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UNIVERSIDADE FEDERAL DO MARANHÃO
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE
MESTRADO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
JOSÉ DE JESUS RODRIGUES MARQUES
AVALIAÇÃO HISTOPATOLÓGICA DO TUMOR DE EHRLICH SÓLIDO
EM CAMUNDONGOS TRATADOS COM Chenopodium ambrosioides
São Luís
2008
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO MARANHÃO
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE
MESTRADO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
AVALIAÇÃO HISTOPATOLÓGICA DO TUMOR DE EHRLICH SÓLIDO
EM CAMUNDONGOS TRATADOS COM Chenopodium ambrosioides
Aluno: José de Jesus Rodrigues Marques
Orientadora: Prof
a
Dr
a
Flávia Raquel Fernandes do Nascimento
Dissertação apresentada ao programa de Mestrado
em Ciências da Saúde da Universidade Federal do
Maranhão (UFMA), como parte dos requisitos para
obtenção do grau de mestre em Ciências da Saúde.
São Luís
2008
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Marques, José de Jesus Rodrigues
Avaliação histopatológica do tumor de Ehrlich sólido em camundongos tratados
com Chenopodium ambrosioides / José de Jesus Rodrigues Marques. – São Luís,
2008.
24 f.
Impresso por computador
Orientadora: Flávia Raquel Fernandes do Nascimento
Dissertação (Mestrado em Ciências da Saúde) – Universidade Federal do
Maranhão, Programa de Mestrado em Ciências da Saúde, 2008.
1. Chenopodium ambrosioides (mastruz) – Tumor de Ehrlich – Tratamento. I.
Nascimento, Flávia Raquel Fernandes do. II. Título.
CDU 582.683.2:615.27
JOSÉ DE JESUS RODRIGUES MARQUES
AVALIAÇÃO HISTOPATOLÓGICA DO TUMOR DE EHRLICH SÓLIDO
EM CAMUNDONGOS TRATADOS COM Chenopodium ambrosioides
A Comissão julgadora dos trabalhos de defesa da Dissertação de Mestrado,
em sessão pública realizada em ......./......./........., considera o candidato
.....................................................
____________________________________________
Prof
a
Dr
a
Flávia Raquel Fernandes do Nascimento
Orientadora
_____________________________________________
Prof
a
Dr
a
Ana Lúcia Abreu Silva
_____________________________________________
Prof
a
Dr
a
Rosane Nassar Meireles Guerra
_____________________________________________
Prof
a
Dr
a
Flávia Maria Mendonça do Amaral
Dedico este trabalho a Deus pela
coragem e pelas vitórias que Ele tem
me concedido.
AGRADECIMENTOS
À Deus, porque Ele é o caminho, a verdade e a vida.
À Profª Drª Flávia Raquel Fernandes do Nascimento, de indiscutível competência,
pela paciência, dedicação e orientação deste trabalho.
Às professoras Drª Rosane Nassar Meireles Guerra e Drª Flávia Maria Mendonça
do Amaral, pelas correções da qualificação.
Ao professor Ms. José Américo da Costa Barroqueiro e à professora Ms Elizabeth
de Sousa Barcelos Barroqueiro, pelo incentivo constante.
Aos colegas de experimento, Paulo Victor S. Pereira e Lucilene Amorim Silva,
pelo auxílio na obtenção dos dados.
À minha mãe Maria de Lourdes, à minha esposa Maria José e a meus filhos Hígor
e Alexandre, pelo companheirismo, amizade e compreensão.
Aos funcionários do Departamento de Morfologia, pelo auxílio durante este
período.
RESUMO
As folhas de Chenopodium ambrosioides L. [Chenopodiaceae] (mastruz) têm sido indicadas
para o tratamento de diversas doenças, dentre elas o câncer. Recentemente foi demonstrado
que C. ambrosioides tem uma potente ação anti-tumoral quando utilizado por via
intraperitoneal 48 horas antes ou 48 horas depois do inóculo do tumor de Ehrlich. O objetivo
deste trabalho foi investigar o efeito do tratamento sub-crônico com C. ambrosioides por
diferentes vias sobre o desenvolvimento do tumor de Ehrlich na forma sólida. Camundongos
C3H/HePas foram tratados diariamente com extrato bruto hidroalcoólico (EBH) de folhas de
C. ambrosioides (5mg/kg) ou com PBS (grupo controle) pelas vias intraperitoneal (EBH ip.),
tópica (EBH tp.) ou oral (EBH oral). Os tratamentos foram iniciados imediatamente após a
inoculação do tumor na pata esquerda (tumor sólido) e foram mantidos por doze dias. A
análise histopatológica considerou a presença de células tumorais, necrose, inflamação e
congestão vascular presentes nas patas portadoras de tumor. Os dados morfométricos
mostraram que o tratamento com EBH por todas as vias induziu aumento na espessura das
patas, o qual foi mais evidente no grupo EBH ip. Contudo, a análise histopatológica
demonstrou que neste grupo o número de células tumorais foi menor, enquanto o infiltrado
neutrofílico foi maior que o controle. Os grupos EBH oral e EBH tópico apresentaram
alterações histolopatológicas pontuais, mas não apresentaram alterações quanto ao número de
células tumorais e nem quanto à resposta inflamatória. Em conclusão, o tratamento por via
intraperitoneal foi eficaz em reduzir o desenvolvimento tumoral, mas ao mesmo tempo,
induziu aumento da área de necrose no tecido da pata. Mais experimentos são necessários
para avaliar os mecanismos envolvidos neste processo.
Palavras-chave: Tumor de Ehrlich, mastruz, Chenopodium ambrosioides.
ABSTRACT
The leaves of Chenopodium ambrosioides L. [Chenopodiaceae] (‘mastruz’) have been
indicated for the treatment of several diseases, among which the cancer. Recently it was
shown that C. ambrosioides has a potent anti-tumoral effect when offered by intraperitoneal
route, and this effect was evident when the treatment was given either two days before or after
the tumor implantation. The aim of this study was to investigate the effect of the subchronic
treatment with C. ambrosioides by different vias on the solid Ehrlich tumor development.
C3H/HePas mice were treated with hydroalcoholic crude extract (HCE) from leaves of C.
ambrosioides (5mg/kg) or with PBS (control group)by intraperitoneal (HCE ip.), topical
(HCE tp.) or oral (HCE oral) routes. The treatments were performed immediately after the
tumor inoculation on the left footpad (solid tumor) and they were maintained by 12 days. The
hystopatholgical analyses considered the presence of tumor cells, the necrosis, the
inflammation and the vascular congestion. The morphmetric data showed that the treatment
with HCE by all the routes induced an increase in the feet thickness, what was more evident
in the ip. treatment. However, the hystopathological analyses showed that the presence of
tumor cells was smaller while the neutrophilic infiltrate was bigger then the control group.
The HCE oral and HCE tp groups showed only punctual alterations in the hystopathological
analyses, but they did not show alterations in the tumor cells presence and in the
inflammatory response. In conclusion, the ip treatment was efficient to reduce the tumor
development, but it has induced an increased necrosis in the footpad. More experiments are in
progress to evaluate the mechanism involved in this process.
Keywords: Ehrlich tumor, mastruz, Chenopodium ambrosioides.
LISTA DE ABREVIATURAS
EBH – Extrato Bruto Hidroalcoólico
ip. – intraperitoneal
PBS – Solução Tamponada de Fosfato
S.E.M. – Erro Padrão da Média
tp. – tópico
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 - Aspecto geral da espécie Chenopodium ambrosioides L. (mastruz)............ 6
Figura 2 - Efeito do tratamento diário com EBH de Chenopodium ambrosioides sobre
a variação ponderal de animais portadores de tumor de Ehrlich na forma
sólida............................................................................................................... 10
Figura 3 - Efeito do tratamento diário com EBH de Chenopodium ambrosioides sobre
a espessura e peso das patas inoculadas com células de tumor de
Ehrlich............................................................................................................. 11
Tabela 1 - Avaliação histopatológica das patas inoculadas com tumor de Ehrlich em
animais tratados com EBH de folhas de Chenopodium ambrosioides por
diferentes vias ................................................................................................. 13
Figura 4 - Fotomicrografia dos tecidos das patas inoculadas com tumor de Ehrlich em
animais tratados diariamente com EBH de Chenopodium ambrosioides.......
14
SUMÁRIO
RESUMO
ABSTRACT
LISTA DE ABREVIATURAS
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
1
INTRODUÇÃO............................................................................................................ 1
2
OBJETIVOS................................................................................................................ 4
2.1 Geral...................................................................................................................... 4
2.2 Específicos…......................................................................................................... 4
3
MATERIAL E MÉTODOS....................................................................................... 5
3.1 Animais.................................................................................................................. 5
3.2 Espécie vegetal...................................................................................................... 5
3.2.1 Classificação botânica................................................................................ 5
3.3 Obtenção do extrato hidroalcoólico de folhas de Chenopodium ambrosioides
6
3.4 Tratamento com o EBH por diferentes vias...................................................... 7
3.5 Neoplasia transplantável..................................................................................... 8
3.5.1 Acompanhamento do desenvolvimento do Tumor de Ehrlich na forma
sólida.......................................................................................................... 8
3.6 Avaliação histopatológica.................................................................................... 8
3.7 Análise estatística................................................................................................. 9
4
RESULTADOS............................................................................................................ 10
4.1 Efeito do tratamento com EBH de C. ambrosioides por diferentes vias sobre
o peso de camundongos portadores de tumor de Ehrlich na forma sólida..... 10
4.2 Efeito do tratamento com EBH de C. ambrosioides por diferentes vias sobre
a espessura e peso das patas inoculadas com tumor de Ehrlich...................... 11
4.3 Alterações histopatológicas induzidas na pata inoculada com tumor de
Ehrlich em animais tratados diariamente com EBH de C. ambrosioides por
diferentes vias ...................................................................................................... 12
5
DISCUSSÃO................................................................................................................ 15
6
CONCLUSÕES........................................................................................................... 19
REFERÊNCIAS............................................................................................................ 20
1 INTRODUÇÃO
O gênero Chenopodium pertence à família Chenopodiaceae e compreende cerca
de 120 espécies que se apresentam sob forma de ervas perenes ou anuais, possuem folhas
alternas, flores pequenas e andróginas ou ainda unissexuadas; sementes livres ou aderentes e
frutos envoltos totalmente, ou em parte, pelo cálice. O gênero é abundante nos trópicos e
regiões adjacentes especialmente na América tropical e África, possuindo importância por sua
ampla variedade de espécies com propriedades medicinais (PIO CORREA, 1984). Essa
espécie é exótica no estado do Maranhão, contudo é cultivada em todas as regiões e muito
empregada pela população como medicamento (RÊGO, 1995).
Chenopodium ambrosioides L., espécie da família Chenopodiaceae, é uma erva
aromática conhecida popularmente como erva-de-Santa-Maria, erva santa, mastruço, mastruz,
menstruz, menstruço e quenopódio. Segundo dados etnobotânicos é popularmente utilizada
como vermífugo, emenagogo, estomático, antitussígeno, abortivo, e no tratamento de asma,
infecções pulmonares, infecções fúngicas, hemorróidas, úlceras leishmanióticas, tuberculose,
gripe, bronquite, problemas digestivos, diarréia, enteroparasitoses, contusões, equimoses e na
recuperação de fraturas ósseas (MASUCCI, 1982; RÊGO, 1995; COSTA et al., 2001;
MOREIRA et al., 2002; ALMASSY JR, 2004; MARINHO, 2004; MEDEIROS et al., 2004;
MORAIS et al., 2005; RODRIGUES; GUEDES, 2006; PILLA et al., 2006; AGRA et al.,
2007; ALBUQUERQUE et al., 2007).
Os estudos de investigação química da espécie Chenopodium ambrosioides têm
comprovado a presença de diversos óleos essenciais, tais como: alcanfor, ascaridol, ascaridol-
glicol, iso-ascariol, cis-ascaridol, trans-ascaridol, ausatona, cânfora, ∆-4-careno, carvacrol,
trans-isocarveol, trans-pinocarveol, p-cimeno, felandreno, geraniol, limoneno, mirceno, α-
pineno, β-pineno, pinocarveol, pinocarvona, pinocarvona, α-terpineno, α-terpineol, α-terpinil
acetato, α-terpinol acetato, α-terpinoleno e timol (DE PASCUAL et al., 1980; PARE et al.,
1993; SANGRERO-NIEVES; BARTLEY, 1995; MUHAYIMANA et al., 1998; ONOCHA et
al., 1999; GUPTA et al., 2002; KIUCHI et al., 2002; PINO et al., 2003; CAVALLI et al.,
2004; OMIDBAIGI et al., 2005; KASALI et al., 2006; MONZOTE et al., 2006); bem como a
presença de flavonóides e terpenóides (BOGACHEVO et al., 1972; SALT; ADLER, 1985;
JAIN et al., 1990; KAMIL et al., 1992; GOHAR et al., 1997; DI CARLO et al., 1999;
KIUCHI et al., 2002; LIU, 2004).
Estudos farmacológicos têm comprovado diversas propriedades incluindo
atividade reparadora de tecidos moles e ósseo, mitogênica, hipotensora, antimicrobiana,
antifúngica, antitumoral, antioxidante, moluscicida, giardicida, leishmanicida, ascaridicida,
tripanomicida, plasmodicida e imunomodulatória (POLLACK et al., 1990; PARE et al.,1993;
KISHORE et al., 1996; GOHAR et al., 1997; FREITAS SILVA, 1998; DI CARLO et al.,
1999; DELESPAUL et al., 2000; HMAMOUCHI et al., 2000; LÓPEZ DE GUIMARAES et
al., 2001; EFFERTH et al., 2002; MOREIRA et al., 2002; FUMIYUKI et al., 2002; KIUCHI
et al., 2002; LIU, 2004; DEMO et al., 2005; PINHEIRO-NETO et al., 2005; CALZADA et
al., 2006; SPEISKY et al., 2006; MONZOTE et al., 2006; NASCIMENTO et al., 2006;
CRUZ et al., 2007; KUMAR et al., 2007; PATRÍCIO et al., 2008).
Recentemente, o grupo de pesquisa do Laboratório de Imunofisiologia da
Universidade Federal do Maranhão demonstrou que o tratamento com extrato hidroalcoólico
das folhas de Chenopodium ambrosioides apresenta um potente efeito anti-tumoral
(NASCIMENTO et al., 2006) após aplicação única por via intraperitoneal, antes ou após a
inoculação das células de tumor de Ehrlich, um carcinoma de crescimento rápido e bastante
agressivo comumente utilizado em experimentos com camundongos (SEGURA et al., 2000).
O tumor de Ehrlich é capaz de crescer em quase todas as linhagens de
camundongos o que sugere que o reconhecimento e a resposta imune a este tumor ocorram de
forma independente do reconhecimento mediado pelo complexo principal de
histocompatibilidade (CHEN; WATIKINS, 1970). Ou seja, o controle dessas células passa
pela ativação da imunidade inata, em especial, de células fagocíticas como macrófagos e
neutrófilos (BERGAMI-SANTOS et al., 2004).
De acordo com o local de implantação, o tumor de Ehrlich se diferencia em tumor
sólido ou ascítico permitindo, portanto, que se investigue a atividade anti-tumoral de produtos
derivados de plantas ou animais em situações tumorais diferentes. O modelo escolhido neste
trabalho foi o tumor de Ehrlich na forma sólida. Este modelo permite uma melhor avaliação
dos efeitos dos tratamentos diários com Chenopodium ambrosioides por diferentes vias. Do
ponto de vista macroscópico, por exemplo, pode ser avaliada tanto a espessura quanto o peso
da pata portadora do tumor e do ponto de vista microscópico, podem ser avaliados diversos
parâmetros que vão desde o infiltrado inflamatório, passando pela caracterização e
quantificação das células tumorais e ainda a avaliação dos vasos e áreas de necrose.
Com base nos resultados descritos anteriormente por Nascimento et al. (2006)
quanto aos efeitos anti-tumoral observado em animais submetidos ao tratamento com dose
única do extrato de Chenopodium ambrosioides, por via intraperitoneal, foi investigado nesse
trabalho se o tratamento subcrônico diário com o mesmo extrato, aplicado por diferentes vias,
poderia potencializar a atividade anti-tumoral previamente relatada. Adicionalmente, foram
avaliadas as alterações histopatológicas ocasionadas pelo tratamento com extrato sobre o
desenvolvimento do tumor de Ehrlich na forma sólida.
2 OBJETIVOS
2.1 Geral
Investigar o efeito do extrato bruto hidroalcoólico (EBH) de Chenopodium
ambrosioides, administrado diariamente, por diferentes vias sobre o desenvolvimento do
tumor de Ehrlich na forma sólida em camundongos.
2.2 Específicos
– Avaliar o efeito do tratamento diário com EBH de Chenopodium ambrosioides
por diferentes vias sobre o peso dos animais
– Avaliar o efeito do tratamento diário com EBH de Chenopodium ambrosioides
pelas diferentes vias sobre a espessura e peso das patas com tumor de Ehrlich.
– Avaliar aspectos histopatológicos das patas inoculadas com células de tumor de
Ehrlich após o tratamento diário com EBH de Chenopodium ambrosioides por diferentes vias.
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Animais
Foram utilizados camundongos machos da linhagem C3H/HePas com idade entre
8 e 16 semanas, fornecidos pelo Biotério Central da Universidade Federal do Maranhão
(UFMA). Os animais foram mantidos, durante o estudo, no Biotério de Experimentação do
Laboratório de Imunofisiologia da UFMA, em condições ambientais controladas. Receberam
ração e água ad libitum. Os animais foram manipulados de acordo com as normas
estabelecidas pelo Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA) e os
procedimentos adotados foram aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa da UFMA
(CEP/UFMA).
3.2 Espécie vegetal
3.2.1 Classificação botânica
Segundo Joly (2002) a espécie vegetal apresenta a seguinte taxonomia:
Reino: Vegetal
Divisão: Angiosperma
Classe: Dicotyledoneae
Sub-classe: Archichlamydeae
Ordem: Centrospermae
Família: Chenopodiaceae
Gênero: Chenopodium
Espécie: Chenopodium ambrosioides L.
Figura 1 – Aspecto geral da espécie Chenopodium ambrosioides L. (mastruz)
3.3 Obtenção do extrato hidroalcoólico de folhas de Chenopodium ambrosioides
Folhas de exemplar adulto da espécie Chenopodium ambrosioides, cultivada no
Horto Medicinal Berta Langes de Morretes – Campus do Bacanga, São Luís/Maranhão, foram
coletadas, na estação seca, no mês de setembro, conforme normas previamente estabelecidas
(OLIVEIRA et al., 1991; VON HERTWIG, 1991; COSTA, 1994; BOTSARIS, 1995).
A identificação botânica foi realizada no Herbário Ático Seabra da Universidade
Federal do Maranhão (UFMA), onde a exsicata está depositada sob nº 1148/SLS017213.
Após a coleta as folhas frescas de Chenopodium ambrosioides foram submetidas à
seleção e limpeza, seguida de secagem em estufa com circulação de ar a 40ºC. Após a
secagem, as folhas foram fragmentadas em moinho.
Duzentos gramas de folhas secas foram submetidos à extração pela técnica de
maceração, em frasco apropriado, empregando em cada etapa de renovação do solvente, um
litro de etanol (70%), mantendo o material em contato por vinte e quatro horas, com agitação
em intervalos de oito horas. Após vinte e quatro horas da primeira etapa da maceração, o
extrato hidroalcoólico foi separado do material vegetal por expressão manual, seguida de
filtração em papel de filtro, sendo acondicionado em frasco âmbar e mantido sob refrigeração.
Em seguida, o material vegetal foi macerado, acrescentando um litro de etanol (70%),
obedecendo às mesmas condições operacionais anteriormente descritas. Esse procedimento
foi repetido por três vezes. Ao final, os extratos hidroalcoólicos obtidos em cada etapa da
maceração foram submetidos, em conjunto, a filtração a vácuo. Em seguida, o extrato bruto
hidroalcoólico (EBH) de Chenopodium ambrosioides foi concentrado sob pressão reduzida
em rotaevaporador; com rendimento de 10,4% (p/p). O extrato bruto hidroalcoólico (EBH) foi
então seco e liofilizado.
Para a realização dos experimentos in vivo o resíduo seco liofilizado foi diluído em
solução tamponada de fosfato (PBS) estéril a uma concentração de 10mg/mL, seguida de
filtração em membrana de 0,22 µm, em câmara de fluxo laminar.
3.4 Tratamento com o EBH por diferentes vias
Os animais (n = 5/grupo) foram inoculados com células de tumor de Ehrlich no
coxim plantar conforme descrito abaixo. Imediatamente após o inóculo, e durante os 12 dias
consecutivos, os animais foram tratados com EBH (5mg/Kg) pelas vias intraperitoneal (EBH
ip.), tópica (EBH tp.) ou oral (EBH oral). A dose do EBH utilizada foi escolhida com base no
trabalho previamente realizado por nosso grupo (NASCIMENTO et al., 2006). O grupo
controle recebeu 0,2 ml de Solução Tamponada de Fosfato (PBS) estéril pelas mesmas vias
utilizadas para o tratamento com EBH.
3.5 Neoplasia transplantável
Para obtenção das células neoplásicas transplantáveis (Tumor de Ehrlich),
camundongos com aproximadamente 8 dias de evolução do tumor ascítico, foram
sacrificados, e o fluido ascítico aspirado com auxílio de seringa e agulhas estéreis, após
excisão da parede abdominal. Para a indução do tumor na forma sólida foram inoculadas
5x10
5
células tumorais no coxim plantar da pata esquerda de cada animal (KLEEB et al.,
1997).
3.5.1 Acompanhamento do desenvolvimento do Tumor de Ehrlich na forma sólida
As espessuras das patas inoculadas ou não com células tumorais foram
mensuradas com auxílio de um paquímetro digital (Sanny), imediatamente antes do inóculo
do tumor no coxim plantar e a cada dois dias, até o décimo segundo dia. Quando os animais
foram sacrificados e as patas amputadas, pesadas e fixadas em formol 10%.
3.6 Avaliação histopatológica
Para a avaliação histopatológica, as patas fixadas em formol 10%, por 24 h, foram
desidratadas em álcool e imersas em parafina. Fragmentos de 5µm foram cortados e corados
com hematoxilina-eosina. Foram analisados os seguintes parâmetros: presença de células
tumorais, infiltrado neutrofílico, infiltrado mononuclear, congestão vascular e necrose. A
análise foi feita em teste duplo cego utilizando a seguinte classificação: - ausente, + presença
moderada; ++ presença intensa; +++ presença muito intensa.
3.7 Análise estatística
Os resultados foram expressos como média ± erro padrão da média (S.E.M) de 5
animais/grupo. As análises estatísticas foram realizadas com auxílio do software GraphPad
versão 3.0 (GraphPad Software Inc, San Diego, CA, USA). Utilizou-se Análise de Variância
ANOVA One-way seguido do teste de Newman-Keuls, com nível de significância de 0,05%.
4 RESULTADOS
4.1 Efeito do tratamento com EBH de Chenopoides ambrosioides por diferentes vias
sobre o peso de camundongos portadores de tumor de Ehrlich na forma sólida
Os animais que receberam PBS por diferentes vias (grupos controles) não
apresentaram diferenças entre si e foram agrupados para facilitar a visualização nos gráficos.
Os animais dos grupos controle, EBH ip. e EBH oral apresentaram uma
diminuição do peso após os 12 dias de inóculo do tumor, entretanto apenas no grupo EBH
oral essa diferença foi significativa. Por outro lado, os animais do grupo EBH tp.
apresentaram ganho de peso em relação ao dia zero, havendo diferença estatística entre este
grupo e o controle (Figura 2).
-5
-4
-3
-2
-1
0
1
2
Controle EBH ip. EBH tp EBH oral
∆
do peso dos anmais (g)
*
*
Figura 2 – Efeito do tratamento diário com EBH de Chenopodium ambrosioides sobre a variação
ponderal de animais portadores de tumor de Ehrlich na forma sólida. Camundongos C3H/HePas
foram inoculados na pata com 5x10
5
células de tumor de Ehrlich e foram tratados diariamente com
EBH de Chenopodium ambrosioides pelas vias ip., tópica e oral. Os animais foram pesados no dia 0 e
após 12 dias do inoculo do tumor. O ∆ representa a diferença entre os pesos dos animais entre o dia 12 e
o dia 0. * p≤0,05 em relação ao controle. N= 5/grupo.
4.2 Efeito do tratamento com EBH de Chenopodium ambrosioides por diferentes vias
sobre a espessura e peso das patas inoculadas com tumor de Ehrlich
O tratamento com EBH induziu aumento significativo na espessura das patas
inoculadas com tumor quando comparadas ao grupo controle, sendo esse efeito mais evidente
no grupo EBH ip. Neste grupo a diferença na espessura das patas foi evidenciada a partir do
terceiro dia após o inóculo das células tumorais (Figura 3A). Ao fim dos tratamentos, tanto a
espessura quanto os pesos das patas inoculadas com tumor de todos os grupos tratados com
EBH foram maiores que os do grupo controle (Figura 3B).
0
1
2
3
4
123456789101112
Dias
∆
espessura da pata (mm)
Controle EBH ip. EBH tp EBH oral
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
A
0
100
200
300
400
Controle EBH ip. EBH tp EBH oral
∆
peso das patas (mg)
0
1
2
3
4
∆
espessura das patas (mm)
Peso Espessura
*
*
*
B
Figura 3 – Efeito do tratamento diário com EBH de Chenopodium ambrosioides sobre a espessura
e peso das patas inoculadas com células de tumor de Ehrlich. Camundongos C3H/HePas foram
inoculados na pata com 5x10
5
células de tumor de Ehrlich e foram tratados diariamente com EBH de
Chenopodium ambrosioides pelas vias intraperitoneal (ip.), tópica (tp) e oral. A espessura das patas foi
medida diariamente com auxílio de um paquímetro digital e a variação entre cada dia e o dia zero foi
calculada para obter o ∆ (A). Ao final dos doze dias de tratamento, os animais foram sacrificados e as
patas mensuradas, amputadas e pesadas (B). Os dados representam a média ± S.E.M de 5/grupo.
*
p
<0
,
05 em rela
ç
ão ao controle.
4.3 Alterações histopatológicas induzidas na pata inoculada com tumor de Ehrlich em
animais tratados diariamente com EBH de Chenopodium ambrosioides por diferentes
vias
Na avaliação histopatológica das patas inoculadas com tumor de Ehrlich foram
observadas algumas diferenças na morfologia da neoplasia. Em todos os grupos, as células
tumorais encontradas no tecido das patas apresentaram intenso pleomorfismo, anaplasia e
relação núcleo/citoplasma maior que as células normais. Entretanto, no grupo controle, as
células tumorais eram mais numerosas, mais integras, maiores, multinucleadas e
arredondadas, enquanto em todos os grupos tratados com EBH, as células tumorais
apresentavam-se mais fragmentas, com extravasamento de conteúdo e características típicas
de morte celular. Vale ressaltar, que no grupo EBH ip. a presença de células tumorais no
tecido foi significativamente menor que no grupo controle (Tabela 1 e Figura 4).
Em relação ao processo inflamatório, todos os grupos apresentaram infiltrado
neutrofílico, entretanto, o grupo EBH ip. foi diferente do controle, pois apresentou infiltrado
celular muito intenso. Todos os grupos apresentaram infiltrado mononuclear moderado, mas
no grupo EBH oral, este infiltrado foi mais intenso.
Em todos os grupos foram observadas áreas de necrose, as quais foram intensas
nos grupos controle e no grupo EBH tp. e muito intensas nos grupos EBH ip. e EBH oral. A
presença de vasos congestos foi observada de forma moderada no grupo controle e no grupo
EBH oral, intenso no grupo EBH ip. e muito intenso no grupo EBH tp, sendo que neste grupo
os resultados foram significativamente diferentes do grupo controle.
Tabela 1 – Avaliação histopatológica das patas inoculadas com tumor de Ehrlich de animais
tratados com PBS ou EBH de folhas de Chenopodium ambrosioides por diferentes vias.
Presença de
células tumorais
Infiltrado
neutrofílico
Infiltrado
mononuclear
Áreas de
necrose
Vasos
congestos
Controle +++
a
++ + ++ +
EBH tp. +++ ++ + ++ +++
*
EBH ip. +
*
+++ + +++ ++
EBH oral +++ ++ ++ +++ +
a
Escores: - (ausente), + (moderado), ++ (intenso), +++ (muito intenso)
*
p<0,05 em relação ao controle. N=5/grupo.
Figura 4 – Fotomicrografia dos tecidos das patas inoculadas com tumor de Ehrlich de animais tratados
diariamente com EBH de Chenopodium ambrosioides. Camundongos C3H/HePas foram inoculados na pata
com 5x10
5
células de tumor de Ehrlich e foram tratados diariamente com EBH de Chenopodium ambrosioides
pelas vias ip., tópica e oral. Ao final dos doze dias de tratamento, os animais foram sacrificados e as patas
amputadas, pesadas e fixadas. Os cortes histológicos foram corados com Hematoxilina-Eosina. Nas fotos é
possível ver as células tumorais (setas brancas) e o infiltrado inflamatório muito intenso (seta preta) presentes nas
patas dos grupos controle (A), EBH or. (B), EBH ip. (C) e EBH tp. (D). Foram avaliados 5 cortes por grupo.
Aumento de 400X.
B
D
A
C
5 DISCUSSÃO
Os resultados obtidos neste trabalho mostraram que os animais do grupo controle
apresentaram redução de peso. O mesmo aconteceu nos grupos EBH ip. e EBH oral, sendo
que neste último, houve uma redução significativamente mais acentuada que o grupo controle.
Por outro lado, os animais do grupo EBH tp. apresentaram resultados inversos, uma vez que
nesse grupo houve um aumento significativo do peso dos animais quando comparado ao
grupo controle. A redução de peso mais acentuada observada nos animais do grupo EBH oral
pode estar relacionada à toxicidade do extrato, uma vez que o mesmo foi aplicado
diariamente. Entretanto, não temos ainda uma explicação plausível para o tratamento por via
tópica ter induzido aumento significativo no peso dos animais. Esses efeitos estão sendo
testados atualmente no laboratório.
Em relação ao desenvolvimento tumoral, foi verificado que apenas o grupo EBH
ip. apresentou menor presença de células do tumor de Ehrlich. Estes resultados corroboraram
os resultados previamente obtidos por Nascimento et al., (2006) que demonstram que a
aplicação de EBH de C. ambrosioides em dose única pela via ip. apresenta efeito anti-
tumoral, o qual não está relacionado ao efeito tumoricida local, mas sim ao efeito sistêmico do
EBH. Da mesma forma, Cruz et al. (2007) demonstraram que a injeção do EBH por via ip.
induz um aumento no influxo de células inflamatórias, principalmente de macrófagos, os
quais apresentam capacidade de espraiamento aumentada e maior produção de óxido nítrico e
peróxido de hidrogênio quando comparados ao grupo controle. Assim é possível sugerir, que
o tratamento com EBH estimula os macrófagos, o que pode potencializar a resposta ao tumor
Alguns compostos químicos presentes em Chenopodium ambrosioides tais como
flavonóides e terpenos (KIUCHI et al., 2002) poderiam explicar os resultados apresentados
aqui. Estes produtos têm recebido atenção considerável nos últimos anos devido suas
propriedades farmacológicas, incluindo a atividade antioxidante e antitumoral (RUBY et al.,
1995; DEFEUDIS et al., 2003; TAKEOKA et al., 2003).
Um fato relevante é que o grupo EBH ip. foi o que apresentou maior espessura
das patas, desde os primeiros dias de aplicação, o que refletiu nos seus pesos finais. Este
aumento está, provavelmente, relacionado à manutenção da resposta inflamatória neutrofílica,
no local de implantação do tumor e não à proliferação de células. Esta inflamação constante
poderia explicar a necrose tissular observada. Entretanto, o grupo EBH oral que não
apresentou inibição do crescimento tumoral, nem infiltrado neutrofílico, apresentou áreas de
necrose similares ao observado no grupo EBH ip. Assim pode-se inferir que a necrose
observada nas patas dos animais do grupo EBH ip. não está diretamente relacionada ao
infiltrado neutrofílico, mas sim a uma associação entre a presença de células tumorais e a
liberação de mediadores inflamatórios.
Vale ressaltar que no grupo EBH ip. houve uma relação inversa entre a espessura
pata e a presença de células tumorais. Estes dados são importantes uma vez que chamam
atenção para o fato de que o aumento da espessura da pata não deve ser tomado isoladamente
como forma de determinar o aumento do desenvolvimento tumoral, enfatizando a necessidade
da avaliação histopatológica. Dados semelhantes foram encontrados por Patrício et al. (2008)
ao avaliarem a espessura de patas murinas inoculadas com formas promastigotas de
Leishmania amazonensis e tratadas com EBH de Chenopodium ambrosioides, as quais
apresentaram aumento na espessura, em detrimento da redução da carga parasitária. Os
resultados destes autores, em conjunto com os obtidos neste trabalho, nos levam a sugerir que
o uso diário de EBH possui efeito pró-inflamatório, sendo esta inflamação capaz de controlar
a proliferação das células tumorais.
De fato, a inflamação parece estar intimamente relacionada ao desenvolvimento
do tumor. Já foi demonstrado que a simples implantação do tumor ascítico de Ehrlich induz
uma reação inflamatória local acompanhada do aumento da permeabilidade vascular o que
resulta na formação intensa de edema, migração de células envolvidas no processo
inflamatório e formação progressiva de fluido ascítico (FECCHIO et al., 1990), o qual é
fundamental para o crescimento do tumor, constituindo uma fonte nutricional direta para as
células tumorais (GUPTA et al., 2004). Essas informações parecem trazer uma controvérsia
ao resultado obtido neste trabalho, uma vez que foi observada uma relação inversa entre o
infiltrado inflamatório neutrofílico e o número de células tumorais. Entretanto, é possível que
a inflamação inicial decorrente da associação da implantação do tumor e do concomitante
tratamento com o EBH pela via intraperitoneal tenha induzido um quadro inflamatório inicial
suficiente para controlar o crescimento do tumor.
A menor presença de células tumorais observada no grupo EBH ip. não foi,
entretanto, observada nos outros grupos tratados. Muito provavelmente, as diferenças
observadas dentre os tratamentos pelas vias ip., tópica e oral estejam relacionadas à absorção
diferencial do EBH, uma vez que a velocidade e a eficiência da absorção de quimioterápicos
dependem da via de administração. A absorção pela via endovenosa, por exemplo, é a mais
veloz e eficaz, uma vez que praticamente a dose total do fármaco alcança a circulação
sistêmica. No entanto, a biodisponibilidade do fármaco, que se refere à fração de uma dose
que tem acesso à circulação sistêmica, pode ser baixa na via tópica e na oral, devido à
absorção incompleta ou pelo fato do fármaco ser metabolizado na parede intestinal ou no
fígado, antes de alcançar a circulação sistêmica (RANG et al., 2005).
No caso específico do EBH, por se tratar de um extrato bruto, não houve a
possibilidade de se testar a via endovenosa diretamente. Entretanto, a via ip., dentre as três
vias testadas, é a que permite o maior alcance do produto à circulação sanguínea, uma vez que
a cavidade peritoneal é altamente vascularizada, permitindo uma rápida absorção venosa do
princípio ativo. A aplicação do EBH pelas vias oral e tópica induziu alterações pontuais nos
animais, o que indica que houve absorção do produto, mas mediante a ausência de efeito anti-
tumoral é possível sugerir que a biodisponibilidade do princípio ativo não tenha sido
suficiente, quer por deficiência na absorção, quer pela aplicação de uma dose baixa para as
vias oral e tópica. Esta última hipótese é a mais plausível, uma vez que a dose de 5mg/Kg foi
utilizada nos três grupos tratados com EBH.
Maiores investigações são, portanto, necessárias no sentido de se avaliar a cinética
da inflamação resultante da associação entre a implantação do tumor e o tratamento com EBH
e relacionar a inflamação neutrofílica com a atitividade anti-tumoral induzida pelo EBH por
via ip. Além disso, faz-se necessário testar doses maiores do EBH, pelas vias tópica e oral,
para avaliar se a baixa atividade anti-tumoral observada nestas vias estão relacionadas à falhas
na absorção do princípio ativo ou à dose baixa utilizada. Vale ressaltar ainda que estudos de
avaliação da toxicidade do EBH em doses maiores já estão em andamento no laboratório para
investigar possíveis reações adversas sistêmicas decorrentes dos tratamentos, bem como o seu
efeito na resposta inflamatória.
6 CONCLUSÕES
– Camundongos portadores de tumor de Ehrlich na forma sólida tratados
diariamente com EBH de C. ambrosioides apresentaram redução do peso quando tratados por
via oral e aumento do peso quando tratados por via tópica.
– O tratamento com EBH de C. ambrosioides induziu um aumento significativo
na espessura e no peso das patas inoculadas com tumor de Ehrlich.
– Os grupos tratados com EBH apresentaram células tumorais menos íntegras do
que o grupo controle, sendo que a presença de células tumorais foi menor apenas no grupo
EBH ip., o qual apresentou também o infiltrado neutrofílico mais intenso e maior área de
necrose na pata.
– O infiltrado neutrofílico observado no grupo EBH ip. parece estar diretamente
relacionado à atividade anti-tumoral observada.
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