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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
INSTITUTO DE CIÊNCIAS DO MAR – LABOMAR
PÓS - GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS MARINHAS TROPICAIS
Diversidade de Vibrio spp. em estuários no Estado do
Ceará associada à atividade de carcinicultura
FRANCISCA GLEIRE RODRIGUES DE MENEZES
FORTALEZA - CE
Março / 2005
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
INSTITUTO DE CIÊNCIAS DO MAR – LABOMAR
PÓS - GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS MARINHAS TROPICAIS
Diversidade de Vibrio spp. em estuários no Estado do
Ceará associada à atividade de carcinicultura
FRANCISCA GLEIRE RODRIGUES DE MENEZES
Dissertação apresentada ao Mestrado em
Ciências Marinhas Tropicais do Instituto de
Ciências do Mar da Universidade Federal do
Ceará, como requisito parcial à obtenção do
título de MESTRE.
Orientadora: Profa. Dra. REGINE HELENA S. DOS FERNANDES VIEIRA
FORTALEZA – CE
Março / 2005
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Os rios e suas lágrimas
Regine Limaverde
Os rios choram.
Eles são vivos e pedem
que não sejam assassinados.
Os rios choram
porque guardam os detritos
das cidades e já não conservam
um verde esmeralda.
Os rios choram
e o culpado é o homem,
que faz de suas águas
fossas, lixo.
Os rios choram
e nós, estudiosos,
aprendemos a ler suas dores.
Os rios choram
e com eles, nós.
Aos meus pais, Joaquim e Liduína, minha avó
Maria do Carmo e ao Pedro Ernesto.
Agradeço eternamente todo o incentivo
durante estes anos e a compreensão por
entenderem minha ausência. Esses são meus
verdadeiros companheiros, nunca vou poder
agradecê-los o bastante.
DEDICO
AGRADECIMENTOS
A Deus meu fiel escudeiro, que sempre esteve por perto em todos os momentos me
dando coragem para continuar.
À Suyane minha irmã maravilhosa que com seu jeito tímido me impulsiona a dar o
melhor de mim sempre.
Ao meu irmão Alexandre, o parceiro de todas as horas.
À minha Tia Francisca, a irmã mais velha que não tive.
À minha mãe, minha maior e melhor amiga.
Ao meu pai, minha fonte de inspiração na vida.
À Oscarina, um presente divino que tive a honra de conhecer e de conviver durante
esses sete anos.
À Susy por toda sua ajuda em campo e na árdua batalha da vida.
À Norma, a companheira que me ensinou a nunca desistir de um ideal.
Aos meus companheiros do mestrado: Janaina, Isabel, Carol, Lucélia, Luis Ernesto, Gil,
Afonso, Leonardo, Esaú, Marquinhos, Geraldo, Guelson, André e Sérgio. Vocês
mostraram que a união realmente faz a força e que as diferenças só servem para
fortalecer a amizade.
Ao Wilson, Pedro Alexandre, Saulo, Júnior, Franzé, Edvar, Dani, Renata Stock e Ilene
por todo carinho e amizade.
Às minhas colegas de laboratório: Isabel, Dani, Gardenny, Renata, Rakel, Rosa, Karla,
Carol, Anahy, Claudia, Edirsana, Cristiane e Janisi. Sem vocês eu não teria conseguido
finalizar esse trabalho, muito obrigada por toda a ajuda, vocês são uma equipe de
primeira.
À Waleska Albuquerque um anjo que Deus colocou na minha vida, e que agora partirá
para o Piauí e irá iluminar o coração de outras pessoas. Muito obrigada por tudo. .
Às eternas reginetes: Leyla, Marilza, Regina, Hilda, Ludmila, Elenice e Flávia.
À Profa. Leda Hagler por ter me acolhido em seu laboratório.
À Selma, Anderson, Ida, Maria do Carmo, Ailton, Patrícia, Paulinho e Olavo, por
mostrarem que ciência se faz com seriedade e muita alegria.
Ao Prof. Gustavo Hitzschky Fernandes Vieira, por toda ajuda prestada neste trabalho.
Ao Hauston pela ajuda nas minhas coletas.
Ao Prof Ernesto Hofer, que fez com que o convívio com os víbrios fosse o mais
satisfatório possível.
Ao Prof. Adauto Fonteles e ao Raul Madrid.
Ao Nonato pelo empréstimo do GPS.
À secretária do mestrado Rosângela por sua paciência e compreensão.
Ao CNPq pela concessão da bolsa de estudo durante o curso.
Ao Senhor Edilson, Jaqueline, Célia, Dona Zuíla, Francisco, Senhor Chico e Jandeilson.
A todos que direta e indiretamente contribuíram para a realização desta pesquisa.
AGRADECIMENTO ESPECIAL
À minha orientadora Regine Vieira (minha eterna cheirosa), uma cientista que tive a
honra de trabalhar durante sete anos e que a cada dia me ensina que para se fazer
ciência é necessário gostar de desafios e estar sempre disposta a se apaixonar por
cada bactéria estudada. Muito obrigada cheirosa!
ÍNDICE
LISTAS DE TABELAS
LISTAS DE FIGURAS
RESUMO
ABSTRACT
1 INTRODUÇÃO
14
2 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
18
2.1 Manguezais 18
2.2 Carcinicultura 19
2.3 Litopenaeus vannamei 23
2.4 Reavaliação taxonômica do gênero Vibrio 24
2.5 Víbrio 24
2.5.1 Espécies de víbrios patogênicas ao homem 25
2.5.2 Espécies de víbrios patógenos ao camarão 27
3 MATERIAL E MÉTODOS
29
3.1 Local de Coleta 29
3.2 Coleta das Amostras 34
3.3 Preparo das Amostras 34
3.3.1 Amostras de água 34
3.3.2 Amostras de sedimento 34
3.4. Número Mais Provável(NMP) de Coliformes Totais e Fecais 34
3.4.1 Teste Presuntivo 35
3.4.2 Teste Confirmatório 35
3.5 Contagem e Isolamento de Vibrio spp. 35
3.5.1 Semeadura Inicial das Amostras 35
3.5.2 Contagem e Isolamento de Colônias Suspeitas 36
3.6. Identificação das Cepas Suspeitas de Vibrio spp. 39
3.6.1 Identificação Presuntiva 39
3.6.2 Identificação Definitiva 40
3.7 Determinação dos fatores extrínsecos 42
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
43
5 CONCLUSÃO
59
6 BIBLIOGRAFIA
60
7 ANEXOS
73
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Localização e quantificação das áreas de mangues no Estado do
Ceará. 19
Tabela 2 Estimativa do número mais provável (NMP) de Vibrio spp. nas
amostras de água e sedimento coletadas nos estuários dos Rios
Pacoti, Choró, Pirangí e Jaguaribe. 44
Tabela 3 Estimativa do número mais provável (NMP) de Vibrio spp.
presente nas amostras de água e sedimento coletados no canal
de captação, no viveiro e no canal de descarga de uma fazenda
de carcinicultura no Rio Jaguaribe.. 44
Tabela 4 Variáveis ambientais medidas nas amostras de água dos
estuários dos Rios Pacoti (controle), Choró, Pirangi e Jaguaribe
(CE) e pontos de uma fazenda de camarão ( Jaguaribe-CE ). 47
Tabela 5 Linhagens de Víbrios isolados dos quatro estuários estudados
nos Rios Pacoti (controle), Choró, Pirangi e Jaguaribe. 51
Tabela 6 Linhagens de Víbrios isolados de amostras de água e sedimento
de três diferentes pontos (canal de captação,canal de descarga e
viveiro) de uma fazenda de camarão localizada em Aracati- CE.
52
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Distribuição das Fazendas de carcinicultura no Estado do
Ceará. 22
Figura 2 Vista panorâmica do Rio Pacoti (Eusébio- CE) 30
Figura 3 Ponto de coleta (1) do Rio Pacoti- CE
30
Figura 4 Ponto de coleta (2) do Rio Pacoti- CE. 30
Figura 5 Vista panorâmica do Rio Choró (Cascavel-CE) 31
Figura 6 Ponto de coleta (1) do Rio Choró (Cascavel – CE) 31
Figura 7 Ponto de coleta (2) do Rio Choró (Cascavel-CE) 31
Figura 8 Vista panorâmica do Rio Pirangi (CE) 32
Figura 9 Ponto de coleta do Rio Pirangi (Guajiru – CE) 32
Figura 10 Vista panorâmica do Rio Jaguaribe (CE) 33
Figura 11 Ponto de coleta do Rio Jaguaribe (Aracati- CE) 33
Figura 12 Esquema para quantificação e identificação de víbrios isolados
das amostras de água coletadas dos estuários e fazenda de
carcinicultura. 37
Figura 13 Esquema para identificação de víbrios isolados das amostras de
sedimento coletadas dos estuários e fazenda de carcinicultura 38
Figura 14 Riqueza de víbrios isolados de água e sedimento dos quatro
estuários estudados, localizados nos Rios Pacoti, Choró, Pirangi
e Jaguaribe. 49
Figura 15 Riqueza de espécies em amostras de água e sedimento de três
diferentes pontos (canal de captação, viveiro e canal de
descarga) de uma fazenda de camarão localizada em Aracati-
CE. 53
RESUMO
Por ser uma atividade econômicamente viável, o cultivo de camarão marinho vem
crescendo em todo o mundo. O Brasil, e em particular a região Nordeste, vem sendo
responsável por grande parte da produção nacional do crustáceo. Os ambientes
estuarinos e de água doce são reservatórios críticos para espécies do gênero Vibrio,
agentes causais de bacterioses. Encontrados na microbiota dominante nos estágios de
desenvolvimento larval dos camarões, essas bactérias podem ser isoladas tanto de
animais saudáveis como do próprio ambiente. Esta pesquisa teve como objetivo
estudar a diversidade de espécies do gênero Vibrio em quatro estuários do Estado do
Ceará. Três deles apresentam atividade de carcinicultura e o quarto não apresenta
essa atividade, sendo usado como controle do experimento. Os pontos estudados
estavam localizados nos rios: Choró, Pirangi, Jaguaribe e Pacoti. Foram analisadas
amostras de água e sedimento dos rios escolhidos e também do canal de captação, do
viveiro e do canal de descarga de uma fazenda de cultivo de camarão marinho, L.
vannamei. Como resultado, foram isoladas e identificadas 138 cepas de amostras
oriundas do ambiente (água e sedimento dos rios) e 25 provenientes das amostras
coletadas na fazenda. As espécies mais freqüentes de Vibrio identificadas nas
amostras de ambiente foram: Vibrio logei, V. parahaemolyticus, V. fluvialis e V.
cholerae. Enquanto que, na fazenda foram: V. logei e V. cholerae. Tendo em vista que:
(a) a diversidade das espécies do gênero Vibrio é muito maior nos estuários do que na
fazenda de carcinicultura; e (b) esta diversidade é semelhante nos estuários com (Rios
Pirangi, Choró e Jaguaribe) e sem (Rio Pacoti) fazendas de cultivo, conclui-se que,
aparentemente, a carcinicultura não causa impacto ambiental na diversidade do gênero
Vibrio.
Palavras-chave: Vibrio, mangues e carcinicultura
ABSTRACT
An economically attractive investment, marine shrimp farming is on the rise not only in
Brazil but also all over the world. Farms in Northeastern Brazil account for most of the
country’s shrimp production. However, shrimp populations have been constantly
submitted to bacterial infections caused by vibrios endemic to estuarine and freshwater
environments. These bacteria are associated with the shrimp microbiota during the early
larval stages and may be isolated from both healthy animals and the environment itself.
The present study consists of a survey of the species diversity of genus Vibrio occurring
in four mangrove areas located on the Choró, Pirangi, Jaguaribe and Pacoti rivers’
estuaries, in Ceará State, three of which with shrimp farms and one without (control).
Water and sediment samples were taken inside the four estuaries as well as in the
inflow and outflow channels and ponds of a Litopenaeus vannamei shrimp farm. As a
results of this research work, 138 strains of Vibrio were isolated and identified from
estuarine water and sediment samples and 25 from samples collected on the farm. The
Vibrio species most frequently observed were V. logei, V. parahaemolyticus, V. fluvialis
and V. cholerae (in samples from the environment) and V. logei and V. cholerae (in
samples from the farm). Our findings suggest that, since vibrios were found in estuaries
both with and without shrimp farming activities and the species diversity was greater in
the environment than on the shrimp farm, estuaries are not negatively impacted by
shrimp culture as far as the genus Vibrio is concerned.
Key words: Vibrio, mangrove, shrimp farming
MENEZES, F. G. R. Diversidade de Vibrio spp. em estuários no Estado do Ceará... 15
1 – INTRODUÇÃO
O camarão marinho é um importante recurso pesqueiro encontrado em todos os
mares do mundo, desde regiões de latitude subpolar até regiões subtropicais, onde sua
incidência é maior. Nos trópicos são encontradas espécies de alto valor econômico,
com áreas de pesca de grande produtividade e produção (Machado, 1988; Lavilla-
Pitogo et al., 1998). Uma das espécies de camarão de grande valor comercial, natural
do Oceano Pacífico, e que foi adaptada no Brasil é Litopenaeus vannamei (Martins,
2003).
Atualmente, o Brasil é o país com a maior produtividade mundial, quase 6,5
toneladas anuais por hectare. A Tailândia vem em segundo lugar, com metade da
eficiência brasileira. Apesar disso, o preço do camarão brasileiro no exterior é o menor
entre os grandes produtores, chegando a US$ 4.29/Kg de janeiro a junho no ano de
2004 (Rocha, 2004). Nos Estados Unidos, por exemplo, o produto nacional foi vendido
ao longo de 2003 por um preço médio de 4.46 dólares/Kg, enquanto os chineses,
maiores produtores mundiais, venderam seu produto a 5.52 dólares/ Kg (Revista Globo
Rural, 2005).
Em 2005 estima-se que a produção brasileira de camarão, de todos os tipos,
voltados para atender à demanda do mercado externo, deverá totalizar 160 mil
toneladas, com 20 mil hectares de áreas de produção (Socil, 2005).
Segundo Valença & Mendes (2004), o cultivo de camarão marinho vem se
intensificando no mundo, sendo encontrado no Brasil, principalmente na região
nordeste, nos Estados do Ceará, Paraíba, Piauí e Rio Grande do Norte. Nos últimos
quatro anos a carcinicultura nessa região concentrou 97% da produção nacional. A
maior parte dos empreendimentos está localizada em áreas de mangues ou próximos a
eles, onde a água é de boa qualidade, com as marés abastecendo os viveiros
(Biodiversity Reporting Award, 2002).
O Ceará, no ano de 2004, foi o segundo maior produtor de camarão do País,
atingindo a cifra de 65 milhões e 18 mil dólares somente com a sua exportação, atrás
apenas do Rio Grande do Norte. Segundo dados do Ministério do Desenvolvimento,
Indústria e Comércio Exterior (MDIC), no mesmo ano, o Estado apresentou um
crescimento em exportação de 10% sobre o ano de 2003 (Eugênio, 2005)
MENEZES, F. G. R. Diversidade de Vibrio spp. em estuários no Estado do Ceará... 16
Melo (2004) ressalta que o Brasil tem todas as condições de se tornar, em
menos de dez anos, o maior produtor mundial de camarão criado em cativeiro, com
exportações superiores a um bilhão de dólares.
Em contrapartida Wainberg (2004) cita que a expansão da carcinicultura brasileira
vem seguindo os mesmos passos de outros países, com um desordenamento no
processo de expansão, seguido de colapso ambiental e sanitário.
Segundo a Resolução do Conselho Nacional do Meio Ambiente – CONAMA, n°
357 de 18 de março de 2005 (CONAMA, 2005), a qual ressalta padrões para corpos de
água destinados a pesca ou cultivo de organismos aquáticos para fins de consumo, não
deverá existir na água nenhum efeito tóxico agudo a organismos, sua quantidade de
carbono orgânico deve ser no máximo 5,00 mg/L e os coliformes não poderão exceder
um limite de 2.500 por 100 mililitros da amostra.
Entretanto, poucos estudos têm sido realizados para avaliar o impacto causado
sobre o ecossistema manguezal devido ao crescimento acelerado dessa atividade. É
necessário, então, estudos que estabeleçam parâmetros que permitam o crescimento
da atividade econômica tão importante para a região sem, no entanto, gerar danos
irrecuperáveis ao meio ambiente que possam vir a prejudicar os próprios cultivos com o
surgimento de doenças, como as vibrioses que causam enormes perdas econômicas
para os cultivadores.
De acordo com Barbieri et al. (1999) os ambientes estuarinos e de água doce são
reservatórios críticos para espécies do gênero Vibrio, causadores de doenças. Gomez-
Gil et al. (2004) citam que as bactérias são um dos patógenos infectantes mais
importantes de organismos aquáticos, tais como camarões peneídeos, várias espécies
de peixes, moluscos e corais.
Os víbrios, agentes causais de bacterioses, compõem a microbiota dominante nos
estágios de desenvolvimento larval dos camarões, sendo também isolados de animais
saudáveis. Esse fato comprovaria a característica oportunista desses microrganismos
associados aos camarões.
A ecologia dos víbrios nos sistemas aquáticos tem sido bem estudada e a
distribuição das espécies é afetada pela salinidade, disponibilidade de nutrientes e
temperatura, dentre outros parâmetros. Nos estudos ecológicos, a incidência de víbrios
MENEZES, F. G. R. Diversidade de Vibrio spp. em estuários no Estado do Ceará... 17
halofílicos é considerada alta em amostras de água e de alimentos marinhos (Wong et
al., 1992, Thompsom et al., 2004), no entanto pouco se sabe em relação à diversidade
desses microrganismos em manguezais impactados pela atividade de carcinicultura no
Estado do Ceará.
O número recente de pesquisas tem associado contaminação aquática ambiental
com infecções de Vibrio em humanos, sugerindo que a importância do monitoramento
sistemático dessas cepas ambientais é necessária para definir seu possível potencial
patogênico e sua significância clínica. Dentro de condições ambientais desfavoráveis,
pode-se citar o decréscimo do nível de Vibrio vulnificus em meses de inverno, como
uma estratégia de sobrevivência. Diz-se que a bactéria entra em um estado de
viabilidade mas não é cultivável (VBNC) ( Baffone et al., 2003, Lipp. et al. 2001).
A partir das informações citadas acima e com o objetivo de se estudar a
diversidade de espécies de Vibrio spp. em quatro regiões de estuários no Estado do
Ceará, três deles apresentando atividade de carcinicultura (Choró, Pirangi e Jaguaribe)
e um sem a presença dessa atividade (Rio Pacoti, usado como controle), essa pesquisa
foi realizada . Baseado nisso, o trabalho teve como objetivos:
1. Quantificar os víbrios, através da técnica do Número Mais Provável (NMP),
das amostras de água e sedimento dos estuários dos Rios Pacoti, Choró,
Pirangi e Jaguaribe;
2. Contar, isolar e identificar as colônias de víbrios sacarose negativas (verdes)
e positivas (amarelas) nas placas de Agar TCBS;
MENEZES, F. G. R. Diversidade de Vibrio spp. em estuários no Estado do Ceará... 18
2- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
2.1 - Manguezais
O ecossistema manguezal se desenvolve em zonas litorâneas associadas a
cursos d’água, em áreas encharcadas, salobras e calmas, com influência das marés,
porém, não atingidos pela ação direta das ondas. É um elo de ligação entre os
ambientes marinho, terrestre e de água doce (Rossi & Mattos, 1992).
Segundo Schaeffer-Novelli (1999), os manguezais são, geralmente, sistemas
jovens que seguindo a dinâmica da maré nas áreas onde se localizam, produzem a
modificação na topografia destes terrenos, resultando numa seqüência de recuos e
avanços da cobertura vegetal. São sistemas funcionalmente complexos, altamente
resilientes e resistentes e conseqüentemente, estáveis. A cobertura vegetal se instala
em substratos de formação recente, de pequena declividade, sob ação diária das
marés, de água salgada ou salobra.
Os manguezais têm sido por muito tempo vistos como locais residuais, razão
porque muitas áreas de floresta de mangue foram perdidas em função de seu emprego,
como lixões, destino final de esgoto urbano e como depósito ilegal de lixos. Estas áreas
são consideradas um dos ecossistemas mais produtivos do mundo, sendo também
chamados de “berçários” por abrigarem inúmeras espécies de animais no período de
reprodução. Eles se desenvolvem em regiões da costa marinha, banhadas pelas
marés. Seu maior desenvolvimento pode ser observado nas áreas onde o relevo
topográfico é suave e a amplitude das marés é alta (Macedo & Rocha, 1985). Como
não sobrevivem em temperaturas frias, estão restritos às áreas tropicais e sub-tropicais
do planeta, onde a temperatura é quente e às regiões onde o clima é úmido (Firme,
2003). No Brasil, a extensão ocupada pelos manguezais é ampla, ocorrendo desde o
extremo norte (Rio Oiapoque) até Santa Catarina (Laguna). Somente no Estado do Rio
Grande do Sul inexiste cobertura vegetal típica de mangue (Schaeffer-Novelli, 1995).
Os manguezais cearenses se distribuem preferencialmente nas zonas
estuarinas, ocorrendo desde a desembocadura dos rios, acompanhando suas margens,
até à influência das marés. Sua área total é estimada em aproximadamente 22.000 ha
distribuída principalmente em treze rios litorâneos (Tabela 1).
MENEZES, F. G. R. Diversidade de Vibrio spp. em estuários no Estado do Ceará... 19
Tabela 1 - Localização e quantificação das áreas de
mangues no Estado do Ceará.
Rios
Área aproximada
de Mangues (ha)
%
Timonha / Ubatuba 10.184 44,40
Remédios 431 1,89
Coreaú 4.620 20,14
Acaraú 1.907 8,32
Zumbi 1.708 7,45
Aracatiaçú 498 2,17
Mundaú / Cruxati 1.071 4,67
Ceará 500 2,17
Cocó 375 1,63
Pacoti 158 0,69
Choro 24 0,10
Pirangí 200 0,87
Jaguaribe 1.260 5,50
Total 22.936 100,00
2.2 – Carcinicultura
A carcinicultura marinha mundial vem crescendo com extrema rapidez. O Brasil é
considerado por especialistas internacionais, como o país com maior potencial para o
desenvolvimento da atividade. Dados da produção nacional a partir de 1997 até 2000
indicaram uma taxa de crescimento anual em torno de 100%. Em 1999 a produção no
Estado do Ceará foi de 1947 ton., pulando para 4.914 ton. em 2000. Em 2004, o
Estado foi o segundo maior produtor de camarão do País, atingindo a cifra de 65
milhões e 18 mil dólares somente com a sua exportação (SEMACE, 2000; Eugênio,
2005).
MENEZES, F. G. R. Diversidade de Vibrio spp. em estuários no Estado do Ceará... 20
As condições ambientais da costa do nordeste brasileiro, com clima semi-árido a
sub-úmido, são extremamente favoráveis a essa finalidade. Entretanto, esse
desenvolvimento acelerado nas últimas décadas tem ocasionado impactos negativos
sobre o ambiente, como a conversão de áreas de mangue em viveiros de criação,
alterações nos regimes hidrológicos em águas fechadas devido a proliferação de
estruturas da atividade de carcinicultura e o descarte de altos níveis de material de
origem orgânica nas águas costeiras (Pei-Uan Qian & Wu, 2001).
O tipo de cultivo empregado nas fazendas é o chamado “intensivo” que se
caracteriza pela combinação de altas densidades de estocagem (> 400.000 indivíduos /
ha) e alta taxa de alimentação. Dependendo das condições e do estágio de
crescimento, a oferta de alimento na forma de ração peletizada acontece várias vezes
ao dia, com troca de água diária correspondendo de 3 a 30% do volume do viveiro
(Paez-Osuna et al., 1998).
A expansão do cultivo de camarão na maioria das áreas costeiras do mundo,
implica em um aumento em larga escala da quantidade de nutrientes e sólidos
suspensos nas águas receptoras dos efluentes. A elevação do aporte de material
particulado tem efeitos imediatos sobre o ambiente receptor tal como redução da
penetração da luz e aumento da concentração de NH
4
+
. Em alguns casos o nível de
impacto é suficiente para afetar a própria atividade de cultivo. Existem fortes evidências
de que perdas na produção de fazendas de carcinicultura na Ásia e América Latina
resultantes de surtos de doenças tenham como origem primária as alterações causadas
no ambiente pelas águas residuais dos cultivos (Phillips et al., 1993, Jones et al., 2001).
Além dos prejuízos causados na própria atividade, esse descarte da matéria
orgânica também está ligado a vários casos de degradação ambiental. Mesmo assim a
existência de dados quantitativos sobre as alterações sofridas no ecossistema
manguezal, impactado por esse tipo de poluição, ainda é pequeno.
A distribuição das fazendas de carcinicultura no Estado do Ceará no ano de
2004 está apresentada na Figura 1.
MENEZES, F. G. R. Diversidade de Vibrio spp. em estuários no Estado do Ceará... 21
A diversidade da comunidade bacteriana também parece sofrer um efeito muito
forte com este tipo de poluição orgânica. Segundo Torsvik et al. (1997), foi encontrado
uma diversidade genética 250 vezes menor em ambientes de mangue utilizados para
aquacultura quando comparado com áreas onde não havia essa atividade.
MENEZES, F. G. R. Diversidade de Vibrio spp. em estuários no Estado do Ceará... 22
Fonte : SEMACE
Figura 1 - Distribuição das Fazendas de carcinicultura no Estado do
Ceará.
MENEZES, F. G. R. Diversidade de Vibrio spp. em estuários no Estado do Ceará... 23
2.3 – Litopenaeus vannamei
O Camarão Litopenaeus vannamei é uma espécie encontrada naturalmente
desde a porção leste do Oceano Pacífico, na altura de Sonora, México, até a altura de
Thumbes, norte do Peru. O animal é uma espécie marinha, com preferência pelo
sedimento, sendo encontrada desde a região de infra-litoral, até profundidades de 72 m,
e seu tamanho pode chegar a 23 cm. É a espécie comercial mais explorada no sul do
México, Guatemala e El Salvador e a espécie mais cultivada no Hemisfério Ocidental
(Barbieri Junior & Ostrenky Neto, 2002 ; Liu et al., 2004).
No Brasil, L. vananmei é uma espécie comercialmente cultivada e introduzida no
país em 1983. Entretanto, somente a partir do inicio dos anos 90, quando alguns
laboratórios de larvicultura privada viabilizaram pós-larvas dessa espécie é que as
validações tecnológicas realizadas pelas fazendas de camarão, nos Estados do Rio
Grande do Norte, Ceará e Paraíba, demonstraram a supremacia de L. vannamei em
relação às espécies nativas (ABCC, 2004).
Devido sua importância para a aquicultura e a excelente qualidade da carne
(destacando-se seu sabor característico, firmeza e coloração), L. vannamei tornou-se
uma espécie bem conhecida e aceita no mercado internacional. Em função disso, o
cultivo dessa espécie vem despertando um interesse crescente nos investidores e
produtores de grande parte da América do Sul, Central e até da China (Barbieri
Junior & Ostrenky Neto, 2002). No Equador e no México o cultivo do camarão L.
vannamei tem se mostrado uma importante atividade econômica, embora esta atividade
venha sofrendo com a atividade de patógenos, tendo por exemplo os víbrios, como os
maiores responsáveis pelas grandes perdas econômicas (Vandenberghe et al., 1999).
No Brasil, a introdução de L. vannamei foi fundamental para o desenvolvimento
da carcinicultura. Além da boa aceitação no mercado, a espécie possui grande
capacidade de adaptação às mais variadas condições de cultivo, apresentando alto
rendimento e elevada densidade de estocagem, em águas híper ou oligohalinas. Além
do que, suporta ambientes com elevada amplitude térmica (entre 9 e 34ºC). Porém, por
se tratar de uma espécie exótica, seu processo de adaptação, manejo e propagação
demandou uma serie de desafios e conquistas importantes, como a produção auto-
MENEZES, F. G. R. Diversidade de Vibrio spp. em estuários no Estado do Ceará... 24
suficiente de pós-larvas; criação de bancos de reprodutores, para acabar com a
dependência externa de matrizes; oferta de rações de boa qualidade; além da completa
reformulação dos processos tecnológicos adotados até então (Barbieri Junior &
Ostrenky Neto, 2002).
Mudanças na salinidade afetam a imunidade do L. vannamei e levam a
susceptibilidade a vibrioses e a mortalidade do organismo. Algumas espécies de víbrios
como V. alginolyticus e V. harveyi, atacam os camarões durante situações de estresse
tais como redução da salinidade (Wang & Chen, 2005).
2.4- Reavaliação taxonômica do gênero Vibrio
Na oitava edição do Manual de Bergey (Buchanan & Gibbons, 1974) foram
listados cinco espécies do gênero Vibrio. Atualmente são descritas 75 espécies no “List
of bacterial names with standing in nomenclature” (LBNSN, 2005). A caracterização e
identificação fenotípica do gênero Vibrio apresenta uma série de dificuldades devido
principalmente a sua elevada diversidade bioquímica. Da mesma forma, a descrição de
várias novas espécies desse gênero leva a constantes alterações na taxonomia da
família Vibrionaceae (Alsina & Blanch, 1994; Vandenberghe et al., 2003) O avanço das
técnicas de biologia molecular tem permitido a realização de uma abordagem polifásica
no estudo da taxonomia e classificação bacteriana baseada em dados fenotípicos,
quimiotaxonômicos e genômicos. Segundo Thompson et al. (2004), a diversidade dos
víbrios ainda não está completamente coberta. Dessa forma é muito provável que no
futuro haja um aumento no número de espécies do gênero Vibrio.
2.5 – Vibrio
O gênero Vibrio compreende 75 espécies (DSMZ, 2005) bastonetes gram-
negativos, distribuídos em ambientes marinhos e estuarinos. Vários membros deste
gênero têm sido implicados em altos números de surtos vinculados à água e frutos do
mar causando infecções gastrointestinal em humanos incluíndo as espécies: V.
cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus, V. mimicus, V. alginolyticus, e V. holissae.
MENEZES, F. G. R. Diversidade de Vibrio spp. em estuários no Estado do Ceará... 25
Na verdade, espécies de Vibrio estão espalhadas e um crescente número destas cepas
são patogênicas a vertebrados marinhos e invertebrados. Todavia, um número de
cepas potencialmente patogênicas de víbrios ficam mal caracterizados, incluindo V.
fluvialis, V. tubiashi, V. splendidus, V. proteolyticus, e V. niripulchritudo, isolados de uma
variedade de fazendas de criação de peixes e espécies de crustáceos (Lee et al.,
2002).
Os víbrios são um grupo de bactérias altamente divergentes, que apresentam
crescimento em vida livre ou simbiose com outras espécies. Eles são distribuídos em
ambientes marinhos e estuarinos. Tipicamente são mais encontrados em ambientes
estuarinos, onde a salinidade se apresenta entre 0,5‰ e 2,5‰ (Nishigushi & Nair, 2003;
Shehane & Sizemore, 2002).
Dentre os diversos substratos existentes, os víbrios podem ser encontrados em
ostras, camarões, mexilhões, algas marinhas, peixes, bem como em água, sedimento e
plâncton, sendo muitas vezes classificados como patógenos oportunistas, causando
doenças quando o organismo está comprometido (Gomez-Gil et al., 1998, Cavallo &
Stabilli, 2004).
Os microrganismos aquáticos pertencentes ao gênero Vibrio são definidos como
bastonetes retos ou curvos, móveis, Gram negativos e não-esporogênicos. Em sua
maioria fermentadores de glicose sem produção de gás, apresentando reação de
oxidase positiva, na maioria das espécies. Algumas espécies de Vibrio são identificadas
como patogênicas ao homem, como por exemplo, V. cholerae, agente causador da
cólera; V. parahaemolyticus e V. vulnificus, responsáveis por muitos casos fatais
relacionados à ingestão de frutos do mar contaminados (Silva et al., 1997, Thompsom
et al., 2004).
2.5.1- Espécies de víbrios patogênicas ao homem
A associação entre os víbrios e os invertebrados existiu depois das interações
patogênicas a homem. Acredita-se que inicialmente o mecanismo de colonização do
tecido era mutualista. Diversas espécies de Vibrio spp. são reconhecidas como
patogênicas aos humanos, como por exemplo, V. cholerae, V. parahaemolyticus, V.
MENEZES, F. G. R. Diversidade de Vibrio spp. em estuários no Estado do Ceará... 26
vulnificus, V. fluvialis, V. furnissi, V. cincinnatiensis, V. metschnikovii e V.mimicus, sendo
alguns deles associados a doenças relacionadas com distúrbios alimentares. Na sua
grande maioria esses microrganismos são conhecidos por causarem doenças entéricas
(Shehane & Sizemore, 2002; Nishigushi & Nair, 2003).
Vibrio cholerae é um dos mais conhecidos víbrios que causam patogenicidade
aos humanos por ser o disseminador da cólera, uma doença epidêmica e pandêmica.
Este vibrião tem sido responsável por sete grandes pandemias, levando milhões de
pessoas a morte. Em algumas epidemias de cólera ocorridas nos anos de 1992 a 1993
em muitas áreas da Ásia, África, América Latina e outros países vizinhos, o agente
causador foi V. cholerae O139 de Bengal, notificado pela primeira vez em outubro de
1992 (Albert et al., 1997; Radu et al., 2002). Até a sexta pandemia, a grande maioria
dos casos de cólera era causada pelo biotipo clássico, somente a partir da sétima
pandemia o biotipo predominante passou a ser o El Tor. Essa substituição talvez esteja
relacionada com a maior capacidade de sobrevivência do último biotipo no intestino
humano e em ambientes aquáticos (Campos, 2004).
Vibrio parahaemolyticus é encontrado na água do mar e em ambientes marinhos,
em todos os continentes. Tem sido reconhecido como responsável por importantes
toxiinfecções alimentares, particularmente no Japão. A infecção é veiculada, na maioria
das vezes, ao consumo de peixes crus ou com cocção insuficiente (Campos, 2004;
Robert-Pillot et al., 2002). Os sintomas mais freqüentes da doença são: diarréia aquosa,
cólicas abdominais, náuseas, vômitos, dores de cabeça e febre. Em junho de 1975,
ocorreu na cidade de Cascavel (CE) um surto de gastrenterite atingindo adultos e
crianças. A análise microbiológica das fezes de uma criança, acometida com a doença,
revelou a presença de V. parahaemolyticus (Hofer, 1983).
Vibrio vulnificus encontra-se distribuído na superfície ou em organismos internos
de várias espécies marinhas e estuarinas de vertebrados e invertebrados, sendo estas
espécies, na maioria dos casos, comercialmente importantes no mundo. Este
microrganismo é um patógeno oportunista capaz de causar septicemia, infecções em
ferimentos de pacientes com debilitações, principalmente doenças crônicas e em
indivíduos que estejam com o sistema imunológico comprometido. Mais de 95% dos
casos por ingestão de frutos do mar contaminados ocasionaram a morte dos indivíduos.
MENEZES, F. G. R. Diversidade de Vibrio spp. em estuários no Estado do Ceará... 27
A ingestão pode ocorrer através de alimentos ou contato direto com a água
contaminada (Shehane & Sizemore, 2002; Parvathi, et al., 2004).
Vibrio alginolyticus é conhecido como uma das espécies halofílicas mais
comumente isoladas de peixes, caranguejos, ostras e camarões (Barros, 2004).
Segundo Tison, (1999) tal víbrio é freqüentemente associado a infecções em feridas
quando expostas ao ambiente marinho.
Vibrio mimicus foi o agente causador de 21 casos de diarréia nos Estados
Unidos em um período de cinco anos, sendo ostras suspeitas de serem o veículo de
transmissão. No Japão, 59 casos de diarréias ocorreram entre 1984 a 1986 e as
pessoas afetadas por esse surto tiveram organismos marinhos como veículo de
transmissão (Landgraf et al., 1996).
2.5.2- Espécies de víbrios patógenos ao camarão
Dentre os patógenos de camarão do gênero Vibrio spp. que são freqüentemente
isolados, podem-se destacar V. alginolyticus, V. costicola, V. harveyi e V.
parahaemolyticus. Destes, V. harveyi, uma bactéria luminescente, é a que apresenta
maior incidência em fazendas na Índia (Panchayuthapani, 1997).
Segundo Liu et al. (2004) e Yeh et al. (2004) as espécies de V. damsela, V.
alginolyticus e V. harveyi também encontram-se associadas a surtos de víbrios
ocorridos em camarões Penaeus monodon e Marsupenaeus japonicus em Taiwan.
As espécies de V. harveyi e V. campbellii têm sido geneticamente relatadas
como espécies que apresentam uma alta similaridade no DNA (69%) e rRNA (97%)
(Gomez-Gil et al., 2003).
V. harveyi foi, predominantemente, isolado de pós-larvas de camarões L.
vannamei, doentes, mas não foi recuperado de indivíduos nos estágios náuplios e zoea
(Vandenberghe et al., 1999), enquanto que V. alginolyticus é a espécie dominante do
gênero Vibrio nas fases larvais do camarão, quer doente ou sadio.
Vieira et al. (2000) realizando análises microbiológicas para identificar o agente
causador de uma mortalidade de larvas e pós-larvas de camarão L. vannamei de uma
larvicultura do nordeste brasileiro isolaram 50% de V. alginolyticus e 50% de V. fluvialis
MENEZES, F. G. R. Diversidade de Vibrio spp. em estuários no Estado do Ceará... 28
nas amostras de pós-larvas enquanto que, nas fases Zoea e nos náuplios de artêmia,
alimento das larvas, foram isoladas 100% de V. alginolyticus.
Embora V. alginolyticus seja responsável por grandes perdas econômicas na
carcinicultura, vale ressaltar que essa espécie juntamente com V. damsela e V. fluvialis
são indígenos do ambiente e do próprio camarão (Robert-Pillot et al., 2002; Hosseini et
al., 2004).
Os víbrios que atacam as larvas do camarão são V. harveyi e V. campbelli,
enquanto que V. penaeicida e V. parahaemolyticus atacam camarões juvenis e adultos
(Gomez-Gil et al., 2004).
MENEZES, F. G. R. Diversidade de Vibrio spp. em estuários no Estado do Ceará... 29
3 – MATERIAL E MÉTODOS
3.1 – Local de Coleta
As coletas foram realizadas nos estuários dos Rios Pacoti (controle) (Figura 2),
Choró (Figura 3), Pirangi e Jaguaribe (Figura 4), no litoral do Estado do Ceará,
perfazendo um total de dez amostras de água e dez de sedimento. Esses quatro
estuários foram, previamente escolhidos baseados na presença ou não (caso do
Pacoti) da atividade de carcinicultura. Os pontos com suas respectivas coordenadas
foram registrados por um GPS da marca Gardim III Plus, e são os seguintes: Pacoti 1 -
03°49’09.5’’ S e 038°24’21.1’’ W, Pacoti 2 - 03°48’52.4’’ S e 038°24’38.1’’ W, Choró 1-
04°6’07.1’’ S e 038°9’02.7’’ W, Choró 2 - 04°6’17.3’’ S e 038°9’17.8’’ W, Pirangi -
04°24’04.9’’ S e 037°51’01.0’’ W, Jaguaribe – Barra do Rio - 04°25’29.5’’ S e
037°46’21.3’’ W. Em cada um desses pontos foram coletadas amostras de água e
sedimento.
Durante a primeira expedição foram coletadas amostras de sedimento e água de
todos os pontos nos quatro estuários. Na segunda coleta a amostragem se restringiu
aos estuários dos Rios Choró e Pacoti, não tendo sido feitas coletas no Rios Pirangi e
Jaguaribe.
Também foram feitas coletas dentro de uma fazenda de carcinicultura localizada
no Rio Jaguaribe, três amostras de água e duas de sedimento. Os pontos amostrados e
as respectivas localizações foram: Canal de Captação - 04°35’34.5’’ S e 037°47’21.4’’
W, Canal de descarga - 04°35’30.5’’ S e 037°47’03.8’’ W, Viveiro - 04°35’38.1’’ S e
037°47’03.3’’ W. O Rio Pacoti funcionou como controle por não apresentar atividade de
carcinicultura.
MENEZES, F. G. R. Diversidade de Vibrio spp. em estuários no Estado do Ceará... 30
Figura 2 - Vista panorâmica do Rio Pacoti
(Eusébio- CE)
Figura 3 - Ponto de coleta (1) do Rio
Pacoti- CE.
Figura 4 – Ponto de coleta (2) do
Rio Pacoti- CE.
MENEZES, F. G. R. Diversidade de Vibrio spp. em estuários no Estado do Ceará... 31
Figura 5 - Vista panorâmica do Rio Choró
(Cascavel-CE)
Figura 6 - Ponto de coleta (1) do Rio
Choró (Cascavel – CE)
Figura 7 – Ponto de coleta (2) do
Rio Choró (Cascavel-CE)
MENEZES, F. G. R. Diversidade de Vibrio spp. em estuários no Estado do Ceará... 32
Figura 8 – Vista panorâmica do Rio Pirangi (CE)
Figura 9 - Ponto de coleta do Rio
Pirangi (Guajiru – CE)
MENEZES, F. G. R. Diversidade de Vibrio spp. em estuários no Estado do Ceará... 33
Figura 10 – Vista panorâmica do Rio Jaguaribe (CE)
Figura 11 – Ponto de coleta do Rio
Jaguaribe (Aracati- CE)
MENEZES, F. G. R. Diversidade de Vibrio spp. em estuários no Estado do Ceará... 34
3.2 – Coleta das Amostras
As amostras, provenientes de uma profundidade de 50 cm, foram coletadas em
garrafas de cor âmbar de 1 litro de capacidade e previamente esterilizadas. O
sedimento foi coletado em Becker de 250 mL, também esterilizado. As amostras foram
transportadas em caixas isotérmicas, contendo gelo, até o laboratório de Microbiologia
do Pescado e Ambiental do Instituto de Ciências do Mar (LABOMAR) onde foram
processadas imediatamente após a chegada.
3.3 – Preparo das Amostras
3.3.1 – Amostras de água
Para a realização das análises, inicialmente, foi inoculado 1 mL da amostra de
água em 9 mL de água peptonada alcalina (APA), pH 7,8, e depois foram feitas
sucessivas diluições decimais de 10
-1
até 10
-5
utilizando-se o mesmo diluente (Figura
12).
3.3.2 – Amostras de sedimento
Para as amostras do sedimento foram pesados 25 gramas e homogeneizadas em
225 mL do diluente APA por 30 minutos. A partir da diluição inicial 10
-1
, foi preparada
uma série de diluições decimais (10
-2
até 10
-5
) utilizando-se o mesmo diluente (Figura
13)
3.4 – Número Mais Provável (NMP) de Coliformes Totais e Fecais
Para determinação do Número Mais Provável de Coliformes Totais (CT) e
Coliformes Fecais (CF) ou termotolerantes, foi empregada a técnica de fermentação em
tubos múltiplos, segundo Feng et al. (2002). Esse teste foi dividido em duas etapas:
teste presuntivo e confirmatório .
MENEZES, F. G. R. Diversidade de Vibrio spp. em estuários no Estado do Ceará... 35
3.4.1 – Teste Presuntivo
Foram transferidas porções de 1 mL de cada diluição (10
-1
a 10
-5
) previamente
preparadas, em três tubos contendo Caldo Lauril Sulfato (CLS)- Difco, com tubos de
Durham invertidos. Em seguida, os tubos foram incubados a 35ºC/48 horas. Após esse
período, os tubos que apresentaram turvação e produção de gás, foram considerados
positivos e submetidos aos demais testes.
3.4.2- Tetes Confirmatório
Dos tubos que apresentaram resultados positivos no teste presuntivo foram
retiradas alíquotas, com o auxílio de uma laça de níquel-cromo, e transferidas para
tubos contendo Caldo EC-Difco, com tubos de durham invertidos. Esses tubos foram
incubados a 45ºC em banho-maria por 24 horas. A positividade do teste foi verificada
pela turvação do meio e produção de gás.
O cálculo do NMP foi feito através da consulta à tabela do NMP de acordo com
Garthright, (2001).
3.5– Contagem e Isolamento de Vibrio spp.
3.5.1 – Semeadura Inicial das Amostras
Para a estimativa do Número Mais Provável (NMP) de Vibrio e isolamento de
colônias sacarose negativas também foi utilizado a técnica dos tubos múltiplos segundo
Elliot et al. (2001).
Das diluições 10
-1
a 10
-5
, previamente preparadas, foram inoculadas porções de
1ml da amostra em tubos contendo APA a 1% de cloreto de sódio, em triplicata para as
amostras de sedimento e quintuplicata para as amostras de água, que foram em
seguidos incubadas a 37ºC/16-18 horas.
MENEZES, F. G. R. Diversidade de Vibrio spp. em estuários no Estado do Ceará... 36
Após o período de incubação foi verificada a positividade dos tubos (turvação)
para a confirmação da presença de Vibrio. Dos tubos positivos foram retiradas alíquotas
e semeadas por estriamento na superfície de placas com o meio Agar Tiossulfato-
citrato-bile-sacarose (TCBS). Foram tomados 0,2 mL, de cada diluição das amostras de
água e sedimento, os quais foram, em seguida, espalhados por toda a superfície do
meio com o auxílio de um bastão de vidro em “L” (alça de Drigalski) esterilizado, em
duplicata. As placas foram então incubadas invertidas em estufa, onde permaneceram
por 18 horas a 37ºC (Elliot et al., 2001).
O cálculo do NMP foi feito através da consulta à tabela do NMP (Garthright, 2001).
3.5.2 – Contagem e Isolamento de Colônias Suspeitas
A contagem das colônias foi realizada em um contador de colônias (marca
PHOENIX mod. EC 550AS) nas placas contendo entre 25-250 colônias. Nas placas de
TCBS com crescimento, as colônias com características fenotípicas de sacarose
positiva (amarelas) e sacarose negativa (verde) foram contadas separadamente.
Para o cálculo do número presuntivo de Unidades Formadoras de Colônias (UFC)
/g ou mL de Vibrios spp., o número de colônias contado foi multiplicado pelo fator de
diluição da respectiva placa de contagem (Downes & Ito, 2001).
MENEZES, F. G. R. Diversidade de Vibrio spp. em estuários no Estado do Ceará... 37
Figura 12 - Esquema para quantificação e identificação de víbrios isolados das amostras de
água coletadas dos estuários e fazenda de carcinicultura.
Provas Bioquímicas
TSA
TCBS - Estufa 37°C/
18- 24h
TSA 1% de NaCl -
37°C/24h
Purificação
Identificação
10
-
1
10
-
2
10
-
4
10
-
3
10
-
5
10
-
1
10
-
2
10
-
3
10
-
4
10
-
5
Estufa 37°C/ 16-18h
Tubos Positivos
Prova
Presuntiva
APA
Diluições
APA
1mL 1mL 1mL 1mL 1mL
1mL
MENEZES, F. G. R. Diversidade de Vibrio spp. em estuários no Estado do Ceará... 38
Figura 13 - Esquema para identificação de víbrios isolados das amostras de sedimento
coletadas dos estuários e fazenda de carcinicultura.
Provas Bioquímicas
TSA
TCBS - Estufa 37°C/
18- 24h
TSA 1% de NaCl -
37°C/24h
Purificação
Identificação
Estufa 37°C/ 16-18h
Tubos Positivos
APA
10
-
1
10
-
2
10
-
4
10
-
3
10
-
5
10
-
1
10
-
2
10
-
3
10
-
4
10
-
5
Prova
Presuntiva
Diluições
APA
1mL
1mL 1mL 1mL
1mL
25g
225mL
APA
MENEZES, F. G. R. Diversidade de Vibrio spp. em estuários no Estado do Ceará... 39
3.6 – Identificação das Cepas Suspeitas de Vibrio spp.
As provas bioquímicas de identificação, citadas a seguir, foram selecionadas de
acordo com Koneman (1993) e Tison (1999).
3.6.1 – Identificação Presuntiva
Cada uma das colônias suspeitas (tanto as sacaroses positivas quanto as
negativas) foi semeada em tubos de ágar triptona soja adicionado de 1% de NaCl -
(TSA) Difco inclinado, e incubados em estufa por 18-24 horas a 35
o
C. Decorrido esse
período as culturas crescidas em ágar TSA foram utilizadas para a prova de Gram,
teste de citocromo-oxidase, motilidade e teste de triagem em TSI.
Teste de Gram:
Este teste foi utilizado para verificar as características morfológicas das cepas
isoladas, em esfregaços corados pelo método de Gram, preparados a partir das
culturas de TSA contendo 1% de NaCl. As cepas que se revelassem no esfregaço
corado, como bacilos Gram-negativos, polimorfos, encurvados ou não, com o teste
positivo para produção de citocromo-oxidase, eram consideradas da família
Vibrionaceae.
Prova da produção de citocromo-oxidase:
A partir da cultura em ágar TSA, uma pequena porção do crescimento foi
transferido, por meio de uma alça de platina, para um papel de filtro “Inlab” tipo 10, com
11,0 cm embebido com o reagente aquoso para oxidase (cloridrato de tetrametil-p-
fenilenodiamina a 1%). Logo a seguir, foram realizadas as leituras. O teste era
considerado positivo quando ocorria o escurecimento do esfregaço. A família
Vibrionaceae apresenta como característica, o teste da produção de citocromo -
oxidase positivo.
MENEZES, F. G. R. Diversidade de Vibrio spp. em estuários no Estado do Ceará... 40
Motilidade:
Para o teste de motilidade inoculou-se com o auxilio de uma agulha de níquel -
cromo longa, tubos contendo o meio semi-sólido SIM (DIFCO) e em seguida incubados
por 24 horas a 35
o
C. O teste positivo é apresentado pelo crescimento ao longo da linha
de inoculação com turvação do meio.
Teste de triagem em TSI:
Esta prova foi utilizada para verificar a capacidade das cepas isoladas de
produzirem ácido sem gás a partir da glicose, e fermentar a sacarose e lactose, sem
produção de H
2
S.
3.6.2 – Identificação Definitiva
A partir de cada cepa suspeita inoculada em tubo com ágar TSA adicionado de
1% de NaCl e incubados a 35
o
C por 24 horas, foram realizados os seguintes testes de
identificação:
Prova para Hidrólise da Arginina e Descarboxilação da Lisina e Ornitina:
Com o auxílio de uma alça de níquel-cromo, foi feita a inoculação de cada cepa
em três tubos contendo o meio basal com 1% de NaCl, sendo adicionado,
separadamente, arginina, lisina e ornitina. Paralelamente, cada cepa foi inoculada em
um tubo contendo o mesmo meio basal, porém sem qualquer aminoácido (controle).
Após a inoculação em cada tubo foi adicionado 1 cm de óleo mineral esterilizado
procedendo-se a seguir a incubação dos tubos a 35
o
C por até 4 dias. O meio inoculado
torna-se amarelo como resultado da produção de ácido oriundo da glicose existente no
meio basal. Quando a reação positiva ocorre, o meio torna-se alcalino, de cor púrpura
e, o tubo controle permanece ácido, de cor amarela.
MENEZES, F. G. R. Diversidade de Vibrio spp. em estuários no Estado do Ceará... 41
Prova de Halofilismo:
Nestas provas, a cultura foi inoculada com o auxílio de uma alça de níquel-cromo,
cinco tubos de Caldo Triptona contendo 0%, 3%, 6%, 8% e 10% de cloreto de sódio,
respectivamente. Os tubos foram incubados a 35
o
C por 18-24 horas. A positividade do
teste é dada pela turvação do meio.
Teste de Voges-Proskauer (VP):
Nesta prova tubos contendo o Caldo MR-VP, foram inoculados com a cultura do
TSA de 24 horas e em seguida foram incubados por 48 horas a 35
o
C. Após a incubação
em cada tubo com crescimento, foram adicionados 0,6 mL de solução alcoólica de alfa-
naftol a 5% (Barrit I) e 0,2 mL de solução aquosa de hidróxido de potássio a 40% (Barrit
II). Em seguida os tubos foram agitados e as leituras realizadas até 30 minutos após a
adição dos reagentes. Essa prova é positiva quando há formação de uma coloração
vermelha.
Teste da hidrólise do Orto-nitrofenio-β – D-Galacto-Piranosídeo (ONPG):
Para a realização desse teste, foram retiradas com o auxílio de uma alça de
níquel-cromo, alíquotas a partir do crescimento em TSI + 1% de NaCl, e transferidas
para tubos contendo 0,25ml de uma solução salina 3% esterilizada. Em cada tubo foi
adicionada uma gota de tolueno, seguindo-se a agitação dos tubos para a liberação da
enzima β-galactosidase. Em seguida os tubos foram colocados em estufa a 37ºC/5
minutos. Após esse tempo, foram adicionados 0,25ml da solução ONPG seguindo-se a
incubação dos tubos a 37ºC/24 horas. A positividade do teste é evidenciada pela
mudança da cor do meio de incolor para amarelo, devido a hidrólise do ONPG por
bactérias produtoras da enzima β galactosidase.
MENEZES, F. G. R. Diversidade de Vibrio spp. em estuários no Estado do Ceará... 42
Prova de Fermentação de Carboidratos:
Para esta prova, as culturas foram inoculadas em quatro tubos contendo Caldo
Púrpura de Bromocresol pH 7,0 ± 0,2, acrescidos de manitol, manose, arabinose,
glicose, lactose e sacarose separadamente. Após a inoculação os meios foram
cobertos por uma camada de 1 cm de óleo mineral esterilizado e incubados a 35
o
C por
4 a 5 dias. A utilização do carboidrato com a conseqüente acidificação do meio é
visualizada pela viragem do meio para amarelo.
Teste de produção do Indol
As cepas crescidas no meio TSA foram semeadas, por picada profunda,
utilizando-se uma agulha de níquel-cromo, no meio Sulfeto-Indol-Motilidade (SIM)-Difco,
incubadas a 35ºC/48 horas. Após o período de incubação, foram adicionados 0,2ml do
reativo de Kovacs (p-dimetilaminobenzaldeído). A produção de Indol, oriunda da
degradação do aminoácido triptofano presente no meio, é observada pela formação de
um anel vermelho sobre a superfície do meio (teste positivo).
3.7 – Determinação dos fatores extrínsecos
No momento da coleta foi medida a temperatura das amostras de água com
auxílio de um termômetro (INCOTERM) e, já em laboratório, foram medidas a
salinidade através do uso de um refratômetro da marca ATAGO S/MILL e o pH
utilizando-se um potenciômetro da marca MARCONI – PA 200P.
MENEZES, F. G. R. Diversidade de Vibrio spp. em estuários no Estado do Ceará... 43
4 – RESULTADOS E DISCUSSÃO
A estimativa do Número Mais Provável (NMP) de Vibrio spp. /100 mL das
amostras de água coletadas nos estuários dos Rios Choró, Pirangi e Jaguaribe (na
primeira coleta), onde a atividade de carcinicultura está presente, variou de 9,3 x 10
5
a
1,1 x 10
7
, 1,0 x 10
7
e 1,1 x 10
7
, respectivamente. Para as amostras de sedimento
coletadas nos mesmos pontos, o NMP/g variou de 2,3 x 10
2
a 3,5 x 10
3
; 1,1 x 10
5
e 1,1
x 10
5
. Na segunda coleta do manguezal do Rio Choró os valores para Vibrio, nas
amostras de água, variaram de 5,4 x 10
6
a 1,6 x 10
8
NMP/100mL e de 1,1 x 10
2
NMP/g
nos dois pontos onde foram coletadas amostras de sedimento (Tabela 2) .
As amostras do estuário Rio Pacoti, onde a atividade de carcinicultura não é
exercida (controle do experimento) apresentaram, na primeira coleta, valores para o
NMP de Vibrio spp. das amostras de água e sedimento de 7,5 x 10
4
a 1,1 x 10
7
/100mL
e de 1,1 x 10
3
a 1,1 x 10
7
/g, respectivamente. Na segunda, os valores para este gênero
bacteriano estiveram na faixa de 1,6 x 10
8
/100mL na água e de 7,4 x 10
1
a 1,1 x 10
3
/g
no sedimento (Tabela 2).
Na Tabela 3 estão dispostos os valores de NMP para Vibrio spp. referentes as
amostras de água e sedimento da área de captação, viveiro e canal de descarga de
escoamento de uma fazenda de cultivo de camarão marinho situada no manguezal do
Rio Jaguaribe.
MENEZES, F. G. R. Diversidade de Vibrio spp. em estuários no Estado do Ceará... 44
Tabela 2 - Estimativa do número mais provável (NMP) de Vibrio spp. nas amostras de
água e sedimento coletadas nos estuários dos Rios Pacoti, Choró, Pirangí e
Jaguaribe.
Amostras
Coleta Local
Água (NMP/ 100 mL) Sedimento (NMP/g)
Pacoti 1 1,1 x 10
7
1,1 x 10
3
Pacoti 2 7,5 x 10
4
1,1 x 10
7
Choró 1 9,3 x 10
5
3,5 x 10
3
Choró 2 1,1 x 10
7
2,3 x 10
2
Pirangi 1,0 x 10
7
1,1 x 10
5
1
a
Jaguaribe 1 1,1 x 10
7
1,1 x 10
5
Pacoti 1 1,6 x 10
8
7,4 x 10
1
Pacoti 2 1,6 x 10
8
1,1 x 10
3
Choró 1 5,4 x 10
6
1,1 x 10
2
2ª
Choró 2 1,6 x 10
8
1,1 x 10
2
Tabela 3 - Estimativa do número mais provável (NMP) de Vibrio spp. presente nas
amostras de água e sedimento coletados no canal de captação, no viveiro
e no canal de descarga de uma fazenda de carcinicultura no Rio
Jaguaribe.
Amostras
Local
Água (NMP/ mL) Sedimento (NMP/g)
Canal de Captação 1,5 x 10
5
1,1 x 10
5
Viveiro 2,4 x 10
6
-
Canal de descarga 4,6 x 10
6
1,5 x 10
5
MENEZES, F. G. R. Diversidade de Vibrio spp. em estuários no Estado do Ceará... 45
Se comparado o NMP de Vibrio das amostras de água e de sedimento do
manguezal dos rios-teste e do rio controle, é possível se constatar que os números não
são tão diferentes, chegando o rio-controle mesmo a apresentar, no segundo ponto da
primeira coleta, valores mais altos do que os apresentados pelos rios-teste. Por outro
lado, a pequena amostragem é insuficiente para se afirmar que houve, ou não,
diferenças entre os valores obtidos na quantificação do NMP de Vibrio nesses
estuários. Um ponto interessante a ser ressaltado é o fato do Rio Pacoti, o curso d água
usado como controle, não ser um rio de águas prístinas, mas sim cheio de
contaminações de esgotos domésticos, evidenciado pelas altas medidas de pH
(variação de 7, 43 a 7,94) apresentadas no decorrer da pesquisa (Tabela 4). No entanto
essa contaminação é diferente das encontradas nos rios-teste, os quais apresentam
uma alta concentração de víbrios oriunda de fazendas de cultivo de camarão em suas
águas, o que não é verdade para o rio-controle.
A legislação ambiental brasileira vigente do Conselho Nacional do Meio
Ambiente, Resolução 357, publicada no Diário Oficial no dia 18 de março de 2005
(CONAMA, 2005) não limita víbrios em águas estuarinas ou doces, razão porque, na
análise dos dados apresentados na tabela 2 e 3 não se pode afirmar se os números
encontrados no trabalho foram altos ou baixos.
Em contrapartida o CONAMA limita os valores para Coliformes, e em análises
realizadas no mesmo período a estimativa do Número Mais Provável (NMP) de
Coliformes Totais (CT) /100 mL das amostras de água coletadas nos estuários dos Rios
Pirangi e Jaguaribe (na primeira coleta), onde a atividade de carcinicultura está
presente, variou de 6,8 x 10
2
e 1,7 x 10
3
, respectivamente. Para as amostras de
sedimento coletadas nos mesmos pontos, o NMP/g variou de 2,1 x 10
2
a 7,8 x 10
2
. Para
os valores de Coliformes Fecais (CF) /100 mL das amostras de água coletadas nos
estuários dos Rios Pirangi e Jaguaribe, variou de 2,0 x 10
2
e < 180, respectivamente.
Para as amostras de sedimento coletadas nos mesmos pontos, o NMP/g variou de 2,1 x
10
2
a 2,0 x 10
2
.
As amostras do manguezal Rio Pacoti, onde a atividade de carcinicultura não é
exercida (controle do experimento) apresentaram, na primeira coleta, valores para o
NMP de CT das amostras de água no ponto 1 de 2,0 x 10
2
e no ponto 2 de 2,4 x
MENEZES, F. G. R. Diversidade de Vibrio spp. em estuários no Estado do Ceará... 46
10
6
/100mL. Os valores para o NMP de CF das amostras de água no ponto 1 foi de <
180 e no ponto 2 de 1,4 x 10
6
/100mL. Não há dados para o NMP de CT e CF para o
sedimento em nenhum dos pontos.
Somente o ponto 2 localizado no Rio Pacoti apresentou valores acima de 2500 por
100 mililitros, o máximo permitido para coliformes na Resolução 357 do Conselho
Nacional do Meio Ambiente (CONAMA, 2005).
Fukushima & Seki (2004) obtiveram, em temperaturas de 10°C, valores entre 10
2
a 10
3
nas contagens de víbrios em amostras de água do Rio Sada, no Japão. Em razão
dessas contagens terem sido feitas em temperaturas desfavoráveis aos vibrios, uma
vez que a incidência e densidade dessa bactéria decresce significantemente a
temperaturas abaixo de 20
o
C (Tison, 1999), os autores esperavam baixa densidade do
gênero nessas águas.
Ao contrário, no presente trabalho, as coletas foram realizadas em temperaturas
que variavam de 25 a 32°C (Tabela 4) características de ambientes tropicais, o que
favoreceu a elevadas contagens de víbrios se comparadas as do trabalho acima
referido. Esse resultado é portanto, lógico, uma vez que a maioria das espécies do
gênero Vibrio é mesófila apresentando um ótimo de temperatura em torno de 30°C
(Baumann et al. 1984).
MENEZES, F. G. R. Diversidade de Vibrio spp. em estuários no Estado do Ceará... 47
Tabela 4 – Variáveis ambientais medidas nas amostras de água dos estuários dos Rios
Pacoti (controle), Choró, Pirangi e Jaguaribe (CE) e pontos de uma
fazenda de camarão ( Jaguaribe-CE ).
Temperatura (˚C) Salinidade(‰) pH
Coletas
Local
1 2 1 2 1 2
Pacoti 1 30,0 32,0 35,0 20,0 7.77 7.94
Pacoti 2 30,0 32,0 34,0 12,0 7.77 7.43
Choró 1 28,0 32,0 37,0 16,0 7.99 7.67
Choró 2 29,0 32,0 37,0 10,0 8.03 7.23
Pirangi 25,0 * 0,0 * 7.13 *
Jaguaribe 1 26,0 * 0,0 * 7.56 *
Canal de Captação 25,0 * 0,0 * 7.08 *
Viveiro 25,0 * 7,0 * 7.40 *
Canal de descarga 25,0 * 1,0 * 7.25 *
* Não houve coleta
Cavallo & Stabili (2004), em uma pesquisa sobre a biodiversidade de víbrios em
águas da costa italiana, ressaltam a correlação existente entre a temperatura da água e
a presença de víbrios. Nesse estudo os autores encontraram uma correlação positiva
entre a presença de V. vulnificus, V. mimicus, V. cholerae não O1, V. logei, V. hollisae,
V. diazotrophicus e V. aestuarianus e a temperatura medida nas águas.
Segundo Verschuere et al. (2000) e Barbieri et al. (1999), fatores físico-químicos
influenciam no desenvolvimento microbiano dos sistemas de aqüicultura, tais como:
salinidade, temperatura e concentração de oxigênio. Esta combinação de fatores
seleciona e define bem os microrganismos que vão proliferar num determinado
ambiente.
As amostras do presente estudo foram realizadas nos meses iniciantes da
estação chuvosa, o que explica a enorme flutuação nos valores de salinidade, com
variação de 0 a 37‰ (Tabela 4), capaz de causar interferência no isolamento dos
organismos. Segundo Hervio-Heath et al. (2002), quando análises são realizadas no
MENEZES, F. G. R. Diversidade de Vibrio spp. em estuários no Estado do Ceará... 48
período dos meses de verão existe uma maior diversidade de Vibrio spp., justificada
pela temperatura elevada que traz melhores condições de sobrevivência para estes
organismos.
A contagem de víbrios sacarose negativa e sacarose positiva da água na
primeira coleta apresentou valores altos, no rio Pacoti , sendo o valor no ponto 1 de
370.000 UFC/100mL , mais baixo que no ponto 2 do rio Choró, 980.000 UFC/mL. Nas
demais coletas tanto para as amostras de água, quanto para sedimento, os valores
foram acima de 10
5
UFC por 100mL ou /g, para os pontos do ambiente e da fazenda.
Normalmente, os carcinicultores, fazem uma correlação da quantidade de víbrios
sacarose negativa e positiva para controlar seus níveis nos viveiros e com isso tentar
evitar o aparecimento de infecções. No entanto não existe base científica que possa
comprovar esta relação, podendo tanto víbrios sacarose positivos como negativos
serem causas de infecção em animais aquáticos (Owens & Edgerton, 1997; Vieira et al.,
2000).
Moriarty (1997) cita que na aqüicultura a transmissão de patógenos entre
indivíduos pode ocorrer facilmente em razão dos animais encontrarem-se confinados
em um pequeno espaço. E ainda, que o conhecimento de uma relação precisa entre as
bactérias da coluna d’água e seu crescimento nos organismos cultivados é essencial na
geração de informações para a tomada de decisão do manejo que se vai empregar.
Em trabalho realizado por Martins (2003) foi constatado que o número de Vibrio
no ambiente natural onde existe uma fazenda com sistema superintensivo, situado no
Rio Pirangi, apresentou uma maior quantidade de Vibrio spp. do que no estuário da
Barra Grande, localizado no município de Icapuí, com sistema semi-intensivo o que
comprova que superpopulações favorecem um maior desenvolvimento do número da
bactéria , não da diversidade.
O alto índice de UFC/g determinado no sedimento mostra que essas bactérias
são boas indicadoras do enriquecimento orgânico que segundo La Rosa et al. (2001)
favorece a concentração de bactérias heterotróficas, em particular dos víbrios.
A diversidade dos víbrios isolados da água e do sedimento no ambiente pode ser
observada na Figura 14, podendo-se constatar que as águas do Rio Choró coletadas
MENEZES, F. G. R. Diversidade de Vibrio spp. em estuários no Estado do Ceará... 49
no ponto 1, local onde ocorre uma maior influência da água oceânica (Figura 6) foram
as que apresentaram maiores incidências de diferentes espécies de Vibrio spp.
Figura 14
– Riqueza de víbrios isolados de água e sedimento dos
quatro estuários estudados, localizados nos Rios
Pacoti, Choró, Pirangi e Jaguaribe.
O Rio Pacoti, o único que não sofre influência da carcinicultura, foi o segundo
local em diversidade de espécies de víbrios, algumas podendo ser patógenas ao
homem (Tabela 5). Este fato justifica-se pelo significante recebimento de descargas
urbanas no rio através de esgotos domésticos, industriais e pelas atividades
recreacionais desenvolvidas em suas águas, o que poderia favorecer o isolamento
dessas bactérias. Da mesma forma, Cavallo & Stabili (2004) citam que em razão do
centro industrial da cidade de Taranto, na costa da Itália, local de altas temperaturas,
receber tanto descarga industrial quanto urbana, o que favorece a proliferação de
nutrientes, tem como conseqüência um estímulo no crescimento de víbrios.
Segundo Hosseini et al. (2004), a contaminação dos ambientes estuarinos que
apresentam áreas recreacionais pode contribuir para o aparecimento de cepas
0
5
10
15
20
25
30
Pacoti 1 Pacoti 2 Choró 1 Choró 2 Pirangí Jaguaribe
Locais de coleta
Número de espécies de Vibrio
identificadas
água
sedimento
MENEZES, F. G. R. Diversidade de Vibrio spp. em estuários no Estado do Ceará... 50
patógenas de Vibrio, que uma vez ingeridas pelos freqüentadores, através do consumo
de organismos marinhos infectados, resultam em surtos esporádicos e epidêmicos de
diarréias.
Por esta razão, o monitoramento bacteriológico das águas de cultivo é de grande
importância, especialmente na aqüicultura, uma vez que o objetivo dos cultivadores de
animais aquáticos é possuírem áreas adequadas com produção de boa qualidade (La
Rosa et al., 2001).
Este monitoramento também é importante para controlar a presença de bactérias
luminescentes nos viveiros, tais como V. harveyi, importante patógeno de P. monodon,
que ataca principalmente camarões juvenis e causa danos econômicos (Lavilla-Pitogo
et al., 1998; Moriarty, 1998), além de outras bactérias patogênicas a diferentes espécies
do crustáceo como relatam Sudheesh & Xu (2001). Os autores inocularam uma cepa
virulenta de V. parahaemolyticus isolada de Penaues orientalis, em P.enaues monodon.
Os camarões P. orientalis eram cultivados em uma fazenda na República da China
onde havia ocorrido recentemente, um surto de uma enfermidade conhecida como
“doença da perna vermelha”. A cepa de V. parahaemolyticus mostrou-se ser altamente
virulenta causando 100% de morte dos animais em até sete dias do experimento e
reproduzindo nos camarões P. monodon a “doença da perna vermelha”, provando
assim que era a responsável pelos sintomas da doença.
Das amostras, de água e sedimento, foram isoladas 167 cepas de Vibrio.
Dessas, 138 foram isoladas do ambiente (Tabela 5) e 25 de uma fazenda de cultivo de
camarão (Tabela 6).
Examinando-se a tabela 5 é possível se visualizar os dados relativos à
identificação das linhagens isoladas das amostras ambientais (água dos rios), podendo-
se observar que o maior índice das bactérias recaiu sobre Vibrio spp. (26 cepas) (não
tendo sido possível a identificação dessas cepas até espécie), seguidos de V. logei
(24), V. parahaemolyticus (14), V. fluvialis (11), V. cholerae (9), V. aestuarinus (8), V.
damsela (6), sendo que das espécies V.vulnificus e V. alginolyticus foram identificadas
apenas uma cepa de cada.
MENEZES, F. G. R. Diversidade de Vibrio spp. em estuários no Estado do Ceará... 51
Tabela 5 – Linhagens de Víbrios isolados dos quatro estuários estudados nos Rios Pacoti
(controle), Choró, Pirangi e Jaguaribe.
Pacoti 1 Pacoti 2 Choró 1 Choro 2 Pirangi Jaguaribe
Vibrio
Água Sed Água Sed Água Sed Água Sed Água Sed Água Sed
Vibrio spp. 3 2 8 3 2 4 1 3
V. logei 3 2 7 1 2 1 4 3 1
V. parahaemolyticus 1 8 2 3
V. fluvialis 4 1 1 1 2 1 1
V. cholerae 2 3 2 1 2
V. aestuarinus 3 2 1 2
V. damsela 1 1 3 1
V. campbelli 1 1 1 1 1
V. costicola 2 1 1 1
V. ordalii 4 1
V. gazogenes 1 3 1
V. metschinikovii 1 1 1 1
V. anguillarum 3 1
V. mimicus 1 2
V. splendidus 1 1
V. harveyi 1 1
V. alginolyticus 1
V. vulnificus 1
V. diazotrophicus 1
V. fisheri 1
Sed. (sedimento)
Nas amostras de água do canal de descarga da Fazenda de camarões foram
identificadas as espécies: V. logei (3 cepas), V. cholerae (1), V. damsela (1), V.
campbelli (1) e V. fluvialis (1). E do sedimento coletado, nesse mesmo ponto da
fazenda, foram isoladas e identificadas somente uma cepa de V. harveyi e uma de
Vibrio spp (Tabela 6).
MENEZES, F. G. R. Diversidade de Vibrio spp. em estuários no Estado do Ceará... 52
Nas amostras de água do canal de captação só foram identificadas três cepas de
V. cholerae e uma de Vibrio spp e nas amostras de sedimento desse ponto foram
confirmadas uma cepa de V. logei, uma de V. costicola e uma de Vibrio spp. (Tabela 6).
Nas amostras de água do viveiro da fazenda foram confirmadas oito cepas
sendo: V. campbelli (1 cepa), V. parahaemolyticus (1), V. fluvialis (1), V. vulnificus (1),
V. costicola (1), V. splendidus (1), V. cincinnatiensis (1) e Vibrio spp. (2) ( Tabela 6).
Tabela 6 – Linhagens de Víbrios isolados de amostras de água e
sedimento de três diferentes pontos (canal de
captação,canal de descarga e viveiro) de uma fazenda
de camarão localizada em Aracati- CE.
Descarga Captação Viveiro
Víbrios Água Sed Água Sed Água
Vibrio spp. 1 1 1 2
V. cholerae 1 3
V. logei 3 1
V. campbelli 1 1
V. fluvialis 1 1
V. costicola 1 1
V. damsela 1
V. harveyi 1
V. parahaemolyticus 1
V. vulnificus 1
V. splendidus 1
V. cincinnatiensis 1
A Figura 15 demonstra a alta diversidade de Vibrio nas águas do viveiro
enquanto que na captação e na descarga esses números são menores. Mesmo assim,
a diversidade de víbrios é sempre maior nas águas dos rios (Figura 14) que nas águas
dos viveiros. Mas isto era de se esperar, uma vez que em ambientes confinados, caso
dos viveiros, há uma maior seleção dos organismos sobreviventes. Segundo Solbrig
MENEZES, F. G. R. Diversidade de Vibrio spp. em estuários no Estado do Ceará... 53
(1991), muitos impactos humanos alteram os recursos disponíveis e desintegram
comunidades, influindo, diretamente , na função dos ecossistemas. Devido a estes
fatos, a regulação da biodiversidade por processos naturais possibilita uma maior
compreensão dos efeitos de muitos destes impactos, levando a uma compreensão de
como os ambiente têm sido modificados. Dentro deste contexto, a identificação dos
ecossistemas mais sensíveis a atividades humanas e a mudanças climáticas,
constituem-se importantes componentes de pesquisas em biodiversidade, contribuindo
para a sustentabilidade dos sistemas.
Figura 15 -Riqueza de espécies em amostras de água e
sedimento de três diferentes pontos (canal de
captação, viveiro e canal de descarga) de uma
fazenda de camarão localizada em Aracati-
CE.
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Captação Viveiro Descarga
Pontos das coletas na fazenda de carcinicultura
água
sedimento
MENEZES, F. G. R. Diversidade de Vibrio spp. em estuários no Estado do Ceará... 54
Os números de cepas de Vibrio spp. isoladas no presente estudo, tanto no
ambiente como na fazenda foram elevados, levando-nos a aceitar o que Cavallo &
Stabili (2004) afirmam neste sentido, de que a dificuldade em se identificar amostras
ambientais de Vibrio se deve ao fato da existência de uma alta diversidade de espécies
no gênero, corroborando com Gomez-Gil et al. (2004) que apontam como causa de erro
na identificação dos víbrios isolados de ambientes de aqüicultura o extenuante trabalho
na aplicação de inúmeros testes bioquímicos e fisiológicos.
V. logei, a espécie de Vibrio mais isolada nos dois ambientes, segundo Li et al.
(1999) está associada a interações com peixes. Esses autores realizaram uma
pesquisa com Sparus sarba, coletados em fazendas de peixes, em Hong Kong, e
detectaram a presença de V. logei em 7,8% das amostras sendo que, a prevalência das
espécies identificadas foi de V. alginolyticus (24), V. vulnificus (12) e V.
parahaemolyticus (7).
Por outro lado, Colquhoun & SØrum (2002) realizando um trabalho para analisar
a similaridade gênica entre o V. logei e o V. salmonicida, relataram que essas duas
espécies de Vibrio são psicrófilas, discordando desta pesquisa onde V. logei foi isolado
de ambientes com temperaturas que variavam entre 25 e 32°C. Provavelmente, houve
uma adaptação da espécie ao clima.
Outrossim, Nishiguchi (2000) no período de maio a setembro estudando três
espécies de cefalópoda encontrado no mar Mediterâneo, do gênero Sepiola, observou
uma simbiose dos animais com V. logei e com V. fisheri. A pesquisa foi levada a cabo
em temperaturas de 18°C, e as duas espécies de Vibrio, em consorciação com as lulas,
representaram um total de 95 a 99% de todos os organismos luminescentes
identificados.
A presença do V. parahaemolyticus ocorreu em maior escala nas águas do rio
Choró, perto do mar (Figura1), corroborando com as afirmações de Cavallo & Satabili
(2004) de que esta espécie é indígena de águas de estuário.
Nos últimos anos novas cepas de V. parahaemolyticus têm causado
gastroenterites epidêmicas nos países da Ásia, sendo conhecidas nos EUA como
patógenos emergentes (Makino et al., 2003). Dados da inspeção européia informam
que frutos do mar das regiões tropicais e subtropicais são reconhecidamente de risco
MENEZES, F. G. R. Diversidade de Vibrio spp. em estuários no Estado do Ceará... 55
pela ocorrência desse Vibrio, por isso o cuidado na sua detecção nos estuários
(Feldhusen, 2000; Barros, 2004).
Em trabalho realizado por La Rosa et al. (2001) no período de março de 1997 a
fevereiro de 1998, no Golfo de Gaeta, nordeste do Oceano Mediterrâneo, observaram
que a freqüência do V. parahaemolyticus na superfície dos sedimentos funciona como
indicador de enriquecimento orgânico, entretanto, os autores ressaltam que o Vibrio só
fica agregado ao sedimento quando as condições da coluna d’água não estão
favoráveis, exemplo: baixa temperatura ou sobre substrato em suspensão, discordando
desta pesquisa, uma vez que foram isoladas seis cepas em rios diferentes (Tabela 5)
em temperatura que variavam entre 28 e 32°C (Tabela 4).
O isolamento do V. fluvialis ocorreu em maior quantidade nas águas de três rios
estudados, estando de acordo com Hosseini et al. (2004) que citam que o V. fluvialis é
indígeno de ambiente marinho e do camarão.
Entretanto, Han et al. (2002) citam que na ingestão de organismos infectados por
esta bactéria o consumidor apresenta sintomas parecidos com os do V. cholerae sendo
por esta razão preocupante, visto que este Vibrio foi originalmente associado com
doenças humanas em pacientes que apresentavam diarréia inflamatória em casos
relatados em Bangladesh.
V. cholerae, não tipado, foi isolado nos dois ambientes estudados, com maior
incidência na água, corroborando com os dados apresentados por Sousa et al. (2004)
que em pesquisa em ostras no Rio Pacoti, Estado do Ceará, citam que a água é o
principal veículo de transmissão da cólera, e que moluscos bivalves e crustáceos são
alimentos marinhos mais freqüentemente associados com este Vibrio. Eles são
facilmente destruídos pelo calor e um adequado cozimento é suficiente para eliminar a
grande maioria. O grande perigo seria se houvesse sido detectado nas águas dos rios
V. cholerae O1 ou O139, o que não foi comprovado, pois Jakšić et al. (2002) citam que
este Vibrio pode sobreviver a cozimento por 8 a 25 minutos em caranguejos
naturalmente contaminados.
Makino et al. (2003), em pesquisa realizada para distinguir o mecanismo
patogênico entre o V. cholerae e o V. parahaemolyticus, sugerem que apesar dos dois
MENEZES, F. G. R. Diversidade de Vibrio spp. em estuários no Estado do Ceará... 56
víbrios causarem doenças similares, os mecanismos usados para estabelecer a
infecção são diferentes.
Por esta razão, a presença de V. cholerae nestes ambientes é preocupante pelo
fato dele ter sido o responsável por mais de 2009 mortes em um período de oito anos
no Brasil, sendo a região nordeste a que teve o maior percentual dos casos (92,1%)
(Vital Brazil et al., 2002).
No presente estudo foram isoladas duas cepas de V. vulnificus em amostras de
água cuja salinidade e temperatura variaram de 7 a 37‰ e de 25 e 32°C,
respectivamente. A temperatura medida nas amostras foi maior (Tabela 3) que a
apresentada na literatura, (Hervio-Heath et al., 2002; Fukushima & Seki, 2004) uma vez
que comumente este Vibrio é isolado de águas costeiras e estuarinas com salinidades
que variam entre 6 e 26‰ e temperatura entre 15 e 27°C, sendo esses fatores
ambientais, os mais simples e rápidos indicadores da presença deste organismo.
Também Parvathi et al. (2004) conseguiram isolar cepas de V. vulnificus nos
meses de janeiro a maio, em ostras coletadas ao longo do sudoeste da costa da Índia,
com uma salinidade de 30‰.
Por outro lado, Lin & Schwarz (2003) em pesquisa realizada nas águas da Baia
de Galveston, Estados Unidos, encontraram diferenças entre grupos de cepas de V.
vulnificus. Um foi isolado nos meses de dezembro a fevereiro, considerados meses
frios, e o outro grupo, nos meses de março a maio, meses de primavera. Nesses meses
as diferenças entre temperatura e salinidade oscilam ressaltando o controle que tais
fatores exercem na distribuição do Vibrio.
V. alginolyticus ocorreu apenas no estuário do Pacoti, ponto 2 (Tabela 4) em
temperaturas de 30°C e salinidade de 34‰ acima dos padrões citados pela literatura
(Hörmansdorfer et al., 2000).
Por ser um dos mais importantes patógenos de camarão, várias pesquisas foram
realizadas com intuito de controlar infecções de V. alginolyticus à espécie de L.
Vannamei. Liu & Chen (2004) e Tseng & Chen (2004) conseguiram concluir que a
associação de amônia e nitrato na água torna o camarão mais susceptível ao Vibrio.
Em contrapartida, Hou & Chen (2005) pesquisando os efeitos da adição do
extrato de Gracilaria tenuistipitata ao camarão, concluíram que os animais que
MENEZES, F. G. R. Diversidade de Vibrio spp. em estuários no Estado do Ceará... 57
receberam uma injeção da solução com o extrato tornaram-se mais resistentes ao V.
alginolyticus.
O isolamento dos V. anguillarum, V. damsella e V. ordalii nas amostras de água
e sedimento dos rios (Tabela 4),onde existe um grande consumo de peixe por parte da
população local, requer atenção, devido estes víbrios serem patógenos ao pescado,
podendo sua ingestão acarretar problemas ao consumidor (Wilk et al., 1995; Colquhoun
& SØrum, 2002; Fujiwara-Nagata & Eguchi, 2004).
O fato de pouca diversidade de víbrios ter sido isolado da fazenda não descarta
a possibilidade da ocorrência de surtos nos camarões cultivados, através do contato
com esses microrganismos, uma vez que eles são patógenos oportunistas (Sudheesh
et al., 2002).
Esta afirmação é reforçada pelos achados de Vieira et al. (2000) que em um
estudo sobre mortalidade de larvas, numa larvicultura de camarão em Pernambuco,
isolaram apenas duas espécies de Vibrio: V. alginolyticus e V. fluvialis, provavelmente
responsáveis pela mortalidade ocorrida na fazenda.
A presença das espécies V. vulnificus, V. alginolyticus, V. harveyi e V. fluvialis
pode indicar um risco para a saúde dos camarões, por serem espécies que estão
associadas com enfermidades em vários cultivos de camarão marinho no mundo
(Martins, 2003).
Na verdade, segundo Baron (1996), muitos tipos de erros podem acontecer
quando organismos são classificados com base somente em suas características
fenotípicas, o que foi feito neste trabalho. Por exemplo, diferentes enzimas
(especificadas por diferentes genes) podem catalizar a mesma reação. Assim também
mesmo se um gene metabólico for funcional, reações negativas podem ocorrer por
causa da inabilidade do substrato em entrar na célula, por causa de mutações no gene
regulatório ou por produção de uma proteína inativa. Não há necessariamente uma
correlação entre a reação e o número de genes para completar uma reação. O “Center
for Disease Control and Prevention” (CDC), nos Estados Unidos, usa 46 testes
bioquímicos para caracterizar membros da família Enterobacteriaceae enquanto, a
maioria dos laboratórios clínicos usa “kits” comerciais de identificação ou testes rápidos
para identificar isolados, com muito menos critérios. No presente trabalho foram usados
MENEZES, F. G. R. Diversidade de Vibrio spp. em estuários no Estado do Ceará... 58
21 testes permanecendo a dúvida, se este número seria suficiente para se chegar à
espécie da família Vibrionaceae. Tison (1999) afirma que 22 provas bioquímicas podem
diferenciar as espécies patogênicas de Vibrio dentre elas, V.cholerae, V.mimicus,
V.parahaemolyticus, V.alginolyticus, V.vulnificus, V. damsela, V. fluvialis, V. furnissii, V.
hollisae, V. metschnikovii, V. circinnatiensis e V. carchariae.
O que se pode afirmar é que a diversidade de víbrios no ambiente é muito maior
do que nas fazendas (Tabelas 5 e 6) e que as espécies V. costicola, V. ordalii, V.
anguillarum, V. vulnificus, V.diazotrophicus e V. fisheri não foram identificadas no Rio
Pacoti, o rio que não sofre impacto da carcinicultura. Somente dois desses (V. costicola
e V. vulnificus) foram isolados da fazenda –teste. Por outro lado, V. cincinnatiensis foi
isolado somente na fazenda. Todos estes víbrios estão naturalmente em águas
estuarinas e ocasionalmente podem atacar os camarões, causando enfermidades, o
que aconteceu recentemente, quando camarões no nordeste foram infectados pelo
Vírus da Mionecrose Infeciosa e subseqüentemente por víbrios (Lima et al., 2004)
causando alta mortalidade nas fazendas afetadas.
Os índices de riqueza de espécie podem ser uma medida extremamente útil,
quando empregados em áreas delimitadas, no espaço e no tempo. Estas medidas
expressam de forma compreensível e instantânea, a diversidade (Magurran, 1988). Por
enquanto os víbrios não foram afetados pelas atividades de carcinicultura. Até quando,
só o futuro esconde a resposta.
MENEZES, F. G. R. Diversidade de Vibrio spp. em estuários no Estado do Ceará... 59
5 – CONCLUSÃO
Tendo em vista que: (a) a diversidade das espécies do gênero Vibrio é muito
maior nos estuários do que na fazenda de carcinicultura; e (b) esta diversidade é
semelhante nos estuários com (Rios Pirangi, Choró e Jaguaribe) e sem (Rio Pacoti)
fazendas de cultivo, conclui-se que, aparentemente, a carcinicultura não causa impacto
ambiental na diversidade do gênero Vibrio.
MENEZES, F. G. R. Diversidade de Vibrio spp. em estuários no Estado do Ceará... 60
6 – BIBLIOGRAFIA
ABCC. Associação Brasileira dos Criadores de Camarão Marinho. A carcinicultura
brasileira em 2003. Revista da ABCC, Recife, ano 6, n.1, 2004.
Albert, J. M.; Bhuiyan, N. A. Talukder, K.A.; Faruque, A.S.G.; Nahar, S.; Faruque, S. M.;
Ansaruzzaman, M. & Rahmam, M. Phenotypic and genotypic changes in Vibrio cholerae
O139 Bengal. J. Clin. Microb., v.35, n.10, p.2588-2592, 1997.
Alsina, M. & Blanch, A. R. Improvement and update of a set of keys for biochemical
identification of Vibrio species. J. Appl. Bacteriol., v.77, p.719-721,1994.
Baffone , W.; Citterio, B.; Vittoria, E.; Casaroli, A.; Campana, R.; Falzano, L. & Donelli,
G. Retention of virulence in viable but non-culturable halophilic Vibrio spp. International
Journal of Food Microbiology, v. 89, p.,31-39., 2003,
Barbieri, E.; Falzano, L.; Fiorentini, C.; Pianetti, A.; Baffone, W., Fabbri, A.;Matarrese,
P.; Casiere, A.; Katouli, M.; Kühn, I; Möllby, R.; Bruscolini, F. & Donelli, G. Occurrence,
diversity, and pathogenicity of halophilic Vibrio spp. and non-O1 Vibrio cholerae from
estuarine waters along the Italian Adriatic coast. Appl. Environ. Microb., v.65, n.6,
p.2748-2753, 1999.
Barbieri Junior, R. C. & Ostrenky Neto, A. Camarões Marinhos- Engorda, Aprenda Fácil,
Viçosa, v. II, 2002.
Baron, E. J. Classification, p.53-64, in: Baron, S.; Peake, R. C.; James, D. A.; Susman,
M.; Kennedy, C. A.; Singleton, M. J. D.; Schuenke, S. (eds.), Medical Microbiology, 4
th
Edition, Churchill Livingstone, New York, USA, 1996.
MENEZES, F. G. R. Diversidade de Vibrio spp. em estuários no Estado do Ceará... 61
Barros, L. M. O. Avaliação bacteriológica de ostra, Crassostrea rhizophorae,
comercializada em Fortaleza – Ceará. Dissertação de Mestrado, Instituto de Ciências
do Mar-LABOMAR, Universidade Federal do Ceará, 60p, Fortaleza, 2004.
Baumann, P.; Furnissi, A. L.; & Lee, J. V. Genus I. Vibrio Pacini 1854,411. Cap. Section
5. Facultatively Anaerobic Gram-negative Rods, p. 518-538, in: Krieg, N.R.; HOLT, J.G.
(eds.), Bergey’s Manual of Sistematic Bacteriology, 964p., 1984.
Biodiversity Reporting Award - BRA: Desastre ronda criação de camarões no mangue.
Conservation Internacional, 2002. Disponível em:
<http://www.conservation.org/xp/CIWEB/programs/awards/2002/brasil/judges/entries/br
a_09.xml>. Acesso em 09 de setembro de 2002.
Buchanan, R.E. & N.E. Gibbons, (eds.), Bergey's Manual of Determinative Bacteriology.
8th edition. The Williams & Wilkins Company, Baltimore, 964p.,1974.
Campos, L. A. Vibrio cholerae. p.337-343, in: Trabulsi, L. R.; Altherthum, F.; Martinez,
M. B.; Campos, L. C. Gompertz, O. F.; Rácz, M. L. (eds), Microbiologia. São Paulo.
Atheneu, 718p., 2004.
Cavallo, R.A. & Stabili, L. Culturable víbrios biodiversity in the Northern Ionian Sea
(Italian coasts). Scientia Marina., v. 68, p.23-29, 2004.
Colquhoun, D. J. & Sørum, H. Cloning, characteristion and phylogenetic analysis of the
fur gene in Vibrio salmonicida and Vibrio logei. Gene. v.296, p.213-220, 2002.
CONAMA, Brasil. Conselho Nacional do Meio Ambiente. Resolução CONAMA n. 357,
18 de março de 2005.
MENEZES, F. G. R. Diversidade de Vibrio spp. em estuários no Estado do Ceará... 62
DSMZ. Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH
Disponível em:
<http://www.dsmz.de/bactnom/bactname.htm> Acesso em 16 de março de 2005).
DOWNES, M. P. & ITO, K. Compendium of methods for the microbiological examination
of foods. APHA 4
th
. edition. 676 p., Washington, DC, 2001.
Elliot, E.L.; Kaysner, C. A.; Jackson, L. & Tamplin M. L
. Vibrio cholerae, V.
parahaemolyticus, V. vulnificus and other Vibrio spp. Jan. 2001. In: FOOD AND DRUG
ADMINISTRATION - FDA, Bacteriological Analytical Manual on line. FDA/Center for
Food Safety and Applied Nutrition - CFSAN, 2001. Disponível em:
< http://www.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-9.html > . Acesso em 07 de Fev. de 2003.
Eugênio, C. Agronegócio Exportação. Camarão: Ceará tenta reverter queda nas
exportações. Disponível em:
< http://www.paginarural.com.br/noticias_detalhes> Acesso em 13 de março de 2005
FDA – Food and Drug Administration. Bacteriological analytical manual on line. FDA/
Center for Food Safety and Applied Nutrition – CFSAN. Disponível em
http://www.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-toc.html. Acesso em 04 de janeiro de 2005.
Feldhusen, F. The role of seafood in bacterial foodborne diseases. Micro. Inf., v.2, n.13,
p.1651-1660, 2000.
Feng, P.; Weagatn, S.D.; Grant, M. A. enumeration of Escherichia coli and the Coliform
bacteria. . In: Food and Drug Administration – FDA. Bacteriological analytical manual on
line. FDA/CFSAM. 2002. Disponível em: http://www.cfsan.fda.gov/~edam/bam-a2.html.
Acesso: 10 jan. 2005.
MENEZES, F. G. R. Diversidade de Vibrio spp. em estuários no Estado do Ceará... 63
Firme, L.P. Caracterização físico-química de solos de mangue e avaliação de sua
contaminação por esgoto doméstico via traçadores fecais. Dissertação de Mestrado,
Universidade de São Paulo-USP, 70 p. 2003.
Fujiwara-Nagata, E. & Eguchi, M. Significance of Na
+
in the fish pathogen, Vibrio
anguillarum, under energy depleted condition. Fems Microbiol. Lett
., v. 234. p. 163-167.
2004.
Fukushima, H. & Seki, R. Ecology of Vibrio vulnificus and Vibrio parahaemolyticus in
brackish environments of the Sada river in Shimane Prefecture, Japan. Fems Microbiol.,
v.48, p.221-229, 2004.
Garthright, W.E. Appendix 2: most probable number from serial dilutions. In: food and
Drug Administration – FDA. Bacteriological analytical manual on line. FDA/CFSAM.
2001. Disponível em: http://www.cfsan.fda.gov/~edam/bam-a2.html. Acesso: 10 jan.
2005.
Gomez-Gil, B.; Rodriguez-Soto, S.; Garcia-Gasca, A.; Roque, A.;Vazquez-Juarez,
R.;Thompson, L. F. & Swings, J. Molecular identification of Víbrio harveyi-related
isolates associated with diseased aquatic organisms. Microbiology,, v.150, p.1769-1777,
2004.
Gomez-Gil, B.; Thompsom, F. L.; Thompsom, C. C. & Swings, J. Vibrio rotiferianus sp.
nov.,isolated from cultures of the rotifer Brachionus plicatilis. Int. J. Syst Evol. Microbiol.,
v.53, p.239-243, 2003.
Gomez-Gil, B.; Tron-Mayén, L.; Roque, A.; Turnbull, J. F.; Inglis, V. & Guerra-Flores, A.
L. Species of Vibrio isolated from hepatopancreas, haemolymph and digestive tract of a
population of healthy juvenile Penaeus vannamei. Aquaculture., v.163, p.1-9, 1998.
MENEZES, F. G. R. Diversidade de Vibrio spp. em estuários no Estado do Ceará... 64
Han, J. H.; Lee, J. H.; Choi, Y. H.; Park, J. H.; Choi, T. J. & Kong, I. S. Purification,
characterizations and molecular cloning of Vibrio fluvialis hemolysin. Biochim. Biophys.
Acta., v.1599, p.106-114, 2002
Hervio-Heath, D.; Colwell, R. R.; Derrien, A.; Robert-Pilot, A.; Fournier, J. M. &
Pommepuy, M. Occurrence of pathogenic vibrios in coastal areas of France. J. Appl
Microbiol., v.92, p.1123-1135, 2002.
Hofer, E. Primeiro isolamento e identificação de Vibrio parahaemolyticus no Brasil, de
infecção gastrointestinal humana. Rev. Microbiol., v.14, n.3, p.174-1745, 1983.
Hörmansdorfer, S.; Wentges, H.; Neugebaur-Büchler, K. & Bauer,J. Isolation of Vibrio
alginolyticus from seawater aquaria. Int. J. Hyg. Environ. Health., v.203, p.169-175,
2000.
Hosseini, H.; Cheraghali, A. M.; Yalfani, R. & Razavilar, V. Incidence of Vibrio spp. in
shrimp caught off the south coast of Iran. Food Control., n.15, p.187-190, 2004.
Hou, W. Y. & Chen, J.C. The immunostimulatory effect of hot-water extract of Gracilaria
tenuistipitata on the white shrimp Litopenaeus vannamei and its resistence against
Vibrio alginolyticus. Fish & Shellfish Imunology., v.19, p.127-138, 2005.
ICMSF – International commisssion on microbiological specifications for foods.
Micoorganisms in foods: 1. Their sigficance and methods of enumerations. 2 ed.
Toronto: University of Toronto press. p.201-207, 287-350, 1978.
Jakšić, S.; Uhitil, S.; Petrak, T.; Bazulic, D. & Karolui, L. G. Occurrence of Vibrio spp. In
sea fish, shrimps and bivalve molluscs harvested from Adriatic sea. Food Control. v.13,
p.491-493, 2002.
MENEZES, F. G. R. Diversidade de Vibrio spp. em estuários no Estado do Ceará... 65
Jones, A. B.; Donohue, M. J.; Udy, J. & Dennison, W.C. Assessing ecological impacts of
shrimp and sewage effluent: biological indicators with standard water quality analysis.
Estuar. Coast. Shelf Sci .,v. 52, p.91-109, 2001.
Koneman, E. W.; Allen. S. D.; Dowell, V. R. & Sommers, H. M. Diagnóstico
Microbiológico – Texto e Atlas Colorido. Panamericana 2
a
. ed., São Paulo, 1993.
Landgraf, M.; Leme, K. B. P.; Garcia-Moreno, M. L. Occurrence of emerging pathogenic
Vibrio spp in seafood consumed in São Paulo city, Brazil. Rev. Microbiol., v.27, p.126-
130, 1996.
La Rosa, T.; Mirto, S.; Marino, A.; Alonzo, V.; Maugeri, T. L. & Mazzola, A. Heterotrophic
bactéria community and pollution indicatiors of mussel – farm impact in the Gulf os
Gaeta (Tyrrhenian Sea). Mar. Environ. Res
., v.52, p.301-321, 2001.
Lavilla-Pitogo, C. R.; Leaño, E. M. & Paner, M. G. Mortalities of pond-cultured juvenile
shrimp, Penaeus monodon, associated with dominance of luminescent víbrios in the
rearing environment. Aquaculture., v.164, p.337-349, 1998.
Lee, S. K.Y.; Wang, H. Z., Law, S. H.W.; Wu, R. S. S. & Kong, R. Y.C.Analysis of the
16S-23S rDNA intergenic spacers (IGSs) of marine vibrios for species-specific signature
DNA sequences. Mar. Pollut. Bull.., v.44, p.412-420, 2002.
LBNSN. List of bacterial names with standing in nomenclature. Disponível em:
http://www.bacterio.cict.fr/. Data de acesso: 04 de março de 2005.
Li, J.; Yie, J.; Foo, R. W. T.; Ling, J. M. L.; Xu, H. & Woo., N. Y. S.Antibiotic resistence
and plasmid profiles of Vibrio isolates from cultured Silver Sea Bream, Sparus sarba.
Mar. Pollut. Bull., v.39, n.1-12, p.245-249, 1999.
MENEZES, F. G. R. Diversidade de Vibrio spp. em estuários no Estado do Ceará... 66
Lipp, E. K.; Rodriguez-Palacios, C. & Rose, J.B. Occurrence and distribuition of the
human pathogen Vibrio vulnificus in a subtropical Gulf os Mexico estuary. Hydrobiologia.
v.,460, p., 165-173, 2001.
Lima, A. S.; Menezes, F. G. R.; Aragão, J. S.; Vieira, R. H. S. F. & Martins, P. C. C.
Vibrio spp. em amostras de camarões, solo e águas de fazendas de camarão nos
Estados do Ceará, Piauí e Rio Grande do Norte. p.117, in: Anais IX Encontro Nacional
de Microbiologia Ambiental – ENAMA., Curitiba, 2004.
Lin, M. & Schwarz, J. Seasonal shifts in populations structure of Vibrio vulnificus in an
estuarine environmental as revealed by partial 16S ribosomal DNA sequencing.Fems
Microbiol. Ecol., v.45, p.23-37, 2003.
Liu, C. H.; Yeh, S. T.; Cheng, S. Y. & Chen, J. C. The imune response of the white
shrimp Litopenaeus vannamei and its susceptibility to Vibrio infection in relation with the
moult cycle. Fish & Shellfish Imunology., v.16, p.151-161, 2004.
Liu, C. H. & Chen, J.C. Effect os ammonia on the imune response of white shrimp
Litopenaeus vannamei and its susceptibility to Vibrio alginolyticus. Fish & Shellfish
Imunology., v.16, p.321-334, 2004.
Macedo, L. A. A. & Rocha, A. A. Lançamento de esgoto em manguezais.
Considerações sobre aspectos ecológico-sanitários na Ilha de São Luís, MA. Revista
DAE., v.45, n.140, p.67-62, 1985.
Machado, Z. L. Camarão Marinho: captura – cultivo – conservação – comercialização.
Recife: SUDENE / PRN, 249p., 1988.
Magurran, A. E. Ecological diversity and its measurement. Magurran, A. E., (eds.) 177 p.
1988.
MENEZES, F. G. R. Diversidade de Vibrio spp. em estuários no Estado do Ceará... 67
Martins, P. C.C. Influência das condições ambientais e das técnicas do manejo de
produção sobre a ocorrência de enfermidades no cultivo de camarão marinho
Litopenaeus vannamei, no Estado do Ceará. Programa de Pós-Graduação em Ecologia
e Recursos Naturais. Universidade Federal de São Carlos. São Paulo. 117 p., 2003.
Makino, K.; Oshima, K.; Kurokawa, K.; Yokoyama, K.; Uda, T.; Tagomori, K.; Lijima, Y.;
Najima, M.; Nakano, M.; Yamashita, A. Kubota, Y.; Kimura, S.; Yasunga, T.; Honda, T.;
Shinagawa, H.; Hattori, M. & Lida, T. Genome sequence of Vibrio parahaemolyticus: a
pathogenic mechanism distinct from that of V. Choleare. The Lancet., v.361, p.743- 749.
2003.
Melo, S. Reaberto mercado americano para o camarão brasileiro. Panor. Aquic
. v.14,
n.86, p.51-52, 2004.
Moriarty, D. J. W. The role of microorganisms in aquaculture ponds. Aquaculture., v.151,
p.333-349, 1997.
Moriarty, D. J. W. Control of luminous Vibrio species in penaeid aquaculture ponds.
Aquaculture., v.164, p.351-358, 1998.
Nishigushi, M. K. Temperature affects species distribution in symbiotic populations of
Vibrio spp. Appl. Environ. Microbiol., v.66, n.8, p.3550-3555, 2000.
Nishigushi, M. K. & Nair, V. S. Evolution of Symbiosis in the Vibrionaceae: a combined
approach using molecules and physiology. Int. J. Syst. Evol. Microbiol
., v.53, p.2019-
1026, 2003.
Owens, L & Edgerton, B. A review of recent informatiuon on freshwater Crayfish
diseases. p. 219-224, In: Flegel, T. W. & macrae, I. H (eds.), Diseases in Asian
aquaculture III. Crustacean Health – general. 405p., 1997.
MENEZES, F. G. R. Diversidade de Vibrio spp. em estuários no Estado do Ceará... 68
Panchayuthapani, D. A survey diseases in India. p. 225-232, In: Flegel, T. W. & Macrae,
I. H. (eds.) Diseases in Asian aquaculture III. Crustacean Health – general. 405p., 1997.
Parvathi, A.; Kumar, H. S.; Karunasagar, I. & Karunasagar, I. Detection and enumeration
of Vibrio vulnificus in oysters from two estuaries along the southwest coast of India,
using molecular methods. Appl. Environ. Microbiol., v.70, n.11, p.6909-6913, 2004.
Paez-Osuna, F.; Guerrero-Galvan, S. & Ruiz-Fernadez, A.C. The environmental impact
of shrimp aquaculture and the coastal pollution in Mexico. Mar. Pollut. Bull., v.36, p.65-
75, 1998.
Pei-Uan Qian, M. C. S. & Wu, I. H. N. Comparison of nutrients release among some
maricultured animals. Aquaculture., v. 200, p.305-316, 2001.
Phillips, M. J.; Lin, C. K. & Beveridge, M. C. M. Shrimp culture and the environment-
lessons from the world’s most rapidly expanding warmwater aquaculture sector. in:
Pullin, R. S. V., Rosenthal, H., Maclean, J.L. (eds.). ICLARM Conference Proceedings.,
p.171-197, 1993.
Radu,S.; Vincent, M.; Apun, K.; Rahim, R. A.; Benjamim, P. G.; Yerman & Rusul, G.
Molecular characterization of Vibrio cholerae O1 outbreak strains in Miri, Sarawak
(Malaysia). Acta Tropica., v.83, p.169 – 176, 2002.
Revista Globo Rural. Aquicultura. Será a soja marinha?. Graças à alta eficiência da
produção, as exportações de camarão disparam e o Brasil já almeja a liderança
mundial. . Disponível em:
<http://revistagloborural.globo.com/GloboRural/0,6993,EEC691095-1641,00.html>
Acesso em 26 de fevereiro de 2005.
MENEZES, F. G. R. Diversidade de Vibrio spp. em estuários no Estado do Ceará... 69
Rocha, I. P. Uma análise da oferta e demanda de camarões no mercado mundial com
destaque para os preços ao produtor e consumidor final. Reflexos na carcinicultura
basileira. Revista da ABCC, n.3, p.26-35, 2004.
Robert-Pillot, A.; Guenole, A. & Fournier, J. M. Usefulness of R72H PCR assay for
differentiation between Vibrio parahaemolyticus and V. alginolyticus species: validation
by DNA-DNA hybridization. Fems Microbiol. Lett. v.215, p.1-6, 2002.
Rossi, M. & Mattos, I. F. O ecossistema mangue: uma análise dos solos e da vegetação
do estado de São Paulo. in: Anais, .Congresso Nacional Sobre Essências Nativas, 2;
São Paulo,: Instituto Florestal, p. 930-936. 1992.
SEMACE - Superintendência Estadual do Meio Ambiente. Governo do Estado do
Ceará. Diagnóstico da Carcinicultura Marinha no Estado do Ceará. 18p. 2000.
Schaeffer-Novelli, Y. Avaliação e ações prioritárias para conservação da biodiversidade
da zona costeira marinha. São Paulo: USP, Instituto Oceanográfico, 56 p, 1999.
Schaeffer-Novelli, Y. Manguezal: Ecossistema entre a terra e o mar. São Paulo: USP,
Insituto Oceanográfico, 64p., 1995.
Shehane, D. S. & Sizemore, R. K. Isolation and preliminary characterization of
bacteriocins produced by Vibrio vulnificus. J. Appl. Microbiol., v.92, p.322-328, 2002.
Silva, N.; Junqueira, V. C.A. & Silveira, N.F.A. Detecção ou contagem de víbrios
patogênicos. p.111-124, in: Manual de métodos de análise microbiológica de
alimentos.cap.15. Varela, São Paulo 295p., 1997.
Soares, J. B.; Casemiro, A. R. S. & Albuquerque, L. M. Metabolismo bacteriano –
fermentação de carboidratos e outras provas bioquímicas. in: Microbiologia Básica.
Fortaleza: Ed. UFC, 180p. 1991.
MENEZES, F. G. R. Diversidade de Vibrio spp. em estuários no Estado do Ceará... 70
Socil. Produção de camarão deve crescer 33% em 2005. A carcinicultura é muito
impactada pelo meio ambiente e precisa de áreas livres de conflitos. Disponível em:
< http://www.socil.com.br/peixes/noticia_prod_camarão.htm> Acesso em 25 de fevereiro
de 2005.
Solbrig, O. T. from genes to ecosystems: a research agenda for biodiversity. Report of a
IUBS-SCOP-UNESCO workshop. The Internatinal Union of Biological Science. Paris.
1991.
Sousa, O. V.; Vieira, R. H. S. F.; Menezes, F. G. R.; Reis, C. M. F. & Hofer, E. Detection
of Vibrio parahaemolyticus and Vibrio cholerae in oyster, Crassostrea rhizophorae,
collected from a natural nursery in the Cocó river estuary, Fortaleza, Ceará, Brazil. Rev.
Inst. Med.Trop. S. Paulo., v.46, n 2, p.59-62, 2004.
Sudheesh, P. S.; Jie, K. & Xu, H. S. Random amplified polymorphic DNA-PCR typing of
Vibrio parahaemolyticus and V. Alginolyticus isolated from cultured shrimps.
Aquaculture. v.207, p.11-17, 2002.
Sudheesh, P. S. & Xu, H. S. Pathogenicity of Vibrio parahaemolyticus in tiger prawn
Penaeus monodon Fabricius: possible role of extracellular proteases. Aquaculture.
v.196, p.37-46, 2001.
Thompson, R. J.; Randa, M.A.; Marcelino, L. A.; Tomita-Mitchell, A.; Lim, E. & Polz, M.
F. Diversity and dynamics of a North Atlantic coastal Vibrio community. Appl. Environ.
Microbiol., v.70, n.7, p.4103-4110, 2004.
Tison, D. L. Vibrio. p. 497-506, in: Murray, P. R.; Baron, E. J.; Pfaller; M. A.; Tenover, F.
C.& Yolken,. R. H. (eds.), Manual of Clinical Microbiology. 7
th
. Edition, 1773p., 1999.
MENEZES, F. G. R. Diversidade de Vibrio spp. em estuários no Estado do Ceará... 71
Torsvik, V. L.; Daae, F. L.; Goksøyr, J.; Sorheim, R.& Ovreas, L. Diversity of bacteria in
soil and marine environments. In: Martins, M.T., Sato, M.I.Z., Tiedje, J.M., Hagler,
L.C.N., Dobereiner, J., Sanchez, P.S. Progress in Microbial Ecology. Proceedings of
Seventh International Symposium on Microbial Ecology, Santos, São Paulo, Brasil.
1997.
Tseng, I.T. & Chen, J.C. The imune response of white shrimp Litopenaeus vannamei
and its susceptibility to Vibrio alginolyticus under nitrite stress. Fish & Shellfish
Imunology., v.17, p.325-333, 2004.
Valença, A. R. & Mendes, G. N. Importância da composição iônica da água oligohalina
e “doce” no cultivo de Litopenaeus vannamei. Panor. Aquic
.., v.14, n.86, p.23-29, 2004.
Vandenberghe, J.; Thompson; F. L.; Gomez-Gil, B. & Swings, J. Phenotypic diversity
amongst Vibrio isolates from marine aquaculture systems. Aquaculture., v.219, p.9 –20,
2003.
Vandenberghe, J.; Verdonck, L.; Robles-Arozena, R.; Rivera, G.; Bolland, A.;
Balladares, M.; Gomez-Gil, B.; Calderon, J.; Sorgeloos, P. & Swings, J. Vibrios
associated with Litopenaeus vannameyi larvae, postlarvae, broodstock, and hatchery
probionts. Appl. Environ. Microbiol., v.65, n.6, p.2592-2597, 1999.
Verschuere, L.; Rombaut, G.; Sorgeloos, P. & Verstraete, W. Probiotic bacteria as
biological control agents in aquaculture. Microbiol. Mol. Biol. Rev., v.64, n.4, p.655-671,
2000.
Vieira, R. H. S. F.; Gesteira, T. C. V.; Marques, L. C.; Martins, P. C. C.; Monteiro, C. M.
& Carvalho, R. L. Vibrio spp. e suas implicações sobre larviculturas de camarões
marinhos. Arq. Ciên. Mar., v.33, p.107-112, 2000.
MENEZES, F. G. R. Diversidade de Vibrio spp. em estuários no Estado do Ceará... 72
Vital Brazil, J. M.; Alves, R. M.; Rivera, I. N.G.; Rodrigues, D. P.; Karaolis, D. K. R. &
Campos, L. C. Prevalence of virulence-associated genes in clinical and environmental
Vibrio cholerae strains isolated in Brazil between 1991 and 1999. Fems Microbiol. Lett.,
v.215, p.15-21, 2002.
Wainberg, A. A. Camarão orgânico braisileiro. Panor. Aquic., v.14, n.86, p.13-19, 2004.
Wang, L. U. & Chen, J. C. The imune response of white shrimp Litopenaus vannamei
and its susceptibility to Vibrio alginolyticus at diferent salinity levels. Fish & Shellfish
Imunology,. v.18, p.269-278, 2005.
Wilk, R.; Stackbrandt, E.; Valle, O.; Daae, F. L.; Rødseth, O. M. & Andersen, K.
Classification of fish-pathogenic vibrios based on comparative 16S rRNA analysis. Int. J.
Syst. Bacteriol., v.45, n.3, p.421-428, 1995.
Wong, H. C., Ting, S. H. & Shieh, W. R. Incidence of Toxigenic Vibrios in Foods
Available in Taiwan. J. Appl. Bacteriol., v.73, p.197-202, 1992.
Yeh, S. T.; Liu, C. H. & Chen, J. C. Effect of copper sulfate on the immune response and
susceptibility to Vibrio alginolyticus in the white shrimp Litopenaeus vannamei
. Fish &
Shellfish Immunology., v.17, p.437-446, 2004.
MENEZES, F. G. R. Diversidade de Vibrio spp. em estuários no Estado do Ceará... 73
7 – ANEXO A – Dados dos biótipos das cepas de Vibrio spp.
Amostras do ambiente
Linhagens
Glicose
Manitol
Lactose
Sacarose
Arabinose
Manose
Lisina
Arginina
Ornitina
0%
3%
6%
8%
10%
Indol
VP
ONPG
Vibrio
1 + + - + + + + + + - + - - - + d + V. mimicus
3 + + - + - + + + + + - + - - + + + V. cholerae
4 + + - + - + + - + + - + - - - + + V. cholerae
5 + - - - - - + + + - - + - - - - - Vibrio spp.
7 - - - + - - - - + + - - - - - + - V. logei
8 - - + - - - + + + + + - - - - + - V. logei
9 - + - + - + + + + - + + + + d d + V. metschinikovii
11 - + - + + + + + + - - - - - - d + V. logei
12 - + - + - + + + - + + + + - - + + V. metschinikovii
14 - + - + - + + + - + + + - - - + + V. metschinikovii
15 + + - + - + + + + + + + - - - - + V. harveyi
16 - + - + + + + + + - - + + + - - - V. alginolyticus
17 + + - + + + - - + + - - - - - d - V. logei
18 - - - + + - + + + - - + - - - - - V. damsella
19 - + - + - + + + - + - - - - - + + V. logei
20 - - - + - - - + + + - - - - - d - V. logei
21 - + - + + + + + + + + - - - + + - V. logei
22 - + - - - + + + + - + + + - + - - V. campbelli
23 - + + - + + + + + - + + + - + - - V. parahaemolyticus
24 - + - + + + + - + + + - - - + - + V. cholerae
25 - + + - + + + - - + + + + - + - - V. parahaemolyticus
26 - + - - - + + + + - + + + - + - - V. parahaemolyticus
27 - + + - - + + + + + + + + - + + - V. damsella
28 d - + + + + + + + + + - - - + - - V. logei
29 - + - - - + + + - + + + + - + - - V. aestuarinus
30 + + - - + + + + + + + + + - + - - V. parahaemolyticus
31 - + + + + + + + - + - - - - - + + Vibrio spp.
32 - + + + + + + + + + + + - - + + + V. cholerae
33 - + + - + + + + + - + + + - - + - V. parahaemolyticus
34 - + + - + - + + + + - + + - - - - V. parahaemolyticus
35 - + + - - + + + + + + + + - + + - V. campbelli
36 d - + + + + + + + + + + + - + - + V. fluvialis
37 - + + + - + + + - - + + + - + - + V. metschinikovii
38 - + + + + + + + + + + + - - - - + V. fluvialis
39 - + + - - + + - + + + + + - + - - V. campbelli
MENEZES, F. G. R. Diversidade de Vibrio spp. em estuários no Estado do Ceará... 74
Linhagens
Glicose
Manitol
Lactose
Sacarose
Arabinose
Manose
Lisina
Arginina
Ornitina
0%
3%
6%
8%
10%
Indol
VP
ONPG
Vibrio
40 - + + - + + + - + + + + - - - d + V. vulnificus
41 - + + + + + + + + + + + + + d + + Vibrio spp.
42 - + + - + - + + + + - + + - - + - V. parahaemolyticus
43 - + + + + + + + + + - - - - - - + V. logei
44 - + + - + + + + - - + + + + + + - V. parahaemolyticus
45 - + + + + + - + + + + + + - + d - Vibrio spp.
46 - - + - + + + + - + + + + - - + - V. damsella
47 - + + - + + + + + + + + + - + d - V. parahaemolyticus
48 - - - - - - + - - + + + - - - - - V. campbelli
50 - - + - + - + - - + - - - - - - + V. logei
51 - + + - + + - + + + + + + + + d - V. costicola
52 - + + + + + - - + + + - - - + - + V. logei
54 - d - - + + + + + + + - - - + - + V. mimicus
55 + + + - + - d - + + + - - - + - - V. logei
56 - + + - + + - - + + + + - - + + + V. mimicus
57 - + + - + + - + + + + - - - + + - V. logei
58 - + + - + + - + - + + - - - + - - V. fisheri
60 - + + + + + - + + + + - - - - + + V. anguillarum
61 - + + + + + - + + + + - - - + + - V. anguillarum
62 - + + + + + - + + + + - - - + + - V. anguillarum
63 - + - - + + - + + + + - - - + - - V. campbelli
64 - + + + - + - - + + + - + - + + + V. cholerae
65 - + - + - + - + + + + - - - + - - V. logei
66 - + - + + + - + + - + - - - + - + V. fluvialis
67 - + - + + + - + + + + - - - + - - V. logei
68 - + + + + + - + + + + - - - + + - V. aestuarinus
69 - + + + + + - + + + d - - - + + - V. aestuarinus
70 - + + + + + - - + + + - - - + + - V. logei
71 - + + + + + - - + + + + + - + + + V. diazotrophicus
73 - + - + - + - + + + + + - - + + + V. cholerae
74 - + - + + + + + + + + + - + - + + V. fluvialis
75 - + - + + + - - - + + + - - + - - Vibrio spp.
76 - + - + - + + + + + + + d - - + + V. cholerae
77 - + - + - + - + + - + + - - + + - Vibrio spp.
78 - + + + + + - + + - + + - - + + + V. anguillarum
MENEZES, F. G. R. Diversidade de Vibrio spp. em estuários no Estado do Ceará... 75
Linhagens
Glicose
Manitol
Lactose
Sacarose
Arabinose
Manose
Lisina
Arginina
Ornitina
0%
3%
6%
8%
10%
Indol
VP
ONPG
Vibrio
79 - + - - + + - - + + + - - - + - - V. logei
81 - + - + - + - + + + + - + - + + - Vibrio spp.
115 - - + - - - - - - - + + + - - - - V. costicola
116 d + - - + + - + - + + + + - + - - V. splendidus biogrupo 1
117 - - - + d - - - + + + + - - d + + V. cholerae
118 - + - - + + + + + - + + + - d - - V. parahaemolyticus
119 - + - - + + + + + - + + + - + - - V. parahaemolyticus
120 - + - - + + + - + - + + + - d - - V. parahaemolyticus
121 - - - + + - - + - + + - - - - - - V. ordalli
122 - - - + - - - - - + + - - - - - - V. ordalli
123 - - - + + - - - + + + - - - - - - V. ordalli
124 - + - - + + - + + - + + + - d - - V. parahaemolyticus
125 - - + + + - + - - + + - - - - - - V. logei
126 - - - + + - + - - + + + - - - - - V. ordalli
127 + - - + + - - + - + + + + - - - - V. costicola
128 - + - + + + + + + + + + + - + - + V. fluvialis
129 - + - + - + + + + + + + - - + - - V. harveyi
130 + - - + + + - - - + + - - - - - + Vibrio spp.
131 - + - - + - + - + - + + + - + - - V. parahaemolyticus
132 - - - + + - + + - + + + + - - - - V. costicola
133 + - - + + + + + - + - + + - - - - V. damsella
134 + - + + + + - + - - + + + - - - - V. gazogenes
135 + - - + + - - + - + + + - - - - + V. fluvialis
136 + d - + + + + + + + + + - - + + - V. damsella
137 + + - + + + + + + + + + + - + - - Vibrio spp.
139 + + - + + - - - - + + + + - - - - V. gazogenes
140 + + - + + + - - - + + + - - - - + Vibrio spp.
141 + - + + + + - - - + + + - - - - + Vibrio spp.
142 - + - + + - + + + + + - - - + + + V. cholerae
143 + - + + + - - - - + + + + - - - + V. gazogenes
144 - + - + + - + + + + + - - - + + + V. cholerae
145 + + - + + + - + + + + + + - + + - V. damsella
146 + - - + + - - - - + + + + - - - - V. costicola
147 + - + + + - + - - + + + + - - - - V. gazogenes
148 + - - + + - - d - - + - - - - - - V. ordalli
MENEZES, F. G. R. Diversidade de Vibrio spp. em estuários no Estado do Ceará... 76
Linhagens
Glicose
Manitol
Lactose
Sacarose
Arabinose
Manose
Lisina
Arginina
Ornitina
0%
3%
6%
8%
10%
Indol
VP
ONPG
Vibrio
149 - - - + + + + + + + + + + - + - + V. fluvialis
150 - + + + + + + + + + + + - - + - + V. fluvialis
151 - + - + + + - + + + + + + - + + + V. fluvialis
152 + + + + + + - - - + + + + - + + - V. gazogenes
153 - + - + + + - + + + + - - - + - - V. logei
154 - + - + + + - + + + + + + - + - - Vibrio spp.
155 - + - + + + - + + + + + - - + - - Vibrio spp.
156 + + + + + + + + - + + + + - + - - V. aestuarinus
157 - + + + + + + + + + + + + - + - - V. aestuarinus
158 - + + + + + - + + + + + + - + - + V. fluvialis
159 + + + + + + + + - + + + - - + - - V. aestuarinus
160 - + + + + + - + + + + - - - + - - Vibrio spp.
161 - + + + + + - + + + + + + - + - - Vibrio spp.
162 - + + + + + - + + + + + + - + - - V. logei
163 - + + + + + + + + + + - - - + - - V. logei
164 - + - + + + - + + + + - - - + - - Vibrio spp.
165 - + - - + + - + + + + - + - + - - V. logei
166 + + + + + + - + - + + + + - + - - Vibrio spp.
167 - + + + + + + + + + + - - - + - - V. logei
168 - + + + + + - + d + + - + - + - - Vibrio spp.
169 - + + + + + + + + + + - + - + - - Vibrio spp.
170 - + + + + + - + + + + - - - + - - Vibrio spp.
171 + + + + + + d - + + + - - - + - - V. logei
172 - + + + + + - + - + + - - - + - - V. aestuarinus
173 - + - + + + - + + + + - - - + - - Vibrio spp.
174 + + - + + + - + - + + - - - + - + V. fluvialis
175 - + + + + + - + - + + - - - + - - V. aestuarinus
176 - + + + + + - - - + + - - - + + - Vibrio spp.
177 - + - + + + - + - + + - - - + - - Vibrio spp.
178 - + - + + + - + - + + + - - + - - Vibrio spp.
179 - + - - + + - + - + + + - - + - - Vibrio spp.
180 - + - d + + d + - + + + - - + - - V. splendidus biogrupo 1
181 - + - + + + - - - + + + - - + - - Vibrio spp.
MENEZES, F. G. R. Diversidade de Vibrio spp. em estuários no Estado do Ceará... 77
Amostras da Fazenda
Linhagens
Glicose
Manitol
Lactose
Sacarose
Arabinose
Manose
Lisina
Arginina
Ornitina
0%
3%
6%
8%
10%
Indol
VP
ONPG
Vibrio
82 - + - + - + - - + - + + + - + - -
V. harveyi
83 - + - + - + - + + - + + d - + - -
Vibrio spp.
88 - + - + + + - + + + + - - - + + +
V. cholerae
89 - + - + + + + + + + + - - - + + +
V. cholerae
90 - + - + - + - + + + + - - - - + +
Vibrio spp.
91 - - + + - - + - + + + + - - - + +
V. cholerae
92 - + - - + + + + + - + + - - + - +
V. vulnificus
93 - + - - + + - - + - + + + - - - +
V., cincinnatiensis
94 - + - + + + - + + - + + - - + - -
Vibrio spp.
95 - + - - + + - + - + + - - - - - -
Vibrio spp.
96 - + - + + + - + + - + + - - + - +
V. fluvialis
97 - + - - + + - + - - + + - - + - +
V. splendidus biogrupo 1
98 - + - - + + - + + - + + - + + - -
V. costicola
99 - + - - + + - + + - + + + - + - -
V. parahaemolyticus
100 - - - - + + + + + + + + - - - - -
V. campbelli
101 - - - + + - + d - + + + - - - - +
V. logei
102 - - - - + - - + + + + + - - - - -
V. campbelli
103 - - + + - - - + + - + - - - - + -
V. damsella
104 - - - + + - + - + + + - - - - + -
V. logei
105 - - + + + + - + + + + - - - - + +
V. fluvialis
106 - - - + + - + - + + + + - - d - +
V. cholerae
107 - + - + + + - + + + + - - - - + -
V. logei
112 - + + + + + + + + - + - - - + + -
V. logei
113 - + - - + - + - + + + + - - - d -
Vibrio spp.
114 - + - + + + - + + + + + - - - d -
V. costicola
MENEZES, F. G. R. Diversidade de Vibrio spp. em estuários no Estado do Ceará... 78
ANEXO B – Sistemática dos Víbrios (DSZM – 2005)
1-Name: VIBRIO
Authors: Pacini 1954
Status: Approved Lists
Type species: V. cholerae
Literature: Int. J. Syst. Bacteriol. 30:417 (AL);
2-Name: Vibrio aerogenes
Authors: Shieh et al. 2000
Status: New Species
Literature: Int. J. Syst. Bacteriol. 50:327;
Risk group: 1 (German classification)
Type strain: ATCC 700797, FG1, DSM 14438
3-Name: Vibrio aestuarianus
Authors: Tison and Seidler 1983
Status: New Species
Literature: Int. J. Syst. Bacteriol. 33:699
Risk group: 1 (German classification)
Type strain: ATCC 35048, OY-0-002
4-Name: Vibrio agarivorans
Authors: Macián et al. 2001
Status: New Species
Literature: Int. J. Syst. Bacteriol. 51:2035;
Risk group: ?
Type strain: 289, CECT 5085, DSM 13756
5-Name: Vibrio albensis
Authors: Lehmann and Neumann 1896
Status: Heterotypic Synonym
Literature: Int. J. Syst. Bacteriol. 30:417 (AL);
Comment: synonymy: Arch. Microbiol. 110:101-120 (1976)
Type strain: ATCC 14547
Synonym: Vibrio cholerae
6-Name: Vibrio alginolyticus
Authors: (Miyamoto et al. 1961) Sakazaki 1968
Status: Approved Lists
Literature: Int. J. Syst. Bacteriol. 30:417 (AL);
Risk group: 2 (German classification)
Type strain: ATCC 17749, CCM 2578, DSM 2171
, IMET 11295
Synonyms: Beneckea alginolytica (homotypic synonym)
MENEZES, F. G. R. Diversidade de Vibrio spp. em estuários no Estado do Ceará... 79
7-Name: Vibrio anguillarum
Authors: Bergeman 1909
Status: Basonym
Literature: Int. J. Syst. Bacteriol. 30:417 (AL)
Type strain: ATCC 19264
Synonym: Listonella anguillarum
8-Name: Vibrio brasiliensis
Authors: Thompson et al. 2003
Status: New Species
Literature: Int. J. Syst. Bacteriol. 53:250;
Risk group: ?
Type strain: CAIM 495, LMG 20546
9-Name: Vibrio calviensis
Authors: Denner et al. 2002
Status: New Species
Literature: Int. J. Syst. Bacteriol. 52:552;
Risk group: ?
Type strain: CIP 107077, DSM 14347
, RE35F/12
10-Name: Vibrio campbellii
Authors: (Baumann et al. 1971) Baumann et al. 1981
Status: New Combination
Literature: Int. J. Syst. Bacteriol. 31:217 (validation list);
Risk group: 1 (German classification)
Type strain: ATCC 25920, IMET 11296
Synonyms: Beneckea campbellii (basonym)
11-Name: Vibrio carchariae
Authors: Grimes et al. 1985
Status: Heterotypic Synonym
Literature: Int. J. Syst. Bacteriol. 35:224 (validation list);
Risk group: 2 (German classification)
Comment: synonymy: IJSB 48:749*
Type strain: 1116b, ATCC 35084
Synonym Vibrio harveyi
12-Name: Vibrio chagasii
Authors: Thompson et al. 2003
Status: New Species
Literature: Int. J. Syst. Bacteriol. 53:758;
Risk group: ?
Type strain: CAIM 431, LMG 21353, R-3712
MENEZES, F. G. R. Diversidade de Vibrio spp. em estuários no Estado do Ceará... 80
13-Name: Vibrio cholerae (Type species)
Authors: Pacini 1854
Status: Approved Lists
Literature: Int. J. Syst. Bacteriol. 30:417 (AL)
Risk group: 2 (German classification)
Type strain: ATCC 14035
Synonyms: Vibrio albensis (heterotypic synonym)
14-Name: Vibrio cincinnatiensis
Authors: Brayton et al. 1986
Status: New Species
Literature: Int. J. Syst. Bacteriol. 36:354 (validation list);
Risk group: 2 (German classification)
Type strain: ATCC 35912
15-Name: Vibrio coralliilyticus
Authors: Ben-Haim et al. 2003
Status: New Species
Literature: Int. J. Syst. Bacteriol. 53:314;
Risk group: ?
Type strain: ATCC BAA-450, LMG 20984, YB1
16-Name: Vibrio costicola
Authors: Smith 1938 emend. Garcia et al. 1987
Status: Basonym
Literature: Int. J. Syst. Bacteriol. 30:417 (AL);
Risk group: 1 (German classification)
Comment: emend. description IJSB 37:255*
Type strain: DSM 11403
, NCMB 701
Synonym: Salinivibrio costicola subsp. costicola
17-Name: Vibrio crassostreae
Authors: Faury et al. 2004
Status: New Species
Literature: Int. J. Syst. Bacteriol. 54:2139;
Risk group: ?
Type strain: CIP 108327, LGP 7, LMG 22240
18-Name: Vibrio cyclitrophicus
Authors: Hedlund and Staley 2001
Status: New Species, Corrected Name
Literature: Int. J. Syst. Bacteriol. 51:65;
Risk group: 1 (German classification)
Comment: nom. corrig.: Vibrio cyclotrophicus (sic); IJSEM 51:269
Type strain: ATCC 700982, CIP 106644, P-2P44
MENEZES, F. G. R. Diversidade de Vibrio spp. em estuários no Estado do Ceará... 81
19-Name: Vibrio damsela
Authors: Love et al. 1982
Status: Basonym
Literature: [2315]
, [4881]
Comment: correction of species epithet damselae to damsela according to correction
of Photobacterium damselae has never been formally proposed
Type strain: ATCC 33539, CDC 2588-80, DSM 7482
Synonym: Photobacterium damselae subsp. damselae
20-Name: Vibrio diabolicus
Authors: Raguénès et al. 1997
Status: New Species
Literature: Int. J. Syst. Bacteriol. 47:994;
Risk group: 1 (German classification)
Type strain: CNCM I-1629, HE800
21-Name: Vibrio diazotrophicus
Authors: Guerinot et al. 1982
Status: New Species
Literature: Int. J. Syst. Bacteriol. 32:356;
Risk group: 1 (German classification)
Type strain: 1, ATCC 33466, DSM 2604
, NS1
22-Name: Vibrio ezurae
Authors: Sawabe et al. 2005
Status: New Species
Literature: Int. J. Syst. Bacteriol. 55:1 (validation list);
Risk group: ?
Type strain: HDS1-1, IAM 15061, LMG 19970
23-Name: Vibrio fischeri
Authors: (Beijerinck 1889) Lehmann and Neumann 1896
Status: Approved Lists
Literature: Int. J. Syst. Bacteriol. 30:417 (AL);
Risk group: 1 (German classification)
Type strain: ATCC 7744, DSM 507
, NCMB 1281
24-Name: Vibrio fluvialis
Authors: Lee et al. 1981
Status: New Species
Literature: Int. J. Syst. Bacteriol. 31:217 (validation list);
Risk group: 2 (German classification)
Type strain: ATCC 33809, IMET 11293, NCTC 11327, VL 5125
MENEZES, F. G. R. Diversidade de Vibrio spp. em estuários no Estado do Ceará... 82
25-Name: Vibrio fortis
Authors: Thompson et al. 2003
Status: New Species
Literature: Int. J. Syst. Bacteriol. 53:1499;
Risk group: ?
Type strain: CAIM 629, LMG 21557, R-15032, STD3-1247
26-Name: Vibrio furnissii
Authors: Brenner et al. 1984
Status: New Species
Literature: Int. J. Syst. Bacteriol. 34:91 (validation list);
Risk group: 2 (German classification)
Type strain: ATCC 35016, CDC B3215
27-Name: Vibrio gallicus
Authors: Sawabe et al. 2004
Status: New Species
Literature: Int. J. Syst. Bacteriol. 54:846;
Risk group: ?
Type strain: CIP 107863, HT2-1, LMG 21878, DSM 16639
28-Name: Vibrio gazogenes
Authors: (Harwood et al. 1980) Baumann et al. 1981
Status: New Combination
Literature: Int. J. Syst. Bacteriol. 31:217 (validation list);
Risk group: 1 (German classification)
Type strain: ATCC 29988, PB1
Synonyms: Beneckea gazogenes (basonym)
29-Name: Vibrio halioticoli
Authors: Sawabe et al. 1998
Status: New Species
Literature: Int. J. Syst. Bacteriol. 48:578;
Risk group: 1 (German classification)
Type strain: A431, IAM 14596
30-Name: Vibrio harveyi
Authors: (Johnson and Shunk 1936) Baumann et al. 1981
Status: New Combination
Literature: Int. J. Syst. Bacteriol. 31:217 (validation list);
Risk group: 2 (German classification)
Type strain: ATCC 14126
Synonyms: Beneckea harveyi (basonym), Lucibacterium harveyi (basonym), Vibrio
carchariae (heterotypic synonym), Vibrio trachuri (heterotypic synonym)
MENEZES, F. G. R. Diversidade de Vibrio spp. em estuários no Estado do Ceará... 83
31-Name: Vibrio hepatarius
Authors: Thompson et al. 2003
Status: New Species
Literature: Int. J. Syst. Bacteriol. 53:1500;
Risk group: ?
Type strain: 1P, CAIM 693, LMG 20362, P62
32-Name: Vibrio hispanicus
Authors: Gomez-Gil et al. 2004
Status: New Species
Literature: Int. J. Syst. Bacteriol. 54:264;
Risk group: ?
Type strain: CAIM 525, LMG 13240, VIB 213, DSM 16580
33-Name: Vibrio hollisae
Authors: Hickman et al. 1982
Status: Basonym
Literature: Int. J. Syst. Bacteriol. 32:384 (validation list);
Risk group: 2 (German classification)
Type strain: ATCC 33564, CDC 0075-80, IMET 12291
Synonym Grimontia hollisae
34-Name: Vibrio ichthyoenteri
Authors: Ishimura et al. 1996
Status: New Species
Literature: Int. J. Syst. Bacteriol. 46:159;
Risk group: 2 (German classification)
Type strain: F-2, IFO 15847, DSM 14397
35-Name: Vibrio iliopiscarius
Authors: Onarheim et al. 1995
Status: Basonym
Literature: Int. J. Syst. Bacteriol. 45:418 (validation list);
Risk group: 1 (German classification)
Comment: type strain incorrectly cited "PT1" in List No 53, IJSB 45:418
Type strain: DSM 9896
, PS1
Synonym: Photobacterium iliopiscarium
36-Name: Vibrio kanaloae
Authors: Thompson et al. 2003
Status: New Species
Literature: Int. J. Syst. Bacteriol. 53:757;
Risk group: ?
Type strain: CAIM 485, INCO 191, LMG 20539
MENEZES, F. G. R. Diversidade de Vibrio spp. em estuários no Estado do Ceará... 84
37-Name: Vibrio lentus
Authors: Macián et al. 2001
Status: New Species
Literature: Int. J. Syst. Bacteriol. 51:1454;
Risk group: 1 (German classification)
Type strain: 4OM4, CECT 5110, DSM 13757
38-Name: Vibrio logei
Authors: (Harwood et al. 1980) Baumann et al. 1981
Status: New Combination
Literature: Int. J. Syst. Bacteriol. 31:217 (validation list);
Risk group: 1 (German classification)
Type strain: 584, ATCC 29985
Synonyms: Photobacterium logei (basonym)
39-Name: Vibrio marinus
Authors: Baumann et al. 1984
Status: Basonym
Literature: Int. J. Syst. Bacteriol. 34:356 (validation list);
Risk group: 1 (German classification)
Type strain: ATCC 15381
Synonym: Moritella marina
40-Name: Vibrio mediterranei
Authors: Pujalte and Garay 1986
Status: New Species
Literature: Int. J. Syst. Bacteriol. 36:278
Risk group: 1 (German classification)
Type strain: CECT 621
41-Name: Vibrio metschnikovii
Authors: Gamaleia 1888
Status: Approved Lists
Literature: Int. J. Syst. Bacteriol. 30:417 (AL);
Risk group: 2 (German classification)
Type strain: NCTC 8443
42-Name: Vibrio mimicus
Authors: Davis et al. 1982
Status: New Species
Literature: Int. J. Syst. Bacteriol. 32:267 (validation list);
Risk group: 2 (German classification)
Type strain: 1721-77, ATCC 33653
MENEZES, F. G. R. Diversidade de Vibrio spp. em estuários no Estado do Ceará... 85
43-Name: Vibrio mytili
Authors: Pujalte et al. 1993
Status: New Species
Literature: Int. J. Syst. Bacteriol. 43:360
Risk group: 1 (German classification)
Type strain: 165, CECT 632
44-Name: Vibrio natriegens
Authors: (Payne et al. 1961) Baumann et al. 1981
Status: New Combination
Literature: Int. J. Syst. Bacteriol. 31:217 (validation list);
Risk group: 1 (German classification)
Type strain: ATCC 14048, DSM 759
, IMET 11297, NCMB 857
Synonyms: Beneckea natriegens (basonym)
45-Name: Vibrio navarrensis
Authors: Urdaci et al. 1991
Status: New Species
Literature: Int. J. Syst. Bacteriol. 41:293
Risk group: 1 (German classification)
Type strain: 1397-6, CIP 103381
46-Name: Vibrio neonatus
Authors: Sawabe et al. 2005
Status: New Species
Literature: Int. J. Syst. Bacteriol. 55:1 (validation list);
Risk group: ?
Type strain: HDD3-1, IAM 15060, LMG 19973
47-Name: Vibrio neptunius
Authors: Thompson et al. 2003
Status: New Species
Literature: Int. J. Syst. Bacteriol. 53:249;
Risk group: ?
Type strain: CAIM 532, LMG 20536
48-Name: Vibrio nereis
Authors: (Harwood et al. 1980) Baumann et al. 1981
Status: New Combination
Literature: Int. J. Syst. Bacteriol. 31:217 (validation list);
Risk group: 1 (German classification)
Type strain: 80, ATCC 25917
Synonyms: Beneckea nereis (basonym)
MENEZES, F. G. R. Diversidade de Vibrio spp. em estuários no Estado do Ceará... 86
49-Name: Vibrio nigripulchritudo
Authors: (Baumann et al. 1971) Baumann et al. 1981
Status: New Combination
Literature: Int. J. Syst. Bacteriol. 31:217 (validation list);
Risk group: 1 (German classification)
Type strain: ATCC 27043
Synonyms: Beneckea nigripulchritudo (basonym)
50-Name: Vibrio ordalii
Authors: Schiewe et al. 1982
Status: New Species
Literature: Int. J. Syst. Bacteriol. 32:384 (validation list);
Risk group: 2 (German classification)
Type strain: ATCC 33509, DF3K
51-Name: Vibrio orientalis
Authors: Yang et al. 1983
Status: New Species
Literature: Int. J. Syst. Bacteriol. 33:673 (validation list);
Risk group: 1 (German classification)
Type strain: 717, ATCC 33934
52-Name: Vibrio pacinii
Authors: Gomez-Gil et al. 2003
Status: New Species
Literature: Int. J. Syst. Bacteriol. 53:1572;
Risk group: ?
Type strain: CAIM 530, LMG 19999, STD3-1057
53- Name: Vibrio parahaemolyticus
Authors: (Fujino et al. 1951) Sakazaki et al. 1963
Status: Approved Lists
Literature: Int. J. Syst. Bacteriol. 30:417 (AL);
Risk group: 2 (German classification)
Type strain: ATCC 17802, DSM 10027
Synonyms: Beneckea parahaemolytica (homotypic synonym)
54-Name: Vibrio pectenicida
Authors: Lambert et al. 1998
Status: New Species
Literature: Int. J. Syst. Bacteriol. 48:486;
Risk group: 1 (German classification)
Type strain: A365, CIP 105190
MENEZES, F. G. R. Diversidade de Vibrio spp. em estuários no Estado do Ceará... 87
55-Name: Vibrio pelagius
Authors: (Baumann et al. 1971) Baumann et al. 1981
Status: Basonym
Literature: [1051]
, [1410], [1849], [9370]
Type strain: ATCC 25916
Synonym: Listonella pelagia
56-Name: Vibrio penaeicida
Authors: Ishimaru et al. 1995
Status: New Species
Literature: Int. J. Syst. Bacteriol. 45:138;
Risk group: 1 (German classification)
Type strain: IFO 15640, JCM 9123, KH-1, DSM 14398
57-Name: Vibrio pomeroyi
Authors: Thompson et al. 2003
Status: New Species
Literature: Int. J. Syst. Bacteriol. 53:757;
Risk group: ?
Type strain: CAIM 578, INCO 62, LMG 20537
58-Name: Vibrio ponticus
Authors: Macián et al. 2005
Status: New Species
Literature: Int. J. Syst. Bacteriol. 55:1 (validation list);
Risk group: ?
Type strain: 369, CECT 5869, DSM 16217
59-Name: Vibrio proteolyticus
Authors: (Merkel et al. 1964) Baumann et al. 1982
Status: New Combination
Literature: Int. J. Syst. Bacteriol. 32:267 (validation list);
Risk group: 1 (German classification)
Comment: Type strain wrongly cited in List No. 8; "corrected" 33:673. Cited as new
species
Type strain: ATCC 15338, DSM 30189
, NCMB 1326
Synonyms: Aeromonas hydrophila subsp. proteolytica (basonym)
60-Name: Vibrio rotiferianus
Authors: Gomez-Gil et al. 2003
Status: New Species
Literature: Int. J. Syst. Bacteriol. 53:242;
Risk group: ?
Type strain: CAIM 577, LMG 21460
MENEZES, F. G. R. Diversidade de Vibrio spp. em estuários no Estado do Ceará... 88
61-Name: Vibrio ruber
Authors: Shieh et al. 2003
Status: New Species
Literature: Int. J. Syst. Bacteriol. 53:483;
Risk group: ?
Type strain: CCRC 17186, JCM 11486, VR1, DSM 16370
62-Name: Vibrio rumoiensis
Authors: Yumoto et al. 1999
Status: New Species
Literature: Int. J. Syst. Bacteriol. 49:935 (validation list);
Risk group: 1 (German classification)
Type strain: Ferm P-14531, S-1
63-Name: Vibrio salmonicida
Authors: Egidius et al. 1986
Status: New Species
Literature: Int. J. Syst. Bacteriol. 36:518
Risk group: 2 (German classification)
Type strain: HI 7751, NCMB 2262
64-Name: Vibrio scophthalmi
Authors: Cerdà-Cuéllar et al. 1997
Status: New Species
Literature: Int. J. Syst. Bacteriol. 47:60;
Risk group: 1 (German classification)
Type strain: A089, CECT 4638
65-Name: Vibrio shilonii
Authors: Kushmaro et al. 2001
Status: New Species, Corrected Name
Literature: Int. J. Syst. Bacteriol. 51:1387;
Risk group: 1 (German classification)
Comment: nom. corrig.: Vibrio shiloi (sic)
Type strain: AK1, ATCC BAA-91, DSM 13774
66-Name: Vibrio splendidus
Authors: (Beijerinck 1900) Baumann et al. 1981
Status: New Combination
Literature: Int. J. Syst. Bacteriol. 31:217 (validation list);
Risk group: 1 (German classification)
Type strain: ATCC 33125, NCMB 1
Synonyms: Beneckea splendida (basonym)
MENEZES, F. G. R. Diversidade de Vibrio spp. em estuários no Estado do Ceará... 89
67-Name: Vibrio succinogenes
Authors: Wolin et al. 1961
Status: Basonym
Literature: Int. J. Syst. Bacteriol. 30:417 (AL);
Type strain: ATCC 29543, DSM 1740
Synonym: Wolinella succinogenes
68-Name: Vibrio superstes
Authors: Hayashi et al. 2003
Status: New Species
Literature: Int. J. Syst. Bacteriol. 53:1816;
Risk group: ?
Type strain: IAM 15009, LMG 21323, DSM 16383
69-Name: Vibrio tapetis
Authors: Borrego et al. 1996
Status: New Species
Literature: Int. J. Syst. Bacteriol. 46:483;
Risk group: 1 (German classification)
Type strain: B1090, CECT 4600
70-Name: Vibrio tasmaniensis
Authors: Thompson et al. 2003
Status: New Species
Literature: Int. J. Syst. Bacteriol. 53:1701 (validation list);
Risk group: ?
Type strain: CAIM 634, LMG 20012, VIB 836
71-Name: Vibrio trachuri
Authors: Iwamoto et al. 1996
Status: Heterotypic Synonym
Literature: Int. J. Syst. Bacteriol. 46:625 (validation list);
Risk group: 2 (German classification)
Comment: synonymy: IJSEM 52:976*
Type strain: JCM 9677, T9210
Synonym: Vibrio harveyi
72-Name: Vibrio tubiashii
Authors: Hada et al. 1984
Status: New Species
Literature: Int. J. Syst. Bacteriol. 34:2
Risk group: 1 (German classification)
Type strain: ATCC 19109
MENEZES, F. G. R. Diversidade de Vibrio spp. em estuários no Estado do Ceará... 90
73-Name: Vibrio viscosus
Authors: Lunder et al. 2000
Status: Basonym
Literature: Int. J. Syst. Bacteriol. 50:447;
Risk group: ?
Type strain: NCIMB 23584, NVI 88/478
Synonym: Moritella viscosa
74-Name: Vibrio vulnificus
Authors: Farmer 1980
Status: New Combination
Literature: Int. J. Syst. Bacteriol. 30:656;
Risk group: 2 (German classification)
Type strain: ATCC 27562, DSM 10143
, IMET 11292
Synonyms: Beneckea vulnifica (basonym)
75-Name: Vibrio wodanis
Authors: Lunder et al. 2000
Status: New Species
Literature: Int. J. Syst. Bacteriol. 50:447;
Risk group: 2 (German classification)
Type strain: NCIMB 13582, NVI 88/441
76-Name: Vibrio xuii
Authors: Thompson et al. 2003
Status: New Species
Literature: Int. J. Syst. Bacteriol. 53:251;
Risk group: ?
Type strain: CAIM 467, LMG 21346
MENEZES, F. G. R. Diversidade de Vibrio spp. em estuários no Estado do Ceará... 91
ANEXO C – Prova de coloração de Gram (Soares et al., 1991)
Nesta prova são utilizadas cepas isoladas a partir de ágar triptona soja (TSA)
inclinado com 24 horas de incubação, onde são seguidos os passos descritos a seguir:
1- Inicialmente faz-se um esfregaço fino:
Com auxílio de uma pinça, tomar uma lâmina de microscópio imersa em álcool;
Colocar uma pequena gota de água destilada sobre a lâmina na parte central;
Retirar assepticamente, com uma agulha de inoculação, uma porção do crescimento
da cultura a ser analisada;
Espalhar a massa celular na gota e em seguida fixar a preparação, passando a
lâmina um pouco acima da chama do Bico de Bulsen (sem superaquecê-la).
2- Cobrir o esfregaço com cristal violeta por 1 minuto;
3- Lavar com água corrente;
4- Cobrir o esfregaço com lugol por 1 minuto;
5- Descorar com álcool 95%;
6- Lavar com água corrente;
7- Contra-corar com safranina 0,25% por 20 segundos;
8- Lavar com água corrente e secar, absorvendo a água com lenço de papel;
9- Observar ao microscópio óptico com objetiva de imersão.
OBS: Microrganismos Gram positivos: azuis ou violetas
Microrganismos Gram negativos: vermelhos
MENEZES, F. G. R. Diversidade de Vibrio spp. em estuários no Estado do Ceará... 92
ANEXO D – Meios de Cultura e Reagentes
1- SOLUÇÃO DE ÁGUA PETONADA ALCALINA (APA) 1% DE CLORETO DE
SÓDIO
- Peptona------------------------------------------------------------------10,0 g
- Cloreto de sódio--------------------------------------------------------10,0 g
- Água destilada---------------------------------------------------------1000 mL
Após a dissolução dos ingredientes, a solução foii distribuída em volumes
de 9 mL, em tubos 15 x 160mm, ou 225 mL em erlenmeyer. Esterilizados em
autoclave por 121°C por 15 minutos. Posteriormente, os mesmos foram
resfriados e mantidos em geladeira até o momento de sua utilização. O pH final
deste meio foi de 7,8 +/- 0,2.
2 – AGAR TRIPTONA-SOJA + 1% DE CLORETO DE SÓDIO (TSA)
O meio era preparado de acordo com as instruções do fabricante. Logo,
40g do produto desidratado eram dissolvidos em 1.000 mL de água destilada
acrescidos de 1 g de NaCl. A mistura era agitada e fervida até completa dissolução
e, em seguida, o meio era distribuído em volumes de 5 mL em tubos de 12 x 120
mm, e esterelizado em autoclave a 121°C por 15 minutos. Após a esterilização, os
tubos eram mantidos em posição inclinada até a solidificação do meio, de forma a
se ter uma base de aproximadamente 2 cm de altura e uma parte inclinada. Após
a solidificação do meio, eram mantidos em geladeira a 4°C. O pH final deste meio
foi de 7,8 +/- 0,2.
MENEZES, F. G. R. Diversidade de Vibrio spp. em estuários no Estado do Ceará... 93
3 - AGAR TIOSSULFATO-CITRATO-BILE-SACAROSE (TCBS- DIFICO)
De acordo com as recomendações do fabricante, foram dissolvidos por
aquecimento, 89,0 gramas do meio desidratado em 1000mL de água destilada. O
meio foi fervido até sua total dissolução. Em seguida, distribuído, ainda quente, em
volumes de 15 mL, aproximadamente, em placas de Petri esterilizadas e após sua
solidificação, as placas foram utilizadas. O pH final deste meio foi de 7,8 +/- 0,2.
4 - PROVA DA PRODUÇÃO DE CITOCROMO-OXIDASE:
- N,N,N´,N´ - tretametil-p-fenileno-diamina (SIGMA)----------------1,0 g
- Água destilada--------------------------------------------------------------100 mL
O reagente foi dissolvido em água e em seguida acondicionado em frasco
escuro e conservado em freezer.
5 – ÁGAR TRÍPLICE-AÇÚCAR-FERRO(TSI) + 1% CLORETO DE SÓDIO
-Ágar Tríplice-Açúcar-Ferro (TSI)--------------------------------------------65,0 g
- Cloreto de sódio-----------------------------------------------------------------1,0 g
-Água destilada------------------------------------------------------------------1000 mL
Os ingredientes foram dissolvidos por aquecimento até fervura e em
seguida o meio foi distribuído em porções de 5 mL em tubos de 12 x 120 mm,
sendo esterilizados em autoclave a 121°C por 15 minutos. Após a esterilização,
os tubos eram mantidos em posição inclinada até a solidificação do meio, de forma
a se ter uma base de aproximadamente 2 cm de altura e uma parte inclinada.
Após a solidificação do meio, eram mantidos em geladeira a 4°C. O pH final deste
meio foi de 7,8 +/- 0,2.
MENEZES, F. G. R. Diversidade de Vibrio spp. em estuários no Estado do Ceará... 94
6 - PROVA PARA HIDRÓLISE DA ARGININA E DESCARBOXILAÇÃO DA LISINA
E ORNITINA + 1% DE CLORETO DE SÓDIO.
Base
- Peptona----------------------------------------------------------------------5,0 g
- Extrato de Levedura------------------------------------------------------3,0 g
- Glicose-----------------------------------------------------------------------1,0 g
- Cloreto de sódio------------------------------------------------------------10 g
- Púrpura de Bromocresol-----------------------------------------------0,02 g
- Água destilada------------------------------------------------------------1000 mL
Para cada 1000 mL de caldo base adicione 1,25 g de L-lisina, L-arginina e
L-ornitina. Ajuste o pH para 7,8 com NaOH 1N. Distribua 5 mL em tubos com
rosca, identifique os tubos por grupos de aminoácidos e controle. Esterilize os
tubos com as tampas frouxas a 121°C por 10minutos. Aperte as tampas para
estocar a 4°C. Após inocular, adicione uma camada (1 mL) de óleo mineral estéril
em cada tubo. Incube a 35°C e examine diariamente durante 4 dias. Inicialmente a
coloração do meio muda de púrpura para amarelo. Se ocorrer a dascarboxilação
do aminoácido a coloração do meio volta para púrpura/violeta (alcalino) – reação
positiva. O pH final deste meio foi de 7,8 +/- 0,2.
7- CALDO TRIPTONA A 1,3,6,8 E 10% DE CLORETO DE SÓDIO (Prova do
Halofilismo)
- Caldo Triptona------------------------------------------------------------------10 g
-Cloreto de sódio--------------------------------------------------------10,30,60,80 e
100,0g
- Água destilada-------------------------------------------------------------------1000 mL
MENEZES, F. G. R. Diversidade de Vibrio spp. em estuários no Estado do Ceará... 95
Procedeu-se a dissolução da triptona e das respectivas concentrações de
cloreto de sódio em um determinado volume de água destilada. Posteriormente, os
volumes foram completados a 1000 mL pela adição de água destilada. Os meios
foram então, distribuídos em porções de 10,0 mL em tubos de 16 x 160mm e
autoclavados a 121°C por 15 minutos. Após o resfriamento foram estocados em
geladeira a 4°C. Paralelamente foi preparado o mesmo meio, porém sem adição
de cloreto de sódio. Ajustar pH para 7,8.
8 - TESTE DE VOGES-PROSKAUER (VP) + 1% de CLORETO DE SÓDIO
Segundo orientações do seu fabricante, 17,0 g do meio MR-VP desidratado
(DIFCO) e 10 g de cloreto de sódio foram dissolvidos em 1000 mL de água
destilada em porções de 5 mL em tubos de 15 x 150mm e, em seguida, a 121°C
por 15 minutos. Após o resfriamento foram estocados em geladeira a 4°C. O pH
final deste meio foi de 7,8 +/- 0,2.
9-TESTE DA HIDRÓLISE DO ORTO-NITROFENIO-Β – D-GALACTO-
PIRANOSÍDEO (ONPG):
- ONPG------------------------------------------------------------------------ 0,08g
- Água destilada------------------------------------------------------------- 15,0 mL
- Solução Fosfato monobásico 1M, pH 7 -------------------------------5,0 mL
Dissolva o ONPG em água destilada a 37°C. Adicione 5,0 mL da solução
de fostato monossódico. A solução deve ser incolor. Armazene em frasco escuro a
4°C. Antes de usar, aqueça parte da solução de ONPG a 37°C sufuciente para o
número de testes. Não reutilize a solução aquecida.
MENEZES, F. G. R. Diversidade de Vibrio spp. em estuários no Estado do Ceará... 96
10 - PROVA DE FERMENTAÇÃO DE CARBOIDRATOS:
Base
- Peptona-----------------------------------------------------------------------10,0 g
- Extrato de Carne-------------------------------------------------------------3,0 g
- Cloreto de sódio------------------------------------------------------------10,0 g
- Púrpura de Bromocresol-------------------------------------------------0,04 g
- Água destilada------------------------------------------------------------1000 mL
Para cada 1000 mL de caldo base adicione 5 g de manitol, manose,
arabinose, glicose, lactose e sacarose separadamento. Ajuste o pH para 7,8 com
NaOH 1N. Distribua 5 mL em tubos com rosca, identifique os tubos por grupos de
carboidratos e controle. Esterilize os tubos com as tampas frouxas a 121°C por 10
minutos. No caso dos carboidratos arabinose, e manose a esterilização deve ser
através de filtração. Em cada tubo de glicose deve ser adicionado antes de
esterilizar um tubo de Durhan. Após inocular, adicione uma camada (1 mL) de óleo
mineral estéril em cada tubo. Incube a 35°C e examine diariamente durante 7 dias.
A positividade da prova ocorre com a mudança do meio muda de púrpura para
amarelo. O pH final deste meio foi de 7,8 +/- 0,2.
11 – CALDO TRIPTONA-SOJA(TSB) + 1% DE CLORETO DE SÓDIO
- Caldo triptona-soja (TSB-DIFCO)---------------------------------------30,0 g
- Cloreto de sódio---------------------------------------------------------------1,0 g
- Água destilada-----------------------------------------------------------------1000 mL
Á água destilada foram adicionados os ingredientes e em seguida, quando
necessário, a mistura era aquecida até dissolução total dos ingredientes. O meio
foi distribuído em porções de 5,0 mL em tubos de ensaio 12 x 120 mm seguindo-
se à esterilização em autoclave por 121°C por 15 minutos. Após o resfriamento
foram estocados em geladeira a 4°C. O pH final deste meio foi de 7,8 +/- 0,2.
MENEZES, F. G. R. Diversidade de Vibrio spp. em estuários no Estado do Ceará... 97
12 - TESTE DE PRODUÇÃO DO INDOL
Foram dissolvidos por aquecimento, 36,0 g de meio SIM desidratado
(DIFCO) e 10 g de cloreto de sódio em 1000 mL de água destilada. Em seguida,
o meio foi distribuído em porções de aproximadamente, 4,0 mL em tubos de 12 x
120 mm seguindo-se à esterilização em autoclave por 121°C por 15 minutos.
Após a autoclavação os tubos foram mantidos em temperatura ambiente em
posição vertical, até a solidificação do meio. Em seguida, mantido em geladeira
até sua utilização. O pH final deste meio foi de 7,8 +/- 0,2.
13- PREPARO DO CORANTE CRISTAL VIOLETA (2%) (Coloração de Gram)
Modificado por Hucker
-Solução A: Cristal violeta (85% puro)---------------------------2,0 g
Álcool Etílico (95%)----------------------------------20 mL
-Solução B: Oxalato de amônio-----------------------------------0,8 g
Água destilada----------------------------------------80 mL
Misturar as soluções A e B.
14 – PREPARO DO CORANTE LUGOL (Coloração de Gram)
- Iodo cristalizado------------------------------------------------------------1,0 g
- Iodeto de potássio---------------------------------------------------------2,0 g
- Água destilada--------------------------------------------------------------300 mL
MENEZES, F. G. R. Diversidade de Vibrio spp. em estuários no Estado do Ceará... 98
15 – PREPARO DO CORATNE SAFRANINA (0,25 %) (Coloração de Gram)
- Safranina (2,5% em álcool a 96%)------------------------------------10 mL
- Água destilada--------------------------------------------------------------100mL
16- Reagentes do VP (ICMSF, 1978)
1 - Solução alcoólica de alfa-naftol a 5%
Foram dissolvidos 5,0 g de alfa-naftol (Merck) em 100 mL de álçcool
absoluto. O reagente foi acondicionado em frasco escuro e mantido a temperatura
ambiente.
2- Solução aquosa de hidróxido de potássio a 40%
Foram dissolvidos 40,0g de hidróxido de potássio (Merck) em 100 mL de
água destilada. O reagente foi acondicionado em frasco escuro e conservado a
temperatura ambiente.
17- Reagente ONPG – Solução de Fosfato Monossódico 1,0 pH 7,0
- NaH
2
PO
4.
H
2
O-----------------------------------------------------------------6,9 g
- Água destilada---------------------------------------------------------------45,0 mL
Em 30 g de NaOH em balão volumérico adicione 100 mL de água
destilada. Antes de adicionar a água coloque o balão em banho com gelo para
evitar o superaquecimento.
Dissolva o NaH
2
PO
4.
H
2
O em 45 mL de água destilada. Adicione 3 mL da
solução de NaOH a 30% e ajuste para o pH 7,0. Complete o volume para 50 mL
com água destilada. Armazene a 4°C.
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