( PDF ) Caracterização molecular de isolados de Trypanosoma cruzi obtidos de mulheres durante a fase crônica da doença de Chagas

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MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO

UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS

INSTITUTO DE PATOLOGIA TROPICAL E SAÚDE PÚBLICA

JULIANA BOAVENTURA AVELAR

Caracterização molecular de isolados de

Trypanosoma cruzi obtidos de

mulheres durante a fase crônica da doença

de Chagas

Orientadora:

Profª Drª Ana Maria de Castro

Colaboradora:

Profª Drª Eliane Lages Silva

Dissertação de Mestrado

Goiânia-GO, 2008

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11. Identificação do material bibliográfico: [ X ] Dissertação [ ] Tese

12. Identificação da Tese ou Dissertação

Autor(a): Juliana Boaventura Avelar

CPF: 779942645-49 E-mail: [email protected]

Seu e-mail pode ser disponibilizado na página? [ x ]Sim [ ] Não

Vínculo Empregatício do autor

País: Brasil UF:GO CNPJ:

Título: Caracterização molecular de isolados de Trypanosoma cruzi obtidos de mulheres durante a fase crônica da doença de

Chagas

Palavras-chave: Doença de Chagas, caracterização molecular e mulheres

Área de concentração: Parasitologia

Data defesa: (dd/mm/aaaa) 29/02/2008

Programa de Pós-Graduação: Medicina Tropical e Saúde Pública

Orientador(a): Ana Maria de Castro

CPF: 33108650106 E-mail: [email protected]

Co-orientador(a): Eliane Lages Silva

CPF: E-mail:

3. Informações de acesso ao documento:

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do(a) autor(a)

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prazo suscita justificativa junto à coordenação do curso. Todo resumo e metadados ficarão sempre

disponibilizados.

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS

INSTITUTO DE PATOLOGIA TROPICAL E SAÚDE PÚBLICA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO

Juliana Boaventura Avelar

Caracterização molecular de isolados de

Trypanosoma cruzi obtidos de

mulheres durante a fase crônica da doença

de Chagas

Dissertação submetida ao PPGMT/UFG

como requisito parcial para obtenção do

grau de Mestre, área de concentração de

Parasitologia

Orientadora:

Profª Drª Ana Maria de Castro

Colaboradora:

Profª Drª Eliane Lages Silva

Dados Internacionais de Catalogação-na-Publicação (CIP)

(GPT/BC/UFG)

Avelar, Juliana Boaventura.

A949c Caracterização molecular de isolados de Trypanosoma cruzi

obtidos de mulheres durante a fase crônica da doença de Chagas /

Juliana Boaventura Avelar. – 2008.

xvii, 69f. : figs., tabs., qds.

Orientadora: Profª. Drª. Ana Maria de Castro, Colaboradora:

Profª Drª Eliane Lages Silva.

Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal de Goiás.

Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública, 2008.

Bibliografia: f.55-67.

Inclui listas de abreviaturas, quadros e de figuras.

Anexos.

1. Doenças de Chagas – Mulheres 2. Doença de Chagas -

Caracterização molecular 3. Trypanosoma Cruzi. I. Castro, Ana

Maria II. Silva, Eliane Lages III. Universidade Federal de Goiás.

Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública IV. Título.

CDU: 616.937

DEDICATÓRIA

Dedico este trabalho a

quatro pessoas fundamentais na

minha vida, minha mãe Belirana

Boaventura Avelar, as minhas

irmãs Fabiana Boaventura

Avelar e Graciana Analia

Boaventura Avelar. E ao meu

grande companheiro Eduardo

Farias Rebelo.

AGRADECIMENTOS

A Deus por me acompanhar em todos os momentos de minha vida.

Á meu pai Walteir Ferreira de Avelar que enquanto esteve vivo fez de

tudo por mim.

Á minha querida mãe Belirana Boaventura Avelar que todos os dias

mesmo longe se preocupa comigo e me fortalece com palavras amigas.

As minhas irmãs Fabiana Boaventura Avelar e Graciana Boaventura

Avelar por me ajudar e entender quando precisei.

Á todos os Tios e Tias que sempre me deram força.

Aos meus queridos primos e primas.

Aos meus queridos Avós José Boaventura Filho e a Julia Araújo dos

Santos (vovó Belinha).

Ao meu companheiro e querido amor Eduardo Farias Rebelo. Obrigada

por tudo que você faz por mim.

Ao Raimundo Rebelo Vaz e Saras Farias de Oliveira por toda amizade e

carinho.

A minha orientadora Ana Maria de Castro que sempre acreditou no meu

potencial e me deu toda confiança em fazer parte de seu grupo de pesquisa.

A professora Doutora Eliane Lages Silva, muito obrigada!

Ao professor Alejandro Luquetti Ostermayer.

A Daniela Stefani Márquez e Jorge Marcelo Marson por todo apoio

técnico e científico prestado para a realização desse trabalho.

Aos amigos Marcos Gontijo da Silva, Josyrene Mariano, pela amizade,

ajuda e estímulo.

A querida amiga Tatiane Luiza da Costa, serei sempre grata a você.

À Liliane da Rocha Siriano meu grande orgulho e exemplo de vida.

A Aline Almeida Barbaresco, Flávia Nascente, Miryan de Sylvio, Liliane

Rego Guimarães por colaborarem sempre comigo.

Aos secretários da Pós-graduação José Clementino de Oliveira Neto e

Kariny Vieira Soares, muito obrigada!

Aos funcionários do IPTSP-UFG (Nair, Sueli Meira, Lourdes, Marieta e

Vânia) pelo carinho e apoio técnico.

Aos alunos e funcionários do Laboratório de Parasitologia da UFTM.

A todos os professores do IPTSP-UFG. Em especial aos professores

que participaram das bancas de qualificação e defesa.

Às pacientes que concordaram em participar dessa pesquisa.

A todos aqueles que acreditam em mudanças e participaram direta ou

indiretamente na execução dessa pesquisa.

SUMÁRIO

DEDICATÓRIA...................................................................................................iii

AGRADECIMENTOS..........................................................................................iv

LISTA DE ABREVIATURAS...............................................................................ix

LISTA DE QUADROS E FIGURAS....................................................................xi

RESUMO...........................................................................................................xvi

ABSTRACT.......................................................................................................xvii

SUMÁRIO...........................................................................................................vi

1- REVISÃO DA LITERATURA...........................................................................1

1.1 Morfologia e ciclo evolutivo.....................................................................1

1.2 Aspectos gerais da doença de Chagas...................................................3

1.2.1 Doença de Chagas em Imunodeprimidos......................................4

1.3 Doença de Chagas congênita.................................................................5

1.4 Diagnóstico..............................................................................................6

1.4.1 Diagnóstico parasitológico............................................................7

1.5 Análise da diversidade intra-específica do T. cruzi.................................8

1.5.1 Variabilidade biológica e bioquímica do T. cruzi..........................8

1.6 Caracterização genética do T. cruzi......................................................10

2- JUSTIFICATIVA.............................................................................................14

3- OBJETIVOS...................................................................................................15

3.1 Objetivo Geral........................................................................................15

3.2 Objetivos Específicos............................................................................13

4-MATERIAL E MÉTODOS...............................................................................16

4.1 Origem dos isolados ............................................................................16

4.2 Processamento das amostras.............................................................16

4.3 Diagnóstico Parasitológico e Molecular................................................17

4.3.1 Hemocultura................................................................................17

4.4 Caracterização genética do T. cruzi.....................................................19

4.4.1 Extração do DNA.......................................................................19

4.4.2 Amplificação específica do T. cruzi...........................................20

4.4.3 Genotipagem do T. cruzi presente nos isolados.......................21

4.4.3.1 Amplificação do domínio divergente D7 do gene 24Sα

rRNA...............................................................................................22

4.4.3.2 Amplificação do domínio de tamanho variável do gene 18S

rRNA...............................................................................................22

4.4.3.3 Amplificação do espaçador não transcrito do gene de mini-

exon................................................................................................23

4.5 Variabilidade genética do kDNA dos isolados do T. cruzi...................23

4.5.1 LSSP-PCR (Low Stringency Single Specific Primer-PCR)….…

…………………………………………………………..…….23

4.5.2 Eletroforese em gel de poliacrilamida.......................................25

4.6 Análise dos perfis de LSSP-PCR e construção dos fenogramas........26

4.6 Análise estatística................................................................................26

5-RESULTADOS...............................................................................................27

5.1 Origem dos pacientes.........................................................................27

5.2 Hemocultura........................................................................................27

5.2.1 Positividade por número de tubos...............................................27

5.3 Caracterização dos grupos e subgrupos das populações do T.

cruzi...........................................................................................................28

5.4 Comparação da variabilidade genética do kDNA entre os 30

isolados.....................................................................................................30

5.5 Comparação da variabilidade genética do kDNA entre os isolados da

Bahia e Goiás............................................................................................33

5.6 Comparação da variabilidade genética do kDNA dos estoques de T.

cruzi, por faixa etária.................................................................................36

5.7 Comparação da variabilidade genética do kDNA dos estoques de T.

cruzi, por idade gestacional.......................................................................37

5.8 Comparação da variabilidade genética do kDNA dos estoques de T.

cruzi, das gestantes e não gestantes........................................................38

5.9 Comparação da variabilidade genética do kDNA entre os isolados

obtidos em tubos diferentes por hemocultura da mesma

paciente.....................................................................................................39

6- DISCUSSÃO..................................................................................................50

7-CONCLUÕES.................................................................................................54

8- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..............................................................55

9-ANEXO I.........................................................................................................68

10- ANEXO II ................................................................................................... 69

LISTA DE ABREVIATURAS

α - Alfa

APAE- Associação de Pais e Amigos Excepcionais

AIDS – Acquired Immunodeficiency Syndrome

BOD – Biochenical Oxygen Demand

CEPMHA/HC – Comitê de Ética em Pesquisa Médica e Animal do Hospital das

Clínicas

ºC - Graus Centígrados

CV - Coeficiente de Variação

DP - Desvio Padrão

DNA - Ácido Desoxirribonucléico

dATP - 2’ deoxiadenosina 5’ trifosfato

dCTP - 2’ deoxicitosina 5’ trifosfato

dGTP - 2’ deoxiguanosina 5’ trifosfato

dTTP - 2’ deoxitimidina 5’ trifosfato

dNTP – Mistura de 2’ deoxinucleosídeos 5’ trifosfato

ELISA- Enzime Linked Immunosorbent Assay

EDTA - Ácido Etilenodiaminotetracético

GP - Glicoproteína

HCl - Ácido clorídrico

HIV –Human Immunodeficiency Syndrome

IL - Interleucina

IPTSP- Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública

kDNA –DNA do cinetoplasto

LSSP-PCR - Low –stringency specifc primer

LIT - Liver Infusion Triptose

Mb – Mega (10

) Base

MgCl

- Cloreto de Magnésio

min - Minuto

NaOH - Hidróxido de Sódio

ng - Nanograma

nL - Mililitros

- Nitrogênio

PCR - Polymerase Chain Reaction

pb - pares de bases

pmol - picomol

pH - Potencial de Hidrogênio

rpm - Rotação por minuto

rRNA - Ácido Ribonucléico Ribossômico

RNA - Ácido Ribonucléico

RAPD – Randomly Amplified Polymorphic DNA

RFLP – Restriction Fragment Length Polymorphism

SIDA-Síndrome da Imunodeficiência Adquirida

T. cruzi - Trypanosoma cruzi

TCI - Trypanosoma cruzi I

TCII - Trypanosoma cruzi II

µL - Microlitros

UFG - Universidade Federal de Goiás

UFTM- Universidade Federal do Triângulo Mineiro

USA –United States of America

v - Volts

% - porcentagem

LISTA DE QUADROS E FIGURAS

Quadro 1: Discriminação dos grupos e subgrupos do T. cruzi pela análise do

tamanho do produto amplificado (em pares de bases) nas PCRs do mini-éxon,

do 18S rDNA e do 24α rDNA.............................................................................21

Quadro 2: Positividade por número de tubos obtidos pela técnica de

hemocultura de 30 mulheres chagásicas crônicas, analisados pela LSSP-

PCR...................................................................................................................27

Figura 1: Esquema da hemocultura, segundo Chiari et al. (1989) e Luz et al.

(1994).................................................................................................................18

Figura 2: Gel de poliacrilamida a 7,5% corado com 0,2% de nitrato de prata,

representativo da PCR com os iniciadores D71 e D72, amplificando as bandas

100/125pb do gene 24Sα rRNA. MM- marcador molecular, canaleta-amostra

correspondente: 01-controle 110pb, 02- 575, 03-576, 04-577, 05-581, 06-587,

07-590, 08-592, 09-593, 10-596, 11-597, 12-600, 13-603, 14-605, 15-608, 16-

609, 17-610, 18-611, 19-controle 110pb, 20-625, 21-626, 22-627, 23-629, 24-

631, 25-632, 24-633, 25-634, 26-636, 27-637, 28-641, 29-644, 30-668 e MM-

marcador molecular...........................................................................................29

Figura 3: Gel de poliacrilamida a 7,5% corado com 0,2% de nitrato de prata,

representativo da PCR com os iniciadores TC, TC1 e TC2, amplificando as

bandas de 300pb do gene mini-exon. MM- marcador molecular, canaleta-

amostra correspondente: 01-controle 330pb, 02- 575, 03-576, 04-577, 05-581,

06-587, 07-590, 08-592, 09-593, 10-596, 11-597, 12-600, 13-603, 14-605, 15-

controle 330pb, 16-608, 17-609, 18-610, 19-611, 20-controle330pb, 21-625, 22-

626, 23-627, 24-629, 25-631, 26-632, 27-633, 28-634, 29-636, 30-637, 31-641,

32-644, 33-668, 34-controle 330pb e MM- marcador

molecular...........................................................................................................29

Figura 4: Gel de poliacrilamida a 7,5% corado com 0,2% de nitrato de prata,

representativo da PCR com os iniciadores V1 e V2 amplificando as bandas de

165pb do gene 18S rRNA. MM- marcador molecular, canaleta-amostra

correspondente: 01-controle 165pb, 02- 575, 03-576, 04-577, 05-581, 06-587,

07-590, 08-592, 09-593, 10-596, 11-597, 12-600, 13-603, 14-605, 15-608, 16-

609, 17-610, 18-611, 19-625, 20-626, 21-627, 22-629, 23-631, 24-632, 25-633,

26-634, 27-636, 28-637, 29-641, 30-644, 31-668, 33controle 165pb e MM-

marcador molecular...........................................................................................29

Figura 5: Caracterização do kDNA dos isolados do T. cruzi pela LSSP-PCR:

gel de poliacrilamida a 7,5% corado com 0,2% de nitrato de prata. MM-

marcador molecular, canaleta-amostra correspondente: 01-575, 02-576, 03-

577, 04-581, 05-587, 06-590, 07-592, 08-593, 09-596, 10-597, 11-600, 12-603,

13-605, 14-608, 15-609, 16-610, 17-611, 18-625, 19-626, 20-627, 21-629, 22-

631, 23-632, 24-633, 25-634, 26-636, 27-637, 28-641, 29-644, 30-668 e MM-

marcador molecular...........................................................................................31

Figura 6: Fenograma mostrando a distância genética entre os isolados do T.

cruzi em todas as regiões estudadas................................................................32

Figura 7: Comparação da distribuição da naturalidade das mulheres infectadas

pelo T.cruzi dos estados da Bahia e de Goiás..................................................33

Figura 8: Fenograma mostrando a distância entre as populações de

Trypanosoma cruzi isolados pela técnica de hemocultura e analisada pela

LSSP-PCR das pacientes do Estado da Bahia.................................................34

Figura 9: Fenograma mostrando a distância entre as populações de

Trypanosoma cruzi isoladas pela técnica de hemocultura, analisada pela LSSP-

PCR das pacientes do Estado de Goiás...........................................................35

Figura 10: Distribuição dos isolados de mulheres infectadas pelo Trypanosoma

cruzi, na fase crônica pela técnica de hemocultura, analisada pela LSSP-PCR

de acordo com a faixa etária..............................................................................36

Figura 11: Distribuição dos isolados de mulheres infectadas pelo Trypanosoma

cruzi, na fase crônica, pela técnica de hemocultura, analisada pela LSSP-PCR

de acordo com a idade gestacional...................................................................37

Figura 12: Distribuição dos isolados de mulheres infectadas pelo Trypanosoma

cruzi, na fase crônica pela técnica de hemocultura, analisada pela LSSP-PCR

do grupo de gestantes e de mulheres não gestantes........................................38

Figura 13: Caracterização do kDNA dos isolados do T. cruzi pela LSSP-PCR:

gel de poliacrilamida a 7,5%, corado com 0,2% de nitrato de prata. MM-

marcador molecular, canaleta-amostra correspondente: 01- 575a, 02-575b, 03-

576, 04-577a, 05-577b, 06-581a, 07-581b, 08-581c, 09-581d, 10-581e, 11-581f,

12-581g, 13-587a, 14-590a, 15-592a, 16-592b, 17-593a, 18-593b, 19-596, 20-

597, 21-600a, 22-600b, 23-603a, 24-603b........................................................40

Figura 14: Fenograma mostrando a distância entre as populações de

Trypanosoma cruzi das amostras 575 a 603 isoladas de mulheres infectadas

na fase crônica pela técnica de hemocultura, analisada pela LSSP-

PCR...................................................................................................................42

Figura 15: Caracterização do kDNA dos isolados do T. cruzi pela LSSP-PCR:

gel de poliacrilamida a 7,5%, corado com 0,2% de nitrato de prata. MM-

marcador molecular, canaleta-amostra correspondente: 01- 603a, 02-603b, 03-

605a, 04-605b, 05-608a, 06-608b, 07-608c, 08-609a, 09-609b, 10-609c, 11-

609d, 12-609e, 13-610a, 14-610b, 15-611a, 16-611b, 17-611c, 18-611d, 19-

611e, 20-625a, 21-625b, 22-625c, 23-625d, 24-625e, 25-627a, 26-627b, 27-

628a, 28-628b, 29-628c, 30-628d e MM- marcador molecular.........................43

Figura 16: Fenograma mostrando a distância entre as populações de

Trypanosoma cruzi das amostras 603 a 628 s isoladas de mulheres infectadas

na fase crônica, pela técnica de hemocultura, analisada pela LSSP-PCR.......45

Figura 17: Caracterização do kDNA dos isolados do T. cruzi pela LSSP-PCR:

gel de poliacrilamida a 7,5% corado com 0,2% de nitrato de prata. MM

marcador molecular, canaleta-amostra correspondente: 01-629a, 02-629b, 03-

631a, 04-631b, 05-632a, 06-632b.....................................................................46

Figura 18: Fenograma mostrando a distância entre as populações de

Trypanosoma. cruzi das amostras 629 a 63 isoladas de mulheres infectadas na

fase crônica pela técnica de hemocultura, analisada pela LSSP-PCR.............46

Figura 19: Caracterização do kDNA dos isolados do T. cruzi pela LSSP-PCR:

gel de poliacrilamida a 7,5%, corado com 0,2% de nitrato de prata. MM

marcador molecular, caneleta-amostra correspondente: 01-633a, 02-633b, 03-

633c, 04-633d, 05-633e, 06-633f, 07-634a, 08-634b, 09-636a, 10-636b, 11-

636c, 12-636d, 13-636e, 14-637a, 15-637b, 16-637c, 17-637d, 18-641a, 19-

641b, 20-641c, 21-644a 22-644b, 23-644c 24-668 e MM marcador

molecular...........................................................................................................47

Figura 20: Fenograma mostrando a distância entre as populações de

Trypanosoma cruzi das amostras 633 a 668 isoladas de mulheres infectadas

na fase crônica pela técnica de hemocultura, analisada pela LSSP-

PCR...................................................................................................................49

RESUMO

A doença de Chagas é uma zoonose causada por um protozoário

flagelado denominado Trypanosoma cruzi, trata-se de um problema específico

da América Latina, onde estima-se que 12 a 14 milhões de pessoas estejam

infectadas. As populações de Trypanosoma cruzi podem ser divididas em dois

grandes grupos, o Trypanossoma cruzi I (TCI) e o Trypanossoma cruzi II (TCII),

sendo o último mais heterogêneo e subdividido em cinco subgrupos TCIIa,

TCIIb, TCIIc, TCIId e TCIIe, porém, pouco se sabe das implicações clínicas e

epidemiológicas dessas classificações. A freqüência da transmissão vertical da

doença de Chagas pode variar de 1,6 a 18,5% de acordo com a região e a

metodologia usada nos estudos. O objetivo desse estudo foi a caracterização

genética de 30 isolados de T. cruzi por meio da hemocultura de pacientes com

doença de Chagas na fase crônica, gestantes e não gestantes. A

caracterização genética foi realizada com três diferentes marcadores que

amplificaram regiões 24Sα e 18S do DNA ribossômico e do gene mini-exon

que permite classificar os grupos e subgrupos do parasito e para a análise da

variabilidade genética entre os isolados do T. cruzi foi realizada a

caracterização da região variável dos minicírculos do kDNA por meio da técnica

de Low –stringency specifc primer (LSSP-PCR), das 30 pacientes estudadas

75% (25/30) eram gestantes e 25% (5/30) não gestantes. As pacientes são de

quarto regiões brasileiras distintas sendo elas dos Estados da Bahia 53,3%

(16/30), Goiás 40,0% (12/30), Paraíba 3,3% (1/30) e Distrito Federal 3,3%

(1/30). A análise do rDNA permitiu evidenciar o TCII em 100% das populações

isoladas nas regiões estudadas, onde o subgrupo TCIIb/e foi detectado em

(96,66%) e o TCIId em (3,33%) este último corresponde a uma amostra do

grupo controle do Estado da Bahia. A variabilidade genética entre as 30

amostras analisadas foi de 24,08 ± 14,4% de compartilhamento de bandas

entre os pares. Houve diferença no compartilhamento de bandas entre as

pacientes da Bahia e Goiás, onde o valor de significância foi menor que 5%.

Não houve diferença entre as porcentagens de bandas compartilhadas nas

análises realizadas por faixa etária das pacientes, idade gestacional e na

análise dos grupos de gestantes e não gestantes. Ao analisar mais de um tubo

proveniente da hemocultura por paciente evidenciamos perfis de assinaturas

gênicas complexas e heterogêneas com 62,5% de bandas compartilhadas

menor que 77% e apenas 37,5% tiveram índices maiores que 83% de

compartilhamento de bandas entre as amostras. Sugerindo assim que nossos

isolados apresentaram uma grande variabilidade genética.

ABSTRACT

Chagas disease is a zoonotic disease caused by a protozoan plagued

called Trypanosoma cruzi, it is a particular problem in Latin America, where it is

estimated that 12 to 14 million people are infected. The populations of

Trypanosoma cruzi can be divided into two major groups, the Trypanossoma

cruzi I (TCI) and Trypanossoma cruzi II (TCII), the last being more

heterogeneous and divided into five subgroups TCIIa, TCIIb, TCIIc, TCIId and

TCIIe However, little is known of epidemiological and clinical implications of

these ratings. The frequency of vertical transmission of Chagas disease can

vary from 1.6 to 18.5% in accordance with the region and the methodology used

in the studies. The aim of this study was to genetic characterization of 30

isolates of T. cruzi through the blood of patients with Chagas disease in the

chronic phase, pregnant and not pregnant. The genetic characterization was

performed with three different markers that amplified regions of the 18S and

24S α DNA ribosomal and mini-exon of the gene that allows classify the groups

and subgroups of the parasite and the analysis of genetic variability among

isolates of T. cruzi was performed the characterization of the variable region of

minicicles of kDNA through the technique of Low-Stringency Single Specific

Primer-PCR (LSSP-PCR). The 30 patients studied 75% (25/30) were women

and 25% (5 / 30) not pregnant. The patients are the four different Brazilian

regions being the States of Bahia 53.3% (16/30), Goiás 40.0% (12/30), Paraíba

3.3% (1 / 30) and the Federal District 3, 3% (1 / 30). The analysis of rDNA

allowed show the TCII in 100% of the isolated populations in the regions

studied, where the subgroup TCIIb/e has been detected in (96.66%) and TCIId

in (3.33%) the latter is a sample of the group Control of the State of Bahia. The

genetic variability between the 30 samples was 24.08 ± 14.4% share of bands

among pairs. There was no difference between the share of bands patients of

Bahia and Goiás, where the value of significance was less than 5%. There was

no difference between the percentages of bands showed in analyses by age of

the patients, gestational age and in the analysis of the groups of pregnant and

not pregnant. In reviewing more than one tube of blood per patient coming

evidenced profiles of signatures genomic complex and heterogeneous with

62.5% of bands shared less than 77% and only 37.5% had rates higher than

83% of bands sharing among samples. Suggesting so our isolates showed a

great genetic variability.

1- REVISÃO DA LITERATURA

1.1Morfologia e ciclo evolutivo

Trypanosoma cruzi é um flagelado da ordem Kinetoplastida, Família

Trypanosomatidae, caracterizado pela existência de um flagelo e do cinetoplasto, uma

estrutura contendo ácido desoxirribonucléico (DNA) localizada dentro da mitocôndria,

única destes parasitos. A identificação do T. cruzi é relativamente fácil, pelo fato de o

seu cinetoplasto ser volumoso, excedendo os limites da membrana parasitária, um dos

detalhes morfológicos que o diferencia do outro único tripanossomo que infecta o

homem em alguns países da América do Sul e Central. Trypanosoma rangeli não é

patogênico para o homem, e pode ocasionar reações sorológicas cruzadas com T.

cruzi (Ramirez et al. 1998).

T. cruzi apresenta três formas evolutivas no seu ciclo, as quais são

identificadas morfologicamente pela posição do cinetoplasto com relação

ao núcleo da célula e à emergência do flagelo. No tripomastigota (estágio

infectante do parasito) o cinetoplasto situa-se na parte posterior do

flagelado, em posição terminal, e o flagelo que se origina próximo do

cinetoplasto emerge da bolsa flagelar, na parte anterior do parasito; nos

epimastigotas (formas de multiplicação do parasito no vetor ou em meios

de cultivos axênicos) o cinetoplasto e a origem do flagelo estão em

posição próxima do núcleo; por fim, os amastigotas (estágios evolutivos

que se multiplicam dentro das células hospedeiras) são organismos

arredondados que apresentam micro flagelo (possui organelas que

normalmente são encontradas no cinetoplasto de células eucarióticas, e

algumas outras estruturas que lhes são próprias). A mitocôndria é tubular

e apresenta as típicas cristas e DNA (cinetoplasto), que são

características dessa estrutura. Uma particularidade do T. cruzi é que, ao

contrário do que acontece nas células eucarióticas, o DNA não está

distribuído ao longo da mitocôndria e se concentra no cinetoplasto

(kDNA). O cinetoplasto possui cerca de 10-20% do DNA total da célula e

esta disposto em uma rede fibrosa constituída por moléculas organizadas

em mini-círculos (95% do DNA total do cinetoplasto) e maxi-círculos.

Embora cerca de 20.000-25.000 mini-círculos estejam presentes no

cinetoplasto, o papel desenvolvido pelo kDNA não é bem conhecido,

ainda que sua presença seja essencial à viabilidade dos estágios

evolutivos do T. cruzi (Brener 1997; Sturm & Simpson 1990).

T. cruzi é representado por populações heterogêneas está constituída

por diferentes cepas que circulam, na natureza, entre o homem, vetores

animais domésticos e reservatórios silvestres. Os tripanossomos

sanguíneos, por exemplo, apresentam fenômeno de polimorfismo,

caracterizado pela existência de formas delgadas e largas que,

respectivamente, predominam em diferentes cepas do T. cruzi. Essas

populações possuem comportamento diverso no que se refere a curvas

de parasitemia, interação com células hospedeiras e resposta imune do

hospedeiro (Andrade 1974).

O ciclo biológico requer dois hospedeiros, um hospedeiro

invertebrado (triatomíneo) e um hospedeiro vertebrado, o qual inclue o

homem, animais domésticos e silvestres. A infecção pelo T. cruzi estava

inicialmente restrita ao ambiente silvestre entre os seus reservatórios e

vetores. A ocupação dos espaços pelo homem e a ação antrópica com os

desmatamentos e afastamento dos animais silvestres, fonte alimentar dos

triatomíneos, aliados à sua domiciliação, foi gradativamente

transformando o ciclo silvestre em peridoméstico e doméstico. Há

indícios de que no Brasil na época da mineração, quando os

desmatamentos eram restritos, a infecção humana estava limitada à

transmissão acidental ou em cavernas onde o homem podia conviver com

alguns triatomíneos (Coura et al. 2000).

Os ciclos de transmissão desta infecção são definidos pela distribuição

geográfica dos triatomíneos e dos hospedeiros vertebrados, um deles associado com

o ciclo silvestre envolvendo reservatórios selvagens T. cruzi I, e o outro com o ciclo

doméstico/peridoméstico associado ao T. cruzi II, no qual o homem e animais

domésticos agem como hospedeiros do parasito (Fernandes et al. 1998, 1999;

Zingales et al. 1998).

O hospedeiro vertebrado se infecta quando as formas tripomastigotas,

eliminadas nas fezes e urina do inseto vetor, entram em contato com a pele lesada ou

mucosas íntegras, penetram e se multiplicam em qualquer tipo celular encontrado no

local, exceto hemácias. Os triatomíneos se infectam durante o repasto sanguíneo em

animais infectados ao ingerir as formas tripomastigotas sanguíneas do T. cruzi, as

quais no estômago do vetor se transformam em esferomastigotas. No intestino médio

os epimastigotas se aderem à superfície epitelial, se multiplicam e migram para a parte

mais posterior, atingindo o reto, onde se diferenciam em tripomastigotas metacíclicos

que são eliminados nas fezes ou urina do vetor e constituem as formas infectantes

para o hospedeiro vertebrado. Todos os triatomíneos podem entrar em contato com T.

cruzi, porém, apenas algumas espécies susceptíveis permitem a multiplicação do

parasito no seu interior (Dias 1992; Silveira 1997).

1.2 Aspectos gerais da doença de Chagas

A doença de Chagas ou Tripanossomíase americana é uma infecção

generalizada, essencialmente crônica, causada pelo protozoário T. cruzi transmitida

naturalmente ao homem e a outros animais por intermédio de hemípteros

hematófagos da subfamília Triatominae, representados principalmente pelas espécies:

Triatoma infestans, Rhodnius prolixus, Triatoma dimidiata, Triatoma sordida,

Panstrogylus megistus e Triatoma brasiliensis. (Who 2002). Segundo Dias (2007) essa

doença afeta cerca de 12 a 14 milhões de pessoas na América Latina, onde mais de

60 milhões vivem sob risco de transmissão, em cerca de 18 países endêmicos.

Outras vias de infecção como, transfusões de sangue, transplantes de órgãos,

acidente em laboratórios de pesquisas, transmissão congênita e oral, tem papel

importante na epidemiologia do T. cruzi, principalmente nesta última década após o

controle da transmissão vetorial pelo Triatoma infestans (Schofield et al. 2006), em

alguns países. Possibilidades raras como a transmissão pelo coito já foi comprovada

em animais de laboratório, porém, a mesma nunca foi relatada em humanos.

Excepcionalmente a transmissão pode ocorrer por outros vetores e pelo contato direto

com fezes infectadas de triatomíneos (Dias 1992).

No Brasil e em alguns outros países latino-americanos, a transmissão do T.

cruzi a seres humanos, por meio de triatomíneos, tornou-se menos expressiva e,

inclusive, já foram certificadas de interrupções desse tipo de transmissão do parasito

(Silveira et al. 2002). Como decorrência de tal situação as conhecidas formas de

infecção rotuladas como alternativas passaram a merecer maiores atenções,

porquanto os atingidos pela protozoose continuam podendo causar novos

comprometimentos capazes então de prejudicar o pleno êxito de medidas preventivas

adotadas até agora (Rassi et al. 2004).

A doença de Chagas é caracterizada por duas fases distintas: a fase

aguda com intensidade e duração de 60 dias, ocorrendo uma intensa

multiplicação parasitária que pode originar manifestações clínicas como

febre, mal estar, astenia, presença de sinais de porta de entrada (sinal de

Romaña e chagoma de inoculação), edema, esplenomegalia e

hepatomegalia, porém a grande maioria dos indivíduos não apresenta

nenhuma sintomatologia. Na passagem para a fase crônica podem estar

envolvidos fenômenos de imunomodulação, como declínio acentuado da

parasitemia e redução progressiva dos fenômenos inflamatórios. Em geral, a

fase crônica inicia-se com a forma indeterminada, também denominada

latente, sub-clínica, apresentando eletrocardiograma, raio-X de toráx, cólon e

esôfago normais. Aproximadamente 20-25% dos indivíduos infectados

evoluem para cardiopatia chagásica crônica, apresentando progressivo dano

cardíaco resultante da destruição de cardiomiócitos e do sistema condutor e,

5-10% são acometidos de síndromes digestivas, destacando-se a

esofagopatia e a colopatia (Cunha-Neto et al. 1995).

1.2.1 Doença de Chagas em Imunodeprimidos

A reativação da doença de Chagas tem sido relacionada a situações que

induzem imunodepressão, como neoplasias, drogas e a infecção pelo HIV (Almeida et

al. 1991). A reativação da doença de Chagas representa muitas vezes a primeira

infecção oportunística nos pacientes com infecção pelo HIV e a meningoencefalite

e/ou miocardite são as principais manifestações clínicas (Gallo et al. 1992). Apesar do

diagnóstico realizado e o tratamento específico instituído, a progressão é muitas vezes

fatal (Sartori et al. 1998).

Estudos, tanto in vitro quanto no homem, têm demonstrado que a infecção

aguda pelo T. cruzi causa severa imunodepressão no hospedeiro. Também, foi

demonstrado na fase aguda que T. cruzi tem a capacidade de induzir diminuição na

expressão das moléculas de superfície CD3+, CD4+ CD8+, bem como de receptores

de IL-2 (Higuchi 1995).

Se a imunodepressão também está presente na fase crônica da doença de

Chagas, é assunto controvertido. Estudos experimentais têm mostrado deficiência da

função helper na fase crônica da doença de Chagas (Higuchi 1995).

1.3 Doença de Chagas congênita

Desde a descrição da doença de Chagas congênita, por Carlos Chagas em

1911, inúmeros autores têm demonstrado a importância da forma de transmissão

congênita, não só experimentalmente, mas principalmente no homem, sendo o

primeiro caso descrito na Venezuela (Dao 1949).

A freqüência da transmissão maternal ou vertical da doença de Chagas pode

variar, de acordo com a região e a metodologia usada no estudo, de 1% no Brasil e de

4 a 12% em Países do Cone Sul (Consenso Brasileiro em Doença de Chagas 2005). A

transmissão vertical é considerada um mecanismo de perpetuação dessa enfermidade

parasitária que vem demonstrando importância nas últimas décadas em regiões

endêmicas e urbanas, onde estão concentrados muitos migrantes acometidos pelo

T.cruzi. Nas décadas de 60 e 70 estudos mostraram, por meio de exame

anatomopatológico de fetos, natimortos e prematuros, evolução fatal intra-uterina

dessa infecção (Bittencourt 1972; Amato-Neto 1968). A partir da década de 80,

pesquisas prospectivas evidenciaram, por meio de diferentes métodos de diagnóstico,

tais como parasitológico, sorológico e anatomopatológico, formas variadas deste

mecanismo de transmissão da doença de Chagas. Estas podem apresentar de

diversas maneiras, exemplificadas por óbito fetal em qualquer fase da gestação,

prematuridade, hepatoesplenomegalia, febre, anemia, icterícia e meningoencefalite;

em cerca de 50% dos casos o recém-nascido pode apresentar-se sem sintomas ou

oligossintomático. Os fatores possibilitadores da transmissão materno-fetal do T. cruzi

não estão bem esclarecidos: a cepa e a presença de parasitos circulantes podem

estar envolvidos (Rassi et al. 2004).

O concepto pode adquirir a doença de Chagas da mãe, via transplacentária,

geralmente após o 6° mês de gestação, entre 22 e 37 semanas e parece depender de

fatores ligados ao parasito e ao hospedeiro (Bittencourt 1992). A fase e as formas

clínicas da infecção materna não parecem afetar a transmissão, embora a fase aguda,

quando a parasitemia é alta e persistente, apresente maior risco que a crônica. A

infecção congênita pode ocorrer em 71% dos recém-nascidos de mães com infecção

aguda durante a gravidez e em 1,6% na fase crônica de doença (Freilij 1994). T. cruzi

atravessa o epitélio corial, parasita o estroma vilositário, prolifera sob a forma

amastigota e provoca alterações. O grau de envolvimento placentário esta geralmente

relacionado com a intensidade das lesões fetais (Reiche et al. 1996). Formas menos

freqüentes de transmissão materna da doença de Chagas podem ocorrer pela

contaminação oral por meio do líquido amniótico, e a transmissão hematogênica,

durante o trabalho de parto. Há também a possibilidade da transmissão pelo leite

materno em mulheres que cursam a fase aguda da infecção ou quando ocorre

sangramento dos mamilos (Howard 1962).

O diagnóstico do recém-nascido muitas vezes pode ser confirmado pela

presença do parasito ao exame direto ou pelo xenodiagnóstico. Os anticorpos da

classe IgM anti-T. cruzi são detectáveis por imunofluorescência indireta e ELISA,

cumprindo assilanar que, às vezes, são de aparecimento tardio, exigindo assim

seguimento do recém-nascido, com coletas de sangue seriadas, ao contrário do que

acontece em casos agudos não-congênitos (Bittencourt 1984). A persistência de

anticorpos específicos da classe IgG por um período maior que 6 meses indica

infecção congênita (Bittencourt 2000).

1.4 Diagnóstico

O diagnóstico da doença de Chagas pode ser feito por métodos parasitológicos

e por testes sorológicos, as alterações clínicas podem ser detectadas por exames de

imagem, como os radiológicos. Na fase aguda da doença procura-se identificar o

parasito, enquanto que na fase crônica da doença utilizam-se métodos imunológicos

para identificação de anticorpos específicos.

1.4.1 Diagnóstico parasitológico

Na fase aguda são utilizados métodos diretos para a pesquisa de formas

tripomastigotas do T. cruzi na corrente sanguínea e métodos de multiplicação como a

hemocultura e o xenodiagnóstico, que apresentam elevada especificidade, porém

baixa sensibilidade.

A pesquisa direta do parasito pode ser feita por microscopia direta onde se

coloca o sangue entre lâmina e lamínula, durante as seis primeiras semanas da

doença. Técnicas como a da gota espessa ou da concentração do sangue, corada

pelo Giemsa aumentam a probabilidade de encontrar o parasito se este estiver com

baixa parasitemia no hospedeiro.

A hemocultura é muito utilizada para diagnóstico na fase crônica da doença de

Chagas visto que T. cruzi é um protozoário facilmente cultivado em inúmeros meios

acelulares contendo componentes como, sais, proteínas e derivados de hemina. É

possível realizar a hemocultura utilizando equipamentos existentes em pequenos

hospitais, centros e postos de saúde em áreas rurais.

O emprego da técnica de hemocultura abriu perspectivas como um método

alternativo visando melhorar a detecção dos parasitos pelos métodos parasitológicos

indiretos, diante da variada sensibilidade dos mesmos. A parasitemia escasssa e

intermitente nos indivíduos infectados na fase crônica da doença de Chagas explicaria

a dificuldade na detecção do T. cruzi em todas as amostras de sangue coletadas, a

qual depende da presença do parasito na amostra no momento da coleta de sangue

(Castro et al. 2002).

A hemocultura é muito importante para o isolamento de populações do T. cruzi

de seres humanos, vetores, reservatórios silvestres e domésticos. Os parasitos

isolados são amplificados em meio de cultivo visando à caracterização por técnicas

bioquímicas e/ou de biologia molecular como, por exemplo, isoenzimas e

endonucleases de restrição, impressões digitais do DNA, amplificação aleatória de

polimorfismos de DNA (RAPD-PCR) e amplificação do domínio divergente do gene

ribossômico 24S e LSSP-PCR (Low stringency single specific primer-PCR) (Chiari &

Galvão 1997).

O método de reação em cadeia da polimerase (PCR) é altamente sensível para

detecção de DNA do parasito. Para a doença de Chagas poderia representar

importante procedimento para os casos com resultados sorológicos duvidosos. Em

outras palavras, poderia ser utilizado como teste padrão ouro. Deve-se tomar muito

cuidado com a contaminação no laboratório no momento de realização do exame para

evitar assim os resultados falsos positivos.

Os testes sorológicos são amplamente utilizados na doença de Chagas, para

selecionar doadores em bancos de sangue, para acompanhamento da terapêutica

antiparasitária, para fins sociais na seleção de trabalhadores, para confirmar ou excluir

uma suspeita clínica e para inquéritos soroepidemiológicos, sendo os mais utilizados a

hemaglutinação Indireta, Imunofluorescência Indireta e o ELISA, sendo testes que

utilizam antígenos brutos e apresentam como vantagens principais sua disponibilidade

em kits comerciais e de boa reprodutibilidade, sua sensibilidade e especificidade

(Luquetti & Rassi 2000).

1.5 Análise da diversidade intra-específica do T. cruzi

1.5.1 Variabilidade biológica e bioquímica do T. cruzi

T. cruzi é constituído por populações heterogêneas contendo um grande

número de clones naturais, que circulam nos ambientes domésticos e silvestres entre

seres humanos, reservatórios e vetores. Tais populações são complexas e

apresentam variações intra-específicas demonstradas em níveis biológicos,

bioquímico, imunológico e genético (Devera et al. 2003). Essa grande variabilidade

biológica e genética encontrada nessa espécie pode ser explicada pelos múltiplos

contatos entre os vetores e reservatórios nas áreas endêmicas, os quais propiciariam

as infecções com mais de uma população do T. cruzi, com distintas propriedades

biológicas entre si, e coexistiriam dentro de um mesmo hospedeiro, sem recombinação

entre eles, constituindo as cepas/populações monoclonais ou multiclonais (Tibayrenc

& Ayala 1991).

As diversas manifestações clínicas observadas na doença de Chagas passam

por períodos ou fases, algumas relacionadas ao hospedeiro como a resposta imune, e

outras inerentes ao parasito que apresenta distintas características evidenciadas pela

diversidade de cepas isoladas dos mais diferentes hospedeiros (Martins et al. 2003).

O estudo da diversidade biológica do T. cruzi realizada experimentalmente em

camundongos demonstrou diferenças significativas entre parâmetros como a

morfologia das formas sanguínea, virulência e patogenicidade, tropismo tecidual e

biodemas do parasito que demonstraram que há cepas de alta e baixa virulência com

elevado poder de patogenicidade (Andrade 1974 e Andrade et al. 1985). Em 1997

Andrade e Magalhães agruparam as cepas de T. cruzi em três biodemas (I, II e III)

com base em critérios relacionados a picos de parasitemia, taxas de mortalidade,

predomínio de formas largas ou delgadas, tropismo tecidual e comportamento

histopatológico. O biodema tipo I inclui as cepas que se multiplicam rapidamente,

apresentam elevada parasitemia com predomínio de formas delgadas e

macrofagotropismo com a mortalidade ocorrendo entre o 7º e 12º dias após-infecção;

no tipo II estão as cepas de multiplicação lenta, picos irregulares de parasitemia entre

o 12º e 22º dias após a infecção, com alta mortalidade; o tipo III inclui aquelas de

multiplicação lenta, mas com picos tardios de parasitemia, entre o 20º e o 30º dias

após a infecção, com predomínio de formas largas e tropismo para musculatura

esquelética.

Outras pesquisas realizadas com o objetivo de diferenciar as cepas do T. cruzi

se basearam na utilização da diferenciação dos perfis eletroforéticos de isoenzimas

que agruparam as populações do T. cruzi em três zimodemas principais, denominados

Z1, Z2 e Z3 (Miles et al. 1977) e ZA, ZB, ZC, ZD (Romanha 1982; Carneiro et al.

1990).

Os zimodemas Z2 e ZA são equivalentes sendo, portanto, encontrados no

Brasil seis principais zimodemas correspondentes ao Z1, Z2 ou ZA, Z3, ZB, ZC e ZD.

Destes, o Z2 estaria associado ao ciclo doméstico, enquanto o Z1 e o Z3 seriam

encontrados principalmente em animais e vetores do ciclo silvestre e em pacientes

infectados pelo T. cruzi na fase aguda (Miles et al. 1980; Barret et al. 1980) Tibayrenc

et al. 1986 analisando um número maior de locus, com 15 marcadores enzimáticos e

cepas do T. cruzi procedentes de diversos países, identificaram 43 zimodemas.

Tibayrenc em 1995 sugeriu a existência de duas grandes linhagens filogenéticas,

altamente heterogêneas, que diferem em várias características biológicas. Estudos

demonstram que uma dessas linhagens esta relacionada com as populações

encontradas em seres humanos e pode ser subdividida em cinco subgrupos distintos

com características geográficas e ecológicas bem definidas (Brissé et al. 2000, 2001).

1.6 Caracterização genética do T. cruzi

O DNA nuclear do T. cruzi tem um conteúdo que varia de 87 a 200 Mb e é

composto por seqüências que codificam proteínas, outras que codificam ácidos

ribonucléicos (RNAs) e seqüências repetitivas (± 44%) do genoma nuclear (Castro et

al. 1981), seu tamanho varia de poucos pares de nucleotídeos até mais de 5 mil pares

de bases (Requena et al. 1996). Estas seqüências podem estar agrupadas ou

dispersas no genoma, muitas delas, como os micro e mini-satélites, os genes de

rRNAs e RNA de seqüência líder, estão organizadas em repetições dispostas uma

após a outra de maneira regular e periódica denominadas de repetições em tandem

(Sloof et al. 1983).

O DNA satélite foi a primeira seqüência repetitiva e caracterizada no genoma

do T. cruzi com cópias em tandem em vários cromossomos (Gonzalez et al. 1984). Os

microssatélites, pequenas seqüências de DNA em tandem, apresentam elevado grau

de polimorfismo sendo utilizados em estudos filogenéticos e taxonômicos, além de

determinar se uma cepa é monoclonal ou policlonal (Macedo et al. 2001).

Com a identificação de marcadores do DNA nuclear com baixas taxas

evolutivas, tais como o domínio divergente do gene de RNA ribossômico (rRNA) 24Sα

e a região intergênica dos genes de mini-exon, estruturaram o consenso sobre a

existência de principais linhagens filogenéticas dentro da espécie de T. cruzi. Souto et

al. (1996) constataram um dimorfismo no produto amplificado do domínio divergente

do gene de rRNA 24Sα do T. cruzi, permitindo a classificação das cepas em três

grupos, sendo os dois primeiros os principais, onde no grupo 1 foi observado um

produto de 125 pb e no grupo 2 um produto amplificado de 110 pb e no 3° grupo onde

os produtos amplificaram as bandas de 110 e 125 pb, esse ultimo grupo foi

denominado de grupo ½.

Na última década as populações de T. cruzi puderam ser classificadas em dois

grandes grupos com características genéticas, biológicas e epidemiológicas bem

distintas, denominado de TCI e o TCII onde no primeiro grupo estão cepas pouco

infectantes para as células hospedeiras e induzem baixa parasitemia, pois expressam

a glicoproteína (gp90) que está relacionada com a inibição da mobilização do cálcio

requerido para a invasão das células. As pertencentes ao segundo grupo são

altamente infectivas para o hospedeiro vertebrado e não expressam a gp90 (Ruiz et al.

1998).

Análises do DNA do T. cruzi mostraram que o TCI consiste de um único grupo

relativamente homogêneo, ao contrário do TCII que pode ser dividido em cinco

subgrupos (TCIIa, TCIIb, TCIIc, TCIId e TCIIe), apresentando o TCIIa TCIIb e TCIIc

com linhagens filogenéticas distintas e duas linhagens hibridas o TCIId e TCIIe, que

tem haplotipos separados dos subgrupos TCIIb e TCIIc (Brisse et al. 2001; Gaunt et al.

2003; Burgos et al. 2007).

A RAPD (random amplified polymorphic DNA) é uma técnica que utiliza curtos

iniciadores de seqüência aleatória que amplificam fragmentos de DNA de tamanho e

intensidade variáveis, gerando perfis complexos de bandas que podem ser específicos

para cada cepa. Tibayrenc et al. (1993), demonstraram uma forte correlação entre os

perfis genéticos obtidos do T. cruzi pela técnica de RAPD e zimodemas. Uma análise

comparativa dos perfis de RAPD com dois isolados de T. cruzi obtidos de pacientes

com doença de Chagas em diferentes períodos mostraram padrões variáveis,

sugerindo populações de parasitas policlonais e monoclonais (D’ Ávila et al. 2006).

O kDNA (organela citoplasmática que representa de 10 a 20% do DNA total do

T. cruzi) está estruturalmente organizado em uma rede complexa de moléculas

circulares formando os maxicírculos e os minicírculos. Os minicírculos representam

95% do DNA total (Simpson & Silva 1971). As seqüências de nucleotídeos da região

variável dos minicírculos são muito heterogêneas, tanto ao nível intra-específico como

interespecífico (Sturm & Simpson 1990). Os minicírculos do kDNA apresentam muitas

cópias por célula, devido a isso eles são comumente usados como alvos na detecção

do parasito.

A técnica de RFLP (restriction fragment length polymorphism) foi prontamente

utilizada para a caracterização do kDNA dos minicírculos do T. cruzi a partir da

digestão do kDNA do parasito por enzimas de restrição estabelecendo grupos

altamente heterogêneos denominados esquizodemas (Morel et al. 1980, 1984). A

obtenção dos esquizodemas a partir da restrição de fragmentos contendo a região

variável do minicírculo de 330 pb amplificados por Polymerase Chain Reaction (PCR)

estabeleceu perfis mais complexos exigindo uma menor quantidade de parasitos para

o estudo de caracterização de cepas e clones (Ávila et al. 1990).

Outra técnica utilizada para caracterizar a região hipervariável do minicírculo do

T. cruzi é a LSSP-PCR (low-stringency specifc primer-PCR) que consiste em submeter

um fragmento de DNA previamente amplificado a uma segunda ração de amplificação,

utilizando um único iniciador geralmente específico para uma das extremidades do

fragmento analisado sob condições de estringência excessivamente baixas. Pelo fato

da reação de LSSP-PCR ocorrer em condições de baixa extringência e especificidade,

a presença de qualquer DNA contaminante impede a reprodutibilidade da técnica

(Pena et al. 1994; Barreto et al. 1996; Vago et al. 1996).

Esses fatores permitem a ligação do iniciador à região de exata

complementaridade e sua interação a múltiplos sítios presentes no interior do

fragmento analisado de maneira seqüência-dependente. É possível identificar assim,

polimorfismos a partir da PCR de fragmentos purificados de kDNA possibilitando a

diferenciação das populações do T. cruzi com alto grau de resolução em material

biológico mesmo com pequeno número de parasitos. Quando os produtos da reação

de LSSP-PCR são separados por eletroforese, um perfil composto por múltiplas

bandas é gerado, o qual reflete a seqüência de nucleotídeos do DNA utilizado como

molde, e que constitui, em conseqüência, a sua “assinatura gênica” (Vago et al. 1996a,

1996b).

Vago et al. (1996) estudaram por meio da LSSP-PCR tecidos de animais

infectados pelo T. cruzi tanto da fase aguda quanto de fase crônica e notaram uma

concordância entre os perfis obtidos da cultura de parasitos com isolados no tecido,

demonstrando a sensibilidade e especificidade da técnica. Andrade et al. (1999)

também utilizando a mesma técnica avaliaram camundongos BALB/c simultaneamente

inoculados com duas diferentes cepas de T. cruzi e verificaram que os animais

infectados com as duas cepas, mesmo ao atingir a fase crônica, não apresentaram

mudanças nos perfis genéticos das cepas parentais. Esse achado demonstra a

importância da técnica para a análise de populações. Em 2000, Vago et al. analisaram

pacientes infectados pelo T. cruzi na fase crônica com cardiomiopatia e esofagopatia e

detectaram perfis genéticos distintos utilizando a técnica de LSSP-PCR.

Meija & Triana (2005), infectaram camundongos com duas cepas de origem

colombiana de T. cruzi e detectaram a presença das duas linhagens de T. cruzi por

meio da LSSP-PCR, bem como o caráter multiclonal das cepas trabalhadas.

Salazar et al. (2006), utilizaram a LSSS-PCR, a fim de determinar a relação

genética entre as amostras de T. cruzi isoladas de diferentes origens geográficas,

espécies vetoras e hospedeiro e mostraram a correlação de muitos isolados com suas

respectivas origens geográficas.

Estes resultados reafirmam o valor da técnica de LSSP-PCR para estudos de

epidemiologia molecular.

2- JUSTIFICATIVA

A diversidade genética do T. cruzi é muito maior do que se tem avaliado e

diversas populações genéticas do parasito podem coexistir dentro de um mesmo

hospedeiro, sem recombinação entre elas, gerando padrões complexos e difíceis de

serem interpretados. Os trabalhos existentes na literatura que avaliam as

características moleculares e bioquímicas do parasito envolvem etapas de isolamento,

amplificação e manutenção, as quais podem dar lugar a processos de seleção clonal,

induzindo modificações no comportamento fenotípico e genotípico deste protozoário.

Deste modo, uma população estudada pode diferir significativamente daquela

presente no hospedeiro vertebrado e não ser representativa das populações

responsáveis pelas lesões teciduais. Atualmente têm-se uma preocupação muito

grande com a padronização de técnicas moleculares para classificação das cepas nos

dois grupos principais TCI e TCII.

A transmissão congênita ou vertical constitui um sério problema de saúde

pública em áreas endêmicas e não-endêmicas, devido à freqüente migração das

populações rurais para os centros urbanos. Lembrando que em áreas não endêmicas

deve-se considerar também a possibilidade de transmissão congênita na segunda e

terceira geração.

O desenvolvimento da técnica de Low Stringency Single Specific Primer-PCR

(LSSP-PCR) abriu uma nova possibilidade de caracterização genética do parasito

diretamente do sangue e tecidos, permitindo estudar a variabilidade genética do kDNA

do T. cruzi, nas populações do parasito diretamente envolvidas nas manifestações

clínicas da infecção. Essa técnica permite detectar distintas alterações de nucleotídeos

em fragmentos de interesse de maneira precisa, rápida e informativa. A caracterização

genética do T. cruzi, associada aos diferentes quadros clínicos presentes na doença

de Chagas, poderá gerar novas perspectivas na epidemiologia molecular desta

infecção.

3- OBJETIVOS

3.1 Objetivo Geral

Caracterização molecular de 30 isolados de T. cruzi por meio da técnica

de hemocultura de pacientes com doença de Chagas na fase crônica,

gestantes e não gestantes pela técnica de LSSP-PCR.

3.2 Objetivos Específicos

1- Determinar os grupos e subgrupos das populações de T. cruzi

isoladas de mulheres infectadas na fase crônica da doença de Chagas,

utilizando marcadores do DNA nuclear: genes 24Sα e 18S (rRNA) e mini-exon.

2- Avaliar a variabilidade intra-específica do T. cruzi pela técnica LSSP-

PCR e sua correlação com a naturalidade, idade e idade gestacional das

pacientes selecionadas para o estudo.

3- Verificar a existência de subpopulações do T. cruzi pela LSSP-PCR,

nos vários tubos de hemocultura obtidos de uma mesma paciente.

4-MATERIAL E MÉTODOS

4.1 Origem dos isolados

Essa pesquisa foi constituída do estudo de 30 isolados de T. cruzi obtidos por

meio da técnica de hemocultura realizadas com pacientes infectadas pelo T. cruzi na

fase crônica da doença de Chagas, 25 gestantes e 5 não gestantes, que foram

previamente diagnosticadas pelo teste da mamãe no Instituto de Diagnóstico e

Prevenção (IDP) da Associação de Pais e Amigos dos Excepcionais de Goiânia

(APAE) e posteriormente encaminhadas, atendidas e acompanhadas no Ambulatório e

Laboratório de Chagas do Hospital das Clínicas da Universidade Federal de Goiás,

Goiânia, GO, no período de 01/2006 a 10/2007.

As pacientes envolvidas neste projeto foram esclarecidas quanto aos objetivos

do mesmo, e dele participaram somente aquelas que concordaram com o

consentimento livre e esclarecido para a coleta e utilização do seu sangue e produtos.

Este projeto de pesquisa foi aprovado pelo Comitê de Ética do Hospital das Clínicas

da UFG, Goiânia, GO com protocolo CEPMHA/HC nº 056/06. Os dados referentes às

pacientes encontram-se no Anexo 1.

4.2 Processamento das amostras

O sangue utilizado na pesquisa foi colhido no laboratório de Chagas do

Hospital das Clínicas-UFG e as hemoculturas foram processadas no laboratório de

Parasitologia do Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública-UFG, Goiânia-GO.

Todas as análises moleculares e estatísticas foram realizadas no setor de

Parasitologia da Universidade Federal do Triângulo Mineiro, Uberaba-MG.

4.3 Diagnóstico Parasitológico e Molecular

4.3.1 Hemocultura

Trinta mililitros de sangue de cada indivíduo foram colhidos para realização da

hemocultura em meio LIT, idealizado por YAEGER e descrito por Fernandes &

Castellani (1964) e Camargo (1964). O protocolo utilizado foi o de Chiari et al. (1989)

com algumas modificações sugeridas por Luz et al. (1994). O sangue venoso foi

colhido utilizando três tubos vacutainer contendo heparina sódica e processado no

máximo em quatro horas, durante esse período foi mantido em banho de gelo. O

sangue foi centrifugado a 1.000g durante 10 minutos a 4°C em centrífuga (Janetzki-

K24) e o plasma removido e centrifugado a parte, ao seu sedimento foi adicionado 3

mL do meio de cultura LIT (Liver Infusion Triptose). Ao sedimento de hemácias foi

adicionado igual volume do plasma removido de meio de cultura LIT (Camargo 1964)

centrifugado a 2.500 g durante (10 min) a 4°C. A seguir, o sobrenadante foi descartado

e o sedimento de hemácias ressuspendido em meio LIT, homogeneizado e alícotas de

2-3mL distribuídas em sete tubos plásticos de 15mL (Falcon, USA) contendo 3mL de

meio LIT, demonstrado na figura 1.

Os tubos foram mantidos em estufa BOD (General Electric-FANEN-LTDA) a

28°C e homogeneizados duas vezes por semana para aeração. Alíquotas de 10µl da

suspensão de cada tubo foram colocadas entre lâmina e lamínula e foram examinadas

em microscópio com aumento de 400X aos 30, 60, 90, 120 e 150 dias após o exame.

A partir das hemoculturas positivas foram realizados cultivo em meio LIT e

criopreservação em N

líquido a-196°C.

Figura 1: Esquema da hemocultura, segundo Chiari et al. (1989) e Luz et al. (1994).

Sedimento do

plasma + 3mL/LIT

26-28

Exames mensais

até 150 dias

Meio LIT -2.500g

C-15min

2-3 mL do sedimento

+ 3mL/ LIT

3 X 10mL de sangue

(heparina)

2.500g

C-

Plasma

2.500g

C-

Plasma

(-20

4.4 Caracterização genética do T. cruzi

4.4.1 Extração do DNA

A reação em cadeia de polimerase (PCR) foi realizada segundo a técnica

descrita por Gomes et al. (1998). Foram colhidos 10mL de sangue de cada paciente

no mesmo momento da hemocultura em tubos vacutainer sem anticoagulante. Este

sangue foi transferido para tubos plásticos de 50 mL (Falcon-USA) contendo igual

volume de Guanidina-HCL 6M/EDTA (Sigma Chemical Co, USA) pH 8,0 (Ávila et al.

1990). Estes reagentes permitem a lise e preservação do DNA à temperatura

ambiente. Essas amostras foram estocadas uma semana a temperatura ambiente e

fervidas a 100°C por (15 min) para promover a linearização dos minicírculos e a sua

liberação da rede do kDNA (Brito et al. 1993), permitindo desse modo, uma

distribuição homogênea de seqüências alvos. A seguir as amostras foram estocadas a

4°C até o momento de uso.

As amostras de hemocultura em guanidina-EDTA (Guanidin-HCL 6M e EDTA

Dissódico 0,2M, pH 8,0) foram fervidas a 100°C em banho-maria durante (15 min),

separadas em alíquotas de 200µL em tubos de microcentrífuga de 1,5 mL (Eppendorf-

USA) aos quais foi acrescentado 100µL de água milli-Q estéril. A desproteinização foi

realizada com 400µL de uma mistura (v/v) de fenol (Tris pH 8,0) e clorofórmio: álcool

isoamílico (24:1) com posterior agitação por (10 min) e centrifugação a 10.000g por (5

min). O sobrenadante foi transferido para outro tubo, adicionou-se 10% de acetato de

sódio (3M pH 5,2), duas vezes o volume de etanol absoluto gelado e foi deixado em

banho de gelo por (15 min) para a precipitação do DNA. A mistura foi centrifugada a

10.000g por (15 min), o sobrenadante descartado e após a volatilização do etanol, o

DNA foi ressuspendido em 60µL de água milli-Q estéril e estocado a 4°C durante 36

horas para ocorrer solubilização. Para cada extração foi realizado um controle

negativo (contendo apenas os reagentes utilizados durante a extração do DNA) e um

controle positivo (amostra de hemocultura de indivíduo infectado pelo T. cruzi).

4.4.2 Amplificação específica do T. cruzi

Nas reações da PCR específica as seqüências da região constante dos

minicírculos de rede de kDNA constituíram o alvo da reação, amplificando um

fragmento de 330pb com os iniciadores 121 (5’-AAATAATGTACGG(T/G)-

GAGATGCATGA-3’) e 122 (5’-GGTTCGATTGGGGTTGGTGTAATATA-3’), (Wincker

et al. 1994).

As reações de amplificação foram realizadas em um volume final de 20µl

contendo Tris-HCL, 10mM (pH 9,0), Triton X-100 0,1%, KCL 75mM, Cl2Mg 3,5mM,

0,2mM de cada deoxinucleotídeos (dATP/dTTP/dGTP/dCTP, Sigma Chenical Co.

USA), 1 unidade de Taq DNA polimerase (Promega Corporation, USA) e 20pmoles de

cada iniciador da reação e 2µl de DNA molde. À mistura da reação foram

acrescentados 30µl de óleo mineral (Sigma Chenical CA. USA) para evitar a

evaporação.

O programa de amplificação foi constituído de uma desnaturação inicial a 95°C

(5 min), 35 ciclos de desnaturação a 95°C (1 min), anelamento a 65°C (1 min) e

extensão a 72°C (1 min) seguida de extensão final de (10 min) em termociclador

automático (PTC-100 MJ Research Inc. USA). Os produtos de amplificação por meio

da PCR foram visualizados em géis de poliacrilamida não desnaturante a 6%, corados

com nitrato de prata 0,2%.

As etapas de extração do DNA e mistura da reação da PCR sempre foram

monitoradas com controles positivos (hemoculturas de indivíduos com doença de

Chagas) e negativos (sangue indivíduos que não eram infectados pelo T. cruzi de

áreas endêmicas e não-endêmicas). Para evitar contaminações, cada etapa da reação

foi realizada em ambientes separados, utilizando reagentes e equipamentos

destinados exclusivamente para cada uma das mesmas. As amostras que

apresentaram resultados negativos foram testadas com DNA extraído de cultura do T.

cruzi. A reação de PCR foi repetida em duplicata nas mesmas condições descritas

anteriormente, sendo adicionadas 2µl de DNA de cultura no segundo tubo para

confirmar se estava ocorrendo inibição da reação.

4.4.3 Genotipagem do T. cruzi presente nos isolados

De acordo com Yeo et al. (2005), por meio da associação dos perfis de bandas

obtidos na análise do mini-exon, do 18S rDNA e do 24α rDNA é possível discriminar

os diferentes grupos e subgrupos do T. cruzi, com exceção dos subgrupos IIb e IIe

(Quadro I).

Quadro 1: Discriminação dos grupos e subgrupos do T. cruzi pela análise do tamanho do

produto amplificado (em pares de bases) nas PCRs do mini-exon, do 18S rDNA e do 24α rDNA

Marcadores TCI TCIIa TCIIb TCIIc TCIId TCIIe Resolução dos

subgrupos (TCII)

Mini-exon 350 400 300 250 300 300 TCIIa,c

18S rDNA 160 155 165 165 165 165 TCIIa

24α rDNA 110 120 125 110 110/125 125 TcIIa,c,d

Fonte: Yeo et al. 2005.

4.4.3.1 Amplificação do domínio divergente D7 do gene 24Sα

rRNA

A amplificação por PCR do domínio divergente D7 do gene RNA ribossômico

24Sα foi realizada com os iniciadores D71 (5’-AAGGTGCGTCGACAGTGTGG-3’) e

D72 (5’-TTTTCAGAATGGCCGAACAGT-3’), como descrito por Souto e Zingales

(1993). A reação foi realizada com um volume final de 22µ contendo 10mM Tris-HCL

(pH=9,0), 50mM de KCL, 3,5mM de MgCL

0,65 unidades de Taq DNA-polimerase

(Promega, Madison, WI, USA), 0,1% Triton X-100, 0,2mM de cada dNTP, 10pmol de

cada iniciador, 1ng/µL de DNA e 30µL de óleo mineral. Após desnaturação pelo calor

(4 min) a 94°C, as amostras foram submetidas a 30 ciclos de três temperaturas 94°C

(1 min) 60°C (1min) e 72°C (1min) seguidos por uma elongação final de (5 min) a

72°C. Os produtos amplificados foram visualizados por eletroforese em gel de

poliacrilamida a 6% e corados pelo nitrato de prata a 0,2%.

4.4.3.2 Amplificação do domínio de tamanho variável do gene

18S rRNA

Para essa PCR foram utilizados os iniciadores V1

(5’-CAAGCGGCTGGGTGGTTATTCCA-3’) e V2

(5’-TTGAGGGAAGGCATGACACATGT-3’). A reação foi realizada em um volume final

de 22µL contendo 10mM Tris-HCL (pH=9,0), 50mM de KCL, 3,5mM de MgCl

, 0,65

unidades de Taq DNA polimerase (Promega, Madison, WI, USA), 0,1% Triton X-100,

0,2mM de cada dNTP, 10 pmol de cada iniciador, 1ng/µL de DNA e 30µL de óleo

mineral. A amplificação constituiu em 30 ciclos (1 min) a 94°C, (1 min) a 50°C, (1 min)

a 72°C, seguidos por uma elongação final de (5 min) a 72°C. Os produtos amplificados

(Quadro 1) foram visualizados por eletroforese em gel de poliacrilamida a 6% e

corados pelo nitrato de prata a 0,2% (Yeo et al. 2005).

4.4.3.3 Amplificação do espaçador não transcrito do gene de

mini-exon

Para essa PCR foram utilizados os seguintes iniciadores: TC (‘5-

CCCCCCTCCCAGGCCACACTG-3’), TCI (5’-GTGTCCGCCACCTCCTTCGGGCC-3’)

e TC2 (5’-CCTGCAGGCACACGTGTGTGTG-3’). A reação foi realizada em um volume

final de 22µL contendo 10mM Tris-HCL (pH=9,0), 50mM de KCL, 3,5mM de MgCl

0,65 unidades de Taq DNA polimerase (Promega, Madison, WI, USA), 0,1% Triton X-

100, 0,2mM de cada dNTP, 10pmol de cada iniciador, 1ng/µL de DNA e 30µL de óleo

mineral. A amplificação consistiu em 27 ciclos (30s a 94°C, 30s a 55°C30s a 72°C)

seguidos por elongação final de 5 min, a 72°C. Os produtos amplificados (Quadro1)

foram visualizados por eletroforese em gel de poliacrilamida a 6% e corados pelo

nitrato de prata a 0,2% (Yeo et al. 2005).

4.5 Variabilidade genética do kDNA dos isolados do T.

cruzi

Para a análise da variabilidade genética entre os isolados do T. cruzi foi

realizada a caracterização da região variável dos minicírculos do kDNA por meio da

técnica de LSSP-PCR em isolados do parasito de 30 hemoculturas, sendo que em

cada hemocultura o material biológico foi aliquotado em sete tubos, resultando assim á

analise de 84 tubos positivos.

4.5.1 LSSP-PCR (Low Stringency Single Specific Primer-PCR)

A obtenção das assinaturas gênicas do kDNA do T. cruzi foi realizada pela

técnica de LSSP-PCR.

Essa reação foi realizada em duas etapas: a primeira constitui na amplificação

específica (PCR) de um fragmento de 330pb, que serviu como DNA molde para a

reação de LSSP-PCR em uma segunda etapa de amplificação. Essa técnica exige

uma quantidade aproximada de 15ng do DNA molde para ser realizada (Vago et al.

1996a).

O produto da amplificação do kDNA do T. cruzi pela PCR correspondente à

banda de 330pb, foi purificado com gel de agarose 1,5% TBE 1X (89mM Tris-borato,

2mM EDTA pH 8,0) preparado com água bidestilada estéril em presença de 0,5µg/ml

de brometo de etídeo. As bandas com 330pb foram visualizadas com um

transiluminador de luz ultravioleta de comprimento de onda longa e coletada com o

auxílio de um bisturi estéril. Após o aquecimento em banho-maria as amostras foram

homogeneizadas e diluídas 1:10 com água mili-Q estéril e usadas como DNA molde

para as reações de LSSP-PCR (Vago et al. 1996b e 2000).

Sabendo que a reação de LSSP-PCR ocorre em condições de baixa

estringência e especificidade e que a presença de qualquer DNA contaminante impede

a reprodutibilidade da técnica todos os procedimentos foram realizados em condições

de esterilidade química e bacteriológica como, por exemplo: a desinfecção da cuba de

eletroforese com HCl 0,25N e NaOH 0,5N (30 minutos cada) e água bidestilada estéril;

a exposição de todo material utilizado (inclusive a cuba de eletroforese) à radiação

ultravioleta (30 min); a corrida de eletroforese com a cuba coberta com filme plástico; a

aplicação do DNA no gel de agarose com intervalo de uma canaleta vazia entre cada

amostra.

Nas reações de LSSP-PCR as amostras de DNA foram re-amplificadas

utilizando um único iniciador específico (correspondente ao iniciador 121 com 21pb)

denominado S35G (5’-AAATAATGTACGGGGGAGATG-3’). A mistura da reação teve

um volume final de 10µl contendo 10mM Tris-HCl (pH8,5), 0,1% Triton X-100, 1,5mM

MgCl

2 ,

0,2mM de cada dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, and dTTP), 1,0 unidade de Taq

DNA polimerase (PROMEGA, MADISON, WI-USA) 45pmol do iniciador e 3µl de DNA

(fragmento de 330pb purificado em agarose e diluído 1:10) cobertos com 30µl de óleo

mineral.

A amplificação passou por 40 ciclos envolvendo desnaturação a 94°C (1 min),

anelamento a 30°C (1 min) e extensão a 72°C (1 min), precedidos de desnaturação

iniciada 94°C (5 min) e extensão adicional a 72°C durante (7 min) em um

termociclador MJ Research PTC-100. Os produtos de LSSP-PCR foram separados por

eletroforese em gel de poliacrilamida a 7,5% e corados pelo nitrato de prata 0,2%.

4.5.2 Eletroforese em gel de poliacrilamida

Os produtos de amplificação por meio da PCR foram analisados em géis de

poliacrilamida não desnaturante, em diferentes concentrações: para a PCR específica

do kDNA foi utilizado a 6%, e para as técnicas de amplificação do 24Sα rDNA, 18S

rDNA, mini-exon e LSSP-PCR a 7,5%.

Uma amostra de 3 a 5µL do produto amplificado, diluída com igual volume do

tampão da amostra 2X (0,5% de xileno-cianol; 60% de glicerol) foi aplicada em cada

canaleta. A corrida eletroforética, em geral, foi realizada a 80-100V durante

aproximadamente 3 horas, ou seja, com a migração de 6-7cm do corante xileno-cianol.

O tamanho das bandas amplificadas foi monitorado com marcadores moleculares de

100pb.

Após a eletroforese os géis foram transferidos para solução fixadora (etanol

absoluto10%, ácido acético 0,5%) durante 5 minutos. As bandas de DNA foram

reveladas pela coloração com 0,2% de nitrato de prata (Ag/NO

), em solução fixadora

durante 10 minutos, seguidas pela redução dos sais de prata com NaOH 3% (v/v) e

0,3% de formaldeído (37%) durante 10 minutos como descrito por Santos et al. (2002).

Após o aparecimento das bandas a revelação foi interrompida com solução fixadora, e

os géis fotografados.

4.6 Análise dos perfis de LSSP-PCR e construção dos

fenogramas

Os perfis de bandas das populações do T. cruzi obtidos pelas reações de

LSSP-PCR como a construção dos fenogramas foram obtidos pelas analises

realizadas pelo programa GEL COMPAR

II versão 5.0 produzido pela Applied Maths

NV 2007.

4.7 Análise estatística

A análise descritiva foi realizada a partir das porcentagens e valores

absolutos apresentados em tabelas e gráficos.

A avaliação das variáveis numéricas foi realizada pelo cálculo das

medidas descritivas: (1) medidas de centralidade (média e mediana); (2) de

dispersão (mínimo, máximo, desvio padrão-DP, coeficiente de variação-CV,

percentis 25 e 75).

Para as comparações entre grupos (Estados da Federação, idade, idade

gestacional das pacientes, porcentagens de bandas compartilhadas nos perfis

de LSSP-PCR, número de bandas nos perfis de LSSP-PCR) foram utilizados

os testes de ANOVA ou Kruskal-Wallis (quando os dados não apresentaram

distribuição normal e homogênea). Para comparações entre apenas dois

grupos, foi usado o teste de Mann-Whitney (quando os dados não

apresentaram distribuição normal e homogênea). Para todos os testes foi

considerado um nível de significância de 5%. Os dados foram analisados com

o auxílio dos softwares Statistica® v7 e MSExcel®.

5-RESULTADOS

5.1 Origem dos pacientes

Dos 30 isolados analisados 75% (25/30) eram provenientes de gestantes e

25% (5/30) não gestantes. As pacientes são de quatro regiões brasileiras distintas

sendo elas dos Estados da Bahia 53,3% (16/30), Goiás 40,0% (12/30), Paraíba 3,3%

(1/30) e Distrito Federal 3,3% (1/30). Todos os dados referentes às pacientes estão no

Anexo I.

5.2 Hemocultura

5.2.1 Positividade por número de tubos

Foram processadas 30 amostras, as quais cada amostra corresponde a uma

paciente. Segundo a técnica de Chiari et al. (1989) e Luz et al. (1994), 30ml de sangue

foi processado e a papa de hemácias aliquotadas em 7 tubos contendo LIT,

perfazendo um total de 210 tubos. Destes, apenas 84 se mostraram positivos e foram

submetidos a análises da variabilidade genética pela técnica de LSSP-PCR, como

demonstrado no Quadro 2.

Quadro 2: Positividade por número de tubos obtidos pela técnica de hemocultura de 30

mulheres chagásicas crônicas, analisados pela LSSP-PCR.

Total de tubos positivos

Nº de tubos Nº de pacientes Nº total de tubos analisados

1 6 6

2 12 24

3 3 9

4 3 12

5 4 20

6 1 6

7 1 7

28 30 84

5.3 Caracterização dos grupos e subgrupos das

populações de T. cruzi

Os isolados do T. cruzi foram caracterizados pela análise de diferentes alvos

do rRNA (24Sα e 18S) e mini-exon, em diferentes grupos e subgrupos (Yeo et al.

2005). Este método evidenciou o TCII em 100% das populações isoladas de T. cruzi

circulantes nas regiões estudadas, pertencentes ao subgrupo TCIIb/e (96,66%) e

TCIId (3,33%) este último corresponde a uma amostra do grupo controle do Estado da

Bahia como demonstrado na canaleta 23 (Figura 2). Com produtos amplificados de

110pb e 125pb para o gene 24Sα (rRNA), 165pb para o gene 18S rRNA e 300pb para

amplificação dos gene do mini-exon. Como demonstrados na Figuras 2, 3 e 4

respectivamente e no Quadro 1.

Figura 2: Gel de poliacrilamida a 7,5% corado com 0,2% de nitrato de prata, representativo da PCR com os iniciadores D71 e D72, amplificando as bandas

100/125pb do gene 24Sα rRNA. MM- marcador molecular, canaleta-amostra correspondente: 01-controle 110pb, 02- 575, 03-576, 04-577, 05-581, 06-587,

07-590, 08-592, 09-593, 10-596, 11-597, 12-600, 13-603, 14-605, 15-608, 16-609, 17-610, 18-611, 19-controle 110pb, 20-625, 21-626, 22-627, 23-629, 24-

631, 25-632, 24-633, 25-634, 26-636, 27-637, 28-641, 29-644, 30-668 e MM- marcador molecular.

Figura 3: Gel de poliacrilamida a 7,5% corado com 0,2% de nitrato de prata, representativo da PCR com os iniciadores TC, TC1 e TC2, amplificando as

bandas de 300pb do gene mini-exon. MM- marcador molecular, canaleta-amostra correspondente: 01-controle 330pb, 02- 575, 03-576, 04-577, 05-581, 06-

587, 07-590, 08-592, 09-593, 10-596, 11-597, 12-600, 13-603, 14-605, 15-controle 330pb, 16-608, 17-609, 18-610, 19-611, 20-controle330pb, 21-625, 22-

626, 23-627, 24-629, 25-631, 26-632, 27-633, 28-634, 29-636, 30-637, 31-641, 32-644, 33-668, 34-controle 330pb e MM- marcador molecular.

Figura 4: Gel de poliacrilamida a 7,5% corado com 0,2% de nitrato de prata, representativo da PCR com os iniciadores V1 e V2 amplificando as bandas de

165pb do gene 18S rRNA. MM- marcador molecular, canaleta-amostra correspondente: 01-controle 165pb, 02- 575, 03-576, 04-577, 05-581, 06-587, 07-590,

08-592, 09-593, 10-596, 11-597, 12-600, 13-603, 14-605, 15-608, 16-609, 17-610, 18-611, 19-625, 20-626, 21-627, 22-629, 23-631, 24-632, 25-633, 26-634,

27-636, 28-637, 29-641, 30-644, 31-668, 33controle 165pb e MM- marcador molecular.

5.4 Comparação da variabilidade genética do kDNA

entre os 30 isolados

A LSSP-PCR demonstrou a variabilidade genética entre as 30 amostras

analisadas, como pode ser observado no gel representado pela Figura 5 com a média

de 24,08 ± 14,4% de compartilhamento de bandas entre os pares, apresentando o

máximo de 66,7% de similaridade entre os isolados 5 e 6, 23 e 25 e 1 e 30,

demonstrado na Figura 6.

As pacientes 1 e 30 são de regiões geográficas bem distintas a primeira é de

Catolé do Rocha-PB e a segunda de Baianópolis-BA apresentando 66,7% de

compartilhamento de bandas. A paciente 5 é de Santa Maria da Vitória-BA e a 6 é de

Morrinhos-GO ambas apresentaram 66,7% de compartilhamento de bandas. A

paciente 23 é de Pilar-GO e a paciente 25 de Itauçú-GO ambas apresentaram 66,7%.

As pacientes 22 e 27 são da mesma cidade (Formosa-GO) onde se observa 62,5% de

bandas compartilhadas. A paciente 9 é de Sítio d’ Abadia-GO e a 13, de Correntina-BA

apesar de geograficamente distintas essas cidades são próximas. Essas similaridades

podem ser avaliadas em destaque no fenograma representado pela Figura 6.

Figura 5: Caracterização do kDNA dos isolados do T. cruzi pela LSSP-PCR: gel de poliacrilamida a 7,5% corado com 0,2% de nitrato de prata. MM-

marcador molecular, caneleta-amostra correspondente: 01-575, 02-576, 03-577, 04-581, 05-587, 06-590, 07-592, 08-593, 09-596, 10-597, 11-600, 12-603,

13-605, 14-608, 15-609, 16-610, 17-611, 18-625, 19-626, 20-627, 21-629, 22-631, 23-632, 24-633, 25-634, 26-636, 27-637, 28-641, 29-644, 30-668 e MM-

marcador molecular.

Dice(Tol1.0%-1.0%)(H>0.0%S>0.0%) [0.0%-100.0%]

LS SP

100

66.7

53.8

66.7

62.5

53.3

38.9

31.5

44.4

42.1

24.1

62.5

33.3

27.9

66.7

36.8

61.5

48.1

41.2

29.2

25.4

22.5

37.5

19.1

20.7

587

590

597

609

632

634

631

637

610

627

608

633

581

596

605

636

576

575

668

629

593

611

592

628

600

644

625

577

603

641

20 SEMANAS

28 SEMANAS

36 SEMANAS

16 SEMANAS

24 SEMANAS

12 SEMANAS

24 SEMANAS

28 SEMANAS

16 SEMANAS

20 SEMANAS

36 SEMANAS

24 SEMANAS

16 SEMANAS

24 SEMANAS

CONTROLE

16 SEMANAS

20 SEMANAS

CONTROLE

16 SEMANAS

CONTROLE

TCIIb/e

TCIId

TCIIb/e

Figura 6: Fenograma mostrando a distância genética entre os isolados do Trypanosoma cruzi

em todas as regiões estudadas.

N° da paciente N° Hemocultura Idade Id gestacional Origem

Genótipo

5.5 Comparação da variabilidade genética do kDNA

entre os isolados da Bahia e Goiás

Houve diferença estatisticamente significativa entre os isolados obtidos das

pacientes provenientes da BA e GO em relação ao compartilhamento de bandas

(Mann-Whitney; p = 0,00029). Como demonstrado na Tabela 1 (Anexo II) e na Figura

Mediana

25%-75%

Min-Max

GO BA

Estado

% bandas compartilhadas

* significativo

Figura 7: Comparação da distribuição da naturalidade das mulheres infectadas pelo

Trypanosoma cruzi dos estados da Bahia e de Goiás.

A média de compartilhamento de bandas entre pacientes da Bahia foi de 20,99

± 12,96% com o compartilhamento máximo de 50,00% entre os pares 10 e 15 e 17 e

20, como demonstrado em destaque na Figura 8.

No fenograma representado pela Figura 8 observa-se claramente a formação

de quatro braços distintos entre os isolados do Estado da Bahia.

Dice (Tol 1.0%-1.0%) (H>0.0% S>0.0%) [0.0%-100.0%]

LSSP

100

42.9

30.4

24.1

37.5

25.3

18.1

44.4

25.6

44.4

29.4

22.2

15.8

629

668

611

628

627

600

644

625

605

597

609

587

577

608

633

641

CONTROLE

24 SEMANAS

16 SEMANAS

20 SEMANAS

24 SEMANAS

CONTROLE

16 SEMANAS

36 SEMANAS

28 SEMANAS

36 SEMANAS

20 SEMANAS

16 SEMANAS

28 SEMANAS

CONTROLE

TCIId

TCIIb/e

Figura 8: Fenograma mostrando a distância entre as populações de Trypanosoma cruzi

isolados pela técnica de hemocultura e analisada pela LSSP-PCR das pacientes do Estado da

Bahia.

A média de compartilhamento de bandas entre pacientes de Goiás foi de 27,94

± 13,31% com o compartilhamento máximo de 66,7% entre os pares 23 e 25 como

demonstrado em destaque na Figura 9.

Dice (Tol 1.0%-1.0%) (H>0.0% S>0.0%) [0.0%-100.0%]

LSSP

100

62.5

53.3

66.7

41.9

31.8

55.6

36.7

27.2

35.7

23.7

20.2

631

637

610

632

634

581

590

593

636

576

596

603

24 SEMANAS

12 SEMANAS

16 SEMANAS

28 SEMANAS

CONTROLE

24 SEMANAS

20 SEMANAS

16 SEMANAS

TCIIb/e

Figura 9: Fenograma mostrando a distância entre as populações de Trypanosoma cruzi

isoladas pela técnica de hemocultura, analisada pela LSSP-PCR das pacientes do Estado de

Goiás.

5.6 Comparação da variabilidade genética do kDNA dos

estoques de T. cruzi por faixa etária

Não houve diferença significativa entre porcentagens de bandas

compartilhadas em relação a faixa etária (Kruskal-Wallis; p = 0,3227). Como

demonstrado no Quadro 3 (Anexo II) e na Figura 10.

Mediana

25%-75%

Min-Max

19-24 anos 25-34 anos > 34 anos

Idade da paciente

% de bandas compartilhadas

Figura 10: Distribuição dos isolados de mulheres infectadas pelo Trypanosoma cruzi, na fase

crônica pela técnica de hemocultura, analisada pela LSSP-PCR de acordo com a faixa etária.

5.7 Comparação da variabilidade genética do kDNA dos

estoques de T. cruzi por idade gestacional

Não houve diferença significativa entre porcentagens de bandas

compartilhadas com relação às idades gestacionais (ANOVA; p = 0,191). Como

demonstrado na Quadro 4 (AnexoII) e na Figura 11.

Média

Min-Max

20 a 24 semanas

28 a 36 semanas

12 a 16 semanas

Controles

Idade gestacional

% de bandas compartilhadas

Figura 11: Distribuição dos isolados de mulheres infectadas pelo Trypanosoma cruzi, na fase

crônica, pela técnica de hemocultura, analisada pela LSSP-PCR de acordo com a idade

gestacional.

5.8 Comparação da variabilidade genética do kDNA dos

estoques de T. cruzi das gestantes e não gestantes

Não houve diferença significativa entre porcentagens de bandas

compartilhadas nos isolados das gestantes quando comparadas com o grupo de

mulheres não gestantes (Mann-Whitney, p = 0,257). Como demonstrado na Quadro 5

(Anexo II) e na Figura 12.

Mediana

25%-75%

Min-Max

Não gestantes

Gestantes

Mulheres

% de bandas compartilhadas

Figura 12: Distribuição dos isolados de mulheres infectadas pelo Trypanosoma cruzi, na fase

crônica pela técnica de hemocultura, analisada pela LSSP-PCR do grupo de gestantes e de

mulheres não gestantes.

5.9 Comparação da variabilidade genética do kDNA

entre os isolados obtidos em tubos diferentes por

hemocultura da mesma paciente

Nas Figuras 13, 15, 17 e 19 estão representados os géis com os perfis

geneticos obtido de diferentes tubos por hemocultura da mesma paciente, para a

verificação de bandas compartilhadas entre elas, enquanto que nas Figuras 14, 16, 18

e 20 estão os fenogramas correspondente as mesmas amostras.

Figura 13: Caracterização do kDNA dos isolados do T. cruzi pela LSSP-PCR: gel de poliacrilamida a 7,5%, corado com 0,2% de nitrato de prata. MM-

marcador molecular, canaleta-amostra correspondente: 01- 575a, 02-575b, 03-576, 04-577a, 05-577b, 06-581a, 07-581b, 08-581c, 09-581d, 10-581e, 11-

581f, 12-581g, 13-587a, 14-590a, 15-592a, 16-592b, 17-593a, 18-593b, 19-596, 20-597, 21-600a, 22-600b, 23-603a, 24-603b.

Canaleta 3, 13 e 14, 19 e 20, são amostras de pacientes que tiveram somente

um tubo positivo na hemocultura.

Nas canaletas 01 e 02 correspondente a amostra 575 (a e b) houve 90,91% de

bandas compartilhadas.

As 04 e 05 são correspondentes as amostras 577 (a e b) houve 50,00% de

compartilhamento de bandas e pode se observar pela análise no fenograma que elas

se localizam em braços opostos.

Das canaletas 06 a 12 correspondem a amostra 581 apresentando uma média

46,81 ± 23,19% de bandas compartilhadas com mínimo de 0% entre as amostras 581e

e 581b e máximo de 85,72% com as amostras 581f e 581g. Como observado na

Figura 14 as amostras 581a e 581b estão localizadas em braços diferentes da árvore

em relação com as amostras 581a, 581d, 581e, 581f e 581g.

As canaletas 15 e 16 correspodentes as 592 (a e b) apresentaram 76.93% de

bandas compartilhadas.

As canaletas 17 e 18 correspodentes as 593 (a e b) apresentaram 60,00% de

bandas compartilhadas.

As canaletas 21 e 22 correspodentes as 600 (a e b) apresentaram 100.00% de

bandas compartilhadas.

As canaletas 23 e 24 correspodentes as 603 (a e b) apresentaram 40.00% de

bandas compartilhadas.

As amostras descritas anteriormente estão apresentadas na Figura 14.

Dice (Tol 1.0%-1.0%) (H>0.0% S>0.0%) [0.0%-100.0%]

LSSP

100

90.9

51.7

36.5

21.1

64.2

85.7

56.7

66.7

33.6

66.7

52.2

42.9

76.9

33.2

22.4

14.3

100

54.5

25.5

12.8

8.7

575a

575b

577a

576

590a

581c

581d

581e

581f

581g

577b

597

593a

596

593b

581a

581b

592a

592b

600a

600b

603a

603b

587a

Figura 14: Fenograma mostrando a distância entre as populações de Trypanosoma cruzi das

amostras 575 a 603 isoladas de mulheres infectadas na fase crônica pela técnica de

hemocultura, analisada pela LSSP-PCR.

Nº da Hemocultura

Figura 15: Caracterização do kDNA dos isolados do T. cruzi pela LSSP-PCR: gel de poliacrilamida a 7,5%, corado com 0,2% de nitrato de prata. MM-

marcador molecular, canaleta-amostra correspondente: 01- 603a, 02-603b, 03-605a, 04-605b, 05-608a, 06-608b, 07-608c, 08-609a, 09-609b, 10-609c, 11-

609d, 12-609e, 13-610a, 14-610b, 15-611a, 16-611b, 17-611c, 18-611d, 19-611e, 20-625a, 21-625b, 22-625c, 23-625d, 24-625e, 25-627a, 26-627b, 27-

628a, 28-628b, 29-628c, 30-628d e MM- marcador molecular.

Nas canaletas 01 e 02 correspondente a amostra 603 (a e b) houve 54,55 % de

bandas compartilhadas.

Nas canaletas 03 e 04 correspondente a amostra 605 (a e b) houve 66,67% de

bandas compartilhadas.

Das canaletas 05 a 07 correspondente a amostra 608 (a, b e c) houve uma de

média 45,42 ± 16,49% de bandas compartilhadas com máxima de 61,54% entre as

amostras 608d e 608c e mínima de 28,57% entre as amostras 608a e 608b.

Das canaletas 08 a 12 correspondente a amostra 609 (a, b, c, d, e) houve uma

média 54,75 ± 16,40% de bandas compartilhadas com máxima de 80,01% entre as

amostras 609d e 609e e mínima de 22,23% entre as amostras 625b e 625c.

Nas canaletas 13 e 14 correspondente a amostra 610 (a e b) houve 40% de

bandas compartilhadas.

Das canaletas 15 a 19 correspondente a amostra 611 (a, b, c, d, e) houve uma

média 68,23 ± 20,23% de bandas compartilhadas com máxima de 100,00% entre as

amostras 611a e 611b e mínima de 44,45% entre as amostras 611a e 611e.

Das canaletas 20 a 24 correspondente a amostra 625 (a, b, c, d, e) houve uma

média 41,76 ± 27,48% de bandas compartilhadas com máxima de 83,33% entre as

amostras 625b e 625c e mínima de 15,39% entre as amostras 625a e 625e.

Nas canaletas 25 e 26 correspondente a amostra 627 (a e b) houve 54,55% de

bandas compartilhadas.

Das canaletas 27 a 30 correspondente a amostra 628 (a, b, c, d) houve uma

média 69,7 ± 11,05% de bandas compartilhadas com máxima de 83,33% entre as

amostras 628a e 628c e mínima de 50,00% entre as amostras 628c e 628b.

As amostras descritas anteriormente estão apresentadas na Figura 16.

Dice (Tol 1.0%-1.0%) (H>0.0% S>0.0%) [0.0%-100.0%]

LSSP

100

54.5

61.5

66.7

25.6

100

88.9

58.9

83.3

72.7

63.1

29.3

18.1

66.7

56.3

43.9

13.5

83.3

36.4

54.5

24.4

15.2

11.9

627a

627b

608b

608c

605a

605b

611a

611b

611d

611c

611e

628a

628c

628d

628b

609a

609b

609d

609e

609c

610a

625e

625d

625a

625c

625b

610b

603a

603b

608a

Figura 16: Fenograma mostrando a distância entre as populações de Trypanosoma cruzi das

amostras 603 a 628 isoladas de mulheres infectadas na fase crônica, pela técnica de

hemocultura, analisada pela LSSP-PCR.

Nº da Hemocultura

Figura 17: Caracterização do kDNA dos isolados do T. cruzi pela LSSP-PCR: gel de

poliacrilamida a 7,5% corado com 0,2% nitrato de prata. MM marcador molecular, canaleta-

amostra correspondente: 01-629a, 02-629b, 03-631a, 04-631b, 05-632a, 06-632b.

Nas canaletas 01 e 02 correspondente a amostra 629 (a e b) houve 100,00%

de bandas compartilhadas.

Nas canaletas 03 e 04 correspondente a amostra 631 (a e b) houve 83,33% de

bandas compartilhadas.

Nas canaletas 05 e 06 correspondente a amostra 632 (a e b) houve 93,33% de

bandas compartilhadas.

As amostras descritas anteriormente estão apresentadas na Figura 18.

Dice (Tol 1.0%-1.0%) (H>0.0% S>0.0%) [0.0%-100.0%]

LSSP

100

83.3

93.3

29.9

100

20.4

631a

631b

632a

632b

629a

629b

Figura 18: Fenograma mostrando a distância entre as populações de Trypanosoma. cruzi das

amostras 629 a 63 isoladas de mulheres infectadas na fase crônica pela técnica de

hemocultura, analisada pela LSSP-PCR.

Nº da Hemocultura

Figura 19: Caracterização do kDNA dos isolados do T. cruzi pela LSSP-PCR: gel de poliacrilamida a 7,5%, corado com 0,2% de nitrato de prata. MM

marcador molecular, canaleta-amostra correspondente: 01-633a, 02-633b, 03-633c, 04-633d, 05-633e, 06-633f, 07-634a, 08-634b, 09-636a, 10-636b, 11-

636c, 12-636d, 13-636e, 14-637a, 15-637b, 16-637c, 17-637d, 18-641a, 19-641b, 20-641c, 21-644a 22-644b, 23-644c 24-668 e MM marcador molecular.

Das canaletas 01 a 06 correspondente a amostra 633 (a, b, c, d, e) houve a

média 70,06 ± 20,31% de bandas compartilhadas com máxima de 100,00% entre as

amostras 633c e 633d; 633a e 633b; 633e e 633f e mínima de 36,37% entre as

amostras 633a e 633e.

Nas canaletas 07 e 08 correspondente a amostra 634 (a e b) houve 100,00%

de bandas compartilhadas.

Das canaletas 09 a 13 correspondente a amostra 636 (a, b, c, d, e) houve a

média 92,04 ± 4,53% de bandas compartilhadas com máxima de 100,00% entre as

amostras 636c e 636d e mínima de 85,72% entre as amostras 636a e 636e.

Das canaletas 14 a 17 correspondente a amostra 637 (a, b, c, d) houve a

média 84,42 ± 10,04% de bandas compartilhadas com máxima de 93,33% entre as

amostras 637a e 637c; 637c e 637d e mínima de 66,67% entre as amostras 637d e

637b.

Das canaletas 18 a 20 correspondente a amostra 641 (a, b e c) houve a média

90,79 ± 4,39% de bandas compartilhadas com máxima de 93,33% entre as amostras

641a e 641b e 641b e 641c e mínima de 85,72% entre as amostras 641a e 641c.

Das canaletas 21 a 23 correspondente a amostra 644 (a, b e c) houve a média

93,33 ± 11,54% de bandas compartilhadas com máxima de 100,00% entre as

amostras 644a e 644b e 644b e 644c e mínima de 80,01% entre as amostras 644a e

644c.

As amostras descritas anteriormente estão apresentadas na Figura 20.

Na estratificação das amostras com mais de um tubo analisado chegamos a

um total de 24 pacientes enquanto que as outras 06 amostras eram tubos individuais,

demostranto que 25% das amostras tiveram entre 40 e 50% de compartilhamento de

bandas, 37,5% tiveram entre 54 a 77% de compartilhamento de bandas e 37,5%

tiveram entre 83 a 100% de compartilhamento de bandas.

Dice (Tol 1.0%-1.0%) (H>0.0% S>0.0%) [0.0%-100.0%]

LSSP

100

94.7

93.2

87.9

47.1

100

68.2

100

59.8

32.1

93.3

89.5

22.8

93.3

89.5

78.1

100

48.1

100

33.9

16.9

636c

636d

636a

636b

636e

668

633c

633d

633a

633b

633e

633f

641a

641b

641c

637a

637c

637d

637b

634a

634b

644a

644b

644c

Figura 20: Fenograma mostrando a distância entre as populações de Trypanosoma cruzi das

amostras 633 a 668 isoladas de mulheres infectadas na fase crônica pela técnica de

hemocultura, analisada pela LSSP-PCR.

Nº da Hemocultura

6- DISCUSSÃO

T. cruzi possui uma estrutura heterogênea representada por populações que

circulam entre os homens, vetores, reservatórios silvestres e animais domésticos

(Brener 1977). Tais diferenças são detectadas por suas diferenças biológicas e

genéticas. A caracterização genética tem fornecido importantes dados sobre a

epidemiologia e patogenia deste protozoário.

Linhagens de Trypanosoma cruzi têm sido identificadas a partir de isolados

utilizando análises bioquímicas e moleculares (Souto et al. 1996; Fernandes et al.

1998; Brisse et al. 2000; Brisse et al. 2001 e Diosque et al. 2003.

Esse trabalho compara pela primeira vez o perfil genético de dois grupos,

gestantes e não gestantes informações não encontradas na literatura.

Em nosso estudo, TCII correspondente ao ciclo doméstico foi encontrado em

todos isolados onde em sua maioria encontramos TCIIb/e (96,66%) e em apenas um

isolado foi identificado TCIId (3,33%). O predomínio dos subgrupos TCIIb/e e TCIId

está de acordo com a literatura, visto que estes são predominantes em humanos e

vetores domésticos (T. infestans) nos países do cone sul da América do Sul (De Luca

D’oro et al. 1993; Barnabé et al. 2001; Di Noia et al. 2002; Freitas et al. 2005; Virreira

et al. 2006). Os dados encontrados relacionados ao TCII (100%) estão de acordo com

a literatura que mostram o predomínio do TCII (Freitas et al. 2005; Lages-Silva et al.

2006) e do subgrupo TCIIb/e (Higo et al. 2004). Lages-Silva et al. 2006 observou que o

T. cruzi II foi detectado em todos os pacientes incluindo aqueles sem alterações

clínicas e também foram encontradas associações com diferentes sintomas e vários

processos patológicos em todas as formas clínicas da doença, embora o T. cruzi I

esteja presente no ciclo de transmissão silvestre na região do Triângulo Mineiro.

Vieira et al. 2006 mostraram em seus resultados que os subgrupos do T. cruzi

TCIIb TCIId e TCIIe assim como as diferentes variantes do subgrupo TCIId podem

induzir infecção congênita. As freqüências das linhagens TCIId são similares em

neonatos e adultos que vivem na mesma localidade geográfica. Os recém-nascidos

infectados pelo TCIId mostraram-se assintomáticos, ou formas clínicas fatais e

severas da doença de Chagas congênita tanto com baixa ou alta parasitemia. Seus

resultados mostraram que independentemente da sua freqüência de distribuição três

subgrupos diferentes de T. cruzi TCIIb TCIId e TCIIe podem ser transmitidos de mães

envolvidas na infecção congênita.

A presença de apenas um isolado caracterizado como TCIId, de uma paciente

do grupo controle da Bahia, correspondente a amostra 629 o qual também circula em

elevada freqüência entre a população humana no ciclo doméstico de transmissão da

doença de Chagas em regiões da Argentina e da Bolívia (Virreira et al. 2006; Burgos

et al. 2007).

Não foi detectado TCIIa e o TCIIc em nenhum dos isolados estudados

neste trabalho, o que já era esperado, pois este genótipo é típico da região

norte. Dados referentes à distribuição desses genótipos entre pacientes com

doença de Chagas são raros, o TCIIa é predominante em áreas endêmicas ao

norte da Bacia Amazônica e nos EUA, e o TCIIc, na Bacia Amazônica e nos

países do cone Sul, principalmente no meio silvestre (dados não publicados,

apud Yeo et al. 2005), havendo relatos de sua presença na Guatemala e Peru

(Higo et al. 2004).

A LSSP-PCR tem mostrado que a variabilidade genética do kDNA do T.

cruzi é um dos fatores mais determinantes na patogênese da doença de

Chagas (Andrade et al. 1999; Vago et al. 2000). A técnica de LSSP-PCR é

capaz de detectar simples ou múltiplas variações nos fragmentos do DNA alvo

e tem sido utilizada nos estudos das doenças genéticas (Pena et al. 1994), e

caracterização genética de diversos microorganismos (Villa et al. 1995; Gomes

et al. 1997; Oliveira et al. 2003).

A variabilidade genética do kDNA dos isolados demonstrada pela LSSP-PCR

permitiu observar 24,08 ± 14,4% de compartilhamento de bandas entre os pares de

isolados das pacientes gestantes e não gestantes de quatro regiões distintas do Brasil

onde cada paciente apresentava um perfil único e exclusivo de assinatura gênica,

corroborando os dados aqui encontrados com os de Pena et al. 1994; Barreto et al.

1996; onde em seus trabalhos descreveram que a variabilidade genética apresentada

nos perfis de LSSP-PCR apresentou assinaturas gênicas altamente variáveis para

indivíduos analisados, onde apresenta perfis distintos entre pacientes sem algum

parentesco.

A caracterização da região variável do kDNA das populações do T. cruzi

isoladas de pacientes de diferentes regiões da Bahia e Goiás pela LSSP-PCR,

realizada no presente trabalho, demonstrou uma ampla heterogeneidade do

parasito evidenciada pela baixa proporção de compartilhamento de bandas,

(Bahia 21,00 ± 12,96% e Goiás de 27,94 ± 13,31%) diferente dos dados

encontrados na literatura. Vago et al. 2000 observou similaridades entre

diferentes pacientes na mesma região geográfica analisando o perfil do kDNA

do T. cruzi pela técnica LSSP-PCR. Este comportamento também foi

observado por Lages-Silva et al. 2006 no Triângulo Mineiro que examinou

pacientes com sintomas clínicos típicos da doença de Chagas (88,6%) com alta

freqüência de formas mistas (44,3%) e poucos casos na forma intermediária,

isso ocorreu provavelmente porque esses pacientes foram selecionados em

uma unidade hospitalar. Isso sugere que as cepas de T. cruzi dentro de uma

mesma região geográfica podem ser relacionadas geneticamente, os quais têm

uma importante função no desenvolvimento nas formas clinicas da doença.

Segundo Salazar et al. 2006 os padrões eletroforéticos obtidos de LSSP-PCR

mostraram heterogeneidade nos padrões de cepas de T. cruzi analisadas.

Estudos experimentais têm mostrado que infecções mistas por T. cruzi

podem ter um grande impacto sobre as propriedades biológicas do parasito no

hospedeiro, enfatizando a importância de considerar a possível ocorrência de

infecções mistas naturais em humanos e suas conseqüências sobre os

aspectos biológicos da doença de Chagas (Martins et al. 2006).

O intenso polimorfismo do kDNA pode resultar de: diferentes seqüências de

minicirculos em cada parasito caracterizado, os altos índices de mutações em suas

regiões hipervariáveis (Tarleton 2001), mudanças reversíveis na seqüência do kDNA

do minicirculo (Alves 1994) ou uma baixa seqüência identificada entre eles. Entretanto

Lages-Silva et al. 2006 não puderam excluir a possibilidade da hipervariabilidade da

assinatura gênica do kDNA ser resultante de anos de interação da relação parasito-

hospedeiro e do sistema imune. Esses fatores podem explicar a dificuldade em

estabelecer perfis genéticos associados com manifestações clínicas específicas da

doença de Chagas.

7- CONCLUSÕES

1- Todas as amostras pertencem ao grupo TCII, sendo (96,66%)

correspondendo ao TCIIb/e e (3,33%) ao TCIId.

2- Houve diferenças estatísticas entre as pacientes dos estados da Bahia e de

Goiás.

3- Não houve diferença entre as porcentagens de bandas compartilhadas

entre as faixas etárias das pacientes.

4- Não houve diferença entre as porcentagens de bandas compartilhadas

entre as idades gestacionais.

5- Não houve diferença entre as porcentagens de bandas compartilhadas nos

isolados das gestantes e das não gestantes.

6- Não houve seleção de populações entre os isolados do mesmo paciente.

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N°

Número

Hemocultura

Nome da

paciente

Idade

gestacional

g.controle

Regiã

Naturalidade

1 575 JRS 29 4° mês PB Catolé do

Rocha

2 576 LGS 22 6° mês GO Nova Roma

3 577 LFO 23 4° mês BA Carinhanha

4 581 DDA 36 4° mês GO Coribe

5 587 EAP 21 5° mês BA Santa Mª da

Vitória

6 590 LZFA 25 7° mês GO Morrinhos

7 592 VSBC 32 DF Brasília

8 593 AGC 36 G. controle GO Passos

9 596 MMSS 29 5° mês GO Sítio d’

Abadia

10 597 MCS 31 7° mês BA Cotegipe

11 600 AAO 32 G.controle BA

12 603 SNR 44 4° mês GO Nova

América

13 605 EAS 29 9° mês BA Correntina

14 608 IOA 24 BA Cotegipe

15 609 GRS 29 9°mês BA Coribe

16 610 ASM 31 3°mês GO Buritinópolis

17 611 CPL 24 4°mês BA Angical

18 625 AMM 23 4° mês BA Wanderley

19 627 MROS 27 6° mês BA Santa Rita de

Cássia

20 628 SOS 24 5° mês BA Ribeirão das

Neves

21 629 END 37 G. controle BA Correntina

22 631 DFG 38 6° mês GO Formosa

23 632 NARM 21 4° mês GO Pilar

24 633 EORS 34 7° mês BA Ribeirão das

Neves

25 634 MFBBR 37 4° mês GO Itauçu

26 636 UMR 32 6° mês GO Anápolis

27 637 JTB 19 6° mês GO Formosa

28 641 ICM 28 G.controle BA Santa Mª da

9-Anexo I- Informações sobre as pacientes

10-Anexos II- Tabela e gráficos

Tabela 1: Distribuição das pacientes estudadas nos estados da Bahia e de Goiás.

Estado

N° de

pares

Média DP Mediana Mínimo Máximo

1° Quartil 3° Quartil

GO 77 28.64% 13.94 26.67 0.00 66.67 20.00 37.50

BA 106 20.99 12.96 18.34 0.00 50.00 12.50 28.57

Quadro 3: Distribuição das pacientes estudadas de acordo com a faixa etária.

Idade

N° de

pares

Média DP Median

Mínim

Máximo 1°

Quartil

3°

Quartil

19-24

anos

45 26.31 14.01 25.00 0.00 58.83 14.29 35.30

25-34

anos

66 24.08 14.61 22.88 0.00 63.16 12.50 33.33

> 34

anos

28 20.50 12.56 16.67 0.00 47.06 13.33 29.67

Quadro 4: Distribuição das pacientes estudadas de acordo com a idade gestacional.

Idade

Gestacional

N° de

pares

Média DP Mediana Mínimo Máximo 1°

Quartil

3°

Quartil

12 a 16

semanas

36 25.40 15.33 26.67 0.00 66.67 13.81 34.06

20 a 24

semanas

36 26.41 12.75 25.00 0.00 62.50 20.72 33.33

28 a 36

semanas

10 34.10 16.57 30.15 10.00 63.16 23.53 50.00

Controles 10 20.56 11.29 20.10 0.00 37.50 14.29 30.77

Quadro 5: Distribuição das pacientes estudadas de acordo com a análise do grupo de gestantes

e de mulheres não gestantes.

Nº de

pares

Média DP Mediana Mínimo Máximo 1º

Quartil

3º

Quartil

Não gestantes 10 20.56 11.29 20.10 0.00 37.50 14.29 30.77

Gestantes 300 26.48 14.47 25.00 0.00 66.67 14.29 36.94

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