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UFRRJ
INSTITUTO DE AGRONOMIA
CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FITOTECNIA
TESE
Caracterização e Uso de Bactérias Diazotróficas
Isoladas de Diferentes Cultivares de Arroz
Originárias do Estado do Maranhão
Antonio Edilson da Silva Araújo
2008
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UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DO RIO DE JANEIRO
INSTITUTO DE AGRONOMIA
CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FITOTECNIA
CARACTERIZAÇÃO E USO DE BACTÉRIAS DIAZOTRÓFICAS
ISOLADAS DE DIFERENTES CULTIVARES DE ARROZ
ORIGINÁRIAS DO ESTADO DO MARANHÃO
ANTONIO EDILSON DA SILVA ARAÚJO
Sob a Orientação do Professor
José Ivo Baldani
e Co-orientação da Professora
Vera Lúcia Divan Baldani
Tese submetida como requisito
parcial para obtenção do grau de
Doutor em Ciências, no Curso de
Pós-Graduação em Fitotecnia,
Área de Concentração em
Agroecologia
Seropédica, RJ
Fevereiro de 2008
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UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DO RIO DE JANEIRO
INSTITUTO DE AGRONOMIA
CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FITOTECNIA
ANTONIO EDILSON DA SILVA ARAÚJO
Tese submetida como requisito parcial para obtenção do grau de Doutor em Ciências, no
Curso de Pós-Graduação em Fitotecnia, área de Concentração em Agroecologia.
TESE APROVADA EM 19/02/2008
_________________________________________________
Jose Ivo Baldani. Dr. CNPAB
(Orientador)
_________________________________________________
Manlio Silvestre Fernandes. Dr. UFRRJ
_________________________________________________
Agostinho Dirceu Didonet. Dr. CNPAF
_________________________________________________
Norma Gouvêa Rumjanek. Dr. CNPAB
_________________________________________________
Altamiro Souza de Lima Ferraz Junior. Dr. UEMA
AGRADECIMENTOS
A DEUS.
Aos meus orientadores Jose Ivo Baldani e Vera Lúcia Divan Baldani, pela
oportunidade, orientação, dedicação e pelo privilegio de fazer parte de sua equipe de pesquisa.
Ao Curso de Pós-Graduação em Fitotecnia (CPGF), pela oportunidade concedida.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pela
bolsa de doutorado concedida.
À Embrapa Agrobiologia (CNPAB), pelas condições oferecidas para e realização
deste trabalho.
À Professora Claudia Antonia Vieira Rossetto, pelo apoio, incentivo, atenção e
ensinamentos.
À Embrapa Meio-Norte, na pessoa do Dr. José Almeida Pereira, pela contribuição na
realização deste trabalho.
Aos amigos da Embrapa Agrobiologia, Liamara Perin, Daniele Cristina, Joilson
Ferreira, Elisete Rodrigues, Ricardo Alexandre, Marinete Flores, Salomão Guimarães, Sandy
Videira, pelo auxílio, momentos de alegria e agradável convívio.
Aos funcionários da Agrobiologia, Luis Carlos, Wilson Cabral, Antonio Lúcio,
Geraldo Baeta, pela disponibilidade, atenção e boa vontade nos serviços prestados.
Aos meus pais, Francisco Matias Araújo e Maria Madalena da Silva Araújo, pelo
esforço, apoio, incentivo, compreensão e por sempre valorizarem a educação.
Aos meus irmãos, em especial à Francisca e Ednaldo, pela confiança e por me ajudar a
manter o equilíbrio emocional durante o curso.
Aos meus amigos do Curso de Pós-Graduação em Fitotecnia, pela amizade e
companheirismo.
A todos que me ajudaram ao longo do desenvolvimento deste trabalho.
BIOGRAFIA DO AUTOR
Antonio Edilson da Silva Araújo; nasceu na cidade de Timbiras, MA, em 17 de julho
de 1973, filho de Francisco Matias Araújo e Maria Madalena da Silva Araújo, tornou-se
Técnico em Agropecuária, em 1995, após concluir o segundo grau na Escola Agrotécnica
Federal de São Luiz. Em 1996, ingressou no curso de Engenharia Agronômica pela
Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, concluindo-o em setembro de 2001. Neste
período, foi bolsista de Iniciação Científica no Departamento de Fitotecnia do Instituto de
Agronomia. Em março de 2002, ingressou no Curso de Mestrado em Fitotecnia pela mesma
Universidade. Defendeu sua dissertação intitulada “Avaliação da Qualidade Sanitária e
Fisiológica em Sementes de Amendoim (Arachis hypogaea L.)” em fevereiro de 2004, no
mesmo ano ingressou no curso de Doutorado em Fitotecnia pela Universidade Federal Rural
do Rio de Janeiro, desenvolvendo o seu projeto de tese nas dependências da Embrapa
Agrobiologia.
RESUMO
ARAÚJO, Antonio Edilson da Silva. Caracterização e uso de bactérias diazotróficas
isoladas de diferentes cultivares de arroz originárias do estado do Maranhão. 2008. 93p.
Tese (Doutorado em Fitotecnia, Agroecologia). Instituto de Agronomia, Departamento de
Fitotecnia, Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Seropédica, RJ, 2008.
Diversos trabalhos têm mostrado que a cultura do arroz pode se beneficiar da
associação com bactérias diazotróficas. Entretanto, a fixação biológica de nitrogênio (FBN)
em arroz é dependente de uma interação complexa entre as plantas, os microrganismos e o
ecossistema. Este trabalho teve como objetivo geral avaliar a contribuição da FBN em
variedades tradicionais de arroz do estado do Maranhão. Como objetivos específicos: a- isolar
e caracterizar bactérias diazotróficas nativas de solo cultivado com arroz no estado do
Maranhão; b- selecionar as bactérias mais eficientes quanto ao acúmulo de biomassa e
produção de grãos; c- verificar se existe relação entre a FBN e o teor de proteínas nos grãos.
Para o isolamento foi utilizada como “planta isca” as cultivares IR42 e Diamante e mais duas
variedades tradicionais de arroz do Maranhão Zebu Branco e Manteiga, crescidas em
amostras de solo, provenientes de três municípios do Maranhão, sendo uma de terras altas
(Bacabal) e duas de área de baixada (Arari e Vitoria do Mearim). Amostras de raízes, colmos
e folhas foram maceradas e inoculadas em meios semi-sólidos semi-seletivos, NFB, JNFB,
LGI, LGIP e JMV, sem adição de nitrogênio. Foram obtidos 304 isolados que foram
classificados morfologicamente como pertencentes às espécies Azospirillum amazonense,
Azospirillum lipoferum, Azospirillum brasilense, Herbaspirillum spp. e Burkholderia spp.,
além de um grupo não identificado. A diversidade genética dos isolados foi avaliada por meio
da amplificação da região 16S DNAr por meio da reação da polimerase em cadeia (PCR) e da
digestão dos produtos de amplificação com enzimas de restrição (ARDRA). O perfil de
fragmentos de restrição confirmou o gênero da maioria dos isolados, além disso, mostrou alta
diversidade, principalmente para os isolados bacterianos caracterizados morfologicamente
como Burkholderia. Isolados representantes dos diferentes grupos foram testados em
condições gnotobióticas, em vasos e em campo, em diferentes variedades procedentes do
Maranhão utilizando-se também duas cultivares como controle. Foi observado que entre os
isolados testados, AR1122 de Herbaspirillum sp. e AR3122 de A. amazonense apresentaram
maior potencial para promover o crescimento das plantas e aumentar a produção de grãos na
cultura do arroz.
Palavras-chave: Fixação biológica de nitrogênio, diversidade microbiana, isolamento.
ABSTRACT
ARAÚJO, Antonio Edilson da Silva. Characterization and use of diazotrophic bacteria
isolated from different rice cultivars originated from Maranhão State. 2008. 93p. Thesis
(Doctor in Fitotecny, Agrobiology). Instituto de Agronomia, Departamento de Fitotecnia,
Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Seropédica, RJ, 2008.
Several works have shown that rice crop can benefit from the association with
diazotrophic bacteria. However, the biological nitrogen fixation (BNF) in rice is dependent of
a complex interaction among the plants, microorganisms and the ecosystem. The general
objective of this work was to evaluate the contribution of BNF in varieties of rice originated
from the State of Maranhão. The specific objectives were: a- To isolate and characterize
native diazotrophic bacteria originated from soil cultivated with rice in Maranhão; b- to select
the most efficient bacteria in relation to dry matter accumulation and grain yield; c- to study
the relationship between FBN and the teor of proteins in the grains. For the isolation was used
two rice varieties (IR42 and Diamante) and two traditional rice varieties of Maranhão (Zebu
Branco and Manteiga), grown in soil samples originated from three districts of Maranhão,
being one of high lands (Bacabal) and two of lowland area (Arari and Vitoria do Mearim).
Samples of roots, stems and leaves were grounded and inoculated in nitrogen free semisolid
semiselective media: NFB, JNFB, LGI, LGIP and JMV. Around 304 isolates were obtained
and classified as belonging to the species Azospirillum amazonense, Azospirillum lipoferum
and Azospirillum brasilense, Herbaspirillum spp. and Burkholderia spp and a non identified
group that was clustered based only in the morphological characteristics. The genetic diversity
of the isolates was evaluated through the amplification of 16S DNAr subunit using the
Polymerize Chain Reaction (PCR) technique and digestion of the amplified products with
restriction enzymes (ARDRA). Restriction fragment profiles confirmed the identity of most of
the isolated and showed high diversity mainly for the bacterial isolates characterized as
Burkholderia. Isolates representative from the different groups were tested in gnotobiotic
conditions, in pots and in the field using different rice varieties originated from the Maranhão
State. Two other cultivars were used as controls. It was observed that among the isolates
tested, the Azospirillum amazonense AR3122 and Herbaspirillum sp AR1122 howed potential
to promote growth of rice plants and to increase the grain yield of this crop.
Keys words: Biological nitrogen fixation, Microbial diversity, Isolation
LISTA DE ABREVIAÇÕES
AIA Ácido indol acético
ARDRA Análise de Restrição da Região 16S DNAr AMplificada
ARA Atividade da Redução de Acetileno
CNPAB Centro Nacional de Pesquisa em Agrobiologia
DNAr DNA ribossomal
dNTPs Desoxinucleotídeos trifosfatados
FBN Fixação Biológica de Nitrogênio
NMP Número Mais Provável
nif Gene que codifica a nitrogenase
PCR Reação em Cadeia da Plomerase
r.p.m. Rotações por minuto
TAE Tris, Acetato, EDTA
TE Tampão Tris, EDTA
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO GERAL ............................................................................................... 1
1.1 Arroz: Importância Econômica ..................................................................................... 1
1.2 O Arroz no Estado do Maranhão ................................................................................... 2
1.3 Diversidade de Bactérias Diazotróficas Associadas às Plantas de Arroz ...................... 3
1.3.1 O gênero Azospirillum ................................................................................................ 4
1.3.2 O gênero Herbaspirillum ............................................................................................ 4
1.3.3 O gênero Burkholderia ............................................................................................... 5
1.4 Colonização e Estabelecimento Endofítico de Bactérias Diazotróficas em Arroz ........ 5
1.4.1 Colonização por Azospirillum spp. ............................................................................. 6
1.4.2 Colonização por Herbaspirillum spp. ......................................................................... 6
1.4.3 Colonização por Burkholderia spp. ............................................................................ 7
1.4.4 Colonização por Azoarcus spp. .................................................................................. 7
1.4.5 Colonização por Rizobium spp. .................................................................................. 8
1.5 Fixação Biológica de Nitrogênio Atmosférico (FBN) em Arroz .................................. 8
1.6 Fatores que Influenciam a Fixação Biológica de Nitrogênio na Cultura do Arroz ....... 8
1.7 Avaliação da Fixação Biológica de Nitrogênio ............................................................. 10
2 CAPÍTULO I. ISOLAMENTO E CARACTERIZAÇÃO DE BACTÉRIAS
DIAZOTRÓFICAS NATIVAS DO ESTADO DO MARANHÃO ............................. 13
2.1 Resumo .......................................................................................................................... 14
2.2 Abstract .......................................................................................................................... 15
2.3 Introdução ...................................................................................................................... 16
2.4 Material e Métodos ........................................................................................................ 17
2.4.1 Isolamento e contagem de bactérias diazotróficas ..................................................... 17
2.4.2 Caracterização morfológica ........................................................................................ 18
2.4.3 Caracterização molecular ........................................................................................... 18
2.4.4 Determinação da atividade de redução do acetileno (ARA) ...................................... 19
2.4.5 Produção de compostos indólicos .............................................................................. 19
2.5 Resultados e Discussão .................................................................................................. 20
2.5.1 Isolamento e contagem de bactérias diazotróficas em arroz ...................................... 20
2.5.2 Determinação da atividade de redução do acetileno (ARA) de culturas bacterianas
in vitro ........................................................................................................................ 23
2.5.3 Determinação da Produção de Ácido Indol-Acético (AIA) in vitro ........................... 23
2.5.4 Diversidade genética dos isolados .............................................................................. 24
2.5.4.1 Isolados caracterizados morfologicamente como Herbaspirillum spp. ................... 24
2.5.4.2 Isolados caracterizados morfologicamente como Azospirillum spp. ....................... 28
2.5.4.3 Isolados caracterizados morfologicamente como Azospirillum amazonense .......... 30
2.5.4.4 Isolados caracterizados morfologicamente como Burkholderia spp. ...................... 32
2.5.4.5 Isolados caracterizados morfologicamente como não identificados ....................... 36
2.6 Conclusões ..................................................................................................................... 39
3 CAPÍTULO II. AVALIAÇÃO DO EFEITO DA INOCULAÇÃO DE BACTÉRIAS
DIAZÓTROFICAS NA PRODUÇÃO DE GRÃOS EM DIFERENTES
CULTIVARES DE ARROZ TRADICIONAIS ........................................................... 40
3.1 Resumo .......................................................................................................................... 41
3.2 Abstract .......................................................................................................................... 42
3.3 Introdução ...................................................................................................................... 43
3.4 Material e Métodos ........................................................................................................ 44
3.4.1 Avaliação preliminar das variedades e cultivares utilizadas para seleção de estirpes ... 44
3.4.2 Seleção de estirpes em condições gnotobióticas ........................................................ 45
3.4.3 Seleção de estirpes em condições de vasos e em campo ............................................ 46
3.4.3.1 Experimento em vasos ............................................................................................. 46
3.4.3.2 Experimento em campo ........................................................................................... 47
3.5 Resultados e Discussão .................................................................................................. 48
3.5.1 Avaliação de características agronômicas das variedades e cultivares utilizadas para
a seleção de estirpes .................................................................................................... 48
3.5.2 Avaliação e seleção de isolados de bactérias diazotróficas em associação com
diferentes variedades de arroz crescidas em condições gnotobióticas ....................... 50
3.5.3 Experimento de arroz cultivado em vasos com terra e inoculado com isolados
previamente selecionados ........................................................................................... 51
3.5.4 Avaliação do efeito da inoculação com bactérias diazotróficas em diferentes
variedades de arroz cultivadas em condições de campo ............................................. 56
3.6 Conclusões ..................................................................................................................... 57
4 CAPÍTULO III. EFEITO DA INOCULAÇÃO COM BACTÉRIAS
DIAZOTRÓFICAS NA GERMINAÇÃO E VIGOR DE SEMENTES ARROZ ..... 58
4.1 Resumo .......................................................................................................................... 59
4.2 Abstract .......................................................................................................................... 60
4.3 Introdução ...................................................................................................................... 61
4.4 Material e Métodos ........................................................................................................ 61
4.5 Resultados e Discussão .................................................................................................. 63
4.6 Conclusões ..................................................................................................................... 66
5. CONCLUSÕES GERAIS .............................................................................................. 67
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ......................................................................... 68
ANEXOS ............................................................................................................................. 80
1
1 INTRODUÇÃO GERAL
1.1 Arroz: Importância Econômica
O gênero Oryza, pertence à família Poaceae (gramineae) e engloba cerca de 23
espécies. Duas formas silvestres são apontadas na literatura como precursoras do arroz
cultivado: a espécie Oryza rufipogon, procedente da Ásia, originando a espécie Oryza sativa;
e a espécie Oryza barthii (= Oryza breviligulata), derivada da África Ocidental, dando origem
à espécie Oryza glaberrima. A espécie O. glaberrima caracteriza-se por não apresentar
ramificações na panícula, pericarpo vermelho e lígulas mais curtas. Já a espécie O. sativa
caracteriza-se por apresentar ramificações secundárias nas panículas, espiguetas persistentes
no pedicelo e lígulas com até 10 mm de comprimento (PEREIRA, 2002).
A espécie O. sativa, devido a sua grande aceitação como alimento se dispersou pelo
mundo todo, e é considerada uma espécie polifilética resultante do cruzamento de formas
espontâneas variadas. Ao longo do tempo, foram surgindo inúmeros tipos geneticamente
divergentes que foram se adaptando às mais variadas condições agroecológicas. Atualmente
esta espécie encontra-se subdividida em três subespécies indica, japonica e javanica
(PEREIRA, 2002).
O arroz (Oryza sativa L.) é o principal alimento para mais da metade da população
mundial (YOKOYAMA et al., 1999). É o segundo cereal mais consumido no mundo,
atendendo a grande parte da necessidade protéica e calórica da população (DE DATTA et al.,
1987). Atualmente, cerca de 90% do volume mundial deste cereal é produzido e consumido
na Ásia. É considerado pela FAO (Food and Agriculture Organization of the United Nations)
como o alimento mais importante para a segurança alimentar do mundo, por ser uma cultura
muito rústica e adaptada às mais diversas condições edafoclimáticas. É o único cereal que
pode ser cultivado em solos inundados, sendo considerada a espécie com maior potencial de
aumento de produção para o combate da fome no mundo. Além disso, contem um excelente
balanceamento nutricional, e pode fornecer 20% da energia e 15% das proteínas necessárias
ao homem e se destaca pela sua fácil digestão.
O Brasil se destaca como o principal produtor de arroz entre os países ocidentais.
Apesar das reduções de produção em algumas safras nos últimos anos, devido às adversidades
climáticas, a produção brasileira de arroz vem apresentando uma tendência de crescimento,
em função, principalmente, do constante incremento de produtividade (FAO, 2006). De
acordo com dados da CONAB (2008), na safra 2006/07, o arroz foi plantado em
aproximadamente 2.976 milhões de hectares no país, produzindo cerca de 11,1 milhões de
toneladas com uma produtividade média de 3.865 quilos por hectare.
Durante muitos anos o Brasil foi um país exportador de arroz, na década de 80 passou
a importar pequenas quantidades e, a partir de 1990, se tornou um dos principais importadores
deste cereal, importando principalmente do Uruguai e da Argentina, que responderam por
cerca de 85 a 90% das importações brasileiras (EMBRAPA, 2007). Nos últimos anos, o
consumo brasileiro de arroz vem aumentando num ritmo bem inferior ao crescimento da
produção devido a uma gradual redução do consumo per capita do cereal, como conseqüência
de uma série de modificações nos padrões e hábitos de consumo de alimentos da população
brasileira. No entanto, CASSUCE et al. (2006) estudando a oferta e a demanda de produtos
agrícolas no Brasil e considerando três cenários econômicos entre 2008 e 2012, observaram
que a demanda de arroz será maior que a oferta nesse período.
2
1.2 O Arroz no Estado do Maranhão
O arroz é uma das plantas cultivadas mais antigas do mundo, e sua história se
confunde com a própria trajetória humana. Originário do sudeste da Ásia foi, provavelmente,
a primeira planta cultivada na Ásia. O arroz se dispersou pelo mundo inteiro. Foram,
provavelmente, os portugueses que introduziram esse cereal na África Ocidental, e os
espanhóis, os responsáveis pela sua disseminação nas Américas (EMBRAPA, 2007).
No Brasil, a história do arroz remonta a época do descobrimento, entretanto, naquela
época já ocorriam no país algumas espécies silvestres. No Maranhão, a introdução do arroz
ocorreu no século XVII. Entretanto não é possível se determinar com precisão o ano em que o
arroz foi introduzido no Maranhão. Neste estado, o arroz vermelho foi a única variedade
cultivada até 1766 quando foi substituída pelo arroz branco da Carolina. Entre os anos de
1768 e 1777, o arroz era o único cereal exportado pelo Brasil, sendo o Maranhão o maior
produtor colonial (PEREIRA, 2002). Até o final do século XIX, a produção de arroz no
estado sofreu oscilações. A partir da primeira metade do século XX, houve uma elevação na
produção do arroz e em 1945 o Maranhão era o nono estado maior produtor (PEREIRA,
2002). As regiões mais produtoras eram a Baixada Maranhense e na região de Bacabal, onde
o cultivo era realizado por pequenos produtores espalhados pelas inúmeras roças na região
(CANEDO, 1993). De 1945 até 1982, a cultura do arroz experimentou um crescimento
constante e atingiu seu ápice em 1982, com a expansão da fronteira agrícola do Estado por
meio da abertura de áreas agrícolas ao Sul. Nesta ocasião, o Maranhão foi o terceiro maior
produtor, perdendo somente para o Rio Grande do Sul e para Goiás. Porém, a partir deste ano,
as áreas tradicionais de cultivo de arroz nos vales dos principais rios, além da baixada
maranhense foram sendo substituídas pela pecuária bovina, passando a cultura do arroz a
ocupar áreas marginais (PEREIRA, 2002).
Há 20 anos, a produção de arroz no Maranhão vem diminuindo a uma taxa de 2,7% ao
ano (MENDEZ DEL VILLAR et al., 2001). Segundo dados da Compania Nacional de
Abastecimento (CONAB), na safra 2006/07, com a segunda maior área plantada do país, o
Maranhão ocupa a quarta posição entre os maiores produtores de arroz do país, atrás do Rio
Grande do Sul, Santa Catarina e Mato Grosso. A produtividade de arroz no Maranhão foi
sempre considerada muito baixa, atualmente em torno de 1.390 kg ha
-1
(CONAB, 2008). A
baixa produtividade é atribuída ao fato do arroz ser produzido por pequenos agricultores,
cujas propriedades rurais, cerca de 85%, têm menos de 100 hectares. 52% da produção é
oriunda de lavouras destas propriedades que têm como característica um forte auto-
abastecimento e baixo emprego de tecnologia, utilizando técnicas rudimentares de cultivo, a
chamada roça em toco, sem preparo do solo nem adubação (MENDEZ DEL VILLAR et al.,
2001).
Os ecossistemas de cultivo de arroz no Brasil estão classificados em “de várzea” e “de
terras altas”, os quais, se subdividem em: a) sistema irrigado por inundação; b) sistema com
irrigação não controlada; c) sistema de várzea úmida; d) sistema de sequeiro tradicional; e, e)
sistema de sequeiro sob irrigação suplementar por aspersão (GUIMARÃES e SANTANA,
1999). Dentre estes sistemas, o sistema irrigado por inundação, predominante nos estados do
Rio Grande do Sul e Santa Catarina, respondem por 60% da produção nacional, embora não
seja o que ocupa a maior área plantada no país. Por outro lado, o sistema de sequeiro
tradicional, caracterizado pela total dependência de água das chuvas, ocupa a maior área
anualmente plantada com arroz no país, no entanto, tem menor expressão em termos de
volume de produção (PEREIRA, 2002).
No Maranhão se encontram todos os sistemas de cultivo, no centro-norte predomina a
roça no toco, sistema de sequeiro tradicional, que é praticado pela maioria dos pequenos
produtores. Na microrregião baixada maranhense, também se encontra, em menor escala, o
3
cultivo do arroz em sistema irrigado, possuindo associações de produtores que utilizam mão-
de-obra familiar e também médios produtores. Os custos de produção mais elevados são
compensados pela maior produtividade e preço de comercialização mais alto. A colheita é
mecanizada ou manual, dependendo da extensão da propiedade (MENDEZ DEL VILLAR et
al., 2001).
Já no Sul do Maranhão, em algumas fazendas o sistema de produção se assemelha
mais ao do Centro-Oeste do país. São extensas áreas plantadas, 80 a 3.500 ha, com uso
intensivo de tecnologia e macanização em todas as fases do cultivo e pós-colheita, tratores,
implementos, colheitadeiras, secadores, variedades de maior aceitação pelo mercado e grande
utilização de insumos. A produção atende ao mercado local e, também é vendida para outros
estados (MENDEZ DEL VILLAR et al., 2001).
No Maranhão, as cultivares utilizadas variam segundo o tipo de cultivo. Os grandes
produtores utilizam cultivares com grãos do tipo longo que as mesmas cultivares
recomendadas para o Centro Oeste que tem melhor aceitação pelo mercado consumidor e
adquirem suas sementes no Mato Grosso e Goiás. Esses genótipos não são obrigatoriamente
adaptados às condições técnicas e nem às condições do mercado local, enquanto que os
pequenos produtores geralmente utilizam as sementes produzidas na safra anterior.
Os pequenos produtores, que não utilizam mecanização, plantam variedades comuns
da região que apresentam grãos redondos e curtos. Visando mudar o costume de reutilizar as
sementes do ano anterior, o governo do estado tem comprado variedades testadas pela
pesquisa dos estados de Mato Grosso e Goiás. No entanto, essas cultivares se mostraram
inadequadas às condições de cultivo, pois necessitam de fertilizantes que não são usados pelos
pequenos produtores o que resulta em rendimentos muito baixos. Além disso, as plantas de
menor porte dificultam a colheita manual (MENDEZ DEL VILLAR et al., 2001). Em função
do costume do agricultor de guardar sua própria semente, no estado do Maranhão se encontra
o maior número de variedades tradicionais de arroz do Brasil. Essas variedades, conservadas
pelo agricultor tradicional, geração após geração, representam um patrimônio genético de
importância fundamental para o futuro do melhoramento da cultura do arroz
(FONSECA et al., 1982).
1.3 Diversidade de Bactérias Diazotróficas Associadas às Plantas de Arroz
Uma diversa comunidade de bactérias fixadoras de nitrogênio tem sido isolada de
plantas de arroz, principalmente, àquelas pertencentes aos gêneros Azospirillum,
Herbaspirillum e Burkholderia (BALDANI e DOBEREINER, 1980; BALDANI et al., 1986,
2000; ENGELHARD et al., 2000). Outros gêneros bacterianos, embora menos comuns, têm
sido constatados em associação com plantas de arroz tais como Clostridium (KENNEDY e
TCHAN, 1992), Azotobacter (KAMUNGO et al., 1997), Azoarcus, Klebsiella, Sphingomonas
e Azorhizobium (ENGELHARD et al., 2000), Corynebacterium flavescens e Bacillus pumilus
(BACILIO-JIMÉNEZ et al., 2001), Serratia marcescens (GYANESHWAR et al., 2001) e
Gluconacetobacter diazotrophicus (MUTHUKUMARASAMY et al., 2005).
As bactérias que colonizam plantas não leguminosas podem ser divididas em três
grupos: bactérias de rizosfera e de vida livre, que inclui todos os microrganismos que
colonizam as raízes superficialmente, tais como, Azotobacter, Beijerinckia, Derxia e
Paenebacillus; bactérias associativas, capazes de colonizar as raízes externa e internamente
que são as do gênero Azospirillum; e, bactérias endofíticas, que colonizam o interior dos
tecidos das raízes e da parte aérea e que não causam prejuízo visível nas plantas que são,
Herbaspirillum, Gluconacetobacter, Azoarcus e Burkholderia (BALDANI et al., 1997). Em
geral a diversidade de bactérias encontrada na superfície e no interior das raízes de arroz é
maior do que aquela do não rizosférico devido a uma variedade de compostos orgânicos
4
liberados pelas raízes que podem ser utilizados como fonte de energia e carbono
(MUTHUKUMARASAMY et al., 2007).
Nos sistemas agrícolas, as bactérias de vida livre são limitadas pela disponibilidade de
fontes de carbono no solo. MUTHUKUMARASAMY et al. (2007) observaram que a
aplicação continua de matéria organica em solo cultivado com arroz, aumenta a população de
bactéias diazotróficas no solo, além de reduzir o efeito inibitório da aplicação de altas doses
de nitrogênio no solo na população destas bactérias. Acredita-se que bactérias diazotróficas
endofíticas por não sofrerem limitação de substâncias ricas em carbono, estarem livres de
competição com outros microrganismos e poderem transferir mais eficientemente os
compostos nitrogenados produzidos, possam ser responsáveis por disponibilizar uma
quantidade significativa de nitrogênio fixado para a planta (BALDANI et al., 2002). A
associação de bactérias endofíticas com arroz e não espécifaca e a dentro dos tecidos vegetal é
baixa (MALARVIZHI e LADHA, 1999). Dentre essas bactérias as mais estudadas para a
cultura de arroz são Azospirillum spp., Herbaspirillum spp. e Burkholderia spp.
1.3.1 O gênero Azospirillum
Bactérias do gênero Azospirillum são heterotróficas capazes de fixar nitrogênio
atmosférico. Dentre as bactérias diazotróficas as do gênero Azospirillum são as mais
estudadas, as espécies desse gênero são do tipo bastonete móvel, aeróbicas heterotróficas que
fixam nitrogênio em condições microaerofílicas (KENNEDY et al., 2004). Nove espécies
estão atualmente descritas: Azospirillum largimobile, Azospirillum lipoferum, Azospirillum
brasilense, Azospirillum amazonense, Azospirillum halopraeferans, Azospirillum irakense,
Azospirillum doebereinerae, Azospirillum oryzae, Azospirillum melinis, Azospirillum
canadense (DÖBEREINER et al., 1995; XIE e YOKOTA, 2005; PENG et al., 2006;
MEHNAZ et al., 2007). São usualmente consideradas rizosféricas, colonizando
predominantemente a superfície das raízes, sendo que algumas estirpes são capazes de
infectar e colonizar o interior dos tecidos de muitos cereais (BALDANI et al., 1997). A
distribuição ecológica de Azospirillum spp. é ampla podendo ser encontrada colonizando
plantas em todo o mundo, tanto em clima tropical quanto em clima temperado (PATRIQUIN
et al., 1983).
Bactérias pertencentes ao gênero Azospirillum apresentam motilidade e quimiotaxia
para ácidos orgânicos, açúcares, aminoácidos e compostos aromáticos bem como para
exudados de raízes, o que torna essas bactérias capazes de se mover para condições favoráveis
de nutrientes na rizosfera da planta, onde se beneficiam dos exudados da planta como fonte de
carbono e energia para multiplicação e colonização da planta (STEENHOUDT e
VANDERLEYDEN, 2000). Dentre as espécies de Azospirillum, A. lipoferum, e A. brasilense
são as mais estudadas, e as que têm sido isoladas da raiz e da parte aérea de plantas de arroz
(JAMES, 2000).
1.3.2 O gênero Herbaspirillum
Bactérias do gênero Herbaspirillum são bastonetes curvos, gram negativas, em forma
de espiral, geralmente vibróides, algumas vezes helicoidais. Em placas de meio JNFB as
colônias são inicialmente pequenas e brancas, tornando-se azulada no centro após uma
semana de incubação. Membro da subdivisão β das Proteobactérias, estes organismos são
aeróbios, não fermentam açúcares e fixam nitrogênio em condições microaerofílicas e foram
primeiramente isoladas de milho, arroz e sorgo (BALDANI et al., 1986). Posteriormente
foram também isoladas de outras gramíneas (OLIVARES et al. 1996, JAMES, 2000) e de
plantas não leguminosas, como abacaxizeiros e bananeiras (CRUZ et al., 2001). Bactérias do
5
gênero Herbaspirillum apresentam baixa capacidade de sobrevivência no solo, não podendo
ser re-isoladas do solo após 30 dias, confirmando sua natureza endofítica, no entanto, podem
permanecer no solo em um estado de latência, não podendo ser cultivadas em meio de cultura
(OLIVARES et al., 1996). Este gênero possui nove espécies descritas, sendo que, apenas H.
seropedicae, H. rubrisubalbicans e H. frisingense fixam nitrogênio em associação com
plantas não leguminosas.
1.3.3 O gênero Burkholderia
O gênero Burkholderia compreende mais de 50 espécies, sendo que poucas delas são
capazes de fixar nitrogênio como Burkholderia vietnamiensis, Burkholderia kururiensis,
Burkholderia tuberum, Burkholderia phynatum, Burkholderia tropica, Burkholderia unamae,
Burkholderia xenovorans, Burkholderia phytofirmans e Burkholderia terrae (ESTRADA-DE
LOS SANTOS et al., 2001; VANDAMME et al., 2002; REIS JUNIOR et al., 2004). O gênero
Burkholderia apresenta características endofíticas, apresenta ampla distribuição geográfica e
coloniza diversas plantas como arroz, cana-de-açúcar, sorgo, milho, trigo. B. vietnamiensis,
foi isolada da rizosfera de raízes de plantas de arroz cultivadas no Vietnã e é, provavelmente,
a espécie predominante entre as espécies de Burkholderia em arroz. RODRIGUES et al.
(2006) observaram maior número de bactérias diazotróficas endofíticas, do gênero
Burkholderia do que do gênero Herbaspirillum isoladas de duas variedades de arroz, IR42 e
IAC4440, sendo que a B. vietnamiensis foi a espécie predominante.
1.4 Colonização e Estabelecimento Endofítico de Bactérias Diazotróficas em Arroz
A infecção das raízes por bactérias diazotróficas é uma condição essencial para o
estabelecimento de uma associação eficiente entre as bactérias e as plantas hospedeiras.
Conhecimentos básicos em colonização das raízes pelos microrganismos são importantes para
manipular a microflora da raiz com o objetivo de obter benefícios para a cultura, já que estes
benefícios dependem de uma colonização efetiva, infecção e estabelecimento das bactérias
nos tecidos das plantas e expressão de genes (JAMES et al., 2002; RONCATO-MACCARI et
al., 2003b).
Bactérias diazotróficas têm a capacidade de infectar e colonizar plantas de arroz e se
estabelecer nos espaços intercelures do córtex, xilema e aerênquima
(KENNEDY et al., 2004). A infecção e colonização das plantas é um processo dinâmico que
envolve a movimentação das bactérias em direção a planta hospedeira, sua adesão à superfície
das plantas e posterior penetração e multiplicação no seu interior (STEENHOUDT e
VANDERLEYDEN, 2000).
A movimentação dos microrganismos em direção às raízes ocorre quando existe um
reconhecimento químico, quimiotaxia. Inicialmente ocorre uma adsorção reversível, e em
seguida uma ancoramento irreversível, controlado por proteínas extracelulares de origem
bacteriana. Esta etapa é comandada por sinais moleculares emitidos pelas raízes da planta
hospedeira, e a sobrevivência do microrganismo depende de fatores bióticos e abióticos
(DOBBELAERE et al., 2003).
Progressos consideráveis foram alcançados nos últimos anos, no sentido de determinar
como as bactérias diazotróficas invadem os tecidos das plantas. Porém, os exatos mecanismos
como estas bactérias interagem com as plantas ainda não são completamente entendidos, pois
bactérias diazotróficas não simbiônticas apresentam uma grande diversidade genética, o que
reflete em uma larga gama de habitats onde elas podem ser encontradas. Além disso,
apresentam mecanismos específicos de interação com as plantas, o que limita o conhecimento
destas interações principalmente em função da dificuldade em estudar um grande número de
6
estirpes interagindo com diversos genótipos de plantas (JAMES, 2000; KENNEDY et al.,
2004). Os possíveis sítios de infecção por bactérias diazotróficas em plantas de arroz são por
meio de feridas na epiderme devido a abrazão com o solo durante o crescimento radicular, por
fissuras causadas durante a emergência das raízes laterais, entre os pelos radiculares e as
células da epiderme e processos enzimáticos envolvendo degradação das paredes celulares
(BALDANI, 1996; STEENHOUDT e VANDERLEYDEN, 2000; BACILIO-JIMÉNEZ et al.,
2001).
1.4.1 Colonização por Azospirillum spp.
O processo de colonização inicia-se pelo ancoramento das bactérias a superfície das
plantas por meio de um material fibrilar. Os sítios primários de colonização são os pontos de
emergência das raízes laterais e a zona de formação de pelos radiculares (BACILIO-
JIMÉNEZ et al., 2001), ocorrendo a formação de pequenos agregados de células bacterianas
na superfície destes pontos.
Azospirillum spp. tem sido considerada uma bactéria que coloniza principalmente a
rizosfera (STEENHOUDT e VANDERLEYDEN, 2000). No entanto, pode colonizar os
espaços intercelulares das células da epiderme e do córtex radicular, parênquima, aerênquima,
o sistema vascular e interior dos pêlos radiculares (ZHU et al., 2002; FENG et al., 2004). A
colonização de plantas por Azospirillum é um processo dependente da estirpe e da planta
hospedeira (BACILIO-JIMÉNEZ et al., 2001; MOSTAJERAN et al., 2007). Utilizando a
fusão de genes que codificam proteína verde fluorescente (gfp) para visualizar a colonização
de raízes de arroz por A. irakense e A. brasilense, ZHU et al. (2002) observaram que estas
duas espécies diferem quanto a modo de colonização de raízes de arroz, durante os primeiros
estágios da associação planta bactéria, a colonização por A. irakense é muito mais rápida do
que por A. brasilense. Em trigo, foi constatado que a Sp7 de A. brasilense, fica restrita à
superfície das raízes enquanto que a estirpe Sp245 coloniza o interior das raízes
(ROTHBALLER et al., 2003).
MOSTAJERAN et al. (2007) observaram que a parede celular exerce uma função
importante na interação da planta com a bactéria e que o processo de infecção e colonização
de plantas de trigo por A. brasilense pode envolver enzimas que degradam polímemos da
parede celular. Após a infecção e colonização das raízes de arroz, A. brasilense migram para a
bainha das folhas e para as folhas, provavelmente pelo espaço intercelular e pelo sistema
vascular de modo silmultâneo conforme relatado por FENG et al. (2004).
1.4.2 Colonização por Herbaspirillum spp.
A colonização de plantas de arroz por Herbaspirillum spp. ocorre através da adesão da
bactéria à superfície da planta, seguida de proliferação nos pontos de emergência das raízes
secundárias e ferimentos na superfície da raiz causados devido a abrazão com o solo durante o
crescimento radicular. Uma vez no interior da planta, os microrganismos colonizam
inicialmente as células da epiderme onde as bactérias se multiplicam e entram pelos espaços
intercelulares colonizando a raiz e os tecidos da parte aérea (BALDANI et al., 1997;
RONCATO-MACCARI et al., 2003b). Quanto ao estabelecimento endofítico, estas bactérias
se localizam principalmente nos espaços intercelulares, nas células mortas, nas vesículas do
xilema e no aerênquima (JAMES et al., 2002).
BALDANI (1996) utilizando as técnicas de microscopia ótica e eletrônica observou
Herbaspirillum spp. colonizando os espaços intercelulares das raízes de arroz, localizando-se
principalmente nos espaços intercelulares da camada de células, imediatamente abaixo da
epiderme e raramente presente no interior das células do córtex. Já ELBELTAGY et al.
7
(2001) observaram que esta bactéria não coloniza a raiz e, sim a parte aérea da planta
hospedeira, colonizando preferencialmente o apoplasto dos tecidos da parte aérea das plantas
e não entra nos tecidos vasculares. Segundo RONCATO-MACCARI et al. (2003b) a
colonização de plantas de arroz por H. seropedicae ocorre em três estágios. No primeiro, as
bactérias colonizam a superfície das raízes, o segundo caracteriza-se pela infecção do tecido
cortical e o terceiro pela colonização do tecido vascular. No entanto, a habilidade de infectar e
colonizar plantas de arroz não é um processo universal para todas as estirpes de
Herbaspirillum spp., depende da estipe e do genótipo da planta (JAMES et al., 2002).
JAMES et al. (2002) estudando a infecção e colonização de duas variedades de arroz,
IR42 e IR72, com H. seropedicae estipe ZAE67, observaram que esta bactéria se multiplica
na zona de emergência das raízes laterais e depois se movem para os tecidos mais internos,
colonizando rapidamente o espaço intercelular, aerênquima e xilema da raiz e da parte aérea
das duas cultivares. Herbaspirillum coloniza tecidos jovens, antes da diferenciação, sugerindo
que esta bactéria aparece na parte área das plantas pelo espaço intercelular e que a motilidade
e a produção de pectinases e celulases poderá esta envolvida neste processo de distribuição
das bactérias pelos tecidos da planta (ELBELTAGY et al., 2001). Não há diferença entre as
estirpes as Nif
+
e Nif
–
de H. seropedicae quanto à habilidade de infeção e colonização de
plântulas de arroz, havendo similaridade no tamanho da população das duas estirpes nos
tercidos da planta, indicando que a colonização não é essencial para a fixação biológica de
nitrogênio (RONCATO-MACCARI et al., 2003a).
1.4.3 Colonização por Burkholderia spp.
A distribuição ecológica deste gênero tem sido muito estudada. No entanto, poucos
estudos foram realizados no sentido de entender o processo de infecção e colonização de
plantas por estas bactérias. Resultados preliminares indicam que o processo de infecção e
colonização das plantas de arroz por estirpes de Burkholderia ocorre primeiramente pela
colonização da superfície da raiz e em seguida entra nas células pelos espaços intercelulares
através de fendas na epiderme, particularmente nas pontas de emergência de raiz secundária
(BALDANI et al. 1997). A estirpe M209 de B. brasilensis também infecta os estômatos dos
folíolos de plântulas de arroz (SILVA et al., 2000).
1.4.4 Colonização por Azoarcus spp.
Até recentemente, as bactérias do gênero Azoarcus tinham sido isoladas somente das
raízes e base do colmo da espécie Kallar grass (Leptochloa fusca) em solos salinos no
Paquistão (REINHOLD-HUREK e HUREK, 1998). Entretanto, estudos em condições
gnotobióticas, mostraram que esta bactéria coloniza também plantas de arroz (HUREK et al.,
1994; REINHOLD-HUREK e HUREK, 1998). Azoarcus spp. expressa dois tipos de enzimas
celuloliticas (exo e endo glucanase) e estas enzimas podem estar envolvidas no processo de
infecção e colonização em raízes de K. grass (REINHOLD-HUREK et al., 1993).
A infecção em K. grass e arroz ocorre pela ponta das raízes e nos pontos de
emergência das raízes laterais, entrando no xilema. Este processo de infecção é
provavelmente um processo ativo que envolve atividade de enzimas que degradam os
polímeros da parede celular, sendo que, dois tipos de enzimas celulolíticas foram detectadas
em Azoarcus (REINHOLD-HUREK et al., 1993). Quanto ao estabelecimento endofítico, esta
bactéria se localiza principalmente no parênquima e nas vesículas do xilema (HUREK e
REINHOLD-HUREK, 2003). A descoberta de Azoarcus spp. em células do parênquima e
vesículas do xilema, em K. grass e arroz, sugere que a dispersão desta bactéria no interior das
plantas ocorre provavelmente pelo sistema vascular (HUREK et al., 1994).
8
1.4.5 Colonização por Rizobium spp.
Foi observado que Rhizobium leguminosaram bv trifolli desenvolve uma associação
natural com plantas de arroz em campos de produção deste cereal no delta do Nilo no Egito.
No Oeste da África, Bradyrhizobium spp. tem sido encontrado colonizando plantas de arroz
irrigado (CHAINTREUIL et al., 2000) e Azorhizobium caulinodans também foi isolado de
raízes de arroz (ENGELHARD et al., 2000). SINGH et al. (2006) mostraram que estirpes de
rizóbio infectam e colonizam os espaços intercelulares de raiz de arroz usando uma fusão
gusA como gene repórter. A infecção das raízes de arroz ocorre por ferimentos na raiz e por
fissuras criadas durante a emergência de raízes laterais, é independente de fatores Nod, não
específica, embora exista diferença na interação entre as estirpes com as plantas, e não
envolve a formação do cordão de infecção (REDDY et al., 1997). Também, WALKER et al.
(2007) observaram que estirpes de Rhyzobium spp. infectam raízes de arroz via pêlos
radiculares, zona de emergência das raízes laterais e colonizam extensamente raízes.
1.5 Fixação Biológica de Nitrogênio Atmosférico (FBN) em Arroz
Diversos trabalhos têm mostrado que a cultura do arroz pode se beneficiar da
associação com bactérias diazotróficas, obtendo significativa contribuição do nitrogênio
fixado biologicamente (SHRESTHA e LADHA, 1996; BALDANI et al., 2000). No entanto,
para JAMES (2000) é impossível dizer com certeza se os efeitos observados com a inoculação
de uma bactéria diazotrófica em arroz são devido à fixação ou a outro fator. Como efeitos
hormonais, aumentando a capacidade da planta de extrair N do solo em função do aumento do
sistema radicular, e/ou em função de alteração no metabolismo da planta pela atividade da
enzima nitrato redutase da bactéria.
RONCATO-MACCARI et al. (2003a) estudando a contribuição da fixação de
nitrogênio para o crescimento de plântulas de arroz, 30 dias após a inoculação com H.
seropedicae com estirpes Nif
+
e Nif
–
, observaram aumento similar na produção de biomassa
da parte aérea e da raiz das plântulas inoculadas com ambas as estirpes. Assim, os autores
sugeriram que os efeitos observados com a inoculação de bactérias diazotróficas no
crescimento de plantas podem ser parcialmente independentes da fixação biológica de
nitrogênio (FBN), envolvendo outros fatores de promoção de crescimento de plantas.
Os exatos mecanismos envolvidos na promoção do crescimento de plantas não são
bem conhecidos. No entanto, acredita-se que em sistemas naturais podem ocorrer tanto
mecanismos de ação direta quanto indireta. Como exemplo dos primeiros, pode-se citar a
FBN, produção de substâncias promotoras do crescimento de plantas e solubilização de
fosfatos. Já para os de ação indireta tem sido sugerido a indução de resistência sistêmica,
produção de sideróforos, diminuição de fatores de estresse e antagonismo a fitopatógenos seja
por competição por nutrientes ou exclusão por nicho ecológico quando estes microganismo
possuem mecanismos comuns para infecção dos tecidos vegetais (CHEN et al., 1995;
OLIVEIRA et al., 2003).
1.6 Fatores que Influenciam a Fixação Biológica de Nitrogênio na Cultura do Arroz
Nos ecossistemas naturais ocorrem diversas bactérias fixadoras de nitrogênio (N
2
),
desde as de vida livre no solo, àquelas de rizosfera, como também as consideradas bactérias
endofíticas, que colonizam o interior dos tecidos das plantas, em associação com uma vasta
gama de plantas não leguminosas (BALDANI e BALDANI, 2005). Dentre estas, acredita-se
que as bactérias endofíticas possuam maior potencial para a FBN devido a habilidade de se
localizarem em espaços inter e intra-celulares, ocupando nichos onde há menor influência de
9
fatores ambientais, menor competição com outros microrganismos por compostos orgânicos e
com baixa difusão de oxigênio (BALDANI et al., 1997). O incremento na produção de grãos,
devido à fixação biológica de nitrogênio em arroz, é sensível a fatores químicos, biológicos e
ambientais, ou seja, é dependente de uma interação complexa entre as plantas, os
microrganismos e o ecossistema (RAO et al., 1998). Assim o conhecimento do genótipo da
planta e do microrganismo envolvido na promoção de crescimento vegetal é de extrema
importância, além da interação com a comunidade microbiana do solo.
Em arroz, é comum se observar diferença na FBN entre os genótipos avaliados
(SHRESTHA e LADHA, 1996; BALDANI et al., 2000), sugerindo que a associação entre as
plantas e as bactérias fixadoras é controlada pelas plantas. Também, RETHATI et al. (2000)
estudando a associação de cultivares de arroz com A. brasilense e H. seropedicae observaram
que a inoculação de ambas as bactérias aumentou a massa das raízes das plantas e que este
efeito benéfico é altamente dependente da cultivar. MEHNAZ et al. (2001) quantificando a
fixação biológica de nitrogênio por meio da técnica de diluição isotópica do
15
N em duas
variedades de arroz inoculadas com diferentes estirpes de duas espécies de bactérias,
observaram que houve interação entre as variedades e as bactérias inoculadas.
A forma de inoculação de bactérias diazotróficas em arroz pode influenciar os
resultados obtidos, no entanto, poucos trabalhos têm sido realizados no sentido de aprimorar o
processo de inoculação. Inoculação é a uma técnica que consiste em colocar as sementes ou as
plântulas em contato com as bactérias e inoculante é o veículo que contém estas bactérias. O
veículo mais utilizado é a turfa, mas inoculante líquido também tem sido estudado
principalmente para inoculação em plântulas.
Segundo ISLAM e BORA (1998) Azospirillum pode ser inoculado por três métodos:
a) imersão das sementes em suspensão bacteriana por alguns minutos, seguida por secagem à
sombra por duas a quatro horas; b) mergulhar as raízes de plântulas de arroz em suspensão
bacteriana por alguns minutos antes do transplantio e c) aplicar a suspensão bacteriana na
rizosfera das plantas. O envolvimento das sementes com turfa também é uma forma de
inoculação utilizada para bactérias diazotróficas em arroz (FEREIRA et al., 2003,
GUIMARÃES et al., 2003).
FEREIRA et al. (2003), selecionando veículos para preparo de inoculante com
bactérias diazotróficas, observaram que o caldo bacteriano mantém por pouco tempo a
sobrevivência das células, o inoculante oleoso dificulta a germinação das sementes, sendo que
o mais promissor é a turfa. Outras formas de inoculação utilizadas são a inoculação de
plântula em meio de cultura (BALDANI et al. 2000, RONCATO-MACCARI et al., 2003a).
A forma de infecção e colonização das plantas pelas bactérias diazotróficas também
influencia os benefícios que a planta pode ter desta associação. Quando a infecção ocorre de
forma mais agressiva, estimula uma resposta de defesa da planta a esta invasão, tendo reflexos
negativos no crescimento das plantas. JAMES et al. (2002) estudando a infecção e
colonização de duas variedades de arroz com H. seropedicae estirpe ZAE67, observaram que
esta bactéria entra por ferimentos na zona de emergência das raízes laterais e coloniza
rapidamente o espaço intercelular. Os autores observaram diferença no grau de infecção. Na
cultivar IR72 o processo de invasão envolveu um grande número de bactérias colonizando a
zona de emergência das raízes secundárias, já na cultivar IR42 a invasão foi menos agressiva.
A colonização agressiva, na cultivar IR72 provocou uma resposta defensiva da planta.
STOLTZFUS et al. (1997) observaram que entre isolados endofitícos, inoculados em
plantas de arroz, certos isolados se apresentaram colonizando as plantas de forma mais
agressiva, sendo que, esta colonização agressiva teve como conseqüência o retardamento do
crescimento das plantas. Também RETHATI et al. (2000), observaram em cultivares de arroz,
inoculadas com A. brasilense e H. seropedicae que o efeito benéfico da inoculação com estas
bactérias estava associado a um número pequeno de bactérias nos tecidos das plantas. Embora
10
uma alta colonização de A. brasilense tenha sido bem tolerada pelas plantas, uma invasão
drástica de H. seropedicae provocou efeito adverso no crescimento das plantas.
A diferença entre os genótipos em relação ao nitrogênio derivado da fixação biológica
pode ser mais evidente em condições de baixo teor de nitrogênio no solo. PRADHAN e
MOHAN (1998), observaram que inoculação de plantas de arroz com A. brasilense, quando
se utilizou metade da dose recomendada de nitrogênio para essa cultura, proporcionou
aumento no vigor das plantas, avaliado aos 30 e 60 dias após a semeadura, assim como,
aumento na produção de matéria seca e na produção de grãos. NIEUWENHOVE et al. (2001),
estudaram o efeito da inoculação de plantas de arroz com A. caulinodans, em combinação
com diferentes níveis de sacarose e nitrogênio, em condições de casa de vegetação. Os autores
observaram, pela técnica de diluição isotópica de
15
N, que houve incorporação de N fixado à
biomassa das plantas inoculadas com A. caulinodans, reduzindo-se o nitrogênio derivado do
fertilizante, em condições de baixo nível de nitrogênio (20 kg ha
-1
) e que, nesta condição, a
perda de nitrogênio foi menor que em condições de alto nível de nitrogênio (60 kg ha
-1
). Os
autores concluíram que a aplicação de 60 kg ha
-1
de nitrogênio afeta negativamente a
atividade da nitrogenase de A. caulinodans em associação com plantas de arroz.
A eficiência da fixação de N
2
pela associação de bactérias diazotróficas com arroz
pode ser limitada quando há baixa disponibilidade de matéria orgânica no solo, pois a matéria
orgânica pode ser fonte de carbono e energia tanto para fixação de N pela microflora de
rizosfera quanto para outras atividades metabólicas. Estes efeitos são mais pronunciados em
solos inundados que em solos não inundados. LADHA et al. (1987) observaram que a
aplicação de palha de arroz antes do plantio aumentou a massa microbiana do solo e, também,
a de bactérias diazotróficas no solo. Já a aplicação de 50% da dose recomendada de nitrogênio
na forma de vermicomposto e 50% na forma de fertilizante mais a inoculação com
Azospirillum e fosfobactérias, aumentou o número de perfilhos, o número de panículas e a
produção em arroz comparado com aplicação de 100% da dose recomendada de nitrogênio na
forma de fertilizante mineral (JEYABAL e KUPPUSWAMY, 2001;
MUTHUKUMARASAMY et al., 2007).
O arroz é cultivado sob dois sistemas de cultivo: de sequeiro e irrigado, sendo que
diferentes sistemas de cultivos têm potenciais distintos para suprir a necessidade de nitrogênio
das plantas. Em arroz de sequeiro, a fixação ocorre em bactérias aeróbicas, já em arroz
irrigado, a fixação ocorre tanto em bactérias aeróbicas quanto anaeróbicas e em geral maiores
contribuições de FBN são obtidas em arroz irrigado, onde as condições ecológicas favoráveis
à biota aquática favorecem também os microrganismos fixadores de nitrogênio de vida livre
(OLIVEIRA, 1992).
1.7 Avaliação da Fixação Biológica de Nitrogênio
A quantificação de nitrogênio fixado biologicamente em gramíneas é fundamental
para que se possa determinar o benefício global deste processo para os sistemas agrícolas. No
entanto, os resultados, são muito variáveis em função de diferenças metodológicas, e da
dependência do genótipo da planta e das condições ambientais em que são realizados,
(JAMES, 2000). Além disso, a correlação dos resultados obtidos com a população de
bactérias é limitada, pois é impossível se atribuir à fixação biológica a uma única espécie de
bactéria e, ainda, a simples presença da bactéria colonizando os tecidos da planta não significa
que esta esteja fixando nitrogênio e, nem que a planta esteja se beneficiando do nitrogênio
fixado (BODDEY et al., 1995).
A inconsistência dos resultados dos experimentos, tanto em condições gnotobióticas,
quanto em casa de vegetação e em campo, é um grande problema para pesquisa com bactérias
diazotróficas e tem limitado o uso destas bactérias. O método de inoculação e as interações
11
entre o genótipo vegetal e da bactéria pode contribuir para o insucesso dos resultados. REIS
JUNIOR et al. (2006) observaram que a interação entre A. amazonense e genótipos de
braquiária é dependente da estirpe. Para se obter sucesso com a inoculação é necessário que a
bactéria inoculada se estabeleça nas plantas e que não perca a capacidade competiva em
relação à comunidade nativa. Baixo pH, déficit hídrico e alta temperatura diminuem a
colonização influenciando os resultados (DOBBELAERE et al., 2003). SALA et al. (2007)
observaram efeito da inoculação de sementes de trigo com bactérias diazotróficas em
Campinas, mas não em Mococa, SP, trabalhando com as mesmas estirpes e cultivar. Na
Tabela 1 apresenta-se, resumidos, os resultados de trabalhos de inoculação com bactérias
diazotróficas em plantas de arroz realizados nos últimos anos.
Tabela 1. Resposta de plantas de arroz à inoculação com bactérias diazotróficas em várias
condições experimentais (continua).
Espécies de bactérias
Condições
experimentais
Efeito observado Referência
Azospirillum lipoferum,
Azospirillum brasilense,
Azospirillum amazonense
e Herbaspirillum
seropedicae
Campo
Não houve efeito no crescimento
nem na produção de grãos
PEREIRA et al. (1988)
Pseudomonas
fluorescentes
Campo e em casa de
vegetação
Aumento na emergência das
plântulas, comprimento das raízes
e altura e biomassa das plantas e
na produção de grãos.
DILEEP et al. (1998)
Azospirillum brasilense
Campo e casa de
vegetação
Aumento no vigor, na produção
de biomassa, e produção de grãos.
PRADHAN e MOHAN
(1998)
Azospirillum spp.
Casa de vegetação,
inundado, por 45 dias
Aumento na biomassa das raízes e
da parte aérea e na extração de N
GUNARTO et al.
(1999)
Rhodobacter capsulatus Vasos
Aumento na biomassa, o numero
de perfilhos e produção de grãos.
ELBADRY et al. (1999)
Nostoc muscorum e
Tolypothhrix tenuis
Casa de vegetação por
25 dias
Aumento na biomassa, das raízes
e no comprimento das plantas.
MULÉ et al. (1999)
Azospirillum brasilense Casa de vegetação
Aumento na altura das plantas
avaliadas até a fase de iniciação
das panículas, aumento na
biomassa da parte aérea e na
produção de grãos.
VALAZCO e CASTRO
(1999)
Herbaspirillum
seropedicae e
Burkholderia
Casa de vegetação e
em condições
gnotobióticas
Aumento na biomassa e no
nitrogênio derivado da fixação
biológica (Ndfa)
BALDANI et al. (2000)
Azospirillum brasilense e
Herbaspirillum
seropedicae
Casa de vegetação por
28 dias
A inoculação com Azospirillum
brasilense aumentou a biomassa
das raízes e da parte aérea das
plantas, já com Herbaspirillum
seropedicae o efeito foi negativo
RETHATI et al. (2000)
Azorhizobium
caulinodans
Condições de casa A inoculação aumentou a
biomassa das plantas, o número
de perfilhos e a incorporação de
N
2
fixado na biomassa, avaliado
pela técnica de diluição isotópica
do
15
N
NIEUWENHOVE et al.
(2001)
12
Tabela 1. Continuação
Herbaspirillum
seropedicae
Condições
gnotobióticas
Aumento na atividade da
nitrogenase incorporação Ndfa
após incubação com
15
N
2
em
plantas de Oryza officinalis
ELBELTAGY et al.
(2001)
Azospirillum brasilense
Condições
gnotobióticas em
solução de Hongland,
por 15 dias
Inibição do crescimento das
plantas, diminuindo a altura das
plantas
BACILIO-JIMÉNEZ et
al. (2001)
Espécies de bactérias
Condições
experimentais
Efeito observado Referência
Azospirillum brasilense,
Aeromonas e
Enterobacter
Condições
gnotobióticas, por oito
semanas
Todas as bactérias promoveram
aumento a área das raízes e o
Ndfa avaliado pela técnica
isotópica
15
N
MEHNAZ et al. (2001)
Herbaspirillum
seropedicae
Condições
gnotobióticas
Aumento na atividade da
nitrogenase aos 10 dias após a
inoculação e da massa seca das
cultivares IR42 e IR72 e somente
a cultivar IR42 apresentou
incorporação significativa de
Ndfa após incubação com
15
N
2
JAMES et al. (2002)
Herbaspirillum
seropedicae
Condições
gnotobióticas por 30
dias
Aumento na biomassa, na
atividade da nitrogenase e na
incorporação de
15
N
2
GYANESHWAR et al.
(2001)
Azospirillum sp. e
Azotobacter
Casa de vegetação e
campo
A inoculação com ambas as
bactérias aumentou a atividade da
nitrogenase (ARA) nas raízes das
plantas inoculadas
DAS e SAHA (2003)
Herbaspirillum
seropedicae
Condições
gnotobióticas
Aumento na massa das raízes
quando houve limitação de
nitrogênio
RONCATO-MACCARI
et al. (2003a)
Burkholderia brasilensis
e Herbaspirillum
seropedicae
Condições
gnotobióticas, em casa
de vegetação e campo
Em condições gnotobióticas,
houve aumento na biomassa da
variedade IAC 4440 e em
condições de campo houve
aumento na produção de grãos
das duas variedades testadas
FERREIRA et al.
(2003)
Burkholderia
brasilensis,
Herbaspirillum
seropedicae e
Herbaspirillum
rubrisubalbicans
Casa de vegetação e
campo
Em casa de vegetação houve
aumento na biomassa das plantas
na avaliação realizada aos 40 dias
após o transplantio. Já em campo
houve aumento na biomassa das
plantas aos 40, 45 e 130 dias após
transplantio, e também houve
aumento na produção de grãos
GUIMARÃES et al.
(2003)
Azospirillum
amazonense
Condições
gnotobióticas e casa
de vegetação
Em condições gmotobióticas
houve efeito negativo,
diminuindo a biomassa das
plântulas, em casa de vegetação
houve efeito positivo e negativo
dependendo da estirpe inoculada
RODRIGUES et al.
(2007)
13
2 CAPÍTULO I
ISOLAMENTO E CARACTERIZAÇÃO DE BACTÉRIAS DIAZOTRÓFICAS
NATIVAS DO ESTADO DO MARANHÃO
14
2.1 Resumo
Com o aumento dos custos dos fertilizantes nitrogenados e a crescente preocupação
com danos ambientais decorrentes do uso dos mesmos, o desenvolvimento de associações
entre bactérias diazotróficas e genótipos de arroz mais eficientes quanto à fixação biológica de
nitrogênio (FBN) pode ser uma alternativa para a redução de custos de produção e de
impactos ambientais causados por esta cultura. O objetivo deste trabalho foi isolar e
caracterizar bactérias diazotróficas nativas do estado do Maranhão com potencial para
inoculação em variedades tradicionais de arroz da própria região. Foram coletadas amostras
em três solos cultivados com arroz no Maranhão, sendo dois de baixada e um de teras altas.
Para o isolamento destas bactérias diazotróficas foram utilizadas três variedades de arroz e a
cultivar IR42 como “plantas isca”. As sementes de cada variedade foram plantadas em vasos
com solo e após 45 dias foram coletadas. As bactérias obtidas de cada amostra foram
caracterizadas morfologicamente e a sua capacidade fixar nitrogênio foi determinada pela
atividade da nitrogenase por meio do método da redução do acetileno (ARA) e a produção de
ácido indol-acético (AIA) pelo método colorimétrico. De acordo com a caracterização
morfológica, os isolados foram classificados como pertencentes às espécies Azospirillum
amazonense, Azospirillum lipoferum, Azospirillum brasilense, Herbaspirillum spp.,
Burkholderia spp. e um grupo desconhecido. A técnica da ARA mostrou que os isolados
apresentaram capacidade de fixar nitrogênio atmosférico. Isolados de A. amazonense
produziram maior quantidade de AIA quando comparados com os isolados de outras espécies.
No caso dos isolados de Burkholderia spp., poucos produziram AIA e em pequena
quantidade. Foram encontrados isolados bacterianos muito eficientes na produção de ácido
indol-acético e fixação de N
2
, sugerindo portanto potencial para promover o crescimento
vegetal quando inoculado em arroz. O perfil de fragmentos de restrição gerados pela técnica
de ARDRA, confirmou o gênero da maioria dos isolados, além disso mostrou alta
diversidade, principalmente para os isolados bacterianos caracterizados morfologicamente
como Burkholderia spp.
15
2.2 Abstract
The increased costs of nitrogen fertilisers and concerning of the human being with the
current environmental damages caused by the excess of nitrogen application, oppened new
opportunity for the exploiting the associations between diazotrophs bacteria and genotypes of
rice more efficient with respect to the biological nitrogen fixation (BNF). The aim of this
study was isolate and characterise native diazotrophic bacteria from soil of the Maranhão
State with potential for inoculation in traditional varieties of rice. Samples were collected
from three soils cultivated with rice in Maranhão, being two of highland and one of lowland
area. It two traditional cultivars of rice (Zebu Branco and Manteiga) and two comercial
varieties (IR42 and Diamante) were used for isolation of these diazotrophic bacteria. The
seeds of each variety or cultivar were planted in pots with soil and collected 45 days later. The
obtained bacteria of each sample were morphological characterised and nitrogenase activity
was determined by the acetylene reduction technique (ARA) and the auxin production by the
colorimeter method. In agreement with the morphological characterisation, the isolates were
classified as Azospirillum amazonense, Azospirillum lipoferum, Azospirillum brasilense,
Herbaspirillum spp. and Burkholderia spp. The ARA showed that most of the isolated
presented the ability to fix nitrogen. Isolates of A. amazonense produced larger amount of
AIA as compared with the other species. In contrast, few isolates of Burkholderia
spp.produced AIA and in small amounts. It was found bacterial isolates very efficient in the
indol-acetic acid production and capability to reduce acetylene the ethylene, therefore with
potential to be used as biofertilizers in rice plants. Restriction fragment profiles generated by
the ARDRA technique confirmed the identity of most of the isolates and showed high
diversity mainly for t bacterial isolates morphologically characterized as Burkholderia.
16
2.3 Introdução
O arroz (Oryza sativa L.) é um alimento de grande importância para população
mundial, sendo o segundo cereal mais consumido no mundo, atendendo a grande parte da
necessidade protéica e calórica da população mundial (DE DATTA et al., 1987). O estado do
Maranhão é um grande produtor e consumidor de arroz no Brasil, sendo o quarto em
produção e o terceiro em área plantada do País, no entanto, ocupa a 22
a
posição entre as
unidades da federação em termos de produtividade (CONAB, 2008), em decorrência do baixo
nível de tecnologia empregado.
Um dos fatores que pode limitar a produção de arroz é a baixa disponibilidade de
nitrogênio nos solos, principalmente nos trópicos, que apresentam solos altamente
intemperizados e, geralmente, com baixo teor de matéria orgânica (DOBEREINER, 1997).
Embora o nitrogênio seja um elemento presente, abundante, na sua forma estável na
atmosfera, para a fixação industrial do N
2
, a quebra da tripla ligação requer grande quantidade
de energia proveniente do petróleo ou gás natural, fontes de energia não renováveis
(STOLTZFUS et al., 1997), tornando estes produtos custosos tanto do ponto de vista
econômico como ecológico. Assim, a aplicação de fertilizantes nitrogenados aumenta o custo
de produção e, além disso, causa impactos negativos ao meio ambiente como contaminação
da água pelo nitrato e emissão de gases de efeito estufa como o óxido nitroso e gás amoníaco
(STOLTZFUS et al., 1997).
As gramíneas são capazes de se associar com diversas bactérias que realizam o
processo de fixação biológica do nitrogênio atmosférico, como as pertencentes aos gêneros
Azospirillum, Gluconacetobacter, Azoarcus, Herbaspirillum, Burkholderia e Pseudomonas
(TRAN VAN et al., 2000; LADHA e REDDY, 2003; KENNEDY et al., 2004). A procura por
bactérias diazotróficas, capazes de converter nitrogênio gasoso em amônia, disponível para as
plantas levou ao isolamento de várias bactérias (DOBBELAERE et al., 2003).
O desenvolvimento de meios de cultura semi-sólidos sem N possibilitou o isolamento
destas bactérias em diversas culturas no decorrer dos anos (BALDANI e BALDANI, 2005). O
uso destes meios oferece uma condição ideal para o crescimento de diazotróficos com caráter
microaerofílico, que ocupam sítios onde a concentração de O
2
é limitada. As recentes
pesquisas com bactérias diazotróficas têm mostrado que a cultura do arroz pode se beneficiar
da associação com bactérias diazotróficas, obtendo significativa contribuição do nitrogênio
fixado biologicamente ou por meio de substâncias promotoras de crescimento
(GYANESHWAR et al., 2001; DOBBELAERE et al., 2003; RODRIGUES et al., 2007;
GOVINDARAJAN et al., 2008).
Em experimentos de inoculação, em casa de vegetação, com a variedade de arroz
Guarani, foi observado aumento de 22% na massa seca, 19% na produção de grãos das plantas
inoculadas com a estirpe ZAE94, 27% na massa seca e de até 20% na produção de grãos para
as plantas inoculadas com a estirpe M130. Além disso, foi observado um aumento do
conteúdo de nitrogênio da planta, induzido pela fixação de nitrogênio realizada por
Herbaspirillum seropedicae variando entre 17 e 19% do N incorporado à planta (BALDANI
et al., 2000).
No entanto, o sucesso do sistema de fixação de nitrogênio em arroz, quanto ao
aumento de produção, é dependente de uma interação complexa entre as plantas, os
microrganismos e o ecossistema (RAO et al., 1998), sendo importante considerar em estudos
de inoculação e quantificação da FBN fatores como ambiente, estirpes e genótipos
(BALDANI et al., 1999). STOLTZFUS et al. (1997) isolando bactérias endofitícas de raízes e
dos tecidos da parte aérea de diversas variedades de arroz crescidas em diferentes tipos de
solo, observaram uma grande diversidade e um grupo destes isolados mostraram-se
17
cosmopolitas podendo ser isolados de diversos tipos de solos e colonizar um número grande
de genótipos.
Variedades tradicionais de arroz podem abrigar populações de bactérias endofitícas
diferentes das observadas em variedades modernas. ELBELTAGY et al. (2001) observaram
mais bactérias endofitícas em arroz selvagem, Oryza officinalis e Oryza rufipogon, do que em
cultivares modernas de O. sativa. No entanto, ENGELHARD et al. (2000) observaram que a
diversidade de bactérias endofitícas culturáveis em arroz selvagem foi significativamente
menor do que em cultivares de O. sativa. Os autores sugeriram que os genótipos ou as
condições ecológicas possuem influência crucial na população de bactérias endofitícas.
No Maranhão se encontra o maior número de variedades locais de arroz do país. Estes
genótipos são menos dependentes de fertilizantes nitrogenados e é possível que exerçam
efeito seletivo sobre a população de bactérias diazotróficas, podendo abrigar bactérias
diazotróficas com potencial para promover um aumento na produção de grãos sem aumentar
os problemas ambientais decorrentes do uso de adubos nitrogenados. O objetivo deste
trabalho foi isolar e caracterizar bactérias diazotróficas nativas do estado do Maranhão com
potencial para inoculação em variedades tradicionais de arroz cultivadas neste estado.
2.4 Material e Métodos
2.4.1 Isolamento e contagem de bactérias diazotróficas
O isolamento de bactérias diazotróficas foi realizado em dois períodos. No primeiro se
utilizou a variedade IR42 crescida por 45 dias, em três amostras de solo provenientes de três
municípios do estado do Maranhão: Arari, Bacabal e Vitória do Mearim. No segundo,
utilizou-se como “plantas isca”, as variedades Diamante, Zebu Branco e Manteiga, crescidas
por 45 dias, em amostras de solo proveniente dos mesmos locais do isolamento anterior.
O isolamento das bactérias diazotróficas foi feito de acordo com a metodologia
descrita por DOBEREINER et al. (1995), utilizando-se diluições seriadas de 10
-2
a 10
-7
de
amostras de raízes, colmos e folhas das plantas. Foram empregados meios de cultura semi-
sólidos semi-seletivos, sem adição de nitrogênio: LGIP para o isolamento de
Gluconacetobacter spp., LGI para Azospirillum amazonense, NFB para Azospirillum spp.,
JNFB para Herbaspirillum spp. (DOBEREINER et al., 1995) e JMV para Burkholderia spp.
(BALDANI, 1996).
Para o isolamento a partir das amostras de planta, foram retiradas amostras de 1 g de
matéria fresca da parte aérea e da raiz. As raízes foram lavadas em água corrente e
posteriormente lavadas em água destilada estéril e a da parte aérea lavada com álcool (70%) e
água estéril. As amostras foram maceradas em 9 ml de solução salina (1/4 dos sais do meio
NFB) e diluídas serialmente. De cada diluição foram retiradas alíquotas de 0,1 ml e
inoculadas em frascos tipo penicilina contendo meio semi-sólido. Os frascos foram incubados
a 30ºC, de cinco a sete dias, após este período o crescimento bacteriano foi avaliado
verificando-se o aparecimento de película características para cada bactéria alvo.
Os frascos com crescimento positivo nas duas últimas diluições, de cada um dos
meios, foram utilizados para o isolamento, efetuando-se a repicagem das bactérias para um
novo meio semi-sólido. Após a incubação por 48 horas foi feita a riscagem em placas com
meio sólido, o mesmo do semi-sólido, acrescido de extrato de levedura. As colônias formadas
nos meios sólidos foram repicadas para novo meio semi-sólido e, após a incubação por 48
horas, foram riscadas em meio rico, Batata ou Batata-P, para purificação final
(DOBEREINER et al., 1995). As culturas puras foram preservadas em meio sólido inclinado
com óleo mineral e em água.
18
2.4.2 Caracterização morfológica
A caracterização morfológica e a motilidade celular foram determinadas durante o
período de isolamento e após a purificação por meio de microscopia ótica com contraste de
fase. A morfologia das colônias foi observada por meio do crescimento dos isolados em meios
sólidos, semi-específicos (LGIP, LGI, NFB, JNFB e JMV) e em meio rico (batata), onde se
observou as características morfológicas das colônias como forma, bordas, coloração e textura
(DÖBEREINER et al., 1995).
2.4.3 Caracterização molecular
A extração do DNA dos isolados bacterianos para posterior amplificação foi realizada
pelo método CTAB (SAMBROOK e RUSSEL, 2001). 2 mL das culturas bacterianas,
crescidas por 48 horas em meio Dygs líquido, pH 6,8 para isolados de Azospirillum e
Herbaspirillum e pH 6.0 para isolados de Burkholderia foram centrifugados a 14.000 rpm por
cinco minutos. O precipitado foi lavado em 500 µL de TE e centrifugado a 14.000 rpm por
cinco minutos. Após a lavagem o precipitado foi resuspendido em 567 µL de TE, adicionou-
se 30 µL de SDS (10%) homogeneizado e, em seguida, foi adicionado 3 µL de proteinase K.
Após homogeneizar bem, as amostras foram incubadas em banho-maria a 37 ºC por uma hora.
Terminado este período foram adicionados 100 µL de NaCl (5 M) homogeneizando-se bem
adicionou-se em seguida 80 µL de CTAB/NaCl. As amostras foram incubadas por dez
minutos a 65ºC em banho-maria e em seguida incubadas em agitador por cerca de 45 minutos
a 30ºC. Após a incubação, o DNA foi extraído adicionado um volume de
fenol/clorofórmio/álcool isoamílico, homogeneizou-se bem, quando foi centrifugado a 14.000
rpm por 10 minutos e, em seguida o sobrenadante foi transferido para um tubo novo. Ao
sobrenadante foi adicionado 5 µL de RNase (5mg/µL) procedendo-se à a incubação por cerca
de 45 minutos em banho-maria a 37ºC. Após o tratamento com RNase foi feita uma segunda
extração com fenol/clorofórmio/álcool isoamílico centrifugado a 14.000 rpm por cinco
minutos, o sobrenadante foi transferido para um tubo novo e precipitado com isopropanol
(100%), o precipitado foi lavado com etanol (70%) e solubilizado em 50 µL de TE.
Após extraido, o DNA foi quantificado por eletroforese em gel de agarose na
concentração de 1,0%, fundida em tampão TAE 1 X. O gel foi submerso em tampão de
corrida TAE 1 X. Em cada canaleta do gel foi aplicado 1 µL de amostra, juntamente com dois
µL de tampão de amostra, e aplicado voltagem constante de 100 volts por 30 minutos, para
promover a migração das amostras. Em seguida, o gel foi corado em solução de brometo de
etídeo (5 mg/L) e visualizado sob luz ultravioleta em fotodocumentador marca Kodak,
modelo EL Logic Imaging System.
A amplificação da região 16S dos isolados foi realizada utilizando os iniciadores Y1,
complementar a seqüência 5’-TGGCTCAGAACGAACGCTGGCGGC-3’ e Y3,
complementar à sequência 5’-CTAGACCCCACTTCAGCATTGTTCCAT-3’ (YOUNG et
al., 1991). A reação consistiu no preparo da mistura: 10% do volume final de tampão de PCR
10 X, 2 mM de MgCl2, 200 µM de dNTP, 0,12 µM de cada iniciador, uma unidade da enzima
Taq DNA polimerase e de 50 a 150 ng de DNA, o volume final de reação de 50 µL. Em
seguida, o material preparado foi colocado num termociclador e submetido ao programa de
amplificação cujos ciclos determinados foram: um ciclo de desnaturação (93°C por dois
minutos), seguido de 35 ciclos intermediários (93°C por 45 segundos, 62°C por 45 segundos e
72°C por dois minutos) e um ciclo final de extensão (72°C por cinco minutos) seguido por
resfriamento (15°C por 15 minutos), para finalizar a reação. Após o término do programa,
19
uma amostra de 5 µL do produto amplificado foi submetida à eletroforese, para visualização
dos produtos de amplificação e o restante guardado em freezer a temperatura de -20ºC.
Os produtos de amplificação das regiões 16S DNAr foram digeridos com as endonucleases de
restrição, AluI e MspI para Herbaspirillum; HinfI e AluI para Burkholderia; e, HaeIII e RsaI
para Azospirillum. Os sítios de corte das enzimas estão apresentados na Tabela 2. Para cada
reação, foram adicionados 8,5 µL de material amplificado, 1,0 µl de tampão de reação
espécifico para cada enzima e cinco unidades da enzima de interesse. Os tubos foram agitados
para homogeneizar os reagentes e incubados a 37ºC em banho-maria por três horas.
Tabela 2. Sítios de restrição das endonucleases utilizadas.
Enzimas Sítios de restrição
AluI 5’-AG - CT-3’
3’-TC - GA-5’
HinfI 5’- G – ANT C-3’
3’- C TNA - G-5’
HaeIII 5’-GG - CC-3’
3’-CC - GG-5’
RsaI 5’-GT - AC-3’
3’-CA - TG-5’
MspI 5’-C – CG G-3’
3’-G GC - C-5’
Todo o material, e mais 2 µL de tampão de amostra foi submetido à eletroforese em
gel de agarose (3%), fundido em tampão TAE 1 X. As amostras foram distribuídas em poços
do gel submerso em tampão de corrida TAE 1 X e submetido a 50 volts por quatro horas.
Após a migração das amostras, o gel foi corado com brometo de etídeo e visualizado sob
iluminação utravioleta conforme mencionado acima.
2.4.4 Determinação da atividade de redução do acetileno (ARA)
A determinação da atividade da nitrogenase em culturas puras foi realizada por meio
da técnica de ARA (HAN e NEW, 1998). As culturas puras conservadas em óleo mineral
foram crescidas em Dygs por 24 horas sob agitação de 200 rpm a 30ºC. Em seguida, as
células foram lavadas duas vezes em solução salina para remover o nitrogênio do meio. Após
a lavagem, foram inoculados 20 µL da suspensão em frascos de 10 mL contendo 5 mL de
semi-sólido (o mesmo utilizado para o isolamento) sem biotina, sem azul de bromotimol e
sem fonte de nitrogênio. Os frascos foram incubados por 48 horas a 30ºC. Após este período,
os frascos foram vedados e injetado 1 mL de acetileno resultando em uma atmosfera de
incubação de 20%. Os frascos foram incubados a 30ºC por uma hora, logo em seguida, 0,5
mL da atmosfera dos frascos foram retirados e injetados em cromatógrafo de gás Perkin
Elmer para analisar a concentração de etileno na amostra.
2.4.5 Produção de compostos indólicos
A produção de AIA pelos isolados foi determinada em meio liquido e semi-sólido pelo
método colorimétrico (SARVAR e KREMER, 1995). As culturas puras conservadas em óleo
mineral foram crescidas em Dygs por 24 horas sob agitação de 200 rpm a 30ºC. Após esse
período a densidade ótica foi ajustada em espectrofotômetro, com comprimento de onda de
620 nm. Uma vez padronizadas as amostras, alíquotas de 20 µl foram inoculadas em tubos de
ensaios com meio líquido e em frascos de penicilina com meio semi-sólidos NFB, JNFB, LGI
20
e JMV (sem extrato de levedura, biotina e azul de bromotimol), com a adição de 100 µL/mL
de D/L-triptofano. As amostras em meio líquido foram colocadas para incubar a 30oC por 48
h sob agitação de 200 rpm. Os frascos com as amostras em meio semi-sólido foram incubados
30oC por 48 h no escuro para os isolados de Azospirillum e Herbaspirillum e 96 horas para os
isolados de Burkholderia. Após esse período de crescimento as culturas foram centrifugadas a
7000 rpm por cinco minutos. Alíquotas de 150 µl do sobrenadante foram depositadas em
microplaca de poliestireno seguida da adição de 100 µl do reagente de Salkowski. Após 30
minutos de reação no escuro à temperatura ambiente, a intensidade da cor foi medida a 540
nm em espectrofotômetro. A concentração de AIA foi determinada utilizando uma curva
padrão com concentrações crescentes de AIA sintético. Os dados foram submetidos à análise
de variância e as médias comparadas pelo teste de Scott-Knott a 5% de probabilidade.
A concentração de proteína das culturas utilizadas para análise de ARA e de produção
de AIA foi determinada pelo método de (LOWRY et al., 1951), utilizando uma curva padrão
feita a partir de concentrações crescentes de proteína (soro albumina bovina). Após a
quantificação da auxina e de acetileno, as culturas foram centrifugadas a 5000 rpm por 15
minutos a 4 ºC, resuspendidas em água estéril e diluídas 1:5 (100 µl da amostra e 400 µl de
água esterilizada). Em seguida, 0,5 mL da cultura diluída foi homogeneizada com 0,5 mL de
NaOH 1 M em tubos de ensaio que foram colocados em banho-maria a 100 ºC por 5 minutos.
Após o resfriamento adicionou se aos tubos 2,5 mL do reagente de Lowry e após reação no
escuro à temperatura ambiente por 10 minutos adicionou-se 500 µl do reagente de Folin-
Ciocalteu 1 M, seguida de rápida agitação. Após 30 minutos de incubação no escuro a
intensidade da coloração foi medida em espectrofotômetro a 750 nm.
2.5 Resultados e Discussão
2.5.1 Isolamento e contagem de bactérias diazotróficas em arroz
Foi observada a formação de película característica indicadora de crescimento positivo
em amostras de raiz lavada, raiz desinfestada e de parte aérea das plantas crescidas nos três
solos em todos os meios semi-sólidos semi-seletivos utilizados (Tabela 3).
Tabela 3. Número Mais Provável (NMP) de bactérias diazotróficas crescidas em meios semi-
sólidos sem nitrogênio provenientes de diferentes partes da planta da cv IR42 cultivada em
três amostras de solo provenientes do estado do Maranhão.
Número de células por grama de peso fresco (x10
5
)
Origem das amostras de solo
Arari Bacabal Vitória do Mearim
Meios de
Cultivo
RL RD PA RL RD PA RL RD PA
NFB
119,0 5,7 5,0 415,0 0,3 3,8 91,7 150,0 0,0
JNFB
37,2 1,1 27,5 1140,0 0,0 0,1 35,0 0,0 0,6
LGI
1290,0 100,0 0,6 34,5 30,9 3,8 73,5 66,7 0,0
LGIP
1430,0 42,4 11,3 603,0 50,0 3,8 190,0 54,5 0,0
JMV
11,6 0,2 0,0 0,5 0,2 0,2 6,5 15,0 0,0
RL – Raiz lavada; RD – Raiz desinfestada; PA – Parte aérea.
Pode-se observar uma maior população de bactérias diazotróficas nas raízes das
plantas, principalmente nas amostras de raiz lavada independentemente da origem da amostra
21
de solo em meio NFB, quando comparadas com a parte aérea (Tabela 3). De modo geral uma
população maior de bactérias foi observada nos solos de Arari e Bacabal nos meios LGI,
LGIP e NFB, enquanto que o solo de Vitória do Mearim foi o que mostrou tendência
apresentar menor população de bactérias, principalmente na parte aérea das plantas.
Independentemente do solo, uma menor população de bactérias diazotróficas foi observada no
meio JMV.
Embora a contagem de células bacterianas, estimadas pela técnica do Número Mais
Provável no meio LGIP, semi-específico para o isolamento de Gluconacetobacter
diazotrophicus, tenha sido alta, até 10
8
, os estudos morfológicos, das bactérias crescidas neste
meio mostraram que as mesmas não apresentavam características de Gluconacetobacter spp.,
mas sim do gênero Burkholderia. No entanto, o gênero Gluconacetobacter, também pode ser
encontrado colonizando plantas de arroz. MUTHUKUMARASAMY et al. (2005) observaram
a ocorrência de G. diazotrophicus em diferentes cultivares de arroz irrigado na Índia. Segundo
MUTHUKUMARASAMY et al. (2007), G. diazotrophicus apresenta uma grande distribuição
geográfica em plantas de arroz em clima temperado. KUSS et al. (2007) observaram uma
população expressiva de bactérias diazotróficas no meio LGIP em diferentes cultivares de
arroz irrigado no Rio Grande do Sul. No entanto, não foi feito uma caracterização das
bactérias isoladas deste meio para confirmar se pertenciam ao gênero Gluconacetobacter.
Nos meios de cultivo LGI e LGIP foi observado, tanto em meio semi-sólido quanto
em meio sólido dois grupos de bactérias umas que acidificavam o meio e outras que
alcalinizavam, tornando estes meios mais amarelo ou esverdeado respectivamente.
RODRIGUES (2003) avaliando o crescimento de isolados de Burkholderia spp. em meio
LGIP observou esta mesma característica, alguns isolados que alcalinizavam o meio e outros
que o acidificaram e que isolados de Burkholderia spp. foram capazes de crescer em meio
completado com 10% de açúcar.
Na primeira coleta foi obtido um total de 164 isolados. Porém, não foi observada a
presença de bactérias com características do gênero Herbaspirillum ou Azospirillum. Os
isolados obtidos apresentaram características morfológicas semelhantes e foram
caracterizados como Burkholderia spp. Não foi possível identificar alguns isolados nesta fase
e, portanto, foram agrupados como não identificados. Os isolados não identificados foram
obtidos principalmente nos meios LGI e LGIP, sendo que alguns destes alcalinizaram o meio
de cultivo (observado pela mudança de cor do indicador de pH do meio de cultivo) e outros,
acidificaram. Quando riscadas nestes mesmos meios sólidos suplementados com extrato de
levedura formaram colônias grandes e pequenas, brancas e amareladas e, também, gomosas.
Já em meio NFB, sólido formaram-se colônias pequenas e azuis translúcida e em JNFB
colônias maiores, azuladas e com centro o escuro. Em microscópio óptico estes isolados
apresentaram células pequenas imóveis e em formato de gota. O número de isolados obtidos
em cada meio semi-sólido e das diferentes partes da planta crescidas nas três amostras de solo
encontram-se na Tabela 4. Como não foi obtido nenhum isolado dos gêneros Herbaspirillum
e Azospirillum, que são bactérias de ocorrência comum em arroz, julgou-se necessário fazer
uma nova etapa de isolamento de bactérias utilizando-se as variedades locais.
22
Tabela 4. Número de isolados de bactérias diazotróficas obtido da cultivar IR42 crescida em
amostras de solo proveniente de três municípios do estado do Maranhão.
Origem do
solo
Parte da
Planta
NFB JNFB LGI LGIP JMV Total
RL* 8 2 12 11 8 41
RD 3 1 8 5 4 21Arari
PA 3 0 0 0 1 4
RL 2 0 6 5 7 20
RD 2 1 5 8 0 16
Bacabal
PA 6 0 4 0 2 12
RL 2 0 5 16 6 29
RD 1 1 3 7 1 13
Vitória do
Mearim
PA 3 0 1 3 1 8
Total 30 5 44 55 30 164
*RL – Raiz lavada; RD – Raiz desinfestada; PA – Parte aérea.
O segundo isolamento permitiu a obtenção de 138 isolados que foram classificados de
acordo com a caracterização morfológica, como A. amazonense, Azospirillum lipoferum,
Azospirillum brasilense, Herbaspirillum spp. e Burkholderia spp. (Tabela 5). Muitos dos
isolados, principalmente oriundos dos meios de cultivo LGI e LGIP, também não foram
identificados nesta fase e para fins de agrupamento permaneceram como não identificados.
No entanto, apresentaram características semelhantes aos obtidos no primeiro isolamento
sugerindo pertencer ao gênero Burkholderia. O maior número de isolados obtidos foi de
Burkholderia spp., sendo 55 no primeiro isolamento e 35 no segundo, e de A. amazonense, 33
isolados. Estes resultados estão de acordo com BALDANI (1996) e RODRIGUES et al.
(2006) que observaram números elevados destes gêneros em cultivares de arroz IR42 e
IAC4440 cultivadas em solos provenientes do estado do Rio de Janeiro e de Goiás.
Tabela 5. Número de isolados de bactérias diazotróficas obtidas das variedades de arroz
Diamante, Zebu Branco e Manteiga, crescidas em amostras de solo proveniente de três
municípios do estado do Maranhão.
Azospirillum
amazonense
Azospirillum
brasilense
Azospirillum
lipoferum
Herbaspirillum
spp.
Burkholderia
spp.
Azospirillum
spp.
Origem dos Solos
(Variedades)
R PA R PA R PA R PA R PA R PA
Arari (Diamante) 11 4 2 1 2 3 4 3 8 5 12 14
Bacabal
(Zebu Branco)
2 0 1 0 2 0 1 0 7 6 7 8
Vitória do Mearim
(Manteiga)
12 4 1 0 0 0 2 2 7 2 3 3
Total 33 4 7 12 35 49
R – Raiz; PA – Parte aérea.
O solo de baixada proveniente do município de Arari foi o que originou o maior
número de isolados de bactérias diazotróficas tanto no primeiro como no segundo isolamento,
sendo que a raiz apresentou maior número de bactérias isoladas. Uma população maior de
23
bactérias diazotróficas em raízes de arroz quando comparada com a do colmo e da folha de
arroz, também, foi observada por RODRIGUES et al. (2006).
2.5.2 Determinação da atividade de redução do acetileno (ARA) de culturas bacterianas
in vitro
A capacidade dos isolados em realizarem a fixação biológica de nitrogênio (FBN)
determinada por meio da atividade da enzima nitrogenase medida pela técnica de redução do
acetileno (ARA) demostrou que a maioria dos isolados foram capazes de reduzir o acetileno a
etileno, comprovando a capacidade destas bactérias de fixarem biológicamente o nitrogênio
atmosférico.
Houve uma grande variabilidade entre os isolados quanto à capacidade de redução de
acetileno, variando de 0,3 a 90,2 nmol mL
-1
após uma hora de incubação (dados não
apresentados). É comum se observar uma alta variabilidade entre isolados quanto à
capacidade de reduzirem acetileno a etileno in vitro. HAN e NEW (1998) também,
observaram grande variabilidade na capacidade de isolados em reduzirem acetileno em meio
de cultivo. Além disso, os autores observaram que a alta FBN em meio de cultivo não se
relaciona com a alta FBN em campo. Uma variabilidade acentuada na capacidade de fixar N
2
também foi observada com outras bactérias isoladas de arroz (RODRIGUES et al., 2006;
KUSS et al., 2007).
A técnica de ARA mostrou que a maioria dos isolados apresentou baixos valores de
FBN, sendo que os isolados de A. amazonense foram aqueles que apresentaram maior
capacidade de redução do acetileno quando comparados com os isolados de outras espécies. A
técnica de redução do acetileno é um método indireto para avaliar a FBN e estirpes que
apresentam alto potencial de FBN in vitro podem não apresentar uma associação eficiente
com as plantas (HAN e NEW, 1998). Além disso, a alta fixação de nitrogênio pelas bactérias,
não implica em transferência do N fixado para a planta (MANTELIN e TOURAINE, 2004).
Em função dessa variabilidade a atividade de redução do acetileno é considerada apenas
qualitativa por alguns autores. A estirpe M2, uma mutante natural não fixadora de nitrogênio,
não foi capaz de reduzir acetileno a etileno nas condições testadas confirmando sua
incapacidade de fixar nitrogênio (BALDANI et al., 1997).
2.5.3 Determinação da Produção de Ácido Indol-Acético (AIA) in vitro
Os isolados das bactérias estudadas apresentaram capacidade diferenciada de produzir
AIA, avaliado pelo método colorimétrico de Salkowski e, sendo os do gênero Azospirillum
aqueles que produziram maiores concentrações de compostos indólicos (Tabela 6).
RADWAN et al. (2004) observaram que estirpes de Azospirillum spp. produzem de três a sete
vezes mais compostos indólicos que estirpes de Herbaspirillum. Dentre os isolados de
Azospirillum spp., os de A. amazonense produziram maior quantidade de AIA comparados
com isolados de outras espécies (Tabela 7). A quantidade de AIA produzida pelos isolados de
A. amazonense, variou de 7 a 303 µM mL
-1
. Estes valores são superiores aos encontrados por
REIS JUNIOR et al. (2004) para A. amazonense em isolados de braquiária.
Poucos isolados de Burkholderia spp. foram capazes de produzir compostos indólicos
nas condições testadas, ou seja, em meio JMV líquido e em semi-sólido, variando de não
detectado até 8 µM mL
-1
(dados não mostrados). Isolados do gênero Burkholderia podem
apresentar capacidade de produzir compostos indólicos conforme indicado por
KUKLINSKY-SOBRAL (2004). No entanto, MARCHIORO (2005) também observou que
entre 17 estirpes de Burkholderia spp. avaliadas, apenas seis produziram compostos indólicos
pelo método do reagente de Salkowski e em pequena quantidade quando comparados com
24
outros gêneros de bactérias diazotróficas. GOVINDARAJAN et al. (2008) observaram a
produção de até 16 µg mL
-1
de AIA por isolados de Burkholderia vietnamiensis após uma
semana de incubação em meio CCM e utilizando cromatografia liquida de alta pressão
(HPLC) que é um método mais sensível e preciso.
2.5.4 Diversidade genética dos isolados
2.5.4.1 Isolados caracterizados morfologicamente como Herbaspirillum spp.
Todos os isolados caracterizados morfologicamente como Herbaspirillum spp. foram
utilizados para a análise da diversidade genética por meio da técnica de ARDRA. A origem de
cada um dos isolados encontra-se na Tabela 8. Os produtos de amplificação da região 16S do
DNAr dos isolados foram digeridos com as enzimas de restrição AluI e MspI que apresentam
maior poder discriminatório para Herbaspirillum spp. (BRASIL, 2005). A restrição dos
produtos de amplificação das estirpes padrões e dos isolados de Herbaspirillum spp. geraram
seis perfis polimórficos para cada uma das enzimas (Figura 1). Dos 10 isolados avaliados,
quatro formaram o mesmo tipo de perfil que a estirpe M4 de Herbaspirillum
rubrisubalbicans. Os demais, formaram perfis distintos entre si e diferentes das estirpes
padrões, sendo que nenhum dos isolados formou o mesmo tipo de perfil que as estirpes
ZAE94 e ZAE67 de H. seropedicae (Tabela 9).
25
Tabela 6. Produção de compostos indólicos por isolados de Azospirillum spp. isolados de
diferentes partes da planta de três variedades de arroz crescidas em amostras de solo
provenientes de três localidades no Maranhão (A = Arari, B= Bacabal e V = Vitória do
Mearim) e avaliados pelo método colorimétrico (média de 4 repetições).
Isolado Solo Parte da planta
µM/µg µM/mL
VR2112 A RD 1,20A 219A
AR3156 A RD 0,77B 181B
AR1161 A RL 0,72B 186B
AR1131 A RD 0,66B 41C
AR2128 A RD 0,56B 30C
AR1246 A RD 0,54B 88B
VR1134 V RD 0,51B 49C
BR1142 B RD 0,43B 85B
AR215 A RD 0,35C 28C
Cd 0,34C 142B
BF1358 B PA 0,32C 75B
AR1135 A RL 0,32C 36B
BR3159 B RL 0,30C 75B
BF1360 B PA 0,28C 73B
BR1139 B RD 0,26C 48C
AR114 A RD 0,25C 32C
BR2113 B RD 0,21C 16C
BR1144 B RD 0,18C 48C
BF2227 B PA 0,18C 47C
AR1133 A RD 0,18C 22C
BR2257 B RD 0,14C 35C
AR1155 A RL 0,14C 32C
AR2132 A RD 0,12C 29C
AR211 A RD 0,10C 19C
VR113 V RD 0,095C 13C
AR2141 A RD 0,092C 41C
AR319 A RD 0,09C 27C
AR2140 A RD 0,08C 30C
AR2247 A RD 0,07C 13C
VR2236 V PA 0,07C 13C
AR1249 B PA 0,07C 15C
AR218 A RD 0,06C 11C
AF3143 A RL 0,06C 14C
BR112 A RD 0,06C 15C
AR1148 B RD 0,04C 9C
BR1145 B RD 0,03C 7C
BR117 B RD 0,01C 3C
BR2110 B RD 0,00C 2C
AR2111 A RD 0,00C 1C
Médias seguidas por letras iguais não diferem entre si pelo teste de Scott-Knott a 5% de probabilidade.
RL – Raiz lavada; RD – Raiz desinfestada; PA – Parte aérea.
26
Tabela 7. Produção de compostos indólicos por Azospirillum amazonense isolados da raiz (R)
e da parte aérea (PA) de diferentes variedades de arroz crescidas em solo provenientes de três
localidades no Maranhão (A = Arari e V = Vitória do Mearim) avaliados pelo método
colorimétrico (média de 4 repetições).
Isolado
Local de coleta das
amostras de solo
Parte da planta
µM/µg µM/mL
VF2213 V PA 1,44A 164D
AR3123 A RD 1,42A 168D
VR2110 V RD 1,39A 145D
VR219 V RD 1,36A 175D
AR3122 A RD 0,99B 186C
AR3124 A RD 0,84B 174D
VR218 V RD 0,83B 303A
VR3125 V RD 0,83B 165D
AR214 A RD 0,71B 159D
AR2128 A RD 0,70B 147D
VR3126 V RD 0,69B 167D
VR2114 V RD 0,69B 166D
Y2 0,68B 154D
AR211 A RD 0,67B 182C
AR213 A RD 0,66B 159D
VF227 V PA 0,65B 156D
AR3127 A RD 0,62B 154D
VR2111 V RD 0,60B 139D
VR3120 V RD 0,59B 164D
AR215 A RD 0,57B 165D
VR2112 V RD 0,409C 168D
Ym69 0,37C 164D
VF2215 V PA 0,36C 119E
AF226 A PA 0,26C 62F
AR3118 A RD 0,12C 22G
VR2116 V RD 0,06C 21G
AR2117 V RD 0,02C 8G
AF222 A PA 0,02C 8G
Médias seguidas por letras iguais não diferem entre si pelo teste de Scott-Knott a 5% de probabilidade.
RD – Raiz desinfestada; PA – Parte aérea.
Tabela 8. Origem dos isolados classificados previamente como Herbaspirillum spp.
utilizados na análise caracterização genética
.
Isolado Parte da planta Meio de cultivo
Local de coleta das
amostras de solo
AR1123 RD NFB Arari
AR1121 RD NFB Arari
VR1119 RD NFB Vitória do Mearim
AR2120 RD JNFB Arari
VR2116 RD JNFB Vitória do Mearim
VR2117 RL JNFB Vitória do Mearim
AR1124 RD NFB Arari
AR1122 RL NFB Arari
AR1125 RL NFB Arari
BR2126 RD JNFB Bacabal
RL – Raiz lavada; RD – Raiz desinfestada; PA – Parte aérea
.
27
Figura 1. Perfil eletroforético de restrição dos fragmentos da região 16S DNAr de estirpes de
referencia Herbaspirillum seropedicae, Herbaspirillum rubrisubalbicans e de novos isolados.
Figura A. Restrição com AluI. Legenda: 1 (marcador de 100 pb), 2 (VR2116), 3 (VR2117), 4
(VR1119), 5 (AR1121), 6 (BR2126), 7 (ZAE94), 8 (ZAE67), 9 (M4), 10 (marcador de 100
pb). Figura B. Restrição com MspI. Legenda: 1 (marcador de 100 pb), 2 (VR2116), 3
(VR2117), 4 (VR1119), 5 (AR2120), 6 (AR1121), 7 (AR1122), 8 (AR1123), 9 (AR1224), 10
(AR1125), 11 (AR2126), 12 (ZAE94), 13 (ZAE67), 14 (M4), 15 (marcador de 100 pb).
Tabela 9. Perfil eletroforético de restrição dos fragmentos da região 16S DNAr de estirpes de
referência Herbaspirillum seropedicae, Herbaspirillum rubrisubalbicans e de novos isolados
.
Perfis de restrição
Estirpes e isolados
AluI MspI
Tipos de
perfis
M4 (Herbaspirillum rubrisubalbicans) A* A 1
ZAE67, ZAE94 (Herbaspirillum seropedicae) B B 2
VR2116, VR2117, AR1224, AR1125 A A 1
VR1119 E F 3
AR2120 C F 4
AR1121 C C 5
AR1122 D D 6
AR1123 F E 7
BR2126 D A 8
*As letras representam o tipo de perfil gerado por cada enzima.
A análise do dendograma (Figura 2) mostra que os quatros isolados que se agruparam
com a estripe M4 formaram o maior grupo com 100% de similaridade. O grupo I, com 77%
de similaridade, englobando também as estirpes ZAE67 e ZAE94. Já o grupo II com apenas
três isolados apresenta 70% de similaridade ao grupo anterior, os demais isolados
apresentaram maior diversidade (Grupo III) apresentando apenas 50% de similaridade.
RODRIGUES (2003) observou por meio da técnica de ARDRA que a maioria das
enzimas de restrição testadas para estudar a diversidade da população de isolados de
Herbaspirillum spp. obtidos de arroz, não foi capaz de diferenciar entre estirpes padrões e
diferentes isolados. No entanto, a restrição da 16S DNAr com as enzimas AluI e MspI foram
capazes de diferenciar H. seropedicae e Herbaspirillum frisingense das outras espécies.
BRASIL (2005) utilizando a técnica do ARDRA para estudar a diversidade da população de
Herbaspirillum spp. isolada de arroz observaram a formação de três grupos distintos, embora
tenha havido grande homogeneidade entre os isolados dentro de cada grupo. O autor observou
28
a formação de perfis de restrição diferentes para a espécie H. seropedicae e H.
rubrisubalbicans, mostrando que esta técnica pode ser utilizada para separar espécies de
Herbaspirillum. CRUZ et al. (2001) também separaram isolados de H. seropedicae e H.
rubrisubalbicans pela técnica do ARDRA. Os isolados que apresentaram perfis polimórficos
diferentes do gerado para H. rubrisubalbicans podem pertencer a outras espécies do gênero,
porém estudos adicionais serão necessários para a confirmação.
Figura 2. Dendograma de similaridade de estirpes de referência Herbaspirillum seropedicae,
Herbaspirillum rubrisubalbicans e de novos isolados caracterizados morfologicamente como
Herbaspirillum spp. Este dendrograma foi gerado pelo programa NTSYS, algoritmo UPGMA
e índice SM a partir dos perfis de restrição dos fragmentos da região 16S DNAr gerados pela
técnica de ARDRA.
2.5.4.2 Isolados caracterizados morfologicamente como Azospirillum spp.
A origem dos isolados caracterizados morfologicamente como A. brasilense e A.
lipoferum e de isolados similares a Azospirillum spp., utilizados para o estudo da diversidade
genética, pode ser observada na Tabela 6. A restrição dos fragmentos amplificados por PCR
da região 16S DNAr foi realizada pelas enzimas HaeIII e RsaI, por apresentarem maior poder
discriminatório para Azospirillum spp. (REIS JUNIOR et al., 2004). Estas enzimas geraram
um total de 11 perfis polimórficos, sendo que a enzima HaeIII gerou seis perfis e a enzima
RsaI cinco (Figura 3). De um total de 30 isolados analisados, 16 formaram o mesmo tipo de
perfil que as estirpes CD, Sp7 de A. brasilense e Sp59 de A. lipoferum. Os demais isolados
formaram oito tipos de perfis distintos, sendo que cinco destes com apenas um isolado
(Tabela 10). Pela análise de agrupamento podemos observar formação de três grupos
principais (Figura 4). No primeiro grupo, podemos observar um subgrupo que engloba mais
de 50% dos isolados com 100% de similaridade com as estirpes de refência, os grupos II e III
apresentaram maior diversidade e os isolados do grupo III apresentaram maior similaridade à
A. amazonense, sendo que o isolado AR1128 apresentou mais de 90% de similaridade com a
estirpe Y2 de A. amazonense.
Grupo III Grupo II Grupo I
29
Figura 3. Perfil eletroforético de restrição dos fragmentos da região 16S DNAr de estirpes de
referência Azospirillum brasilense, Azospirillum lipoferum e de novos isolados. Figura A.
Restrição com Hae III. Legenda: 1 (marcador de 100 pb), 2 (CD), 3 (Sp7), 4 (Sp59), 5
(AR211), 6 (BR112), 7 (BR2110), 8 (BR2113), 9 (BF2227), 10 (AR2128), 11 (AR2130), 12
(AR2132), 13 (AR1133), 14 (VR1134), 15 (VR2236), 16 (BR2137), 17 (BR1138), 18
(BR1246), 19 (AR2247), 20 (marcador de 100 pb). Figura B. Restrição com RsaI. Legenda: 1
(marcador de 100 pb), 2 (AR211), 3 (BR112), 4 (VR113), 5 (AR114), 6 (BR2110), 7
(BR2113), 8 (BF2214), 9 (BF2227), 10 (AR2128), 11 (AR2130), 12 (AR2132), 13 (AR1133),
14 (VR2236), 15 (BR1139), 16 (VR1142), 17 (CD), 18 (Sp7), 19 (Sp59), 20 (marcador de
100 pb).
Tabela 10. Perfil eletroforético de restrição dos fragmentos da região 16S DNAr de estirpes
de referencia Azospirillum brasilense, Azospirillum lipoferum e de novos isolados.
Perfis de restrição
Estirpes e isolados
HaeIII RsaI
Tipos de
perfis
CD, Sp7 (Azospirillum brasilense), Sp59 (Azospirillum
lipoferum)
A* A 1
AR211, AR216, BR117, AR218, AR319, BR2110, BF2214,
BF2227, AR2130, BR2137, BR1139, AR2141, VR1142,
AR3143, AR1245, AR2247
A A 1
AR2132, VR1134 A E 2
BR112 B B 3
AR2128 B D 4
VR113 C A 5
AR114, AR215, AR1135, VF2236 D B 6
AR2129, AR2130, AR1131 E A 7
BR1246 A C 8
AR1133 F B 9
AR2111 B F 10
BR2113 A D 11
*As letras representam o tipo de perfil gerado por cada enzima.
30
Figura 4. Dendograma de similaridade de estirpes de referência de Azospirillum brasilense,
Azospirillum lipoferum e Azospirillum amazonense e de isolados caracterizados
morfologicamente com Azospirillum spp. Este dendrograma foi gerado pelo programa
NTSYS, algoritmo UPGMA e índice SM a partir dos perfis de restrição gerados pela técnica
de ARDRA.
Embora, as enzimas utilizadas não tenham separado as estirpes padrões de A.
brasilense e A. lipoferum, metade dos isolados se agruparam com estas espécies confirmando
que estes isolados pertencem ao gênero Azospirillum. Foi observada uma grande diversidade
entre os isolados pela análise dos perfis polimóficos gerados, no entanto não foi observado
efeito dos locais de coleta ou da parte da planta no agrupamento dos isolados. BRASIL et al.
(2005) observaram, também, uma alta diversidade para isolados de Azospirillum spp. obtidos
de arroz, porém, embora estes autores não tenham separado as espécies A. brasilense e A.
lipoferum, eles observaram a formação de dois grupos com 50% de similaridade entre estas
espécies.
2.5.4.3 Isolados caracterizados morfologicamente como Azospirillum amazonense
A restrição dos fragmentos amplificados das estirpes e dos isolados de A. amazonense
(Tabela 7) pelas enzimas HaeIII e RsaI gerou um total de sete perfis polimórficos, sendo que
a enzima HaeIII gerou três perfis e a enzima RsaI quatro (Figura 5). De um total de 24
isolados analisados, 16 formaram o mesmo tipo de perfil que as estirpes Y2 e CBAMC de A.
amazonense. Os demais isolados formaram seis tipos distintos de perfis, sendo, dois com dois
isolados cada um e quatro com apenas um isolado (Tabela 11). Pela análise de agrupamento
(Figura 6) pode-se observar que a maioria dos isolados (66%) se agruparam com as estirpes
CBAMC e Y2 com 100% de similaridade. O grupo I, divide-se em dois subgrupos, sendo um
com apenas dois isolados que apresentam 73% de similaridade com as estirpes de referência,
o grupo II com três isolados apresenta 69% de similaridade com o grupo I, já o grupo III
formado pelos isolados que apresentaram pouca similaridade com as estirpes de referência,
Grupo III
Grupo II
Grupo I
31
apenas 38%, e podem pertencer a gêneros ou a espécies diferentes, pois uma baixa
diversidade entre isolados de A. amazonense pela técnica do ARDRA foi observada por REIS
JUNIOR et al. (2004). É possível se verificar uma maior diversidade entre isolados de A.
amazonense quando se utiliza a região intergênica 16S – 23S (REIS JUNIOR et al., 2006).
Figura 5. Perfil eletroforético de restrição dos fragmentos da região 16S DNAr de estirpes de
referencia Azospirillum amazonense e de novos isolados. Figura A. Restrição com RsaI.
Legenda: 1 (marcador de 100 pb), 2 (AR211), 3 (AR215), 4 (VF227), 5 (VR218), 6 (VR219),
7 (VR2112), 8 (VF2213), 9 (VR2114), 10 (VR2116), 11 (AR2117), 12 (VR3120), 13
(AR3121), 14 (AR3123), 15 (AR3124), 16 (VR3125), 17 (AR3127), 18 (Y2), 19 (CBAMC),
20 (marcador de 100 pb). Figura B. Restrição com HaeIII. Legenda: 1 (marcador de 100 pb),
2 (AR111), 3 (AF222), 4 (AR213), 5 (AR214), 6 (AR215), 7 (AF226), 8 (VF227), 9
(VR2110), 10 (VR2111), 11 (VR2114), 12 (VR2215), 13 (VR2116), 14 (AR3118), 15
(AR3121), 16 (AR3122), 17 (VR3126), 18 (Y2), 19 (CBAMC), 20 (marcador de 100 pb).
Tabela 11. Perfil eletroforético de restrição dos fragmentos da região 16S DNAr de estirpes
de referencia Azospirillum amazonense e de novos isolados
Perfis de restrição
Estirpes e isolados
HaeIII RsaI
Tipos de
perfis
Y2, CBAMC (Azospirillum amazonense) A* A 1
AR111, AR213, AR214, AR215, VF227, VR218, VR2110,
VR2112, VR2114, VR2116, VR3120, AR3122, AR3123,
VR3125, VR3126, AR3127, AR2117.
A A 1
VR2111, AR3124 A B 2
VF2213, VR219 B A 3
AR3118, AR3121 B C 4
AF222 B D 5
AR2128 C A 6
AF226 C C 7
*As letras representam o tipo de perfil gerado por cada enzima.
32
Figura 6. Dendograma de similaridade de estirpes de referência de Azospirillum brasilense,
Azospirillum lipoferum e Azospirillum amazonense e de isolados caracterizados
morfologicamente com Azospirillum amazonense. Este dendrograma foi gerado pelo
programa NTSYS, algoritmo UPGMA e índice SM a partir dos perfis de restrição gerados
pela técnica de ARDRA.
2.5.4.4 Isolados caracterizados morfologicamente como Burkholderia spp.
A análise da diversidade genética dos isolados caracterizados como pertencentes ao
gênero Burkholderia pela caracterização morfológica, foi realizada com 30 isolados
representativos das diferentes partes da planta e das diferentes amostras de solo, todos obtidos
do meio de cultivo JMV, a origem destes isolados encontram-se na Tabela 12. Foram
utilizadas as enzimas AluI e HinfI que apresentam maior poder discriminatório para isolados
de Burkholderia spp., segundo BRASIL (2005).
A restrição dos fragmentos amplificados por PCR da região 16S DNAr pelas enzimas
AluI e HinfI das estirpes de Burkholderia brasilensis (M130), Burkholderia tropica (Ppe8) e
B. vietnamiensis (TVV75) e dos isolados caracterizados morfologicamente como
Burkholderia spp. gerou um total de sete perfis polimórficos (Figura 7). A maioria dos
isolados (54%) formaram o mesmo tipo de perfil que os das estirpes M130 de B. brasilensis e
TVV75 de B. vietnamiensis. Os demais isolados formaram cinco tipos distintos de perfil,
sendo, um com oito isolados e os demais com apenas um isolado cada (Tabela 13). Embora
não tenha sido observada uma grande diversidade entre os isolados, pela técnica do ARDRA,
foi observada influência do local de coleta da amostra de solo na diversidade dos isolados de
Burkholderia spp (Tabela 13). O tipo de perfil 3 foi mais comum no solo de Bacabal, que é de
terras altas, já o tipo de perfil 1 foi mais comum nos solos de Arari e Vitória do Mearim que
são solos de baixada. Além disso, os tipos de perfil 5, 6 e 7 apareceram só no solo de Arari.
O dendograma gerado pela análise de agrupamento dos isolados caracteridos como
Burkholderia pela caracterização morfológica mostra a formação de dois grupos principais
(Figura 8). O grupo I formado pelos isolados que apresentaram 100 % de similaridade com as
estirpes de referência M130 e TVV75 e o grupo II com dois subgrupos apresentando mais de
Grupo III
Grupo II
Grupo I
33
90 % de similaridade com a estirpe Ppe8 de B. tropica. A técnica do ARDRA não foi
suficiente para identificar espécies
Embora tenha sido observada grande diversidade entre os isolados, não foi observada
influência da parte da planta ou do local de coleta da amostra de solo na diversidade dos
isolados. Além disso, a técnica do ARDRA não foi suficiente para identificar espécies, sendo,
portanto, necessário o uso de técnicas mais precisas para a identificação dos isolados como o
sequenciamento da região 16S DNAr. PERIN (2007) observou grande variação entre isolados
de Burkholderia spp. obtidos de cana-de-açúcar pela técnica do ARDRA, no entando esta
técnica foi capaz de identificar apenas cinco isolados, dois como B. tropica e dois como
Burkholderia uname. RODRIGUES et al. (2006) caracterizaram isolados de Burkholderia
spp. obtidos de arroz e observaram que houve prodominância das espécies B. vietnamiensis e
Burkholderia kururiensis. BRASIL (2005) observou prodominância de B. vietnamiensis entre
isolados de Burkholderia spp. isolados de plantas de arroz.
34
Tabela 12. Origem dos isolados classificados previamente como Burkholderia spp. utilizados
na análise de caracterização genética.
Isolados Parte da planta Local de coleta da amostra de solo
AR516 RL Arari
AR5214 RD Arari
AF5323 PA Arari
AR5130 RL Arari
AR5131 RL Arari
AF5333 PA Arari
AR5244 PA Arari
AR5145 RL Arari
AR5150 RL Arari
AF5272 PA Arari
AR5276 RD Arari
BR514 RL Bacabal
BR518 RL Bacabal
BF5325 PA Bacabal
BR5161 RL Bacabal
BR5239 RD Bacabal
BR5154 RL Bacabal
BR5256 PA Bacabal
BR5257 PA Bacabal
BR5159 RD Bacabal
VR521 RD V. do Mearim
VR5135 RL V. do Mearim
VR5138 RL V. do Mearim
VR5140 RL V. do Mearim
VR5165 RL V. do Mearim
VR5166 RL V. do Mearim
VR5168 RL V. do Mearim
VR5169 RL V. do Mearim
VR5171 RL V. do Mearim
VF5120 PA V. do Mearim
VR4175 RL V. do Mearim
RL – Raiz lavada; RD – Raiz desinfestada; PA – Parte aérea.
35
Figura 7. Perfil eletroforético de restrição dos fragmentos da região 16S DNAr de estirpes de
referência Burkholderia brasilensis, Burkholderia tropica, Burkholderia vietnamiensis e de
novos isolados. Figura A. Rerstrição com AluI. Legenda: 1 (marcador de 100 pb), 2 (VR521),
3 (BR514), 4 (AR516), 5 (BR518), 6 (AR5214), 7 (VR5120), 8 (AF5323), 9 (BF5325), 10
(AR5130), 11 (AR5131), 12 (AR5132), 13 (AF5333), 14 (VR5135), 15 (VR5138), 16
(BR5239), 17 (marcador de 100 pb). Figura B. Restrição com HinfI. Legenda: 1 (marcador de
100 pb), 2 (BR514), 3 (AR516), 4 (BR518), 5 (AR5214), 6 (VR5120), 7 (AF5323), 8
(BF5325), 9 (AR5130), 10 (AR5131), 11 (AR5132), 12 (AF5333), 13 (VR5135), 14
(VR5138), 15 (BR5239), 16 (VR5140), 17 (TVV75), 18 (PPE8), 19 (M130), 20 (marcador de
100 pb).
Tabela 13. Perfil eletroforético de restrição dos fragmentos da região 16S DNAr de estirpes
de referência Burkholderia brasilensis, Burkholderia tropica, Burkholderia vietnamiensis e de
novos isolados.
Perfis de restrição
Estirpes e isolados
AluI HinfI
Tipos de
perfis
M130 (Burkholderia brasilensis), TVV75 (Burkholderia
vietnamiensis)
A* A 1
Ppe8 (Burkholderia tropica) B A 2
VR521, AR516, VR5120, AF5323, BF5325, AR5130, AR5131,
VR5138, BR5239, AR5150, BR5256, AR1161, VR5168,
VR5169, VF5271, AR5276
A A 1
BR514, BR518, AR5214, VR5135, BR5154, BR5257, BR5159,
VR5165
B B 3
AR5145 B C 5
AF5333 D A 6
AR5244 E D 7
*As letras representam o tipo de perfil gerado por cada enzima.
36
Figura 8. Dendograma de similaridade de estirpes de referência de Burkholderia brasilensis,
Burkholderia vietnamiensis, Burkholderia tropica e de isolados caracterizados
morfologicamente com Burkholderia spp. Este dendrograma foi gerado pelo programa
NTSYS, algoritmo UPGMA e índice SM a partir dos perfis de restrição gerados pela técnica
de ARDRA.
2.5.4.5 Isolados caracterizados morfologicamente como não identificados
A análise da diversidade genética dos isolados denominados “não identificados” com
base na caracterização morfológica, foi feita com 37 isolados representativos das diferentes
partes da planta e das diferentes amostras de solo (Tabela 14). Estes isolados foram obtidos
dos meios de cultivo NFB, LGI e LGIP. Os produtos de amplificação da região 16S do DNAr
foram digeridos com as enzimas de restrição AluI, RsaI e HinfI. A restrição dos fragmentos
amplificados por estas enzimas mostrou grande diversidade entre os isolados analisados,
gerando um total de 11 perfis polimórficos (Figura 9). Na Tabela 15 encontram-se os padrões
de restrição gerados por estas enzimas, onde pode se observar que o tipo de perfil 1 foi mais
comum no solo de Bacabal e Arari e os tipos de perfil 4, 6 e 8 só apareceram no solo de
Vitória do Mearim. Além disso, houve influência do meio de cultivo no qual estes isolados
foram obtidos. Dentre os isolados avaliados, obtidos dos meios NFB e LGIP, mais da metade
formou o mesmo perfil que o das estirpes M130 e TVV75, já os que foram obtidos do meio
LGI mostraram-se mais diversos. Apenas quatro desses isolados analisados agruparam com as
estirpes M130 e TVV75. Os demais formaram vários grupos, sendo três destes com apenas
um isolado cada.
A análise de agrupamento mostrou que a maioria dos isolados (54%) dos isolados
analisados se agruparam com as estirpes M130 de B. brasilensis e TVV75 de B. vietnamiensis
com 100% de similaridade (Grupo II). O grupo I foi formado por cinco isolados que
apresentaram 92% de similaridade com as estirpes de referência M130 e TVV75, já o grupo
III, foi formado por isolados que apresentaram maior similaridade (96%) com a estirpe Ppe8
de B. tropica. (Figura 10).
Grupo IGrupo II
37
Tabela 14. Origem dos isolados classificados pertencentes ao grupo “não identificados” e
utilizados para a caracterização genética.
Isolados Parte da planta Meio de cultivo Solo
AR111 RL NFB Arari
AR112 RL NFB Arari
AR223 RD NFB Arari
AF134 PA NFB Arari
BR115 RL NFB Bacabal
BR116 RL NFB Bacabal
BF137 PA NFB Bacabal
BF138 PA NFB Bacabal
BR129 RL NFB Bacabal
AR1210 RD NFB Arari
AR1111 RL NFB Arari
BR1212 RL NFB Bacabal
AR4213 RD LGIP Arari
AF4214 PA LGIP Arari
AR4115 RL LGIP Arari
AR4116 RL LGIP Arari
BR4217 RD LGIP Bacabal
BF4218 PA LGIP Bacabal
BR4119 RL LGIP Bacabal
BR4120 RL LGIP Bacabal
VF4321 PA LGIP V. do Mearim
VR4122 RL LGIP V. do Mearim
VR4123 RL LGIP V. do Mearim
VR4124 RL LGIP V. do Mearim
BR4225 RD LGIP Bacabal
AR3226 RD LGI Arari
AR3127 RL LGI Arari
AR3128 RL LGI Arari
AR3229 RL LGI Arari
BF3330 PA LGI Bacabal
BR3131 RL LGI Bacabal
BR3132 RL LGI Bacabal
BF3233 PA LGI Bacabal
VR3234 RD LGI V. do Mearim
VR3135 RL LGI V. do Mearim
VR3236 PA LGI V. do Mearim
VR3137 RL LGI V. do Mearim
RL – Raiz lavada; RD – Raiz desinfestada; PA – Parte aérea.
38
Figura 9. Perfil eletroforético de restrição dos fragmentos da região 16S DNAr de estirpes de
referencia de novos isolados. Restrição com AluI. Legenda: 1 (marcador de 100 pb), 2
(BR4119) 3 (BR4120), 4 (VF4321), 5 (VR4122), 6 (VR4123), 7 (VR4124), 8 (BR4225), 9
(AR3226), 10 (AR3127), 11 (AR3128), 12 (AR3229), 13 (BF3330), 14 (BR3131), 15
(BR3132), 16 (BF3233), 17 (VR3234), 18 (VR3135), 19 (VR3236), 20 (marcador de 100 pb).
Tabela 15. Perfil eletroforético de restrição dos fragmentos da região 16S DNAr de estirpes
de referência Burkholderia brasilensis, Burkholderia tropica, Burkholderia vietnamiensis e de
novos isolados não identificados pelas caracteristicas morfológicas.
Perfis de restrição
Estirpes e isolados
AluI HinfI RsaI
Tipos de
perfis
M130, TVV75 A* A A 1
Ppe8 B A E 2
AR112, BR115, BF137, BF138, BR129, AR1210,
BR1212, AF4214, AR4115, AR4116, BR4217, BF4218,
BR4120, VR4122, VR4124, BR4225, AR3226, BR3132,
BF3233
A A A 1
AR4213 A A B 3
VF4321, VR4123 A B B 4
AR1111, VR3236 A D D 5
VR3234, VR3137 B C D 6
AR111, BR116, AR3127, AR3229, BF3330, C A A 7
VR3135 B E D 8
BR3131 D C E 9
AF134, AR3128 C E C 10
AR223 C D D 11
*As letras representam o tipo de perfil gerado por cada enzima.
39
Figura 10. Dendograma de similaridade de estirpes de referência de Burkholderia brasilensis,
Burkholderia tropica, Burkholderia vietnamiensis e de isolados caracterizados
morfologicamente como “não identificados”. Este dendrograma foi gerado pelo programa
NTSYS, algoritmo UPGMA e índice SM a partir dos perfis de restrição gerados pela técnica
de ARDRA.
2.6 Conclusões
Foram isoladas bactérias diazotróficas agrupados de acordo com a caracterização
morfológica e pela técnica de ARDRA, como pertencentes aos gêneros Azospirillum,
Herbaspirillum e Burkholderia.
A análise de diversidade genética mostrou que houve alta diversidade entre os isolados
obtidos, principalmente os do gênero Burkholderia.
Foram encontrados isolados bacterianos eficientes na produção de ácido indol-acético
e capazes de fixar N
2
, portanto apresentam potencial para promover o crescimento vegetal
quando inoculados em plantas.
Grupo III
Grupo II
Grupo I
40
3 CAPÍTULO II
AVALIAÇÃO DO EFEITO DA INOCULAÇÃO DE BACTÉRIAS DIAZÓTROFICAS
NA PRODUÇÃO DE GRÃOS EM DIFERENTES CULTIVARES DE ARROZ
TRADICIONAIS
41
3.1 Resumo
O arroz (Oryza sativa L.) é um alimento de grande importância por ser uma excelente
fonte de carbohidratos e proteínas. Pela sua grande adaptabilidade edafoclimática é
considerado pela FAO como o alimento mais importante para a segurança alimentar do
mundo. O objetivo deste trabalho foi selecionar isolados diazotróficos nativos do estado do
Maranhão com base na habilidade destes em promover o crescimento de plantas. Para isso,
foram instalados experimentos em condições gnotobióticas, em vasos e em campo. Foram
testados três isolados representativos de cada grupo, com base na produção de AIA e ARA e
que foram inoculados em 10 variedades tradicionais de arroz do estado do Maranhão. Após a
inoculação as plantas foram crescidas por 30 dias em solução de Hoaglands em tubos de
ensaio. Foi observado efeito positivo dos tratamentos de inoculação de alguns isolados na
promoção do crescimento das plantas crescidas em condições gnotobióticas. Em vasos foram
testados sete isolados em associação com nove genótipos de arroz. Foi observado efeito dos
tratamentos de inoculação na produção de massa seca da parte aérea, no rendimento de grãos
e na massa de mil grãos, sendo que este efeito foi dependente do genótipo da planta. Em
condições de campo foram testados cinco isolados em associação com três genótipos de arroz
e não foi observado interação entre tratamentos de inoculação e genótipos para os parâmetros
estudados. Entretanto houve efeito simples dos tratamentos de inoculação na produção de
grãos, sendo que os isolados Herbaspirillum sp. AR1122 e A. amazonense AR3122
apresentaram maior potencial para promover o crescimento das plantas e aumentar a produção
de grãos na cultura do arroz.
42
3.2 Abstract
The rice (Oryza sativa L.) is an important source of carbohydrate and proteins. Due to
great edaphoclimatic adaptability it is considered by FAO as the most important food for
supplying the hungary of the World. The aim of this work was to select native diazotrophic
bacteria isolated from soil of the Maranhão State based on their ability to promote growth of
rice plants. Experiments were carrid out in gnotobiotic, pots and field conditions. Isolates
selected based on the production of AIA and ARA were evaluated in association with ten
traditional varieties of rice grown in Hoaglands solution for 30 days. A positive effect on
growth promotion of the plants was observed for some isolates as compared to the non-
inoculated plants. Seven isolates were tested in association with nine genotypes of rice grown
in pots. The results showed an effect of the inoculation on dry mass production of aerial part,
grain yield and mass of thousand grains, and this effect was dependent on the plant genotype.
In the field conditions, five isolates were tested with three rice cultivars and no interaction
was observed between the inoculation treatments and genotypes for the studied parameters.
Nevertheless, it was observed that among the isolates tested, the Azospirillum amazonense
AR3122 and Herbaspirillum sp AR1122 showed potential to promote growth of rice plants
and to increase the grain yield of this crop.
43
3.3 Introdução
O arroz (Oryza sativa L.) é um alimento de grande importância para população
mundial. Nos próximos anos, haverá a necessidade de se aumentar à produção mundial de
arroz para atender a demanda do crescimento populacional. As práticas agrícolas existentes
para atingir este objetivo requerem o uso de grandes quantidades de adubos nitrogenados,
uma vez que o nitrogênio é o principal nutriente que limita o crescimento de plantas em
muitos ecossistemas, sendo que a redução do uso destes compostos é um objetivo a ser
atingido pela agricultura moderna. O nitrogênio molecular (N
2
) compõe 78% dos gases da
atmosfera e pode ser fixado ou transformado em formas mais reduzidas, como NH
3
, que
podem ser assimiladas pelas plantas por processos biológicos mediados principalmente por
bactérias (NEVES e RUMJANEK, 1998).
A fixação biológica de nitrogênio (FBN) é a maior responsável pelo aporte de
nitrogênio nos sistemas biológicos, contribuindo com cerca de 65% do nitrogênio fixado
(NEWTON, 2000), fornecendo o nitrogênio necessário para o desenvolvimento vegetal
diretamente para as plantas por meio de associações, ou quando os organismos morrem e o
libera no ambiente (LINDERMAN e GLOVER, 2003). As gramíneas são capazes de associar-
se com diversas espécies de bactérias diazotróficas (KENNEDY et al., 2004). Experimentos
recentes têm demonstrado que plantas de arroz podem se beneficiar da associação com
bactérias diazotróficas, aumentando a produção quando inoculadas (TRAN VAN et al., 2000;
GOVINDARAJAN et al., 2008; RODRIGUES et al., 2007).
Existem diferenças consideráveis entre genótipos de arroz quanto à obtenção de
nitrogênio por meio da FBN (CAMPOS, 1999; BALDANI et al., 2000). No entanto, os
fatores envolvidos nestas diferenças não são bem conhecidos. A presença de um alto número
de células bacterianas diazotróficas, associadas às raízes de plantas de arroz, não significa,
necessariamente que as plantas sejam beneficiadas com quantidades significativas de
nitrogênio via FBN (BODDEY et al., 1995). REIS JUNIOR (1998) não observou diferença
entre a população de bactérias diazotróficas presentes em genótipos de cana-de-açúcar ditos
eficientes quanto ao potencial de FBN em relação aos não eficientes. Também, CAMPOS
(1999) visando identificar genótipos de arroz mais eficientes quanto a obtenção de nitrógenio
via fixação biológica, constatou que não houve diferença na população de bactérias
diazotróficas entre os genótipos considerados eficientes e os ineficientes.
Alguns estudos indicam que a promoção do crescimento em plantas de arroz não está
diretamente associada à fixação biológica de nitrogênio, mas a outros mecanismos (SUTRZ et
al., 2000; PENG et al., 2002). A promoção de crescimento pode ser o resultado de diversos
mecanismos como indução de resistência a patógenos, aumento da disponibilidade de
nutrientes pela solubilização de nutrientes minerais precipitados, e/ou produção de
fitohormônios que induzem a formação de pêlos radiculares adicionais ou raízes laterais,
produção de sideróforos e pela fixação de nitrogênio (RODRIGUEZ e FRAGA, 1999;
BISWAS et al., 2000; RAMAMOORTHY et al., 2001; GOVINDARAJAN et al., 2008).
Numerosos resultados positivos têm sido obtidos, no aumento da produção de arroz
devido a inoculação com bactérias diazotróficas. No entanto os resultados são inconsistentes e
isso tem dificultado a obtenção de um produto comercial (BASHAN, 1998). Isto pode ser
atribuído, em parte, a fatores ecológicos e ambientais como características físicas e químicas
do solo e capacidade dos microrganismos de se estabelecerem e competirem com a
comunidade microbiana nativa (STEENHOUDT e VANDERLEYDEN, 2000).
O objetivo deste trabalho foi selecionar isolados diazotróficos nativos do Estado do
Maranhão com base na habilidade destes em promover o crescimento de plantas de arroz e
aumentar a produção de grãos.
44
3.4 Material e Métodos
3.4.1 Avaliação preliminar das variedades e cultivares utilizadas para seleção de
estirpes
Foram utilizadas 17 variedades tradicionais de arroz provenientes de pequenos
produtores de arroz do estado do Maranhão (Tabela 16), sendo cinco com baixo teor de
proteína total nos grãos (Cutião, Cana Forte, Pingo D’água, Palha Murcha, Lajeado sem
Pelo), cinco com médio teor de proteína nos grãos (Bacabinha Roxo, Bacaba Comprido, Zebu
Branco, Lajeado Liso, Rabo de Burro) e cinco com alto teor de proteína (Cana Roxa, Zebu
Branco (caru), Bacabinha, Braquiária e Arroz 70) (ARAÚJO et al., 2003) acrescidas de seis
cultivares melhoradas (CNA4899, CNA7553, CNA8172, CNA3490, IR42 e IAC4440). Dado
a necessidade de multiplicar as sementes, para serem utilizadas nos experimentos de
inoculação in vitro e em vasos, foi instalado um experimento, em casa de vegetação, em vasos
contendo 4 kg de terra adubada de acordo com o recomendado para a cultura com base na
análise de solo.
Tabela 16. Genótipos de arroz utilizados para a multiplicação de sementes.
Genótipo Teor de proteína Local de origem Procedência
Arroz 70 V. do Mearim Araújo (2003)
Bacabinha V. do Mearim Araújo (2003)
Cana Roxa Viana Araújo (2003)
Manteiga Penalva Araújo (2003)
Zebú Branco
Alto (>8%)
Viana Araújo (2003)
Bacaba Comprido V. do Mearim Araújo (2003)
Bacabinha Roxo V. do Mearim Araújo (2003)
Braquiária V. do Mearim Araújo (2003)
Come Cru Vermelho Miranda Norte Araújo (2003)
Pingo D’água Viana Araújo (2003)
Zebú Branco (Caru)
Médio (7-8%)
V. do Mearim Araújo (2003)
Cana Forte Miranda Norte Araújo (2003)
Cutião Viana Araújo (2003)
Lajeado sem Pêlo Arari Araújo (2003)
Lajeado Liso V. do Mearim Araújo (2003)
Palha Murcha Penalva Araújo (2003)
Rabo de Burro
Baixo (6-7%)
Penalva Araújo (2003)
Melhoradas
CNA4899
CNA7553
CNA8172
CNA3490
Embrapa Arroz e
Feijão
IR42 IRRI
IAC4440 IAC
Os vasos foram dispostos inteiramente ao acaso em bancadas em casa de vegetação
com quatro repetições. As plantas foram coletadas à medida em que atingiam a fase de
45
maturação das sementes, quando foram separadas em panículas e palha e foram determinados
a produção de matéria seca total, o número de panículas por vaso, a percentagem de
espiguetas cheias e estéreis por panícula, a altura das plantas, a massa de mil sementes, o teor
de N das sementes e da parte aérea e a proteína bruta das sementes. A percentagem de
espiguetas cheias e estéreis por panícula foi determinada em três panículas, apanhadas ao
acaso de cada repetição, utilizadon-se o valor médio para cada repetição. A massa de mil
sementes foi determinada em amostras de 100 sementes de cada repetição e multiplicando-se
cada valor por 10, a fim de obter a referida massa.
As avaliações dos teores de N foram realizadas na Embrapa Agrobiologia, de acordo
com o método proposto por TEDESCO et al. (1995). As amostras da parte aérea das plantas
foram colocadas em estufa de circulação forçada a 65
o
C até peso constante e o material seco
foi moído e utilizado para análise de teor de N. Os grãos foram descascados a mão e moídos,
amostras de 200 mg de farinha de arroz foram digeridas com ácido sulfúrico e água oxigenada
e após a destilação, obteve-se o teor de N. O conteúdo de proteína bruta dos grãos foi
calculado pelo teor de N multiplicado pelo fator 5,95. Este fator é baseado no conteúdo de
nitrogênio (16,8%) da principal proteína do arroz, a glutelina (JULIANO, 1985).
3.4.2 Seleção de estirpes em condições gnotobióticas
Os isolados que apresentaram maior produção de AIA in vitro, foram inoculados, em
condições gnotobióticas, em 10 variedades tradicionais de arroz do Maranhão, sendo cinco
com alto teor de proteína bruta (Zebu Branco, Arroz 70, Cana Roxa, Bacabinha, e Braquiária)
e cinco com baixo teor de proteína bruta (Cana forte, Come Cru Vermelho, Pingo D’água,
Lajeado Liso e Bacaba Comprido) (ARAÚJO et al., 2003). Além disso, foi incluída a cultivar
IR42 utilizada como controle. Os ensaios foram conduzidos em tubos de ensaio transparentes
com 120 mL de capacidade, contendo 60 mL de solução de Hoaglands, sem nitrogênio, em 6
g de agar . L
-1
(BALDANI et al., 2000). Foram conduzidos dois experimentos. No primeiro,
foram utilizados 10 isolados, sendo três de Herbaspirillum ssp. (VR2117, AR1122 e
AR1124), três de Azospirillum ssp. (BR2113, AR1135 e BF1358), três de Azospirillum
amazonense (VR218, VF2213 e AR3122) e um de Sphingomonas spp. (AR2112). A estirpe
ZAE94 de Herbaspirillum seropedicae foi utilizada com controle positivo, além de um
tratamento controle inoculado com células mortas de ZAE94. No segundo experimento foram
utilizados três isolados de Burkholderia ssp. (BF5327, BF5276 e BF4231), além da estirpe
ZAE94 e do tratamento controle inoculado com células mortas por autoclavagem.
A inoculação foi realizada antes da solidificação do meio (40 a 45ºC) com 1 mL da
cultura líquida de cada estirpe, crescida no meio DYGS por 16 horas contendo 10
9
células
mL
-1
e o controle foi inoculado com 1 mL
-1
células previamente autoclavadas. Antes do
plantio, as sementes foram desinfestadas e pré-germinadas em placas de ágar-água (1%), por
dois dias a 30°C. Apenas as sementes livres de contaminantes microbianos foram plantadas
(BALDANI et al., 2000).
Os tubos com as plântulas foram mantidos em casa de bio-segurança a 25ºC por 30
dias. Após este período as plantas foram retiradas do meio e lavadas em água corrente para
eliminar resíduos do meio e postas para secar em papel toalha para retirar o excesso de
umidade e determinada a massa fresca. A massa seca foi determinar após as amostras serem
levadas à estufa de circulação de ar forçado a 65ºC por 72 horas.
Os experimentos foram conduzidos no delineamento inteiramente casualizado em
esquema fatorial, sendo o primeiro, 11 x 12 (11 genótipos e 12 tratamentos de inoculação) e o
segundo, 11 x 5 (11 genótipos e 5 tratamentos de inoculação) ambos com quatro repetições.
Os dados foram submetidos à análise de variância e as médias testadas pelo teste de Scott-
Knott a 5% de probabilidade.
46
3.4.3 Seleção de estirpes em condições de vasos e em campo
3.4.3.1 Experimento em vasos
Os isolados que proporcionaram maior acúmulo de massa seca nas plantas de arroz,
quando comparados com o controle positivo ZAE94 foram testados simultaneamente em dois
experimentos de inoculação, um em vasos e outro em campo. O experimento em vasos foi
instalado no dia 20 de janeiro de 2007 na Embrapa Agrobiologia em Seropédica, RJ, e o de
campo no dia 08 de fevereiro de 2007 na Embrapa Meio Norte em Teresina, PI.
O experimento em vasos foi instalado em vasos plásticos, pintados externamente com
tinta alumínio, contendo 4 kg de terra fina seca ao ar destorroada e peneirada proveniente de
um Planossolo série ecologia. Os vasos foram mantidos ao ar livre, entre as casas de
vegetação, na área experimental da Embrapa Agrobiologia dispostos em blocos ao acaso em
esquema fatorial (nove tratamentos de inoculação x nove genótipos) com quatro repetições.
Os tratamentos consistiram da inoculação das sementes de cada genótipo com dois isolados de
Azospirillum spp.: BR2113 e BF1358; dois de A. amazonense VR218 e AR3122; dois de
Herbaspirillum spp. AR1122 e AR1124; e um de Sphingomonas spp. AR2112. A estirpe
ZAE94 de H. seropedicae foi utilizada como controle positivo, além da testemunha
nitrogenada que recebeu 100 kg de nitrogênio na forma de nitrato de amônio dividido em três
aplicações, sendo, 20 kg ha
-1
no início do perfilhamento, 40 kg ha
-1
, 50 dias após emergência
e 40 kg ha
-1
aos 75 dias após emergência.
Uma semana antes do plantio, procedeu-se a adubação com base na análise química do
solo. Os resultados da análise do solo encontram se na Tabela 17. Foi aplicada em cada vaso
uma dose equivalente a 120 kg de P
2
O
5
ha
-1
na forma de superfosfato simples e
micronutrientes na dose equivalente a 60 kg de FTE BR-12 ha
-1
. No início do perfilhamento
(25 dias após a emergência) em todos os tratamentos foi aplicada uma solução de NH
4
NO
3
na
dose equivalente a 10 kg de N ha
-1
e uma de K
2
SO
4
na dose 30 kg ha
-1
. Posteriormente, aos 50
dias após a emergência foi aplicada outra dose de NH
4
NO
3
equivalente a 10 kg de N ha
-1
.
Tabela 17. Análise química das amostras de solo utilizadas nos experimentos em vasos e de
campo.
Solos PH/H
2
O
Al
cmol
c
dm
-3
Ca + Mg
Ca
mg dm
-3
Mg P K
RJ 5,8 0,1 0,7 0,5 0,2 17,3 45,6
PI 6,1 0,1 7,4 5,9 1,5 7,8 310,0
No experimento em vasos foram utilizadas seis variedades tradicionais de arroz do
estado do Maranhão, sendo três com alto teor de proteína total nos grãos (Zebu Branco, Arroz
70 e Braquiária) e três com e baixo teor de proteína total (Cana forte, Come Cru Vermelho e
Pingo D’água) (ARAÚJO et al., 2003). Além disso, foram usadas duas cultivares
recomendadas para o estado do Maranhão (Bonança e Canastra). A cultivar IR42 foi utilizada
como controle positivo.
As suspensões bacterianas utilizadas no preparo do inoculante foram obtidas a partir
de culturas puras crescidas por 16 horas em meio Dygs sob agitação. Após esse período, a
concentração das suspensões foi determinada por meio da densidade ótica em
espectrofotômetro com comprimento de onda de 620 nm e foi ajustada para aproximadamente
109 células mL-1. O inoculante foi preparado adicionando-se 15 mL da suspensão de cada
47
bactéria, em sacos de polietileno contendo 35 g de turfa (previamente moída, seca, corrigida a
acidez e esterilizada). As sementes foram desinfestadas superficialmente com hipoclorito de
sódio a 1%, por 10 minutos, em seguido, de quatro lavagens com com água destilada estéril e
colocadas para secar em fluxo laminar por duas horas. Estas sementes foram inoculadas,
utilizando-se uma proporção de 10 g do inoculante por kg de semente, empregando-se uma
solução de goma arábica a 10% para fixar o inoculante às sementes e, em seguida, foram
colocadas para secar à sombra antes da utilização.
Cada vaso foi considerado como uma parcela experimental, onde foram plantadas oito
sementes, sendo feito o desbaste após a emergência, deixando-se três plantas uniformes por
vaso. No início da fase de florescimento foi retirada uma planta para contagem das bactérias
nos tecidos vegetais, mantendo-se duas até o término do ciclo da cultura.
As plantas foram coletadas à medida em que atingiam a fase de maturação dos grãos,
sendo cortadas rente ao solo e separadas em panículas e palha. Os seguintes parâmetros foram
efetuados as seguintes avaliações: altura das plantas, número de panículas, número de grãos
por panícula, massa de 1000 grãos, produção de massa seca da parte aérea e produção de
grãos, teor de N da parte aérea e proteína bruta dos grãos.
A altura das plantas foi determinada medindo-se à distância da base da planta até o
ápice das folhas bandeira com os limbos distendidos, a massa de 1000 grãos foi determinada
pesando-se em balança analítica 100 grãos por parcela e multiplicando-se por 10 sendo os
resultados corrigidos para 13% de umidade dos grãos. A massa seca da parte aérea foi obtida
pela pesagem das amostras após terem secado em estufa de circulação de ar forçada à
temperatura de 65ºC até atingirem peso constante. A produção de grãos foi determinada para
cada parcela, corrigida para 13% de umidade expressos em gramas por vaso. As avaliações
dos teores de N foram realizadas conforme descrito anteriormente.
Os dados obtidos foram submetidos à análise de variância e as médias comparadas
pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade.
3.4.3.2 Experimento em campo
No experimento em condições de campo foram utilizadas duas variedades típicas do
Maranhão, sendo uma com alto teor de proteína bruta do grão (Arroz 70) e uma com baixo
teor de proteína bruta do grão (Cana Forte), além da cultivar Bonança recomendada para a
região e utilizada como controle. Foram utilizados quatro isolados (AR3122 de A.
amazonense, AR1122 de Herbaspirillum spp., BR2113 de Azospirillum spp., AR2112 de
Sphingomonas spp.), além da estirpe ZAE94 e um controle com 100 kg ha
-1
de nitrogênio
mineral.
O experimento foi instalado no campo experimental da Embrapa Meio-Norte em
Teresina, PI, adotando-se o delineamento experimental em blocos ao acaso, em esquema
fatorial (seis tratamentos de inoculação x três genótipos de arroz de sequeiro) com quatro
repetições. Os tratamentos consistiram da inoculação das sementes de cada genótipo com cada
uma das bactérias diazotróficas, mais a testemunha nitrogenada. As sementes foram
misturadas à turfa na proporção de 10
9
células por grama de turfa, utilizando-se uma
proporção de 10 g do inoculante por kg de semente e, em seguida, secas à sombra antes da
utilização. Foram plantadas 100 sementes por metro linear.
Cada parcela ocupou 3 m
2
(1,5 x 2 m) com cinco linhas de 2,0 m de comprimento
espaçadas de 0,30 m, sendo a área útil constituída pelas 3 linhas centrais, desprezando-se 0,5
m em ambas as extremidades de cada linha.
A adubação foi realizada de acordo com o recomendado para a cultura com base na
análise de solo, aplicando-se 120 kg de P
2
O
5
ha
-1
na forma de superfosfato simples e 60 kg de
K
2
O ha
-1
na forma de cloreto de potássio no plantio. O nitrogênio (20 kg ha
-1
) na forma de
48
uréia) foi aplicado em cobertura, 20 dias após a emergência das plantas em todos os
tratamentos. Os tratos culturais foram os recomendados para a cultura.
Na ocasião da colheita foram avaliados os seguintes parâmetros: altura das plantas,
medindo-se, ao acaso, cinco plantas por parcela, a distância da superfície do solo até o ápice
das folhas bandeira com o limbo destendido; número de panículas, mediante contagem na
área útil de cada parcela; número de grãos por panícula, amostrando-se ao acaso 10 panículas
em cada parcela; massa de 1.000 grãos, pesando-se em balança analítica 100 grãos oriundos
das 10 panículas coletadas ao acaso mutiplicado por 10 e os resultados expressos em peso de
1.000 grãos e corrigidos para 13% de umidade; produção de massa seca, obtida pela pesagem
de amostras de cinco plantas por parcela coletadas ao acaso e colocadas para secar em estufa à
temperatura de 65ºC, até atingirem peso constante. A produção de grãos foi determinada com
base na área útil de 1 m
2
por parcela, nas quais se determinou o peso e umidade dos grãos,
sendo os resultados expressos em Mg ha
-1
, a 13% de umidade.
Os dados obtidos foram submetidos à análise de variância e as médias comparadas
pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade.
3.5 Resultados e Discussão
3.5.1 Avaliação de características agronômicas das variedades e cultivares utilizadas
para a seleção de estirpes
As variedades tradicionais Lajeado Liso, Lajeado sem Pelo e Rabo de Burro,
apresentaram um ciclo mais longo (180 dias) e maior produção de matéria seca total e número
de panículas por vaso em relação aqueles de ciclo mais curto (Tabela 18). As variedades
tradicionais apresentaram maior altura o que pode favorecer-las na competição com plantas
invasoras, podendo ser uma vantagem no sistema de cultivo de roça em toco, comum no
estado do Maranhão. Houve diferença na massa de mil sementes entre os genótipos. Esta é
uma variável estável dentro da variedade, porém dependente da translocação de carboidratos
que tem sua síntese e remobilização influenciadas pelas condições ambientais. Todos os
genótipos apresentaram uma alta percentagem de espiguetas estéreis (dados não mostrados),
embora tenha havido diferença entre estes, isto pode ter ocorrido em função das altas
temperaturas observadas durante o período reprodutivo.
Houve diferença significativa para o teor de N na palha e nas sementes e de proteína
bruta entre os genótipos estudados (Tabela 19). As variedades de Lajeado (sem Pelo e Liso)
apresentaram menor teor de proteína nos grãos, resultados estes que estão de acordo com
ARAUJO et al. (2003) que observaram menor teor de proteína nos grãos nestas variedades.
De um modo geral, as cultivares apresentaram um teor de proteína mais elevado que os
observados por ARAUJO et al. (2003) quando trabalharam com as mesmas variedades
procedentes do estado do Maranhão. Também FERRAZ JUNIOR et al. (2001) observaram
que algumas variedades apresentaram teores diferentes de proteína bruta quando cultivadas no
Rio de Janeiro ou no Maranhão enquanto que para outras variedades não houve alteração
neste parâmetro. Segundo JULIANO (1985), os teores de proteína bruta dos grãos podem
variar muito, devido a mudanças nas condições ambientais, sendo que para o arroz, a
disponibilidade de N é um dos principais fatores ambientais que afetam o teor de proteína
bruta dos grãos.
49
Tabela 18. Biomassa da parte aérea e número de panículas, número de espiguetas, massa de
mil sementes, altura das plantas e ciclo em dias de 23 genótipos de arroz cultivados em vaso.
Genótipo
Biomassa seca
de palha (g)
Número de
panículas
Número de
espiguetas por
panícula
Massa de 1000
sementes (g)
Altura das
plantas (cm)
Ciclo
(dias)
Cutião 14,35D* 5,25B 68,33C 31,45C 101 120
IAC4440 23,23B 10,50A 77,66C 24,88F 80 120
IR42 24,89B 9,25A 91,33B 22,45G 81 135
Arroz 70 12,85E 6,00B 47,5F 33,86B 91 135
Bacabinha 13,88D 4,00C 125,00A 20,65H 112 135
Cana Roxa 16,40C 4,25C 85,33B 28,43D 117 135
Manteiga 16,37D 4,25C 109,16A 21,82G 107 135
Zebu Branco 14,76D 4,00C 95,58B 28,82D 125 135
Braquiária 17,78C 4,75C 72,25C 25,22F 121 135
Bacaba Comprido 16,94C 5,25B 83,83B 30,98C 120 135
Bacabinha Roxo 11,19E 3,00C 94,25B 27,33E 105 135
Come Cru Vermelho 15,01D 5,75B 73,00C 30,58C 103 135
Pingo D’água 17,10C 6,75B 61,49D 26,26F 118 135
Zebu Branco (Caru) 11,72E 3,50C 89,45B 29,45D 118 135
Cana Forte 15,35D 4,50C 62,75D 27,52E 106 135
Palha Murcha 14,43D 5,00C 65,00C 36,36A 103 135
CNA4899 22,93B 10,00A 78,00C 22,36G 75 135
CNA7553 22,68B 11,50A 77,66C 22,45G 76 135
CNA8172 09,52E 4,50C 73,50C 25,81F 69 135
Lajeado Liso 46,58A 10,75A 69,75C 23,55G 115 180
Lajeado sem Pelo 46,77A 10,50A 82,16E 21,95G 118 180
Rabo de Burro 20,52B 6,00B 105,91A 22,01G 99 180
CNA3490 17,63C 7,75B 62,75D 19,69H 70 180
C.V. (%) 11,16 9,20 7,5 3,78
* Médias seguidas por letras iguais não diferem entre si pelo teste de Scott-Knott a 5% de probabilidade.
Tabela 19. Teor de N nas sementes e na parte aérea e ter de proteína bruta total de 23
genótipos de arroz.
Genótipo Teor de N na semente (%) Teor de N na palha (%) Proteína bruta
Arroz 70 1,55A* 0,45E 9,24A
Bacabinha 1,52A 0,452E 9,02A
Cana Roxa 1,43B 0,42E 8,48B
Manteiga 1,39B 0,44E 8,27B
Zebu Branco 1,36B 0,43E 8,08B
Braquiária 1,44B 0,38E 8,54B
Bacaba Comprido 1,34B 0,37E 7,96B
Bacabinha Roxo 1,42B 0,45E 8,46B
Come Cru Vermelho 1,33B 0,36E 7,87B
Pingo D’água 1,45B 0,35E 8,63B
Zebu Branco (Caru) 1,34B 0,42E 7,94B
Cana Forte 1,35B 0,49C 8,04B
Palha Murcha 1,38B 0,44E 8,21B
Cutião 1,42B 0,49E 8,24B
Lajeado Liso 1,08D 0,79B 6,38C
Lajeado sem Pelo 1,11D 0,72C 6,61C
Rabo de Burro 1,39B 0,81B 8,28B
CNA4899 1,54A 0,55D 9,14A
CNA7553 1,39B 0,49D 8,32B
CNA8172 1,68A 0,64C 9,96A
CNA3490 1,32B 0,98A 7,82B
IR42 1,32B 0,54D 7,82B
IAC4440 1,23C 0,58D 7,34B
C.V. (%) 7,10 13,61 7,10
* Médias seguidas por letras iguais não diferem entre si pelo teste de Scott-Knott a 5% de probabilidade.
50
3.5.2 Avaliação e seleção de isolados de bactérias diazotróficas em associação com
diferentes variedades de arroz crescidas em condições gnotobióticas
Os resultados obtidos nos experimentos de inoculação em condições gnotobióticas,
não mostraram interação entre as estirpes inoculadas e os genótipos das plantas testados
(Tabela 20). Embora tenha havido diferença entre as estirpes inoculadas quanto acúmulo de
matéria seca pelas plantas, não foi observado efeito positivo da inoculação para os diferentes
genótipos de arroz, sendo observado até efeito negativo na maioria das estirpes inoculadas
quando comparadas com o controle não inoculado (Tabela 21). Somente os isolados AR3122
de A. amazonense e AR2112 de Sphingomonas spp. não promoveram a diminuição da
produção de matéria seca quando comparados com o controle não inoculado. FERREIRA et
al. (2003) também não observaram interação entre estirpes de H. seropedicae ZAE94 e B.
brasilensis M130 e as variedades de arroz IR42 e IAC4440 em condições gnotobióticas,
embora não tenha sido observado efeito inibitório no crescimento das plantas. Entre 80
isolados testados em condições gnotobióticas apenas quatro apresentaram efeito positivo para
o crescimento de plantas (BALDANI et al., 2000).
Tabela 20. Acúmulo de massa seca (mg) em 11 genótipos de arroz inoculadas com diferentes
isolados bactérias diazotróficas dos gêneros Herbaspirillum e Azospirillum em condições
gnotobióticas.
Isolados
Cana
Roxa
Zebu
Branco
Bacabinha Braquiária
Arroz
70
Bacaba
comprido
Pingo
D’água
Lageado
Liso
Cana
Forte
Come
Cru
IR42 Média
AR3122 62,3* 52,0 44,7 61,0 58,2 52,0 51,2 52,7 63,0 58,5 51,2 55,2a
AR2112 55,5 47,0 42,0 51,2 60,7 58,5 47,2 43,0 48,2 55,2 45,5 50,4ab
VR218 57,5 46,5 45,3 50,7 58,0 47,0 47,7 38,0 48,2 50,0 45,5 48,0ab
VF2213 44,3 51,0 40,7 46,7 54,0 46,2 40,0 27,5 41,5 53,7 41,0 44,0bc
BF1358 36,0 37,7 32,7 52,2 51,7 46,5 34,7 24,7 27,7 41,7 48,7 39,5cd
AR1135 33,5 40,5 25,0 37,7 35,2 40,0 36,0 23,0 30,2 40,2 30,0 33,7de
AR1124 34,0 28,5 24,7 32,0 42,7 32,0 32,7 15,5 25,7 41,2 31,2 30,9ef
BR2113 40,7 29,7 13,0 36,0 37,2 37,7 27,2 23,0 35,2 27,5 31,0 30,7ef
VR2117 37,0 25,0 19,7 31,5 35,0 37,2 27,7 24,2 27,7 36,5 23,0 29,5f
AR1122 35,5 29,7 27,2 26,5 31,7 38,2 23,2 15,0 31,7 34,2 25,5 28,0f
ZAE94
(controle
positivo)
40,3 41,0 35,7 35,0 43,2 47,3 35,0 31,2 43,2 34,2 38,5 38,6cd
Testemunha
absoluta
48,5 51,0 48,2 56,7 60,2 50,7 50,0 43,0 42,5 61,5 42,2 50,7ab
Média 43,7AB 39,9AB 33,3CD 43,1AB 47,3A 44,4AB 37,7CD 30,0D 38,7BC 44,5AB 37,5BC
C.V. (%) 28,00
* Médias seguidas por letras iguais (maiúsculas para cultivares e minúsculas para procedimento de inoculação) não diferem entre si pelo
teste de Tukey a 5% de probabilidade.
O efeito negativo pode ter ocorrido em função do alto número de células utilizadas no
inóculo o que pode ter desencadeado uma resposta defensiva da planta. JAMES et al. (2002)
observaram que a colonização muito agressiva por H. seropedicae na cultivar IR72 ocasionou
uma resposta defensiva da planta à colonização com efeitos negativos ao crescimento vegetal.
A resposta da planta ao AIA, liberado por bactérias, pode variar de efeito benéfico a inibitório
dependendo da concentração. Quando a concentração de AIA endógeno nas raízes já se
encontra em níveis ótimos para o crescimento, o AIA adicional liberado pelas bactérias pode
alterar o metabolismo da planta e afetar o crescimento (BARAZANI e FRIEDMAN, 1999).
Estes autores observaram que altas concentrações de AIA, produzido por bactérias, inibiram o
crescimento de raízes de alface em condições axênicas.
51
Tabela 21. Acúmulo de massa seca (mg) em 11 genótipos de arroz inoculados com bactérias
diazotróficas do gênero Burkholderia em condições gnotobióticas.
Isolados
Cana
Roxa
Zebu
Branco
Bacabinha Braquiária
Arroz
70
Bacaba
comprido
Pingo
D’água
Lageado
Liso
Cana
Forte
Come
Cru
IR42 Média
BF4231 44,0* 36,5 28,3 37,2 49,0 45,2 37,2 33,0 42,7 55,5 38,5 40,6b
BF5327 36,5 44,5 32,0 40,7 43,5 44,2 38,2 24,2 43,5 48,7 40,7 39,7b
BF5276 45,5 36,5 31,7 35,2 54,0 41,0 40,7 34,0 35,0 43,2 34,5 39,2b
ZAE94
(controle
positivo)
40,2 41,0 35,7 35,0 43,2 47,2 35,0 31,2 43,5 34,2 38,5 36,6b
Testemunha
absoluta
48,5 51,0 48,3 56,7 60,2 50,7 50,0 43,0 42,5 61,5 45,2 50,7a
Média 42,9AB 41,9AB 35,2BC 40,0AB 50,0A 45,7AB 40,2AB 33,1C 41,4AB 48,6A 39,5BC
C.V. (%) 25,06
* Médias seguidas por letras iguais (maiúsculas para cultivares e minúsculas para procedimento de inoculação) não diferem entre si pelo
teste de Tukey a 5% de probabilidade.
Os isolados de A. amazonense e o de Sphingomonas spp. que produziram as maiores
quantidades de AIA in vitro, foram aqueles que causaram menor efeito inibitório ao
crescimento das plantas, sugerindo que o efeito inibitório não é devido ao AIA produzido,
mas sim a outros fatores como, por exemplo, outros fitohormônios. RODRIGUES et al.
(2007) não observaram correlação entre a produção de compostos indólicos in vitro e a
promoção do crescimento de plantas de arroz das cultivares IR42 e IAC4440 por isolados de
A. amazonense quando avaliados em condições gnotobióticas. Os autores observaram ainda
que os tratamentos de inoculação para a maioria dos isolados testados apresentaram efeito
inibitório no crescimento de plantas. Também, BACILIO-JIMÉNEZ et al. (2001) observaram
efeito inibitório em plantas de arroz inoculadas com Azospirillum brasilense crescidas em
condições gnotobióticas. A resposta da planta à produção de compostos indólicos por
bactérias é influenciada pelo genótipo da planta e do microrganismo. JAIN e PATRIQUIN
(1985) observaram, em trigo, que as mudanças na ramificação das raízes das plantas foram
influenciadas por estirpes de Azospirillum spp. e a cultivar de trigo.
A comparação do efeito da inoculação dos diferentes isolados com a estirpe ZAE94,
usada como controle positivo, mostrou que houve maior produção de matéria seca nas plantas
inoculadas com os isolados de A. amazonense (AR3122, VR218 e BR2113),
Sphingomonas spp. (AR2112) e Azospirillum spp. (BF1358) (Tabela 20). Já para os isolados
de Burkholderia spp. (Tabela 21), não foi observado diferença quando comparados com a
estirpe ZAE94. Por outro lado, foi constatada entre as variedades de arroz utilizadas, nos dois
experimentos de inoculação em condições gnotobióticas, diferenças no ganho de massa seca
(Tabelas 20 e 21). Estas diferenças podem ser em função exclusiva do genótipo das plantas
independentemente dos tratamentos de inoculação.
3.5.3 Experimento de arroz cultivado em vasos com terra e inoculado com isolados
previamente selecionados
A análise dos dados do experimento realizado em vasos, mostrou que houve interação
entre tratamentos de inoculação e os genótipos de arroz no acúmulo de massa seca da parte
aérea, rendimento de grãos, número de grãos cheios por panícula e massa de mil grãos
(Tabelas 22, 23 e 24). Para estes parâmetros, a resposta das plantas à inoculação com
bactérias diazotróficas foi dependente do genótipo da planta de arroz. Em arroz, é comum se
observar diferença na FBN entre os genótipos avaliados (SHRESTHA e LADHA, 1996;
BALDANI et al., 2000), sugerindo que a associação entre as plantas e as bactérias fixadoras é
controlada pelas plantas. Também, RETHATI et al. (2000) estudando a associação de
52
cultivares de arroz com A. brasilense e H. seropedicae observaram que a inoculação de ambas
as bactérias aumentou a massa das raízes das plantas e que este efeito benéfico, devido à
inoculação, foi altamente dependente da cultivar.
Tabela 22. Acúmulo de massa seca (g/planta) da parte aérea de nove genótipos de arroz,
inoculados com isolados de Azospirillum amazonense (VR218 e AR3122), Azospirillum spp.
(BR2113 e BF1358), Herbaspirillum spp. (AR1122 e AR1124) e Sphingomonas spp.
(AR2112) em vasos.
Isolados
Zebu
Branco
Arroz 70 Braquiária
Cana
Forte
Pingo
D’água
Come
Cru
Bonança IR42 Canastra Média
AR1122 9,3ABb* 10,6Aa 6,5CDb 8,6BCb 8,2BCd 7,2BCbc 6,4CDa 8,9ABab 6,0Dbc 7,8
VR218 8,5Abc 8,2Abc 6,2Ab 8,4Ab 7,8Ad 8,2Aab 7,1Aa 6,3Ac 7,4Aab 7,6
AR1124 8,3ABbc 9,8Aab 5,7Db 8,3ABb 9,4Abc 6,7BCc 5,9CDa 7,1CDbc 4,7Dc 7,5
BF1358 7,6ABbc 6,7ABcd 6,2BCb 7,6ABb 8,7Acd 8,2ABbc 5,6Ca 6,5ABc 5,3Cbc 7,0
AR2112 6,8Ccd 9,6ABab 6,6Cb 7,8BCb 11,4Ac 6,6Cc 6,3Ca 6,7Cbc 6,1Cbc 7,6
AR3122 6,8BCcd 7,7BCbc 7,4BCab 11,7Aa 8,7Bcd 6,5BCc 7,8BCa 8,2CDab 6,8BCbc 7,6
BR2113 6,1Dd 9,0ABbc 6,7CDab 9,2ABb 10,6Abc 8,4BCbc 6,1Da 6,0Cc 6,2Dbc 7,8
ZAE94 (controle
positivo)
8,7Abbc 7,4BCcd 6,0Cb 9,8Aab 9,7ABbc 9,4ABab 6,1Ca 6,3Cc 5,4Cbc 7,7
Testemunha
Nitrogenada
(100Kg/há).
13,6Aba 11,3CDa 9,0DEa 11,8BCa 15,1Aa 10,2Ea 7,9Ea 10,4CDa 9,5DEa 11,0
Média 8,4 8,9 6,7 9,2 7,0 7,9 6,5 7,4 6,4
C.V. (%) 13,15
* Médias seguidas por letras iguais (maiúsculas para cultivares e minúsculas para procedimento de inoculação) não diferem entre si pelo
teste de Tukey a 5% de probabilidade.
Tabela 23. Produção de grãos (g/vaso) de nove genótipos de arroz, inoculados com isolados
de Azospirillum amazonense (VR218 e AR3122), Azospirillum spp. (BR2113 e BF1358),
Herbaspirillum spp. (AR1122 e AR1124) e Sphingomonas spp. (AR2112) em vasos.
Isolados
Zebu
Branco
Arroz 70 Braquiária
Cana
Forte
Pingo
D’água
Come
Cru
Bonança IR42 Canastra Média
AR1122 5,7BCa* 8,1ABa 6,6BCb 6,6BCab 6,8BCab 6,4BCa 5,8BCab 9,2Aab 4,8Cb 6,7
VR218 4,7Ca 6,6ABab 7,6ABab 8,0Aa 6,3ABCb 7,8ABa 5,5BCb 7,6ABb 5,7BCab 6,5
AR1124 6,0Aa 7,3Aab 7,1Aab 6,1Aab 6,5Ab 7,2Aa 5,2Ab 7,2Ab 5,2Aab 6,4
BF1358 6,8ABa 7,0ABab 7,0ABab 6,0ABab 5,1Bb 6,4ABa 4,8Bb 7,7Ab 5,5ABab 6,3
AR2112 6,7ABa 7,2ABab 7,0ABab 5,1Bb 5,6Bb 5,8Ba 5,6Bb 8,7Aab 6,5ABab 6,5
AR3122 5,6Ba 6,9ABab 7,6ABab 6,9ABab 5,4Bb 6,5Ba 6,2Bab 9,2Aab 5,8Bab 6,7
BR2113 5,4ABa 7,4ABab 6,6ABb 6,3ABab 6,3ABb 7,2ABa 5,1Bb 7,7Ab 6,2ABab 6,5
ZAE94 (controle
positivo)
6,1Ba 5,7Bb 7,2ABab 6,9ABab 6,2Bb 6,0Ba 5,4Bb 8,7Aab 5,9Bab 6,5
Testemunha
Nitrogenada
(100Kg/há).
6,5Ca 7,0BCab 9,0Aba 7,3BCab 9,1ABa 6,3Ca 8,1BCa 10,7Aa 7,4BCa 7,9
Média 5,9 7,0 7,3 6,6 6,4 6,5 5,8 8,5 5,7
C.V. (%) 15,71
* Médias seguidas por letras iguais (maiúsculas para cultivares e minúsculas para procedimento de inoculação) não diferem entre si pelo
teste de Tukey a 5% de probabilidade.
53
Tabela 24. Grãos cheios por panícula de nove genótipos de arroz, inoculadas com isolados de
Azospirillum amazonense (VR218 e AR3122), Azospirillum spp. (BR2113 e BF1358),
Herbaspirillum spp. (AR1122 e AR1124) e Sphingomonas spp. (AR2112) em vasos.
Isolados
Zebu
Branco
Arroz 70 Braquiária
Cana
Forte
Pingo
D’água
Come
Cru
Bonança IR42 Canastra Média
AR1122 71,0Aab* 61,0ABa 43,0BCb 57,3ABab 50,0BCbc
46,8BCbc
56,8ABa 36,3Ca 56,0BCa 53,11
VR218 52,5Ab 60,8Aa 45,5ABb 64,5Aa 52,5Abc 49,3ABbc 60,0Aa 31,8Ba 60,5Aa 53,03
AR1124 56,5ABb 53,3ABa 50,5ABab 44,0ABb 59,8Aab 54,0ABbc 53,3ABa 37,0Ba 47,8ABa 50,66
BF1358 67,5Aab 51,0ABa 54,5Aab 48,8ABab 52,3ABbc 62,3Aabc 48,0ABa 34,0Ba 49,8ABa 52,00
AR2112 61,3Ab 61,5Aa 58,8ABab 50,0ABab 41,0BCc 53,0ABbc 47,0BCa 34,3Ca 59,5ABa 51,80
AR3122 82,0Aa 51,3BCa 54,3ABab 44,3Cb 69,3ABa 42,8Cc 58,5BCa 39,3Ca 56,3BCa 55,30
BR2113 60,3ABb 58,5ABa 52,3ABab 55,5ABab 46,0ABbc 66,5Aab 59,0ABa 42,0Ba 53,3ABa 54,91
ZAE94 (controle
positivo)
55,3Ab 54,8Aa 58,3Aab 51,0Aab 62,0Aab
57,3Aabc
56,0Aa 42,8Aa 50,5Aa 54,19
Testemunha
Nitrogenada
(100Kg/há).
60,3ABb 59,3ABa 68,5Aa 63,5Aab 60,8ABab
73,3Aa
66,8Aa 41,3Ba 60,5ABa 61,55
Média 62,9 56,8 53,9 53,2 54,9 56,1 56,1 38,5 54,9
C.V. (%) 20,17
* Médias seguidas por letras iguais (maiúsculas para cultivares e minúsculas para procedimento de inoculação) não diferem entre si pelo
teste de Tukey a 5% de probabilidade.
Para altura de plantas e número de panículas por vaso, não houve efeito dos
tratamentos de inoculação em nenhum dos genótipos estudados (dados não mostrados).
DILEEP et al. (1998) observaram que a inoculação com Pseudomonas fluorescences em arroz
cultivado sob condições de campo e em casa de vegetação, aumentou a altura e biomassa das
plantas. Já VALAZCO e CASTRO (1999) observaram que a inoculação de arroz, crescido em
casa de vegetação, com A. brasilense aumentou a altura das plantas avaliada até a fase de
iniciação das panículas. No entanto, no final do ciclo da cultura não foi observado efeito dos
tratamentos de inoculação para este parâmetro.
O maior acúmulo de massa seca da parte aérea para todos os genótipos foi observado
com adubação nitrogenada de 100 kg N ha
-1
(Tabela 22). Os isolados AR1122 e AR1124 de
Herbasprillum spp., proporcionaram maior produção de massa seca nas variedades Arroz 70 e
Zebu Branco, enquanto que para as variedades Braquiária e Cana Forte, os isolados VR218 e
AR3122 de A. amazonense proporcionaram maior produção de matéria seca com rendimento
igual ou superior à inoculação com a estirpe ZAE94. Na cultivar IR42 os isolados AR1122 de
Herbaspirillum spp. e AR3122 de A. amazonense proporcionaram a maior produção de massa
seca. Estes dois isolados proporcionaram maior produção massa seca da parte aérea para a
maioria dos genótipos testados, embora menor do que a testemunha nitrogenada.
VALAZCO e CASTRO (1999) observaram que a inoculação de arroz com A.
brasilense, cultivado em casa de vegetação aumentou a massa seca da parte aérea. Também,
BISWAS et al. (2000), estudando rizobactérias promotoras do crescimento de plantas,
Rhizobium spp., Bradyrhizobium spp., Azospirillum lipoferum e Gluconacetobacter
diazotrophicus, em condições de casa de vegetação, observaram que algumas das estirpes de
bactérias testadas estimularam o crescimento das plantas (massa seca), sendo o efeito da
inoculação dependente das estirpes e variedades das plantas. GUIMARÃES et al. (2003)
avaliando plantas de arroz crescidas em casa de vegetação, observaram efeito positivo no
acúmulo de massa seca de plantas de arroz da variedade Guarani aos 40 dias após transplantio
das plântulas inoculadas com estirpes de Herbaspirillum e Burkholderia, mas não aos 70 e
130 dias após o transplantio.
A análise de produção de grãos mostrou que a inoculação com o isolado AR1122 de
Herbaspirillum na variedade Arroz 70 apresentou uma produção de grãos igual à testemunha
nitrogenada (Tabela 23). Além disso, o mesmo isolado proporcionou uma produção de grãos
igual ou superior àquela proporcionada pela estirpe ZAE94 para todos os genótipos testados.
54
Já a inoculação dos isolados de A. amazonense VR218 e AR3122 resultaram em uma
produção de grãos significativamente maior quando comparada com a estirpe ZAE94, na
variedade Cana Forte e nos genótipos Arroz 70 e Bonança respectivamente. Nas variedades
Come Cru e Zebu Branco não houve diferença entre os tratamentos de inoculação para
produção de grãos e nem destes para a testemunha nitrogenada (100 kg N ha
-1
) para a
produção de grãos (Tabela 23).
Os efeitos da inoculação de plantas com bactérias diazotróficas nem sempre se
refletem em aumento de produção de grãos no campo (PEREIRA et al., 1988).
RAMAMOORTHY et al. (2000) observaram que a inoculação de sementes de arroz com
Azospirillum aumentou o vigor das plantas, embora isso não tenha se refletido na produção de
grãos. Já BISWAS et al. (2000), em condições de casa de vegetação, observaram que a
inoculação de sementes de arroz pré-germinadas com estirpes de Rhizobium spp. aumentou a
velocidade de emergência, o acúmulo de massa seca nas plantas e proporcionou maior
eficiência de absorção de nutrientes. PRADHAN e MOHAN (1998) observaram que
inoculação de plantas de arroz com A. brasilense, quando utilizou a metade da dose
recomendada de nitrogênio para a cultura do arroz, proporcionou aumento no vigor das
plantas aos 30 e 60 dias após a inoculação e aumento na produção de grãos. Também,
GUIMARÃES et al. (2003) observaram aumento de até 25% na produção de grãos na
variedade Guarani inoculada com estirpes de Herbaspirillum e Burkholderia, em condições
de casa de vegetação e campo.
A análise do número de grãos cheios por panícula mostrou que o isolado AR3122 de
A. amazonense aumentou o número de grãos por panícula na variedade Zebu Branco e Pingo
D’água, quando comparado com os outros tratamentos de inoculação e com a testemunha
nitrogenada (Tabela 24). Já nas variedades Cana Forte e Come Cru, esta mesma bactéria
promoveu uma redução no número de grãos cheios por panícula. O isolado VR218 de A.
amazonense promoveu um maior número de grãos por panícula na variedade Cana Forte,
enquanto que nas variedades Braquiária e Come Cru o maior número de grãos por panícula
foi obtido com a testemunha nitrogenada (100 kg N ha
-1
), Em contraste, não houve efeito dos
tratamentos de inoculação para os genótipos Arroz 70, Bonança, IR42 e Canastra (Tabela 24).
Pode-se observar pelas Tabelas 23 e 24 que as diferenças na produção de grãos
ocorreram principalmente, em função do número de grãos por panícula. Este efeito pode ser
claramente observado na variedade Cana Forte inoculada com o isolado VR218 de A.
amazonense. Já o isolado AR2112 de Sphingomonas spp. promoveu uma menor produção de
grãos e menor número de grãos por panícula, esta tendência não seja constante claro para
todos os tratamentos.
A análise da massa de mil grãos mostrou que houve efeito da inoculação nos genótipos
Zebu Branco, Braquiária, e IR42 (Tabela 25). O isolado BR2113 de Azospirillum spp.
promoveu o desenvolvimento de grãos mais pesados na variedade Zebu Branco, a estirpe
ZAE94 na variedade Braquiária e o isolado VR218 de A. amazonense na cultivar IR42. Nos
referidos genótipos, como também, na variedade Come Cru, a massa de mil grãos foi maior
nas plantas inoculadas do que na testemunha nitrogenada (100 kg N ha
-1
). TRAN VAN et al.
(2000) observaram que a adubação com 0, 45 e 90 kg N ha
-1
não afetou a massa de mil grãos,
sendo que a inoculação com Burkholderia vietnamiensis aumentou a massa de mil grãos
quando comparado com os tratamentos não inoculados. GOVINDARAJAN et al. (2008)
também observaram que a inoculação de G. diazotrophicus, H. seropedicae, A. lipoferum e B.
vietnamiensis aumentou o peso de mil grãos em duas cultivares de arroz, sendo que este
parâmetro foi um importante componente de produção. SALA et al. (2007) observaram em
trigo que a inoculação com bactérias diazotróficas, aumentou a massa de 1000 sementes, no
entanto, o local de cultivo influenciou a resposta da planta.
55
Tabela 25. Massa de 1000 grãos (g) de nove genótipos de arroz, inoculados com isolados de
Azospirillum amazonense (VR218 e AR3122), Azospirillum spp. (BR2113 e BF1358),
Herbaspirillum sp (AR1122 e AR1124) e Sphingomonas spp. (AR2112) em vasos.
Isolados Zebu Branco Arroz 70 Braquiária
Cana
Forte
Pingo
D’água
Come
Cru
Bonança IR42 Canastra Média
AR1122 27,7ABab* 26,4Ba 30,8Aab 27,1Ba 24,7BCa
26,9Ba
22,8Ca 21,8Cb 22,8Ca 26,7
VR218 27,9ABa 28,0ABa 31,2Aab 26,5Ba 25,0BCa 27,0Ba 22,9BCa 26,6Ba 22,4Ca 26,4
AR1124 27,6ABab 26,4BCa 30,9Aab 28,2ABa 24,9Ca 27,5BCa 23,5Ca 24,3CDab 23,2Da 26,2
BF1358 28,3ABa 27,0BCa 31,3Aab 27,3BCa 24,4CDa 27,2BCa 23,4Ea 24,7CDab 23,6DEa 26,3
AR2112 26,1BCab 25,0BCa 30,8Aab 27,7ABa 23,2CDa 27,5ABa 22,9CDa 23,9CDab 22,2Da 25,5
AR3122 28,1ABa 26,6Ba 30,6Aab 27,5ABa 24,9BCa 28,3ABa 22,3Ca 23,1Cb 22,9Ca 26,0
BR2113 28,6Aa 26,5BCa 29,8Aab 27,6ABa 24,4CDa 24,0CDa 23,4CDa 23,1Db 23,2CDa 26,2
ZAE94 (controle
positivo)
26,8BCab 26,8BCa 32,5Aa 26,7BCa 24,7CDa
29,0Ba
23,6CDa 21,9Db 23,0Da 26,1
Testemunha
Nitrogenada
(100Kg/há).
24,3BCb 24,6BCa 28,5Ab 25,3ABa 22,9BCa
22Cb
24,6BCa 21,9BCb 24,3BCa 24,2
Média 27,3 26,4 30,7 27,1 24,2 27,1 23,3 23,5 23,1
C.V. (%) 5,99
* Médias seguidas por letras iguais (maiúsculas para cultivares e minúsculas para procedimento de inoculação) não diferem entre si pelo
teste de Tukey a 5% de probabilidade.
Para acúmulo de nitrogênio na biomassa da parte aérea das plantas houve interação
entre tratamentos de inoculação e os genótipos de arroz, sendo que o isolado VR218 de A.
amazonense se destacou em todos os genótipos testados. Com aumento variando entre 160 a
390 %, dependendo do genótipo, em relação a testemunha nitrogenada que recebeu 100 kg de
nitrogênio ha
-1
(Tabela 26). O isolado AR1122 de Herbaspirillum spp. se destacou nos
genótipos Cana forte, Zebu branco e Come cru, com aumento de 150 % no nitrogênio
acomulado na biomassa em relação a testetemunha nitrogenada. As cultivares melhoradas
Bonança e Canastra apresentaram maior acúmulo de N na biomassa com a adubação
nitrogenada do que os tratamentos de inoculação com exceção da inoculação com o isolado
VR218.
Não houve efeito dos tratamentos de inoculação no acúmulo de proteína nos grãos
(Tabela 27), independentemente do genótipo da planta quando comparado com a estirpe
ZAE94. Somente os grãos provenientes do tratamento testemunha nitrogenada, que recebeu
100 kg N ha
-1
, apresentaram maior teor de proteína. RODRIGUES et al. (2007) não
observaram efeito significativo no acúmulo de N nos grãos da cultivar IR42 inoculada com
diferentes isolados de A. amazonense em condições de vasos. Também, FERREIRA et al.
(2003) não constataram aumento no acúmulo de N-Toltal nos grãos da cultivar IR42
inoculada com H. seropedicae em condições de casa de vegetação, já em condições de campo
estes autores observaram aumento de 20% de nitrogênio nos grãos com a inoculação de H.
seropedicae na mesma cultivar.
56
Tabela 26. Acúmulo de nitrogênio (%) na biomassa de nove cultivares de arroz inoculadas
com isolados de Azospirillum amazonense (VR218 e AR3122), Azospirillum spp. (BR2113 e
BF1358), Herbaspirillum spp. (AR1122 e AR1124) e Sphingomonas spp. (AR2112) em
vasos.
Isolados
Zebu
Branco
Arroz 70 Braquiária Cana Forte
Pingo
D’água
Come
Cru
Bonança IR42 Canastra Média
AR1122 0,70ABa 0,43CDb 0,48CDbc 0,56BCb 0,44CDb 0,66ABb 0,38Db 0,46CDb 0,77Ac 0,54
VR218 0,84Da 0,98BCa 1,05Ba 0,78Da 0,81Da 1,66Aa 0,75Da 0,85CDa 1,58Aa 1,02
AR1124 0,41ABbc 0,37CDb 0,43BCc 0,34Cc 0,35Cbc 0,53Abc 0,32Cb 0,36Cbc 0,5ABde 0,40
BF1358 0,38ABbc 0,31ABb 0,37ABc 0,32ABc 0,38ABbc 0,32ABd 0,28Bb 0,34ABbc 0,45Ae 0,35
AR2112 0,36BCbc 0,33Cb 0,42ABCc 0,36BCc 0,32Cbc 0,52Abc 0,36BCb 0,32Cbc 0,47ABde 0,38
AR3122 0,28Cc 0,32Cb 0,40CDc 0,30Cc 0,29Cc 0,53ABbc 0,29Cb 0,33Cbc 0,61Ad 0,37
BR2113 0,33Cbc 0,35Cb 0,43BCc 0,30Cc 0,33Cbc 0,63Ab 0,33Cb 0,37BCbc 0,51ABde 0,40
ZAE94 (controle
positivo)
0,33DEbc 0,30DEb 0,43BCDc 0,31DEc 0,32DEbc 0,56Bbc 0,28Eb 0,45BCbc 0,92Ab 0,43
Testemunha
Nitrogenada
(100Kg/há).
0,47CDb 0,38Db 0,60BCb 0,38Cc 0,40Cbc 0,42Ccd 0,67Ba 0,41Cbc 0,96Ab 0,52
Média 0,45 0,42 0,51 0,40 0,40 0,63 0,41 0,43 0,75
C.V. (%). 13,15
* Médias seguidas por letras iguais (maiúsculas para cultivares e minúsculas para procedimento de inoculação) não diferem entre si pelo
teste de Tukey a 5% de probabilidade.
Tabela 27. Acúmulo de proteína (%) nos grãos de nove cultivares de arroz inoculadas com
isolados de Azospirillum amazonense (VR218 e AR3122), Azospirillum spp. (BR2113 e
BF1358), Herbaspirillum spp. (AR1122 e AR1124) e Sphingomonas spp. (AR2112) em
vasos.
Isolados
Zebu
Branco
Arroz 70 Braquiária
Cana
Forte
Pingo
D’água
Come
Cru
Bonança IR42 Canastra Média
AR1122 4,5* 5,9 7,2 6,3 6,4 6,6 8,1 5,62 7,81 6,69b
VR218 6,4 6,8 6,6 5,6 5,4 6,2 7,3 6,87 7,11 6,41b
AR1124 6,1 6,1 7,2 6,8 5,8 6,0 8,2 5,54 7,11 6,48b
BF1358 6,4 5,8 6,7 5,8 6,1 6,1 7,5 5,62 7,42 6,39b
AR2112 6,6 6,4 7,3 6,1 5,9 7,2 7,2 5,23 7,30 6,57b
AR3122 6,6 6,0 6,9 5,8 6,6 7,1 7,2 5,56 6,81 6,51b
BR2113 6,1 5,5 6,9 7,1 6,5 6,4 8,2 5,31 7,27 6,57b
ZAE94 (controle
positivo)
6,1 5,5 6,1 6,2 6,1
5,9
8,0 5,36
7,06
6,25b
Testemunha
Nitrogenada
(100Kg/há).
8,6 7,3 8,0 7,1 7,8
8,1
9,2 7,33
8,09
7,94a
Média 6,6CD 6,1DE 7,0BC 6,2DE 6,3DE 6,6CD 7,9A 5,8E 7,3AB
C.V. (%). 11,16
* Médias seguidas por letras iguais (maiúsculas para cultivares e minúsculas para procedimento de inoculação) não diferem entre si pelo
teste de Tukey a 5% de probabilidade.
Todas as variedades apresentaram baixo teor de proteína nos grãos, entre 6 e 7%,
independentemente dos tratamentos de inoculação. Mesmo as variedades Arroz 70, Zebu
Branco e Braquiária, que foram escolhidas por apresentarem alto teor de proteína nos grãos
(>8%), contrastando com as variedades Come Cru, Cana Forte e Pingo D’água (6-7%)
apresentaram baixo teor de proteína nos grãos, sugerindo que as plantas se desenvolveram em
condições de deficiência de nitrogênio. A diferença entre os genótipos em relação ao
nitrogênio derivado da fixação biológica pode ser mais evidente em condições de baixo nível
de nitrogênio no solo (PRADHAN e MOHAN, 1998). Este efeito também foi observado por
NIEUWENHOVE et al. (2001) estudando a inoculação de plantas de arroz com Azorhizobium
caulinodans, em combinação com diferentes níveis de sacarose e nitrogênio, em condições de
casa de vegetação. Esses autores observaram, pela técnica de diluição isotópica de
15
N, que
houve incorporação de N
2
fixado na biomassa das plantas inoculadas com A. caulinodans, em
57
condições de baixo nível de nitrogênio (20 kg ha
-1
) e que, nesta condição, a perda de
nitrogênio foi menor que em condições de alto nível de nitrogênio (60 kg ha
-1
).
3.5.4 Avaliação do efeito da inoculação com bactérias diazotróficas em diferentes
variedades de arroz cultivadas em condições de campo
No experimento realizado em condições de campo, a variedade Cana Forte não
completou o ciclo devido à falta de chuvas na fase de enchimento dos grãos. Assim, a análise
dos dados foi realizada somente com os genótipos Arroz 70 e Bonança. A análise de variância
mostrou que não houve interação entre genótipos e as estirpes inoculadas nas sementes para
nenhum dos parâmetros estudados. É possível que seja devido ao efeito residual de adubação
com nitrogênio em cultivos anteriores na área, tendo em vista que a produção obtida (mais de
3500 kg ha
-1
) foi muito superior à média nacional para arroz de sequeiro (1500 kg ha
-1
).
Pode-se observar que houve efeito dos tratamentos de inoculação no rendimento de
grãos e no teor de proteína nos grãos sem considerar a testemunha nitrogenada (Tabela 28). A
inoculação com o isolado AR1122 de Hebaspirillum spp. proporcionou uma maior produção
de grãos independentemente do genótipo produzindo 11% a mais que a inoculação com a
estirpe ZAE94, apresentando o mesmo teor de proteína nos grãos que a testemunha
nitrogenada (Tabela 28). Já a inoculação com o isolado BR2113 de Azospirillum spp. foi o
tratamento que apresentou a menor produção de grãos, assim como, o menor teor de proteína
nos grãos independentemente do genótipo da planta.
Tabela 28. Produtividade de dois genótipos de arroz, submetidas à inoculação com estirpes de
Azospirillum amazonense (AR3122), Azospirillum spp. (BR2113), Herbaspirillum spp.
(AR1122) e Sphingomonas spp. (AR2112) em condições de campo.
Produção (Kg . ha
-1
) Biomassa seca (g)/planta Proteína (%)
Isolados
Arroz 70 Bonança Média Arroz 70 Bonança Média Arroz 70 Bonança Média
AR1122 4336,2 5061,6 4698,9a 21,8 8,5 15,1 a 8,75 8,25 8,50a
AR3122 3562,5 4884,7 4223,4ab 31,5 10,3 20,9 a 8,50 6,75 7,62ab
AR2112 3006,4 5081,4 4043,9ab 24,8 10,8 17,8a 6,75 7,75 7,25ab
BR2113 2550,5 4523,1 3536,8b 25,8 7,0 16,4a 6,50 6,50 6,50b
ZAE94 (controle
positivo)
3362,4 5011,9 4187,7ab 20,5 10,5 15,5a 7,00 6,50 6,75b
Testemunha
Nitrogenada
(100Kg/há).
3931,5 4929,9 4430,7ab 26,5 8,3 17,4a 9,50 7,75 8,62a
Média 3458,3B 4915,4A 25,1A 9,2B 7,83A 7,23A
C.V. (%) 14,61 22,22 14,31
* Médias seguidas por letras iguais (maiúsculas para cultivares e minúsculas para procedimento de inoculação) não diferem
entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade.
A análise de outros parâmetros agronômicos mostrou que a inoculação não afetou o
número de panículas por m
2
, a massa de mil grãos e nem o número de grãos por panícula
(Tabela 29). Embora não tenha havido diferença significativa para estes parâmetros, a
diferença na produção observada entre os tratamentos de inoculação com a bactéria AR1122 e
BR2113 pode ter ocorrido em função do maior número de panículas por m
2
e do número de
grãos por panícula
.
Tabela 29. Dados médios de número de panículas por m
2
, massa de mil grãos e número de
grãos por panícula de plantas de dois genótipos de arroz submetidos à inoculação com
58
Azospirillum amazonense (AR3122), Azospirillum spp. (AR2113), Herbaspirillum spp.
(AR1122) e Sphingomonas spp. (AR2112) em condições de campo.
Número de panículas m
2
Massa de mil grãos Nº de grãos por panícula
Isolados
Arroz 70 Bonança Média Arroz 70 Bonança Média Arroz 70 Bonança Média
AR1122 207 226 216a 28,692 24,982 26,837a 73 91 82a
AR3122 198 227 212a 25,907 25,067 25,487a 67 85 76a
AR2112 170 247 208a 27,497 24,190 25,844a 68 80 74a
AR2113 146 243 194a 25,497 25,977 25,640a 73 72 72a
ZAE94 (controle
positivo)
171 246 209a 29,647 25,317 27,837a 70 80 75a
Testemunha
Nitrogenada
(100Kg/há).
175 243 209a 27,737 25,852 26,837a 75 75 75a
Média 178B 239A 27,46A 25,23B 71B 80A
C.V. (%) 18,09 7,18 9,12
* Médias seguidas por letras iguais (maiúsculas para cultivares e minúsculas para procedimento de inoculação) não diferem
entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade.
Em aveia, SALANTUR et al. (2005) observaram que o aumento de produção de grãos
em função da inoculação com bactérias diazotróficas foi devido ao aumento de panículas por
m
2
e do número de grãos por panícula. No entanto, GOVINDARAJAN et al. (2008)
observaram em arroz que o aumento de produção, também, ocorre em função do aumento na
massa de mil grãos.
A fixação biológica de nitrogênio pelas bactérias inoculadas pode não ter sido o
principal fator que influenciou a resposta das plantas aos tratamentos de inoculação. Outros
fatores podem ter influenciado, tendo em vista que no experimento em condições de vasos,
embora tenha ocorrido efeito na produção de grãos e seus componentes, não houve efeito no
teor de proteína nos grãos.
Entre os isolados estudados, AR1122 de Herbaspirillum spp. e AR3122 de A.
amazonense foram os que se mostraram mais promissores para promover o crescimento de
plantas de arroz. Por outro lado, não foi observada relação entre o alto teor de proteína nos
grãos observado para algumas variedades tradicionais de arroz do Maranhão e a fixação
biológica de nitrogênio. No entando, novos estudos são necessários para confirmar os
resultados.
3.6 Conclusões
Houve efeito positivo da inoculação dependente do genótipo vegetal, nos
experimentos em condições de casa de vegetação e em campo, sendo os isolados VR218 de A.
amazonense e AR1122 de Herbaspirillum spp foram os mais promissores.
Não houve relação entre o alto teor de proteína algumas variedades tradicionais de
arroz do Maranhão com a fixação biológica de nitrogênio.
59
4 CAPÍTULO III
EFEITO DA INOCULAÇÃO COM BACTÉRIAS DIAZOTRÓFICAS NA
GERMINAÇÃO E VIGOR DE SEMENTES ARROZ
60
4.1 Resumo
Bactérias diazotróficas são freqüentemente associadas a plantas de arroz, podendo
promover a germinação de sementes e o crescimento de plantas. O objetivo deste trabalho foi
avaliar a germinação e o vigor de sementes de arroz inoculadas com bactérias diazotróficas.
Para isso, foram instalados dois experimentos em condições de laboratório. No primeiro, dois
lotes distintos de sementes de arroz da cultivar IAC4440 foram inoculados com oito estirpes
de bactérias diazotróficas (Cd, ZAE94, M130, AR2112, BR2113, AR3122, AR1122 e
BF1358). No segundo experimento, sementes recém-colhidas da cultivar IR42 e da variedade
Zebu Branco, recém-colhidas, foram inoculadas com seis estirpes de bactérias diazotróficas
(ZAE94, M130, AR2112, AR3122, AR1122 e BF1358). Além disso, foram utilizados dois
tratamentos adicionais nos dois experimentos: controle com a turva umedecida com o meio de
cultivo estéril e sementes não inoculadas. Os resultados mostraram que a inoculação com as
bactérias AR1122, M130, BF1358, ZAE94 e AR3122 favoreceu a germinação das sementes
de arroz do lote que apresentava menor poder germinativo e maior contaminação por fungos.
No segundo experimento, a inoculação com as bactérias diazotróficas favoreceu a velocidade
de germinação das sementes das cultivar IR42 e da variedade Zebu Branco, porém não
proporcionou aumento da germinação das sementes com alto poder germinativo e baixa
contaminação por fungos. Testes in vitro mostraram que as estirpes BF1358, M130, AR1122
e ZAE94 apresentaram, respectivamente, elevados efeitos antagônicos ao fungo Fusarium
spp. isoladas das sementes de arroz.
61
4.2 Abstract
Diazotrophic bacteria are frequently associated whit plant of rice (Oryza sativa), and
could promove the seed germination and the growth of plants. The objective of this work was
to evaluate the rice seeds germination and the vigour as affected by the inoculation with
diazotrophic bacteria. Two experiments were conduced in laboratory conditions. In the first,
two lots of rice seeds of cultivar IAC4440 were inoculated with eight strains of diazotrophic
bacteria (Cd, ZAE94, M130, AR2112, BR2113, AR3122, AR1122 e BF1358). In the second
study, seeds of cultivar IR42 and the variety Zebu Branco, recently harvested were inoculated
with six strains (ZAE94, M130, AR2112, AR3122, AR1122 e BF1358). In both studies, there
were also two additional treatments (control with the peat soil humidified with a sterile
medium and seeds without no inoculation). The results showed that the inoculation with the
bacteria AR1122, M130, BF1358, ZAE94 and AR3122 favoured the germination of rice seeds
of the lot stored four years and with low germination and high fungi contamination. In the
second experiment, the inoculation with the bacteria favoured the speed of seed germination
of cultivar IR42 and the variety Zebu Branco, although it did not increased seeds germination
with high germination and low contamination by fungi. In vitro experiment showed that the
strains BF1358, M130, AR1122 and ZAE94 produced, respectively, the highest antagonistic
effects against Fusarium sp. isolated from rice seeds.
62
4.3 Introdução
Um numeroso e diverso espectro de bactérias diazotróficas tem sido recentemente
isolado de plantas de arroz (ELBELTAGY et al., 2001). Segundo PENG et al. (2002) é
possível que muitas destas bactérias associadas às plantas de arroz estejam envolvidas na
promoção do crescimento de plantas. A capacidade da população de microrganismos
promover o crescimento de plantas envolve mecanismos como a fixação biológica de
nitrogênio (HAN et al., 2005), a produção de fitohormônios e, ou, a solubilização de fosfato e
o aumento na formação de pelos radiculares e, ou, a formação de raízes laterais
(RODRIGUEZ e FRAGA, 1999), a inibição do crescimento de fungos e a indução de
resistência sistêmica no hospedeiro (BEVIVINO et al., 2005). Atualmente, alguns trabalhos
têm sido realizados no sentido de avaliar os aspectos benéficos da associação de plantas com
bactérias diazotróficas com a germinação de sementes. RAMAMOORTHY et al. (2000)
observaram aumento na germinação de sementes de arroz de dois lotes (com alto e baixo
vigor) inoculadas com Azospirillum lipoferum e Azospirillum brasilense após 14 dias de
instalação. Também, KARTHIKEYAN et al. (2007) avaliando as sementes de Catharanthus
roseus, observaram que a inoculação da semente com bactérias diazotróficas (Azospirillum
spp. e Azotobacter spp.), isoladas da rizosfera e da raiz desta planta, aumentou a percentagem
de germinação, assim como o vigor e o acúmulo de massa seca das plântulas em condições
gnotobioticas. Em soja, foi observado que a presença de Methylobacterium spp. estimulou a
emissão de raiz primária das plântulas após 5 dias da instalação devido a estimulo hormonal e
quebra de dormência (KOENIG et al., 2002). Também, BARAZANI e FRIEDMAN (1999)
constataram que a maioria das bactérias isoladas da rizosfera de plantas são produtoras de
fitohormônios. Fitohormônios são essenciais na coordenação de diferentes aspectos da
fisiologia de plantas, como germinação de sementes e formação de raízes, dentre outros
(RAVEN et al., 2001). ARSEGO et al. (2006) observaram que o tratamento de sementes de
arroz com giberelinas proporcionou o desenvolvimento de plântulas com desempenho
superior. Plântulas vigorosas podem competir mais eficientemente, principalmente em
condições de estresse, por luz, nutrientes e água, influenciando no estabelecimento da
população e na produção de grãos (FAROOQ et al., 2006). Assim, a aplicação de bactérias
diazotróficas com o objetivo de melhorar a germinação e o estabelecimento das plantas de
arroz, pode ser uma tecnologia de baixo custo e de fácil aplicação. Nesse sentido, o objetivo
deste trabalho foi o de avaliar a germinação e o vigor de sementes de arroz, por meio da
inoculação com bactérias diazotróficas.
4.4 Material e Métodos
Foram conduzidos dois experimentos no Laboratório de Análise de Sementes da
UFRRJ, com sementes de arroz (Oryza sativa L.), no ano 2007. No primeiro experimento,
foram utilizados dois lotes de sementes da cultivar IAC 4440, sendo que um deles
armazenado em câmara localizada na Embrapa-CNPAB, com 15ºC e 50% de umidade
relativa do ar por quatro anos (lote 1) e o outro por um ano, nas mesmas condições do lote 1
(lote 2). No segundo experimento, foram utilizadas sementes de arroz da cultivar IR42
(genótipo 1) e da variedade Zebu Branco (genótipo 2) recém colhidas da área experimental da
Embrapa Agrobiologia, no ano de 2007, em Seropédica, RJ. O delineamento experimental
adotado foi o inteiramente casualizado em esquema fatorial (10 procedimentos de inoculação
x dois lotes no primeiro experimento e oito procedimentos de inoculação x dois genótipos no
segundo experimento) com quatro repetições. Os tratamentos consistiram da inoculação das
sementes com o inoculante a base de turfa empregando as bactérias diazotróficas bem como
63
de um tratamento somente com a turva umedecida com o meio de cultivo estéril, denominado
de controle e o outro tratamento, sem o procedimento de inoculação, denominado de
testemunha. No primeiro experimento, foram utilizadas, as seguintes estirpes: 1 - Azospirillum
brasilense Cd, 2 - Herbaspirillum seropedicae ZAE94, 3 - Burkholderia brasilensis M130 e
quatro isoladas da raiz de arroz que apresentaram alta produção de compostos indolicos in
vitro, em testes prévios, 4 - Sphingomonas spp. AR2112, 5 - A. brasilense BR2113, 6 -
Azospirillum amazonense AR3122, 7 - Herbaspirillum AR1122 e 8 - Azospirillum sp.
BF1358. No segundo experimento, foram utilizadas 1 - H. seropedicae ZAE94, 2 - B.
brasilensis M130, 3 - Sphingomonas spp. AR2112, 4 - A. amazonense AR3122, 5 -
Herbaspirillum AR1122 e 6 - Azospirillum sp BF1358.
As suspensões bacterianas foram preparadas a partir de culturas puras crescidas por 16
horas em meio Dygs sob agitação. Após esse período, a concentração das células foi
determinada por meio da densidade ótica em espectrofotômetro com comprimento de onda de
620 nm e foi ajustada para aproximadamente 10
9
células mL
-1
. O inoculante foi preparado
adicionando 15 mL da suspensão de cada bactéria, em sacos de polietileno contendo 35 g de
turfa (previamente moída, seca, corrigida acidez e esterilizada). Após o preparo, o inoculante
foi mantido em estufa a 30ºC por 24 horas, em seguida, realizou-se a contagem das células em
meio semi-sólido por meio da técnica do Número Mais Provável. O controle consistiu na
adição de 15 mL do meio de cultivo estéril em 35 g de turfa.
A inoculação das sementes foi realizada após a desinfestação superficial das sementes
com hipoclorito de sódio a 1%, por dez minutos (CHUN et al., 1997) e em seguida, estas
foram lavadas por quatro vezes em água destilada estéril e colocadas para secar em fluxo
laminar por duas horas. Estas sementes foram inoculadas, utilizado uma proporção de 10 g do
inoculante por kg de semente, empregando uma solução de goma arábica a 10% para fixar o
inoculante às sementes e, em seguida, colocadas para secar à sombra antes da utilização.
As sementes inoculadas foram submetidas aos testes de germinação e de vigor
(primeira contagem de germinação e classificação das plântulas). O teste de germinação foi
realizado seguindo as recomendações prescritas nas Regras para Análise de Sementes
(BRASIL, 1992). As sementes foram distribuídas em papel germitest previamente
esterilizados e umedecidos com o volume de água 2,5 vezes a massa do substrato. Os rolos de
papel com as sementes foram mantidos a 25
o
C sob 12 horas de luz. As avaliações foram
realizadas aos cinco e aos 14 dias. Em conjunto com este teste foi realizado o teste de
primeira contagem de germinação que constou na determinação da porcentagem de plântulas
normais, verificadas no quinto dia após a instalação do teste também em conjunto, foi
realizado o teste de classificação de plântulas. As plântulas normais foram classificadas em
fortes e fracas (KRZYZANOWSKI et al., 1999). Os dados obtidos foram transformados em
raiz de (x + 0,5) e submetidos à análise de variância. A comparação entre médias foi feita por
meio do teste de Tukey a 5% de probabilidade.
No primeiro experimento, as bactérias que mostraram maior capacidade de inibir o
crescimento de fungos durante o teste de germinação foram submetidos a ensaios contra
Fusarium spp., que foram os fungos presentes em maior quantidade nas sementes analisadas e
que foram isolados durante a realização do teste de germinação. Para isso, foi utilizado um
meio rico (Dygs), colocando-se um disco de ágar de 0,5 cm de diâmetro com crescimento
abundante dos fungos a 1,5 cm da borda da placa e na outra extremidade uma estria da
bactéria (MELO et al., 1995), mais um tratamento controle que recebeu apenas o disco com
crescimento do fungo sem presença da bactéria. Após sete dias de incubação a 28°C e
fotoperíodo de 12 horas, o crescimento micelial foi medido. O delineamento utilizado foi o
inteiramente ao acaso com quatro repetições por tratamento. Os dados foram submetidos a
análise de variância, e as médias, comparadas através do teste de Tukey, a 5% de
probabilidade.
64
4.5 Resultados e Discussão
No primeiro experimento, foi constatado que houve interação entre lotes e os
tratamentos de inoculação para germinação quando se avaliou o efeito dos tratamentos de
inoculação em dois lotes distintos de sementes, que permaneceram armazenadas por
diferentes períodos (Tabela 30). Assim para o lote 1, que estava armazenado por mais tempo e
com menor valor de germinação (58%), houve aumento da germinação das sementes
submetidas aos tratamentos de inoculação com as bactérias AR1122, M130, BF1358, Z94 e
AR1122, provavelmente devido a redução da contaminação fúngica, como contatado pela
diminuição da percentagem de plântulas anormais deterioradas (Tabela 30).
Tabela 30. Efeito da inoculação com bactérias diazotróficas na percentagem de germinação,
plântulas anormais deformadas, plântulas anormais infeccionadas em dois lotes de sementes
de arroz cv. IAC 4440.
Germinação
Plântulas anormais
deformadas
Plântulas anormais
deterioradas
Tratamentos
Lote 1 Lote 2 Médias Lote 1 Lote 2 Médias Lote 1 Lote 2 Médias
AR1122 89Aa* 96Aa 92 6Abcd 2Aa 4 5Ade 3Aa 4
M130 88Aa 93Aa 90 2Acd 3Aa 3 3Ae 0Aa 1
BF1358 84Bab 97Aa 91 2Ad 2Aa 2 2Ae 0Aa 1
ZAE94 80Bab 96Aa 88 6Abcd 3Aa 4 7Acde 1Ba 4
AR3122 67Bcd 98Aa 83 7Abcd 2Aa 4 18Aab 0Ba 9
AR2112 66Bde 95Aa 81 9Abcd 1Ba 5 13Aabc 2Ba 7
Cd 62Bde 99Aa 81 15Aab 1Ba 8 8Abcd 0Ba 4
BR2113 62Bde 93Aa 78 20Aa 3Ba 12 8Abcd 1Ba 4
Controle 58Bde 90Aa 74 16Aab 4Ba 10 19Aab 5Ba 12
Testemunha 50Be 94Aa 72 12abc 3Ba 7 24Aa 1Ba 12
Médias 71 95 9 2 10 1
C.V.(%) 4,71 41,64 38,02
* Médias seguidas por letras iguais (maiúsculas para lotes e minúsculas para procedimento de
inoculação) não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade.
Pela Tabela 31 e Figura 11 pode-se notar que estas bactérias foram capazes de inibir o
desenvolvimento de fungo in vitro, permitindo, assim, que as sementes germinassem melhor.
Bactérias diazotróficas associadas as gramíneas têm sido relatadas como importantes agentes
no biocontrole de patógenos nestas plantas (CAVAGLIERI et al., 2005; HAN et al., 2005).
Bactérias do complexo Burkholderia cepaceae são capazes de colonizar plantas de culturas
importantes como milho, arroz e trigo e são importantes antagonistas de patógenos do solo
podendo ser utilizadas em biocontrole contra Fusarium spp. (BEVIVINO et al., 1998, 2005).
Para KIM et al. (1998) Sphingomonas spp. são freqüentemente encontradas em sementes de
arroz e em outras partes desta planta, podendo ser utilizadas para o controle de patógenos em
arroz.
TRAN VAN et al. (2000) observaram que Burkholderia vietnamiensis TVV75 inibe o
crescimento de vários fungos fitopatogênos. Também NANDAKUMAR et al. (2001)
demonstraram que apenas uma aplicação de Pseudomonas fluorescens na cultura do arroz
induziu resistência sistêmica contra o fungo Rhizoctonia solani, impedindo o crescimento
miceliano e a incidência da doença. Já SCHLOTER et al. (1997) observaram antagonismo de
Rhizobium leguminosarum bv trifolii quando inoculado em plantas leguminosas e não
leguminosas em casa de vegetação.
65
Tabela 31. Inibição de crescimento micelial de Fusarium spp. por bactérias diazotróficas
mais controle sem inoculação. Médias de quatro repetições.
Crescimento micelial (cm)
Tratamentos
Fusarium sp.
Controle 6,4a*
H. seropedicae ZAE94 5,3b
Herbaspirillum sp. AR1122 5,0bc
Burkholderia brasilensis M130 4,5cd
Azospirillum spp. BF1358 4,2d
C.V.(%) 5,85
* Médias seguidas por letras iguais não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade.
Figura 11. A) inibição do crescimento micelial de Fusarium spp. por Burkholderia brasilenis
M130 e B) controle.
Já, para as sementes do lote 2 que apresentava inicialmente 90% de germinação após
dois anos de armazenamento, não houve efeito dos tratamentos de inoculação na germinação
e percentagem de plântulas anormais (deterioradas e deformadas) (Tabela 30). Em relação a
avaliação do vigor não foi constatado efeito da aplicação dos tratamentos de inoculação com
as bactérias no vigor das sementes do lote 1, avaliado pelo teste primeira contagem de
germinação (Tabela 32). Pelo teste de classificação das plantas independentemente do lote, as
sementes submetidas a inoculação com a bactéria AR3122 apresentaram maior vigor, ou seja,
maior percentagem de plântulas normais fortes (bem desenvolvidas). No entanto, LEE et al.
(2006) trabalhando com bactérias metilotróficas do gênero Methylobacterium e outras
bactérias (Enterobacter spp. e Burkholderia spp.) diazotróficas constataram que estas
bactérias foram capazes de produzir compostos indólicos in vitro e que o tratamento de
sementes de arroz com estas bactérias favoreceram a germinação e a velocidade de
germinação de sementes de arroz. Também, BISWAS et al. (2000), observaram aumento do
coleoptilo e da radícula de sementes de arroz inoculadas com estirpes de Rhizobium spp. após
120 horas de incubação a 30ºC no escuro. Já RAMAMOORTHY et al. (2000) após remoção
das sementes contaminadas, observaram que a inoculação de sementes de arroz com
Azospirillum spp. aumentou a germinação das sementes de arroz de dois lotes com diferentes
níveis de vigor, aos 14 dias, embora isso não tenha se refletido na produção de grãos.
A
B
66
Tabela 32. Dados médios, em percentagem, de plântulas normais na primeira contagem de
germinação, e de plântulas normais (fortes e fracas) obtidas de dois lotes de sementes de arroz
da cv. IAC 4440, após inoculação com bactérias diazotróficas mais os tratamentos testemunha
e controle.
Primeira contagem de
germinação
Plântulas normais fortes Plântulas normais fracas
Tratamentos
Lote 1 Lote 2 Médias Lote 1 Lote 2 Médias Lote 1 Lote 2 Médias
AR1122 19Ba* 31Abcd 25 30 52 41abc 56Aab 43Aab 49
M130 17Aa 21Ac 19 27 48 38bc 60Aa 43Bab 51
BF1358 21Aa 23Abc 22 33 50 42abc 46Aab 42Aab 44
ZAE94 26Ba 37Aabc 31 38 65 52ab 43Aab 35Aab 39
AR3122 27Aa 30Aabc 29 38 67 53ª 30Ab 26Ab 28
AR2112 27Aa 34Aabc 30 29 50 40abc 40Aab 46Aa 43
Cd 20Aa 25Abc 22 28 52 40abc 32Aab 43Aab 37
BR2113 19Ba 35Aabc 27 25 60 42abc 38Aab 34Aab 34
Controle 22Aa 29Aabc 26 25 43 34c 34Bb 47Aa 40
Testemunha 19Ba 43Aa 31 23 58 40abc 28Ab 37Aab 32
Médias 21 31 29B 55A 40 39
C.V. (%) 12,23 10,36 11,21
*Médias seguidas por letras iguais (maiúsculas para lotes e minúsculas para procedimento de inoculação) não
diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade.
No segundo experimento, não houve interação entre tratamentos e genótipos na
percentagem de germinação de sementes de arroz, provavelmente devido à baixa
contaminação por fungos, como constatados pela percentagem de plântulas anormais
deterioradas (Tabela 33). No entanto, os tratamentos de inoculação com todas as bactérias
aumentaram o vigor, avaliado pelo teste de primeira contagem de germinação, das sementes
do G1 e das sementes do G2 com exceção da bactéria AR2112, este efeito também foi
observado pelo teste de classificação de plântulas, principalmente para as bactérias BF1358 e
AR3122 (Tabela 34)
.
Tabela 33. Dados médios, em percentagem, de germinação e de plântulas anormais
(deformadas e deterioradas) obtidas de sementes de dois genótipos de arroz IR42 (G1) e Zebu
Branco (G2), após inoculação com bactérias diazotróficas mais os tratamentos controle e
testemunha.
Germinação
Plântulas anormais
deformadas
Plântulas anormais
deterioradas
Tratamentos
G1 G2 Médias G1 G2 Médias G1 G2 Médias
BF1358 99 93 96a* 0 3 2a 0 3 2a
AR3122 97 95 96a 2 4 3a 0 3 2a
AR1122 96 89 93a 2 7 5ab 0 0 0a
ZAE94 93 88 91a 7 8 8ab 0 1 1a
M130 91 92 92a 8 6 7ab 0 0 0a
AR2112 90 91 91a 6 6 6ab 1 1 1a
Controle 95 86 91a 4 11 8ab 3 3 3a
Testemunha 93 88 91a 4 9 7ab 0 4 2a
Médias 94 90 4B 7A 1A 2A
C.V.(%) 2,84 45,23 60,86
*Médias seguidas por letras iguais (maiúsculas para genótipos e minúsculas para procedimento de inoculação)
não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade.
67
Tabela 34. Dados médios, em percentagem, de plântulas normais na primeira contagem de
germinação e de plântulas normais (fortes e fracas), obtidas de sementes de dois genótipos de
arroz IR42 (G1) e Zebu Branco (G2), após inoculação com bactérias diazotróficas mais os
tratamentos controle e testemunha.
Primeira contagem de
germinação
Plântulas normais fortes Plântulas normais fracas
Tratamentos
G1 G2 Médias G1 G2 Médias G1 G2 Médias
BF1358 60Aa* 51Aa 56 74Aa 59Ba 67 25Ab 34Aa 30
AR3122 57Aab 46Aa 52 61Aabc 57Aa 59 36Abc 38Aa 37
AR1122 43Abc 51Aa 47 51Abcd 53Aab 52 45Aab 35Aa 40
ZAE94 56Aab 50Aa 53 62Aab 56Aa 59 31Abc 32Aa 32
M130 53Aab 48Aa 50 57Aabc 52Aab 55 34Abc 40Aa 37
AR2112 40Abc 37Aab 39 62Aab 47B 55 26Bb 44Aa 36
Controle 29Ad 36Aab 33 42Ad 44Aab 43 53Aa 42Aa 47
Testemunha 32Ad 27Ab 29 46Acd 40Ab 43 47Aab 48Aa 48
Médias 45 44 56 51 37 39
C.V. (%) 8,22 6,68 9,91
* Médias seguidas por letras iguais (maiúsculas para genótipos e minúsculas para procedimento de inoculação)
não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade.
No entanto, em sementes de C. roseus, KARTHIKEYAN et al. (2007) observaram que
quando inoculadas com bactérias diazotróficas (Azospirillum spp. e Azotobacter spp.),
isoladas da rizosfera e da raiz desta planta, apresentaram maior percentagem de germinação e
de vigor. Também em soja, foi observado que a inoculação de sementes com
Methylobacterium spp., estimula a emissão de raiz primária do primeiro ao quinto dia das
sementes, devido a estímulo hormonal (KOENIG et al., 2002). O efeito na germinação são
atribuídos à capacidade destes microrganismos em produzir fitohormônios que aumentam a
atividade de enzimas como amilases (RAMAMOORTHY et al., 2000). A habilidade de
Azospirillum spp. em reduzir os efeitos de déficit de hídrico em sementes de cereais sob
estresse osmótico ou salino, também são atribuídos à sua capacidade de produzir giberelinas
(CREUS et al., 2004).
4.6 CONCLUSÕES
A inoculação com as bactérias AR1122, M130, BF1358, ZAE94 e AR3112 favoreceu
a germinação das sementes de arroz com menor poder germinativo e maior contaminação por
fungos.
A inoculação com as bactérias diazotróficas favoreceu a velocidade de germinação das
sementes das cultivar IR42 e da variedade Zebu Branco, embora não tenha proporcionado
aumento da germinação de sementes com maior poder germinativo e menor contaminação por
fungos.
68
5 CONCLUSÕES GERAIS
Foram isoladas bactérias diazotróficas que foram agrupadas de acordo com a
caracterização morfológica e pela técnica de ARDRA como pertencentes aos gêneros
Azospirillum, Herbaspirillum e Burkholderia.
Foram encontrados isolados bacterianos eficientes na produção de ácido indol-acético
e capazes de fixar N
2
, portanto apresentam potencial para promover o crescimento vegetal
quando inoculado em plantas.
Houve efeito positivo da inoculação dependentes do genótipo vegetal, nos
experimentos em condições de casa de vegetação e em campo.
Não foi observada relação entre o alto teor de proteína observado em algumas
variedades tradicionais de arroz do Maranhão com a fixação biológica de nitrogênio
Bactérias diazotróficas, principalmente Burkholderia, possuem potencial para controle
de patógenos em sementes.
69
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81
ANEXOS
Anexo A. Resumo da análise de variância para os dados de produção de compostos indólicos
por isolados de Azospirillum spp., isolados da raiz (R) e da parte aérea (PA) de três variedades
de arroz crescidas em solo provenientes de três localidades no Maranhão (A = Arari, B=
Bacabal e V = Vitória do Mearim) avaliados pelo método colorimétrico.
Anexo B. Resumo da análise de variância para os dados de de produção de compostos
indólicos por isolados de Azospirillum amazonense, isolados da raiz (R) e da parte aérea (PA)
de diferentes variedades de arroz crescidas em solo provenientes de duas localidades no
Maranhão (A = Arari e V = Vitória do Mearim) avaliados pelo método colorimétrico.
Anexo C. Resumo da análise de variância para os dados de acúmulo massa seca da parte
aérea, número de panículas, % de sementes chochas e cheias por panículas massa de mil
sementes de 23 genótipos de arroz.
Anexo D. Resumo da análise de variância para os dados de acúmulo de massa seca em 11
variedades de arroz inoculadas com diferentes isolados de bactérias diazotróficas dos gêneros
Herbaspirillum e Azospirillum.
Anexo E. Resumo da análise de variância para os dados de acúmulo de massa seca em 11
variedades de arroz inoculadas com bactérias diazotróficas do gênero Burkholderia.
Anexo F. Resumo da análise de variância para os dados de acúmulo de massa seca da parte
aérea (MSP), altura de plantas (Altura), produção de grãos (Produção), número de panícula
por vaso (NPAN), número de sementes por panícula (NSP), massa de 1000 grãos (MMS) e
acúmulo de proteína em diferentes genótipos de arroz inoculados com bactérias diazotróficas
em condições de vaso.
Anexo G. Resumo da análise de variância dos dados de acúmulo de massa seca da parte
aérea, produção de grãos, altura de plantas, numero de panículas por m
2
e número de grãos
por panícula de dois genótipos de arroz submetidas à inoculação com diferentes bactérias
diazotróficas em condições de campo.
Anexo H. Resumo da análise de variância para os dados do teste de germinação em sementes
de dois lotes arroz da cultivar IAC 4440, em função de distintos procedimentos de inoculação
com bactérias diazotróficas.
Anexo I. Resumo da análise de variância para os dados do teste de germinação em sementes
de arroz das cultivares IR42 e Zebu branco, em função de distintos procedimentos de
inoculação com bactérias diazotróficas.
Anexo J. Resumo da análise de variância para os dados de inibição do crescimento micelial
de Fusarium sp. causado por bactérias diazotróficas.
Anexo K. Todos os isolados de bactérias diazotróficas obtidos de amostras de solo
proveniente de três municípios do estado do Maranhão.
82
Anexo A. Resumo da análise de variância para os dados de produção de compostos indólicos
por isolados de Azospirillum spp., isolados da raiz (R) e da parte aérea (PA) de três variedades
de arroz crescidas em solo provenientes de três localidades no Maranhão (A = Arari, B=
Bacabal e V = Vitória do Mearim) avaliados pelo método colorimétrico.
Quadrado médio
Fontes de variação GL
Mg/mL
µM/µg
Isolado 38 11238.072921** 0.315119**
Resíduo 199 240.797633 0.066094**
C.V. (%) 32,57 96,15
** significativo a 1%.
Anexo B. Resumo da análise de variância para os dados de de produção de compostos
indólicos por isolados de Azospirillum amazonense, isolados da raiz (R) e da parte aérea (PA)
de diferentes variedades de arroz crescidas em solo provenientes de duas localidades no
Maranhão (A = Arari e V = Vitória do Mearim) avaliados pelo método colorimétrico.
GL Quadrado médio
Fontes de variação
Mg/mL
µM/µg
Isolado 38 20421.418329** 0.632864**
Resíduo 199 369.097874 0,222116
C.V. (%) 13,90 76,21
** significativo a 1%.
83
Anexo C. Resumo da análise de variância para os dados de acúmulo massa seca da parte
aérea, número de panículas, % de sementes chochas e cheias por panículas massa de mil
sementes de 23 genótipos de arroz.
Quadrado médio
Fontes de
variação
GL
Massa seca
(g/ planta)
Altura
N
o
de panícula
por planta
N
o
de grãos por
panícula
Massa de
1000 grãos
Teor de N
na parte
aérea
Proteína
Trat. 22 364,2299** 1295,6375** 28,54249** 1618,91666** 0,795675** 0,10602** 2,430636**
Resíduo 69 4,594573 15,880627 1,387681 234,446970 0,009840 0,005081 0,338808
C.V. (%) 11,16 3,78 18,46 20,20 3,78 13,61 7,10
** significativo a 1%.
Anexo D. Resumo da análise de variância para os dados de acúmulo de massa seca em 11
variedades de arroz inoculadas com diferentes isolados de bactérias diazotróficas dos gêneros
Herbaspirillum e Azospirillum.
Quadrado médio
Fontes de variação GL
PS
Variedade (V) 11 0,003901**
Isolado (I) 10 0,001319**
V x I 110 0.000084ns
Resíduo 396 0,000110
C.V. (%) 28,00
** significativo a 1%.
84
Anexo E. Resumo da análise de variância para os dados de acúmulo de massa seca em 11
variedades de arroz inoculadas com bactérias diazotróficas do gênero Burkholderia
.
Quadrado médio
Fontes de variação GL
PS
Variedade (V) 11 0,001118**
Isolado (I) 10 0,000517**
V x I 110 0.000083ns
Resíduo 396 0,000110
C.V. (%) 25,06
** significativo a 1%.
Anexo F. Resumo da análise de variância para os dados de acúmulo de massa seca da parte
aérea (MSP), altura de plantas (Altura), produção de grãos (Produção), número de panícula
por vaso (NPAN), número de sementes por panícula (NSP), massa de 1000 grãos (MMS) e
acúmulo de proteína em diferentes genótipos de arroz inoculados com bactérias diazotróficas
em condições de vaso.
Quadrado médio
Fontes de
variação
GL
MSR MSP Altura Produção NPAN NSP MMS Proteína
Bloco 3 18,003501** 0,529855ns 153,11214** 2,584080ns 1,887860ns 128,92489ns 2,39551ns 0,594537ns
Isolado (I) 8 33,272863** 154,6017** 58,80729ns 8,754631** 3,540223** 365,8194** 16,22414** 8,84220**
Variedade (V) 8 69,094772** 90,17337** 9263,0937** 27,212956** 171,2831** 1646,4513** 231,5199** 14,84599**
I x V 64 5,812919** 31,83595** 34,38541ns 2,109089** 1,310089ns 187,5503** 4,766668** 0,68446ns
Resíduo 240 2,519817 24,333430 35,310185 1,111310 1,077160 82,725309 2,394498 0,551651
C.V. (%) 16,33 13,15 7,20 15,71 20,17 16,82 5,99 11,16
ns = não significativo; ** significativo a 1%.
85
Anexo G. Resumo da análise de variância dos dados de acúmulo de massa seca da parte
aérea, produção de grãos, altura de plantas, numero de panículas por m
2
e número de grãos
por panícula de dois genótipos de arroz submetidas à inoculação com diferentes bactérias
diazotróficas em condições de campo
.
Quadrado médio
Fontes de variação GL
Massa seca por
planta
Rendimento Altura
N
o
de panículas
m
2
N
o
de grãos por
panícula
Bloco 3 95,225775** 5528,815746ns 1456,6600** 4674,243056ns 1618,916667**
Isolado (I) 5 32,752547ns 12256,036007* 62,388889ns 451,720833ns 87,833333ns
Variedades (V) 1 3048,301880** 254809,780724** 8809,387222** 44469,18750** 1064,083333*
I x V 5 35,048186 3794,03030ns 90,459222ns 1826,58750ns 141,433333ns
Resíduo 33 14,490866 3740,862637 154,724275 1421,136995 234,446970
C.V. (%) 22,22 14,61 9,12 18,09 20,20
ns = não significativo; * significativo a 5%; ** significativo a 1%.
Anexo H. Resumo da análise de variância para os dados do teste de germinação em sementes
de dois lotes arroz da cultivar IAC 4440, em função de distintos procedimentos de inoculação
com bactérias diazotróficas.
Quadrado médio
Fontes de
variação
GL
Germinação
Plântulas
anormais
deformadas
Plântulas
anormais
infeccionadas
Sementes
mortas
Primeira
contagem de
germinação
Plântulas
normais fortes
Plântulas
normais fracas
Estirpes (E) 9 1,459606** 2,636889** 4,390853** 2,420739** 1,153397** 1,555268** 2,698348**
Lotes (L) 1 37,637110** 37,092876** 70,645701** 56,202042** 16,394438** 79,653908** 0,055768ns
E x L 9 1,254174** 2,467298** 2,563969** 1,306347* 0,821066* 0,487190ns 1,277952*
Resíduo 60 0,183121 0,780498 0,61110 0,542014 0,383565 0,439807 0,496366
C.V. (%) 4,71 41,64 38,02 33,70 12,23 10,36 11,21
ns = não significativo; * significativo a 5%; ** significativo a 1%.
86
Anexo I. Resumo da análise de variância para os dados do teste de germinação em sementes
de arroz das cultivares IR42 e Zebu branco, em função de distintos procedimentos de
inoculação com bactérias diazotróficas.
Quadrado médio
Fontes de
variação
GL
Germinação
Plântulas
anormais
deformadas
Plântulas
anormais
infeccionadas
Sementes
mortas
Primeira
contagem de
germinação
Plântulas
normais fortes
Plântulas
normais
fracas
Estirpes (E) 7 0,126722ns 2,680404* 0,214286ns 0,613941ns 4,426993** 2,480723** 2,243566**
Variedade (V) 1 0,701823** 6,166821* 0,12500ns 3,202415ns 0,004760ns 2,298822** 0,476776ns
E x V 7 0,0733330ns 0,725202ns 0,339286ns 0,404052ns 0,604335* 0,383214ns 1,115959**
Resíduo 48 0,074627 0,969823 0,416667 0,539260 0,292037 0,240667 0,373958
C.V. (%) 2,84 45,23 60,86 67,48 8,22 6,68 9,91
ns = não significativo; * significativo a 5%; ** significativo a 1%.
Anexo J. Resumo da análise de variância para os dados de inibição do crescimento micelial
de Fusarium sp. causado por bactérias diazotróficas.
Fontes de variação GL Quadrado médio
Tratamento 5 3,924417**
Resíduo 18 0,09639
C.V. (%) 5,85
** significativo a 1%.
87
Anexo K. Todos os isolados de bactérias diazotróficas obtidos de amostras de solo
proveniente de três municípios do estado do Maranhão.
Número
Código
antigo
Código
Novo
Número
Código
antigo
Código Novo Número
Código
antigo
Código
Novo
1 A11 ARM-ID-1 51 A31 ARM-ID-51 101 A31 ARM-ID-101
2 A11 ARM-ID-2 52 B33 BRM-ID-52 102 A31 ARM-ID-102
3 D11 VRM-ID-3 53 B33 BRM-ID-53 103 A31 ARM-ID-103
4 A22 ARM-ID-4 54 A33 ARM-ID-54 104 D32 VRM-ID-104
5 A13 AFM-ID-5 55 A33 ARM-ID-55 105 D32 VRM-ID-105
6 B12 BRM-ID-6 56 A31 ARM-ID-56 106 D32 VRM-ID-106
7 A11 ARM-ID-7 57 A31 ARM-ID-57 107 D32 VRM-ID-107
8 B11 BRM-ID-8 58 A32 ARM-ID-58 108 D32 VRM-ID-108
9 A21 ARM-ID-9 59 A32 ARM-ID-59 109 D32 VRM-ID-109
10 A12 ARM-ID-10 60 B33 BFM-ID-60 110 B32 BRM-ID-110
11 A11 ARM-ID-11 61 B33 BFM-ID-61 111 B32 BRM-ID-111
12 B12 BRM-ID-12 62 A32 ARM-ID-62 112 B32 BRM-ID-112
13 B22 BRM-ID-13 63 A32 ARM-ID-63 113 A32 ARM-ID-113
14 A11 ARM-ID-14 64 B31 BRM-ID-64 114 A42 ARM-ID-114
15 A21 ARM-ID-15 65 B31 BRM-ID-65 115 A42 ARM-ID-115
16 B13 BFM-ID-16 66 A32 ARM-ID-66 116 A42 ARM-ID-116
17 B13 BFM-ID-17 67 A32 ARM-ID-67 117 A41 ARM-ID-117
18 B11 BRM-ID-18 68 B32 BRM-ID-68 118 A41 ARM-ID-118
19 B11 BRM-ID-19 69 B32 BRM-ID-69 119 B42 BRM-ID-119
20 B12 BRM-ID-20 70 A31 ARM-ID-70 120 B41 BRM-ID-120
21 A11 ARM-ID-21 71 A31 ARM-ID-71 121 A41 ARM-ID-121
22 B12 BRM-ID-22 72 B33 BFM-ID-72 122 A41 ARM-ID-122
23 A12 ARM-ID-23 73 B33 BFM-ID-73 123 A41 ARM-ID-123
24 A11 ARM-ID-24 74 A31 ARM-ID-74 124 B42 BRM-ID-124
25 B13 BFM-ID-25 75 A31 ARM-ID-75 125 A41 ARM-ID-125
26 B13 BFM-ID-26 76 A31 ARM-ID-76 126 A41 ARM-ID-126
27 B13 BFM-ID-27 77 A31 ARM-ID-77 127 B42 BRM-ID-127
28 A12 ARM-ID-28 78 A31 ARM-ID-78 128 A41 ARM-ID-128
29 A13 AFM-ID-29 79 A31 ARM-ID-79 129 A41 ARM-ID-129
30 A11 ARM-ID-30 80 B32 BRM-ID-80 130 B41 BRM-ID-130
31 A13 AFM-ID-31 81 B32 BRM-ID-81 131 A41 ARM-ID-131
32 B11 BRM-ID-32 82 B31 BRM-ID-82 132 B42 BRM-ID-132
33 A11 ARM-ID-33 83 B31 BRM-ID-83 133 B41 BRM-ID-133
34 B12 BRM-ID-34 84 A31 ARM-ID-84 134 A42 ARM-ID-134
35 B13 BFM-ID-35 85 A31 ARM-ID-85 135 B43 BFM-ID-135
36 A32 ARM-ID-36 86 B32 BRM-ID-86 136 A42 ARM-ID-136
37 A32 ARM-ID-37 87 B32 BRM-ID-87 137 B42 BRM-ID-137
38 B31 BRM-ID-38 88 B33 BFM-ID-88 138 B41 BRM-ID-138
39 B31 BRM-ID-39 89 B33 BFM-ID-89 139 A42 ARM-ID-139
40 A31 ARM-ID-40 90 A31 ARM-ID-90 140 B41 BRM-ID-140
41 A31 ARM-ID-41 91 A31 ARM-ID-91 141 A42 ARM-ID-141
42 B31 BRM-ID-42 92 A32 ARM-ID-92 142 B41 BRM-ID-142
43 B31 BRM-ID-43 93 A32 ARM-ID-93 143 B42 BRM-ID-143
44 B32 BRM-ID-44 94 B31 BRM-ID-94 144 A41 ARM-ID-144
45 B32 BRM-ID-45 95 B31 BRM-ID-95 145 B41 BRM-ID-145
46 B31 BRM-ID-46 96 A32 ARM-ID-96 146 B41 BRM-ID-146
47 B31 BRM-ID-47 97 A32 ARM-ID-97 147 D41 BRM-ID-147
48 A32 ARM-ID-48 98 A31 ARM-ID-98 148 D43 VFM-ID-148
49 A32 ARM-ID-49 99 A31 ARM-ID-99 149 D43 VFM-ID-149
50 A31 ARM-ID-50 100 A31 ARM-ID-100 150 D41 VRM-ID-150
88
Anexo K. Continuação.
Número Código antigo Código Novo Número Código antigo Código Novo
151 D41 DRM-ID-151 201 AR1125 ARM-HE-201
152 D43 VFM-ID-152 202 BR2126 BRM-HE-202
153 D41 VRM-ID-153 203 AR211 ARM-AZ-203
154 D41 VRM-ID-154 204 AR212 ARM-AZ-204
155 D43 VFM-ID-155 205 VR113 ARM-AZ-205
156 D41 VRM-ID-156 206 AR114 ARM-AZ-206
157 D41 VRM-ID-157 207 AR215 ARM-AZ-207
158 D41 VRM-ID-158 208 A216 ARM-AZ-208
159 D43 VFM-ID-159 209 BR117 ARM-AZ-209
160 D41 VRM-ID-160 210 AR218 ARM-AZ-210
161 D41 VRM-ID-161 211 AR319 ARM-AZ-211
162 D52 VRM-BU-162 212 BR2111 BRM-AZ-212
163 D51 VRM-BU-163 213 A2112 ARM-SP-213
164 D51 VRM-BU-164 214 B2113 BRM-AZ-214
165 B51 BRM-BU-165 215 BF2227 BFM-AZ-215
166 A52 ARM-BU-166 216 AR2128 ARM-AZ-216
167 A51 ARM-BU-167 217 AR2129 ARM-AZ-217
168 B51 BRM-BU-168 218 AR2130 ARM-AZ-218
169 B51 BRM-BU-169 219 AR1131 ARM-AZ-219
170 B51 BRM-BU-170 220 AR2132 ARM-AZ-220
171 B51 BRM-BU-171 221 AR1133 ARM-AZ-221
172 A51 ARM-BU-172 222 VR1134 VRM-AZ-222
173 A51 ARM-BU-173 223 AR1135 ARM-AZ-223
174 A52 ARM-BU-174 224 VF2236 VFM-AZ-224
175 A52 ARM-BU-175 225 BR2137 BRM-AZ-225
176 A51 ARM-BU-176 226 BR1138 BRM-AZ-226
177 A52 ARM-BU-177 227 BR1139 BRM-AZ-227
178 A52 ARM-BU-178 228 AR2140 BRM-AZ-228
179 D51 VRM-BU-179 229 AR2141 ARM-AZ-229
180 D51 VRM-BU-180 230 BR1142 BRM-AZ-230
181 D51 VRM-BU-181 231 A2111 ARM-AM-231
182 A51 ARM-BU-182 232 AF22 AFM-AM-232
183 A53 AFM-BU-183 233 AR213 ARM-AM-232
184 B53 BFM-BU-184 234 AR214 ARM-AM-234
185 B-53 BFM-BU-185 235 AR215 ARM-AM-235
186 A51 ARM-BU-186 236 AF226 AFM-AM-236
187 B53 BFM-BU-187 237 VF227 VFM-AM-237
188 B51 BRM-BU-188 238 VR218 VRM-AM-238
189 B53 BFM-BU-189 239 VR219 VRM-AM-239
190 A51 ARM-BU-190 240 AR2110 ARM-AM-240
191 D2231-3A VFM-HE-191 241 VR2111 VRM-AM-241
192 VR2116 VRM-HE-192 242 VR2112 VRM-AM-242
193 VR2117 VRM-HE-193 243 VF2213 VFM-AM-243
194 A2231-2C AFM-HE-194 244 VR2114 VRM-AM-244
195 VR1119 VRM-HE-195 245 VF2215 VFM-AM-245
196 AR2120 ARM-HE-196 246 VR2116 VRM-AM-246
197 AR1121 ARM-HE-197 247 AR2117 ARM-AM-247
198 AR1122 ARM-HE-198 248 AR3118 ARM-AM-248
199 AR1123 ARM-HE-199 249 VR3119 VRM-AM-249
200 AR1124 ARM-HE-200 250 VR3120 VRM-AM-250
89
Anexo K. Continuação.
Número Código antigo Código Novo Número Código antigo Código Novo
251 AR3121 ARM-AM-251 295 D5131-2B VRM-BU-295
252 AR3122 ARM-AM-252 296 B5231-2B VFM-BU-296
253 AR3123 ARM-AM-253 297 D5131-1A VRM-BU-297
254 AR3124 ARM-AM-254 298 A5141-1B ARM-BU-298
255 VR3125 VRM-AM-255 299 B4231-2C BFM-BU-299
256 VR3126 VRM-AM-256 300 A5141-1B ARM-BU-300
257 AR3127 ARM-AM-257 301 A5231-1B AFM-BU-301
258 AR2128 ARM-AM-258 302 A5131-2B ARM-BU-302
259 A312-2B ARM-ND-259 303 A511-1B ARM-BU-303
260 A3131-2B ARM-ND-260 304 A511-1A ARM-BU-304
261 A312-2A ARM-ND-261 305 A5142-1B ARM-BU-305
262 B312-1A BRM-ND-262 306 A512-1B ARM-BU-306
263 B3152-2C BRM-ND-263 307 A5132-1A ARM-BU-307
264 B312-3A BRM-ND-264 308 A5132-1A ARM-BU-308
265 B3231-1C BFM-ND-265 309 A5132-1B ARM-BU-309
266 D3131-1C VRM-ND-266 310 A512-1A ARM-BU-310
267 D3231-1B VFM-ND-267 311 B5131-1B ARM-BU-311
268 A4141-1B ARM-ND-268 312 B4231-2C BFM-BU-312
269 A411-1A ARM-ND-269 313 B521-1C BFM-BU-313
270 A4141-4D ARM-ND-270 314 B5231-2B BFM-BU-314
271 A4142-4A ARM-ND-271 315 B512-1B BRM-BU-315
272 A421-2A AFM-ND-272 316 B5142-4B BRM-BU-316
273 A4141-1A ARM-ND-273 317 B512-2A BRM-BU-317
274 A4231-1B AFM-ND-274 318 B5142-4A BRM-BU-318
275 A4131-2B ARM-ND-275 319 B512-2B BRM-BU-319
276 A4141-3A ARM-ND-276 320 A5142-3A ARM-BU-320
277 A4131-1A ARM-ND-277 321 B5132-1A BRM-BU-321
278 A4231-3A AFM-ND-278 322 D512-2A VRM-BU-322
279 B4231-2A BFM-ND-279 323 D5131-1B VRM-BU-323
280 B411-1B BFM-ND-280 324 D5132-3A VRM-BU-324
281 B4231-3B BFM-ND-281 325 D5132-3A VRM-BU-325
282 B4231-1B BFM-ND-282 326 D512-2A VRM-BU-326
283 B4231-1B BFM-ND-283 327 D512-1A VRM-BU-327
284 D3141-1A VRM-ND-284 328 D5131-1A VRM-BU-328
285 B411-2A BRM-ND-285 329 A5231-2B AFM-BU-329
286 D4131-2A VRM-ND-286 330 A5141-1B ARM-BU-330
287 D4131-2A VRM-ND-287 331 A5141-1B ARM-BU-331
288 A5141-1B ARM-BU-288 332 A5141-1D ARM-BU-332
289 A511-1A ARM-BU-289 333 A5231-1B AFM-BU-333
290 A5231-1B AFM-BU-290 334 A511-1B ARM-BU-334
291 A511-1B ARM-BU-291 335 A511-1A ARM-BU-335
292 D5131-1B VRM-BU-292 336 A4231-2C AFM-BU-336
293 A5131-1B ARM-BU-293 337 B5131-1C ARM-BU-337
294 B521-1C BFM-BU-294 338 D5131-1A VRM-BU-338
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