( PDF ) Estabelecimento de modelo animal de diabetes tipo II efeito da suplementação com óleo de peixe sobre a sensibilidade e responsividade à insulina

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ANDRESSA FRANZÓI MACHADO

ESTABELECIMENTO DE MODELO ANIMAL DE DIABETES TIPO II

Efeito da suplementação com óleo de peixe sobre a sensibilidade e

responsividade à insulina

CURITIBA

2008

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ANDRESSA FRANZÓI MACHADO

ESTABELECIMENTO DE MODELO ANIMAL DE DIABETES TIPO II.

Efeito da suplementação com óleo de peixe sobre a sensibilidade e

responsividade à insulina

Dissertação de Mestrado apresentada ao

Programa de Pós-graduação em Biologia

Celular e Molecular, área de concentração

Fisiologia, Setor de Ciências Biológicas,

Universidade Federal do Paraná como

requisito para obtenção do título de mestre.

Orientador: Prof. Dr. Luiz Cláudio Fernandes.

CURITIBA

2008

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Aos meus pais pela confiança,

motivação e amor

AGRADECIMENTOS

Primeiramente agradeço a meus pais pelo amor incondicional, por aceitar,

apoiar e confiar nas minhas escolhas, mesmo não concordando tanto assim com elas,

por nunca deixar de estar ao meu lado, pelos conselhos, por abdicar seus sonhos e

minha a presença pra dar vida aos meus sonhos. Sem vocês eu nunca teria chegado

até aqui, vocês são o alicerce da minha vida! Amo vocês!!

À toda a minha família, especialmente a minha vó Julieta que sempre

perguntava como estava meus estudos, mesmo sem entender o que eu fazia, mas

sempre me motivando e ao meu irmão Hálisson, pois sei exatamente que sua

dedicação também contribuiu para minha formação, obrigada mesmo!

Ao meu chefe, Luiz Cláudio, pela orientação, por me aceitar no seu

laboratório, sem nenhuma referência, por simplesmente acreditar que as pessoas são

capazes de aprender e por dar essa chance a todos, agarre-a quem quiser e puder.

Obrigada pelo maravilhoso ambiente de trabalho, por ensinar o que é um trabalho em

equipe, pois não sei se algum dia encontrarei um lugar de trabalho tão bom quanto o

“lab”, e se este é assim, com certeza é mérito seu que sabe cultivar e cuidar muito bem

dele. Ah, e obrigada por me ajudar nos meus experimentos sempre que precisei.

À todos amigos que fiz no “lab”: Ana, Carina, Carine, César, Dalton. Dani

Pequito, Diogo, Everson, Fabíola, Fernanda, Gleisson, Isabela, Jaisson, Kátia, Loli,

Luciana, Luis Alexandre, Marcelo, Rica, Sandro, Sérgio, Paulo, Pedro. Obrigada por me

auxiliar sempre e pelo agradável convívio todos os dias.

À Carine por ter me recebido no laboratório, pela paciência em me ensinar

técnicas, pela conversas, pelo apoio, pelos puxões de orelha sempre que necessários,

por me ajudar e ensinar a cuidar dos ratinhos, pela ajuda nos experimentos. Você sabe

o quanto foi importante nessa etapa da minha vida! Obrigada.

Ao Gleisson e ao Rica pela ajuda em TODOS os experimentos, sem vocês

nunca teria concluído este trabalho. Vocês foram essenciais, obrigada por me ensinar

as técnicas, tirar minhas dúvidas, por tornar os vários dias de experimentos mais

divertidos e menos cansativos pra mim. Gleisson, valeu pela disposição, por me ajudar

sábados, feriados, após chegar de viagem, apesar de tudo e de todas as “maizenadas”

no final tudo se acerta e desculpe por ter pedido pra você sacrificar os ratinhos. Rica,

valeu por toda ajuda nos experimentos e ainda por me ensinar a eletroforese e o

western blotting, pelas discussões sobre diabetes, modelo de diabetes, óleo de peixe,

etc, acho que fui até chata, mas com certeza você contribuiu para que eu entendesse

melhor tudo isso. Vocês foram ótimos, sabem que podem contar comigo!

Às minhas amigas boregas Carina, Fabíola e Ana por estarem presentes

diariamente comigo, pelas conversas, pelas risadas, por tirar minhas dúvidas sempre,

pelo auxilio nos experimentos, pelos conselhos e pela motivação na hora certa. Vocês

foram sensacionais, obrigada por tudo!

Ao Sandro e a Luciana também agradeço em especial pela ajuda, pelo

convívio e pela disposição sempre que puderam.

À Kátia e Fabi pelo auxílio no HPLC. À Kátia pelas dicas de Western

Blotting sempre bem-vindas. Ao Everson por estar disposto a ensinar, explicar e dividir

o que sabe e por me ajudar a entender e calcular o tal ITT.

Ao Jaisson, Marcelo e Luis Alexandre pela amizade, pela companhia no

café da manhã quase diário no R.U., por sempre estarem dispostos a ajudar. Valeu!!!

Ao estagiário e às ex-estagiárias (futuras mestres e boregas), César, Dani

e a Isa pelo auxílio sempre que puderam. Espero ter conseguido ensinar alguma coisa

pra vocês também e desculpe se deixei a desejar.

À Loli pela verdadeira amizade, pelos conselhos, pelas “causações” e pela

motivação.

À todos os funcionários do Biotério, em especial, ao Luizão que fez o

possível e o impossível pra que eu conseguisse conduzir meu trabalho de acordo com

meu cronograma.

À Bruna e Gi, pelo convívio diário em casa, por ter sido uma segunda

família, às vezes no papel de filhas, irmãs e até mesmo mães pra mim, rsrs. Obrigada

por me ouvir e aconselhar em qualquer situação, pelas risadas, pelas causações e

boreguisses. Bru, amiga querida, obrigada pela amizade sempre e por me ensinar a

cultivar minha auto-estima. Gi, que conheci de repente pra simplesmente dividir um

apartamento e se tornou uma grande amiga, obrigada por tudo e por me agüentar até

hoje. Adoro vocês!!

Às minhas amigas amadas da faculdade, Daia e Marina, valeu pelo apoio,

pelos conselhos, pelas conversas e incentivo. Daia, amiga querida, sua presença e

alegria fazem muita falta, obrigada por ter me acolhido no início do mestrado na sua

casa, senão não teria teto.

Aos meus queridos amigos Curitibanos, ou quase Curitibanos da

“Equipinteira”, valeu por todos os momentos de diversão, descontração, encontros,

viagens. Saibam que todos são muito importantes pra mim e a alegria e a amizade de

vocês fez com que resgatasse minhas forças pra iniciar cada semana de trabalho.

Agradeço em especial todas princesas amadas. A Pri, que desde o início torceu por

mim. À Malu, Juca, Fer, Ro, Marise, Vane pelos conselhos profissionais e pessoais. Ao

Dan por me ajudar a formatar as figuras e também a sua família por me receber em São

Paulo quando precisei ir até a USP em função dos experimentos. Sempre adoro, nunca

detesto essa “equipe”!!!

Aos meus amigos Maringaenses (pé-vermelhos): Thaís, Giovana, Márcia,

Aline, Paulo, Marcos, Cássius, Simone, Adriano, Emerson, Arieno, Lari e Maria Lígia

que foram essenciais e participaram deste processo, pelo incentivo e motivação.

Obrigada, adoro vocês!!

Também agradeço a Talita, Dani e Elen pelo convívio durante a faculdade,

por ter participado desta escolha que fiz na minha vida e me incentivado a estudar pra

prova do mestrado. À Elen por ter me aconselhado a procurar o Luiz como orientador.

Aos meus novos amigos do “Rio do Peixe”, Lari, Patrícia e João, obrigado

pelas dicas profissionais, pelo incentivo e motivação pra que eu nunca desista e

alcance meus objetivos. Lari, valeu por todas as conversas nas idas e vindas do Rio do

Peixe!!

Aos professores que me incentivaram na graduação, principalmente a

Dra. Elenice Murate por ter me orientado na iniciação cientifica, etapa que julgo

essencial pra conquista do mestrado.

Ao programa de Pós-Graduação de Biologia Celular e Molecular pela

oportunidade.

Ao CNPQ pelo apoio financeiro

À Deus, pois sei que não teria alcançado nada sem Ele.

“Se as coisas são inatingíveis..ora! Não é

motivo para não querê-las...

Que tristes os caminhos, se não fora

A presença distante das estrelas!”

Mario Quintana

SUMÁRIO

LISTA DE ABREVIATURAS............................................................................................ix

LISTA DE FIGURAS........................................................................................................xi

RESUMO........................................................................................................................xiv

ABSTRACT.....................................................................................................................xv

1 INTRODUÇÃO..............................................................................................................1

1.1 Diabetes Mellitus Tipo II.............................................................................................1

1.2 Resistência à Insulina.................................................................................................2

1.3 Modelo Animal Experimental de Diabetes Tipo II.......................................................7

1.4

ÁCIDOS GRAXOS...........................................................................................................9

1.4.1 Estrutura e metabolismo dos ácidos graxos.............................................................9

1.4.2 Ácidos graxos e diabetes tipo II.............................................................................12

2 JUSTIFICATIVA..........................................................................................................16

OBJETIVOS................................................................................................................17

MATERIAIS E MÉTODOS...........................................................................................18

4.1 Animais.....................................................................................................................18

4.2 Material.....................................................................................................................18

4.3 Indução do diabetes tipo II experimental..................................................................18

4.4 Protocolo experimental.............................................................................................19

4.5 Procedimentos Realizados para a Caracterização do Modelo Animal de Diabetes

tipo II........................................................................................................................19

4.5.1 Teste de tolerância intraperitonial à glicose (IGTT)...............................................20

4.5.2 Determinação da insulina plasmática...................................................................20

4.5.3 Determinação da glicose plasmática....................................................................21

4.5.4 Teste de tolerância à insulina (ITT)......................................................................21

4.6 Procedimentos Realizados para Avaliar o Efeito das Diferentes

Suplementações......................................................................................................22

4.6.1 Determinação dos lipídeos plasmáticos................................................................22

4.6.2 Isolamento e incubação do músculo sóleo ...........................................................22

4.6.3 Quantificação protéica do músculo sóleo............................................................23

4.6.4 Eletroforese em gel de poliacrilamida com Dodecil Sulfato de Sódio (SDS-

PAGE)........................................................................................................................24

4.6.5 Separação eletroforética de proteína..............................................................24

4.6.6 Imunoblotting...................................................................................................24

4.7 Análise Estatística..............................................................................................25

5 RESULTADOS.......................................................................................................26

5.1 Caracterização do Modelo de Diabetes..............................................................26

5.2 Efeito da Suplementação com Óleo de Peixe.....................................................30

5.2.1 Teste de tolerância intraperitonial à glicose......................................................30

5.2.2 Parâmetros bioquímicos...................................................................................32

5.2.3 Metabolismo da glicose no músculo esquelético dos ratos.............................36

5.2.3.1 Produção de lactato pelo músculo esquelético..........................................36

5.2.3.2 Síntese de [U-

C]-glicogênio a partir de [U-

C]-D-glicose pelo músculo

esquelético.................................................................................................41

5.2.4 Expressão das proteínas IRβ e Akt no músculo sóleo....................................46

6 DISCUSSÃO..........................................................................................................48

7 CONCLUSÃO.........................................................................................................63

REFERÊNCIAS..........................................................................................................64

ANEXO.......................................................................................................................75

LISTA DE ABREVIATURAS

AA - Ácido araquidônico

Acetil-Coa - Acetil coenzima

AKT - Proteína quinase B

ALA - Ácido graxo α- Linolênico

AL - Ácido linoléico

ANOVA - Análise de variância

ATP - Adenosina Trifosfato

CoA - Coenzima A

COX - Ciclooxigenase

DHA - Ácido graxo docosahexaenóico

EPA - Ácido graxo eicosapentaenóico

EPM - Erro padrão da média

FFQ - Fosfofrutoquinase

G-6-F - Glicose-6-fosfato

GLUT-4 - Transportador de glicose 4

GSK-3 - Glicogênio sintase quinase 3

HDL - Lipoproteína de alta densidade

HK - Hexoquinase

HMG-CoA - 3-hidroxi-3-metil coenzima

IDL - Lipoproteína de densidade intermediária

IGTT - Teste de tolerância intraperitonial à glicose

IRβ - Subunidade β do receptor da insulina

IRS - Substrato do receptor da insulina

IRS-1 - Substrato do receptor de insulina-1

IRS-2 - Substrato do receptor de insulina-2

i.p. - Intraperitonial

ITT - Teste de tolerância à insulina

LOX - Lipooxigenase

LT - Leucotrienos

Kitt - Queda da glicose expressa em porcentagem por minuto

LDL – Lipoproteínas de baixa densidade

MAPK - Proteína quinase ativada por mitógeno

n-3 - Ômega 3

n-6 - Ômega 6

n-9 - Ômega 9

NAD

- Nicotinamida Adenina Dinucleotídeo Oxidada

NADH - Nicotinamida Adenina Dinucleotídeo Reduzida

p.c. - Peso corporal

PDK-1 - Quinase depedente de fosfoinosítideos-1

PDH - Piruvato desidrogenase

PG - Prostaglandinas

PI3K - Fosfatidilinositol-3-quinase

PP-1 - Fosfoproteína fosfatase-1

PPAR α - Receptor nuclear α ativado pelos proliferadores de peroxissomos

SH2- Domínio 2 homólogo a Src

Shc - proteína adaptadora de ligação a fosfotirosina contendo SH2

SDS - Dodecil sulfato de sódio

SDS-PAGE - Gel de poliacrilamida com Docecil Sulfato de Sódio

SREBP-1c - Sterol regulatory element-binding proteins

STZ - Estreptozotocina

TX - Tromboxanas

VLDL - Lipoproteína de muito baixa densidade

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Via da sinalização da insulina. Fonte SALTIER & KAHN (2001,

adaptado)..................................................................................................4

Figura 2 - Mecanismo de resistência à insulina induzido por ácidos graxos no músculo

esquelético proposto por Randle. HK - hexoquinase; G-6-F - glicose-6-

fosfato; FFQ - fosfofrutoquinase; PDH - piruvato desidrogenase; CoA -

coenzima A. Fonte: SHULMAM (2000,

adaptado).......................................................................................................7

Figura 3 - Representação esquemática dos ácidos graxos poliinsaturados. Fonte:

ROSE & CONOLLY (1999, adaptado).........................................................10

Figura 4 - Síntese e metabolismo dos ácidos graxos n-3 e n-6. Fonte: CALDER (2001,

adaptado).....................................................................................................11

Figura 5 - Perfil do consumo de ácidos graxos da espécie humana ao longo dos anos.

Fonte: SIMOPOULOS (2002, adaptado)......................................................13

Figura 6 - Concentração plasmática de glicose dos ratos controle (C) e diabético (D) na

10º semana de vida......................................................................................26

Figura 7 - Glicemia dos ratos do grupo controle (C) e diabéticos (D) frente o teste de

tolerância intraperitonial à glicose................................................................27

Figura 8 - Concentração plasmática de insulina (ng/mL) em jejum dos ratos controle

Figura 9 - Concentração plasmática de insulina dos ratos dos grupos controle (C) e

diabético (D) obtida durante o teste de tolerância intraperitonial à

glicose..........................................................................................................29

Figura 10 - Porcentagem de variação da glicemia dos ratos controle (C), diabéticos

(D), diabético suplementados com óleo de peixe (DOP) ou gordura de

coco (DGC) após seis semanas de suplementação frente ao teste de

tolerância intraperitonial à glicose..............................................................31

Figura 11 - Concentrações plasmáticas de glicose (mg/dL) em jejum dos grupos

controle (C), suplementado com óleo de peixe (OP) ou suplementado com

xii

gordura de coco (GC), diabético (D), diabético suplementado com óleo de

peixe e diabético suplementado com gordura de coco (DGC) após seis

semanas de suplementação......................................................................33

Figura 12 - Concentrações plasmáticas de triacilglicerol (mg/dL) em jejum dos grupos

controle (C), suplementado com óleo de peixe (OP), suplementado com

gordura de coco (GC), diabético (D), diabético suplementado com óleo de

peixe e diabético suplementado com gordura de coco (DGC) após seis

semanas de suplementação......................................................................34

Figura 13 - Concentrações plasmáticas de colesterol (mg/dL),em jejum, dos grupos

controle (C), suplementado com óleo de peixe (OP), suplementado com

gordura de coco (GC), diabético (D) , diabético suplementado com óleo de

peixe (DOP) e diabético suplementado com gordura de coco

(DGC).........................................................................................................35

Figura 14 - Produção de lactato pelos músculos sóleos incubados dos ratos controle

de coco (GC) na ausência e presença de 100 µU/mL, 10000 µU/mL de

insulina.......................................................................................................37

Figura 15 - Produção de lactato pelos músculos sóleos incubados dos ratos controle

de insulina..................................................................................................38

Figura 16 - Produção de lactato pelos músculos sóleos incubados dos ratos diabético

(D), diabético suplementado com óleo de peixe (DOP) e diabético

suplementado com gordura de coco (DGC) na ausência e presença de

100 µU/mL e 10000 µU/mL de insulina.....................................................40

Figura 17 - Síntese de glicogênio a partir de [U-

C]-D-glicose pelos músculos sóleos

incubados dos ratos controle (C) e suplementado com óleo (OP) de peixe

e suplementado com gordura de coco (GC) na ausência e na presença de

100 µU/mL, 10000 µU/mL de insulina......................................................42

xiii

Figura 18 - Síntese de glicogênio a partir de [U-

C]-D-glicose pelos músculos sóleos

incubados dos ratos controle (C) e diabético (D) na ausência e presença

de 100 µU/mL, 10000 µU/mL de insulina..................................................43

Figura 19 - Síntese de glicogênio a partir de [U-

C]-D-glicose pelos músculos sóleos

incubados dos ratos diabético (D), diabético suplementado com óleo de

peixe (DOP) e diabético suplementado com gordura de coco (DGC) na

ausência e na presença de 100 µU/mL, 10000 µU/mL de

insulina.......................................................................................................45

Figura 20 - Expressão da proteína IRβ no músculo sóleo dos ratos dos grupos controle

(C), suplementado com óleo de peixe (OP), suplementado com gordura de

coco (GC), diabético (D), diabético suplementado com óleo de peixe

(DOP) e diabético suplementado com gordura de coco

(DGC).........................................................................................................46

Figura 21 - Expressão da proteína AKT no músculo sóleo dos ratos dos grupos controle

(C), suplementado com óleo de peixe (OP), suplementado com gordura de

coco (GC), diabético (D), diabético suplementado com óleo de peixe e

diabético suplementado com gordura de coco

(DGC).........................................................................................................47

xiv

RESUMO

Diabetes tipo II é a forma mais prevalente de diabetes e depende de fatores genéticos e

ambientais, tais como o consumo de dietas ricas em gordura, principalmente ácidos

graxos saturados e sedentarismo. Pacientes com diabetes tipo II apresentam

hiperglicemia e dislipidemia como resultado de deficiências na secreção e ação da

insulina, ou seja, disfunção da célula β pancreática e resistência à insulina. Ácidos

graxos poliinsaturados ω- 3 são essenciais para o crescimento e desenvolvimento

normais e podem ter papel importante na prevenção e tratamento do diabetes e

resistência à insulina pelo aumento da fluidez da membrana e redução na concentração

plasmática de triacilglicerol. A globalização tem contribuído para o aumento de dietas

ricas em ácidos graxos saturados, trans e baixo consumo de ácidos graxos

poliinsaturados e, consequentemente aumento da prevalência de obesidade e diabetes

tipo II. Nosso estudo investigou o efeito da suplementação com óleo de peixe, rico em

ácidos graxos poliinsaturados ω- 3, sobre parâmetros bioquímicos, tolerância à glicose

e sensibilidade e responsividade do músculo sóleo na ausência ou presença de

insulina, pela determinação da produção de lactato e síntese de glicogênio de ratos

diabéticos. Diabetes tipo II experimental foi induzido através de injeção intraperitonial de

estreptozotocina (100 mg/kg p.c.) em ratos wistar com dois dias de vida. Após 10

semanas, os ratos foram divididos em seis grupos: ratos controles ou diabéticos

alimentados com ração regular e não suplementados (C ou D), alimentados com ração

regular e suplementados com óleo de peixe (OP ou DOP), alimentados com ração

regular e suplementados com gordura de coco (GC ou DGC). Após, os ratos foram

suplementados diariamente com óleo de peixe ou gordura saturada (1g/kg p.c.) durante

seis semanas. O diabetes experimental resultou em hiperglicemia, intolerância à

glicose, baixa insulinemia basal, provável alteração na secreção de insulina na

presença de glicose, resistência à insulina, hipertriacilglicerolemia, hipercolesterolemia

e redução da produção de lactato e síntese de glicogênio na presença de insulina, o

que significa menor sensibilidade e responsividade do músculo sóleo comparado com à

dos animais não diabéticos. Gordura de coco aumentou a concentração plasmática de

triacilglicerol e reduziu a sensibilidade e responsividade do músculo sóleo na presença

de insulina para os animais não diabéticos. Óleo de peixe reduziu a concentração

plasmática de colesterol para os animais não diabéticos e aumentou a produção de

lactato na presença de insulina, ou seja, melhorou a sensibilidade do músculo sóleo,

mas não alterou a síntese de glicogênio para os ratos diabéticos. Nossos dados

sugerem que a suplementação com óleo de peixe reduz a lipidemia nos animais não

diabéticos e aumenta a sensibilidade à insulina no diabetes tipo II.

ABSTRACT

Type II diabetes is the most prevalent form of diabetes and its development is

associated to genetic and environmental factors, such as consumption of energy-dense

diets high in fat, particularly saturated fatty acids and sedentary lifestyle. Patients with

type 2 diabetes have hyperglycemia and dyslipidemia as a result of deficiencies in both

insulin secretion and insulin action, due to β-cell dysfunction and insulin resistance.

Polyunsaturated fatty acids ω- 3 are essential for normal growth and development and

may play an important role in the prevention and treatment of diabetes and insulin

resistance by increasing membrane fluidity and decreasing plasma triacylglicerol

concentrations. Globalization have contribute to increased consumption of diets rich in

saturated and trans fatty acids and low consumption of polyunsaturated fatty acids and

which has been associated to obesity and prevalence of type II diabetes. The present

study investigated the effect of supplementation with fish oil, rich in ω- 3 polyunsaturated

fatty acids on blood biochemical parameters, glucose tolerance and sensitivity and

responsivity of skeletal soleus muscle to insulin in diabetic rats. Experimental type II

diabetes was induced by intravenous injection of streptozotocin (100 mg/kg b.c.) in 2

days old male Wistar rats .After 10 weeks, Wistar rats were divided into six groups: rats

control or diabetic were fed with regular chow (C or D), fed regular chow and

supplemented with coconut fat (GC or DGC) or fish oil (OP or DOP). Then, rats were

daily supplemented with fish oil or coconut fat (1g/kg b.c.). Experimental diabetes

resulted in hyperglycemia, glucose intolerance, lower plasma insulin concentrations,

impaired of insulin secretion at presence of glucose, insulin resistance,

hypertriacylglycerolemia, hypercholesterolemia and reduced lactate production and

glycogen syntesis at presence of insulin meaning sensitivity and responsivity of skeletal

soleus muscle decreased when compared to non-diabetic rats. Coconut fat increased

plasma triacylglycerol concentrations and reduced sensitivity and responsivity of skeletal

soleus muscle at presence of insulin to non-diabetic rats. Fish oil decreased plasma

cholesterol concentrations in non-diabetic rats and increased the lactate production at

presence of insulin which improved sensitivity of skeletal soleus muscle, but not altered

the glycogen syntesis of diabetic rats. Our data suggest that FO supplementation

reduced lipidemia to non-diabetic rats and increased insulin sensitivity in type II

diabetes.

INTRODUÇÃO

1.1 Diabetes Mellitus Tipo II

Atualmente, o diabetes tipo II é a maior causa de morbidade e mortalidade

em todo o mundo (PETERSEN & SHULMAN, 2006). Estima-se que aproximadamente

5% da população global é diabética, sendo 85% a 95% destes atribuídos ao diabetes

mellitus não-insulino dependente ou diabetes tipo II (AVRAMOGLU et al., 2006). Em

2003, segundo a Federação Internacional do Diabetes, esta doença acometeu

aproximadamente 194 milhões de pessoas e poderá aumentar para 200 a 300 milhões

em 2025 (FUJIMOTO, 2000; PETERSEN & SHULMAN, 2006).

O diabetes tipo II é uma doença multifatorial, resultado da combinação de

fatores ambientais e da predisposição genética, sendo algumas famílias e/ou etnias

mais suscetíveis a esta doença. O sedentarismo e as dietas com alta proporção de

carboidratos refinados e gorduras saturadas são os principais fatores ambientais

responsáveis pelo aumento do sobrepeso e da obesidade e, conseqüentemente, do

diabetes tipo II, uma vez que a gordura corporal, principalmente na região abdominal é

o principal fator de risco para o diabetes tipo II (FUJIMOTO, 2000; LEAHY, 2005). Em

função desses fatores, apesar de não ser considerada uma doença da infância, a

incidência do diabetes tipo II aumentou na população pediátrica persistindo até a vida

adulta, resultando em alta prevalência de diabetes tipo II e doenças cardiovasculares

em adultos jovens (BAO et al., 1996; FREEDMAN et al., 2001; SINHA et al., 2002;

AVRAMOGLU et al., 2006).

Existem várias classificações para o diabetes mellitus, sendo as principais:

o diabetes mellitus tipo I e o diabetes mellitus tipo II. O tipo I é resultado da destruição

das ilhotas de Langerhans do pâncreas e ocorre em 5 a 10% dos casos. Já o tipo II é a

mais comum e resulta de defeitos da secreção e/ou ação da insulina. Ambos os tipos

de diabetes mellitus apresentam complicações semelhantes, porém são diferentes em

relação aos processos patogênicos (SALTIEL, 2001).

O diabetes tipo II também causa complicações crônicas como retinopatias,

nefropatias e doenças do sistema circulatório. Além disso, o diabetes tipo II e a

resistência à insulina encontram-se freqüentemente associados com a hipertensão e as

dislipidemias, aumentando a incidência da síndrome metabólica, os riscos para

aterosclerose e doenças coronarianas (STOECKLI & KELLER, 2004; AVRAMOGLU et

al., 2006).

Inicialmente, a fisiopatologia do diabetes tipo II envolve defeitos na

sensibilidade à insulina nos tecidos periféricos, especialmente no fígado, tecido adiposo

e muscular, seguidos da redução na secreção de insulina, resultado da disfunção

progressiva do pâncreas (PETERSEN & SHULMAN, 2002). Além disso, o fígado

aumenta a produção de glicose (LEAHY, 2005). Assim, os indicadores do diabetes tipo

II incluem menor tolerância à glicose, hiperglicemia, hiperinsulinemia, reservas de

glicogênio reduzidas, conseqüência do comprometimento da captação da glicose

(SALTIEL, 2001; AVRAMOGLU et al., 2006).

1.2 Resistência à Insulina

A insulina é um potente hormônio anabólico, secretado pelas células β das

ilhotas de Langerhans do pâncreas em resposta ao aumento da concentração de

glicose e aminoácidos no sangue após as refeições. É composta por duas cadeias

polipeptídicas (cadeias A e B) ligadas entre si por pontes dissulfeto e promove a síntese

e armazenamento de carboidratos, lipídeos e proteínas, e inibe a quebra e liberação

destes para a corrente sangüínea (BELL et al, 1990; PESSIN & SALTIER, 2000;

SALTIER & KAHN, 2001). O comprometimento da ação da insulina nos tecidos

periféricos caracteriza a resistência ao hormônio (FUJIMOTO, 2000; PETERSEN &

SHULMAN, 2002).

Geralmente, a resistência à insulina desenvolve-se como primeiro

indicador do diabetes tipo II (AVRAMOGLU et al., 2006). No entanto, o pâncreas pode

compensar a resposta reduzida à insulina pelo aumento da secreção deste hormônio,

na tentativa de controlar a concentração de glicose no sangue. Se não houver

tratamento, ocorre falência das células β do pâncreas, resultando na menor produção

de insulina e a manifestação do diabetes tipo II (SALTIEL, 2001; PETERSEN &

SHULMAN, 2002; AVRAMOGLU et al., 2006). Ainda, a insensibilidade à insulina reduz

a supressão da lipólise no tecido adiposo, aumentando o fluxo de ácidos graxos livres e

aumento da secreção da lipoproteína de muito baixa densidade (VLDL) hepática,

causando hipertriacilglicerolemia e redução na concentração plasmática das

lipoproteínas de alta densidade (HDL) (AVRAMOGLU et al., 2006). A desregulação dos

lipídeos plasmáticos e o aumento no conteúdo de triacilglicerol intramuscular parecem

estar diretamente relacionados com a resistência à insulina por alterar mecanismos da

via de sinalização da insulina (PAN et al., 1997; MANCO et al., 2000; AVRAMOGLU et

al., 2006; DEY et al, 2006).

Em condições metabólicas normais, a ação biológica da insulina inicia-se

com a ligação do hormônio no receptor da insulina (Figura 1). Este receptor é uma

proteína transmembrana heterodimérica que pertence à família dos receptores de

fatores de crescimento e diferenciação celular (WHITE, 1997), com atividade intrínseca

de tirosina quinase. É composto por duas subunidades α (extracelulares e responsáveis

pela ligação da insulina) e duas subunidades β (intracelulares e responsáveis pela

atividade tirosina quinase) (NYSTROM & QUON, 1999; SALTIER & KAHN, 2001; DEY

et al, 2006;). A subunidade α inibe a atividade da tirosina quinase da subunidade β,

sendo este efeito inibido com a ligação da insulina no receptor (BALLOTI et al., 1989;

KUBAR & ROCHET, 1990). Com isso, ocorre autofosforilação dos resíduos de tirosina

específicos na subunidade β do receptor da insulina (IRβ), que alteram a conformação e

permitem a fosforilação de proteínas intracelulares, como os substratos para o receptor

da insulina-1,-2,-3,-4 (IRS-1,-2,-3,-4), proteína adaptadora de ligação a fosfotirosina

contendo domínio 2 homólogo a Src (SH2) (Shc), entre outros, que ativam várias outras

vias de sinalização (PRONK et al., 1993; SALTIER & KAHN, 2001; MUOIO &

NEWGARD, 2008).

Figura 1 – Via da sinalização da insulina. Fonte: SALTIER & KAHN (2001, adaptado).

A família dos IRS parece ter um efeito particular no controle da

homeostase metabólica, sendo o IRS-1 um mediador chave da captação de glicose

estimulada pela insulina e ativação de vias anabólicas no músculo e tecido adiposo, no

entanto no fígado estas ocorrem pelo IRS-2. A fosforilação do IRS-1 permite sua

associação com a subunidade regulatória p85 da enzima fosfatidil inositol 3- quinase

(PI3K) e esta interação recruta a subunidade catalítica p110 da PI3K para a membrana

plasmática, resultando na conversão do fosfatidil inositol-4, 5-bifosfato para fosfatidil

inositol -3, 4 ,5-trifosfato, o que permite a propagação de sinais mediados por esta

enzima, como a ativação da quinase dependente de fosfoinositídeos-1 (PDK-1) e da

Akt (ou proteína quinase B) (KAPELLER & CANTLEY, 1994; SALTIER & KAHN, 2001;

MUOIO & NEWGARD, 2008).

A fosforilação da Akt regula várias respostas fisiológicas da insulina como

a translocação do transportador de glicose (GLUT)-4 para a membrana plasmática, a

síntese de glicogênio e outros efeitos metabólicos (ASANO et al., 2000; MUOIO &

NEWGARD, 2008). A AKT fosforila e inativa a glicogênio sintase quinase 3 (GSK-3),

responsável pela fosforilação e inativação da enzima glicogênio sintase (CROSS et al,

1995; MUOIO & NEWGARD, 2008) e também ativa a proteína ativadora guanosina

trifosfatase (GTPase) AS160 Rab que facilita a translocação do GLUT-4 (MUOIO &

NEWGARD, 2008).

Outra via ativada pelo IRS, através dos domínios homólogos ao Src-2

(SH2) é a cascata de proteína quinase ativada por mitógeno (MAPK) responsável pela

regulação da expressão de alguns genes, crescimento e diferenciação celular

(SALTIER & KAHN, 2001). Alguns estudos sugerem que a via da MAPK contribua para

a translocação do GLUT-4 para membrana plasmática (FURTADO et al., 2003;

THONG et al., 2005) e para o aumento da síntese de glicogênio através da ativação da

fosfoproteína fosfatase-1 (PP-1), responsável pela desfosforilação e ativação da enzima

glicogênio sintase (YANO et al. 1993).

A alteração na ativação de qualquer proteína envolvida na sinalização

necessária para as ações da insulina pode causar resistência ao hormônio.

Concentrações elevadas de ácidos graxos livres no plasma estão relacionadas com o

aumento do conteúdo de metabólitos lipídicos, como acil-CoA, diacilglicerol e ceramidas

e alteração na composição fosfolipídica da membrana plasmática que parecem resultar

em defeitos na via de sinalização da insulina (SHULMAN et al. 2000; PETERSEN et

al., 2003; MUOIO & NEWGARD, 2008), envolvendo a redução da fosforilação do

receptor da insulina, IRS-1, Akt e PI3K, alterando a translocação do GLUT-4,

comprometendo a captação da glicose e ativação das vias anabólicas (DRESNER et

al., 1999; AVRAMOGLU et al., 2006; DEY et al, 2006).

Em adição, o aumento dos ácidos graxos parece competir com a glicose,

reduzindo o metabolismo dos carboidratos. Em 1963, Randle e colaboradores

descreveram o ciclo ácido graxo-glicose (Figura 2), também conhecido como ciclo de

Randle. Foi mostrado que o aumento do fluxo de ácidos graxos, em músculo cardíaco e

diafragmático de ratos, elevava a produção de acetil-coenzima (Co)A e nicotinamida

adenina dinucleotídeo reduzida (NADH) mitocondrial pela β- oxidação, levando a

inibição do complexo piruvato desidrogenase, resultando no aumento da concentração

de citrato. Assim, a alta concentração de citrato e ATP inibiam a atividade da

fosfofrutoquinase, levando redução na via glicolítica. Consequentemente, o conteúdo de

glicose-6-fosfato elevava-se inibindo a hexoquinase, causando acúmulo de glicose

intracelular, comprometendo a captação desta (RANDLE et al., 1963; RANDLE et

al.,1994; SHULMAN, 2000).

É fato que a concentração elevada de ácidos graxos no plasma é

responsável pela perda da sensibilidade à insulina, porém, ainda existem controvérsias

sobre o mecanismo de ação envolvido nesta resposta. Alterações na via de sinalização

da insulina e o ciclo de Randle parecem participar deste fenômeno (DEY et al, 2006).

Figura 2 - Mecanismo de resistência à insulina induzido por ácidos graxos no músculo

esquelético proposto por Randle. HK - hexoquinase; G-6-F - glicose-6-

fosfato; FFQ - fosfofrutoquinase; PDH - piruvato desidrogenase; CoA -

coenzima A. Fonte: SHULMAM (2000, adaptado).

1.3 Modelo Animal Experimental de Diabetes Tipo II

O modelo animal de diabetes tipo II induzido por estreptozotocina em rato

neonatal foi descrito pela primeira vez na década de 80. Este modelo baseia-se na

destruição das células β do pâncreas seguida pela regeneração destas células e

intolerância à glicose (SARTORETTO et al., 2005).

A administração de estreptozotocina em ratos adultos causa uma rápida e

irreversível destruição das células β pancreáticas resultando em severa síndrome

diabética dependente de insulina. Todavia, quando a estreptozotocina é administrada

no período neonatal via intraperitoneal, o efeito agudo da destruição das células β do

pâncreas é seguido pela regeneração espontânea destas células e a concentração de

glicose retorna ao normal dentro de duas semanas. Porém, o distúrbio da resposta da

insulina à glicose permanece, promovendo o modelo de diabetes tipo II (BACOVÁ et al.,

2005).

As células β pancreáticas que não foram destruídas podem aumentar a

secreção de insulina e manter o nível normal da glicemia, evitando a hiperglicemia. No

entanto, estas células podem sofrer exaustão e consequentemente reduzir sua função,

levando ao aumento dos níveis de glicose no sangue (TAKADA et al., 2007).

Este modelo induz a concentração de insulina no sangue levemente

reduzida, assim como concentração de glicose plasmática um pouco elevada e menor

conteúdo de insulina pancreática. O padrão de liberação de insulina encontrado nestes

ratos é qualitativamente similar ao do rato Goto-Kakizaki, que é um modelo genético de

diabetes tipo II não obeso (ARULMOZHI et al., 2004). Além disso, foi demonstrado que

a injeção de estreptozotocina no período neonatal, induz, em ratos adultos, defeitos

similares aos encontrados em humanos com diabetes tipo II, tais como redução na

secreção de insulina induzida por glicose, aumento moderado na concentração de

glicose de jejum, intolerância oral à glicose e resistência moderada à insulina (ANGEL

et al., 1996).

Existem evidências de que a severa redução nas células β do pâncreas

obtidas de pacientes com diabetes tipo II ou de animais, após a injeção de

estreptozotocina, não está associada com resistência severa à insulina. Porém, alguns

estudos com este modelo de diabetes II mostraram que a utilização da glicose, induzida

por hiperinsulinemia, por toda a massa corporal foi significantemente reduzida e a

produção hepática de glicose foi menos eficientemente suprimida por concentração

máxima de insulina, indicando que a resistência à insulina estava presente in vivo nos

tecidos periféricos e no fígado (ARULMOZHI et al., 2004). Em adição, TAKADA et al.

(2007) mostraram que este modelo de diabetes apresenta um estado de resistência à

insulina junto com dano à ilhota pancreática. Os animais neonatos, diabetizados com

estreptozotocina apresentaram redução da ligação da insulina ao receptor, menor

captação e oxidação de glicose pelos adipócitos estimulados com insulina e menor

conteúdo de insulina nas ilhotas pancreáticas.

Sabe-se que nenhum modelo animal de diabetes é idêntico à síndrome

humana. Nem mesmo, os modelos animais de diabetes tipo II genéticos disponíveis

simulam exatamente a doença nos humanos. No entanto, o modelo de diabetes tipo II

induzido por estreptozotocina em rato neonatal tem muitas vantagens sobre os outros

modelos e é considerado um modelo experimental adequado de diabetes mellitus tipo II

(ARULMOZHI et al., 2004).

1.4

ÁCIDOS GRAXOS

1.4.1 Estrutura e metabolismo dos ácidos graxos

Os ácidos graxos são ácidos carboxílicos compostos por longa cadeia de

hidrocarbonetos com um grupo carboxila numa extremidade e um metila na outra

(CALDER, 2005). Estes podem ser saturados ou insaturados, dependendo do grau de

saturação da molécula. Na ausência de duplas ligações são classificados como

saturados e na presença de duplas ligações, insaturados (RUXTON et al, 2004). Os

ácidos graxos são adquiridos da dieta, principalmente como triacilgliceróis, e são

armazenados para reserva energética, transformados em hormônios, transportadores,

mensageiros celulares e constituintes da membrana celular (ALBERTS et al, 1994).

Existem três importantes famílias de ácidos graxos poliinsaturados

denominados de: ômega 3 (n-3), ômega 6 (n-6) e ômega 9 (n-9), sendo que a

nomenclatura se refere à posição da primeira dupla ligação a partir do carbono ômega

no terminal metila da cadeia de hidrocarboneto (Figura 3) (DOMMELS et al, 2002;

CALDER, 2005).

Figura 3 – Representação esquemática dos ácidos graxos poliinsaturados. Fonte:

ROSE & CONOLLY (1999, adaptado).

O ácido graxo α-linolênico (ALA; 18:3n-3) é precursor do ácido

eicosapentaenóico (EPA; 20:5n-3) e do docosahexaenóico (DHA 22:6n-3) e o ácido

linoléico (AL;18:2n-6) é precursor do ácido araquidônico (AA; 20:4n-6). Os ALA e AL

possuem efeitos opostos e são considerados essenciais para a dieta humana, pois não

podem ser sintetizados pelo organismo humano e nem interconvertidos, devido a

ausência das enzimas dessaturases ∆12 e ∆15 (TAPIERO et al, 2002; RUXTON,

2004;).

Na biossíntese dos ácidos graxos n-3 e n-6, estes compartilham a mesma

enzima dessaturase (∆-6-dessaturase), e portanto competem pela mesma via

metabólica. A ∆-6- dessaturase tem preferência pelo ácido α-linolênico, todavia altas

concentrações de ácido linoléico podem inibir a conversão do ALA em EPA e DHA,

reduzindo a quantidade destes ácidos graxos (RUXTON, 2004). (Figura 4)

Figura 4 – Síntese e metabolismo dos ácidos graxos n-3 e n-6. Fonte: CALDER (2001,

adaptado).

Tanto o ácido araquidônico (AA) quanto o eicosapentaenóico (EPA) são

precursores de eicosanóides, que atuam como moduladores químicos em muitos

processos biológicos, tais como a resposta inflamatória, agregação plaquetária,

permeabilidade vascular e formação de interleucinas. Pórem, os eicosanóides das

famílias n-6 e n-3 têm efeitos diferentes e opostos. Os ácidos graxos n-6 possuem

papel inflamatório, capacidade de agregação plaquetária, atividade vasoconstritora e

alta potência como agentes quimiotáxicos. Os ácidos graxos n-3 tendem a ter

propriedades benéficas tais como antiinflamatórias, antiarrítmicas e de redução da

concentração de lipídios no sangue (CALDER, 2001).

Além disso, os ácidos graxos poliinsaturados fazem parte dos

fosfolipídeos das membranas biológicas (TAPIERO et al, 2002; RUXTON, 2004). As

membranas celulares são bicamadas lipídicas que separam a célula do espaço

extracelular das organelas intracelulares. Estas permitem a manutenção de gradientes

iônicos, a diferença do potencial e modulam a passagem de hormônios, substratos,

nutrientes e sinais intracelulares (PAN et al.,1995). O maior componente das

membranas plasmáticas, representando aproximadamente 60%, são os fosfolipídeos e

servem como mediadores importantes dos eventos nucleares regulando a expressão

gênica e específica envolvida no metabolismo da glicose e dos lipídeos e adipogênese

(PAN et al., 1995; HELGE, et al., 2001; LOMBARDO & CHICCO, 2006).

As principais fontes dos ácidos graxos ômega-3 são os peixes, óleo de

peixe, canola, linhaça, nozes e as folhas verdes escuras. Já o ômega-6 compõe

principalmente os óleos vegetais e sementes, como milho, girassol, soja, entre outros

(MANCO et al, 2004; CALDER, 2005) e as gorduras saturadas são os ácidos palmíticos

e esteáricos, encontrados principalmente nas carnes de porco, carneiro e boi, e os

ácidos mirísticos e láuricos, presentes no coco (MANCO et al, 2004).

1.4.2 Ácidos graxos e diabetes tipo II

A globalização tem contribuído para o aumento do consumo de gorduras e

de dietas com alta densidade energética, particularmente ricas em ácidos graxos

saturados (MANCO et al, 2004). O estudo evolutivo da dieta humana (Figura 5) mostrou

que nossos ancestrais, do período Paleolítico, consumiam grande quantidade de

agentes antioxidantes, menor quantidade de ácidos graxos saturados e gordura trans e

a mesma razão de ácidos graxos n-6:n-3 quando comparado com as dietas atuais.

Estimativas mostram que a razão n-6:n-3 está 20:1, sendo o recomendado 4:1

(SIMOPOULOS, 1999).

Após a revolução industrial, o consumo de ácidos graxos n-6 e gorduras

saturadas aumentou, elevando o valor energético total das dietas ocidentais, e ainda

houve decréscimo na ingestão de ácidos graxos n-3 e antioxidantes. A alta ingestão de

ácidos graxos n-6 ocorreu devido ao aumento do consumo dos óleos vegetais de milho,

sementes de girassol, algodão e soja, devido à recomendação indiscriminada de

substituir ácidos graxos n-6 por gorduras saturadas, para reduzir o colesterol sérico e

pelo desenvolvimento da tecnologia na extração de óleo vegetais (SIMOPOULOS,

1999).

Figura 5 – Perfil do consumo de ácidos graxos da espécie humana ao longo dos anos.

Fonte: SIMOPOULOS (2002, adaptado).

Os ácidos graxos n-3 são essenciais para o crescimento e

desenvolvimento normal e são importantes na prevenção e tratamento da doença

arterial coronariana, hipertensão, diabetes, doenças inflamatórias, desordens auto

imunes e câncer (JUMP, 2002; SIMOPOULOS, 2002). Estes benefícios são

comprovados por estudos epidemiológicos que reportam a baixa prevalência da

intolerância à glicose, diabetes tipo II, infarto do miocárdio, inflamação crônica, entre

outras, em populações que consomem grandes quantidades de ácidos graxos ômega 3.

Por outro lado, as dietas ricas em gorduras saturadas e com baixo teor de ácidos

graxos n-3 estão associadas com o aumento da adiposidade, aumento do risco de

diabetes tipo II, redução da sensibilidade à insulina no músculo esquelético e distúrbios

no metabolismo da glicose (LICHTENSTEIN & SCHWAB, 2000; MANCO et al, 2004;

NETTLETON & KATZ, 2005). Sendo assim, entre outros fatores, a gordura dietética

tem importante papel na indução da resistência à insulina. Estudos experimentais têm

mostrado que a quantidade e/ou o tipo de ácidos graxos ingeridos alteram a

sensibilidade à insulina nos seus tecidos alvos (VESSBY, et al 2000; TAOUIS et al,

2002).

Dietas ricas em ácidos graxos modificaram a ação da insulina em ratos,

porém quando os lipídeos provinham do óleo de peixe houve prevenção da resistência

à insulina. (TAOUIS et al, 2002). Ainda, a substituição dos ácidos graxos saturados

pelos poliinsaturados mudou o padrão característico dos lipídeos séricos encontrados

no estado de resistência à insulina (VESSBY, et al 2000). No entanto, os mecanismos

do efeito protetor dos ácidos graxos n-3 não estão totalmente esclarecidos. Estes

efeitos dietéticos do ômega 3 podem ocorrer devido à incorporação dos ácidos graxos

nos fosfolipídeos das membranas dos tecidos alvos da insulina e também por seu efeito

hipolipidêmico, ou seja, redução do conteúdo de triacilgliceróis (THOMPSON et al.,

2000; TAOUIS et al., 2002; LOMBARDO & CHICCO, 2006)..

As propriedades das membranas como a fluidez, permeabilidade e

ancoragem das proteínas de membrana dependem da composição dos ácidos graxos

dos fosfolipídeos (HELGE, et al., 2001; HULBERT et al., 2005). Borkman et al. (1993)

mostraram pela primeira vez a associação entre a composição de ácido graxos dos

fosfolipídeos de membrana no músculo esquelético e a sensibilidade à insulina em

humanos, ou seja, as proporções de ácidos graxos poliinsaturados nos fosfolipídeos de

membrana do músculo estavam diretamente relacionado com a sensibilidade à insulina.

Quantidades menores de ácidos graxos poliinsaturados na membrana

podem diminuir o processo de consumo de energia da célula através da redução do

fluxo de íons e prótons, energia necessária para manter a homeostase iônica. Este

processo contribui para o metabolismo basal da célula, assim membranas com menores

proporções de ácidos graxos poliinsaturados reduzem o metabolismo celular. Isto pode

contribuir para o aumento do estoque da gordura corporal, inclusive no fígado e no

músculo esquelético, ambos críticos para a ação da insulina (HULBERT et al., 2005).

A composição dos ácidos graxos das membranas também pode

influenciar a ação da insulina, alterando as proteínas intracelulares específicas da

sinalização da insulina, através da modulação da afinidade do receptor e da

translocação dos transportadores de glicose para a membrana (HULBERT et al., 2005).

No músculo de rato, as alterações na composição da membrana causadas pelos ácidos

graxos n-3 afetaram os receptores da insulina, o IRS-1 e a PI3K (LOMBARDO &

CHICCO, 2006; TAOUIS et al, 2002). Em um modelo animal espontâneo de diabetes, a

suplementação com óleo de peixe por aproximadamente 18 semanas preveniu o

desenvolvimento da resistência à insulina, provavelmente pela maior expressão do

RNAm para GLUT-4 mediado pela alteração na composição da membrana

(LOMBARDO & CHICCO, 2006).

Além disso, segundo LICHTENSTEIN & SCHWAB (2000), o tipo de ácidos

graxos da membrana pode modificar a atividade das enzimas associadas com o

metabolismo da glicose.

2 JUSTIFICATIVA

O diabetes tipo II é uma doença metabólica associada a complicações

crônicas como retinopatias, nefropatias e doenças do sistema circulatório

(AVRAMOGLU et al., 2006). A fisiopatologia do diabetes envolve menor sensibilidade à

insulina nos tecidos alvo, seguido da produção reduzida de insulina como resultado da

disfunção progressiva da célula β pancreática (PETERSEN & SHULMAN, 2002).

Estudos epidemiológicos têm reportado baixa prevalência do diabetes tipo

II e da intolerância à glicose em populações que consomem grandes quantidades de

ácidos graxos n-3, encontrados principalmente no peixe e óleo de peixe (NETTLETON

& KATZ, 2005). Estudos in vivo também apresentaram resultados positivos em relação

à ação da insulina no músculo de ratos suplementados com óleo de peixe (TAOUIS et

al, 2002; LOMBARDO & CHICCO, 2006;).

A maioria dos estudos experimentais é realizada no músculo esquelético,

o maior tecido alvo da insulina e mostram que a redução das insaturações nos

fosfolipídeos da membrana está diretamente relacionada com a redução da ação da

insulina (HULBERT et al., 2005). Contudo, o mecanismo pelo qual o ômega 3 melhora

sensibilidade à insulina no músculo esquelético não está totalmente esclarecido, mas

pode envolver mudanças no metabolismo da glicose e também dos ácidos graxos,

interferência na sinalização da insulina, redução na concentração de ácidos graxos

livres no plasma, entre outros.

De acordo com PETERSEN & SHULMAN (2002), o metabolismo da

glicose está comprometido no indivíduo diabético. Danos na síntese de glicogênio, na

atividade da hexoquinase e no transporte da glicose são características encontradas no

diabetes tipo II.

Desta forma, torna-se necessário avaliar a ação dos ácidos graxos ômega 3

sobre a sensibilidade e responsividade à insulina no músculo sóleo de ratos com

diabetes tipo II, em diferentes etapas do metabolismo da glicose e investigar o possível

mecanismo de ação.

OBJETIVOS

Consolidar um modelo animal de diabetes tipo II e investigar o efeito da

suplementação com óleo de peixe sobre parâmetros bioquímicos sanguíneos e a

sensibilidade e responsividade à insulina do músculo sóleo de ratos diabéticos. Para

alcançar estes objetivos foram determinados:

• Α concentração de glicose plasmática em jejum antes e após a suplementação com

óleo de peixe;

• O teste de tolerância intraperitonial à glicose (IGTT) antes e após o período

experimental;

• A concentração de insulina plasmática, em jejum, e durante o IGTT nos ratos antes da

suplementação;

• O teste de tolerância à insulina (ITT) antes da suplementação;

• Α concentrações de triacilglicerol e colesterol total após a suplementação;

• Α síntese de [

C]- glicogênio e a produção de lactato em músculo sóleo isolado e

incubado na ausência e presença de insulina;

• Α expressão das proteínas IRβ e AKT envolvida na via de sinalização da insulina.

MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 Animais

Foram utilizados ratos machos albinos da linhagem Wistar com

aproximadamente dois dias de vida obtidos do biotério do Setor de Ciências Biológicas

da Universidade Federal do Paraná. Os animais foram mantidos em ciclo claro/ escuro

(12h/12h), em ambiente com temperatura controlada de 22 ± 2 °C com ração (Nuvital

CR-1, Nuvital Nutrientes Ltda., Curitiba, PR, BRA, composta por 66% de carboidratos,

23% de proteínas, 4% de lipídios, 6% de fibras e 1% de vitaminas e minerais (PIZATO

et al., 2005)) e água à vontade.

Todos os procedimentos que envolvem os animais foram aprovados pelo

Comitê de Ética em Experimentação Animal do Setor de Ciências Biológicas, da

Universidade Federal do Paraná (Anexo).

4.2 Material

O óleo de peixe foi doado gentilmente pela Fundação Herbarium. Cada

cápsula de óleo de peixe (1g/cápsula) contém 0,192 g de EPA e 0,124g DHA. A

gordura de coco foi adquirida no Mercado Municipal da cidade de Curitiba –PR.

As enzimas e reagentes utilizados neste estudo foram obtidos da Sigma

Chemical Co. (Saint Louis, USA). Todos os componentes para a solução de Krebs-

Ringer e a glicose foram obtidos da Reagen Quimbrás Indústria Brasileira S/A( Rio de

Janeiro, RJ, BRA). A glicose radiomarcada foi adquirida da Amersham Bioscience

(U.K.). Os anticorpos policlonais de coelho anti- IRβ e anti-Akt foram obtidos da Santa

Cruz Biotechnology.

4.3 Indução do Diabetes Tipo II Experimental

No segundo dia após o nascimento dos animais, o diabetes tipo II foi

induzido pela administração intraperitonial (ip) de estreptozotocina (STZ) (100 mg/kg de

massa corporal) diluída em tampão citrato pH 4,5 (ASHOKKUMAR & PARI, 2005).

4.4 Protocolo Experimental

Após a administração de estreptozotocina e o desmame, os ratos foram

divididos em seis grupos: controle (C); diabetizado (D), animais suplementados com

óleo de peixe (OP); animais suplementados com gordura de coco (GC); diabetizado

suplementado com óleo de peixe (DOP) e diabetizado suplementado com gordura de

coco (DGC). Os grupos denominados controle e diabético não receberam

suplementação.

Após 10 semanas, a instalação do diabetes tipo II foi confirmada através

do teste de tolerância intraperitoneal à glicose (IGTT). Então, os ratos foram

suplementados com óleo de peixe (ácido graxo poliinsaturado n-3) e com gordura de

coco (ácido graxo saturado) na dose de 1g/kg de massa corporal, com auxílio de

micropipeta, diariamente por seis semanas consecutivas.

Os animais foram pesados três vezes por semana com auxilio de uma

balança da marca Urano com precisão de 1 g para o controle do peso durante o

experimento e para os ajustes na dose da suplementação. Após o período de

suplementação, os animais foram anestesiados com éter e aproximadamente 1 ml de

sangue coletado através de punção cardíaca e centrifugado a 290 g a 4°C por 10 min

em centrífuga Eppendorf modelo 5810R (GER). O plasma foi separado para dosagem

da glicemia, colesterolemia e triacilglicerolemia. Dois dias depois da coleta do sangue,

os ratos foram ortotanasiados por deslocamento cervical para a rápida coleta do

músculo sóleo e posterior incubação e análise das proteínas do tecido. Todos os

procedimentos foram realizados após um período de jejum de aproximadamente 12

horas.

4.5 Procedimentos Realizados Para a Caracterização do Modelo Animal de Diabetes

tipo II

Todos os testes e análises descritos abaixo foram realizados após a 10°

semana de indução do diabetes. A coleta do sangue e a separação do plasma para

dosagem de insulina e glicose foram realizadas como descrito anteriormente.

4.5.1 Teste de tolerância intraperitonial à glicose (IGTT)

O teste de tolerância à glicose é um método de referência para o

diagnóstico do diabetes ou da intolerância à glicose, no caso da glicemia duas horas

após administração de glicose não retornar próxima da concentração basal de glicose

ou apresentar-se maior do que 200 mg/dL para humanos (GROSS et al., 2002).

O teste de tolerância intraperitonial à glicose foi realizado mediante a

injeção i.p. de uma solução de glicose (2g/kg de massa corporal). A glicemia foi

determinada nos tempos zero (antes da ip), 30, 60, 90 e 120 minutos após a injeção,

utilizando-se glicosímetro e fitas para glicemia da marca One Touch Ultra®. Este teste

foi repetido após o período de suplementação, porém a glicemia foi mensurada até 90

minutos após a carga de glicose, pois o resultado não foi estatisticamente diferente

após este tempo no teste anterior.

A concentração de insulina também foi mensurada nos tempos 0, 30 e 60

minutos através do método de radioimunoensaio descrito abaixo.

4.6.2 Determinação da insulina plasmática

A dosagem de insulina plasmática foi realizada no Instituto de Ciências

Biomédicas da Universidade de São Paulo (USP) pelo método de radioimunoensaio.

Esse método é baseado na competição entre insulina porcina marcada com

radioisótopo

125

I e a insulina de rato fria (não-marcada) pelo anticorpo anti-insulina

produzido na cobaia. Mantendo-se constante a quantidade de hormônio radioativo e do

anticorpo, a formação do complexo insulinamarcada-anticorpo depende da quantidade

de insulina fria presente na solução padrão. O complexo antígeno-anticorpo pode ser

facilmente precipitado pela adsorção do hormônio ao polietileno glicol. A concentração

do hormônio na amostra foi determinada pela quantificação de radiação gama. Os

resultados foram expressos em ng/mL.

4.5.3 Determinação da glicose plasmática

A concentração plasmática de glicose foi mensurada pelo método

enzimático colorimétrico, utilizando um kit de glicose Bioliquid

, de acordo com as

instruções do fabricante. A leitura da absorbância foi realizada em espectofotômetro a

505 nm da marca ULTROSPEC 2000 (Pharmacia Biotech). Os resultados foram

expressos em mg/dL. Este parâmetro foi repetido após o período de suplementação.

4.5.4 Teste de tolerância à insulina (ITT)

O teste tolerância à insulina é usado para medir a resistência periférica à

insulina. Este teste mensura a sensibilidade à insulina utilizando a constante do

desaparecimento da glicose (Kitt) como índice do metabolismo da glicose mediado pela

insulina. O Kitt corresponde à queda da glicose expressa em porcentagem por minuto,

assim quanto maior o Kitt maior a sensiblidade à insulina. (FURUYA, et al, 2005;

GELONEZE e TAMBASCIA, 2006; MURALI et al, 2002).

Para a realização do ITT, os ratos foram anestesiados com pentobarbital

(50 mg/kg de massa coporal, i.p.) e em seguida, foi injetado na veia peniana 1U/kg de

massa corporal de insulina Regular da marca Humulin® . A glicemia foi mensurada nos

tempos 0,5,10,15,20,40 minutos utilizando –se um glicosímetro e fitas para glicemia da

marca One Touch Ultra® .

O Kitt foi calculado utilizando a seguinte fórmula:

Kitt = 0,693 x 100 /t

Onde, o t

1/2

representa a meia-vida do decaimento da glicose e foi

determinado a partir do slope ou coeficiente angular da reta obtida pela regressão linear

do logaritmo natural da glicose versus o tempo.

4.6 Procedimentos Realizados para Avaliar o Efeito das Diferentes Suplementações.

Todos os testes e análises foram realizados após a sexta semana de

suplementação com óleo de peixe ou gordura de coco.

4.6.1 Determinação dos lipídeos plasmáticos

As concentrações plasmáticas de triacilglicerol e colesterol total foram

determinadas por método enzimático colorimétrico, utilizando os kits triglicérides GPO-

Trinder

e colesterol total Bioliquid

, respectivamente, conforme especificações do

fabricante. A leitura da absorbância foi realizada em espectrofotômetro a 500 nm e os

resultados expressos em mg/dL.

4.6.2 Isolamento e incubação do músculo sóleo

Alguns ratos foram mortos por deslocamento cervical e os músculos

sóleos foram cuidadosamente e rapidamente isolado, divididos longitudinalmente em

duas ou três partes, pesados (25 a 35 mg) e pré-incubados em erlenmeyers, contendo

3 mL de tampão Krebs-Ringer (contendo albumina sérica bovina (BSA) a 1% e glicose a

56 mM) sob agitação constante com atmosfera de O

/CO

(95%/5%) por período de 30

minutos. O restante do tecido foi rapidamente congelado em nitrogênio líquido e

armazenado a -80°C para posterior análise das proteínas.

Após o período de pré–incubação os músculos foram transferidos para

outros erlenmeyers contendo 3 mL de meio Krebs-Ringer, acrescidos de 0,1µCi/ml

[U-

C] - D- glicose, com 100 e 10.000 μU/mL ou sem insulina (basal). Os músculos foram

incubados por 1 hora, nas mesmas condições da pré-incubação, porém a gaseificação

ocorreu somente durante os primeiros 15 minutos. No final da incubação, os músculos e

o tampão de incubação foram utilizados para avaliação da síntese de glicogênio e

produção de lactato, respectivamente, conforme ESPINAL et al. (1983) e ENGLE &

JONES (1978).

4.6.3 Quantificação protéica do músculo sóleo

Amostras de aproximadamente 100 mg de músculo foram

homogeneizadas em Tampão de lise na proporção 1:7 com auxílio de homogeinizador

de tecidos, centrifugadas por 5 minutos a 17949 x g a 4 ºC e o sobrenadante coletado

para quantificação protéica.

A quantificação protéica foi realizada pelo método Bradford (BRADFORD,

1976). A concentração de proteínas das amostras foi calculada com base em curva

padrão de proteína conhecida (BSA). As amostras foram diluídas vinte vezes para não

extrapolar a curva padrão. Foram plaqueados 250 μL de solução de Bradford e 10 μL

de cada um dos padrões ou das amostras (quatro réplicas) em placas de 96 poços,

sendo a leitura realizada em leitor de microplaca a 595 nm.

O cálculo da concentração protéica das amostras foi realizado a partir da

equação da reta (y=ax+b), sendo que y, a absorbância e x, a concentração de proteína.

O valor de x encontrado foi multiplicado pela diluição da amostra (20 vezes) para se

obter a concentração de proteína da amostra em μg/mL.

4.6.4 Eletroforese em gel de poliacrilamida com Dodecil Sulfato de Sódio (SDS-PAGE)

Após quantificação protéica, foi realizada diluição das amostras utilizando

tampão Laemmli de forma a deixar a concentração final em 3 μg/uL de

proteína/amostra, ou seja, todas as amostras com a mesma concentração. O tampão

Laemmli contém SDS (dodecil sulfato de sódio) para desnaturar a proteína e prover

carga negativa constante de forma que todas fiquem com a mesma carga na amostra;

glicerol para dar à amostra densidade maior do que o tampão de corrida e β-

mercaptoetanol (agente redutor) para desfazer pontes dissulfeto da estrutura protéica,

possibilitando a separação da amostra em subunidades.

4.6.5 Separação eletroforética de proteína

O método “SDS- PAGE” descrito por Laemmli em 1960 foi desenvolvido

para que a proteína submetida a um campo elétrico migre unicamente pelo tamanho. O

SDS é um detergente carregado negativamente que se liga a regiões hidrofóbicas das

proteínas. O complexo formado SDS-proteína distribui carga negativa semelhante entre

todas as proteínas que migrarão para o pólo positivo do campo elétrico. Portanto, a

migração das proteínas no método “SDS-PAGE” depende principalmente das suas

massas moleculares. O gel de empilhamento foi preparado a 4% permitindo que todas

as proteínas migrem com a mesma velocidade no início da corrida. Após passarem pelo

gel de empilhamento as amostras alcançam o gel de resolução onde as amostras

começam a migrar de acordo com a massa molecular. Neste gel, a porcentagem de

acrilamida foi de 10%, adequado para separar as proteínas alvos (AKT e IRβ). Os géis

foram preparados com uma solução de acrilamida:bisacrilamida (30:1). A polimerização

desta mistura inicia-se pela adição de persulfato de amônio e TEMED.

Subsequentemente, as amostras foram submetidas à eletroforese em gel

de poliacrilamida “SDS-PAGE” por aproximadamente 2 horas (8V/cm de gel)

4.6.5 Imunoblotting

O método de Imunoblotting (ou “Western blotting) surgiu em 1979, descrito

por Towbin e colaboradores e permite a identificação de proteínas específicas pelo uso

de anticorpos mono ou policlonais, incluindo a detecção, a quantidade relativa e o peso

molecular de proteínas, em uma mistura complexa. Após a separação das proteínas em

gel de poliacrilamida “SDS-PAGE”, elas foram transferidas para uma membrana de

nitrocelulose. A membrana foi incubada por duas horas em tampão de bloqueio,

contendo 1,5% de leite desnatado para evitar ligações inespecíficas dos anticorpos.

Após o bloqueio, a membrana foi incubada em tampão de incubação contendo 1,5% de

BSA e o anticorpo primário contra a proteína AKT ou IRβ. Para visualização da

interação proteína-anticorpo foi utilizado anticorpo secundário contra o anticorpo

primário (anti-Akt ou anti- IRβ), sendo este complexado com enzima horseradish

peroxidase (HRP). Pela adição de substrato quimioluminescente pode-se observar em

filme Kodak para radiografia uma imagem referente às proteínas AKT e IRβ.

4.7 Análise Estatística

Os dados foram expressos como média ± erro padrão da média (EPM) dos

grupos experimentais e foram submetidos à análise de variância de duas vias (ANOVA)

com o pós teste de Bonferroni, ou teste t de Student quando indicado para um nível de

significância de p < 0,05.

6 RESULTADOS

5.1 Caracterização do Modelo de Diabetes

Na figura 6 está apresentada a glicemia (mg/dL) dos ratos controle (C) e

induzidos à diabetes mensurada na décima semana de vida imediatamente antes do

período da suplementação. Este parâmetro foi maior no grupo diabético (174 ± 5)

quando comparado com o grupo controle (134 ± 6) (p<0,001).

C D

100

150

200

Glicemia mg/dL

Figura 6 - Concentração plasmática de glicose dos ratos controle (C) (n= 26) e

diabéticos (D) (n= 37) na décima semana de vida. Valores estão expressos

como média ± EPM de cinco experimentos.

p<0,001 quando comparado com o grupo controle.

O IGTT está apresentado da Figura 7. A glicemia (mg/dL) dos ratos C e D,

no tempo zero, foi respectivamente 103 ± 5 e 131 ± 3 ( p<0,05). Trinta minutos após a

administração i.p. de glicose (2g/kg de massa corporal), a concentração de glicose

plasmática do grupo C foi de 267 ± 26 e do grupo D de foi 345 ± 25 (p<0,05). Aos 60,

90 e 120 minutos a glicemia retornou ao valor basal no grupo controle. Em

contraposição, nestes tempos, a glicose plasmática no grupo diabético manteve-se

similar à encontrada aos 30 minutos.

0 30 60 90 120 150

100

200

300

400

500

tempo (min)

Glicem ia m g/dL

Figura 7 - Glicemia dos ratos do grupo controle (C) (n=9) e diabéticos (D) (n=17) frente

o teste de tolerância intraperitoneal à glicose. Valores estão expressos

como média ± EPM de dois experimentos.

p<0,001 quando comparado com o grupo controle.

A insulina plasmática (ng/mL) em jejum (Figura 8) do grupo controle foi de

1,9 ± 0,2, enquanto que no diabético foi de 1,3 ± 0,1, o qual foi significativamente menor

(p<0,05).

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

Insulina ng/ml

Figura 8 - Concentração plasmática de insulina (ng/mL) em jejum dos ratos controle (C)

(n= 34) e diabético (D) (n=26). Valores estão expressos como média ± EPM

de dois experimentos.

p<0,05 quando comparado com o grupo controle.

A concentração plasmática de insulina (ng/mL) durante o IGTT (Figura 9)

no tempo zero nos ratos C e D foi de 2,2 ± 0,3 e 1,6 ± 0,9, respectivamente (p>0,05).

Aos 30 minutos, no grupo controle foi de 3,1 ± 1,3 e no diabético foi de 0,75 ± 0,6, que

foi significativamente menor (p<0,05). Aos 60 minutos em ambos os grupos retornou

aos valores próximos do tempo zero, mas no grupo diabético a concentração de

insulina foi ainda significativamente menor quando comparada à do grupo controle

(p<0,05).

0 30 60

tempo (min)

Insulina ng/ml

Figura 9 – Concentração plasmática de insulina dos ratos dos grupos controle (C) (n=

3) e diabético (D) (n= 3) obtida durante o teste de tolerância intraperitonial à

glicose. Valores estão expressos como média ± DP de um experimento.

p< 0,05 quando comparado com o grupo controle.

O K

itt

(%/min) encontrado para o grupo diabético foi de 3,4 ± 0,9 e para o

grupo controle foi 7,4± 0,5. A elevação encontrada demonstra resistência à insulina.

5. 2 Efeito da Suplementação com Óleo de Peixe

5.2.1 Teste de tolerância intraperitoneal à glicose

Na figura 10 estão apresentados os dados referentes ao comportamento

da glicemia frente ao teste de tolerância intraperitonial à glicose dos animais após seis

semanas de suplementação.

No grupo C aos 30 minutos a % da variação da glicemia em relação ao

tempo zero foi de 275 ± 31, aos 60 e 90 minutos retornou próxima ao valor basal. Nos

grupos D, DOP e DGC nestes mesmos tempos, esta variação foi de 390 ± 32,7, 324 ±

30, 408 ± 37, respectivamente, sendo estes valores para os grupos D e DGC

significativamente maior quando comparados aos do grupo controle (p<0,05). Em

contrapartida, a diferença não foi significativa comparando-se os grupo C e DOP

(p>0,05).

Os grupos D, DOP e DGC não apresentaram diferença entre si na

tolerância à glicose, nos tempos 60 e 90 minutos (p>0,05), mas foram diferentes do

grupo C (p< 0,05).

0 30 60 90

100

200

300

400

500

DOP

DGC

tempo (min)

% variação da glicemia em relação ao tempo 0`

Figura 10 - Porcentagem de Variação da glicemia dos ratos controle (C) (n=8),

diabéticos (D) (n=8), diabético suplementados com óleo de peixe (DOP) (n=8)

ou gordura de coco (DGC) (n=8) após seis semanas de suplementação frente

ao teste de tolerância intraperitoneal à glicose. Valores expressos como média

± EPM de dois experimentos.

p< 0,05 quando comparado D e DGC em relação ao controle

p<0,05 quando comparado D, DOP, DGC em relação ao controle.

5.2.2 Parâmetros bioquímicos

A glicemia (mg/dL), em jejum, dos ratos controle foi de 122 ± 5. A

suplementação com óleo de peixe (OP) ou gordura de coco (GC) não alterou a glicemia

dos animais não diabéticos. Nos animais diabéticos (D), a glicemia de jejum foi de 136 ±

4, o qual foi significativamente maior quando comparado à do controle (p<0,05). A

suplementação com óleo de peixe (DOP) ou gordura de coco (DGC) não tiveram efeito

sobre a glicemia, a qual se manteve similar à do grupo diabético não suplementado (D),

mas foram significativamente maiores quando comparadas às dos animais não

diabéticos suplementados OP e GC, respectivamente (p<0,05) (Figura 11).

DGC

100

125

150

175

200

Glicemia (mg/dL)

Figura 11 – Concentrações plasmáticas de glicose (mg/dL) em jejum dos grupos

controle (C) (n=22), suplementado com óleo de peixe (OP) (n= 23) ou

suplementado com gordura de coco (GC) (n=20), diabético (D) (n=25),

diabético suplementado com óleo de peixe (n=19) e diabético

suplementado com gordura de coco (DGC) (n=21) após seis semanas de

suplementação. Valores estão expressos como média ± EPM de cinco

experimentos.

p< 0,05 quando comparado com os animais não diabéticos

C OP GC D DOP DGC

122 ± 5 113 ± 3 119 ± 4 136 ± 4

134 ± 6

138 ± 5

A concentração plasmática de triacilglicerol (mg/dL) está apresentada na

figura 12. No grupo controle foi de 39,9 ± 3,6. A suplementação com óleo de peixe não

alterou este parâmetro (p>0,05 vs C), contudo a gordura de coco elevou a

triacilglicerolemia para 50 ± 3,4, o qual foi significativamente maior quando comparada

com à do C e OP (p<0,05). O diabetes elevou a triacilglicerolemia para 54 ± 4, valor

próximo ao encontrado no grupo suplementado com gordura de coco, o qual foi maior

que o do grupo controle (p <0,05). A suplementação com óleo de peixe no grupo

diabético reduziu o triacilglicerol plasmático, porém este valor não foi significativamente

diferente quando comparado com os dos grupos OP e D (p>0,05). Interessantemente, o

mesmo foi observado com a suplementação com gordura de coco (p>0,05 vs GC e D)

C OP GC D DOP DGC

a b

Triacilglicerolemia (mg/dL)

Figura 12 – Concentrações plasmáticas de triacilglicerol (mg/dL) em jejum dos grupos

controle (C) (n=17), suplementado com óleo de peixe (OP) (n= 18),

suplementado com gordura de coco (GC) (n=18), diabético (D) (n=16),

diabético suplementado com óleo de peixe (n=13) e diabético suplementado

com gordura de coco (DGC) (n=16) após seis semanas de suplementação.

Valores estão expressos como média ± EPM de cinco experimentos.

p<0,05 quando comparado ao C.

p<0,05 quando comparado ao OP.

C OP GC D DOP DGC

39,9 ± 3,6 39,4 ± 3,3 50 ± 3,4

54 ± 4,4

45,3 ± 3,6 45,5 ± 6,3

A concentração de colesterol (mg/dL) no grupo controle foi de 49,5 ± 1,9.

A suplementação com óleo de peixe (OP) reduziu a colesterolemia para 41,5 ± 2,7, a

qual foi menor significativamente (p<0,05). Por outro lado, a suplementação com

gordura de coco (GC) não alterou este parâmetro, sendo similar à do grupo C (p>0,05).

A indução do diabetes elevou a colesterolemia para

58,8 ± 3,6, valor significativo quando

comparado ao do grupo C (p<0,05). Nem a suplementação com óleo de peixe (DOP) ou

gordura de coco (DGC) foi capaz de reduzir a maior colesterolemia induzida pelo

diabetes, sendo similares à do grupo D (p<0,05) (Figura 13).

C OP GC D DOP DGC

Colesterolemia (mg/dL)

Figura 13 – Concentrações plasmáticas de colesterol (mg/dL),em jejum, dos grupos

controle (C) (n=12), suplementado com óleo de peixe (OP) (n= 15),

suplementado com gordura de coco (GC) (n=13), diabético (D) (n=11),

diabético suplementado com óleo de peixe (DOP) (n=9) e diabético

suplementado com gordura de coco (DGC) (n=7). Valores estão

expressos como média ± EPM de três experimentos.

p<0,05 quando comparado ao C

C OP GC D DOP DGC

49,5 ± 1,9 41,5 ± 2,7

49,4 ± 2,6 58,8 ± 3,6

54 ± 4,5 58,4 ± 4,3

5.2.5 Metabolismo da glicose no músculo esquelético dos ratos

5.2.5.1 Produção de lactato pelo músculo esquelético

Na Figura 14 estão apresentados os resultados da produção de lactato

pelos músculos sóleos incubados na ausência e presença de insulina (100 µU/mL ou

10000 µU/mL) dos grupos não diabéticos.

Na ausência de insulina (basal), a produção de lactato a partir da glicose,

foi aproximadamente 15 µmol/h/g de tecido (p>0,05) nos grupos C, OP e GC. A adição

de 100 µU/mL de insulina, aumentou a produção para aproximadamente 20 µmol/h/g de

tecido (p>0,05) nos três grupos. Na resposta máxima à insulina (10.000 µU/mL), a

produção de lactato foi de 31, 28 e 26 µmol/h/g de tecido, respectivamente para o

grupos C, OP e GC. A produção de lactato pelo músculo sóleo foi significativamente

menor quando comparado ao do grupo C (p<0,01).

A produção de lactato pelos músculos sóleos incubados na ausência e

presença de insulina dos grupos C e D está apresentada na Figura 15. A produção

basal foi de 14 µmol/h/g de tecido para ambos os grupos (p>0,05). O estímulo com 100

µU/mL de insulina aumentou a produção de lactato para 21 e 15 µmol/h/g de tecido

(p<0,05) e a adição de 10.000 µU/mL de insulina incrementou a produção de lactato

para 31 e 24 µmol/h/g de tecido (p<0,05), respectivamente. Os músculos do grupo D

apresentaram menor produção de lactato em relação à do controle (p<0,05), quando

estimulados com insulina.

0.1 1 10 100 1000 10000 100000

log [insulina] μU/mL

Produção de Lactato

(

mol/h/g)

Figura 14 - Produção de lactato pelos músculos sóleos incubados dos ratos controle

de coco (GC) na ausência e presença de 100 µU/mL, 10000 µU/mL de

insulina. Valores estão expressos como média ± EPM de oito

experimentos.

p< 0,01 quando comparado ao C

Insulina

Grupos

Ausência 100 µU/mL 10000µU/mL

C 14 ± 0.56 (n=16) 21 ± 0,45 (n=10) 31 ± 1,3 (n=8)

OP 15 ± 0,55 (n=14) 21 ± 0,35 (n=9) 28 ± 1,4 (n=11)

GC 15 ± 0,74 (n=7) 20 ±0,51 (n=11) 26 ± 0,66 (n=7)

0.1 1 10 100 1000 10000 100000

log [insulina] μU/mL

Produção de Lactato

(

mol/h/g)

Figura 15 - Produção de lactato pelos músculos sóleos incubados dos ratos controle

de insulina. Valores estão expressos como média ± EPM de oito

experimentos.

p< 0,05 quando comparado ao C

p< 0,01 quando comparado ao C

Insulina

Grupos

Ausência 100 µU/mL 10000µU/mL

C 14 ± 0.56 (n=16) 21 ± 0,45 (n=10) 31 ± 1,3 (n=8)

D 14 ± 0,62 (n=11) 18 ± 0,25 (n=7)

24 ± 0,83 (n=9)

Os resultados da produção de lactato pelos músculos dos grupos D, DOP

e DGC encontram-se na Figura 16. A produção basal de lactato nos grupos D, DOP e

DGC foi aproximadamente 15 µmol/h/g de tecido (p>0,05). Os músculos sóleos

estimulados com 100 µU/mL de insulina produziram mais lactato quando comparados

com o estímulo basal. O músculo do grupo D produziu 18 µmol/h/g de tecido e do grupo

DGC aumentou a produção para 19 µmol/h/g, valor não diferente do grupo D (p>0,05).

Os músculos do grupo DOP incrementaram a produção para 21 µmol/h/g de tecido,

valor significativamente maior quando comparado com o do D e DGC (p<0,05). Com o

estímulo máximo de insulina (10000 µU/mL), não houve diferença na produção de

lactato entre os grupos D, DOP e DGC (p<0,05), sendo os valores, respectivamente,

24, 26 e 24 µmol/h/g de tecido.

0.1 1 10 100 1000 10000 100000

DOP

DGC

log [insulina] μU/mL

Produção de Lactato

(

m ol/h/g)

Figura 16 - Produção de lactato pelos músculos sóleos incubados dos ratos diabético

(D), diabético suplementado com óleo de peixe (DOP) e diabético

suplementado com gordura de coco (DGC) na ausência e presença de

100 µU/mL e 10000 µU/mL de insulina. Valores estão expressos como

média ± EPM de oito experimentos.

p< 0,05 quando comparado ao D e DGC

Insulina

Grupos

Ausência 100 µU/mL 10000µU/mL

D 14 ± 0,62 (n=11) 18 ± 0,25 (n=7) 24 ± 0,83 (n=9)

DOP 15 ± 0,48 (n=14) 21 ± 0,59 (n=9)

26 ± 0,78 (n=13)

DGC 15 ± 0,52 (n=12) 19 ± 0,44 (n=13) 24 ± 1,4 (n=8)

5.2.3.2 Síntese de [U-

C]-glicogênio a partir de [U-

C]-D-glicose pelo músculo

esquelético

Na Figura 17 estão os resultados da síntese de [U-

C]-glicogênio

(μmol/h/g tecido) a partir de [U-

C]-D-glicose pelos músculos sóleos incubados na

ausência ou presença de insulina (100 µU/mL ou 10000 µU/mL), dos grupos não

diabéticos.

Na ausência de insulina, a síntese de [U-

C]-glicogênio a partir de [U-

C]-

D-glicose nos grupos C, OP e GC foi aproximadamente de 0,14 µmol/h/g de tecido

(p>0,05), respectivamente. A adição de 100 µU/mL de insulina, aumentou a produção

dos grupos C e OP para 0,33 e 0,29 µmol/h/g de tecido (p>0,05). Para o grupo GC, a

produção foi incrementada para 0,20 µmol/h/g de tecido, sendo esta significativamente

menor em relação à dos grupos C e OP (p<0,05). Na resposta máxima à insulina

(10.000 µU/mL), a síntese de [U-

C]-glicogênio foi 0,67, 0,63 e 0,5 µmol/h/g de tecido,

respectivamente para o grupos C, OP e GC. O resultado encontrado no grupo GC foi

significativamente menor quando comparado ao do grupo C (p<0,05).

A síntese de [U-

C]-glicogênio dos músculos sóleos incubados na

ausência ou presença de insulina dos grupos C e D está apresentada na Figura 18. A

síntese de [U-

C]-glicogênio basal foi de 0,14 e 0,12 µmol/h/g de tecido para os grupos

C e D, respectivamente (p>0,05). O estímulo com 100 µU/mL de insulina aumentou a

produção de glicogênio para ambos os grupos. Para o C, a síntese de glicogênio foi de

0,33 µmol/h/g de tecido e no grupo D 0,18 µmol/h/g de tecido, valor significativamente

menor comparado com o grupo C (p<0,05). A presença de 10.000 µU/mL de insulina

incrementou a síntese de [U-

C]-glicogênio para 0,67 e 0,58 µmol/h/g de tecido,

respectivamente para os grupos C e D, sem diferença significativa (p>0,05).

0.1 1 10 100 1000 10000 100000

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

log [insulina] μU/mL

Síntese de [

C]-glicogênio

(

mol/h/g de tecido)

Figura 17 - Síntese de glicogênio a partir de [U-

C]-D-glicose pelos músculos sóleos

incubados dos ratos controle (C) e suplementado com óleo (OP) de peixe e

suplementado com gordura de coco (GC) na ausência e na presença de 100

µU/mL, 10000 µU/mL de insulina. Valores estão expressos como média ± EPM

de oito experimentos.

p<0,05 quando comparado ao C e OP

p< 0,05 quando comparado ao C

insulina

Grupos

Ausência 100 µU/mL 10000µU/mL

C 0.14 ± 0.01 (n=17) 0.33 ± 0.02 (n=8) 0.67 ±0.07 (n=13)

OP 0.14 ± 0.01 (n=12) 0.29 ± 0.02 (n=9) 0.63 ± 0.06 (n=13)

GC 0.13 ± 0.011 (n=8) 0.20 ± 0.015 (n=7)

0.5 ± 0,07 (n=14)

0.1 1 10 100 1000 10000 100000

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

log [insulina] μU/mL

Síntese de [

C]-glicogênio

(μ m ol/h/g de tecido)

Figura 18 - Síntese de glicogênio a partir de [U-

C]-D-glicose pelos músculos sóleos

incubados dos ratos controle (C) e diabético (D) na ausência e presença de

100 µU/mL, 10000 µU/mL de insulina. Valores expressos como média ±

EPM de oito experimentos.

p<0,001 quando comparado ao C

insulina

Grupos

Ausência 100 µU/mL 10000µU/mL

C 0.14 ± 0.01 (n=17) 0.33 ± 0.02 (n=8) 0.67 ±0.07 (n=13)

D 0.12 ± 0.01 (n=12) 0.18 ± 0.01 (n=13)

0.58 ± 0.07 (n=16)

Na figura 19 estão os resultados da síntese de glicogênio a partir de [U-

C]-D-glicose pelos músculos sóleos dos ratos dos grupos D, DOP e DGC.

A síntese basal de glicogênio pelo músculos sóleos dos ratos dos grupos

D, DOP e DGC foi respectivamente, 0,12, 0,13, 0,13 µmol/h/g de tecido (p>0,05). Os

músculos sóleos estimulados com 100 µU/mL de insulina incrementaram a produção de

glicogênio para 0,18, 0,20 e 0,21 µmol/h/g de tecido, respectivamente (p>0,05). Com o

estímulo máximo de insulina (10.000 µU/mL), os músculos incubados produziram 0,58,

0,59, 0,54 µmol/h/g de tecido, para os mesmos grupos. A síntese de glicogênio não foi

significativamente diferente em ambas concentrações de insulina investigadas (p>0,05).

0.1 1 10 100 1000 10000 100000

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

DOP

DGC

log [insulina] μU/mL

Síntese de [

C]-glicogênio

(

mol/h/g de tecido)

Figura 19 - Síntese de glicogênio a partir de [U-

C]-D-glicose pelos músculos sóleos

incubados dos ratos diabético (D), diabético suplementado com óleo de

peixe (DOP) e diabético suplementado com gordura de coco (DGC) na

ausência e na presença de 100 µU/mL, 10000 µU/mL de insulina. Valores

estão expressos como média ± EPM de oito experimentos.

insulina

Grupos

Ausência 100 µU/mL 10000µU/mL

D 0.12 ± 0.008 (n=12) 0.18 ± 0.01 (n=13) 0.58 ± 0.075 (n=16)

DOP 0.13 ± 0.006 (n=11) 0.20 ± 0.012 (n=8) 0.59 ± 0.07 (n=10)

DGC 0.13 ± 0.006 (n=13) 0.21 ± 0.01 (n=9) 0.54 ± 0.005 (n=14)

5.2.4 Expressão das proteínas IRβ e Akt no músculo sóleo

Na figura 20 está apresentada a expressão da proteína IRβ do músculo

sóleo dos animais controles e diabéticos que receberam ou não a suplementação com

óleo de peixe ou gordura de coco. Não houve diferença estatística na expressão da

proteína IRβ entre os grupos (p >0,05).

95 kDa

COP

DOP

DGC

100

150

200

Unidades arbitrárias

Figura 20 – Expressão da proteína IRβ no músculo sóleo dos ratos dos grupos controle

(C), suplementado com óleo de peixe (OP), suplementado com gordura de

coco (GC), diabético (D), diabético suplementado com óleo de peixe

(DOP) e diabético suplementado com gordura de coco (DGC). Os valores

estão apresentados em unidades arbitrárias da média ± EPM de 3

experimentos.

A expressão da proteína Akt no músculo sóleo de todos os grupos está

apresentada na figura 21.

A expressão desta proteína não foi diferente no grupo não diabético

suplementado com óleo de peixe (OP) quando comparado com o controle (p>0,05). Em

contrapartida, a gordura de coco reduziu em 26,9% a expressão da Akt nos ratos não

diabéticos, sendo significativamente menor que a do controle e suplementados com

óleo de peixe (p<0,05). O quadro diabético também reduziu significativamente a

expressão da Akt (34,3%) quando comparado à do grupo C (p<0,05). A suplementação

com óleo de peixe e gordura de coco não alterou a redução da expressão da Akt

induzida pelo diabetes.

56 kDa

DOP

100

150

200

Unidades arbitrárias

Figura 21 – Expressão da proteína Akt no músculo sóleo dos ratos dos grupos controle

(C), suplementado com óleo de peixe (OP), suplementado com gordura

de coco (GC), diabético (D), diabético suplementado com óleo de peixe

e diabético suplementado com gordura de coco (DGC). Os dados estão

apresentados em unidades arbitrárias como média ± EPM de 3

experimentos.

p< 0,05 quando comparado com o grupo C

p< 0,05 quando comparado com o grupo OP

6 DISCUSSÃO

O diabetes mellitus é um problema de saúde mundial, sendo a forma mais

prevalente da doença o diabetes tipo II (ASHOKKUMAR & PARI, 2005).

Entre os vários modelos animais de diabetes tipo II, existem os genéticos,

induzidos por drogas ou pela alteração da dieta, contudo nenhum destes simula,

exatamente, o quadro de diabetes tipo II encontrado nos humanos (ARULMOZHI et al,

2004).

A indução do quadro de diabetes pela STZ é amplamente utilizada para se

estudar a fisiopatologia desta síndrome. Em animais adultos, a estreptozotocina induz o

quadro severo do diabetes com a necessidade da administração de insulina para que o

animal sobreviva por um longo tempo. Quando a indução do diabetes pela

estreptozotocina ocorre na fase neonatal, o processo é lento, inicialmente com poucos

sintomas e é considerado um bom modelo de diabetes tipo II (TAKADA et al, 2007).

Em nosso estudo, o diabetes mellitus experimental utilizado foi o modelo

de diabetes tipo II. A indução foi realizada pela injeção intraperitoneal de

estreptozotocina em ratos wistar no período neonatal (ASHOKKUMAR & PARI, 2005) e

após a 10° semana da indução do diabetes tipo II, a instalação da doença foi testada.

Os ratos do grupo diabético apresentaram hiperglicemia em relação ao grupo controle

(Figura 6). Vários estudos mostraram que ratos que receberam injeção i.p. de

estreptozotocina apresentam hiperglicemia moderada (ANGEL et al., 1996;

ARULMOZHI et al, 2004). O IGTT confirmou o estado de intolerância à glicose no grupo

D, indicando a instalação do quadro diabético nestes animais, uma vez que a glicemia

do grupo diabético não retornou a concentração basal como observado no grupo

controle (Figura 7). A falta de insulina ou a resistência periférica à insulina poderia

justificar o resultado encontrado no IGTT e a hiperglicemia. Desta forma, a mensuração

da insulinemia em jejum e durante o IGTT e o ITT foram realizados.

Sabe-se que a exposição das células β-pancreáticas à glicose resulta em

padrão bifásico da secreção de insulina. A resposta inicial à glicose é caracterizada

pelo aumento na secreção de insulina seguida do declínio próxima da concentração

basal. A fase inicial rápida da secreção de insulina parece ocorrer pela liberação do

conteúdo nos grânulos secretórios próximos da membrana plasmática da célula β. Já a

exposição prolongada à glicose provoca a produção de nova insulina para controlar a

glicemia (PRATLEY & WEYER, 2001).

Os ratos diabéticos apresentaram baixa insulinemia em jejum (Figura 8).

Quando injetado glicose via i.p, estes animais apresentaram menor concentração

plasmática de insulina em relação ao grupo controle nos tempos trinta e sessenta

minutos e ainda após trinta minutos da i.p, a insulinemia dos diabéticos foi menor

quando comparado com o tempo zero e após uma hora tendeu a retornar a

concentração basal (Figura 9). Com isso, podemos sugerir que a primeira fase da

secreção de insulina pelas células β pancreáticas dos ratos diabéticos estava reduzida

trinta minutos após a i.p de glicose (Figura 9), contribuindo para a alta glicemia

encontrada no IGTT (Figura 7) e após uma hora da carga de glicose, a insulina

começou a ser produzida, mas a glicemia no IGTT não retornou à concentração de

glicose próxima à basal como observado no grupo controle (Figura 7).

Tanto a baixa insulinemia quanto a possível alteração da secreção e

produção da insulina pelas células β pancreáticas na presença de glicose podem ter

contribuído para a hiperglicemia e para a redução na tolerância à glicose no grupo

diabético, no entanto para confirmar a alteração na secreção de insulina seria

necessário mensurar diretamente este parâmetro frente à glicose nas células β

pancreáticas.

O ITT é um método simples, razoavelmente exato e rápido para

determinação da resistência à insulina (MURALI et al., 2002). A injeção em bolo, de

insulina via intravenosa, promove a queda da glicose, devido à supressão da produção

hepática de glicose e pelo estímulo à captação de glicose pelos tecidos sensíveis à

insulina (GELONEZE & TAMBASCIA, 2006). Neste teste, a sensibilidade à insulina é

calculada usando a constante do desaparecimento da glicose (K

itt

). O K

itt

é calculado a

partir dos valores de glicemia do ITT e corresponde à queda da glicose expressa em

porcentagem por minuto, assim quanto maior o K

itt

maior a sensiblidade à insulina.

(FURUYA et al, 2005; GELONEZE e TAMBASCIA, 2006; MURALI et al, 2002).

Em nosso estudo, o K

itt

mostrou que o grupo diabético estava resistente à

insulina quando comparado com o grupo controle. Murali (2002) mostrou que ratos

diabetizados com STZ, no período neonatal, apresentavam K

itt

menor que os animais

não diabetizados, ou seja, resistência à insulina. Em resumo, nossos dados mostraram

que os ratos apresentaram hiperglicemia, menor tolerância à glicose, secreção reduzida

da insulina na presença de glicose, baixa insulinemia e menor K

itt

em relação ao grupo

controle, confirmando então o quadro diabético. A injeção de STZ, em ratos neonatos,

foi mostrada ser capaz de induzir a redução da secreção de insulina induzida pela

glicose, hiperglicemia moderada em jejum, intolerância oral à glicose e resistência

moderada à insulina (ANGEL et al., 1996). Nossos achados corroboram aos

encontrados neste estudo.

O lento processo do desenvolvimento da hiperglicemia, da intolerância à

glicose e moderada hipoinsulinemia são características que podem se assemelhar ao

diabetes mellitus tipo II em humanos. A indução do diabetes no período neonatal pode

destruir progressivamente, mas não totalmente, as células β pancreáticas, mimetizando

a situação encontrada em pacientes diabéticos. Neste modelo animal de diabetes, os

ratos apresentaram redução no conteúdo de insulina pancreática, provavelmente em

decorrência da exaustão das células β pancreáticas pelo aumento inicial da secreção

de insulina na tentativa de superar a resistência periférica à insulina. Os autores

relataram também hiperinsulinemia nos ratos diabéticos, mas sugeriram ser um estado

transitório que levaria a incapacidade das células β pancreáticas em secretar insulina

(TAKADA et al., 2007). Outros estudos divergem em relação à insulinemia basal.

Nossos resultados corroboram com os de Angel (1996) e Ashokkumar & Pari (2005)

que relataram insulinemia, em ratos diabéticos, significativamente menor que à dos não

diabéticos. Murali (2002) também relatou que ratos diabéticos estavam

hiperinsulinêmicos em relação aos não diabéticos. A possível explicação para estes

achados deve-se a abordagem utilizada, como por exemplo a dose de STZ e o dia

escolhido após o nascimento para a indução. Dependendo da dose de STZ e do dia da

injeção i.p., o modelo de diabetes neonatal, induzido por STZ, exibe vários estágios do

diabetes tipo II, como alteração na tolerância à glicose e aumento moderado ou severo

da glicemia (ARULMOZHI, 2004).

Geralmente, a resistência à insulina é forte indicador do diabetes tipo II e

pode ser acompanhada por concentrações elevadas de insulina no plasma

(AVRAMOGLU et al., 2006). Atualmente, está cada vez mais claro que tanto o diabetes

tipo I quanto o diabetes tipo II são desordens heterogêneas. Defeitos na secreção e

ação da insulina estão presentes em ambos os diabetes, tipo I e II (ASHOKKUMAR &

PARI, 2005). Sendo assim, o diabetes tipo II é uma doença crônica heterogênea

caracterizada por hiperglicemia, resultado da resistência à insulina e da deficiência

secundária à insulina pela falência das células β pancreáticas (TAKADA et al., 2007).

Portanto, as características encontradas nos animais deste estudo mostram um quadro

típico de diabetes tipo II.

Após caracterizar a instalação do quadro de diabetes nos ratos Wistar, os

animais foram suplementados com óleo de peixe ou gordura de coco por seis semanas

consecutivas. O aumento da incidência do diabetes tipo II está diretamente relacionado

com mudanças no estilo de vida, como o sedentarismo e dietas com alta proporção de

carboidratos refinados e gorduras, principalmente saturadas e trans. Em contradição, é

observado que em populações que consomem grande quantidade de gordura

poliinsaturada do tipo ômega 3, a prevalência de doenças cardiovasculares, diabetes

tipo II e intolerância à glicose é pequena. Além disso, muitos estudos mostram o efeito

preventivo e protetivo dos ácidos graxo n-3 no distúrbio do diabetes. Com isso,

investigamos se a suplementação com óleo peixe e gordura saturada alterava o quadro

diabético descrito acima.

Os ácidos eicosapentaenóico e docosahexaenóico são os dois principais

ácidos graxos ômega 3 encontrados no óleo peixe e possuem efeitos sobre os lipídeos

séricos e lipoproteínas (GRIMSGAARD et al., 1997; MORI et al., 2000A), glicose sérica,

pressão arterial (MORI et al. 1999; GRIMSGAARD et al., 1998) e função endotelial

(MORI et al., 2000B).

Estudos experimentais em humanos apresentaram resultados

controversos em relação ao efeito dos ácidos graxos n-3 sobre a glicemia (MORI et al.,

1999), sendo que alguns autores mostraram efeitos deletérios sobre o controle

glicêmico (BORKMAN et al. 1989; FRIDAY et al., 1989; MOSTAD et al. 2006;

WOODMAN et al., 2007), porém estes efeitos foram atribuídos à alta (acima 4g/dia)

dose de ácidos graxos n-3 (FRIDAY et al., 1989; BORKMAN et al. 1989; MOSTAD et

al. 2006). Em contrapartida, outros estudos mostraram que a suplementação com

ácidos graxos n-3 em doses moderadas (2 à 3 g/dia) não modificaram a glicemia dos

indivíduos (MORGAN et al.,1995, SIRTORI et al.,1998, LUO et al., 1998; FRIEDBERG

et al., 1998; MONTORI et al.,2000; KABIR et al., 2007) e foram efetivas em reduzir a

concentração de triacilglicerol, ou seja, o efeito sobre os lipídeos foi positivo sem

nenhum efeito adverso sobre o controle da glicemia (FRIEDBERG et al., 1998;

MONTORI et al.,2000; KABIR et al., 2007). No nosso estudo, corroborando estes

autores, a glicose plasmática em jejum obtida após o período experimental não mostrou

diferença estatística entre os grupos diabéticos (Figura 11). Porém, estes dados

mostraram hiperglicemia após o período de suplementação, confirmando a manutenção

do quadro de diabetes encontrado inicialmente.

O IGTT (Figura 10), realizado após seis semanas de suplementação,

mostrou que a glicemia, trinta minutos após a carga de glicose, dos grupos D e DGC foi

significativamente maior do que a do controle (p<0,05), porém os ratos diabéticos que

receberam óleo de peixe não apresentaram aumento significativo na concentração

plasmática de glicose comparada à do controle (p>0,05). No entanto, após 60 e 90

minutos do i.p. de glicose a glicemia de todos os diabéticos suplementados ou não ficou

significativamente elevada em relação ao controle (p<0,05). Com isso, a secreção inicial

da glicose nos ratos diabéticos suplementados com óleo de peixe parece mais eficiente

do que nos ratos diabéticos que receberam ou não gordura de coco. É fato que os

ácidos graxos n-3 presentes no óleo se incorporam na membrana plasmática das

células, alterando a fluidez, podendo modificar a função de proteínas inseridas na

membrana, como os transportadores de glicose, neste caso o GLUT-2 ou proteínas

canais envolvidas na secreção de insulina. Assim, estes animais podem ter secretado

insulina presente nos grânulos mais rapidamente do que os animais não tratados ou

suplementados com gordura de coco. Ao analisarmos o que aconteceu aos sessenta e

noventa minutos após a injeção i.p. de glicose, a produção de nova insulina no grupo

DOP não foi modificada em relação aos grupos D e DGC, uma vez que as células β-

pancreáticas estavam parcialmente destruídas em todos os animais diabéticos. Assim,

parece que temos um efeito facilitador na primeira fase de secreção da insulina, mas

não na segunda fase.

Além da hiperglicemia e intolerância à glicose, o diabetes mellitus tipo II

está frequentemente associado com o metabolismo anormal de lipídeos com elevação

de triacilgliceróis e lipoproteínas de baixa densidade (LDL), fatores de alto risco para

doenças cardiovasculares nos pacientes diabéticos (PATTI, et al., 1999). O diabetes

provoca aumento da lipólise contribuindo para hiperlipidemia (BAKER & GIBBONS,

2000; PARI & ASHOKKUMAR, 2005 ). Em geral, as alterações no metabolismo das

lipoproteínas contendo apo B-100, incluindo VLDL, IDL (lipoproteína de densidade

intermediária) e LDL são anormalidades encontradas no diabetes (BAKER & GIBBONS,

2000).

A maior concentração dos lipídeos plasmáticos é influenciada pelo

aumento do triacilglicerol na lipoproteína de muito baixa densidade (VLDL) secretada

pelo fígado. O efeito inibitório da insulina in vivo sobre a VLDL rica em triacilglicerol é

em parte pela supressão do fluxo de ácidos graxos não esterificados do tecido adiposo

para o fígado, reduzindo a disponibilidade do substrato para a produção do triacilglicerol

e também foi mostrado um efeito inibitório direto sobre a secreção de VLDL e ApoB,

independente da quantidade de precursores do triacilglicerol no fígado (BAKER &

GIBBONS, 2000). Ainda, a resistência à insulina reduz a atividade e a expressão do

receptor de LDL e aumenta a via da biossíntese de colesterol hepático (CHAN et al.,

2002). Esta via possui uma enzima limitante chamada 3-hidroxi-3-metil coenzima

(HMG-CoA) redutase que está fortemente associada com a taxa de síntese do

colesterol no fígado (SMIT et al., 1994; PARI & ASHOKKUMAR, 2005). MATSUZAWA

et al (1991) mostraram que a atividade desta enzima estava aumentada em ratos

geneticamente diabéticos não insulino dependente e PARI & ASHOKKUMAR (2005)

também encontraram aumento significante da HMG-CoA redutase no modelo animal de

diabetes induzido por STZ, no período neonatal. Sendo assim, as maiores

concentrações de triacilglicerol (Figura 12) e colesterol total (Figura 13) encontrados

nos ratos diabéticos refletem a baixa insulinemia e o quadro de resistência à insulina,

características deste distúrbio e concorda com MURALI et al. (2002) e ASHOKKUMAR

& PARI (2005) que mostraram no mesmo modelo de diabetes, hipertriacilglicerolemia e

hipercolesterolemia. Em adição, baseados nos dados da literatura, é possível inferir que

os ratos diabéticos avaliados neste estudo também apresentavam maior atividade da

enzima HMG-CoA redutase.

O óleo de peixe rico em EPA e DHA regulam o metabolismo lipídico. As

diversas subclasses de lipídeos dietéticos possuem efeitos diferentes na lipogênese

(CATERINA et al.,2007, CHAN et al.,2002).

Os ácidos graxos n-3 reduzem a concentração de triacilgliceróis

circulantes. Os mecanismos de ação do ômega 3 sugeridos para a redução dos

triacilgliceróis são a redução da síntese hepática da VLDL, alguns estudos relatam

aumento da taxa catabólica da VLDL (CATERINA et al.,2007) e a redução da

lipogênese hepática e o aumento parcial da β-oxidação, em ratos (HARRIS &

BULCHANDANI, 2006). A inibição das enzimas da via de síntese de triacilgliceróis

hepáticos, principalmente a diacilglicerol aciltransferase e a supressão da transcrição do

gene lipogênico SREBP-1c (sterol regulatory element-binding protein)

, são mecanismos

dos ácidos graxos n-3 que resultam na inibição da síntese de novos ácidos graxos e

triacilgliceróis (CHAN et al., 2002; CARPENTIER et al., 2006). Isto limita a quantidade

de triacilglicerol disponível para o empacotamento na VLDL, levando a produção de

partículas de VLDL pequenas com menos triacilglicerol (CHAN et al., 2002, GRIFFIN,

2001). O aumento na β-oxidação dos ácidos graxos parece ocorrer pela habilidade dos

ácidos graxos n-3 em ativar o receptor nuclear α ativado pelos proliferadores de

peroxissomos (PPAR α) que aumentam a expressão gênica de enzimas envolvidas na

via de oxidação dos ácidos graxos (GRIFFIN, 2001; CHAN et al., 2002, WOODMAN et

al., 2002; PIGHIN et al., 2003; CARPENTIER et al., 2006).

No entanto, neste estudo, a suplementação com óleo de peixe, tanto para

os ratos diabéticos quanto não diabéticos, não alterou significativamente a

triacilglicerolemia, encontramos somente uma tendência à redução do triacilglicerol

plasmático no grupo DOP e também no DGC em relação ao D (Figura 12). Em

contrapartida, a gordura de coco, para os ratos não diabéticos, aumentou

significativamente a concentração plasmática de triacilglicerol em relação aos ratos não

suplementados (Figura 12) e ainda foi similar ao grupo diabético.

Dietas ricas em lipídeos, principalmente quando a maior porcentagem

destes lipídeos são ácidos graxos saturados, aumentam o acúmulo de gordura visceral

e as concentrações plasmáticas de colesterol e triacilglicerol (LOMBARDO & CHICCO,

2006). Foi encontrado que a atividade e os níveis de RNAm da enzima ácido graxo

sintase no tecido adiposo branco apresenta regulação diminuída pelo aumento do

conteúdo de gordura saturada na dieta, comprometendo assim a síntese de ácidos

graxos neste tecido. O óleo de peixe foi menos efetivo em reduzir estas variáveis

(BENHIZIA et al., 1994, LOMBARDO & CHICCO, 2006). Desta forma, os efeitos das

gorduras saturadas são diferentes e muitas vezes opostos aos dos ácidos graxos n-3

relatados anteriormente. No nosso estudo, a gordura coco, por ser saturada, aumentou

o triacilglicerol plasmático nos ratos não-diabéticos e assim pode ter contribuído para

alterações na sensibilidade à insulina observadas nestes animais. Em contradição, a

tendência desta gordura em reduzir a triacilglicerolemia nos ratos diabéticos foi um

achado interessante. Os lipídeos nos ratos Wistar variam muito e talvez isto tenha

interferido no resultado final.

Estudos mostram que o ácido graxo n-3 também é capaz de reduzir o

colesterol plasmático em ratos, provavelmente por ações inibitórias sobre a HMG-CoA

redutase e sobre a produção de VLDL (AL-SHURBAJI et al., 1991, SMIT et al., 1994).

Porém, a suplementação com óleo de peixe não foi capaz de melhorar este perfil nos

ratos diabéticos. Em contrapartida, o óleo de peixe reduziu a colesterolemia nos ratos

não diabéticos comparado com o grupo controle, mostrando o efeito dos ácidos graxos

n-3 em reduzir o colesterol plasmático (Figura 13). Os efeitos do EPA e DHA dependem

da dose administrada. Assim a dose, o tempo de suplementação e o modelo de

diabetes podem ter interferido na ação do óleo peixe sobre metabolismo dos lipídeos

nos ratos (CATERINA et al., 2007).

A tolerância normal à glicose é mantida pelo preciso balanço entre

secreção de insulina das células β pancreáticas e sua ação sobre os tecidos sensíveis

ao hormônio, principalmente músculo e tecido adiposo (PRATLEY & WEYER, 2001).

Ainda, a homeostase da glicose envolve a regulação coordenada de várias vias

metabólicas, incluindo gliconeogênese e glicólise. (ASHOKKUMAR & PARI, 2005).

A insulina promove o transporte de glicose, a glicólise e a síntese de

glicogênio no músculo esquelético, maior local de captação da glicose estimulada por

este hormônio (D`ALESSANDRO et al., 2000). O músculo esquelético parece ser o

principal sítio de resistência à insulina e o tecido periférico de maior interesse para

avaliar esta característica no diabetes tipo II (BONADONNA et al., 1993; DELARUE et

al., 2004).

Para avaliar a completa ação da insulina, é necessário obter uma curva

dose–resposta, onde o termo sensibilidade à insulina está ligado a propriedades da

curva dose-resposta da ação da insulina sobre a queda da glicose (MIKINES, 1992).

Uma definição mais prática de sensibilidade foi usada em inúmeros estudos in vivo e in

vitro, em que a resposta de um dado processo metabólico (como o transporte, síntese

de glicogênio, glicólise, síntese protéica) é medida na presença de concentrações

basais e máximas do hormônio. A concentração de insulina que causa 50% da resposta

máxima pode ser usada como índice de sensibilidade à insulina (GREEN &

NEWSHOLME, 1979; RIZZA et AL., 1981; ESPINAL et al., 1983; GOODMAN et al.,

1983; KRAEGEN et al., 1985; STIREWALT et al., 1985; FERNANDES, L. C., 1989). Já

a relação dose-resposta do efeito biológico máximo da insulina caracteriza a

responsividade ao hormônio (MIKINES, 1992).

Para investigar o efeito do óleo de peixe e da gordura de coco sobre a

sensibilidade e responsividade à insulina do músculo sóleo, avaliamos a produção de

lactato e a síntese de glicogênio, destinos celulares da glicose, no músculo sóleo de

ratos diabéticos e não diabéticos, estimulados ou não com insulina. Diferentes doses de

insulina foram utilizadas com o objetivo de avaliar a resposta do músculo em condições

fisiológicas (100 μU/mL) (FRYER, 1995) ou sob concentração máxima de insulina

(10000 μU/mL) (HIRABARA, 2005), investigando-se a sensibilidade e a responsividade

do músculo sóleo à insulina, respectivamente.

A taxa de formação de lactato representa um índice do transporte de

glicose e da atividade da via glicolítica (FERNANDES, L.C., 1989). Considerando a

gordura dietética como um fator para a resistência à insulina, muitos estudos apontam

que o excesso de lipídeos dietéticos, principalmente os saturados, predispõe a menor

ação da insulina nos tecidos (LOMBARDO & CHICCO, 2006). Estudos em modelos

animais mostram que tanto a quantidade como a qualidade da gordura podem

determinar o aumento ou a redução da sensibilidade à insulina nos tecidos periféricos

(DELARUE et al., 2004).

Atualmente, vários modelos animais utilizados para o estudo da

resistência à insulina e do diabetes tipo II são obtidos pelo aumento da gordura

dietética, composta principalmente por ácidos graxos saturados. Dieta hiperlipídica com

gordura saturada em ratos levou a alteração da ação da insulina, como menor captação

e fosforilação da glicose nos músculos esqueléticos oxidativos (FRYER, 1995).

Além disso, o ciclo ácido graxo-glicose, proposto por Randle e

colaboradores (1963), explica a interação entre estes dois substratos, sendo que o

aumento dos ácidos graxos plasmáticos é capaz de reduzir o metabolismo de

carboidratos. O aumento na oxidação destes lipídeos, resulta em maior concentração

de intermediários metabólicos das vias aeróbias, inibindo enzimas chave da via

glicolítica. Sabe-se que situações de resistência à insulina, como diabetes tipo II e

obesidade, aumentam a concentração de ácidos graxos (SHULMAN et al. 2000;

PETERSEN et al., 2003). Ainda, o aumento dos ácidos graxos parece reduzir a

ativação das proteínas da via de sinalização da insulina, como IRS, PI3K, Akt,

comprometendo a captação, oxidação e armazenamento da glicose (CURI et al., 2002;

DRESNER et al., 1999).

Neste estudo, os ratos suplementados com gordura de coco produziram

menos lactato pelo músculo sóleo incubado quando adicionado 10000 µU/mL de

insulina, isto mostra que este tecido sofreu alterações na responsividade à insulina

(Figura 14). Este fato pode ter ocorrido pela alteração na via de sinalização da insulina,

comprometendo a captação da glicose, uma vez que foi observado menor expressão na

proteína Akt no músculo destes ratos. A Akt participa da via de sinalização deste

hormônio fosforilando alvos como a GSK-3 e facilita a translocação de vesículas

contendo GLUT-4 para a superfície da célula, promovendo entre outras ações a síntese

de glicogênio e a captação da glicose (CEFALU, 2001; MORINO et al., 2006). Apesar

da ativação desta proteína não ter sido estudada, a redução da expressão pode ter

comprometido a sinalização do hormônio e consequentemente a translocação do

GLUT-4 para a membrana. Em adição, devido a alteração na triacilglicerolemia nestes

ratos, o ciclo de Randle também pode ter participado neste processo através da

redução na metabolização da glicose, no entanto para confirmar esta hipótese enzimas

da via glicolítica devem ser analisadas.

Sabe-se que o controle da via glicolítica pela insulina ocorre na regulação

da entrada de glicose na célula e na posterior fosforilação, pela hexoquinase levando a

continuação do fluxo deste metabólito. Esta enzima tem papel importante na

manutenção da homeostase da glicose em todas as células que metabolizam glicose

para produção de ATP (KLEIN et al., 1991; MARSHALL et al., 1995; ASHOKKUMAR &

PARI, 2005). Deficiências em algumas enzimas do metabolismo da glicose parecem

estar presentes no distúrbio do diabetes (BEUTLER, 1988; ASHOKKUMAR & PARI,

2005, HIGUCHI et al.,2007). A enzima hexoquiinase estava reduzida em ratos

diabéticos induzidos por STZ, no período neonatal (ASHOKKUMAR & PARI, 2005).

Ainda, a baixa insulinemia dos ratos diabetizados com estreptozotocina não tratados

afetou o sistema de transporte de glicose no músculo esquelético, reduzindo a captação

estimulada por doses basal ou máxima de insulina (D`ALESSANDRO et al., 2000). Os

músculos sóleos dos animais diabéticos apresentaram menor produção de lactato na

presença de insulina (100 µU/mL e 10000 µU/mL ), ou seja, redução na sensibilidade e

responsividade ao hormônio (Figura 15). O comprometimento no metabolismo da

glicose pode ter ocorrido por alterações na via glicolítica ou na via de sinalização da

insulina, reduzindo a captação da glicose.

Pela análise das proteínas da via de sinalização da insulina,

possivelmente a redução significativa na expressão da proteína Akt no músculo pode

ter contribuído para a menor ação da insulina e captação da glicose (Figura 21). No

entanto o mesmo não foi observado em relação à proteína IRβ (Figura 20), sendo a

expressão desta similar em todos os grupos experimentais. Com isso, podemos sugerir

que neste modelo de diabetes tipo II, a alteração na sinalização da insulina não ocorre

na ligação do hormônio com o receptor e sim esta deve ocorrer em um evento pós-

receptor. Apesar de termos analisado somente as expressões destas proteínas nos

músculos esqueléticos dos ratos diabéticos, estas poderiam justificar parte do quadro

de resistência à insulina. Por outro lado, baseado em dados apresentados por outros

autores, os ratos provavelmente apresentavam quantidades reduzidas das enzimas do

metabolismo da glicose, como a hexoquinase. Em adição, a alteração encontrada nos

lipídeos plasmáticos dos animais diabéticos pode sugerir a competição dos metabólitos

ácido graxo–glicose pelas vias metabólicas, através do ciclo de Randle,

comprometendo o metabolismo da glicose. Sendo assim, pode-se sugerir que tanto

alterações na via de sinalização da insulina, quanto na via glicolítica contribuíram para

menor produção de lactato pelo músculo dos ratos diabéticos. Ainda, estes resultados

contribuem para a caracterização deste modelo animal de diabetes tipo II.

Sabe-se que os ácidos graxos n-3 possuem ação benéfica sobre a ação

da insulina, porém os mecanismos envolvidos neste efeito não estão totalmente

esclarecidos. A normalização dos triacilgliceróis plasmáticos, dos ácidos graxos livres e

também do conteúdo de triacilglicerol no tecido podem contribuir para a restauração da

homeostase da glicose e sensibilidade à insulina no músculo esquelético. Além disso, o

consumo de ácidos graxos n-3 induz mudanças na estrutura e fluidez das membranas

das células o que pode afetar a ação da insulina, através de alterações na via de

sinalização do hormônio (D´ALESSANDRO et al., 2000).

A suplementação com óleo de peixe nos animais diabéticos alterou a

produção de lactato pelo músculo sóleo estimulado por 100 µU/mL de insulina,

aumentando a sensibilidade do tecido ao hormônio (Figura 16). Porém, a dose máxima

de insulina não alterou a responsividade do tecido quando comparado aos grupos

diabéticos e diabéticos suplementados com gordura de coco. Os possíveis mecanismos

de ação do óleo de peixe em aumentar a sensibilidade à insulina, não foram

identificados através dos parâmetros analisados neste estudo. Ao investigar as

proteínas IRβ e Akt, observamos que não houve alteração na expressão destas em

relação ao grupo diabético não suplementado e suplementado com gordura de coco.

No entanto, não podemos descartar a hipótese que a suplementação com óleo de peixe

melhora a ativação das proteínas da via de sinalização da insulina, contribuindo para

captação da glicose, uma vez que não analisamos a ativação das proteínas estudadas

e também de outras proteínas da via. Contudo, a maior ativação desta via pode ser um

dos mecanismos, porém precisa ser investigado.

O estoque de glicogênio está intimamente ligado com ação da insulina e

homeostase da glicose. Grande parte da glicose captada nas fibras musculares em

resposta a insulina é depositada como glicogênio (BOUCHÉ et al., 2004). No nosso

estudo, foi encontrado redução na síntese de glicogênio no músculo dos animais

suplementados com gordura de coco, quando adicionado 100 µU/mL e 10000 µU/mL de

insulina (Figura 17). Os músculos dos animais que receberam gordura de coco podem

ter apresentado menor taxa de síntese de glicogênio durante a incubação pela redução

na captação de glicose e/ou também por alteração na via metabólica, menor expressão

da proteína Akt, envolvida na via de sinalização da síntese de glicogênio, e/ou pela

competição metabólica entre ácido graxo-glicose, como discutido anteriormente para a

produção de lactato do mesmo.

Em estudo conduzido por PETERSEN & SHULMAN (2002), avaliou-se o

destino da glicose após sua captação pelo músculo em sujeitos saudáveis e com

diabetes tipo II, através de uma técnica não invasiva, a ressonância magnética nuclear

por espectros de carbono 13. Os resultados mostraram que a síntese de glicogênio

representa a maior via não oxidativa do metabolismo da glicose em indivíduos normais.

Ainda, a formação de glicogênio em sujeitos com diabetes foi 60% menor comparado

com sujeitos saudáveis, evidenciando que a síntese de glicogênio foi profundamente

comprometida em pessoas com diabetes tipo II. Este estudo concluiu que a síntese de

glicogênio foi o maior defeito metabólico responsável pela resistência à insulina nestes

indivíduos. O menor conteúdo de glicogênio foi atribuído à redução no transporte da

glicose e na enzima hexoquinase, pois a concentração intracelular de glicose-6-fosfato

estava reduzida nos pacientes diabéticos. Caso a enzima glicogênio-sintase fosse a

etapa limitante desta via nos diabéticos, o conteúdo de glicose-6-fosfato estaria maior

ou inalterado (PETERSEN & SHULMAN, 2002).

A glicogênio sintase é a enzima limitante da síntese de glicogênio e sua

atividade é modulada pela fosforilação e desfosforilação. Porém, o mecanismo pelo

qual a insulina ativa a síntese de glicogênio ainda é controverso. A ativação da enzima

pode envolver fosfatases, como a proteína fosfatase-1 (PP1), via MAPK ou também via

proteína Akt. A fosforilação pela Akt inativa a GSK-3, o que desfosforila e aumenta a

atividade da glicogênio sintase (BOUCHÉ et al, 2004). Adicionalmente, a redução no

transporte da glicose como etapa limitante da síntese de glicogênio, a atividade da

glicogênio sintase encontra-se alterada no diabetes tipo II, porém existem dúvidas se é

um defeito primário ou conseqüência da hiperglicemia. A expressão da glicogênio

sintase é normal, sugerindo que a regulação da enzima encontra-se alterada (BOUCHÉ

et al, 2004).

Nossos resultados mostram que os músculos dos animais diabéticos

sintetizaram menos glicogênio, quando adicionado 100 µU/mL de insulina, quando

comparado com os ratos não diabéticos (Figura 18), corroborando os de PETERSEN &

SHULMAN (2002), que mostraram grande comprometimento desta via metabólica em

pacientes com diabetes tipo II.

Não podemos afirmar qual etapa limitante desta via estava comprometida

no músculo dos ratos diabéticos deste estudo. No entanto, da mesma forma como já foi

discutido, a redução da expressão da Akt, o ciclo de Randle e alteração na enzima

hexokinase podem ter comprometido a captação e metabolização da glicose e desta

forma a via da síntese de glicogênio estava reduzida, corroborando com achados em

humanos encontrados na literatura, onde esta via foi alterada pela menor captação da

glicose e redução da enzima hexoquinase. Em contrapartida, nosso estudo também

sugere alteração na regulação da via de sinalização da síntese de glicogênio, pelo perfil

da expressão da Akt no músculo destes ratos, uma vez que esta participa da ativação

da glicogênio sintase, enzima limitante da síntese de glicogênio. No entanto, a análise

da ativação da Akt, da expressão da GSK-3, da glicogênio sintase e/ou do conteúdo de

glicose-6-fosfato poderiam justificar esta hipótese.

As suplementações com óleo de peixe e gordura de coco não modificaram

os mecanismos da síntese de glicogênio nos músculos dos ratos diabéticos (Figura 19).

Apesar da suplementação com óleo de peixe nestes ratos ter aumentado a captação

e/ou metabolização da glicose, justificada pela maior produção de lactato, isto não

contribui para o aumento da síntese de glicogênio. Com isso, neste modelo de diabetes

tipo II, pode-se sugerir que esta via não dependa exclusivamente da captação ou

metabolização da glicose, talvez as alterações na via de sinalização da insulina em

especial na atividade da Akt, GSK-3 e assim na regulação e conteúdo da glicogênio-

sintase estejam realmente alterados e não foram modificados pelos ácidos graxos n-3.

Em resumo, nossos resultados mostram que a suplementação com

gordura de coco e o quadro diabético foram capaz de reduzir a sensibilidade e a

responsividade à insulina dos músculos sóleos dos ratos, possivelmente por alterações

na via de sinalização da insulina, pela competição entre os substratos ácido-graxo-

glicose pelas via metabólicas ou ainda redução ou desregulação de enzimas da via

glicolítica ou da síntese de glicogênio. A suplementação com óleo de peixe aumentou a

produção de lactato pelos músculos dos ratos diabéticos, porém não mostrou nenhum

efeito na síntese de glicogênio e também não modificou a ação da insulina nos ratos

não diabéticos.

7 CONCLUSÃO

- O quadro diabético nos animais foi confirmado com a presença de hiperglicemia,

intolerância à glicose, baixa insulinemia basal, secreção reduzida de insulina na

presença de glicose e resistência à insulina;

- Após o período experimental, os ratos diabéticos apresentaram hiperglicemia,

hipertriacilglicerolemia e hipercolesterolemia. O óleo de peixe não alterou nenhum

destes parâmetros, mas parece melhorar a primeira fase de secreção da insulina nestes

animais;

- Para os animais não diabéticos, a gordura de coco foi capaz de aumentar a

concentração plasmática de triacilglicerol e reduzir a sensibilidade e responsividade do

músculo sóleo à insulina, possivelmente por alterações na via de sinalização do

hormônio e pelo ciclo de Randle. A suplementação com óleo de peixe foi capaz de

reduzir a colesterolemia destes ratos;

-Os animais diabéticos apresentaram redução da sensibilidade e responsividade à

insulina no músculo sóleo, possivelmente por alterações na via de sinalização do

hormônio, envolvendo eventos pós-receptores e provavelmente a proteína Akt

participou deste processo. Ainda a competição entre ácido graxo-glicose e alterações

nas enzimas das vias metabólicas da glicose, como a hexoquinase e glicogênio-sintase

podem ter contribuído para esta característica.

- A suplementação com óleo de peixe para os diabéticos aumentou a sensibilidade à

insulina dos músculos sóleos, quando analisada a produção de lactato, sugerindo

aumento na captação da glicose e da glicólise, porém não foi capaz de melhorar a

síntese de glicogênio. Desta forma podemos sugerir que esta via metabólica neste ratos

não depende somente da captação e metabolização da glicose, mas também da

ativação de proteínas, como a Akt e GS3-K e também da enzima glicogênio-sintase.

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ANEXO – CERTIFICADO DO COMITÊ DE ÉTICA EM

EXPERIMENTAÇÃO ANIMAL

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