( PDF ) Caracterização funcional das ? -amilases de bacillus subtilis e pyrococcus furiosus ? estudo da enzima nativa de bacillus e expressão heteróloga da ?- amilase de pyrococcus furiosus em pichia pastoris

Download PDF

ads:

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

INSTITUTO DE BIOQUÍMICA MÉDICA

PROGRAMA DE BIOLOGIA ESTRUTURAL

CARACTERIZAÇÃO FUNCIONAL DAS α -AMILASES DE Bacillus

subtilis E Pyrococcus furiosus – ESTUDO DA ENZIMA

NATIVA DE Bacillus E EXPRESSÃO HETERÓLOGA DA α-

AMILASE DE Pyrococcus furiosus EM Pichia pastoris .

PABLO AUGUSTO CARDOSO SOARES

RIO DE JANEIRO

2008

ads:

Livros Grátis

http://www.livrosgratis.com.br

Milhares de livros grátis para download.

CARACTERIZAÇÃO FUNCIONAL DAS α -AMILASES DE Bacillus

subtilis E Pyrococcus furiosus – ESTUDO DA ENZIMA

NATIVA DE Bacillus E EXPRESSÃO HETERÓLOGA DA α-

AMILASE DE Pyrococcus furiosus EM Pichia pastoris .

PABLO AUGUSTO CARDOSO SOARES

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

INSTITUTO DE BIOQUÍMICA MÉDICA

PROGRAMA DE BIOLOGIA ESTRUTURAL

ads:

iii

CARACTERIZAÇÃO FUNCIONAL DAS α -AMILASES DE Bacillus

subtilis E Pyrococcus furiosus – ESTUDO DA ENZIMA

NATIVA DE Bacillus E EXPRESSÃO HETERÓLOGA DA α-

AMILASE DE Pyrococcus furiosus EM Pichia pastoris .

PABLO AUGUSTO CARDOSO SOARES

Dissertação submetida ao corpo docente do

Instituto de Bioquímica Médica da

Universidade Federal do Rio de Janeiro

como parte dos requisitos necessários à obtenção

do grau de mestre em Química Biológica.

ORIENTADOR: JULIO ALBERTO MIGNACO

Banca Examinadora_________________________________________

Dr. Marcelo Alves Ferreira

Pesquisador da FioCruz

Dr. Paulo César de Carvalho-Alves

Professor Adjunto do Instituto de Bioquímica Médica, UFRJ

Dra. Geórgia Corrêa Atella

Professor Adjunto do Instituto de Bioquímica Médica, UFRJ

Revisor_____________________________________________________

Dr. Marcius da Silva Almeida

Professor Adjunto do Instituto de Bioquímica Médica, UFRJ

Suplente____________________________________________________

Dra. Cláudia dos Santos Magioli

Pesquisador Junior do Instituto Nacional de Propriedade Industrial

Orientador__________________________________________________

Dr. Júlio Alberto Mignaco

Professor Adjunto do Instituto de Bioquímica Médica, UFRJ

Co-Orientador______________________________________________

Dr. Carlos Frederico Leite Fontes

Professor Adjunto do Instituto de Bioquímica Médica, UFRJ

Soares, P.A.C.

Caracterização funcional das α-amilases de Bacillus subtilis e

Pyrococcus furiosus – Estudo da enzima nativa de Bacillus e expressão

heteróloga da α-amilase de Pyrococcus furiosus em Pichia pastoris.

115 fls.

Tese: Mestre em Química Biológica

1 - α-amilase; 2 - Bacillus subtilis ; 3 - Pyrococcus furiosus; 4

- Expressão heteróloga de proteínas; 5 - Enzimas.

I. Universidade Federal do Rio de Janeiro – Bioquímica Médica

II. Título

Este trabalho foi desenvolvido no laboratório de Estrutura e

Regulação de Proteínas e ATPases do Instituto de Bioquímica Médica da

Universidade Federal do Rio de Janeiro, sob a orientação do Professor Júlio

Alberto Mignaco e co-orientação do Professor Carlos Frederico Leite

Fontes, na vigência de auxílios concedidos pela CAPES, FAPERJ, CNPq e

TEP-CENPES.

vii

“ Põe o quanto és no mínimo que fazes. ”

Fernando Pessoa

viii

Ao meu pai, minha mãe, e meu irmão,

que estiveram sempre ao meu lado.

Agradecimentos_____________________________________________

Não poderia começar meus agradecimentos por outra pessoa sem ser

por Júlio Alberto Mignaco, que conheci através do CEDERJ. Antes de

decidir fazer o mestrado na UFRJ eu trabalhava como roteirista das aulas

de biologia do curso de Ciências Biológicas do CEDERJ. Foi a partir daí

que o Júlio me fez o convite para ser seu aluno de mestrado e dar

andamento ao projeto das amilases. Desta forma sou profundamente grato

por ele ter acreditado em mim e ter me dado esta oportunidade.

Outro tão importante quanto Júlio é Carlos Frederico Leite Fontes

(FRED) que com todo seu jeitão também acreditou e confiou a mim a

responsabilidade de tocar este projeto. E hoje, muito mais do que meus

orientadores, eles são meus grandes amigos. Falando no Fred, não posso

deixar de agradecer toda a paciência e cumplicidade de sua esposa Denise,

que foi muito importante e uma grande amiga em todo esse caminho.

Lembro-me como se fosse hoje, o dia em que tive que usar o

espectrofotômetro pela primeira vez, estava meio nervoso, pois nem Julio e

Fred estavam mais no laboratório. Para minha surpresa e “sorte” a Lia

ainda estava no laboratório. Quando ela me viu com aqueles vários tubos

para serem lidos e um olhar muito pensativo para o espectrofotômetro, ela

perguntou: “Você quer ajuda?”. E eu, obviamente, respondi que SIM. Foi

nesse dia que, além de eu aprender a usar o espectrofotômetro, passei a

contar a ajuda dela para várias coisas. Não posso deixar de agradecer todas

as vezes que ela ficava me esperando até eu acabar um experimento,

mesmo quando eu errava um “pouquinho” na previsão do término.

Agradeço também a ela por me ensinar a montar o gel de SDS-PAGE e

sutileza para dizer a solução de Acrilamida precisa conter também Bis-

Acrilamida, pois sem ela o gel não polimeriza. Enfim, foram inúmeras às

vezes em que a Lia esteve ao meu lado me ajudando e dando boas idéias,

desta forma ela se tornou uma excelente amiga, companheira,... . Faltariam

palavras para que eu pudesse expressar toda minha gratidão e admiração

por ela.

Tenho muito a agradecer também a Cristiane Maia Alves (CRIS),

minha aluna de iniciação científica, que se mostrou muito presente e

atuante em todos os experimentos. Graças a alguns equívocos cometidos

por ela obtivemos alguns resultados realmente surpreendentes. Não tenho

palavras para dizer o quão grato sou a ela, só o que posso dizer é que, além

de ser uma excelente aluna, é uma grande amiga, e esteve do meu lado nos

momentos bons e ruins, onde parecia que tudo estava dando errado... por

isso, sou imensamente grato a ela.

Não poderia deixar de citar todos os membros do laboratório da

Professora Eleonora Kurtenbach, em especial meu amigo Iuri Bastos

Pereira, que foi o meu tutor na expressão heteróloga da α-amilase de

Pyrococcus furiosus, pois sem ele meu trabalho seria infinitamente mais

árduo.

Agradeço também aos Professores Hector Barrabin e Helena Maria

Scofano pelos bons conselhos, críticas e idéias durante as apresentações

dos journals de laboratório.

Como não poderia deixar de ser, agradeço também a todos os meus

amigos e amigas do laboratório, Otacílio, Bernardo, Cristiano, Leandro,

Thiago, Luciano, Jorge, Marcelo, Daniel, Ana Paula, Vanessa Honorato,

Vanessa Cortes, Milene, Juliana, Danielly, Rosângela, Mônica, e todas as

outras pessoas que por ventura tenha me esquecido, que participaram direta

e indiretamente no meu trabalho.

Agradeço agora às duas pessoas que foram, são e serão as mais

importantes na minha vida, que são os meus pais: Dionísio Soares e Zélia

Soares, que sempre estiveram presentes, me apoiaram, e acreditaram em

mim, em todas as situações.

Finalizando minha lista de agradecimentos, gostaria de agradecer a

Deus por tudo o que aconteceu em minha vida durante esta caminhada, e

espero ter aprendido tudo o que ele quis me dizer com diferentes sinais,

pois uma coisa é certa: NADA É POR ACASO!

xii

Resumo:

As α-amilases microbianas são utilizadas nas indústrias têxtil,

alimentícia e de detergentes. Nós estudamos duas amilases, oriundas de

Bacillus subtilis e Pyroccocus furiosus. Ambas são acidófilas, sendo a de

Bacillus subtilis termotolerante e a de Pyroccocus furiosus termoresistente.

Neste trabalho verificamos o efeito de diferentes meios, substratos,

concentrações de sais, e pressão hidrostática na atividade da α-amilase de

Bacillus subtilis, e para a α-amilase de Pyroccocus furiosus descrevemos

uma metodologia de expressão heteróloga desta proteína, o efeito da

concentração de substratos, e sua termoresistência. As culturas de Bacillus

subtilis foram crescidas em meio LB a 30 °C por 72 horas. O sobrenadante

foi estocado a 4 °C, posteriormente foi precipitado com uma solução de

sulfato de amônio (62,5%). Além disso foi utilizado um concentrador

Amicon (corte de 10 kDa) onde as enzimas foram concentradas de 50-200

vezes e refrigeradas. A α-amilase de Pyroccocus furiosus foi expressa em

Pichia pastoris sob o controle do promotor AOX1, altamente expresso por

indução com metanol. Neste sistema, a atividade amilásica alcançou seu

máximo após 8 dias de expressão. Após estes 8 dias, os sobrenadantes

destas culturas foram armazenados a 4 °C. A atividade, testada em água

adicionada de 0,4 M de NaCl ou água do mar sintética, 20 mM de tampão

(pH 5.5 para B. subtilis e pH 4.5 para P. furiosus), 0,1% de amido solúvel e

1 mM de CaCl

, foi analisada pelo método de DNS. Os substratos

sintéticos nitrofenil-maltotriosídeo (CNPG3), nitrofenil-maltopentaose

(pNPG5), e amido propilado também foram utilizados. O amido propilado,

usado no reboco de poços de petróleo, mostrou-se um bom substrato para

ambas enzimas. A atividade amilásica foi medida a 55 °C-75 °C (B.

subtilis) e 80 °C-100 °C (P. furiosus). Em água do mar, a atividade

aumentou e se manteve por mais de 120 min. quando 4 M de NaCl foi

adicionado (B. subtilis). CNPG3, mas não pNPG5, se mostrou um bom

substrato em todas as temperaturas. A pressão hidrostática aumentou a

atividade hidrolítica em 3,5 vezes a 2,0 kbar, e a atividade se manteve por

mais de 120 min. a 55 °C (B. subtilis). Estas duas enzimas podem ser úteis

em processos industriais em virtude da sua versatilidade e graças aos seus

perfis de termotolerância e termoresistência, acidofilicidade, especificidade

de substrato, e para B. subtilis, pela ativação por pressão. Em suma, ambas

apresentaram um perfil desejado para aplicações ligadas à cadeia produtiva

de petróleo e ou gás.

xiii

Abstract:

Microbial α-amylases are used in food, textile, and detergent

industries. We studied two amylases, one from Bacillus subtilis and another

from Pyroccocus furiosus. Both proved to be acidophilic and

thermoresistant. In this work we report the effects of different media,

substrates, enzyme concentration, salt concentration, and hydrostatic

pressure, on the Bacillus subtilis amylase activity, and for Pyroccocus

furiosus we describe the heterologus expression methodology of α-amylase

and also the effects of substrate concentration, enzyme concentration.

Bacillus subtilis cultures were grown in LB medium at 30 °C with passages

at 72 h. The supernatants, stored at 4 °C, were precipitated with ammonium

sulfate (62.5%). Otherwise, an Amicon concentrator (10 kDa-cutoff) was

used. Enzyme was concentrated 50-200 fold and frozen. The α-amylase of

Pyroccocus furiosus was expressed in Pichia pastoris under control of the

AOX1 promoter, highly expressed under induction with methanol. In this

system, a peak of amylase activity could be detected after 8 days of

expression. After 8 days, the supernatants were stored at 4° C. Activity was

tested either in freshwater supplemented with 0.4 M NaCl or in synthetic

seawater with 20 mM buffer (pH 5.5 for B. subtilis and pH 4.5 for P.

furiosus), 0.1% soluble starch, 1 mM CaCl

, was assayed by the (DNS)

method. The synthetic substrate nitrophenyl-maltotrioside (CNPG3),

nitrophenyl-maltopentaose (pNPG5), and propylated starches were also

used. This starch was a good substrate for both enzymes. The amylolytic

activity was assayed at 55 °C-75 °C (B. subtilis) and 80 °C-100 °C (P.

furiosus). In seawater, the activity increased and lasted longer (>120 min)

when 4 M NaCl was added (B. subtilis). CNPG3 was a substrate at all the

temperatures, and hydrostatic pressure activated hydrolysis by 3.5-fold at

2.0 Kbar, with stability for more than 120 min at 55°C (B. subtilis). These

two enzymes might be suitable for industry due to the good

thermotolerance, acidophilic preference, substrate broad-specificity and, for

the B. subtilis enzyme, pressure activation.

xiv

Lista de Abreviações:

AOX – enzima álcool-oxidase

Atm - atmosferas

BBS – meio salino básico

BMG – meio mínimo glicerol

BSA – albumina bovina sérica

- íons cálcio

CNTP – condições normais de temperatura e pressão

CNPG3 - Nitro fenil maltotriosídeo

DNA – ácido desoxirribonucléico

DNS – Ácido 3,5 dinitro-salicilato

DO – densidade óptica

DTT – ditiotreitol

GAPDH – enzima gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase

IPTG – isopropil-β-D-tiogalactopiranosídeo

LB – meio Luria-Bertani

MPa – Megapascal

NaOH – Hidróxido de sódio

NaCl – Cloreto de sódio

OGM – organismo geneticamente modificado

PCR – reação de polimerização em cadeia

pH – potencial hidrogeniônico

SDS – dodecil sulfato de sódio

SDS-PAGE – eletroforese em gel de poliacrilamida na presença de SDS

TAE – tampão Tris-acetato-EDTA

TBE – tampão Tris-borato-EDTA

YPD – meio extrato de levedo, peptona e dextrose

KCl – cloreto de potássio

xvi

Índice:

1- Introdução___________________________________________________________________ 1

1.1 - Amido e polissacarídeos em geral______________________________________________ 1

1.2 - Características das a-amilases_________________________________________________

1.3 - Procedimentos industriais_____________________________________________________ 12

1.3.1 - Utilização de α-amilase em poços de petróleo___________________________________ 14

1.4 - Microorganismos produtores de amilases_________________________________________ 16

1.4.1 - Temperatura______________________________________________________________ 16

1.4.2 - pH______________________________________________________________________ 18

1.4.3 - Disponibilidade de água_____________________________________________________ 18

1.4.4 - Disponibilidade de oxigênio_________________________________________________ 19

1.4.5 - Bacillus subtilis___________________________________________________________ 20

1.4.6 - Pyrococcus furiosus________________________________________________________

1.5 - Expressão heteróloga de α-amilases em Pichia pastori______________________________ 23

2 – Objetivos___________________________________________________________________ 28

3 - Material e métodos____________________________________________________________ 29

3.1 - Cultura de células e armazenamento do sobrenadante da cultura de Bacillus subtilis_______ 29

3.2 - Determinação do crescimento das culturas de Bacillus subtilis________________________ 30

3.3 - Determinação da atividade enzimática___________________________________________ 31

3.4 – Teste de estabilidade enzimática dos sobrenadantes________________________________ 33

3.5 - Determinação da atividade amilásica em função da temperatura_______________________ 33

3.6 - Determinação da atividade amilásica em função do pH______________________________ 34

3.7 - Efeito de indução da produção e secreção da α-amilase por Ca

e amido_______________ 34

3.8 - Enriquecimento da atividade amilásica através de precipitação com Sulfato de Amônio____ 35

3.9 - Enriquecimento da atividade amilásica por concentração com concentrador Amicon______ 36

3.10 - Determinação da halotolerância na atividade enzimática____________________________ 37

3.11 - Determinação da atividade enzimática em função do tempo_________________________ 38

3.12 - Determinação do peso molecular da amilase através de SDS-PAGE__________________ 38

3.13 - Coloração de gel pelo método de Prata Rápida___________________________________ 39

3.14 - Determinação da atividade amilásica sob pressão hidrostática_______________________ 41

3.15 - Amplificação, clonagem e expressão do gene da a-amilase extracelular de Pyrococcus

furiosus____________________________________________________________________ 42

3.15.1 - Otimização de códons do gene da amilase de Pyrococcus furiosus__________________ 42

3.15.2 - Sub-clonagem e expressão heteróloga da amilase de Pyrococcus furiosus_____________ 43

3.15.3 – Transfecção do vetor pPIC9 para DH5-α (células competentes)____________________ 44

3.15.4 - Transformação de Pichia pastoris com o vetor pPIC9____________________________ 45

3.15.5 - Testes de expressão da amilase recombinante __________________________________ 47

xvii

3.16 - Determinação da atividade amilásica de Pyrococcus furiosus recombinante____________ 48

3.17 - Formulação do meio reacional para determinação da atividade da amilase

recombinante_______________________________________________________________

3.18 - Determinação da atividade amilásica em função da temperatura______________________ 49

3.19 - Determinação da atividade amilásica em função do pH_____________________________ 49

3.20 - Determinação da atividade amilásica em função da concentração de enzima (sobrenadante) 50

3.21 - Determinação da atividade amilásica em função da concentração de substrato___________ 50

3.22 - Determinação da atividade amilásica em função de concentrações baixas de enzima

(sobrenadante) e mais substrato_________________________________________________ 51

3.23 - Determinação do peso molecular da amilase por SDS-PAGE________________________ 52

4 - Resultados__________________________________________________________________ 53

4.1 - Bacillus subtilis_____________________________________________________________ 53

4.1.1 - Determinação do crescimento das culturas de Bacillus subtilis______________________ 53

4.1.2 – Teste de estabilidade enzimática dos sobrenadantes_______________________________ 55

4.1.3 - Determinação da atividade amilásica em função da temperatura_____________________ 57

4.1.4 - Determinação da atividade amilásica em função do pH____________________________ 59

4.1.5 - Efeito de indução da amilase por Ca

e amido___________________________________ 61

4.1.6 - Enriquecimento da atividade amilásica através da concentração por precipitação com

Sulfato de Amônio_________________________________________________________ 63

4.1.7 - Determinação da halotolerância da atividade enzimática___________________________ 65

4.1.8 - Determinação da atividade enzimática em função do tempo________________________ 66

4.1.9 - Determinação do peso molecular da amilase de Bacillus subtilis por SDS-PAGE_______ 69

4.1.10 - Determinação da atividade amilásica sob pressão hidrostática______________________ 71

4.2 - Pyrococcus furiosus_________________________________________________________ 73

4.2.1 - Mapa do vetor pPIC9 com o local de inserção do gene_____________________________ 73

4.2.2 - Confirmação da transfecção do vetor pPIC9 para DH5-α (células competentes) por gel de

agarose__________________________________________________________________ 74

4.2.3 - Expressão da a-amilase de Pyrococcus furiosus em Pichia pastoris__________________

4.2.4 - Determinação da atividade amilásica em função do pH____________________________ 78

4.2.5 - Determinação da atividade amilásica em função de diferentes concentrações de substrato_ 82

4.2.6 - Determinação da atividade amilásica em função de concentrações baixas de enzima e altas

de substrato_______________________________________________________________ 86

4.2.7 - Determinação do peso molecular da amilase através de SDS-PAGE__________________ 90

5 - Discussão___________________________________________________________________ 92

5.1 - Aplicabilidade das α-amilases em processos industriais_____________________________ 92

5.2 - Parâmetros específicos da α-amilase de Bacillus subtilis (temperatura, pH, peso molecular,

estabilidade e salinidade)______________________________________________________ 93

5.3 - Expressão heteróloga da α-amilase de Pyrococcus furiosus em Pichia pastoris___________ 99

xviii

5.4 - Parâmetros específicos da α-amilase de Pyrococcus furiosus (temperatura, pH, peso

molecular e estabilidade)____________________________________________________

100

6 - Conclusão___________________________________________________________________ 103

7 - Referencias Bibliográficas______________________________________________________ 106

8 – Anexo_____________________________________________________________________ 114

xix

Índice das Figuras:

Figura 1 - Representação das ligações α-1-4 e α-1-6 entre as unidades de D-glicose___________ 2

Figura 2 - Representação estrutural da amilose e amilopectina____________________________ 3

Figura 3 - Diagrama da topologia da α-amilase com as quatro regiões conservadas ___________ 7

Figura 4 - Imagem cristalográfica da α-amilase de Bacillus subtilis________________________ 9

Figura 5 - Mecanismo catalítico proposto para α-amilase________________________________ 11

Figura 6 - Representação esquemática das faixas de temperatura ótima relacionadas aos

diferentes microorganismos_______________________________________________ 17

Figura 7 - Curva de crescimento bacteriano __________________________________________ 54

Figura 8 - Estabilidade da atividade amilásica em meio de expressão ______________________ 56

Figura 9 - Atividade amilolítica de amilase de Bacillus subtilis em função da temperatura de

incubação ____________________________________________________________ 58

Figura 10 - Atividade amilolítica de Bacillus subtilis em função do pH ____________________ 60

Figura 11 - Efeito do Ca2+ e do amido na atividade da amilase de Bacillus subtilis____________ 62

Figura 12 - Efeito da precipitação por sulfato de amônio na atividade amilásica de Bacillus

subtilis_______________________________________________________________ 64

Figura 13 - Efeito da adição de NaCl e KCl na atividade amilolítica da enzima de Bacillus

subtilis ______________________________________________________________

Figura 14 - Resistência da atividade amilolítica em função do tempo e temperatura ___________ 68

Figura 15 - SDS-PAGE 10% do sobrenadante de Bacillus subtilis concentrado por Amicon e por

precipitação com Sulfato de Amônio _______________________________________ 70

Figura 16 - Efeito de pressão hidrostática na atividade amilásica __________________________ 72

Figura 17 - Mapa do vetor pPIC9 adaptado do Manual de expressão em Pichia pastoris________ 74

Figura 18 - Eletroforese em gel de agarose da miniprep do vetor Ppic9 contendo o inserto de

interesse (Pyrfu amylase)________________________________________________

Figura 19 - Eletroforese em gel de agarose da digestão do pPic9 contendo o inserto de interesse_ 75

Figura 20 - Curva temporal da atividade amilásica para comparação entre os clones 1, 2 e 7 e os

controles negativos_____________________________________________________ 77

Figura 21 - Curva temporal da atividade amilásica em diferentes pHs (clone 01)______________ 79

Figura 22 - Curva temporal da atividade amilásica em diferentes pHs (clone 02)______________ 80

Figura 23 - Curva temporal da atividade amilásica em diferentes pHs (clone 07)______________ 81

Figura 24 - Curva temporal da atividade amilásica com diferentes concentrações de substrato

(amido) (clone 01)______________________________________________________

Figura 25 - Curva temporal da atividade amilásica com diferentes concentrações de substrato

(amido) (clone 02)______________________________________________________ 84

Figura 26 - Curva temporal da atividade amilásica com diferentes concentrações de substrato

(amido) (clone 07)______________________________________________________

Figura 27 - Curva temporal da atividade amilásica para pequenos volumes de sobrenadante do

clone 1______________________________________________________________ 87

Figura 28- Curva temporal da atividade amilásica para pequenos volumes de sobrenadante do

clone 2______________________________________________________________ 88

Figura 29- Curva temporal da atividade amilásica para pequenos volumes de sobrenadante do

clone 7______________________________________________________________ 89

Figura 30 - SDS-PAGE 10% dos 3 clones utilizados na expressão da α-amilase de Pyrococcus

furiosus______________________________________________________________ 91

xxi

Índice de Tabelas:

Tabela 1_______________________________________________________________________ 95

1-Introdução:

1.1-Amido e polissacarídeos em geral

Os açúcares são considerados uma excelente fonte energética para os

seres vivos, e através da via glicolítica estes açúcares, em especial a

glicose, são degradados fornecendo a energia necessária para sobrevivência

da maioria dos organismos. A glicose é encontrada na constituição de

polímeros como celulose e amido que são produzidos predominantemente

em plantas superiores assim como o glicogênio que é aceito como a

principal reserva de açúcares em animais (Nielsen & Borchert, 2000).

Dentre os diversos polissacarídeos encontrados na natureza, um dos

mais abundantes é, indubitavelmente, o amido sendo considerado uma

fonte de energia facilmente acessível. O amido é sintetizado como

resultado da fotossíntese em um processo onde energia solar é convertida

em energia química. Este polímero é sintetizado em plastídios presentes

nas folhas, também podendo ser sintetizado em tubérculos, sementes e

raízes, e costuma ser depositado em grânulos presentes no citoplasma

celular de plantas. Sua composição é exclusivamente formada por unidades

de D-glicose ligadas entre si através do carbono 1 da hexose por ligações

glicosídicas (Fig. 1). Estas ligações são estáveis em pH básico, mas podem

sofrer hidrólise espontânea em pH ácido (Van der Maarel et al., 2002 ).

Figura 1: Representação das ligações α-1-4 e α-1-6 entre as unidades de D-glicose

(http://bifi.unizar.es/jsancho/estructuramacromoleculas/16polisacaridos/16polisac.htm).

Sabe-se que o amido é formado por dois componentes de alto peso

molecular, amilose e amilopectina. A amilose compõe de 15% a 25% da

estrutura do amido consistindo de um polímero linear formado por resíduos

de glicopiranose ligados entre si por ligações do tipo α-1,4. Por outro lado,

a amilopectina compõe 75% a 85% da estrutura deste polissacarídeo

consistindo de um polímero ramificado apresentando além de ligações

glicosídicas α-1,4, pontos de ramificação ocorrentes a cada 17 – 26

unidades de glicose com ligação do tipo α-1,6 (Fig. 2)(Jorgensen et al.,

1997).

Figura 2: Representação estrutural da amilose e amilopectina

(http://bifi.unizar.es/jsancho/estructuramacromoleculas/16polisacaridos/16polisac.htm).

1.2-Características das a-amilases:

As enzimas ocorrem em todos os organismos vivos e catalisam

reações bioquímicas necessárias para manutenção e controle metabólico.

Devido à complexa estrutura do amido, as células requerem uma

combinação apropriada de enzimas para sua despolimerização e obtenção

de açúcares menores como glicose e maltose. Estas enzimas podem ser

classificadas em quatro grupos (Van der Maarel et al., 2002 ):

I. Exo-enzimas, atuando na terminação não redutora da cadeia, gerando

produtos de baixo peso molecular como glicose, maltose e β-dextrina-

limite (e.g. β-amilase, glicoamilase e α-glicosidade - Bertoldo &

Antranikian, 2002).

II. Endo-enzimas, atuando no interior da cadeia e produzindo sacarídeos

lineares e ramificados de vários tamanhos (e.g. amilases - Bertoldo &

Antranikian, 2002).

III. Enzimas desramificadoras, que hidrolisam exclusivamente ligações

glicosídicas α-1,6 ( e.g. isoamilase e pullulanase tipo 1 - Israilides et al.,

1999).

IV. Transferases, que clivam a ligação glicosidica α-1,4 da molécula

doadora e transferem do doador para um aceptor glicosídico, com a

formação de uma nova ligação glicosídica. Enzimas como amilomaltase

e ciclodextrina glicosiltransferase formam uma nova ligação do tipo α-

1,4 enquanto que enzimas ramificadoras formam novas ligações do tipo

α-1,6 (Van der Maarel et al., 2002).

As α-amilases (EC: 3.2.1.1, α-glucan-4-glucanohidrolase) são

produzidas por animais, plantas e microorganismos, e são consideradas

endo-enzimas capazes de hidrolisar amido, glicogênio e outros

polissacarídeos, promovendo a clivagem da ligação glicosídica interna do

tipo α-1,4 e originando oligossacarídeos de diferentes tamanhos, porém

não são capazes de clivar ligações do tipo α-1,6 como aquelas presentes nas

ramificações das amilopectinas.

A maioria das enzimas amilolíticas são pertencentes a três diferentes

famílias de glicosidases, de acordo com a Carbohydrate Active Enzyme

(CAZy) database (Coutinho, 1999), baseado na homologia da seqüência de

aminoácidos de cada enzima:

I. Família 13, compreendendo α-amilases assim como outras

enzimas que tem atividade amilolitica.

II. Família 14, que compreende as b-amilases.

III. Família 15, que compreende as glicoamilases.

Apesar desses três grupos apresentarem amilases com funções

relacionadas, isto é, todas são capazes de clivar ligações glicosídicas

presentes no amido, estruturalmente elas apresentam características

próprias, não possuindo similaridade na seqüência de aminoácidos

(Janecek, & Sevcík, 1999). No entanto, duas α-amilases identificadas em

Dictyolglomus thermophilum e Pyrococcus furiosus não podem ser

classificadas na família 13, e foram incluídas na família 57 posteriormente

estabelecida (Jorgensen et al.,1997).

A família 13, ou família das α-amilases, compreende enzimas com as

seguintes características: Enzimas que sejam capazes de hidrolisar ligações

glicosídicas produzindo monossacarídeos ou oligossacarídeos α-

anoméricos, ou que formem ligações glicosídicas α-1,4 ou α-1,6

(transglicosilação), ou que possuem ambas as atividades. Além disso, estas

enzimas devem possuir uma estrutura (b/a)

(ou TIM barrel) contendo os

resíduos do sítio catalítico (Fig. 3), e apresentar em sua seqüência primária

as quatro regiões conservadas que contêm os aminoácidos que formam o

sítio catalítico (Kuriki & Imanaka, 1999).

Figura 3: Diagrama da topologia da α-amilase com as quatro regiões conservadas, em

amarelo nos temos as fitas β e em vermelho as α hélices (Nielsen & Borchert, 2000).

Estudos de difração de raio-X realizados com α-amilases de

mamífero e bacteriana mostraram que estas consistem de três domínios,

denominados A, B, e C (Fig. 4). O domínio A forma a região central da

molécula e contem os três resíduos referentes ao sítio ativo: Asp231,

Glu261, Asp328. O domínio B forma uma grande parte do sítio de ligação

para o substrato e acredita-se ter grande importância para as diferenças

observadas quanto a especificidade para substrato entre as α-amilases

(Nielsen & Borchert, 2000). O domínio C constitui a região C terminal da

enzima e sua função ainda não é conhecida. Porém, um estudo em que foi

feita a análise de mutações do domínio C da α-amilase de Bacillus

stearothermophilus sugeriu que esta região está envolvida na atividade

enzimática (Holm et al., 1990).

Figura 4: Imagem cristalográfica da α-amilase de Bacillus subtilis. O domínio A é

mostrado em verde, o domínio B em magenta, e o domínio C em azul. As esferas em

vermelho representam os íons cálcio. A estrutura em amarelo representa uma

maltopentose ligada ao sítio ativo da α-amilase (Nielsen & Borchert, 2000).

O mecanismo catalítico aceito para as α-amilases envolve dois

resíduos catalíticos do sítio ativo: um ácido glutâmico e um aspartato como

nucleófilo. De acordo com este mecanismo (Fig. 5), após o substrato se

ligar ao sítio ativo da amilase, o ácido glutâmico em sua forma ácida doa

um próton para o oxigênio da ligação glicosídica e em seguida o aspartato

realiza o ataque nucleofílico do C1 da glicose. Um íon oxocarbânion é

formado em um estado de transição, seguido pela formação de um

intermediário covalente. A molécula de glicose protonada deixa o sítio

ativo enquanto uma molécula de água ou uma nova molécula de glicose se

desloca para o sítio ativo e ataca a ligação covalente entre a glicose e o

aspartato. Novamente um íon oxocarbânion é formado em um estado de

transição. O glutamato por sua vez aceita um hidrogênio da água ou de uma

nova molécula de glicose que entrou no sítio ativo. O oxigênio da água, ou

a molécula da glicose presente no sítio ativo, substitui a ligação do

oxocarbânion entre a molécula de glicose e o aspartato, originando um

novo grupo hidroxila na posição C1 da glicose ou uma nova ligação

glicosidica (transglicosilação) (Van der Maarel, et al., 2002). Apenas dois

dos três resíduos catalíticos conservados desempenham diretamente uma

função. O terceiro resíduo conservado, um segundo aspartato, se liga aos

grupos OH-2 e OH-3 do substrato através de pontes de hidrogênio e

desempenha um papel importante na modificação conformacional do

substrato (Uitdehaag et al., 1999).

Figura 5: Mecanismo catalítico proposto para α-amilase (Van der Maarel et al., 2002).

Para que esta enzima apresente boa estabilidade e atividade é

essencial a presença de pelo menos um íon Ca

por molécula, portanto, as

α-amilases são consideradas metaloenzimas. Além disso, o cálcio é

essencial para o correto enovelamento enzimático (Buisson et al, 1987). A

afinidade pelo cálcio é muito mais alta do que por outros íons, e a

quantidade de íons Ca

que se ligam à enzima pode variar de um a dez

(Janecek & Baláz, 1992). No entanto, um estudo realizado por Malhotra et

al. em 2000 mostrou que a bactéria Bacillus thermooleovorrans apresenta

produção da enzima e atividade α-amilásica independente da presença de

. O uso desta enzima na hidrólise de amido elimina a necessidade de

cálcio em processos como a liquefação de amido. Além do cálcio, o zinco

já foi descrito como um indutor da formação de enovelamentos distintos de

α- amilase de Bacillus subtilis (Janecek & Baláz, 1992).

1.3-Procedimentos industriais:

A hidrólise enzimática e modificações de polissacarídeos tem sido de

grande interesse no campo da biotecnologia. Enzimas termoestáveis

capazes de hidrolisar amido, como amilases, pululanases, e glicoamilases,

desempenham um importante papel na indústria alimentícia, química e

farmacêutica.

O processamento do amido em escala industrial emergiu em meados

dos anos 90, e no início o amido era hidrolisado a glicose utilizando o

tratamento com ácidos. Já em 1811, o cientista Kirchoff descobriu um

sabor adocicado obtido de uma suspensão de amido e água tratados com

ácidos diluídos. Porém, foi apenas em 1921 que Newkirk descreveu um

procedimento industrial para a produção de glicose a partir de amido.

Nesse processo o amido era misturado com água, fervido para dissolução

dos grânulos de amido e liberação de amilopectina e amilose na água, e em

seguida era tratado com ácido por certo tempo, dependendo do nível de

hidrólise que fosse desejável.

O método de hidrolise ácida para produção de glicose tem sido mais

recentemente substituído pelo tratamento enzimático, onde são empregadas

enzimas como α-amilases termoestáveis, pululanases, e amiloglicosidases,

entre outras. Após hidrólise completa do amido é possível obter glicose,

que pode ser convertida a frutose através da enzima glicose isomerase. Esta

conversão em muitos casos é necessária, considerando que a frutose é

aproximadamente duas vezes mais doce que a glicose (Van der Maarel et

al., 2002).

As enzimas capazes de hidrolisar amido, principalmente as α-

amilases, são utilizadas em diversos procedimentos industriais, como a

produção de amido modificado para a indústria de papéis, a liquefação de

amido, a remoção de amido em manufaturados de indústrias têxteis, e

também como aditivos para detergentes (Nielsen & Borchert, 2000).

É possível obter α-amilases estáveis através de isolamento de

microorganismos extremófílos, através da produção manipulada

geneticamente, ou através da estabilização de α-amilases instáveis por

modificações que podem ser realizadas através de imobilização,

modificações químicas, ou engenharia protéica (Janecek & Baláz, 1992).

Significantes avanços tem sido alcançados com o objetivo de

promover a otimização de α-amilases, principalmente em termos de

termoestabilidade, visando o melhor aproveitamento em procedimentos

industriais.

1.3.1-Utilização de α-amilase em poços de petróleo:

Poços horizontais e multilaterais são utilizados na indústria

petrolífera, em detrimento aos poços verticais, por mostrarem melhor

desempenho na drenagem e na produção de petróleo e gás do reservatório.

Mesmo sendo muito mais caros que os verticais, os poços horizontais têm a

capacidade de produzir de três a oito vezes mais que um poço vertical de

mesma profundidade. Contudo, a perfuração horizontal representa uma

operação mais complexa que a vertical, acarretando problemas

operacionais como o dano à formação, que diminui a produção do poço.

A maior parte dos danos à formação ocorre nas proximidades do

poço e resulta, na maioria dos casos, no entupimento dos poros com

detritos. Durante a perfuração, o contato do fluido de perfuração com a

zona produtora pode alterar as características permo-porosas do

reservatório, reduzindo a sua produtividade. A invasão dos fluidos de

perfuração, mesmo aqueles à base de água, compostos principalmente de

polímeros naturais (amido e goma xantana, por exemplo), na parede do

poço leva à formação de um reboco interno e externo (filter-cake),

necessário para manutenção da estrutura da formação, mas que precisa ser

removido no momento no qual o poço inicia a produção do petróleo.

Tradicionalmente são utilizados ácidos ou oxidantes fortes para

remoção do reboco. As espécies ácidas tipicamente utilizadas são o ácido

clorídrico ou o ácido acético. Apesar dos ácidos e dos oxidantes

apresentarem um bom desempenho no testes de laboratório, experiências

no campo indicaram que a aplicação dessas soluções não levou a uma

remoção efetiva do reboco (Hodge et al., 1996). Além disso, os ácidos e os

oxidantes não possuem especificidade em relação ao substrato que atacam.

Eles reagem com qualquer substância que seja passível de degradação,

incluindo as tubulações, os hidrocarbonetos e muitos dos componentes da

formação (Luyster e Ali, 2000; Suhy e Harris Jr., 1998). Uma alternativa à

utilização de ácidos e de oxidantes é a aplicação de soluções enzimáticas

que hidrolisem os polímeros presentes no reboco. A vantagem da utilização

das enzimas é que elas atuam sobre substratos específicos, no caso os

polímeros do reboco, não degradam a formação, nem reagem com os

equipamentos ou com o produto (Beall et al., 1996).

1.4-Microorganismos produtores de amilases:

O crescimento e atividade microbiana são profundamente afetados

pelas condições ambientais, e a compreensão destas influências ambientais

contribui para o desenvolvimento de métodos para controle e otimização da

atividade microbiana. Dentre os diversos fatores ambientais que podem ser

considerados, quatro são de grande relevância: temperatura, pH, e

disponibilidade de água e oxigênio. (Madigan et al., 2000)

1.4.1-Temperatura

A temperatura é um dos fatores que mais afetam a sobrevivência dos

microorganismos. À medida que a temperatura aumenta, as reações

químicas e enzimáticas passam a ocorrer em maior velocidade. Porém

quando a temperatura aumenta muito, essas enzimas podem sofrer danos

irreversíveis, pois o aquecimento provoca o aumento da atividade

metabólica até um ponto em que, porém, as reações de inativação começam

a atuar.

Os microorganismos, no que se refere às temperaturas ótimas de

crescimento, exibem diferentes faixas, que podem ser classificadas em

quatro grupos (Fig. 6): i) Psicrófilos, os organismos que apresentam

temperatura ótima de crescimento geralmente inferior a 15 °C; ii)

Mesófilos, com ótimos de crescimento em temperaturas medianas, que

variam de 15 a 45 °C; iii) Termófilos, cuja temperatura ótima para

crescimento situa-se na faixa de 45 a 80 °C, sendo estes microorganismos

encontrados principalmente em fontes termais e outros ambientes quentes;

e iv) Hipertermófilos, cujo ótimo para crescimento é superior a 80 °C

sendo encontrados na natureza apenas em áreas bastante restritas, como

fumarolas submersas. (Madigan et al., 2000)

Figura 6: Representação esquemática das faixas de temperatura ótima relacionadas aos

diferentes microorganismos. (Madigan et al., 2000)

1.4.2-pH

A maioria dos microorganismos tem uma faixa de pH favorável ao

seu crescimento que varia entre 2 a 3 unidades. Os ambientes naturais

costumam apresentar valores de pH variando entre 5 e 9, sendo os

organismos cuja faixa de pH corresponde a esses valores os mais comuns.

Organismos que crescem em pHs inferiores a 5 são denominados

acidófilos. Algumas bactérias são consideradas acidófilas obrigatórias,

como Thiobacillus sp., Sulfolobus sp. e Thermoplasma sp.. Por outro lado,

alguns microorganismos apresentam valores elevados relacionados ao pH

ótimo, podendo atingir o valor de 10, como, por exemplo, algumas cepas

de Bacillus, recebendo a denominação de alcalifílicos, sendo geralmente

encontrados em habitats muito básicos, como lagos ricos em carbonato e

bicarbonato de sódio, e em solos contendo carbonato. (Madigan et al.,

2000)

1.4.3-Disponibilidade de água:

A água é um importante fator que pode afetar diretamente o

crescimento dos microorganismos, sendo de fundamental importância para

as atividades metabólicas de cada organismo. A disponibilidade de água

não está somente relacionada ao conteúdo aquoso, mas também é função da

concentração de solutos, tais como sais e açúcares, que estão dissolvidos na

água. Organismos marinhos, que apresentam excelente crescimento e

atividade em água do mar, comumente apresentam a necessidade de certas

quantidades de cloreto de sódio, recebendo a denominação de halófilos.

Alguns organismos são capazes de suportar certa quantidade de sal

no ambiente, porém apresentam crescimento ótimo na ausência desse,

sendo denominados de halotolerantes. Outra classe de microorganismos

são os halófilos extremos, cujo crescimento ocorre em ambientes com

altíssimas concentrações de sal, (algumas espécies requerem até 15 a 30%

de cloreto de sódio para um ótimo crescimento). Estes são relevantes

principalmente em indústrias alimentícias, onde sais e açúcares são

adicionados como conservantes (Madigan et al., 2000).

1.4.4-Disponibilidade de oxigênio

Os microorganismos podem se comportar de diversas maneiras com

relação à necessidade ou tolerância ao oxigênio. Organismos capazes de

crescer em grandes tensões de oxigênio são ditos aeróbios. Por outro lado,

os microaerófilos são aeróbios utilizando oxigênio apenas quando este está

presente em níveis inferiores ao do ar devido a sua capacidade limitada de

respirar. Já os aeróbios facultativos, em condições apropriadas, podem

crescer tanto na presença como na ausência de oxigênio (Madigan et al.,

2000). O oxigênio é pouco solúvel em água, e em ambientes aquáticos e

alguns habitats úmidos (principalmente os que apresentam abundância de

matéria orgânica), o oxigênio pode ser rapidamente esgotado. Os

anaeróbios são aqueles que não utilizam oxigênio, havendo dois diferentes

tipos: anaeróbios aerotolerantes, que toleram e crescem na presença de

, e anaeróbios estritos, que são inibidos ou mortos pela presença de O

(Madigan et al., 2000).

Atualmente sabe-se que há uma grande variedade de

microorganismos, pertencentes aos reinos Archaea e Bacteria, que são

perfeitamente capazes de degradar e utilizar amido como fonte de carbono,

através da secreção de enzimas capazes de degradar este biopolímero.

Neste trabalho foram utilizadas duas abordagens: o isolamento direto da α-

amilase do sobrenadante de cultivo de uma cepa de Bacillus subtilis, e a

expressão heteróloga, em Pichia pastoris, de uma α-amilase de Pyrococcus

furiosus.

1.4.5-Bacillus subtilis

As bactérias do gênero Bacillus são conhecidas por serem capazes de

produzir uma grande quantidade de enzimas extracelulares, sendo algumas

de grande importância industrial. Algumas cepas foram desenvolvidas

especificamente para a produção em massa de algumas amilases para fins

industriais (Cornelis, 1982).

Bacillus subtilis é uma bactéria gram-positiva, de vida livre,

comumente encontrada no solo, sendo capaz de formar um endosporo, o

que permite ao organismo sobreviver a condições extremas do meio

ambiente (Nakano & Zuber, 1998). Alguns livros de microbiologia a

classificam como aeróbica, mas Priest (1993) mostrou em seu trabalho que

ela é capaz de crescer em condições de baixa aeração. A α-amilase

produzida por esta bactéria é secretada para o meio de cultura, o que

permite separá-la da massa de células através de centrifugação, e foi

utilizada por nosso grupo diretamente.

1.4.6-Pyrococcus furiosus

Muitas regiões no mundo são consideradas extremas, como os

ambientes geotermais, as regiões polares, e as profundezas do oceano.

Nesses locais é praticamente impossível a sobrevivência de organismos

superiores, devido a sua complexidade e compartimentalização, logo, estes

ambientes se tornaram preferencialmente habitados por microorganismos

(Bertoldo & Antranikian, 2002). Pyrococcus furiosus é um exemplo de

microorganismo que sobrevive em condições extremas. Esta bactéria

marinha é anaeróbica, apresentando temperatura ótima para crescimento

em torno de 100 °C, e foi isolada, primeiramente, por Fiala & Stetter em

1986 de lama sulfurosa da costa da ilha Vulcano, Itália (apud Laderman et

al., 1993). Há mais de uma α-amilase secretada por esta bactéria, sendo que

uma delas foi purificada e caracterizada como um homodímero com massa

molecular de 130 kDa com caráter alcalófílo (Laderman et al., 1993).

Pyrococcus furiosus é um microorganismo hipertermófilo e,

portanto, potencialmente vantajoso quando se pode obter sua enzimas para

emprego em processos industriais e biotecnológicos. As enzimas

produzidas por estes organismos, como a α-amilase, são capazes de

catalisar reações bioquímicas em elevadas temperaturas, apresentando-se

normalmente mais estáveis que enzimas de mesófilos e, conseqüentemente,

prolongando a durabilidade de preparações enzimáticas (Madigan et al.,

2000). Os genes que codificam α-amilases extracelulares de P. furiosus

foram anteriormente clonados, e a enzima recombinante expressa em

Bacillus subtilis e em Escherichia coli (Jorgensen et al., 1997), visando

essencialmente sua otimização e aplicabilidade em procedimentos

industriais. Escolhemos uma destas seqüências, que corresponde a uma α-

amilase extracelular acidofílica, para realizar este trabalho.

1.5-Expressão heteróloga de α-amilases em Pichia pastoris

Alguns trabalhos já mostraram que a quantidade de enzimas

produzidas pela maioria dos microorganismos hipertermófilos parece ser

insuficiente para aplicações biotecnológicas. A clonagem do gene

correspondente às enzimas, e sua expressão em um vetor heterólogo

poderia possibilitar a resolução deste problema. Sistematicamente, o

número de genes que codificam enzimas amilolíticas presentes em

organismos termófilos que foram clonados e expressos em leveduras tem

aumentado significantemente nos últimos anos (Bertoldo & Antranikian,

2002).

A levedura P. pastoris tem sido usada com sucesso na expressão

heteróloga de proteínas das mais variadas fontes, sendo uma importante

ferramenta biotecnológica nos dias de hoje. P. pastoris tem a capacidade de

crescer em condições de oferta mínima de nutrientes, utilizando metanol

como única fonte de carbono. Isso permite seu cultivo em meios simples (o

que facilita o processo de purificação da proteína heteróloga) e em

fermentadores para obtenção de grandes quantidades de biomassa e,

consequentemente, proteína (Daly & Hearn, 2005).

Várias são as vantagens do uso de organismos eucariotos no lugar de

procariotos para a expressão de proteínas heterólogas e, devido a isso, o

emprego da levedura P. pastoris vem crescendo consideravelmente,

principalmente nas últimas três décadas. A maquinaria pós-transducional

da levedura permite o correto enovelamento de proteínas estabilizadas por

pontes dissulfeto (no retículo endoplasmático) além de permitir outros

processamentos como a isomerização da prolina, sulfatação, lipidação,

fosforilação ou glicosilação, freqüentes em aproximadamente 0,5 – 1% de

todas as proteínas expressas por células eucarióticas (Lueking et al., 2000).

Além disso, o isolamento de proteínas heterólogas em P. pastoris é

facilitado pelo fato desta levedura não secretar uma grande quantidade de

suas próprias proteínas, facilitando o processo de purificação (Jahic et al.,

2006).

O alto custo e a dificuldade de manipulação de células de insetos e

mamíferos acaba representando uma outra vantagem do uso de leveduras

como sistema de expressão de proteínas: Leveduras são capazes de crescer

em meios de culturas de baixo custo relativo e ainda podem ser

abundantemente cultivadas em fermentadores, como anteriormente exposto

(Daly & Hearn, 2005). Além disso, a estabilidade dos transformantes

permite a expressão de proteínas mesmo em situações livres de pressão

seletiva. Neste caso, menos de 1% do gene recombinante é perdido a cada

geração mesmo na ausência de pressão seletiva (Romanos, 1995). Esta

vantagem sobre a expressão em bactérias se deve ao fato do plasmídio

utilizado para a transformação da levedura se integrar ao genoma da célula

e não apenas permanecer no citoplasma, como no caso de procariotos

(Sreekrishna et al., 1997). Vários trabalhos já demonstraram a expressão de

proteínas heterólogas, inclusive proteínas complexas como glicoproteínas

humanas e colágeno humano, que foram processadas e secretadas por P.

pastoris com sucesso (Hamilton et al., 2003) (Pakkanen et al., 2003).

Os primeiros plasmídeos construídos para a transformação de P.

pastoris se baseavam na seleção das células transformadas através do

auxotrofismo para histidina, um aminoácido essencial para a manutenção

da maquinaria celular. Nessas cepas inicialmente utilizadas, um dos genes

responsáveis pela transcrição da proteína histidina desidrogenase (HIS4),

envolvida na síntese de histidina, está deficiente (cepas GS115, KM71 e

SMD1168). Estas cepas são complementadas pelo gene HIS4 presente nos

plasmídeos comerciais (pHIL, pPIC9, pPIC9K, por exemplo) (Daly e

Hearn, 2005). A expressão por esses vetores se baseia no fato da levedura

metilotrófica conseguir crescer utilizando o metanol como sua única fonte

de carbono. A álcool oxidase é uma enzima chave na metabolização do

metanol. O gene que codifica esta enzima (AOX1) é fortemente induzido na

presença de metanol (Jahic et al., 2006). Deste modo, o gene recombinante

de interesse é clonado sob a regulação do promotor do AOX. (Daly &

Hearn, 2005). O tamanho dos primeiros vetores baseados nessa estratégia

de expressão foi fator limitante para o sucesso de algumas transformações

(Sears et al.,1998). Ainda, uma seqüência sinal originária da levedura

Saccharomyces cerevisiae, e responsável pela formação do pilus sexual

entre as leveduras do tipo A e α, permite a expressão de uma proteína de

fusão com a seqüência α de acasalamento (

-mating factor) e a proteína de

interesse. Tal peptídeo sinal é responsável pelo direcionamento do produto

expresso para a membrana celular e posterior secreção no meio de cultura.

A liberação da proteína recombinante livre da seqüência α de acasalamento

é obtida através de proteases específicas de P. pastoris (KEX2 e STE13)

presentes na membrana, cujos sítios de clivagem encontram-se entre o

peptídeo sinal e a proteína de interesse (Daly e Hearn, 2005).

Mais recentemente, alguns novos plasmídeos, de menores tamanhos,

foram obtidos e comercializados com o objetivo de facilitar o processo de

clonagem e expressão de proteínas em P. pastoris. Tais plasmídeos abrem

mão do gene complementar para a síntese de histidina e passam a conferir

seletividade baseada no uso do antibiótico zeocina. Deste modo, novas

cepas, agora deficientes na síntese de algumas proteases e não mais do

aminoácido histidina foram obtidas (SMD1168H, KM71H e a já

caracterizada X-33) com o objetivo de expressar proteínas com base em

promotores diversos, a saber DHAS – diidroxiacetona-sintetase e FLD1 –

formaldeído-desidrogenase (Chen et al., 2001, Daly e Hearn, 2005).

O promotor para a gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase (PGAP)

permite a expressão constitutiva das proteínas recombinantes, uma vez que

o seu gene é constitutivamente expresso na levedura. Assim, uma família

de vetores baseados nesse promotor (vetores pGAP), com o gene que

confere resistência à zeocina (vetores pGAPZ), podem ser obtidos

comercialmente. Além disso, a secreção do produto recombinante em

grandes quantidades no meio de cultura pode ainda ser alcançada através da

seqüência sinal de S. cerevisiae (vetores pGAPZα).

2-Objetivos:

Este trabalho tem os seguintes objetivos:

Ø Isolamento e caracterização enzimática da α-amilase de Bacillus

subtilis.

Ø Expressão heteróloga em Pichia pastoris e caracterização enzimática

da α-amilase de Pyroccocus furiosus.

3-Material e métodos:

Reagentes: todos os reagentes utilizados eram de grau analítico ou

superior. Os sais e o metanol utilizados eram das marcas Isofar, Vetec, ou

Reagen. A peptona (de carne) e o extrato de levedura eram da Oxoid.

Acrilamida, bis-acrilamida eram da Sigma. Tampões eram Sigma, USB, ou

Reagen. O ácido dinitrosalicílico (DNS) era VETEC. A ágarose (grau

biologia molecular) era Gibco. Os resultados obtidos foram sempre

similares independente da marca utilizada.

3.1-Cultura de células e armazenamento do sobrenadante da cultura

de Bacillus subtilis:

Primeiramente foi escolhida uma cepa de Bacillus subtilis (não

patogênica) que é produtora de amilase, a qual é secretada para o meio de

cultura. Para o crescimento destas culturas foram utilizados erlenmeyers de

vidro de 500 mL, devidamente fechados com rolhas de algodão hidrófobo e

gaze, posteriormente cobertas com papel alumínio. Após esta fase os

erlenmeyers foram autoclavados por 30 minutos e guardados em um

armário de materiais estéreis. Foi utilizado como meio primário de cultura

o meio Luria Bertani (LB) modificado, composto por: 1 L de água milli Q,

10 g de peptona, 5 g de extrato de levedura, 5 g de NaCl, o pH foi corrigido

para 7,0 com NaOH 5 M, utilizando um pHmetro Analyser (modelo pH

300M). Após a preparação do meio, o mesmo foi aliquotado em garrafas

(1l), autoclavado por 30 minutos e depois devidamente armazenado.

Depois de todo o material estar pronto e devidamente esterilizado o

inóculo foi feito da seguinte maneira: Os esporos foram resuspendidos em

4 ml de meio LB. 4 erlenmeyers de 500 mL, que foram previamente

preenchidos com 250 ml de meio LB, receberam 1 mL desta suspensão por

cada um. Tomando-se o cuidado de trabalhar próximo à chama de um bico

de Bunsen.

A partir deste momento os inóculos foram levados para um agitador

orbital termostatizado (Nova Ética modelo 430 RDE) à temperatura de 30

C, sob agitação de 125 rpm.

3.2-Determinação do crescimento das culturas de Bacillus subtilis:

A leitura de D.O. foi usada como parâmetro indicador do

crescimento das culturas. Nos primeiros repiques foram feitas curvas de

crescimento para verificar em que momento havia uma maior produção de

enzima. Para a realização da curva de crescimento alíquotas de 1 ml foram

retiradas nos tempos de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 12, 16, 24 e 48 horas e diluídas 1

vez em água Milli-Q. As leituras foram realizadas em espectrofotômetro

Spectro Vision modelo SB-1819S, no comprimento de onda de 470 nm.

A cada 48 horas eram feitos repiques para que as culturas fossem

mantidas. Os repiques eram realizados com a transferência de 250 µl da

cultura anterior para um novo erlenmeyer de 500 mL com 250 ml de meio

LB.

Após o repique, as culturas anteriores eram colocadas em garrafas de

centrifuga de 250 ml (Nalgene) e centrifugadas em uma centrífuga

refrigerada HITACHI, em rotor RPR-12-2, por 30 minutos a 6000 rpm, à

temperatura de 4

C. Ao final da centrifugação, o pellet (contendo células

íntegras e debris) era descartado, e os sobrenadantes devidamente

etiquetados e guardados a 4

C ou em freezer vertical a -18

3.3-Determinação da atividade enzimática:

A metodologia que foi adaptada para a determinação da atividade

enzimática dos fluidos enzimáticos foi o método do ácido dinitrosalicílico –

DNS (Miller, 1959). Este método dosa os açúcares redutores, produtos da

quebra enzimática do amido, tendo glicose como referência. Foi utilizada

uma modificação do ensaio para dosagem de açúcares redutores do 3,5 di-

nitro-salicilato, que permite o emprego de volumes menores de amostra.

Este método possui sensibilidade para dosar hexoses e oligosacarídeos com

extremidades redutoras, em uma faixa de detecção de 5 a 150 mg totais.

Para a realização deste ensaio enzimático foram feitos dois brancos

distintos: um deles era a retirada da amostra no tempo zero e o outro foi

feito em meio de reação sem enzima. Cada um dos tempos experimentais

foi feito em duplicata. Para Bacillus subtilis, os experimentos foram feitos

com inóculos distintos, com n de 3 ou mais. Para Pyrococcus furiosus, os

experimentos foram feitos com uma só expressão e clones distintos.

O meio de reação, inicialmente para amostras não concentradas, era

composto por 800 µl de enzima (sobrenadante); 800 µl água do mar

autoclavada; 50 µL de tampão Acetato de Sódio, pH 5,0 2 M; 80 µL de

CaCl

(1 mM final)

e 400 µl de solução de amido 1% para dar início a

reação e em seguida os tubos eram colocados em banho-maria (55

C) . A

cada intervalo de tempo eram retirados 150 µl de amostra, que eram

colocados em um tubo de ensaio com 50 µl de HCl 1 N para parar a

reação, seguidos de 50 µl de NaOH 1 N para neutralização do pH. Em

seguida, os tubos eram colocados em banho de gelo.

Após a retirada do último ponto, 250 µl de reagente DNS foi

adicionado a cada um dos tubos, os quais foram então incubados em banho-

maria a 100 °C, por 5 minutos, para que o DNS reagisse com os açúcares

redutores formados pela hidrólise do amido nas amostras. O próximo passo

foi a adição de 2 ml de água Milli-Q em cada um dos tubos, para uma

adequada diluição para leitura a 540 nm no espectrofotômetro.

3.4-Teste de estabilidade enzimática dos sobrenadantes

Para verificar se haveria ação de possíveis proteases secretadas no

sobrenadante ou qualquer outro efeito que levasse a queda da atividade α-

amilásica, realizou-se um experimento utilizando dois sobrenadantes

distintos: Um recém repicado (15° repique) e outro (8° repique) que havia

sido mantido a 4

C por 16 dias.

Para a realização deste ensaio enzimático cada amostra tinha uma

seqüência de tubos com os tempos de 10, 20, 30, 40 e 60 minutos. Os

meios de reação e a avaliação do resultado foram feitos de acordo com a

metodologia descrita acima.

3.5-Determinação da atividade amilásica em função da temperatura:

Para a realização deste ensaio enzimático cada amostra tinha uma

seqüência de tubos com os tempos de 10, 20, 30, 40 e 60 minutos. Os

meios de reação foram preparados de acordo com a metodologia descrita

acima. Foram escolhidas as seguintes temperaturas 45

C, 55

C, 65

C e 75

C. Ao final da reação o resultado foi revelado pelo ensaio do DNS

(metodologia acima).

3.6-Determinação da atividade amilásica em função do pH:

Para a realização deste ensaio enzimático cada amostra tinha uma

seqüência de tubos com os tempos de 10, 20, 30, 40 e 60 minutos. Os

meios de reação foram preparados de acordo com a metodologia descrita

acima. Foi escolhida a temperatura de 55

C, pois de acordo com o

experimento anterior essa temperatura foi a melhor para esta amilase de B.

subtilis. A reação foi interrompida e adicionado o DNS a cada um dos

tubos, seguido por leitura em espectrofotômetro (metodologia acima).

Todos os tampões utilizados foram corrigidos para o efeito da temperatura

sobre as propriedades tamponantes do Tris, Mes-Tris, e Acetato de Sódio.

Para isso, empiricamente amostras sem enzima contendo tampão foram

aquecidas nas temperaturas utilizadas nos ensaios, e o pH do estoque de

tampão corrigido com diferentes volumes de HCl e NaOH.

3.7-Efeito de indução da produção e secreção da α-amilase por Ca

amido:

Para a realização deste experimento foram preparados quatro meios

de cultura diferentes, sendo eles LB, LB + Ca

, LB + Amido, e LB + Ca

+ Amido. As culturas cresceram pelo período de 48 horas nestes

respectivos meios. O sobrenadante foi separado das células através de

centrifugação (metodologia citada anteriormente) para ser usado neste

experimento.

Neste ensaio enzimático cada amostra tinha uma seqüência de tubos

com os tempos de 10, 20, 30, 40 e 60 minutos. Os meios de reação foram

preparados de acordo com a metodologia descrita acima. Foi escolhida a

temperatura de 55

3.8-Enriquecimento da atividade amilásica através de precipitação

com Sulfato de Amônio:

Para a realização deste experimento 150 ml de sobrenadante da

cultura foram precipitados com 350 ml de uma solução de Sulfato de

Amônio saturada (62,5%). Procedeu-se da seguinte maneira: o

sobrenadante (150 ml) foi colocado em um Becher de vidro de 500 ml, o

qual foi acondicionado em um recipiente com gelo sobre uma placa de

agitação. A solução saturada de Sulfato de Amônio foi lentamente

adicionada por gotejamento ao sobrenadante que estava sob leve e

constante agitação. Finda a adição, a mistura foi mantida a 4

C sob a

mesma agitação overnight. A mistura foi centrifugada a 18.000 rpm por

120 minutos em rotor RPR-12, a 4

C. O centrifugado foi então suspenso

em 10 ml de tampão Tris 10 mM (pH 7,5) com 1 mM de Ca

, onde optou-

se por manter a enzima a pH ligeiramente alcalino no estoque para

minimizar a possível ação de proteases ácidas. Quatro meios de reação

distintos foram preparados usando 50 µl de concentrado da precipitação,

600 µl de sobrenadante da precipitação, 600 µl de sobrenadante do meio

LB e 600 µl de sobrenadante do meio LB + Ca

. A diferença entre os

volumes enzimáticos foi compensada com a variação do volume de água do

mar autoclavada utilizada no meio reacional. Neste ensaio enzimático cada

amostra tinha uma seqüência de tubos de ensaio de vidro (10 ml) referentes

como brancos e os respectivos tempos de 10, 20, 30, 40 e 60 minutos. A

temperatura de reação foi de 55

3.9-Enriquecimento da atividade amilásica por concentração com

concentrador Amicon:

Para a realização deste experimento 150 ml de sobrenadante da

cultura foram concentrados com o concentrador Amicon.

Este processo de concentração utiliza uma membrana filtrante com

poros de 30 kDa (Millipore). Este sistema de concentração conta com um

receptáculo que é acoplado a um suporte de metal, onde o mesmo se

conecta a um cilindro de nitrogênio, que mantêm uma pressão positiva de 4

kgf/cm

. Depois de montado o concentrador é mantido a 4

C sob agitação

de uma placa magnética. O filtrado é coletado em outro recipiente, para

posteriormente ser descartado. O receptáculo do concentrador comporta

somente 50 ml de sobrenadante, ou seja, o receptáculo foi enchido 3 vezes.

Após ser concentrado 15 vezes (150:10 ml), o concentrado de

sobrenadante é guardado em um tubo falcon de 15 ml a 4

Neste experimento foi usado um volume de 50 µl de enzima. A

diferença entre os volumes enzimáticos foi compensada com a variação do

volume de água do mar autoclavada utilizada no meio reacional. Neste

ensaio enzimático cada amostra tinha uma seqüência de tubos com os

respectivos tempos: 10, 20, 30, 40 e 60 minutos. A temperatura de reação

foi de 55

3.10-Determinação da halotolerância na atividade enzimática:

A halotolerância foi determinada com a utilização de tampão

Formiato de Sódio contendo 20 g/l de KCl e diferentes concentrações de

NaCl (36,37 g/l, 72,75 g/l, 145,5 g/l e 291 g/l). Os meios reacionais

contendo cada um dos tampões foram preparados de acordo com a

metodologia descrita anteriormente. Neste ensaio enzimático cada amostra

tinha uma seqüência de tubos com os tempos de 10, 20, 30, 40 e 60

minutos. A temperatura de reação foi de 55

3.11-Determinação da atividade enzimática em função do tempo:

Neste ensaio foi usado apenas 50 µl de enzima concentrada com

sulfato de amônio (metodologia descrita acima), o pH foi 5,5, a

temperatura de reação foi 55

C e a salinidade 35 ppm (água do mar). Os

meios reacionais foram preparados de acordo com a metodologia descrita

anteriormente. Neste ensaio enzimático cada amostra tinha uma seqüência

de tubos de ensaio de vidro (10 ml) referentes aos brancos e aos tempos de

10, 20, 30, 40, 60, 90, 100, 110 e 150 minutos.

3.12-Determinação do peso molecular da amilase através de SDS-

PAGE:

Para esta determinação foi feito um gel de SDS-PAGE 10 % do gel

de corrida com 3% do gel de concentração (Laemmli, 1970). Para melhor

visualização da proteína, o sobrenadante foi concentrado com Amicon

(metodologia descrita anteriormente) e depois com sulfato de amônio

(metodologia descrita anteriormente). A cuba de eletroforese utilizada foi

um modelo Mini-PROTEAN Tetra Cell (BioRad) e a fonte foi uma Thermo

EC modelo EC250-90. Para cada gel foi utilizado 20 mA, corrente

constante e voltagem variável, por aproximadamente 1 hora.

3.13-Coloração de gel pelo método de Prata Rápida:

Para este método de coloração foram usadas as seguintes soluções da

seguinte maneira.

1. Primeiramente foi feita a fixação do gel com uma solução de Etanol

30% (Merck, Alemanha) e Ácido Acético 10% (Vetec, Brasil) por

30 minutos, em seguida o gel foi lavado 3 vezes por 5 minutos com

uma solução de Etanol 30% (Merck, Alemanha), depois o gel foi

lavado com água Milli-Q por 20 minutos com gel totalmente imerso

na água. Para o decréscimo de Background o gel lavado por 2

minutos com uma solução de Tiosulfato de Sódio 2,5 mM (Reagen,

Brasil), em seguida o gel foi lavado 2 vezes, por 5 minutos, com

água Milli-Q. O próximo passo foi expor o gel uma solução de

Nitrato de Prata 0,2% (Isofar, Brasil) com Formaldeido 0,03%

(Vetec, Brasil) por 30 minutos, em seguida o gel foi lavado com

água Milli-Q por 1 minuto. Depois a revelação foi feita com a

imersão do gel em uma solução de Carbonato de Sódio 3% (Isofar,

Brasil), Formaldeido 0,02% (Vetec, Brasil) e Tiosulfato de Sódio

0,02 mM (Reagen, Brasil). Após isso a reação foi parada com a

solução de Ácido Acético 100% (Vetec, Brasil) e para finalizar o

gel é lavado extensivamente com água Milli-Q.

Após a coloração o gel foi observado e fotografado em um trans-

iluminador.

3.14-Determinação da atividade amilásica sob pressão hidrostática:

Para a realização deste experimento a enzima foi incubada à

temperatura de 55

C em um meio contendo 1 mM de CNPG3 (nitrofenil-

maltotriosídeo), 20 mL de enzima concentrada, 1 mM CaCl

, em água do

mar tamponada com tampão Acetato de Sódio a pH 5,5, em um gerador de

pressão HIP (Erie, Pensilvânia, USA) acoplado a uma célula de pressão

termostatizada, com janelas ópticas, que permite a aquisição de dados em

tempo real (com a amostra continuamente submetida à pressão) em

temperatura controlada. A enzima foi exposta a uma variação de pressão de

até 200 MPa na temperatura de 55 °C. Posteriormente, foi realizado um

ensaio onde a mesma enzima foi submetida e mantida em um valor fixo de

alta pressão hidrostática (200 MPa) e mantida nesta condição para

avaliação da sua barotolerância.

3.15-Construção e expressão do gene da a-amilase extracelular de

Pyrococcus furiosus.

3.15.1-Otimização de códons do gene da amilase de Pyrococcus

furiosus:

Os códons do gene codificando a amilase de P. furiosus, foram

alterados, de modo a obter uma menor freqüência de códons raros para P.

pastoris, e também para aumentar o teor de GC, ambos fatores que podem

limitar a produção de proteínas recombinantes em P. pastoris (Cereghino et

al., 2002). Este redesenho foi feito manualmente, observando-se a distância

gênica entre os códons (distribuição ao longo da seqüência) e calculando o

teor de GC a cada alteração. O mRNA resultante foi submetido a análise da

formação de estruturas secundárias através do programa CLC

FreeWorkbench. O gene redesenhado com a otimização de códons foi

encaminhado para síntese automatizada e inserção no vetor pPIC9, a cargo

da firma Genscript © (www.genscript.com). O gene sintético otimizado foi

utilizado para uma nova expressão no sistema de Pichia pastoris. O

procedimento para obtenção de massa de plasmídio é descrito a seguir.

3.15.2-Sub-clonagem da amilase de Pyrococcus furiosus:

Uma amostra do vetor de expressão pPIC9 para uso em levedura

Pichia pastoris foi linearizada com as enzimas XhoI e EcoRI de forma a

expor o sítio de inserção para o gene da amilase de Pyrococcus furiosus. A

inserção se deu logo após o fator a de acasalamento de S. cerevisae e do

promotor AOX da enzima álcool oxidase. A construção do gene se deu

com o gene otimizado sem a inclusão da sequência Glu-Ala-Glu-Ala.

3.15.3-Transfecção do vetor pPIC9 para E. coli DH5-α (células

competentes):

Antes dos testes de expressão o vetor com a seqüência de interesse

foi transfectado utilizando-se a técnica de choque térmico de acordo com

Sambrook, et al., 1982, onde E.coli DH5-α foi usada para amplificação e

estocagem do vetor pPIC9.

Algumas culturas, onde se verificou o sucesso da transformação, a

partir de um tratamento com ampicilina, foram plaqueadas e usadas para a

extração de DNA plasmidial, usando-se o kit Wizard Plus SV da Promega.

Para aumentar a quantidade de plasmídeo (Sambrook, 1982), quatro clones

positivos foram utilizados para esta etapa. Logo após este procedimento,

um gel de agarose foi feito para verificar o tamanho do vetor amplificado.

A confirmação dos tamanhos da inserção e do vetor linearizado foi

realizada através da digestão do vetor com as enzimas de restrição SalI e

XhoI. A reação de digestão foi processada primeiramente por 3 horas a 37

C, com 5 µL da enzima XhoI para a linearização do vetor e depois a reação

foi interrompida, incubando-se em banho-maria a 65 °C por 15 minutos.

Logo após, 5 µL de SalI foram adicionados e a reação de digestão

conduzida por mais 3 h, a 37 °C, sendo interrompida da mesma maneira.

3.15.4-Transformação de Pichia pastoris com o vetor pPIC9:

Com a confirmação da etapa anterior, o próximo experimento foi a

realização de uma extração de DNA plasmidial em maior escala, para obter

o material para a eletroporação de P. pastoris. A extração foi realizada a

partir da propagação do clone 1 em meio líquido LB com ampicilina

enriquecido com peptona de carne (Isofar, Brasil). As células foram então

lisadas e o material foi submetido ao kit SV Wizard plus (PROMEGA),

seguindo rigorosamente o protocolo descrito pelo fabricante. Após este

procedimento, obtivemos aproximadamente 42 µg de DNA plasmidial em

150 µL de volume da midi-prep, quantidade suficiente para a etapa de

transfecção. Antes de realizarmos a transfecçcão, ainda submetemos o

material a uma nova digestão com SalI para linearizar o vetor e aplicamos

em um gel de agarose (1%) para extrair o vetor linearizado do gel, através

de um kit de extração de DNA em gel de agarose da PROMEGA.

Após a corrida do gel por 40 minutos, a banda foi visualizada no

transiluminador UV (coloração por brometo de etídio) e as bandas foram

recortadas do gel com o auxílio de um estilete. O material foi liquefeito e

submetido ao kit de extração.

A eletroporação foi então realizada conforme descrito adiante.

Incubamos duas colônias de leveduras (uma da linhagem GS115 e

outra da linhagem SMD1168) em 5 mL YPD (dextrose 2,0%, peptona

2,0% e extrato de bacto-levedura 1,0%) overnight a 28 °C .

As leveduras forma cultivadas até o meio atingir uma D.O.

600

1,34, quando as culturas foram imediatamente resfriadas e então

centrifugadas a 3.500 rpm por 15 minutos a 4

C para descarte do

sobrenadante. O precipitado celular foi lavado três vezes com água estéril

gelada, com centrifugações a cada lavagem, e ao final destas lavagens foi

ressuspenso em sorbitol 1 M gelado. Adicionou-se, às cubetas para

eletrotransferencia préviamente resfriadas, 320 µL de sorbitol gelado e 80

µL da suspensão de células. Após mistura, adicionou-se 5 µL de DNA

plasmidial linearizado (em torno de 5 µg/ml) e a suspensão resultante foi

mantida no gelo por 5 minutos. O aparelho de eletroporação foi então

ajustado para a voltagem de 2,43 Kv; capacitância de 25 µF e resistência de

400 Ω, e a amostra foi submetida ao pulso. Logo depois o material foi

mantido em gelo até a hora do plaqueamento. O plaqueamento foi feito

através da adição de 5, 10, 20 ou 100 µL das células transformadas a placas

de petri com meio YNB sólido. As placas foram incubadas a 30 °C por 3

dias.

Para confirmação dos clones transformados, foi feito um PCR de

colônia de 56 clones, onde utilizamos um primer comercial direcionada

para o gene AOX1 presente no do vetor pPIC9. A seleção se baseia em

produtos de PCR com tamanho diferente ao produto esperado do AOXI,

que tem que aparecer em todo caso.

3.15.5-Testes de expressão da amilase de recombinante:

Após a identificação dos clones efetivamente transformados, uma

série de testes de expressão foi realizada. As colônias escolhidas foram

semeadas em 5 mL de meio BMG 1%, em tubo Falcon de 50 mL. Estes

inóculos foram incubados em torno de 18 horas em shaker com agitação

vigorosa e temperatura de 30 °C. Após este período, o meio foi completado

até 50 mL com meio BMG 1% e transferidos para erlenmeyers de 125 mL.

Em seguida o inóculo foi incubado por 24 horas em shaker com vigorosa

agitação a 30 °C. O inóculo foi então centrifugado a 3500 RPM em

centrifuga MSE (modelo Mistral 2000) por 15 minutos, na temperatura de

30 °C. O pellet obtido foi suspendido em 10 mL de meio BMM (fosfato de

potássio 100 mM, 1,34% de YNB, 4 x 10

-5

% de biotina e 0,7% de metanol)

para promover a expressão da amilase. A indução da expressão foi

realizada diariamente com 0,7% de metanol por um período de 10 dias.

Para verificar a eficiência da indução da expressão, a cada dois dias uma

alíquota de 1 mL era retirada e adicionada em eppendorf seguida de

centrifugação. O sobrenadante separado era utilizado para verificação da

atividade amilásica através do método de DNS (metodologia descrita

anteriormente).

3.16- Formulação do meio reacional para determinação da atividade

amilase recombinante:

O meio de reação era composto por 800 µL de enzima

(sobrenadante); 800 µL água do mar autoclavada; 50 µL de tampão

Formiato de Na

2 M (~50 mM final, a pH 4,5); 80 µL de CaCl

e 400 µL

de solução de amido 1% . O restante da metodologia foi igual à utilizada

para a amilase de Bacillus subtilis, com ressalvas feitas para a temperatura

utilizada nos experimentos.

3.17- Determinação da atividade da amilase recombinante:

Como foi dito anteriormente, a expressão foi feita com o gene

otimizado. A expressão mostrou através dos géis de agarose e do PCR de

colônia que o construto havia sido realizado com sucesso e

consequentemente houve uma atividade enzimática excelente. Desta forma,

os géis mostrados nos resultados e os ensaios enzimáticos foram realizados

com os sobrenadantes (clones 1, 2 e 7).

3.18-Determinação da atividade amilásica em função da temperatura:

Para a realização deste ensaio enzimático cada clone selecionado (1,

2 e 7) tinha uma seqüência de tubos com os tempos de 20, 40, 60, 90 e 120

minutos. Os meios de reação foram preparados de acordo com a

metodologia descrita em seções anteriores. Foram escolhidas as

temperaturas de 80

C, 90

C e 100

C, devido à natureza termotolerante

esperada para a amilase de P. furiosus. Após parar a reação e fazer a reação

com o DNS como descrito anteriormente, a O.D. das reações foi lida no

espectrofotômetro para determinação das atividades (metodologia acima).

3.19-Determinação da atividade amilásica em função do pH:

Para a realização deste ensaio enzimático cada clone (1, 2 e 7) tinha

uma seqüência de tubos com os tempos de 20, 40, 60, 90 e 120 minutos. Os

meios de reação foram preparados de acordo com a metodologia descrita

acima. Foi escolhida a temperatura de 90

C e, de acordo com relatos da

literatura (Jorgensen et al., 1997) os seguintes pHs: 4,0; 4,5; 5,5 e 6,0. Ao

final da reação o resultado foi avaliado pelo método do DNS.

3.20-Determinação da atividade amilásica em função da concentração

de enzima (sobrenadante):

Para a realização deste ensaio enzimático cada um dos clones (1, 2 e

7) tinha uma seqüência de tubos com os tempos de 20, 40, 60, 90 e 120

minutos. Os meios de reação foram preparados com os seguintes volumes

de sobrenadante: 50 µL, 200 µl, 400 µL e 600 µL. A diferença entre os

volumes enzimáticos foi compensada com a variação do volume de água do

mar autoclavada utilizada no meio reacional. Foi escolhida a temperatura

de 90

C; 50 mM de tampão acetato (pH 5,5) e 400 µL de amido 1%. O

resultado foi revelado pelo método do DNS.

3.21-Determinação da atividade amilásica em função da concentração

de substrato:

Para a realização deste ensaio enzimático cada clone (1, 2 e 7) tinha

uma seqüência de tubos com os tempos de 20, 40, 60, 90 e 120 minutos. Os

meios de reação foram preparados com os seguintes volumes de amido 1%

(dissolvido em água do mar): 600 µL, 800 µL, 1000 µL, 1200 µL e 1550

µL para um volume total de 2130 µL. A diferença entre os volumes das

reações foi compensada com a variação do volume de água do mar

autoclavada utilizada no meio reacional. Foi escolhida a temperatura de

C; 50 mM de tampão acetato (pH 5,5), e 50 µL de enzima. O resultado

foi avaliado pelo método do DNS.

3.22-Determinação da atividade amilásica em função de concentrações

baixas de enzima (sobrenadante) e mais substrato:

Para a realização deste ensaio enzimático cada clone (1, 2 e 7) tinha

uma seqüência de tubos com os tempos de 20, 40, 60, 90 e 120 minutos. Os

meios de reação foram preparados com os seguintes volumes de

sobrenadante: 10 µL, 20 µL, 30 µL, e 40 µL, para um volume final de 2

mL. A diferença entre os volumes enzimáticos foi compensada com a

variação do volume de água do mar autoclavada utilizada no meio

reacional. Foi usada a temperatura de 90

C; 50 mM de tampão acetato (pH

5,5), e 1550 µL amido 1% (final 0,78%). O resultado foi avaliado pelo

método do DNS.

3.23-Determinação do peso molecular da amilase por SDS-PAGE:

Para esta determinação foi realizada um gel de SDS-PAGE a 10%

(Laemmli, 1970). Foram utilizados: poço 1, 5 µL de padrão de peso

molecular (Fermentas SM0441); poço 2, 5 µL de tampão de amostra (6x) e

25 µL do sobrenadante do clone 1 sem aquecimento; poço 3, 5 µl de

tampão de amostra (6x) e 25 µL do sobrenadante do clone 1 com

aquecimento; poço 4, 5 µL de tampão de amostra (6x), 25 µL do

sobrenadante do clone 2 sem aquecimento; poço 5, 5 µL de tampão de

amostra (6x), 25 µL do sobrenadante do clone 2 com aquecimento; poço 6,

5 µL de tampão de amostra (6x), 25 µL do sobrenadante do clone 7 sem

aquecimento e poço 7, 5 µL de tampão de amostra (6x), 25 µL do

sobrenadante do clone 7 com aquecimento. As amostras foram aquecidas

por 5 minutos a 100 °C.

A cuba de eletroforese utilizada foi um modelo Mini-PROTEAN

Tetra (BioRad). Para cada gel foram utilizados 20 mA e 120 V por

aproximadamente 1 hora. O gel foi corado pelo método de prata rápida da

mesma forma como o gel para a amilase de Bacillus subtilis.

4-Resultados:

4.1-Bacillus subtilis

4.1.1-Determinação do crescimento das culturas de Bacillus subtilis:

Como esperado para o crescimento de B. subtilis, na Figura 7 pode-

se ver uma fase lag nas primeiras 4 horas, seguida de um padrão

exponencial de crescimento típico até as 20 horas, atingindo a fase

estacionária a partir de 24 horas em diante. Medidas pontuais da atividade

amilásica a 3, 12, 24 e 36 horas de crescimento, mostraram que a produção

de amilase se inicia na fase exponencial e é mantida na fase estacionária

desta cultura (dados não mostrados).

Figura 7. Curva de crescimento bacteriano. As células foram crescidas a 30

C em

meio LB sob agitação de 125 rpm. Os pontos mostrados na curva representam os

tempos de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 12, 16, 24 e 48 horas.

4.1.2-Teste de estabilidade enzimática dos sobrenadantes:

De acordo com de Park et al. (2004) um conjunto de proteases

começa a ser secretado por B. subtilis depois da fase exponencial de

crescimento. Com base nesta possibilidade optou-se por analisar uma

possível interferência na atividade amilásica possivelmente causada pela

ação de enzimas proteolíticas. Nossos resultados sugeriram que a atividade

amilásica é estável (Figura 8).

Tempo (Min)

0 10 20 30 40 50 60 70

D.O.

540

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

refrigerador (8° repique)

15° repique

8° repique 15° repique

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

Atividade Relativa (µg/ ml enz/ min)

Figura 8. Estabilidade da atividade amilásica em meio de expressão. Sobrenadante

da cutlura de B. subtilis contendo a atividade amilásica foi armazenado por 16 dias a 4

°C. Após este período a atividade amilásica foi novamente medida (A) (O erro padrão

de cada ponto é representado pelas barras, n=3). O gráfico de barras representa os

valores de regressão linear para os pontos que melhor representam as velocidades

iniciais das curvas de progresso de reação (B).

4.1.3-Determinação da atividade amilásica em função da temperatura:

Para melhor caracterizar a amilase de B. subtilis, testamos a

termodependência e a termotolerância da atividade a temperaturas

crescentes. Na figura 9 estão os resultados que mostram que a enzima

apresentou melhor atividade e estabilidade à temperatura de 55

Contudo, a enzima ainda se mostrou ativa a 65

C, apresentando atividade

comparável ao encontrado a 45

C. Entretanto, quando o ensaio foi

realizado a 75

C, esta preparação mostrou sinais de desnaturação, não

possuindo atividade mensurável. É relevante ressaltar que a 75

C ocorreu

precipitação visível da enzima, provavelmente evidenciando uma

agregação induzida por desnaturação térmica.

Tempo (min)

0 10 20 30 40 50 60 70

D.O.

540 nm

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

45 °C

55 °C

65 °C

75 °C

Temperatura

45 °C 55 °C 65 °C 75 °C

Atividade Relativa (µg/ ml enz/ min)

Figura 9. Atividade amilolítica de amilase de Bacillus subtilis em função da

temperatura de incubação. As temperaturas de incubação variaram de 45 °C a 75 °C.

A atividade amilásica foi medida de acordo com a metodologia citada anteriormente

(A). O gráfico de barras representa os valores de regressão linear para os pontos que

melhor representam as velocidades iniciais das curvas de progresso de reação (B).

4.1.4-Determinação da atividade amilásica em função do pH:

Diferentes linhagens de Bacillus subtilis, e diferentes espécies do

gênero Bacillus, notoriamente produzem amilases com diferentes

tamanhos, seqüências, termoestabilidade, e especificidades de pH para sua

melhor atividade (Najafi et al., 2005). Assim, procedemos à caracterização

não só da termoestabilidade, mas também da dependência ao pH desta

amilase. Na Figura 10 estão representados os dados que mostram que esta

amilase de Bacillus subtilis apresenta um caráter acidofílico. O ótimo de

pH desta enzima está na faixa entre 5,0 e 6,0, sendo que a pH 7,0 a

atividade é muito menor, e comparável à encontrada a pH alcalino (8,0)

onde as amilases de Bacillus sp. em modo geral são menos ativas (Najafi et

al., 2005). Os resultados são a média de 3 experimentos em triplicata, à

temperatura de 55

Tempo (Min)

0 10 20 30 40 50 60 70

D.O.

540 nm

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

pH 5,0

pH 6,0

pH 7,0

pH 8,0

pH 5,0 pH 6,0 pH 7,0 pH 8,0

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

Atividade Relativa (µg/ ml enz/ min)

Figura 10. Atividade amilolítica de Bacillus subtilis em função do pH. Os meios

reacionais e as atividades foram preparados e medidos respectivamente de acordo com a

metodologia citada previamente com. Foram preparados 4 meios reacionais

promovendo uma variação de pH de 5,0 a 8,0 (A). O gráfico de barras representa os

valores de regressão linear para os pontos que melhor representam as velocidades

iniciais das curvas de progresso de reação (B). N = 3.

4.1.5-Efeito de indução da amilase por Ca

e amido:

Foi relatado na literatura que a composição do meio de cultura pode

influenciar positivamente na produção de amilase por cepas de Bacillus sp.

(Santos & Martins, 2003). Assim sendo, uma série de testes com diferentes

combinações de amido e cálcio no meio de cultivo foi realizada. Na Figura

11 é representado o efeito de 0,1 mM de CaCl

, e de amido 0,1%, presentes

no meio de cultivo e mantidos durante o ensaio de amilase. Verificamos

que, para a cepa utilizada, o CaCl

adicional se mostrou indutor da

atividade de amilase, enquanto que o amido como fonte auxiliar de carbono

durante o crescimento bacteriano não foi efetivo em induzir a atividade

amilolítica desta cepa.

Tempo (Min)

0 10 20 30 40 50

D.O.

540 nm

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

normal (1)

normal + Ca

(2)

amido no meio de cultura (3)

amido no meio de cultura + Ca

(4)

0 1 2 3 4 5

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

Atividade Relativa (µg/ ml enz/ min)

Figura 11. Efeito do Ca

e do amido na atividade da amilase de Bacillus subtilis.

Células foram crescidas em meio LB suplementado com 1 mM de CaCl

e/ou 1% de

amido solúvel, amido de milho regular ou amido hidrolisável por variados períodos e a

atividade amilásica da enzima secretada foi verificada. Os resultados não foram

diferentes para cada tipo de amido (A). O gráfico de barras representa os valores de

regressão linear para os pontos que melhor representam as velocidades iniciais das

curvas de progresso de reação (B). N = 3.

4.1.6-Enriquecimento da atividade amilásica através da concentração

por precipitação com Sulfato de Amônio:

Com o objetivo de promover o enriquecimento da atividade

amilásica, realizou-se uma precipitação do sobrenadante total da cultura

com solução saturada de sulfato de amônio. O material concentrado cerca

de vinte vezes em sulfato de amônio (50 µL) foi ensaiado em confronto

com 600 µL do sobrenadante normal. A técnica utilizada obteve sucesso,

pois a velocidade de hidrólise do material concentrado apresentou-se

bastante superior à curva com o sobrenadante não concentrado, que foi

elaborada com um volume total de enzima 12 vezes maior (Figura 12).

1 2 3 4

Tempo (Min)

0 10 20 30 40 50

D.O.

540 nm

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

normal (600 uL) (1)

normal + Ca2+ (600 uL) (2)

sob. da precipitação (600 uL) (3)

conc. da precipitação (50 uL) (4)

Atividade Relativa (µg/ ml enz/ min)

Figura 12. Efeito da precipitação por sulfato de amônio na atividade amilásica de

Bacillus subtilis. O sobrenadante da cultura foi precipitado com solução saturada de

sulfato de amônio (62,5%), na temperatura de 4 °C e sob leve agitação. A atividade

amilásica do sobrenadante e do precipitado após centrifugação foi testada a 55 °C (A).

O gráfico de barras representa os valores de regressão linear para os pontos que melhor

representam as velocidades iniciais das curvas de progresso de reação (B). N = 3.

4.1.7-Determinação da halotolerância da atividade enzimática:

Este ensaio foi realizado com a finalidade de verificar a influência da

salinidade na atividade amilolítica. Quatro meios, com concentrações

crescentes de cloreto de sódio (NaCl a 36,37 g/L, 72,75 g/L, 145,15 g/L,

291,0 g/L), comumente utilizado no campo petrolífero como agente

adensante, foram utilizados para este teste. Também foram preparados dois

controles, um contendo cloreto de potássio (20 g/L) e outro contendo

apenas tampão acetato de sódio 50 mM. Tanto a elevação da salinidade até

um máximo de 291 g/L, adicionados a água do mar, perfazendo

aproximadamente uma concentração de NaCl de 5 M, quanto a presença de

KCl proporcionaram um aumento significativo na atividade enzimática

(Fig. 13).

Tempo (minutos)

0 10 20 30 40 50 60 70

D.O.

540 nm

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

somente KCl

36,37 g/L NaCl

72,75 g/L NaCl

145,5 g/L NaCl

291 g/L NaCl (5 M)

acetato de Na

Atividade Amilásica (ug/min/20 ul enzima)

20 g/LKCl

36,37 g/L NaCl

Acetato

de Na+

145,5 g/L NaCl

291 g/L NaCl

72,75 g/L NaCl

Figura 13. Efeito da adição de NaCl e KCl na atividade amilolítica da enzima de

Bacillus subtilis. Os resultados são da média de 2 experimentos e o gráfico de barras

representa os valores de regressão linear para os pontos que melhor representam as

velocidades iniciais das curvas de progresso de reação. Não houve uma diferença

significativa entre as diferentes concentrações de sal, mas nota-se um aumento

significativo em relação ao meio apenas tamponado com acetato de sódio.

4.1.8-Determinação da atividade enzimática em função do tempo:

O objetivo deste ensaio foi observar o comportamento da amilase

precipitada ao longo do tempo de ensaio, nas temperaturas de 60 °C e 70

°C (Fig. 14). O resultado obtido demonstra que a enzima apresenta-se

estável, resistindo ativa à temperatura de 60 °C, ao passo que a 70 °C a

atividade é diminuída, condizente com a inativação observada

anteriormente a 75

C. Nota-se que a formação de produto se mostrou

crescente por um período superior a duas horas em ambos casos,

evidenciando que a atividade se manteve, mesmo nestas temperaturas,

elevada para uma amilase proveniente de um organismo não-termófilo.

60 °C 70 °C

Temperatura

Atividade Relativa (µg/ ml enz/ min)

Tempo (Min)

0 20 40 60 80 100 120 140 160

D.O.

540 nm

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

60 °C

70 °C

Figura 14. Resistência da atividade amilolítica em função do tempo e temperatura.

A atividade amilolítica foi testada até 150 minutos usando 50 µL de sobrenadante

concentrado com solução saturada de sulfato de amônio. Os resultados são da média de

2 experimentos (A). O gráfico de barras representa os valores de regressão linear para

os pontos que melhor representam as velocidades iniciais das curvas de progresso de

reação (B).

4.1.9-Determinação do peso molecular da amilase de Bacillus subtilis

por SDS-PAGE:

As primeiras tentativas de observar a banda correspondente à amilase

de B. subtilis em SDS-PAGE diretamente a partir do sobrenadante das

culturas foram mal sucedidas, devido à baixa concentração de proteína ou a

sua má coloração por azul de Coomassie ou prata. Para melhorar a

visualização da amilase no gel, o sobrenadante foi concentrado

inicialmente com o concentrador Amicon (metodologia descrita

anteriormente) e posteriormente com solução saturada de Sulfato de

Amônio 62,5% (metodologia descrita anteriormente). Antes da aplicação

das amostras no gel, recorremos à utilização de uréia e de aquecimento (60

s em banho-maria a 100

C) para promover a desnaturação da amilase,

diminuindo a formação de dímeros e agregados e facilitando assim a

visualização da banda referente à amilase no gel. Foi possível assim

constatar a existência de uma banda com aproximadamente 46 kDa, e outra

banda com cerca de 72 kDa, que poderia corresponder a um dímero da

enzima (Figura 15).

Figura 15. SDS-PAGE 10% do sobrenadante de Bacillus subtilis concentrado por

Amicon e por precipitação com Sulfato de Amônio. Poço 1: marcador de peso

molecular (Fermentas modelo SM0441); poço 2: Sobrenadante não concentrado; poço

3: Concentrado com amicon e sulfato de amônio; poço 4: Concentrado com sulfato de

amônio e amicon adicionado de uréia. Todas as amostras foram aquecidas previamente.

As setas indicam a banda de 47 kDa característica da α-amilase de Bacillus.

4.1.10-Determinação da atividade amilásica sob pressão hidrostática:

Para testar o efeito da alta pressão hidrostática sobre a atividade

amilásica de Bacillus subtilis. foram adquiridos substratos sintéticos

cromogênicos, o pNPOG5 e o CNPG3, ambos análogos de maltosídeos

com grupamentos nitrofenol (cromogênicos) em suas extremidades. Deste

modo, seria possível acompanhar a atividade enzimática continuamente no

interior da célula de pressão. Verificamos que a amilase de Bacillus subtilis

foi incapaz de liberar pNP a partir do pNPOG5, enquanto o CNPG3 era

hidrolisado liberando pNP ao meio. Isto sugere que, no caso do pNPOG5, o

pseudosubstrato não estaria sendo clivado, ou estaria sendo clivado em um

ponto onde os produtos liberados seriam pNP-maltose e maltotriose, e/ou

pNP-glicose e maltotetraose, que não apresentariam a cor esperada, e a

enzima estaria atuando como endo-amilase. Os resultados mostraram

também que a enzima não só é piezotolerante, como também é ativada por

altas pressões hidrostáticas. Na Figura 16A a enzima apresenta um ganho

de atividade de 2,5 vezes, a 2000 atmosferas (200 MPa). Na Figura 16B

observa-se uma alta atividade enzimática durante os primeiros 40 minutos,

e posteriormente há uma redução lenta e contínua, provavelmente causada

pela privação de substrato.

Pressão, MPa

0 50 100 150 200

atividade relativa nas CNTP (%)

100

150

200

250

300

Tempo, min

0 10 20 30 40 50 60 70

D.O.

425 nm

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

Figura – 16. (A) Efeito de pressão hidrostática na atividade amilásica. Neste ensaio

a enzima foi submetida a pressões crescentes (40, 80, 120, 160 e 200 MPa), a uma

temperatura de 55 °C, fazendo etapas de 7 minutos de duração para cada pressão. A

atividade amilásica foi medida com 1 mM de CNPG3, a 415 nm, em espectrofotômetro

GBC modelo CINTRA20. (B) A atividade amilásica em meio contendo 1 mM CNPG3,

1 mM CaCl

, Acetato de Sódio pH 5.5 e 20 µL sobrenadante concentrado com solução

saturada de sulfato de amônio foi levada a 200 MPa e o curso temporal acompanhado

até 60 min, a 55

C. N = 2.

4.2-Pyrococcus furiosus

4.2.1-Mapa do vetor pPIC9 com o local de inserção do gene.

No mapa do vetor pPIC9 (Fig. 17) é mostrado o local onde foi

inserido o gene (1,3 Kb) que codifica a α-amilase de Pyrococcus furiosus.

Figura 17. Mapa do vetor pPIC9 adaptado do Manual de expressão em Pichia

pastoris (www.invitrogen.com).

4.2.2-Confirmação da transfecção do vetor pPIC9 para DH5-α (células

competentes) por gel de agarose.

Após a realização da Mini-Prep, um gel de agarose foi feito para

verificar o tamanho do vetor amplificado (os quatro clones mostrados

mostram uma banda de 9,2 Kb que corresponde ao peso do vetor pPIC9

(7,9 Kb do plasmídio e 1,3 Kb o do inserto desejado).

Figura 18. Eletroforese em gel de agarose da miniprep do vetor Ppic9 contendo o

inserto de interesse (Pyrfu amylase). A miniprep foi feita a partir de quatro clones

positivos após a transformação de E. coli. Poço 1-DNA-ladder, poços 2-5 mostram uma

banda com 9,2 kb que corresponde ao vetor com o gene da amilase inserido.

A confirmação dos tamanhos do inserto e do vetor linearizado foi

feito um gel de agarose 0,8% do material digerido. Note-se que a

combinação dos cortes proporcionados pelas duas enzimas de restrição

usadas (SalI e XhoI), removeria um fragmento de aproximadamente 3,2 kb

a montante da entrada do nosso inserto (sítio de XhoI), isto proporcionou a

detecção de dois fragmentos, um com cerca de 6,0 Kb e outro com 3,2 Kb

(Fig. 19).

Figura 19. Eletroforese em gel de agarose da digestão do pPic9 contendo o inserto

de interesse – Poço 1 - Padrão de peso molecular, Poço 3 - Clone 1 digerido com SalI,

poço 4 - Clone 6 digerido com a mesma enzima de restrição, poço 5 - Clone 1 digerido

com SalI e XhoI e poço 6 - Clone 6 digerido com as mesmas enzimas de restrição. O

clone 1 foi escolhido por apresentar menor contaminação. No Poço 6 se evidencia um

pouco do vetor não digerido (banda de 9,2 kDa).

Após a confirmação do peso molecular do fragmento

correspondente a α-amilase (Fig. 19), foi feita a transformação do vetor

pPIC9 + α-amilase em Pichia pastoris (metodologia descrita

anteriormente). A Figura 20A mostra um experimento realizado para

confirmar o sucesso da expressão com os clones 1, 2 e 7. Foram usados

como controles negativos Pichia pastoris + pPIC9 vazio e somente P.

pastoris (Fig. 20A). Foi feito também um PCR de colônia para confirmação

dos controles negativos (Fig. 20B). Não foi feito o PCR com os clones

positivos pois o sequenciamento (anexo 1) já havia sido realizado pela

Genescript © e a digestão do pPIC9 + α-amilase (Fig. 19) apresentou o

perfil de bandas esperado.

Tempo (Min)

0 20 40 60 80 100

D.O.

540 nm

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

Clone 1-P. pastoris + pPIC9+amilase

Clone 2-P. pastoris + pPIC9+amilase

Clone 7-P. pastoris + pPIC9+amilase

Controle-P. pastoris + pPIC9 vazio

Controle-P. pastoris

Figura 20. Curva temporal da atividade amilásica para comparação entre os

clones 1, 2 e 7 e os controles negativos: Foram utilizados para este experimento

tampão formiato de sódio 50 mM, pH 4,5, e 0,7% de amido, para um volume final de

2.130 µL. (A). Eletroforese em gel de agarose 1%. No poço P – 0,5 µg de padrão de

peso molecular de 1 Kb (Invitrogen), poço 1 – 20 µl de amostra de P. pastoris + pPIC9

vazio e no poço 2 – 20 µl de amostra P. pastoris sem vetor.

4.2.3-Expressão da a-amilase de Pyrococcus furiosus em Pichia

pastoris:

A expressão da amilase de Pyrococcus furiosus na levedura Pichia

pastoris foi induzida pela adição de metanol a células cultivadas em meio

líquido. A expressão com gene otimizado foi válida pois a proteína

desejada foi expressa com sucesso. Desta forma os resultados são

mostrados a seguir.

4.2.4-Determinação da atividade amilásica em função do pH:

Os resultados representados nas Figuras 21-23 mostram que a

amilase de Pyrococcus furiosus possui um caráter acidófílo. O ótimo de pH

desta amilase é 4,5 para os três clones, similar ao já descrito na literatura

para esta enzima (Jorgensen et al., 1997). Nos outros pHs os três clones

apresentaram uma pequena queda da atividade (pH 4,0, 5,5 e 6,0). Os

resultados são a média de 3 experimentos em triplicata, à temperatura de 90

pH 4,0 pH 4,5 pH 5,5 pH 6,0

Atividade Relativa (µg/ ml enz/ min)

Clone 1

Tempo (Min)

0 20 40 60 80 100 120 140

D.O.

540 nm

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

pH 4,0

pH 4,5

pH 5,5

pH 6,0

Figura 21. Curva temporal da atividade amilásica em diferentes pHs. Foram

utilizados para este experimento tampão formiato de sódio 50 mM nos pHs citados no

gráfico acima, 50 µL de sobrenadante do clone 1 e 400 µL de amido 1% para um

volume final de 2.130 µL (A). O gráfico de barras representa os valores de regressão

linear para os pontos que melhor representam as velocidades iniciais das curvas de

progresso de reação (B). N = 3

pH 4,0 pH 4,5 pH 5,5 pH 6,0

Atividade Relativa (µg/ ml enz/ min)

Clone 2

Tempo (Min)

0 20 40 60 80 100 120 140

D.O.

540 nm

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

pH 4,0

pH 4,5

pH 5,5

pH 6,0

Figura 22. Curva temporal da atividade amilásica em diferentes pHs. Foram

utililizados para este experimento tampão formiato de sódio 50 mM nos pHs citados no

gráfico acima, 50 µL de sobrenadante do clone 2 e 400 µL de amido 1% para um

volume final de 2.130 µL (A). O gráfico de barras representa os valores de regressão

linear para os pontos que melhor representam as velocidades iniciais das curvas de

progresso de reação (B). N = 3.

pH 4,0 pH 4,5 pH 5,5 pH 6,0

Atividade Relativa (µg/ ml enz/ min)

Clone 7

Tempo (Min)

0 20 40 60 80 100 120 140

D.O.

540 nm

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

pH 4,0

pH 4,5

pH 5,5

pH 6,0

Figura 23. Curva temporal da atividade amilásica em diferentes pHs. Foram

utililizados para este experimento tampão formiato de sódio 50 mM nos pHs citados no

gráfico acima, 50 µL de sobrenadante do clone 1 e 400 µL de amido 1% para um

volume final de 2.130 µL (A). O gráfico de barras representa os valores de regressão

linear para os pontos que melhor representam as velocidades iniciais das curvas de

progresso de reação (B). N = 3.

4.2.5-Determinação da atividade amilásica em função de diferentes

concentrações de substrato.

Neste experimento foram testadas diferentes concentrações de

substrato (0,3-0,7% de amido), para determinar a concentração suficiente

de substrato para 50 µL de enzima adicionados, tendo em vista que no

experimento anterior os gráficos mostram um situação de esgotamento de

substrato. Os resultados são a média de 3 experimentos em triplicata, à

temperatura de 90

C (Fig. 24-26).

Substrato

0,3% 0,4% 0,5% 0,6% 0,7%

100

120

140

160

Atividade Relativa (µg/ ml enz/ min)

Clone 01

Tempo (Min)

0 20 40 60 80 100 120 140

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

1,8

2,0

0,3%

0,4%

0,5%

0,6%

0,7%

D.O.

540 nm

Figura 24. Curva temporal da atividade amilásica com diferentes concentrações de

substrato (amido). Foram utilizados para este experimento tampão formiato de sódio

50 mM, pH 4,5, 50 µL de sobrenadante do clone 1 para um volume final de 2.130 µL

(A). O gráfico de barras representa os valores de regressão linear para os pontos que

melhor representam as velocidades iniciais das curvas de progresso de reação (B). N =

Substrato

0,3% 0,4% 0,5% 0,6% 0,7%

100

120

140

Atividade Relativa (µg/ ml enz/ min)

Clone 02

Tempo (Min)

0 20 40 60 80 100 120 140

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

1,8

2,0

0,3%

0,4%

0,5%

0,6%

0,7%

D.O.

540 nm

Figura 25. Curva temporal da atividade amilásica com diferentes concentrações de

substrato (amido). Foram utilizados para este experimento tampão formiato de sódio

50 mM, pH 4,5, 50 µL de sobrenadante do clone 2, para um volume final de 2.130 µL

(A). O gráfico de barras representa os valores de regressão linear para os pontos que

melhor representam as velocidades iniciais das curvas de progresso de reação (B). N =

0,3% 0,4% 0,5% 0,6% 0,7%

100

120

140

160

Substrato

Atividade Relativa (µg/ ml enz/ min)

Clone 07

Tempo (Min)

0 20 40 60 80 100 120 140

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

1,8

2,0

0,3%

0,4%

0,5%

0,6%

0,7%

D.O.

540 nm

Figura 26. Curva temporal da atividade amilásica com diferentes concentrações de

substrato (amido). Foram utilizados para este experimento tampão formiato de sódio

50 mM, pH 4,5, 50 µL de sobrenadante do clone 7, para um volume final de 2.130 µL

(A). O gráfico de barras representa os valores de regressão linear para os pontos que

melhor representam as velocidades iniciais das curvas de progresso de reação (B). N =

4.2.6-Determinação da atividade amilásica em função de concentrações

baixas de enzima e altas de substrato:

Neste experimento foram testados diferentes adições de enzima (10-

40 µL) ao meio (~2 mL de volume final), para determinar a concentração

necessária de enzima para realizar os experimentos com 0,7% de amido

sem que o substrato esgotasse rapidamente, para poder determinar o tempo

de sobrevivência da enzima com atividade. Os resultados são a média de 3

experimentos em triplicata à temperatura de 90

C (Fig. 27-29).

Clone 1

Tempo (Min)

0 20 40 60 80 100

D.O.

540 nm

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

10 µl

20 µl

30 µl

40 µl

10 µl 20 µl 30 µl 40 µl

100

120

140

Enzima

Atividade Relativa (µg/min)

Figura 27. Curva temporal da atividade amilásica para pequenos volumes de

sobrenadante do clone 1. Foram utilizados para este experimento tampão formiato de

sódio 50 mM, pH 4,5, e 0,7% de amido, para um volume final de 2.130 µL. (A). O

gráfico de barras representa os valores de regressão linear para os pontos que melhor

representam as velocidades iniciais das curvas de progresso de reação (B). N = 3.

Clone 2

Tempo (Min)

0 20 40 60 80 100

D.O.

540 nm

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

1,8

10 µl

20 µl

30 µl

40 µl

10 µl 20 µl 30 µl 40 µl

100

120

140

160

Enzima

Atividade Relativa (µg/min)

Figura 28. Curva temporal da atividade amilásica com pequenos volumes de

sobrenadante do clone 2. Foram utilizados para este experimento tampão formiato de

sódio 50 mM, pH 4,5, e 0,7% de amido, para um volume final de 2.130 µL (A). O

gráfico de barras representa os valores de regressão linear para os pontos que melhor

representam as velocidades iniciais das curvas de progresso de reação (B). N = 3.

Clone 7

Tempo (Min)

0 20 40 60 80 100

D.O.

540 nm

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

1,8

10 µl

20 µl

30 µl

40 µl

10 µl 20 µl 30 µl 40 µl

100

120

140

Enzima

Atividade Relativa (µg/ ml enz/ min)

Figura 29. Curva temporal da atividade amilásica para pequenos volumes de

sobrenadante do clone 7. Foram utilizados para este experimento tampão formiato de

sódio 50 mM, pH 4,5, e 0,7% de amido, para um volume final de 2.130 µL (A). O

gráfico de barras representa os valores de regressão linear para os pontos que melhor

representam as velocidades iniciais das curvas de progresso de reação (B). N = 3.

4.2.7-Determinação do peso molecular da amilase através de SDS-

PAGE.

Para melhorar a visualização da amilase dos clones no gel, cada um

dos clones teve uma amostra fervida (100 °C) por 5 minutos antes de serem

aplicadas no gel (Fig. 30). A utilização do aquecimento foi para promover a

desnaturação ou dissociação da amilase, diminuindo a formação de

dímeros, facilitando assim a visualização da banda referente à amilase no

gel. É possível, nas amostras aquecidas, observar uma banda que poderia

corresponder à a-amilase de Pyrococcus furiosus, que possui 424

aminoácidos, o que resultaria em um peso molecular de aproximadamente

47 kDa. É interessante notar que nas amostras que não sofreram o

aquecimento, observam-se duas bandas com maior peso molecular, com

cerca de 68 kDa e 79 kDa, que são enfraquecidas no gel após aquecimento,

e que poderiam corresponder a dímeros da amilase, já relatados

anteriormente por outros autores (Dong et. al., 1997)

Figura 30. SDS-PAGE 10% dos 3 clones utilizados na expressão da α-

amilase de Pyrococcus furiosus. Poço 1 - padrão; poço 2- sobrenadante do clone 1 sem

aquecimento; poço 3- sobrenadante do clone 1 com aquecimento; poço 4- sobrenadante

do clone 2 sem aquecimento; poço 5- sobrenadante do clone 2 com aquecimento; poço

6- sobrenadante do clone 7 sem aquecimento e poço 7, sobrenadante do clone 7 com

aquecimento. As amostras foram aquecidas por 5 minutos a 100 °C com o tampão de

amostra. Foram aplicados 25 µL de cada amostra e gel foi corado por prata.

5-Discussão:

5.1-Aplicabilidade das α-amilases em processos industriais:

As amilases, de forma geral, são enzimas capazes de hidrolisar

moléculas de amido dando origem a diversos produtos, incluindo dextrinas

e polímeros cada vez menores de glicose (Windish & Mhatre, 1965). Estas

enzimas apresentam uma grande importância, através das aplicações

biotecnológicas, na indústria de panificação, alimentícia em geral, têxtil, de

papéis, e mesmo na produção de etanol (Pandey et al., 2000). As amilases

detêm hoje em dia aproximadamente 25% da comercialização das enzimas

disponíveis no mercado (Burhan et al., 2003; Rao et al., 1998; Sidhu et al.,

1997). Segundo Pandey et al. (2000) as amilases substituíram quase

completamente a hidrólise química do amido nos processos industriais.

A termoestabilidade é a característica mais importante e desejável

nas enzimas industriais (Asgher et al., 2007). As α-amilases podem ser

aplicadas de diferentes formas, sendo que para cada uma delas são

requeridas propriedades muito particulares como: estabilidade, temperatura

ótima e pH ótimo (McTigue et al., 1995).

5.2-Parâmetros específicos da α-amilase de Bacillus subtilis

(temperatura ótima, pH ótimo, peso molecular, estabilidade e atividade

frente á salinidade ):

De acordo com os dados obtidos através dos experimentos que

tiveram a temperatura como variável, observou-se que a α-amilase de

Bacillus subtilis se mantém ativa em uma faixa que vai de 55 a 70 °C,

sendo que a temperatura ótima que alia atividade e durabilidade parece

estar entre 55-60 °C. Najafi et al. (2005) relatam que a α-amilase de

Bacillus subtilis AX20 apresenta uma temperatura ótima de 60 °C,

enquanto que Bacillus licheniformes (Ivanova et al., 1993), Bacillus

subtilis (Marco et al., 1996), Bacillus sp. (Lin et al., 1998) e Bacillus

circulans GRS 313 (Dey et al., 2002) apresentam respectivamente 90 °C,

50 °C, 70 °C e 48 °C como temperaturas ótimas de atividade (apud Najafi

et al., 2005). A enzima de Bacillus subtilis estudada nesta dissertação se

apresentou maior termotolerância que a enzima citada por Marco et al.

(1996).

De acordo com os dados obtidos nos experimentos que tiveram o pH

como variável, observou-se que a α-amilase de Bacillus subtilis apresenta

maior atividade entre pH 5 e 6, sendo que o pH ótimo é de 5,5. Najafi et al.

(2005) relatam que a α-amilase de Bacillus subtilis AX20 apresenta um pH

ótimo de 6, enquanto que Bacillus licheniformes (Ivanova, 1993), Bacillus

subtilis (Marco, 1996), Bacillus sp. (Lin, 1998) e Bacillus circulans GRS

313 (Dey, 2002) apresentam respectivamente 6,0-6,5; 6,5; 9,0; e 4,9 como

pHs ótimos de atividade (Najafi et al., 2005).

Através de SDS-PAGE 10% observou-se que a α-amilase de Bacillus

subtilis apresenta um peso molecular aproximado de 55,0 kDa. Najafi et al.

(2005) observaram que a α-amilase de Bacillus subtilis AX20 apresenta um

peso molecular de 149,0 kDa, enquanto que Bacillus licheniformes

(Ivanova et al., 1993), Bacillus subtilis (Marco et al., 1996) e Bacillus sp.

(Lin et al., 1998) apresentaram respectivamente 58,0, 57,7 e 42,0 como

peso molecular (Najafi et al., 2005).

Um apanhado de todas estas características das diversas α-amilases

identificadas no gênero Bacillus, incluindo a descrita nesta tese, é exposto

na Tabela 1.

Tabela 1 – Comparação de algumas características de algumas α-amilase de Bacillus sp.

(Najafi et al., 2005) com a α-amilase de Bacillus subtilis

Microrganismo P.M. (kDa) pH ótimo Temp. ótima

Bacillus subtilis (esta tese) 55 5,5 55

Bacillus subtilis AX20 (Najafi et

al., 2005)

149 6,0 60

Bacillus licheniformes (Ivanova et

al., 1993)

58 6,0-6,5 90

Bacillus subtilis (Marco et al., 1996)

57,7 6,5 50

Bacillus sp. (Lin et al., 1998) 48 9 70

Bacillus circulans GRS 313 (Dey

et. al., 2002)

- 4,9 48

A α-amilase de Bacillus subtilis produzida em nosso laboratório foi

testada por um período de 2,5 horas, com o intuito de verificar a sua

termoresistência a 60 e 70 °C, pois estas são as temperaturas utilizadas nos

simuladores de poços de petróleo no CENPES/PETROBRAS. A α-amilase

se mostrou termotolerante e manteve a atividade nas duas temperaturas até

a retirada do último ponto. Shewale & Pandit (2007) mostraram que a α-

amilase de Bacillus licheniformes, quando imobilizada em suporte de

celbeads superporosas, apresenta uma termoestabilidade de 8 h a 55 °C.

Os testes de halotolerância realizados com a α-amilase de Bacillus

subtilis em tampão formiato de sódio sugeriram que as melhores condições

de operação para esta enzima seriam na faixa de salinidade maior ou igual à

encontrada na água do mar. O uso de altas concentrações de sais, como

NaCl ou KCl, promoveu neste caso alterações significativas no

comportamento da amilase, com o uso do tampão formiato de sódio. Estes

resultados são de grande relevância, uma vez que tanto NaCl como KCl são

empregados em larga escala nos poços de petróleo como adensantes e

inibidores de argilas. Mesmo na força iônica alta provocada pela adição de

5 M de NaCl, a atividade observada para a amilase testada foi máxima,

validando-a para operação em condições utilizadas em campo.

Nos experimentos realizados com suplementação dos meios com

e Amido, observamos que no meio suplementado com Ca

, Bacillus

subtilis foi observada uma atividade amilásica superior aos outros

sobrenadantes. Alikhajeh et al. (2007) usaram no meio de cultura, para

crescimento de Bacillus KR-8104, amido de batata, peptona de soja, extrato

de carne, cloreto de cálcio monohidratado, sulfato de magnésio

pentahidratado e fosfato de potássio dibásico, enquanto Saxena et al.

(2007) utilizaram, para Bacillus sp. PN5, amido, peptona e extrato de

carne, obtendo em ambas situações uma melhor obtenção da atividade

amilásica. Em nossos experimentos a presença do amido no meio de

cultura não se mostrou relevante como nos dois trabalhos acima, além de

introduzir, nos meios de reação, um inconveniente que é o aumento dos

brancos experimentais (ocorre o aparecimento de glicose livre proveniente

da degradação pela bactéria). No entanto, isto foi facilmente superado pela

execução de controles apropriados. Estes experimentos foram realizados

com uma quantidade menor de sobrenadante contendo enzima (300 µL)

para verificarmos mais efetivamente o efeito da indução.

Com o objetivo de aumentar a atividade da α-amilase de Bacillus

subtilis e reduzir o volume da mesma nos meios reacionais, foram

realizados dois métodos de concentração, um com o concentrador Amicon

e o outro com solução saturada de sulfato de amônio. Nos dois processos, o

mesmo volume de sobrenadante (inicialmente150 mL) foi concentrado 15

vezes (final de 10 mL), sendo que na concentração com sulfato de amônio

o precipitado foi dissolvido em 10 mL de Tris HCl pH 7,0. Para ambos

processos de concentração, houve um resultado muito satisfatório, pois

com apenas 50 µL de enzima foi obtida uma atividade enzimática bem

superior à da enzima sem concentração. Najafi et al. (2005) também

realizaram uma precipitação com sulfato de amônio como uma das etapas

de purificação da α-amilase.

Em virtude da aplicabilidade da α-amilase de Bacillus subtilis em

poços de petróleo, foram realizados experimentos com o fim de verificar a

atividade da α-amilase sob alta pressão hidrostática, sabendo-se que a

média de profundidade dos poços é 2000 m e a pressão de operação pode

atingir 400 atmosferas. Os resultados mostraram que a enzima é

piezotolerante e estimulada por altas pressões hidrostáticas (característica

altamente desejável), apresentando um ganho de atividade de 2,5 vezes a

2000 atmosferas (200 MPa). Considerando-se que a pressão em poços

profundos pode ser bastante elevada, esta característica pode ser muito útil

para sua aplicabilidade nos mesmos.

5.3-Expressão heteróloga da α-amilase de Pyrococcus furiosus em

Pichia pastoris:

Os microrganismos hipertermófilos são capazes de produzir enzimas

que se mantêm ativas a temperaturas onde outras enzimas (mesófilas)

seriam rapidamente desnaturadas (Lipman et al., 1990). Muitos estudos

têm sido realizados com estas enzimas, incluindo α-amilase, devido à

grande aplicabilidade e demanda das mesmas em setores industriais.

A análise completa do genoma de Pyrococcus furiosus, um

microrganismo hipertermófilo, revelou que esta bactéria apresenta uma

série de enzimas amilolíticas (Yang et al., 2004), e entre elas existem genes

que codificam α-amilases. Segundo Yang et al. (2004), o gene

correspondente a uma possível enzima amilolítica, diferente da utilizada

nesta tese, foi isolado, clonado e expresso em E. coli, e essa enzima,

quando caracterizada, apresentou tanto características de ciclodrextrina-

hidrolase quanto de α-amilase. No presente trabalho também foi isolado e

clonado o gene que codificaria uma α-amilase. No entanto, a expressão foi

realizada na levedura Pichia pastoris, com o intuito de se obter um

rendimento maior de enzima. Esta amilase é a mesma clonada

anteriormente e expressa por Jorgensen et al. (1997) em E. coli e B.

subtilis, porém pela primeira vez ela estaria sendo expressa em Pichia

pastoris. A enzima de P. furiosus que foi expressa em P. pastoris

100

apresentou características de α-amilase, porém não foi realizado nenhum

experimento que caracterizaria uma atividade relacionada com a

ciclodextrina-hidrolase.

5.4-Parâmetros específicos da α-amilase de Pyrococcus furiosus

(temperatura ótima, pH ótimo, peso molecular e estabilidade):

De acordo com os dados obtidos através dos experimentos que

tiveram a temperatura como variável, observou-se nos três clones da α-

amilase de P. furiosus, expressos em P. pastoris, apresentaram uma

atividade amilásica muito significativa nas temperaturas de 80, 90 e 100

°C. A diferença de atividade entre as temperaturas e entre os clones não foi

significativa, mas podemos perceber um pequeno aumento da atividade na

temperatura de 90 °C. Yang et al. (2004) expressaram a α-amilase de P.

furiosus em E. coli BL 21 e também realizaram experimentos em busca de

uma temperatura ótima, e para isso efetuaram experimentos nas

temperaturas de 85, 90, 95 e 100 °C, mostrando que 90 °C foi a

temperatura ótima de atividade. Dong et. al. (1997) mostraram em seu

trabalho que a atividade da α-amilase de P. furiosus expressa em E. coli por

eles teve uma temperatura ótima de 100 °C. Jorgensen et al. (1997) além de

expressarem a α-amilase de P. furiosus em E. coli, também o fizeram em B.

101

subtilis. Seus experimentos mostram que a temperatura ótima encontrada

varia de 100 – 105 °C.

A determinação do pH ótimo para a atividade da α-amilase de P.

furiosus foi realizada a 90 °C, tendo em vista que esta foi a melhor

temperatura. Os experimentos foram realizados nos pHs 4,0; 4,5; 5,5 e 6,0

com tampão formiato de sódio 50 mM. Os clones testados não

apresentaram diferenças significativas entre eles, porém todos

apresentaram uma atividade significativamente melhor em pH 4,5. O

mesmo também foi observado por Yang et al. (2004) só que com tampão

acetato de sódio. Dong et. al. (1997) também usaram tampão acetato de

sódio, só que descreveram como ótima a faixa de 5,5–6,0. Jorgensen et. al.

(1997) descreveram como ótimo o pH 4,5, também usando acetato de

sódio.

A determinação do peso molecular feita em SDS-PAGE 10% mostrou

que o peso molecular da α-amilase de P. furiosus expressos em P. pastoris

é de aproximadamente 47 kDa, mas como já foi descrito na literatura, é

possível que haja a formação de dímeros com pesos moleculares maiores.

Desta forma acreditamos que as duas bandas mais pesadas encontradas

acima da banda de 47 kDa, de cada um dos clones, poderiam ser dímeros

desta amilase. Yang et al. (2004) descreveram o peso molecular da α-

amilase de P. furiosus como sendo de 66 kDa, enquanto Jorgensen et. al.

(1997) descreveram o peso molecular como sendo 54 kDa. A discrepância

102

no peso molecular poderia ser devida não só à formação de dímeros ou

heterodímeros protéicos, mas também a diferenças no processamento do

gene nos vetores de expressão. No caso da enzima descrita por Yang et al.

(2004), resta ainda a possibilidade de que o gene seja diferente do que foi

clonado por Jorgensen et al. (1997).

A termoresistência da α-amilase de Pyrococcus furiosus foi descrita

por Jorgensen et. al. (1997). Após 6 horas de incubação a 90

C ou 100

a enzima apresentava 100% (90 °C) e 80% de atividade residual (100 °C).

Yang et al. (2004) observaram 100% (85 °C) e 80% de atividade residual a

(95 °C) após incubação de 2 horas.

Em nossos experimentos, os 3 clones que expressaram a α-amilase

de P. furiosus apresentaram a mesma resistência por 2 horas na temperatura

de 90 °C, o que é muito parecido com os resultados dos outros trabalhos

citados acima.

103

6-Conclusão:

O principal aspecto deste projeto é a expressão e caracterização de

amilases com aplicações industriais, e a demonstração da viabilidade da

utilização de formulações enzimáticas para atividades de completação em

poços de petróleo. As duas amilases descritas neste trabalho (de B. subtilis

e P. furiosus) apresentam características bioquímicas e físicoquímicas

diferentes. Estas enzimas, por sua vez possuem, uma faixa de aplicação

igual ou superior ao das formulações comerciais que foram efetivamente

comparadas em nosso laboratório (dados não mostrados), possibilitando

seu emprego em uma gama maior de aplicações e um melhor desempenho

em ambientes de perfuração. Tanto a α-amilase de B. subtilis quanto a de P.

furiosus apresentam características intrínsecas altamente desejáveis como

termotolerância, termoresistência, acidofilicidade e halofilicidade. O

conjunto de resultados e estratégias desenvolvidas em nosso laboratório,

viabiliza a implementação dos produtos e processos descritos neste trabalho

em uma maior escala. Isto permitiria a realização de testes de campo para

confirmar uma possível adoção destes produtos no processo produtivo da

PETROBRAS. Deste modo, o sucesso desta etapa acarretará em uma

grande economia de divisas através da nacionalização da produção destes

insumos que hoje são adquiridos do mercado externo. As enzimas de B.

subtilis e P. furiosus representam dois novos produtos enzimáticos que são

104

atualmente o objeto de um pedido de patente em tramitação junto a

PETROBRAS.

Estas novas tecnologias enzimáticas não envolvem o emprego e ou

aplicação in situ de organismos transgênicos viáveis, nem o uso de

reagentes químicos explosivos, corrosivos ou tóxicos, o que implica em

risco reduzido e baixo impacto ambiental quando da sua implementação

nos sítios produtivos. As atividades descritas neste trabalho viabilizarão o

emprego de novas metodologias de simples operação que permitem uma

maior conservação dos equipamentos de perfuração, sítios de produção,

resultando em uma menor agressão ao ambiente e economia na cadeia

produtiva. A possível adoção destas metodologias reforçaria a postura da

PETROBRAS como uma entidade preocupada com a adoção de políticas

tecnológicas ecologicamente corretas e por isso mesmo menos agressivas

ao ambiente.

Em resumo, a α-amilase de Bacillus subtilis é termotolerante,

barotolerante, hiperhalófila e acidófila, e por sua vez é secretada no meio

de cultivo. A α-amilase de Pyrococcus furiosus é termoresistente,

hiperhalófila e acidófila, é proveniente do genoma de um organismo

hipertermofílo, e através de tecnologia de DNA recombinante foi expresso

de forma heteróloga na levedura Pichia pastoris. O racional do estudo e

desenvolvimento de duas atividades enzimáticas com requerimentos

diferentes de temperatura foi possibilitar a implementação das novas

105

formulações usando um mesmo fluido de completação em poços que

apresentem atividades geotérmicas distintas. Isto apresenta grande

relevância no âmbito da exploração de petróleo offshore, visto que

ocorreram relatos de campo nos quais as formulações comercialmente

disponíveis parecem precipitar por desnaturação térmica (comunicação

oficial da empresa). Este fato foi comprovado em nossas atividades

experimentais utilizando algumas formulações comerciais (códigos: gbw-

16, 4512 e 4511T e MB33), correntemente adquiridas pela PETROBRAS

para comparação com as enzimas de Bacillus subtilis e Pyrococcus

furiosus. Estes resultados foram publicados nos respectivos boletins

técnicos da PETROBRÁS (Estudo dos fatores que afetam a cinética

enzimática da GBW-16, Estudo dos fatores que afetam a cinética

enzimática das amilases código 4512 e 4511T e Estudo do impacto do

emprego de um novo sistema tamponante sobre a cinética enzimática de

uma amilase comercial e desenvolvimento de uma nova formulação

enzimática.

106

7-Referencias Bibliográficas:

Alikhajeh, J., Khajeh, K., Naderi-Manesh, M., Ranjbar, B., Sajedi,

R.H., Naderi-Manesh, H. (2007). Kinetic analysis, structural studies

and prediction of pKa values of Bacillus KR-8104 α-amylase: The

determinants of pH-activity profile. Enzyme Microb Technol (2007),

doi:10.1016/j.enzmictec.2007.02.019

Altschul S.F., Gish W., Miller W., Myers E.W., Lipman D.J. (1990)

Basic local alignment search tool. J Mol Biol. 5,215,403-10.

Bastos, I.P. Expressão heteróloga constitutiva da defensina de ervilha Psd1

em Pichia pastoris e seu uso como bioantagonista no controle da doença

de maçãs causada pelo fungo Penicillium expansum. Dissertação de

Mestrado em Química Biológica do Instituto de Ciências Biomédicas,

Departamento de Bioquímica Médica, Centro de Ciências da Saúde,

Universidade Federal do Rio de Janeiro, pp.: 110, 2006.

Beall, B.B., Brannon, H. D., Tjonjoepin, R. M., O’Driscoll, K. (1996)

Evaluation of a new tecnich for removing horizontal wellbore damage

attributable to drill-in filter cake. SPE 36429 In: SPE Annual Technical

Conference & Exhibition, Denver, USA.

Bertoldo, C. and Antranikian, G. (2002). Starch-hydrolyzing enzymes

from thermophilic archaea and bacteria. Current Opinion in Chemical

Biology, 6,151–160.

107

Buisson, G., E. Duee, R. Haser, and Payan, F.. (1987). Three

dimensional structure of porcine pancreatic α-amylase at 2.9 Å

resolution. Role of calcium in structure and activity. EMBO J 6,3909–

3916.

Burhan, A., Nisa, U., Gokhan, C., Omer, C., Ashabil, A., & Osman, G.

(2003). Enzymatic properties of a novel thermophilic, alkaline and

chelator resistant amylase from an alkalophilic Bacillus sp. Isolate

ANT-6. Process Biochemistry, 38 1397–1403.

Chen, G-H., Tang, S-J., Chen, C-S., Jiang, S-T. (2001). High-level

production of recombinant chicken cystatin by Pichia pastoris and its

aplication in mackerel surimi. Journal of Agricultural and Food

Chemistry, 49, 541–546.

Cornelis, P., Digneffe, C. and Willemot, K. (1982). Cloning and

expression of a Bacillus coagulansamylase gene in Escherichia coli.

Mol. Gen. Genet., 186, 507-511.

Coutinho, P.M. and Henrissat, B. (1999). Carbohydrate-active enzymes:

an integrated database approach, in: H.J. Gilbert, G. Davies, B.

Henrissat, B. Svensson (Eds.), Recent Advances in Carbohydrate

Bioengineering, The Royal Society of Chemistry, Cambridge, 3-12.

Daly, R. e Hearn, M. T. W. (2005). Expression of heterologous proteins in

Pichia pastoris: a useful experimental tool in protein engineering and

production. Journal of Molecular Recognition, 18, 119–138.

108

Dey, G., Palit, S., Banerjee, R., Maiti, B. R .J. (2002). Purification and

characterization of maltooligosaccharide-forming amylase from Bacillus

circulans GRS 313, Ind. Microbiol. Biotechnol. 28, 193–200.

Henrissat, B. (1991). A classification of glycosyl hydrolases based on

amino acid sequence similarities, Biochem. J. 280, 309-316.

Dong, G., Vieille, C., Savchenko, A., Zeikus, J. G. (1997). Cloning,

Sequencing, and Expression of the Gene Encoding Extracellular a-

Amylase from Pyrococcus furiosus and Biochemical Characterization of

the Recombinant Enzyme. Applied and Enviro. Micro. 63, 9, 3569–

3576

Hodge, R. M., Augustine, B. G., Burton, R. C., Sanders, W. W., Stomp,

D. A. (1996). Evaluation and selection of drill-in-fluid candidates to

minimize formation damage. . SPE 31082 In: International Symposium

on Formation Damage Control, Lafayette, EUA.

Holm, L., Koivula, A.K., Lehtovaara, P.M., Hemminki, A., Knowles,

J.K.C. (1990). Random mutagenesis used to probe the structure and

function of Bacillus stearothermophilus alpha-amylase. Protein Eng. 3,

181–191.

Israilides, C., Smith, A., Scanlon, B., Barnett, C. (1999). Pullulan from

agro-industrial wastes. Biotechnol. Genet. Eng. Rev. 16, 309–324.

Ivanova, V., Dobreva, E., Emanuilova, E. (1993). Purification and

characterization of thermostable α-amylase from Bacillus licheniformis,

J. Biotechnol, 28, 277–289.

109

Jahic, M., Veide, A., Charoenrat,T., Teeri,T. and Enfors, S. (2006).

Process technology for production and recovery of heterologous

proteins with Pichia pastoris. Biotechnol. Prog. 22, 1465-1473.

Janecek, S. & Balaz, S. (1992). α-Amylases and approaches leading to

their enhanced stability. FEBS, 304, 1, l-3.

Janecek, S. & Sevcík, J. (1999). The evolution of starch-binding domain.

FEBS, 456, l19-125.

Jorgensen, S.; Vorgias, C. E.; Antranikian G. (1997) Cloning,

Sequencing, Characterization, and Expression of an Extracellular a-

Amylase from the Hyperthermophilic Archaeon Pyrococcus furiosus in

Escherichia coli and Bacillus subtilis. J. Biol. Chem. 272, 26, 16335–

16342.

Kuriki, T., Imanaka, T. (1999). The concept of the α-amylase family:

structural similarity and common catalytic mechanism. J. Biosci.

Bioeng. 87, 557–565.

Ladermant, K. A., Asadat, K., Uemorit, T., Mukai, H., Taguchit, Y.,

Kato, I. and Anfinsen, C.B. (1993). α-Amylase from the

Hyperthermophilic Archaebacterium Pyrococcus furiosus cloning and

sequencing of the gene and expression in E. coli. J.Biol.Chem. 268, 32,

24402-24407.

Lin, L.L., Chyau, C.C., Hsu, W.H. (1998). Production and properties of a

rawstarch-degrading amylase from the thermophilic and alkaliphilic

Bacillus sp. TS-23, Biotechnol. Appl. Biochem. 28, 61–68.

110

Lueking, A., Holz, C., Gotthold, C., Lehrach, H. e Cahill, D. (2000). A

system for dual protein expression in Pichia pastoris and Escherichia

coli. Protein Expression and Purification, 20, 372–378.

Luyster, M. R., Ali, S. A. (2000) Factors affecting the performance of

enzyme breakers for removal of xantan-based filter-cakes. SPE 58749

In: International Symposium on Formation Damage Control, Lafayette,

EUA.

M. Asgher , M. Javaid Asad , S.U. Rahman , R.L. Legge (2007). A

thermostable a-amylase from a moderately thermophilic Bacillus

subtilis strain for starch processing. Journal of Food Engineering, 79,

950–955.

Maarel van der, M.J.E.C., Veen van der, B., Uitdehaag, J.C.M.,

Leemhuis, H. and Dijkhuizen, L. (2002). Properties and applications

of starch-converting enzymes of the α-amylase family. Journal of

Biotechnology, 94, 137–155.

Madigan, M.T., Martinko, J.M., Parker, J. (2000). Brock Biology of

Microorganisms. 9

ed. Library of Congress Catalog-in-Publication Data

Malhotra, R., Noorwez, S.M. and Satyanarayana, T. (2000). Production

and partial characterization of thermostable and calcium-independent a-

amylase of an extreme thermophile Bacillus thermooleovorans NP54. L.

Ap. Micro., 31, 378-384.

111

Marco, J.L., Bataus, L.A., Valencia, F.F., Ulhora, C.J., Astolfi, S.,

Felix, C.R. (1996) Purification and characterization of a truncated

Bacillus subtilis α-amylase produced by Escherichia coli. Appl.

Microbiol. Biotechnol. 44, 746–752.

McTigue, M. A., Kelly, C. T., Doyle, E. M., & Fogarty, W. M. (1995).

The alkaline amylase of the alkalophilic Bacillus sp. IMD 370. Enzyme

and Microbial Technology, 17, 570–573.

Najafi, M.F., Deobagkar, D., Deobagkar, D. (2005). Purification and

characterization of an extracellular α-amylase from Bacillus subtilis

AX20. Protein Expression and Purification, 41, 349–354.

Nakano, M.M. and Zuber, P. (1998). Anaerobic growth of a “strict

aerobe” (Bacillus subtilis). Annu. Rev. Microbiol. 52, 165–90.

Nielsen, J.E. & Borchert, T.V. (2000). Protein engineering of bacterial α-

amylase. Biochem.Biophys.Acta, 1543, 253-274.

Pandey, A., Nigam, P., Soccol, C. R., Soccol, V. T., Sing, D., & Mohan,

R. (2000). Advances in microbial amylases. Biotechnology and Applied

Biochemistry, 31, 135–152.

Priest, F.G. (1993). Systematics and ecology of Bacillus. 16, 3–16.

Rao, M. B., Tanksale, A. M., Gathe, M. S., & Deshpande, V. V. (1998).

Molecular and biotechnological aspects of microbial proteases.

Microbiology and Molecular Biology Reviews, 62, 597–635.

112

Romanos, M.A. (1995). Advantages in the use of Pichia pastoris for high-

level gene expression. Current Opinion in Biotechnology, 6, 527–533.

Saxena, R.K., Dutt, K., Ágarwal, L., Nayyar, P. (2007). A highly

thermostable and alkaline amylase from a Bacillus sp. PN5. Bioresource

Technology, 98, 260–265.

Sears, I.B., Oconnor, J., Rossanese, O.W. e Glick, B.S. (1998) A

versatile set of vectors for constitutive and regulated gene expression in

Pichia pastoris. Yeast, 14, 783–790.

Shewale, S.D. & Pandit, A.B. (2007). Hydrolysis of soluble starch using

Bacillus licheniformis α-amylase immobilized on superporous

CELBEADS. Carbohydrate Research, 342, 997–1008.

Sidhu, G. S., Sharma, P., Chakrabarti, T., & Gupta, J. K. (1997). Strain

improvement for the production of a thermostable a-amylase. Enzyme

and Microbial Technology, 21, 525–530.

Sreekrishna, K., Nelles, L., Pontenz, R., Cruze, J., Mazzaferro, P.,

Fish, W., Fuke, M., Holden, K., Phelps, D. (1989). High-level

expression purification and characterization of recombinant human

tumor necrosis factor synthetized in the methylotrophic yeast Pichia

pastoris. Biochemistry, 28, 4, 117–4.125.

Suhy, T. E., Harris JR., R. P. (1998). Application of polymer specific

enzymes to clean up drill-in fluids SPE 51094 In: SPE Eastern Regional

Meeting, Pittsburgh.

113

Uitdehaag, J.C.M., Mosi, R., Kalk, K.H., van der Veen, B.A.,

Dijkhuizen, L., Withers, S.G., Dijkstra, B.W., (1999). X-ray

structures along the reaction pathway of cyclodextrin

glycosyltransferaseelucidate catalysis in the α-amylase family. Nature

Struct. Biol. 6, 432–436.

Windish, W. W., & Mhatre, N. S. (1965). Microbial amylases. In W. U.

Wayne (Ed.). Advances in applied microbiology (Vol. 7, pp. 273–304).

New York: Academic Press.

Yang, S.J., Lee, H.S., Park, C.S., Kim ,Y.R., Moon, T.W., Park, K.H.

(2004). Enzymatic Analysis of an Amylolytic Enzyme from the

Hyperthermophilic Archaeon Pyrococcus furiosus Reveals Its Novel

Catalytic Properties as both an α-Amylase and a Cyclodextrin-

Hydrolyzing Enzyme. Applied and Enviro. Microbiol. 70 10, 5988–

5995.

114

8-Anexos

Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
 
Milhares de Livros para Download:
 
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas

Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo
 
 