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ANGELO RAFAEL CALABRIA TANCREDI
ESTUDO CLÍNICO, EPIDEMIOLÓGICO, HISTOLÓGICO DE
PAPILOMAS DA MUCOSA ORAL E SUA RELAÇÃO COM O
PAPILOMAVÍRUSHUMANO (HPV) ATRAVÉS DAS TÉCNICAS DE
HIBRIDIZAÇÃO IN SITU E PCR
São Paulo
2007
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Angelo Rafael Calabria Tancredi
Estudo clínico, epidemiológico, histológico de papilomas da
mucosa oral e sua relação com o Papilomavírushumano (HPV)
através das técnicas de hibridização in situ e PCR
Tese apresentada à Faculdade de
Odontologia da Universidade de São
Paulo, para obter o título de Mestre pelo
Programa de Pós-Graduação em
Odontologia.
Área de Concentração: Diagnóstico Bucal
Orientador: Prof. Dr. Gilberto Marcucci
São Paulo
2007
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Catalogação na Publicação
Serviço de Documentação Odontológica
Faculdade de Odontologia da Universidade de São Paulo
Tancredi, Angelo Rafael Calabria
Estudo clínico, epidemiológico, histológico de papilomas da mucosa oral e sua
relação com Papilomavírushumano (HPV) através das técnicas de hibridização in situ e
PCR - São Paulo, 2007.
61: fig.; 30 cm.
Dissertação (Mestrado – Programa de Pós-Graduação em Odontologia. Área
de Concentração: Diagnóstico Bucal) -- Faculdade de Odontologia da Universidade de
São Paulo.
1. Papiloma bucal - 2. Papilomavírushumano - 3. Diagnóstico bucal
CDD 617.63
BLACK D62
AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE
TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA
FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE E
COMUNICADO AO AUTOR A REFERÊNCIA DA CITAÇÃO.
São Paulo, ____/____/____
Assinatura:
E-mail:
FOLHA DE APROVAÇÃO
Tancredi ARC. Estudos clínicos, epidemiológicos e histológicos de papilomas da
mucosa oral e sua relação com o Papilomavírushumano (HPV) através das técnicas
de hibridização in situ e PCR [Dissertação de Mestrado]. São Paulo: Faculdade de
Odontologia USP; 2007.
São Paulo, / /2007
Banca Examinadora
1) Prof(a). Dr(a).____________________________________________________
Titulação: _________________________________________________________
Julgamento: __________________ Assinatura: ___________________________
2) Prof(a). Dr(a).____________________________________________________
Titulação: _________________________________________________________
Julgamento: __________________ Assinatura: ___________________________
3) Prof(a). Dr(a).____________________________________________________
Titulação: _________________________________________________________
Julgamento: __________________ Assinatura: ___________________________
DEDICATÓRIA
À Deus por permitir ter Maria Lúcia e Raffaele, meus pais, que sempre tiveram a
compreensão e sempre me apoiaram incondicionalmente em todos os momentos e
decisões da minha vida. Minha eterna gratidão pelo exemplo de caráter e vida que
puderam me proporcionar. Amo vocês!
À minha irmã Patrícia, pela compreensão, amizade, carinho e pelos constantes
estímulos não permitindo que desanimasse jamais! Te amo irmã querida !
À minha tia Lila, agradeço a Deus por tê-la em meu caminho e na minha vida.
À minha noiva Krishna, mulher da minha vida, agradeço a amizade, o
companheirismo, a cumplicidade, a paciência, o amor e o incentivo que desde
sempre me proporcionou. Presente de Deus! Te amo sempre !
AGRADECIMENTOS
Ao meu orientador Prof. Dr. Gilberto Marcucci agradeço pela confiança depositada
na minha pessoa e no meu trabalho. Obrigado Professor pelo aprendizado e pela
oportunidade em ser seu orientado, isso carrego comigo eternamente.
Ao Prof. Dr. Fábio Daumas Nunes pela oportunidade de ter sua colaboração direta e
indiscutível para que fosse realizada essa pesquisa.
Aos meus primeiros Professores de Semiologia, André e Dulce, minha enorme
gratidão pelos primeiros ensinamentos e por toda a orientação no início da minha
caminhada. Tudo isso é fruto do estímulo de vocês!
Ao Prof. Dr. Celso Augusto Lemos Jr agradeço pela amizade e pelos ensinamentos
que foram consolidados por ti. Muito Obrigado!
Aos Professores da Disciplina de Estomatologia Clínica da Faculdade de
Odontologia da Universidade de São Paulo, pela amizade, convivência e por nos
ensinar de forma competente.
Aos Profs. Drs. e colegas Carlos Eduardo Ribeiro e Francisco Octávio Pacca pelo
apoio, pelas sugestões e pelo carinho. Muito Obrigado!
A todos os colegas de Pós Graduação em Diagnóstico Bucal da FOUSP, pelo
companheirismo e pela convivência que pudemos partilhar ao longo dessa jornada.
Agradecimento especial a Daniela Xavier Nunes e aos novos colegas da Patologia
Bucal, Renata Acay, Patrícia Adachi, Paulo Braz, Roberto Chico, Hélder Antônio,
Fábio Couracin, Tatiana Libório e Camila Rodini, com vocês este trabalho fica
engrandecido.
À Nina, Cida (CIDOCA), Cecília, Bia, Patrícia e Elisa por sempre se disponibilizarem
para que esse trabalho fosse desenvolvido. Muito Grato com todo meu carinho por
vocês.
A CAPES pela bolsa de Mestrado no programa Demanda Social
Agradeço a todos que de alguma forma contribuíram para a elaboração deste
trabalho.
Um professor influi para a eternidade; nunca se pode dizer até onde vai a sua
influência.
(Henry B. Adams)
A esperança adquire-se. Chega-se à esperança através da verdade, pagando
o preço de repetidos esforços e de uma longa paciência. Para encontrar a
esperança é necessário ir além do desespero. Quando chegamos ao fim da noite,
encontramos a aurora.
(Georges Bernanos)
A felicidade não está no fim da jornada, mas sim em cada curva do caminho
que percorremos para a encontrar.
(Autor desconhecido)
Tancredi, ARC. Estudos clínicos, epidemiológicos e histológicos de papilomas da
mucosa oral e sua relação com o Papilomavírushumano (HPV) através das técnicas
de hibridização in situ e PCR [Dissertação de Mestrado]. São Paulo: Faculdade de
Odontologia USP; 2007.
RESUMO
O Papilomavírushumano (HPV) é um DNA vírus do grupo papovavírus, que é
altamente transmissível sexualmente, sendo bastante encontrado na região
anogenital e mucosa oral. A sua implantação oral pode ser por auto-inoculação ou
pelo contato oro-sexual. As principais manifestações orais associadas ao HPV são:
papiloma, condiloma acuminado, verruga vulgar e hiperplasia epitelial focal. O
papiloma é uma lesão epitelial associada ao HPV e pode ocorrer em vários locais da
mucosa oral. Histopatologicamente, o papiloma oral é caracterizado por coilocitose,
disceratose, papilomatose, hiperceratose e acantose. A literatura ressalta a
importância do estudo dessas lesões, uma vez que estudos demonstram que
mesmo com os achados macroscópicos e histológicos serem compatíveis com a
presença do vírus, somente técnicas de detecção podem comprovar a presença
viral.O objetivo deste estudo foi verificar a presença do HPV, por meio das técnicas
de hibridização in situ e PCR, em lesões diagnosticadas histopatologicamente como
papilomas e comparar esses resultados com características clínicas e histológicas.
Cinqüenta casos foram selecionados da Disciplina de Patologia Bucal e da Disciplina
de Estomatologia Clínica da FOUSP. Esta seleção de 50 casos foi submetida à
reação de hibridização in situ, e 10 casos dentre os mesmos por técnica da PCR e
100% casos foram negativos. Nenhuma das características histológicas previamente
analisadas puderam formar estreita relação com a hibridização in situ e PCR.
Conclui-se que a análise histopatológica ao HE não se correlaciona com os
resultados das técnicas de hibridização in situ e PCR, porém importante ressaltar
para detecção do HPV nas lesões estudadas é imprescindível o uso de técnicas de
Biologia Molecular otimizadas como a hibridização in situ e PCR realizadas nesse
estudo.
Palavras-chave: Papiloma oral – papilomavírushumano (HPV) – hibridização in situ –
PCR - diagnóstico histopatológico – diagnóstico molecular
Tancredi, ARC. Clinic, epidemiologic, histologic study of oral papillomas and its
relation to Humanpapillomavirus (HPV) by In Situ Hybridization and PCR
[Dissertação de Mestrado]. São Paulo: Faculty of Dentistry USP; 2007.
ABSTRACT
The Humanpapillomavirus (HPV) is a DNA virus from the group of papovavirus,
which is highly sexually transmitted and it can be often found in the anogenital area
and in the oral mucosal. The oral implantation can be by self-inoculation or by the
oral sexual contact. The main oral appearances associated to HPV are: papilloma,
condylomata acuminata, verruca vulgaris and focal epithelial hyperplasia. Papilloma
is an epithelial lesion that is associated to HPV and can occurs in many places of the
oral mucosal. Histopathologically, the oral papilloma is characterized by koylocitosis,
dyskeratosis, papillomatosis, hyperkeratosis and acanthosis. The literature shows the
importance of these lesions once studies show that macroscopic and histologic
founds suggest the presence of the virus, only detection technics can prove the viral
presence. The target of this study is to check the presence of HPV, by means of In
situ hybridization and PCR, in lesions diagnosed histopathologically as papillomas
and compare these results with clinic and histologic features. Fifty cases were
selected from the Discipline of Oral Pathology and the Discipline of Oral Diagnose of
FOUSP. This selection of 50 cases were submitted to the reaction of In situ
hybridization, and 10 cases among the same by PCR and 100% of the cases were
negative. None of the histologic features were previously analyzed could form a
narrow relation with the In situ hybridization and PCR. Therefore it is concluded that
the histopathologic analysis to HE do not correlate with the results of the In situ
hybridization and PCR, however the detection of the HPV in the studied lesions it is
absolutely necessary the use of Molecular Biology techniques as the In situ
hybridization and PCR done in this study.
Key Words: Oral papilloma – Humanpapillomavirus (HPV) – In situ hybridization –
PCR - histopathologic diagnose – molecular diagnose
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 2.1 – Mapa Genômico do HPV tipo 16 ..........................................................18
Figura 4.1 - Gel de Agarose 2% mostrando amplificação PCR da lesão ..................37
Figura 5.1 – Aspectos clínicos e localização mais freqüente ....................................38
Figura 5.2 - Aspectos clínicos e localização mais freqüente .....................................38
Figura 5.3 - Aspectos clínicos e localização mais freqüente .....................................38
Figura 5.4 - Características histopatológicas do papiloma ........................................39
Figura 5.5 - Gel de agarose 2% mostrando resultado da amplificação por PCR do
DNA da lesão mostrando da esquerda para a direita, o marcador de peso molecular
(LM), o controle positivo (C+) com bandas iluminadas para 200pb e 400pb, as 10
amostras e o controle negativo (C-)...........................................................................43
Figura 5.6 - Imagem da PCR mostrando negatividade em todos os casos (1-10).
Observar os marcadores de peso molecular (LM) na primeira coluna, os dois
controles positivos C+, na segunda e terceira coluna, e o controle negativo na última
coluna.........................................................................................................................43
LISTA DE TABELAS E GRÁFICOS
Quadro 4.1 - Dados referentes aos iniciadores GP5-GP6.........................................35
Quadro 4.2 - Concentração dos reagentes utilizados nas reações de PCR..............35
Gráfico 5.4 -Características Histopatológicas............................................................39
LISTA DE ABREVIATURA E SIGLAS
HPV Papilomavírushumano
HIV Vírus da Imunodeficiência Humana
PCR Polymerase Chain Reaction (Reação da polimerase em cadeia)
HE Hematoxilina e Eosina
DNA Ácido desoxirribonucléico
NaCl Cloreto de sódio
MgCL2 Cloreto de magnésio
ISH In Situ Hybridization (Hibridização in situ)
CSA-ISH In Situ Hybridization (Hibridização in situ com sinal amplificado)
LISTA DE SÍMBOLOS
o
C Graus Celsius
W Watts
μm Micrômetro
μl Microlitro
μg Micrograma
μM Micromol
dNTP Deoxinucleotídeotrifosfato
nt Nucleotídeo
M Molar
mL Mililitro
mM Milimolar
rpm Rotações por minuto
OD Densidade óptica
pmol Picomol
pb Pares de base
SUMÁRIO
p.
1 INTRODUÇÃO .......................................................................................................13
2 REVISÃO DA LITERATURA .................................................................................16
2.1 Papilomavírushumano (HPV) ...........................................................................16
2.2 Papiloma oral – características clínicas, epidemiológicas e histológicas...20
2.3 Testes diagnósticos para detecção do HPV ...................................................23
3 PROPOSIÇÃO........................................................................................................29
4 MATERIAL E MÉTODOS.......................................................................................30
4.1 Casuística e análise morfológica.....................................................................33
4.2 Técnica de Hibridização in situ .......................................................................30
4.3 Características Histopatológicas ....................................................................32
4.4 Análise e critérios adotados para interpretação dos resultados da ISH..... 33
4.5 Reação da PCR para HPV................................................................................ 33
4.6 Análise e critérios adotados para resultado da técnica da PCR.................. 36
5 RESULTADOS ......................................................................................................38
5.1 Dados Clínicos...................................................................................................38
5.2 Características histopatológicas .....................................................................39
5.3 Positividade para sonda HPV amplo espectro para CSA-ISH........................42
5.4 Amplificação para sonda HPV amplo espectro na PCR.................................43
6 DISCUSSÃO ..........................................................................................................44
7 CONCLUSÕES ......................................................................................................52
REFERÊNCIAS .........................................................................................................53
ANEXOS ...................................................................................................................58
13
1 INTRODUÇÃO
O Papilomavírushumano (HPV) é um vírus pertencente à família dos
papovavírus de tamanho reduzido e DNA circular, de fita dupla, epiteliotrópico, não
envelopado, com cerca de 8000 pares de bases e com estrutura física e organização
gênica bem conhecida. Seu genoma é composto de genes precoces (E), cuja função
primária é a replicação epissomal e genes tardios (L), que codificam as proteínas do
capsídeo viral. Os genes precoces (E) são divididos em E1 a E7 e os tardios em
L1/L2 (BODINI; FIAMMINGHI, 1989; KUROSE; TERAI; SOEDARSONO, 2003;
LOPES; MEEKS, 2001; SOUTO; FALHARI; CRUZ, 2005; TERAI; TAKAGI, 2001). O
HPV está envolvido na patogênese de papilomas orais, condiloma acuminado,
verruga vulgar e hiperplasia epitelial focal (BISHOP; EMANUEL; SIMS, 1998;
BODINI; FIAMMINGHI, 1989; CHANG et al., 1991; COSTA et al., 1994; DHARIWAL;
CUBIE; SOUTHAM, 1995; PIGNATARI; WECKX; BORDASCH, 1995; SCULLY;
PRIME; MAITLAND, 1985; SOARES et al., 2005; SYRJANEN, 2003).
As células basais do epitélio são o alvo da infecção pelo vírus onde este
atinge seus núcleos através de microlacerações no epitélio causando lesões que
são acompanhadas de uma hiperplasia do epitélio, característica comum de lesões
induzidas por HPV (CHANG et al., 1991).
O papiloma oral é uma lesão benigna da mucosa oral que acomete
principalmente a língua e palato, sem predileção por sexo. Inicialmente era descrito
como um neoplasma benigno intraepitelial, porém alguns têm demonstrado sua
etiologia viral, fato esse relevante devido à grande variedade, complexidade e fácil
14
transmissão desse vírus, inclusive por auto inoculação (SCULLY; PRIME;
MAITLAND, 1985; SOARES et al, 2005).
Clinicamente, o papiloma oral apresenta-se como um crescimento exofítico,
peduncular, indolor, cuja superfície mostra projeções digitiformes ou verrucosas,
mais comumente encontrado em língua e palato. O diagnóstico diferencial se faz
com verruga vulgar, hiperplasia epitelial focal e condiloma acuminado. Apresenta
quadro histopatológico caracterizado por crescimento peduncular exofítico com
tecido conjuntivo fibroso recoberto com projeções epiteliais papilares e
freqüentemente hiperqueratose, coilocitose, disqueratose, papilomatose e acantose
(ABBEY; PAGE; SAWYER, 1980; CHANG et al., 1991; EVERSOLE; LAIPIS, 1988;
SYRJANEN, 2003; YAMAGUCHI et al. 1998).
O diagnóstico de infecção pelo HPV é frequentemente baseado em uma
combinação de aparências clínicas e histopatológicos dos tecidos que foram
submetidos à biópsia (SCULLY; PRIME; MAITLAND, 1985). Atualmente, a reação
em cadeia da polimerase (PCR) e a técnica de hibridização in situ são técnicas
frequentemente utilizadas quando se procura estabelecer qual subtipo viral está
presente no tecido biopsiado. Como o HPV-6 e o HPV-11 são classificados como
baixo risco ou não oncogênicos, e os HPV-16 e HPV-18 são classificados como de
alto risco ou oncogênicos, é muito importante o uso de técnicas sensíveis e
eficientes para definir o subtipo viral (TERAI; TAKAGI, 2001).
Apesar dos diversos aspectos citados que justifiquem o envolvimento do HPV
na iniciação e progressão de várias lesões orais alguns fatores não estão
suficientemente esclarecidos. Dentre estes fatores podemos destacar o achado
freqüente de vários tipos de HPV em mucosa normal, com incidência variando de
0% a 81% incluindo os HPV de alto e baixo risco. Acredita-se que esta presença
15
pode estar associada a infecções sub-clínicas ou latentes ou a um quadro infeccioso
com um baixo número de cópias do vírus ou ainda, que a cavidade oral funcione
como um reservatório de HPV (TERAI; TAKAGI, 2001).
Outros fatores a serem considerados que limitam a comprovação do papel do
HPV no desenvolvimento de lesões orais são: a variação da sensibilidade dos
métodos de detecção empregados, a divergência de tipos de material pesquisado,
bem como à diversidade das populações estudadas e as dimensões das lesões
(ELAMIN et al., 1998). Por este motivo, o emprego de métodos de alta sensibilidade
e a padronização de amostras representativas constitui condição fundamental para a
realização de estudos de alta confiabilidade.
16
2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1 Papilomavírushumano (HPV)
O Papilomavírushumano (HPV) é um pequeno vírus de 55 nm de diâmetro
com DNA circular de fita dupla, não envelopado, epiteliotrópico, com cerca de 8.000
pares de bases e com estrutura física e organização gênica bem conhecida
(SCULLY; PRIME; MAITLAND, 1985; TERAI; TAKAGI, 2001). As partículas
icosaédricas do papilomavírus contêm 72 capsômeros e são dependentes do meio
de diferenciação terminal dos ceratinócitos para replicação, síntese do capsídeo e
montagem do vírus (OLIVEIRA et al., 2005; SCULLY; PRIME; MAITLAND, 1985).
O genoma do HPV é composto de early-phase genes ou genes precoces (E),
cuja função primária é a replicação epissomal, late-phase genes ou genes tardios
(L), que codificam as proteínas do capsídeo viral e uma região longa de controle
(LCR) que compreende apenas cerca de 10% do genoma viral. Os genes precoces
(E) são divididos em E1 a E7 e os tardios em L1 e L2. Os genes E6 e E7 por sua vez
são regulados pelos genes inibidores E1 e E2. A seqüência entre o fim de L1 e o
começo de E6 é a região longa de controle (LCR) e é conhecida também como
região não codante (NCR). Essas regiões contêm muitas das seqüências
regulatórias cis que controlam a transcrição e a replicação (OLIVEIRA et al., 2006).
Os produtos dos genes E1 e E2 estão mais especificamente ligados à
regulação da transcrição e replicação das proteínas virais. Quando há integração do
genoma viral ao genoma da célula hospedeira, esses genes podem ser alterados ou
17
deletados levando à transcrição descontrolada das proteínas, inclusive das
oncoproteínas virais E6 e E7 (HA; CALIFANO, 2004). Essas oncoproteínas são
capazes de interferir em importantes mecanismos de controle do ciclo celular,
apoptose e manutenção da estabilidade cromossômica, o que pode explicar a
patogênese das doenças associadas à infecção por HPV (WENTZENSEN;
VINOKUROVA; VON KNEBEL-DOEBERITZ, 2004). Acredita-se que as células
tumorais resultam da desrregulação de duas grandes vias de controle do ciclo
celular: a via do p53 e a via do pRB e é justamente nessas duas vias que as
oncoproteínas produzidas pelo HPV têm sua ação (FREGONESI et al., 2003).
A oncoproteína E6 pode se ligar e interferir no funcionamento do produto do
gene supressor de tumor p53. Essa inativação da proteína p53 é fator conhecido
para o desenvolvimento de neoplasias malignas em diversos sítios do corpo
humano, inclusive em carcinomas epidermóides orais – a inativação do gene p53
seja por mutação ou por infecção por HPVs de alto risco é extremamente freqüente
em diversas linhagens celulares de carcinoma epidermóide oral (MIN et al., 1994). A
progressão para a malignidade é acompanhada pela perda de um mecanismo
regulatório intracelular de inspeção, o qual correlaciona-se com uma abundante
expressão gênica viral (TERAI; TAKAGI, 2001).
Além disso, E6 produzidas por HPVs de alto risco podem ativar a enzima
telomerase, que sabidamente é outro fator envolvido na carcinogênese (SCULLY,
2002).
A oncoproteína E7 pode se ligar e interferir no funcionamento do produto do
gene supressor de tumor Rb1 (pRB) e proteínas relacionadas. A forma
hipofosforilada de pRB forma um complexo com o fator de transcrição E2F e impede
a progressão do ciclo celular de G1 para S. E7 é capaz de romper essa interação
18
entre pRB e E2F, permitindo que E2F ative seus subseqüentes alvos celulares
necessários para a progressão do ciclo celular (FREGONESI et al., 2003).
Além de E6 e E7, o gene E5 pode estar envolvido também, já que seu
produto, a proteína E5, altera a resposta dos receptores tirosino-quinase nas células
e pode assim modular o receptor de EGF (SCULLY, 2002), estimulando o
crescimento epitelial (TINOCO et al., 2004).
A figura abaixo representa o mapa genômico do HPV 16 que pode ser
considerado como um protótipo genômico para todos os tipos de HPV (HUBBARD,
2003).
A transmissão do HPV para a mucosa oral ocorre por auto-inoculação ou é
sexualmente transmissível, no entanto, a transmissão vertical da mãe para o recém-
nascido também tem sido descrita.Na mucosa oral, a língua é o local mais freqüente
para infecções pelo HPV, seguido por: palato, mucosa jugal, lábios, tonsila, úvula,
Fi
g
ura 2.1
–
Ma
p
a
g
enômico do HPV ti
p
o 16
19
gengiva e assoalho de boca (SCULLY; PRIME; MAITLAND, 1985; SOARES et al.,
2005).
A infecção pelo HPV é iniciada quando uma partícula viral penetra em células
basais e células indiferenciadas e em divisão do epitélio. Nas células basais e
parabasais, o DNA viral replica em um baixo padrão e apenas genes precoces são
transcritos, também em baixo padrão. Multiplicação extensiva do DNA viral e
transcrição de todos os genes virais, bem como formação do capsídeo, ocorre
apenas nas camadas mais superficiais do epitélio. O vírus multiplica-se
exclusivamente no núcleo de células infectadas. No entanto, a manifestação
patológica associada ao HPV é confinada aos sítios onde a infecção foi iniciada.
Partículas virais com capsídeos completos estão, portanto, ausentes nas células
basais, e a replicação produtiva do HPV está restrita às células nos estratos
espinhoso e granuloso (OLIVEIRA et al., 2006).
Devido os avanços na biologia molecular e genética, mais de 130 tipos de
HPV já foram identificados. Destes, 25 tipos foram associados com lesões bucais
(HPVs-1,2, 3, 4, 6, 7, 10, 11, 13, 16, 18, 30, 31, 32, 33, 35,40, 45, 52, 55, 57, 59, 69,
72 e 73). O HPV pode ser classificado como de alto ou baixo risco, dependendo da
associação do tipo viral e malignidade. OS HPV-6 e HPV-11 têm um baixo risco de
associação com a malignidade e estão comumente relacionados à etiologia de
lesões proliferativas orais, como o papiloma e o condiloma acuminado, enquanto, os
HPV-16 e HPV-18 são os tipos mais prevalentes em lesões malignas orais e por isto
são chamados de oncogênicos ou de alto risco (SYRJANEN, 2003).
Apesar dos diversos aspectos citados que justifiquem o envolvimento do HPV
na iniciação e progressão dos carcinomas orais alguns fatores não permitem defini-
lo com precisão como um fato carcinogênico independente. Dentre estes fatores
20
podemos destacar o achado freqüente de vários tipos de HPV em mucosa normal,
com incidência variando de 0% a 81%, o que inclui os HPVs de alto e baixo risco.
Acredita-se que esta presença pode estar associada a infecções sub-clínicas ou
latentes ou a um quadro infeccioso com um baixo número de cópias do vírus ou
ainda, que a cavidade oral funcione como um reservatório de HPV (TERAI; TAKAGI,
2001). Porém estudos recentes com casuística expressiva e método muito sensível
mostraram prevalência na mucosa normal entre 1 e 2% (HA; CALIFANO, 2004).
A posição das células infectadas no epitélio também pode indicar a relação
entre infecção e lesão. Segundo Campisi et al. (2006), DNA de HPV encontrado nas
camadas basal e suprabasal do epitélio representam infecção latente. Nessa forma
inativa, o HPV não expressa suas oncoproteínas virais e, portanto, não interfere no
ciclo celular. Os autores reforçam que esse tipo de infecção é de importância
limitada na análise da relação entre infecção por HPV e lesões em mucosa oral.
2.2 Papiloma Oral – características clínicas, histopatológicas e etiopatogenia
O papiloma foi relatado pela primeira vez por Shope e Hurst (1933) em
coelhos e a partir desse estudo um número cada vez mais expressivo de lesões foi
relacionado à ação e patogênese do HPV inclusive o papiloma, que primeiramente
era descrito apenas como um neoplasma benigno intraepitelial (SCULLY; PRIME;
MAITLAND, 1985; SOARES et al., 2005).
A condição é descrita como a lesão mais comum relacionada ao HPV e
considerada como uma neoplasia benigna e geralmente apresenta-se como um
21
crescimento exofítico.O papiloma oral é o tumor benigno mais diagnosticado (1-
4.6%) e mais freqüentemente encontrado na língua, palato e lábio inferior, podendo
ocorrer em qualquer idade, porém mais prevalente entre a 3º. e 5º. décadas de vida
e distribuído igualmente entre os sexos (ABBEY; PAGE; SAWYER, 1980; BODINI;
FIAMMINGHI, 1989; COSTA et al., 1994; EVERSOLE; LAIPIS, 1988;
GREER;GOLDMAN, 1974; WARD et al.,1995; YAMAGUCHI et al.,1998).
Clinicamente, o papiloma oral apresenta-se como um crescimento exofítico,
peduncular, indolor, menor que 10mm, cuja superfície mostra projeções digitiformes
ou verrucosas, mais comumente encontrado em língua e palato. O tratamento é
cirúrgico com pequena margem de segurança para evitar a ocorrência de
recidivas.O diagnóstico diferencial se faz com verruga vulgar, hiperplasia epitelial
focal e condiloma acuminado (ABBEY; PAGE; SAWYER, 1980; CHANG et al., 1991;
EVERSOLE; LAIPIS, 1988; LOPES; MEEKS, 2001; SYRJANEN, 2003; WARD et al.,
1995; YAMAGUCHI et al., 1998).
O quadro histopatológico do papiloma oral é caracterizado por uma
proliferação do epitélio escamoso estratificado queratinizado, múltiplas projeções
papilomatosas com áreas centrais de tecido conjuntivo fibrovascular, estes podem
apresentar componentes inflamatórios dependendo do trauma causado pela lesão.
Freqüentemente encontra-se hiperqueratose, disqueratose, papilomatose, acantose
e coilocitose (ABBEY; PAGE; SAWYER, 1980; BODINI; FIAMMINGHI, 1989; COSTA
et al., 1994; CHANG et al., 1991; GREER; GOLDMAN, 1974; OSHIRO et al., 1996;
SILVA; QUEIROZ, 2006; SOARES et al., 2005; YAMAGUCHI et al., 1998).
Uma característica bastante marcante no quadro histopatológico do papiloma
oral é a presença de coilócitos, que pode ser definido como a presença de células
exibindo núcleos picnóticos, contornado por extensos halos claros com volume
22
geralmente semelhante ao citoplasmático, ocorrendo preferencialmente em células
superficiais (CHANG et al., 1991; EVERSOLE; LAIPIS, 1988; OLIVEIRA et al.,
2005).
A presença do HPV em células epiteliais causa danos que podem ser
visualizados em microscopia de luz. O termo coilócito, que significa célula vazia, foi
introduzido por Koss e Durfee (1956) para descrever as células de tamanho
aumentado, apresentando núcleo pequeno, irregular e hipercromatico, circundado
por um halo claro negativo para glicogênio, que eram observadas em algumas
lesões cervicais. Hoje sabe-se que os coilócitos não são patognomônicos para
infecção por HPV e que essas alterações celulares são resultantes da degeneração
produzida pela infecção viral ativa. Associada com outras características histológicas
como acantose, disqueratose e multinucleação de queratinócitos, a presença de
coilócitos é usada como evidência e sugestão, em microscopia de luz, de infecção
por HPV em lesões planas ou papilares (FORNATORA et al., 1996; ZIOL et al.,
1998). Entretanto essas características histológicas são apenas sugestivas; para a
confirmação da infecção pelo HPV é necessário que se realize algum teste que
detecte a presença do vírus.
Foram adicionados características histopatológicas como cariorrexis,
alteração de cromatina, hipercromatismo nuclear e células bi ou multinucleadas para
associar à lesão com a infecção por HPV, de acordo com um protocolo
citomorfológico em lesões cérvico-uterinas, proposto por Yamamoto et al. (2004) que
fizeram uso desse protocolo para aumentar a especificidade de testes que detectam
a presença de infecção por HPV.
23
2.3 Testes diagnósticos para a detecção do Papilomavírushumano (HPV)
São vários os métodos de identificação dos genomas do HPV e seus
transcritos nos tecidos humanos, que incluem imunoperoxidase, hibridizações,
PCRs, captura híbrida, sequenciamento de DNA, dentre outros (MOLIJN et al.,
2005).
Os métodos têm sensibilidade e especificidade variadas e por este motivo
podem ser separados em três categorias (OLIVEIRA et al., 2005):
• Baixa sensibilidade: microscopia eletrônica, imunoistoquímica,
imunofluorescência e hibridização in situ. Em virtude de apenas
detectar o vírus quando estão presentes em mais de 10 cópias de DNA
viral por célula.
• Moderada sensibilidade: Southern blot, dot blot e hibridizações blot
reversas. Pois detectam o vírus quando 1 a 10 cópias do DNA viral
estão presentes por célula.
• Alta sensibilidade: Reações em Cadeia da Polimerase (PCR). Por ser
capaz de detectar um genoma viral em até 100.000 células.
Apesar desta classificação ser adotada para estudos experimentais, torna-se
extremamente importante, considerar o contexto em que o método é utilizado.
Diversos são os fatores que influenciam na sensibilidade do teste diagnóstico e por
isto alteram a classificação sugerida acima. Dentre estes podemos citar: a
integridade do genoma, o tamanho do fragmento de DNA do vírus, o tipo de amostra
disponível, se tecidos frescos ou fixados e emblocados em parafina, a quantidade de
24
cópias do genoma viral e o tamanho macroscópico do espécime obtido. Para a
determinação da sensibilidade do método, devem estar asseguradas a qualidade e
pureza das amostras (OLIVEIRA et al., 2005; TERAI; TAKAGI, 2001).
A hibridização in situ classificada por Oliveira et al. (2005) como um teste de
baixa sensibilidade não pode ser aplicada a este estudo, que utilizou a reação de
hibridização in situ com sinal amplificado (CSA-ISH) e os autores que a utilizam
acreditam ser uma técnica equivalente em sensibilidade a PCR para detecção de
DNA viral em tecidos( BRITO; VASSALLO; ALTEMANI, 2000).
A técnica de imunoistoquímica não tem valor diagnóstico na infecção por HPV
apesar da sensibilidade e especificidade na identificação de diversos outros vírus,
devido a existência de muitos genótipos de HPV e também porque o DNA viral é
bem mais abundante do que proteínas virais na infecção ativa (NUOVO, 2006). PCR
e ISH são os métodos mais amplamente utilizados: o primeiro por ser
comprovadamente o mais sensível e o segundo por permitir a localização
morfológica das células infectadas no tecido (HERRINGTON, 1998; HUBBARD,
2003). Na tentativa de solucionar suas limitações, mais recentemente dois novos
métodos foram propostos, Nested PCR e amplificação de sinal para ISH,
proporcionando localização morfológica na ISH e maior sensibilidade na PCR
(DABIC et al., 2004; NUOVO, 2006). Não há um método seguro que determine a
relação causal vírus-doença, embora a detecção do HPV seja fortemente sugestiva;
a avaliação de outros fatores como carga viral, soropositividade, estado de
integração vírus-hospedeiro e posição das células infectadas no epitélio podem
contribuir no sentido de comprovação de infecção por HPV (HUBBARD, 2003;
SCULLY, 2002).
25
Outros fatores a serem considerados que impedem a comprovação do papel
do HPV no desenvolvimento de lesões orais são: a variação da sensibilidade dos
métodos de detecção empregados, a divergência de tipos de material pesquisado,
bem como à diversidade das populações estudadas e o tamanho da amostra
(ELAMIN et al., 1998). Por estes motivos, o emprego de métodos de alta
sensibilidade e a padronização de amostras representativas constitui condição
fundamental para a realização de estudos de alta confiabilidade.
Existe ainda a possibilidade de se pesquisar a soropositividade para HPV,
porque a ausência do DNA viral na mucosa não significa necessariamente que o
indivíduo nunca tenha sido exposto ao vírus (HA; CALIFANO, 2004). De acordo com
o estudo de Dahlstrom et al. (2003), o vírus pode ter estado naquela mucosa,
eventualmente até causando alguma alteração genética, e depois ter desaparecido –
a detecção dessa infecção passada só é possível então através da pesquisa de
anticorpos contra HPV. Esses autores sugerem que essa avaliação sorológica possa
ser até melhor que a simples detecção de DNA de HPV.
A literatura envolvida nos últimos 20 anos segundo Tinoco et al. (2004)
demonstraram que os estudos realizados neste período revelaram a importância do
HPV em lesões da cavidade oral e orofaringe. A maioria absoluta dos autores
acreditam haver relação do HPV com estas lesões. Seja por um co-fator, ou apenas,
um agente de proliferação celular; outros porém o confirmam como agente
etiológico.
O HPV como agente etiológico do papiloma oral está comprovado da mesma
forma que lesões papilares do trato genital e pele (condiloma acuminado e verruga
vulgar), porém os casos que não se comprovam a detecção do vírus estão
geralmente relacionados com a técnica utilizada e as características das amostras.
26
Os estudos utilizando a técnica de hibridização in situ em blocos de parafina
demonstraram que foram obtidos 7 casos positivos (35%) para HPV 6 e 11 entre os
20 casos selecionados e dupla infecção por HPV 2 e 6 quando os ensaios foram
submetidos a condições de alta estringência . Os 13 casos negativos podem não ter
reagido com as sondas empregadas ou pelo fato do DNA viral se encontrar em um
pequeno número de cópias, insuficiente para o nível de detecção do método
utilizado neste estudo.Histologicamente 45% dos papilomas orais apresentaram
células semelhantes a coilócitos na camada espinhosa, o que não interferiu
expressivamente na detecção do vírus (EVERSOLE; LAIPIS, 1988).
Segundo as tendências de desenvolvimento de técnicas aplicadas em
Patologia tem sido claro que apenas a microscopia óptica e procedimentos de
coloração são insuficientes para suspeitar da etiologia de algumas lesões
associadas ao HPV, por isso que estudos realizados por Syrjanen, Syrjanen e
Lamberg (1986) utilizaram a técnica de hibridização in situ,com sondas de amplo
espectro e sob condições elevadas de estringência, obteve em um total de 7
papilomas uma positividade de 4 casos (57%), evidenciando uma forte implicação
do HPV como agente causador desses papilomas e enfatizando a técnica como
poderosa ferramenta na detecção do HPV.
Young e Min (1991) analisaram 21 pacientes com diagnóstico de papiloma
oral, os quais foram submetidos a técnica de hibridização in situ com sondas
específicas e neste estudo 13 papilomas escamosos (62%) foram positivos para
HPV 6 e 11. Os autores evidenciaram que não houve nenhuma correlação entre os
casos positivos e os aspectos histológicos (séssil ou pediculado, coilocitose ou
padrão de queratinização).
27
Estudos feitos por Zeuss, Miller e White (1991) utilizaram 30 casos de
papilomas orais emblocados em parafina os quais foram submetidos a técnica de
hibridização in situ com sondas para HPV 6 e 11. Dos 30 casos selecionados
apenas 4 (13.3%) apresentaram positividade para HPV. Quanto à comparação
histológica apenas 2 casos positivos apresentaram células semelhantes a coilócitos.
Jimenez et al. (2001) utilizaram o exame de PCR em blocos parafinados de
biópsias com diagnóstico de papiloma oral e do total de 27 casos, 11 (40.74%) foram
positivos para HPV. Os autores enfatizam que os casos negativos podem estar
associados a diversos fatores: pequenas quantidades de DNA ou mesmo o fato da
maioria das infecções orais causadas por HPV serem provavelmente infecções
pouco produtivas ou até mesmo em estado latente.
O estudo realizado por Syrjanen et al. (1987) avaliaram uma série de 92
casos de papiloma/condiloma acuminado. O critério para incluir as duas lesões
deve-se a similaridade histológica de ambas lesões. Realizada a técnica de
hibridização in situ em amostras emblocadas em parafina obteve-se dos 92 casos,
45 casos positivos (48.9%) para as sondas específicas de HPV 6, 11 e 13.
Loning et al. (1985) realizaram um estudo com 5 papilomas orais, 5
leucoplasias e 6 carcinomas. Realizada a técnica de hibridização in situ nos 5
papilomas emblocados em parafina, os autores obtiveram 4 casos (80%) positivos
com sondas de amplo espectro sem condições de estringência. Ressaltado pelos
autores que um dos casos negativos não havia discrepância entre os resultados
imunohistológicos x presença do vírus; avaliaram que isso se deve provavelmente
pela perda do tecido infectado pelo vírus durante a secção do tecido a ser tratado.
Em estudo realizado por Dhariwal, Cubie e Southam (1995) avaliaram 3 kits
para tipagem do HPV em 20 lesões (19 condiloma acuminado e 1 papiloma
28
escamoso). A técnica de hibridização in situ foi realizada a partir dos blocos de
parafina e o Kit BIOHIT HPV in situ Typing Test (Croft Biotech, UK) possibilitou a
positividade para HPV neste caso de papiloma por ser o que apresentou maior
sensibilidade entre os kits utilizados.
A comparação entre PCR e ISH foi avaliada por Ward et al. (1995). Nesse
estudo os autores utilizaram 19 casos com diagnóstico de papiloma oral e
submeteram os mesmos a técnica da PCR. Os resultados evidenciaram a
participação do HPV 6 e 11 em 13 casos (68%). Esses resultados contrariam
estudos dos próprios autores quando utilizaram 30 casos (13.3%) submetidos a ISH
para detecção do DNA do HPV, onde haviam aproximadamente 20 a 50 cópias virais
por célula ou não havia seqüências de DNA ou até mesmo poucas cópias para
serem detectadas por ISH.
A análise do HPV 16 e 18 em papilomas orais pela técnica de hibridização in
situ foi avaliada por Lopes e Meeks (2001). O autores utilizaram 5 pacientes HIV +
que apresentaram diagnóstico histológico de papiloma e realizaram ISH nos casos
emblocados em parafina com sondas específicas para HPV 16 e 18. Os pacientes
apresentavam mais de uma lesão em cavidade oral e no total de 16 lesões, 9
(52.2%) apresentaram positividade para essas sondas específicas. Apesar dos
papilomas estarem associados aos subtipos de baixo risco, este estudo demonstra a
susceptibilidade à infecção pelo HPV, provavelmente devido a supressão do sistema
imune comprometidos pelo HIV.
A prevalência do HPV em papilomas orais pode variar de 4% a 80% segundo
Yamaguchi et al. (1998), dependendo dos métodos de detecção utilizados. Essa
discrepância permite que fica a esclarecer qual é o melhor método de detecção do
HPV e o tipo de amostra utilizada para obter resultados fiéis para detecção do HPV .
29
3 PROPOSIÇÃO
1) Identificar e quantificar alterações histológicas do papiloma oral compatíveis com
a presença de vírus nas células do epitélio.
2) Relacionar as alterações clínicas, epidemiológicas e histológicas observadas em
HE com a localização do DNA do HPV verificada por hibridização in situ e PCR.
30
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Casuística e análise morfológica
Esta pesquisa foi aprovada pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade
de Odontologia da Universidade de São Paulo, conforme parecer de aprovação
número 150/05 (Anexos A,B e C).
Casos diagnosticados como papiloma foram selecionados dos arquivos da
Disciplina de Patologia Bucal e da Disciplina de Estomatologia Clínica da Faculdade
de Odontologia da Universidade de São Paulo. Cortes corados por HE referentes a
esses casos foram submetidos a um estudo morfológico sob microscopia de luz para
confirmação do diagnóstico. Dados referentes à idade, sexo, raça, bem como sítios
da lesão foram observados.
4.2 Técnica de hibridização in situ
A partir do material obtido de biópsias das lesões selecionadas, previamente
fixado em formol 10% e emblocados em parafina, foram obtidos cortes de 5 μm de
espessura. Os cortes foram estendidos em lâminas de vidro previamente lavadas em
álcool absoluto, secas e silanizadas. Após secagem durante 24 horas em estufa a
60ºC, os cortes foram submetidos à desparafinização em dois banhos de xilol, um a
31
60ºC por 15 minutos, e outro em temperatura ambiente por mais 15 minutos. Em
seguida os cortes foram hidratados em série descendentes de etanóis, através de
duas passagens de 1 minuto cada em etanol absoluto e uma passagem de 3
minutos em etanol 95%. Posteriormente, foram lavados em banho de água destilada
durante 6 minutos.
Os cortes receberam tratamento com solução de recuperação antigênica
concentrada (Dakocytomation, USA), diluída em água destilada na proporção
volumétrica de 1:10, em microondas de 900W em quatro ciclos de 4 minutos
cada, sendo o primeiro utilizando potência máxima e os outros três utilizando 20%
da potência. Após resfriamento completo da solução em temperatura ambiente e
lavagem em água destilada, o bloqueio da peroxidase endógena foi feito com dois
banhos de 10 minutos cada em solução de peróxido de hidrogênio a 9% e
metanol, na proporção volumétrica de 1:1.
Os cortes foram então lavados novamente em água destilada, secos e
encubados com a sonda biotinilada de amplo espectro para DNA de HPV. Os
cortes foram cobertos com lamínulas de vidro, para permitir íntimo contato entre a
sonda e o tecido, e as lâminas foram colocadas sobre uma placa com
temperatura de 95ºC durante 5 minutos, para desnaturação protéica do DNA da
sonda e do DNA-alvo no tecido. As lâminas ficaram em câmara úmida por 21
horas à temperatura de 37ºC para a hibridização.
No segundo dia, os cortes foram lavados com tampão TRIS-NaCl, ph7,4 e
a detecção da hibridização procedeu-se utilizando o sistema catalisado de
amplificação de sinal para hibridização in situ (CSA-ISH) GenPoint™
(DakoCytomation, USA), de acordo com as instruções do fabricante.
32
Os cortes foram contra-corados com hematoxilina de Mayer previamente
filtrada. Os passos seguintes foram a desidratação em cadeia ascendente de
etanóis, com concentração inicial de 70% até chegar em 100%, através de
banhos de 2 minutos em cada etanol, e a diafanização em xilol - dois banhos de 5
minutos cada. As lâminas de vidro foram então montadas com lamínulas de vidro
e resina.
Como controles positivos foram utilizados casos de infecção por HPV em
mucosa anogenital previamente testados e positivos para as sondas e método em
questão.
4.3 Características Histopatológicas
A avaliação do quadro histopatológico dos espécimes selecionados levaram
em consideração os seguintes parâmetros:
1. Cariorrexis
2. Disqueratose
3. Coilócitos
4. Células Bi ou Multinucleadas
5. Alteração de Cromatina
6. Hipercromatismo Nuclear
Essas características foram levantadas por um único Patologista através da
leitura das lâminas com diagnóstico histopatológico de papiloma .
33
Após observar cada aspecto histológico acima citado anteriormente,
comparou-se a freqüência desses achados com os resultados das reações de
hibridização in situ e PCR para marcação do HPV.
4.4 Análise e critérios adotados para a interpretação dos resultados da técnica
de hibridização in situ
A análise dos resultados da técnica de hibridização in situ foi feita mediante
uma avaliação qualitativa da presença de células positivas para HPV em
microscopia de luz por dois observadores. Foram consideradas positivas as
células epiteliais que apresentaram sinal de hibridização, representado por
pequenos pontos acastanhados e/ou coloração acastanhada difusa no núcleo
celular. A intensidade da marcação e a quantidade de células marcadas não
foram levadas em consideração.
4.5 Reação de PCR para HPV
Para a extração do DNA de todas as amostras foi utilizado o sistema
QIAamp (QIAGEN Ltd) seguindo-se as especificações do fabricante.
34
A partir de cada caso de papiloma emblocado em parafina foram obtidos
de 10 a 20 cortes de 10 μm de espessura. Esse material em condições estéreis
foi depositado em tubos Eppendorf de 1.5 ml. Para a desparafinização deste
material foi adicionado aos tubos 1 ml de xilol aquecido a 65 °C por 10 minutos.
Os tubos foram então centrifugados a 10.000 rpm por três minutos, desprezando-
se o material sobrenadante e seguindo novas trocas de xilol aquecido, até
remoção completa da parafina. O corpo de fundo do tecido foi hidratado em
cadeia descendente de etanol (etanol absoluto, etanol 95% e etanol 70 % em
água milli-Q). Cada troca foi precedida de homogeneização e centrifugação a
10.000 rpm durante três minutos, em temperatura ambiente.
Após a remoção da parafina foi feita a incubação das amostras em
proteinase K em estufa a 55ºC, com agitação suave constante, por um período
de 18 horas. Então, as amostras foram purificadas pela lavagem e centrifugação
através de colunas de filtragem. Na última etapa o DNA foi removido do filtro e
suspenso em tampão fornecido pelo fabricante.
As amostras de DNA obtidas foram amplificadas pela técnica de PCR
(Polimerase Chain Reaction, Invitrogen) através de iniciadores para o DNA do
HPV. Foram utilizados iniciadores degenerados senso e anti-senso GP5 – GP6
que amplificarão o produto de 200 pb.
Gene GP5-GP6
Iniciador Senso 5 CGTCCMAARGGAWACTGATC 3
Iniciador antisenso 5 GCMCAGGGWCATAAYAATGG 3
Produto 180 pb
Quadro 4.1. Dados referentes aos iniciadores GP5-GP6
35
As reações de PCR foram realizadas com 40 ciclos e temperatura de
associação de 55 graus. Aos tubos Eppendorf foram acrescentados os seguintes
reagentes: DNA, iniciadores senso e antisenso, dNTP , tampão (10 X) , magnésio,
enzima Taq polimerase e água destilada / autoclavada para completar 25 μl de
solução. A quadro 4.2 mostra as respectivas concentrações dos reagentes utilizados
nessas reações.
Componente Concentração
Tampão 10x 1x
Magnésio (Mg Cl2) 2,5 mM
dNTP ( 10 mM cada nt ) 240 μM
Iniciador senso 5 pmol
Iniciador antisenso 5 pmol
Enzima Taq polimerase 2 U / 25 μl
DNA 4 μg / μl
Quadro 4.2 Concentração dos reagentes utilizados nas reações de PCR.
Os tubos com os reagentes já citados foram levados ao termociclador PTC –
100 Peltier-Effect Cycling, no qual foram submetidos a um pré-tratamento de
desnaturação a 95 °C por 5 minutos, seguidos por 40 ciclos de reação. Nesses
ciclos ocorreu uma desnaturação de 95°C por 1 minuto, associação dos iniciadores
a 55 °C por 60 segundos, extensão enzimática a 72 °C por 60 segundos, após o
ciclo final houve uma extensão adicional de 5 minutos a 72 °C.
36
Os resultados foram avaliados em gel de agarose a 2% contendo brometo de
etídio e visualizados em um transiluminador com luz UV, e a seguir fotografados
em uma câmera digital para documentação.
4.6 Análise e critérios adotados para os resultados da técnica da PCR
Através da leitura das bandas iluminadas pelo transiluminador com lâmpada
ultravioleta, foi possível determinar a amplificação ou não do DNA das amostras.
Usamos como referência um marcador de peso molecular (Low DNA Mass Ladder),
um controle positivo que mostrava as bandas iluminadas na região de 400pb a 200
pb). A positividade deste exame de PCR garante que o DNA em estudo está integro
e viável para a pesquisa como mostra a figura 4.1
37
Figura 4.1- Gel de agarose 2% mostrando resultado da amplificação por PCR do DNA da lesão
mostrando da esquerda para a direita, o marcador de peso molecular (LM), o controle positivo (C+)
com bandas iluminadas para 200pb e 400pb, as 10 amostras e o controle negativo (C-)
400pb
200pb
38
5 RESULTADOS
5.1 Dados clínicos
Quanto à idade dos pacientes, observamos que houve predileção pelas 2ª, 4ª,
5ª e 6ª décadas de vida, sendo que a mediana de idade foi de 43 anos (alcance 04 a
76 anos). Quanto ao sexo, observamos uma predileção muito discreta pelo sexo
masculino (54%) e feminino (46%), na proporção de 1,17: 1, sem significância
estatística. O sítio mais afetado foi palato (34%), seguido por língua (26%), lábios
(16 %), mucosa jugal (6 %), comissura labial (4%), rebordo alveolar (4%), freio (2 %),
pilar amigdaliano (2%), úvula (2%), gengiva (2%) e assoalho bucal (2 %). Quanto à
raça dos casos analisados houve uma predileção expressiva pelos leucodermas
(72%), seguido de melanodermas (18 %) e xantodermas (10 %).Os resultados
referentes à idade, sexo, raça e localização estão resumidos na tabela do Anexo D e
as figuras 5.1, 5.2 e 5.3 abaixo demonstram aspectos clínicos e localizações mais
freqüentes.
Figuras 5.1, 5.2 e 5.3 – Aspectos clínicos gerais e localizações mais freqüentes
5.1 5.2 5.3
39
5.2 Características Histopatológicas
Para os resultados referentes as características histopatológicas levantadas
na leitura das lâminas, foram levadas em consideração as seguintes características:
células bi ou multinucleadas, cariorrexis, células semelhantes a coilócitos
(coilocitose), alteração da cromatina e hipercromatismo nuclear. Os resultados
referentes estão resumidamente abaixo no gráfico 5.4 e a presença de cada
característica histopatológica encontrada nos papilomas estão representadas pelas
figuras 5.4 (A, B,C,D, E, F).
98%
92%
76%
74%
54%
38%
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Características Histológicas
Coilocitose
Hipercromatismo nuclear
Células Bi/Multinucleadas
Alteração de Cromatina
Disqueratose
Cariorrex
Gráfico 5.4 - Características histopatológicas encontradas nos papilomas
40
Figura 5.4 - Características histopatológicas do papiloma: A.
Quadro histopatológico exibindo células
semelhantes a coilócitos (HE 20X); B. Quadro
histopatológico exibindo hipercromatismo nuclear
(HE 20 X); C. Quadro histopatológico exibindo
alteração de cromatina e cariorrexis (HE 20X)
A
B
C
41
Figura 5.4 - Características histopatológicas do papiloma:
D. Quadro histopatológico exibindo cariorrexis
(HE 20X); E. Quadro histopatológico exibindo
disqueratose (HE 20X) F. Quadro
histopatológico exibindo células binucleadas
(HE 20X).
F
E
D
42
5.3 Positividade para a sonda HPV de amplo espectro na CSA-ISH
Figura 5.4 - G. Reação de hibridização in situ demonstrando
marcação positiva (Controle positivo -
Anogenital) para o HPV; H. Reação de
hibridização in situ demonstrando marcação
negativa para o HPV
G
H
43
Dentre os 50 casos selecionados nesse estudo submetidos à hibridização in
situ com sonda HPV de amplo espectro, Zero (100%) apresentaram marcação
negativa para o HPV.
5.4 Amplificação para a sonda HPV de amplo espectro na PCR
Dentre os 50 casos selecionados nesse estudo, foram selecionados 10 casos
significantes e submetidos à técnica de PCR com sonda HPV de amplo espectro e
Zero (100%) não apresentaram amplificação para marcação do HPV.
Figura 5.5 - Gel de agarose 2% mostrando resultado da amplificação por PCR do
DNA da lesão mostrando da esquerda para a direita, o marcador de
peso molecular (LM), o controle positivo (C+) com bandas iluminadas
para 200pb e 400pb, as 10 amostras e o controle negativo (C-)
Figura 5.6 - Imagem da PCR mostrando negatividade em todos os casos (1-10).
Observar os marcadores de peso molecular (LM) na primeira coluna,
os dois controles positivos C+, na segunda e terceira coluna, e o
controle negativo na última coluna
400pb
200pb
400pb
200pb
44
6 DISCUSSÃO
O HPV está fortemente associado como fator etiológico no desenvolvimento
de lesões de pele e trato genital e também do papiloma oral. Apesar de algumas
pesquisas citarem índices diferentes de infecção por HPV em papilomas orais esses
podem variar de acordo com: a quantidade de DNA viral, a variabilidade das
técnicas, o tamanho macroscópico do espécime obtido e a utilização de tecidos
frescos ou emblocados em parafina, porém há um consenso na literatura que todas
essas variáveis podem influenciar diretamente na detecção do DNA viral do HPV.
Considerado como um tumor benigno epitelial (SCULLY; PRIME; MAITLAND,
1985; SOARES et al., 2005), o papiloma oral foi associado ao HPV. Foram os
estudos como o de Shope e Hurst (1933) e posteriormente por Koss e Durfee (1956)
que começaram a evidenciar a presença de infecção por HPV no desenvolvimento
de lesões inclusive dos papilomas.
O papiloma oral afeta ambos os sexos eqüitativamente com maior incidência
entre as 3º.e 5º. décadas de vida (ABBEY; PAGE; SAWYER, 1980; BODINI;
FIAMMINGHI, 1989; COSTA et al., 1994; EVERSOLE; LAIPIS, 1988; GREER;
GOLDMAN, 1974; WARD et al.,1995; YAMAGUCHI et al. 1998). Os 50 casos
analisados neste estudo apresentaram discreta predileção pelo sexo masculino
(54%) e média de idade de 43 anos corroborando com os achados na literatura.
O local de predileção do papiloma oral é a língua seguido do palato e lábio,
sendo menos freqüente em outra regiões da mucosa oral (ABBEY; PAGE;
SAWYER, 1980; BODINI; FIAMMINGHI, 1989; COSTA et al., 1994; EVERSOLE;
LAIPIS, 1988; GREER; GOLDMAN, 1974; WARD et al.,1995; YAMAGUCHI et al.
45
1998). Os resultados apresentados neste estudo em relação à localização são
diferentes da literatura porque o palato (34%) seguido da língua (26%), foram os
sítios de predileção da lesão nos 50 casos. Quando realizado levantamento em
relação à raça, a predominância é absoluta dos leucodermas (72%) seguido dos
melanodermas com 18% dos casos e apenas 10% de xantodermas, mostrando
resultados bastante semelhantes ao encontrado na literatura com média de 83%
para os leucodermas, 12% para melanodermas e sem citação para os xantodermas
(ABBEY; PAGE; SAWYER, 1980; OSHIRO et al., 1996; SOARES et al., 2005).
O diagnóstico do papiloma oral é um fator bem definido na literatura, com
correntes de autores que afirmam que o seu diagnóstico está baseado nas
aparências clínicas e histológicas. O aspecto clínico do papiloma oral é característico
e apresenta-se como um crescimento exofítico, peduncular, indolor, menor que
10mm, cuja superfície mostra projeções digitiformes ou verrucosas, mais
comumente encontrado em língua e palato. O tratamento é cirúrgico com pequena
margem de segurança para evitar a ocorrência de recidivas e o diagnóstico
diferencial se faz com verruga vulgar, hiperplasia epitelial focal e condiloma
acuminado (ABBEY; PAGE; SAWYER, 1980; CHANG et al., 1991; EVERSOLE;
LAIPIS, 1988; LOPES; MEEKS, 2001; SYRJANEN, 2003; WARD et al., 1995;
YAMAGUCHI et al. 1998).
O quadro histopatológico do papiloma oral é caracterizado por uma
proliferação do epitélio escamoso estratificado queratinizado, múltiplas projeções
papilomatosas com áreas centrais de tecido conjuntivo fibrovascular, estes podem
apresentar componentes inflamatórios dependendo do trauma causado na lesão.
Freqüentemente encontra-se hiperqueratose, disqueratose, papilomatose, acantose
e coilocitose (ABBEY; PAGE; SAWYER, 1980; BODINI; FIAMMINGHI, 1989; COSTA
46
et al., 1994; CHANG et al., 1991; GREER; GOLDMAN, 1974; OSHIRO et al., 1996;
SILVA; QUEIROZ, 2006; SOARES et al., 2005; YAMAGUCHI et al.,1998), resultados
semelhantes encontrados nos papilomas deste estudo. Foram adicionados
características histopatológicas como cariorrexis, alteração de cromatina,
hipercromatismo nuclear e células bi ou multinucleadas para associar à lesão com a
infecção por HPV de acordo com um protocolo citomorfológico cérvico-uterino
proposto por Yamamoto et al. (2004), que o utilizaram para aumentar a
especificidade de testes que detectam a presença de infecção por HPV. Porém em
nossos estudos essas características adicionais não tiveram relevância na pesquisa
da presença de DNA viral do HPV.
A presença de coilócitos não refletiu neste estudo infecção por HPV.
Antigamente considerado como um sinal patognomônico, hoje sabe-se que essa
alterações celulares e associados a outras características histológicas são usadas
apenas como uma sugestão de infecção por HPV, necessitando que se realize
algum teste para detecção do vírus (FORNATORA et al., 1996; ZIOL et al., 1998),
porém em infecções latentes essas técnicas podem estar limitadas, porque as
células infectadas geralmente se encontram nas camadas supra basal e basal e o
HPV nessa condição não expressa suas oncoproteínas virais e portanto, por
estarem inativas, não interferem no ciclo celular e conseqüentemente não são
passíveis de detecção do vírus de acordo com Campisi et al. (2006).
Em nossos estudos apesar da presença expressiva de coilócitos (98% - 50
casos) que é uma das características histopatológicas que sugerem a presença de
infecção por HPV, não foram suficientes para influenciar um resultado positivo pelas
técnicas de hibridização in situ e PCR, fato este comprovado em diversos estudos
47
que não há nenhuma correlação histológica com os casos positivos para HPV
(EVERSOLE; LAIPIS, 1988; YOUNG; MIN, 1991; ZEUSS; MILLER; WHITE, 1991).
Nenhuma das características histopatológicas consideradas neste estudo
pode correlacionar-se com a detecção do HPV, o que impossibilitou a utilização
desses padrões histopatológicos para determinar presença de DNA viral do HPV no
papiloma, devendo para tanto ser utilizada as técnicas de hibridização in situ e PCR
para essa detecção.
Os 50 casos utilizados nesse estudo não puderam formar estreita relação
entre os achados clínicos, histológicos e testes para detecção de DNA viral com a
infecção por HPV utilizando sondas de amplo espectro tanto em CSA-ISH como na
PCR. Isto está em desacordo com a literatura, que apesar dos diferentes índices de
infecção por HPV, os estudos realizados comprovam a íntima relação entre essa
lesão e HPV quando utilizam a técnica de hibridização in situ com sondas
específicas e de amplo espectro em blocos parafinados de lesões diagnosticadas
como papiloma. Os autores Dhariwal, Cubie e Southam (1995), Loning et al. (1985),
Syrjanen, Syrjanen e Lamberg (1986) utilizaram 3, 5 e 7 casos de papiloma dos
quais foram positivos 33.3%, 80% e 57% respectivamente.
Os trabalhos de Lopes e Meeks (2001), Ward et al. (1995) e Eversole e
Laipis (1988) utilizaram 16,19 e 20 casos de papiloma dos quais 52.2%, 68% e 35%
respectivamente foram positivos para marcação do HPV. Young e Min (1991),
Jimenez et al. (2001) e Zeuss et al. (1991) fizeram uso de 21, 27 e 30 casos dos
quais 62%, 40% e 13.3% respectivamente apresentaram marcação positiva para
HPV. Os 92 casos selecionados por Syrjanen et al. (1987) apresentaram 48.9% de
positividade.
48
Todos esse estudos permitem a relação do papiloma com o HPV de 13 a 80%
dos casos (média 48.9%), ressaltando que nos casos negativos os autores afirmam
tal fato que a baixa detecção pode ser causada pela pequena quantidade de DNA,
ausência de DNA viral nos cortes do tecido, infecções com poucas cópias virais,
infecções latentes e sensibilidade dos métodos utilizados. E em relação aos
aspectos histopatológicos também não houve correlação tanto nos casos positivos e
negativos.
A técnica empregada nesse estudo é amplamente utilizada já que é possível
realizar a reação a partir de uma secção tecidual e nesse estudo foram utilizados 2
cortes, porém o ideal seriam a partir de 3 cortes. Entretanto a técnica de ISH
convencional apresenta pouca sensibilidade, pois detecta a partir de 10 a 50 cópias
do DNA viral, isto é, particularmente insatisfatório, porque o HPV faz lesões pouco
produtivas na mucosa oral. Estratégias para otimizar uma melhor detecção por ISH
têm sido desenvolvidas como a CSA-ISH, e já existem sistemas de amplificação
disponíveis que eficazmente aumentam sua sensibilidade com a possibilidade de
localização do DNA viral no tecido analisado.
Nesse estudo optamos por usar o método CSA-ISH (com controles positivos e
otimizados para lesões anogenitais).Baseado na amplificação catalisada de sinais
positivos de hibridização pelo complexo biotiniltiramida. Esse sistema mostrou-se
muito sensível para detecção de DNA viral do HPV e de acordo com os autores com
sensibilidade comparável à PCR (DABIC et al., 2004; FREGONESI et al., 2003).
Porém ainda insuficiente devido ao baixo número de cópias virais que o HPV produz
nos papilomas da mucosa oral e também por ter sido utilizado 2 kits com lotes
diferentes , ou ainda porque o DNA estava degradado.Nota-se que a técnica
49
realizada foi realizada de forma adequada e satisfatória comprovado pelo resultado
positivo em lesão anogenital, sem background, através do protocolo do fabricante.
A proposta de verificação do sucesso da técnica em todas as etapas é a
utilização de uma sonda de controle positivo que se anela ao DNA humano, ou seja,
se a técnica e outras etapas como a fixação estiverem corretas, o resultado deverá
ser positivo. Caso esse DNA estiver intacto, teoricamente a sonda conseguirá se
anelar e proporcionar resultado positivo, se negativar pode ser um indício de DNA
degradado, se o mesmo foi perdido, provavelmente o DNA viral também foi perdido.
Existe uma diversidade de técnicas utilizadas para a detecção do HPV em
lesões da mucosa oral e outros sítios anatômicos que permitem a grande variedade
de resultados encontrados na literatura. A maioria dos estudos utilizam a técnica,
PCR, combinada ou não a outras técnicas, para detectar DNA viral de HPV em
tecidos que apresentam diferentes formas de armazenamento e conservação. A
razão pela qual se utiliza a PCR é por ser uma técnica com maior sensibilidade entre
as disponíveis para detecção do HPV, sendo teoricamente mais confiável, porém
também com possibilidade de resultado falso-negativo.
Na literatura é indiscutível e bem consolidada a técnica da PCR como “gold
standard” para detecção do HPV (DABIC et al., 2004; HA; CALIFANO, 2004;
HUBBARD, 2003; NUOVO, 2006). Porém essa técnica como todas existentes,
apresentam suas limitações. A quantidade de tecido necessária para a extração de
DNA a ser utilizada na reação é uma delas. Nesse estudo foram utilizados material
arquivado, restante de biópsias emblocadas em parafina, e esse material utilizado
geralmente apresenta-se em pequeno tamanho devido às próprias características do
papiloma e o processo de formolização, parafinização e posterior desparafinização,
promovem um enovelamento de proteínas no núcleo, ligações entre proteínas e
50
DNA, assim como a própria desfragmentação do DNA tornando a detecção viral
dificultada e até impossível (MESQUITA et al., 2001). Estas podem ser as razões
pelas quais alguns estudos, mesmo utilizando técnicas mais sensíveis, encontram
resultados muito próximos de zero ou iguais a zero como o estudo de Rivero e
Nunes (2006), quando se pesquisa HPV em lesões da mucosa oral.
Estratégias têm sido desenvolvidas para superar os problemas de que as
lesões estão emblocadas em parafina e são submetidas à técnica da PCR. A
Nested-PCR é uma poderosa ferramenta como técnica; capaz de amplificar
seqüências de DNA sucessivamente aumentando a sensibilidade e a especificidade
da reação. A utilização de dois pares de primers de PCR são usados para amplificar
o fragmento; enquanto um par é usado para amplificar um fragmento em um PCR
padrão, o segundo par se une a esse produto obtido na PCR padrão possibilitando
uma amplificação em um segundo PCR. A vantagem e a lógica da Nested-PCR
consiste na possibilidade de ter sido amplificado erroneamente um fragmento, a
probabilidade é muito baixa de se obter um produto amplificado pela segunda vez
por esses segundos set de primers, isso aumenta consideravelmente a sua
sensibilidade e especificidade em relação à PCR padrão (BERKHOUT et al., 1995).
Existem estudos na literatura que encontram melhores resultados com PCR
do que com a CSA-ISH em tecidos emblocados em parafina (DABIC et., 2004), mas
o grau de concordância entre os métodos utilizados na literatura é muito variável.
Apesar disso, estudos concordam e comprovam que a CSA-ISH é um método mais
confiável e sensível que a ISH convencional na detecção do HPV em conjunto com a
análise morfológica tecidual, ainda que o ideal seja usado juntamente com a técnica
de PCR.
51
Nesse sentido estamos nos dedicando com a continuidade desse estudo para
solucionar e otimizar as técnicas utilizadas continuando com os casos de papilomas
orais disponíveis nos arquivos da Disciplina de Patologia Bucal e Estomatologia
Clínica da Faculdade de Odontologia da Universidade de São Paulo para confirmar
ou inferir estes nossos resultados.
52
7 CONCLUSÃO
Os resultados obtidos nesse estudo permitem concluir que:
1. O papiloma ocorreu em sua maioria em indivíduos leucodermas (72%),
afetando mais o sexo masculino (54%), com idade média de 43.08 anos e
o local de predileção da lesão foi o palato (34%).
2. Nenhuma das características histopatológicas consideradas neste estudo
pode correlacionar-se com a detecção do HPV, o que impossibilitou a
utilização desses padrões histopatológicos para determinar a presença do
HPV.
3. O índice de detecção do HPV nos 50 casos foi Zero (100%) pela técnica
de hibridização in situ com sinal amplificado.
4. O índice de detecção do HPV em 10 dos mesmos 50 casos também foi
Zero (100%) pela técnica da PCR.
5. Os resultados obtidos, mesmo que negativos, sugerem uma baixa
presença de HPV em lesões da mucosa oral.
53
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58
Anexo A – Parecer do Comitê de Ética FOUSP
59
Anexo B – Parecer do Comitê de Ética FOUSP
60
Anexo C – Parecer do Comitê de Ética FOUSP
61
Anexo D – Dados referentes a sexo, raça, idade e localização dos pacientes portadores de papiloma
Caso Sexo Cor Idade Localização
1 F N 4 GENGIVA
2 M B 48 PALATO
3 F A 44 PALATO
4 M B 13 LÍNGUA
5 M B 14 LÁBIO
6 F B 32 COMISSURA LABIAL
7 F B 7 PALATO
8 F B 48 PALATO
9 F B 62 PALATO
10 F B 58 PALATO
11 F B 66 PALATO
12 M B 32 PALATO
13 F N 12 LÁBIO
14 M N 24 ÚVULA
15 M B 6 LÁBIO
16 M B 47 LÁBIO
17 M B 43 LÁBIO
18 F B 47 LÍNGUA
19 M B 51 LÁBIO
20 F B 48 ASSOALHO DE BOCA
21 M B 43 PALATO
22 F B 50 LÍNGUA
23 M B 76 MUCOSA JUGAL
24 M B 25 PALATO
25 M N 42 PALATO
26 M B 32 LÍNGUA
27 F B 50 LÁBIO
28 M B 68 LÍNGUA
29 M B 68 REBORDO ALVEOLAR
30 F B 70 PALATO
31 M B 37 PALATO
32 F A 56 MUCOSA JUGAL
33 M B 34 PALATO
34 M N 42 PALATO
35 M N 58 LÁBIO
36 F B 46 LINGUA
37 F B 52 LÍNGUA
38 F N 27 MUCOSA JUGAL
39 F B 52 PILAR AMIGDALIANO
40 F A 57 LÍNGUA
41 F A 60 LÍNGUA
42 F B 54 LÍNGUA
43 F N 8 COMISSURA LABIAL
44 F B 68 PALATO
45 M A 50 PALATO
46 F B 28 LÍNGUA
47 M B 68 LÍNGUA
48 F B 50 REBORDO ALVEOLAR
49 M N 42 FREIO LABIAL
50 F B 35 LÍNGUA
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