( PDF ) Estudo da ação antinociceptiva e antiinflamatória do1-nitro-2-feniletano, principal constituinte da Aniba canelilla

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ANDERSON BENTES DE LIMA

ESTUDO DA AÇÃO ANTINOCICEPTIVA E

ANTIINFLAMATÓRIA DO 1-NITRO-2-FENILETANO,

PRINCIPAL CONSTITUINTE DA Aniba canelilla

BELÉM

2008

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ANDERSON BENTES DE LIMA

AVALIAÇÃO ANTINOCICEPTIVA E ANTIINFLAMATÓRIA DO 1-NITRO-2-

FENILETANO, PRINCIPAL CONSTITUINTE DA Aniba canelilla

Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Ciências Farmacêuticas da Universidade Federal

do Pará, como requisito final para a obtenção do grau de Mestre

em Ciências Farmacêuticas, sob orientação do professor Dr.

Pergentino José da Cunha Sousa.

Orientador: Prof. Dr. Pergentino José da Cunha Sousa

Co-Orientador: Prof. Dr. José Guilherme Soares Maia

BELÉM

2008

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ANDERSON BENTES DE LIMA

AVALIAÇÃO ANTINOCICEPTIVA E ANTIINFLAMATÓRIA DO 1-NITRO-2-

FENILETANO, PRINCIPAL CONSTITUINTE DA Aniba canelilla

Banca Examinadora:

________________________________________________

Prof. Dr. Pergentino José da Cunha Sousa

ORIENTADOR

________________________________________________

Prof. Dr. José Guilherme Soares Maia

CO-ORIENTADOR

_______________________

1º EXAMINADOR

Prof. Dr. José Carlos Tavares Carvalho

_________________________________________________

2º EXAMINADOR

Prof. Dra. Maria Elena Crespo Lopez

Aprovado pela Comissão Avaliadora no dia 26 de junho de 2008.

Este trabalho dedico:

A meus pais João Carlos Lopez de Lima e Maria Helena Bentes de Lima;

Ao meu irmão Emerson Bentes de Lima

E minha namorada Alessandra Souto Cardoso.

AGRADECIMENTOS

A Universidade Federal do Pará.

A Universidade de São Paulo de Ribeirão Preto.

Ao orientador, professor Dr. Pergentino José da Cunha Sousa, pela orientação

competente e pela amizade demonstrada em cada ensinamento e conselho durante esta

caminhada.

Ao professor da Faculdade de Engenharia Química e de Alimentos da UFPA José

Guilherme Soares Maia por ter conceder o espaço físico e estrutura para o fracionamento do

1-nitro-2-feniletano.

A Joyce Kelly por ter realizado o fracionamento do 1-nitro-2-feniletano.

Aos professores da Faculdade de Farmácia da UFPA por sua preciosas contribuições

para a melhoria deste trabalho.

A professora Gloria Emilia Petto de Sousa e toda sua equipa que foram importantes

para a finalização deste estudo.

Aos meus pais, João Carlos e Maria Helena, meu irmão, cujo amor e incentivo

ajudaram na realização deste trabalho.

A minha namorada Alessandra Cardoso, por incentivar e compartilhar todos os

momentos da minha vida e principalmente desse projeto com dedicação e amor.

Aos meus amigos, Christian, Edilberto, Maxwell, Luciana Bravim por me ajudarem

nesse trabalho através do apoio, carinho e respeito que mantiveram por mim, além da amizade

que foi se estreitando ao longo desse tempo.

Aos amigos do mestrado que participaram do processo de desenvolvimento desse

trabalho.

A Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – CAPES – pela

bolsa concedida.

Ao Instituto Evandro Chagas pela doação de animais.

Ao programa de biodiversidade PPBIO do Ministério da Ciência e Tecnologia pelo

auxílio financeiro.

E, a todos aqueles que contribuíram de modo direto ou indireto, a realização desta

dissertação.

“A persistência é o caminho do êxito”

Charles Chaplin

RESUMO

A Aniba canelilla (H.B.K) Mez, conhecida popularmente como “casca-preciosa” é uma espécie

da família Lauraceae que apresenta ampla distribuição na região amazônica. O chá das folhas e

das cascas são utilizados na medicina popular como digestivo, carminativo e antiinflamatório.

Neste estudo decidiu-se avaliar se esta atividade é devida a um de seus principais constituintes,

o 1-nitro-2-feniletano. A amostra – obtida por purificação do óleo essencial de Aniba canelilla

– possui 97,5% de 1-nitro-2-feniletano foi fornecida pelo Laboratório de Engenharia Química

da UFPA. Nos modelos de nocicepção foram realizados os testes da contorção abdominal,

placa quente e formalina. Enquanto que nos modelos de inflamação foram realizados a

dermatite induzido pelo óleo de croton, edema de pata induzido por dextrana e carragenina e

peritonite induzido pela carragenina. No teste de contorção abdominal induzido por ácido

acético, o 1-nitro-2-feniletano nas doses de 15, 25 e 50 mg/kg reduziu de maneira significativa

o número de contorções abdominais. No teste de placa quente (55 ± 0,5° C), o 1-nitro-2-

feniletano nas doses de 50, 100 e 200 mg/kg não induziu alterações no tempo de latência

quando comparado ao grupo controle. No teste de formalina, o 1-nitro-2-feniletano nas doses

de 25 e 50 mg/kg reduziu de maneira significativa o estímulo álgico na 2ª fase do teste. Além

disso, a antinocicepção foi revertida pela naloxona na segunda fase. Na dermatite induzida pelo

óleo de croton, o 1-nitro-2-feniletano nas doses de 25 e 50 mg/kg reduziu de maneira

significativa o eritema em relação ao grupo controle (inibição de 73% e 79%,

respectivamente). Nos edemas de pata induzido por carragenina e dextrana, o 1-nitro-2-

feniletano foi capaz de impedir o desenvolvimento do edema, nas doses de 25 e 50 mg/kg, em

comparação com o grupo controle. Na peritonite induzida por carragenina, o 1-nitro-2-

feniletano na dose de 25 mg/kg reduziu o número de células globais e o número de neutrófilos

quando comparado ao grupo controle (inibição de 22,55% e 38,13%, respectivamente). Nossos

resultados sugerem que o 1-nitro-2-feniletano tem atividade antinociceptiva e antiinflamatória,

provavelmente, de origem periférica, além disso, os resultados sugerem que os receptores

opióides estão envolvidos no efeito antinociceptivo do 1-nitro-2-feniletano.

Palavras-chave: Aniba canelilla; 1-nitro-2-feniletano; nocicepção; inflamação.

ABSTRACT

Aniba canellila is a large size tree found in Northern region of Brazil and largely used in folk

medicine. The infusate of its leaves and bark skin is believed to be a good antispasmodic,

antidiarreic, anti-inflammatory, tonic agent and a good stimulant of digestive and the central

nervous systems. This study was designed to evaluate the effects 1-nitro-2-phenylethane,

main component of Aniba canelilla. We evaluated the antinociceptive and anti-inflammatory

effects of the 1-nitro-2-phenylethane which is the main component of essential oil of Aniba

canelilla. For nociception models were designed the writhing test, hot plate test and formalin

test. For inflammation models were designed the croton oil-induced ear edema, rat paw edema

induced by carrageenan and dextran, and leucocyte and neutrophil migration on carrageenan-

induced peritonitis. In the writhing test, the 1-nitro-2-phenylethane dosed at 15, 25 and 50

mg/kg reduced the abdominal writhes in a significant manner. In the hot plate test (55 ± 0.5°

C), the 1-nitro-2-phenylethane dosed at 50, 100 and 200 mg/kg did not induced alterations in

the latency time when compared to the control. In the formalin test, the 1-nitro-2-

phenylethane dosed at 50 and 25 mg/kg reduced in a significant manner the second phase of

the algic stimulous. In addition, its antinociception was reversed by naloxone in the second

phase. The 1-nitro2-phenyletahne produced inhibition of rat paw edema induced by

carrageenan and dextran in a dose-dependent manner at the doses of 25 and 50 mg/kg. Doses

of 25 and 50 mg/kg caused a dose-dependent inhibition of croton oil-induced ear edema in

mice (with inhibition of 73% and 79%, respectively). Pretreatment (60 min) of rats with 1-

nitro-2-phenylethane (25 mg/kg) significantly decreased leucocyte and neutrophil migration

on carrageenan-induced peritonitis (with inhibition of 22,55% and 38,13%, respectively). Our

results suggest that 1-nitro-2-phenylethane has analgesic activity which, according to the tests

employed, is probably of peripheral origin. The mechanism involved is not completely

understood, however these results suggest that opiod receptors are involved in the

antinociceptive action of the 1-nitro-2-phenylethane. Further, our results suggest that 1-nitro-

2-phenylethane has anti-inflammatory activity which, according to the tests employed, is

probably of peripheral origin.

Keywords: Aniba canelilla, 1-nitro-2-phenylethane, nociception, inflammation.

SUMÁRIO

RESUMO _________________vii

ABSTRACT _________________viii

LISTA DE ILUSTRAÇÕES xii

LISTA DE ABREVIATURAS ______xiv

1. INTRODUÇÃO 15

1.1. PRODUTOS NATURAIS____ 15

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 17

2.1. FAMÍLIA LAURACEAE__________ 17

2.2. Aniba canelilla_____________ 17

2.3. 1-NITRO-2-FENILETANO_________________________________ 19

2.4. INFLAMAÇÃO________ 19

2.5. DOR_________________ 21

2.6. MEDIADORES DA RESPOSTA INFLAMATÓRIA 23

2.6.1. DERIVADOS DO ÁCIDO ARAQUIDÔNICO 23

a) PROSTAGLANDINAS_______________ 23

b) LEUCOTRIENOS____________________ 25

2.6.2. AUTACÓIDES________________________ 25

a) SEROTONINA_____________________ 25

b) HISTAMINA______________________ 26

2.7. NEUTRÓFILOS____________ 27

3. OBJETIVOS ____________ 29

3.1. OBJETIVOS GERAL____

3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS 29

4. MATERIAIS E MÉTODOS 29

4.1. MATERIAL BOTÂNICO 29

4.2. ANIMAIS 29

4.3. AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE____ 30

4.4. ESTUDO DA ATIVIDADE ANTINOCICEPTIVA 30

4.4.1. ATIVIDADE ANALGÉSICA PERIFÉRICA 30

4.4.2. ATIVIDADE ANALGÉSICA CENTRAL 31

4.4.3. TESTE DE FORMALINA_________ 31

4.5. ESTUDO DA ATIVIDADE ANTIINFLAMATÓRIA 32

4.5.1. DERMATITE INDUZIDA PELO ÓLEO DE CROTON 32

4.5.2. ESTUDO DA ATIVIDADE ANTI-EDEMATOGÊNICA 32

a) EDEMA DE PATA INDUZIDO POR DEXTRANA___ 32

b) EDEMA DE PATA INDUZIDO POR CARRAGENINA___ 32

4.5.3. PERITONITE EM RATOS INDUZIDO POR CARRAGENINA 33

4.6. ANÁLISE ESTATÍSTICA_______________________ 34

4.7. DROGAS, REAGENTES E SOLUÇÕES________________ 34

4.8. APARELHAGEM E MATERIAIS UTILIZADOS________ 35

5. RESULTADOS 36

5.1. TOXICIDADE AGUDA DL

_____________ 36

5.2. ESTUDO DA ATIVIDADE ANTINOCICEPTIVA 37

5.2.1. ATIVIDADE ANALGÉSICA PERIFÉRICA 37

5.2.2. ATIVIDADE ANALGÉSICA CENTRAL___ 37

5.2.3. TESTE DE FORMALINA_______________ 38

5.3. ESTUDO DA ATIVIDADE ANTIINFLAMATÓRIA

5.3.1. DERMATITE INDUZIDA PELO ÓLEO DE CROTON 40

5.3.2. EDEMA DE PATA INDUZIDO POR DEXTRANA 40

5.3.3. EDEMA DE PATA INDUZIDO POR CARRAGENINA 41

5.3.4. PERITONITE EM RATOS INDUZIDO POR CARRAGENINA 42

6. DISCUSSÃO 44

7. CONCLUSÃO__________________________________________________48

8. REFERÊNCIAS ____________ 49

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1: Aniba canelilla, flores e folhas_______________ ___18

Figura 2: 1-nitro-2-feniletano_ ___18

Figura 3: Local de administração da carragenina e dextrana na região intraplantar de ratos

_______________________________________33

Figura 4: Determinação da DL

em camundongos através da equação da reta. No eixo das

ordenadas: valores dos probitos, correspondentes ao percentual de mortes e, no eixo das

abscissas, as doses de 1-nitro-2-feniletano em escala logarítmica.

____________________________________________________________________36

Figura 5: Efeito do 1-nitro-2-feniletano sobre o estímulo nociceptivo induzido pela injeção

intraperitoneal de Ácido Acético 0,6% em camundongos__ ___37

Figura 6: Efeitos do 1-nitro-2-feniletano sobre o estímulo nociceptivo térmico (55± 0,1°C)

induzido em camundongos _____ _________38

Figura 7: Efeito do 1-nitro-2-feniletano, dependente de concentração, sobre a primeira fase do

estímulo nociceptivo induzido por Formalina 1% _____________________39

Figura 8: Efeito do 1-nitro-2-feniletano, dependente de concentração, sobre a segunda fase do

estímulo nociceptivo induzido por Formalina 1% _____________________39

Figura 9: Efeito do 1-nitro-2-feniletano sobre o estímulo inflamatório induzido pelo óleo de

croton em camundongos ______ ___40

Figura 10: Efeito do 1-nitro-2-feniletano (nas doses de 25 e 50 mg/kg) administrado por via

oral, em relação ao efeito antiedematogênico no teste de edema de pata induzido por dextrana

em ratos_____________________________________________________ ___41

Figura 11: Efeito do 1-nitro-2-feniletano (nas doses de 25 e 50 mg/kg) administrado por via

oral, em relação ao efeito antiedematogênico no teste de edema de pata induzido por

carragenina em ratos ___42

Figura 12: Efeito do 1-nitro-2-feniletano (nas doses de 25 e 50 mg/kg) administrado por via

oral, em relação ao efeito sobre a migração de células totais na peritonite induzida por

carragenina em ratos ______ ______ ___43

Figura 13: Efeito do 1-nitro-2-feniletano (nas doses de 25 e 50 mg/kg) administrado por via

oral, em relação ao efeito sobre a migração de neutrófilos na peritonite induzida por

carragenina em ratos__ ___43

Tabela 1: Efeito do 1-nitro-2-feniletano nas contorções induzidas por Ácido Acético 0,6%

_______________63

Tabela 2: Efeito do 1-nitro-2-feniletano no teste da placa quente em camundongos__63

Tabela 3: Efeito do 1-nitro-2-feniletano sobre a nocicepção induzida por Formalina 1% em

camundongos ________________________________64

Tabela 4: Efeito do 1-nitro-2-feniletano na dermatite induzida pelo óleo de croton

________________________________________ ___64

Tabela 5: Efeito do 1-nitro-2-feniletano na migração de leucócitos induzida por carragenina.

__________________________________________ ___65

Tabela 6: Efeito do 1-nitro-2-feniletano na migração de neutrófilos induzida por carragenina.

__________________________________________ ___65

LISTA DE ABREVIATURAS

5-HT

Serotonina

AINES

Antiinflamatórios não-esteroidais

ANOVA

Análise de variância

Interleucina

IL-8

Interleucina 8

COX

Ciclooxigenase

IL-1β

Interleucina 1β

Dose letal para 50% dos animais tratados

E.P. M

Erro padrão da média

I.P.

Intraperitoneal

TXA

Tromboxano A

IL-10

Interleucina 10

PGD

Prostaglandinas da série D

PGF

Prostaglandinas da série F

PGs

Prostaglandinas

PLA

Fosfolipase A

5-LOX

5-lipoxigenase

PGE

Prostaglandinas da série E

PGI

Prostaglandinas da série I

PAF

Fator Ativador Plaquetário

Óxido nítrico

iNOS

Óxido nítrico sintetase induzida

TNF-α

Fator de Necrose Tumoral alfa

V.O.

Via oral

P.O.

Per oral

S.C.

Subcutânea

NF-κB

Fator nuclear κB

NOS

Sintetase do óxido nítrico

GMPc

Guanosina monofostato cíclico

AMPc

Monofosfato cíclico de 3’5’-adenosina

Bradicinina

LTB4

Leucotrieno B4

1 Introdução

1.1 Produtos Naturais

A utilização de produtos naturais como matéria prima para a produção de substâncias

com atividade biológica, especialmente os fármacos, tem sido extensamente relatado ao longo

dos anos (PIETROVSKI, 2004).

Os produtos naturais representam fontes de diversidades moleculares na descoberta de

drogas. Ainda permanece urgente a necessidade para identificar novos quimiotipos para

conduzir o desenvolvimento em muitas áreas terapêuticas. Entre o desafio para a tentativa de

diversidade de produtos naturais é preciso permanecer competitivo com substâncias sintéticas.

Avanços significativos são realizados para a formação de enzimas adaptadas envolvidas na

biossíntese de produtos naturais, além de novas estruturas que produzem substituintes não

naturais (ZHANG, C. et al, 2006).

Enquanto os produtos naturais representam uma rica fonte de compostos

terapeuticamente aproveitáveis, o interesse no desenvolvimento de produtos naturais pela

indústria farmacêutica tem declinado. Entretanto, os produtos naturais permanecem

biologicamente validados e, como tal, devem proporcionar uma boa produção de opções

terapêuticas. Se os produtos naturais são mais uma vez interesse de extensa descoberta de

drogas no mundo, eles precisam ser utilizados ao alcance de conduzir novos padrões de

produção terapêutica (QUINN et al, 2008).

Os produtos naturais têm contribuído fortemente no desenvolvimento de novas

estratégias terapêuticas através de seus metabólitos secundários. Estes são conhecidos por

atuar de forma direta ou indireta no organismo podendo inibir ou ativar importantes alvos

moleculares e celulares, por exemplo: mediadores inflamatórios (metabólitos do ácido

araquidônico, peptídeos, citocinas, aminoácidos excitatórios, entre outros), sobre a produção

ou ação de segundos mensageiros (como GMPc, AMPc, proteínas quinases, etc.), na

expressão e transcrição de fatores como AP-1, NF-κB, e proto-oncogenes (c-jun, c-fos e c-

myc), e na expressão de células pró-inflamatórias como sintetase do óxido nítrico (NOS),

ciclooxigenase (COX-2), citocinas (IL-β, TNF-α, etc.), neuropeptídeos e proteases

(CALIXTO et al, 2003).

Desta forma, nos últimos anos, tem-se evidenciado um crescente aumento no estudo

de plantas preconizadas pela medicina popular para validar a sua utilização como fitoterápico

seguro e eficaz, tendo em vista que o uso popular de uma determinada planta não é suficiente

para validá-la como fitoterápico. Deste modo, o emprego de técnicas modernas de

farmacologia, bioquímica, toxicologia e biologia molecular renovaram o interesse na procura

de novos medicamentos ou de protótipos de novos fármacos a partir de produtos naturais

(CALIXTO, 2000).

A partir da medicina popular, foram realizados estudos com o óleo essencial de Aniba

canelilla no laboratório de Farmacodinâmica da Universidade Federal do Pará, nos quais

foram demonstrados atividades antinociceptiva e antiinflamatória daquele. Portanto, decidiu-

se avaliar se estas atividades são devido a um de seus principais componentes, o 1-nitro-2-

feniletano.

2 Revisão Bibliográfica

2.1 Família Lauraceae

A Lauraceae é uma importante família de árvores e arbustos com registro que se

estende ao período Cretáceo (HU et al, 2007). A família Lauraceae é constituída por 30

gêneros, com distribuição marcadamente tropical e subtropical, com ocorrência em todo

mundo, especialmente as florestas centro e sul-americanas e, em sua maioria, espécies

lenhosas arbóreas. As espécies aromáticas de Lauraceae estão compreendidas principalmente

entre os gêneros Aniba, Nectandra, Octea, Licaria e Dicypellium (MARQUES, 2001).

O gênero Aniba compreende cerca de 41 espécies cujos representantes se encontram

em sua maioria na Amazônia. Algumas espécies são exploradas para a preparação de produtos

medicinais, óleos essenciais, e outras que são considerados potencialmente no lenho e na

casca (MELO et al, 2006).

Uma revisão da literatura revelou que a destilação da madeira de Aniba spp cresceu na

Amazônia brasileira. Ela é conhecida popularmente como óleo de pau-rosa. Toxicidade

bacteriana e fúngica foram descritos para os óleos. Outros componentes presentes no gênero

Aniba incluem os alcalóides, neoligninas e flavonóides, sem atividade antimicrobiana relatada

(KLAUSMEYER et al, 2004).

Foi demonstrado que a Aniba riparia, a qual é conhecida popularmente no Brasil

como “louro” apresenta atividade sobre o sistema nervoso central, com efeitos ansiolíticos,

demonstrando elevada confusão e dificuldade motora em camundongos (MELO et al, 2006).

Simic et al (2004) mostraram que a atividade antifúngica do óleo essencial Aniba

roseadora era devido à presença do linalol.

2.2 – Aniba canelilla

Segundo PINTO (1995), o primeiro contato com a Aniba canelilla foi obra do acaso,

quando os irmãos Francisco e Gonzalo Pizarro ouviram uma história fantástica de que existia

uma terra do outro lado da muralha andina onde a canela (Cinnamomum zeylanicum) crescia

por profusão.

Esta possibilidade os fez imaginar que poderiam romper o monopólio da canela, a

qual, na época estava nas mãos dos portugueses e era a especiaria mais procurada no mercado

europeu, tornando seu comércio bastante lucrativo (PINTO, 1995).

Nesta tentativa, Gonzalo Pizarro saiu à procura de canela a frente de um exército de 80

espanhóis e avançou a pé, mata adentro, na região Amazônica. Após dois meses de busca

Pizarro e seus homens julgaram ter encontrado algumas árvores de canela e ter findado a

busca, mas foram traídos pelo olfato, pois o aroma da planta encontrada muito se assemelhava

ao da canela. Na realidade não se tratava do Cinnamomum zeylanicum. Pizarro havia feito o

primeiro contato com a casca preciosa, a Aniba canelilla (GOTTLIEB & MAGALHÃES,

1978).

A Aniba canelilla (H.B.K) Mez (Figura 1), conhecida popularmente como casca-

preciosa, casca-do-maranhão, canela-cheirosa, folha preciosa, pau cheiroso, é uma espécie da

família Lauraceae que apresenta ampla distribuição na região amazônica. O chá das folhas e

cascas é utilizado na medicina popular como digestivo, carminativo e antiinflamatório

(MAIA, ZOGHBI & ANDRADE, 2001).

No óleo essencial da casca da Aniba canelilla foi avaliada a função gastrintestinal no

músculo liso do íleo de cobaio, promovendo a inibição das contrações induzidas por potássio,

acetilcolina e histamina e, revertendo às contraturas induzidas por potássio e tetraetilamônio,

demonstrando, deste modo, uma atividade antiespasmódica (SOUSA et al., 2004).

Este mesmo óleo quando administrado em ratos normotensos apresentou efeito

hipotensor devido a um relaxamento vascular ativo, sem interferir com o tono simpático, a

bradicardia pareceu depender da presença de um impulso parassimpático funcional e

operacional para o coração (LAHLOU et al, 2005).

Fonte: http://www.sbq.org.br/PN-NET/causo10.htm

Figura 1: Folhas e flores da

Aniba canelilla.

2.3 1-nitro-2-feniletano

Do óleo essencial de Aniba canelilla foi isolado e identificado o único nitro derivado

odorífero conhecido até hoje, o 1-nitro-2-feniletano que se encontra em todos os órgãos da

planta, além do eugenol, metileugenol e safrol. A presença de 1-nitro-2-feniletano distingue a

espécie Aniba canelilla das demais, em toda a família Lauraceae (GOTTLIEB &

MAGALHÃES, 1960).

O componente principal do óleo essencial de Aniba canelilla (H.B.K) Mez, o 1-nitro-

2-feniletano, é o responsável pelo odor de canela. O percentual deste componente na Aniba

canelilla (H.B.K) Mez difere de acordo com a estação do ano. No período chuvoso, o 1-nitro-

2-feniletano atinge valores próximos de 95%. Enquanto na época seca, o 1-nitro-2-feniletano

diminui para 39% (TAVEIRA et al., 2003).

2.4 Inflamação

A inflamação é uma reação complexa envolvendo componentes celulares e

moleculares. É uma resposta inespecífica a uma agressão específica. O agente responsável

pela agressão pode ter natureza química, física ou biológica (ZHOU et al., 2007).

A inflamação aguda em indivíduos normais é normalmente um mecanismo de

proteção localizada em resposta a invasão microbiana, trauma/injúria ou estímulo químico.

Quando a resposta inflamatória é excessiva e prolongada pode levar as diversas desordens que

formam as patogêneses mais prevalentes, como as doenças reumáticas, diabetes, doença de

Alzheimer e aterosclerose (SERHAN & CHIANG, 2004).

O acúmulo e a ativação de leucócitos são as maiores desordens inflamatórias. Existe

grande distância entre o controle de eventos pelo mediador químico endógeno e a resposta do

hospedeiro. Estes pequenos sinais químicos regulam o tráfico de leucócitos como os sinais

Figura 2: 1-nitro-2-feniletano

cardinais da inflamação – são eritema, dor, calor, edema e perda de função da área lesionada.

Estes sinais são provenientes da dilatação de arteríolas e aumento da permeabilidade vascular

por ação de mediadores inflamatórios. Há o aumento do fluxo sanguíneo na área lesada

produzindo calor e eritema. Com aumento da temperatura, as reações metabólicas ocorrem

com maior rapidez e liberam calor adicional. O edema surge com aumento da permeabilidade

(VERGNOLLE, 2008).

Esses efeitos são estabelecidos por eicosanóides clássicos, como as prostaglandinas e

leucotrienos, que exercem importantes funções como mediadores locais e exercem expansivas

ações em reposta de interesse na inflamação. Nos anos recentes, o alcance e o conjunto de

mediadores químicos têm sido identificados consideravelmente. Esse conjunto inclui novos

mediadores, novas citocinas (interleucina–10, fator de crescimento β), gases (óxido nítrico),

como também novas funções para nucleosídeos e nucleotídeos (SERHAN & CHIANG,

2004).

Os mediadores da inflamação, portanto, são substâncias formadas e liberadas,

concomitante ou sequencialmente, no local da lesão. A origem destes mediadores pode ser

plasmática (fatores do complemento e bradicinina) ou celular (histamina, serotonina,

prostaglandinas, fator ativador plaquetário (PAF), leucotrienos, citocinas, etc). Os mediadores

estão envolvidos na gênese e manutenção dos eventos característicos da reação inflamatória e

se ligam a receptores específicos nas células-alvos podendo, inclusive, estimular a liberação

de outros mediadores (ZHOU et al., 2007).

Além disso, muitos mediadores inflamatórios provocam mudanças na excitabilidade

do neurônio. Entre os mediadores envolvidos estão: histamina, serotonina, adenosina,

bradicinina, citocinas (interleucina–1–beta, interleucina–6), leucotrienos, nervo de

crescimentos neural, prostaglandinas, óxido nítrico e mais recentemente as serinas proteases.

Esses mediadores induzem despolarização da membrana, diminuição na condutância da

membrana, elevação da excitabilidade ou supressão da hiperpolarização após os potenciais de

ação. Os mediadores inflamatórios provocam ativação direta sobre reflexo os nociceptores

periféricos, causando hipersensibilidade imediata (VERGNOLLE, 2008).

Os principais componentes para o desenvolvimento da inflamação são: (i) vaso

dilatação; (ii) aumento da permeabilidade vascular; (iii) ativação e adesão celular; (iv) e

coagulação (SAYERS, 2002).

O resultado da ativação de leucócitos para migrarem para o tecido é atuarem contra

agentes nocivos. Isto é uma resposta benéfica “normal” que é essencial para a sobrevivência,

além de reparar e curar o tecido. Os eventos celulares envolvem a adesão de leucócitos à

parede do endotélio e subseqüente migração de neutrófilos para o interior dos tecidos

(SAYERS, 2002).

Os efetores da resposta inflamatória são citocinas como o fator de necrose tumoral α

(TNF-α) e várias interleucinas (ILs). As citocinas são produzidas por uma variedade de

células envolvidas na resposta inflamatória, incluindo macrófagos, neutrófilos de células

endoteliais, os quais têm uma variedade de efeitos, inserindo expressão da molécula de

adesão, quimiotaxia e ativação de outras vias inflamatórias (coagulação, complemento,

cininas e fibrinólise). Esta resposta local é firmemente controlada pela produção de

interleucinas antiinflamatórias (IL-10) e antagonista endógeno (SAYERS, RD, 2002).

O fator nuclear κB (NF-κB) representa a família de fatores de transcrição eucariótica,

regulados pela expressão de genes envolvidos em proliferação celular, resposta inflamatória e

adesão de células (NIEDERBERGER et al, 2001).

A ativação do NF-κB foi relatada para induzir transcrição de múltiplos mediadores

pro-inflamatórios, como o iNOS, COX-2, TNF-α, and IL-1β, os quais são envolvidos na

patogenia da doença inflamatória (HUTTI et al, 2007).

Devido à função crítica do NF-κB na expressão do gene inflamatório, o NF-κB é alvo

corrente no tratamento de várias doenças inflamatórias. Drogas antiinflamatórias

demonstraram inibição da expressão de citocinas inflamatórias pela inibição da via da

ativação de NF-κB (HAYDEN & GHOSH, 2004). Portanto, um inibidor do NF-κB é uma

droga terapêutica em potencial na aplicação clinica para regular a resposta imune em doença

inflamatória (HUTTI et al, 2007).

2.5 Dor

A dor é uma sensação de experiência desagradável que acontece quando o tecido é

lesionado. Deste modo, a sensação de dor protege o corpo de uma possível ameaça ou lesão.

A transdução do estímulo doloroso ocorre nas terminações nervosas das fibras C não-

mielinizadas e nas fibras Aδ mielinizadas. A maioria dos nociceptores responde a estímulos

mecânicos, térmicos e químicos, razão pela qual são chamados de nociceptores polimodais

(YUNJONG LEE et al, 2005).

O estímulo nóxico de uma intensidade suficiente para causar lesão tecidual está

associado à liberação de numerosos mediadores inflamatórios. Alguns desses mediadores

estimulam diretamente nociceptores periféricos. Recentes avanços na pesquisa com canais

iônicos em neurônios sensoriais revelaram mecanismos moleculares essenciais, para a

transmissão de vários tipos de sinais neurais, os quais são conduzidos do encéfalo para o local

de percepção da dor (JULIUS & BASBAUM, 2001).

Vários mediadores químicos conhecidos presente no local lesado podem estimular os

nociceptores e, portanto, promover a dor. Dentre os mediadores inflamatórios incluídos neste

grupo estão a histamina (que também causa prurido) e a bradicinina (BK). A BK atua através

de receptores ligados à proteína G, produzindo uma variedade de efeitos pró-inflamatório que

inclui vasodilatação e edema (MAYER, 2006). A bradicinina também estimula atividade

enzimática da fosfolipase A

ligada à membrana que, por sua vez, provoca a desesterificação

da membrana levando à liberação do ácido araquidônico livre (ácido ecosatetraenóico) e à

biossíntese subseqüente de prostaglandinas (por exemplo, PGE

e prostaciclinas, PGI

) pela

ciclooxigenase (COX). As prostaglandinas são potentes vasodilatadoras e importantes

mediadores na dor inflamatória (WIENECKE, 2008).

A dor pode resultar de vários fatores, como aumento da pressão, devido ao edema,

sobre tecidos e terminações nervosas; de lesão das fibras nervosas; da irritação tóxica

produzidas por microorganismos ou extravasamento de substâncias intracelulares de células

lesadas e, também por cininas que afetam terminações nervosas. As prostaglandinas

intensificam a dor associada à inflamação (ROCHA et al, 2007).

A dor é desencadeada pela ativação de nociceptores específicos (dor nociceptiva).

Entretanto, ela pode ser resultante de lesão de fibras sensoriais, ou dano ocasionado no

sistema nervoso central (MILLAN, 2002). A dor pode ser subdividida em aguda e crônica. A

dor aguda é de curta duração, geralmente persistente apenas no período de duração do dano

tecidual e representa uma reação fisiológica natural do organismo. A dor crônica é evidente

quando cessa a função dos mecanismos normais de cicatrização e em doenças como artrite

reumatóide pode persistir por semanas, meses ou até mesmo anos (PAGE et al., 2004).

A dor não é uma entidade isolada, ela difere essencialmente nas causas que variam de

acordo com sintomas e mecanismos neurobiológicos. Em curso de escala, três formas de dor

podem ser distinguidas (ZEILHOFER, 2007).

A dor nociceptiva originada da ativação de neurônios nociceptivos primários, os quais

têm função fisiológica importante como a proteção da lesão tecidual. A dor de origem

inflamatória origina todas as formas de inflamação. Finalmente, a dor neuropática originada

de uma lesão tecidual de origem periférica ou de nervos e neurônios centrais. A dor

neuropática é acompanhada por dor espontânea intensa e dor provocada por leve estímulo. A

dor inflamatória e a dor neuropática podem exceder a duração da causa primária da dor. Elas

podem se tornar síndromes de dor crônica (ZEILHOFER, 2007).

2.6 Mediadores da resposta inflamatória

2.6.1. Derivados do ácido araquidônico

A estimulação das membranas celulares induz a liberação, via ação da fosfolipase A

(PLA

) do ácido araquidônico, de um ácido graxo insaturado que contém vinte carbonos e

quatro duplas ligações. A seguir ocorre a sua biotransformação à prostaglandinas (PGs), via

ação de ciclooxigenase (COX), a leucotrienos via ação das lipoxigenases, entre outras

substâncias (WANG et al, 2007).

Os metabólitos do ácido araquidônico formados através das vias da ciclooxigenase e

lipoxigenase representam importantes classes de mediadores inflamatórios. A prostaglandina,

em particular a PGE

, é conhecida por causar ou aumentar os sinais cardinais da inflamação.

O ácido araquidônico provoca uma resposta inflamatória intensa, a qual é afetada por

inibidores da lipoxigenase e da ciclooxigenase (SANJITA et al, 2008).

a) Prostaglandinas

As prostaglandinas estão envolvidas em processos fisiológicos e patológicos,

incluindo vasodilatação ou vasoconstrição, contração e relaxamento da musculatura brônquica

e uterina, hipotensão, ovulação, metabolismo ósseo, aumento do fluxo sanguíneo renal

(resultando em diurese, natriurese e estimulação da renina), supressão da secreção ácido

gástrica, hiperalgesia, regulação de atividade quimiotática celular, resposta endócrina e

angiogênese, entre outros (HILÁRIO et al, 2006).

No trato gastrintestinal, as prostaglandinas I2 e E2 são citoprotetoras da mucosa

gástrica, porque diminuem a secreção ácido gástrica, aumento do fluxo sanguíneo local,

estimulam produção de muco e aumento da síntese de glutationa (e consequentemente

capacidade de eliminar radicais livres), além de aumentar a síntese de bicarbonato e de fluxo

sanguíneo na superfície da camada da mucosa gástrica. Nos rins, as prostaglandinas

aumentam a filtração glomerular porque possuem efeito vasodilatador. Finalmente, dentro do

sistema cardiovascular, eles podem causar severos efeitos hemodinâmicos com a

vasodilatação (HILÁRIO et al, 2006).

As prostaglandinas também têm efeitos fisiopatológicos, como eritema e aumentos do

fluxo sanguíneo local, hiperalgesia, provavelmente devido à sensibilização de nociceptores,

aumento da temperatura corporal através de estimulação de citocinas sobre o hipotálamo.

Quando a produção de prostaglandinas é aumentada, há o aumento da sensibilidade à dor e

febre, além da resposta inflamatória aumentada. Todavia, as prostaglandinas também são

capazes de ação antiinflamatória devido a supressão da síntese de IL-1 e síntese de TNF

(HILÁRIO et al, 2006).

Em 1971, um trabalho pioneiro realizado por Vane e colaboradores identificou a

inibição da síntese de prostaglandinas como mecanismo de ação do ácido acetilsalicílico

(aspirina) e relatou as drogas antiinflamatórias não esteroidais (AINES). Essa inibição ocorre

através da inibição de duas ciclooxigenases, uma constitutivamente expressada (COX-1) e

uma induzida, a COX-2. Ambas as enzimas são formadas pelo ácido araquidônico, o qual é

liberado devido à lesão tecidual que promove a ativação de fosfolipase A

. A expressão

aumentada de COX-2 é associada com vários fatores fisiopatológicos, incluindo doenças

inflamatórias e diferentes cânceres (HARPER & TYSON-CAPPER, 2008). O terminal

tecidual de prostaglandina sintetase ou isômeros, em seguida, convertem PGH

em diferentes

prostaglandinas ativadas (PGD

, PGE

, PGF

, PCI

) e tromboxano A

(TXA

), coletivamente

chamados de prostanoides (ZEILHOFER, 2007).

Além das duas enzimas, foi descrita por Chandrasekharan em 2002 a COX-3, o qual

pode ser uma variação da COX-1. Nos seres humanos o RNAm da COX-3 é expresso em

maior quantidade no córtex cerebral e no coração.

Os AINES bloqueiam ambas as enzimas e induzem o aparecimento de graves efeitos

adversos como sangramento gastrintestinal, alterações renais e nos mecanismos de hemóstase,

resultado da inibição da atividade da prostaglandina E

sintetase. Essas alterações, que

parecem ser decorrentes da inibição da COX-1, levaram à busca de inibidores mais seletivos,

o que resultou no surgimento de drogas mais seletivas para COX-2 (SCHOLICH &

GEISSLINGER, 2006).

Inibidores seletivos e específicos para COX-2 foram desenvolvidos na tentativa de

reduzir os efeitos da inibição da COX-1 (BRUNE & HINZ, 2004). Esses inibidores incluem o

piroxicam, meloxicam, diclofenaco, naproxeno e nimesulida (primeira geração dos inibidores

de COX-2), e celecoxib, etoricoxib, valdecoxib, parecoxib e lumaracoxib (segunda geração,

mais específico, seletivo para inibidores de COX-2) (VAN HECKEN et al, 2000).

Rofecoxib e celecoxib foram os primeiros inibidores seletivos da COX-2 aprovados

pelo FDA (Food and Drug Administration) para tratamento de artrite reumatóide, osteoartrite

e alívio da dor aguda (CAPONE et al, 2003). Contudo, estes inibidores seletivos de COX-2

inibem a PGI

que tem efeitos protetores sobre o sistema vascular. A PGI

atenuada pode

explicar a maior incidência de ataques cardíacos e acidente vascular cerebral entre aqueles

que tomam estes fármacos (SCHOLICH & GEISSLINGER, 2006).

b) Leucotrienos

Os leucotrienos são uma família de substâncias farmacologicamente ativas e potentes

derivadas do ácido araquidônico por ação de 5-lipooxigenases. Estas são enzimas solúveis

localizadas no citosol e encontradas predominantemente nos pulmões, plaquetas, células

endoteliais, monócitos, mastócitos, eosinófilos e linfócitos B (MONTUSCHI, 2007).

A via da 5-lipoxigenase (5-LOX) é associada com uma variedade de doenças

inflamatórias incluindo asma, arteriosclerose, artrite reumatoide, dor, câncer e fibrose

hepática. Muitas classes de inibidores da 5-lipoxigenas foram identificados, mas apenas uma

droga, o zileuton, um inibidor redox da 5-LOX, foi aprovado para uso clínico (ZWEIFEL et

al, 2008).

Os leucotrienos são potentes mediadores pro-inflamatórios, estimulam diretamente e

indiretamente proliferação de fibroblastos e síntese de colágeno (WAN & WUF, 2007). Os

leucotrienos consistem em diidroxi leucotrieno LTB4 e cistenil leucotrienos LTC4, LTD4 e

LTE4, por ação de receptores expressos em superfícies de células inflamatórias e em paredes

de vasos. Os leucotrienos induzem ativação de leucócitos e quimiotaxia com alta e baixa

afinidade pelos receptores BLT1 e BLT2, respectivamente (BÄCK, 2006).

O leucotrieno B4 (LTB-4) é um lipídio inflamatório derivado da membrana de

fosfolipídios pela seqüência de ação da fosfolipase A2 citosolica, 5-lipoxigenase e leucotrieno

A4 hidrolase. Muitas doenças inflamatórias são associadas com elevados níveis de LTB-4

como asma, doença pulmonar obstrutiva crônica e artrite (HICKS et al, 2007).

2.6.2. Autacóides

a) Serotonina

A serotonina (5-hidroxitriptamina ou 5-HT) é sintetizada a partir do triptofano numa

reação mediada por triptofano sintetase. Encontrada em células enterocromafins instestinais,

plaquetas humanas, mastócitos de ratos, mas não de humanos, e sistema nervoso central, a

amina possui multiplicidade de ações biológicas em função da variedade de receptores

farmacológicos (GERSHON, 2004). A maior fonte de serotonina está nos neurônios entéricos

do trato gastrintestinal, em particular os interneurônios. A 5-HT tem sido reconhecida como

um mediador endógeno da resposta inflamatória em tecidos periféricos. As ações de

serotonina são traduzidas por uma larga família de receptores serotoninérgicos divididos em

sete classes (5-HT

–5-HT

) (WOUTERS et al, 2007).

A serotonina tem funções rigorosas distintas no trato gastrintestinal, atuando como

fator parácrino, traduzindo informação das células enterocromarfins para neurônios aferentes

primários (GERSHON, 2004) e para células adjacentes na mucosa e submucosa (ZHU et al,

2001). Além disso, a serotonina é um neurotransmissor (KIM et al, 2000).

A indução de hiperalgesia por carragenina sugere que os subtipos de receptores 5-

e 5-HT

parecem ter efeito facilitatório no processamento do mecanismo nociceptivo

na espinha dorsal de ratos (ZHANG, Y. et al., 2001). Estes dados reforçam o aumento da

participação de 5-HT

na resposta nociceptiva (PARADA et al., 2001).

b) Histamina

A histamina foi descoberta em 1910 por Dale & Laidlaw e foi caracterizada como

mediador da resposta anafilática em 1932. A histamina, mediador armazenado em mastócitos

juntamente com 5-HT, é uma amina formada a partir da histidina por ação da histidina

descarboxilase e encontrada em vários tecidos. Tem ampla distribuição tecidual, mas está

concentrada principalmente nos pulmões, pele e trato gastrintestinal. É liberada através da

interação de antígenos com imunoglobulina E na superfície de células mastocitárias, deste

modo, desempenhando uma função central na hipersensibilidade imediata e respostas

alérgicas. Suas ações fisiológicas resultam de ação em quatro receptores farmacológicos

denominados H

e H

(MAINTZ & NOVACK, 2007) e H

(RABER, 2007), sendo que

todos os receptores atuam sobre a família da acoplados a proteína G (THURMOND et al,

2008).

Os receptores H

são acoplados a proteína G induzem a ativação de fosfolipase C,

produção de fosfato de inositol e mobilização de cálcio. Os receptores H

ativam a proteína G,

aumentando a formação de AMP cíclico (BAKKER et al, 2002). Os receptores H

são

mediados pela proteína e induzem a inibição da formação do AMP cíclico, aumentando a

mobilização de cálcio e ativando a proteína quinase ativadora de mitógeno (MAPKs) (LEURS

et al, 2005). Os receptores H

atuam ao inibir a formação de AMP cíclico (THURMOND et

al, 2008).

A histamina tem participação importante em fenômenos inflamatórios. Na rinite

alérgica e na asma, a administração de bloqueadores dos receptores H

reduz a sintomatologia

inflamatória. Tem ação vasodilatadora pronunciada. A histamina induz síntese de PGI

e NO

que produzem vasodilatação, além do aumento da permeabilidade vascular, principalmente

pela ação sobre as vênulas pós-capilares. Provoca vasoconstrição dos músculos intestinais e

brônquicos (FOGEL et al, 2005; CHIMONA et al, 2008).

Existem quatro classes de antagonistas da histamina: os antagonistas dos receptores

, H

e H

. O primeiro grupo – afeta mecanismos inflamatórios e alérgicos – é

representado por antagonistas H

de primeira geração (difenidramina, mepiramina, entre

outros) e de segunda geração (loratadina, terfenadina, entre outros) (THURMOND et al,

2008).

A histamina é também encontrada nas células parietais da mucosa gástrica, onde atua

sobre receptores H

. Os antagonistas de receptores H

são eficazes na cura de úlceras

gastrintestinais através da inibição da secreção ácido gástrica. Eles são representados por

cimetidina, ranitidina, nizatidina e famotidina (LEFRANC, 2006).

A histamina é encontrada no cérebro em menor quantidade do que em outros tecidos,

como a pele e pulmões. A liberação endógena de histamina no cérebro é regulada pelos

receptores H

. No SNC, os receptores H

são frequentemente expressos como auto-receptores

pré-sinápticos (RABER, 2007). Estes receptores histaminérgicos são exclusivamente

encontrados no núcleo tuberomamilar do hipotálamo posterior e são transmitidos por quase

toda região do encéfalo (TASHIRO & YANAI, 2007).

Os receptores H

não são frequentemente expressos como os outros receptores

histaminérgicos. Eles estão envolvidos em liberação de agentes quimiotáticos e de mediaores

inflamatórios por eosinófilos, mastócitos, monócitos, células dendríticas e células T CD

sugerindo uma importante função no sistema imune (RABER, 2007; HUANG &

THURMOND, 2008).

2.7 Neutrófilos

O recrutamento de neutrófilos para o tecido injuriado é essencial para a inflamação e

para a defesa contra a infecção, mas ao mesmo tempo pode prejudicar a cura da lesão. Um

mecanismo para a regulação dessa dualidade é promovido por lipídios autacóides, os quais

atuam limitando a ativação de leucócitos e promovendo a resolução da inflamação

(GRONERT, 2008).

O agrupamento de neutrófilos da circulação para o sítio inflamatório envolve muitos

eventos, os quais se iniciam com o rolamento ao longo da parede da célula endotelial mediada

predominantemente por L-, P-, e E-selectinas. Em seguida, os neutrófilos são ativados por

quimiocinas liberadas por células inflamatórias presentes no endotélio. Isto induz ao aumento

de integrinas, cuja função é mediar a adesão firme de neutrófilos nas células endoteliais. O

ICAM-1 e o VCAM são exemplos de célula de adesão (RITTNER et al, 2005).

Na fase inicial da dor neuropática periférica, os neutrófilos também exercem papel

importante tendo sido demonstrado que a sua depleção, ao mesmo tempo em que ocorre a

injúria neuronal, atenua a indução da hiperalgesia térmica durante a depleção. Entretanto, em

animais onde não é feita a depleção de neutrófilos, a resposta inflamatória pode estabelecer-se

e, mesmo após oito dias, a depleção de neutrófilos não terá mais efeito sobre a hiperalgesia

(PERKINS & TRACEY, 2000).

Segundo os autores, isto ocorre porque, nesta fase, os macrófagos e seus mediadores

são provavelmente mais importantes que os neutrófilos na manutenção da hiperalgesia. Parece

que os neutrófilos contribuem para a fase inicial da dor neuropática periférica através da

liberação de mediadores algésicos, os quais sensibilizariam os nociceptores assim como

estimulariam a liberação de fatores quimiotáticos, que recrutariam outras células do sistema

imune, entre as quais os próprios macrófagos.

Os neutrófilos endoneurais podem agir no sítio da injúria nervosa para induzir

hiperalgesia diretamente, através da liberação de mediadores que sensibilizam ou ativam

nociceptores aferentes, e também podem agir indiretamente, induzindo a liberação de

mediadores algogênicos de outros tipos celulares (ZUO et al, 2003).

3 Objetivos

3.1 Objetivo geral

Avaliar o 1-nitro-2-feniletano – o principal constituinte da Aniba canelilla – quanto à

toxicidade aguda e, se este constituinte é o responsável pelas atividades antinociceptiva e

antiinflamatória produzidas pelo óleo essencial.

3.2 Objetivos específicos

Determinar da toxicidade aguda (DL

) do 1-nitro-2-feniletano.

Avaliar a atividade anti-nociceptiva do 1-nitro-2-feniletano.

Estudar a atividade anti-edematogênica do 1-nitro-2-feniletano.

Caracterizar o efeito do 1-nitro-2-feniletano na dermatite induzida pelo óleo de croton.

Determinar a atividade antiinflamatória do 1-nitro-2-feniletano na peritonite induzida por

carragenina.

4 Materiais e Métodos

4.1 Material botânico

As amostras de plantas foram coletadas na reserva Cauaxi, município de Ulionópolis,

Estado do Pará em maio de 2005. O exemplar da espécie foi identificado por comparação

autêntica (MG 174904) de Aniba canelilla, que está registrada no herbário João Murça Pires

do Museu Paraense Emílio Goeldi, em Belém, Pará.

O 1-nitro-2-feniletano, com um grau de pureza de 97,5%, foi doado pelo laboratório

de Engenharia Química da UFPA. Este constituinte foi obtido por purificação do óleo

essencial da casca da madeira de Aniba canelilla.

4.2 Animais

Foram utilizados camundongos machos (Mus musculus) adultos (25-40g) e ratos

(Rattus norvegicus) machos pesando entre 180 e 300 g. Os animais, provenientes do Instituto

Evandro Chagas (Belém), foram alojados no Biotério Setorial do Faculdade de Farmácia da

Universidade Federal do Pará (UFPA). Estes foram alojados em gaiolas, mantidos sob

condições controladas de temperatura (25ºC) e ciclo de claro/escuro de 12h: a fase clara

iniciando-se às 6h e terminando às 18h, com livre acesso a água e ração tipo ad libitum. Antes

da realização de cada teste, os animais foram deixados em jejum por um período de 12horas.

O manuseio e uso dos animais estão de acordo com as normas institucionais (Parecer

MED010/2008).

4.3 Avaliação de toxicidade aguda (DL

)

Avaliação da DL

- para determinação da DL

foram utilizados camundongos (Mus

musculus) Swiss albinos machos divididos em grupos de 10 animais, os quais pesavam entre

20-30 g. Cada grupo foi mantido em jejum de 12 h e, em seguida, receberam, através de

cânula orogástrica, as doses 500, 600, 750 e 1000 mg/kg diluído em Tween 80 a 1%. Em

seguida, os animais foram observados por um período de 4 h para avaliação de possíveis

alterações comportamentais.

Segundo o teste descrito por Malone e Robichaud (1962) os parâmetros

comportamentais observados foram: atenção, alerta, analgesia, atividade motora espontânea,

locomoção, falta de apetite, apatia, resposta ao tato, secreção nasal, piloereção, estereotipia,

agressividade, ataxia, sudorese, micção, diarréia e convulsão.

Após este período, os animais foram tratados com ração e água ad libitum e

observados por um período adicional de 24, 48 e 72 h. Os casos de morte foram anotados para

cada grupo e expresso em percentual do número total de animais tratados. A determinação da

foi feita através da conversão da porcentagem de mortalidade dos animais em probitos,

traçando assim a equação da reta em função dos valores das doses em escala logarítmica.

4.4 Estudo da atividade antinociceptiva

4.4.1 Atividade analgésica periférica

As contorções abdominais, descritas de acordo com o método de Koster et al (1959),

foram induzidas em camundongos através da administração de ácido acético 0.6% i.p. em

volume de 0.1 mL a cada 10 g de peso do animal. A reação do animal a esse estímulo é o

desenvolvimento de movimentos repetidos de contração da parede abdominal, rotação do

corpo e extensão das patas traseiras. Este conjunto de reações é denominado contorções

abdominais e a intensidade da nocicepção é quantificada como o número total de contorções

abdominais durante o período de observação de 20 minutos iniciando-se 10 minutos após a

administração do ácido acético. Os animais, durante o tempo de observação, foram contidos

em funis de vidro com diâmetro de aproximadamente 22 centímetros . O 1-nitro-2-feniletano

(15, 25, e 50 mg/kg; p.o.) foi administrado uma hora antes da administração do agente

nociceptivo. Um grupo de animais recebeu solução salina e Tween 80 a 1% (p.o., grupo

controle). A droga padrão, indometacina (5 mg/kg, p.o.), foi administrada 60 minutos antes da

administração do ácido acético. Todos os grupos foram constituídos por 10 animais.

4.4.2 Atividade analgésica central

Foi utilizado o modelo estabelecido por MacDonald et al. (1946). Os camundongos

foram colocados sobre uma placa de alumínio aquecida a temperatura fixa (55±0.5º C) e

anotado o tempo, em segundos, para que o animal manifeste alguma reação em resposta ao

estímulo térmico. Esta reação é esterotípica e consiste em pular ou lamber as patas

posteriores. Os experimentos foram iniciados 60 minutos após a administração 1-nitro-2-

feniletano (50, 100 e 200 mg/kg, p.o.) e do grupo controle (salina 0.9% e Tween 80 a 1%).

Um grupo foi tratado com morfina (10 mg/kg, s.c.) 45 minutos antes dos animais serem

colocados na placa aquecida. Todos os grupos foram constituídos por 10 animais.

4.4.3 Teste de Formalina

Para confirmação do efeito antinociceptivo do 1-nitro-2-feniletano, foi utilizado o teste

de nocicepção induzida pela injeção intraplantar de formalina.

Após administração intraplantar de formalina (20 µL de solução de formalina a 1 %) o

tempo que cada camundongo passou lambendo a pata traseira foi cronometrado em duas fases

sendo a primeira de 0-5 minutos e a segunda de 15-30 minutos após a administração de

formalina. O 1-nitro-2-feniletano (25 e 50 mg/kg, p.o.) foi administrado 60 minutos antes da

injeção de formalina. O grupo controle recebeu apenas veículo (salina 0,9% e Tween 80 a 1%,

p.o.) uma hora antes da administração de formalina e outro grupo de animal recebeu a droga

padrão morfina (4mg/kg, s.c.) 30 minutos antes da formalina (HUNSKAAR & HOLE, 1985).

Com o objetivo de verificar a participação do sistema opióide no efeito do 1-nitro-2-

feniletano foi realizada a co-administração do 1-nitro-2-feniletano (50 mg/kg, p.o., 60 minutos

antes da formalina) e do antagonista opióide naloxona (1 mg/kg, i.p., 45 minutos antes da

formalina). Todos os grupos foram constituídos por 10 animais.

4.5 Estudo da atividade antiinflamatória

4.5.1 Dermatite induzida pelo óleo de Croton

Foi utilizado o método descrito por Tubaro et al. (1985). A indução da dermatite

ocorreu após aplicação de 20µL de uma solução de óleo de croton em acetona na superfície da

orelha direita dos camundongos, pesando entre 20 e 30 g. Na orelha esquerda, foi aplicado o

mesmo volume de acetona. Uma hora antes da aplicação, foi realizado o tratamento por via

oral, sendo dois grupos tratados com nitrofeniletano (25 e 50mg/kg, v.o.). Outro com

dexametasona (10 mg/kg, p.o), e o grupo controle tratado com solução salina e Tween 80 1%.

A avaliação da resposta inflamatória, feita em balança analítica, ocorreu após 6 horas

da aplicação do estímulo. Os camundongos foram submetidos à eutanásia e uma amostra de 6

mm de diâmetro da orelha foi retirada com auxílio de punch de biópsia, e estabelecida a

diferença do peso entre a amostra da orelha controle (esquerda) e orelha estimulada (direita),

expressando os resultados obtidos em mg. Todos os grupos foram constituídos por 10

animais.

4.5.2 Estudo da atividade anti-edematogênica

a) Edema de pata induzido por dextrana

O edema de pata baseia-se na variação do volume das patas traseiras dos ratos (Rattus

novergicus) Wistar, após a aplicação de algum estímulo inflamatório (CARVALHO et al.,

1999). Os animais foram separados em grupos de cinco animais, e uma hora antes da

aplicação do agente inflamatório (0,1ml de dextrana 1%) foram tratados, por via oral, com 1-

nitro-2-feniletano 25 e 50 mg/kg, e ciproheptadina (5 mg/kg), em volume final de 0,1 mL/100

g de peso do animal. Na região intraplantar da pata direita foi administrado dextrana e igual

volume de solução salina na pata esquerda (Figura 3). O desenvolvimento do edema, avaliado

em milímetros com auxílio de paquímetro digital Mitutoyo, foi medido imediatamente após a

administração de dextrana e solução salina, em intervalos de 30 minutos, durante duas horas.

Todos os grupos foram constituídos por 5 animais.

b) Edema de pata induzido por carragenina

O edema de pata baseia-se na variação do volume das patas traseiras dos ratos (Rattus

novergicus) Wistar, após a aplicação de algum estímulo inflamatório (CARVALHO et al.,

1999). Os animais foram separados em grupos de cinco animais e, uma hora antes da

aplicação dos agentes inflamatórios (0,1mL de carragenina 1%), foram tratados, por via oral,

com 1-nitro-2-feniletano 25 e 50 mg/kg e indometacina (10 mg/kg), em volume final de 0,1

mL/100 g de peso do animal. Na região intraplantar da pata direita foram administrados

carragenina e igual volume de solução salina na pata esquerda (Figura 3). O desenvolvimento

do edema, avaliado em milímetros com auxílio de paquímetro digital Mitutoyo, foi medido

imediatamente após a administração de carragenina e solução salina, em intervalos regulares

de uma hora, durante cinco horas. Todos os grupos foram constituídos por 5 animais.

Figura 3: Local de administração da carragenina e dextrana na região intraplantar de ratos

(BURITOVA et al, 1996).

4.5.3 Peritonite em ratos induzido por carragenina

Uma solução de carragenina em 300 µg/mL em salina estéril foi injetada na cavidade

peritoneal de ratos. A migração celular foi analisada, 4 horas após a injeção do estímulo. Para

tanto, os animais foram sacrificados e foram injetados 10 mL de PBS heparinizado (1

mL/1000 mL de PBS) na cavidade peritoneal e realizaram-se as contagens total e a diferencial

das células contidas na mesma. Os resultados obtidos na contagem diferencial foram

expressos como número de neutrófilos por mL do lavado peritoneal. Para realização da

contagem total, 20 µL do lavado peritoneal foram diluídos em 0.4 mL da solução de Turk. A

Ângulo da Pata

Nível de medição do diâmetro da pata

Local de aplicação

Pata

Local de administração da carragenina e dextrana

Diâmetro da Pata

contagem foi realizada, em câmara de Neubauer. Parte do lavado peritoneal foi centrifugada a

1000 rpm por 10 minutos; o sobrenadante foi resuspenso em 0.4 mL de uma solução de

albumina a 3% em PBS p/v. O esfregaço celular foi feito em lâmina própria. As células

foram coradas pelo corante pancrômico de Rosenfeld e contadas em microscópio óptico,

usando-se objetiva de imersão em óleo. Foram contadas 100 células em cada lâmina,

diferenciando-as em: neutrófilos, eosinófilos, macrófagos e linfócitos. O número de células

diferenciadas foi calculado pelo percentual encontrado em relação ao número total de células.

Os resultados são expressos como média ± e.p.m. (erro padrão da média) do número de

células x 10

/mL de fluido peritoneal (SOUZA & FERREIRA, 1985). Os animais foram

tratados uma hora antes da administração da carragenina com 1-nitro-2-feniletano (25 e 50

mg/kg) e dexametasona (1mg/kg). Todos os grupos constituídos por 5 animais.

4.6 – Análise estatística

Os resultados são apresentados como média ± e.p.m. (erro padrão da média), onde n

representa o número de animais. São considerados estatisticamente significantes os resultados

que apresentaram probabilidade de ocorrência da hipótese de nulidade menor que 5%

(P<0,05). Para comparação das médias foram utilizados ANOVA (Análise de variância one-

way) seguida de um método de múltiplas comparações (Teste de Student-Newman-Keuls e

teste de Dunn’s). A análise estatística foi realizada utilizando-se o programa estatístico Sigma

Stat.

4.7 Drogas, reagentes e soluções

As drogas utilizadas neste estudo foram:

Ácido acético P.A. glacial (VETEC, Rio de Janeiro).

Formaldeído P.A (VETEC, Rio de Janeiro).

Cloridrato de morfina (Laboratório Cristália, Itapira, São Paulo).

Hidrocloridrato de ciproheptadina, (Sigma Chemical CO, St Louis, MO, USA),

solubilizada em solução salina 0.9%.

Carragenina (Sigma Chemical CO, St Louis, MO, USA) solubilizada em solução

salina 0.9% e vigorosamente agitada no momento do uso.

Dextrana (Sigma Chemical CO, St Louis, MO, USA) solubilizada em solução salina

0.9% e vigorosamente agitada no momento do uso.

Indometacina (Sigma Chemical CO, St Louis, MO, USA).

Tween 80 (Merck Schuchardt).

Dexametasona fosfato dissódico (Laboratório Aché, Campinas, São Paulo).

Cloridrato de xilazina (Bayer).

Cloridrato de Ketamina (Laboratório Konig S.A. São Paulo).

Salina tamponada com fosfato (PBS)

Cloreto de Sódio P.A 8.0g

Cloreto de Potássio P.A. 0.2g

Fosfato de sódio dibásico P.A 1.15g

Fosfato de sódio monobásico P.A 0.2g

Água destilada q.s.p 1.0l

pH 7.4

Solução de Turk

Ácido acético glacial P.A 20.0 mL

Azul de metileno 0.5 mL

Água destilada 1.0L

Corante pancrômico de Rosenfeld

Gienza-azul-eosina-azul de metileno 97.0mg

May-Grunwald-eosina-azul de metileno 53.0mg

Metanol P.A 1.0L

4.8 Aparelhagem e materiais usados

CENTRÍFUGA CLÍNICA

Centrífuga Fanen mod. 208 foi utilizada na centrifugação do lavado peritoneal no teste de

migração celular.

MICROSCÓPIO

Para as análises microscópicas foi utilizado MICROSCÓPIO TRILOCULAR JENAVAL

GF-PA.

PAQUÍMETRO

Para as medições no edema de pata foi utilizado o PAQUÍMETRO DIGITAL

MITUTOYO.

5 Resultados

5.1 Toxicidade aguda (DL

)

Na determinação da DL

os camundongos que receberam por via oral doses de 500,

600, 750 e 1000 mg/kg, apresentaram, durante o período de observação de 72 horas,

percentual de morte de 0, 20, 70 e 100%, respectivamente. O valor da DL

corresponde a 712

± 17,39 mg/kg (Figura 4). Este valor classifica esta substância como pertencente aos agentes

xenobióticos de classe 4 (pouco tóxica), (OECD, 2001).

As mudanças comportamentais, as quais poderiam ser observadas nos animais após

receber o tratamento, foram registradas durante 4 horas ininterruptas e, observou-se, além do

número de animais mortos, dificuldade de locomoção e agitação nos camundongos. Após esse

período de tempo os animais foram observados em 24, 48 e 72 horas.

1 10 100 1000 10000

Dose mg/kg

probitoo

y = 11,744Ln(x) - 72,151

= 0,945

Figura 4: Determinação da DL

em camundongos através da equação da reta. Eixo das

ordenadas: valores dos probitos, correspondentes ao percentual de mortes e, no eixo das

abscissas, as doses de 1-nitro-2-feniletano em escala logarítmica. R

é o coeficiente de

correlação.

5.2 Estudo da atividade antinociceptiva

5.2.1 Atividade analgésica periférica

Os resultados apresentados na Figura 4 e Tabela 1 (anexo) mostram o efeito dose-

dependente do 1-nitro-2-feniletano sobre o número de contorções abdominais, induzido pelo

ácido acético 0,6%. As doses de 15, 25 e 50mg/kg reduziram o número de contorções

abdominais em 19,19%, 48,43% e 74,47%, respectivamente, quando comparadas ao grupo

controle. A indometacina (5 mg/kg), um fármaco anti-inflamatório não-esteroidal, utilizado

como droga padrão neste teste, diminuiu em aproximadamente 60,38% o número de

contorções abdominais quando comparada ao grupo controle.

Veículo

Nitro 15mg/kg

Nitro 25mg/kg

Nitro 50mg/kg

Indometacina 5mg/kg

Número de contorções

Figura 5: Efeito do 1-nitro-2-feniletano e Indometacina sobre o estímulo nociceptivo

induzido pela injeção intraperitoneal de Ácido Acético 0,6% em camundongos. Cada coluna

representa média ± e.p.m. de 10 animais. *P< 0,05, quando comparado ao grupo controle;

ANOVA, Teste de Student-Newman-Keuls.

5.2.2 Atividade analgésica central

O 1-nitro-2-feniletano nas doses de 50, 100 e 200 mg/kg não mostrou atividade

analgésica central quando comparado ao grupo controle (Figura 6). Entretanto a morfina

(fármaco opióide) prolongou de maneira significante a latência (tempo que os animais

necessitam para manifestar uma reação estereotipada ao estímulo térmico) nos tempos 30, 60

e 90 segundos, no teste da placa quente.

0 20 40 60 80 100 120

Veículo

Nitro50mg/kg

Nitro100mg/kg

Nitro200mg/kg

Morfina10mg/kg

Tempo (min.)

Latência (seg.)

Figura 6: Efeitos do 1-nitro-2-feniletano nas doses de 50, 100 e 200 mg/kg e da morfina na

dose de 10 mg/kg sobre o estímulo nociceptivo térmico (55± 0,1°C) induzido em

camundongos. Cada ponto representa média ± e.p.m. de 10 animais.

*P< 0,05, quando comparado ao grupo controle; ANOVA, método de Dunn's.

5.2.3 Teste de Formalina

O 1-nitro-2-feniletano nas doses de 25 e 50mg/kg reduziu de maneira significativa o

tempo de lambida em relação ao grupo controle na 2ª fase do teste de formalina (fase

inflamatória) em 51,11% e 79,16%, respectivamente (Figura 8). Entretanto, o 1-nitro-2-

feniletano não foi eficaz na 1ª fase (fase neurogênica) deste teste. A morfina (4 mg/kg),

analgésico opióide, reduziu de maneira significante as duas fases em 79,08% e 73,16%,

respectivamente (Tabela 2, anexo). Neste teste, a naloxona (1mg/kg) reverteu o efeito do 1-

nitro-2-feniletano apenas na segunda fase. Ainda neste teste a naloxona foi capaz de reverter o

efeito da morfina tanto na primeira fase quanto na segunda fase no teste da formalina.

Primeira fase

Veículo

Naloxona

Morfina 4mg/kg

Nitro 25 mg/kg

Nitro 50 mg/kg

Naloxona+Morfina

Naloxona+Nitro50

Tempo de lambida (seg.)

0-5 min

Figura 7: Cada grupo representa média ± e.p.m. (erro padrão da média), de 10 animais. * p <

0,05 quando comparado ao controle; ** p < 0.05 quando comparado ao agonista mais

antagonista versus agonista sozinho (ANOVA, Teste de Student Newman Kuels).

Segunda fase

100

125

150

175

200

Veículo

Naloxona 1mg/kg

Morfina 4mg/kg

Nitro 25 mg/kg

Nitro 50mg/kg

Naloxona+Morfina

Naloxona+Nitro 50

Tempo de lambida (seg.)

15 - 30 min

Figura 8: Cada grupo representa média ± e.p.m. (erro padrão da média), de 10 animais. * p <

0,05 quando comparado ao controle; ** p < 0.05 quando comparado ao agonista mais

antagonista versus agonista sozinho (ANOVA, Teste de Student Newman Kuels).

O 1-nitro-2-feniletano nas doses de 25 e 50 mg/kg foi capaz de diminuir em 73,8 e

79,4% o eritema induzido pelo óleo de croton em relação ao grupo controle (Tabela 3, anexo).

A dexametasona (10 mg/kg), um antiinflamatório esteroidal, reduziu o eritema em

87,01%.

Veículo

Nitro 25 mg/kg

Nitro 50 mg/kg

Dexametasona10mg/kg

Edema (mg)

Figura 9: Efeito do 1-nitro-2-feniletano e dexametasona sobre o estímulo inflamatório

induzido pelo óleo de croton em camundongos. Cada coluna representa média ± e.p.m. de 10

animais. *P< 0,05, quando comparado ao grupo controle; ANOVA, teste de Student-

Newman- Keuls.

5.3.2 Edema de pata induzido por dextrana

O 1-nitro-2-feniletano, mostrou um efeito dose-dependente no edema de pata de rato

induzido por dextrana. Na dose de 25 mg/kg, foi capaz de impedir o desenvolvimento do

edema em 15,58%, 26,78%, 44,92% e 30,07% nos tempos 30, 60, 90 e 120 minutos,

respectivamente. Na dose de 50 mg/kg houve uma inibição do desenvolvimento do edema em

38,1%, 61%, 69,09% e 73,65% nos tempos 30, 60, 90 e 120 minutos, respectivamente. A

ciproheptadina foi capaz de impedir o desenvolvimento do edema em 71,94%, 67,29%,

71,18% e 52,25% nos tempos 30, 60, 90 e 120 min, respectivamente (Figura 10).

5.3 Estudo da atividade antiinflamatória

5.3.1 Dermatite induzida pelo óleo de croton

Tempo (min.)

0 20 40 60 80 100 120

Edema em mm

Controle (n=5)

Nitrof. 25mg/kg (n=5)

Nitrof. 50mg/kg (n=5)

Ciprohep. 5 mg/kg (n=5)

Figura 10: Efeito do 1-nitro-2-feniletano (nas doses de 25 e 50 mg/kg) e ciproheptadina (5

mg/kg) administrado por via oral, em relação ao efeito antiedematogênico no teste de edema

de pata induzido por dextrana em ratos (1000 µg/pata). Cada ponto representa média ± e.p.m.

de 5 animais.

*P< 0,05, quando comparado ao grupo controle; ANOVA, Teste de Student-Newman-Keuls.

5.3.3 Edema de pata induzido por carragenina

No edema de pata de rato induzido por carragenina o 1-nitro-2-feniletano também

mostrou um efeito dose-dependente. O 1-nitro-2-feniletano, na dose de 25 mg/kg, foi capaz de

impedir o desenvolvimento do edema em 26,83%, 43,91%, 41,6% e 39,85% nos tempos de 2,

3, 4 e 5 h. Na dose de 50 mg/kg o 1-nitro-2-feniletano causou uma inibição do

desenvolvimento do edema em 51,76%, 54,46%, 47,2% e 49% nos tempos de 2, 3, 4 e 5 h. A

indometacina foi capaz de impedi o desenvolvimento do edema em 41,07%, 66,95%, 61,73%,

50,07% e 64,99% nos tempos de nos tempos de 1, 2, 3, 4 e 5 h, respectivamente (Figura 11).

Figura 11: Efeito do 1-nitro-2-feniletano (nas doses de 25 e 50 mg/kg) e indometacina

administrado por via oral, em relação ao efeito antiedematogênico no teste de edema de pata

induzido por carragenina em ratos (1000 µg/pata). Cada ponto representa média ± e.p.m. de 5,

6 e 7 animais.

*P< 0,05, quando comparado ao grupo controle; Teste de Student-Newman-Keuls.

5.3.4 Peritonite em ratos induzido por carragenina

No modelo de peritonite induzido por carragenina a concentração de leucócitos após 4

horas aumentou para 8,1x10

células/mL, o qual define como 100% de migração de

leucócitos. Enquanto que a concentração de neutrófilos após 4 horas da administração da

carragenina aumentou para 5,3x10

celular/mL, o qual define como 100% de migração de

neutrófilos. Quando os animais foram tratados com 1-nitro-2-feniletano (25 mg/kg, p.o.) ou

dexametasona (1 mg/kg, p.o.) houve uma diminuição significativa do número total de

leucócitos (Figura 12) e do número de neutrófilos (Figura 13) demonstrando inibição no

processo inflamatório. A diminuição do número de leucócitos foi de 22,55% e 32,37%,

respectivamente (Tabela 5). A diminuição do número de neutrófilos foi de 38,13% e 69,77%,

respectivamente (Tabela 6). Entretanto, o 1-nitro-2-feniletano (50 mg/kg, p.o.) aumentou o

número de leucócitos em 49,33% e de neutrófilos em 85,34%.

Tempo (horas)

0 1 2 3 4 5

Edema em mm

Controle (n=5)

Nitrof.25mg/kg (n=7)

Nitrof. 50mg/kg (n=6)

Indom. 10 mg/kg (n=5)

Veículo

Nitro50mg/kg/salina

Nitro50mg/kg/carrag

Nitro25mg/kg/carrag

Dexametasona1mg/kg

nº de cels globais x

/ml

Figura 12: Efeito de administração de 1-nitro-2-feniletano (25 e 50 mg/kg, p.o.) ou

dexametasona (1 mg/kg, p.o.) na inflamação aguda induzida por carragenina, medida pela

concentração de leucócitos no fluido peritoneal (peritonite). Cada grupo representa média ±

e.p.m. (erro padrão da média), de 5 animais. * p < 0,05 quando comparado ao controle;

(ANOVA, Teste de Student Newman Kuels). # p < 0,05 quando comparado ao controle

(ANOVA, Teste de Student Newman Kuels).

Veículo

Nitro50/salina

Nitro50mg/kg/carrag

Nitro25mg/kg/carrag

Dexametasona1mg/kg

nº de neutrófilos x

/ml

Figura 13: Efeito de administração de 1-nitro-2-feniletano (25 e 50 mg/kg, p.o.) ou

dexametasona (1 mg/kg, p.o.) na inflamação aguda induzida por carragenina, medida pela

concentração de neutrófilos no fluido peritoneal (peritonite). Cada grupo representa média ±

e.p.m. (erro padrão da média), de 5 animais. * p < 0,05 quando comparado ao controle

(ANOVA, Teste de Student Newman Kuels). # p < 0,05 quando comparado ao controle

(ANOVA, Teste de Student Newman Kuels).

6 Discussão

O presente trabalho teve como objetivo avaliar as prováveis atividades antinociceptiva

e antiinflamatória do 1-nitro-2-feniletano uma vez que o óleo essencial de Aniba canelilla

apresentou ambas as atividades e, também, por que muitos tipos de dor possuem um

componente inflamatório envolvido. Para isso, utilizamos modelos clássicos de avaliação

farmacológica envolvendo atividades antinociceptiva e antiinflamatória.

O teste de contorções abdominais induzidas pelo ácido acético 0,6% é um modelo

experimental usado, para avaliar possíveis efeitos antinociceptivos periféricos de natureza

antiinflamatória, uma vez que o ácido acético, na concentração usada, induz a dor indireta que

ocorre em conseqüência de uma inflamação aguda no peritônio (IKEDA et al, 2001).

A inflamação ocasiona a liberação de prostaglandinas, o suficiente para provocar

espasmos traduzidos em contorção (LAPA et al., 2003; CUNHA et al., 2003; MIRANDA et

al., 2001). Acredita-se que o ácido acético atua indiretamente causando a liberação de

mediadores endógenos envolvidos na modulação da nocicepção, incluindo a bradicinina,

serotonina, histamina e prostaglandinas (WHITE, 1964; LEI GUO, 2008).

Além disso, nocicepção induzida pelo ácido acético, depende da liberação de

citocinas como IL-1β, TNF-α e a IL-8, a partir de macrófagos e basófilos residentes na

cavidade abdominal e, em conjunto com outros mediadores podem induzir a nocicepção

característica observada nesse modelo (RIBEIRO et al, 2000; IKEDA et al, 2001).

O 1-nitro-2-feniletano nas doses de 25 e 50 mg/kg foi capaz de reduzir de maneira

significativa o número de contorções abdominais induzidas pelo ácido acético. As doses de 25

e 50 mg/kg foram tão eficazes quanto à indometacina – antiinflamatório de natureza não-

esteroidal – (AINES), em reduzir as contorções abdominais em camundongos.

O teste de placa quente é utilizado para avaliar a atividade analgésica mediada por

mecanismos centrais, pois o calor é freqüentemente utilizado como um estímulo nóxico, em

modelos de dor aguda (ANTONIOLLI; VILLAR, 2003), mediado pela ativação dos

nociceptores (fibras Aδ e C), conduzindo o impulso ao corno dorsal pela medula espinhal, e

posteriormente aos centros corticais (PIETROVSKI, 2004).

O 1-nitro-2-feniletano, nas doses de 50, 100 e 200 mg/kg, não alterou os movimentos

estereotipados (saltar ou lamber a pata) nos tempos avaliados. Entretanto, a morfina elevou o

período de latência nos tempos 30’, 60’ e 90’. Este resultado exclui uma possível atividade

analgésica de ação central. A morfina que atua sobre os receptores opióides promovendo a

abertura dos canais de potássio, reduzindo, deste modo, tanto a excitabilidade neuronal, pois a

condutância aumentada ao K

causa hiperpolarização da membrana (HAESELER et al, 2006).

O teste de formalina talvez seja o modelo de dor clínica mais utilizado, no qual, a

primeira fase parece ser devido a estimulação química direta dos nociceptores, enquanto a

segunda fase é dependente da inflamação periférica e modificações no processamento central

(TJOLSEN et al, 1997, CAPONE & ALOISI, 2004 ).

O teste da formalina permite evidenciar duas fases de sensibilidade dolorosa: a

primeira fase que ocorre durante os primeiros 5 minutos após a injeção da formalina

(nocicepção de origem neurogênica) resulta de estímulo químico direto de fibras aferentes

nociceptivas mielinizadas e não mielinizadas, principalmente a fibra C, a qual pode ser

suprimido por drogas analgésicas opioides como a morfina (HUNSKAAR & HOLE, 1985,

AMARAL et al. 2007; GONÇALVES et al. 2008). Resultados experimentais demonstram que

a substância P e a bradicinina participam da primeira fase (VANEGAS & SCHAIBLE, 2004).

A segunda fase ocorre entre 15 a 30 minutos após a formalina, mediadores

inflamatórios formados nos tecidos periféricos, como as prostaglandinas, serotonina,

histamina e bradicinina, induzem mudanças funcionais nos neurônios, do corno dorsal que, ao

longo do tempo promove a facilitação da transmissão em nível espinhal. Esta evidência

sugere que o processo de inflamação periférica está envolvido na segunda fase (HUNSKAAR

& HOLE, 1985; FRANÇA et al, 2001; OLIVEIRA et al, 2008).

O 1-nitro-2-feniletano, nas doses de 25 e 50 mg/kg, reduziu de maneira significante o

tempo de lambidas na 2ª fase em relação ao grupo controle. A morfina reduziu o tempo de

lambida na 1ª e na 2ª fase em relação ao grupo controle.

A naloxona, um antagonista opióide, mostra a influência antinociceptiva do 1-nitro-2-

feniletano (50 mg/kg, p.o.). Isso sugere a participação do sistema opióide na modulação da

dor inibida pelo 1-nitro-2-feniletano.

O teste de eritema em orelha de camundongos induzido por óleo de croton é um dos

modelos utilizado para avaliar a atividade antiinflamatória de drogas. O óleo de croton é

irritante vascular, causando infiltração leucocitária de polimorfonucleares, edema intracelular

e dermatite tópica. Na fase inicial há degranulação de mastócitos. Em roedores esses grânulos

contêm mediadores inflamatórios com predominância de serotonina (MONTELLO, 2002). A

vantagem do modelo de inflamação em orelha induzido pelo óleo de croton é o bom

prognóstico para a triagem a atividade antiinflamatória tópica e a sensibilidade por drogas

esteroidais (TUBARO, 1985; SINGH et al, 2008), o que foi demonstrado no nosso modelo

experimental, no qual a dexametasona foi usada como controle padrão inibindo 87,01%. Os

grupos tratados com 25 e 50 mg/kg de 1-nitro-2-feniletano apresentaram inibição de 73,8 e

79,4%, respectivamente, demonstrando, deste modo, que este constituinte possa inibir

fosfolipase A

, o que indiretamente interfere com o processo de geração de prostaglandinas

(BATE et al, 2004), gerado pelo metabolismo do ácido araquidônico quando aplicado o óleo

de croton (INOUE et al., 1989; YONG & DE YOUNG, 1989).

A dextrana é um agente inflamatório conhecido por induzir edema mediado por

histamina e 5-hidroxitriptamina (serotonina) (TAMURA et al., 2002; ESTEVES et al., 2005),

conseqüente à degranulação de mastócitos (LO et al., 1982). A histamina interage com

receptores H

, H

e H

, sendo que os receptores H

estão localizados, entre outros locais,

nos vasos sangüíneos, enquanto os receptores H

localizam-se predominantemente na mucosa

gástrica, outros receptores. Os receptores H

são frequentemente expressos no SNC. Os

receptores H

são encontrados em células hematopoiéticas periféricas como eosinófilos,

neutrófilos e células T CD

O 1-nitro-2-feniletano inibiu o desenvolvimento do edema induzido por dextrana de

maneira dose-dependente. Este dado sugere que 1-nitro-2-feniletano interfere com a ação

edematogênica da histamina por mecanismo ainda não elucidado. A ciproheptadina – droga

antagonista de receptores H

e 5-HT

(CHINUCK et al, 2007) – reduziu em todos os tempos o

edema induzido pela dextrana.

Outro agente flogístico utilizado foi a carragenina, a qual induz exsudato rico em

proteínas que contém grande número de neutrófilos e metabolismo do ácido araquidônico

pelas vias da ciclooxigenase e lipoxigenase (LO et al., 1982, ZHANG, B. et al., 2007).

Apresenta três fases distintas envolvidas na resposta inflamatória aguda. A primeira fase (0-90

min) relaciona-se à liberação de histamina e serotonina, a segunda fase (90-150 min) envolve

a liberação de cininas, enquanto as prostaglandinas estão envolvidas na terceira fase (150-360

min) (DI ROSA et al., 1971, GARCIA et al., 2004). O 1-nitro-2-feniletano, no edema de pata

induzido por carragenina, apresentou atividade anti-edematogênica, nas doses de 25 e

50mg/kg, sendo esta atividade dose-dependente. A indometacina – fármaco antiinflamatório

que atua inibindo COX-1 inibiu o desenvolvimento do edema em todos os tempos.

Durante a peritonite há um aumento no transporte de pequenos e grandes solutos entre

o plasma e a membrana porosa, além da produção paralela de migração celular. Essas

mudanças podem ser explicadas pela vasodilatação dos capilares na membrana peritoneal e

pela abertura dos poros nos microvasos, causados por mediadores celulares e inflamatórios,

como neutrófilos e prostaglandina E2, respectivamente (PAULINO et al, 2008).

Os experimentos com carragenina demonstraram que o 1-nitro-2-feniletano inibe a

mobilização de leucócitos e neutrófilos na cavidade peritoneal. Entretanto, com a dose maior,

o 1-nitro-2-feniletano aumentou a migração celular. Do mesmo modo que foi observado por

Niederberger et al (2001), no qual, foi demonstrada expressão maior de COX-2 observado em

doses altas de celecoxib. Isto foi mediado pelo aumento na ativação do NF-κB, cuja função

está envolvida na transcrição de genes envolvidos na resposta inflamatória, proliferação

celular e adesão de células.

Os resultados obtidos no teste de contorção abdominal, a ação seletiva na 2ª fase do

teste da formalina, a inibição do desenvolvimento do edema induzido por carragenina e

dextrana, a inibição do estímulo inflamatório induzido pelo óleo de croton em orelhas de

camundongos, e ainda a inibição de leucócitos e neutrófilos sugerem que 1-nitro-2-feniletano

possui atividades antinociceptiva e antiinflamatória

7 Conclusão

• Através dos testes de contorção abdominal e formalina, sugerem que o 1-nitro-2-

feniletano possui atividade antinociceptiva, provavelmente, de origem periférica.

• Os resultados sugerem que os receptores opióides estão envolvidos no efeito

antinociceptivo do 1-nitro-2-feniletano.

• O 1-nitro-2-feniletano apresentou atividade anti-edematogênica e antiinflamatória nos

modelos de edema de pata, dermatite em orelha de camundongos, e migração celular.

Deste modo, sugere-se que a ação antiinflamatória desse composto possa ocorrer

através de uma interferência na síntese e/ou liberação das cininas, prostaglandinas,

histamina e serotonina, ou por agir sobre esses receptores envolvidos na resposta

inflamatória; entretanto são necessários outros estudos para elucidar estas hipóteses.

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ZWEIFEL B. S.; HARDY M. M.; ANDERSON G. D.; DUFIELD D. R.; PUFAHL R. A. &

MASFERRER J. L. A rat air pouch model for evaluating the efficacy and selectivity of 5-

lipoxygenase inhibitors. European Journal of Pharmacology, 584, 166-174, 2008.

* De acordo com:

ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE NORMAS TÉCNICAS. Referências Bibliográficas:

NBR 6023. Rio e Janeiro: ABNT, 2002.

Anexo

Tabela 1: Efeito do 1-nitro-2-feniletano nas contorções induzidas por Ácido Acético 0,6%.

Grupo

(V.O)

Dose

(mg/kg)

Número de contorções

(por 20 minutos)

% de inibição

Controle - 42,80±2,28 -

1-nitro-2-feniletano 15 32,20±4,23 19,19*

1-nitro-2-feniletano 25 19,11±3,35 48,43*

1-nitro-2-feniletano 50 9,80±1,71 74,47*

Indometacina 5 17,86±1,63 60,38*

*P< 0,05, quando comparado ao grupo controle; Teste de Student-Newman-Keuls

Tabela 2: Efeito do 1-nitro-2-feniletano no teste de placa quente em camundongos.

GRUPO

(V.O)

Dose

(mg/kg)

Tempo

120

Controle - 12,08±0,78 10,16±1,27 11,56±0,77 12,03±1,20

1-nitro-2-

feniletano

50 10,09±0,76 12,26±0,94 10,38±0,50 11,46±1,08

1-nitro-2-

feniletano

100 10,94±1,60 11,26±1,34 12,06±0,86 10,15±1,17

1-nitro-2-

feniletano

200 10,88±1,04 12,22±2,11 9,22±1,11 9,88±1,01

Morfina 10 33±2,87* 33,27±2,83* 28,90±3,53* 17,45±2,94

Cada grupo representa média ± e.p.m de 10 animais. *P< 0,05, quando comparado ao grupo

controle; Teste de Student-Newman-Keuls.

Tabela 3: Efeito do 1-nitro-2-feniletano e morfina sobre a nocicepção induzida por Formalina

1% em camundongos. Resultados expressos como média do tempo (segundos) que o animal

passou lambendo a pata.

Grupo

Dose

(mg/kg)

Nº de

Lambidas

(1º fase)

% de

inibição

Nº de

Lambidas

(2º fase)

% de

inibição

Controle - 49,2±2,73 - 175,25±20,48 -

Naloxona 1 61,7±3,64 - 163,25±17,7 -

1-nitro-2-feniletano 25 49,1±4,24 - 96,8±9,38 51,11*

1-nitro-2-feniletano 50 38,93±5,33 - 40,07±4,69 79,16*

Morfina 4 11,33±2,85 74,62* 12,77±2,38 73,08*

Naloxona x Nitro 1 x 50 44,14±3,03 - 105,42±24,83 -

Naloxona x Morfina 1 x 4 45±3,4 - 99,4±23,78 -

* (P < 0,05) Estatisticamente diferente do controle (ANOVA; Teste Student-Newman-

Keuls).

Tabela 4: Efeito do 1-nitro-2-feniletano na dermatite induzida pelo óleo de croton.

Grupo

(V.O)

Dose

(mg/kg)

Peso das orelhas

em mg

% de inibição

Controle - 8,24±0,69 -

1-nitro-2-feniletano 25 1,92±0,42 73,8*

1-nitro-2-feniletano 50 0,68±1,16 79,4*

Dexametasona 10 0,86±0,30 87,01*

* (P < 0,05) Estatisticamente diferente do controle (ANOVA; Teste Student-Newman-

Keuls).

Tabela 5: Efeito do 1-nitro-2-feniletano na migração de leucócitos induzidas por carragenina.

Grupo

(V.O)

Dose

(mg/kg)

Número de células

globais x 10

% de inibição

Controle - 8,15±0,59 -

Nitro/salina 50 2,02±0,61 -

1-nitro-2-feniletano 25 5,7±1,07 22,55%*

1-nitro-2-feniletano 50 16,08±1,99 -

Dexametasona 1 5,11±0,80 32,37%*

*P< 0,05, quando comparado ao grupo controle; Teste de Student-Newman-Keuls

Tabela 6:

Efeito do 1-nitro-2-feniletano na migração de neutrófilos induzidas por

carragenina.

Grupo

(V.O)

Dose

(mg/kg)

Número de neutrófilos x

% de inibição

Controle - 5,31±0,38 -

Nitro/salina 50 0,87±0,30 -

Nitro/carragenina 25 2,59±0,93 38,13%*

Nitro/carragenina 50 36,26±8,11 -

Dexametasona 1 1,35±0,37 69,77%*

*P< 0,05, quando comparado ao grupo controle; Teste de Student-Newman-Keuls

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