( PDF ) Avaliação da atividade antimicrobiana de plantas utilizadas na medicina popular da Amazônia

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ

INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

CHRISTIAN MIRANDA RIBEIRO

AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DE PLANTAS UTILIZADAS

NA MEDICINA POPULAR DA AMAZÔNIA

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Ciências Farmacêuticas do

Instituto de Ciências da Saúde da Universidade

Federal do Pará como requisito para obtenção do

título de Mestre em Ciências Farmacêuticas.

Área de Concentração: Fármacos e Medicamentos

Orientador: Prof. Dr. José Maria dos Santos Vieira

Co-orientador: Prof. Dr. Davi de Jesus Oliveira

Belém

2008

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FICHA CATALOGRÁFICA

Instituto de Ciências da Saúde da Universidade Federal do Pará

Ribeiro, Christian Miranda.

Avaliação da atividade antimicrobiana de plantas medicinais da Amazônia/ Christian

Miranda Ribeiro - Belém, 2008. 70p.

Dissertação (Mestrado) – Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas. Instituto

de Ciências da Saúde. Universidade Federal do Pará.

Área de concentração: Fármacos e Medicamentos.

Linha de Pesquisa: Avaliação Biológica de Produtos Naturais e Sintéticos.

Orientador: Vieira, José Maria dos Santos.

Versão do título para o inglês: Antimicrobial avaliation of medicinal plants of Amazonia.

Descritores: 1. Plantas medicinais. 2. Atividade antimicrobiana. 3. Extratos vegetais. 4.

Antimicrobianos. 5. Uncaria guianensis. 6. Medicina popular.

UFPA/ICS/PPGCF/2008

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Autor: Christian Miranda Ribeiro

Título: Avaliação da atividade antimicrobiana de plantas utilizadas na medicina

popular da Amazônia.

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências

Farmacêuticas do Instituto de Ciências da Saúde da Universidade Federal do

Pará como requisito para obtenção do título de Mestre em Ciências

Farmacêutica.

Área de Concentração: Fármacos e Medicamentos

APROVADA EM : ........./.............../..................

Banca Examinadora:

Profa. Dra. KARLA TEREZA SILVA RIBEIRO – ICB/UFPA

Prof. Dr. JOSÉ OTÁVIO CARRÉRA SILVA JUNIOR – ICS/UFPA

Prof. Dr. JOSÉ MARIA DOS SANTOS VIEIRA – ICS/UFPA

Belém

2008

DEDICATÓRIA

Este trabalho dedico:

Aos meus pais Sydney Itauran Ribeiro e Maria Raimunda Miranda Ribeiro.

Com vocês aprendi que todo sonho é possível. Pelo apoio, incentivo e amor

integral, meu muito obrigado!

AGRADECIMENTOS

À Deus pela saúde

Ao orientador, Prof. Dr.José Maria dos Santos Vieira, pela orientação e

pela amizade construída durante esta caminhada.

Ao Prof. Dr. Davi de Jesus Oliveira pela competente co-orientação.

Ao Prof. Dr. Wagner Luiz Ramos Barbosa por conceder o espaço físico e

estrutura para obtenção dos extratos e análises fitoquímicas

A farmacêutica e amiga Lúcia Karla Vasconcelos pela paciência e

carinho.

A farmacêutica Kaira Souza pela ajuda e amizade.

Aos professores da Faculdade de Farmácia da UFPA por suas

contribuições para a melhoria deste trabalho.

Aos meus pais, Sydney Itauran Ribeiro e Maria Raimunda Miranda

Ribeiro e irmãos Sydney Junior e Rafaela Ribeiro, cujo amor e incentivo

ajudaram na realização deste trabalho.

Ao meu amigo Alan Barroso Araújo por me guiar e escolher os caminhos

certos.

Aos meus amigos, Anderson Bentes, Luciana Pinto, Tânia Mara,

Daniella Paternostro, Solange Regina, Mariana Muller e Mauro por me

ajudarem nesse trabalho através do apoio e respeito que mantiveram por mim.

Aos amigos do mestrado que participaram do processo de

desenvolvimento desse trabalho.

A Universidade Federal do Pará pela oportunidade concedida.

A Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior –

CAPES – pela bolsa concedida.

E, a todos aqueles que contribuíram de modo direto ou indireto, na

realização desta dissertação.

“Uma coletânea de pensamentos deve ser uma farmácia

onde se encontrem remédios para todos os males”

Voltaire

RESUMO

O estudo de plantas medicinais possibilita a descoberta de novos compostos

bioativos na procura de drogas promissoras. O aumento de infecções e o

aparecimento da resistência microbiana reforçam essa pesquisa. O objetivo do

trabalho foi avaliar a atividade antimicrobiana de extratos de seis espécies de

plantas medicinais que ocorrem na Amazônia: Psidium guajava (goiabeira),

Bryophyllum calycinum Salisb (pirarucu), Eleutherine plicata Herb

(marupazinho), Uncaria guianensis (unha-de-gato), Arrabideae chica (pariri) e

Mansoa alliacea (Lam.) A.H. Gentry (cipó d'alho) frente a cepas ATCC de

bactérias e fungos. A coleta e a identificação das plantas foram realizadas na

EMBRAPA/CPATU e a análise fitoquímica no Laboratório de Fitoquímica da

FACFAR/UFPA e CESUPA obedecendo às metodologias estabelecidas nestes

laboratórios. Os extratos etanólicos seco das folhas frescas das plantas e bulbo

do marupazinho foram submetidos à avaliação da atividade antimicrobiana pelo

método de disco difusão em ágar e determinação da Concentração Inibitória

Mínima (CIM) através do método de microdiluição em placas e disco difusão

em ágar. Os extratos foram utilizados em concentrações de 500, 250, 125, 62,5

e 31,25 mg/mL utilizando como solvente o Dimetil-Sulfóxido (DMSO). O extrato

de goiabeira teve atividade frente a S. aureus, P. aeruginosa e C. albicans (CIM

125mg\mL), o de pirarucu frente a S. aureus (CIM= 500 mg/mL) e P.

aeruginosa (CIM= 250 mg/mL), o de marupazinho para S. aureus (CIM=

500mg/mL) e C. albicans (CIM= 250mg/mL), o de unha-de-gato contra S.

aureus (CIM= 62,5 mg/mL) e o de pariri inibiu S. aureus (62,5 mg/mL), E. coli

(250 mg/mL) e C. albicans (500 mg/mL). O fracionamento do EEB de U.

guianensis através da técnica de dissolução fracionada demonstrou que a

fração metanólica teve ação antimicrobiana. Os resultados comprovaram que

estas plantas possuem atividade antimicrobiana. Estes extratos abrem uma

possibilidade de descobertas de novos compostos antimicrobianos

clinicamente efetivos.

ABSTRACT

The study of medicinal plants it makes possible the discovery of new bioactive

components in the search for promising drugs. The increase of infections and

the appearance of the microbial resistance strengthen this research. The

Objective of this study it was evaluate the antimicrobial activity of the extracts of

six medicinal plants of the Amazonia: Psidium guajava (guava), Bryophyllum

calycinum Salisb (pirarucu), Eleutherine plicata Herb (marupazinho), Uncaria

guianensis (Cat´s claw), Arrabideae chica (pariri) e Mansoa alliacea (Lam.) A.H.

Gentry (cipó d'alho) against ATCC strains of fungi and bacteria.The collection

and the identification of the plant were performed in EMBRAPA/CPATU and the

phytochemical analysis in the Laboratory of FACFAR/UFPA and CESUPA in

agreement with the methodologies established in these laboratories. The crude

ethanolic extract of leaves and the underground parts of marupazinho were

submitted to the antimicrobial activity evaluation though the ágar disc diffusion

method and determination of minimum inhibitory concentration (MIC) though

microdilution in plate and ágar disc diffusion methods. The extracts were

used in concentrations of 500, 250, 125, 62,5 and 31,25 mg/mL using as

solvent

Dimethyl Sulfoxide (

DMSO). The Guava extract was effective

against S. aureus, P. aeruginosa and C. albicans (MIC 125mg\mL),

pirarucu was effective against S aureus (MIC= 500 mg/mL) and P.

aeruginosa (MIC= 250 mg/mL), marupazinho against S.aureus (MIC=

500mg/mL) and C. albicans (MIC= 250mg/mL),

Cat´s claw against S.

aureus (MIC= 62,5mg/mL) and pariri was effective against S. aureus (MIC=

62,5 mg/mL), E. coli (MIC=250 mg/mL) and C. albicans (MIC 500 mg/mL). The

fractions of U. guianensis extracts was obtained though fractioned dissolution

methods and show that only the methanolic fraction presented antimicrobial

activity. The results show that Amazonia medicinal plants presents antimicrobial

activity and. This promissory extracts open the possibility of finding new

clinically effective antimicrobial compounds

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO........................................................................................... 12

2. REVISÃO DA LITERATURA..................................................................... 14

2.1. Psidium guajava......................................................................................

2.2. Bryophyllum calycinum............................................................................

2.3. Eleutherine plicata...................................................................................

2.4. Uncaria guianensis..................................................................................

2.5. Arrabidaea chica.....................................................................................

2.6. Mansoa alliacea......................................................................................

3. OBJETIVOS............................................................................................... 23

3.1. Geral........................................................................................................ 23

3.2. Específicos.............................................................................................. 23

4. MATERIAL E MÉTODOS......................................................................... 24

4.1. Coleta e Identificação do Material Vegetal.............................................. 24

4.2. Obtenção do extrato etanólico bruto (EEB)............................................. 30

4.3. Abordagem fitoquímica........................................................................... 30

4.3.1 Utilizando como solvente água destilada..............................................

4.3.2 Utilizando como solvente metanol.........................................................

4.3.3 Utilizando Clorofórmio como solvente...................................................

4.3.4 Utilizando éter etílico.............................................................................

4.3.5 Antraquinonas.......................................................................................

4.3.6 Alcalóides..............................................................................................

4.3.7 Purinas..................................................................................................

4.4. Microrganismos..................................................................................... 35

4.5. Avaliação Preliminar da Atividade Antimicrobiana.................................. 36

4.6. Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM)........................ 36

4.7 Critérios para aceitação da atividade antimicrobiana de extratos brutos

de plantas.......................................................................................................

4.8 Fracionamento do Extrato Etanólico Bruto de Uncaria guianensis..........

4.8.1 Dissolução Fracionada..........................................................................

4.8.2 Avaliação da atividade antimicrobiana das frações de Uncaria

guianensis.......................................................................................................

4.8.3 Perfil comparativo entre a atividade antimicrobiana do extrato bruto

de Uncaria guianensis e a fração metanólica.................................................

4.9 Fluxograma da metodologia.....................................................................

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO................................................................. 40

5.1. Abordagem Fitoquímica dos Extratos Etanólicos Brutos........................ 40

5.2. Atividade antimicrobiana dos EEBs das plantas..................................... 43

5.3. Atividade antimicrobiana das frações de Uncaria guianensis.................

5.4 Perfil comparativo entre o extrato bruto de Uncaria guianensis e fração

metanólica.......................................................................................................

6. CONCLUSÃO.............................................................................................

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.......................................................... 55

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Critérios para aceitação da atividade antimicrobiana de

extratos brutos de plantas

....................................................................

Tabela 2 - Abordagem Fitoquímica dos extratos etanólicos brutos de

Psidium guajava (goiabeira), Bryophyllum calycinum (pirarucu),

Eleutherine plicata (marupazinho), Uncaria guianensis (unha-de-gato),

Arrabidaea chica (pariri) e Mansoa alliacea (cipó d’alho)..............................

Tabela 3 - Avaliação preliminar da atividade antimicrobiana dos extratos

etanólicos brutos (concentração de 500 mg/mL) de Psidium guajava

(goiabeira), Bryophyllum calycinum (pirarucu), Eleutherine plicata

(marupazinho), Uncaria guianensis (unha-de-gato), Arrabidaea chica

(pariri) e Mansoa alliacea (cipó d’alho)..........................................................

Tabela 4 - Concentração Inibitória Mínima (CIM) dos extratos etanólicos

brutos de Psidium guajava (goiabeira), Bryophyllum calycinum (pirarucu),

Eleutherine plicata (marupazinho), Uncaria guianensis (unha-de-gato) e

Arrabidaea chica (pariri) pelos métodos de disco difusão em ágar e de

microdiluição em placas.............................................................................

Tabela 5 - Avaliação da atividade antimicrobiana das frações de Uncaria

guianensis (unha-de-gato).............................................................................

Tabela 6 – Atividade antimicrobiana do EEB de Uncaria guaianensis

(unha-de-gato) por disco difusão em ágar.....................................................

Tabela 7 – Atividade antimicrobiana da fração metanólica de Uncaria

guianensis (unha-de-gato) por disco difusão em ágar...................................

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 – Folhas de Psidium guajava L. (Goiabeira). Exsicata doada pelo

Laboratório de Botânica da EMBRAPA-Amazônia Oriental (Determinador:

Miguel Pastana do Nascimento)....................................................................

Figura 2 – Folhas de Bryophyllum calycinum Salisb (Pirarucu). Exsicata

doada pelo Laboratório de Botânica da EMBRAPA-Amazônia Oriental

(Determinador: Miguel Pastana do Nascimento)...........................................

Figura 3 – Folhas de Eleutherine plicata Herb. (Marupazinho). Exsicata

preparada no Laboratório de Fitoquímica e identificada no Departamento

de Botânica do Museu Paraense Emílio Goeldi pelo Dr. Mário Augusto

Gonçalves Jardim do Departamento de Botânica (registro MG123511)........

Figura 4 – Folhas de Uncaria guianensis (Aubl.) Gmelin (unha-de-gato).

Exsicata preparada no Laboratório de Botânica da EMBRAPA-Amazônia

Oriental (Determinador: Miguel Pastana do Nascimento)..............................

Figura 5 – Folhas de Arrabidaea chica (HKB) Verlot. (pariri). Exsicata

preparada no Laboratório de Botânica da EMBRAPA-Amazônia Oriental

(Determinador: Miguel Pastana do Nascimento)...........................................

Figura 6 – Folhas de Mansoa alliacea (Lam.) A.H. Gentry (Cipó d’alho).

Exsicata doada pelo Laboratório de Botânica da EMBRAPA-Amazônia

Oriental (Determinador: Miguel Pastana do Nascimento)..............................

Figura 7 – Atividade antimicrobiana da fração metanólica de Uncaria

guianensis com ação na concentração de 100 mg (halo de 8

mm)................

Figura 8 – Atividade antimicrobiana do EEB de Uncaria guianensis por

disco difusão em ágar....................................................................................

Figura 9 – Atividade antimicrobiana da ração metanólica de Uncaria

guianensis por disco difusão em ágar............................................................

Figura 10 – Atividade antimicrobiana da fração metanólica e do EEB de

Uncaria guianensis (unha-de-gato) por disco difusão em ágar.................

1. INTRODUÇÃO

As substâncias antimicrobianas representam um dos principais avanços

da farmacoterapia nas últimas décadas com progressos sem limites dentro da

terapêutica medicamentosa. O referido grupo de medicamentos condiciona, de

forma efetiva, o efeito de espécies microbianas patogênicas e oportunistas

responsáveis pelas mais variadas patologias que tanto provocaram a

incapacidade prolongada ou óbito de seres humanos, sem restrição de faixa

etária, situação financeira ou estado de saúde do indivíduo atingido (ROBERT

et al., 1997; TAVARES, 1984).

Atualmente, os termos antibiótico e antimicrobiano são considerados

como sinonímia, designando assim toda substância oriunda de seres vivos,

microrganismos ou vegetais, como também aquelas sintetizadas em laboratório

com a capacidade de em pequenas concentrações apresentarem atividade

letal ou inibitória contra espécies microbianas e prevenir o desenvolvimento de

microrganismos resistentes (AMATO NETO et al., 1994; ROBERTS et al.,

1997).

Por um longo período de tempo, plantas têm sido uma das fontes de

produtos naturais para a manutenção da saúde humana. As mais diversas

enfermidades têm sido tratadas com chás (infuso, decocto, macerados), sucos,

tinturas, banhos, cataplasmas e ungüentos, preparados a partir de parte das

plantas. A referida conduta terapêutica remonta, principalmente, aos antigos

povos da China, Egito, Ásia e Roma, em que os eruditos, com base em seus

conhecimentos, classificaram numerosas espécies vegetais, com a respectiva

indicação do uso medicinal. Posteriormente, os gregos instituíram o emprego

“racional” das plantas na prática médica, sendo seguido pelos clínicos da

Europa Ocidental (FERNANDEZ et al., 1982; ROBERTS et al., 1997).

As observações populares sobre o uso e a eficácia de plantas

medicinais contribuem, de forma relevante, para a divulgação das virtudes

terapêuticas dos vegetais, prescritos com freqüência, pelos efeitos medicinais

que produzem, apesar de não terem seus constituintes químicos conhecidos,

mas tornando válidas informações terapêuticas que foram sendo acumuladas

durante séculos (MACIEL et al., 2002). Porém, desde o advento dos

antibióticos, o uso de derivados de plantas como antimicrobianos tem sido

virtualmente inexistente (COWAN, 1999).

Embora as indústrias químicas e farmacêuticas tenham produzido uma

imensa variedade de diferentes antibióticos nos últimos tempos, cada vez mais

tem sido observado o aumento de microrganismos resistentes aos

antimicrobianos disponíveis no mercado, incentivando a busca de novas fontes

de substâncias com atividades antimicrobianas. Além disso, a alta incidência

de infecções, principalmente em indivíduos imunocomprometidos, aumenta a

importância da procura e da descoberta de compostos terapêuticos

alternativos. De acordo com a Organização Mundial de Saúde (OMS), plantas

medicinais deveria ser a melhor fonte para obter-se uma variedade de drogas

(PRASHAR et al., 2003).

Sendo assim, pesquisas voltadas para o estudo e a avaliação de

produtos naturais como terapêuticos e principalmente com atividade

antimicrobiana devem ser estimulados no intuito de criar novas drogas. Dentro

desse contexto, os estudos com plantas utilizadas na medicina popular

representam prioridade na Amazônia, pela variedade e riqueza de sua flora.

No Brasil encontram-se cerca de 20% das 250 mil espécies medicinais

catalogadas pela Organização das Nações Unidas (ONU), facilitando o

aproveitamento do potencial curativo dos vegetais para o tratamento de

doenças (DRUMOND et al., 2004). Na Amazônia existe grande diversidade

vegetal, onde se encontram muitas plantas com propriedades medicinais e, que

durante milênios são utilizadas pelas comunidades nativas.

O projeto “PADRONIZAÇÃO DE PREPARAÇÕES TRADICIONAIS À

BASE DE PLANTAS MEDICINAIS PARA O DESENVOLVIMENTO DE

FITOTERÁPICOS” realizado pelo Setor de Insumos Farmacêuticos –

(SINFARM) – do Programa Pobreza e Meio Ambiente – (POEMA) – do Núcleo

de Meio Ambiente – (NUMA) – da Universidade Federal do Para – (UFPA)

caracterizou algumas espécies vegetais de uso medicinal tradicional visando o

aproveitamento em fitoterápicos. A triagem das plantas através de questionário

etnofarmacêutico, selecionou espécies vegetais utilizadas para doenças que

possam ter como agentes bactérias ou fungos (BARBOSA & PINTO, 2001).

A partir desta seleção foi avaliada, no presente trabalho, a atividade

antimicrobiana de seis espécies utilizadas na medicina popular da Amazônia,:

Psidium guajava L. (goiabeira), Bryophyllum calycinum Salisb (pirarucu),

Eleutherine plicata Herb (marupazinho), Uncaria guianensis (Aubl.) Gmelin

(Unha de gato), Arrabidaea chica (HKB) Verlot (pariri) e Mansoa alliacea (Lam.)

A.H. Gentry (cipó d’alho).

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1. Psidium guajava

A família Myrtaceae inclui cerca de 130 gêneros e aproximadamente

4.620 espécies arbustivas e arbóreas, bem representada em regiões tropicais e

subtropicais, com centros de dispersão na Austrália, oeste da Índia e América

(MABBERLEY, 1997; JUDD et al., 1999). É considerada nativa da América

tropical, em especial do Brasil e das Antilhas. Essa família inclui gêneros como

Myrtus, Psidium, Pimenta, Eugenia, Pseudocaryophyllus, Syzygium,

Eucalyptus, Leptospermum e Melaleuca, sendo representada por várias

espécies medicinais, dentre elas, a espécie Psidium guajava L, denominada

comumente de goiabeira, guava em inglês e guayabo em espanhol. É

conhecida na região Amazônica como Goiaba, no entanto, existem registros

para a espécie como Goiabeira, Araçá-goiaba, Araçá-guaiaba, Araçá-guaçu,

Guaiaba, Guaiava, Araçá-vaçu no Rio grande do Sul, e Goiabeira Branca em

Minas Gerais (LOZOYA et al., 2002).

Apresenta excelentes condições para exploração em escala comercial,

em função de seus frutos atingirem bons preços no mercado e serem muito

apreciados pelas suas características, tanto para o consumo de mesa como

para a fabricação de produtos industrializados (MANICA et al., 2000;

CAÑIZARES et al., 2003). Dentre as frutas tropicais brasileiras, a goiaba ocupa

lugar de destaque, não só pelo seu aroma e sabor, como também pelo seu

valor nutricional, é frequentemente cultivada em razão dos frutos comestíveis

em pomares domésticos ou plantações comerciais para a indústria alimentícia

(LORENZI, 1992) colocando o Brasil na posição de maior produtor mundial de

goiabas vermelhas (IEA, 2007).

É um arbusto ou árvore de pequeno porte, galhada, com caule tortuoso

e casca lisa, frutífera de copa aberta, de aproximadamente 8,0 m de altura,

apresentando folhas opostas, curto-pecioladas, ovadolanceoladas, glabras ou

ligeiramente pubescentes na face superior, aromáticas e de textura coriácea,

de 8-12cm de comprimento por 3-6cm de largura (LORENZI, 1992); botões

florais tomentossos ou glabros, com cálice membranoso; flores hermafroditas,

diclamídeas, actinomorfas, brancas e com numerosos estames. Apresentam

flores alvas, solitárias ou em grupos de 2-3 nas axilas das folhas, fruto com

baga amarela, de polpa abundante apresentando duas variedades mais

comuns, as de frutos com polpa vermelha (P. guajava var. pomifera) e a de

polpa branca (P. guajava var. pyrifera) (LORENZI, 1992; ROBINEAU, 1995).

Na região Amazônica, as folhas de P. guajava são empregadas

popularmente no tratamento caseiro de desordens gastrintestinais, prática

herdada originalmente da medicina asteca no México (LOZOYA et al., 2002).

Infusos ou decoctos preparados com folhas frescas ou desidratadas são

indicados para diarréia, disenteria, flatulência e cólica abdominal. É muito

utilizado o chá em bochechos e gargarejo no tratamento de inflamações da

boca e da garganta ou em lavagens locais de úlceras e na leucorréia

(CARRICONDE, 2000; MATOS, 2002). Adicionalmente, comprovaram-se as

atividades antimicrobiana, antitussígena (JAIARJ et al., 1999), sedativa

(LUTTERODT & MALEQUE, 1988), antioxidante (MARTIN et al., 1998; WANG,

2000; NADERI et al., 2003; ANJANEYULU & CHOPRA, 2004; WOODMAN &

CHAN, 2004) e antiproliferativa para células cancerígenas (MANOSROI et.,

2005).

Para fins medicinais, a planta deve ser podada e regada freqüentemente

para estimular a produção de gomos foliares terminais (MATOS, 2002).

2.2. Bryophyllum calycinum

Bryophyllum calycinum Salisb (B. pinnatum, Kalanchoe pinnata) é uma

planta silvestre pertencente à família Crassulaceae e ao gênero Bryophyllum,

possuindo várias sinonímias como: Pirarucu (nome mais conhecido

popularmente no estado do Pará), coirama, erva-da-costa, folha-da-costa,

folha-grossa, orelha-de-monge, paratudo ou folha da fortuna roxo, saião, São

Raimundo (BALBACH, 1995). Trata-se de um subarbusto com até 50 cm de

altura, de ramos herbáceos cobertos de penugem, ereto, com haste suculenta

e bastante enrijecida, com folhas vivíparas opostas, pinadas, com um a cinco

folíolos muito suculentos, com ápice arredondado, base arredondada,

glaberrimas, nervação imersa, brilhosas e com aspecto sedoso. Apresenta

inflorescências terminais cimosas, alongadas, com cerca de 30 cm de

comprimento, flores com cálice gamossépalo inflado, com 5 dentes, com 2-2,5

cm de comprimento, corola tubulosa basifixas; gineceu com 4 carpelos

ligeiramente concrescidos na base, folículos multispermos, sementes

minúsculas com testa reticulada (BERG, 1982). As suas flores de coloração

rósea apresentam-se em cachos no ápice dos ramos, as folhas são ovais,

arredondadas na base e serrilhadas nas bordas. Os frutos são constituídos de

pequenas cápsulas contendo sementes (LORENZI & MATOS, 2002).

As folhas frescas de pirarucu são amplamente utilizadas na fitoterapia,

na qual são descritas propriedades medicinais: analgésica, antialérgica,

antiartrítica, antibacteriana, antidiabética, antifúngica, antiinflamatória tópica,

antilítica, anti-séptica, bactericida, cicatrizante, depurativa, diurética, emoliente

e hemostática (ALMEIDA et al., 2000).

Planta cicatrizante e refrescante, as folhas frescas e tostadas são úteis

nas cefalalgias, sendo que a infusão das mesmas serve para combater os

ergogitamentos linfáticos e as inchações erisipelatosas das pernas. O suco

parece ser eficaz contra calos, frieiras e queimaduras (ALBUQUERQUE, 1989).

As propriedades medicinais da planta pirarucu são evidenciadas por

diversas substancias químicas, como flavonóides, cálcio, ácido succcínico,

ácido málico, triterpeno, esteróis, ácido cítrico e ácido lático (GAIND, 1971;

GUPTA, 1973). Além desses constituintes químicos existem aminoácidos como

arginina, que é anticancerígeno, glicina que diminui a quantidade de ácido úrico

no organismo e histidina. Os bufadienolídeos que estão presente nas folhas

promovem uma atividade anti-tumoral, dentre eles destacam-se o 12-O-

tetradecanoilforbol-13-acetato e a briofilina (SUPRATMAN et al., 2001).

A planta possui também atividade relatada contra a leishmaniose (DA

SILVA et al., 1995; DA SILVA et al., 1999; TORRES-SANTOS et al., 2003;

MUZITANO et al., 2006).

2.3. Eleutherine plicata

A Eleutherine plicata Herb. (marupazinho) é uma planta herbácea

bulbosa e rizomatosa, acaule, entourecida, de 20-30 cm de altura, nativa da

América tropical, incluindo os campos secos da Amazônia brasileira. Os bulbos

apresentam escamas semelhantes à cebola, de coloração vinho e exsudando

látex branco quando cortados. Caracterizam-se por folhas simples, inteiras,

plissadas longitudinalmente, de cerca de 25 cm de comprimento. Flores

brancas ou rosadas, dispostas numa panícula ampla no ápice de um longo

escapo rígido acima da folhagem, que se abrem apenas ao por do sol.

Multiplica-se facilmente por bulbos, tornando-se persistente em muitas áreas a

ponto de ser considerada “planta daninha” (ALBUQUERQUE, 1989; VIEIRA

1992). Nas regiões do sul e sudeste perde a parte aérea durante o inverno e na

região Nordeste formam touceiras decumbentes.

Pertencente a família Iridaceae, essa planta possui vários nomes

populares, sendo os principais marupazinho, marupá, marupá – piranga,

marupaí, em Cuba “lágrimas de la virgen”.

Esta planta é amplamente utilizada na medicina caseira de quase todo

país, principalmente na região Amazônica, hábito iniciado pelas populações

indígenas desta região. Não há, porém, comprovação científica de sua eficácia

nem da segurança de suas preparações. De acordo com o uso popular, os

rizomas são empregados contra gastralgia, histeria, diarréia e vermes

intestinais (SCHULTES, 1990; MORS, 2000). Há relatos também de possuir

ação antifertilidade, sendo empregada no Haiti como contraceptivo (WENIGER,

1982; GRENAND, 1987). Ao extrato dessa planta são atribuídas propriedades

antimicrobianas e ação dilatadora coronária, potencialmente útil no tratamento

de doenças cardíacas (DIG, 1982). Como medicação caseira, na Amazônia, é

usada para o tratamento de diarréia e amebíase, fervendo-se 2 bulbos cortados

em pequenos pedaços durante 15 minutos em 500 mL de água e ingerindo-se

uma xícara antes das refeições. Os indígenas das Guianas empregam seus

bulbos para o preparo de emplastro em aplicações externa contra contusões e

ferimentos visando acelerar a cicatrização, já o suco com sal, é usado como

medicação interna contra epilepsia (GRENAND, 1987). São citados na sua

composição química a presença de naftoquinonas (NGUYEN, 1983),

antraquinonas do tipo crisofanol (GRENAND, 1987), além de uma saponina

esteroidal. (ALBUQUERQUE, 1989; VIEIRA, 1992).

2.4. Uncaria guianensis

Uncaria guianensis (Aubl) Gmelin pertence ao gênero Uncaria que é

representado por cerca de 60 espécies de lianas distribuídas principalmente na

África e Ásia, ocorrem em amplas áreas da Amazônia brasileira e em países da

América Central (Guatemala, Belize, Honduras, El Salvador, Nicarágua, Costa

Rica, Panamá) e do Sul (Colômbia, Venezuela, Guiana, Equador, Peru e

Bolívia), indicadas como seu centro de origem (POLLITO; TOMAZELLO, 2006).

As plantas são arbustos vigorosos e robustos, pouco ramificado, de

ramos escandentes ou trepadores com um espinho em forma de gancho em

cada axila foliar, de 30 m de comprimento (quando cresce isolado fora da mata

forma uma pequena touceira de hastes mais ou menos verticais de até 5 m de

altura). A espécie é nativa da Amazônia, principalmente na parte central e

noroeste, quase sempre em matas de várzeas inundáveis ou não, com um par

de espinhos, originados de pedúnculos abortivos, utilizados para galgar a copa

das árvores denominadas de “unha de gato”

Possui folhas simples, opostas, pecioladas, membranáceas, de 5-10 cm

de comprimento, lâmina ovada, elíptica, consistência cartácea ou papirácea e

um par de estípulas interpeciolares, livres na base, deltóide, obovada com

coloração verde claro. O caule com textura fibrosa-laminar coloração mesclada

de marrom avermelhado e creme, tem uma peculiaridade de armazenar água

para satisfazer suas próprias necessidades vitais, quando as chuvas são

escassas, este líquido armazenado é um poderoso energizante oferecido pela

natureza para saciar a sede, fome e cansaço na selva, deixando um discreto

sabor amargo. Inflorescências em glomérulos axilares, pedunculados, de forma

perfeitamente globosa, com flores branco amareladas (POLLITO;

TOMAZELLO, 2006)

Existem na América tropical pelo menos 50 espécies deste gênero. Na

Amazônia ocidental, nos estados do Amazonas, Acre e Rondônia, ocorre a

espécie Uncaria tomentosa (Willd) DC, com características e propriedades

mais ou menos semelhantes e uma das mais utilizadas na medicina tradicional

principalmente fora do Brasil. Diferencia-se de Uncaria guianensis

principalmente pelos espinhos menos curvos, pelas hastes mais anguladas e

pelas folhas um pouco menores (3-5 cm). Multiplica-se por sementes e por

meios vegetativos. (TAYLOR 1998, REVILLA 2001).

A sua anatomia demonstra pertencer à família Rubiaceae, com a

exceção dos elementos vasculares solitários, arredondados, largos e

freqüentes, parênquima axial difuso e largura dos raios, que correspondem a

plantas de hábito lianescente. A casca, lenho e folhas dessas plantas têm sido

usadas pelos povos amazônicos para o tratamento de inúmeras enfermidades

(gastrite, úlcera, diarréia, artrite, câncer, etc.) e como abortivo além de

aumentar a resistência dos tecidos. A seiva da unha de gato, pelas suas

propriedades energéticas e nutritivas, é utilizada pelos povos das florestas

(AQUINO et al., 1989).

A maior atenção dispensada a esta planta até hoje é relativo a presença

em suas raízes e cascas de alcalóides oxindólicos, com vários estudos

relatando o poder de estimular o sistema imunológico em até 50% (MATTA,

1976; KEPLINGER et al., 1990,). Isto induziu, em todo mundo, o seu amplo uso

como adjuvante no tratamento da Síndrome da Imunodeficiência Adquirida

(AIDS), do câncer e de outras doenças que afetam o sistema imunológico

(GONTUZZO, 1993). Outra propriedade desta planta que vem merecendo

ampla atenção dois cientistas atualmente é a antiinflamatória, principalmente

os “glicosídeos do ácido quinóvico”, considerados os mais potentes

antiinflamatórios encontrados em plantas, capazes de inibir inflamações em ate

69% (AQUINO 1991; YEPEZ 1991, RECIO 1995; CERRI 1998).

2.5. Arrabidaea chica

A família Bignoniaceae pertence à ordem Scrophulariales, subclasse

Asteridae, e reúne aproximadamente 120 gêneros e 650 espécies geralmente

tropicais espontâneas da América do Sul, incluindo árvores, lianas, arbustos e

raramente ervas. Em levantamento etnofarmacológico realizado na região

Amazônica, algumas espécies dessa família mostraram-se amplamente

utilizadas com fins medicinais entre elas estão a Arrabidaea chica (HKB) Verlot

e Mansoa alliacea (Lam.) A.H. Gentry (TAKEMURA et al 1995).

A espécie Arrabidaea chica (H&B) Verlot é conhecida popularmente

como cipó-pau, cipó-cruz, carajuru, carapiranga (CORREA, 1984), além de

pariri, carajirú, crajirú, carajerú, crejer, entre outras e pertence à família das

Bignoniaceae, conhecida como a família do Ipê. Apresenta dois grandes

centros de distribuição geográfica, o Brasil e o continente Africano, observa-se

que o Brasil é, provavelmente, a região onde a família apresenta-se com o

maior número de espécies, ocorrendo desde a Amazônia até o Rio Grande do

Sul, não possuindo um habitat único

(PAULETTI et al., 2003).

É caracterizada morfologicamente como uma planta arbustiva

ascendente com aproximadamente 2,5 m de altura, de ramos subtetragonos,

que possuem folhas compostas, bi ou trilobadas, de folíolos oblongo-

lanceolados, cartáceos, de 8 -13 cm de comprimento e com fitotaxia tipo oposta

dística. As flores são campanuladas róseo-lilacinas em panículas terminais

(ALBUQUERQUE, 1989; VIEIRA, 1992). Os frutos são silíquas deiscentes.

Possui como princípios ativos o ácido anisíaco, carujina, taninos, ferro

assimilável e cianocobalamina (ALBUQUERQUE, 1989). É comum a presença

de folhas modificadas denominadas gavinhas (órgão de suporte), auxiliando na

fixação ao substrato (CORREA, 1984).

Na espécie Arrabidaea chica, há identificado vários pigmentos como a

bixina, genipina e derivados da cajurina, que produzindo um corante vermelho-

escuro servem para tingir toda variedade de fibras artesanais, sendo

supostamente eficazes contra dermatoses e impinges (CORREA, 1984,

TAYLOR 1998, MORS 2000) e são comumente utilizados pelos indígenas da

Amazônia na sua pintura corporal, para tingir seus enfeites, utensílios e

vestuários, bem como para tatuagem, na arte, magia e até como método

profilático contra picada de mosquitos e como protetor solar. Os estudos

químicos demonstraram presença de fitosteróis, flavonóides e pigmentos

utilizados em cosméticos como: carajurona, carajurina e 3-deoxiantocianidina

(ESTRELA, 1995), taninos, ácido anísico, ferro assimilável e cianocoblamina.

(ALBUQUERQUE, 1989; VIEIRA, 1998). As propriedades tintoriais dessa

planta são devido a dois pigmentos flavônicos: a carajurina, que é o pigmento

principal e a carajurona (GRENARD et al.,1987).

É uma planta trepadeira com atributos ornamentais, é amplamente

utilizada na medicina caseira, principalmente na região Amazônica é usada

como anti-inflamatoria, antimicrobiana (TAYLOR, 1998) e para o tratamento de

cólicas intestinais, diarréias, anemias, uterinas, hemorragias, impigens, micose

e lavagem de ferimentos na pele (CORRÊA,1984) além de um agente

adstringente, sendo seu extrato usado na cosmética em forma de sabonete

cremoso produzindo um efeito anti-acne (TAKEMURA,1995) e atividade

antifúngica (BARBOSA & QUIGNARD,1998).

2.6. Mansoa alliacea

Conhecida popularmente como cipó-alho, alho, cipó-de-alho, alho-

d'água (DI STASI & HIRUMA-LIMA, 2002)

e cipó d’alho (LORENZI & MATOS,

2002) a planta é uma Bignoniaceae nativa em quase todas as regiões tropicais

do Brasil, principalmente na região Amazônica.

É uma espécie de arbusto trepador, de ramos cilíndricos e glabros, com

gavinhas; folhas normalmente 2-3 folioladas, curto pecioladas, com folíolos

peciolados, elípticos e coriáceos, podendo chegar a até 16 cm de comprimento,

inflorescência em racemo com cálice campanulado ou tubular e corola amarela

e afunilada; anteras glabras e ovário oblongo; fruto do tipo capsular largo,

oblongo-linear, contendo sementes oblongas. O caule lenhoso e as folhas

possuem um odor fortíssimo de alho, o que gera o nome popular atribuído a

espécie. Essa característica permite o uso da planta em substituição ao alho. O

nome do gênero deriva do grego aden = “glândula” e kalymma = “invólucro”,

significando “coberta de glândulas” e referindo-se ao cálice e às bráceteas

florais.

Em levantamento etnofarmacêutico foi constatado que as folhas, cascas

e raízes de Mansoa alliacea (Lam.) A.H. Gentry (sinonímia: Adenocalymna

alliaceum Miers) são empregadas na medicina caseira em muitas regiões do

país, principalmente como analgésica, antipirética e antireumática via oral ou

tópica (LORENZI & MATOS, 2002). O macerado alcoólico da casca da raiz e o

emplasto das folhas aplicado na zona afetada são considerados antireumáticos

e antiartríticos. A infusão de suas folhas é empregada contra febres e

resfriados e, a maceração aquosa das raízes, é usada como tônico constituinte

(REVILLA, 2001). Na Amazônia ocidental o chá da planta inteira moída é

empregado no tratamento de doenças respiratórias (SCHULTES & RAFFAUT,

1990). Nas Guianas o debuto dos ramos e folha é empregado em lavagens

externas como tratamento caseiro de dores e cansaço muscular. Entre os

indígenas esta planta é também empregada de maneira mística para espantar

maus espíritos (GRENAND,1987).

O seu aroma de alho é atribuído à presença de compostos do tipo

allisevenol, derivados do enxofre (ZOGHBI, 1984). Um estudo preliminar com a

casca do caule indicou a presença de alcalóides e ácidos do tipo dialil sufídrico,

comparáveis aos encontrados no alho (APPARATO, 1981).

Os dados de espécie vegetal, família, nome vulgar, órgão testado e uso

popular das plantas utilizadas neste trabalho estão resumidos no quadro 1.

Quadro1: Espécie vegetal, família, nome local, órgão testado e uso popular.

Espécie

vegetal

Família Nome vulgar Órgão

testado

Uso popular

Psidium

guajava L

Myrtaceae

Goiabeira,

Araçá-goiaba,

Araçá-

guaiaba,

Araçá-guaçu,

Guaiaba,

Guaiava

Folhas

Inflamações da

boca e da

garganta,

Desordens

intestinais,

Diarréias

Bryophyllum

calycinum

Salisb

Crassulaceae

Pirarucu

Saião roxo

Folha da

fortuna

Folhas

Analgésica,

antialérgica,

antiartrítica,

antibacteriana,

antidiabética,

antifúngica

Eleutherine

plicata Herb

Iridaceae

marupazinho,

marupá,

marupá –

piranga,

marupaí

Bulbo

Diarréias e

infecções

causadas por

amebas

Uncaria

guianensis

(Aubl.)

Gmelin

Rubiaceae

Unha-de-gato

Folhas

Gastrite, úlcera,

diarréia, artrite

Arrabidaea

chica (HKB)

Verlot

Bignoniaceae

pariri, crajiru,

cipó-cruz

Folhas

Antiinflamatório,

agente

adstringente,

anemia

Mansoa

alliacea

(Lam.) A.H.

Gentry

Bignoniaceae

Cipó d’alho

cipó-alho

alho-d'água

Folhas

Anti-reumáticos

e antiartríticos

Contra

resfriados

3. OBJETIVOS

3.1 Geral

Avaliar a atividade antimicrobiana in vitro de extratos de plantas

utilizadas na medicina popular na Amazônia visando o seu aproveitamento na

utilização de fitoterápicos.

3.2 Específicos

1. Avaliar a atividade antimicrobiana in vitro de extratos etanólicos brutos de

folhas de Psidium guajava L.(goiabeira), Bryophyllum calycinum Salisb

(pirarucu), Uncaria guianensis (Aubl.) Gmelin. (Unha de gato), Arrabidaea chica

(HKB) Verlot (pariri) e Mansoa alliacea (Lam.) A.H. Gentry (cipó d’alho)

2. Avaliar a atividade antimicrobiana in vitro de extratos de bulbos de

Eleutherine plicata Herb (marupazinho)

3. Proceder o fracionamento do extrato etanólico bruto de Uncaria guianensis

(Aubl.) Gmelin. (Unha de gato).

4. Avaliar a atividade antimicrobiana in vitro das frações obtidas do extrato de

Uncaria guianensis (Aubl.) Gmelin. (Unha de gato).

5. Determinar a concentração inibitória mínima, frente a cepas de fungos e

bactérias, dos extratos e frações das plantas que apresentarem atividade

antimicrobiana.

4. MATERIAL E MÉTODOS

4.1. Coleta e identificação do material vegetal

As folhas frescas da goiabeira (337,3g) foram coletadas dia 23/01/2007

no Horto de Plantas Medicinais da Empresa Brasileira de Pesquisas

Agropecuárias (EMBRAPA-Amazônia Oriental) e identificadas no Laboratório

de Botânica desta Instituição (Determinador: Miguel Pastana do Nascimento)

sendo uma exsicata depositada no Herbário da EMBRAPA Amazônia Oriental

(Figura 1).

Figura 1 – Folhas de Psidium guajava L. (Goiabeira). Exsicata doada pelo Laboratório de

Botânica da EMBRAPA-Amazônia Oriental (Determinador: Miguel Pastana do Nascimento).

As folhas frescas de Pirarucu (550g) foram coletadas dia 30/04/2007 no

Horto de plantas medicinais da EMBRAPA Amazônia Oriental e identificadas

no Laboratório de Botânica desta Instituição pelo Botânico Miguel Pastana do

Nascimento sendo uma exsicata (Figura 2) depositada no Herbário IAN

(EMBRAPA Amazônia Oriental).

Figura 2 – Folhas de Bryophyllum calycinum Salisb (Pirarucu). Exsicata doada pelo Laboratório

de Botânica da EMBRAPA-Amazônia Oriental (Determinador: Miguel Pastana do Nascimento).

O bulbo de Marupazinho (970,79g) foi coletado dia 16/02/2007 no Horto

do EMAÚS localizado no Bairro do Benguí, em Belém-PA. A exsicata (Figura 3)

foi preparada e enviada ao Museu Paraense Emílio Goeldi para ser analisada

pelo Dr. Mário Augusto Gonçalves Jardim do Departamento de Botânica sendo

identificada com o de numero de registro MG123511.

Figura 3 – Folhas de Eleutherine plicata Herb. (Marupazinho). Exsicata preparada no

Laboratório de Fitoquímica e identificada no Departamento de Botânica do Museu Paraense

Emílio Goeldi pelo Dr. Mário Augusto Gonçalves Jardim do Departamento de Botânica (registro

MG123511).

As folhas frescas de unha-de-gato (484,68g) (Figura 5) foram coletadas

dia 26/01/2007 no Horto de plantas medicinais, cedida pelo pesquisador Dr.

Osmar Alves Lameira. As plantas foram identificadas no Laboratório de

Botânica desta Instituição (Determinador: Miguel Pastana do Nascimento)

sendo uma exsicata de cada espécie depositada no Herbário da EMBRAPA-

Amazônia Oriental e outra no Laboratório de Fitoquímica da Faculdade

Farmácia do Instituto de Ciências da Saúde da Universidade Federal do Pará

(LAFIT/FF/ICS/UFPA).

Figura 4 – Folhas de Uncaria guianensis (Aubl.) Gmelin (unha-de-gato). Exsicata preparada no

Laboratório de Botânica da EMBRAPA-Amazônia Oriental (Determinador: Miguel Pastana do

Nascimento).

As folhas frescas de pariri (160,23g) (Figura 4) foram coletadas dia

23/01/2007 na Empresa Brasileira de Pesquisas Agropecuária (EMBRAPA-

AMAZÔNIA ORIENTAL). O pariri teve como procedência a área do Laboratório

de Botânica, em Belém-PA, cedido pelo pesquisador Dr. Joaquim Ivanir

Gomes.

Figura 5 – Folhas de Arrabidaea chica (HKB) Verlot. (pariri). Exsicata preparada no Laboratório

de Botânica da EMBRAPA-Amazônia Oriental (Determinador: Miguel Pastana do Nascimento).

As folhas frescas de cipó d’alho (356,7g) foram coletadas dia 16/03/2007

no Horto de plantas medicinais da EMBRAPA Amazônia Oriental e

identificadas no Laboratório de Botânica desta Instituição (Determinador:

Miguel Pastana do Nascimento) sendo uma exsicata depositada no Herbário

IAN da EMBRAPA Amazônia Oriental (Figura 6).

Figura 6 – Folhas de Mansoa alliacea (Lam.) A.H. Gentry (Cipó d’alho). Exsicata doada pelo

Laboratório de Botânica da EMBRAPA-Amazônia Oriental (Determinador: Miguel Pastana do

Nascimento).

4.2. Obtenção do extrato etanólico bruto (EEB)

As análises foram realizadas segundo as metodologias utilizadas pelo

Laboratório de Fitoquímica do Departamento de Farmácia (BARBOSA et al.,

2004).

Para a obtenção do EEBs as folhas frescas de goiabeira, pirarucu, unha-

de-gato, pariri, cipó d’alho e bulbos de marupazinho, após a limpeza, foram

deixadas por 7 dias à temperatura ambiente e 2 dias em estufa de circulação

de ar forçado, separadamente, para secagem. O material vegetal seco foi

então triturado e macerado por duas semanas, isoladamente, em 1500 mL de

etanol a 95%. Em seguida, os macerados foram filtrados em papel filtro

Whatman qualitativo e concentrados à baixa pressão a 50

C, em evaporador

rotatório, até a evaporação completa do solvente. O concentrado foi colocado

em estufa por 24 h a 45

C e posteriormente pesado, obtendo-se 16,7808 g de

EEB seco de goiabeira, 30,39 g de pirarucu, 300,20 g de marupazinho, 7,2235

g de pariri, 59,9510 g de unha-de-gato e 24,1948 g de cipó d’alho. A partir

destes concentrados foram preparadas as soluções para testes de atividade

antimicrobiana.

4.3. Abordagem Fitoquímica

Os extratos foram submetidos a uma investigação dos constituintes

químicos por classe metabólica. As classes de metabólitos secundários

testados foram: saponinas, ácidos orgânicos, açúcares redutores, alcalóides,

polissacarídeos, proteínas e aminoácidos, fenóis e taninos, flavonóides,

purinas, glicosídios cardíacos, azulenos, catequinas, sesquiterpenolactonas e

outras lactonas, esteróides e tripernóides, azulenos, carotenóides, depsídios e

depsidonas, derivados de cumarina, antraquinonas e antraquinonas. Estes

testes foram realizados em triplicata e seguiram as condições estabelecidas no

Manual para Análise Fitoquímica e Cromatográfica de Extratos Vegetais

(BARBOSA, 2001) e descritas abaixo.

4.3.1 Utilizando como solvente água destilada

Uma solução mãe foi preparada com 420mg de cada extrato seco e 84

mL de água destilada separadamente. A solubilização do extrato ao solvente

foi realizada em sonicador. Após este procedimento, foi realizada uma filtração

simples. Alíquotas desta solução foram retiradas para a realização de testes

para identificação de saponina espumídica, ácidos orgânicos, polissacarídeos,

fenóis e taninos redutores, proteína e aminoácidos.

a) Saponina Espumídica

Retirou-se da solução mãe, uma alíquota de 15 mL que foram

distribuídos em três tubos de ensaio, de modo que, cada recipiente

apresentasse 5 mL desta solução. Em seguida adicionou-se 15 mL de água

destilada em cada recipiente. Procedeu-se agitação vigorosa durante 2 minutos

em tubo fechado. Se a camada de espuma permanecer estável por mais de

meia hora, o resultado é considerado positivo para saponina espumídica

b) Ácidos Orgânicos

Foi colocado 1 mL de solução mãe em cada um dos poços de uma placa

escavada. Posteriormente, em cada amostra, foram adicionadas nove gotas de

reativo de Pascová A e 1 gota de reativo de Pascová B. Se houver

descoloração do reativo, a reação é positiva.

c) Polissacarídeos

Em três tubos de ensaio foram colocados 5 mL de solução-mãe e

adicionados 2 gotas de lugol em cada.O aparecimento de coloração azul indica

resultado positivo.

d) Fenóis e Taninos

Em três tubos de ensaio adicionou-se 5 mL de solução-mãe e

posteriormente 2 gotas de solução alcoólica de FeCl

a 1%.Qualquer mudança

na coloração ou formação de precipitado é indicativo de reação positiva,

quando comparado com o teste em branco (água + Sol. de FeCl

e)) Açúcares Redutores

Adicionou-se 5 mL da solução mãe em três tubos de ensaio. Foram

acrescentados 2 mL de reativo FEHLING A e 2 mL de reativo FEHLING B.

Estes recipientes foram levados à aquecimento em banho Maria por cinco

minutos. O aparecimento de um precipitado vermelho tijolo, indica presença de

açúcares redutores.

f) Proteínas e Aminoácidos

Foram transferidos 3 mL de solução mãe para 3 tubos de ensaio.

Acrescentaram-se 0,5mL de solução aquosa de Nihidrina a 1%, sendo esses

recipientes levados a aquecimento até ebulição. O aparecimento de coloração

violeta persistente indica reação positiva.

4.3.2 Utilizando como solvente metanol

Uma solução mãe foi preparada com 360 mg dos extratos secos e 72

mL de metanol. Utilizou-se um bastão de vidro para solubilizar o extrato ao

solvente. Por conseguinte, foi realizada uma filtragem simples. Esta solução foi

utilizada nos testes para identificação de flavonóides, glicosídeos cardíacos,

catequinas, derivados benzaquinonas, sesquiterpenolactonas e outras

lactonas.

a) Flavonóides

Mediu-se 10 mL de solução mãe e colocou-se em três tubos de ensaio.

Adicionaram-se 5 gotas de HCl concentrado, em cada um dos tubos.

Acrescentaram-se raspas de magnésio em cada tubo. O surgimento de uma

coloração rósea na solução indica reação positiva.

b) Glicosídeos Cardíacos

Em três tubos de ensaio foram colocados 2mL de solução mãe. Em cada

tubo foram postas 2 gotas do reativo de Keede A e 2 gotas do reativo de Keede

B. Coloração azul ou violeta indica reação positiva.

c) Catequinas

Transferiu-se 3 mL da solução mãe para três tubos de ensaio.

Adicionou-se 1 mL da solução aquosa de vanilina a 1% e 1 mL de HCl

concentrado. O aparecimento de cor vermelha indica presença de catequinas.

d) Derivados Benzaquinonas; Naftoquinonas e Fenantraquinonas

Mediu-se 3 mL da solução mãe e transferiu-se para três tubos de

ensaio. Em cada tubo foram acrescentados 2 gotas de Na

a 25%, 2 gotas

de formaldeído a 4% e 2 gotas de Orto-dinitrobenzeno a 5%. A mistura foi

levada ao banho maria. Coloração violeta indica reação positiva.

e) Sesquiterpenolactonas e outras lactonas

Colocou-se 3 mL da solução mãe em três tubos de ensaio. Adicionaram-

se aos tubos doze gotas de solução alcoólica de cloridrato de hidroxilamina a

10% e duas gotas de solução metanólica de KOH a 10%. Levou-se ao banho

maria por dois minutos. O aparecimento de coloração violeta, indica reação

positiva.

4.3.3 Utilizando Clorofórmio como solvente

Como nos testes anteriormente descritos fez-se necessária a

preparação de uma solução mãe. Esta solução foi preparada com 250 mg dos

extratos secos e 50 mL de clorofórmio. Esta solução foi usada para identificar

substâncias como: esteróides e triterpenóides, azulenos e carotenóide.

a) Esteróides e Triterpenóides

Foram retirados da solução mãe 30 mL. Esta alíquota foi filtrada em

carvão ativado. O filtrado foi distribuído de maneira uniforme em três tubos de

ensaio. Aos tubos, foi adicionado 1mL de anidrido acético seguido de agitação.

Adicionaram-se três gotas de H

concentrado. Tornou-se a agitar o

recipiente. Os procedimentos foram realizados em capela. Observe se há

rápido desenvolvimento de cores, que vão do azul evanescente, ao verde

persistente que indicam resultado positivo.

b) Azulenos

Foram colocados 2 mL da solução mãe em três tubos de ensaio.

Levados ao banho maria para concentrar até 0,5mL e, em seguida,

adicionados 2,5 mL de solução de p-dimetilaminobenzaldeido. Os tubos de

ensaio foram aquecidos durante 5 minutos em banho maria. Após esfriar,

acrescentou-se 10 mL de éter de petróleo em cada recipiente. Podendo ser

observadas duas fases distintas. Quando há presença de proazulenos, a fase

aquosa adquire coloração azul, porém, quando estes estão em pequena

quantidade, a coloração observada é esverdeada.

c) Carotenóides

Transferiu-se 3 mL de solução mãe para três tubos de ensaio.

Adicionaram-se gotas de ácido trifluoracético. A observação de coloração azul

indica reação positiva.

4.3.4 Utilizando éter etílico

Foi preparada uma solução mãe com 200 mg dos extratos secos e 40

mL de éter etílico. Esta solução foi utilizada para identificação de depsídeos e

depsidonas, e derivados da cumarina.

a) Depsideos e depsidonas

Transferiu-se para um tubo de ensaio 5 mL da solução mãe. Todo o éter

foi evaporado em banho maria e ao resíduo foram acrescentados 3 mL de

metanol. Agitaram-se e adicionaram-se 3 gotas de cloreto férrico (FeCl

)

1%. O

aparecimento de coloração verde, azul ou cinza, indica reação positiva.

b) Derivados da Cumarina

Colocou-se em tubo de ensaio 5 mL da solução mãe. Concentrou-se em

banho maria até uma quantidade de 0,5 mL. Em papel filtro foram aplicadas

gotas de solução etérea, de modo a formar duas manchas de

aproximadamente 1 centímetro de diâmetro cada. A uma destas, juntou-se 1

gota de solução NaOH 1N. O papel filtro foi levado à câmara de UV, onde a

metade da mancha que continha NaOH 1N estava coberta com papel escuro.

Fluorescência azul na parte exposta da mancha indica reação positiva.

4.3.5 Antraquinonas

Dissolveu-se 25 mg dos extratos secos em 5 mL de tolueno. Adicionou-

se 2 mL de solução de NH

OH a 10%. Agitou-se suavemente. O aparecimento

de coloração rósea, vermelha ou violeta na fase aquosa, indica reação positiva.

4.3.6 Alcalóides

Dissolveu-se 25 mg de extrato seco em 5 mL de HCl a 5%. Por filtração

simples, separaram-se quatro porções de 1 mL em tubos de ensaio e

adicionaram-se gotas de reativo de Bouchardat, de reativo de Dragendorff e

reativo de Mayer.

Na presença de alcalóides ocorre:

a) Reativo de Bouchardat: precipitado laranja avermelhado

b) Reativo de Dragendorff: precipitado vermelho tijolo

c) Reativo de Mayer: precipitado branco

4.3.7 Purinas

Em uma cápsula de porcelana, juntou-se 5 mg de extrato seco, 3 gotas

de solução de HCl 6N e 2 gotas de H

concentrado. Evaporou-se em banho

maria. Adicionou-se 3 gotas de solução de NH

OH 6N. O surgimento de

coloração violeta indica reação positiva.

4.4. Microrganismos Testados

Os microrganismos testados foram cepas padrão ATCC (American Type

Culture Colection) recomendadas para testes de suscetibilidade aos

antimicrobianos (CLSI, 2003). Em resumo, os microrganismos testados

apresentam as seguintes características:

Staphyloccoccus aureus (ATCC 25923): Bactéria Gram-positiva, responsável

por inúmeras e variadas infecções e síndromes em humanos e com resistência

a vários tipos de antimicrobianos.

Escherichia coli (ATCC 25922): Bactéria Gram-negativa, agente de infecções

gastrintestinal e principal responsável de infecções urinárias em mulheres.

Apresenta facilidade na aquisição e transferência de plasmídeos de resistência

à antimicrobianos.

Pseudomonas aeruginosa (ATCC 10145): Bactéria Gram-negativa, importante

agente de infecções nosocomiais e resistente a uma grande variedade de

antimicrobianos.

Candida albicans (ATCC 10231): Fungo leveduriforme, principal agente de

infecções fúngicas oportunistas, principalmente no trato vaginal e oral.

4.5. Avaliação Preliminar da Atividade Antimicrobiana

Foram preparados inóculos do microrganismo a testar tomando-se 3 a 4

colônias da cepa isolada em ágar Muller-Hinton e diluídas em solução salina a

0,85% até atingir a turbidez correspondente ao tubo 0,5 da escala de Mac-

Farland correspondendo aproximadamente 1 a 2 x 10

UFC/mL de E. coli

ATCC 25922 (BAUER et al., 1966; CLSI, 2003a; KARTAL et al., 2003).

Cada suspensão de microrganismo foi semeada (em triplicata), com

auxílio de um swab descartável, em toda a superfície de meio ágar Muller

Hinton. Em seguida foram adicionados discos de papel filtro (Whatman – tipo

3), de 6 mm de diâmetro, impregnados com 10 µL de cada extrato das plantas

testadas em uma concentração de 500 mg/mL dissolvidos em Dimetil-Sulfóxido

(DMSO).

Após incubação das placas a 35°C por 24 h foi reali zada a leitura dos

resultados medindo-se o halo, em mm, formado ao redor dos discos contendo

os extratos. Foi considerado como resultado final de cada extrato a média das

3 medidas e como suscetível halo igual ou acima de 8 mm de diâmetro de

acordo com os critérios de PAREKH & CHANDA, 2007; SANTOS et al., 2007.

Discos com cloranfenicol e nistatina foram utilizados como controle positivo e

de DMSO como controle negativo.

4.6. Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM)

Os extratos testados que apresentaram atividade antimicrobiana na

avaliação preliminar (halo de inibição igual ou acima de 8 mm) foram

submetidos a determinação da CIM pela técnica de disco difusão em ágar

acima citada e pela técnica de microdiluição em caldo (CLSI, 2002; CLSI

2003b; BERTINI et al., 2005; LIMA et al., 2006; SANTOS et al., 2007). As

concentrações testadas foram 500, 250, 125, 62,5 e 31,25 mg/mL

Os testes foram realizados em caldo Muller Hinton contidos em placa

“Sensitive microtiter” de 96 poços esterilizadas, e utilizadas em análises de

ELISA (Enzime Linked Immunosorbent Assay). Uma alíquota de 10 µL de cada

extrato nas concentrações de 500, 250, 125, 62,5, e 31,25 mg/mL foi

depositada em cada poço da placa contendo caldo Muller Hinton e suspensão

de microrganismos para um volume final de 200 µL em cada poço. Foi

realizado controle da absorvância do extrato, do caldo Muller Hinton, das

suspensões de microrganismos, de cloranfenicol e de nistatina.

As placas foram cobertas com parafilme e incubadas a 35

C por 24

horas. A leitura foi realizada em leitor de ELISA no comprimento de onda de

650 nm (LIMA et al., 2006) comparando-se a absorvância dos poços com

extrato e do orifício controle. Foi considerada como CIM a menor concentração

do extrato capaz de inibir o crescimento microbiano.

4.7 Critérios para aceitação da atividade antimicrobiana de extratos

brutos de plantas

Foram utilizados os critérios sugeridos por HOLETZ et al., 2002

conforme tabela 1.

Tabela 1 – Critérios para aceitação da atividade antimicrobiana de extratos brutos e plantas

(HOLETZ et al., 2002).

CIM DO EXTRATO RESULTADO

Abaixo de 100 mg/mL Boa atividade antimicrobiana

Entre 100 e 500 mg/mL Moderada atividade antimicrobiana

Entre 500 e 1000 mg/mL Fraca atividade antimicrobiana

Acima de 1000 mg/mL Inativo

4.8 Fracionamento do Extrato Etanólico Bruto de Uncaria guianensis

4.8.1 Dissolução Fracionada

O EEB de Uncaria guianensis ( Unha-de-gato) foi fracionado pela técnica

de dissolução fracionada com solventes de polaridade crescentes (hexano,

diclorometano, acetato de etila, acetona e metanol). Neste processo, os

solventes retiram da mistura, em etapas sucessivas, grupos de substâncias de

solubilidade semelhante.

Uma alíquota de 5 g de EEB de Uncaria guianensis foi pesado e

transferido para erlenmayer de 250 mL onde posteriormente o material foi

lavado 2 vezes com 125 mL de hexano e colocado para agitar em agitador

automático para dissolução e filtrado por papel de filtro qualitativo. O filtrado foi

então recolhido em outro erlenmeyer de 250 mL para posterior concentração. O

resíduo obtido foi lavado com diclorometano, utilizando-se o mesmo

procedimento acima, o qual também foi recolhido para posterior concentração.

O mesmo procedimento foi realizado para acetato de etila, acetona e metanol

onde por fim, recolheu-se o resíduo final.

As frações obtidas foram concentradas à baixa pressão a 50

C, em

evaporador rotatório, até a evaporação completa do solvente. O concentrado

foi posteriormente pesado, obtendo-se 0,360 g de fração hexânica, 0,205 g da

fração diclorometano, 0,102 g da fração acetato de etila, 0,215 g da fração

acetona e por fim 3,17 g de fração metanólica representando o maior

rendimento de 63,4%.

4.8.2 Avaliação da atividade antimicrobiana das frações de Uncaria

guianensis.

A partir das frações obtidas, foram realizados testes de suscetibilidade

antimicrobiana pelo método de disco difusão em ágar já descrito anteriormente.

As frações hexano, diclorometano, acetato de etila, acetona e metanol

foram testadas frente à cepa ATCC 25923 de Staphylococcus aureus. Para

isso foram preparadas, a partir dos concentrados obtidos de cada fração,

soluções em concentrações de 100, 50, 25 e 12,5 mg/mL disolvidas em DMSO

que foram utilizadas para impregnar os discos e realizar os testes.

4.8.3 Perfil comparativo entre a atividade antimicrobiana do extrato bruto

de Uncaria guianensis e a fração metanólica.

Após análise antimicrobiana das frações de Uncaria guianensis, foi

possível estabelecer um perfil comparativo entre o extrato etanólico bruto

(EEB) de Uncaria guianensis e a fração que apresentou atividade (fração

metanólica). Nesta etapa foram utilizadas diferentes concentrações das

amostras numa escala crescente de 100, 200, 300, 400 e 500 mg/mL

dissolvidos em DMSO. A partir dessas soluções foram realizados os testes de

disco difusão em Ágar.

4.9 Fluxograma da metodologia

Coleta e identificação

do material vegetal

Preparação do extrato

Abordagem

fitoquímica

CIM

Pirarucu

S. aureus (ATCC 25923)

E. coli (ATCC 25922)

P aeruginosa (ATCC 10145)

C. albicans

(ATCC 10231)

Goiabeira Marupazinho Unha de gato Pariri

Cipó d’alho.

EEB

Avaliação preliminar da atividade

antimicrobiana

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1. Abordagem Fitoquímica dos Extratos Etanólicos Brutos

Os resultados obtidos na abordagem fitoquímica das 06 espécies

utilizadas neste estudo, estão representados na Tabela 2.

A abordagem fitoquímica no EEB de Psidium guajava L. (goiabeira),

revelou a presença de saponinas espumicídicas, fenóis e taninos, flavonóides,

catequinas, carotenóides e alcalóides. Segundo MORALES & LOZOYA (1994),

o efeito espasmolítico e antidiarréico está relacionado com o conteúdo em

flavonóides, em particular de derivados de quercetina, que atuam como

antagonistas do cálcio nas fibras musculares lisas.

Nas folhas de Bryophyllum calycinum Salisb (pirarucu) foi observada a

presença de ácidos orgânicos, açúcares redutores, fenóis e taninos,

flavonóides, catequinas, lactonas, esteródes e triterpenóides, azulenos,

carotenóides, depsídios e depsidonas e derivados de cumarina. GAIND &

GUPTA, (1971) e (1973) relataram a presença de flavonóides, esteróides e

triterpenóides presentes em folhas, alguns constituintes presentes possuem

propriedades medicinais já comprovadas, como os azulenos, flavonóides e

ácidos orgânicos.

A presença de taninos, catequinas e flavonóides podem conferir

atividade antimicrobiana às folhas de goiabeira e do pirarucu (SCALBERT,

1991; DJIPA et al., 2000; HARBONE, 2000; BYLKA et al., 2004; VELURI et al.,

2004) Nas folhas de Eleutherine plicata Herb (marupazinho) foram detectados

açúcares redutores, fenóis e taninos, esteróides e terpenóides, azulenos,

carotenóides, depsídios e depsidonas e derivados de cumarina. ALVES et al.,

2003 relataram a presença de naftoquinonas em extratos preparados a partir

de bulbos de marupazinho. A presença de taninos no extrato pode ser

responsável pela atividade antimicrobiana da planta (DJIPA et al 2000).

A abordagem fitoquímica do EEB de Uncaria guianensis revelou a

presença de saponinas, açucares redutores, catequinas, sesquiterpenolactonas

e outras lactonas, derivados de cumarina e indicação de purinas e alcalóides.

KEPLINGER (1990) e MATTA (1976) comprovaram a presença de alcalóides

oxindólicos em cascas e raízes, resultados semelhantes ao de GONTUZZO

(1993). Já AQUINO (1991), YEPEZ (1991), RECIO (1995) e CERRI (1998)

relataram a presença de “glicosídeos do ácido quinóvico” considerados uns dos

mais potentes antinflamatórios encontrados em plantas.

O EEB de Arrabideae chica caracterizou a presença de saponinas fenóis

e taninos, glicosídios cardíacos, derivados de benzaquinonas, naftoquinonas e

fenantraquinonas, esteróides e triterpenóides, carotenóides, antraquinonas e

purinas, assim como indicação de flavonóides, depsídios e depsidonas.

ESTRELA (1995) demonstrou a presença de taninos flavonóides e fitosterois

na planta. VIEIRA (1998) e ALBUQUERQUE (1989) encontraram taninos, ácido

anísico e cianocobalamina.

A abordagem fitoquímica de Mansoa alliacea (cipó d’alho) revelou a

presença de açúcares redutores, fenóis e taninos, flavonóides, esteróides e

triterpenóides, azulenos, carotenóides e alcalóides dados que também

sugerem uma possível atividade antimicrobiana, entretanto, em nosso estudo,

Mansoa alliacea (cipó d’alho) não apresentou atividade contra os

microrganismos testados.

Tabela 2 - Abordagem Fitoquímica dos extratos etanólicos brutos de Psidium guajava (goiabeira), Bryophyllum calycinum (pirarucu), Eleutherine plicata

(marupazinho), Uncaria guianensis (unha-de-gato), Arrabidaea chica (pariri) e Mansoa alliacea (cipó d’alho).

SUBSTÂNCIAS PESQUISADAS P.

guajava

calycinum

plicata

guianensis

chica

alliacea

Saponina espumicidíca + - - + + -

Ácidos Orgânicos - + - - - -

Açucares Redutores - + + + - +

Polissacarídeos - - - - - -

Proteínas e Aminoácidos - - - - - -

Fenóis e Taninos + + + - + +

Flavonóides + + - - I +

Glicosídios Cardíacos - - - - + -

Catequinas + + - + - -

Derivados de Benzaquinonas, Naftoquinonas e

Fenantraquinonas

- - - - + -

Sesquiterpenolactonas e outras lactonas - + - + - -

Esteródes e Triterpenóides - + + - + +

Azulenos - + + - - +

Carotenóides + + + - + +

Depsídios e Depsidonas - + + - + -

Derivados de Cumarina - + + + - -

Antraquinonas - - - - + -

Alcalóide + - - I - +

Purinas - - - I + -

+ Presença

- Ausência

I Indiativo

5.2. Atividade antimicrobiana dos EEBs das plantas

Os microrganismos usados (Escherichia coli ATCC 25922,

Staphylococcus aureus ATCC -25923, Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145

e Candida albicans ATCC 10231) foram escolhidos por serem recomendados

como microrganismos padrões para testes de suscetibilidade antimicrobiana,

sendo responsáveis por várias formas de infecções em humanos e adquirirem,

com mais freqüência, resistência aos antimicrobianos (OPLUSTIL et al., 2000).

Não existe um consenso sobre o nível aceitável para extratos de plantas

quando comparados com antibióticos padrões. Alguns autores consideram

somente resultados similares aos de antibióticos conhecidos, desde que se

trabalhe com uma fração já determinada (ALIGIANIS et al., 2001). Entretanto,

como trabalhamos com extrato bruto das plantas, seguimos o critério sugerido

por HOLETZ et al., (2002) baseado nos resultados de CIM (Tabela 1).

Entretanto, a maior concentração de extrato empregada no presente trabalho,

foi de 500 mg/mL, uma vez que em concentrações mais altas, as soluções dos

extratos não permitiram uma absorção total nos discos, além da intensa

coloração que prejudicava a leitura dos resultados. Para HOLETZ et al., (2002)

extratos vegetais que apresentam atividade antimicrobiana em concentrações

acima de 500 mg/mL possuem fraca atividade, sendo de difícil aproveitamento

farmacêutico no tratamento de infecções bacterianas ou fúngicas.

Apenas o extrato de Mansoa alliacea (Lam.) A.H. Gentry (cipó d’alho)

não apresentou atividade contra nenhum dos organismos testados (Tabela 3),

não justificando, portanto, sua utilização no tratamento de doenças infecciosas

causadas por estes microrganismos (S. aureus, P. aeruginosa, E. coli e C.

albicans). É possível que esta planta não possua efeito antimicrobiano ou que o

extrato da planta contenha constituintes antibacterianos em concentrações não

suficientes para ser considerado efetivo. Entretanto, novos testes devem ser

conduzidos utilizando outras espécies bacterianas e cepas padronizadas para

comprovação da ausência de atividade antimicrobiana desta planta.

Na verificação preliminar da atividade antimicrobiana das folhas de

Psidium guajava L. (goiabeira) foi observada atividade antibacteriana contra S.

aureus e P. aeruginosa e antifúngica frente à levedura C. albicans. Na

determinação da concentração inibitória mínima, o EEB de goiabeira foi ativo

até a concentração de 125 mg/mL frente aos microrganismos testados

(Tabelas 3 e 4).

Tabela 3 - Avaliação preliminar da atividade antimicrobiana dos extratos etanólicos brutos

(concentração de 500 mg/mL) de Psidium guajava (goiabeira), Bryophyllum calycinum

(pirarucu), Eleutherine plicata (marupazinho), Uncaria guianensis (unha-de-gato), Arrabidaea

chica (pariri) e Mansoa alliacea (cipó d’alho).

Espécie Vegetal Microrganismo Avaliação

preliminar da

atividade

antimicrobiana

Halo

(mm)

S. aureus

+ (13 mm)

E. coli

- -

P. aeruginosa

+ (11 mm)

Psidium guajava

(goiabeira)

C. albicans

+ (17 mm)

S. aureus

+ (11 mm)

E. coli

- -

P. aeruginosa

+ (14 mm)

Bryophyllum calycinum

(pirarucu)

C. albicans

- -

S. aureus

+ (19 mm)

E. coli

- -

P. aeruginosa

- -

Eleutherine plicata

(marupazinho)

C. albicans

+ (12 mm)

S. aureus

+ (12 mm)

E. coli

- -

P. aeruginosa

- -

Uncaria guianensis

(Unha de gato)

C. albicans

- -

S. aureus

+ (14 mm)

E. coli

+ (10mm)

P. aeruginosa

- -

Arrabidaea chica

(pariri)

C. albicans

+ (10 mm)

S. aureus

- -

E. coli

- -

P. aeruginosa

- -

Mansoa alliacea

(cipó d’alho)

C. albicans

- -

Embora o extrato de goiabeira possa ter apresentado CIM na mesma

concentração contra todos os microrganismos testados, os halos formados nos

testes de difusão contra C. albicans foram maiores, sugerindo uma melhor

ação contra fungos. Desse modo, sugere-se a realização de testes contra

outros fungos leveduriformes (como o Criptococcus neoformans) e

filamentosos (como os dermatófitos e o Aspergillus fumigatus), considerando a

diversidade de uso da planta na medicina popular em vários tipos de doenças

(CARRICONDE, 2000; MATOS, 2002).

O extrato de P. guajava foi relatado com atividade antimicrobiana para S.

aureus, Bacillus subtilis, E. coli, P. aeruginosa e C. albicans por GNAN &

DEMELLO (1999) e por HOLETZ et al., (2002). Já os resultados de

GONÇALVES et al., (2005) constataram ação contra Streptococcus pyogenes,

Proteus mirabilis e S. aureus, não constando ação frente à E. coli e P.

aeruginosa. Resultados semelhantes encontraram SANCHES et al., (2005),

com atividade do extrato etanólico e aquoso de várias partes da planta contra

S. aureus e B. subtilis e sem atividade contra E. coli e P. aeruginosa. Os

trabalhos de VIEIRA et al., (2001), revelaram ação do extrato etanólico de

brotos da goiabeira contra cepas de S. aureus e E. coli isoladas de amostras

de camarões e peixes oceânicos.

Mesmo sendo diferentes as cepas, a concentração dos extratos, a

metodologia e a origem das plantas utilizadas nos trabalhos acima citados, os

resultados são aceitáveis. Segundo HOOD et al., (2003) a falta de

padronização de testes de susceptibilidade antimicrobiana tem sido um dos

entraves encontrados para a realização desse tipo de estudo.

Na verificação preliminar da atividade antimicrobiana o extrato de

Bryophyllum calycinum Salisb apresentou atividade contra S. aureus e P.

aeruginosa, entretanto, não revelou atividade contra a bactéria Gram-negativa

E. coli e contra o fungo leveduriforme Candida albicans.(Tabela 3).

Quando realizada a determinação da concentração inibitória mínima, o

extrato de pirarucu foi ativo até a concentração de 250 mg/mL frente a P.

aeruginosa e 500 mg/mL contra S. aureus (Tabela 4). DA SILVA (2007)

também demonstrou atividade antibacteriana da folha de pirarucu frente a S.

aureus resistente a meticilina. Estes resultados justificam a continuação de

estudos fitoquímicos e microbiológicos com a planta na tentativa de obter

frações ativas que possam ser utilizados em fitoterápicos antimicrobianos. A

planta possui também atividade relatada contra Lesichmania brasiliensis (DA

SILVA et al., 1995; DA SILVA et al 1999; TORRES-SANTOS et al 2003 e

MUZITANO et al., 2006).

Tabela 4 – Concentração Inibitória Mínima (CIM) dos extratos etanólicos brutos de Psidium guajava (goiabeira), Bryophyllum calycinum (pirarucu),

Eleutherine plicata (marupazinho), Uncaria guianensis (unha-de-gato) e Arrabidaea chica (pariri) pelos métodos de disco difusão em ágar e de microdiluição

em placas.

Disco Difusão em Ágar Microdiluição em Placas

Planta Microrgansimo 500

mg/mL

250

mg/mL

125

mg/mL

62,5

mg/mL

31,25

mg/mL

500

mg/mL

250

mg/mL

125

mg/mL

62,5

mg/mL

31,25

mg/mL

P. guajava S.aureus

13 mm*

11 mm 9 mm - - + + + - -

(Goiabeira)

P. aeruginosa

11 mm 10 mm 10 mm - - + + + - -

C. albicans

17 mm 16 mm 11 mm - - + + + - -

B. calycinum S. aureus

11 mm - - - - + - - - -

(Pirarucu)

P. aeruginosa

14 mm 11 mm - - - + + - - -

E. plicata S. aureus

19 mm 17 mm 15 mm 10 mm - + + + + -

(Marupazinho)

C. albicans

12 mm 10 mm - - - + + - - -

U. guianensis

(Unha-de-gato)

S. aureus

15 mm 12 mm 10 mm 9 mm - + + + + -

A. chica S. aureus

14 mm 12 mm 11 mm 10 mm - + + + + -

(Pariri)

E. coli

10 mm 9 mm - - - + + - - -

C. albicans

10 mm - - - - + - - - -

* - Medida do Halo de Inibição

Na verificação preliminar da atividade antimicrobiana o extrato de

Eleutherine plicata Herb (marupazinho) apresentou atividade contra S. aureus e

C. albicans. O marupazinho mostrou melhor atividade contra a bactéria Gram-

positiva S. aureus com CIM de 62,5 mg/mL. A CIM contra C. albicans foi de

250 mg/mL (Tabelas 3 e 4). O extrato diclorometano de bulbos de Eleutherine

plicata foi relatado com forte ação antifúngica frente a Cladosporium

sphaerospermum (ALVES et al., 2003).

Na verificação da atividade antimicrobiana do extrato de Uncaria

guianensis (Aubl.) Gmelin (unha-de-gato) foi observada atividade

antibacteriana contra S. aureus apresentando CIM de 62,5 mg/mL (Tabelas 3 e

4). Foi relatada atividade antimicrobiana para Uncaria tomentosa

micropulverizada frente a Streptococcus. mutans e Staphylococcus spp da

cavidade oral por VASQUEZ et al., (2007), não exibindo efeito inibitório sobre

P. aeruginosa e C. albicans. Estes resultados diferem de SILVA et al., (1998)

que observaram inibição de isolados de C. albicans. KLOUCEK et al., (2005)

apresentou resultados positivos para B. cereus, B. subtilis, E faecalis, S.

aureus, S epidermidis e E. coli. Mesmo sendo Uncaria tomentosa e Uncaria

guianensis de espécies diferentes estes resultados reforçam a idéia de

atividade antimicrobiana da unha-de-gato.

Já o extrato etanólico bruto de Arrabidaea chica (HKB) Verlot (pariri)

apresentou atividade antibacteriana contra S. aureus e E. coli, e antifúngica

frente à levedura C. albicans. Com CIM de 62,5 mg/mL para S. aureus, de 250

mg/mL para E. coli e de 500 mg/mL para C. albicans (Tabelas 3 e 4).

Considerando os critérios sugeridos por HOLETZ et al., (2002) os

melhores resultados obtidos foram contra S. aureus, para Eleutherine plicata,

Uncaria guianensis e Arrabideae chica representando uma CIM abaixo de 100

mg/mL (62,5mg/mL). Estes resultados sugerem que estes extratos possuem

boa atividade antimicrobiana, portanto, têm potencial para serem usados na

produção de fitoterápicos de aplicação tópica contra infecções causadas por

bactérias Gram-positivas.

A diferença entre os efeitos antimicrobianos das plantas estudadas, se

justifica pelas propriedades fitoquímicas distintas entre as espécies. Com

exceção de Mansoa alliacea (Lam.) A.H. Gentry (cipó d’alho) que não

apresentou nenhuma atividade frente aos quatro microrganismos testados,

todas as outras espécies vegetais apresentaram-se positivas para um

microrganismo em comum, o Staphyloccoccus aureus. Segundo VLIETINCK et

al., (1995), RABE et al., (1997), LIN et al., (1999) e KELMANSON et al., (2000),

muitas das plantas com atividade antimicrobiana que já foram estudadas por

diversos pesquisadores são ativas apenas contra cepas de bactérias Gram

positivas. URZUA et al., (1998) sugerem que a membrana externa das

bactérias Gram negativas poderia agir como uma barreira contra as

substancias ativas presente nos extratos de plantas. No entanto, extratos de

folhas de goiabeira, de pirarucu e de pariri avaliados neste estudo mostraram-

se ativos contra cepas de bactérias Gram positivas e Gram negativas.

Não encontramos na literatura consultada qualquer referência quanto à

atividade antimicrobiana de Uncaria guianensis e Mansoa alliacea. Segundo

DUARTE (2006) apesar da rica biodiversidade de plantas no Brasil, somente

estão disponíveis dados sobre 44 espécies de plantas pertencentes a 20

famílias com atividade antimicrobiana positiva, incluindo espécies nativas e

exóticas. Estes dados não incluem os resultados de divulgação em reuniões

científicas e teses da comunidade acadêmica, que geralmente não são

publicados. Além do mais, para a maioria das plantas, somente uma das

partes, como folha, raiz ou caule, ou somente um tipo de preparação como óleo

essencial ou extrato foram estudados.

A técnica de microdiluição em caldo utilizada para determinação da CIM

apresentou dificuldades na observação da turvação, devido à intensa coloração

dos extratos, principalmente o extrato de pirarucu. Assim, foi realizada a

técnica de disco difusão em ágar para confirmação dos resultados. Entretanto,

esta técnica não é recomendável para este fim, mas os resultados foram

semelhantes (Tabela 4). Uma alternativa a ser seguida em futuros

experimentos é a utilização da técnica de ELOFF, (1998) a qual utiliza um sal

(p-iodonitrotetrazolium violet) para revelar o crescimento. Segundo os autores,

esta técnica foi mais sensível que a técnica de ágar difusão em disco nos

experimentos realizados com vários tipos de extratos vegetais.

5.3. Atividade antimicrobiana das frações de Uncaria guianensis

A técnica de fracionamento é uma estratégia que proporciona investigar

as diversas substâncias presentes no extrato bruto, possibilitando a separação

dos componentes do extrato segundo suas solubilidades nos solventes

utilizados. (BARBOSA et al., 2001).

Dentre os extratos que apresentaram atividade antimicrobiana foi

escolhida, para determinar a fração responsável pela atividade, a planta

Uncaria guianensis (unha-de-gato) por ainda não ter relatos na literatura quanto

a esta atividade e por ser bastante utilizada na medicina popular da Amazônia,

particularmente no estado do Pará. Ressalta-se também que as demais plantas

(goiabeira, marupazinho, pariri e pirarucu) estão sendo estudadas quanto à

esse item em outros projetos do Programa de Pós-Graduação em Ciências

Farmacêuticas da UFPA.

Após obtenção de 5 frações apenas a fração metanólica do extrato bruto

de Uncaria guianensis na concentração de 100 mg apresentou inibição de

crescimento frente à cepa de Staphyloccoccus aureus (Tabela 5) apresentando

um halo de inibição de 8 mm (figura 7), o que sugere que a ação

antimicrobiana do extrato de unha-de-gato está nesta fração e não em

substâncias de baixa e média polaridade como hexano, diclorometano, acetato

de etila e acetona. As concentrações de 50, 25, e 12 mg/mL não apresentaram

atividade antimicrobiana pelos padrões estabelecidos.

Tabela 5 - Avaliação da atividade antimicrobiana das frações de Uncaria guianensis (unha-de-

gato).

Fração testada Concentração

100mg/mL 50mg/mL 25mg/mL 12,5mg/mL

Hexano - - - -

Diclorometano - - - -

Acetato de etila - - - -

Acetona - - - -

Metanólica + - - -

Figura 7 – Atividade antimicrobiana da fração metanólica de Uncaria guianensis com ação na

concentração de 100mg (halo de 8 mm).

5.4 Perfil comparativo entre o extrato bruto de Uncaria guianensis e fração

metanólica

A partir desse resultado foi possível realizar um perfil comparativo entre

o EEB de Uncaria guianensis e sua fração metanólica, já que ambas

apresentaram atividade frente Staphylococcus aureus.

Os resultados da tabela 6 mostram que o EEB apresentou-se de

maneira dose-dependente, pois ocorreu um halo de 12 mm na concentração de

500 mg/mL de 11 mm em 400 mg/mL de 10 mm em 300 mg/mL, 9 mm em 200

mg/mL e de 8 mm em 100 mg/mL (figura 8).

Tabela 6– Atividade antimicrobiana do EEB de Uncaria guianensis (unha-de-gato) por disco

difusão em ágar.

Amostra testada Concentração Halo de inibição (mm)

500 mg/mL 12 mm

400 mg/mL 11 mm

EEB 300 mg/mL 10 mm

200 mg/mL 9 mm

100 mg/mL 8 mm

Figura 8 – Atividade antimicrobiana do EEB de Uncaria guianensis por disco difusão em ágar.

Na fração metanólica (tabela 7), as concentração de 500 e 400 mg/mL

apresentaram um halo de inibição de 12 mm, a de 300mg/mL ocorreu halo de

11 mm, em 200 mg/mL houve desenvolvimento de halo de 10 mm e em 100

mg/mL o halo foi de 8 mm. (figura 9)

Tabela 7 – Atividade antimicrobiana da fração metanólica de Uncaria guianensis (unha-de-

gato) por disco difusão em ágar.

Amostra testada Concentração Halo de inibição (mm)

500mg/mL 12 mm

400mg/mL 12 mm

Fração metanólica 300mg/mL 11 mm

200mg/mL 10 mm

100mg/mL 8 mm

Figura 9 – Atividade antimicrobiana da fração metanólica de Uncaria guianensis por disco

difusão em ágar.

Os resultados indicam uma ação mais efetiva da fração metanólica de

unha-de-gato quando comparada com o extrato bruto (Figura 10). Isto se

justifica pelo fato de que o extrato bruto apresenta maior mistura de

substâncias, enquanto que, a fração já separa substâncias mais específicas,

por semelhança de solubilidade. Isto permite sugerir que a ação antimicrobiana

do extrato bruto de Uncaria guianensis é decorrente de substâncias de alta

polaridade como as presentes na fração metanólica.

0 100 200 300 400 500 600

FMeOH

EEB

Concentração (mg)

Inibição (mm)

Figura 10 – Atividade antimicrobiana da fração metanólica e do EEB Uncaria guianensis

(unha-de-gato) por disco difusão em ágar.

Embora os resultados encontrados suportem o uso das plantas

goiabeira, pirarucu, marupazinho, pariri e unha-de-gato como antimicrobianos

em terapêutica popular, não é recomendada, sem estudos mais avançados, a

sua utilização no tratamento de infecções severas.

Os resultados contribuem para a caracterização da atividade

antimicrobiana das plantas utilizados na medicina popular da Amazônia,

colaborando com a busca por novas substâncias, a partir de fontes naturais,

que ajudem a combater a expansão da resistência microbiana. Sugere-se a

continuação de estudos contra microrganismos multiresistentes isolados de

processos clínicos e a ação em menores concentrações associados com

antibióticos, para observar o possível efeito sinérgico dessa associação.

6. CONCLUSÕES

- Psidium guajava (goiabeira) demonstrou moderada atividade

antimicrobiana frente a S. aureus, P. aeruginosa e C. albicans.

- Bryophyllum calycinum Salisb (pirarucu) teve moderada atividade

contra S. aureus e P. aeruginosa.

- Eleutherine plicata Herb (marupazinho) possui boa atividade frente a S.

aureus e moderada contra C. albicans.

- Arrabidaea chica (pariri) possui boa atividade frente a S. aureus, e

moderada contra E. coli e C. albicans.

- Uncaria guianensis (unha-de-gato) possui boa atividade contra S.

aureus.

- Mansoa alliacea (cipó d’alho) não demonstrou atividade antimicrobiana

frente aos microrganismos testados.

- Dentre as frações do extrato etanólico bruto de Uncaria guianensis

testadas, somente a fração metanólica apresentou atividade antimicrobiana.

- A fração metanólica de Unaria guianensis teve ação antimicrobiana

contra S. aureus mais efetiva que o extrato etanólico bruto da mesma planta.

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