( PDF ) Caracterização estrutural de tecidos mamários normais e neoplásicos através de espalhamento de raios X

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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

FACULDADE DE FILOSOFIA, CIÊNCIAS E LETRAS DE RIBEIRÃO PRETO

DEPARTAMENTO DE FÍSICA E MATEMÁTICA

ANDRÉ LUIZ COELHO CONCEIÇÃO

Caracterização estrutural de tecidos mamários normais e

neoplásicos através de espalhamento de raios X

RIBEIRÂO PRETO, SP – BRASIL

AGOSTO DE 2008

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ANDRÉ LUIZ COELHO CONCEIÇÃO

Caracterização estrutural de tecidos mamários normais

e neoplásicos através de espalhamento de raios X

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Física Aplicada à Medicina e

Biologia da Faculdade de Filosofia Ciências e

Letras de Ribeirão Preto, Universidade de São

Paulo, como requisito parcial à obtenção do grau

de Mestre em Ciências.

Orientador: Prof. Dr. Martin Eduardo Poletti

RIBEIRÂO PRETO, SP – BRASIL

AGOSTO DE 2008

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AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE

TRABALHO POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA FINS

DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.

Conceição, André Luiz Coelho

Caracterização estrutural de tecidos mamários normais e neoplásicos através de

espalhamento de raios X / André Luiz Coelho Conceição; Orientação: Prof. Dr. Martin

Eduardo Poletti, Ribeirão Preto: FFCLRP / USP, 2008.

Dissertação (Mestrado) apresentada à Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de

Ribeirão Preto - Universidade de São Paulo.

1. Espalhamento de Raios-X. 3. Câncer de mama.

Tecido mamário. 4. Radiodiagnóstico.

ANDRÉ LUIZ COELHO CONCEIÇÃO

Caracterização estrutural de tecidos mamários normais e neoplásicos através

de espalhamento de raios X

Esta dissertação foi julgada adequada à obtenção do grau de Mestre e aprovada em sua

forma final pelo Curso de Mestrado em Física Aplicada à Medicina e Biologia da

Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto, da Universidade de São Paulo.

Ribeirão Preto, _____/________________/______.

______________________________________________________

Prof. Dr. Martin Eduardo Poletti

Orientador - Universidade de São Paulo

______________________________________________________

Prof. Dr. Irineu Mazzaro

Universidade Federal do Paraná

______________________________________________________

Pesquisadora Dra. Daniela Zanchet

Laboratório Nacional de Luz Síncrotron

__________________________________________________________________________i

“Existe uma coisa que uma longa existência me ensinou:

toda a nossa ciência, comparada à realidade, é primitiva e

inocente; e, portanto, é o que temos de mais valioso.”.

Albert Einstein

_______________________________________________________________________ii

Dedico este trabalho à minha família,

amigos, colegas e educadores

_______________________________________________________________________iii

AGRADECIMENTOS

Este trabalho é o resultado de um esforço coletivo de todas as pessoas que

participaram do meu desenvolvimento pessoal e profissional. Não há palavras que

consigam descrever o verdadeiro e imensurável sentimento de gratidão a todas elas:

A Deus, pela vida, saúde, paz, iluminação, força de vontade e oportunidades a

mim concedidas.

A toda minha família, em especial aos meus pais, Osmar e Ana, e meu irmão,

Flávio, pelo amor e incentivos incondicionais.

Ao Prof. Dr. Martin Eduardo Poletti, pelo excelente trabalho de orientação tanto na

parte técnica ao longo do programa de mestrado, quanto em ensinamentos para a vida.

Aos companheiros do grupo Física das Radiações e Dosimetria: João José

Guimarães da Costa, Ana Paula Vollet Cunha, Tiago Rangon Giacometti, Diego Merigue

da Cunha, Alessandra Tomal, Marina Piacenti Silva, e em especial, Marcelo Antoniassi,

pela sabedoria compartilhada.

Ao Prof. Dr. Alfredo Ribeiro Silva, pela experiência transmitida na área de

patologia de doenças mamárias.

Ao técnico Eldereis de Paula, pela ajuda na montagem e manutenção técnica do

laboratório de física das radiações e dosimetria.

_______________________________________________________________________iv

Ao Departamento de Patologia do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina

da USP de Ribeirão Preto pelas amostras de tecido mamário cedidas, sem as quais este

trabalho não se tornaria possível.

Ao pessoal das secretarias do Departamento de Física e Matemática e da

Faculdade de Filosofia, de Ciências e Letras da USP de Ribeirão Preto, pela, sempre

presente, boa vontade nos atendimentos.

Aos grandes amigos de Santa Rosa de Viterbo, por estarem sempre próximos

tanto nos momentos difíceis, como nos de lazer e diversão, bem como aos novos amigos

encontrados em Ribeirão Preto, pelo companheirismo sempre presente.

Em especial aos amigos Júlio, Rafael, Jonathas, Alexandre e Theo pelo

companheirismo, incentivo e aprendizado profissional e principalmente pessoal.

Aos funcionários do Laboratório Nacional de Luz Síncrotron pelos inúmeros

auxílios prestados, tanto no momento da realização das medidas, quanto em dúvidas

posteriores, principalmente ao pessoal das linhas XRD-1, SAXS-1 e SAXS-2.

À FAPESP, pela concessão da bolsa ao projeto “Estudo das organizações

moleculares e supramoleculares de tecidos mamários normais e neoplásicos por

espalhamento de fótons”, processo 06/54027-3 e pelo apoio financeiro ao projeto Jovem

Pesquisador em centros emergentes “Caracterização Histopatológica de Tecidos

Mamários através da Radiação Secundária”, processo 02/00380-3.

_______________________________________________________________________v

Resumo

CONCEIÇÃO, A. L. C. Caracterização estrutural de tecidos mamários normais e

neoplásicos através de espalhamento de raios X. [Dissertação]. Ribeirão Preto: Faculdade

de Filosofia Ciências e Letras de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo; 2008. 103 p.

A radiação espalhada em radiodiagnóstico, como em mamografia, é usualmente

considerada um problema, uma vez que degrada o contraste da imagem. No entanto,

pesquisas recentes mostram que a distribuição angular de fótons espalhados (perfil de

espalhamento) pode fornecer informações sobre as estruturas que compõem um tecido

biológico, permitindo, a partir da análise desta, identificar a presença de anormalidades no

tecido.

A proposta deste trabalho foi desenvolver medidas do perfil de espalhamento a

médio (WAXS) e baixo ângulo (SAXS) de tecidos mamários previamente classificados,

como tecidos normais, alterações benignas ou malignas, usando um tubo de raios X e

radiação Síncrotron e, posteriormente, identificar as estruturas moleculares e

supramoleculares presentes nos tecidos estudados e verificar estatisticamente se as

informações contidas conjuntamente nos perfis de espalhamento a médio e baixo ângulo

permitem diferenciar tecidos normais de alterados. Este tipo de estudo é potencialmente

importante na área da Saúde por estar associado ao desenvolvimento de novas técnicas

radiológicas que permitiriam ampliar a capacidade de diagnóstico do câncer mamário.

Palavras chave: espalhamento de raios X, tecido mamário, mamografia.

_______________________________________________________________________vi

Abstract

CONCEIÇÃO, A. L. C. Structural characterization of human breast tissues normal and

neoplastic by x-ray scattering. [Dissertação]. Ribeirão Preto: Faculdade de Filosofia

Ciências e Letras de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo; 2008. 103 p.

Scattering radiation in diagnostic radiology, such as mammography, is usually

considered a problem, since it degrades the image contrast. However, recent research

shows that the angular distribution of scattered photons (scattering profile) can provide

information on the structures that compose a biological tissue, allowing, from the analysis

of this, identify the presence of abnormalities in the tissue.

The purpose of this study was to develop measurements of scattering profile at

wide angle x-ray scattering (WAXS) and small angle x-ray scattering (SAXS) from breast

tissue previously classified as normal tissue, benign or malignant disease, using a x-ray

tube and synchrotron radiation and, subsequently, identify molecular and supra-molecular

structures present in these tissues studied and verify statistically, if the information

contained in both scattering profiles at wide and small angle allow differentiate normal

tissues of changed. This type of study is potentially important in the health area, since to

be associated with the development of new radiological techniques that would allow to

expand the ability of breast cancer diagnosis.

Keywords: x-ray scattering, human breast tissue, mammography

_______________________________________________________________________vii

Índice

CAPÍTULO 1 – INTRODUÇÃO ...................................................................................... - 1 -

CAPÍTULO 2 – HISTÓRICO E REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ................................................. - 6 -

2.1. O espalhamento no radiodiagnóstico: desvantagem.................................................... - 6 -

2.2. O espalhamento como ferramenta para determinação de estruturas em tecidos

biológicos: vantagem ........................................................................................................ - 7 -

CAPÍTULO 3 – FUNDAMENTOS TEÓRICOS ................................................................. - 15 -

3.1. Aspectos Clínicos ...................................................................................................... - 15 -

3.1.1. Anatomia da mama.................................................................................................................... - 15 -

3.1.2. Histologia da mama ................................................................................................................... - 17 -

3.1.3. Patologias mamárias .................................................................................................................. - 19 -

3.2. Fontes de produção de raios X .................................................................................. - 22 -

3.2.1. Tubo de raios X .......................................................................................................................... - 23 -

3.2.1. Síncrotron .................................................................................................................................. - 24 -

3.3. Interação dos raios X com a matéria ......................................................................... - 26 -

3.3.1. Vetor de Espalhamento ............................................................................................................. - 27 -

3.3.2. Espalhamento Elástico ............................................................................................................... - 29 -

3.3.2.1. Espalhamento por elétron livre .......................................................................................... - 29 -

3.3.2.2. Espalhamento por átomo livre ........................................................................................... - 30 -

3.3.2.3. Espalhamento por Molécula Livre ...................................................................................... - 32 -

3.3.2.4. Espalhamento por Conjunto de Moléculas ........................................................................ - 35 -

CAPÍTULO 4 – MATERIAIS E MÉTODOS ..................................................................... - 39 -

4.1. Amostras ................................................................................................................. - 39 -

4.2. Experiências de Espalhamento de Raios X ................................................................. - 40 -

4.2.1. Espalhamento de raios X em médio ângulo (WAXS) usando tubo de raios X ............................ - 40 -

4.2.1.1. Distribuição de Amostras ................................................................................................... - 40 -

4.2.1.2. Arranjo Experimental ......................................................................................................... - 41 -

4.2.1.3. Metodologia Adotada ........................................................................................................ - 43 -

4.2.2. Espalhamento de raios X em médio ângulo (WAXS) usando radiação síncrotron .................... - 52 -

4.2.2.1. Distribuição de Amostras ................................................................................................... - 52 -

4.2.2.2. Arranjo Experimental ......................................................................................................... - 53 -

4.2.2.3. Metodologia Adotada ........................................................................................................ - 55 -

4.2.3. Espalhamento de raios X em baixo ângulo (SAXS) usando radiação síncrotron ........................ - 60 -

4.2.3.1. Distribuição de Amostras ................................................................................................... - 60 -

4.2.3.2. Arranjo Experimental ......................................................................................................... - 61 -

4.2.3.3. Metodologia Adotada ........................................................................................................ - 63 -

4.2.4. Combinação de experiências simultâneas de WAXS e SAXS ..................................................... - 67 -

4.2.4.1. Distribuição das amostras .................................................................................................. - 68 -

4.2.4.2. Arranjo Experimental ......................................................................................................... - 68 -

4.2.4.3. Metodologia ....................................................................................................................... - 70 -

CAPÍTULO 5 – RESULTADOS E DISCUSSÕES ............................................................... - 75 -

5.1. Espalhamento de raios X em médio ângulo (WAXS) ................................................... - 75 -

_______________________________________________________________________viii

5.1.1. Coeficiente linear de espalhamento elástico: determinação de estruturas moleculares e sua

correlação com imagens histológicas .................................................................................................. - 75 -

5.1.2. Comparação com a literatura .................................................................................................... - 80 -

5.2. Espalhamento de raios X em baixo ângulo (SAXS) ...................................................... - 83 -

5.2.1. Perfil de espalhamento: determinação de estruturas supramoleculares e sua correlação com

imagens histológicas ............................................................................................................................ - 83 -

5.2.2. Comparação com a literatura .................................................................................................... - 87 -

5.3. Combinação simultânea de WAXS e SAXS ................................................................. - 89 -

5.3.1. Perfil de espalhamento: Determinação de estruturas moleculares e supramoleculares .......... - 89 -

CAPÍTULO 6 – CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS ........................................................... - 92 -

6.1. Sobre as medidas de WAXS....................................................................................... - 92 -

6.2. Sobre as medidas de SAXS ........................................................................................ - 93 -

6.3. Sobre a combinação de WAXS e SAXS ....................................................................... - 95 -

6.4. Perspectivas ............................................................................................................. - 95 -

Referências ............................................................................................................. - 97 -

_______________________________________________________________________ix

Lista de Figuras

Figura 2.1: Diagrama que ilustra a formação da imagem radiográfica convencional considerando a

radiação transmitida primária e espalhada. (a) paciente; (b) intensidade da radiação que atinge o

filme: B1 representa a radiação espalhada e B2 a total (transmitida + espalhada); (c) imagem

radiográfica................................................................................................................................ - 7 -

Figura 3.1: Estrutura anatômica da mama (a) e (b). As glândulas mamárias, as quais consistem de

lóbulos, são embebidas em tecido adiposo e circundadas por tecido conjuntivo. ..................... - 15 -

Figura 3.2: Tipos de neoplasias ................................................................................................ - 20 -

Figura 3.3: Lâmina histológica de uma amostra de carcinoma ductal, indicando calcificações,

necroses, além das células cancerosas. A área rosada na figura corresponde à matriz extracelular,

formada principalmente por colágeno. Além disso, observa-se a membrana basal ao redor do

ducto. ...................................................................................................................................... - 22 -

Figura 3.4: Espectro eletromagnético exibindo a região correspondente aos raios X (retângulo

vermelho). ............................................................................................................................... - 23 -

Figura 3.5: Esquema de funcionamento de um wiggler, o qual deve ser inserido em linha reta nas

instalações de um síncrotron. .................................................................................................. - 25 -

Figura 3.6: Geometria do espalhamento; (a) vetor espalhamento como resultante; (b) a diferença

de fase é dada pela diferença de caminhos ópticos. A linha mais espessa é o comprimento do

caminho máximo. .................................................................................................................... - 28 -

Figura 3.7: Seção de choque diferencial Thomson em função do ângulo de espalhamento. ..... - 30 -

Figura 3.8: Fator de forma

(

)

ZqF , para o átomo de Oxigênio dado por Hubbel et al. (1975). - 31 -

Figura 3.9: Seção de Choque Diferencial para o espalhamento Rayleigh para o átomo de Oxigênio

para fótons de 17,44 keV. ........................................................................................................ - 32 -

Figura 3.10: Fator de forma da molécula de H

)(qF

mol

, obtido utilizando distribuição de

densidade eletrônica e

)(qF

MAI

mol

alcançado através do modelo atômico independente (CHAN e DOI,

1983). ...................................................................................................................................... - 34 -

Figura 3.11: Seção de choque diferencial elástica para (i) água líquida a 20ºC de Morin (1982), (ii)

molécula de água (MAI). .......................................................................................................... - 36 -

Figura 4.1: Distribuição histopatológica dos tecidos analisados no experimento de WAXS usando

tubo de raios X. ........................................................................................................................ - 41 -

Figura 4.2: Arranjo experimental para as medidas de difração de raios X. ................................ - 41 -

Figura 4.3: Visão da área da amostra irradiada. ........................................................................ - 42 -

Figura 4.4: Medida experimental das contribuições espúrias. .................................................. - 45 -

Figura 4.5: Variação da intensidade do feixe incidente experimental. ...................................... - 46 -

Figura 4.6: Comportamento do fator de polarização P(q). ........................................................ - 48 -

Figura 4.7: Fator de atenuação teórico para uma amostra de água. ......................................... - 49 -

_______________________________________________________________________x

Figura 4.8: (a) comparação do coeficiente linear de espalhamento para água líquida obtido

experimentalmente com o reportado por Morin (MORIN, 1962); (b) diferença relativa entre as

curvas da figura (a). ................................................................................................................. - 51 -

Figura 4.9: Distribuição histopatológica dos tecidos analisados neste experimento .................. - 52 -

Figura 4.10: Montagem experimental na linha D12A - XRD-1 no LNLS. ..................................... - 53 -

Figura 4.11: Medida experimental do espalhamento por contribuições espúrias. .................... - 56 -

Figura 4.12: Comportamento do fator de atenuação e efeitos geométricos de uma amostra de

água líquida para o experimento de WAXS utilizando as geometrias de transmissão e reflexão. - 57

Figura 4.13: a) coeficiente linear de espalhamento elastico experimental para água comparado

com o tabulado por Morin (1982); b) Diferença relativa entre as duas curvas exibidas em a). .. - 59 -

Figura 4.14: Distribuição das amostras de tecidos mamários utilizados neste experimento. ..... - 60 -

Figura 4.15: Esboço da montagem experimental para experimento de SAXS. ........................... - 61 -

Figura 4.16: Esboço da posição da amostra no disco de chumbo (porta-amostra). ................... - 62 -

Figura 4.17: Exemplo de uma imagem de SAXS com o sistema de coordenadas. ...................... - 63 -

Figura 4.18: Intensidade espalhada por contribuições espúrias. ............................................... - 65 -

Figura 4.19: Intensidade normalizada medida experimentalmente para uma amostra de

SilverBehenate comparado aos valores de Huang et al. (1993). ................................................ - 67 -

Figura 4.20: Distribuição das amostras utilizadas para a combinação WAXS e SAXS. ................ - 68 -

Figura 4.21: Montagem experimental da linha SAXS-1 no LNLS utilizada para as medidas

combinando WAXS e SAXS simultaneamente. .......................................................................... - 69 -

Figura 4.22: Imagens de WAXS. Da esquerda para a direita, cada faixa corresponde à distribuição

de intensidade espalhada de: três tipos de tecidos mamários, contribuições espúrias e amostra

padrão de alumina. .................................................................................................................. - 71 -

Figura 4.23: Intensidade espalhada por contribuições espúrias para os experimentos de: a) SAXS e

b) WAXS. .................................................................................................................................. - 72 -

Figura 4.24: Fator de correção para atenuação e efeitos geométricos para uma amostra de tecido

adiposo para os experimentos de: a) SAXS e b) WAXS. ............................................................. - 73 -

Figura 5.1: Comparação do coeficiente linear de espalhamento elástico obtido com a técnica de

WAXS, utilizando diferentes configurações experimentais para: a) tecido normal adiposo; b)

neoplasia benigna e c) neoplasia maligna. A figura 5.1d compara o

para amostras típicas de

tecido mamário normal adiposo, neoplasia benigna e maligna. ................................................ - 76 -

Figura 5.2: Lâmina histológica de uma amostra de tecido normal adiposo. .............................. - 77 -

Figura 5.3: Lâmina histológica de uma amostra de fibroadenoma. ........................................... - 79 -

Figura 5.4: Lâmina histológica de uma amostra de carcinoma ductal invasivo. ......................... - 79 -

Figura 5.5: Comparação do perfil de espalhamento de tecido mamário adiposo obtido neste

trabalho com outros anteriormente publicados. ...................................................................... - 81 -

_______________________________________________________________________xi

Figura 5.7: Comparação do perfil de espalhamento de uma amostra típica de carcinoma ductal

invasivo obtido neste trabalho com outros anteriormente publicados. .................................... - 81 -

Figura 5.6: Comparação do perfil de espalhamento de uma amostra típica de fibroadenoma obtido

neste trabalho com outros anteriormente publicados. ............................................................. - 81 -

Figura 5.8: Perfil de espalhamento de amostras típicas dos três tipos de tecidos mamários

estudados neste trabalho utilizando SAXS. ............................................................................... - 83 -

Figura 5.9: Representação esquemática do arranjo hierárquico do colágeno fibrilar de tecidos

mamários, exibindo ainda seus parâmetros dimensionais. ....................................................... - 85 -

Figura 5.10: Comparação do perfil de espalhamento de uma amostra típica de tecido normal

obtido neste trabalho com outros anteriormente publicados. .................................................. - 88 -

Figura 5.11: Comparação do perfil de espalhamento de uma amostra típica de neoplasia maligna

obtido neste trabalho com outros anteriormente publicados. .................................................. - 88 -

Figura 5.12: Perfil de espalhamento na região de WAXS de amostras típicas de tecido normal,

neoplasia benigna e maligna. ................................................................................................... - 90 -

Figura 5.13: Perfil de espalhamento na região de SAXS de amostras típicas de tecido normal,

neoplasia benigna e maligna. ................................................................................................... - 90 -

_______________________________________________________________________xii

Lista de Tabelas

Tabela 5.1. Picos dos três tipos de tecidos mamários histologicamente classificados. .............. - 79 -

Tabela 5.2. Picos dos três tipos de tecidos mamários histologicamente classificados. .............. - 86 -

_______________________________________________________________________xiii

Lista de Abreviaturas e Siglas

A(q): fator de correção para atenuação e efeitos geométricos

C: fator de normalização

EDXRD: Difração de raios X dispersivo em energia

F(q): fator de forma

HPGe: detector de Germânio Hiperpuro

: Intensidade Relativa

K(q): fator de correção para variação da intensidade do feixe para manter área de

irradiação constante

LNLS: Laboratório Nacional de Luz Síncrotron

NAI(Tl): detector de Iodeto de Sódio ativado com Telúrio

: número de átomos por unidade de volume (igual a (N

.ρ / M), sendo N

a constante de

Avogadro, ρ a densidade e M a massa molecular).

P(q): fator de correção para polarização

PMMA: Polimetilmetacrilato

PVC: Policloreto de vinila

q: parâmetro relacionado com o momento transferido. Dado por q=(4π.sen(θ/2))/λ.

SAXS: Small Angle X-ray Scattering (Espalhamento de raios X em baixos ângulos)

WAXS: Wide Angle X-Ray Scattering (Espalhamento de raios X em médios ângulos)

: coeficiente linear de espalhamento elástico

____________________________________________________________________________ - 1 -

CAPÍTULO 1 – INTRODUÇÃO

De acordo com a Organização Mundial da Saúde (OMS), mais de 11 milhões de

pessoas são diagnosticadas com câncer em todo o mundo e cerca de sete milhões destas

morrem por ano (12,5% das mortes mundiais) (http://www.who.int/cancer

). O tipo de

câncer de maior incidência entre as mulheres é o câncer de mama, sendo responsável

por cerca de 20% de todas as mortes devido ao câncer (ROGERS et al., 1999). Além

disso, o câncer de mama é uma das principais causas de morte entre as mulheres nos

países em desenvolvimento (PARKIN, 2001). Segundo estimativas de incidência de

câncer no Brasil para 2008, o câncer de mama será o segundo tipo mais comum, com

cerca de 49.400 casos (INSTITUTO NACIONAL DE CÂNCER, 2007). Entretanto, se o

câncer de mama é diagnosticado e tratado em sua fase inicial, aproximadamente 90%

dos pacientes podem ser curar curados (SEIDMAN et al., 1982; MICHAELSON et al.,

2002). Dentre as muitas técnicas de detecção de neoplasias mamárias utilizadas

atualmente, a mamografia é a mais empregada clinicamente para a detecção precoce do

câncer de mama. As mamografias são obtidas usando as diferenças entre os coeficientes

de atenuação linear dos diversos tipos de tecidos, detectando corpos de diferentes

densidades e formas nos tecidos mamários. A radiação transmitida (modulada em

intensidade pelo paciente) impressiona um receptor de imagem, gerando um padrão de

contraste no filme, sendo esta imagem formada, posteriormente usada para o diagnóstico

(JOHNS e CUNNINGHAM, 1983; HAUS e CULLINAN, 1996). Entretanto, esta técnica não

é nem 100% sensível, nem 100% específica, uma vez que alguns diagnósticos falso-

negativo e falso-positivo acontecem, resultando em casos de câncer não diagnosticados

ou biópsias desnecessárias (MUSHLIN et al., 1998; SOUHAMI e TOBIAS, 1998). Este

fato ocorre principalmente, devido à pequena diferença nas propriedades de atenuação

_______________________________________________________________________- 2 -

dos tecidos mamários e à ocorrência de efeitos de espalhamento (inelástico e elástico)

gerando uma degradação do contraste na imagem, fatores estes que acarretam uma

diminuição entre os diferentes tons de cinza presentes nas mamografias, diminuindo a

detectabilidade do exame (KOCH et al., 1996; BARNES, 1979, 1991; POLETTI, 1997a).

Com a finalidade de reduzir os efeitos indesejáveis da radiação espalhada na imagem

mamográfica, o espalhamento começou a ser estudado mais intensamente (JOHNS e

YAFFE, 1983; MAGALHÃES et al., 1995). Estudos recentes apontaram que a radiação

espalhada pode permitir uma imagem seletiva dos diferentes tipos de tecidos irradiados

(SPELLER, 1999), visto que os fótons espalhados carregam informação sobre a estrutura

presente nos tecidos do paciente, informação que não é considerada na radiografia

convencional. Estas descobertas fizeram com que se intensificassem os estudos sobre o

espalhamento de fótons de baixa energia, como a utilizada em mamografia, visando obter

o perfil de espalhamento de tecidos e materiais equivalentes.

Denomina-se perfil de espalhamento a distribuição do número de fótons

espalhados elasticamente em função do ângulo de espalhamento (ou do momento

transferido), sendo esta distribuição decorrente dos efeitos coletivos de espalhamento

devido ao átomo, molécula ou arranjos supramoleculares presentes no material. Para

uma dada energia, os fenômenos de espalhamento em altos ângulos são devido à

estrutura atômica do material (KANE et al., 1985). Nessa região as interferências entre os

diversos átomos que compõem o tecido não são detectadas. Em ângulos intermediários

aparecem interferências atômicas ou moleculares (KLUG e ALEXANDER, 1974) e, em

baixos ângulos surgem interferências de grupos de moléculas (estruturas

supramoleculares) (GLATTER e KRATKY, 1982). Esses efeitos de interferência atômica,

molecular e supramolecular causam, na distribuição angular de intensidade espalhada,

um único e característico perfil de espalhamento, o qual pode ser computado se forem

conhecidos os parâmetros estruturais (distribuição espacial de carga, distância entre

_______________________________________________________________________- 3 -

átomos, etc.). Como estes parâmetros são, em geral, desconhecidos a priori, o perfil de

espalhamento deve ser medido experimentalmente (POLETTI, 2001).

Os perfis de espalhamento de estruturas atômicas, moleculares e

supramoleculares podem ser medidos experimentalmente através das técnicas de

espalhamento Rayleigh, difração ou também denominado espalhamento de raios X em

médio ângulo do inglês Wide Angle X-ray Scattering (WAXS) e espalhamento de raios X

em baixo ângulo do inglês Small Angle X-ray Scattering (SAXS), respectivamente.

Entretanto, neste trabalho apenas as duas últimas técnicas serão utilizadas.

Embora existam trabalhos publicados relatando a aplicação das técnicas de WAXS

(KIDANE et al., 1999; POLETTI et al., 2002b; GRIFFITHIS et al., 2007; OLIVEIRA et al.,

2008) e SAXS (LEWIS et al., 2000; FERNÁNDEZ et al., 2002, 2004, 2005; ROUND et al.,

2005) em tecidos mamários, existem discordâncias entre os resultados apresentados

pelos diferentes autores e além disso, não existe na literatura nenhum trabalho que

aplique simultaneamente as duas técnicas sobre um mesmo conjunto de amostras de

tecidos mamários para identificação de estruturas em escala molecular e supramolecular.

Portanto, este trabalho tem como objetivos:

• Obter informações detalhadas das diferentes estruturas em escala molecular e

supramolecular existentes nos tecidos mamários normais e neoplásicos, a partir da

análise e interpretação dos perfis de espalhamento em médio e baixo ângulo,

obtidos através de medidas com feixes de raios X e radiação síncrotron.

• Apresentar resultados de medidas simultâneas de espalhamento de raios X em

médio e baixo ângulo, permitindo assim, observar a maioria das estruturas

existentes nestes tecidos.

Esta dissertação foi organizada da seguinte forma:

_______________________________________________________________________- 4 -

No capítulo 2 é apresentado um breve histórico do papel da radiação espalhada

em radiodiagnóstico, vantagens e desvantagens é apresentado. Seguindo com uma

sucinta revisão bibliográfica dos dados publicados sobre a utilização da radiação

espalhada como ferramenta para determinação de estruturas moleculares e

supramoleculares.

No capítulo 3 é feita uma breve descrição dos fundamentos teóricos em que este

trabalho está baseado. Principiando por uma descrição concisa da mama: anatomia,

histologia e patologia. Posteriormente, dedicou-se a definição dos tipos de fontes de

radiação utilizadas neste trabalho, tubo de raios X e radiação síncrotron. Por fim, serão

apresentadas as abordagens para descrever a seção de choque diferencial elástica para

o espalhamento de fótons em diversos sistemas, partindo do caso mais simples, o

espalhamento de fótons por um elétron livre, até o caso que envolve um material amorfo

composto por várias moléculas, sendo este último o mais apropriado para descrever o

espalhamento por tecidos biológicos.

O capítulo 4 apresenta os materiais utilizados para a realização dos experimentos

de ambas as técnicas (WAXS e SAXS), bem como a metodologia aplicada às medidas

em cada configuração experimental, onde são descritas as correções necessárias para a

obtenção dos perfis de espalhamento, isto é, as correções por contribuições espúrias,

atenuação e efeitos geométricos e polarização, bem como, os procedimentos para

estimar as incertezas associadas a tais perfis e, por fim a validação da metodologia

experimental desenvolvida.

No capítulo 5, os perfis de espalhamento obtidos por cada técnica são

apresentados e, as informações extraídas a partir da análise e interpretações destes são

correlacionadas às estruturas presentes nos tecidos mamários normais e neoplásicos,

Além disso, comparações com trabalhos prévios são mostradas. Por fim, o perfil de

_______________________________________________________________________- 5 -

espalhamento resultante das medidas simultâneas em médio e baixo ângulo é

apresentado.

O capítulo 6 é dedicado às conclusões sobre as técnicas utilizadas, os resultados

obtidos e seu potencial diagnóstico, bem como, as perspectivas para trabalhos futuros.

_______________________________________________________________________- 6 -

CAPÍTULO 2 – HISTÓRICO E REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

Neste capítulo será estudado o papel do espalhamento no radiodiagnóstico,

considerando suas vantagens e desvantagens. Além disso, será também apresentada

uma breve revisão bibliográfica dos dados publicados sobre a utilização do fenômeno de

espalhamento elástico para determinação de estruturas em materiais, principalmente em

tecidos biológicos.

2.1. O espalhamento no radiodiagnóstico: desvantagem

As imagens radiográficas convencionais são obtidas através das diferenças de

coeficientes de atenuação linear dos diversos tipos de tecidos e materiais, detectando

corpos de diferentes densidades e formas em um dado material. A radiação transmitida,

composta da radiação primária e espalhada, impressiona um receptor de imagem,

geralmente uma combinação tela-filme, gerando um padrão de contraste no filme (JOHNS

e CUNNINGHAM, 1983).

A figura 2.1 mostra como o espalhamento atua na formação da imagem,

adicionando à intensidade um fundo quase constante ao longo da distribuição espacial

(curva B1 sobre a figura 2.1-b). Este fundo é decorrente da interpretação que o receptor

faz, não diferenciando fótons espalhados daqueles transmitidos sem nenhuma interação.

Desta forma, fótons espalhados contribuem para a redução do contraste na imagem

radiológica e caso não sejam reduzidos, podem diminuir o contraste em até 60%

(BARNES, 1991). Em particular, na mamografia esta degradação do contraste torna-se

crítica (STRID, 1976; POLETTI, 1997). Por isso, diversos investimentos em pesquisas têm

como objetivo explorar e controlar o efeito da radiação espalhada, de forma a permitir que

_______________________________________________________________________- 7 -

a imagem contenha informações mais claras e precisas como, o uso de grades, espaço

de ar, etc (BARNES, 1979, POLETTI et al., 1997b).

Figura 2.1: Diagrama que ilustra a formação da imagem radiográfica convencional considerando a

radiação transmitida primária e espalhada. (a) paciente; (b) intensidade da radiação que atinge o

filme: B1 representa a radiação espalhada e B2 a total (transmitida + espalhada); (c) imagem

radiográfica.

2.2. O espalhamento como ferramenta para determinação de

estruturas em tecidos biológicos: vantagem

Entretanto, o conceito de considerar o espalhamento como uma

desvantagem vem mudando ultimamente (SPELLER, 1999), pois estudos recentes

mostram que experiências de espalhamento de raios X (espalhamento em médio e baixo

ângulo) fornecem informações detalhadas sobre as estruturas que compõe os tecidos,

fornecendo meios alternativos para distinguir patologias (KIDANE et al., 1999; LEWIS et

_______________________________________________________________________- 8 -

al., 2000; POLETTI et al., 2002b; FERNÁNDEZ et al., 2002, 2004; ROUND et al., 2005;

OLIVEIRA et al., 2008).

Estes fatos levaram a se pesquisar as propriedades de espalhamento dos

diferentes tecidos, tornando-se necessário à obtenção de medidas precisas dos perfis de

espalhamento dos diferentes tecidos humanos (OLIVEIRA et al., 2008).

Os perfis de espalhamento correspondentes às estruturas moleculares e

supramoleculares existentes em tecidos biológicos podem ser obtidos através da

utilização das técnicas de espalhamento de raios X em médio (WAXS) (KLUG e

ALEXANDER, 1974) e baixo ângulo (SAXS) (GLATTER e KRATKY, 1982),

respectivamente.

Neste tópico será apresentada uma revisão bibliográfica com os principais

trabalhos publicados sobre a utilização de ambas as técnicas, WAXS e SAXS, em tecidos

biológicos, com ênfase em tecidos mamários.

A técnica de WAXS permite obter uma distribuição espacial de pequenas

estruturas que compõem as células de um tecido, cujo tamanho esteja entre 1 e 10Å (por

exemplo, água ou pequenas moléculas, como as de ácidos graxos) (PEPLOW e

VERGHESE, 1998, KIDANE et al., 1999; POLETTI et al. 2002a, 2002b; CUNHA et al.,

2006; GRIFFITHS et al., 2007; RYAN et al., 2007; OLIVEIRA et al., 2008).

Kosanetzky et al. (1987) utilizando um difractômetro de raios X com anodo de Co

(Kα=6,935keV), mediram os perfis de espalhamento da água, vários materiais plásticos

equivalentes e alguns tecidos biológicos extraídos de animais, tendo observado que o

tecido adiposo possui um alto grau de ordenamento. Além disso, diferenças entre os

perfis de espalhamento dos tecidos de diferentes órgãos, foram notadas.

Bradley et al. (1989) mediram a seção de choque elástica da água, nylon e lucite,

utilizando uma fonte monoenergética de raios gama de

241

Am (59,54keV) e apresentaram

um método para correção dos dados experimentais. Os resultados obtidos mostram a

_______________________________________________________________________- 9 -

existência de picos de espalhamento que ocorrem em diferentes posições angulares para

cada material.

Evans et al. (1991) mediram o perfil de espalhamento de tecidos mamários

(adiposo, fibroglandular, tumor benigno, carcinoma e fibroadenoma), sangue e alguns

materiais equivalentes, utilizando um feixe polienergético produzido por um tubo de raios

X com ânodo de cobre (energia média efetiva de 46keV) e um contador proporcional

bidimensional sensível a posição, como detector. Tabularam as posições do pico principal

de espalhamento e o valor da largura à meia altura de cada tipo de amostra, observando

grandes diferenças entre os perfis dos tecidos adiposo e fibroglandular, além de

pequenas diferenças entre carcinomas e tecido fibroglandular.

Tartari et al.(1997a) mediram a seção de choque diferencial molecular de

espalhamento coerente de gordura proveniente de suínos e polimetilmetacrilato (PMMA)

utilizando um tubo de raios X com anodo de cobre (Kα=8,04keV). Tabularam o fator de

forma a partir dos dados obtidos, considerando os materiais como sendo

monomoleculares e mostraram que o PMMA não é um material adequado para simular o

espalhamento de tecido adiposo. Também mostraram fatores de correção relevantes que

devem ser aplicados aos dados experimentais (1998) e um estudo da validade da

aproximação do Modelo Atômico Independente (1997b).

Peplow e Verghese (1998) tabularam o fator de forma molecular de espalhamento

coerente de materiais plásticos, tecidos biológicos de animais e tecido mamário humano.

Para isso utilizaram radiação síncroton monoenergética de 8keV e 20keV e apresentaram

um cálculo para obter o fator de forma através das distribuições medidas utilizando o

método de Monte Carlo. Entretanto, apenas uma amostra de tecido mamário foi tabulada,

a qual não possuía classificação histológica.

Kidane et al. (1999) mediram o perfil de espalhamento para tecidos mamários

normais e neoplásicos através da técnica de EDXRD (difração de raios X dispersiva em

_______________________________________________________________________- 10 -

energia) com um tubo de raios X com anodo de tungstênio (Kα=58,86keV). A composição

histológica de cada tecido foi determinada, e os perfis de espalhamento dos diferentes

tipos de tecidos comparados. Os resultados mostraram que há diferenças notáveis entre

os perfis de espalhamento de tecidos normais e neoplásicos. As posições e altura dos

picos principais de espalhamento foram tabuladas, porém os perfis de espalhamento

possuem pobre resolução em momento transferido.

Tartari

et al. (1999) mediram a seção de choque diferencial molecular de tecido

ósseo e compararam os resultados obtidos anteriormente para gordura e PMMA (1997)

com resultados de outros autores. Posteriormente, Tartari et al. (2000) mostraram que

pode-se obter o fator de forma de tecidos biológicos hipotéticos através da combinação

linear dos fatores de forma de alguns componentes básicos, como gordura, colágeno,

componentes minerais de tecidos ósseos e água, utilizando simulações de Monte Carlo

para a geometria experimental utilizada. Em 2002, Tartari et al. (2002) tabularam os

fatores de forma moleculares para gordura, água, matriz óssea e componente mineral

ósseo, e obtiveram, através de simulações de Monte Carlo de um difractômetro comercial

operando em modo reflexão, os fatores de forma para tecido adiposo e muscular,

comparando-os com resultados obtidos experimentalmente por outros autores.

Poletti et al. (2002a) mediram o coeficiente linear de espalhamento elástico de

tecidos mamários normais e neoplásicos, e materiais equivalentes utilizando tubos de

raios X com ânodo de Cobalto (Kα=6,93keV) e de Molibdênio (Kα=17,44keV). Os

resultados mostravam diferenças consideráveis entre os tecidos mamários e os materiais

equivalentes. Diferenças entre os tecidos normais e neoplásicos também foram

observadas. Posteriormente, apresentaram novas comparações entre tecidos mamários

(adiposo e glandular) e materiais equivalentes (2002b), encontrando novamente

diferenças entre eles. Obtiveram também o fator de forma e o coeficiente de atenuação

_______________________________________________________________________- 11 -

linear para esses tecidos e materiais, além de apresentarem parâmetros para caracterizar

seus perfis de espalhamento, tais como posição e altura do pico e largura à meia altura.

Poletti et al. (2002c) também apresentaram um método de correção de dados

experimentais para se obter a seção de choque diferencial de espalhamento de materiais

amorfos, considerando efeitos de polarização do feixe, múltiplo espalhamento, atenuação,

geometria, dentre outros fatores. Em 2004 Poletti et al. (2004) apresentaram novas

comparações entre tecidos mamários, muscular e materiais equivalentes. Os resultados

mostraram que os perfis de espalhamento de tecidos humanos e materiais equivalentes

apresentam diferenças significativas.

Castro et al. (2005) obtiveram os perfis de espalhamento coerente para tecidos

mamários humanos normais e neoplásicos, útero e rim, usando radiação síncrotron.

Foram medidas amostras pareadas, i.e. amostra de tecido tumoral juntamente com outra

amostra contendo o tecido sadio circundante a este tecido tumoral. Eles compararam os

perfis de espalhamento de cada amostra com suas respectivas classificações

histológicas.

Cunha et al. (2006) utilizaram feixe de raios X monoenergético de 8,04keV gerado

por um tubo de raios com ânodo de cobre e um detector cintilador de NaI(Tl) para medir o

perfil de espalhamento de tecidos mamário normais e malignos. Nestes perfis de

espalhamento medidos, eles aplicaram análise de discriminante e conseguiram classificar

corretamente 97% das amostras analisadas.

Griffiths et al. (2007) correlacionaram medidas de difração por dispersão de

energia com imagens por difração e transmissão usando a técnica de microCT para 19

amostras e mostraram que a razão entre as intensidades de dois picos característicos em

tecidos mamários, sendo em 13,8 e 18,9nm

-1

, pode ser utilizada para caracterizar cada

tipo de tecido.

_______________________________________________________________________- 12 -

Ryan et al. (2007) utilizaram um tubo de raios X com ânodo de tungstênio para

produzir um feixe de raios X polienergético e um detector HPGe dispersivo em energia

para as medidas das densidades eletrônicas e dos perfis de espalhamento de tecidos

mamários normais, neoplasia benigna e maligna. Eles empregaram análise multivariada

para combinar os resultados de densidade eletrônica obtidos por espalhamento Compton

com os de estruturas conseguidos na experiência de EDXRD e conseguiram uma

sensibilidade de 100% e especificidade de 54% no modelo.

Oliveira et al. (2008) apresentaram perfis de espalhamento de amostras

histopatologicamente classificadas como tecido normal, neoplasia benigna e maligna,

obtidas com um difractômetro comercial, bem como descreveram os procedimentos para

corrigir tais perfis medidos. Além disso, nestes perfis corrigidos foi aplicada análise

multivariada obtido que o método possui uma sensibilidade 95,6% e uma especificidade

de 82,3% na distinção entre tecido normal e neoplásico.

A técnica de SAXS é um poderoso método que permite determinar características

de sistemas moleculares em seus diferentes graus de organização, por exemplo,

proteínas e fibras de colágeno, correspondendo a estruturas maiores que 10Å (ROGERS

et al., 1999; LEWIS et al., 2000; FERNÁNDEZ et al., 2002, 2004, 2005; ROUND et al.,

2005).

Rogers et al. (1999) apresentam resultados preliminares de perfis de

espalhamento de tecidos mamários normais e neoplásicos utilizando radiação

monocromática e um contador proporcional multi-filamento bidimensional. Eles

encontraram uma significante redução no grau de ordenamento na estrutura das fibras de

colágeno em tecidos tumorais em comparação com tecidos normais.

Lewis et al. (2000) analisaram os perfis de espalhamento de 99 amostras de

tecidos mamários, normais e neoplásicos e encontraram diferenças sistemáticas no

espaçamento (d-spacing) entre as fibras de colágeno, bem como nas intensidades

_______________________________________________________________________- 13 -

espalhadas por estes tecidos. Eles extraíram valores de dois parâmetros (posição e

intensidade do pico de 3ª ordem) dos perfis de espalhamento e verificaram ser possível

distinguir entre cada tipo de tecido utilizando estes parâmetros, porém a incerteza

associada a cada valor não foi considerada.

Fernández et al. (2002) correlacionaram o perfil de espalhamento de tecidos

mamários normais e neoplásicos obtidos por espalhamento de raios X em baixos ângulos

utilizando radiação síncroton monoenergética de 12,5keV com informações

histopatológicas dos mesmo. Dessa correlação, eles observaram diferenças nos

parâmetros das fibras de colágeno presentes nos tecidos mamários como, periodicidade

espacial, diâmetro e arranjo molecular da fibra. Em 2005, Fernández et al. (2005)

correlacionaram imagens histológicas com imagem por difração e, a partir dos resultados

obtidos verificaram que quanto maior a invasão das células cancerosas nas fibras de

colágeno, maior é a degradação destas, provocando aumento da superfície específica e

distensão das ligação intermoleculares nestas fibras de colágeno invadidas.

Round et al. (2005) encontraram diferenças significativas entre os perfis de

espalhamento de amostras de tecidos mamários normais e neoplásicos malignos. As

medidas foram realizadas utilizando um feixe de raios X monoenergético de 8,04keV

produzido por um tubo de raios X e um detector bidimensional image plate com resolução

de 50µm. Apesar de serem utilizadas apenas 23 amostras eles obtiveram uma

sensitividade de 100% ao aplicar a técnica de espalhamento de raios X em baixo ângulo

para caracterizar um tecido normal de um maligno.

A combinação de ambas as técnicas (WAXS e SAXS) permite correlacionar

mudanças estruturais em nível atômico com mudanças em escala supramoleculares (ALI

et al., 2004).

Tartari et al. (2005) obtiveram a seção de choque diferencial elástica de alguns

materiais e tecidos biológicos, como osso e tecido adiposo. Para tais medidas foi utilizado

_______________________________________________________________________- 14 -

um feixe de raios X monoenergético de 12,4keV, mas com distâncias da amostra ao

detector de 1m e 3m, para WAXS e SAXS respectivamente. Eles apresentam também um

procedimento de normalização, bem como incluem nos cálculos o fator de interferência

molecular que considera o efeito dos arranjos moleculares na distribuição dos fótons

espalhados.

Conceição et al. (2008), usando radiação síncrotron monocromática de 8,4keV,

combinaram simultaneamente as técnicas de WAXS e SAXS sob um mesmo conjunto de

amostras de tecidos mamários normais e neoplásicos para obter os perfis de

espalhamento destas amostras. Eles extraíram destes perfis dois parâmetros (razão entre

as intensidades dos picos, em 13,9 e 20,1nm

-1

, e intensidade do pico de 3ª ordem de

reflexão das fibras de colágeno) e verificaram que a combinação destes parâmetros pode

ser utilizada para identificação do câncer de mama.

Ao se comparar os trabalhos acima entre si, discordâncias são observadas. Dessa

forma, este trabalho além de acrescentar novos dados à literatura, tem também como

finalidade desenvolver medidas precisas do perfil de espalhamento de tecidos mamários

normais e neoplásicos e, através da análise e interpretação deste, determinar as

estruturas moleculares e supramoleculares existentes nestes tecidos.

_______________________________________________________________________

CAPÍTULO 3 –

FUN

3.1.

Aspectos Clínicos

Nesta sub

seção será apresentada uma breve descrição de uma mama normal

englobando suas características anatômicas, histológicas e patológicas.

3.1.1.

Anatomia da mama

O conhecimento da

para o estudo de suas patologias.

3.1 e, pode ser

dividida em duas componentes: componente estrutural e componente

funcional (DÂNGELO e FATTINI, 2003; NETTER, 2004)

Figura 3.1

: Estrutura anatômica da mama (a) e (b). As glândulas mamárias, as quais consistem

de lóbulos, são embebidas em tecido adiposo e circundadas por tecido conjuntivo.

Componente e

estruturas da mama, denominado estroma mamário. O estroma mamário por sua vez é

dividido em estroma interlobular e intralobular. O estroma interlobular, na mulher jovem, é

(a)

_______________________________________________________________________

FUN

DAMENTOS TEÓRICOS

Aspectos Clínicos

seção será apresentada uma breve descrição de uma mama normal

englobando suas características anatômicas, histológicas e patológicas.

Anatomia da mama

O conhecimento da

estrutura anatômica normal

do tecido mamário é essencial

para o estudo de suas patologias.

A estrutura anatômica da mama

é mostrada na

dividida em duas componentes: componente estrutural e componente

funcional (DÂNGELO e FATTINI, 2003; NETTER, 2004)

: Estrutura anatômica da mama (a) e (b). As glândulas mamárias, as quais consistem

de lóbulos, são embebidas em tecido adiposo e circundadas por tecido conjuntivo.

Componente e

strutural

: responsável pela sustentação e proteç

estruturas da mama, denominado estroma mamário. O estroma mamário por sua vez é

dividido em estroma interlobular e intralobular. O estroma interlobular, na mulher jovem, é

(b)

_______________________________________________________________________

- 15 -

seção será apresentada uma breve descrição de uma mama normal

englobando suas características anatômicas, histológicas e patológicas.

do tecido mamário é essencial

é mostrada na

figura

dividida em duas componentes: componente estrutural e componente

: Estrutura anatômica da mama (a) e (b). As glândulas mamárias, as quais consistem

de lóbulos, são embebidas em tecido adiposo e circundadas por tecido conjuntivo.

: responsável pela sustentação e proteç

ão das

estruturas da mama, denominado estroma mamário. O estroma mamário por sua vez é

dividido em estroma interlobular e intralobular. O estroma interlobular, na mulher jovem, é

_______________________________________________________________________- 16 -

composto basicamente de tecido conjuntivo denso (fibroso), contando ainda com algumas

células de tecido adiposo (adipócitos). Já o estroma intralobular possui grande quantidade

de tecido conjuntivo frouxo e uma pequena população de células de linfócitos, além de ser

muito sensível às variações hormonais do ciclo menstrual. A constituição do estroma

mamário é variável, com o passar dos anos aumenta a quantidade de tecido adiposo,

diminuindo a proporção de tecido conjuntivo.

ii) Componente funcional: responsável pelas principais funções da mama,

como produzir e secretar o leite, é denominado parênquima mamário. O parênquima

mamário é composto basicamente por células epiteliais. As mamas são consideradas

anexas à pele, uma vez que as glândulas cutâneas se modificaram e deram origem às

glândulas mamárias ou unidades lobulares. Cada glândula mamária é composta de 15 a

20 lóbulos. Os lóbulos mamários são estruturas de contorno circular, formados pelo

agrupamento de ácinos e ductos e circundados pelo estroma interlobular. Os ácinos têm a

função é a secretar o leite e são compostos por dois tipos de células: uma camada interna

de células epiteliais e uma camada externa de células mioepiteliais. A função das células

mioepiteliais é contrair-se, promovendo a extrusão do leite secretado. Os ductos

mamários, como os ácinos, são formados por uma dupla população de células de

revestimento, epiteliais (interno) e mioepiteliais (externo), possuindo grande quantidade

de água em sua composição e sua principal função é drenar os lóbulos.

A distribuição dos tecidos conjuntivo denso e frouxo, epitelial e adiposo, depende

de fatores como: ciclo hormonal, idade, alimentação e principalmente de fatores

genéticos.

_______________________________________________________________________- 17 -

3.1.2. Histologia da mama

Apesar da sua grande complexidade, a mama como o organismo humano é

constituída por apenas quatro tipos básicos de tecidos: conjuntivo, epitelial, muscular e

nervoso. Estes tecidos são formados por células e moléculas da matriz celular

(JUNQUEIRA e CARNEIRO, 2004). Neste trabalho serão detalhados os tecidos

conjuntivos e epiteliais.

Os tecidos conjuntivos variam consideravelmente tanto na forma quanto na

função. Alguns servem como arcabouço sobre o qual as células epiteliais se dispõem

para formar órgãos; outros servem como sustentação de vários tecidos e órgãos e ainda

outros contêm o meio fluido (fluido tecidual) através do qual, nutrientes e resíduos passam

enquanto transitam entre o sangue e as células do corpo. Muitos tipos de células estão

associados com os tecidos conjuntivos, mas os fibroblastos e os macrófagos são os mais

comuns. Os fibroblastos são células de forma estrelada que sintetizam além das

glicosaminoglicanas, proteoglicanas e glicoproteínas multiadesivas, principalmente a

elastina e as fibras de colágeno. O colágeno é a classe mais abundante de proteínas do

organismo humano e representa mais de 30% do total de proteínas no corpo, sendo uma

proteína de importância fundamental na constituição da matriz extracelular e responsável

por grande parte de suas propriedades físicas. O colágeno é composto por aminoácidos

arranjados na forma de alfa-hélice-tripla e existem cerca 28 tipos diferentes de colágeno,

possuindo diferentes funções. Na mama, os mais comuns são os dos tipos I, III e IV,

sendo os dois primeiros fibrilares e o último não fibrilar (CAMERON et al. 2002). Os

macrófagos, que geralmente não são tão abundantes como os fibroblastos, são ativos

fagócitos, englobando substâncias estranhas, bem como células mortas. O tecido

conjuntivo é dividido em denso e frouxo. O tecido conjuntivo denso (fibroso) distingue-se

pela abundância de fibras de colágeno, garantindo à mama, maior capacidade de resistir

_______________________________________________________________________- 18 -

a graus excepcionais de tensão. Este tipo de tecido pode ser encontrado na forma

irregular, cuja forma se assemelha à do tecido conjuntivo frouxo, porém com maior

quantidade de fibras colágenas, bem como na forma regular, caracterizada pela

predominância de fibras colágenas firmemente unidas em feixes paralelos.

O tecido adiposo é um tipo especial de conjuntivo formado por pequenas células

chamadas adipócitos. Essas células contêm basicamente moléculas de lipídios,

principalmente triglicerídeos, que por sua vez é composto da união de uma molécula de

glicerol e três de ácidos graxos, tendo como função básica fornecer às outras células

nutrientes e energia. No corpo, os adipócitos podem ser encontrados isolados ou em

pequenos grupos no tecido conjuntivo comum, porém, a maioria deles forma grandes

agregados, constituindo o tecido adiposo.

Os tecidos epiteliais são formados por células intimamente unidas, com um

mínimo de material intercelular entre elas, que recobrem as superfícies e revestem as

cavidades do corpo. As células epiteliais são acompanhadas de tecido conjuntivo

subjacente, com o qual se ligam por uma delgada camada chamada membrana basal. A

membrana basal é geralmente formada pela fusão de duas lâminas basais ou de uma

lâmina basal e uma lâmina reticular. A lâmina basal consiste basicamente de colágeno

tipo IV (não fibrilar), glicoproteínas e proteoglicanas, e desempenham vários papéis como

na conexão dos órgãos, na filtração de moléculas, influenciando a polaridade das células,

mas principalmente regulando a proliferação e a diferenciação celular. Enquanto a lâmina

reticular é composta de fibras reticulares que se desenvolvem a partir do tecido conjuntivo

e sua principal função é fornecer suporte e proteção às células epiteliais.

Existem vários tipos de tecidos epiteliais que se diferem quanto ao arranjo das

camadas celulares e a forma das células da superfície livre do tecido. Dentre os vários, o

de maior interesse para esse trabalho é o tecido epitelial glandular. Os epitélios

glandulares são constituídos por células especializadas na atividade de secreção e as

_______________________________________________________________________- 19 -

moléculas a serem secretadas são armazenadas em pequenas vesículas chamadas

grânulos de secreção. As glândulas mamárias podem sintetizar, armazenar e secretar

proteínas, lipídios ou complexos de carboidratos e proteínas.

3.1.3. Patologias mamárias

Uma patologia, ou lesão patológica, é considerada como uma anormalidade que

surge nos tecidos. O termo neoplasia descreve aquelas patologias que aparecem na

forma de tumores ou massas estranhas ao organismo, referindo-se também a fibrose e

angiogênese (aumento da vascularização) associados ao desenvolvimento do tumor.

De acordo com a natureza patológica, as neoplasias ou tumores mamários podem

ser classificados como benigno e maligno.

As neoplasias benignas possuem como característica um crescimento lento e seu

tecido de sustentação, estroma, é semelhante ao de tecidos normais, no que se refere à

não ocorrência de invasão tecidual ou metástases. As neoplasias malignas são originadas

por células geneticamente modificadas, que sofreram mutações em seu DNA, e a

multiplicação dessas células, além de exagerada e desordenada, em alguns casos é

também invasiva, ou seja, invade os tecidos adjacentes, processo denominado de

metástase. Em alguns casos o tecido cresce tão rapidamente que não há suporte

sanguíneo necessário, provocando necroses (COTRAN et al., 1989). Somente as

neoplasias malignas podem ser denominadas como câncer. A figura 3.2 apresenta um

organograma representando os tipos de neoplasias.

_______________________________________________________________________- 20 -

Figura 3.2: Tipos de neoplasias

Dentre as neoplasias benignas mamárias destacam-se a adenose (tipo epitelial), o

fibroadenoma e as alterações fibrocísticas (estas últimas de tipo misto).

A adenose é caracterizada pelo aumento do volume dos lóbulos mamários

provocado pelo aumento numérico dos ácinos. Isto pode acompanhar-se ou não por

fibrose intralobular. Uma vez que o estroma intralobular normal é composto de tecido

conjuntivo frouxo, após a fibrose, torna-se semelhante ao estroma interlobular, de tecido

fibroso denso (NHSBSP Publication 58, 2005).

O fibroadenoma é o tumor benigno mamário mais comum e ocorre mais

freqüentemente em mulheres na idade fértil. O fibroadenoma é criado a partir da

proliferação do estroma intralobular, contendo também glândulas. As células da parte

conjuntiva do tumor são monoclonais e as da parte epitelial são policlonais, o que indica

que estas últimas não são propriamente neoplásicas, mas proliferam em resposta a

estímulos químicos secretados pelas células do estroma. No fibroadenoma o estroma é

frouxo, composto por células estreladas (fibroblastos) separadas por material intersticial

levemente basófilo e o parênquima forma túbulos ramificados e dilatados em meio ao

estroma, mas ainda possui a dupla população de células (epiteliais e mioepiteliais), um

importante elemento em favor da benignidade do tumor (NHSBSP Publication 58, 2005).

_______________________________________________________________________- 21 -

A alteração fibrocística caracteriza-se por hiperplasia tanto do estroma quanto do

epitélio mamários, em proporções variáveis. Pode haver fibrose tanto do estroma

interlobular como do intralobular. Ainda outro importante componente da alteração

fibrocística são cistos pequenos ou volumosos, derivados de ácinos (NHSBSP Publication

58, 2005).

Dos tumores malignos, os tipos mais freqüentes são os tumores epiteliais não

invasivos como o carcinoma ductal in situ e carcinoma lobular in situ, além dos tumores

mistos, epiteliais e conjuntivos, como o carcinoma ductal invasivo.

Carcinoma ductal in situ é caracterizado por uma proliferação irregular de células

epiteliais com características citológicas de malignidade dentro das estruturas do

parênquima, e confinadas nos ductos lobulares por uma membrana basal intacta

(WINCHESTER, D. J. e WINCHESTER, D. P., 2000).

O carcinoma lobular in situ é muitas vezes considerado uma situação pré-

cancerosa, sendo caracterizado pela proliferação de fibroblastos e ácinos dentro dos

lóbulos. Os ductos distendidos são preenchidos por células monoclonais fracamente

aderente umas às outras. Entretanto, essas células ficam limitadas ao lóbulo não se

espalhando para outras regiões (WINCHESTER, D. J. e WINCHESTER, D. P., 2000).

O carcinoma ductal invasivo é um tumor pouco diferenciado, cujas células formam

cordões sólidos que infiltram difusamente o tecido mamário, ele recebe esse nome porque

as células cancerosas invadem os tecidos epiteliais dos ductos e vão se espalhando, à

partir de reações bioquímicas induzidas por essas células. Este tipo de tumor é

caracterizado por extensa proliferação fibroblástica e produção de fibras de colágeno, o

que fornecer maior consistência ao tumor. Na periferia, o tumor é mal delimitado e sem

cápsula, infiltrando o tecido adiposo e o tecido mamário pré-existente (WINCHESTER, D.

J. e WINCHESTER, D. P., 2000). A figura 3.3 exibe o exemplo da lâmina histológica de

uma amostra de carcinoma ductal invasivo.

_______________________________________________________________________

Figura 3.3

: Lâmina

indicando calcificações, necroses, além das células cancerosas. A área

rosada na figura corresponde à matriz extracelular, formada principalmente

por colágeno. Além disso, observa

3.2.

Fontes de produção de raios X

Wilhelm Conrad Roentgen descobriu um tipo desconhecido de radiação em 1895

que chamou de raios X e, posteriormente, foi também chamado de raios Roentgen

(JOHNS e CUNNINGHAM, 1983)

comprimento de onda muito pequeno e a propriedade de atravessar materiais permitindo

inspecionar o interior de objetos. Imediatamente após sua descoberta, as aplicações para

este tipo de radiação se tornaram evidentes principal

radiografias.

Os raios X descrevem uma grande região no espectro eletromagnético, com

intervalo de energia de poucos elétron

ultravioleta) até energias de centenas de keV (raios X

3.4.

_______________________________________________________________________

: Lâmina

histológica de uma amostra de carcinoma ductal,

indicando calcificações, necroses, além das células cancerosas. A área

rosada na figura corresponde à matriz extracelular, formada principalmente

por colágeno. Além disso, observa

se a membrana basal ao redo

Fontes de produção de raios X

Wilhelm Conrad Roentgen descobriu um tipo desconhecido de radiação em 1895

que chamou de raios X e, posteriormente, foi também chamado de raios Roentgen

(JOHNS e CUNNINGHAM, 1983)

. Este tipo particular de

radiação eletromagnética tem

comprimento de onda muito pequeno e a propriedade de atravessar materiais permitindo

inspecionar o interior de objetos. Imediatamente após sua descoberta, as aplicações para

este tipo de radiação se tornaram evidentes principal

mente na medicina, através de

Os raios X descrevem uma grande região no espectro eletromagnético, com

intervalo de energia de poucos elétron

volts (raios X moles, próximo a radiação

ultravioleta) até energias de centenas de keV (raios X

duros, próximos aos raios

_______________________________________________________________________

- 22 -

histológica de uma amostra de carcinoma ductal,

indicando calcificações, necroses, além das células cancerosas. A área

rosada na figura corresponde à matriz extracelular, formada principalmente

se a membrana basal ao redo

r do ducto.

Wilhelm Conrad Roentgen descobriu um tipo desconhecido de radiação em 1895

que chamou de raios X e, posteriormente, foi também chamado de raios Roentgen

radiação eletromagnética tem

comprimento de onda muito pequeno e a propriedade de atravessar materiais permitindo

inspecionar o interior de objetos. Imediatamente após sua descoberta, as aplicações para

mente na medicina, através de

Os raios X descrevem uma grande região no espectro eletromagnético, com

volts (raios X moles, próximo a radiação

duros, próximos aos raios

γ), figura

_______________________________________________________________________

Figura 3.4

: Espectro eletromagnético exibindo a região correspondente aos raios X

(retângulo vermelho).

Algumas das formas pelas quais os raios X são gerados estão explicadas mais

detalhadamente nos dois próxim

3.2

.1. Tubo de raios X

Um tubo de raios X é um circuito elétrico constituído principalmente de um cátodo,

e um ânodo. O cátodo é um filamento que quando aquecido libera elétrons por efeito

termoiônico, já o ânodo é o alvo onde estes elétrons

existe um campo elétrico criado por um potencial da ordem de dezenas de kV, que

aceleram os elétrons criados no cátodo em direção ao ânodo. No ânodo, a energia

acumulada pelos elétrons é convertida principalmente na produç

em produção de radiação (raios X).

O espectro de um tubo de raios X apresenta uma componente contínua

(bremsstrahlung, raios X de frenagem ou radiação branca) e outra discreta (raios X

característicos) em energia. A

elétrons no ânodo através de interações coulombianas inelásticas. Já

_______________________________________________________________________

: Espectro eletromagnético exibindo a região correspondente aos raios X

(retângulo vermelho).

Algumas das formas pelas quais os raios X são gerados estão explicadas mais

detalhadamente nos dois próxim

os tópicos.

.1. Tubo de raios X

Um tubo de raios X é um circuito elétrico constituído principalmente de um cátodo,

e um ânodo. O cátodo é um filamento que quando aquecido libera elétrons por efeito

termoiônico, já o ânodo é o alvo onde estes elétrons

colidem. Entre o cátodo e o ânodo

existe um campo elétrico criado por um potencial da ordem de dezenas de kV, que

aceleram os elétrons criados no cátodo em direção ao ânodo. No ânodo, a energia

acumulada pelos elétrons é convertida principalmente na produç

ão de

em produção de radiação (raios X).

O espectro de um tubo de raios X apresenta uma componente contínua

(bremsstrahlung, raios X de frenagem ou radiação branca) e outra discreta (raios X

característicos) em energia. A

radiação branca

é formada pela desaceleração dos

elétrons no ânodo através de interações coulombianas inelásticas. Já

_______________________________________________________________________

- 23 -

: Espectro eletromagnético exibindo a região correspondente aos raios X

Algumas das formas pelas quais os raios X são gerados estão explicadas mais

Um tubo de raios X é um circuito elétrico constituído principalmente de um cátodo,

e um ânodo. O cátodo é um filamento que quando aquecido libera elétrons por efeito

colidem. Entre o cátodo e o ânodo

existe um campo elétrico criado por um potencial da ordem de dezenas de kV, que

aceleram os elétrons criados no cátodo em direção ao ânodo. No ânodo, a energia

ão de

calor e apenas 1%

O espectro de um tubo de raios X apresenta uma componente contínua

(bremsstrahlung, raios X de frenagem ou radiação branca) e outra discreta (raios X

é formada pela desaceleração dos

elétrons no ânodo através de interações coulombianas inelásticas. Já

os raios X

_______________________________________________________________________- 24 -

característicos são fótons de energia discreta, resultantes do preenchimento de uma

vacância deixada por um elétron de uma camada mais interna (que interagiu com elétrons

provenientes do cátodo) por outro elétron de uma camada superior mais energética. As

intensidades entre a radiação branca e a característica dependem do tipo de alvo e da

tensão aplicada, e, além disso, podem ser modificadas através do uso de filtros (ATTIX,

1986).

3.2.1. Síncrotron

A radiação síncrotron é produzida por elétrons relativísticos acelerados em

movimento circular em instalações denominadas síncrotrons. Os elétrons, inicialmente

liberados por uma fonte radioativa, são acelerados em um acelerador linear alcançando

velocidade relativística. Então, estes elétrons relativísticos são inseridos dentro de um

anel de propulsão, onde um campo magnético aumenta sincronicamente, até atingir a

energia desejada. Finalmente eles são injetados em um anel de armazenamento, a

verdadeira fonte de radiação. No anel de armazenamento os elétrons são mantidos em

uma órbita estável por meio de campos magnéticos. A radiação síncrotron tem um amplo

intervalo espectral desde infravermelho até raios X duros (DUKE, 2000).

Na chamada terceira geração de síncrotrons, existem três tipos de fontes,

denominadas: ímãs defletores, onduladores e wigglers.

Os ímãs defletores constituem os vértices do anel de armazenamento, onde os

elétrons são curvados por meio de um dipolo uniforme para seguirem na órbita circular,

como conseqüência desta mudança, na direção do movimento dos elétrons, radiação é

emitida, principalmente, na direção tangencialmente às suas órbitas.

_______________________________________________________________________- 25 -

Existem secções das órbitas dos elétrons entre os ímãs defletores em forma de

linhas retas, onde wigglers e onduladores podem ser instalados. Estas fontes são

chamadas dispositivos de inserção (ID) e são formados por um conjunto de pequenos

dipolos com a polaridade alternadamente periódica. Esta variação alternada dos dipolos

induz uma trajetória oscilatória dos elétrons, fazendo com que estes irradiem radiação

síncrotron em toda mudança de direção de oscilação.

As oscilações nos onduladores são pequenas, de forma que as radiações de

sucessivas fontes pontuais interferem e dão origem a radiações que possuem somente o

comprimento de onda resultante da interferência construtiva destas ondas. A radiação

proveniente destas fontes é muito bem colimada e contém comprimentos de onda

harmônicos.

As oscilações dos elétrons no wiggler são muito mais amplas, onde o fenômeno de

interferência não é importante, figura 3.5. A intensidade dos pólos N é somada. A

distribuição espectral é similar à distribuição contínua de radiação dos ímãs defletores.

Figura 3.5: Esquema de funcionamento de um wiggler, o qual deve ser

inserido em linha reta nas instalações de um síncrotron.

Especificamente o Brasil, conta com uma fonte de luz síncrotron, o Laboratório

Nacional de Luz Síncrotron (LNLS) em Campinas. Atualmente, 13 linhas de luz estão em

funcionamento permitindo diversos tipos de experiências. O LNLS é uma fonte de

radiação síncrotron de terceira geração com a energia do elétron no anel de

_______________________________________________________________________- 26 -

armazenamento de 1,37Gev, tendo como fonte um ímã defletor, sendo capaz de produzir

um fluxo de ~ 5x10

fótons.s

-1

em 8keV (http://www.lnls.br).

3.3. Interação dos raios X com a matéria

As interações dos raios X com a matéria dependem basicamente da energia dos

fótons incidentes e do material alvo (número atômico e densidade). Os principais

fenômenos de interação da radiação com a matéria considerando a faixa de energia

utilizada em radiodiagnóstico (E<100keV) são o efeito fotoelétrico e os espalhamentos

inelástico e elástico. Em particular, para fótons com energia utilizada em mamografia

(17,44 keV) numa amostra de tecido mamário, 80,7% do total de interações ocorrem por

efeito fotoelétrico, 10,8% para o espalhamento inelástico e 8,5% para o espalhamento

elástico (JOHNS e CUNNINGHAM, 1983).

No processo fotoelétrico, um fóton de energia hν interage com um átomo

transferindo toda sua energia durante a colisão, ejetando um elétron principalmente de

uma camada eletrônica mais interna, camada K, por exemplo. Este elétron ejetado é

denominado fotoelétron. A vacância deixada por este elétron ejetado é então preenchida

por outro elétron de uma camada mais energética e um fóton (raios X característico, vide

seção 3.2.1) é produzido, cuja energia é igual à diferença de energia entre os dois níveis

de energia.

Por outro lado, quando um fóton incidente interage com um elétron atômico e

transfere parte de sua energia a este elétron de forma a liberá-lo e, um fóton com energia

menor que a incidente é liberado, fica caracterizado o processo de espalhamento

inelástico ou Compton.

_______________________________________________________________________- 27 -

Um fóton ao interagir com a matéria desviando-se de sua trajetória inicial de modo

que não sofra variação em sua energia, temos o chamado espalhamento elástico ou

coerente. O campo elétrico da onda eletromagnética, com comprimento de onda λ,

associada a esse fóton induz oscilações como em um dipolo nos elétrons presentes na

matéria. As cargas aceleradas geram ondas secundárias (radiação espalhada) de mesmo

comprimento de onda λ que a radiação incidente (JOHNS e CUNNINGHAM, 1983).

Como o objetivo deste trabalho está na obtenção do coeficiente linear de

espalhamento elástico para determinação das estruturas moleculares e supramoleculares,

passaremos a detalhar melhor esta grandeza nos próximos tópicos, porém, anteriormente

é necessário realizar uma discussão sobre o vetor de espalhamento.

3.3.1. Vetor de Espalhamento

Considerando o espalhamento elástico de um fóton de comprimento de onda λ por

um átomo em que o fóton incidente tem o vetor de onda

e o fóton espalhado

, o vetor

de espalhamento

, figura 3.6, é definido como:

kkq −= '

(3.1)

em que:

λπ

2=k . A interferência será construtiva ou destrutiva dependendo da

diferença de fase entre os diferentes fótons espalhados.

_______________________________________________________________________- 28 -

Figura 3.6

: Geometria do espalhamento; (

)

vetor espalhamento como resultante; (b) a

diferença de fase é dada pela diferença de

caminhos ópticos. A linha mais espessa é o

comprimento do caminho máximo.

A diferença de fase total, figura 6(b) é dada por:

( )

rqrkrkr ⋅=⋅−⋅=∆ '

(3.2)

O vetor espalhamento

pode ser calculado geometricamente a partir da figura

6(a). Usando a lei dos cossenos, temos:













−−+==

cos2''

θπ

kqqkkk

(3.3)

Como estamos tratando de espalhamento elástico,

kk ='

e usando que

























−

222

cos

θθπ

sen

, obtem-se:













+−=

222

senkqkkq

(3.4)













senkq

(3.5)

Portanto, como

( )

4 sen

q =

(3.6)

_______________________________________________________________________- 29 -

(

)

φθ

222

cossin1−=

Ω

qq =

é o módulo do vetor de espalhamento.

3.3.2. Espalhamento Elástico

3.3.2.1. Espalhamento por elétron livre

Se o espalhamento elástico ocorre devido somente a um elétron livre ele recebe o

nome de espalhamento Thomson, em homenagem ao primeiro cientista que obteve a

seção de choque diferencial de espalhamento para um elétron (THOMSON, 1906).

Thomson considerando um feixe de fótons não polarizado e apenas suposições de física

clássica obteve a seguinte expressão:

( )

cos1













Ω

(3.7)

em que:

1082.2

−

×==

πε

é o raio clássico do elétron e θ é o ângulo de

espalhamento.

Quando a radiação é polarizada, a seção de choque diferencial elástica é dada

por:

(3.8)

em que: θ é o ângulo polar de espalhamento e φ é ângulo azimutal de espalhamento

(medido da direção de polarização).

A forma da seção de choque Thomson está representada na figura 3.7.

_______________________________________________________________________- 30 -

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200

Seção de Choque Diferencial

(dσ/dΩ) (m

/eletron.sr) x 10

-30

(dσ/dΩ)

para E = 10 keV

θ ( º )

Figura 3.7: Seção de choque diferencial Thomson em função do

ângulo de espalhamento.

3.3.2.2. Espalhamento por átomo livre

O espalhamento elástico de fótons por um átomo livre, chamado espalhamento

Rayleigh em homenagem ao cientista que o discutiu para a luz visível Lord Rayleigh

(1881), ocorre quando os fótons incidentes têm sua energia conservada e sofrem variação

de momento após o espalhamento pelos elétrons ligados ao átomo. As ondas espalhadas

por cada elétron sofrem interferência construtiva devido à diferença de caminho ótico

percorrido no átomo. A seção de choque diferencial pode ser expressa na forma:

( )

[ ]

ThRay

ZqF













Ω













Ω

σσ

, (3.9)

em que:

é vetor de espalhamento, dado pelo equação (3.6), sendo proporcional ao

momento transferido pelo fóton na interação com o átomo. Z é o número atômico,

(

)

ZqF ,

_______________________________________________________________________- 31 -

é chamado fator de forma atômico. A partir desse ponto será usado

para representar o

momento transferido.

A função

(

)

ZqF , é a transformada de Fourier da distribuição de cargas do átomo

(GUINIER, 1994). O fator de forma total do átomo pode ser decomposto na soma dos

fatores de forma individuais de cada camada eletrônica do átomo (HUBBEL et al., 1975).

O fator de forma

(

)

ZqF , está representado na figura 8 para o átomo de Oxigênio (Z=8).

A partir da figura 3.8 pode-se notar que para baixos valores de momento

transferido

, isto é

→0,

(

)

ZZqF →, (interferência construtiva). Para altos valores de

(

→∞),

(

)

0, →ZqF (interferência destrutiva).

Figura 3.8: Fator de forma

(

)

ZqF ,

para o átomo de Oxigênio dado por

Hubbel et al. (1975).

0 20 40 60 80 100 120

Z=8

F(q,Z)

q (nm

-1

)

_______________________________________________________________________- 32 -

Este comportamento modela a seção de choque Thomson, produzindo a seção de

choque diferencial

Ray













Ω

como mostrado na figura 3.9.

Figura 3.9: Seção de Choque Diferencial para o espalhamento Rayleigh

para o átomo de Oxigênio para fótons de 17,44 keV.

3.3.2.3. Espalhamento por Molécula Livre

A seção de choque diferencial de elástica para uma molécula livre é da forma:

mol

elas













Ω













Ω

σσ

)(

(3.10)

em que

)(

mol

é o fator de forma molecular, e pode ser obtido por três aproximações.

A primeira aproximação considera a correlação entre elétrons de diferentes

átomos em uma mesma molécula. Todavia, é necessário o conhecimento da distribuição

da densidade eletrônica dentro da molécula, a qual não é bem conhecida para inúmeras

moléculas (BLUM, 1971; NARTEN e LEVY, 1971).

0 20 40 60 80 100 120

Seção de Choque Diferencial

(dσ/dΩ) (m

/átomo.sr) x 10

-28

q (nm

-1

)

_______________________________________________________________________- 33 -

A segunda aproximação requer o conhecimento das distâncias atômicas dentro de

uma molécula, pois leva em conta a correlação entre diferentes átomos desta (DEBYE,

1915). Em baixo momento transferido esta correlação da origem a efeitos de interferência,

dependendo do grau de ordenamento estrutural da molécula.

A terceira aproximação é a forma mais simples de se calcular o espalhamento de

fótons por uma molécula livre, pois supõe que o espalhamento por uma molécula livre é

composto pelas contribuições independentes de cada átomo que a compõe e, portanto, o

fator de forma molecular será determinado pela soma dos fatores de forma de cada átomo

independentemente. Essa última aproximação é também chamada Modelo Atômico

Independente (MAI) (CHAN e DOI, 1983).

Para um composto ou mistura existem duas maneiras de calcular o fator de forma

molecular:

I. Se o número de átomos for conhecido,

)(

mol

assume a forma:

∑

= )()(

qFnqF

iimol

(3.11)

em que:

é o fator de forma de cada átomo e

o número de átomos de cada elemento.

II. Se o número de átomos for desconhecido,

)(

mol

pode ser obtida pela fração de

massa

e pela massa atômica

do átomo i:

∑













= )(

)(

imol

(3.12)

em que:

é o peso molecular.

A figura 3.10 mostra o comportamento da função

)(qF

mol

para molécula de água

utilizando a distribuição de densidade de carga eletrônica (primeira aproximação

_______________________________________________________________________- 34 -

mencionada) (HUBBEL, 1975) e o modelo atômico independente (última aproximação

mencionada) (CHAN e DOI, 1983). Pode-se notar que as duas aproximações convergem

para o mesmo valor quando

−

> nmq

Figura 3.10: Fator de forma da molécula de H

)(qF

mol

, obtido utilizando

distribuição de densidade eletrônica e

)(qF

MAI

mol

alcançado através do

modelo atômico independente (CHAN e DOI, 1983).

É útil nesta parte definir o coeficiente linear de espalhamento elástico,

, o qual

está diretamente relacionado à seção de choque diferencial elástica por:

Ω

(3.13)

em que

n é o número de átomos por unidade de volume (

V A

n N M

= ⋅ , sendo

densidade da amostra,

a massa molecular e

o número de Avogadro) que para

amostras de tecidos mamários é desconhecido. Esta grandeza descreve a probabilidade

por unidade de caminho, de um fóton espalhar num determinado ângulo sólido.

0 20 40 60 80 100 120

mol

(q)

q (nm

-1

)

mol

(q)

MAI

mol

(q)

_______________________________________________________________________- 35 -

3.3.2.4. Espalhamento por Conjunto de Moléculas

A descrição do espalhamento por um conjunto de moléculas do mesmo tipo

também pode ser obtida através da aproximação de fator de forma:

mol

elaselas













Ω













Ω

Υ=













Ω

σσσ

)()(

(3.14)

em que:

(

)

elas

Ω

é a seção de choque diferencial por molécula,

)(q

é a função

interferência, que leva em conta o grau de ordem da estrutura atômica (ou molecular),

mol

elas













Ω

é a seção de choque para o espalhamento de uma molécula livre (2.10), )(qF

é o fator de forma equivalente que permite obter a seção de choque do conjunto de

moléculas a partir da seção de choque Thomson na equação (2.7).

)(q

assume a forma:

∑

+=Υ

qrsen

)(

1)(

(3.15)

em que:

leva em conta a diferença entre a densidade atômica média e a densidade de

centros espalhadores em cada posição

conforme Poletti et al. (2002b).

A figura 3.11 mostra para água líquida a 20ºC obtida a partir do fator de forma

equivalente tabulado por Morin (1982), deduzidos dos dados experimentais realizados por

Narten e Levi (1971). Observa-se que a função de interferência provoca oscilações na

seção de choque do conjunto de moléculas. Tais oscilações ocorrem em torno da seção

de choque da molécula livre calculada a partir do MAI, observando-se também a

existência de interferência destrutiva para valores baixos de momento transferido. Este

_______________________________________________________________________- 36 -

efeito coincide com os encontrados pela termodinâmica (KLUG e ALEXANDER, 1974).

Para valores de

maiores as duas curvas convergem para os mesmos valores. A partir

dos picos de espalhamento, é possível, utilizando a lei de Bragg (CULLITY, 1978), obter a

distância entre os centros espalhadores para o material analisado, em particular, para a

água neste caso.

0 20 40 60 80 100 120

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

(cm

-1

)

q (nm

-1

)

(i) Água líquida

(ii) H

O (MAI)

Figura 3.11: Seção de choque diferencial elástica para (i) água

líquida a 20ºC de Morin (1982), (ii) molécula de água (MAI).

A formulação descrita acima, não engloba arranjos supramoleculares (estruturas

maiores que 10Å), por isso é necessário outro tratamento para essas grandes cadeias

moleculares.

Os fótons espalhados elasticamente por estruturas supramoleculares presentes

em tecidos compreendem a região de espalhamento de raios X em baixo ângulo (SAXS).

A formulação geral para estudo dos perfis de espalhamento de SAXS foi desenvolvida

para sistemas de partículas isotrópicos que não possuíam ordenamento em longas

cadeias (GUINIER, 1994). Para estes casos, se uma molécula de volume V é irradiada, a

_______________________________________________________________________- 37 -

amplitude de espalhamento está relacionada à distribuição de densidade eletrônica desta

molécula, em unidades de elétron, por uma transformada de Fourier:

(3.16)

em que

é a amplitude de espalhamento de um elétron e

(

)

é o número de elétrons

por unidade de volume na posição

. Um elemento de volume dV em

contém

(

)

elétrons.

Uma fibra de um eixo de orientação preferida, composta de várias moléculas, em

forma de discos, ordenadas paralela e covalentemente, porém sem ordenamento em

longas cadeias, possui uma distribuição de intensidade dada por:

(

)

(

)

(

)

(

)

qFqFqYqI

(3.17)

em que

(

)

é a função de interferência média, a qual considera a interferência entre os

fótons de raios X espalhados por diferentes moléculas na fibra e o termo subseqüente

representa a intensidade média espalhada por uma fibra.

Porém, levando em conta algumas suposições e modelos estruturais do material

em estudo, essa formulação pode ser estendida para estudo de objetos densamente

agrupados (como encontrado nos tecidos humanos em geral), os quais permitem

considerar orientações anisotrópicas e/ou ordenamento em longas cadeias, como os

arranjos de fibras de colágeno presentes nos tecidos conjuntivos frouxo e denso (WESS

et al., 1998; WILKINSON e HUKINS, 1999). Dessa forma, a intensidade espalhada por um

arranjo de fibras de colágeno com um eixo de orientação preferido, porém permitindo

orientação anisotrópica, detectada, é dada pela convolução da função de distribuição de

orientação

(

)

g pela distribuição de intensidade de uma fibra

(

)

, eq. (3.18) (HUKINS,

1981). A função de distribuição de orientação tem simetria cilíndrica e representa a

(

)

(

)

(

)

∫

−

= dVerAqF

rqi

_______________________________________________________________________- 38 -

probabilidade de se encontrar uma fibra orientada entre

δφ

, com relação à

orientação preferida da fibra.

(

)

(

)

(

)

qIgqI

⊗=

(3.18)

A intensidade espalhada por um arranjo de fibras é proporcional ao coeficiente

linear de espalhamento:

( )

aVS

∝

Ω

(3.19)

Para este sistema anisotrópico duas direções de espalhamento são claramente

definidas: a direção meridional, paralela ao eixo da fibra e a direção equatorial

perpendicular ao eixo da fibra (HULMES et al., 1995)

[63]

. Na direção meridional, os fótons

são espalhados principalmente pela distribuição eletrônica que varia ao longo do eixo da

fibra e estão associados à periodicidade axial da densidade eletrônica da fibra e à

estrutura do arranjo molecular (picos de Bragg). Na direção equatorial, a distribuição de

intensidade dos fótons espalhados elasticamente contém informações sobre o tamanho

da fibra (diâmetro) e de sua orientação dentro de um tecido (picos de Bessel) (GLATTER

e KRATKY, 1982).

_______________________________________________________________________- 39 -

CAPÍTULO 4 – MATERIAIS E MÉTODOS

4.1. Amostras

As amostras de tecido mamário analisadas neste trabalho foram fornecidas pelo

Departamento de Patologia do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de

Ribeirão Preto (DP-HCFMRP). O material coletado era residual de tecidos retirados em

procedimentos cirúrgicos de mastectomia (cirurgia para retirada de parte da mama

invadida por tumores) e mastoplastia (cirurgia plástica para redução da mama). O volume

de tecido colhido era determinado de forma a se ter uma amostra o mais homogênea

possível e em quantidade suficiente para ser irradiada.

Após coletadas, as amostras eram armazenadas em recipientes plásticos

adequados para este tipo de armazenagem e fixados em formalina (10% formaldeído em

água) em temperatura ambiente e classificadas histopatologicamente por profissionais do

DP-HCFMRP através da análise microscópica das lâminas de tecido, como tecido normal,

neoplasia benigna e neoplasia maligna, este último grupo foi ainda classificado em um

subgrupo de acordo com as recomendações de Bloom e Richardson (BLOOM E

RICHARDSON, 1957). Esta classificação foi posteriormente confirmada por um docente

especialista em patologias mamárias do DP-HCFMRP-USP.

As concentrações de carbono, hidrogênio e nitrogênio de cada amostra foram

obtidas pelo método de CHN através de um analisador elementar modelo EA1110 da CE

Instruments® pertencente ao Laboratório de Análise Elementar do Departamento de

Química da Faculdade de Filosofia Ciências e letras de Ribeirão Preto, Universidade de

São Paulo (LAE-DQ-FFCLRP-USP). As densidades foram obtidas medindo-se massa e

volume.

_______________________________________________________________________- 40 -

4.2. Experiências de Espalhamento de Raios X

Nesta seção serão descritas como foram realizadas as experiências de

espalhamento de raios X em médio (WAXS) e baixo ângulo (SAXS). As experiências de

WAXS foram realizadas variando o tipo de fonte de radiação (tubo de raios X e radiação

síncrotron) e o tipo de geometria (transmissão e reflexão) (CONCEIÇÃO et al., 2006;

CONCEIÇÃO et al. 2007a e CONCEIÇÃO et al., 2008a). As experiências de SAXS foram

realizadas no Laboratório Nacional de Luz Síncrotron (CONCEIÇÃO et al., 2007b;

CONCEIÇÃO et al., 2007c e CONCEIÇÃO et al, 2008b). Além disso, a última parte desta

seção será dedicada à descrição de uma experiência na qual foram combinadas as

técnicas de WAXS e SAXS simultaneamente sobre um mesmo conjunto de amostras

(CONCEIÇÃO et al., 2008c).

4.2.1. Espalhamento de raios X em médio ângulo (WAXS) usando tubo

de raios X

Nesta seção serão apresentados os materiais e arranjo experimental utilizados no

experimento de WAXS usando tubo de raios X convencional, bem como o método

aplicado aos dados medidos, com a finalidade de obter os coeficientes lineares de

espalhamento elástico.

4.2.1.1. Distribuição de Amostras

Para as medidas de espalhamento de raios X em médio ângulo (WAXS) foram

utilizadas 78 amostras de tecidos mamários normais e neoplásicos, descritos na seção

3.1 e distribuídos de acordo com a figura 4.1.

_______________________________________________________________________- 41 -

33.3%

14.1%

52.6%

Tecido Normal

Neoplasia Benigna

Neoplasia Maligna

Figura 4.1: Distribuição histopatológica dos tecidos analisados no

experimento de WAXS usando tubo de raios X.

4.2.1.2. Arranjo Experimental

As medidas de WAXS foram realizadas em um difractômetro comercial Siemens

D-5005, pertencente ao Laboratório de Difratometria do Departamento de Química da

Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto da Universidade de São

Paulo, cujo arranjo experimental adotado é mostrado na figura 4.2.

Figura 4.2: Arranjo experimental para as medidas de difração de raios X.

_______________________________________________________________________- 42 -

O arranjo experimental montado, modo de reflexão, consistia basicamente de um

tubo de raios X, fendas divergentes, fendas Söller, um goniômetro, monocromador e

sistema de detecção. O tubo de raios X possuía um anodo de Cu (Z=29; K

= 8,04 keV e

= 8,91 keV). O feixe emergente do ânodo era colimado por uma fenda divergente

vertical com abertura variável localizada a uma distância de 85±1mm do ânodo. A fenda

com abertura variável era utilizada para se obter na amostra uma área irradiada constante

de 6×12mm

mesmo variando o ângulo de incidência e detecção, conforme mostra a

figura 4.3. Em seguida, o feixe passava por uma fenda Söller que tornava o feixe incidente

paralelo na horizontal, localizada a 35±1mm da fenda divergente.

As amostras de tecidos mamários foram cortadas e acomodadas em um recipiente

acrílico cilíndrico (porta-amostra) construído com diâmetro interno de 18mm e uma altura

de 4mm. Uma fina camada de policloreto de vinila (filme de PVC), com espessura de

1,5±0,2µm, foi utilizada recobrindo a amostra de forma a sua superfície se tornar o mais

regular possível. O porta-amostra foi posicionado no centro do goniômetro localizado

sobre o eixo central do difractômetro e a 210±1mm do anodo, e girava de forma que o

ângulo incidente e o ângulo espalhado fossem iguais em relação à normal à superfície da

amostra.

Figura 4.3: Visão da área da amostra irradiada.

_______________________________________________________________________- 43 -

O feixe de raios X espalhado pela amostra atravessava uma fenda divergente com

abertura variável a 135±1mm do centro do goniômetro e uma fenda Söller localizada à

25±1mm da fenda divergente. O feixe espalhado atingia então o monocromador de grafite

(2d=0,2708nm) a 100±1mm da fenda Söller, selecionando os fótons espalhados com

energia de 8,04keV com refletância aproximada de 100%. A radiação espalhada por ele

atingia finalmente o detector de cintilação, com eficiência de 95% na energia selecionada.

O detector estava associado a uma eletrônica padrão (fotomultiplicadora e amplificador) e

conectado a um microcomputador por uma placa de interface. O software de aquisição

dos dados foi desenvolvido pelo próprio fabricante do difractômetro.

Os fótons espalhados eram detectados variando o ângulo de espalhamento no

intervalo 5º - 80º, em passos de 1/3 de grau, com tempo de contagem típico de 20s,

garantindo assim uma boa contagem de fótons no detector, com uma incerteza estatística

( counts/1 ) de 4%.

4.2.1.3. Metodologia Adotada

O procedimento adotado para extrair das medidas de espalhamento de raios X em

médio ângulo por tecidos mamários, o perfil de espalhamento (

), baseia-se na seguinte

equação:

( ) ( ) ( )

[ ]

( ) ( ) ( )( )

( )

qAqPqKqTqBqI

⋅+⋅⋅⋅⋅⋅−=

−

θµ

exp

cos1

(4.1)

em que

)(

exp

é a intensidade espalhada medida, )(qB está relacionado às contribuições

espúrias,

(

)

qT é o fator de transmissão da amostra, medido experimentalmente. O termo

entre colchetes corresponde à intensidade espalhada exclusivamente pela amostra e,

_______________________________________________________________________- 44 -

para obtermos

é necessário que correções sejam aplicadas a esta intensidade devido

à variação de intensidade por área de irradiação constante

)(qK

, polarização

)(qP

atenuação e fatores geométricos

)(qA

, 2

r (1+cos

θ) a seção de choque Thomson (θ

está relacionado a

por:













⋅

−

sen

) e, por fim, o fator de normalização C

(OLIVEIRA et al., 2008).

i) Correção por contribuições espúrias B(q)

Considera-se contribuição espúria ao perfil de espalhamento qualquer contagem

de fótons que cheguem ao detector, não oriundas da amostra de tecido analisada. Devido

ao arranjo experimental utilizado podemos ter várias dessas fontes de espalhamento, tais

como o espalhamento do feixe de raios X no ar, sobre o filme de PVC que cobre a

amostra, e ainda a contribuição espalhada devido ao porta-amostra de acrílico. Poderia

ser citada também a contribuição proveniente de raios cósmicos e também da radiação

natural do ambiente.

As contribuições espúrias foram registradas em vários experimentos: (i) a

intensidade espalhada pelo porta-amostra coberto com o filme de PVC, (ii) somente pelo

porta-amostra, somente pelo ar e por fim (iii) a intensidade de fundo, registrada sem

irradiação, foram medidas e removidas da equação 4.1 através do fator

(

)

qB . As

intensidades espalhadas provenientes de contribuições espúrias para uma amostra de

água líquida são mostradas na figura 4.4.

_______________________________________________________________________- 45 -

10 20 30 40 50 60 70

100

1000

Intensidade Relativa (u.a.)

q (nm

-1

)

Intensidade total medida

Contribuição do ar

Contribuição do porta-amostras + filme de PVC

Contribuição do porta-amostras

Figura 4.4: Medida experimental das contribuições espúrias.

Na figura 4.4 nota-se que o filme de PVC apresenta um pico em baixo momento

transferido que poderia influenciar as medidas nesta região, além disso, o porta-amostra

apresenta intensidade crescente em altos momentos transferidos, representando cerca de

10% na intensidade total medida nesta região. Fatos estes que evidenciam a importância

de se remover as contribuições espúrias da intensidade total medida.

ii) Correção por Intensidade (área de irradiação constante) K(q)

Como já mencionado anteriormente, durante o processo de medida manteve-se a

área de irradiação constante sobre a superfície da amostra, de modo a irradiar sempre à

mesma do tecido. Este procedimento foi feito utilizando um recurso próprio do

difractômetro usado nesta experiência. Para isso, as aberturas das fendas divergentes

deviam variar com o ângulo de medida. Conforme o ângulo de incidência do feixe de raios

X aumentava, uma maior abertura da fenda era necessária para manter a área de

irradiação constante, isto era, portanto, acompanhado por um aumento do número de

_______________________________________________________________________- 46 -

fótons que atingem esta área. Dessa forma, há a necessidade de que as medidas sejam

corrigidas pela variação da intensidade do feixe, provocada pelo aumento da abertura da

fenda. O fator de variação da intensidade foi obtido experimentalmente, obtendo-se

ângulo de divergência da fenda em cada ângulo de medida e, posteriormente colocando

um monocromador, cujo ângulo de difração do cristal era conhecido, na posição da

amostra mediu-se a intensidade espalhada para cada ângulo de divergência da fenda,

obtendo a variação da intensidade do feixe em relação à abertura de divergência da fenda

e, finalmente a variação da intensidade espalhada em relação ao ângulo de incidência do

feixe na amostra foi determinada. Este fator foi comprovado teoricamente e, verificado

que se comporta como uma função

(

)

sen . A variação da intensidade do feixe de raios X

está representada na figura 4.5, abaixo:

10 20 30 40 50 60 70

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Intensidade do feixe incidente (u.a.)

q (nm

-1

)

Figura 4.5: Variação da intensidade do feixe incidente experimental.

Conforme mencionado anteriormente, teoricamente o comportamento do fator de

correção pela variação da intensidade do feixe,

(

)

qK , é de uma função seno. Entretanto,

na figura 4.5, este comportamento não é evidente, isto se deve ao fato de que no eixo das

_______________________________________________________________________- 47 -

abscissas a grandeza presente é o momento transferido que também depende da função

seno.

iii) Correção por polarização P(q)

Quando um cristal monocromador é utilizado, o feixe emergente será parcialmente

polarizado (JAMES, 1962). A polarização parcial induzida pelo uso de um monocromador

no feixe espalhado pela amostra deve ser considerada, uma vez que ela afetará a

intensidade medida. Portanto, há a necessidade de se corrigir as intensidades medidas

pelo fator de polarização P(q), dado por (AZZAROF, 1968):

( )

θθ

cos

coscos1

(4.2)

em que

é o ângulo de espalhamento da amostra e

é o ângulo de difração do

monocromador. Sabendo que













⋅

−

sen e

é o comprimento de onda da

radiação proveniente do monocromador e incidente na amostra.

O comportamento do fator de polarização no intervalo de momento transferido

medido pode ser visto na figura 4.6:

_______________________________________________________________________- 48 -

10 20 30 40 50 60 70

0,6

0,7

0,8

0,9

1,0

P (q)

q (nm

-1

)

Figura 4.6: Comportamento do fator de polarização P(q).

iv) Correção por atenuação e efeitos geométricos A(q)

Para a geometria utilizada neste experimento, em que ambos fonte e detector

estão do esmo lado da amostra, denominada difração no modo reflexão, o fator de

atenuação pode ser calculado seguindo o método proposto por Milberg (MILBERG, 1958),

considerando algumas variações decorrentes da condição de área irradiada constante. O

fator A(q) foi obtido de forma analítica e seu comportamento em função do momento

transferido para uma amostra de água líquida é exibido na figura 4.7.

_______________________________________________________________________- 49 -

10 20 30 40 50 60 70

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

A(q) (mm

)

q (nm

-1

)

Figura 4.7: Fator de atenuação teórico para uma amostra de água.

v) Fator de Normalização C

O procedimento de normalização consiste em comparar a grandeza experimental

corrigida considerando todos os fatores de correção anteriormente mencionados com os

valores teóricos para as seções de choque diferenciais elásticas em altos valores de

momento transferido, onde os efeitos intramoleculares e intermoleculares podem ser

desprezados.

O fator de normalização C pode ser calculado como a média da razão entre os

dados teóricos

Theor

e os dados experimentais correspondentes

exp

, no intervalo de

momento transferido 44,05-70,37nm

-1

, que além de assegurar que os efeitos de

interferência podem ser ignorados, também representa um período completo, onde dois

máximos adjacentes de difração sejam praticamente imperceptíveis (POLETTI, 2001 e

POLETTI ET AL., 2002b). O fator de normalização é dado por:

_______________________________________________________________________- 50 -

(

)

(

)

).(

sin4

).(

cos4

∆













−

+∆













±=∆q

(4.3)

em que n é o número de pontos medidos no intervalo escolhido.

Neste caso, o

Theor

foi calculado usando o MAI através das concentrações

elementares das amostras determinadas anteriormente, seção 3.1, e a relação 2.14.

vi) Incertezas

A incerteza foi estimada por propagação de erros da equação (4.1), as variáveis

foram assumidas não correlacionadas e apenas incertezas associadas a grandezas

experimentais foram levadas em conta.

Os dados foram coletados com uma incerteza estatística (

counts/1

) de

aproximadamente 4% na contagem total de fótons espalhados

)(

exp

, e as contribuições

espúrias

)(B

tiveram no máximo 6% de incerteza. A incerteza estatística associada ao

fator de atenuação ficou entre 4 e 5%, além de 3% devido às correções de polarização e

0,9% decorrente da correção da variação da intensidade do feixe. Ainda, o erro

proveniente do procedimento de normalização foi de aproximadamente 0,5%, resultando

em uma incerteza total final de aproximadamente 8%.

A incerteza associada ao momento transferido é dada por:

(4.4)

∑

iTheor

)(

)(1

exp

37,7005,44

−

≤≤ nmq

_______________________________________________________________________- 51 -

Substituindo valores na equação (4.4), foi encontrada uma incerteza estatística

devido ao momento transferido,

∆

, de 2% em média no intervalo medido neste

experimento.

vii) Validação do Procedimento Experimental

A validação do procedimento experimental empregado neste experimento de

WAXS utilizando tubo de raios X foi feita pela comparação do coeficiente linear de

espalhamento elástico obtido experimentalmente com o reportado por Morin (MORIN,

1982) para uma amostra de água líquida. No intervalo de momento transferido medido, a

discrepância máxima entre os dois resultados foi de 6% e dentro das incertezas

experimentais, figura 4.8.

0 10 20 30 40 50 60 70 80

-8

-6

-4

-2

0,04

0,08

0,12

0,16

0,20

0 10 20 30 40 50 60 70 80

Diferença Relativa (%)

Experimental

Morin 1982

(cm

-1

)

q (nm

-1

)

Figura 4.8: (a) comparação do coeficiente linear de espalhamento para água líquida

obtido experimentalmente com o reportado por Morin (MORIN, 1962); (b) diferença

relativa entre as curvas da figura (a).

_______________________________________________________________________- 52 -

4.2.2. Espalhamento de raios X em médio ângulo (WAXS) usando

radiação síncrotron

Nesta seção será descrito o experimento de WAXS usando radiação síncrotron,

realizado na linha D12A – XRD1 do Laboratório Nacional de Luz Síncrotron (LNLS) para

as geometrias de transmissão e reflexão, os materiais utilizados e os procedimentos

metodológicos adotados para correção dos dados experimentais em ambas as técnicas

para a obtenção do coeficiente linear de espalhamento elástico para os tipos de tecidos

mamários estudados.

4.2.2.1. Distribuição de Amostras

Neste experimento foram utilizadas 95 amostras de tecidos mamários normais e

neoplásicos, classificadas conforme descrito na seção 3.1 e distribuídas de acordo com a

figura 4.9.

14.7%

30.5%

54.7%

Tecido Normal

Neoplasia Maligna

Neoplasia Benigna

Figura 4.9: Distribuição histopatológica dos tecidos analisados neste experimento

_______________________________________________________________________- 53 -

4.2.2.2. Arranjo Experimental

A montagem experimental foi implementada na linha D12A – XRD1 do Laboratório

Nacional de Luz Síncrotron em Campinas, Brasil, devido às facilidades de instrumentação

disponíveis para utilização neste laboratório.

Para este experimento foram utilizadas duas geometrias, transmissão e reflexão. A

geometria de transmissão é aquela em que a fonte e o detector estão em lados opostos

com relação à amostra. A montagem experimental utilizada para ambas as geometrias é

composta basicamente de uma fonte (dipolo), um espelho sagital, um monocromador e

um difractômetro Huber de 3+1 círculos, conforme figura 4.10.

Figura 4.10: Montagem experimental na linha D12A - XRD-1 no LNLS.

O espelho sagital é usado para filtrar fótons de altas energias e focalizar o feixe,

reduzindo a área de irradiação sobre a amostra (5,5mm x 1,0mm). O monocromador de

Dipolo (fonte)

Espelho

Monocromador

“Panela”

5,45m

1,24m

8,31m

2,20m

Fendas

Difractômetro

Huber

_______________________________________________________________________- 54 -

duplo cristal de Si(111) com d-spacing=3,1356Å, foi usado para selecionar uma maior

resolução em energia, (∆λ/λ~10

-4

) em 11keV (λ=1,127Å) e também para focalização

horizontal do feixe. O tempo de medida foi escolhido para que a incerteza estatística (

counts/1

) associada ao fluxo de fótons durante as medidas fossem menores que 2%.

As amostras de tecidos mamários humanos, descritas anteriormente,

armazenados em adequados recipientes à temperatura ambiente, no instante da

realização das medidas, foram cortadas e inseridas dentro de porta-amostras de

dimensões, 30±1mm x 15±1mm x 8±1mm e cobertos por uma folha de kapton, de

170±5µm de espessura, em ambos os lados do porta-amostra.

O porta-amostra estava localizado dentro do difractômetro Huber 3+1 círculos

posicionado sobre uma mesa rotativa, e a distância da amostra ao detector foi fixada em

210mm. O difractômetro Huber tem precisão angular de ±0,03° e permite realizar medidas

no intervalo de 0,8° a 78,55° com passos de 0,25°.

Entre a amostra e o detector, foi colocado um monocromador de grafite para

garantir que apenas os fótons com energia de 11keV atinjam o detector, dessa forma

evita-se que os fótons provenientes de espalhamento inelástico sejam detectados. O

detector utilizado foi um cintilador de NaI(Tl) com capacidade para 10

contagens/s, e a

eficiência do detector para a energia de utilizada neste experimento (11keV) é cerca de

40%. Este detector estava acoplado a um analisador monocanal e controlado por um

software instalado no computador principal.

_______________________________________________________________________- 55 -

4.2.2.3. Metodologia Adotada

As medidas de WAXS para ambas as técnicas foram realizadas no plano vertical

(φ=90°), portanto na equação 3.8

(

)

0cos =

. Aplicando esta consideração à equação

3.16, encontra-se que

é:

(

)

(

)

(

)

(

)

[

]

(

)

CrqAqTqBqIq

⋅⋅⋅⋅−=

− 2

exp

(4.5)

onde

)(

exp

é a intensidade espalhada medida, )(qB está relacionado às contribuições

espúrias,

(

)

é o fator de transmissão da amostra medido experimentalmente. O termo

entre colchetes corresponde à intensidade espalhada exclusivamente pela amostra e,

para obtenção de

)(qA

é o fator de correção por atenuação e efeitos geométricos, o

qual apresenta um comportamento específico para cada uma das duas geometrias

utilizadas (transmissão e reflexão) e será mais bem explicado adiante. O termo

refere-

se ao raio clássico do elétron. O último passo para obtenção do coeficiente linear de

espalhamento elástico consiste na normalização dos dados pelo fator de normalização C.

i) Correção por contribuições espúrias B(q)

Considera-se contribuição espúria os fótons espalhados provenientes do

espalhamento do feixe de raios X no ar, sobre a folha de kapton que cobre a amostra, e

ainda a intensidade espalhada devido ao porta-amostra de acrílico.

As contribuições espúrias foram registradas em vários experimentos. A

intensidade espalhada pelo porta-amostra coberto com as folhas de kapton, mas sem

amostra e posteriormente a espalhada pelo ar, foram medidos e suas contribuições foram

_______________________________________________________________________- 56 -

removidas, através do fator

(

)

qB , conforme equação 4.5. Além disso, foi verificado que as

contribuições espúrias não dependiam significantemente da geometria empregada e,

portanto na figura 4.11 apenas as contribuições para geometria de transmissão são

exibidas.

Figura 4.11: Medida experimental do espalhamento por contribuições espúrias.

ii) Determinação do fator de atenuação e efeitos geométricos A(q)

Para ambas as geometrias utilizadas neste experimento, o fator

(

)

qA foi

determinado analiticamente. As equações 4.6 e 4.7 correspondem ao fator

(

)

para as

geometrias de transmissão e reflexão, respectivamente.

(4.6)

( )

cos

)(

cos

etba

−

⋅⋅⋅

0 10 20 30 40 50 60 70

100

1000

Intensidade Relativa (u.a.)

q (nm

-1

)

Porta-amostra + folhas de kapton

_______________________________________________________________________- 57 -

( )

( ) ( )













−+

⋅













−













−

sen

(4.7)

em que

e b são respectivamente, comprimento e largura da seção transversal do feixe

de raios X que incide na amostra,

é a espessura da amostra,

é o ângulo de

espalhamento e

é o coeficiente de atenuação da amostra. Este último coeficiente foi

experimentalmente medido para cada amostra em um experimento independente,

anteriormente à coleta de dados.

A figura 4.12 exibe os fatores A(q) normalizados para as duas geometrias

empregadas neste experimento, obtidos através das equações 4.6 e 4.7, para uma

amostra de água líquida no intervalo de momento transferido utilizado neste estudo.

Figura 4.12: Comportamento do fator de atenuação e efeitos

geométricos de uma amostra de água líquida para o experimento de

WAXS utilizando as geometrias de transmissão e reflexão.

0 10 20 30 40 50 60 70

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

A(q)

norm

q (nm

-1

)

Reflexão

Transmissão

_______________________________________________________________________- 58 -

O comportamento do fator de atenuação para ambas as geometrias, exibido na

figura 4.12, concorda com os obtidos por Gonçalves e Magalhães (2000).

iii) Procedimento de Normalização

O fator de normalização, C, foi obtido de forma similar à descrita acima (seção

4.2.1.3.v) no intervalo de 47,65-70,55nm

-1

iv) Incertezas

A incerteza foi estimada por propagação de erros da equação 4.5. Para este caso,

a incerteza estatística na contagem total de fótons espalhados

)(

exp

foi de 0,2%, as

contribuições espúrias

)(B

tiveram em média 1% de incerteza. A incerteza estatística

associada ao fator de atenuação ficou entre 3 e 5%. Ainda, o erro proveniente do

procedimento de normalização foi de aproximadamente 0,8%, resultando em uma

incerteza total final de aproximadamente 6%.

A incerteza associada ao momento transferido é dada pela equação 3.4 e

aplicando-a a este experimento no intervalo de medido, foi encontrada uma incerteza

estatística devido ao momento transferido,

∆

, de 2% em média.

v) Validação do Procedimento Experimental

O procedimento experimental adotado neste experimento foi validado pela

comparação de coeficiente linear de espalhamento elástico para água líquida obtido neste

estudo com os tabulados por Morin (MORIN, 1982). As discrepâncias foram menores que

_______________________________________________________________________- 59 -

10 20 30 40 50 60 70

-3

-2

-1

0,04

0,08

0,12

0,16

(cm

-1

)

Diferença Relativa (%)

q (nm

-1

)

Morin 1982

Experimental

5% no intervalo de momento transferido medido e dentro das incertezas experimentais

independentemente do arranjo geométrico utilizado, figura 4.13. Como as curvas

experimentais para água líquida para as duas geometrias utilizadas neste experimento

praticamente se sobrepunham optou-se por mostrar apenas a referente à geometria de

transmissão.

Figura 4.13: a) coeficiente linear de espalhamento elastico experimental para água

comparado com o tabulado por Morin (1982); b) Diferença relativa entre as duas curvas

exibidas em a).

_______________________________________________________________________- 60 -

20%

30%

50%

Tecido Normal

Neoplasia Maligna

Neoplasia Benigna

4.2.3. Espalhamento de raios X em baixo ângulo (SAXS) usando

radiação síncrotron

Nesta seção serão descritas a configuração experimental, bem como a

metodologia e abordagem teórica adotadas na obtenção dos perfis de espalhamento para

baixos ângulos.

4.2.3.1. Distribuição de Amostras

Para este experimento foram utilizadas 20 amostras, englobando os três tipos de

tecidos mamários previamente descritos na seção 4.1. A distribuição das amostras

analisadas é apresentada na figura a seguir:

Figura 4.14: Distribuição das amostras de tecidos mamários

utilizados neste experimento.

_______________________________________________________________________- 61 -

4.2.3.2. Arranjo Experimental

O experimento de SAXS foi implementado na linha SAXS-2 na fonte de luz

síncrotron do Laboratório Nacional de Luz Síncrotron em Campinas, Brasil. A montagem

experimental utilizada neste experimento é exibida na figura 4.15.

O feixe de luz síncrotron foi monocromatizado em 7,71keV (λ=1,608Å) e focalizado

a partir de um monocromador com duplo cristal de silício curvado elasticamente, em uma

pequena área sobre o detector (1,0mm x 0,5mm). Um disco de chumbo de 8mm de

diâmetro, denominado beam stop, foi adicionado adjacente ao detector e centralizado a

este, para evitar que o feixe primário, de alta intensidade, atinja o detector, saturando-o. A

distribuição radial dos fótons espalhados elasticamente pelas amostras de tecidos

mamários foi registrada em uma câmara de CCD bidimensional da MARUSA®, composta

de 2048 x 2048 pixels, cada um com resolução espacial de 79µm.

Figura 4.15: Esboço da montagem experimental para experimento de SAXS.

Além disso, a instrumentação da linha de SAXS conta com dois conjuntos de

espalhador/detector. Um deles está localizado antes da amostra e mede a intensidade do

feixe incidente

, o outro se localiza após a amostra e mede a intensidade do feixe

transmitido

, o que permite determinar o fator de transmissão da amostra no momento

da medida.

_______________________________________________________________________- 62 -

Duas distâncias da amostra ao detector foram utilizadas, 804 e 2043mm,

permitindo medidas no intervalo de momento transferido 0,058nm

-1

≤

≤2,500nm

-1

. Com a

finalidade de minimizar os efeitos de espalhamento no ar e perdas por absorção, o

espaço entre a amostra e o detector foi colocado sob vácuo.

Nesta experiência as amostras foram cortadas nas dimensões de 10,0mm x

2,0mm x 1,0mm e inseridas em um porta-amostra circular de alumínio com diâmetro de

30,0mm, figura 4.16. Folhas de mica de espessuras de 0,2mm cobriam ambos os lados

do porta-amostra, antes dos fótons atingirem a amostra e depois de a atravessarem. O

tempo de medida foi ajustado de forma a assegurar incerteza estatística menor que 2%

na distribuição angular dos fótons espalhados.

Amostra padrão de Silver Behenate, [CH

(CH

)

COOAg], foi utilizada para

calibração da imagem para o espaço recíproco,

, a partir dos resultados de Huang

(HUANG et al., 1993).

Figura 4.16: Esboço da posição da amostra no disco de chumbo (porta-amostra).

_______________________________________________________________________

4.2

.3.3. Metodologia Adotada

No intervalo de momento transferido medido neste experimento, os fótons

espalhados carregam informações das estruturas supramoleculares dos tecidos em

estudo. A abordagem teórica adotada

materiais amorfos com orientação anisotrópica e ordenamento em longas cadeias é

aquela descrita na seção 3.3.2.4 e representada pela equação 3.19.

A intensidade espalhada

provenientes das

contribuições espúrias foram obtidas através da integração da

distribuição radial nas imagens bidimensionais de SAXS em ambas as direções,

meridional e equatorial

(WILKINSON

dispo

nibilizado por

(http://www.esrf.

eu/computing/scientific/FIT2D/)

Figura 4.17:

Exemplo de uma imagem de SAXS com o sistema de coordenadas.

Após ter sido estabelecido o espaço recíproco, as intensidades

corrigidas por tempo de exposição, variação da corrente de elétrons no anel síncrotron e

por atenuação, tanto da amostra quanto das folhas de mica.

_______________________________________________________________________

.3.3. Metodologia Adotada

No intervalo de momento transferido medido neste experimento, os fótons

espalhados carregam informações das estruturas supramoleculares dos tecidos em

estudo. A abordagem teórica adotada

para experimentos de raios X em baixo ângulo de

materiais amorfos com orientação anisotrópica e ordenamento em longas cadeias é

aquela descrita na seção 3.3.2.4 e representada pela equação 3.19.

A intensidade espalhada

por todas as amostras medidas, bem c

contribuições espúrias foram obtidas através da integração da

distribuição radial nas imagens bidimensionais de SAXS em ambas as direções,

(WILKINSON

et al

., 2006), figura 4.17,

usando o programa

nibilizado por

European Synchrotron Radiation Facilities

eu/computing/scientific/FIT2D/)

Exemplo de uma imagem de SAXS com o sistema de coordenadas.

Após ter sido estabelecido o espaço recíproco, as intensidades

corrigidas por tempo de exposição, variação da corrente de elétrons no anel síncrotron e

por atenuação, tanto da amostra quanto das folhas de mica.

Por fim, para se obter uma

_______________________________________________________________________

- 63 -

No intervalo de momento transferido medido neste experimento, os fótons

espalhados carregam informações das estruturas supramoleculares dos tecidos em

para experimentos de raios X em baixo ângulo de

materiais amorfos com orientação anisotrópica e ordenamento em longas cadeias é

por todas as amostras medidas, bem c

omo as

contribuições espúrias foram obtidas através da integração da

distribuição radial nas imagens bidimensionais de SAXS em ambas as direções,

usando o programa

Fit2D,

European Synchrotron Radiation Facilities

Exemplo de uma imagem de SAXS com o sistema de coordenadas.

Após ter sido estabelecido o espaço recíproco, as intensidades

espalhadas foram

corrigidas por tempo de exposição, variação da corrente de elétrons no anel síncrotron e

Por fim, para se obter uma

_______________________________________________________________________- 64 -

relação com o coeficiente linear de espalhamento elástico foram removidas as

contribuições espúrias, já corrigidas pelos fatores descritos anteriormente.

(4.8)

em que

BGA

são as intensidades totais espalhadas por (amostra + porta-amostra

+ folhas de mica) e (porta-amostra + folhas de mica), respectivamente, normalizadas pelo

tempo de exposição e pela variação da corrente de elétrons no anel síncrotron.

(

)

corresponde ao fator de atenuação. Os índices A e BG na expressão acima estão

relacionados à amostra e (porta-amostra + folhas de mica), respectivamente.

Ao invés de utilizar o coeficiente linear de espalhamento elástico que é

proporcional à quantidade do lado direito, será utilizado o parâmetro intensidade relativa

I , uma vez que nesta região de momento transferido, os efeitos de interferência não

podem ser desprezados, por isso, torna-se incorreto normalizar os dados para obtenção

do coeficiente linear de espalhamento elástico.

(

)

(

)

(

)

(

)

qAqIqAqII

BGBGBGABGAR

⋅−⋅=

(4.9)

i) Contribuições Espúrias

(

)

As contribuições espúrias ou também chamadas de espalhamento parasita estão

relacionadas ao espalhamento adicional causado por elementos inseridos no caminho do

feixe após a amostra (fendas, janelas, etc), bem como pelo conjunto porta-amostra e

folhas de mica. A intensidade deste espalhamento parasita foi medida por um tempo

(

)

(

)

(

)

(

)

(

)

[

]

qAqIqAqIq

BGBGBGABGAS

⋅−⋅∝

_______________________________________________________________________- 65 -

0 1 2

Intensidade Relativa x10

-4

(u.a.)

q (nm

-1

)

adequado para se ter uma incerteza estatística menor que 2%, colocando o porta-amostra

coberto pelas duas folhas de mica, mas sem a presença de amostra, figura 4.18.

Figura 4.18: Intensidade espalhada por contribuições espúrias.

ii) Atenuação

(

)

O fator de correção para atenuação é o mesmo mostrado na equação 4.6 para

experimentos de WAXS, uma vez que o experimento de SAXS foi realizado utilizando-se

a geometria de transmissão. Entretanto, para SAXS pode-se considerar que

(

)

cos ≈

portanto

(

)

qA é constante para todo o intervalo de momento transferido medido neste

experimento, dependendo apenas dos parâmetros físicos da amostra, coeficiente linear

de atenuação e espessura, determinados em experimentos independentes anteriormente

à coleta de dados de cada amostra.

_______________________________________________________________________- 66 -

iii) Incertezas

Assumindo que as incertezas de cada grandeza experimental não estejam

correlacionadas e aplicando propagação de erros na equação (4.9), foi determinada a

incerteza para

I .

Para este experimento, a incerteza estatística na contagem total dos fótons

espalhados foi de aproximadamente 1,8% as contribuições espúrias tiveram incerteza

máxima de 3%. A incerteza estatística associada ao fator de transmissão foi de 0,9%.

Ainda, a incerteza proveniente do tempo de exposição e da variação da corrente do anel

foi de 0,6%, resultando em uma incerteza final em média 5,5%.

Aplicando a equação (4.4), a incerteza estatística devido ao momento transferido,

∆

, é menor que 2% no intervalo medido neste experimento.

iv) Validação do Procedimento Experimental

O procedimento experimental adotado nos experimentos de SAXS foi validado

pela comparação das intensidades relativas normalizadas obtidas para uma amostra de

SilverBehenate com os valores descritos por Huang et al. (1993), figura 4.19.

_______________________________________________________________________- 67 -

1,0 1,5 2,0 2,5

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Intensidade Relativa Normalizada (u.a.)

q (nm

-1

)

Huang

[67]

Este trabalho

Figura 4.19: Intensidade normalizada medida experimentalmente para

uma amostra de SilverBehenate comparado aos valores de Huang et

al. (1993).

Da figura 4.19 verifica-se a concordância na posição dos picos e nas intensidades

relativas, entretanto o perfil de espalhamento de SAXS obtido neste trabalho possui maior

resolução em momento transferido que o de Huang (HUANG et al., 1993). As

discrepâncias entre os dois experimentos, dentro das incertezas experimentais, foram

menores que 4% no intervalo de momento transferido medido.

4.2.4. Combinação de experiências simultâneas de WAXS e SAXS

Foram combinadas as técnicas de WAXS e SAXS usando radiação síncrotron

sobre um mesmo conjunto de amostras para que se permita correlacionar mudanças em

nível atômico e molecular com alterações em escala supramolecular.

_______________________________________________________________________- 68 -

4.2.4.1. Distribuição das amostras

Para a combinação das técnicas de WAXS e SAXS, a distribuição das

amostras de tecido mamário utilizadas é apresentada na figura a seguir:

Tecido Normal Fibroadenoma Carcinoma Ductal

Número de Amostras

Tipo de Tecido

Figura 4.20: Distribuição das amostras utilizadas para a combinação

WAXS e SAXS.

4.2.4.2. Arranjo Experimental

A combinação simultânea das técnicas de WAXS e SAXS foi implementada na

linha SAXS-1 do Laboratório Nacional de Luz Síncrotron em Campinas. A montagem

experimental utilizada nestes experimentos pode ser observada na figura 4.21. Um

monocromador de duplo cristal de Si (111) foi usado para monocromatizar o feixe de raios

X em um comprimento de onda é de 1,48Å, bem como para reduzir a área de irradiação

na amostra (1,0mm x 0,5mm). A distribuição radial dos fótons espalhados elasticamente

pelas amostras de tecidos mamários foi registrada em detectores bidimensionais image

plate modelo BAS III da Fuji. O detector image plate de WAXS foi fixado sobre um suporte

cilíndrico e focalizado sobre a amostra a uma distância de 200mm desta, como pode ser

_______________________________________________________________________- 69 -

visto na figura 4.21, cobrindo o intervalo de momento transferido de 6.28nm

-1

≤

≤50.26nm

-1

. A distância da amostra ao detector image plate de SAXS foi de 1590mm e

para evitar perdas por absorção e espalhamento do ar, o espaço entre amostra e detector

de SAXS foi colocado sob vácuo, figura 4.21. Um disco de chumbo de 8mm de diâmetro

foi inserido adjacente e centralmente ao detector de SAXS ao detector para evitar a

saturação deste produzida pela alta intensidade do feixe primário. Nesse caso, o intervalo

de momento transferido possível de ser detectado está entre 0,15nm

-1

e 1,90nm

-1

Posteriormente às medidas, os detectores passavam por um scanner de alta resolução

(100µm) MAR 300 da Molecular Dynamics®, disponível nas instalações desta linha de luz

para digitalização dos padrões gravados no detector image plate, gerando as imagens de

WAXS e SAXS. O tempo de medida foi ajustado para garantir uma incerteza estatística

menor que 2% na contagem dos fótons espalhados elasticamente. Amostras padrões de

alumina (N2O3) e SilverBehenate [CH

(CH

)

COOAg] foram utilizadas para calibração

das imagens de WAXS e SAXS para o espaço recíproco,

, respectivamente.

Figura 4.21: Montagem experimental da linha SAXS-1 no LNLS utilizada para as

medidas combinando WAXS e SAXS simultaneamente.

_______________________________________________________________________- 70 -

4.2.4.3. Metodologia

Ao se combinar as técnicas de WAXS e SAXS, serão identificadas padrões de

interferências de estruturas moleculares (menores que 10Å) e supramoleculares (maiores

que 10Å). Portanto, a abordagem teórica utilizada será aquela descrita na seção 3.3.2.4

para os dois tipos de estruturas.

Posteriormente à digitalização de todas as imagens (padrões, amostras e porta-

amostra) de WAXS e SAXS, estas foram processadas usando o programa Fit2D

(http://www.esrf.eu/computing/scientific/FIT2D/). Para as imagens de WAXS, a distribuição

de intensidade espalhada em função do momento transferido foi integrada na direção

vertical no centro de cada faixa, figura 4.22, enquanto para as imagens de SAXS esta

integração foi realizada em ambas as direções, meridional e equatorial (WILKINSON et

al., 2006), como mostrado na figura 3.17. Para se obter o coeficiente linear de

espalhamento elástico, vários passos são necessários. O primeiro é a correção das

medidas pela variação da corrente no anel síncrotron durante as medidas. O segundo

passo consiste em eliminar todos os fótons provenientes de contribuições espúrias. No

passo seguinte, o resultado deve ser corrigido por atenuação e efeitos geométricos. Por

fim, o último passo consiste em normalizar os dados, equação 4.10.

(

)

(

)

(

)

(

)

(

)

[

]

CqAqIqAqIq

BGBGBGABGAS

⋅⋅−⋅=

(4.10)

em que

BGA

são as intensidades totais espalhadas por (amostra + porta-amostra

+ folhas de mica) e (porta-amostra + folhas de mica), respectivamente, normalizadas pela

variação da corrente de elétrons no anel síncrotron.

(

)

qA corresponde ao fator de

correção para atenuação e efeitos geométricos. Os índices A e BG na expressão acima

_______________________________________________________________________- 71 -

estão relacionados à amostra e (porta-amostra + folhas de mica), respectivamente. O

fator C é o fator de normalização dos dados.

Uma vez que não existe um intervalo de momento transferido comum aos

experimentos de WAXS e SAXS, o que permitiria normalizar a distribuição de intensidade

espalhada somente pela amostra utilizando o perfil de espalhamento da mesma amostra

na região WAXS, será utilizada novamente o parâmetro intensidade relativa (

) para

quantificar essa intensidade espalhada em SAXS, conforme mencionado anteriormente

para o experimento independente de SAXS, equação 4.9, seção 4.2.3.3.

Figura 4.22: Imagens de WAXS. Da esquerda para a direita, cada faixa

corresponde à distribuição de intensidade espalhada de: três tipos de

tecidos mamários, contribuições espúrias e amostra padrão de alumina.

i) Contribuições Espúrias I

(q)

As contribuições espúrias provenientes de porta-amostra, folhas de mica,

colimadores e etc, foram medidas em experimentos independentes e as intensidades

espalhadas por estes materiais em função do momento transferido podem ser vistas nas

figuras 4.23a e b.

_______________________________________________________________________- 72 -

Figura 4.23: Intensidade espalhada por contribuições espúrias para

os experimentos de: a) SAXS e b) WAXS.

ii) Atenuação e efeitos geométricos A(q)

Ambos os experimentos de WAXS e SAXS foram realizados utilizando a geometria

de transmissão e, por isso, o fator de correção para atenuação é aquele exibido na

equação 4.6. Porém para SAXS, aplicando as mesmas considerações descritas na seção

4.2.3.3.iii, observa-se que este coeficiente é constante para cada amostra. Os fatores de

atenuação e efeitos geométricos para SAXS e WAXS são exibidos nas figuras 4.24a e b,

respectivamente.

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0

0,01

0,1

Inetnsidade Relativa (u.a.)

q (nm

-1

)

5 10 15 20 25 30 35 40 45

0,0040

0,0045

0,0050

0,0055

0,0060

0,0065

0,0070

Intensidade Relativa (u.a.)

q (nm

-1

)

_______________________________________________________________________- 73 -

Figura 4.24: Fator de correção para atenuação e efeitos geométricos para uma amostra

de tecido adiposo para os experimentos de: a) SAXS e b) WAXS.

iii) Normalização C

O fator de normalização é obtido a partir da razão entre os valores teóricos e

experimentais de

, na região de alto momento transferido onde efeitos de interferência

moleculares podem ser desprezados (POLETTI, 2002b), conforme descrito na seção

4.2.1.3.v. Portanto apenas os perfis de espalhamento na região de WAXS foram

normalizados.

iv) Incertezas

As incertezas para ambas as técnicas de SAXS e WAXS foram estimadas

por propagação de erros das equações 4.9 e 4.10, sendo que as variáveis foram

assumidas não correlacionadas e apenas incertezas associadas a grandezas

experimentais foram levadas em conta.

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5

0,015

0,020

0,025

0,030

0,035

0,040

0,045

0,050

0,055

A(q)

q (nm

-1

)

10 20 30 40 50

0,015

0,020

0,025

0,030

0,035

0,040

0,045

0,050

A (q)

q (nm

-1

)

_______________________________________________________________________- 74 -

Para ambos os experimentos, a incerteza estatística na contagem total dos fótons

espalhados foi de aproximadamente 1,8%, enquanto à relacionada às contribuições

espúrias tiveram incerteza máxima de 3% e a incerteza proveniente da variação da

corrente do anel foi de 0,6% em média, sendo iguais para ambos os experimentos.

Porém, a incerteza estatística associada ao fator de atenuação e efeitos geométricos foi

de 1,3% e 0,6% para WAXS e SAXS respectivamente. Ainda, para WAXS a incerteza

relacionada ao fator de normalização foi de 0,8%. A incerteza final resultante foi em média

7,4% para WAXS e 5,5% para SAXS.

Aplicando a equação (3.4), a incerteza estatística encontrada devido ao momento

transferido,

∆

, é menor que 2% no intervalo medido neste experimento.

_______________________________________________________________________- 75 -

CAPÍTULO 5 – RESULTADOS E DISCUSSÕES

5.1. Espalhamento de raios X em médio ângulo (WAXS)

5.1.1. Coeficiente linear de espalhamento elástico: determinação de

estruturas moleculares e sua correlação com imagens histológicas

Os coeficientes lineares de espalhamento elástico

de cada tipo de tecido

mamário foram obtidos através da aplicação dos procedimentos de correção e

normalização, descritos no capítulo anterior, às distribuições angulares da intensidade de

fótons espalhados medidos em cada experimento de WAXS. Os experimentos de WAXS

foram realizados utilizando-se dois tipos de fontes de excitação (raios X e radiação

síncrotron) e dois arranjos geométricos (reflexão e transmissão). A comparação entre

cada configuração experimental é mostrada na figura 5.1, onde as figuras 5.1a, 5.1b e

5.1c apresentam o coeficiente linear de espalhamento elástico para amostras típicas de

tecido normal adiposo, neoplasia benigna e neoplasia maligna, respectivamente. A

comparação entre os perfis de espalhamento dos três tipos de tecidos estudados neste

trabalho é exibida na figura 5.1d.

_______________________________________________________________________- 76 -

Figura 5.1: Comparação do coeficiente linear de espalhamento elástico obtido com a técnica de

WAXS, utilizando diferentes configurações experimentais para: a) tecido normal adiposo; b)

neoplasia benigna e c) neoplasia maligna. A figura 5.1d compara o

para amostras típicas de

tecido mamário normal adiposo, neoplasia benigna e maligna.

Baseado nas figuras 5.1a, 5.1b e 5.1c, observa-se que o perfil de espalhamento de

cada tipo de tecido possui poucos picos e com formato largo, típico de materiais amorfos,

independentemente da fonte e geometria utilizadas, porém os perfis obtidos utilizando

radiação síncrotron apresentam maior resolução em momento transferido que os obtidos

com tubo de raios X convencional. Além disso, verifica-se que cada grupo de tecido

0 10 20 30 40 50 60 70

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

(cm

-1

)

q (nm

-1

)

Tubo de raios X - geometria de reflexão

Síncrotron - geometria de reflexão

Síncrotron - geometria de transmissão

0 10 20 30 40 50 60 70

0,00

0,04

0,08

0,12

0,16

0,20

0,24

(cm

-1

)

q (nm

-1

)

Tubo de raios X - geometria de reflexão

Síncrotron - geometria de reflexão

Síncrotron - geometria de transmissão

0 10 20 30 40 50 60 70

0,00

0,04

0,08

0,12

0,16

0,20

(cm

-1

)

q (nm

-1

)

Tubo de raios X - geomtria de reflexão

Síncrotron - geometria de reflexão

Síncrotron - geometria de transmissão

0 10 20 30 40 50 60 70

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

0,35

0,40

(cm

-1

)

q (nm

-1

)

Tecido Normal

Neoplasia Maligna

Neplasia Benigna

_______________________________________________________________________

mamário estudado neste trabalho apresenta um perfil de espalhamento característico,

figura 5.1d.

A figura 5.2 apresenta a lâmina histológica correspondente à amostra de tecido

normal adiposo apresentada na figura 5.1a, onde podem ser visualizadas

fundamentais, dos tecidos adiposos, os adipócitos (formato hexagonal na figura), cuja

constituição é basicamente de triglicerídeos, os quais por sua vez são formados por uma

molécula de glicerol e três de ácidos graxos, como mencionado na seção

Figura 5.2

: Lâmina

No correspondente perfil de espalhamento deste tecido, destaca

um primeiro pico na posição correspondente a

(CULLITY, 1978) encontra

de elementos que distam cerca de 4,5

carbônica dos ácidos graxos, principais moléculas que compõem o tecido adiposo,

apresenta átomos de carbono separados por uma distância de 4,5

vizinhos

na cadeia adjacente.

normais adiposos está situado em

harmônico do pico de ácidos graxos.

do momento transferido fundamental, especificamente neste caso, o momento transferido

_______________________________________________________________________

mamário estudado neste trabalho apresenta um perfil de espalhamento característico,

A figura 5.2 apresenta a lâmina histológica correspondente à amostra de tecido

normal adiposo apresentada na figura 5.1a, onde podem ser visualizadas

fundamentais, dos tecidos adiposos, os adipócitos (formato hexagonal na figura), cuja

constituição é basicamente de triglicerídeos, os quais por sua vez são formados por uma

molécula de glicerol e três de ácidos graxos, como mencionado na seção

: Lâmina

histoló

gica de uma amostra de tecido normal adiposo

No correspondente perfil de espalhamento deste tecido, destaca

um primeiro pico na posição correspondente a

=13,9nm

-1

. Através da lei

se que este pico está relacionado ao espalhamento construtivo

de elementos que distam cerca de 4,5

entre si. Lide (1996) mostrou que a cadeia

carbônica dos ácidos graxos, principais moléculas que compõem o tecido adiposo,

apresenta átomos de carbono separados por uma distância de 4,5

na cadeia adjacente.

O o

utro pico presente no perfil de espalhamento dos tecidos

normais adiposos está situado em

=28,2nm

-1

e pode estar associa

do ao espalhamento

harmônico do pico de ácidos graxos.

Um harmônico é definido como um múltiplo inteiro

do momento transferido fundamental, especificamente neste caso, o momento transferido

_______________________________________________________________________

- 77 -

mamário estudado neste trabalho apresenta um perfil de espalhamento característico,

A figura 5.2 apresenta a lâmina histológica correspondente à amostra de tecido

normal adiposo apresentada na figura 5.1a, onde podem ser visualizadas

as células

fundamentais, dos tecidos adiposos, os adipócitos (formato hexagonal na figura), cuja

constituição é basicamente de triglicerídeos, os quais por sua vez são formados por uma

molécula de glicerol e três de ácidos graxos, como mencionado na seção

3.1.2.

gica de uma amostra de tecido normal adiposo

No correspondente perfil de espalhamento deste tecido, destaca

-se a presença de

. Através da lei

de Bragg

se que este pico está relacionado ao espalhamento construtivo

entre si. Lide (1996) mostrou que a cadeia

carbônica dos ácidos graxos, principais moléculas que compõem o tecido adiposo,

apresenta átomos de carbono separados por uma distância de 4,5

Å dos respectivos

utro pico presente no perfil de espalhamento dos tecidos

do ao espalhamento

Um harmônico é definido como um múltiplo inteiro

do momento transferido fundamental, especificamente neste caso, o momento transferido

_______________________________________________________________________- 78 -

fundamental é

=13,9nm

-1

. Portanto, nesta região de momento transferido podemos

concluir que o perfil de espalhamento medido carrega informação das estruturas

relacionadas aos ácidos graxos.

As figuras 5.3 e 5.4 apresentam as lâminas histológicas correspondentes às

amostras de fibroadenoma e carcinoma. Em ambas as lâminas destacam-se duas

componentes teciduais principais: uma formada por fibras (componente fibrosa) e outra

por ácinos (componente glandular). Cabe mencionar que os carcinomas apresentam um

número maior de ácinos e maior densidade de fibras (componente fibrosa densa). Desta

forma, é esperado que os perfis de espalhamento correspondentes a estas neoplasias

deveriam carregar informações sobre as estruturas presentes nestas duas componentes.

Dos perfis correspondentes às amostras de fibroadenoma (fig. 5.1b) e de

carcinoma (fig. 5.1.c) pode ser visto que existe uma semelhança à forma, porém

diferenças em relação às intensidades. Em ambos os perfis de espalhamento está

evidente a presença de um pico na posição de

=20,1nm

-1

, o qual pela lei de Bragg

corresponde ao espalhamento entre centros espalhadores, cuja distância entre eles é de

3,0Å. Segundo Voet (1995) a distância entre os centros espalhadores (oxigênio-oxigênio)

de duas moléculas de água adjacentes possuem distância de 3,0Å. Alem deste pico o

resto do perfil apresenta uma grande similaridade com o perfil de espalhamento obtido

para uma amostra da água líquida (figura 4.8). A existência de água nestes tecidos pode

ser explicada pela grande quantidade de ácinos, os quais são compostos basicamente

por água, como mencionado anteriormente. Desta forma, podemos concluir que nesta

região de WAXS apenas o espalhamento das moléculas de água podem ser identificados

(

=20,1nm

-1

), uma vez que neste intervalo de momento transferido o espalhamento das

fibras de colágeno é insignificante (BOHNDIEK et al., 2008). Ainda, com relação aos

perfis de espalhamento das neoplasias malignas utilizando radiação síncrotron,

_______________________________________________________________________- 79 -

Figura 5.

: Lâmina

histoló

gica de

uma amostra de fibroadenoma.

Figura 5.

: Lâmina

histoló

gica de uma

amostra de carcinoma ductal invasivo.

destacamos que picos cristalinos aparecem em

=16,8nm

-1

, podendo estar relacionado

ao espalhamento construtivo de cristais de hidroxiapatita (FARQUHARSON e SPELLER,

1997), os quais são indicadores da presença de microcalcificações e podem estar

associados à presença de câncer de mama (MORGAN et al., 2005).

A tabela 5.1 apresenta o resumo de alguns parâmetros podem ser extraídos dos

perfis de espalhamento para cada grupo de tecido mamário analisado como: posição e

intensidade média, bem como a estrutura molecular relacionada a tais picos. Cabe

mencionar que a posição do pico está relacionada, através da lei de Bragg, a distância

entre os centros espalhadores numa amostra. Já a intensidade do pico está diretamente

relacionada à densidade de centros espalhadores presentes na amostra em estudo.

Tabela 5.1. Picos dos três tipos de tecidos mamários histologicamente classificados.

Tipo de Tecido

Posição do

pico (nm

-1

)

Intensidade do pico

(u.a.)

Estrutura

Molecular

Normal adiposo

13,9±0,3 0,36±0,03 Ácidos graxos

28,2±0,7

0,120±0,009

_______________________________________________________________________- 80 -

Neoplasia benigna

20,1±0,5

0,148±0,009

Água

Neoplasia Maligna

20,1±0,5

16,8±0,4

0,27±0,03

0,047±0,02

Água

Hidroxiapatita

O fato de a intensidade média do pico correspondente ao espalhamento das

moléculas de água ser maior nas neoplasias malignas do que nas benignas, é devido à

maior quantidade de ácinos e, portanto maior quantidade de centros espalhadores (água),

existentes nas neoplasias malignas, como pode ser observado na lâmina histológica de

uma amostra de carcinoma ductal invasivo, figura 5.4.

Baseado nas informações apresentadas na tabela 5.1, pode-se afirmar que os

parâmetros posição e intensidade dos picos de cada estrutura molecular, identificadas

através da técnica de WAXS, podem ser úteis para classificação dos diferentes tipos de

tecidos mamários (GRIFFITHS et al., 2007). Cabe mencionar que os resultados obtidos

na experiência de WAXS utilizando um tubo de raios X foram publicados em: Oliveira et

al. (2008)

5.1.2. Comparação com a literatura

Existem na literatura alguns trabalhos que utilizam a técnica de WAXS para

caracterizar tecidos mamários em escala molecular (KIDANE et al. 1999, POLETTI et al.

2002b, RYAN et al. 2007), por isso é útil comparar os resultados obtidos nestes trabalhos

anteriores com os alcançados neste estudo. A figura 5.5 compara o perfil de

espalhamento de trabalhos prévios com este para tecido adiposo, enquanto a figura 5.6

_______________________________________________________________________- 81 -

faz esta comparação para neoplasia benigna e por fim, a figura 5.7 confronta os

resultados de estudos anteriores com este para amostras de neoplasia maligna.

8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

(cm

-1

)

q (nm

-1

)

Kidane et al. (1999)

Poletti et al. (2002b)

Ryan et al. (2007)

Este trabalho

Figura 5.5: Comparação do perfil de espalhamento de tecido mamário

adiposo obtido neste trabalho com outros anteriormente publicados.

Comparando os perfis de espalhamento de todos os grupos de tecidos mamários

analisados neste trabalho com outros publicados anteriormente, observa-se concordância

5 10 15 20 25 30 35 40 45

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

(cm

-1

)

q (nm

-1

)

Kidane et al. (1999)

Ryan et al. (2007)

Este trabalho

5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

(cm

-1

)

q (nm

-1

)

Kidane et al. (1999)

Ryan et al. (2007)

Este trabalho

Figura 5.6

: Comparação do perfil de

espalhamento de uma amostra típica de

fibroadenoma obtido neste trabalho com

outros anteriormente publicados.

Figura 5.

: Comparação do perfil de

espalhamento de uma amostra típica de

carcinoma ductal invasivo obtido neste trabalho

com outros anteriormente publicados.

_______________________________________________________________________- 82 -

com relação à posição dos picos. Porém, com relação à forma dos perfis de

espalhamento e à intensidade dos picos claras diferenças podem ser notadas. Estas

diferenças podem ser explicadas, principalmente, pela técnica utilizada (EDXRD) nas

medidas de Kidane et al. (1999) e Ryan et al. (2007), a qual utilizava um feixe

polienergético ao em vez de um feixe monoenergético, o que implica em baixa resolução

em termos de momento transferido de cada experimento e a diferentes procedimentos de

correção (atenuação, polarização, etc) e normalização, o que poderia induzir distorções

nos perfis de espalhamentos obtidos em comparação ao que seria esperado como

mostrado por Poletti (2001).

A comparação dos perfis de espalhamento de tecido mamário normal adiposo

obtido neste trabalho com outros publicados anteriormente (KIDANE et al., 1999,

POLETTI et al., 2002b, RYAN et al., 2007) apresenta a mesma posição do pico (ao redor

de 13,9nm

-1

), contudo diferenças na forma do perfil e na intensidade do pico são notadas

e podem ser devido às causas mencionadas acima. Com relação à comparação dos

perfis de espalhamento de um caso específico de neoplasia benigna (fibroadenoma) e

maligna (carcinoma ductal invasivo) obtidos neste estudo com outros previamente

reportados (KIDANE et al., 1999, RYAN et al., 2007), verifica-se semelhança quanto à

posição do pico principal (ao redor de 20,1nm

-1

Portanto, além das posições dos picos, nenhuma outra conclusão pode ser tirada

destas comparações, uma vez que as diferentes técnicas utilizadas por cada autor,

descritas acima, influenciam na forma dos perfis e na intensidade dos picos.

_______________________________________________________________________- 83 -

5.2. Espalhamento de raios X em baixo ângulo (SAXS)

5.2.1. Perfil de espalhamento: determinação de estruturas

supramoleculares e sua correlação com imagens histológicas

A distribuição da intensidade espalhada em função do momento transferido (perfil

de espalhamento) para amostras típicas de tecido normal, neoplasia benigna e maligna,

após o tratamento dos dados e aplicação dos procedimentos de correção descritos na

seção 4.2.3.3, pode ser visualizada na figura 5.8.

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Intensidade Relativa (u.a.)

q (nm

-1

)

Tecido normal adiposo

Tecido normal misto

Neoplasia Benigna

Neoplasia Maligna

Figura 5.8: Perfil de espalhamento de amostras típicas dos três tipos de

tecidos mamários estudados neste trabalho utilizando SAXS.

Dos perfis de espalhamento apresentados na figura 5.8 podem-se destacar três

sinais característicos: um pico largo na posição de

=1,5nm

-1

, a intensidade de fundo

com decaimento exponencial, e vários picos no intervalo de momento transferido entre

0,25 e 1,20nm

-1

_______________________________________________________________________- 84 -

Apenas os tecidos normais com componente adiposa apresentam um pico bem

definido na posição de

=1,5nm

-1

. Utilizando a lei de Bragg, verifica-se que este pico

deve-se ao espalhamento construtivo de centros que distam 41,6Å. Mykhaylyk et al.

(2007) afirmaram que a distância dos centros espalhadores de duas cadeias adjacentes

de triglicerídeos é de aproximadamente 41,6Å. Cada triglicerídeo é formado pela união de

uma molécula de glicerol e três de ácidos graxos (NELSON e COX, 2006), sendo estes

últimos identificados anteriormente na região de WAXS. Dessa forma, pode-se concluir

que utilizando a técnica SAXS é possível identificar os arranjos supramoleculares que

compõem determinado tecido, aqui em especial para tecido adiposo, os triglicerídeos.

A intensidade da radiação espalhada de fundo está relacionada com a

componente de espalhamento difuso. Existem vários modelos para explicar o

comportamento desta componente em tecidos mamários (ROGERS et al., 1999,

WILKINSON et al., 2006), entretanto, todos eles apresentam as mesmas características

de decaimento exponencial como as obtidas neste trabalho. A maior intensidade de fundo

ocorre nas neoplasias malignas e está relacionada à maior densidade eletrônica destes

tecidos.

Por fim, a terceira característica dos perfis de espalhamento de SAXS

apresentados de na figura 5.8 correspondentes ao espalhamento construtivo de

estruturas, cuja distância fundamental é de 65nm. Segundo Holmes et al. (2001) esta

distância corresponde à periodicidade axial das fibras de colágeno, cujo arranjo

hierárquico é exibido na figura 5.9. Portanto, os vários picos presentes nos perfis de

espalhamento dos tecidos: normal misto, neoplasia benigna e maligna, correspondem aos

picos de espalhamento de ordens superiores destas estruturas fibrilares desde a 3ª ordem

(

=0,29nm

-1

) até a 12ª (

=1,17nm

-1

). Baseado nestes picos de colágeno, verifica-se que

a periodicidade axial das fibras de colágeno é ligeiramente maior nas neoplasias benignas

_______________________________________________________________________- 85 -

em comparação aos outros tipos de tecido, principalmente no pico de 3ª ordem, cuja

razão pode estar relacionada a um relaxamento das ligações intermoleculares de longas

cadeias, ocorrido pela perda estrutural das fibras invadidas (FERNÁNDEZ et al., 2002).

Ainda com relação às neoplasias benignas, nota-se que as intensidades dos picos

correspondentes às fibras de colágeno são menores, fato que pode ser explicado pela

utilização neste experimento de apenas amostras de fibroadenomas, os quais são

formados pela proliferação do estroma intralobular que é composto basicamente de tecido

conjuntivo frouxo, possuindo menor densidade de fibras, seção 3.1.3, e, portanto menor

intensidade espalhada.

Figura 5.9: Representação esquemática do arranjo hierárquico do colágeno

fibrilar de tecidos mamários, exibindo ainda seus parâmetros dimensionais.

A tabela 5.2 mostra as posições e intensidades dos picos de cada tipo de tecido

analisado neste experimento, bem como as estruturas relacionadas a tais picos.

_______________________________________________________________________- 86 -

Tabela 5.2. Picos dos três tipos de tecidos mamários histologicamente classificados.

Tipo de Tecido

Posição do

pico (nm

-1

)

Intensidade do pico

Estrutura

supamolecular

1,51±0,03 (270±7)x10

Triglicerídeo

Tecido Normal

1,16±0,02

1,07±0,02

0,96±0,02

0,87±0,02

0,78±0,02

0,68±0,01

0,58±0,01

0,49±0,01

0,29±0,01

(166±4)x10

(362±9)x10

-6

(113±4)x10

-5

(109±3)x10

-5

(241±6)x10

-5

(136±3)x10

-5

(298±8)x10

-6

(201±7)x10

-5

(297±7)x10

-5

Fibras de colágeno

Neoplasia Benigna

1,16±0,02

1,07±0,02

0,97±0,02

0,87±0,02

0,78±0,02

0,68±0,01

0,58±0,01

0,48±0,01

0,30±0,01

(94±2)x10

(49±1)x10

-5

(77±2)x10

-5

(47±2)x10

-5

(88±2)x10

-5

(297±7)x10

-6

(202±5)x10

-6

(201±5)x10

-5

(252±8)x10

-5

Fibras de colágeno

Neoplasia Maligna

1,16±0,02

1,07±0,02

0,97±0,02

0,87±0,02

0,78±0,02

(145±4)x10

-4

(53±1)x10

-5

(127±3)x10

-5

(125±3)x10

-5

(253±4)x10

-5

Fibras de colágeno

_______________________________________________________________________- 87 -

0,68±0,01

0,58±0,01

0,49±0,01

0,29±0,01

(142±3)x10

(316±8)x10

-6

(220±6)x10

-5

(301±6)x10

-5

Fibras de colágeno

*continuação da tabela 5.2

A partir dos valores de intensidade dispostos na tabela 5.2, verifica-se que as

neoplasias malignas apresentam uma maior intensidade nos picos relacionados às fibras

de colágeno, isto se deve à crescente invasão das células cancerosas nas fibras e

conseqüentemente maior degradação dessas fibras, fazendo com que, em contrapartida,

o organismo atue na reparação destas (PUCCI-MINAFRA et al. 1993), o que provoca um

aumento na superfície específica da fibra reparada, e, conseqüente maior intensidade

espalhada (FERNÁNDEZ et al. 2002).

5.2.2. Comparação com a literatura

Existem na literatura poucos trabalhos que empregam a técnica de SAXS para

estudo de tecidos mamários. Nesta subseção serão confrontados os resultados obtidos

neste trabalho com os anteriormente publicados na literatura (FERNÁNDEZ et al., 2002,

ROUND et al., 2005). Embora outros autores mencionem terem estudado tecidos

mamários (LEWIS ET AL. 2000, FERNÁNDEZ ET AL. 2005), eles não apresentam os

perfis de espalhamento medidos. Destaca-se ainda, que nenhum trabalho apresentou

perfis de espalhamento para amostras de neoplasia benigna, portanto este tipo de tecido

mamário não será comparado nesta subseção.

_______________________________________________________________________- 88 -

As figuras 5.10 e 5.11 apresentam as comparações dos perfis de espalhamento

obtidos neste trabalho com os previamente publicados para tecido normal e neoplasia

maligna.

A partir da figura 5.10 pode-se verificar a concordância dos resultados obtidos

neste trabalho para uma amostra típica de tecido normal com os apresentados por

Fernández et al. (2002), principalmente com relação à forma do perfil de espalhamento e

a posição dos picos no intervalo de momento transferido concomitante entre os dois

trabalhos (picos de espalhamento de fibras de colágeno da 3ª à 7ª ordem). Com relação a

Round et al. (2005), embora se tenha o mesmo intervalo de momento transferido medido

neste experimento de SAXS que o apresentado por aqueles autores, o perfil de

espalhamento publicado por estes, diferentemente do obtido neste estudo, não apresenta

nenhum pico de espalhamento, o que pode ser devido à baixa resolução em momento

transferido e/ou deficiência nos procedimentos de correção dos seus dados

experimentais.

0,5 1,0 1,5 2,0

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

Intensidade Relatva (u.a.)

q (nm

-1

)

Fernandez et al. (2002)

Round et al. (2005)

Este trabalho

0,5 1,0 1,5 2,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

Intensidade Relativa (u.a.)

q (nm

-1

)

Fernandez et al. (2002)

Round et al. (2005)

Este trabalho

Figura 5.10

: Comparação do perfil de

espalhamento de uma amostra típica de tecido

normal obtido neste trabalho com outros

anteriormente publicados.

Figura 5.11

: Comparação do perfil de

espalhamento de uma amostra típica de

neoplasia maligna obtido neste trabalho com

outros anteriormente publicados.

_______________________________________________________________________- 89 -

Os perfis de espalhamento referentes à neoplasia maligna comparados na figura

5.11, apresentam concordância com relação à intensidade de fundo. Porém o perfil

apresentado por Round et al. (2005), como para o caso de tecido normal discutido

anteriormente, não apresenta picos de espalhamento das fibras de colágeno como os

perfis de espalhamento obtidos neste trabalho e no de Fernández et al. (2002), devido

novamente aos mesmos problemas citados anteriormente para tecido normal.

5.3. Combinação simultânea de WAXS e SAXS

Conforme mostrado nos resultados preliminares de WAXS e SAXS, podemos

concluir que estes perfis permitem observar várias estruturas moleculares e

supramoleculares presentes nos tecidos: adiposo (ácidos graxos e triglicerídeos),

conjuntivo denso e frouxo (fibras de colágeno) e epitelial glandular (água), relacionado

este último à presença de ácinos. Contudo, nesta seção serão apresentados resultados

de uma experiência, na qual foram combinadas simultaneamente as técnicas de WAXS e

SAXS sobre um mesmo conjunto de amostras, fato que resumiria estas informações, bem

como permitiria correlacionar todas estas informações para cada tecido mamário. Cabe

salientar que nenhum trabalho científico tem sido apresentado na literatura que combine

estas a tecidos mamários.

5.3.1. Perfil de espalhamento: Determinação de estruturas moleculares

e supramoleculares

As figuras 5.12 e 5.13 apresentam os perfis de espalhamento de amostras típicas

de cada grupo de tecido mamário estudado neste trabalho para WAXS e SAXS,

respectivamente.

_______________________________________________________________________- 90 -

Figura 5.12: Perfil de espalhamento na região de WAXS de amostras

típicas de tecido normal, neoplasia benigna e maligna.

Figura 5.13: Perfil de espalhamento na região de SAXS de amostras típicas

de tecido normal, neoplasia benigna e maligna.

10 15 20 25 30 35 40 45

0,05

0,06

0,07

0,08

0,09

0,10

0,11

0,12

(cm

-1

)

q (nm

-1

)

Tecido Normal

Neoplasia Benigna

Neoplasia Maligna

pico de ácidos graxos

pico de água

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0

0,5

1,0

Intensidade Relativa (u.a.)

q (nm

-1

)

Tecido Normal

Neoplasia Benigna

Neoplasia Maligna

picos de colágeno pico de

triglicerídeos

_______________________________________________________________________- 91 -

Os perfis de espalhamento para WAXS exibidos na figura 5.12 apresentam-se

semelhantes aos mostrados na seção 5.1.1, com relação à forma e posição dos picos

para cada grupo de tecido mamário estudado neste trabalho. Para tecidos normais

verifica-se que um pico está presente em

=13,9nm

-1

, relacionado ao espalhamento de

moléculas de ácidos graxos. Além disso, os perfis de espalhamento correspondentes às

neoplasias, tanto benigna quanto maligna, possuem um pico característico em

=20,1nm

relacionado à existência de água nestes tecidos, concordando com os resultados

exibidos anteriormente.

Pode ser observar da figura 5.13 a presença de picos relacionados ao

espalhamento construtivo das fibras de colágeno desde a 3ª (

=0,29nm

-1

) até a 12ª

ordem (

=1,17nm

-1

) em todos os grupos de tecidos, bem como, variações nas

intensidades destes para cada grupo de tecido mamário, conforme visto na seção 5.2.1.

Além disso, para tecido normal, o pico relacionado ao arranjo de triglicerídeos também

está presente (

=1,51nm

-1

A partir da combinação simultânea das técnicas de WAXS e SAXS torna-se

possível identificar ao mesmo tempo estruturas existentes nos tecidos mamários normais

e neoplásicos em escala molecular e supramolecular, respectivamente. Por exemplo, com

a técnica de WAXS ficou evidenciada a presença de moléculas de ácidos graxos em

tecido normal, já na técnica de SAXS foi verificado a existência de triglicerídeos nestes

mesmos tecidos. Por outro lado, nos tecidos neoplásicos podem ser identificadas as duas

componentes teciduais principais: fibroso frouxo (benignas) ou denso (malignas) e

epitelial glandular (ácinos) e, ainda, a partir das análises correlacionando as informações

de ambos os perfis (WAXS e SAXS) identificar o tipo de neoplasia (Conceição et al.

2008c).

_______________________________________________________________________- 92 -

CAPÍTULO 6 – CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS

6.1. Sobre as medidas de WAXS

• Para cada tipo de experimento de espalhamento de raios X em médios

ângulos (WAXS) foi desenvolvido um procedimento de correção e

normalização dos dados. Em geral, as incertezas experimentais associadas

aos perfis de espalhamentos obtidos variaram entre 6 e 8%. Os

procedimentos de correção foram validados pela comparação do perfil de

espalhamento para água obtido para cada configuração experimental com

outro previamente publicado (MORIN, 1982), sendo que as diferenças entre

os dois perfis foram menores que ±4%, dentro das incertezas experimentais,

significando que a metodologia é satisfatória. Alem disto, os procedimentos

mostraram-se sólidos uma vez que apesar das diferentes características

adotadas em cada montagem experimental, os perfis de espalhamento dos

tecidos mamários normais e neoplásicos corrigidos foram semelhantes quanto

à forma e posição dos picos apresentando apenas algumas diferenças com

relação à resolução em momento transferido.

• Os resultados obtidos mostraram que é possível a identificação de estruturas

entre 1 e 10Å. Os perfis de espalhamento de tecidos normais com

componente adiposa sempre apresentaram um pico em

=13,9nm

-1

(TARTARI et al., 1997b) relacionado ao espalhamento construtivo de

moléculas de ácidos graxos (LIDE, 1996), um dos componentes do tecido

adiposo. Para as neoplasias benignas e malignas surge um pico característico

_______________________________________________________________________- 93 -

=19,4nm

-1

(POLETTI et al., 2002b) correspondente a existência de

grande quantidade de água nestes tecidos (VOET, D. e VOET, J. D. 1995).

Em adição, para as neoplasias benignas a quantidade de água presente é

menor que nas malignas, fato este, evidenciado pela menor intensidade deste

pico no perfil de espalhamento desta neoplasia em comparação à neoplasia

maligna. Ainda, com relação aos perfis de espalhamento de algumas

neoplasias malignas destacamos a presença de picos cristalinos relacionados

ao espalhamento construtivo de cristais de hidroxiapatita (FARQUHARSON e

SPELLER, 1997). Portanto, pode-se concluir que a técnica de WAXS pode ser

utilizada para determinar as estruturas moleculares que compõem um tecido

biológico, particularmente, tecido mamário

6.2. Sobre as medidas de SAXS

• As medidas de espalhamento de raios X em baixo ângulo foram realizadas na

linha D11A-SAXS do Laboratório Nacional de Luz Síncrotron (LNLS) utilizando

duas distâncias da amostra ao detector bidimensional (CCD) de alta

resolução, o que permitiu estender o intervalo de momento transferido medido.

O procedimento para tratamento dos dados foi elaborado especialmente para

este tipo de experimento e apresentou uma incerteza final associada de

aproximadamente 6% e a validação deste, foi obtida pela comparação do

perfil de espalhamento de uma amostra padrão de Silver Behenate deste

trabalho com outro reportado anteriormente (HUANG et al., 1993), resultando

em uma diferença relativa de 4%, dentro das incertezas experimentais.

_______________________________________________________________________- 94 -

• Através da análise e interpretação dos perfis de espalhamento dos diferentes

grupos de tecidos mamários estudados neste trabalho foi possível a

identificação de estruturas de tamanhos maiores que 10Å, como por exemplo,

fibras de colágeno e triglicerídeos. Foi verificado para todos os grupos com

alguma componente fibrosa a presença de picos de espalhamento desde a 3ª

((

=0,29nm

-1

) até a 12ª ordem (

=1,17nm

-1

) de estruturas com parâmetro de

ordem de 65 nm (relacionados às fibras de colágeno). As neoplasias benignas

analisadas neste experimento eram do tipo fibroadenoma, por isso

apresentavam menor intensidade nos picos correspondentes às fibras de

colágeno, uma vez que este tipo de neoplasia possui menor quantidade de

tecido conjuntivo fibroso. Com relação às neoplasias malignas foi observado

que estas possuem maior intensidade, fato que comprova o resultado de

trabalhos anteriores (FERNÁNDEZ et al., 2002, 2004) que relacionam esta

característica a reação do organismo em reparar as fibras de colágeno

invadidas pelo câncer (PUCCI-MINAFRA et al., 1993), aumentando a

superfície específica destas e, conseqüentemente a intensidade espalhada.

Além disso, as amostras de tecido normal com alguma componente adiposa

apresentavam um pico em

=1,51nm

-1

correspondendo ao espalhamento de

arranjos de triglicerídeos (MYKHAYLYK et al., 2007). Portanto, pode-se

concluir que a aplicação da técnica de SAXS em um tecido biológico,

particularmente, em tecido mamário, pode ser utilizada para determinar as

estruturas supramoleculares compõem estes tecidos.

_______________________________________________________________________- 95 -

6.3. Sobre a combinação de WAXS e SAXS

• Os resultados preliminares indicam que a combinação das técnicas de WAXS

e SAXS permite correlacionar alterações em nível atômico e molecular com as

ocorridas em escala supramolecular, como por exemplo, correlacionar

modificações estruturais nas componentes fibrosas ou epiteliais glandulares.

Embora, ainda seja necessária a realização de medidas complementares, as

evidências encontradas até o presente momento sugerem a possibilidade da

utilização simultânea de ambas as técnicas como potenciais ferramentas de

diagnóstico de câncer de mama (Conceição et al., 2008).

6.4. Perspectivas

A partir dos resultados obtidos neste trabalho, abrem-se as seguintes

perspectivas:

• Medir o perfil de espalhamento nas regiões de WAXS e SAXS de uma maior

quantidade de tecidos mamários (normais e neoplásicos) procurando

englobar a maioria das neoplasias benignas e malignas encontradas

clinicamente, bem como verificar se o modo de preparação das amostras

pode interferir nos perfis medidos.

• Realizar medidas no intervalo de momento transferido entre

=2,2nm

-1

=5,1nm

-1

para verificar se existem estruturas ainda não identificadas, bem

como para se ter medidas em uma região que permite unir os perfis de

_______________________________________________________________________- 96 -

espalhamento obtidos em WAXS com os de SAXS, mostrando todas as

estruturas existentes nos tecidos mamários normais e neoplásicos.

• Os resultados preliminares obtidos da combinação simultânea das técnicas

de WAXS e SAXS sugerem a possibilidade de utilização desta combinação

como ferramenta de diagnóstico do câncer de mama. Por isso, seria

interessante tentar decompor o perfil de espalhamento em contribuições de

vários componentes e, a partir disso, elaborar um modelo de diagnóstico.

_______________________________________________________________________- 97 -

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