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PAULA ALVAREZ ABREU
Receptor de NMDA: modelagem molecular por
homologia e análise SAR de antagonistas
de um potencial alvo terapêutico
em doenças neurodegenerativas
Orientadora: Helena Carla Castro Cardoso de Almeida
NITERÓI
2008
UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE
CENTRO DE ESTUDOS GERAIS
INSTITUTO DE BIOLOGIA
PROGRAMA DE NEUROIMUNOLOGIA
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i
PAULA ALVAREZ ABREU
Receptor de NMDA: modelagem molecular por
homologia e análise SAR de antagonistas
de um potencial alvo terapêutico
em doenças neurodegenerativas
DISSERTAÇÃO SUBMETIDA À
UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE
VISANDO A OBTENÇÃO DO GRAU DE
MESTRE EM NEUROIMUNOLOGIA
Orientadora: Helena Carla Castro Cardoso de Almeida
NITERÓI
2008
UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE
CENTRO DE ESTUDOS GERAIS
INSTITUTO DE BIOLOGIA
PROGRAMA DE NEUROIMUNOLOGIA
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ii
A16 Abreu Paula Alvarez
Receptor de NMDA: modelagem molecular por
homologia e análise SAR de antagonistas de um
potencial alvo terapêutico em doenças
neurodegenerativas / Paula Alvarez Abreu. – Niterói,
[s. n.], 2008.
86f
Dissertação – (Mestrado em Neuroimunologia) -
Universidade Federal Fluminense, 2008.
1. Receptor de N-Metil-D-aspartato. 2. Modelos
moleculares. 3. Relação Estrutura- Atividade. 4.
Transtornos heredodegenerativos do sistema
nervoso. I. Título.
CDD: 612.01575
iii
PAULA ALVAREZ ABREU
Receptor de NMDA: modelagem molecular por homologia e análise
SAR de antagonistas de um potencial alvo terapêutico em doenças
neurodegenerativas
Dissertação de mestrado submetida à
Universidade Federal Fluminense
como requisito parcial para obtenção
do grau de mestre em
Neuroimunologia.
Banca Examinadora
_______________________________________________________________
Dra. Magaly Girão Albuquerque – IQ – UFRJ
_______________________________________________________________
Dr. José Mauro Granjeiro - GCM – UFF
_______________________________________________________________
Dra. Elizabeth Giestal de Araujo - GNE - UFF
_______________________________________________________________
Dr. Carlos Rangel Rodrígues (revisor e suplente - Fac. Farmácia UFRJ)
iv
"Escolha um trabalho que ame e não terás que trabalhar um único dia
em sua vida."
Confúcio
v
Agradecimentos
Aos meus pais por todo amor e por terem sempre me apoiado e acreditado em mim
em todos os momentos da minha vida, possibilitando que eu chegasse até aqui.
À minha família principalmente minhas tias e irmão pelo carinho e incentivo.
À minha orientadora Helena Carla Castro por ter me introduzido na área da
pesquisa e pela orientação, confiança e apoio desde a iniciação científica.
Aos amigos do laboratório por compartilhar as dúvidas e aflições que ajudam em
nosso crescimento e por proporcionar um ótimo convívio durante todo este tempo.
Aos colaboradores da Faculdade de Farmácia e do Instituto de Química da UFRJ,
da Química Orgânica e da Neuroimunologia da UFF e aos professores do programa
por todo o apoio e contribuição para a minha formação.
vi
Sumário
Páginas
Lista de Abreviaturas......................................................................................
ix
Lista de Figuras..............................................................................................
xi
Lista de Tabelas..............................................................................................
xiv
Resumo...........................................................................................................
xvi
Abstract...........................................................................................................
xvii
1.INTRODUÇÃO ............................................................................................
1
1.1
. Receptor de NMDA: ainda um alvo terapêutico .....................................
1
1.1.1. Estrutura e função do receptor d
e NMDA ............................................
1
1.1.2. Doenças neurodegenerativas relacionadas ao receptor de NMDA..
7
1.2. Técnicas de bioinformática
e de modelagem molecular..........................
11
1.2.1. Modelagem por homologia de alvos terapêuticos ...............................
14
1.2.2. Alinhamento de seqüências ................................................................
15
1.2.3. Construção do modelo .........................................................................
17
1.2.4. Otimização do modelo .........................................................................
17
1.2.5. Validação do modelo ...........................................................................
18
1.2.6. Interações entre ligante e receptor ......................................................
21
1.3. Na ausência do alvo, análise do ligante .................................................
23
1.3.1. Análise conformacional e relação estrutura-atividade (SAR)...............
24
1.3.2. Relação Estrutura Atividade Quantitativa (QSAR) ..............................
25
1.3.3. Análise in silico dos parâmetros ADMET .............................................
26
1.3.4. Regra dos cinco de Lipinski: avaliando outros parâmetros para a
mesma questão .............................................................................................
27
1.3.5. Regra dos cinco de Lipinski modificada para penetração no sistema
nervoso central ..............................................................................................
29
vii
2. OBJETIVOS ..............................................................................................
32
2.1. Objetivo Geral .........................................................................................
32
2.2. Objetivos Específicos ..............................................................................
32
2.2.1. Quanto ao receptor ..............................................................................
32
2.2.2. Quanto aos Ligantes ............................................................................
33
3. METODOLOGIA ........................................................................................
34
3.1. Construção dos Modelos por Homologia ................................................
34
3.2. Docking dos modelos com os ligantes e análise das interações ............
35
3.3. Análise de SAR/QSAR de derivados de fenil-amidinas ..........................
36
3.4. Desenho racional de novas triazolil-amidinas ........................................
37
3.5. Análise in silico dos parâmetros farmacocinéticos..................................
38
4. RESULTADOS...........................................................................................
40
4.1. Análise do Receptor de NMDA ...............................................................
40
4.1.1. Alinhamento de seqüência e construção dos modelos por homologia.
40
4.1.2. Docking, análise das interações e da mudança conformacional entre
as formas aberta e fechada das subunidades do receptor de NMDA ...........
47
4.2. Análise dos ligantes do receptor de NMDA ............................................
53
4.2.1. Análise de SAR/QSAR de derivados de fenil-amidinas.......................
53
4.2.2. Desenho de duas triazolil-amidinas e predição da atividade biológica
(2a-2b)............................................................................................................
57
4.2.3. Modificação estrutural e desenho de triazolil-amidinas mais ativas
(2c-2g)............................................................................................................
60
4.2.4. Análise in silico dos parâmetros ADMET..............................................
62
5. DISCUSSÃO...............................................................................................
65
5.1. Análise dos Modelos do Receptor de NMDA..........................................
65
viii
5.2. Análise dos ligantes do receptor de NMDA.............................................
71
6. Conclusões................................................................................................
75
6.1. Receptor de NMDA – Modelagem por Homologia.................................
75
6.2. Análise do Ligante...................................................................................
75
7. Referências Bibliográficas.......................................................................
76
8. Anexo de artigos publicados durante o período do mestrado.............
86
ix
Lista de Abreviaturas
3D Tridimensional ou em três dimensões
ADME Absorção, distribuição, metabolismo e excreção
ADMET Absorção, distribuição, metabolismo, excreção e toxicidade
ALH Aceptores de ligação hidrogênio
AM1 Austin Model 1
AMPA Ácido alfa-amino-3-hidróxi-5-metil-4-isoxazol-propiônico
ASM Área superfícial molecular
ASP Àrea de superfícial polar
BHE Barreira hematoencefálica
clogP Coeficiente de partição octanol/água calculado, (lipofilicidade)
DLH Doador de ligação hidrogênio
DNA Ácido desóxi-ribonucleico
e Elétron
eV Elétrons volts
HF Hartree-fock
HOMO Orbital molecular de maior energia ocupado
IC
50
Menor concentração que inibe 50% da atividade
L-dopa Levodopa
Log S Solubilidade em água
LUMO Orbital molecular de menor energia desocupado
MM Massa molecular
MMFF Molecular Mechanics Force Field, Campo de Força de Mecânica Molecular
NMDA Ácido N-metil-D-aspártico
x
PM3 Parametric model 3
QSAR Quantitative structure-activity relationship, relação quantitativa estrutura
atividade
RMN Ressonância magnética nuclear
RMS Root mean square, Raiz dos mínimos quadrados
RNA Ácido ribonucléico
SAR Structure-activity relationship, relação estrutura-atividade
SNC Sistema nervoso central
VM Volume molecular
ua Unidade atômica
xi
Lista de Figuras
Figura 1. Regulação da entrada e saída de íons através da ativação dos receptores
de AMPA, NMDA e kainato pelo agonista glutamato. A) regulação da expressão
gênica (1), liberação pré sináptica de neurotransmissores (2), ativação de enzimas
(3) e controle da abertura de canais (4). B) ativação de proteases (5) e, lipases
intracelulares (6), despolarização da membrana da mitocôndria (7) e aumento da
geração de radicais livres (8).......................................................................................2
Figura 2. Desenho esquemático da estrutura do receptor de NMDA e os principais
sítios presentes nas subunidades ...............................................................................4
Figura 3. Desenho esquemático de uma subunidade do receptor de NMDA...........5
Figura 4. Ligantes de receptor de NMDA incluindo antagonistas competitivos (A),
antagonistas não competitivos bloqueadores de canal (B), antagonistas alostéricos,
seletivos para NR2B (C) e antagonistas do sítio de ligação a glicina (D). .................7
Figura 5. Antagonistas seletivos da subunidade NR2B do receptor de NMDA......10
Figura 6. Processo de descoberta de novos fármacos (Adaptado de Troullier,
2002)..........................................................................................................................13
Figura 7. Definição de ângulos de torção Phi (Φ) e Psi (Ψ) da cadeia principal das
proteínas....................................................................................................................19
Figura 8. Gráfico de Ramachandran exemplificando a estereoquímica dos
aminoácidos presentes na proteína 1FTL de acordo com a distribuição dos ângulos
phi e psi. Em vermelho, regiões mais favoráveis, em amarelo e creme, regiões
permitidas e em branco, regiões desfavoráveis........................................................20
Figura 9. Principais razões do fracasso no desenvolvimento de fármacos (Adaptado
de Van de Waterbeemd, 2003)..................................................................................28
Figura 10. Alinhamento entre as seqüências primárias da região S1S2 das
subunidades NR2A-D do receptor de NMDA e da subunidade GluR2 do receptor de
AMPA mostrando a predição da estrutura secundária (vermelho α-hélice e verde
folha β-pregueada) e destacando os resíduos de cisteínas (*). Os aminoácidos que
participam da ligação ao agonista glutamato estão destacados dentro de
retângulos..................................................................................................................41
Figura 11. Comparação da estrutura 3D dos modelos da região S1S2 das
subunidades NR2B - NR2D na forma fechada e NR2A – D aberta e da estrutura
cristal das subunidades NR2A do receptor de NMDA na forma fechada e GluR2 de
AMPA na forma aberta. (A) Formas fechadas (1ª linha) e abertas (2ª linha). Mapas
de potencial eletrostático das formas fechadas mostrando a visão frontal (3ª linha) e
com rotação de 180° no eixo vertical (4ª linha). (B) Sobreposição das formas
fechadas (esquerda) e abertas (direita).....................................................................43
xii
Figura 12. Gráfico da análise do Verify3D para os modelos do receptor de NMDA
nas formas fechada (A) e aberta (B). NR2A em azul, NR2B rosa, NR2C amarelo e
NR2D verde...............................................................................................................45
Figura 13. Comparação entre a estrutura cristal da subunidade NR2A (molde) e os
modelos de NR2B construído neste trabalho (Modelo 1) e descrito por Tickhonova e
colaboradores (Modelo 2). Em cinza o alinhamento entre os modelos com a
subunidade NR2A ressaltando em cores a região 430-460 (NR2A em azul, modelo 1
em vermelho e modelo 2 em verde) .........................................................................46
Figura 14. Alinhamento estrutural da região do sítio de ligação ao glutamato das
subunidades NR2, NR2B, NR2C e NR2D do receptor de NMDA e GluR2 do receptor
de AMPA. NR2A azul, NR2B rosa, NR2C amarelo, NR2D verde e GluR2
cinza..........................................................................................................................48
Figura 15. Comparação do sítio de ligação ao glutamato na presença do agonista
(branco) na subunidade NR2B do receptor de NMDA (A) e GluR2 do receptor de
AMPA (B)...................................................................................................................49
Figura 16. Comparação do mapa de potencial eletrostático do agonista glutamato
(esquerda) e antagonista EAB515 (direita), mostrando as regiões carregadas
positivamente (azul) e negativamente (vermelho).....................................................49
Figura 17. Aminoácidos contidos num raio de 10 Å de distância do antagonista
EAB515 no complexo das subunidades do receptor de NMDA ...............................50
Figura 18. Alinhamento estrutural da região do sítio de ligação ao glutamato na
presença do antagonista entre as subunidades NR2A-D do receptor de NMDA,
NR2A azul, NR2B rosa, NR2C amarelo e NR2D verde ...........................................50
Figura 19. Comparação entre interações com o antagonista competitivo EAB515
(branco) (A) na subunidade NR2A e (B) na subunidade NR2B do receptor de NMDA
(cinza)........................................................................................................................52
Figura 20. Alinhamento estrutural entre os modelos (NR2A, NR2B, NR2C e NR2D)
e estrutura cristal de GluR2 nas formas aberta (verde) e fechada (azul), mostrando o
glutamato no centro da molécula. Em destaque a tabela mostrando a variação de
RMS e de volume da cavidade formada no sítio de ligação entre as formas aberta e
fechada......................................................................................................................52
Figura 21. Gráfico dos valores de pIC
50
experimental versus calculado para os
compostos 1a a 1q. A reta representa o que seria uma correlação perfeita.............56
Figure 22. Estrutura molecular da conformação mais estável (A) e mapa de
potencial eletrostático molecular das fenil-amidinas (1a-1q) (B)...............................57
Figure 23. Desenho racional das triazolil-amidinas (2a-2g).....................................58
xiii
Figura 24. Efeito Neuroprotetor das triazolil-amidinas 2a e 2b (100 nM) frente à
morte celular induzida pelo glutamato (1 mM) em culturas de retina de pinto. Os
dados representam a média ± SEM de 3 experimentos
individuais..................................................................................................................60
Figure 25. A. Comparação dos valores de druglikeness e drug score das fenil-
amidinas mais potentes (1a-1d), das triazolil-amidinas (2a-2g) e dos antagonistas do
receptor de NMDA descritos na literatura .................................................................63
Figure 26. Risco de toxicidade calculado através do Osiris Property Explorer para
as fenil-amidinas mais potentes (1a-1d), as triazolil-amidinas (2a-2g) e antagonistas
do receptor de NMDA descritos na literatura.............................................................64
xiv
Lista de Tabelas
Tabela 1. Doenças neurodegenerativas crônicas relacionadas ao receptor de
NMDA..........................................................................................................................9
Tabela 2. Comparação de proteínas obtidas por modelagem por homologia e
cristalografia de raios X.............................................................................................15
Tabela 3. Comparação dos valores percentuais de identidade e dos valores de RMS
resultantes do alinhamento das estruturas primárias e terciárias respectivamente
das subunidades NR2A, NR2B, NR2C e NR2D do receptor de NMDA e da
subunidade GluR2 do receptor de AMPA..................................................................42
Tabela 4. Análise do gráfico de Ramachandran para os modelos nas formas aberta
e fechada e para os moldes (templates) utilizados (NR2A F e GluR2 A) .................44
Tabela 5. Comparação incluindo o perfil biológico: (afinidade de ligação - pK
i
e
atividade functional - pIC
50
) das 17 fenil-amidinas (1a-1q), o pIC
50
calculado e os
descritores - energia de HOMO/LUMO (E
HOMO
e E
LUMO,
Ev), Momento dipolo
molecular (µ, Debye), massa molecular g/mol (MM), área superficial molecular
(ASM, Å
2
), ovalidade, razão entre volume e área (oval), número de grupamentos
aceptores de ligação hidrogênio (nALH) e doadores (nDLH), coeficiente de partição
octanol/água (cLogP) e cLogS (solubilidade em água calculada)............................ 53
Tabela 6. Matriz de correlação cruzada entre a atividade biológica experimental (pK
i
e pIC
50
) [Claiborne et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. (2003) 13: 697] energia de
HOMO/LUMO (E
HOMO
e E
LUMO,
Ev), Momento dipolo molecular (µ, Debye), Massa
molecular g/mol (MM), área superficial molecular (ASM, Å
2
), Ovalidade (razão entre
volume e área), número de grupamentos aceptores de ligação hidrogênio (nALH) e
doadores (nDLH), coeficiente de partição octanol/água (cLogP) e cLogS
(solubilidade em água calculada) para as 17 fenil-amidinas (1a-1q)........................54
Tabela 7. Comparação do pIC
50
(M)
predito e descritores incluindo energia de
HOMO/LUMO (E
HOMO
e E
LUMO,
Ev), Momento dipolo molecular (µ, Debye), Massa
molecular g/mol (MM), área superficial molecular (ASM, Å
2
), ovalidade, razão entre
volume e área (oval), número de grupamentos aceptores de ligação hidrogênio
(nALH) e doadores (nDLH), coeficiente de partição octanol/água (cLogP) e cLogS
(solubilidade em água calculada). Estrutura molecular da conformação mais estável
(A) e mapa de potencial eletrostático molecular (B) das triazolil-amidinas
sintetizadas (2a-2b)...................................................................................................59
xv
Tabela 8. Comparação do pIC
50
(M)
predito e descritores incluindo energia de
HOMO/LUMO (E
HOMO
e E
LUMO,
Ev), momento dipolo molecular (µ, Debye), massa
molecular g/mol (MM), área superficial molecular (ASM, Å
2
), ovalidade, razão entre
volume e área (oval), número de grupamentos aceptores de ligação hidrogênio
(nALH) e doadores (nDLH), coeficiente de partição octanol/água (cLogP) e cLogS
(solubilidade em água calculada). Estrutura molecular da conformação mais estável
(A) e mapa de potencial eletrostático molecular (B) das triazolil-amidinas
desenhadas (2c-2g)..................................................................................................61
Tabela 9. Análise das propriedades físico-químicas teóricas das triazolil-amidinas
(2a-2g) envolvidas na biodisponibilidade oral para fármacos do SNC......................64
xvi
Resumo
O receptor de NMDA é um membro da família de receptores de glutamato
ionotrópicos. A neurotoxicidade induzida pela sua hiperativação resulta em inúmeras
condições patológicas que vão desde doenças neurodegenerativas agudas, como
derrame e trauma, até doenças crônicas, como Huntington, mal de Parkinson e
Alzheimer, que podem causar a morte neuronal. Este trabalho é composto de duas
seções onde na primeira foi estudado o receptor de NMDA por métodos de
modelagem por homologia e na segunda foram propostos antagonistas utilizando
técnicas de análise quantitativa da relação estrutura-atividade (QSAR). Na primeira
parte deste trabalho construímos modelos por homologia do domínio S1S2 de todas
as subunidades NR2 do receptor de NMDA (NR2A, NR2B, NR2C e NR2D) na forma
aberta (ligada ao antagonista EAB515) e das subunidades NR2B-D na forma
fechada (ligada ao agonista glutamato). Através dos modelos foi possível observar a
mudança conformacional do receptor quando ligado ao agonista ou ao antagonista,
e revelou os resíduos Gly483, His485, Gly510, Ser511, Thr513, Arg518, Val685,
Ser689, Thr690, Tyr730, Asp731 e Tyr761 como importantes para interação do
receptor com o glutamato e com o antagonista EAB515. Divergências nas estruturas
primária, secundária e terciária e nos mapas de potencial eletrostático entre as
subunidades NR2A-D e o receptor de AMPA foram também observadas, o que pode
futuramente auxiliar no desenho de novos fármacos mais seletivos e com menos
efeitos adversos úteis na terapia das doenças neurodegenerativas.
Na segunda seção deste trabalho realizamos uma análise QSAR de 17 fenil-
amidinas (1a-1q) (Claiborne et al., 2003) descritas como antagonistas do receptor
de NMDA e desenhamos de forma racional uma série de triazolil-amidinas (2a-2g)
que mostrou um perfil melhor que das quatro fenil-amidinas mais ativas na predição
da sua potência através do modelo de QSAR gerado. As triazolil-amidinas
apresentaram ainda altos valores de druglikeness e drug score e baixo risco de
toxicidade teórica na avaliação de ADMET. Além disso, todos os compostos
desenvolvidos preencheram “a regra dos cinco” modificada de Lipinski para
penetração no sistema nervoso central, apontando as triazolil-amidinas como
moléculas promissoras para futura exploração sintética e biológica.
xvii
Abstract
NMDA receptor is a member of ionotropic glutamate receptor family. The
neurotoxicity induced by its activation results in several pathologic conditions: from
acute neurodegenerative diseases as stroke and trauma to chronic disorders as
Huntington, Parkinson and Alzheimer, which can cause neuronal death. This work is
composed by two sections where in the first section, NMDA receptor was studied
usinghHomology modeling methods and in the second, antagonists were proposed
using structure activity relationship analysis (QSAR). In first part of this work we
constructed homology models of S1S2 domain of all NR2 subunits of NMDA
receptor (NR2A, NRB, NR2C and NR2D) in the opened form (bound to the
antagonist EAB515) and of NR2B-D subunits in the closed form (bound to the
agonist glutamate). Through these models it was possible to observe the receptor
conformational changes when bound to the agonist or to the antagonist, and
revealed the residues Gly483, His485, Gly510, Ser511, Thr513, Arg518, Val685,
Ser689, Thr690, Tyr730, Asp731 and Tyr761 as important for the glutamate and
antagonist EAB515 interaction. Divergence in primary, secondary and tertiary
structures and in electrostatic potential maps between NR2A-D and the AMPA
receptor were also observed, which can help in the future to the design of new more
selective drugs and with less adverse effects useful in neurodegenerative diseases.
In the second section of this work, we performed a QSAR analysis of 17
phenyl-amidines (1a-1q) (Claiborne et al., 2003) described as NMDA receptor
antagonists and rationally designed a series of triazolyl-amidines (2a-2g) which
showed a better profile than the four most active phenyl-amidines in the prediction of
their potency through the QSAR generated model. The triazolil-amidines also
presented higher values of druglikeness and drug-score and low theoretical toxicity
risks in ADMET evaluation. Besides this, all the development compounds fulfilled the
Lipinski modified “rule of five” for central nervous system penetration, pointing the
triazolyl-amidines as promising molecules for future synthetic and biological
exploration.
1
1. INTRODUÇÃO
1.1. Receptor de NMDA: ainda um alvo terapêutico
1.1.1. Estrutura e função do receptor de NMDA
O glutamato é o principal neurotransmissor excitatório do sistema nervoso de
mamíferos (Catarzi et al., 2004). Os receptores deste neurotransmissor são
divididos em duas classes: a) metabotrópicos, de ação lenta que mobilizam vias de
segundos mensageiros, e b) ionotrópicos, de ação rápida e ligados a canais iônicos.
Dentre os receptores da família de receptores de glutamato ionotrópicos
estão os receptores do ácido N-metil-D-aspártico (NMDA), do ácido alfa-amino-3-
hidroxi-5-metil-4-isoxazol-propiônico (AMPA) e de kainato (Dingledine et al, 1999).
Estes receptores têm a denominação de acordo com o principal agonista sintético:
NMDA, AMPA e kainato, respectivamente (Kaye et al, 2007). O excesso de
glutamato no meio extracelular promove a ativação constante destes receptores,
principalmente dos receptores de NMDA, desencadeando um processo de
neurotoxicidade que ocorre, por exemplo, durante períodos de hipoglicemia e
isquemia (Choi e Rothman, 1990) (Figura 1).
O receptor de NMDA desempenha importantes funções fisiológicas e está
presente nas membranas pós-sinápticas. Em estágios precoces do
desenvolvimento, este receptor parece estar envolvido na determinação de morte ou
sobrevida de neurônios, enquanto durante a fase adulta, está envolvido na
plasticidade sináptica, aprendizado, consolidação da memória, transmissão
sensorial e coordenação, entre outras funções (Tickhonova et al, 2002, Marinelli et
al, 2007, Stoll et al, 2007).
2
Figura 1. Regulação da entrada e saída de íons através da ativação dos receptores de
AMPA, NMDA e kainato pelo agonista glutamato. A) regulação da expressão gênica (1),
liberação pré sináptica de neurotransmissores (2), ativação de enzimas (3) e controle da
abertura de canais (4). B) ativação de proteases (5) e, lipases intracelulares (6),
despolarização da membrana da mitocôndria (7) e aumento da geração de radicais livres
(8).
O receptor de NMDA, juntamente com o de AMPA, medeia a maior parte da
transmissão sináptica excitatória (Curtis et al, 2003; Gogas, 2006). Os receptores de
AMPA e de NMDA coexistem em diversas sinapses, sendo o potencial sináptico
excitatório formado por ambos. O receptor de NMDA é permeável aos íons sódio,
potássio e cálcio, enquanto que o receptor de AMPA é permeável a sódio e a
potássio e em sua maioria impermeável ao cálcio. De forma singular, os canais
ativados por NMDA, além de promoverem excitação através da entrada de sódio,
promovem também a entrada de cálcio, sendo a corrente iônica de entrada
dependente de voltagem (Bear et al., 2002).
O cálcio está envolvido em diversos processos celulares tais como: liberação
pré-sináptica de neurotransmissores, ativação de enzimas, controle da abertura de
canais e regulação da expressão gênica. Entretanto, em condições excessivas, o
cálcio pode promover morte celular por apoptose. O aumento da concentração de
Abreu PA
3
cálcio citoplasmático, sustentada por uma abertura duradoura do canal de NMDA,
deflagra o processo excitotóxico por diferentes vias intracelulares que podem
envolver a ativação de lipases e proteases intracelulares, despolarização da
membrana da mitocôndria ou ainda aumento da geração de radicais livres (Figura 1)
(Prehen et al, 1996; Bear et al, 2002; Sen et al, 2008).
O receptor de NMDA é ativado pela ligação simultânea de um agonista ao
sítio do glutamato e de um co-agonista ao sítio da glicina, o que provoca uma
mudança conformacional e a conseqüente abertura do poro, além da liberação de
um íon magnésio, que em potenciais normais de repouso bloqueia o canal
impedindo a passagem de outros íons. Quando a membrana é despolarizada, o que
normalmente ocorre após a ativação do receptor de AMPA na mesma sinapse ou
em sinapse vizinha, o íon magnésio é liberado, permitindo a passagem de corrente
pelo canal do receptor de NMDA. Desta forma, o receptor de NMDA, além de ser
um canal iônico dependente de ligante, é também dependente de voltagem (Bear et
al., 2002).
O receptor de NMDA é um hetero-oligômero formado por diferentes
combinações das subunidades NR1, NR2 e NR3. A subunidade NR1 apresenta oito
isoformas formadas pelo splicing alternativo de um único gene, a subunidade NR2
apresenta quatro subtipos (NR2A-D), e a NR3 apresenta dois (NR3A e B) (Curtis et
al., 2003, Paoletti e Neyton, 2007; Nikan e Meltzer, 2002; Furukawa et al., 2005). As
subunidades NR1 e NR3 apresentam um sítio de ligação ao co-agonista (glicina),
enquanto que as subunidades NR2A-D contêm um sítio de ligação ao agonista
glutamato (Figura 2). A natureza heteromérica dos receptores de NMDA é
evidenciada pela demonstração de que receptores de NMDA são funcionais
4
somente quando ambas as subunidades NR1 e NR2 estão presentes (Meguro et al.,
1992; Monyer et al., 1992).
Figura 2. Desenho esquemático da estrutura do receptor de NMDA e os principais sítios
presentes nas subunidades.
As subunidades do receptor de NMDA compartilham uma topologia comum na
membrana, sendo compostas por: a) um domínio N-terminal extracelular formado
por 350 aminoácidos, que contém sítios para ligantes alostéricos nas subunidades
NR2A (e.g. zinco) e NR2B (e.g. ifenprodil), b) três segmentos transmembrânicos
(TM1, TM3 e TM4) cada um formado por cerca de 150 aminoácidos, e uma alça de
reentrada no poro (M2), c) alças extracelulares entre N-terminal e TM1 e entre TM3
e TM4 que formam o sítio de ligação ao agonista em NR2 e ao co-agonista em NR1
e NR3 e d) um C-terminal citoplasmático que varia de acordo com a subunidade e
que apresenta sítios de interação com proteínas intracelulares (Figura 3) (Paoletti e
Neyton, 2007).
Abreu PA
5
As alças extracelulares em NR2 formam o domínio S1 e S2 de ligação ao
agonista natural e tem o formato de concha. Quando um agonista se liga a esta
região, ela assume uma forma fechada que promove uma mudança conformacional
e abertura do poro, permitindo a passagem de íons, enquanto a ligação de um
antagonista faz com que este domínio fique na forma aberta levando ao fechamento
do poro, o que impede a passagem de íons. A estrutura cristalográfica desta região
na subunidade NR2A (na forma fechada/ligada ao glutamato) foi determinada em
2005 e foi expressa substituindo os três domínios transmembrânicos e a alça de
reentrada por dois aminoácidos: (ácido glutâmico e treonina) que une o domínio S1
e S2 (Furukawa et al., 2005; Stoll et al., 2007).
Figura 3. Desenho esquemático de uma subunidade do receptor de NMDA.
Evidências indicam que o receptor de NMDA atua fisiologicamente na forma
de tetrâmeros que diferem na composição das subunidades, apresentando assim,
diferentes propriedades eletrofisiológicas e farmacológicas (Paoletti e Neyton, 2007;
Abreu PA
6
Nikan e Meltzer, 2002; Kinarsky et al., 2005). O receptor de NMDA tem ampla
distribuição no sistema nervoso central, sendo as subunidades deste receptor
expressas em diferentes regiões, onde NR2A é expressa em todo o cérebro, NR2B
é encontrada no córtex cerebral, hipocampo e bulbo olfatório, NR2C no cerebelo e
NR2D no mesencéfalo. A medula espinhal expressa ainda níveis elevados de NR2C
e D (Tolle et al., 1993).
É interessante notar que a ausência de NR2B no cerebelo sugere que os
antagonistas seletivos desta subunidade podem apresentar menos efeitos adversos,
visto que provavelmente, não irão afetar a função locomotora do indivíduo (Nikam e
Meltzer, 2002; Tickhonova et al., 2002; Curtis et al., 2003). Esta hipótese é
reforçada pelos efeitos do ifenprodil, um antagonista do receptor NR1/NR2B, que
apresenta perfil mais seguro do que outros antagonistas não seletivos (Figura 4).
Contudo, apesar de ser seletivo para a subunidade NR2B, o ifenprodil apresenta
uma alta afinidade pelo receptor adrenérgico (Chenard e Menitti, 1999; Nikan e
Meltzer, 2002). Conseqüentemente, ainda continua a busca pelo desenvolvimento
de antagonistas seletivos da subunidade NR2B com o objetivo de tratar diversas
doenças nas quais a neurotransmissão glutamatérgica está significativamente
envolvida (Claiborne et al., 2003; McCauley et al., 2004).
Na identificação de novos antagonistas do receptor de NMDA, o canal iônico
do receptor de NMDA tem sido apontado como um alvo promissor, visto que
apresenta sítios distintos de interação que são responsáveis por uma intensa
modulação sináptica causando alteração no fluxo de íons sódio, potássio e cálcio.
Atualmente quatro sítios do receptor são considerados possíveis alvos para ligantes
endógenos e exógenos: a) o sítio de ligação do agonista e de antagonistas
competitivos (e.g. AP5, CPP, LY233536 e EAB515) b) o sítio de ligação do co-
7
agonista onde se liga a glicina (e.g. ACEA-1021, ZD-9379, L701324 e MDL105519),
c) o sítio de ligação de antagonistas alostéricos (e.g. ifenprodil, Co10676,
PD0174494 e Cl1041) e, d) o sítio de ligação de antagonistas não competitivos que
bloqueiam o canal (e.g. MK801, PCP, ketamina e Memantina) (Figura 4)
(Tickhonova et al., 2002; Paoletti e Neyton, 2007).
Figura 4. Ligantes de receptor de NMDA incluindo antagonistas competitivos (A),
antagonistas não competitivos bloqueadores de canal (B), antagonistas alostéricos,
seletivos para NR2B (C) e antagonistas do sítio de ligação a glicina (D).
1.1.2. Doenças neurodegenerativas relacionadas ao receptor de NMDA
A neurotoxicidade induzida pela hiperativação do receptor de NMDA resulta
em inúmeras condições patológicas que vão desde doenças neurodegenerativas
agudas, como derrame e trauma, até doenças crônicas, como Huntington, mal de
Parkinson e Alzheimer, que podem causar a morte neuronal (Tabela 1) (Armstrong e
Gouaux, 2000; Fray et al., 2001; Tickhonova et al., 2002, Claiborne et al., 2003;
Barta-Szalai et al., 2004). As doenças neurodegenerativas são caracterizadas por
perda progressiva e irreversível de neurônios de regiões específicas do cérebro,
8
sendo que a terapia disponível é limitada ao tratamento sintomático, o que não
altera a progressão da doença (Goodman e Gilman, 2001; Bodner et al., 2006). A
necessidade de tratamento destas patologias tem suscitado o desenvolvimento de
antagonistas do receptor de NMDA, mas o emprego clínico não tem demonstrado
êxito devido aos graves efeitos colaterais, que incluem déficit motor, sedação e
estados psicomiméticos, além de baixo índice terapêutico (Tabela 1) (Max et. al.,
1995; Muir e Lees, 1995; Nikam e Meltzer, 2002).
Em episódios patológicos, tais como acidentes vasculares, sejam estes de
origem isquêmica ou hemorrágica, uma grande quantidade de glutamato é liberada
para o meio extracelular, levando a ativação constante dos receptores de glutamato.
Na isquemia aguda, a liberação descontrolada de glutamato, e a subseqüente
hiperativação do sistema de transmissão excitatório, é uma das principais causas de
morte e incapacitação do indivíduo a longo prazo. Os antagonistas do receptor de
NMDA apresentam efeito neuroprotetor contra os danos permanentes da isquemia,
mesmo quando administrados várias horas após o evento isquêmico. Alguns
compostos, como os protótipos ifenprodil e eliprodil, são efetivos em ensaios in vivo
e in vitro na redução do dano cerebral provocado por isquemia focal e global, assim
como por lesão traumática aguda (Baskaya et al., 1997; Gotti et al., 1988; Nikam e
Meltzer, 2002). Antagonistas competitivos, como o CGS-19755 e o Selfotel, também
são relatados na literatura, mas todos falharam na fase III dos ensaios clínicos
(Baudy et al., 2001).
Os receptores de NMDA também estão envolvidos na hiperalgesia e alodinia
em resposta ao estímulo inflamatório ou dano nervoso. Estudos de
imunocitoquímica demonstram que as subunidades NR2B do receptor estão
localizadas nas lâminas I e II do corno dorsal da medula espinhal, sugerindo o
9
envolvimento deste receptor na transmissão da dor. Antagonistas de amplo espectro
como MK-801 e CPP são efetivos na redução da hiperalgesia induzida por
carragenina e formalina, mas apenas quando administrados em doses que
produzem efeitos colaterais motores (Calabresi e Mercuri, 1993; Boyce, et al. 1999;
Nikam e Meltzer, 2002).
Tabela 1. Doenças neurodegenerativas crônicas relacionadas ao receptor de NMDA.
Doença Características Fármacos Autores
Alzheimer
Perda de neurônios corticais e
hipocampais, mudanças
patológicas na transmissão
neuronal e presença de placas
senis (agregados da proteína β
amilóide) e fusos neurofibrilares
levam a incapacidade cognitiva e
de memória. O peptídeo β
amilóide parece sensibilizar
neurônios em cultura à morte
celular induzida pelo glutamato
ou NMDA, mas não pelo AMPA.
Antagonistas não
competitivos, como
memantina, mostram
eficácia melhorando o
aprendizado e a memória
em ensaios pré-clínicos,
além de reduzir os níveis
de peptídeos β.
Bakchine e Loft,
2007; Standridge
et al., 2004;
Brauner-Osborne
et al, 2000;
Brorson et al.,
1995; Scholtzova
et al., 2007,
Rosini, et al.,
2008.
Parkinson
Perda de neurônios da
substância negra, déficit de
dopamina e agregados de α-
sinucleína levam à alteração dos
movimentos extrapiramidais,
tremor, rigidez, bradicinesia e
instabilidade postural. A
hiperatividade glutamatérgica
secundária e a perda primária de
dopamina têm um papel
importante na patofisiologia da
doença.
Amantadina, um
antagonista não
competitivo, tem sido
usado na doença de
Parkinson. Antagonistas
seletivos para NR1/NR2B
possuem efeitos
antiparkinsonianos
quando administrados
sozinhos, além de
potencializar o efeito da
levodopa (L-dopa).
Nikam e Meltzer,
2002, Standaert,
et al., 1994;
Kuppenbender et
al., 2000; Tahar
et al., 2004.
Huntington
Degeneração seletiva
predominantemente dos
neurônios estriatais causada por
uma forma mutante do gene
huntingtin que leva à discinesias,
movimentos extrapiramidais e
mudanças na função cognitiva e
comportamental. As alterações
iniciais causam um aumento na
corrente mediada pelo receptor
de NMDA, desorganização na
homeostase do cálcio e aumento
da vulnerabilidade à
excitotoxicidade mediada pelo
NMDA.
O perfil favorável do
recemide e ketamina,
antagonistas competitivos
do receptor de NMDA,
sugere que estes
compostos possam ser
usados como agentes
neuroprotetores com
função de adiar a
progressão da doença.
Kremer et al.,
1992; Gogas,
2006; Li et al.,
2004; Brauner-
Osborne et al.,
2000; Lucetti et
al., 2002.
10
Na busca por antagonistas do receptor de NMDA, que possam ser usados na
terapia de doenças neurodegenerativas, alguns compostos foram descritos como
tendo uma seletividade maior pela subunidade NR2B em relação às outras, o que
resulta em menos efeitos colaterais. Entre estes compostos está o ifenprodil que
assim como outros (e.g. Co101676, PD174494 e Cl1041), apesar de seletivos,
ainda apresentam efeitos adversos. Por isso, muito esforço tem sido realizado na
busca por compostos menos tóxicos e novas classes foram sintetizadas, tais como
as estiril-amidinas (I), aril-amidinas (II e III) e benzamidinas cíclicas (IV), que
demonstraram ser oralmente eficazes como antagonistas seletivos do receptor de
NMDA NR1/NR2B (Figura 5) (Curtis et al., 2003; Claiborne et al., 2003; Borza et al.,
2005; Nguyen et al., 2007).
Figura 5. Antagonistas seletivos da subunidade NR2B do receptor de NMDA.
O envolvimento do glutamato e do receptor de NMDA em diversas doenças
neurodegenerativas tem levado a busca pelo desenvolvimento de fármacos efetivos
e seguros que tenham este sistema como alvo. O planejamento de novos fármacos
tem sido um desafio para a química medicinal e o estudo estrutural deste receptor e
de seus ligantes permite uma avaliação mais detalhada e pode auxiliar no
desenvolvimento de antagonistas mais potentes e seletivos. O sucesso neste
11
desenvolvimento pode apontar um novo caminho para a terapia de diversas
doenças que continuam tendo um tratamento meramente paliativo.
1.2. Bioinformática e modelagem molecular
A bioinformática é uma área interdisciplinar com origem nas ciências da
computação, na estatística, na química e na biologia molecular. A bioinformática
desenvolveu-se, inicialmente, para permitir a análise dos resultados do
seqüenciamento de genes, que gerou e continua gerando uma quantidade cada vez
maior de dados sobre proteínas, DNA e RNA. Deste modo, foi necessário utilizar
métodos estatísticos capazes de analisar grandes quantidades de dados biológicos
para predizer funções dos genes e demonstrar relações entre genes e proteínas.
Assim, surgiu o proteoma, que é o conjunto de todas as proteínas que intervêm nos
processos biológicos de uma espécie no seu contexto estrutural e funcional. O
objetivo do projeto proteoma é estudar a composição, a estrutura e a função de
proteínas já que muitas patologias estão relacionadas a alterações em
determinadas proteínas e que estas podem ser novos alvos terapêuticos (Burley,
2000; Collins et al., 2003; Lu et al., 2008).
A modelagem molecular surgiu como um conjunto de ferramentas da
bioinformática que investiga as estruturas e propriedades moleculares usando a
química computacional e técnicas de visualização gráfica para fornecer uma
representação tridimensional próxima da estrutura real (Sant’anna, 2002). O grande
desenvolvimento da modelagem molecular deve-se ao avanço nos recursos
computacionais em termos de equipamentos (hardware), que aumentam a
velocidade de cálculo e a capacidade de armazenamento de dados, e de programas
12
de química computacional (software). A criação de novos programas possibilitou
que um número maior de informações fossem obtidas com grande rapidez e
acuidade podendo então serem analisadas e utilizadas por áreas afins (Blundell et
al., 1987; Bajorath et al., 1993, Assumpção, 2006).
Considerando-se os benefícios para a saúde humana e os altos custos de
tempo e dinheiro no processo de descoberta de novos fármacos, novas técnicas de
modelagem molecular têm sido desenvolvidas para otimizar este processo (Ooms,
2000; Souza, 2007). As etapas para se obter um novo fármaco envolvem a
identificação de um grupo de moléculas que tenham potencial de interação com um
alvo, a análise da atividade biológica destas moléculas em ensaios in vitro, testes
pré-clínicos em animais de laboratório para verificar a eficácia, toxicidade e efeitos
colaterais das moléculas em condições fisiológicas e testes clínicos em seres
humanos em condições controladas para determinar a eficácia, toxicidade e efeitos
colaterais no organismo humano. Assim, o processo se inicia com uma grande
quantidade de moléculas, mas, a cada fase, muitas delas são descartadas por não
atenderem às especificações necessárias. Ao final, apenas algumas moléculas
apresentarão um perfil adequado, e uma será eleita como candidato potencial a um
novo fármaco (Figura 6) (Troullier et al., 2002).
Desta forma, grande parte dos gastos das indústrias farmacêuticas (~75%) é
empregado na avaliação e no teste de substâncias que são descartadas no decorrer
do processo. Se as indústrias conseguirem eliminar muitas destas substâncias nas
etapas iniciais do processo, poderão aumentar o seu retorno comercial e
redirecionar o investimento em pesquisa de outras patologias. A modelagem
molecular se mostra promissora por permitir a detecção precoce de moléculas com
13
problemas e por orientar a pesquisa na direção de moléculas com maior potencial
(Troullier et al., 2002, Collins et al, 2003; Hansch et al., 2004).
Figura 6. Processo de descoberta de novos fármacos (Adaptado de Troullier et al., 2002).
As técnicas de modelagem molecular utilizadas na descoberta de fármacos
variam, dependendo da extensão das informações estruturais disponíveis sobre o
alvo (enzima/receptor) e os ligantes. O desenho direto e indireto são as duas
estratégias que podem ser utilizadas no processo de desenho de novos fármacos
(Cohen et al.,1990; Oohms, 2000; Chavatte e Farce, 2006). No método indireto,
quando a estrutura tridimensional do alvo é desconhecida, as informações sobre a
estrutura dos compostos ativos e inativos podem ser utilizadas para determinar
características importantes, tais como grupos hidrofóbicos, ligação hidrogênio e
momento dipolo. A partir destas informações, gera-se um modelo que pode ser
utilizado para a seleção de compostos dentro de bancos de dados ou orientar o
processo de planejamento e síntese de novas entidades químicas (Jorgensen,
14
2004; Veselovsky e Ivanov, 2003). No método direto, quando a estrutura 3D do alvo
é conhecida, é analisado o complexo ligante-receptor. As estruturas 3D de
macromoléculas podem ser obtidas experimentalmente por cristalografia de raios X,
uma das técnicas mais empregadas, ou por Ressonância Magnética Nuclear (RMN)
onde a limitação está relacionada ao tamanho da proteína; ou podem ser obtidas
teoricamente por modelagem por homologia (Acharya e Lloyd, 2005). Com relação
ao modo de interação ligante-receptor, estruturas de complexos determinadas
experimentalmente por co-cristalização ou obtidas teoricamente utilizando técnicas
de docking têm sido os métodos mais utilizados (Kontoyanni et al., 2004; Souza,
2007, Chavatte e Farce, 2006). O estudo do complexo ligante-receptor permite
observar as interações mais importantes e essas informações podem ser utilizadas
para encontrar compostos mais potentes (Santos, 2002).
1.2.1. Modelagem por homologia de alvos terapêuticos
A determinação experimental da estrutura 3D de proteínas por técnicas de
cristalografia de raios X e RMN, tem custo elevado e depende, muitas vezes, de
uma alta concentração proteica. Tendo em vista que algumas proteínas não podem
ser obtidas em altas concentrações, seja por dificuldades no isolamento ou na
clonagem ou porque algumas não podem ser cristalizadas, têm se buscado
ferramentas que sejam capazes de simular o enovelamento de proteínas, onde a
modelagem por homologia é a ferramenta mais bem sucedida para a predição da
estrutura tridimensional (Kopp e Schweed, 2006; Hillisch et al., 2004). A modelagem
por homologia baseia-se em padrões estruturais conservados observados em
proteínas com estruturas primárias similares, geralmente membros da mesma
família. Nestes casos, a homologia entre proteínas pode estar relacionada a
15
estruturas ou funções similares que foram conservadas evolutivamente (Santos,
2000).
Assim, os modelos por homologia são construídos a partir de dados de
coordenadas de raios X de proteínas semelhantes, usando técnicas de alinhamento
de seqüência e análise de homologia (Santanna, 2002).
A comparação de modelos tridimensionais obtidos por técnicas de
modelagem molecular com a estrutura obtida por cristalografia de raios X tem
indicado uma significativa confiabilidade nos modelos gerados. O grau de
similaridade pode ser avaliado pelo valor da raiz dos mínimos quadrados (RMS,
Root Mean Square) das distâncias entre os átomos das cadeias principais do
modelo teórico com a da estrutura cristalográfica da mesma proteína (Tabela 2)
(Hillisch et al., 2004; Baker e Sali, 2001).
Tabela 2. Comparação de proteínas obtidas por modelagem por homologia e cristalografia
por difração de raios X.
Proteína Homóloga
Código no PDB da
proteína modelada
Código % Identidade
RMS entre o modelo e
a estrutura de Raio X
5MBN 4HHB 25 0,99
1DTX 1AAP 36 0,85
2PTN 4CHA 44 1,15
1BBC 1PPA 47 1,56
1LZT 1LZ1 60 0,73
1AZU 2AZA 62 0,90
1SBC 2SBT 70 1,07
Adaptado de Castro, H.C. - Comunicação pessoal.
1.2.2. Alinhamento de seqüências
A comparação entre seqüências é a principal forma utilizada para atribuir
função a uma seqüência recém decodificada de um genoma. A capacidade de
16
alguns programas de executar comparações automatizadas simplifica estas análises
e auxilia na predição e na construção de modelos estruturais. A comparação inicia-
se com o alinhamento aleatório das seqüências e a qualidade do alinhamento
gerado é avaliada e pontuada considerando as regiões conservadas (Gibas e
Jambeck, 2001). A pontuação do alinhamento baseia-se na identidade dos
aminoácidos, com pontuação máxima quando idênticos, pontuação positiva quando
similares (e.g. aminoácidos que conservam propriedades químicas como ácido
glutâmico e ácido aspártico) e pontuação negativa quando distintos (e.g. troca de
um ácido glutâmico com característica polar negativa por uma leucina característica
apolar neutra).
O termo identidade refere-se à presença de um mesmo aminoácido na
mesma posição em duas seqüências alinhadas. O termo similaridade é usado
quando um aminoácido é substituído por outro com propriedades químicas
semelhantes, enquanto o termo homologia de seqüência indica a relação evolutiva
entre as seqüências. A substituição de um aminoácido por outro representa uma
mutação pontual, mas muitas seqüências apresentam inserções ou deleções de
aminoácidos originando espaços vazios (gaps) no alinhamento. A maioria dos
algoritmos usados pelos programas de alinhamento atribui uma penalidade para
gaps. Desta forma, gaps são incluídos somente se houver necessidade e não em
toda a seqüência, sendo atribuída também uma penalidade maior para incluir um
gap novo do que para aumentar um gap já existente (Gibas e Jambeck, 2001).
As técnicas de alinhamento de várias seqüências simultaneamente permitem
a identificação da semelhança evolutiva e estrutural entre as proteínas codificadas
por cada seqüência avaliada no alinhamento. Proteínas com funções relacionadas
são semelhantes tanto em seqüência como em estrutura terciária, sendo que a
17
seqüência tende a se modificar mais rapidamente do que a estrutura terciária no
curso da evolução. Normalmente, a estrutura de proteínas homólogas se conserva,
visto que, uma estrutura ancestral comum é crucial para a função específica de
cada uma delas (Gibas e Jambeck, 2001, Santos, 2002).
1.2.3. Construção do modelo
Para definir o molde (template) a ser utilizado na construção de um modelo
por homologia é necessário ter a seqüência de aminoácidos e realizar uma busca
em um banco de dados de seqüência de estruturas existentes no banco de dados
de proteína (Protein Data Bank – PDB), comparando com a seqüência da proteína
em questão (Bernstein et al., 1977). De modo geral, para seqüências com número
de resíduos acima de 80, um grau de identidade superior a 25%, indica que as
estruturas tridimensionais são semelhantes, desde que apresentem similaridades
funcionais, justificando que a estrutura tridimensional da proteína molde pode ser
usada na modelagem por homologia da proteína alvo (Santos, 2002; Rost e Sander,
1996). É interessante ressaltar que se o grau de identidade entre as seqüências for
superior a 60%, a capacidade preditiva do modelo resultante pode ser da magnitude
de uma estrutura obtida experimentalmente (Santos, 2002). Apesar dos resultados
promissores, a construção e avaliação do modelo deve ser cuidadosa, tendo em
vista casos de insucesso relatados na literatura (Luthy et al., 1992; Hillisch et al.,
2004).
1.2.4. Otimização do modelo
As estruturas geradas na modelagem por homologia devem ser otimizadas
para se aproximar de forma confiável de uma estrutura estável real. O processo de
18
otimização da geometria de uma estrutura objetiva encontrar o mínimo de energia
mais próximo em relação à geometria de partida, que pode ser realizado por
cálculos de mecânica molecular (Sant’anna, 2002).
A mecânica molecular utiliza campos de força empíricos para calcular a
energia do sistema como uma função das posições nucleares, ignorando a
presença dos elétrons (Sant’anna, 2002, Carvalho et al., 2003). Essa simplificação
torna possível o estudo das biomacromoléculas, cujos sistemas contêm mais de 10
mil átomos (Assumpção, 2006).
Como regra geral, os cálculos precisam ser mantidos em um valor ideal, uma
vez que cálculos muito extensivos podem desviar excessivamente o sistema do
molde original (Grant e Richards, 1995).
1.2.5. Validação do modelo
A última etapa do processo de modelagem por homologia de uma proteína é
a análise da confiabilidade da estrutura gerada, o que é uma tarefa difícil, já que a
qualidade do modelo depende de diversas propriedades em diferentes níveis de
organização estrutural. Um importante indicador da qualidade estereoquímica de
uma proteína é a distribuição dos ângulos torsionais phi (Φ) e psi (Ψ) da cadeia
principal (Fersht, 1998; Santos, 2002). Os ângulos phi e psi referem-se a rotações
de duas unidades rígidas dos peptídeos em torno do carbono alfa (Cα), sendo phi, o
ângulo de torção da ligação Cα-N e psi o ângulo de torção resultante da ligação Cα-
CO (carbono da carbonila) (Branden e Tooze, 1991) (Figura 7).
19
Figura 7. Definição dos ângulos de torção phi (Φ) e psi (Ψ) da cadeia principal de proteínas
(Adaptado de Jakubowski, 2008).
A maioria das combinações entre os ângulos de torção phi e psi não são
favoráveis devido à ocorrência de colisões estéricas entre átomos não ligados em
diferentes cadeias ou dentro de um mesmo resíduo (e.g. grupamento R). O gráfico
de Ramachandran mostra a distribuição das combinações entre todos os ângulos
phi (Φ) e psi (Ψ) que uma proteína pode apresentar. No caso da proteína apresentar
resíduos de aminoácidos com problemas estereoquímicos, estes estarão em
regiões desfavoráveis do gráfico, sendo que os resíduos prolina e glicina devem ser
analisados separadamente, visto que apresentam características estereoquímicas
próprias (Santos, 2002). A glicina, que tem um átomo de hidrogênio como cadeia
lateral, pode ocupar uma ampla região do gráfico de Ramachandran, enquanto que
a prolina ocupa uma região do gráfico mais limitada em comparação aos demais
aminoácidos, devido à ausência de rotação livre da ligação N-Cα, visto que é um
aminoácido cíclico.
A análise da percentagem de resíduos que ocupam regiões favoráveis no
gráfico é uma das melhores maneiras de avaliar a estereoquímica de um modelo
estrutural proteico. Neste gráfico (Figura 8), as regiões em vermelho correspondem
a combinações dos ângulos Φ e Ψ mais favoráveis, em amarelo e creme as
combinações permitidas, enquanto em branco, as combinações desfavoráveis
(Santos, 2002, Murray et al., 2006).
20
Figura 8. Gráfico de Ramachandran exemplificando a estereoquímica dos aminoácidos
presentes na proteína 1FTL de acordo com a distribuição dos ângulos phi e psi. Em
vermelho, regiões mais favoráveis, em amarelo e creme, regiões permitidas e em branco,
regiões desfavoráveis.
Outra forma de analisar a qualidade de um modelo é através da verificação
do ambiente em torno de cada resíduo na proteína e análise da compatibilidade
entre estrutura 3D da proteína modelada e a sua própria seqüência de aminoácidos
usando o programa profile 3D. O perfil obtido para cada resíduo estatisticamente é
comparado com a preferência de cada um dos 20 aminoácidos por um determinado
ambiente. O ambiente dos resíduos é definido por três parâmetros: a área do
resíduo que está voltada para o interior da proteína, a área coberta por átomos
polares e a estrutura secundária. O método baseia-se no fato de que modelos de
proteínas com estrutura 3D adequada têm pontuações (scores) maiores do que os
modelos com estrutura 3D inadequada. Além disso, o método avalia o score 3D-1D
para cada aminoácido que deve apresentar, preferencialmente, valores maiores do
que zero (Lüthy et al.,1992).
21
1.2.6. Interações entre ligante e receptor
O reconhecimento molecular do ligante pelo sítio receptor está associado à
estrutura do ligante que deve ser complementar ao sítio de ligação (Verli, 2002). O
receptor (ou enzima) é uma macromolécula que apresenta um sítio de ligação com
propriedades estereoquímicas que são reconhecidas por moléculas específicas (e.g.
agonista no caso de um receptor ou substrato no caso de uma enzima). Os
aminoácidos localizados no sítio de ligação do receptor interagem com a molécula-
ligante através dos átomos das cadeias laterais ou das ligações peptídicas da
cadeia principal que podem iniciar uma mudança conformacional no receptor ou
uma reação na enzima. A ligação entre o fármaco e a macromolécula-alvo ocorre
geralmente através de interações não covalentes, que incluem interações por
ligação hidrogênio, iônicas, dipolo-dipolo, hidrofóbicas e van der Walls (Gearien,
1989). Estas interações só são possíveis quando as superfícies moleculares estão
próximas, sendo a força da interação dependente da distância (Silverman, 1992;
Santos, 2002).
Ligações covalentes são de alta energia e por isso dificilmente são clivadas
em processos não enzimáticos. Desta forma, os complexos ligante-receptor que
envolvem ligações desta natureza raramente são desfeitos e levam a uma inibição
enzimática irreversível ou inativação do sítio alvo (inibição suicida) (Santos, 2002;
Katzung, 2002).
A ligação hidrogênio é a interação não covalente mais importante nos
sistemas biológicos, sendo responsável pela formação da estrutura secundária em
proteínas (e.g. α-hélice e folha β-pregueada) e ácidos nucléicos (e,g. hélice de
DNA). Esta interação é formada entre um átomo de hidrogênio ligado
covalentemente a um átomo eletronegativo (geralmente nitrogênio e oxigênio) e um
22
outro átomo eletronegativo (geralmente nitrogênio ou oxigênio) contendo um par de
elétrons livre, sendo muito importante para o encaixe do fármaco no sítio da
macromolécula-alvo (Santos, 2002).
As interações iônicas ocorrem entre grupamentos com cargas opostas, são
interações mais fortes do que as ligações hidrogênio porém mais fracas que a
ligação covalente (Murray et al., 2006). Em pH fisiológico, a cadeia lateral de
aminoácidos básicos (arginina e lisina) encontra-se protonada, caracterizando sítios
catiônicos enquanto que a cadeia lateral de aminoácidos ácidos (ácido aspártico e
glutâmico) encontra-se desprotonada caracterizando sítios aniônicos. Assim, os
grupamentos dos ligantes e receptores contendo cargas opostas são mutuamente
atraídos por complementaridade de cargas (Santos, 2002).
A interação dipolo-dipolo é uma interação mais fraca que a interação iônica e
envolve a atração entre dipolos permanentes opostos do ligante e do receptor que
são produzidos pela distribuição assimétrica de elétrons em função da presença de
ligações polares (Silverman, 1992). A ligação hidrogênio é um tipo especial de
ligação dipolo-dipolo.
A interação hidrofóbica ocorre entre grupamentos apolares que tendem a se
associar para minimizar as interações não favoráveis energeticamente com grupos
polares e com a água presente nos meios biológicos (Murray et al., 2006). Este tipo
de interação ocorre entre os lipídios das membranas biológicas e entre as cadeias
hidrofóbicas presentes no ligante e no sítio receptor (Santos, 2002; Katzung et al.,
2002).
As interações de van der Walls são as interações de mais fraca energia e
ocorrem em função da polarização transitória (dipolo instantâneo e dipolo induzido)
de ligações de baixa polaridade ou apolares como ligações carbono-carbono e
23
carbono-hidrogênio. Apesar de fracas, estas interações são de extrema importância
para o reconhecimento molecular do ligante pelo sítio receptor (Silverman, 1992).
Ressalta-se que fármacos que interagem por ligações fracas são, por vezes,
mais seletivos do que aqueles que interagem por ligações de alta energia. Isto
ocorre porque as ligações fracas exigem um encaixe muito preciso do ligante no
sítio receptor (Katzung, 2002). O estudo da interação ligante-proteína é de grande
importância, visto que o seu entendimento possibilita a descoberta de fármacos com
com potência elevada, maior seletividade e menos efeitos adversos (Baskin et al,
2003).
O docking é um método de ajuste ou ancoramento molecular que permite
explorar o modo de interação dos compostos nos sítios de ligação, por ajuste
manual (docking manual), onde o composto é posicionado no sítio de interação de
acordo com modelos comparativos de outros compostos análogos, ou automático
(docking automático) onde o composto é posicionado por programas que utilizam
algoritmos de busca para achar as orientações mais estáveis (i.e. de menor energia)
(Smith, 1996; Assumpção, 2006).
1.3. E na ausência do alvo, a análise do ligante
A disponibilidade de programas computacionais de química e bancos de
dados em rede são ferramentas fundamentais para a simulação do comportamento
de sistemas moleculares reais no planejamento de novos fármacos. Estes
programas permitem a análise de propriedades físico-químicas de moléculas de
interesse biológico. Novos agentes terapêuticos podem ser desenvolvidos pela
análise da relação estrutura-atividade, onde os dados estruturais podem ser obtidos
24
por técnicas de modelagem molecular. Características estruturais dos ligantes
podem ser calculadas teoricamente resultando em parâmetros potencialmente
indicadores do perfil de atividade biológica (Patrick, 2001; Carvalho et al., 2003).
1.3.1 Análise conformacional e relação estrutura-atividade (SAR)
A análise conformacional é uma busca das possíveis conformações que uma
molécula pode assumir e seus respectivos estados de energia. Esta análise é
realizada pela rotação das ligações simples, onde são alterados os ângulos de
torção ou ângulos de diedro e calculados os correspondentes estados de energia
para cada conformação (Souza, 2007).
A análise conformacional é a primeira etapa para análise da estrutura de um
ligante. As moléculas desenhadas na forma tridimensional não estão,
necessariamente, na conformação mais estável, visto que, durante a geração das
estruturas 3D podem ocorrer distorções na molécula, como deformações de
comprimentos de ligação, de ângulos de ligação e de ângulos de torção de seus
valores de menor energia, i.e. mais estáveis (Souza, 2007).
A análise conformacional sistemática, conhecida também como pesquisa de
grade, consiste em varrer os ângulos de torção da molécula simultaneamente. Este
procedimento é limitado, a moléculas com um número relativamente pequeno de
rotações livres, em função da explosão combinatória. O número de confôrmeros a
ser analisado equivale a (360°/θ)
n
, onde θ é o incremento usado na varredura do
ângulo de torção e n é o número de rotações livres. Quanto menor incremento (θ), e
maior o número de rotações livres, maior será a quantidade de conformações
geradas, mas, na prática, apenas alguns confôrmeros são importantes. No caso de
uma ligação simples Csp
3
-Csp
3
, por exemplo, um incremento de 120º é adequado,
25
pois permite que as conformações mais próximas dos mínimos da superfície de
energia potencial sejam encontradas (Leach et al., 1996; Souza, 2007).
A análise da relação estrutura-atividade de compostos é realizada utilizando
propriedades estereoeletrônicas que podem ser calculadas usando a mecânica
quântica que se baseia na equação de Schrödinger (Foresman e Frisch, 1993;
Souza, 2007). Este tipo de cálculo tem um custo computacional elevado por
descrever as propriedades das moléculas levando em conta a natureza ondulatória
dos elétrons, sendo restrito a sistemas com menos de mil átomos (Sant’anna, 2002).
Os cálculos de mecânica quântica podem ser subdivididos em dois grupos:
ab initio e semi-empírico. O método ab initio usa equações exatas, sem
aproximações, que envolve a população eletrônica total da molécula, podendo ser
aplicado apenas a moléculas relativamente pequenas e, por ser mais exato requer
grande capacidade de memória e tempo de cálculo do computador. O método semi-
empírico é menos exato, usa vários graus de aproximação e envolve apenas os
elétrons da camada de valência dos átomos da molécula (e.g. AM1 e PM3), porém é
mais rápido e pode ser utilizado na otimização da geometria de moléculas que
variam de 10 a 120 átomos (Sant’anna, 2002, Carvalho et al., 2003; Patrick, 2001).
1.3.2. Relação Quantitativa Estrutura Atividade (QSAR)
O QSAR é um método de correlação quantitativa entre estrutura química e
atividade biológica, onde a variação de atividade pode ser quantitativamente
correlacionada com as variações das propriedades físico-químicas e características
estruturais de uma série de moléculas (Sant`anna, 2002; Zhou e Madura, 2004).
Usando este método, propriedades estereoeletrônicas de uma série de moléculas
(e.g. energia dos orbitais de fronteira HOMO e LUMO, mapas de potencial
26
eletrostático molecular, momento dipolo molecular) podem ser utilizadas como
descritores e relacionadas com o perfil de atividade biológica (Consonni, 2002).
Com o método de QSAR usando descritores moleculares, é possível construir
modelos matemáticos (equações) para predizer, quantitativamente, a afinidade de
ligação de moléculas existentes ou hipotéticas relacionadas a um conjunto de
moléculas de treinamento. O modelo de QSAR é uma equação matemática
estatisticamente validada que correlaciona a estrutura química com o perfil de
atividade. A técnica de QSAR, que pode contribuir muito no processo de descoberta
de novos fármacos, foi originalmente baseada na idéia de que compostos similares
apresentam propriedades físico-químicas e efeitos biológicos semelhantes e
estabelece comparação entre propriedades estereoeletrônicas de candidatos a
fármacos e afinidade de ligação a um alvo molecular comum (Lill, 2007; Khan et al.,
2007). Com o advento da modelagem molecular, descritores tridimensionais têm
substituído os descritores físico-químicos e bidimensionais (Verli et al, 2002).
De acordo com as dimensões dos descritores moleculares, a metodologia de
QSAR pode ser classificada em: a) QSAR-1D, onde a estrutura do ligante é
representada por suas propriedades moleculares globais (e.g. Log P e pKa); b)
QSAR-2D, onde a estrutura do ligante é representada por padrões estruturais 2D,
sem considerar a representação 3D (e.g. conectividade e farmacóforo 2D); c)
QSAR-3D, onde a estrutura do ligante é representada por sua estrutura 3D; d)
QSAR-4D, em que os ligantes são representados por um conjunto de conformações
ou estados de protonação; e) QSAR-5D semelhante ao 4D mas com a
representação de diferentes modelos de encaixe induzido (ligante-receptor); f)
QSAR-6D, semelhante ao 5D, mas com a representação de diferentes cenários de
solvatação (Lill, 2007).
27
1.3.3. Análise in silico dos parâmetros ADMET
Os processos farmacocinéticos de absorção, distribuição metabolismo e
eliminação (ADME) são de grande importância na escolha de um fármaco. Para um
fármaco ou candidato a fármaco atingir eficácia terapêutica, deve possuir uma
potência elevada e seletividade para interagir com o alvo biológico, mas também
deve ser capaz de atingir concentrações no tecido alvo acima de um valor limite pré-
determinado (Katzung, 2002).
O perfil de ADMET junto com a toxicidade (ADMET) são parâmetros que têm
um papel importante em definir a biodisponibilidade e os efeitos tóxicos de uma
molécula, auxiliando na redução do tempo e do custo do processo de pesquisa e
desenvolvimento de novos fármacos (Hansch et al., 2004). A busca pela otimização
da estrutura química de compostos em relação aos parâmetros ADMET é um
desafio, visto que cerca de 50% das razões que levam ao fracasso no
desenvolvimento de um fármaco estão associadas ao perfil farmacocinético e
toxicológico (Figura 9). Estudos atuais indicam claramente que essas duas áreas
devem ser investigadas em etapas iniciais do processo de desenvolvimento de
novos fármacos, a fim de reduzir os custos (Pajouhesh e Lenz, 2005; Dennis 1990,
van de Waterbeemd, 2003).
Atualmente, estudos in silico dos parâmetros ADMET são realizados em
etapas preliminares do processo de desenvolvimento de fármacos, a fim de
economizar tempo e delinear melhor o estudo de novos compostos. A otimização
destas propriedades por modificações moleculares de compostos promissores, é
essencial na seleção de candidatos a fármacos com maior probabilidade de não
serem descartados na fase clínica.
28
39%
30%
11%
10%
5%
5%
Farmacocinética Perda da eficácia
Toxicidade Efeitos adversos
Razões comerciais Outros
Figura 9. Principais razões do fracasso no desenvolvimento de fármacos (Adaptado de van
de Waterbeemd, 2003).
A análise do potencial de um composto como fármaco também pode ser
realizada por estudos de druglikeness e drug score. O potencial de druglikeness de
um composto está relacionado à semelhança com fármacos do mercado, sendo
baseado em descritores topológicos, dados estruturais ou outras propriedades como
cLogP (coeficiente de partição octanol/água calculado) e peso molecular.
O programa Osiris (http://www.organic-chemistry.org/prog/peo/drugScore.
html) utiliza uma lista de 5300 fragmentos moleculares , onde a freqüência de
ocorrência de cada fragmento é determinada com base em uma coleção de 3300
fármacos comerciais e 15000 compostos da coleção Fluka que não são fármacos
comerciais. As análises demonstram que 80% dos fármacos comerciais têm um
valor de druglikeness positivo, enquanto a maioria dos compostos Fluka apresenta
valores negativos. O potencial de drug score combina o potencial de druglikeness,
cLogP, LogS (solubilidade em água), peso molecular e risco de toxicidade em um
valor que é utilizado para inferir o potencial de um composto se tornar um fármaco.
29
1.3.4. Regra dos cinco de Lipinski: avaliando outros parâmetros para a mesma
questão
Entre os parâmetros de ADMET, uma boa biodisponibilidade oral é um dos
atributos mais desejáveis de um novo fármaco. A predição da biodisponibilidade oral
é um desafio, visto que envolve múltiplos fatores biológicos e físico-químicos como
dissolução no trato gastrointestinal, permeação pelas membranas intestinais e
metabolismo de primeira passagem intestinal e hepático. Atualmente, muito esforço
tem sido feito para predizer a absorção intestinal, que é a primeira etapa para uma
boa biodisponibilidade oral (Hou et al., 2007; Khan e Sylte, 2007). Neste contexto, a
predição desta propriedade foi proposta pela primeira vez por Lipinski e
colaboradores (Lipinski et al., 2001) sendo conhecida como “regra dos cinco de
Lipinski” que define um conjunto de parâmetros capazes de identificar compostos
com problemas de absorção e permeabilidade. Um banco de dados de
aproximadamente 2500 fármacos comerciais oralmente ativos foi usado para
elaborar diretrizes gerais que pudessem ser utilizadas pelos químicos medicinais
para estimar o potencial de permeabilidade e de solubilidade de um composto. De
acordo com esta regra uma boa absorção e permeação é mais comum quando o
número de grupos aceptores de ligação hidrogênio é menor ou igual a 10, o número
de grupos doadores de ligação hidrogênio menor ou igual a 5, o peso molecular
menor ou igual a 500 Da e Log P calculado menor ou igual a 5 (Lipinski et al., 2001).
Um número excessivo de grupos doadores e aceptores de ligação hidrogênio,
assim como um alto peso molecular dificultam a permeabilidade através da
bicamada da membrana enquanto uma lipofilicidade elevada reduz a absorção
(Lipinski et al., 2001, Abraham et al., 1994). Posteriormente, um quinto parâmetro foi
30
adicionado estabelecendo que o número de ligações rotáveis deve ser menor ou
igual a 10 para que o composto apresente uma permeabilidade eficiente pelas
membranas (Pajouhesh e Lenz, 2005).
1.3.5. Regra dos cinco de Lipinski modificada para penetração no sistema
nervoso central
Os fármacos administrados por via oral, mas que têm como alvo
macromoléculas no sistema nervoso central (SNC), devem ser capazes de
atravessar a barreira hematoencefálica (BHE) para exercerem a sua atividade.
Fármacos moderadamente lipofílicos podem atravessar a BHE por difusão passiva,
e portanto, propriedades que influenciam na permeação devem ser consideradas.
Em geral, os fármacos que tem como alvo o SNC, são mais lipofílicos, menos
polares, menos flexíveis e apresentam menor peso molecular e menor volume
molecular do que fármacos com outras indicações terapêuticas (Mouritsen e
Jorgensen, 1998; Pajouesh e Lenz, 2005).
Desta forma, baseado em 1500 fármacos comerciais oralmente ativos no
SNC, Lipinski elaborou um conjunto de regras aplicáveis para fármacos que devem
ter uma penetração eficiente no SNC. Este estudo indicou que as propriedades
físico-químicas, em geral, têm um limite menor do que no caso de outras classes de
fármacos (Pajouesh e Lenz, 2005). De acordo com este estudo, os fármacos que
conseguem atravessar a barreira hematoencefálica e apresentar atividade no SNC
apresentam peso molecular ≤ 400, cLogP ≤ 5, aceptores de ligação hidrogênio ≤ 7,
e doadores de ligação hidrogênio ≤ 3.
Outros parâmetros podem ser usados para avaliar a capacidade de uma
molécula atravessar a BHE, como a área superfícial polar (ASP), que é definida
31
como a área superficial referente aos átomos de nitrogênio e oxigênio e aos átomos
de hidrogênio a eles ligados. A ASP de fármacos que atuam no SNC deve ser
significativamente menor do que para outras classes de fármacos, sendo estimados
valores de 60-70Å
2
como ideais e o limite máximo de 90Å
2
. A ASP está diretamente
relacionada à capacidade de formar ligações hidrogênio e à polaridade. A habilidade
de formar ligação hidrogênio, por sua vez, está relacionada ao número de átomos
de oxigênio e nitrogênio presentes na molécula, sendo o somatório utilizado na
regra de Lipinski para estabelecer o número de grupos aceptores de ligação
hidrogênio, ainda que os pares de elétrons livres destes átomos não estejam
disponíveis para este tipo de interação. A flexibilidade da molécula é outra
característica a ser analisada e está relacionada ao número de ligações rotáveis,
sendo uma certa flexibilidade importante para a passagem através das membranas
(Pajouhesh e Lenz, 2005).
32
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo Geral
O objetivo deste trabalho é gerar informações relevantes sobre a estrutura do
receptor de NMDA e possíveis ligantes utilizando técnicas de bioinformática e de
modelagem molecular a fim de contribuir para o desenvolvimento de antagonistas
mais potentes, seletivos e menos tóxicos.
2.2. Objetivos Específicos
2.2.1. Quanto ao receptor
Construir modelos da estrutura 3D do domínio S1S2 das subunidades NR2B,
NR2C e NR2D nas formas fechada e NR2A, NR2B, NR2C e NR2D nas formas
aberta das subunidades do receptor de NMDA, utilizando a técnica de modelagem
por homologia e avaliar a relação estrutura-atividade.
Realizar o docking dos ligantes glutamato (agonista natural) e EAB515
(antagonista competitivo), nos modelos gerados para determinar os resíduos
importantes na interação ligante-receptor.
Comparar as formas fechadas e abertas destes modelos para observar uma
possível mudança conformacional do receptor ao ligar ao agonista ou ao
antagonista.
Avaliar as diferenças e similaridades nas estruturas primária, secundária e
terciária das subunidades NR2A, NR2B, NR2C e NR2D e comparar os modelos
33
construídos com a subunidade GluR2 do receptor de AMPA a fim de determinar
diferenças no sítio de ligação que possa auxiliar na orientação da síntese de
compostos mais seletivos para a subunidade NR2B do receptor de NMDA.
2.2.2. Quanto aos Ligantes
Analisar a relação estrutura-atividade de 17 fenil-amidinas descritas na
literatura como antagonistas do receptor de NMDA.
Utilizar os dados sobre as fenil-amidinas para orientar o desenho de uma
nova série de triazolil-amidinas.
Gerar um modelo de QSAR que possa predizer de forma eficiente a potência
biológica das amidinas racionalizadas.
Propor modificações estruturais nas triazolil-amidinas para obtenção de
compostos mais potentes com base na análise das fenil-amidinas.
Avaliar o perfil das triazolil-amidinas como potenciais fármacos utilizando os
parâmetros ADMET, comparando com outros compostos descritos na literatura
como antagonistas do receptor de NMDA.
34
3. METODOLOGIA
3.1. Construção dos Modelos por Homologia
A construção dos modelos por homologia do domínio S1S2 das subunidades
NR2A-D do receptor de NMDA se iniciou com a identificação de proteínas moldes
(templates), baseado na similaridade com a seqüência de aminoácidos e na
semelhança funcional. Para isto, foi feita uma busca no banco de dados de
estruturas de proteínas PDB (http://www.rcsb.org/pdb/) (Bernstein et al., 1977,
Altschul et al., 1990). Para construção dos modelos de NR2B-D na forma fechada,
foi selecionada a estrutura cristalográfica da subunidade NR2A do receptor de
NMDA (forma fechada/ligada ao glutamato) disponível sob o código 2A5S
(Furukawa et al., 2005). Para a construção dos modelos NR2A-D na forma aberta foi
usada apenas para orientação da abertura, além da estrutura de NR2A na forma
fechada, a estrutura cristalográfica da subunidade GluR2 do receptor de AMPA
(forma aberta/ligada ao antagonista DNQX) disponível sob o código 1FTL
(Armstrong e Gouaux, 2000). Estes modelos foram construídos usando o servidor
Swiss Model (http://swissmodel.expasy.org/).
A seqüência primária do domínio S1S2 das subunidades NR2A-D do receptor
de NMDA e GluR2 do receptor de AMPA foram alinhadas usando o programa
Clustal-W, para analisar as similaridades na cadeia de aminoácidos.
Os modelos construídos foram submetidos a etapas sucessivas de
otimização da geometria usando o campo de força Gromos96, disponível no
programa Deep View / Swiss-PDB Viewer 3.7 (Guex e Peitsch, 1997), com o
objetivo de minimizar contatos desfavoráveis entre os resíduos. Em seguida, os
35
modelos foram validados pela análise do gráfico de Ramachandran e pela análise
do score 3D-1D, usando os programas Procheck e Verify-3D respectivamente,
ambos disponíveis no servidor Parmodel
(http://laboheme.df.ibilce.unesp.br/cluster/parmodel_mpi/index.php).
3.2. Docking dos modelos com os ligantes e análise das interações
Os complexos dos ligantes glutamato (agonista natural) e EAB515
(antagonista competitivo) com os modelos foram construídos usando técnicas de
alinhamento estrutural e docking manual considerando as estruturas dos ligantes e
dos modelos rígidas. Os complexos do glutamato com as subunidades NR2B,
NR2C, NR2D foram construídos pelo alinhamento estrutural com a estrutura
cristalográfica da subunidade NR2A usando o programa Deep View / Swiss-PDB
Viewer 3.7 (Guex e Peitsch, 1997). Os complexos do antagonista EAB515 com os
modelos das subunidades NR2A, NR2B, NR2C e NR2D foram construídos usando o
programa HyperChem Release 7 (Hypercube Inc, 2002) utilizando a orientação do
glutamato. A estrutura 3D do ligante EAB515 foi construída no programa Spartan’06
(Wavefunction Inc. Irvine, CA, 2000) e submetida à análise conformacional
sistemática, usando as opções padrões e o campo de força MMFF94 disponível no
programa Spartan. Após o docking manual, os complexos foram otimizados até um
gradiente interno a 0,1 kcal/molÅ, usando o campo de força MM++ disponível no
HyperChem Release 7.
A análise das interações entre os ligantes e as subunidades do receptor foi
realizada usando os programas Deep View / Swiss-PDB Viewer 3.7 (Guex e
Peitsch, 1997) e os programas Ligand-Protein Contacts - LPC
36
(http://bip.weizmann.ac.il/oca-bin/lpccsu), este último capaz de analisar
automaticamente os resíduos em contato e os tipos de interação (Sobolev et al.,
1999). A análise da variação do volume da cavidade formada no sítio de ligação do
glutamato foi realizada usando o programa Molegro Virtual Docker 2.4 (Molegro
Bioinformatics Solution, 2008).
3.3. Análise de SAR/QSAR de derivados de fenil-amidinas
As estruturas 3D das 17 fenil-amidinas (1a-1q) descritas na literatura como
antagonistas do receptor de NMDA (Claiborne et al., 2003) foram construídas no
programa Spartan’06, onde um derivado hipotético não substituído (R1=R2=H) foi
submetido à análise conformacional sistemática, usando as opções padrões e o
campo de força MMFF94, disponível no programa Spartan.
Realizando-se modificações apropriadas na estrutura do confôrmero mais
estável do derivado não substituído, obteve-se as estruturas 3D das 17 fenil-
amidinas (1a-1q) que foram submetidas a cálculos de otimização de geometria,
realizados no vácuo e sem qualquer restrição geométrica, usando o método semi-
empírico AM1. Em seguida cada estrutura foi submetida ao cálculo ab initio de ponto
único (single point) utilizando o método Hartree-Fock com a base 3-21G* disponível
no programa Spartan (Souza, 2007).
Os descritores estereoeletrônicos assim calculados correspondem às
energias dos orbitais de fronteira HOMO (Highest Occupied Molecular Orbital) e
LUMO (Lowest Unoccupied Molecular Orbital), aos coeficientes de distribuição dos
orbitais HOMO e LUMO, à densidade eletrônica e ao potencial eletrostático
molecular. As superfícies tridimensionais dos mapas de potencial eletrostático foram
37
geradas na faixa de energia entre -30 e +30 kcal/mol e sobrepostos em uma
superfície molecular de densidade de elétrons constante (0,002e/ua³). Cada ponto
do mapa expressa o valor da energia de interação eletrostática avaliado através de
um átomo prova de carga unitária positiva fornecendo uma indicação do tamanho
total e a forma das moléculas e da localização dos potenciais eletrostáticos atrativos
(negativos) e repulsivos (positivos) (Silva et al., 2008).
Outros descritores, como LogP (coeficiente de partição octanol/água), LogS
(solubilidade em água), foram calculados no programa Osiris Property Explorer
disponível em http://www.organic-chemistry.org/prog/peo/. Montou-se uma matriz de
correlação cruzada com os descritores calculados para identificar aqueles mais
correlacionados com a variação da resposta biológica (pIC
50
). Em seguida, foram
realizadas análises de regressão linear múltipla, aplicando o método de busca
sistemática de variáveis (descritores) (Ferreira et al., 2002) para gerar um modelo
(equação) de QSAR (Quantitative Structure-Activity Relationship) capaz de predizer
a potência biológica (pIC
50pred
).
3.4. Desenho racional de novas triazolil-amidinas usando QSAR
Dois novos potenciais antagonistas do receptor de NMDA (2a e 2b) foram
racionalizados utilizando conceitos de química medicinal, como hibridação molecular
e substituição aromática isostérica. As estruturas foram desenhadas combinando o
grupamento amidina presente nas fenil-amidinas da literatura com afinidade como
antagonistas do receptor de NMDA (Claiborne et al., 2003), com os anéis
heteroaromáticos triazóis, 1,2,3-triazol (2a) e 1,2,4-triazol (2b), presentes em
diversos fármacos conhecidos. A mesma metodologia usada no cálculo dos
38
descritores para as fenil-amidinas também foi aplicada às triazolil-amidinas. A
predição da potência biológica de 2a e 2b foi realizada utilizando o melhor modelo
de QSAR gerado na análise das fenil-amidinas, e por fim, foram propostas
modificações estruturais em 2a e 2b para a obtenção de compostos possivelmente
mais ativos (2c-2g).
3.5. Análise in silico dos parâmetros farmacocinéticos
As quatro fenil-amidinas mais potentes da literatura e as triazolil-amidinas
propostas foram submetidas à análise in silico dos parâmetros ADMET (absorção,
distribuição, metabolismo, excreção e toxicidade) usando o programa Osiris
Property Explorer (http://www.organic-chemistry.org/prog/peo/drugScore.html), onde
foram determinados o potencial de druglikeness e o drug score que é relacionado a
descritores topológicos, impressões de druglikeness, estruturas chaves e outras
propriedades como cLogP e massa molecular (Teckto, 2005).
A avaliação in silico da toxicidade de moléculas inclui efeitos mutagênico,
tumorigênico, irritante e sobre a reprodução.
Como os compostos planejados são para a administração via oral, eles
devem ser capazes de ser absorvidos no trato gastrintestinal e atravessar a barreira
hematoencefálica para atuar no sistema nervoso central (SNC). Desta forma, eles
foram avaliados de acordo com a “Regra dos Cinco” de Lipinski modificada para
penetração no SNC, que estabelece: peso molecular ≤400 daltons (Da), coeficiente
de partição octanol/água calculado (cLogP) ≤5, número de aceptores de ligação
hidrogênio (nALH) ≤7 e número de grupos doadores de ligação hidrogênio (nDLH)
≤3 (Pajouhesh e Lenz, 2005). A regra estabelece que pelo menos três destes
39
requisitos devem ser satisfeitos para que o composto apresente uma boa
biodisponibilidade oral e penetração no SNC. Além disso, foram calculados a área
superficial polar e o número de ligações rotáveis, parâmetros também relacionados
à capacidade do fármaco de permear as membranas biológicas, que devem ser
menores do que 90Å e 10 respectivamente (Pajouhesh e Lenz, 2005). Estas
propriedades foram obtidas utilizando os programas Spartan’06 e Molinspiration
(http://www.molinspiration.com/cgi-bin/properties) e comparada com as mesmas
propriedades calculadas para as fenil-amidinas e outros antagonistas do receptor de
NMDA (ifenprodil, Co101676, PD174494 e CI1041) (Barta-Szalai et al., 2004; Nikam
e Meltzer, 2002).
40
4. RESULTADOS
4.1. Análise do Receptor de NMDA
4.1.1. Alinhamento de seqüência e construção dos modelos por homologia
Para a análise da estrutura primária da região S1S2, das subunidades do
receptor de NMDA foi feito um alinhamento múltiplo entre as seqüências das
subunidades NR2A, NR2B, NR2C e NR2D do receptor de NMDA e da subunidade
GluR2 do receptor de AMPA, usando o programa Clustal-W (Figura 10).
O alinhamento das seqüências primária da região de interação com o
glutamato (domínio S1S2) destas proteínas revela uma alta similaridade entre as
subunidades NR2 (69-80%), enquanto entre as subunidades NR2 e GluR2, o
percentual de similaridade é significativamente menor (26-27%) (Tabela 3). Os
resíduos de cisteína nas posições 460, 745 e 800 se apresentam conservados em
todas as subunidades NR2 e GluR2. Enquanto os resíduos de cisteína 429, 436,
455 e 456 foram conservados apenas entre as subunidades NR2, sendo
substituídos na subunidade GluR2 (Figura 10). As cisteínas são importantes por
formar ligações dissulfeto intracadeia que estabilizam a estrutura da proteína.
A estrutura secundária realizada no programa Swiss Model revela a presença
de estruturas em α-hélices e folhas β-pregueada conservadas entre todas as
subunidades, inclusive GluR2. Uma pequena variação é observada apenas na
região que compreende os resíduos 430 a 460, que não está presente em GluR2,
que em NR2A e NR2C aparece como dois segmentos de folha β-pregueada um
pouco mais extensas do que em NR2B e NR2D (Figura 10).
41
Figura 10. Alinhamento entre as seqüências primárias da região S1S2 das subunidades
NR2A-D do receptor de NMDA e da subunidade GluR2 do receptor de AMPA mostrando a
predição da estrutura secundária (vermelho α-hélice e verde folha β-pregueada) e
destacando os resíduos de cisteínas (*). Os aminoácidos que participam da ligação ao
agonista glutamato estão destacados dentro de retângulos.
Os modelos 3D (estrutura terciária) teóricos das subunidades NR2A, NR2B,
NR2C e NR2D foram construídos automaticamente usando o servidor Swiss Model.
Os modelos na forma fechada usaram como molde a estrutura de cristalografia de
raio X de NR2A na forma fechada, disponível no PDB sob o código 2A5S. Para os
modelos na forma aberta, além da estrutura 2A5S ter sido utilizada também como
molde estrutural, a estrutura de cristalografia de raio X da subunidade GluR2 do
receptor de AMPA na forma aberta (código PDB 1FTL) foi usada para orientar o
grau de abertura entre os domínios S1 e S2 que caracteriza a forma aberta destas
estruturas.
Em seguida, as estruturas foram submetidas a diversos ciclos de
minimização de energia e foi realizado o docking do glutamato com as subunidades
nas formas fechadas e do antagonista EAB515 com as subunidades nas formas
abertas para avaliar as interações e comparar as subunidades do receptor de
NMDA entre elas e ainda com a subunidade GluR2 do receptor de AMPA.
Considerando as formas fechadas, o alinhamento estrutural entre as subunidades
42
NR2 revela um desvio de RMS entre 0,16 e 0,30 Å, e entre as subunidades NR2 e
GluR2, um desvio de RMS de 1,36 Å. Considerando as formas abertas, o desvio de
RMS varia de 0,76 a 1,21 entre as subunidades NR2 e de 1,20 a 1,44 entre as
subunidades NR2 e GluR2 (Tabela 3 e Figura 11).
Tabela 3. Comparação dos valores percentuais de identidade e dos valores de RMS
resultantes do alinhamento das estruturas primárias e terciárias respectivamente das
subunidades NR2A, NR2B, NR2C e NR2D do receptor de NMDA e da subunidade GluR2
do receptor de AMPA.
Subunidades
Identidade
a
(%)
RMS
b
(Å)
(forma fechada)
RMS
b
(Å)
(forma aberta)
NR2A/NR2B 80 0,16 0,76
NR2A/NR2C 74 0,26 1,06
NR2A/NR2D 71 0,21 1,08
NR2A/GluR2 27 1,36 1,26
NR2B/NR2C 72 0,28 1,15
NR2B/NR2D 69 0,25 0,97
NR2B/GluR2 27 1,36 1,20
NR2C/NR2D 78 0,30 1,21
NR2C/GluR2 26 1,36 1,44
NR2D/GluR2 26 1,36 1,43
a) Percentual de identidade resultante do alinhamento das estruturas primárias (seqúência
de aminoácidos da região S1S2 do domínio de ligação ao glutamato.
b) Raiz dos mínimos quadrados das distâncias interatômicas resultantes da sobreposição
das cadeias principais das formas fechada e aberta das subunidades NR2A-D e GluR2.
Os modelos nas formas fechada e aberta foram validados pela análise do
gráfico de Ramachandran usando o programa Procheck (Laskowski et al., 1993)
(Tabela 4). A análise dos gráficos demonstra que os modelos apresentam uma boa
estereoquímica, visto que cerca de 81-87% dos resíduos adotam ângulos de torção
Φ e Ψ
mais favoráveis semelhantes ao molde (template) utilizado (NR2A). Apenas
cerca de 1% dos resíduos encontram-se em regiões desfavoráveis, sendo que estes
4
3
resíduos se localizam em regiões distantes do sítio de ligação ao glutamato, o que
não compromete a análise da interação com este ligante.
Figura 11. Comparação da estrutura 3D dos modelos da região S1S2 das subunidades
NR2B - NR2D na forma fechada e NR2A – D aberta e da estrutura cristal das subunidades
NR2A do receptor de NMDA na forma fechada e GluR2 de AMPA na forma aberta. (A)
Formas fechadas (1ª linha) e abertas (2ª linha). Mapas de potencial eletrostático das formas
fechadas mostrando a visão frontal (3ª linha) e com rotação de 180° no eixo vertical (4ª
linha). (B) Sobreposição das formas fechadas (esquerda) e abertas (direita).
44
Tabela 4. Análise do gráfico de Ramachandran para os modelos nas formas aberta e
fechada e para os moldes (templates) utilizados (NR2A F e GluR2 A).
% de Resíduos nas regiões
Subunidades
Favoráveis Permitidas Não-favoráveis
NR2A F (molde) 87,1 12,9 0
NR2B F 87,1 12,5 0,4
NR2C F 87,1 12,1 0,8
NR2D F 84,9 13,4 1,7
NR2A A 85,6 13,6 0,8
NR2B A 85,5 13,7 0,8
NR2C A 84,2 15,4 0,4
NR2D A 81,3 17,0 1,7
GluR2 A (molde) 94,4 5,6 0
F = fechada, A = aberta
Na validação dos modelos, foi utilizado também o programa Verify3D, que
avalia a compatibilidade entre a estrutura tridimensional de uma proteína e a sua
própria seqüência de aminoácidos e estabelece um valor de pontuação (score) total
relacionado à qualidade do modelo (Luthy et al., 1992) (Figura 12). Os modelos das
subunidades NR2A, NR2B, NR2C e NR2D do receptor de NMDA nas formas
fechadas e abertas apresentam valores próximos do ideal e semelhantes também
ao obtido para o molde (NR2A), sendo que NR2B e NR2C na forma aberta
apresentam valores ainda mais altos do que o molde.
A análise do score dos resíduos individualmente mostra valores aceitáveis
para todos os modelos. Apenas NR2A e NR2D nas formas abertas apresentam
alguns resíduos com scores negativos localizados longe do sítio de ligação, o que
45
não deve comprometer a qualidade dos modelos e das interações analisadas
(Figura 12).
Figura 12. Gráfico da análise do Verify3D para os modelos do receptor de NMDA nas
formas fechada (A) e aberta (B). NR2A em azul, NR2B rosa, NR2C amarelo e NR2D verde.
A análise dos mapas de potencial eletrostático dos modelos mostra um perfil
de distribuição de cargas diferenciado entre as subunidades (Figura 11). Enquanto
NR2A, NR2B e NR2D apresentam uma maior proporção de regiões negativas em
vermelho (ácidas), em NR2C e em GluR2 predominam as regiões neutras.
Em relação à cavidade do sítio de ligação para o glutamato foi observada a
presença de uma região negativa nas subunidades NR2 e uma região mais neutra
46
em GluR2. De modo interessante, em todos os modelos, na região próxima à
carboxila do ligante (glutamato) está presente uma região positiva em azul (básica)
na proteína que favorece uma possível interação eletrostática (iônica). A análise dos
mapas de potencial eletrostático mostra que, apesar do alto percentual de resíduos
conservados nestas estruturas, existem diferenças significativas na distribuição de
cargas e na superfície molecular (Figura 11).
O modelo da subunidade NR2B na forma fechada construído neste estudo foi
comparado com o modelo relatado por Tickhonova e colaboradores (Tickhonova et
al., 2002), cujo molde é a subunidade GluR2 do receptor de AMPA que apresenta
apenas 27% de identidade com NR2B, diferente do nosso modelo cujo molde é a
NR2A, uma subunidade do próprio receptor de NMDA, que apresenta 80% de
identidade com NR2B (Figura 13).
Figura 13. Comparação entre a estrutura cristal da subunidade NR2A (molde) e os modelos
de NR2B construído neste trabalho (Modelo 1) e descrito por Tickhonova e colaboradores
(Modelo 2). Em cinza o alinhamento entre os modelos com a subunidade NR2A ressaltando
em cores a região 430-460 (NR2A em azul, modelo 1 em vermelho e modelo 2 em verde).
47
A análise dos desvios de RMS demonstra uma maior similaridade entre
NR2A e o nosso modelo do que com o modelo de Tickhonova e colaboradores,
principalmente na região da alça 430-460, que mostra um deslocamento no modelo
anterior (Figura 13). De acordo com a homologia entre NR2B e NR2A, o nosso
modelo pode apresentar uma confiabilidade maior do que o descrito por Tickhnova,
o que permite uma melhor análise da relação estrutura-atividade para os ligantes do
receptor de NMDA.
4.1.2. Docking, análise das interações e da mudança conformacional entre as
formas aberta e fechada das subunidades do receptor de NMDA
Os modelos das subunidades na forma fechada foram alinhados com a
estrutura da subunidade NR2A do receptor de NMDA, obtida por cristalografia de
raios X para realização do docking com o agonista glutamato. Os complexos foram
otimizados e as interações entre o ligante e a subunidade e foram analisadas. A
análise do sítio de ligação mostra que os resíduos que participam interagindo por
ligação hidrogênio foram conservados, inclusive nas mesmas posições nas
subunidades NR2A, NR2B, NR2C e NR2D, enquanto em GluR2, ocorre
deslocamento e algumas substituições (Figura 14).
O estudo do sítio de ligação ao glutamato mostra os seguintes aminoácidos
capazes de realizar ligações hidrogênio ou interações eletrostáticas com o ligante
nas subunidades NR2A-D do receptor de NMDA: Ser511, Thr513, Arg518, Ser689 e
Thr690. De modo interessante, o resíduo His485 é capaz de fazer uma interação
cátion-π com o grupo amino do glutamato.
48
Figura 14. Alinhamento estrutural da região do sítio de ligação ao glutamato das
subunidades NR2, NR2B, NR2C e NR2D do receptor de NMDA e GluR2 do receptor de
AMPA. NR2A azul, NR2B rosa, NR2C amarelo, NR2D verde e GluR2 cinza.
Na subunidade GluR2 do receptor de AMPA, os resíduos His485, Ser511 e
Asp731 são substituídos por Tyr485, Pro511 e Leu731 respectivamente. O resíduo
Pro511 na subunidade GluR2 também interage por ligação hidrogênio com o
glutamato, a Leu731 não é capaz de interagir enquanto o resíduo Glu732 é capaz
de interagir com o glutamato, diferente do que ocorre no receptor de NMDA, em que
nesta posição, está presente uma alanina. A Tyr485 também faz uma interação
cátion-π em GluR2 (Figura 15).
Além disso, foi realizado o docking do antagonista EAB515 com as formas
abertas das subunidades NR2A, NR2B, NR2C e NR2D, de modo a analisar as
diferenças na interação com estas subunidades, já que diferente da maioria, este
antagonista apresenta uma maior afinidade por NR2B do que por NR2A.
49
Figura 15. Comparação do sítio de ligação ao glutamato na presença do agonista (branco)
na subunidade NR2B do receptor de NMDA (A) e GluR2 do receptor de AMPA (B).
Para realizar o docking com os modelos nas formas abertas, o composto
EAB515 foi submetido a uma análise conformacional onde buscou-se uma
conformação de menor energia mas que fosse semelhante também a estrutura do
glutamato obtida por cristalografia de raio X com NR2A e foi feito o alinhamento com
o glutamato através dos grupos amino e carboxila presentes em ambas as
estruturas e baseado na semelhança na distribuição de cargas na superfície (Figura
16). Os complexos foram construídos (NR2A-EAB515, NR2B-EAB515, NR2C-
EAB515 e NR2D-EAB515) e otimizados e as interações analisadas.
Figura 16. Comparação do mapa de potencial eletrostático do agonista glutamato
(esquerda) e antagonista EAB515 (direita), mostrando as regiões carregadas positivamente
(azul) e negativamente (vermelho).
50
A análise dos aminoácidos das subunidades NR2A-D contidos dentro de um
raio de 10 Å de distância do antagonista EAB515 mostra que a maioria dos resíduos
são conservados nesta região, sendo apenas alguns substituídos como: Glu714Asp
em NR2B, Ala414Arg, Gly712Ser em NR2C e Ala414Arg, Arg692Lys, Arg711Pro,
Gly712Arg em NR2D (Figura 17).
Figura 17. Aminoácidos contidos num raio de 10 Å de distância do antagonista EAB515 no
complexo das subunidades do receptor de NMDA.
A comparação do docking entre as subunidades NR2A, NR2B, NR2C e
NR2D com o ligante EAB515 mostra diferenças na forma de encaixe do ligante
(Figura 18), principalmente no caso de NR2D onde se observam resíduos diferentes
interagindo (e.g. Asn515 e Asp731).
Figura 18. Alinhamento estrutural da região do sítio de ligação ao glutamato na presença do
antagonista entre as subunidades NR2A-D do receptor de NMDA, NR2A azul, NR2B rosa,
NR2C amarelo e NR2D verde.
411 483 496 510 531 684 711 728 759
NR2A ---LEEAPF---GKHG---M---GSLTINEER---TGI---TVPNGSTER---RGVE---FIYDAAVL---TGY---
NR2B ---LEAAPF---GKHG---M---GSLTINEER---TGI---TVPNGSTER---RGVD---FIYDAAVL---TGY---
NR2C ---LEERPF---GKHG---M---GSLTINEER---TGI---TVPNGSTER---RSVE---FIYDAAVL---TGY---
NR2D ---LEERPF---GKHG---M---GSLTINEER---TGI---TVPNGSTEK---PRVE---FIYDAAVL---TGY---
51
De forma interessante, a Lys484, que faz uma interação cátion-π em NR2A-
C, se encontra mais afastada do anel em NR2D interagindo com o grupo amino de
EAB515, enquanto a His485, que interage com o anel aromático do ligante nas
outras subunidades, em NR2D encontra-se orientada para o lado oposto. A His485,
em NR2C, faz uma interação iônica com a carboxila do ligante diferente da Thr690
que está muito distante em NR2C para interagir por ligação hidrogênio.
NR2A e NR2B são as subunidades predominantemente expressas no cérebro,
e devido ao potencial dos antagonistas seletivos para NR2B para serem usados na
terapia, o sítio de interação com o ligante nestas duas subunidades foi analisado, no
intuito de explicar a seletividade maior de EAB515 por NR2B. Alguns resíduos
interagem através de ligações hidrofóbicas e são conservados nas duas
subunidades como: Glu413, Lys484, His485, Val713, Tyr730 e Val734, sendo que a
Leu411 interage apenas em NR2A tendo em vista sua distância em NR2B.
Observam-se interações entre os anéis aromáticos da His485 e da Tyr730 enquanto
Lys484 parece fazer uma interação cátion-π. Os resíduos Glu412, Glu413, His485,
Thr684, Asn687, Gly688, Asp731, Tyr761 participam interagindo através de
interações mais fracas como dipolo-dipolo ou Van der Walls nas duas subunidades.
As ligações hidrogênio ou iônicas que são mais fortes ocorrem com os
aminoácidos Ser511, Thr513, Arg518, Ser689, Thr690 em ambas as subunidades
apesar de algumas ligações ocorrerem entre átomos diferenciados. Na subunidade
NR2B observou-se a formação de uma ligação hidrogênio extra com o antagonista,
o que poderia estabilizar melhor o complexo e justificar uma maior afinidade do
ligante por NR2B em relação a NR2A (Figura 19). A energia de complexação com o
antagonista EAB515 foi também um pouco menor para NR2B.
52
Figura 19. Comparação entre interações com o antagonista competitivo EAB515 (branco)
(A) na subunidade NR2A e (B) na subunidade NR2B do receptor de NMDA (cinza).
Além disso, foi analisada a mudança conformacional que o receptor pode
sofrer ao ligar ao agonista e ao antagonista, o que pode ser observado através do
alinhamento entre as estruturas, da variação no RMS entre as formas aberta e
fechada e do volume da cavidade na região do sítio de ligação que é maior na forma
aberta do que na forma fechada. A variação do RMS (1,89 a 3,75) e a variação no
volume da cavidade (168,75 – 535,55 Å
3
) confirmam que as estruturas NR2A-NR2D
do receptor de NMDA sofrem uma mudança conformacional, semelhante a que
ocorre com a subunidade GluR2 do receptor de AMPA (Figura 20).
Figura 20. Alinhamento estrutural entre os modelos (NR2A, NR2B, NR2C e NR2D) e
estrutura cristal de GluR2 nas formas aberta (verde) e fechada (azul), mostrando o
glutamato no centro da molécula. Em destaque a tabela mostrando a variação de RMS e de
volume da cavidade formada no sítio de ligação entre as formas aberta e fechada.
53
4.2. Análise dos ligantes do receptor de NMDA
4.2.1. Análise de SAR/QSAR de derivados de fenil-amidinas
Com o intuito de realizar o planejamento de antagonistas do receptor de
NMDA mais potentes foi aplicado um estudo de modelagem molecular para a série
de 17 fenil-amidinas (1a-1q) já reportadas na literatura (Claiborne et al., 2003) como
antagonistas seletivos da subunidade NR2B do receptor de NMDA que parecem se
ligar ao sítio de moduladores alostéricos (Tabela 5).
Tabela 5. Comparação incluindo o perfil biológico: (afinidade de ligação - pK
i
e atividade
functional - pIC
50
) das 17 fenil-amidinas (1a-1q), o pIC
50
calculado e os descritores -
energia de HOMO/LUMO (E
HOMO
e E
LUMO,
Ev), Momento dipolo molecular (µ, Debye),
massa molecular g/mol (MM), área superficial molecular (ASM, Å
2
), ovalidade, razão entre
volume e área (oval), número de grupamentos aceptores de ligação hidrogênio (nALH) e
doadores (nDLH), coeficiente de partição octanol/água (cLogP) e cLogS (solubilidade em
água calculada)
a) Valores experimentais de pIC
50
(M) e pK
i
(M) [Claiborne et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. (2003)
13:697], b) Valores de pIC
50
foram obtidos usando a equação 1 [pIC
50
= 0,336(cLogP) + 1,612(E
HOMO
)
+12,636(Ovalidade) + 1,867 (n=17, R
2
= 0,854), c) nDLH (número de grupos doadores de ligação
hidrogênio) não foram mostrados por ser igual a 2 para todos os compostos.
54
Nas análises de SAR e QSAR foram calculados diversos descritores
moleculares como energia de HOMO/LUMO (E
HOMO
e E
LUMO
), momento dipolo
molecular (µ), Área de Superfície Molecular (ASM), Ovalidade (razão entre volume e
área), Volume Molecular (VM), Massa Molecular (MM), coeficiente de partição
octanol/água calculado (cLogP), solubilidade em água (cLogS) e número de
grupamentos aceptores de ligação hidrogênio (ALH) (Tabela 5).
A análise destes descritores moleculares revelou características importantes
que podem estar relacionadas com a atividade experimental de antagonista do
receptor de NMDA (pIC
50Exp
). A matriz de correlação cruzada (Tabela 6) mostrou
que E
HOMO
, MM, ASM, ovalidade e número de grupos aceptores de ligação
hidrogênio foram os descritores mais correlacionados com os valores de pIC
50
.
Tabela 6. Matriz de correlação cruzada entre a atividade biológica experimental (pK
i
e pIC
50
)
[Claiborne et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. (2003) 13: 697] energia de HOMO/LUMO (E
HOMO
e E
LUMO,
Ev), Momento dipolo molecular (µ, Debye), Massa molecular g/mol (MM), área
superficial molecular (ASM, Å
2
), Ovalidade (razão entre volume e área), número de
grupamentos aceptores de ligação hidrogênio (nALH) e doadores (nDLH), coeficiente de
partição octanol/água (cLogP) e cLogS (solubilidade em água calculada) para as 17 fenil-
amidinas (1a-1q).
pIC
50Exp
pK
i
E
HOMO
E
LUMO
µ VM
ASM
Ovalidade
MM
cLogP
LogS
nALH
pIC
50Exp
1,00
pK
i
0,78 1,00
E
HOMO
0,60 0,27
1,00
E
LUMO
0,19 0,05
0,54 1,00
µ 0,09 0,01
0,06 0,02
1,00
VM 0,74 0,65
0,08 -0,12
0,36
1,00
ASM 0,74 0,66
0,07 -0,13
0,32
1,00
1,00
Ovalidade
0,72 0,65
0,05 -0,18
0,25
0,98
0,99
1,00
MM 0,48 0,61
-0,29
-0,19
0,37
0,88
0,87
0,85 1,00
cLogP 0,15 0,60
-0,50
-0,37
0,17
0,48
0,48
0,48 0,73
1,00
LogS -0,20 -0,66
0,40 0,17
-0,18
-0,46
-0,46
-0,45 -0,72
-0,97
1,00
nALH 0,69 0,43
0,49 0,57
0,30
0,63
0,61
0,57 0,50
-0,08
-0,04
1,00
55
A tabela 6 também mostra que o ensaio de ligação ao NR2B (pK
i
) está
diretamente correlacionado ao ensaio funcional (pIC
50
), o que indica que a atividade
antagonista está relacionada à capacidade de ligar à esta subunidade (Tabelas 5 e
6).
Foi realizada também uma análise de regressão linear múltipla para gerar um
modelo de QSAR e orientar o planejamento de novas moléculas. Com este
propósito, foi aplicado um aparato de busca sistemática para a seleção de variáveis
(Ferreira et al, 2002) para examinar a correlação destes descritores calculados com
a atividade funcional (pIC
50Exp
) das 17 fenil-amidinas (1a-1q) (Tabela 5). Assim, para
construir um modelo de QSAR capaz de predizer a atividade biológica (pIC
50pred
)
foram usadas ovalidade, E
HOMO
e cLogP, já que estas variáveis possibilitaram a
construção da melhor equação para reproduzir efetivamente a atividade
experimental (Equação 1).
Os valores de atividade preditos por nosso modelo foram muito semelhantes
aos experimentais, o que pode ser observado pela diferença máxima entre a
atividade experimental e a predita (0,60), a diferença mínima (0,02) e a média
(0,23). Através do gráfico pIC
50Exp
versus pIC
50Calc
foi possível perceber que os
valores se encontravam próximos da correlação perfeita representada pela reta,
sendo o desvio padrão dos valores residuais (pIC
50Exp
- pIC
50Calc
) igual a 0,29. O
único composto que se comportou fora dos valores aceitáveis e, portanto, constitui-
pIC
50Pred
= 0,336(cLogP) + 1,612(E
HOMO
) +12,636(Ovalidade) + 1,867 Eq. (1)
(n = 17, R
2
= 0,854)
56
se um outlier, foi o 1i, visto que, apresentou um valor residual de 0,60, e assim, um
pouco maior que o dobro do desvio padrão (Figura 21).
5
5,5
6
6,5
7
7,5
8
8,5
9
9,5
10
5 5,5 6 6,5 7 7,5 8 8,5 9 9,5 10
pIC
50Exp
pIC
50Calc
Figura 21. Gráfico dos valores de pIC
50
experimental versus calculado para os compostos
1a a 1q. A reta representa o que seria uma correlação perfeita.
Os mapas de potencial eletrostático das fenil-amidinas (1a–1q) (Figura 22)
revelaram que elas apresentam características estereoeletrônicas semelhantes
mostrando uma forma em “V”, com o grupo amidina no meio e os anéis fenilas nas
pontas.
Os quatro compostos mais ativos apresentaram substituintes doadores de
elétrons na posição R
2
(OMe ou Me), o que resulta em carga negativa concentrada
no anel fenila, enquanto na posição R
1
a maioria apresenta uma carga negativa, que
no grupo CF
3
está relacionada aos átomos flúor e no OCF
3
está mais relacionada ao
oxigênio (Figura 22).
57
Figure 22. Estrutura molecular da conformação mais estável (A) e mapa de potencial
eletrostático molecular das fenil-amidinas (1a-1q) (B).
4.2.2. Desenho de duas triazolil-amidinas e predição da atividade biológica (2a-
2b)
Inicialmente dois novos derivados de triazolil-amidinas (2a-2b) foram
desenvolvidos combinando-se o grupamento amidina presente nas fenil-amidinas da
literatura já reconhecidas como antagonistas do receptor de NMDA (Claiborne et al.,
2003), e realizando uma substituição isostérica aromática em Ar
1
e Ar
2
pelos grupos
58
1,2,3-triazol (2a) e 1,2,4-triazol (2b) baseado nos estudos de modelagem molecular
e QSAR. No caso do composto 2b além da substituição isostérica foi feita a
remoção do grupo metileno (Figura 23).
Figure 23. Desenho racional das triazolil-amidinas (2a-2g).
Os triazóis 2a e 2b recém propostos foram submetidos aos mesmos cálculos
que as fenil-amidinas e observou-se que o composto 2a apresentou alto valor de
energia de HOMO, semelhante às fenil-amidinas mais ativas, um maior número de
grupos aceptores de ligações hidrogênio e valores medianos de volume e área,
diferentemente, 2b apresentou apenas o número de grupos aceptores de ligação
hidrogênio maior do que as amidinas mais ativas (Tabela 5 e 7).
A análise dos mapas de potencial eletrostático de 2a e 2b mostrou uma forma
geral semelhante àquela observada para as fenil-amidinas (1a-1q), porém 2b
apresentou uma estrutura mais rígida e um perfil eletrônico um pouco diferenciado,
com uma região mais eletronegativa.
59
Tabela 7. Comparação do pIC
50
(M)
predito e descritores incluindo energia de HOMO/LUMO
(E
HOMO
e E
LUMO,
Ev), Momento dipolo molecular (µ, Debye), Massa molecular g/mol (MM),
área superficial molecular (ASM, Å
2
), ovalidade, razão entre volume e área (oval), número
de grupamentos aceptores de ligação hidrogênio (nALH) e doadores (nDLH), coeficiente de
partição octanol/água (cLogP) e cLogS (solubilidade em água calculada). Estrutura
molecular da conformação mais estável (A) e mapa de potencial eletrostático molecular (B)
das triazolil-amidinas sintetizadas (2a-2b).
a) Valores de pIC
50
predito obtidos na equação 1 [pIC
50
= 0,336(cLogP) + 1,612(E
HOMO
)
+12,636(Ovalidade) + 1,867 (n=17, R
2
= 0,854).
A partir dos resultados teóricos positivos, as fenil-amidinas 2a e 2b foram
então sintetizadas e testadas em ensaios biológicos que mostraram o seu perfil
neuroprotetor frente à morte celular induzida pelo glutamato (1 mM) em culturas de
neurônios de aves. Ambos 2a e 2b (100 nM) incubados por 48 h protegeram os
neurônios do efeito do glutamato (73% e 55% respectivamente) (Figura 24).
O perfil de citotoxicidade de 2a e 2b foi analisado em células Vero e mostrou
um perfil seguro para as duas moléculas: (2a CC
50
= 1402,0 µM e 2b CC
50
= 1403,5
µM). Além disso, o perfil de neurotoxicidade em culturas de retina de pinto
demonstrou uma significativa sobrevivência neuronal (88 e 71%) na presença de 2a
e 2b respectivamente (Figure 24).
Composto
pIC
50Pred
a
E
HOMO
VM ASM Oval nALH
nDLH
MM cLogP
2a 7,71 -8,72 293,42 319,02 1,49 5 2 277,33 3,05
2b 5,01 -9,47 221,81 251,72 1,42 5 3 255,20 1,38
60
Figura 24. Efeito Neuroprotetor das triazolil-amidinas 2a e 2b (100 nM) frente à morte
celular induzida pelo glutamato (1 mM) em culturas de retina de pinto. Os dados
representam a média ± SEM de 3 experimentos individuais.
4.2.3. Modificação estrutural e desenho de triazolil-amidinas mais ativas (2c-
2g)
No intuito de aumentar o potencial destes compostos como antagonistas do
receptor de NMDA, planejamos algumas modificações estruturais em 2a e 2b
baseados na análise de SAR/QSAR das fenil-amidinas (Tabela 5). Desta forma, os
compostos 2c-2g (Figura 23) foram desenhados, realizando-se a substituição
isostérica em Ar
1
e Ar
2
com os grupos triazolil e adicionando também alguns
substituintes baseado nas fenil-amidinas mais potentes.
Analisando os descritores calculados para os novos derivados foi observado o
aumento dos valores de energia de HOMO, VM e ASM e foi mantido o número de
grupos aceptores de ligação hidrogênio, exceto para 2f. A análise destes compostos
revelou que todos os novos derivados 2c-2g apresentam teoricamente um potencial
maior como candidato a fármaco do que 2a e 2b.
61
Tabela 8. Comparação do pIC
50
(M)
predito e descritores incluindo energia de HOMO/LUMO
(E
HOMO
e E
LUMO,
Ev), momento dipolo molecular (µ, Debye), massa molecular g/mol (MM),
área superficial molecular (ASM, Å
2
), ovalidade, razão entre volume e área (oval), número
de grupamentos aceptores de ligação hidrogênio (nALH) e doadores (nDLH), coeficiente de
partição octanol/água (cLogP) e cLogS (solubilidade em água calculada). Estrutura
molecular da conformação mais estável (A) e mapa de potencial eletrostático molecular (B)
das triazolil-amidinas desenhadas (2c-2g).
a) Valores de pIC
50
predito foram obtidos usando a equação 1 [pIC
50
= 0,336(cLogP) + 1,612(E
HOMO
)
+12,636(Ovalidade) + 1,867 (n=17, R
2
= 0,854).
De forma interessante, os valores de energia de HOMO (-8,63 a -7,91 eV)
destes compostos foram próximos àqueles observados para as quatro fenil-
amidinas mais potentes (-8,80 a -8,56 eV), bem como o VM (272,88-348,40 Å
3
e
307,64-313,44 Å
3
), ASM (295,27-379,98 Å
2
e 334,85-342,25 Å
2
) e ovalidade (1,46-
1,58 e 1,52-1,53) respectivamente, enquanto o número de grupos aceptores de
ligação hidrogênio eram maiores (Tabela 5 e 8).
De forma análoga, a análise dos mapas de potencial eletrostático (2c-2g)
revelou um perfil estereoeletrônico semelhante àquele observado para as fenil-
amidinas da literatura (1a-1q). As propriedades eletrônicas analisadas revelaram
uma carga negativa no anel fenila em Ar
2
semelhante às fenil-amidinas mais ativas,
mas com regiões mais eletronegativas devido ao grupo triazolil. Estas propriedades
podem ser importantes para a interação com o alvo (Figura 22 e Tabela 8).
Composto
pIC
50Pred
a
E
HOMO
VM ASM Oval nALH nDLH MM cLogP
2c 7,92 -8,63 293,68 320,20 1,50 5 2 277,33 3,05
2d 8,35 -8,61 321,02 350,03 1,53 5 2 307,36 2,95
2e 8,46 -8,63 320,71 347,34 1,54 5 2 307,36 2,95
2f 9,41 -8,54 348,40 379,27 1,58 8 2 344,38 3,86
2g 8,30 -7,91 272,88 295,98 1,46 5 3 263,30 2,42
B
A
62
A aplicação da equação de QSAR derivada das 17 fenil amidinas (1a-1q) para
predizer a potência biológica (pIC
50Pred
) dos compostos 2a-2g mostrou que, exceto
para o composto 2b (pIC
50Pred
= 5,01 M), a potência calculada para as triazolil
amidinas foram semelhantes ou melhores do que para as fenil-amidinas mais
potentes (1a-1d) (Tabelas 5, 7 e 8).
4.2.4. Análise in silico dos parâmetros ADMET
As triazolil-amidinas (2a-2g) foram submetidas a uma análise in silico usando o
programa Osiris para avaliar o potencial teórico destes compostos como candidatos
a novos fármacos, comparando com as quatro fenil-amidinas mais potentes. Para
isso, determinamos os valores de: a) cLogP, que corresponde a lipofilicidade do
composto; b) risco toxicológico relacionado aos efeitos irritantes, mutagênico,
tumorigênico e sobre a reprodução; c) druglikeness que avalia a freqüência de
ocorrência de fragmentos comuns a fármacos comerciais; e) drug score, que
combina druglikeness, cLogP, LogS, massa molecular e risco de toxicidade em um
valor que pode inferir o potencial de um composto se tornar um futuro fármaco.
De acordo com a avaliação do Osiris, a lipofilicidade (cLogP) das triazolil-
amidinas (2a-2g) (1,38-3,86) foi semelhante àquela observada para as fenil-
amidinas mais potentes (1a-1d) (2,97-3,71) e apontou que os compostos seriam
suficientemente hidrofóbicos para penetrarem nas membranas biológicas (Tabela 3
e 5). As triazolil-amidinas apresentaram ainda um melhor perfil de druglikeness e
drug score do que os estimados para as fenil-amidinas e também para outros
antagonistas do receptor de NMDA (ifenprodil, Co101676, PD174494 e CI1041)
(Barta-Szalai,2004; Nikam, 2002).
63
Os derivados 2a-2g mostraram valores de druglikeness menores do que
ifenprodil e PD174494, mas melhores do que os do Co101676 e CI1041 bem como
drug scores semelhantes ou melhores do que estes outros antagonistas (Figura 25).
Figure 25. A. Comparação dos valores de druglikeness e drug score das fenil-
amidinas mais potentes (1a-1d), das triazolil-amidinas (2a-2g) e dos antagonistas do
receptor de NMDA descritos na literatura.
Quando avaliamos os compostos utilizando a “regra dos 5” de Lipinski
modificada para penetração no SNC, os nossos resultados mostraram que todas as
triazolil-amidinas e também as quatro fenil-amidinas avaliadas atendem aos
requisitos inferindo sua capacidade de penetração no SNC e uma boa
biodisponibilidade oral. Fármacos que agem no SNC devem ter uma área de
superfície polar (ASP) <60-70 Å
2
(Tabela 9) e número de ligações rotáveis <8, o que
foi observado nas triazolil-amidinas estudadas.
64
Tabela 9. Análise das propriedades físico-químicas teóricas das triazolil-amidinas (2a-2g)
envolvidas na biodisponibilidade oral para fármacos do SNC.
Composto
nALH nDLH PM cLogP PSA nRot
2a 5 2 277,33 3,05 50,50 4
2b 5 3 255,20 1,38 62,72 2
2c 5 2 277,33 3,05 52,18 3
2d 5 2 307,36 2,95 56,63 5
2e 5 2 307,36 2,95 59,34 5
2f 8 2 344,38 3,86 74,42 4
2g 5 3 263,30 2,42 62,47 2
A avaliação da toxicidade no Osiris revelou que a maioria das triazolil-amidinas
possui um baixo risco de causar efeitos irritantes, tumorigênicos, mutagênicos e
reprodutivo exceto 2b e 2g que apresentaram algum risco teratogênico. Os outros
antagonistas do receptor de NMDA previamente descritos também apresentaram
baixo risco de toxicidade exceto PD17244494 que mostrou alto risco irritante,
enquanto as fenil-amidinas 1b e 1c apresentaram riscos mutagênicos e 1d um alto
efeito teratogênico (Figure 26).
Figure 26. Risco de toxicidade calculado através do Osiris Property Explorer para as fenil-
amidinas mais potentes (1a-1d), as triazolil-amidinas (2a-2g) e antagonistas do receptor de
NMDA descritos na literatura.
65
5. DISCUSSÃO
O receptor de N-metil-D-aspartato (NMDA) é uma molécula que apresenta
funções importantes no sistema nervoso (SNC) de mamíferos incluindo nos quadros
patogênicos correlatos (Kaye et al., 2007). Nos últimos anos, vários estudos vêm
sendo realizados para o desenvolvimento de antagonistas do receptor de NMDA
para o tratamento de doenças neurodegenerativas como: doenças de Alzheimer,
Parkinson, Huntington, derrame e trauma. O receptor de NMDA é composto por
tetrâmeros formados por subunidades NR1 e NR2 (A-D) (Furukawa et al., 2005;
Paoletti e Neyton, 2007). A literatura demonstra que antagonistas seletivos da
subunidade NR2B podem apresentar menos efeitos adversos, visto que esta
subunidade não está presente no cerebelo, o que deverá evitar os efeitos adversos
sobre a função locomotora (Curtis et al., 2003).
Este trabalho envolve duas seções onde na primeira parte realizamos a
construção de modelos por homologia do domínio S1S2 das subunidades NR2B,
NR2C e NR2D do receptor de NMDA na forma fechada (ligada ao agonista natural
glutamato) e das subunidades NR2A, B, C e D na forma aberta (ligada ao
antagonista EAB515) e na segunda parte, fizemos a análise da relação estrutura-
atividade (SAR) de 17 fenil-amidinas (1a-1q) (Claiborne et al., 2003) e desenhamos
de forma racional novas triazolil-amidinas (2a-2g) com potencial perfil biológico.
5.1. Análise dos Modelos do Receptor de NMDA
Neste trabalho, a análise da estrutura primária das subunidades NR2A-D do
receptor de NMDA e GluR2 do receptor de AMPA mostrou que os aminoácidos são
66
mais conservados entre as subunidades do receptor de NMDA do que no receptor
de AMPA provavelmente devido a maior semelhança funcional. Apesar das
diferenças na estrutura primária, a estrutura secundária é bastante conservada em
todas as subunidades inclusive em GluR2 do receptor de AMPA com diferença
apenas na inserção de um gap 430-455 em GluR2, o que se mostra análogo aos
resultados obtidos por Tickhonova e colaboradores, 2002).
Os modelos da região do domínio S1S2 das subunidades NR2B-D na forma
fechada e NR2A-D na forma aberta do receptor de NMDA foram construídos usando
a modelagem por homologia e através dos modelos foi possível um estudo da
estrutura terciária destas subunidades. Foi demonstrada uma alta conservação da
estrutura tridimensional, inclusive em GluR2 do receptor de AMPA, que apesar de
ter apenas 27% de identidade na seqüência de aminoácidos, conserva uma
estrutura semelhante, mostrando uma evolução convergente, que confirma que no
curso da evolução, a seqüência tende a se modificar mais rapidamente do que a
estrutura terciária. Apesar de semelhantes na forma geral, a análise do desvio de
RMS resultante da sobreposição da cadeia principal destas subunidades nas formas
aberta e fechada, mostra diferenças entre os modelos, principalmente entre aqueles
na forma aberta que tiveram o valor de RMS maior. O mapa de potencial
eletrostático é outro parâmetro importante a ser analisado que mostra diferenças
entre estruturas proteicas, dependendo da composição de aminoácidos, a proteína
apresenta uma distribuição de cargas na superfície distinta, o que é de grande
importância para a interação com outras moléculas, que depende da
complementaridade de cargas. Os nossos modelos quando comparados entre si e
com os moldes NR2A e GluR2 mostraram um perfil diferenciado de cargas na
superfície. Estas diferenças podem ser responsáveis pelas propriedades fisiológicas
67
e farmacológicas distintas, dependendo das combinações de subunidades que
formam o receptor.
A validação dos modelos é uma parte fundamental da modelagem por
homologia para garantir a confiabilidade da estrutura gerada, e das interações que
estão sendo analisadas. Os nossos modelos foram submetidos a duas formas de
validação diferentes através da análise da qualidade estereoquímica através do
gráfico de Ramachandran e da análise do ambiente químico dos aminoácidos e da
compatibilidade entre seqüência e estrutura tridimensional através das análises do
Profile 3D. Em ambas as validações os nossos modelos tiveram valores aceitáveis
demonstrando serem confiáveis, sendo que aqueles aminoácidos que apresentaram
uma estereoquímica desfavorável ou um score negativo estavam distantes do sítio
de ligação que o que não estaria comprometendo a qualidade dos modelos como
um todo e das interações analisadas.
Para demonstrar a importância dos modelos construídos neste trabalho
comparamos o modelo da subunidade NR2B na forma fechada construído com
outro modelo descrito na literatura (Tickhonova et al., 2002), cujo molde é a
subunidade GluR2 do receptor de AMPA que apresenta apenas 27% de identidade
com NR2B, diferente do nosso modelo cujo molde é a NR2A, que apresenta 80% de
identidade com NR2B. A comparação entre as estruturas tridimensionais destes
modelos através da análise dos desvios de RMS demonstra uma maior similaridade
entre NR2A e o nosso modelo do que com o modelo de Tickhonova e
colaboradores. Sendo a estrutura de NR2A uma estrutura do próprio receptor de
NMDA que apresenta uma semelhança funcional maior com NR2B do que GLUR2
que é uma subunidade do receptor de AMPA, então baseado na homologia entre
NR2B e NR2A, o nosso modelo provavelmente tem uma capacidade preditiva maior
68
permitindo uma análise mais confiável da função deste receptor e das interações
com os ligantes.
O nosso modelo também parece ser superior a outros modelos descritos na
literatura, como o construído com base na subunidade NR1, uma subunidade do
receptor de NMDA que apresenta um sítio de ligação ao co-agonista, glicina no
lugar do sítio de ligação ao glutamato (Blaise et al., 2005; Chen et al., 2005). Isto
também é verdadeiro para o modelo que usa como molde a proteína periplasmática
de bactéria (LAOBP) com apenas 18% de identidade (Laube et al, 2004).
O docking do agonista glutamato com os modelos NR2B-D na forma fechada
revelou a importância dos resíduos His485, Ser511, Thr513, Arg518, Ser689 e
Thr690 para a interação e demonstrou diferenças devido às substituições dos
resíduos His485, Ser511 e Asp731 nas subunidades NR2 por Tyr485, Pro511 e
Leu731 em GluR2 do receptor de AMPA, além de um deslocamento em alguns
aminoácidos nesta subunidade. As diferenças nas interações observadas no sítio de
ligação ao glutamato na presença do agonista justificam que os receptores de
AMPA e de NMDA apresentem afinidades distintas por diferentes agonistas (i.e.
NMDA e AMPA) e antagonistas, podendo orientar a descoberta de ligantes mais
seletivos.
Atualmente existem vários antagonistas seletivos para o receptor de NMDA,
mas o emprego clínico não tem demonstrado o êxito esperado, visto que as drogas
atualmente disponíveis ainda apresentam graves efeitos colaterais limitando o uso,
sendo, portanto sendo necessárias novas opções mais seletivas (Curtis et al, 2003).
Neste trabalho foi realizado o docking do antagonista EAB515 com os modelos
NR2A-D na forma aberta para avaliação do comportamento das subunidades
durante a ligação com esta molécula. Os antagonistas competitivos do sítio de
69
ligação ao glutamato no receptor de NMDA (e.g. AP5 e CPP) apresentam, em geral,
afinidade em ordem decrescente por NR2A > NR2B > NR2C > NR2D. No entanto,
como a região do sítio de ligação é altamente conservada entre estas subunidades,
as variações na afinidade pelos antagonistas são geralmente discretas (Paoletti e
Neyton, 2007).
A análise das interações de alguns antagonistas com o receptor de NMDA
mostra que compostos pouco volumosos apresentam menor seletividade por
interagir apenas com os resíduos imediatamente vizinhos ao sítio, enquanto
compostos maiores podem ser mais seletivos (Feng et al., 2005). Em geral, os
antagonistas apresentam uma afinidade maior por NR2A do que por NR2B,
entretanto, existem alguns antagonistas como PBPD, LY233536 e EAB515 que
apresentam um padrão diferenciado, com maior seletividade para NR2B do que
para NR2A. Desta forma, a escolha do EAB515 foi resultante do tamanho desta
molécula que é considerada grande, contendo apenas um centro estereogênico e
com maior seletividade por NR2B do que por NR2A (Figura 16). Esta característica
poderia nos permitir a análise das interações que ocorrem no sítio de ligação que
pudessem justificar o perfil de afinidade diferente deste antagonista.
O docking do antagonista EAB515 com os modelos NR2A-D na forma aberta
mostrou uma forma de interação diferenciada entre as subunidades, o que pode ser
explicado pelas substituições nos aminoácidos contidos num raio de 10 Å de
distância do antagonista EAB515 (Figura 17 e 18). Apesar de muitos destes
aminoácidos não estarem interagindo diretamente com o ligante, eles podem ser
posições em potencial para alvos de novos antagonistas, determinando uma
seletividade maior frente às subunidades (Figura 17).
70
Como NR2A e NR2B são as subunidades expressas predominantemente no
cérebro, e devido ao potencial dos antagonistas seletivos para NR2B para serem
usados na terapia, o sítio de interação com o ligante nestas duas subunidades foi
analisado, para explicar a seletividade maior de EAB515 por NR2B. Em ambas
subunidades os resíduos Leu411, Glu413, Lys484, His485, Ser511, Thr513, Arg518,
Thr684, Ser689, Thr690, Val713, Tyr729, Asp730, Val733, Tyr761 e Tyr769 são
importantes para a interação com o antagonista EAB515 e interagem através de
ligações hidrogênio, iônica, hidrofóbica, dipolo-dipolo e van der Walls. Em NR2B
observou-se a formação de uma ligação hidrogênio a mais com o antagonista, o que
poderia estabilizar melhor o complexo, além da energia de complexação com o
antagonista EAB515 ter sido um pouco menor para NR2B, o que pode justificar uma
maior afinidade do ligante por esta subunidade em relação a NR2A (Figura 19).
Estas diferenças mostram que apesar dos aminoácidos serem em sua maioria
conservados no sítio de ligação, o antagonista EAB515 tem uma forma peculiar de
se ligar a cada subunidade, o que ocorre em função da estrutura da proteína como
um todo e não apenas dos resíduos que interagem diretamente. A influência de
aminoácidos mais distantes que podem interagir com o sítio de ligação ao glutamato
se confirma nos estudos como um fator a ser considerado, de forma semelhante ao
relatado por Blaise e colaboradores, 2005.
Os modelos por homologia das subunidades nas formas fechada e aberta
revelam diferenças de desvios de RMS e uma variação no volume da cavidade do
sítio de ligação ao glutamato entre as formas avaliadas, confirmando a mudança
conformacional que ocorre no receptor após a ligação do agonista ou antagonista
que é semelhante ao que ocorre nas estruturas obtidas por cristalografia de raio X
das subunidades GluR2 do receptor de AMPA nas formas fechada e aberta. O
71
tamanho maior da cavidade nas formas abertas destas subunidades permite que
antagonistas tenham um tamanho maior do que os agonistas (Figura 16), podendo
interagir com um número maior de resíduos presentes no sítio e conferindo uma
maior seletividade.
5.2. Análise dos ligantes do receptor de NMDA
Este trabalho envolveu também o estudo de antagonistas do receptor de
NMDA que agem no sítio de moduladores alostéricos (Paoletti e Neyton, 2007). Por
estar presente apenas na subunidade NR2B, os compostos que agem neste sítio
apresentam uma seletividade muito maior por NR2B, o que é de grande
importância, visto que, antagonistas seletivos para esta subunidade apresentam um
potencial promissor para serem usados na terapia de doenças neurodegenerativas
(Nikam e Meltzer, 2002).
A análise da série de fenil-amidinas, descritas na literatura (Claiborne et al.,
2003) como antagonistas seletivos da subunidade NR2B do receptor de NMDA,
revelou diversas propriedades estereoeletrônicas envolvidas com a atividade
biológica (E
HOMO
, Ovalidade, número de grupos aceptores de ligação hidrogênio). A
avaliação das propriedades eletrônicas e estruturais demonstrou que a energia de
HOMO destes compostos aumenta com a atividade biológica (pIC
50
), sugerindo que
esta deve ser uma característica importante. Os compostos mais potentes
apresentaram VM e ASM mais altos e conseqüentemente maiores valores de
ovalidade (razão entre volume e área), em adição a um número maior de grupos
aceptores de ligação hidrogênio, o que pode ser importante para interagir com o
receptor de NMDA (Tabelas 5 e 6).
72
Através da análise das fenil-amidinas foi feita uma análise de regressão linear
múltipla para gerar um modelo de QSAR capaz de predizer a atividade biológica
destas fenil-amidinas onde E
HOMO
, Ovalidade e cLogP foram os descritores que
geraram a melhor equação. Esta equação foi a que apresentou o melhor valor de R
2
e teve maior capacidade preditiva, o que pode ser visto pela diferença pequena
entre a atividade calculada pelo modelo de QSAR e atividade experimental. Apenas
1i se mostrou fora dos valores esperados, apresentando a atividade calculada
menor do que a experimental (Figura 21).
Através de conhecimentos de química medicinal, hibridação molecular e
substituição aromática isostérica, foi possível o desenho de uma nova série de
amidinas. Diversos compostos contendo anéis 1,2,3- e 1,2,4-triazóis, apresentam
perfil de atividade biológica, agindo como grupos farmacofóricos em diversos
fármacos como antiplaquetários (Cunha et al., 2003), antivirais (De La Rosa et al.,
2003), antimicrobianos (Costa et al., 2006) e antiinflamatórios (Biagi et al., 1992).
Neste trabalho, estes grupos foram usados no desenho racional de novas triazolil-
amidinas, tendo como base os dados teóricos e resultados da literatura.
As triazolil-amidinas 2a e 2b após sintetizadas e testadas mostraram efeito
neuroprotetor frente a morte celular induzida pelo glutamato em cultura de neurônios
da retina. Estudos anteriores haviam demonstrado que a excitotoxicidade induzida
pelo glutamato nestas culturas está relacionada à ligação ao receptor de NMDA,
visto que é completamente bloqueada através do uso do MK801, um bloqueador de
canal deste receptor (Ferreira e Paes-de-Carvalho, 2001). Além disso, ensaios
biológicos mostraram baixo risco de neurotoxicidade e de citotoxicidade em células
Vero.
73
Baseado nestes resultados foram propostas modificações estruturais nestas
triazolil-amidinas para obtenção de compostos possivelmente mais potentes (2c-2g)
onde além da substituição aromática isostérica foram adicionados substituintes
baseado nas fenil-amidinas mais potentes. A análise da estrutura tridimensional e
dos mapas de potencial eletrostático das triazolil-amidinas 2a-2g revelaram que
estas moléculas apresentam características estereoeletrônicas semelhantes às
fenil-amidinas (1a–1q) (Figura 22). Contudo as triazolil-amidinas apresentam uma
região de carga negativa devido ao anel triazol, o que deve influenciar no perfil
inibitório destes compostos, considerando a importância da complementaridade
estereoeletrônica para a interação com o receptor (Silva et al., 2008).
O modelo de QSAR foi usado neste estudo para predizer a atividade
biológica desta série de compostos e mostrou que 2c-2g apresentavam valores
semelhantes ou maiores do que as fenil-amidinas mais potentes (1a-1d),
demonstrando o potencial promissor desta série.
A análise dos parâmetros ADMET mostrou que os compostos obedecem à
regra de Lipinski, indicando uma boa biodisponibilidade oral. Para estes fármacos
que precisam penetrar na barreira hematoencefálica, em geral, as propriedades
físicas se apresentam numa faixa mais estreita do que em outras classes, fazendo
com que estes sejam mais lipofílicos, menos polares, menos flexíveis e com menor
volume e massa molecular do que os outros compostos (Pajouhesh et al., 2005), o
que aparentemente foi preenchido pelos compostos planejados.
A análise do potencial teórico destes compostos como candidatos a novos
fármacos através dos valores de druglikeness e de drugscore, comparado as quatro
fenil-amidinas mais potentes e com outros antagonistas seletivos da subunidade
NR2B do receptor de NMDA mais conhecidos, mostrou que as triazolil-amidinas
74
apresentam valores maiores do que vários destes (Figura 25). Os valores de
druglikeness positivos indicam que estes compostos contêm, predominantemente,
fragmentos que estão presentes com maior freqüência nos fármacos comerciais,
enquanto o drugscore, combinando o potencial de druglikeness, cLogP, LogS
(solubilidade em água), peso molecular e risco de toxicidade em um valor, indica o
potencial destes compostos se tornar um fármaco (Tekto, 2005).
Além disso, as triazolil-amidinas apresentam baixa toxicidade teórica, o que foi
reforçado pelos ensaios biológicos, apenas 2b e 2g apresentaram risco de efeito
sobre a reprodução. É importante notar que a toxicidade predita aqui, não garante
que estes compostos sejam completamente livres de efeitos tóxicos (Silva et al.,
2008), entretanto, reforça o potencial promissor destes compostos, especialmente
2d-2f que apresentaram os melhores valores de pIC
50
preditos e menor risco de
toxicidade. Este estudo pode servir para a proposta de novos fármacos
potencialmente mais seletivos e com menos efeitos colaterais úteis na terapia das
doenças neurodegenerativas.
75
6. Conclusões
6.1 Receptor de NMDA – Modelagem por Homologia
O presente trabalho demonstrou as diferenças na estrutura tridimensional,
nos mapas de potencial eletrostático e no sítio de ligação entre as subunidades
NR2A-D e com a subunidade GluR2 do receptor de AMPA.
O estudo estrutural da região do domínio S1S2 das subunidades NR2A-D do
receptor de NMDA revelou resíduos (His485, Ser511, Thr513, Arg518, Ser689,
Thr690, Asp731) importantes para a interação com o glutamato e Leu411, Glu413,
Lys484, His485, Ser511, Thr513, Arg518, Thr684, Ser689, Thr690, Val713, Tyr729,
Asp730, Val733, Tyr761 e Tyr769 para a interação com EAB515.
Os modelos revelaram uma diferença de RMS e de volume da cavidade do
sítio de ligação entre as formas aberta e fechada do receptor confirmando a
mudança conformacional que ocorre ao ligar ao agonista ou antagonista.
6.2 Análise do Ligante
O estudo dos antagonistas do receptor de NMDA mostrou propriedades
estereoeletrônicas envolvidas com a atividade biológica (EHOMO, Ovalidade e
número de aceptores de ligação de Hidrogênio) e possibilitou o desenho de triazolil-
amidinas possivelmente mais ativas.
A análise dos parâmetros ADMET mostrou que os compostos obedeceram a
regra de Lipinski e apresentavam baixa toxicidade teórica, confirmado pelos ensaios
biológicos.
76
7. Referências Bibliográficas
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86
8. Anexo de artigos publicados durante o período do mestrado
1. Oliveira-Carvalho, A. L., Guimaraes, P. R., Abreu, P.A., Dutra, D.L.S., Junqueira-
De-Azevedo, I. L. M., Rodrigues, C. R., Ho, P.L., Castro, H.C., Zingali, R. B.
Identification and characterization of a new member of snake venom thrombin
inhibitors from Bothrops insularis using a proteomic approach. Toxicon 51:659-671,
2008.
2. Gouveia, M., Braggio, E., Abreu, P.A., Zalcberg, I., Leão L., Rodrigues, C. R.,
Castro, H.C. Metilação do DNA e DNA-metiltransferases: um caminho para a
terapia. Journal of Metabolism and Nutrition / Revista do Metabolismo e Nutrição,
9:173 - 180, 2007.
3. Abreu, P.A., Dellamora-Ortiz G, Leao-Ferreira, L., Gouveia, M., Braggio, E.,
Zalcberg, I., Santos, D. O., Bourguinhon, S., Cabral, L. M., Rodrigues, C. R., Castro,
H.C. DNA-methylation: a promising target for the twenty-first century. Expert Opinion
on Therapeutic Targets, 12(8):1035-47.
4. Silva, F. C., Souza, M. C. B. V., Frugulhetti, I. I. P., Castro, H.C., Souza, S. L. O.,
Souza, T. M. L., Rodrigues, D. Q., Souza, A. M. T., Abreu, P.A., Passamani, F.,
Rodrigues, C. R. Synthesis, HIV-RT inhibitory activity and SAR of 1-benzyl-1H-1,2,3-
triazole derivatives of carbohydrates. European Journal of Medicinal Chemistry. In
press, 2008.
5. Abreu, P.A.; Castro, H.C.; Paes De Carvalho, R.; Rodrigues, C.R.; Giongo,
Viveca; Frugulhetti, I.C.P.P.; Ferreira, J.M.; Caversan, O.M.; Leão, R.A.C.; Marins,
L.M.S.; Henriques, A.M.; Farias, F.M.C.; Albuquerque, M.G.; Pinheiro, S. Molecular
modeling studies of a phenyl-amidine class of NMDA receptor antagonists and the
rational design of new triazolyl-amidine derivatives. Submetido à revista European
Journal of Medicinal Chemistry, 2008.
Toxicon 51 (2008) 659–671
Identification and characterization of a new member of snake
venom thrombin inhibitors from Bothrops insularis using a
proteomic approach
$
Ana Lu´ cia Oliveira-Carvalho
a
, Patrı
´
cia Ramos Guimara
˜
es
a
, Paula Alvarez Abreu
b
,
Denis L.S. Dutra
a
, Ina
´
cio L.M. Junqueira-de-Azevedo
c,d
, Carlos Rangel Rodrigues
b
,
Paulo Lee Ho
c,d
, Helena C. Castro
b,Ã
, Russolina B. Zingali
a,Ã
a
Rede Proteo
ˆ
mica do Rio de Janeiro and Laborato
´
rio de Hemostase e Venenos (LabHemoVen),
Unidade de Espectrometria de Massas e Proteo
ˆ
mica, Programa de Biologia Estrutural, Instituto de Bioquı
´
mica Me
´
dica-ICB,
Universidade Federal do Rio de Janeiro, CEP 21941-590, Rio de Janeiro/RJ, Brazil
b
Laborato
´
rio de Antibio
´
ticos, Bioquı
´
mica e Modelagem Molecular (LABioMol), Departamento de Biologia Celular e Molecular-IB/CEG,
Universidade Federal Fluminense, CEP 24001-970, Nitero
´
i/RJ, Brazil
c
Centro de Biotecnologia, Instituto Butantan—IBU, CEP 05503-900, Sa˜o Paulo/SP, Brazil
d
Instituto de Biocie
ˆ
ncias, Universidade de Sa˜o Paulo, Sa˜o Paulo/SP, Brazil
Received 9 September 2007; received in revised form 28 November 2007; accepted 29 November 2007
Available online 14 December 2007
Abstract
Snake venom C-type lectin-like proteins (CLPs) are ubiquitously found in Viperidae snake venoms and differ from the
C-type lectins as they display different biological activities but no carbohydrate-binding activity. Previous analysis of the
transcriptome obtained from the Bothrops insularis venom gland showed the presence of two clusters homologous to
bothrojaracin (BJC) chains a and b. In an effort to identify a new BJC-like molecule, we used an approach associated with
proteomic technologies to identify the presence of the expressed protein and then to purify and characterize a new
thrombin inhibitor from B. insularis venom. We also constructed homology models of this protein and BJC, which were
compared with other C-type lectin-like family members and revealed several conserved features of this intriguing snake
venom toxin family.
r 2007 Elsevier Ltd. All rights reserved.
Keywords: Snake venom; Thrombin inhibitor; Structure; Lectin C-type; Phylogenetic; Electrophoresis 2D; Proteomics
1. Introduction
Snake venoms contain a variety of proteins with
diverse pharmacological activities (Lu et al., 2005;
Farsky et al., 2005). These proteins belong to
multiple protein families, such as phospholipases
A
2
, serine proteinases, metalloproteina ses, C-type
lectins, C-type lectin-like proteins (CLPs), Kunitz-type
ARTICLE IN PRESS
www.elsevier.com/locate/toxicon
0041-0101/$ - see front matter r 2007 Elsevier Ltd. All rights reserved.
doi:10.1016/j.toxicon.2007.11.026
$
Ethical statement: We would like to declare that the
manuscript did not utilize experiments with animals or humans.
The study was realized with in vitro assays using purified samples.
Ã
Corresponding authors.
Review
10.1517/14728220802271004 © 2008 Informa UK Ltd ISSN 1472-8222 1035
All rights reserved: reproduction in whole or in part not permitted
Oncologic, Endocrine & Metabolic
DNA methylation: A promising
target for the twenty-fi rst century
Paula A Abreu , Gisela Dellamora-Ortiz , Luiz R Leão-Ferreira , Maria Gouveia ,
Esteban Braggio , Ilana Zalcberg , Dilvani O Santos , Saulo Bourguinhon ,
Lucio M Cabral , Carlos R Rodrigues & Helena C Castro
†
†
Federal Fluminense University, Biology Institute, Department of Celular and Molecular Biology,
CEP 24020-150 Niterói, Rio de Janeiro, Brazil
Background : Over the last few years DNA methylation and its involvement
in diseases such as cancer has become of great interest for applied research.
Since reversal of aberrant DNA methylation may influence the behavior of
tumors, the methylation of DNA CpG sites is a potential target for the
development of inhibitors for use in cancer treatment. Objective/methods :
We briefly review the structural and mechanistic features of DNA
methylation, including a structural analysis of the three main human DNA
methyltransferases and some (pre)clinical results. Results/conclusion :
Despite side effects, data obtained to date still support the vision that
DNA-methylation, possibly associated with the use of histone deacetylases
(HDACs) and/or artificial transcription factors (ATFs), is a promising target
for improving anticancer therapy in the 21st century.
Keywords: cancer , CpG sites , DNA methylation , methyltransferases
Expert Opin. Ther. Targets (2008) 12(8):1035-1047
1. Introduction
The genomic era has been remarkable for the increase in knowledge about processes
and mechanisms involving DNA. Several DNA expression regulatory mechanisms
have been described such as the epigenetic mechanisms. These include expression
alterations in somatic cells without modification of nucleotide sequences
(i.e., methylation and acetylation of histones), and DNA cytosine methylation [1,2] .
Cytosine methylation is a process catalyzed by DNA methyltransferases (DNMTs).
These enzymes add a methyl group to the cytosine located at a 5 ′ –CG–3 ′ specific
sequence (CpG site) generating 5-methylcytosine [3] . The literature describes
methylation as a safety mechanism in animal cells and a genetic regulator to control
gene transcription [4,5] .
Due to the key role of methylation in many physiological (i.e., embryogenesis)
and pathological processes (i.e., tumor development), in this work we briefly
review the DNA methylation process catalyzed by DNA methyltransferases and
the structural and functional features of human DNMTs and some clinical cases.
The purpose of this review is to improve the understanding of DNA methylation
and its potential as a therapeutic target.
2. General overview
The first DNA-methyltransferase, to our knowledge, was described in
Escherichia coli in 1964 by Gold and Hurwitz [6] . Since then, DNMTs have
been described in several organisms from prokaryotes to mammals, including
humans. DNA-methyltransferases catalyze the cytosine methylation process by
transferring a methyl group from the S -adenosyl- L -methionine (AdoMet) to the
1. Introduction
2. General overview
3. Mammalian
DNA-methyltransferases
4. Methylation as a
therapeutic target
5. What is new on the view
6. Expert opinion
Original article
Synthesis, HIV-RT inhibitory activity and SAR of
1-benzyl-1H-1,2,3-triazole derivatives of carbohydrates
Fernando de C. da Silva
a
, Maria Cecilia B.V. de Souza
a
, Izabel I.P. Frugulhetti
b
,
Helena C. Castro
b
, Silmara L. de O. Souza
b
, Thiago Moreno L. de Souza
b
,
Diego Q. Rodrigues
b
, Alessandra M.T. Souza
a
, Paula A. Abreu
b
,
Fabiana Passamani
c
, Carlos R. Rodrigues
c,
*
, Vitor F. Ferreira
a,
**
a
Universidade Federal Fluminense, Departamento de Quı´mica Orgaˆnica, Instituto de Quı´mica, Outeiro de S
~
ao Jo
~
ao Baptista,
CEP 24020-141, Nitero´i, RJ, Brazil
b
Universidade Federal Fluminense, LABioMol, Departamento de Biologia Geral e Celular, Outeiro de S~ao Jo~ao Baptista,
CEP 24020-150, Nitero´i, RJ, Brazil
c
Laborato´rio de Modelagem Molecular e QSAR (ModMolQSAR), Faculdade de Farma´cia, Universidade Federal do Rio de Janeiro,
CEP 21941-590, Rio de Janeiro, RJ, Brazil
Received 26 November 2007; received in revised form 25 February 2008; accepted 29 February 2008
Abstract
This paper describes the synthesis of several 1-benzyl-1H-1,2,3-triazoles attached to different carbohydrate templates and their in vitro
inhibitory profile against HIV-1 reverse transcriptase. In addition a theoretical comparison of the most active compounds with other classical
antivirals was also performed. Our results showed 2a, 2d and 2g as the most active compounds that inhibited the HIV-1 reverse transcriptase
catalytic activity with cytotoxicity lower than AZT and SI higher than DDC and DDI. The overall theoretical analysis of the molecular descrip-
tors of 2a, 2d and 2g revealed that their HOMO energy is similar to other antivirals in use (AZT, DDC, DDI and 3TC) and together with the
volume may contribute for the biological profile as they may allow new interactions with the target. In fact the 1,2,3-triazole compounds
presented more lipophilicity and higher molecular volume and weight than the antivirals studied, which suggested that these features might
not only contribute for new interactions with the HIV-RT but also influence the specificity and consequently the low cytoxicity profile of these
compounds. Thus these data point them as promising leading compounds for generating new anti-HIV-RT compounds.
Ó 2008 Published by Elsevier Masson SAS.
Keywords: HIV-RT; 1,2,3-Triazole; Anti-HIV; Antiviral
1. Introduction
Acquired immune deficiency syndrome (AIDS) is the first
pandemic disease of the molecular biology era, which killed
over 20 million people worldwide
[1,2]. The human immuno-
deficiency virus (HIV) is the AIDS causative agent and its
reverse transcriptase (HIV-TR) is the main target of AIDS
treatment [3,4]. This enzyme plays an essential and multifunc-
tional role in the virus replication. It allows the transcription of
HIV-single-stranded RNA genome into a DNA double helix
capable of integration into host cell chromosomes
[5e9].
The combination of HIV reverse transcriptase and protease
inhibitors in the highly active antiretroviral therapies (HAART)
against HIV infection led to a decline in morbidity and mortal-
ity
[5e9]. Nonetheless, viral replication is still persisting as
lymphatic system and central nervous system acts as reservoir
for the virus
[5], and wherein some antivirals, more particularly
the protease inhibitors (PIs), do not penetrate at an efficient in-
hibitory level
[10]. In addition the emergence of drug-resistant
* Corresponding author.
** Corresponding author. Tel.: þ55 21 26292345.
E-mail addresses:
uff.br
(V.F. Ferreira).
0223-5234/$ - see front matter Ó 2008 Published by Elsevier Masson SAS.
doi:10.1016/j.ejmech.2008.02.047
ARTICLE IN PRESS
Please cite this article in press as: Fernando de C. da Silva et al., Eur. J. Med. Chem. (2008), doi:10.1016/j.ejmech.2008.02.047
A
vailable online at www.sciencedirect.com
European Journal of Medicinal Chemistry xx (2008) 1e11
http://www.elsevier.com/locate/ejmech
+ MODEL
Elsevier Editorial System(tm) for European Journal of Medicinal Chemistry
Manuscript Draft
Manuscript Number:
Title: Molecular Modeling Studies of a Phenyl-Amidine Class of NMDA Receptor Antagonists and the
Rational Design of New Triazolyl-Amidine Derivatives
Article Type: Original Paper
Keywords: Quantitative Structure-Activity Relationship (QSAR); Phenyl-amidine; Triazolyl-amidine; NR2B
selective NMDA receptor antagonist; in silico ADMET screening
Corresponding Author: Dr. Helena Carla Castro, PhD
Corresponding Author's Institution: Federal Fluminense University
First Author: Paula A Abreu , MsD
Order of Authors: Paula A Abreu , MsD; Helena Carla Castro, PhD; Roberto P Carvalho , PhD; Carlos R
Rodrigues , PhD; Viveca A da Silva, PhD; Izabel C Frugulhetti , PhD; Jainne M Ferreira , MsD; Octavia M
Caversan , PhD; Raquel A Leão , MsD; Luana M Marins , PhD; André M Henriques , PhD; Florence M
Farias , PhD; Magaly G Albuquerque, PhD; Sergio Pinheiro, PhD
Abstract: In the recent years many efforts have been made to develop NMDA receptor antagonists for
treating different pathological conditions (i.e. thrombo-embolic stroke, traumatic head injury, Huntington,
Parkinson and Alzheimer diseases). However, since side effects limit the use of most antagonists (e.g.
ifenprodil), new drugs are still required. In this work, we performed a Quantitative Structure-Activity
Relationship (QSAR) analysis of 17 phenyl-amidines derivatives (1a-1q) recently described as NMDA
receptor antagonists, and used the data to rationally design new 1,2,3- and 1,2,4-triazolyl-amidines (2a-2g).
The most potent phenyl-amidines and the designed triazolyl-amidines were submitted to an in silico ADMET
(absorpti
on, distribution, metabolism, excretion, and toxicity) screening to determine their overall drug score
and toxicity profile. Our prototypes revealed a better profile, with high values of druglikeness, drug score and
toxicity risks and fulfillment of the Lipinski modified 'rule-of-five' for successful CNS penetration which
pointed them as promising candidates for further synthetic and biological exploration. Therefore, we
synthesized 2a (1,2,3-triazolyl-amidine) and 2b (1,2,4-triazolyl-amidine) and evaluated their neuroprotective
activity profile against glutamate side effects. Importantly, the pharmacological (neuroprotection from
glutamate excitotoxicity) and toxicity (cytotoxicity and neurotoxicity) results of 2a and 2b reinforced our
theoretical predictio
n, which indicated the potential lead profile of the new rationalized series of triazolyl-
amidines.
UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE
CENTRO DE ESTUDOS GERAIS/INSTITUTO DE BIOLOGIA
DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA CELULAR E MOLECULAR
Laboratório de Bioquímica e Modelagem Molecular
Universidade Federal Fluminense Laboratório de Antibióticos, Bioquímica e Modelagem
Molecular
Telefone +55 21 2717.2043 / 93471210
Fax +55 21 2719.5934
Endereço
Sala 1, Bloco 1, 3º andar, Ed. Sede Instituto de Biologia Outeiro
de São João Baptista, s/n - Campus do Valonguinho 24.020-150
Niterói RJ Brasil
e-mail: labiomol2003@yahoo.com.br
Date: June 1
st
, 2008
Dear Sir,
Please find enclosed the revised paper entitled “Molecular Modeling Studies of a Phenyl-
Amidine Class of NMDA Receptor Antagonists and the Rational Design of New Triazolyl-Amidine
Derivatives” for your consideration as a regular paper for
European Journal Medicinal Chemistry.
This paper is co-authored with Paula Alvarez Abreu; Roberto Paes de Carvalho; Carlos Rangel
Rodrigues; Viveca Antonia Giongo Galvão da Silva, Izabel Christina de Palmer Paixao Frugulhetti;
Jainne Martins Ferreira; Octavia Malta Caversan; Raquel Ana Capela Leão; Luana Monteiro
Spíndola Marins; André Medeiros Henriques; Florence Moellmann Cordeiro de Farias; Magaly
Girão Albuquerque and Sergio Pinheiro. All correspondence should be addressed to Helena C.
Castro, Laboratório de Bioquímica e Modelagem Molecular (LaBioMol), 3
o
andar, Departamento
de Biologia Celular e Molecular, IB-CEG, Universidade Federal Fluminense, CEP 24001-970,
Niterói, RJ, Brazil. Phone:+55 21 2629.2294, Fax:+55 21 2629.2376. E-mail address:
The manuscript represents original work and has not been previously published or
simultaneously submitted elsewhere for publication. The manuscript has been read and approved by
all authors. There is no commercial associations which might lead to a conflict of interest. I confirm
that I, and my coauthors have provided full disclosure regarding any relevant relationships,
financial in the acknowledge section.
Please, we ask you for not sending this article to any referee from the laboratory LASSBio
of Pharmacy Faculty (LASSBio/Faculdade de Farmácia) at Universidade Federal do Rio de Janeiro
due to conflict of interests.
Sincerely,
Dr. Helena C. Castro
ABreuCover Letter
Molecular Modeling Studies of a Phenyl-Amidine Class of NMDA Receptor Antagonists and the Rational
Design of New Triazolyl-Amidine Derivatives.
Paula A. Abreu,
Helena C. Castro, Roberto P. Carvalho, Carlos R. Rodrigues, Viveca A. G.
G. da Silva , Izabel C.P.P. Frugulhetti, Jainne M.Ferreira, Octavia M.
Caversan, Raquel A. C. Leão, Luana M. S. Marins, André M. Henriques,
Florence M. C. Farias, Magaly G.Albuquerque, Sergio Pinheiro.
We performed a QSAR analysis of 17 phenyl-amidines recently
described as NMDA receptor antagonists, and used to rationally design
new 1,2,3- and 1,2,4-triazolyl-amidines. A combination of synthetic
chemistry, biological assays and molecular modeling studies is presented.
ABreuGraphical Abstract
Click here to download Graphical Abstract: AbreuPAgraphical abstract.doc
Molecular Modeling Studies of a Phenyl-Amidine Class of NMDA Receptor
Antagonists and the Rational Design of New Triazolyl-Amidine Derivatives
Paula A. Abreu
a,b
, Helena C. Castro*
a,b
, Roberto P. Carvalho
c
, Carlos R. Rodrigues
d
, Viveca
A. G. G. da Silva
a
, Izabel C.P.P. Frugulhetti
a,b
, Jainne M.Ferreira
b,c
, Octavia M. Caversan
b,c
,
Raquel A. C. Leão
e
, Luana M. S. Marins
e
, André M. Henriques
e
, Florence M. C. Farias
e
,
Magaly G.Albuquerque
f
, Sergio Pinheiro*
e
a
LABioMol, Departamento de Biologia Celular e Molecular,
b
Programa de Pós-Graduação em
Neuroimunologia,
c
Laboratório de Neurobiologia Celular, IB-/CEG,
e
Laboratório de Síntese
Assimétrica, GQO - Instituto de Química, Universidade Federal Fluminense, CEP 24001-970,
Niterói, RJ, Brazil.
d
ModMolQSAR, Faculdade de Farmácia, Universidade Federal do Rio de Janeiro, CEP 21941-590,
Rio de Janeiro, RJ, Brazil.
f
LabMMol, Instituto de Química, Universidade Federal do Rio de Janeiro, CEP 21941-590, Rio de
Janeiro, RJ, Brazil.
*Correspondence authors:
Helena C. Castro
Universidade Federal Fluminense (UFF), Centro de Estudos Gerais (CEG), Instituto de
Biologia, Programa de Pós-Graduação em Neuroimunologia, Departamento de Biologia
Celular e Molecular, Outeiro de São João Batista s/n, Campus do Valonguinho, Centro, CEP
24210-130, Niteroi, RJ, Brazil
Phones:+55-21-2629-2294/2281; Fax :+55-21-2717-2041
E-mail: hcas[email protected]om.br
Sergio Pinheiro
Universidade Federal Fluminense (UFF), Centro de Estudos Gerais (CEG), Instituto de
Química, Programa de Pós-Graduação em Química Orgânica, Outeiro de São João Batista s/n,
Campus do Valonguinho, Centro, CEP 24020-141, Niteroi, RJ, Brazil
Phone: +55-21-2629-2369/2345; Fax: +55-21-2719-3349
E-mail: [email protected]m
AbreuManuscript
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Abstract – In the recent years many efforts have been made to develop NMDA receptor
antagonists for treating different pathological conditions (
i.e. thrombo-embolic stroke,
traumatic head injury, Huntington, Parkinson and Alzheimer diseases). However, since side
effects limit the use of most antagonists (
e.g. ifenprodil), new drugs are still required. In this
work, we performed a Quantitative Structure-Activity Relationship (QSAR) analysis of 17
phenyl-amidines derivatives (
1a-1q) recently described as NMDA receptor antagonists, and
used the data to rationally design new 1,2,3- and 1,2,4-triazolyl-amidines (
2a-2g). The most
potent phenyl-amidines and the designed triazolyl-amidines were submitted to an
in silico
ADMET (absorption, distribution, metabolism, excretion, and toxicity) screening to
determine their overall drug score and toxicity profile. Our prototypes revealed a better
profile, with high values of druglikeness, drug score and toxicity risks and fulfillment of the
Lipinski modified ‘rule-of-five’ for successful CNS penetration which pointed them as
promising candidates for further synthetic and biological exploration. Therefore, we
synthesized
2a (1,2,3-triazolyl-amidine) and 2b (1,2,4-triazolyl-amidine) and evaluated their
neuroprotective activity profile against glutamate side effects. Importantly, the
pharmacological (neuroprotection from glutamate excitotoxicity) and toxicity (cytotoxicity
and neurotoxicity) results of
2a and 2b reinforced our theoretical prediction, which indicated
the potential lead profile of the new rationalized series of triazolyl-amidines.
Keywords: Quantitative Structure-Activity Relationship (QSAR); Phenyl-amidine, Triazolyl-
amidine; NR2B selective NMDA receptor antagonist;
in silico ADMET screening.
1. Introduction
The N-methyl-D-aspartic acid (NMDA) receptors are a group of ionotropic glutamate
receptors that plays an important role in different physiological functions, including the
neuronal development, synaptic plasticity, learning, and memory [1]. NMDA receptor is
composed of multiple protein subunits, NR1 (with at least eight isoforms), NR2 (A-D) and
NR3 (NR3A and NR3B) in different combinations. In general the physiological receptor is a
heteromer containing a NR1 subunit with one or more NR2 subunits, but different
compositions may occur [2,3]. Therefore, depending on the receptor composition both the
electrophysiological and pharmacological properties may vary [3].
Due to its role, the overstimulation of NMDA receptor has been implicated in several
pathological conditions involving neuronal death and degeneration (
e.g. thrombo-embolic
stroke, traumatic head injury, Parkinson, Huntington and Alzheimer diseases). Therefore this
pathological role which has driven the search for NMDA receptor antagonists as a promising
therapy [4-6]. Currently, the use of NMDA receptor antagonists for acute and chronic
neuronal diseases therapy still present undesirable side effects such as motor deficit and
sedation that limit their use [7-9]. Importantly, the absence of NR2B message in the
cerebellum suggests that a NR2B selective antagonist might not adversely affect the
locomotor function [3,10,11].
Ifenprodil (Figure 1) is a selective NR1/NR2B NMDA receptor antagonist that
presents a safer side effect profile than other non-selective antagonists (
e.g.
memantine).However it still presents some side effects similar to other NMDA receptor
antagonists (
e.g. Co101676, PD174494 and Cl1041) [3,5] (Figure 1). Currently, many efforts
are on progress to develop less toxic compounds for several neuropathological conditions
such as compounds, based on styrylamidines (
I), arylamidines (II and III) and cyclic
benzamidines (
IV), was introduced as orally efficacious selective NR1/NR2B NMDA
receptor antagonists (Figure 1) [3,7,11, 12-15,16,17].
In this work, we assessed some stereoelectronic properties of a series of 17 phenyl-
amidines (
1a-1q) described as selective NR1/NR2B NMDA receptor antagonist (Table 1) by
using molecular modeling approach [7]. Since many compounds based on 1,2,3- and 1,2,4-
triazoles have important biological activities [18-20] such as antiplatelet [21], anticonvulsant
[22] and anti-inflammatory profiles [23]. We used our QSAR study, to design seven triazolyl-
amidines (
2a-g) containing 1,2,3- and 1,2,4-triazolyl systems as a new class of potential
neuroprotective NMDA receptor antagonists (Figure 2). We also synthesized and
experimentally evaluated the neuroprotective effect, the cytotoxicity and neurotoxicity
profiles of
2a and 2b.
2. Results and Discussion
2.1 SAR/QSAR analysis of the phenyl-amidine derivatives
In the attempt to provide an useful guideline for the design of more potent NR1/NR2B
NMDA receptor antagonists, we employed molecular modeling studies to a series of 17
phenyl-amidines (
1a-1q) already reported in the literature [7] (Table 1).
In the SAR (Structure-Activity Relationship) and QSAR (Quantitative Structure-
Activity Relationship) studies, we calculated several descriptors including E
HOMO
and E
LUMO
(HOMO/LUMO Energy), μ (Molecular Dipole Moment), MV (Molecular Volume), MSA
(Molecular Surface Area), Ovality (a ratio of volume and area), MM (Molecular Mass),
cLogP (calculated octanol/water partition coefficient), cLogS (calculated water solubility),
and HBA (number of hydrogen bond acceptors) for the 17 phenyl-amidines (
1a-1q) (Table
1). Interestingly, our theoretical results revealed important features that could be related to
the experimental NMDA receptor antagonist activity (pIC
50
) described in the literature [7].
The cross correlation matrix showed that E
HOMO
, MV, MSA, Ovality and HBA groups are the
most correlated descriptors to the experimental pIC
50
values (Table 2). It is also possible to
observe that the NR2B binding assay (p
K
i
) is directly correlated to the functional assay
(pIC
50
), which reinforced that the antagonistic activity is due to the compounds ability of
binding to these receptor subunits.
The structural and electronic properties evaluation showed that HOMO energy of
these compounds increased with the biological potency (pIC
50
), suggesting that the
nucleophilicity may be an important feature. The most potent compounds presented higher
MV and MSA and, consequently, higher ovality, besides the higher number of HBA groups
that may be important to interact with the NMDA receptor (Table 1).
We also performed a multiple linear regression (MLR) analysis to generate a QSAR
model for orienting the design of new molecules. On that purpose, we applied the systematic
search approach for variable selection [24] to examine the correlation of these calculated
descriptors with the functional activity (pIC
50
) of the 17 phenyl-amidines (1a-1q) (Table 1).
To construct a QSAR-model capable of predicting the biological activity response (pIC
50Pred
),
we used ovality, E
HOMO
and cLogP since these variables allowed the construction of the best
equation to effectively reproduce experimental potency (Equation 1). The potencies predicted
by our model were very similar to those experimentally determined, which could be observed
by the maximum difference between experimental and predicted potencies (0.60), the
minimum difference (0.02) and the average (0.23).
pIC
50Pred
= 0.336(cLogP) + 1.612(E
HOMO
) +12.636(Ovality) + 1.867
(n = 17, R2 = 0.854)
Eq. (1)
The conformational analysis and the molecular electrostatic potential (MEP) maps of
the phenyl-amidines (
1a-1q) revealed a similar stereoelectronic "V" shape with the amidine
group in the middle and the phenyl rings in both sides (Figure 3).
The four most potent compounds presented electron-donating groups in R
2
(OMe or
Me), which resulted in a negative charge concentrated in the phenyl ring. Meanwhile most of
them presented a less negative charge in R
1
position (i.e. CF
3
-electron donating group), or a
neutral charge (
i.e.CF
3
-electron withdrawing group) (Figure 3). Considering the importance
of stereoelectronic complementarity for the target receptor interaction, these features
probably influenced in the compounds inhibitory profile.
2.2. Design of triazolyl-amidine derivatives and biological activity prediction
Based on the QSAR results, we designed two new triazolyl-amidine derivatives (2a
and 2b) by combining the amidine group, that has already been tested as NMDA receptor
antagonist [7] and new triazolyl groups-1,2,3-triazole (
2a) and 1,2,4-triazole (2b) (Figure 3).
Initially the comparison of the same descriptors calculated for the phenyl-amidine
derivatives showed compound
2a with high number of HBA groups and HOMO energy value
similar to the most potent phenyl-amidines, in contrast to
2b that presented only higher
number of HBA groups than the most potent phenyl-amidines (Tables 1 and 3).
In order to improve the overall potential of these two compounds as neuroprotective
molecules, we suggested some structural modifications based on the phenyl-amidines
analysis generating the compounds
2c-2g (Figure 2 and 3). Thus, we used the triazolyl group
in each side of the molecule and in both sides simultaneously (
2f) also adding some
substitutions based on the most potent phenyl-amidines. The analysis of the descriptors
initially calculated for the phenyl-amidine derivatives, showed that our rational design
increased values of HOMO energy, MV (volume) and MSA (area), and maintained the
number of HBA groups for all new compounds, except for
2f. Thus, the analysis of these
compounds suggested that
2c-2g may present a higher potential for a drug than 2a and 2b.
Importantly, the HOMO energy values (-8.63 to -7.91 eV) of these compounds were similar
to that observed for the four most potent phenyl-amidines (-8.80 to -8.56 eV) as well as MV
(272.88–348.40 Å3 and 307.64-313.44 Å3), MSA (295.27–379.98 Å2 and 334.85–342.25
Å2) and ovality (1.46-1.58 and 1.52-1.53) respectively (Table 1 and 3).
In order to predict the biological potency (pIC
50Pred
) of compounds 2a-2g, we applied
the QSAR Equation 1 derived from 17 phenyl-amidines (
1a-1q). According to our model,
except for compound
2b (pIC
50Pred
= 5.01 M), the calculated potencies for the other triazolyl-
amidines were similar to or better than the most potent phenyl-amidines (
1a-1d) (Tables 1
and 3).
The analysis of the electrostatic potential maps and the structure of the best conformer
of the triazolyl-amidines (
2a-2g) also reinforced the data revealing a stereoelectronic "V"
shape similar to that observed for phenyl-amidines (
1a-1q) (Figure 3). The electronic
property analysis revealed a negative charge in the phenyl ring in the right side, except for
2b
that do not present the phenyl group at this position (Figure 2 and Table 3).
2.3. In silico ADMET screening
To analyze their overall theoretical potential as a drug candidate and to compare with
the four most potent amidines, we submitted the triazolyl-amidines (
2a-2g) to an in silico
ADMET (absorption, distribution, metabolism, excretion and toxicity) screening using the
Osiris system. Therefore, we determined the cLogP (lipophilicity), the toxicity risks (irritant,
mutagenic, tumorigenic, and reproductive effects), the druglikeness (comparison with
commercial drugs and non-drug-like compounds), and the drug score, that combines
druglikeness, cLogP, cLogS, molecular mass and toxicity risks in one value to infer the drug
potential of these compounds.
According to the Osiris property evaluation, the lipophilicity (cLogP) of these
triazolyl-amidines (
2a-2g) (1.38-3.86) was similar to that observed for the most potent
phenyl-amidines (
1a-1d) (2.97-3.71) and pointed the compounds as sufficiently hydrophobic
for penetrating the biological membranes (Tables 1 and 3). We noticed that the triazolyl-
amidines presented a better profile of druglikeness and drug score than phenyl-amidines
(Figures 4) and druglikeness values lower than ifenprodil and Co101676 and Cl1041, other
NMDA receptor antagonists (Figure 4).
Literature described that CNS drugs that penetrate blood brain barrier are more
lipophilic, less polar, less flexible and with lower molecular mass and volume than other
classes of drugs. Since the compounds are considered for oral delivery and should be able to
cross the blood-brain barrier into the CNS, they were evaluated according to the Lipinski
modified ‘rule-of-five’ for successful CNS penetration. Interestingly, our theoretical results
showed all triazolyl-amines and the four most potent phenyl-amidines compounds as
fulfilling the Lipinski modified ‘rule-of-five’ for successful CNS penetration, with MM
≤400
Da, cLogP ≤5, number of HBA ≤7, and number of HBD ≤3. In fact, the rule states that at
least three of these requirements should be satisfied for a drug good bioavailability.
Interestingly, CNS drugs should have polar surface area (PSA) <60-70Å2 and number
of rotatable bonds (RotB) < 8 such as observed for all triazolyl-amidines, except for
2f
(74.42Å), that is still lower than the upper limit for penetrate the brain (~90Å2) (Table 3).
The Osiris toxicity evaluation showed most of the triazolyl-amidines with a low
profile for irritant, tumorigenic, mutagenic and reproductive effects, except for
2b and 2f that
presented some teratogenic risks analogously to
1d. The NMDA receptor antagonist
PD1724494 showed a high irritant risk, while the phenyl-amidines
1b and 1c presented
mutagenic risks (Figure 4). It is important to notice that the toxicity predicted herein does not
guarantee that these compounds are completely free of any toxic effect [25]. However, it
reinforced their promising potential for a drug, especially
2d-2g compounds that presented
the better values of pIC
50
.
2.4 Chemistry
In this work, we synthesized the triazole-amidines 2a (Scheme 1) and 2b (Scheme 2)
that presented different triazolyl rings (1,2,3-triazole and 1,2,4-triazole, respectively) to
evaluate their potentiality as lead compounds. The reaction of the aldehyde
3 [26] with
hydroxylamine cloridrate generated the 1,2,3-triazole oxime
4 [27], which on treatment with
acetic anhydride led to the corresponding 1,2,3-triazole nitrile
5 [28]. In a modified
procedure, carried out in DMSO as the solvent, the reaction of 5 with benzylamine in cuprous
chloride at 80oC [29] produced the novel 1,2,3-triazole amidine
2a (Scheme 1) in good yield
(73%) (Scheme 1).
The reaction of trifluoroacetic acid with aminoguanidine bicarbonate led to the 1,2,4-
triazole
6 (Scheme 2) as described in the literature [30]. The subsequent treatment of 3 with
benzonitrile in the presence of cuprous chloride at 80oC produced, regioselectively, the novel
1,2,4-triazole amidine
2b in good yield (75%)(Scheme 2) [29].
2.5. Neuroprotection from glutamate excitotoxicity
Previous work showed that the excitotoxicity induced by glutamate in avian retinal
neurons cultures is directly related to the agonist glutamate binding to NMDA receptors since
this excitotoxicity is completely blocked by the NMDA channel blocker MK-801 [31]. To
test the ability of the triazolyl-amidines to protect neuronal cells from glutamate
excitotoxicity, we pre-incubated these neurons cultures with the triazolyl-amidines (
2a and
2b) (100 nM) before the addition of glutamate (1 mM) as described in materials and methods
section (Figure 5).
Our assays confirmed that glutamate promotes an extensive cell death (77%) after
incubation for 8 h compared to control without glutamate. Interestingly both compounds
2a
and 2b protected the neurons from the glutamate effect (73% and 55%) (Figure 5), analogous
to that described for Ifenprodil [32]. No significant effect was observed when incubating
these compounds with the neuron cultures without adding glutamate suggesting a safe profile.
2.6. Cytotoxicity assays
In this study, we evaluated the cytotoxicity profile using different concentrations of
the triazolyl-amidines on Vero cells (Figure 6).
Our experimental results showed that both molecules
2a and 2b present a safe profile
with a CC
50
(1402.00M and 1403.51 M respectively) and a selective index > 14,020 (not
shown). The low cytotoxic profile of these compounds reinforced the theoretical results
predicted herein that suggested that they might present a safe profile as therapeutical agents.
3. Conclusion
The overall SAR analysis of 17 phenyl-amidines (1a-1q) described in the literature
revealed structural parameters and electronic properties that could be related to the biological
profile. Higher values of HOMO energy, molecular volume, molecular surface area, ovality
and number of hydrogen bond acceptor groups were apparently the most correlated
descriptors with the interaction with NMDA receptor. The results of molecular modeling
techniques applied on the phenyl-amidine series enabled the design of two triazolyl-amidines
(
2a-2b) as a potential lead compounds for designing of a new class of NMDA receptor
antagonists (
2c-2f). The experimental evaluation of 2a and 2b showed that both protected the
neurons from the glutamate-induced excitotoxicity with low toxicity profile in cells, which
reinforced their promising profile. Based on these two triazolyl-amidines, we designed
2c-2g,
which accordingly to our theoretical analysis may be more potent compounds with less
toxicity risks. These data may lead to more effective and less toxic compounds for treating
neurodisorders involving NMDA receptors.
4. Computational and experimental methods
4.1. Molecular modeling, SAR & QSAR studies, and in silico ADMET screening
The non-substituted derivative was submitted to the default systematic conformational
analysis procedure, available in the Spartan’06 software package (Wavefunction Inc. Irvine,
CA, 2000), using the MMFF94 force field, and the most stable conformer was used to
assemble the 17 amidines.
To evaluate the stereoelectronic properties, all structures were submitted to a full
geometry optimization process, using the Austin Model 1 (AM1) semi-empirical
Hamiltonian, and, subsequently, to a single-point energy
ab initio calculation, at the 3-21G*
level, both methods available in Spartan’06. Then, some electronic properties, such as
HOMO (Highest Occupied Molecular Orbital) and LUMO (Lowest Unoccupied Molecular
Orbital) energy values, HOMO and LUMO orbital coefficients distribution, molecular dipole
moment (μ), and molecular electrostatic potential (MEP) maps were calculated to perform the
structure-activity relationship (SAR) studies.
MEP isoenergy surface maps were generated in the range from
−25.0 (deepest red
color) to +30.0 (deepest blue color) kcal/mol and superimposed onto a molecular surface of
constant electron density of 0.002e/au3. Each point of the three dimensional molecular
surface map expresses the electrostatic interaction energy value evaluated with a probe atom
of positive unitary charge, providing an indication of the overall molecular size and location
of attractive (negative) or repulsive (positive) electrostatic potentials [25].
In addition, descriptors, such as molecular volume (MV), molecular surface area
(MSA), and ovality (a ratio of volume and area, measuring the overall shape) were calculated
using Spartan’06, while molecular mass (MM), cLogP (octanol/water partition coefficient)
and cLogS (water solubility) were calculated using the Osiris Property Explorer on-line
system (available at http://www.organic-chemistry.org/prog/peo/). The same methodology
was applied for both phenyl-amidines and triazolyl-amidines (
2a-g).
The Quantitative Structure-Activity Relationship (QSAR) study was performed by
multiple linear regression (MLR), applying the systematic search approach for variable
selection [24] , to examine the correlation of the calculated descriptors with the functional
activity (pIC
50
) for the 17 phenyl-amidines (1a-1q), and to generate a QSAR model, capable
of predicting the biological activity response (pIC
50Pred
) for the triazolyl-amidines (2a-g).
The four most potent phenyl-amidines and triazolyl-amidines were submitted to an
in
silico
ADMET (absorption, distribution, metabolism, excretion, and toxicity) screening, using
the Osiris system. The Osiris druglikeness is based on the occurrence frequency of each
fragment that is determined within the collection of traded drugs and within the non-drug-like
collection of Fluka compounds. The Osiris drug score is related to topological descriptors,
fingerprints of molecular druglikeness, structural keys and other properties, such as cLogP
and molecular mass [33].
We also evaluated these compounds according to the Lipinski’s modified ‘rule-of-
five’ for successful CNS penetration using the analysis of Spartan06` and molinspiration
program (http://www.molinspiration.com/cgi-bin/properties). This rule states molecular mass
≤400 daltons (Da), calculated octanol/water partition coefficient (cLogP) ≤5, number of
hydrogen-bond acceptors (HBA) ≤7, and number of hydrogen-bond donors (HBD) ≤3
[34,35].
4.2. Chemistry
General: Flash chromatography was performed in 230-400 mesh silica gel (Merck).
Melting points were determined on a Fischer-Johns apparatus and 1H and 13C-NMR spectra
were recorded in a Varian Unity Plus (300 MHz).
Amidine
2a: A DMSO (1 mL) solution of benzylamine (107 mg; 1 mmol) was added
to a DMSO (2 mL) solution of
5 (213 mg; 1.25 mmol) and CuCl (124 mg; 1.25 mmol). The
mixture was stirred under a nitrogen atmosphere, at 80oC for 20 h. AcOEt (2 mL) and 50%
aqueous NaOH (4 mL) were added. The mixture was vigorously stirred for 30 minutes. The
filtered and the solid was washed with AcOEt (10 mL). The organic layer was dried over
Na
2
SO
4
and the volatiles were removed in vacuum. The residue was purified by flash
chromatography on silica gel (10% AcOEt in hexane as the eluent) to give
2a as a white solid
(202 mg, 73% yield). Mp = 121-123oC. IR (KBr, cm-1): 3280, 3033, 2919, 1658, 1595,
1553, 1497, 1455, 1322, 1227, 1153, 970, 756, 697, 667; 1H-NMR (300 MHz, DMSO-
d6, δ)
9.33 (m, 1H), 8.58 (s, 1H), 8.38 (ddd, J=7.5 Hz, J=3.2 Hz, J=1.2 Hz, 2H), 7.73 (ddd, J=8.7
Hz, J=7.5 Hz, J=1.7 Hz, 2H), 7.60 (tt, J=8.7 Hz, J=1.2 Hz, 1H), 7.50-7.45 (m, 4H), 7.40-7.34
(m, 1H), 4.63 (d, J=6.3 Hz, 2H); 13C-NMR (75 MHz, DMSO-
d6, δ) 159.2 (s), 144.2 (s),
139.2 (s), 138.9 (s), 136.4 (s), 129.8 (s), 128.6 (s), 128.4 (s), 127.4 (s), 126.9 (s), 118.9 (s),
42.2 (s).
Amidine
2b: A suspension of 6 (152 mg; 1 mmol) in benzonitrile (1 mL) was added
to a benzonitrile (2 mL) solution of CuCl (124 mg; 1.25 mmol). The mixture was stirred,
under a nitrogen atmosphere, at 80oC for 20 h. AcOEt (2 mL) and 50% NaOH (4 mL) were
added. The mixture was vigorously stirred for 30 minutes. The organic layer was washed
consecutively with 3M NH
4
OH (until negative test for Cu(II) using 0.1M K
4
Fe(CN)
6
), with
5% NH
4
Cl (until neutralization), and then with water (15 mL). Subsequently it was dried over
Na
2
SO
4
and the volatiles were removed in vacuum. The residue was crystallized from ethyl
alcohol to give
2b as a yellow solid (191 mg, 75% yield). Mp = 151oC. IR (KBr, cm-1):
3346, 3203, 3061, 2920, 2851, 1645, 1578, 1530, 1510, 1466, 1447, 1216, 1181, 1145, 1034,
1008, 860, 771, 743, 697 cm-1; 1H-NMR (300 MHz, DMSO-
d6, δ) 9.07 (s, 1H), 8.90 (s,
1H), 8.22 (s, 1H), 8.17-8.13 (m, 3H), 7.70-7.64 (m, 2H); 13CNMR (75 MHz, DMSO-
d6, δ)
160.7 (s), 160.4 (s), 149.7 (q, J=37 Hz), 134.6 (s), 131.8 (s), 128.7 (s), 127.7 (s), 119.8 (q,
J=269 Hz).
4.3. Biological activity assays
4.3.1 Neuroprotection from glutamate excitotoxicity
Earlier work showed that incubation of these cultures with glutamate (1mM) for 8 h
promoted an intense cell death [31] that could be prevented by previous culture treatment
with 10 μM ifenprodil [32]. Thus triazolyl-amidines 2a and 2b were tested for their
neuroprotective potential profile by pre-incubating the purified cultures of avian retinal
neurons prepared as described elsewhere with them (100 nM) for 48 h [36]. Then we added
glutamate (1mM) and after 8 h, the cultures were fixed and the number of viable cells was
determined by counting at least 5 fields of 0.114 mm2 of each dish using a phase contrast
inverted microscope.
2a and 2b (100nM) were also tested without the addition of glutamate
to observe their effect on the avian culture. All experiments were made in triplicate at least
three times.
4.3.2. Cytotoxicity assay
Monolayers of 104 Vero (African green monkey kidney) cells in 96-multiwell plates
were treated with several concentrations (50, 250, 500, and 100
0 μM) of triazolyl-amidines
2a and 2b for 72h. Then, 50μL of 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium
bromide (MTT, Sigma) solution (1 mg/mL of MTT in solvent) was added to evaluate cell
viability according to procedures described elsewhere [37]. The 50% cytotoxic concentration
(CC
50
) was calculated by linear regression analysis of the dose-response curves. All
experiments were made in triplicate at least three times.
5. Acknowledgements
Research fellowships from Brazilian agencies granted to H.C.C. (FAPERJ), R.P.C
(CNPq), I.C.P.P.F. (CNPq), P.A.A. (CNPq), V.A.G.G.S. (FIOTEC), J.M.F. (CAPES),
O.M.C. (CNPq), R.A.C.L. (FAPERJ), L.M.S.M. (CAPES), and A.M.H. (CNPq) are
gratefully acknowledged. This work was partially supported by CAPES, CNPq, FAPERJ,
FIOTEC, Instituto de Biologia/UFF, Instituto de Química/UFF, Faculdade de
Farmácia/UFRJ, Intituto de Química/UFRJ (CNPq/PIBIC), and NPPN/UFRJ.
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Table 1. Comparison of the experimental biological data (pK
i
and pIC
50
) of the 17 phenyl-amidines
(
1a-1q) described by Claiborne et al 2003 with the theoretical parameters including E
HOMO
and E
LUMO
(HOMO/LUMO Energy Ev) μ (Molecular Dipole Moment Debye) MV (Molecular Volume Å3) MSA
(Molecular Surface Area Å2) Ovality (a ratio of volume and area) MM (Molecular Mass g/mol)
cLogP (calculated octanol/water partition coefficient) cLogS (calculated water solubility) and HBA
(number of hydrogen bond acceptors).
a) Experimental values of pK
i
(M) and pIC
50
(M) [Claiborne et al. Bioorg. Med. Chem. Lett. (2003) 13:697]. b)
The calculated pIC
50
values were obtained using Equation 1 [pIC
50
= 0.336(cLogP) + 1.612(E
HOMO
) +
12.636(Ovality) + 1.867 (n=17 R2= 0.854)]. c) Number of hydrogen bond donors (HBD) = 2 for all compounds.
Table 2. Cross correlation matrix of the experimental biological activities (pK
i
and pIC
50
) for the 17
phenyl-amidine compounds (
1a-1q) described by Claiborne et al 2003 and the calculated descriptors
E
HOMO
and E
LUMO
(HOMO/LUMO Energy Ev) μ (Molecular Dipole Moment Debye) MV (Molecular
Volume Å3) MSA (Molecular Surface Area Å2) Ovality (a ratio of volume and area) MM (Molecular
Mass g/mol) cLogP (calculated octanol/water partition coefficient) cLogS (calculated water
solubility) and HBA (number of hydrogen bond acceptors).
pIC
50
pK
i
E
HOMO
E
LUMO
μ MV MSA Ovality MM cLogP cLogS HBA
pIC
50
1.00
pK
i
0.78 1.00
E
HOMO
0.60 0.27 1.00
E
LUMO
0.19 0.05 0.54 1.00
μ
0.09 0.01 0.06 0.02 1.00
MV
0.74 0.65 0.08 -0.12 0.36 1.00
MSA
0.74 0.66 0.07 -0.13 0.32 1.00 1.00
Ovality
0.72 0.65 0.05 -0.18 0.25 0.98 0.99 1.00
MM
0.48 0.61 -0.29 -0.19 0.37 0.88 0.87 0.85 1.00
cLogP
0.15 0.60 -0.50 -0.37 0.17 0.48 0.48 0.48 0.73 1.00
cLogS
-0.20 -0.66 0.40 0.17 -0.18 -0.46 -0.46 -0.45 -0.72 -0.97 1.00
HBA
0.69 0.43 0.49 0.57 0.30 0.63 0.61 0.57 0.50 -0.08 -0.04 1.00
Table 3. Comparison of the theoretical parameters of the QSAR based designed designed triazolyl-
amidines (
2a-2g). The analysis included the predicted pIC
50
(M) and the calculated descriptors E
HOMO
(HOMO Energy Ev) MV (Molecular Volume Å3) MSA (Molecular Surface Area Å2) Ovality (a ratio
of volume and area) and the pharmakocinetic properties for a good oral for CSN drugs bioavalability
that include MM (Molecular Mass g/mol) cLogP (calculated octanol/water partition coefficient) HBA
(number of hydrogen bond acceptors) HBD (number of hydrogen bond donors) PSA (polar surface
area) and RotB (number of rotatable bonds).
Pharmacokinetic properties
#
pIC
50Pred
a
E
HOMO
MV MSA Ovality
MM cLogP HBA HBD PSA RotB
2a
7.71 -8.72 293.42 319.02 1.49 277.33 3.05 5 2 50.50 4
2b
5.01 -9.47 221.81 251.72 1.42 255.20 1.38 5 3 62.72 2
2c
7.92 -8.63 293.68 320.20 1.50 277.33 3.05 5 2 52.18 3
2d
8.35 -8.61 321.02 350.03 1.53 307.36 2.95 5 2 56.63 5
2e
8.46 -8.63 320.71 347.34 1.54 307.33 2.95 5 2 59.34 5
2f
9.41 -8.54 348.40 379.27 1.58 344.38 3.86 8 2 74.42 4
2g
8.30 -7.91 272.88 295.98 1.46 263.30 2.42 5 3 62.47 2
a) The predicted pIC
50
values were calculated using Equation 1 [pIC
50
= 0.336(cLogP) + 1.612(E
HOMO
) +
12.636(Ovality) + 1.867.
N
N
N
Ph
N
NH
H
Ph
2
a
N
N
N
Ph
C
H
O
3
a
N
N
N
Ph
4
NOH
b
N
N
N
Ph
CN
5
c
Scheme 1. a) Synthesis route of triazolil-amidine 2a. NH
2
OH.HCl, NaHCO
3
, Na
2
SO
4
, CH
2
Cl
2
, r.t.,
18 h, 87%. b) Ac
2
O, reflux, 2 h, 70%. c) BnNH
2
, CuCl, DMSO, 80oC, 20 h, 73%.
F
3
C OH
O
a
N
N
N
F
3
C
N
H
Ph
H
NH
2a
N
N
N
F
3
C
NH
2
H
3
b
Scheme 2. a) Synthesis route of triazolil-amidine 2b. aminoguanidine bicarbonate, toluene, reflux,
20h, 91%. b) PhCN, CuCl, 80oC, 20 h, 75%.
Figure 1. Selective NR2B/NMDA receptor antagonists.
Figure 2. Rational design of triazolyl-amidines (2a-2g).
Figure 3. Comparison of most stable conformation structures (up) and molecular electrostatic
potential (MEP) maps (bottom) of phenyl-amidines (
1a-1q) (A) and triazolyl-amidines (2a-
2g) (B) respectively.
A
B
Figure 4. Comparison of Toxicity Risks (A) Druglikeness and Drug score Profiles (B) of the most
potent phenyl-amidines (
1a-1d) the triazolyl-amidines (2a-2g) and some NMDA receptor antagonists
(Ifenprodil CO101676 PD0174494 and Cl-1041 calculated by using Osiris Property Explorer.
Figure 5: Neuroprotective effect of pre-incubation (48h) of triazolyl-amidines 2a and 2b.
Figure 6. Toxicity profile of triazolyl-amidines 2a and 2b as described in Materials and Methods
section. [The data represent the mean ± SEM from 3 individual experiments]. Cytotoxicity (Vero
cells) of
2a and 2b (50 250 500 and 1000 μM).
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