
Figura 9: Imagem capturada no programa ImagePro Plus, representando o módulo de
contagem dos vasos sanguíneos. Aumento: 200x
Para avaliar a produção das metaloproteinases foram preparadas as duas últimas
lâminas utilizando-se os anticorpos anti-MMP2 (72kDa Collagennase IV, Chemicon
Internacional, USA) e o anti-MMP9 (clone 9D4.2, Chemicon Internacional, USA). Os cortes
de colesteatomas foram incubados por 72 horas, a quatro graus Celsius, na diluição 1:40,
seguido de aplicação do complexo estreptavidina-biotina-peroxidase (LSAB, Dako) e
revelação com diaminobenzidina tetraidroclorido (Kit DAB, Dako). A imunoreatividade das
metaloproteinases foi observada na matriz dos colesteatomas, sendo que a MMP9 no
citoplasma das células do epitélio e a MMP2 no citoplasma e no núcleo.
48
Observou-se a intensidade de coloração da MMP2 e da MMP9, sendo resultado o
expresso em 0, 1, 2 e 3, de acordo com a intensidade de coloração das metaloproteinases
(ausente, discreto, moderado e acentuado, respectivamente). Além de avaliar a intensidade da
coloração, também foi estimado o percentual de material que havia sido corado, numa escala
que variou de zero (nenhuma imunoreatividade) a 100% (todo o material corado), este
percentual foi dicotomizado em: 1 - quando os percentuais variavam de 0 a 50% e 2 - de 51 a
100%. A variável final a ser analisada, estatisticamente, foi o resultado do produto entre a
intensidade de coloração (de zero a três) pelo fator multiplicador (1 ou 2) resultante do
percentual de material corado.
4.8 Considerações Éticas
Foi obtido Termo de Consentimento Livre Informado (Anexo 2) para a utilização
anônima dos dados dos pacientes e para coleta do material em cirurgia. A obtenção ou não do
consentimento informado não influenciou o tratamento dos pacientes. Este projeto foi
aprovado, quanto às questões éticas e metodológicas, pelo Grupo de Pesquisa e Pós-
Graduação do HCPA, em outubro de 2002 (Anexo 3).
4.9 Análise Estatística
A comparação entre os grupos foi realizada através dos testes de Mann-Whitney e exato
de Fisher. Para verificar a existência de correlação, foi utilizado o coeficiente de correlação de
49
Spearman. A análise estatística foi executada no software Statistical Package for Social Science
(SPSS) 10.0 for Windows.
1) Coeficiente de correlação de Spearman: foi utilizado para o estudo das
correlações entre duas variáveis contínuas, correlacionando-se a variável idade com a
espessura da perimatriz, com a imunoreatividade das metaloproteinases, com o
número de vasos sangüíneos na perimatriz e com o número médio de camadas
celulares da matriz. Também foi utilizado para verificar a existência de correlação
entre a espessura da perimatriz com o número de vasos sangüíneos na perimatriz e o
número médio de camadas celulares da matriz.
2) Teste Mann-Whitney: foi utilizado para testar a homogeneidade dos
dois grupos em relação ao número médio de camadas celulares da matriz, o número
médio de vasos sanguíneos na perimatriz, a imunoreatividade dos anticorpos anti-
CD31, anti-MMP2 e anti-MMP9.
3) Teste de exato de Fisher: foi utilizado para testar a homogeneidade dos
dois grupos em relação às variáveis hiperplasia na matriz, fibrose, granuloma e
epitélio delimitante da perimatriz.
A análise descritiva da idade foi realizada por meio da observação do cálculo de
médias e desvios-padrão. Para a variável gênero, foi calculada a freqüência absoluta.
Todos os testes foram realizados na forma bi-caudal, admitindo-se como
estatisticamente significativos os valores de P menores ou iguais a 0,05.
5. Resultados
5.1 Dados Demográficos
A amostra contou com 120 colesteatomas, sendo distribuídos igualmente entre os
grupos pediátrico (até 18 anos de idade à data da cirurgia) e adulto (com mais de 18 anos à
data da cirurgia). A amostra estava igualmente dividida quanto ao gênero também.
A média ± desvio padrão da idade dos pacientes à data da cirurgia foi de 24,99 ±
16,80 anos. O grupo pediátrico apresentou média de idade igual a 11,75 ± 3,48 anos, sendo de
38,02 ± 14,31 anos no grupo adulto.
A Figura 10, a seguir, apresenta o fluxograma da amostra e o Anexo 4 apresenta uma
descrição detalhada do grupo de pacientes.
51
Figura 10: Fluxograma da inclusão e distribuição da amostra.
5.2 Dados Histológicos
Nesta seção, são relatados dados obtidos das descrições histopatológicas das lâminas
referentes aos casos estudados, bem como algumas imagens digitais representativas dos
resultados encontrados (Figura 11). As demais imagens da coleção estão em CD anexo a esse
volume (Anexo 6).
90 analisados
115 pacientes
15
45 pediátricos
15
45 adultos
30 sem
imunoistoquímica
5 colesteatomas bilaterais
3
2
120 colesteatomas
52
Figura 11: Colesteatomas representativos da amostra, ilustrando seus constituintes histológicos. 1 –
Perimatriz, 2 – Matriz, 3 – Conteúdo Cístico. A – Colesteatoma epitimpânico, proveniente de paciente do
gênero feminino, com 44 anos de idade. Histologicamente apresenta-se como epitélio escamosos
estratificado, queratinizado, com média de três camadas de células. Perimatriz ausente. Aumento: 200x. B
– Colesteatoma epitimpânico, proveniente de paciente do gênero masculino, com 37 anos de idade.
Histologicamente apresenta-se como epitélio escamoso estratificado, queratinizado, com média de seis
camadas de células. Perimatriz estreita, fibrótica, com raros linfócitos. Ausência de granuloma. Aumento:
200x. C – Colesteatoma mesotimpânico, proveniente de paciente do gênero feminino, com 35 anos de
idade. Histologicamente apresenta-se como epitélio escamoso estratificado, queratinizado, com média de
quatro camadas de células. Perimatriz muito estreita, sem fibrose e sem infiltrado inflamatório. Aumento:
200x. D - Colesteatoma mesotimpânico, proveniente de paciente do gênero masculino, com 16 anos de
idade. Histologicamente apresenta-se como epitélio escamoso estratificado, queratinizado, com média de
seis camadas de células. Perimatriz estreita e delicada, sem fibrose e com infiltrado inflamatório discreto.
Aumento: 200x. E - Colesteatoma epitimpânico, proveniente de paciente do gênero feminino, com 11
anos de idade. Histologicamente apresenta-se como epitélio escamoso estratificado, queratinizado, com
média de doze camadas de células epiteliais. A perimatriz exibe fibrose densa, infiltrado inflamatório
crônico acentuado e está delimitada em seu plano profundo por epitélio cubóide simples. Aumento: 50x. F
- Colesteatoma mesotimpânico, proveniente de paciente do gênero feminino, com sete anos de idade.
Histologicamente apresenta-se como epitélio escamoso estratificado, queratinizado, com média de treze
camadas de células. Perimatriz mostra fibrose discreta com infiltrado inflamatório acentuado e exsudação
neutrocitária, estando delimitada em seu plano profundo por epitélio cubóide simples. Ausência de
granulomas. Aumento: 50x.
E
C
F
D
53
Os colesteatomas apresentaram-se, ao microscópio óptico, como uma formação
cística, revestida por epitélio escamoso estratificado e queratinizado, a chamada matriz,
assentada sobre tecido conjuntivo denso de espessura variável, tanto intra como
interpacientes, designado de perimatriz. Essa, por vezes, exibia infiltrado inflamatório
linfoplasmocitário e/ou tecido de granulação e reação de corpo estranho, especialmente se
tivesse ocorrido ruptura da lesão. O conteúdo cístico, por sua vez, consistia de lamelas de
queratina.
Pode-se afirmar que o revestimento (matriz) dos colesteatomas é indistinguível de
uma mucosa escamosa (epitélio escamoso estratificado com um córion – lâmina própria –
subjacente, como os encontrados no revestimento da boca, vagina, esôfago) e da pele, exceto
pelo fato de esta última exibir os anexos cutâneos (pêlos e glândulas). Também não podem
ser distinguidos dos cistos epidérmicos ou infundibulares, de qualquer localização.
O número médio de camadas celulares do epitélio escamoso estratificado variou de 2
a 23, com mediana de 6 (5 a 9). A hiperplasia na matriz apareceu em 34% dos colesteatomas,
14% apresentavam granuloma e em 61% havia fibrose presente. A presença de um epitélio
cubóide simples, delimitando a perimatriz em seu plano profundo, ocorreu em 22% dos casos.
Quando estratificado por grupo etário, os componentes histológicos analisados
apresentaram distribuição semelhante nos dois grupos, com exceção da espessura da
perimatriz e da presença de epitélio delimitante (Tabela 1).
54
Tabela 1: Comparação dos grupos pediátrico e adultos quanto às características
histomorfológicas do colesteatoma
Variável Geral n=120 Pediátrico n=60 Adulto n=60 Valor P
Espessura 81 (34 a 217) 104 (48 a 245) 49 (15 a 176) 0,045
1
Matriz 6 (5 a 9) 6 (5 a9) 6 (5 a 10) 0,721
1
Hiperplasia 39 (34,5%) 20 (33,3%) 19 (32,2%) 0,988
2
Epitélio Delimitante 25 (22,1%) 17 (28,3%) 7 (11,9%) 0,037
2
Fibrose 75 (61,3%) 39 (65,0%) 36 (61,0%) 0,668
2
Granuloma 16 (14,3%) 8 (13,3%) 8 (14,5%) 0,999
2
Mann-Whitney
1
, Exato de Fisher
2
A perimatriz aparece como uma rede inflamatória que envolve o colesteatoma, de
espessura variável, tanto intra como interpacientes. Havia sete amostras com perimatriz igual
a zero, sendo seis no grupo de adultos e apenas uma no grupo pediátrico.
5.3 Dados Imunológicos
Nesta seção, são relatados dados obtidos das análises com os marcadores
imunológicos (anti-CD31, anti-MMP2 citoplasmática e nuclear e anti-MMP9) das lâminas
referentes aos casos estudados, bem como as imagens digitais representativas dos resultados
encontrados (Figuras 12, 13, 14 e 15).
Dos 120 colesteatomas analisados, 30 tiveram de ser excluídos desta parte da análise,
por não apresentarem condições para o processamento imunoistoquímico.
O número médio de vasos sangüíneos (Figura 12) foi de 6 (0 a 11). No grupo
pediátrico foi igual a 7 (4 a 11), e no grupo adulto de 4 (0 a 10). Ao compararmos o número
médio de vasos sangüíneos entre os grupos, através do teste Mann-Whitney, encontramos
diferença estatisticamente significativa (P=0,044).
55
Figura 12: Colesteatoma marcado com CD 31. Aumento: 200x
A mediana da MMP 2 citoplasmática (Figura 13) foi de 0 (0 a1). No grupo pediátrico
foi igual a 1 (0 a 3), e no grupo adulto de 0 (0 a 1). Ao compararmos a quantidade de MMP2
citoplasmática entre os grupos, através do teste Mann-Whitney, encontramos diferença
estatisticamente significativa (P=0,006).
56
Figura 13: Colesteatomas marcados com MMP2 no citoplasma. Aumento: 200x
Os resultados para MMP2 nuclear (Figura 14) apresentaram semelhantes: mediana
grupo geral foi de 0 (0 a 1); no grupo pediátrico foi igual a 1 (0 a 1), e no grupo adulto de 0 (0
a 1). Ao compararmos a quantidade de MMP2 citoplasmática entre os grupos, através do teste
Mann-Whitney, encontramos diferença estatisticamente significativa (P=0,056).
57
Figura 14: Colesteatomas marcados com MMP2 no núcleo. Aumento: 200x
A mediana da MMP 9 (Figura 15) foi de 1 (0 a 4). No grupo pediátrico foi igual a 2 (0
a 4), e no grupo adulto de 0 (0 a 4). Ao compararmos a quantidade de MMP9 entre os grupos,
através do teste Mann-Whitney, encontramos diferença estatisticamente significativa
(P=0,049).
58
Figura 15: Colesteatomas marcados com MMP2 no citoplasma. Aumento: 200x
A tabela 2 apresenta a comparação das variáveis, entre os grupos pediátrico e adulto,
através dos testes de Mann-Whitney.
Tabela 2: Comparação das variáveis estudas entre os grupos Pediátrico e Adulto 70
Variável Geral n=90 Pediátrico n=45 Adulto n=45 Valor P
Número de Vasos: CD31 6 (0 a 11) 7 (4 a 11) 4 (0 a 10) 0.044
MMP2 citoplasmática 0 (0 a 2) 1 (0 a 3) 0 (0 a 1) 0.006
MMP2 nuclear 0 (0 a 1) 0 (0 a 1) 0 (0 a 1) 0.056
MMP9 1 (0 a 4) 2 (0 a 4) 0 (0 a 4) 0.049
Mann-Whitney
Ao correlacionarmos o número médio de vasos sangüíneos e das metaloproteinases,
entre si, e com o número médio de camadas celulares da matriz, com a espessura da
59
perimatriz e com o grau histológico de inflamação encontramos correlações fortes, porém
somente a MMP2 citoplasmática apresentou correlação com a idade do paciente à data da
cirurgia (Tabela 3).
Tabela 3: Correlações encontradas entre as variáveis estudadas
Idade Espessura
Matriz CD31 MMP2 c MMP2 n MMP9
Idade _____ -0.256
(0.008)
-0.010
(0.919)
-0.164
(0.160)
-0.248
(0.027)
-0.139
(0.180)
-0.154
(0.173)
Espessura
-0.256
(0.008)
_____ 0.479
(<0.0001)
0.742
(<0.0001)
0.465
(<0.0001)
0.414
(<0.0001)
0.643
(<0.0001)
Matriz -0.010
(0.919)
0.439
(<0.0001)
_____ 0.473
(<0.0001)
0.302
(<0.0001)
0.183
(0.077)
0.300
(0.007)
CD31 -0.164
(0.160)
0.742
(<0.0001)
0.473
(<0.0001)
_____ 0.539
(<0.0001)
0.515
(<0.0001)
0.850
(<0.0001)
MMP2 c -0.248
(0.027)
0.465
(<0.0001)
0.302
(<0.0001)
0.539
(<0.0001)
_____ 0.908
(<0.0001)
0.664
(<0.0001)
MMP2 n -0.139
(0.180)
0.414
(<0.0001)
0.183
(0.077)
0.515
(<0.0001)
0.908
(<0.0001)
_____ 0.548
(<0.0001)
MMP9 -0.154
(0.173)
0.643
(<0.0001)
0.300
(0.007)
0.850
(<0.0001)
0.664
(<0.0001)
0.548
(<0.0001)
_____
Idade= idade do paciente à data da cirurgia, em anos; Espessura= espessura da perimatriz,
em micrômetros; Matriz= número médio de camadas celulares da matriz; Inflamação= grau
histológico de inflamação; CD31= número médio de vasos sanguíneos na perimatriz;
MMP2 c= reatividade da metaloproteinase 2 no citoplasma das células da matriz; MMP2 n=
reatividade da metaloproteinase 2 no núcleo das células da matriz; MMP9= reatividade da
metaloproteinase 9 no citoplasma das células da matriz; Coeficiente de Correlação de
Spearman (Valor P)
6. Discussão
Iniciamos essa discussão retomando algumas questões já elencadas na introdução e
revisão da literatura dessa tese. Em nossa dissertação de mestrado (Dornelles et al., 2006)
apresentamos evidências de que há correlação inversa entre o tamanho da perimatriz, medida
em micrômetros, com a idade do paciente na data da cirurgia, e uma correlação direta dessa
espessura com o número médio de camadas celulares na matriz. Com esses resultados,
podemos sugerir que as características clínicas diferenciadas dos colesteatomas pediátricos
poderiam estar relacionadas à intensidade do processo inflamatório na sua estrutura. Além
dos indícios de um maior grau de inflamação nos colesteatomas pediátricos, já havíamos
encontrado correlação direta entre o número médio de camadas de células epiteliais na matriz
com a espessura da perimatriz. Esse fato poderia indicar que não só a perimatriz encontra-se
mais ativa nos colesteatomas pediátricos, mas também a matriz teria um estado proliferativo,
atual ou passado, mais acentuado. Esses achados corroboram a hipótese de Bujia et al. (1996)
os quais sugeriram que os colesteatomas pediátricos apresentariam um estado acelerado de
proliferação. No entanto, a técnica utilizada naquele momento não era capaz de responder se
a espessura da perimatriz estava relacionada ao seu grau inflamatório ou à quantidade de
fibras de colágeno em sua estrutura.
61
Responder esta questão é de fundamental importância visto que as fibras de colágeno
são material amorfo, bioquimicamente inerte, ao contrário do processo inflamatório, que
quando ativo, poderá ter repercussões clínicas.
Considerando-se que a perimatriz é formada por fibras de colágeno e células
inflamatórias, elaboramos duas hipóteses para as diferenças de espessura da perimatriz, em
colesteatomas adquiridos:
1. uma perimatriz mais espessa poderia ser conseqüência de uma maior quantidade
de fibras colágenas (achado, possivelmente, acompanhado de uma menor
ação das enzimas colagenases);
2. o aumento da espessura da perimatriz dever-se-ia ao processo inflamatório
acentuado.
No presente estudo, pudemos demonstrar, através da quantificação do processo de
angiogênese e das metaloproteinases, que a espessura da perimatriz está correlacionada com o
grau inflamatório e não com a quantidade de colágeno, visto que encontramos correlação
direta e forte entre a espessura da perimatriz, o grau de angiogênese e a expressão das
metaloproteinases.
Os presentes achados confirmaram a existência de correlação entre o tamanho da
perimatriz e seu grau histológico de inflamação, pois encontramos correlação forte e direta
entre essas variáveis, ou seja, quanto maior a perimatriz maior o grau de angiogênese
encontrado nos colesteatomas. Também encontramos correlação, igualmente forte e direta da
angiogênese com a expressão das metaloproteinases estudadas, portanto, quanto maior a
produção de metaloproteinases maior o grau de angiogênese nos colesteatomas estudados.
62
Além desse achado, também através do anticorpo anti-CD31, encontramos diferença
da angiogênese entre as classes etárias (grupos pediátrico e adulto) e pudemos observar que,
no grupo pediátrico, o número médio de vasos sangüíneos na perimatriz é bem maior do que
no adulto. Esse achado sugere que o processo inflamatório é definitivamente mais exacerbado
nas crianças o que poderia traduzir-se em uma agressividade maior nos colesteatomas
pediátricos.
Nesse ponto, ainda resta-nos a questão da quantidade de fibras de colágeno na
perimatriz, dado que estudamos através das enzimas que degradam essa proteína, as
metaloproteinases.
Nossos resultados demonstraram que as metaloproteinases (MMP2 citoplasmática,
MMP2 nuclear e MMP9) estão com expressão aumentada em colesteatomas pediátricos.
Cabe, neste momento, ressaltar que a MMP2 citoplasmática também estava correlacionada,
inversamente, com a idade do paciente à data da cirurgia, ou seja, quanto menor a idade do
paciente maior é a expressão desta proteína.
Sabemos que a MMP2 é uma enzima proteolítica capaz de degradar componentes de
ligação celular, característica essa que está associada com a capacidade de infiltração e
invasão em tecidos adjacentes. Em processos biológicos normais, a MMP2 é uma das
responsáveis pela homeostase da estrutura óssea, apresentando-se expressa em maior
quantidade em doenças inflamatórias osteolíticas. Através dos resultados por nós
encontrados, podemos sugerir que os colesteatomas pediátricos possuam um maior poder de
invasão e erosão, em conseqüência da maior expressão de MMP2, do que os colesteatomas
em pacientes adultos. A maior expressão de MMP2 pode dever-se ao fato de haver uma
processo inflamatório mais exacerbado no colesteatoma quando em crianças, pois os
mediadores inflamatório estimulam a produção de metaloproteinases.
63
A inflamação crônica e a angiogênese são dois processos que decorrem juntos, sendo
ambos estimulados por hipóxia, o que acarretará o acúmulo de macrófagos e outras células
imunológicas (Murdoch et al., 2005), assim como, em produção aumentada de fatores de
crescimento (Folkman, 1995b; Carmeliet, 2000; Yancopoulos et al., 2000; Ferrara et al.,
2003; Carmeliet, 2005; Semenza et al., 2006).
A angiogênese apóia a inflamação, por fornecer oxigênio e nutrientes para as
necessidades metabólicas das células presentes em locais inflamados (Costa et al., 2007).
Essa interação complexa entre inflamação crônica e angiogênese é desencadeada pela
produção de óxido nítrico (NO), sendo a síntese desse ativada por agentes inflamatórios. O
óxido nítrico estimula a dilatação e a permeabilidade dos vasos sangüíneos, uma característica
exigida para o extravazamento de células do sistema imune. Um dos passos cruciais
envolvidos nesse processo é a adesão de células imunológicas às células endoteliais da parede
vascular (Kreis e Vale, 1999). As moléculas de metaloproteinases têm um papel relevante
nessa etapa do processo inflamatório, e são regulados por uma variedade de mediadores
inflamatórios liberados por diferentes tipos de células (Kreis e Vale, 1999; Ley, 2001; Bujia
et al., 1994).
A hipóxia é característica na inflamação, induzindo o aumento da expressão de fatores
indutores dessa, os quais promovem a transcrição de vários genes angiogênicos (Coussens e
Werb, 2004; Naldine e Carraro, 2005). A ativação do Fator Nuclear Kappa-B (NF-kB), um
fator de transcrição, é um acontecimento primário na inflamação. O NF-kB é um molécula
regulatória da expressão e da função de um grande espectro de genes, incluindo as
metaloproteinases, envolvidos na sobrevivência, crescimento e migração celular (Charo e
Ransohoff, 2006; Charo e Taubman, 2004; Maxwel et al., 1999; Karin et al., 2002; Karin,
2006). Ao todo, o apoio de vários tipos distintos de células capacita à produção contínua de
64
moléculas inflamatórias e de angiogênese, tais como, a ativação de metaloproteinases que
degradam a matriz extracelular (Ley, 2001).
Vários trabalhos estudaram a relação da inflamação com a otite média crônica
colesteatomatosa: Sudhoff et al. (2004), Hamzei et al. (2003), Dazert et al. (2003), Schilling
et al. (1991), Dornelles et al. (2006), Dornelles (2004b), dentre outros.
Sudhoff et al. (2004), em modelo experimental com ratos, usaram os marcadores
imunoistoquímicos CD11a, CD11b, CD14, CD51 e CD68. Os autores encontraram uma
expressão aumentada das citocinas investigadas: fator estimulante de colônias de macrófagos
(M-CSF), osteoprotegerina (OPG) e o ligante de osteoprotegerina (OPGL). Sugerem que
esses resultados revelam os eventos básicos da biologia inflamatória na reabsorção óssea
realizada por osteoclastos e fornecem novas introspecções na compreensão da erosão óssea
induzida por colesteatoma.
Hamzei et al. (2003) investigaram a expressão de fatores de ativação e diferenciação
de osteoclastos e estudaram a ocorrência de células precursoras de osteoclastos no tecido de
colesteatoma adquirido humano, através de análise imunoistoquímica com uma família de CD
(CD4, CD11a, CD11b, CD14, CD51, CD68). Esse estudo revelou que o número de células
precursoras de osteoclastos estava aumentada na perimatriz. Esses resultados apoiam um
conceito descrito para a artrite inflamatória: a inflamação relacionada ao colesteatoma induz a
reabsorção do osso pela liberação de OPGL das células-T ativadas e provoca a
osteoclastogênese.
Dazert et al. (2003) realizaram estudo para a avaliarem as taxas de proliferação e
expressão das moléculas de adesão celular para analisar o papel patogenético da matriz no
colesteatoma. Os parâmetros celulares-biológicos foram comparados aos achados clínicos. As
taxas de proliferação da matriz foram aumentadas na comparação ao epitélio normal. As
moléculas de adesão celular para junções intercelulares estavam expressas similarmente no
65
teste padrão nos colesteatomas e no epitélio normal. As moléculas de adesão celular para
junção das células matriz mostraram expressão aumentada nos colesteatomas. Esse estudo
confirma hipóteses precedentes que o crescimento dos colesteatomas não é estimulado pela
matriz, mas sim que a proliferação aumentada dessa é estimulada pelo processo inflamatório
na perimatriz no colesteatoma.
Schilling et al. (1991) caracterizaram as células que infiltraram o estroma de
colesteatomas adquiridos, usando um painel dos anticorpos monoclonais (anti-CD45, anti-
CD3, anti-CD22, anti-CD19). Demonstraram que os infiltrados celulares no estroma do
colesteatoma são compostos principalmente de células T com os macrófagos dispersos entre
eles. A expressão de HLA-DR, molécula do complexo de histocompatibilidade, era quase tão
elevada quanto que a de CD45, antígeno comum leucocitário, visto que as células de CD25-
positivo foram detectadas em quantidades mais baixas. Também encontraram que a maioria
de células T e os macrófagos no estroma do colesteatoma estão em um estado
imunologicamente ativado.
Aspectos celulares da angiogênese, ou seja, os vários níveis do processo envolvido no
crescimento de novos vasos sangüíneos a partir de vasos pré-existentes, incluem migração e
proliferação de células bem como remodelação da matriz extracelular, tendo como fator
chave desse processo as metaloproteinases (Bogaczewicz et al. 2006). A degradação dos
componentes da matriz extracelular vascular é um evento significativo durante a angiogênese,
sendo crucial para a formação de novos vasos sangüíneos.
Como já mencionamos, as metaloproteinases são uma classe de enzimas relacionadas
com a estrutura celular, as quais são responsáveis pelo metabolismo da matriz extracelular do
tecido conectivo (Visse e Nagase, 2003).
Morales et al. (2007) relacionaram a expressão da MMP 2 com complicações clínicas
- erosão óssea da cadeia ossicular ou das proteções ósseas da orelha interna, do nervo facial e
66
das meninges - causadas por colesteatomas adquiridos, tendo encontrado que os
colesteatomas provenientes de pacientes que apresentavam complicações clínicas tinham uma
expressão imunoistoquímica de MMP2 mais intensa, quando comparados aos colesteatomas
de pacientes sem complicações. Os autores sugerem que o envolvimento das
metaloproteinases poderia ser fundamental no processo de erosão óssea; sendo assim
sugeriram que se um colesteatoma produzir mais metaloproteinase poderá provocar erosão
óssea mais intensa e, conseqüentemente, incidirá em mais complicações clínicas. Ao nosso
ver essa hipótese proposta por Morales et al. (2007) aproxima-se de uma explicação bastante
plausível para o poder de erosão óssea dos colesteatomas.
Há uma estreita relação entre os processos inflamatórios e as metaloproteinases, um
feedback de auto-alimentação, ou seja, a inflamação provoca o aumento da produção de
metaloproteinases, sendo essas fundamentais para a angiogênese que é um fenômeno
indispensável da resposta inflamatória.
O fato das metaloproteinases serem enzimas associadas com a absorção patológica da
matriz extracelular em processos inflamatórios crônicos (Wilmoth et al., 2003), o que,
portanto, as coloca como parte necessária nos processos de erosão e reabsorção óssea, foi o
que nos levou a estudá-las.
Segundo Olszewska et al. (2004) os colesteatomas possuem a capacidade de
dissolução da matriz extracelular, através de proteólise, o que lhe possibilita a invasão do
estroma de tecidos adjacentes, inclusive do tecido ósseo. Em 1998, Banerjee et al.,
demonstraram que as MMP 2 e 9 encontravam-se presentes no colesteatoma. Nossos
resultados mostram imunoexpressão dessas duas metaloproteinases na matriz dos
colesteatomas adquiridos, sendo que a MMP 2 no núcleo e no citoplasma das células do
epitélio e a MMP 9 no citoplasma.
67
Em 2001, Bernal-Sprekelsen et al. perceberam que as metaloproteinases e o fator de
crescimento básico de fibroblastos poderiam explicar atividades destrutivas e proliferativas
do colesteatoma. Laeeq e Faust (2007) sugerem que o estroma dos fibroblastos poderia
estimular o fenótipo invasivo dos queratinócitos, inclusive a proteólise da matriz extracelular.
Zhu et al. (2001), em estudo experimental, demonstraram que a desordem entre
metaloproteinases e seus inibidores foi uma das razões pela absorção óssea causada por
colesteatoma de orelha média. Em 2003, Wilmoth et al. observaram, também em estudo
experimental, que membranas timpânicas colocadas em cultura com toxinas de bactérias
expressaram maior quantidade de metaloproteinases. Parece-nos, portanto que colesteatomas,
estimulados por fatores infecciosos, produzem mais metaloproteinases. No entanto, no
presente estudo, não tínhamos o objetivo de correlacionar os achados histológicos e
imunoistoquímicos com os achados do estado da cadeia ossicular, bem como com possíveis
agentes infecciosos.
Considerando-se os resultados apresentados nessa tese podemos sugerir que a
agressividade dos colesteatomas reside nos processos bioquímicos que ocorrem na perimatriz
e que é nessa estrutura do colesteatoma onde são desencadeados os gatilhos da erosão óssea,
marca registrada da otite média crônica colesteatomatosa. Ainda, podemos inferir que os
colesteatomas pediátricos são mais agressivos que os de adultos, visto que apresentam um
grau inflamatório mais exacerbado e uma maior produção de metaloproteinases.
Todavia, as metaloproteinases estão envolvidas no processo de remodelação óssea,
que apesar de ocorrer durante a vida toda, apresenta-se em escala exponencial durante a
infância. Apesar de não termos esse dado, pois não era o foco de nossa tese, parece-nos
provável que nessa faixa etária haja uma maior produção de metaloproteinases. Entretanto,
como nossos resultados apontam uma forte correlação direta entre o processo inflamatório e a
produção de metaloproteinases na perimatriz de colesteatomas adquiridos, podemos sugerir
68
que a produção das metaloproteinases nos colesteatomas estudados está mais relacionada ao
processo inflamatório do que ao background dessas enzimas no grupo pediátrico.
Costa, em comunicação pessoal, fez uma analogia da perimatriz com um “campo de
batalha”, sugerindo que seria nessa região histológica do colesteatoma onde ocorreria a
disputa, com os tecidos adjacentes da mucosa da caixa timpânica, pelo território da orelha
média. Com a expansão do colesteatoma, a inflamação aumentaria produzindo mais
elementos da cascata inflamatória.
De um lado, no ataque, encontra-se o colesteatoma; de
outro, os tecidos adjacentes da mucosa da caixa timpânica. Com a expansão do colesteatoma,
a reação inflamatória aumentaria, conseqüentemente produziria mais elementos da cascata
inflamatória. Sendo assim, baseados em nossos achados, podemos sugerir que as
características clínicas diferenciadas dos colesteatomas pediátricos estariam relacionadas à
exuberância da sua inflamação.
No entanto, a grande discussão da patogênese da otite média crônica colesteatomatosa
leva-nos sempre ao um grande elo perdido: qual o fator desencadeante desse processo?
Tentando ilustrar nossa contribuição sobre a patogênese da otite média crônica, apresentamos
uma representação esquemática (Figura 16) de possíveis eventos decorrentes de uma retração
timpânica que culmine com seu toque na cadeia ossicular.
69
Figura 16: Representação esquemática de possíveis eventos decorrentes de uma retração
timpânica, com o toque dessa na cadeia ossicular
Considerando-se que o primeiro evento desse processo seja o toque da membrana
timpânica na cadeia ossicular, os próximos passos seguirão um dos quatro caminhos de uma
encruzilhada:
1 – Resolução: formas incipientes que revertem à normalidade por atuação terapêutica
ou espontaneamente;
2 – Estabilização sem erosão (aparente) da cadeia ossicular (não se descarta
microerosões): casos, não raros na clínica, em que estas retrações permanecem sem processo
inflamatório ativo, por anos sem qualquer complicação;
3 – Erosão grosseira da cadeia ossicular e posterior estabilização: as chamadas
“retrações secas”.
70
4 – Colesteatomatização: desestabilização da retração, com inflamação ativa e
recorrente e possível colesteatomatização, o ápice dessa pirâmide.
O aparecimento e a evolução do colesteatoma parecem ser multifatoriais e,
provavelmente, relacionados às características genéticas e ambientais, envolvendo aspectos
de biologia molecular, com marcada ação de citoqueratinas presentes em células epiteliais,
com características latentes de proliferação e migração, assim como da atuação em cascata de
citocinas, proteínas produzidas pelas células em resposta ao processo inflamatório, que atuam
modificando as características das próprias células e as de tecidos próximos (Liang et al,
2003). Esta interação entre as citocinas acaba sendo, ao mesmo tempo, causa e efeito da
características dos colesteatomas (Ribeiro e Pereira, 2003).
Em nossa visão sobre a patogênese dos colesteatomas adquiridos o fator
desencadeante de todo processo de colesteatomatização reside na diminuição de pressão
dentro da orelha média (Figura 17). A redução pressória na orelha média poderá levar à
retração progressiva da membrana timpânica, com formação de bolsa de retração, a qual, após
perder seu poder de auto-limpeza, acumularia epitélio descamado.
71
Figura 17: Hipótese de patogênese dos colesteatomas adquiridos
Partindo-se de uma orelha normal, um fator desencadeante inicial em um primeiro
momento (infecções de vias aéreas superiores, alergias, barotraumas, entre outros), ou seja, na
fase reversível de todo este processo, seria a disfunção tubária funcional ou mecânica. Uma
vez que a tuba auditiva fosse incompetente para equilibrar as pressões atmosféricas e intra-
timpânicas, mesmo com o auxílio de manobras voluntárias, a entrada de ar na orelha média
diminuiria e a aeração dependeria exclusivamente do estabelecimento de um gradiente
Patogênese do Colesteatoma
Obstru
ç
ão Tub
á
ria Fase I
Diminui
ção da Pressão
MT PS
Oss
í
culos
Lesão no Martelo
Col
á
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óstium
Á
tico
Diafragma
Timpânico
bilateral
Bioquí
mico
Biof
í
sico
Inflama
ção
Pressão
Mediadores
Isquemia
Hiperprolifera
ção
Erosão
Acú
mulo de
queratina
Progressão
72
pressórico, entre as extremidades nasofaríngeas e timpânicas da tuba; esse mecanismo de
regulação pressórica parece ser muito comum nas crianças (Bluestone, 1981).
A membrana timpânica com suas duas porções (flácida e tensa), por ser a única parede
distensível da orelha média é a mais delicada. A parte tensa poderia sofrer processos de
atrofia localizados ou difusos; a atrofia difusa poderia também levar à retração timpânica
total, com a membrana praticamente recobrindo as estruturas da orelha média, sem entretanto
fixar-se a elas. Uma outra situação surgiria caso a retração se limitasse à região póstero-
superior; a progressão dessa retração seria acompanhada da erosão da apófise longa da
bigorna e desse segmento timpânico alterado com a cabeça do estribo, independentemente da
formação de colesteatomas.
Em relação à parte flácida da membrana timpânica, é mais comum a formação de
bolsas de retrações aticais, inicialmente com propriedades de auto-limpeza dessas, porém, na
evolução desse quadro, essas propriedades seriam perdidas, sendo que o epitélio pavimentoso
estratificado queratinizado do canal auditivo externo migraria para o interior da orelha média
e acumular-se-ia na região retraída, posteriormente encistando-se e dando origem ao
colesteatoma.
Esse mesmo processo poderia ocorrer nas retrações timpânicas póstero-superiores.
Nessas situações, entretanto, parece que um segundo fator poderia somar-se na gênese do
colesteatoma. A infecção dessa área e a conseqüente irritação e hiperplasia de células da
camada basal acrescentaria correntes de células escamosas em direção à orelha média.
Essa série de eventos não evoluiria necessariamente em um sentido uni-direcional. Na
verdade, a evolução do processo poderia ser modificada por vários fatores extrínsicos e
intrínsicos à orelha com desaceleração da reação inflamatória; podendo o processo
inflamatório apresentar-se com graus variados de evolução e com aspectos heterogêneos
dentro de uma mesma orelha.
73
A presença de colesteatoma na fenda auditiva de pacientes com otite média crônica,
indubitavelmente, resulta em maior morbi-mortalidade decorrente do grande poder de erosão
óssea destes acúmulos epiteliais (Sadé, Halevy, 1974; Bretlau et al, 1982).
A absorção óssea é estimulada por uma variedade de fatores, incluindo a inflamação, a
pressão local e citoqueratinas específicas (Olszewska et al, 2004). O conceito enzimático, no
qual enzimas de origem epitelial são consideradas as responsáveis pela destruição óssea, foi
definido por Abramson e Huang (1976), o qual demonstrou a presença de colagenases e
hidrolases no colesteatoma, hipótese posteriormente confirmada por Thompsen (1977).
Ferlito et al (1997) sugeriram que a propriedade destrutiva dos colesteatomas, a erosão óssea,
é causada pela produção de colagenase pelos componentes dos tecidos epitelial escamoso e
fibroso. À hipótese de reabsorção óssea por ação bioquímica, exclusivamente exercida por
enzimas colagenolíticas, foram incorporados, posteriormente, outros agentes, como o fator de
necrose tumoral (TNF), as interleucinas (IL-1α) e as prostaglandinas (PGE
2
) (Minotti et al,
1996; Kurihara et al, 1991; Hansen et al, 2001).
Apesar de haver erosão óssea na otite média crônica não colesteatomatosa, em
aproximadamente 40% dos casos por nós estudados, o colesteatoma traz consigo um aumento
significativo dessa prevalência (90% em adultos e 100% em crianças de nossa amostra),
tornando-se um evento quase que universal. Acreditamos que a destruição óssea seja
decorrente da interação dos mecanismos biofísicos e bioquímicos.
No processo biofísico a pressão exercida pela massa do colesteatoma levaria à
isquemia, seguida de necrose óssea, até esse momento sem envolvimento de nenhum
mediador químico. No entanto, no processo bioquímico temos como fator principal a
inflamação, tanto a que ocorre na orelha média quanto na perimatriz do colesteatoma. Seja
por um agente externo (infecção no canal auditivo externo) seja por força interna (inflamação
na orelha média) as reações desencadeiam um sistema de retroalimentação que poderá levar à
74
hiperproliferação da matriz do colesteatoma, quando serão produzidas mais
metaloproteinases. Sabemos que os mediadores inflamatórios são fatores cruciais no estímulo
à produção de metaloproteinases pela matriz, e que essas enzimas agirão na remodelação da
matriz extracelular provocando a erosão ossicular.
No entanto, as duas grandes incógnitas desse processo são como ele se inicia e qual o
ponto de passagem entre a retração e o colesteatoma.
Ao lembrarmos-nos da hipótese do continuum (Paparella, 1970) e ao analisarmos a
seqüência de eventos desde a retração da membrana timpânica até a colesteatomatização da
orelha média, podemos considerar que o colesteatoma seria o ápide de uma única doença, a
otite média crônica, e não um evento isolado. Além de outras características intrínsecas do
paciente, parece-nos que o envolvimento da resposta inflamatória na patogênese dos
colesteatomas deva ser fundamental (Dornelles et al., 2006).
Ao final desse trabalho podemos concluir que o processo inflamatório no grupo
pediátrico é mais acentuado (maior angiogênese nesse grupo). Porém, a diferença encontrada
entre os colesteatomas pediátricos e adultos talvez possa dever-se ao meio onde eles se
desenvolvem, ou seja, talvez o colesteatoma na criança repercurta a maior instabilidade da
orelha média nessa faixa etária. Estruturalmente os colesteatomas em crianças e adultos são
semelhantes, com exceção da espessura da perimatriz, os demais componentes histológicos
assemelham-se. A desestabilização da orelha média poderia acontecer por dois processos
distintos, chamados por Costa (1997) de inside-out ou outside-in.
Na situação inside-out ocorreria algum processo intratimpânico, possivelmente
inflamatório-infeccioso, com repercussão sobre a perimatriz, a qual se desestabilizaria, ou
seja, haveria exacerbação da inflamação, com conseqüente aumento da produção de
mediadores bioquímicos (produtos da cascata inflamatória e metaloproteinases). Toda essa
aceleração bioquímica na perimatriz estimulará a hiperproliferação da matriz, descamação e
75
acúmulo de epitélio, em outras palavras, a formação de colesteatoma. No processo outside-
in, onde encontramos uma membrana timpânica retraída, debilmente estabilizada, um irritante
externo, por exemplo, uma contaminação por água, estimularia a camada mais externa, ou
seja, a matriz, que desencadeará a mesma seqüência de eventos até a formação do
colesteatoma. Sendo assim, podemos sugerir que a matriz e a perimatriz estimulam-se
mutuamente, num sistema de retro alimentação, a atividade da perimatriz estimula a
proliferação da matriz, essa por sua vez, envia mensageiros para a perimatriz que provocaram
o aumento da produção de metaloproteinases e inflamação, o que levará a mais proliferação
do epitélio. Na criança, tanto nos casos inside-out ou outside-in a desestabilização da orelha
média seria mais acentuada.
Conjugando a hipótese de que a orelha média em crianças seria mais instável com os
nossos achados nessa tese, podemos vislumbrar algumas implicações clínicas no tratamento
da otite média crônica no grupo pediátrico. Levando em consideração uma possível atividade
bioquímica maior dos colesteatomas na criança, devemos pensar em duas situações especiais
nessa faixa etária: a prevenção precoce e o tratamento cirúrgico mais agressivo.
Desde o primeiro relato da técnica de mastoidectomia, em 1649, por Riolanus, até os
dias atuais, essa cirurgia passou por uma evolução gradual, auxiliada por pesquisas nesse
campo e pelo desenvolvimento tecnológico. No entanto, problemas tal como morbidez
operatória, recorrência de doença, e gerência de candidatos de alto-risco cirúrgico ainda
apresentam obstáculos desafiantes para o otologista superar (Minotti et al, 1996). Ainda
estamos em estágios muito iniciais nas pesquisas para tratamentos clínicos e profiláticos para
os colesteatomas, porém algumas substâncias já foram testadas para avaliar sua ação na
inibição dos colesteatomas, tais como: ácido trans-retinóico, inibidores de metaloproteinases,
de citoqueratinas e da reabsorção óssea. Como nessa tese trabalhamos com as
76
metaloproteinases, discorreremos, nessa discussão, sobre uma alternativa terapêutica com o
emprego dessas enzimas.
Em processos fisiológicos normais, a liberação de enzimas proteolíticas, dentre elas as
metaloproteinases, é controlada por inibidores enzimáticos, através de um equilíbrio
dinâmico, fato que é necessário para que ocorram os reparos em tecidos lesados (Kraien e
Korem, 2000). Contudo, quando há um desequilíbrio dessa homeostase orgânica, os
inibidores enzimáticos teciduais serão pouco eficazes em decorrência de a balança tender para
a produção descontrolada das enzimas proteolíticas. Além desse desequilíbrio entre as
enzimas proteolíticas e seus inibidores, substâncias anti-angiogênicas, tal como a
angiostatina, parecem, igualmente, desempenhar papel ineficaz quando a homeostase é
perdida (Pastor e Giorgi, 2002).
A inibição das formas ativas de metaloproteinases pode dar-se pela ação de seus
inibidores teciduais (TIMP). A aplicação de TIMP como ferramenta terapêutica através de
terapia gênica ou aplicação direta de proteína está em fase inicial de desenvolvimento (Baker
et al., 2002). No entanto, há um claro potencial para a aplicação de TIMP como inibidores
endógenos (Zucker et al., 2000), provavelmente o caminho para o êxito será o
desenvolvimento de TIMP com especificidade alterada, as quais permitam um
direcionamento para proteinases específicas (Nagase et al., 2006).
O distúrbio no balanço das MMP e das TIMP pode ser encontrado em várias doenças,
tais como câncer, artrite reumatóide e periodontite (Verstappen et al., 2006) tendo um
importante papel na patofisiologia de diversas condições inflamatórias (Medina e Radomski,
2006).
Segundo Schonemark et al. (1996) as TIMP puderam ser localizadas, em seu estudo,
em poucas áreas restritas ao tecido de granulação nos colesteatomas. Uma desregulação do
77
equilíbrio MMP-TIMP, nos colesteatomas, poderia causar o aumento da ação proteolítica dos
mecanismos de degradação óssea (Yang et al., 2002).
Diferentes MMP e TIMP são expressas em células ósseas, sendo sua biosíntese
regulada por fatores hormonais locais e sistêmicos (Varghese, 2006). As funções das MMP e
das TIMP, no osso, incluem a degradação do colágeno e de outros componentes da matriz
óssea; a migração e a sobrevivência de células ósseas; a formação e a reabsorção óssea. A
expressão anormal das MMP, ou seja, a desregulação do complexo inibitório MMP-TIMP,
pode levar a condições patológicas que afetam ossos e cartilagens.
A possibilidade do envolvimento da metaloproteinases na patogênese e,
principalmente, atividade dos colesteatomas, coloca-nos o desafio de buscarmos alternativas
terapêuticas, possivelmente com os inibidores sintéticos de metaloproteinases. Estudos
experimentais, tanto em laboratório quanto em humanos, deverá ser o próximo passo em
nossa linha de pesquisa.
Ao final dessa tese e em conjunto com os estudos anteriormente realizados por nosso
grupo (Dornelles et al., 2005, Dornelles et al., 2006) podemos perceber a sobreposição de
evidências que indicam uma maior agressividade da otite média crônica colesteatomatosa em
crianças, visto que nesses pacientes os colesteatomas adquiridos apresentam uma perimatriz
mais espessa, possuem um processo inflamatório mais exacerbado, um maior grau de
angiogênese e produzem mais metaloproteinases que os colesteatomas de pacientes adultos.
Sendo assim, podemos sugerir, que esses fatores conjugados, levam a otite média crônica
colesteatomatosa a ser mais agressiva em crianças do que em adultos.
7. Conclusões
7.1 A expressão dos anticorpos anti-CD31, anti-MMP2 (citoplasmática e nuclear) e
anti-MMP9 é maior no grupo pediátrico.
7.2 O número médio de vasos sangüíneos está fortemente correlacionado com a
quantidade de metaloproteinases, com o número médio de camadas celulares da matriz, com a
espessura da perimatriz, com o grau histológico de inflamação.
7.3 A metaloproteinase 2, tanto citoplasmática quanto nuclear, estava fortemente
correlacionada com a espessura da perimatriz, com o grau histológico de inflamação e o com
número médio de camadas celulares da matriz.
7.4 A metaloproteinase 2 citoplasmática estava correlacionada, inversamente, com a
idade do paciente à data da cirurgia.
7.5 A metaloproteinase 9 estava fortemente correlacionada com a espessura da
perimatriz, com o grau histológico de inflamação e com o número médio de camadas
celulares da matriz.
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PARTE III –ANEXOS
Anexo 1
95
Anexo 2
Termo de Consentimento Informado
Anexo 3
Carta de Aprovação do Grupo de Pesquisa e Pós-Graduação
Anexo 4
Descrição demográfica da amostra
Número Iniciais Idade Gênero
1
F.P.R.S. 15
Masculino
2
C.L. 14
Feminino
4
M.R.C. 5
Masculino
5
O.B.F. 53
Feminino
6
L.V. 16
Masculino
7
N.L.R. 36
Feminino
8
R.A.R. 31
Feminino
9
S.W. 18
Masculino
10d
J.C.S.D. 35
Feminino
10e
J.C.S.D. 35
Feminino
11
J.F. 11
Masculino
13
D.S. 27
Feminino
15
A.B.T. 18
Feminino
18
C.O.G. 21
Feminino
19
B.L.S. 12
Feminino
20
G.B. 12
Feminino
21
P.R.S. 40
Feminino
22
A.K.O. 10
Masculino
24
E.M.S. 25
Masculino
25
F.H.P. 37
Masculino
26d
V.S.M. 9
Feminino
26e
V.S.M. 9
Feminino
27
C.S. 40
Feminino
28
C.R. 37
Feminino
29
D.K. 18
Feminino
31
E.K. 53
Feminino
32
A.K.O. 10
Feminino
33
T.R.X. 23
Feminino
36
V.M.M. 37
Masculino
37
E.A.N. 10
Feminino
Número Iniciais Idade Gênero
38
D.L.R. 9
Masculino
39
R.M. 13
Masculino
42
A.C. 22
Masculino
43
L.M.S.S. 22
Feminino
44
M.R.O 18
Masculino
45
M.B. 39
Masculino
47
F.M.A.P. 20
Feminino
48
A.R.L. 12
Masculino
50
S.W. 21
Feminino
52
B.M.D. 8
Feminino
53
J.C.S. 12
Feminino
55
S.S. 7
Masculino
57
E.Z.S. 17
Masculino
63
M.W. 25
Masculino
65
R.S.A. 25
Feminino
68
J.P.W. 35
Masculino
69
M.X.F. 43
Feminino
70
D.S.S. 11
Masculino
71
G.V.I. 17
Feminino
72
M.D.A. 9
Feminino
73
M.M.S. 51
Feminino
74
J.L. 78
Masculino
75
D.R.S. 14
Masculino
77
F.J.R. 13
Masculino
79
C.C.O. 20
Masculino
81
P.J.S.M. 16
Masculino
82
J.C.R. 35
Masculino
83
M.C. 37
Masculino
84
E.S.J.J. 31
Masculino
85
A.O. 15
Masculino
99
Número Iniciais Idade Gênero
86
L.B.M. 11
Masculino
89
B.S. 11
Feminino
90
A.R. 59
Masculino
91
P.H.S. 66
Feminino
92
N.D. 44
Masculino
94
N.D. 69
Feminino
97
M.R. 10
Masculino
98
G.M. 38
Masculino
99
M.S. 24
Feminino
101
R.F. 14
Feminino
103
M.M.S.M
67
Masculino
104
L.F.G. 24
Masculino
106
J.P.T. 29
Feminino
107
N.C.O.S. 38
Feminino
108
D.G. 38
Masculino
110
R.A.D. 38
Masculino
112
C.M.V. 11
Feminino
115
M.L.T. 70
Feminino
116
L.E. 58
Masculino
119
S.O.L. 11
Feminino
120
R.D. 6
Masculino
121
J.F. 14
Feminino
127
I.S.S. 40
Feminino
128
W.J.S.J. 8
Feminino
131
V.L.B. 48
Feminino
140
W.G.L. 14
Masculino
142
J.C.S. 14
Masculino
143
C.B. 42
Masculino
146
L.R.S.P 18
Masculino
147
P.J.S. 11
Feminino
Número Iniciais Idade
Gênero
150
W.S.F. 30
Masculino
151
P.H.S. 33
Masculino
153
F.R.H. 10
Feminino
153
F.R.H. 10
Feminino
160
T.R.S. 7
Masculino
161
T.M.S. 3
Masculino
162
T.M.S. 3
Masculino
164
R.R.F. 69
Feminino
165
B.L.S. 28
Masculino
166
D.S.S. 13
Masculino
167
E.A.D.N. 12
Masculino
168
J.B.G. 29
Masculino
171
D.L.V. 11
Masculino
172
A.S.C. 11
Masculino
175
J.B. 13
Feminino
175
J.B. 13
Feminino
176
G.B. 14
Masculino
179
A.K. 18
Masculino
183
D.B.B. 14
Feminino
184
T.M.A. 8
Feminino
185
R.A.R. 12
Masculino
186
T.M.P 45
Feminino
187
M.B. 40
Feminino
188
V.P.G 38
Feminino
193
A.T. 45
Masculino
194
R.S.S. 23
Masculino
197
F.S. 22
Feminino
198
M.M.L 23
Masculino
199
A.T. 7
Masculino
200
M.N.A. 35
Feminino
100
Anexo 5
Comparison of acquired cholesteatomas in adult and pediatric patients using MMP2
and MMP9 markers for immunohistochemistry analysis
Cristina Dornelles: MS in Health Sciences – Pediatrics; Doctoral Candidate in Health
Sciences – Pediatrics, Federal University of Rio Grande do Sul. Biologist, Brazilian Center
for Otitis Media
Luíse Meurer: MD, PhD in Gastroenterology – Adjunct Professor, Pathology Department,
Federal University of Rio Grande do Sul
Sady Selaimen da Costa: MD, PhD in Surgery – Associate Professor, Department of
Ophthalmology and Ear, Nose and Throat, Federal University of Rio Grande do Sul
Letícia Petersen Schmidt Rosito: MD, MS in Surgery, ENT Department, Hospital de
Clínicas de Porto Alegre
Sabrina Lima Alves: Medical student – Federal University of Rio Grande do Sul School
of Medicine
Andréia Argenta: Medical student – Federal University of Rio Grande do Sul School of
Medicine. Research Assistant, Brazilian Center for Otitis Media
Andrei Roberto da Silva: Resident ENT Physician, University of São Paulo
Centro de Otite Média do Brasil – ComBr
Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas: Pediatria
Serviço de Otorrinolaringologia - Hospital de Clínicas de Porto Alegre - HCPA
Serviço de Patologia - Hospital de Clínicas de Porto Alegre – HCPA
Autora para Correspondência: Cristina Dornelles: Rua Cangussu, 1343 - Porto Alegre -
RS – 90830-010 - (55-51) 84136773, cristinadornelles@yahoo.com.br
101
ABSTRACT:
The quantification of angiogenesis and metalloproteinases may be useful in
cholesteatoma behavior assessment as markers of its aggressiveness. Objective: Compare
markers CD31, MMP2 and MMP9 in pediatric and adult patients. Method: Cross-sectional
study. Pediatric (18 years old or below) and adult groups (19 years old or above). Sample:
120 cholesteatomas, fixed in 10% formol, prepared on five blades of each sample through
habitual histological techniques, observing: number of blood vessels (CD 31), marking with
MMP2 and MMP9, number of matrix cells and thickness at perimatrix cell. Data were
analyzed through SPSS using Spearman and Mann-Whitney coefficients. Results:
Cholesteatomas equally distributed: 60 in pediatric patients (11.77±3.57 years); 60 in adult
patients (38.29±14.51 years). Pediatric CD31: 7 (4-11), adult CD31: 4 (0-10) (P=0.044).
Pediatric cytoplasmatic MMP2: 1 (0-3), adult cytoplasmatic MMP2: 0 (0-1) (P=0.006).
Pediatric nuclear MMP2: 0 (0-1), adult nuclear MMP2: 0 (0-1) (P=0.056). Pediatric
MMP9: 2 (0-4), adult MMP9: 0 (0-4) (P=0.049), when correlating the number of blood
vessels and metalloproteinases with perimatrix thickness. Conclusions: Pediatric
cholesteatomas present a more exacerbated inflammatory degree, produce more
metalloproteinases, factors that, when combined, could characterize pediatric
cholesteatomas as more aggressive than adult cholesteatomas.
KEY WORDS:
Perimatrix; Inflammation; Cholesteatoma; Angiogenesis; Collagenases
102
Introduction
Cholesteatomas were defined by Schuknecht
1
as the accumulation of scaled keratin
inside the middle ear or any pneumatized area in the temporal bone deriving from a
keratinized squamous epithelium. The annual incidence of cholesteatoma was found to be
about 3 per 100,000 in children and 9.2 per 100,000 in adult. There is male predominance,
approximately 1.4 times more high in men than in women
2,3,4
.
Acquired cholesteatoma presented three histological components: matrix, perimatrix
and cystic content
5
(Figure 1). The matrix is a keratinized stratified squamous epithelium,
with four layers that are identical to the. The perimatrix is a loose connective tissue,
containing collagen fibers, fibrocytes and inflammatory cells. And the cystic content, by his
time, is constituted for keratin lamellae and epithelium remands
5
.
Controversies exist as to whether cholesteatomas behave differently in children than
in adults. Of a side, Sheehy
6
, Tos
7
and Edelstein
8
believe that pediatric cholesteatomas are
less expansive, leading to a lower rate of complications. On the other hand, Glasscock
9
,
Ruah
10
, Bujia
11
, Palva
12
and Sudhoff
13
hold that cholesteatomas originating in childhood are
more aggressive and have more extensive growth patterns. Smythe
14
consider pediatric
cholesteatomas to be so different from adult cholesteatomas that they should be considered
different diseases.
In this sense, Quaranta et al.
15
observed that the perimatrix of pediatric
cholesteatomas is richer in mononuclear inflammatory elements than that of adults. Based
on this finding, they suggest that the characteristics of the perimatrix exert an important
role in the pathogenesis of cholesteatomas, which could explain differences in the behavior
of pediatric and adult cholesteatomas
15
.
103
Histological studies conducted by Dornelles et al.
16,17,18
identified an inverse
correlation between the cholesteatoma perimatrix thickness and the patient’s age on the
surgery date, as well as a direct correlation between the thickness and the histological
degree of the inflammation at the perimatrix. These findings suggest that the perimatrix is
thicker and has a more exacerbated inflammatory process in pediatric cholesteatomas. It is
known that the cholesteatoma growth requires angiogenesis in the perimatrix conjunctive
tissue
19
. In these studies
16,17,18
, the inflammatory activity degree of the perimatrix was
calculated through semi-quantitative measurements
20
. A more precise measurement of the
inflammatory activity is the angiogenesis quantification, which can be performed
immunohistochemically by counting the blood vessels in the perimatrix, through
immunohistochemistry with marker CD 31
21,22
.
The exacerbated inflammatory process in cholesteatoma perimatrix adds more
complexity to the chronic otitis media with cholesteatoma (COMC), with the bone erosion
power, a characteristic that is almost universal of the COMC, one of the parameters
employed to assess its aggressiveness. Bernal-Sprekelsen et al.
23
suggested that
metalloproteinases (MMP) could explain part of the invasive and destructive activities
(destruction of ossicles and other parts of the temporal bone) of the ear cholesteatoma.
MMPs are related to several aspects of tissue growth and invasion and the stimulation of
angiogenesis.
The quantification of angiogenesis and metalloproteinases as markers of
aggressiveness may be useful in cholesteatoma behavior assessment. Thus, the purpose of
this study is to analyze immunohistochemically both matrix and perimatrix of acquired
cholesteatomas in children and adults, with markers CD31, MMP2 and MMP9, and
104
correlate such findings with their histological components and the patient’s age on the
surgery date.
Method
This study was a comparative and contemporaneous cross-sectional analysis,
approved by the institution in 2003. All patients signed the Consent Term for the
anonymous utilization of data in scientific publications.
Patients were include according to the following criteria: 1) diagnosis of chronic
otitis media with cholesteatoma; and 2) presence of matrix (keratinized stratified squamous
epithelium) and perimatrix (loose connective tissue) in the cholesteatoma sample collected
(In Figure 1 is a representative cholesteatoma, showing histological components).
Exclusion criteria were: 1) diagnosis of congenital cholesteatoma; and 2) sample
inadequate for immunohistochemistry processing. The patients were divided in two groups,
according to their age at the time of surgery (adults if above 18 years old and children until
that age). Sixty cholesteatomas were include in each group.
Tissue samples were collected, between May of 2003 and March of 2007, by the
operating ENT surgeon, in specifics sites of the middle ear and mastoid: mesotympanum
(over of the bulging of the promontory); the wall of the anterior epytympanum around
middle wall of the attic, the proeminence of the lateral semicircular canal. These areas were
chosen due the smoothness of the surface making possible the removal of big pieces of well
conserved matrix and perimatrix. Samples of these sites were thought to probably contain
matrix and perimatrix, and have to measure at least 5 mm. The material was immediately
fixed in 10% formol and processed by usual histological techniques with inclusion in
paraffin.
105
Five slides of each sample were prepared for morphological and
immunohistochemistry analyses. The slides were analyzed using a light microscope at 200
powers by two independent observers (one, a faculty member of the Pathology Department
of the Federal University of Rio Grande do Sul Medical School, and the other, the primary
author). The slides were “blinded” prior to interpretation.
The first slide was stained with hematoxylin-eosine (HE) (Figure 2A) with the
which were evaluated the histological integrity of the colesteatoma (presence of matrix and
perimatrix), beyond the observation of the following components: average number of
epithelial cell layers of matrix, presence or not of delimiting epithelium, hyperplasia,
fibrosis and granuloma.
Mean number of matrix cells layers was obtained by counting cells layers in five
different fields of slides, carrying out on average of those for obtain to statistical it to be
tested. The other aspects (delimiting epithelium, hyperplasia, fibrosis and granuloma) were
analyzed only qualitatively ("present" or "absent").
After the blade evaluation in HE, with the histological integrity confirmation of the
samples, the second blade was stained with Picrosyrius (Figure 2B), for the perimatrix
thickness measurement. This stain was used for allowing a better differentiation of the
perimatrix than with the HE stain (3A), as Picrosyrius stains the collagen fibers in dark red,
making it easier to delimit the thickness to be measured. The perimatrix thickness was
obtained through analyses of computerized images using ImagePro Plus Media Cybernetics
software (Figure 3). Laminas were examined on all their extension and it was obtained 20
measurements of perimatrix by each cholesteatoma, in order to denote the intrapatients
variability. Using the 20 measures of each perimatrix, we obtained the median, which are
the summarizing measures for the analysis of perimatrix’s thickness. In the cases in that to
106
perimatriz was extremely thin, not permitting to his measurement by the software, the
thickness was considered as like zero.
The same cholesteatomas used in the cuts with Picrosyrius stain were submitted to
the immunohistochemistry technique employed in the Pathology Service routine, which
consists in deparaffinization, rehydration, antigen retrieval, endogenous peroxidase
inactivation, and blocking of non-specific background staining.
The third blade was prepared for counting the mean number of blood vessels, using
the primary anti-CD31 antibody (clone JC7OA, Dako Cytomation, Carpinteria, CA, USA).
The material was incubated for 12 hours, at 4°C and 1:40 dilution, followed by the
application of streptavidin-biotin-peroxidase complex (LSAB, Dako) and print processing
with diaminobenzidine tetrahydrochloride (Kit DAB, Dako).
The mean number of blood vessels in the perimatrix (stained by the anti-CD31
antibody reaction) was collected continuously, through the Chalkley count, where a 25-
point grid of is placed onto a scanned image and all points that coincide with the marked
vessels are counted (Figure 4). Two to five images were used, depending on the size of the
cholesteatomas, and the mean value was obtained with the number of counted vessels in
each image. The perimatrix areas with evident granulation tissue were avoided in image
capture. Reading of blades was performed by two independent observers (one was a student
at the Pathology Department and one was the main researcher), the final variable was the
mean value of all readings performed with each blade.
In order to evaluate the production of metalloproteinases, the two last blades were
prepared using anti-MMP2 (72kDa Collagennase IV, Chemicon International, USA) and
anti-MMP9 (clone 9D4.2, Chemicon International, USA) antibodies. Cuts of
cholesteatomas were incubated for 72 hours, at 4°C and 1:40 dilution, followed by the
107
application of biotin-streptavidin peroxidase complex (LSAB, Dako) and print processing
with diaminobenzidine tetrahydrochloride (Kit DAB, Dako). Immunoreactivity of
metalloproteinases was observed in the matrix of cholesteatomas, being MMP9 in the
cytoplasm of epithelium cells and MMP2 in the cytoplasm and nucleus.
The intensity of MMP2 and MMP9 colorings was observed and the results were
expressed as 0, 1, 2 and 3, according to the metalloproteinase coloring intensity (absent,
mild, moderate and accentuated, respectively). Besides the coloring evaluation, the
percentage of stained material was also estimated, using a scale ranging from zero (no
immunoreactivity) to 100% (all material was stained). Such percentage was dichotomized
as follows: 1 - percentages ranging from 0 to 50% and 2 - from 51 to 100%. The final
variable to be statistically analyzed was the product result of the coloring intensity (zero to
three) using the multiplying factor (1 or 2) resulting from the percentage of stained
material.
Frequency tables were used for descriptive data. Spearman’s coefficient was used in
the statistical analysis, in the correlation of the mean number of blood vessels and the
quantification of metalloproteinases with the mean number of cells in the matrix, the
perimatrix thickness and the patient’s age on the surgery date. The Mann-Whitney test was
used to compare the perimatrix thickness, the mean number of blood vessels and the
quantification of metalloproteinases between the groups. Fisher’s exact test was used to
compare the presence of delimitating epithelium, hyperplasia, fibrosis and granuloma
between the groups. The analysis was performed through software application SPSS 13.0
for Windows. Values of P≤0.05 were considered as statistically significant.
Results
108
1 - Demographic data
The sample was composed of 120 cholesteatomas, which were equally distributed in
the pediatric and adult groups. The sample was equally divided also in terms of genre.
The mean±standard deviation values of patient’s age on the surgery date was
24.99±16.80 years. The pediatric group presented mean age of 11.75±3.48 years and the
adult group presented mean age of 38.02±14.31.
As the dates didn’t present normal distribution, from this point, will be presented by
his median and interquartil interval. By the same fact, all the statistical analysis will be
carried out with nonparametric tests.
2 – Histological findings
The mean number of cell layers in the matrix ranged from 2 to 23, with median
value of 6 (5 to 9). Hyperplasia in the matrix was identified in 35% of the cholesteatomas,
14% presented granuloma and 67% presented fibrosis. The presence of simple cuboidal
epithelium, delimitating the perimatrix in its depth plane, occurred in 20% of the cases.
The variable perimatrix thickness appeared in cholesteatomas from different
patients, as well as in the material from the same individual. One species in particular
presented areas from very delicate thickness to thick parts. The thickness was of 78
micrometers (34 to 217), considering the minimum value of zero and the maximum value
of 1269. In seven cases - six adults and one pediatric case – the perimatrix was extremely
thin that it could not be measured, and was considered as zero. Figure 5 shows some very
representative examples of the variation in the histological composition found in this
sample of acquired cholesteatomas.
109
When stratified in age groups, the histological components analyzed in this study
presented a similar distribution in both groups, except for the perimatrix thickness and the
presence of delimitating epithelium (Table 1).
3 – Immunohistochemical findings
The mean number of blood vessels (Figure 6) was 6 (0 to 11). In the pediatric
group, this number was 7 (4 to 11) and 4 (0 to 10) in the adult group.
Cytoplasmatic MMP 2 median value (Figure 7) was 0 (0 to 1). In the pediatric
group, this value was 1 (0 to 3) and 0 (0 a 1) in the adult group.
The results of nuclear MMP2 (Figure 8) were similar. Median value for the general
group: 0 (0 to 1); in the pediatric group, it was 1 (0 to 1) and 0 (0 a 1) in the adult group.
MMP 9 median value (Figure 9) was 1 (0 to 4). In the pediatric group, this value
was 2 (0 to 4) and 0 (0 a 4) in the adult group.
When comparing the mean value of blood vessels, the quantity of cytoplasmatic
MMP2, nuclear MMP2 and MMP9 between the groups using the Mann-Whitney test, all
variables analyzed showed a statistically significant difference.
Table 1 shows the comparison of histological and immunohistochemical variables
between the pediatric and adult groups, using Mann-Whitney and Fisher’s exact tests:
When correlating the mean number of blood vessels with the mean number of
metalloproteinases, with the mean number of cell layers of the matrix and with the
perimatrix thickness, strong correlations are found. Besides, an inverse correlation was
found, of cytoplasmatic MMP2 with the patient’s age on the surgery date (Table 2).
Discussion
110
In a series of studies conducted by our group
16,17,18
we analyzed the histological
inflammation degree in the perimatrix of acquired cholesteatomas, using a semi-
quantitative variable. We found in these studies
16,17,18
a strong and inverse correlation the
patient’s age on the surgery date with the inflammatory process, i.e., the younger the
patient, the larger the inflammation. In this study, we attempted to enhance the precision of
this analysis using a quantitative variable resulting from the measurement through
immunohistochemistry, anti-CD 31 antibody (marker of angiogenesis). With this variable,
we found a statistical difference of the angiogenesis between the age groups (pediatric and
adult groups) and we realized that the mean number of blood vessels in the perimatrix is
much higher in the pediatric group than it is in the adult group, a fact that leads us to
suggest that the inflammatory process is more exacerbated in children, a characteristic that
could involve a higher aggressiveness degree of the cholesteatomas presented by the
pediatric group.
Besides the angiogenesis measurement, we also studied the metalloproteinases for
being enzymes associated with the pathological absorption of the extracell matrix in
chronic inflammatory processes
24
, which, therefore, considers it as a required part in bone
erosion and reabsorption processes. MMP activity is regulated by Tissue Inhibitor of
Metalloproteinase (TIMP) and the interruption of such combination may lead to a
pathological process. Figure 10 shows the sites of MMP production, expression and activity
in the cholesteatomas (adapted from Medina and Radomski
25
).
We know metalloproteinases are proteolytic enzymes that can degrade components
of the connective tissue
24
. In addition, the production of metalloproteinases is encouraged
by the inflammatory process. Thus, we suggest that the cholesteatomas, when stimulated by
infectious factors, can produce more of these enzymes that degrade collagen fibers
25
.
111
Our results indicated that the metalloproteinases (cytoplasmatic MMP2, nuclear
MMP2 and MMP9) showed increased expression in pediatric cholesteatomas. In other
words, younger patients have higher expression of metalloproteinases. It should be noted
that cytoplasmatic MMP2 was also inversely correlated with the patient’s age on the
surgery date, i.e., the younger the patient, the higher this protein expression.
We know that MMP2 is a proteolytic enzyme associated with the ability to
penetrate into and invade adjacent tissues
26
. In normal biological processes, the
metalloproteinases are responsible for the bone tissue homeostase, with higher expression
in inflammatory osteolytic diseases. Based on our results, we can suggest the pediatric
cholesteatomas present a greater potential for bone invasion and erosion, as a result of the
higher expression of metalloproteinases than of cholesteatomas in adult patients.
Based on the results obtained in this study, we can suggest the aggressiveness of
cholesteatomas resides in biochemical processes that occur in the perimatrix, and that the
bone erosion initiates in such cholesteatoma structure, a typical characteristic of the chronic
otitis media with cholesteatoma.
When concluding this study and combining it with the studies previously conducted
by our group
16,17,18
, we can realize increased number of evidences indicating greater
aggressiveness of chronic otitis media with cholesteatoma in children, as follows: the
pediatric cholesteatomas present a thicker perimatrix, a more exacerbated inflammatory
process, a higher degree of angiogenesis and produce more metalloproteinases than
cholesteatomas of adult patients. Thus, we can suggest that these combined factors make
chronic otitis media with cholesteatoma more aggressive in children than in adults.
Conclusions
112
The expressions of CD31, cytoplasmatic MMP2, nuclear MMP2 and MMP9 are
higher in the pediatric group.
The mean number of blood vessels is strongly correlated with the quantity of
metalloproteinases, the mean number of cell layers in the matrix, the perimatrix thickness
and the histological inflammation degree.
Acknowledgements
We would like to thank the Pathology and Ear, Nose and Throat Departments of the
Hospital de Clínicas de Porto Alegre, for the permission to use their facilities and enable
the development of this project.
The Research and Post Graduation Group of the Hospital de Clínicas de Porto
Alegre (GPPG-HCPA) and the Post Graduation Program in Medical Sciences: Pediatrics
Department of the Universidade Federal do Rio Grande do Sul, for their technical support.
The Fundo de Incentivo à Pesquisa e Eventos of the Hospital de Clínicas de Porto
Alegre (FIPE-HCPA), for the research financing.
Conflict of interest
The authors haven’t a financial relationship with the organization that sponsored the
research.
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116
Tables:
Table 1: Comparison of variables studied between the Pediatric and Adult Groups
Variable General
(n=120)
Pediatric Group
(n=60)
Adult Group
(n=60)
P
Value
Perimatrix Thickness 78 (34 to 217) 104 (48 to 245) 49 (15 to 176) 0.014
1
Matrix 6 (5 to 9) 6 (5 to 9) 6 (5 to 9.5) 0.813
1
Number of Vessels: CD31 6 (0 to 11) 7 (4 to 11) 4 (0 to 10) 0.044
1
Cytoplasmatic MMP2 0 (0 to 2) 1 (0 to 3) 0 (0 to 1) 0.006
1
Nuclear MMP2 0 (0 to 1) 0 (0 to 1) 0 (0 to 1) 0.054
1
MMP9 1 (0 to 4) 2 (0 to 4) 0 (0 to 4) 0.049
1
Delimitating Epithelium 24 (20.2%) 17 (28.1%) 7 (12.3%) 0.036
2
Hyperplasia 42 (35.1%) 21 (35.1%) 21 (35.1%) 0.999
2
Fibrosis 80 (66.7%) 42 (70.2%) 38 (63.2%) 0.551
2
Granuloma 17 (14.2%) 9 (15.0%) 8 (14.0%) 0.999
2
Mann-Whitney Test
1
, Fisher’s Exact Test
2
Table 2: Correlations found when comparing the studied variables
Age Thickness
Matrix CD31 c MMP2
n MMP2
MMP9
Age _____ -0.256
(0.008)
-0.010
(0.919)
-0.164
(0.160)
-0.248
(0.027)
-0.139
(0.180)
-0.154
(0.173)
Thickness
-0.256
(0.008)
_____ 0.479
(<0.0001)
0.742
(<0.0001)
0.465
(<0.0001)
0.414
(<0.0001)
0.643
(<0.0001)
Matrix -0.010
(0.919)
0.439
(<0.0001)
_____ 0.473
(<0.0001)
0.302
(<0.0001)
0.183
(0.077)
0.300
(0.007)
CD31 -0.164
(0.160)
0.742
(<0.0001)
0.473
(<0.0001)
_____ 0.539
(<0.0001)
0.515
(<0.0001)
0.850
(<0.0001)
MMP2 c -0.248
(0.027)
0.465
(<0.0001)
0.302
(<0.0001)
0.539
(<0.0001)
_____ 0.908
(<0.0001)
0.664
(<0.0001)
MMP2 n -0.139
(0.180)
0.414
(<0.0001)
0.183
(0.077)
0.515
(<0.0001)
0.908
(<0.0001)
_____ 0.548
(<0.0001)
MMP9 -0.154
(0.173)
0.643
(<0.0001)
0.300
(0.007)
0.850
(<0.0001)
0.664
(<0.0001)
0.548
(<0.0001)
_____
Age = patient’s age on the surgery date (in years); Thickness = perimatrix thickness (in micrometers); Matrix= mean number of cell layers
in the matrix; Inflammation = histological inflammation degree; CD31 = mean number of blood vessels in the perimatrix; c MMP2 =
reactivity of metalloproteinase 2 in the matrix cell cytoplasm; n MMP2 = reactivity of metalloproteinase
2 in matrix cell nucleus; MMP9 =
reactivity of metalloproteinase
9 in the matrix cell cytoplasm; Spearman’s Correlation Coefficient (P Value).
117
Legends of Figures:
Figure 1: Summary of the different cell types that produce MMP and TIMP. The
cholesteatoma matrix may initiate the immunological response with the activation of
different cells in the perimatrix, such as: macrophages, fibroblasts and leucocytes, releasing
cytokines, such as interleukin-1 (IL-1) and the Tumoral Necrosis Factor (TNF α). The
activated immunological cells can also release both MMP and TIMP. Physiological
conditions may cause unbalanced MMP/TIMP. Inflammatory reactions lead to unbalance
of MMP in relation to TIMP, which may cause the extracell matrix remodeling.
Figure 2: Scanned image of the blade, cross-sectional cut of the cholesteatoma,
stained with Hematoxylin-Eosin. We can see its three constituting parts: A – Perimatrix, B
– Matrix, C – Cystic Content. Enlargement: 100x
Figure 3: Histological image of the cholesteatoma stained with Hematoxylin-Eosin
(A) and Picrosyrius (B): 1 – Perimatrix, 2 – Matrix, 3 – Cystic Content. Enlargement: 100x
Figure 4: Image obtained with Image Pro-Plus through thickness measurement
technique.
Figure 5: Image of ImagePro Plus Media Cybernetis software screen, showing
Chalkley grid: 1 - Blood vessel marked that does not coincide with the grid point, 2 - Point
that coincides with blood vessel.
Figure 6: Representative cholesteatomas of the sample, illustrating their histological
components: 1 – Perimatrix, 2 – Matrix, 3 – Cystic Content. A – Epitympanic
cholesteatoma from a female patient of 44 years old. In histological terms, it presents
stratified scaly keratinized epithelium, mean number of cell layers: three. Perimatrix is
118
absent. Enlargement: 200x. B – Epitympanic cholesteatoma from a male patient of 37 years
old. In histological terms, it presents stratified scaly keratinized epithelium, mean number
of cell layers: six. Narrow and fibrotic perimatrix, with rare lymphocytes. Absence of
granuloma. Enlargement: 200x. C – Mesotympanic cholesteatoma from a female patient of
35 years old. In histological terms, it presents stratified scaly keratinized epithelium, mean
number of cell layers: four. Very narrow perimatrix, no fibrosis and no inflammatory
infiltrate. Enlargement: 200x. D - Mesotympanic cholesteatoma from a male patient of 16
years old. In histological terms, it presents stratified scaly keratinized epithelium, mean
number of cell layers: six. Narrow and delicate perimatrix, no fibrosis and with little
inflammatory infiltrate. Enlargement: 200x. E - Epitympanic cholesteatoma from a female
patient of 11 years old. In histological terms, it presents stratified scaly keratinized
epithelium, mean number of epithelial cell layers: twelve. The perimatrix presents dense
fibrosis, accentuated chronic inflammatory infiltrate and is delimitated in its depth plane by
simple cuboidal epithelium. Enlargement: 50x. F - Mesotympanic cholesteatoma from a
female patient of seven years old. In histological terms, it presents stratified scaly
keratinized epithelium, mean number of cell layers: thirteen. The perimatrix presents mild
fibrosis with accentuated inflammatory infiltrate and neutrocytic exudation, being
delimitated in its depth plane by simple cuboidal epithelium. Absence of granuloma.
Enlargement: 50x.
Figure7: Cholesteatoma marked with CD 31 (arrow). Enlargement: 200x
Figure 8: Cholesteatoma marked with cytoplasmatic MMP 2. Moderate
immunoreactivity, 80% of cells were stained. Enlargement: 200x
Figure 9: Cholesteatoma marked with nuclear MMP 2. Moderate immunoreactivity,
70% of cells were stained. Enlargement: 200x
119
Figure 10: Cholesteatoma marked with MMP 9. Accentuated immunoreactivity,
100% of cells were stained. Enlargement: 200x
120
Figure 1
121
Figure 2
Figure 3
122
Figure 4
Figure 5
123
Figure 6
124
Figure 7
125
Figure 8
126
Figure 9
127
Figure 10
Dear Professor Dornelles,
Your submission entitled "Comparison of acquired cholesteatoma between pediatric and
adult patients" has been been assigned the following manuscript number: EAORL-D-08-
00198.
You will be able to check on the progress of your paper by logging on to Editorial Manager
as an author. The URL is http://eaorl.edmgr.com/.
Thank you for submitting your work to this journal.
Kind regards,
Jan Olofsson
Managing Editor
European Archives of Oto-Rhino-Laryngology and Head & Neck
Anexo 6
CD com a coleção histológica
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