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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
INSTITUTO DE CIÊNCIAS DO MAR
MESTRADO EM CIÊNCIAS MARINHAS TROPICAIS
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VANESSA LÚCIA RODRIGUES NOGUEIRA
FORTALEZA - CE
2005
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
INSTITUTO DE CIÊNCIAS DO MAR
MESTRADO EM CIÊNCIAS MARINHAS TROPICAIS
3$3(/'$63527(Ë1$6'$7,17$/,%(5$'$3(/$
/(60$'20$5$3/<6,$'$&7</20(/$5$1*126
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Dissertação apresentada ao Mestrado em Ciências
Marinhas Tropicais do Instituto de Ciências do Mar
da Universidade Federal do Ceará, como requisito
parcial à obtenção do título de MESTRE.
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ii
Esta dissertação foi submetida à coordenação do Curso de Pós-Graduação em
Ciências Marinhas Tropicais como parte dos requisitos necessários para a obtenção do
Grau de Mestre em Ciências Marinhas, outorgado pela Universidade Federal do Ceará.
A transcrição de qualquer trecho desta dissertação é permitida, desde que
seja feita de conformidade com as normas da ética científica.
_________________________________________________
Vanessa Lúcia Rodrigues Nogueira
Dissertação Aprovada em:
_________________________________________________
Dra. Vânia Maria Maciel Melo
Depto. de Biologia
Universidade Federal do Ceará
2ULHQWDGRUD
____________________________ _____________________________
Dra. Valdirene Moreira Gomes
Centro de Biociências e Biotecnologia
Universidade Estadual do Norte Fluminense-RJ
([DPLQDGRUD
Dra. Ana de Fátima F. U. de Carvalho
Depto. de Biologia
Universidade Federal do Ceará
([DPLQDGRUD
iv
PLQKDIDPtOLD
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TXHVHPSUHHVWLYHUDPGRPHXODGRPH
DSRLDQGRHWRUFHQGRSRUPLP
'HGLFRFRPFDULQKR
$*5$'(&,0(1726
Em especial, à minha orientadora, Profa. Dra. Vânia Maria Maciel Melo, pela orientação
criteriosa, por seu entusiasmo, atenção, participação, paciência, carinho e amizade. E,
principalmente, por me ensinar a fazer tudo com amor e dedicação.
À Profa. Dra. Ana de Fátima Fontenele Urano de Carvalho, por estar sempre pronta a me
ajudar e orientar. Pelo carinho e amizade e por aceitar participar da avaliação de minha
dissertação.
À Profa.
Suzana Cláudia Martins Silveira, pelo carinho, amizade e apoio em todos os
momentos de minha graduação e realização desse trabalho.
À Profa. Dra. Valdirene Moreira Gomes, da UENF, por ter me recebido com tanto carinho
em sua casa e dedicação na realização dos trabalhos desenvolvidos no seu laboratório e,
sobretudo, pela amizade.
À Profa. Dra. Maura Cunha, da UENF, por sua dedicação e bom humor em me ajudar a
realizar os ensaios de microscopia.
Aos Prof. Dr. José Tadeu Abreu de Oliveira e Dra. Ilka Maria Vasconcelos, do
Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular da UFC, por estarem sempre prontos a
me ajudar e a disponibilizar seus laboratórios para realização de alguns experimentos.
Ao Dr. Gandhi Rádis-Baptista pela colaboração das análises de eletroforese bidimensional.
À Profa. Dra. Letícia Veras Costa Lotufo, do Departamento de Farmacologia da UFC, pelo
auxílio e disponibilidade nos experimentos de citotoxicidade.
v
vi
À Profa. Dra. Helena Mattews Cascon, do Departamento de Biologia da UFC, por sempre
estar disposta a me ajudar com algumas dúvidas ao longo do trabalho e pelas viagens de
campo, para coletar amostras e, por ceder seus aquários para manutenção dos animais.
Aos professores do Departamento de Biologia, que contribuíram para minha formação
acadêmico-científica.
Aos professores do Instituto de Ciências do Mar, pelos ensinamentos na área de Ciências
Marinhas, que despertaram em mim uma grande paixão.
À Fundação Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Científico e Tecnológico (FUNCAP)
pela concessão da bolsa de pós-graduação e auxílio à pesquisa.
Aos amigos do laboratório de Microbiologia, Raphaela, Lidianne, Fernanda, Denise,
Natasha, Sarinha, Gardênia, Samantha, Viviane, Durcileide, Simone, Tatiane, Alysson,
Caio, Júlio, Genilton, e em especial a Tallitinha, que de alguma forma me ajudaram muito,
pelo apoio e pela convivência agradável me dando forças durante todo meu trabalho.
Aos Colegas do laboratório de Fisiologia Animal, André, Nara, Jérsia, e em especial ao
Davi, sempre dispostos a me ajudar nos experimentos com os animais.
Ao amigo Luis Ernesto que sempre me ajudou nas minhas dúvidas, apoio e nos
experimentos com os exemplares da lesma e, por sua extrema contribuição para realização
desse trabalho.
À Izabela, uma amiga que fiz na UENF quando estive lá e que disponibilizou todo seu
tempo para me acompanhar nos experimentos realizados, com imensa boa vontade e
simpatia.
Aos meus amigos do curso de biologia que sempre farão parte da minha vida, Lú, Raquel,
Max, Beto, Daniel, Danise e Lorena pelos momentos de alegria e apoio durante esses anos.
vii
Aos Colegas do mestrado Rossana, Taty, Odete, Aline, Ítalo, Gardenny, Cris, Renata,
Renata Stock, Manuel, etc. que durante o curso foram sempre amigos e prestativos, e que
de alguma forma tornaram o dia-a-dia menos árduo.
À Rivalda que sempre me deu apoio e amizade todos esses anos e sempre cuida de todos do
laboratório com alegria e carinho.
Especialmente aos meus pais, Leonardo e Vera, que são o meu amparo, porto seguro,
durante todos os anos da minha vida. Por terem feito de tudo para que eu trilhasse pelo
melhor caminho. Aos meus irmãos, Leonardo e Valéria que sempre torcem por mim e pela
nossa grande amizade. À minha sogra Bibia e cunhada, Maysinha, pela torcida e carinho
sempre.
A Wamberg, meu amor e grande amigo, que sempre esteve do meu lado nos momentos
difíceis, com carinho e alegria, e me ensinou a persistir nos meus sonhos. Obrigada por
existir na minha vida e que sem você nada disso seria possível.
$ 'HXVTXHPHJXLDHPWRGRVRVPHXVSDVVRVHD(OHHQWUHJRPLQKDYLGD.
viii
Este trabalho foi realizado graças ao auxílio das seguintes instituições:
Fundação Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Científico e Tecnológico do Estado do
Ceará (FUNCAP)
Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)
Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular, Centro de Ciências, Universidade
Federal do Ceará, Fortaleza, Ce.
Laboratório de Fisiologia e Bioquímica de Microrganismos da Universidade Estadual do
Norte Fluminense (UENF), Campos dos Goytacazes, RJ.
Laboratório de Biologia Celular e Tecidual, Centro de Biociências e Biotecnologia,
Universidade Estadual do Norte Fluminense, Campos dos Goytacazes, RJ.
Laboratório de Microbiologia e Imunologia do Departamento de Biologia da Universidade
Federal do Ceará, onde o trabalho foi realizado.
ix
Ë1',&(
LISTA DE FIGURAS.......................................................................................................... xii
LISTA DE TABELAS..........................................................................................................xv
ABREVIATURAS...............................................................................................................xvi
RESUMO........................................................................................................................... xvii
ABSTRACT.........................................................................................................................xix
1. INTRODUÇÃO..................................................................................................................2
1.1. Considerações Gerais...................................................................................................2
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ...........................................................................................3
2.1. O Ambiente Marinho...................................................................................................3
2.2. Estratégias de Defesa em Invertebrados Marinhos......................................................4
2.3. Filo Mollusca: Características Gerais..........................................................................6
2.4. Mecanismos de Defesa de Lesmas-do-mar..................................................................9
2.5. Tinta Púrpura .............................................................................................................11
2.6. $SO\VLDGDFW\ORPHOD ...................................................................................................15
2.7. Proteínas Isoladas de Lesmas-do-Mar.......................................................................16
3. OBJETIVOS.....................................................................................................................18
3.1. Objetivos Específicos.................................................................................................18
4. MATERIAIS.....................................................................................................................19
4.1.Materiais Biológicos...................................................................................................19
4.1.1. $SO\VLDGDFW\ORPHOD............................................................................................19
4.1.2. Microrganismos..................................................................................................19
4.1.3. Coelho, Camundongos e Ratos...........................................................................19
4.2. Reagentes e Outros Materiais ....................................................................................19
4.2.1. Proteínas..............................................................................................................19
4.2.2. Meios de Cultura.................................................................................................20
4.2.3. Matrizes para Cromatografias.............................................................................20
4.2.4. Reagentes para Eletroforese................................................................................20
4.2.5. Materiais para “Dot” e “Western-blotting” ........................................................20
5. METODOLOGIA.............................................................................................................21
5.1. Coleta e Tratamento da Tinta.....................................................................................21
x
5.2. Eletroforese Bi-Dimensional da Tinta.......................................................................21
5.3. Determinação de Proteína..........................................................................................22
5.4. Purificação da Dactylomelina-P ................................................................................22
5.4.1. Precipitação da Tinta com Sulfato de Amônio...................................................22
5.4.2. Cromatografia de Troca Iônica...........................................................................22
5.4.3. Cromatografia de Interação Hidrofóbica............................................................23
5.5. Caracterização da Dactylomelina-P...........................................................................23
5.5.1. Estimativa da Massa Molecular por PAGE-SDS ...............................................23
5.5.2. Determinação do Ponto Isoelétrico.....................................................................24
5.5.3. Composição de Aminoácidos .............................................................................24
5.5.4. Determinação de Carboidratos............................................................................25
5.5.5. Estabilidade Térmica ..........................................................................................25
5.5.6. Influência do pH na Atividade da Proteína.........................................................25
5.5.7. Resistência a Protease.........................................................................................25
5.6. Atividades Biológicas da Tinta e da Dactylomelina-P..............................................26
5.6.1. Atividade Antibacteriana em Meio Sólido .........................................................26
5.6.2. Determinação da Concentração Inibitória Mínima e Mecanismo de Ação........26
5.6.3. Atividade Antifúngica em Meio Sólido..............................................................27
5.6.4. Atividade Antifúngica em Meio Líquido............................................................28
5.6.5. Extração dos Peptídeos da Tinta.........................................................................29
5.6.6. Atividade Hemaglutinante..................................................................................29
5.6.7. Atividade Anticoagulante...................................................................................29
5.6.8. Determinação da Atividade E-1,3 Glucanásica ..................................................30
5.6.9. Análise de Atividade Quitinásica .......................................................................31
5.6.10. Detecção de Atividade Quitinásica Inespecífica em SDS-PAGE ....................31
5.7. Avaliação do Potencial Tóxico da Dactylomelina-P.................................................32
5.7.1. Atividade Hemolítica..........................................................................................32
5.7.2. Atividade Citotóxica...........................................................................................32
5.7.3. Atividade Tóxica em Camundongos...................................................................33
5.8. Localização da Dactylomelina-P na Lesma $ SO\VLDGDFW\ORPHOD .............................33
5.8.1. Produção de Anticorpos Policlonais...................................................................33
xi
5.8.2. Determinação dos Títulos dos Soros Anti-Dactylomelina-P..............................34
5.8.3. Estudos de Imunolocalização..............................................................................34
5.9. Interação da Dactylomelina-P com a bactéria 6WDSK\ORFRFFXV DXUHXV por
Microscopia Eletrônica de Transmissão......................................................................37
6. RESULTADOS ................................................................................................................38
6.1. Composição de Proteínas da Tinta de $. GDFW\ORPHOD...............................................38
6.2. Purificação da Dactylomelina-P ................................................................................39
6.3. Caracterização da Dactylomelina-P...........................................................................46
6.3.1. Estimativa da Massa Molecular..........................................................................46
6.3.2. Ponto Isoelétrico.................................................................................................47
6.3.3. Composição de Aminoácidos .............................................................................47
6.3.4. Determinação de Carboidratos............................................................................49
6.3.5. Estabilidade Térmica ..........................................................................................49
6.3.6. Influência do pH na Atividade da Dactylomelina-P...........................................51
6.3.7. Resistência a Protease.........................................................................................51
6.4. Atividades Biológicas da Dactylomelina-P...............................................................52
6.4.1. Espectro de Ação................................................................................................52
6.4.2. Concentração Inibitória Mínima e Concentração Bactericida Mínima..............57
6.4.3 Interação da dactylomelina-P com a bactéria 6W. DXUHXV .....................................57
6.4.4. Atividade Hemaglutinante..................................................................................59
6.4.5. Atividade Anticoagulante...................................................................................59
6.4. 6. Atividades Enzimáticas......................................................................................59
6.5. Potencial Tóxico da Dactylomelina-P .......................................................................59
6.6. Imunolocalização da Dactylomelina-P......................................................................60
6.6.1. Produção de Anticorpos Policlonais...................................................................60
6.6.2. Estudos de Imunolocalização da Dactylomelina-P.............................................60
6.6.3. Localização da Dactylomelina-P na Glândula de Tinta......................................61
7. DISCUSSÃO.....................................................................................................................64
8. CONCLUSÃO..................................................................................................................75
9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .............................................................................76
xii
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 – Exemplos de moluscos opistobrânquios das ordens Nudibranchia (A:
&KURPRGRULV FDYDH;B: &KURPRGRULV HOLVDEHWKLQD;C: +H[DEUDQFKXV VDQJXLQHXV)e
Anaspidea (D: %XUVDWHOODOHDFKLL;E: $SO\VLDGDFW\ORPHOD;F: $SO\VLDRFXOLIHUD).. ...............7
FIGURA 2 – Defesa das lesmas-do-mar através da ontogenia, mostrada em cada estágio de
vida: ovos, veligers, fase de metamorfose, juvenis e adultos (JOHNSON, 1999).. ...........120
FIGURA 3 – A: Localização da glândula de tinta da lesma-do-mar $SO\VLD GDFW\ORPHOD.
B: Desenho esquemático, segundo Johnson HWDO., 1999 ....................................................152
FIGURA 4 – $SO\VLD GDFW\ORPHOD encontrada na praia de Fleixeiras, Trari, Ceará no
momento da liberação da tinta..............................................................................................15
FIGURA 5 – Eletroforese bidimensional em gel de poliacrilamida da tinta (20µgP) de $.
GDFW\ORPHOD. A focalização isolelétrica da amostra foi feita em membrana de pHs 4,0 a 7,0.
Marcadores de massa molecular: 250 kDa, 160 kDa, 105 kDa, 75 kDa, 50 kDa, 30 kDa, 25
kDa, 5 kDa e 10kD................................................................................................................38
FIGURA 6 – Antibiograma das frações protéicas e da tinta $. GD FW\ORPHOD contra a bactéria
6W. DXUHXV. Tb: tinta bruta; Td: tinta dialisada; Frações obtidas por fracionamento da tinta
com sulfato de amônio: F
0/30
,F
30/60
e F
60/90
. Todos os discos receberam uma alíquota de 30
µl...........................................................................................................................................40
FIGURA 7 – Cromatografia de troca iônica em coluna de DE52-Metilcelulose da F
30/60%
obtida pela precipitação da tinta $. GDFW\ORPHOD com sulfato de amônio.............................41
FIGURA 8 – Cromatografia de interação hidrofóbica em coluna de Phenyl-Sepharose do
pico DEII obtido da cromatografia de troca iônica...............................................................42
FIGURA 9 – Atividade antibiótica dos picos obtidos da cromatografia de troca iônica
(DEII), interação hidrofóbica (PHSII), da F3
0/60 %
e da tinta (Tp) do molusco $. GDFW\ORPHOD
contra bactéria 6W. DXUHXV. A: antibiótico controle: Vancomicina........................................44
FIGURA 10 – Esquema de purificação adotado para o isolamento da dactylomelina-P, uma
proteína com atividade antibacteriana presente na tinta do molusco $SO\VLD
GDFW\ORPHOD.......................................................................................................................... 45
FIGURA 11 – Eletroforese em gel de poliacrilamida na presença de SDS da fração protéica
e picos das cromatografias obtidos durante a purificação da dactylomelina-P. Raia 1 –
xiii
Marcador molecular; Raia 2 –F
30/60%
; Raia 3 – Pico II da cromatografia de DEAE Celulose
e Raia 4 – Pico II da cromatografia de interação hidrofóbica em Phenyl Sepharose.
Amostras: 20 µg/poço...........................................................................................................46
FIGURA 12 – Ponto isoelétrico (pI 5,0) e massa molecular da dactylomelina-P (60 kDa)
determinados em gel de poliacrilamida por eletroforese bidimensional. .............................47
FIGURA 13 – Géis de eletroforeses em poliacrilamida da dactylomelina-P após coloração
com Coomassie brilliant blue (A) e Ácido periódico de Schiff (B). Raia 1 - controle
positivo, Peroxidase; Raia 2 - Dactylomelina-P. Amostras: 1mgP/ml.................................49
FIGURA 14 – Ação do calor na atividade antibacteriana da dactylomelina-P. C: disco com
30 µl de dactylomelina-3 JPO Qão aquecida; e discos com 30 µl de dactylomelina-P
JPODTXHFLGDDHºC por diferentes períodos de tempo......................50
FIGURA 15 – Influência do pH na atividade da dactylomelina-P contra 6W. DXUHXV. C: disco
com 30 µl de dactylomelina-P (500µg/ml) em pH 7,0; discos com 30 µl de dactylomelina-P
(500µg/ml) previamente tamponada em diferentes pHs: 2,0 a 12,0.....................................51
FIGURA 16 – Ação da tinta bruta e da dactylomelina-P sobre o crescimento vegetativo do
fungo 0XFRU sp. A: tinta bruta (30 µl); B: dactylomelina-P (1 mg/ml)................................53
FIGURA 17 – Fotomicrografias de culturas do fungo Colletotricum lindemuthianum
desenvolvidas a partir de conídios cultivados em meio contendo dactylomelina-P ou tinta
bruta de A. dactylomela. (A) Controle, conídios incubados em Caldo Sabouraund; (B)
Conídios incubados com a tinta bruta de A. dactylomela e (C) Conídios incubados com a
dactylomelina-P. Esfregaços corados com lactofenol azul de algodão. Aumento: 400
x.............................................................................................................................................56
FIGURA 18 – Determinação da concentração inibitória mínima (CIM) da dactylomelina-P
para St. aureus pelo método de difusão em placa. Discos com concentrações de
dactylomelina-P variando de 4-500 µg/ml............................................................................57
FIGURA 19 – Fotomicrografias de células de Staphylococcus aureus cultivadas em meio
sem a proteína dactylomelina-P (A) e em meio contendo 500 µg/ml de dactylomelina-P
(B). Aumento 85.000 x .. .....................................................................................................58
FIGURA 20 – Anatomia interna da lesma Aplysia dactylomela, destacando dentre outros a
localização do papo, hepatopâncreas, glândula de albúmem e glândula opalina. ................61
xiv
FIGURA 21 – Western blot de extratos de órgãos e da hemolinfa da lesma A. dactylomela.
A: Membrana de PVDF revelando as proteínas reconhecidas pelo anticorpo anti-
dactylomelina-P. Raia 1: dactylomelina-P; Raia 2: hemolinfa; Raia 3: glândula opalina;
Raia 4: glândula digestiva; Raia 5: coração; Raia 6: glândula de tinta; Raia 7: glândula de
albúmen e Raia 8: Papo. B: Eletroforese em gel de poliacrilamida das amostras para
comparação, corada com Coomassie Brilliant Blue ............................................................62
FIGURA 22 – Imunohistoquímica da glândula de tinta da lesma A. dactylomela revelada
pelo anticorpo anti-dactylomelina-P. A, B e C: Cortes observados sem coloração (200, 400,
800x); D: Corte corado com azul de toluidina (400x) E: Corte controle, preparado com soro
pré-imune, observado sem coloração (200x) e F: Corte controle, preparado com soro pré-
imune, corado com azul de toluidina (400x). As setas apontam os locais da dactylomelina-P
na glândula............................................................................................................................63
xv
/,67$'(7$%(/$6
TABELA 1 – Teor de proteínas e atividade antibacteriana das frações protéicas obtidas a
partir da precipitação da tinta de $. GDFW\ORPHODcom sulfato de amônio ............................39
TABELA 2 – Purificação da proteína com atividade antibacteriana da tinta de $SO\VLD
GDFW\ORPHOD...........................................................................................................................43
TABELA 3 – Composição de aminoácidos da dactylomelina-P. Os valores estão expressos
em mg para cada 10 g de proteína liofilizada.......................................................................48
TABELA 4 – Espectro de atividade antibacteriana da tinta do molusco $. GDFW\ORPHOD e da
dactylomelina-P ....................................................................................................................52
TABELA 5 – Atividade antifúngica em meio sólido da tinta e da dactylomelina-P............54
TABELA 6 – Atividade antifúngica em meio líquido da tinta bruta e da dactylomelina-P. 1:
Inibição da germinação de esporos; 2: Inibição no desenvolvimento de hifas s .................55
NOGUEIRA, V. L. R. 2005 Papel de Proteínas Presentes na Tinta...
xvi
$%5(9,$785$6
%6$
Albumina sérica bovina
&%0
Concentração Bactericida Mínima
&,0
Concentração Inibitória Mínima
'062
Dimetilsulfóxido
'77
Ditiotrietol
N'D
kilo Dalton
0
Molar
P$
Miliamperagem
077
3-(4,5-dimetil-2-tiazol)-2,5-difenil-brometo de tetrazolium
23'
Orto Fenileno de Amina
3$*(
Eletroforese em gel de Poliacrilamida
3%6
Salina com Tampão Fosfato de Sódio
S+
Potencial hidrogeniônico
S,
Ponto isoelétrico
39')
Fluoreto de polivinidileno
5I
Mobilidade Relativa
6'6
Dodecil sulfato de sódio
7(0('
N,’ N,’ N,’ N,’ tetrametiletilenodiamina
7ULV
Tris (hidroximetil) aminometano
8)&
Unidades Formadoras de Colônias
89
Ultravioleta
NOGUEIRA, V. L. R. 2005 Papel de Proteínas Presentes na Tinta...
xvii
5(6802
O gastrópode marinho $SO\VLD GDFW\ORPHOD é conhecido por liberar uma tinta
púrpura sempre que é importunado. Como não possui nenhuma estrutura externa de
proteção, acredita-se que essa secreção, rica em substâncias biologicamente ativas,
participe da defesa química do animal. A tinta é composta de pigmentos, proteínas e
substâncias de baixa massa molecular. Os pigmentos da tinta são originados de algas
vermelhas, mas quanto às proteínas, pouco é conhecido sobre a sua origem, processamento,
local de armazenamento e função no animal. Este trabalho descreve pela primeira vez a
composição protéica da tinta e apresenta algumas características físico-químicas e
biológicas da dactylomelina-P, uma proteína antibacteriana presente na tinta dessa lesma,
além de trazer informações acerca da localização desta proteína na glândula de tinta. A tinta
foi obtida a partir de espécimes encontrados na praia de Fleixeiras, Ce. A composição de
proteínas da tinta foi determinada por eletroforese bidimensional e a purificação da
dactylomelina-P foi feita através de cromatografias de troca iônica e interação hidrofóbica.
Dactylomelina-P foi analisada quanto à massa molecular, ponto isoelétrico, composição de
aminoácidos, presença de carboidratos, estabilidade térmica, resistência ao pH e a
proteases. Várias atividades biológicas foram testadas com a tinta e com a dactylomelina-P,
incluindo atividades antimicrobianas, enzimáticas, hemaglutinante, anticoagulante,
hemolítica, citotóxica e tóxica. Os ensaios de localização da proteína foram realizados em
diferentes tecidos da lesma por ZHVWHUQ EORW na glândula de tinta por imunohistoquímica e
a interação com a bactéria 6WDSK\ORFRFFXVDXUHXV foi feita por imunocitoquímica. A tinta de
$. GDFW\ORPHOD contém mais de 40 proteínas/ peptídeos, com massas abaixo de 70 kDa e pIs
na faixa ácida. A proteína mais abundante na tinta é a dactylomelina-P, que é uma molécula
monomérica, de 59,8 kDa, pI 5,0, que possui alto teor de metionina e menos de 1% de
carboidratos, é desnaturada a 60 ºC por 10 minutos e resiste a pHs entre 3-12.
Dactylomelina-P mostra um amplo espectro de ação antibacteriano, mas não antifúngico,
ao contrário da tinta que possui um fator com esta atividade. É particularmente eficiente
contra bactérias marinhas, podendo ser bactericida (4,0µg/ml) ou bacteriostática
(0,2µg/ml), dependendo da concentração. Dactylomelina-P aglutinou eritrócitos de coelho,
ratos e camundongos, não apresentou atividade anticoagulante, hemolítica e nem citotóxica.
NOGUEIRA, V. L. R. 2005 Papel de Proteínas Presentes na Tinta...
xviii
ADL
50
para camundongos ficou entre 60-100 mg/Kg, sendo considerada moderadamente
tóxica. Dactylomelina-P só foi encontrada na glândula de tinta, localizando-se
preferencialmente nas células das vesículas produtoras. Ensaios de microscopia eletrônica
de transmissão revelaram que a dactylomelina atravessa a parede celular da bactéria 6.
DXUHXV e, interage principalmente com a membrana citoplasmática, provavelmente
interferindo no metabolismo, ao invés de causar danos à célula.
NOGUEIRA, V. L. R. 2005 Papel de Proteínas Presentes na Tinta...
xix
$%675$&7
The sea hare $SO\VLD GDFW\ORPHOD is known by discharging a purple ink when
disturbed. As it doesn't show any external structure of protection, it is believed that this
secretion, rich in bioactive substances, participates in the chemical defense against
pathogens and/or predators. The ink is constituted mainly by pigments, proteins and low
molecular mass substances. The pigments are originated from red algae, nevertheless, there
is lack of information about the origin, processing, storage and function of the ink proteins.
This work describes the protein composition of the ink and present some physiochemical
and biological characteristics of the dactylomelin-P, an antibacterial protein from the ink
besides information concerning the location of this protein in the purple gland. The ink was
obtained from specimens collected at Fleixeiras beach, Ce. The protein composition of the
ink was studied by bi-dimensional electrophoresis. The purification of dactylomelin-P
consisted basically in ion exchange and hydrophobic interaction chromatography.
Dactylomelina-P was analyzed as to molecular mass, isoeletric point, amino acid
composition, carbohydrates, heat stability, pH and proteinase resistance. Several biological
activities were tested with the ink and with dactylomelina-P, including antimicrobial,
enzymatic, haemagglutinating, anticoagulant, hemolytic, cytotoxic and toxic activities. The
immunolocalization assays of dactylomelina-P were carried out in different sea hare tissues
by western blot and immunohistochemistry and the interaction with 6WDSK\ORFRFFXV DXU HXV
was investigated by immunocytochemistry. The ink of $ GDFW\ORPHOD contains more than
40 proteins/peptides, with molecular masses below 70 kDa and acid pIs. The most abundant
protein in the ink is the dactylomelin-P, a monomeric protein with 59,8 kDa, pI 5,0, high
methionin content, and less than 1% carbohydrates. It is denatured at 60 ºC for 10 minutes
and it resists to pH range of 3-12. Dactylomelin-P shows a wide antibacterial action
spectrum, but no antifungal, unlike the ink that possesses some factor with this activity. It is
particularly efficient against sea bacteria, can be bactericidal (4,0µg/ml) or bacteriostatic
(0,2µg/ml), depending on the concentration. Dactylomelin-P agglutinated rabbit, mice and
rat erythrocytes, but it did not show anticoagulating, hemolytic and cytotoxic activities. The
LD
50
for mice was 60-100 mg/Kg, being considered moderately toxic. Dactylomelin-P was
only found in the ink gland, being located preferentially in the cells of the producing
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xx
vesicles. The electronic transmission microscopy revealed that the dactylomelina-P crosses
the cell wall of 6. DXUHXV and interacts mainly with the plasmatic membrane, probably
interfering in the metabolism of the bacterium, instead of causing mechanic damage to the
cell.
NOGUEIRA, V. L. R. 2005 Papel de Proteínas Presentes na Tinta...
2
,1752'8d2
1.1. Considerações Gerais
O Filo Mollusca abriga espécimes de importância econômica como as ostras,
lulas, polvos, mariscos bivalves produtores de pérola e outros menos conhecidos ou até
temidos, como as lesmas-do-mar (SAKAMOTO HW DO., 1998). O medo das lesmas vem do
fato de algumas delas liberarem uma tinta de cor púrpura quando importunadas. Essa tinta é
liberada pela glândula de Tinta, que fica na cavidade paleal do animal. Quando ocorre o
estímulo, a tinta é rapidamente eliminada e, como é muito viscosa, leva alguns segundos
para dissipar-se na água. Essa tinta é rica em substâncias bioativas que, provavelmente,
participam na defesa do animal (ÁVILA, 1995). As lesmas não possuem estruturas externas
de proteção e, além disso, possuem nadadeiras, parapódios, originadas de projeções laterais
amplas e corpo freqüentemente colorido, tornando-se muito visíveis a potenciais
predadores (NOLEN HW DO., 1995). Todavia, esses animais, aparentemente desprotegidos e
apetitosos possuem poucos predadores, o que desperta o interesse em se desvendar suas
estratégias de defesa. Sabe-se que o arsenal de defesa desses animais inclui substâncias
adquiridas a partir da dieta algal e outras de natureza constitutivas presentes em várias
secreções, incluindo a tinta (MACCOLL HW DO., 1990). Embora existam alguns trabalhos
descrevendo o isolamento e a caracterização de proteínas a partir da tinta de algumas
poucas espécies de lesmas, não se conhece a origem dessas proteínas, sua forma de
armazenamento na glândula e, principalmente, sua função. Os oceanos ainda guardam
muitos segredos a serem descobertos e um deles diz respeito às substâncias que os
organismos marinhos produzem ou armazenam adaptativamente para serem utilizadas em
processos de comunicação, defesa, predação, competição e/ou reprodução. Estudos dessa
natureza são importantes para a compreensão da evolução dos mecanismos de defesa dos
animais e podem propiciar a descoberta de novas substâncias com potencial biotecnológico
ou terapêutico (FREITAS & MENDES, 1986).
NOGUEIRA, V. L. R. 2005 Papel de Proteínas Presentes na Tinta...
3
5(9,62%,%/,2*5È),&$
2.1. O Ambiente Marinho
O ecossistema marinho detém a maior parte dos organismos primitivos, como as
algas, as esponjas os corais e as anêmonas. Desprovidos de sistema nervoso desenvolvido
ou de órgãos especializados na captação de luz e do som, esses seres restringem-se à forma
de comunicação mais primitiva, àquela que se efetua por mediadores químicos. Essa forma
de comunicação é responsável pela geração de uma grande diversidade de moléculas neste
ecossistema. Os diálogos químicos envolvem interações intra e interespecíficas. Nas
interações intraespecíficas participam os feromônios sexuais, territoriais, de alarme, de
pista e de agrupamento, enquanto nas interações interespecíficas participam os
cairomônios, que são substâncias que beneficiam o organismo que as recebe e os
alomônios, que conferem vantagens aos organismos produtores. Essas interações, portanto,
geram um fluxo contínuo de moléculas das mais diferentes naturezas e complexidades
(SOLÉ-CAVA & KELECOM, 1988). Muitas dessas substâncias já mostraram ser de
grande valor terapêutico (CARTÉ, 1996). Dessa forma, o ambiente marinho é uma
excepcional reserva de produtos naturais bioativos, que provavelmente exibem fatores
estruturais não encontrados nos produtos naturais terrestres (IRELAND HWDO., 1988).
Apesar do ambiente marinho ser muito mais diversificado que o terrestre, pelas
dificuldades de coleta de organismos, ainda é pouco conhecido. No entanto, somente entre
1977 e 1987, 2500 novos produtos naturais marinhos foram reportados na literatura
(IRELAND HW DO., 1993). Em 1992, por exemplo, mais de 500 novos metabólitos bioativos
foram isolados desses organismos, relatados em mais de 200 publicações. Nos anos de
1998 a 2000, 106 compostos marinhos derivados de diversos organismos, como animais,
algas, fungos e bactérias se encontravam em fase pré-clinica (MAYER & HAMANN,
2005).
Dentre os invertebrados marinhos, as esponjas, os corais, os moluscos e, em
menor escala, os equinodermas, os briozoários, os corais moles e os tunicados são as fontes
principais de produtos naturais de origem marinha. Embora haja um surpreendente número
de produtos naturais isolados de invertebrados marinhos, as inferências biológicas têm sido
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tímidas e cuidadosas, uma vez que estas substâncias, em muitos casos, são oriundas de
microrganismos associados a esses invertebrados ou obtidas da dieta alimentar, restringindo
a compreensão da química do grupo (PEREIRA & SOARES, 2002).
2.2. Estratégias de Defesa em Invertebrados Marinhos
Todos os organismos possuem mecanismos de defesa contra microrganismos.
Esses mecanismos constituem a imunidade natural. Os mecanismos de defesa
especializados que constituem a imunidade adquirida só estão presentes nos vertebrados. O
sistema de defesa dos invertebrados difere grandemente desses, sendo a principal
característica a incapacidade de produzir anticorpos. Esse fato não os torna menos
indefesos ou incapazes de se defender de seus agressores. Os invertebrados primitivos que
povoam nossos oceanos são registros vivos de que mecanismos de defesa, às vezes
rudimentares, foram bastante eficazes na manutenção desses filos ao longo da evolução
(ROIT, 1989).
Nos invertebrados, várias células respondem aos microrganismos, que cercam
esses agentes infecciosos e os destroem. Essas células se parecem com as células
fagocitárias e foram denominadas de amebócitos fagocíticos nos acelomados, hemócitos
nos moluscos e artrópodes, celomócitos nos anelídeos e leucócitos sangüíneos nos
tunicados. Além disso, os invertebrados produzem aglutininas, que se ligam a carboidratos
presentes nas paredes celulares dos microrganismos facilitando a fagocitose, e numerosos
fatores líticos e antimicrobianos como as lisozimas. Muitos estudos têm demonstrado que
os invertebrados são capazes de rejeitar transplantes de tecidos estranhos ou
alotransplantes. Essas reações de rejeição são mediadas principalmente por células
semelhantes às células fagocitárias. Elas diferem das que ocorrem nos vertebrados porque a
memória para o tecido transplantado não é gerada ou é difícil de ser demonstrada. No
entanto, tais resultados indicam que até os invertebrados devem expressar moléculas de
superfície que distinguem o próprio do estranho, como fazem os vertebrados (ABBAS &
LITCHTMAN, 2005).
Para alguns invertebrados os únicos mecanismos de proteção são aqueles
desempenhados pelas barreiras morfológicas e comportamentais. São exemplos de barreiras
NOGUEIRA, V. L. R. 2005 Papel de Proteínas Presentes na Tinta...
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morfológicas os esqueletos de calcário dos corais, os espinhos dos ouriços-do-mar, as
conchas de carbonato de cálcio de alguns moluscos e as espículas, finas como agulhas, das
esponjas. Como exemplos de barreiras comportamentais têm-se a camuflagem, a aquisição
de hábitos noturnos ou a colonização de zonas de difícil acesso, como pequenos buracos ou
ranhuras. Para muitos organismos, particularmente aqueles desprovidos de proteção
externa, as principais estratégias de defesa envolvem a acumulação ou produção de
secreções ricas em substâncias bioativas (SOLÉ-CAVA & KELECOM, 1988).
Um exemplo típico de defesa química é o de alguns tunicados que acumulam
vanádio, um elemento químico bastante tóxico e raro na água do mar, além de produzirem e
concentrarem ácido sulfúrico na parte externa do corpo, que servem para afastar os
predadores (PEREIRA & SOARES, 2002). Outro exemplo bem conhecido é da anêmona–
do–mar, $QWKRSOHXUDHOHJDQWtVVLPD, que quando ameaçada se contrai e, após certo tempo,
anêmonas da mesma espécie que se encontram ao seu redor também se contraem, sendo
dessa forma, rejeitadas pelo predador. Estudos das secreções produzidas nesta resposta
permitiram identificar a antopleurina, um feromônio de alarme, que é um análogo estrutural
do neurotransmissor ácido gama-aminobutírico (GABA). É Interessante destacar que o
predador ataca a anêmona principalmente nos tentáculos e na parte superior do corpo, onde
há menor concentração de antopleurina, o que sugere que essa substância tenha, também,
um papel de defesa (BAKUS HW DO., 1988).
Toxinas são também freqüentemente encontradas em vários invertebrados
como as medusas e as anêmonas, organismos providos de nematocisto. Os nematocistos
são estruturas celulares que explodem e penetram na pele de animais agressores. Há
registros de queimaduras e até de morte de banhistas em conseqüência desse contato. Essas
toxinas podem estar presentes também em algas, moluscos e platelmintos, podendo servir
tanto de defesa como de ataque, dependendo dos organismos (BAKUS HW DO., 1988). Um
dos exemplos mais conhecidos de toxina de invertebrado é a palitoxina, isolada dos
zoantídeos (cnidários sem esqueleto calcário) do gênero 3DO\WKRD. Essa toxina é a mais
violenta conhecida até hoje. Causa vasoconstricção e, dependendo da dose, pode ser fatal
(IRELAND HW DO., 1993). A palitoxina era usada por nativos em Maui, no Hawaii, na ponta
de suas lanças como defesa contra invasores (COLWELL, 1983). Outra toxina bastante
conhecida é a lofotoxina, uma toxina neuromuscular de algumas gorgônias do Pacífico, do
NOGUEIRA, V. L. R. 2005 Papel de Proteínas Presentes na Tinta...
6
gênero /RSKRJRUJLD tão deletéria como o curare, veneno obtida de algumas folhas de
plantas como 6WU\FKQRV WR[LIHUD ou 6. JXLDQHQVLV. A toxina ocorre em corais ou gorgônias
de águas tropicais ou subtropicais, e exibe citotoxidade, ictiotoxidade e atividade
antibacteriana (JACOBS HW DO., 1985).
Muitos invertebrados marinhos, como moluscos sem concha são aparentemente
mais indefesos do que outros invertebrados marinhos. Portanto, é provável que esses
animais acumulem toxinas em seus corpos para proporcionar uma defesa química
(HIGUCHI, HW DO., 1998). Apesar da ausência da concha, poucos predadores desses animais
são conhecidos. Muitas explicações, incluindo, comportamento defensivo e secreções
químicas, têm sido abordadas para reconhecer a habilidade desses moluscos em escapar de
predadores (CIMINO, 1985). Em geral, o estabelecimento de um mecanismo de defesa
química pareceu ter servido à falta de proteção física proporcionada pela concha. Acredita-
se que a concha foi perdida depois que a defesa química foi envolvida. Acreditam que foi
um relacionamento de causa e efeito entre a perda da concha e o ganho do mecanismo de
defesa química. Embora, é claro, que a defesa química foi elaborada gradualmente,
enquanto a concha foi sendo perdida. A concha é uma defesa efetiva, mas não perfeita, para
muitos moluscos. Mecanismos auxiliares de defesa, incluindo comportamental, anatômica e
química estão presentes em formas com a concha bem desenvolvida (FAULKNER, 1983).
2.3. Filo Mollusca: Características Gerais
Os moluscos têm corpo mole, não segmentado, consistindo tipicamente de uma
cabeça anterior, um pé ventral e uma massa visceral dorsal. O corpo é recoberto pelo
manto, responsável pela formação da concha. Possuem sistema circulatório aberto (exceto
em Cephalopoda), com coração. A respiração pode ser branquial ou pulmonar. O sistema
nervoso é formado por três pares de gânglios. São animais dióicos ou monóicos e a
fecundação pode ser interna ou externa (RUPPERT & BARNES, 1996).
O Filo compreende sete classes de aspectos e hábitos diferentes, mas a maioria
dos trabalhos sobre defesa e produtos naturais concentra-se na classe Gastropoda, que
compreende os caramujos, caracóis e lesmas. Essa classe está dividida em 3 subclasses:
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7
Prosobranchia, Opisthobranchia e Pulmonata. Devido à proteção física fornecida pela
concha, os prosobrânquios não contêm metabólitos secundários interessantes (RUPPERT &
BARNES, 1996).
Na subclasse Pulmonata, o foco tem sido a família Siphonariidae, que possui
espécies produtoras do antibiótico diemenensina-A (HOCHOLOWSKI & FAULKNER,
1983). Os moluscos da subclasse Opisthobranchia não possuem estrutura externa de
proteção e, além disso, o manto que recobre o animal é freqüentemente colorido, como os
nudibrânquios e as lesmas-do-mar, e apesar de parecerem frágeis e apetitosos (Figura 1),
possuem poucos predadores (NOLEN HW DO., 1995). Geralmente, esses animais concentram
metabólitos a partir da dieta e os incorporam em suas estratégias de defesa (FAULKNER,
1988).
FIGURA 1 – Exemplos de moluscos opistobrânquios das ordens Nudibranchia (A:
&KURPRGRULV FDYDH;B: &KURPRGRULV HOLVDEHWKLQD;C: +H[DEUDQFKXV
VDQJXLQHXV) e Anaspidea (D: %XUVDWHOOD OHDFKLL;E: $SO\VLD GDFW\ORPHOD;
F: $SO\VLDRFXOLIHUD).
$
%
& '
(
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8
As lesmas-do-mar são temidas desde tempos Romanos por causa de uma tinta
púrpura que algumas espécies secretam quando são importunadas (HALSTEAD, 1965). As
lesmas-do-mar compreendem a ordem Anaspidea, que contem duas famílias (Akeridae e
Aplysiidae) com nove gêneros: $NHUD $SO\VLD 'RODEHOOD 'RODEULIHUD 3HWDOLIHUD
3K\OODSO\VLD1RWDUFKXV6W\ORFKHLOXVH%XUVDWHOOD(THOMPSON, 1976).
Várias espécies de lesmas dos gêneros 'RODEHOOD, %XUVDWHOOD e $SO\VLD liberam a
tinta púrpura. Das 37 espécies descritas para o gênero $SO\VLD, por exemplo, 30 liberam
essa secreção (NOLEN HWDO., 1995).
A tinta púrpura é liberada pela glândula de tinta localizada abaixo da concha no
manto. Quando ocorre o estímulo, essa tinta é eliminada e, como é muito viscosa, demora
alguns segundos para dissipar-se. Assim, uma das primeiras funções atribuídas a essa
secreção foi a de funcionar como uma cortina de fumaça, dando tempo ao animal para
escapar do predador. Pelo fato de terem sido encontradas várias substâncias bioativas nessa
secreção, outras funções têm sido sugeridas, incluindo a de defesa (ÁVILA, 1995).
A tinta é constituída de pigmentos que corresponde a 65% de sua massa seca, e
o restante consistindo de proteínas de alta massa molecular e pequena quantidade de outros
compostos de baixa massa molecular (TROXLER HW DO., 1981).
COELHO HW DO (1998), propuseram um modelo para explicar o processo de
obtenção do pigmento púrpuro pelo molusco a partir de sua dieta. Segundo os autores, o
pigmento ficoeritrina, presente nas algas vermelhas, é processado em vacúolos da glândula
digestiva do molusco. O cromóforo é separado da proteína e é transportado pela hemolinfa
para a glândula de tinta, onde é armazenado em vacúolos até sua liberação. Ao contrário
dos pigmentos, essas proteínas parecem não ser originadas da dieta, haja vista que não foi
encontrada nenhuma homologia com as biliproteínas algais (MACCOLL HW DO., 1990;
BEZERRA HWDO., 2004). Embora ainda não tenha sido elucidada a síntese, processamento e
função das proteínas da tinta especula-se que devam estar envolvidas na defesa desses
animais (COELHO HWDO., 1998; MELO HWDO., 1998; 2000).
Além da glândula de tinta, esses animais possuem as glândulas opalina e
digestiva, que secretam substâncias tóxicas. A glândula opalina ou de Bohadsch, como
também é conhecida, está situada na parte anterior da cavidade paleal e secreta um fluido
leitoso que em algumas espécies, possui um odor nauseante. A glândula digestiva, ou
NOGUEIRA, V. L. R. 2005 Papel de Proteínas Presentes na Tinta...
9
hepatopâncreas, elimina suas secreções diretamente no estômago e, além da função
digestiva, parece armazenar metabólitos de defesa obtidos a partir da dieta (ROGERSHW DO.,
1995). Esses animais produzem ainda um muco, que recobre todo o corpo e é rico em
substâncias bioativas, o que limita ou impede a predação (KISUGI HWDO., 1989).
2.4. Mecanismos de Defesa de Lesmas-do-mar
As lesmas-do-mar são conhecidas por adquirir defesa química de suas dietas,
exatamente como muitos insetos que comem plantas enriquecidas quimicamente
(DUFFLEY, 1980). Esses animais são geralmente impalatáveis para muitos predadores.
Entretanto, embora evidências indiquem que as lesmas-do-mar seqüestrem metabólitos
secundários de suas dietas, existe pequena evidência direta que esses metabólitos
seqüestrados prestam às lesmas-do-mar impalatabilidade. Em suma, embora essas lesmas
seqüestrem metabólitos que são desagradáveis para potenciais predadores, eles não
parecem localizar esses compostos em locais condizentes com o papel de defesa, como a
pele, por exemplo (FAULKNER, 1992).
Algumas lesmas-do-mar, mas notadamente $SO\VLD MXOLDQD que come
exclusivamente algas verdes dos gêneros 8OYD ou (QWHURPRUSKD, pobres em metabólitos
secundários, mostra ser mais vulnerável a predação que as lesmas, que comem algas
vermelhas ricas em compostos tóxicos (CAREFOOT, 1987). Entretanto, poucas diferenças
significativas foram encontradas na palatabilidade de outras partes do corpo, apenas na
glândula digestiva. Entretanto, secreção da glândula opalina, pele e presente nos ovos de $.
MXOLDQD parece conter substâncias que participam na sua defesa química (PENNINGS,
1994).
As defesas que as lesmas-do-mar empregam mudam por toda ontogenia e são
normalmente interligadas (Figura 2) dando a esses animais vários estágios de defesa
dependendo do tipo e intensidade de ameaça predatória (JOHNSON, 1999). Embora seja
verdade que poucos organismos fazem das lesmas-do-mar a maior parte de sua dieta,
predadores desses animais certamente existem (NOLEN, HW DO., 1995). Eles incluem a
grande anêmona-do-mar $QWKRSOHXUD [DQWKRJUDPPLFD, gastrópodes predadores 1DYDQD[ e
NOGUEIRA, V. L. R. 2005 Papel de Proteínas Presentes na Tinta...
10
0HORDPSKRUDe a estrela-do-mar&RVFLQDVWHULDVF DODPDULD(JOHNSON, 1999).
FIGURA 2 – Defesas das lesmas-do-mar através da ontogenia, mostradas em cada estágio
de vida: ovos, veligers, fase de metamorfose, juvenis e adultos (JOHNSON,
1999).
As lesmas-do-mar colocam massas de ovos sobre diversos substratos, como
algas ou rochas, e têm sido encontrados também em raiz de mangues, pedaços de madeira e
fundo arenoso (CAREFOOT, 1987). Os ovos expostos oferecem uma fonte fácil de
nutrientes para predadores, e existem somente duas referências na literatura de predação em
massa de ovos; ambas por estrela-do-mar (JOHNSON, 1999). Têm surgido hipóteses de
que metabólitos secundários da dieta algal das lesmas são responsáveis pela aparente
repugnância dos ovos, entretanto, poucos estudos têm sido conduzidos. PENNINGS &
PAUL (1993) fizeram experimentos com as lesmas 6W\ORFKHLOXV ORQJLFDXGD 'RODEHOOD
DXULFXODULD H $SO\VLD FDOLIRUQLFD, onde se alimentaram de dietas naturais e artificiais
contendo metabólitos secundários, mas esses metabólitos não foram encontrados nos ovos.
2YRV
9HOLJHU
0HWDPRUIRV
H
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'HVDJUDGiYHO
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5HWLUDGDHTXHGD 5HWLUDGD&RQWUDomRORFDO
7LQWD
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2GRU"
7DPDQKR
'HVDJUDGDYHO
NOGUEIRA, V. L. R. 2005 Papel de Proteínas Presentes na Tinta...
11
É possível que lesmas-do-mar sintetizamGHQRYR, substâncias que detêm predação em ovos
(JOHNSON, 1999).
Presumivelmente, a proteção química oferecida pela massa de ovos não é a
maior parte da estratégia de defesa na larva veliger livre-natante. Isso, não tem, entretanto
sido testado. Se a proteção química é perdida, a larva veliger parece depender somente da
proteção física da concha larval. Depois de sobreviver várias semanas no plâncton, as
larvas sedimentam na coluna d'água próximo as algas preferidas (normalmente vermelhas
para espécies que produzem tinta) onde elas começam o processo de metamorfose
(CAREFOOT, 1987). Até o desenvolvimento do estágio 6, três a quatro vesículas de tinta
podem ser vistas em espécimes preservadas. Pelo 3° dia ou estágio 8 o animal começa a se
alimentar de algas e a tinta começa a ser visível. Pelo estágio 9, quatro a seis vesículas de
tinta estão cheias com tinta púrpura em $. &DOLIRUQLFD e o animal já é capaz de liberar tinta
nesse estágio (KRIEGSTEIN, 1977).
A defesa em estágios de juvenil e adulto pode em sua maioria ser dividido
dentro das categorias passiva e ativa. Defesas passivas são aquelas em que a ação direta do
sistema nervoso não é requerida, são consideradas a primeira linha de defesa. Defesas
ativas, por outro lado, são normalmente inativas e em sua maioria são ativadas com ataque
predatório, representam à linha final de defesa. Como exemplos de defesas passivas têm a
coloração, odor, palatabilidade e o tamanho. Entre as defesas ativas encontram-se o
comportamento de retirada do sifão e brânquias, locomoção de escape (“galope” e
“natação”) e defesas químicas, incluindo a tinta, liberada pela glândula de tinta, e a
secreção opalina, liberada pela glândula hipobranquial (JOHNSON, 1999).
2.5. Tinta Púrpura
Como já foi citado anteriormente, a tinta é liberada pela glândula de tinta
também comumente chamada de glândula do manto, glândula púrpura ou glândula de
Blochmann. Glândula púrpura não é uma escolha apropriada, pois se refere somente às
espécies que liberam a tinta púrpura e por isso sugere que os animais que liberam tinta
branca não têm a glândula ou que não é homóloga à glândula de tinta. Glândula do manto
seria aceitável, exceto por que pode ser confundida com outras glândulas contidas dentro da
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12
cavidade do manto. Se Blochmann tivesse descrito somente a glândula de tinta esse
também seria um nome apropriado, mas infelizmente seu nome tem sido aplicado também
para glândula hipobranquial. Por essas razões o nome glândula de tinta é o nome mais
apropriado (JOHNSON, 1999).
A glândula de tinta está localizada na cavidade paleal do manto, sobre as
brânquias (Figura 3). O estudo de PRINCE HW DO. (1998) com a glândula de tinta de $.
FDOLIRUQLFDH$. EUDVLOLDQD aperfeiçoaram o entendimento da estrutura dessa glândula, e o
processamento e secreção da tinta.
FIGURA 3 – A: Localização da glândula de tinta da lesma-do-mar $SO\VLD GDFW\ORPHOD.
B: Desenho esquemático, segundo JOHNSON HW DO. (1999).
*OkQGXOD2SDOLQD
5LQyIRUR
3DUDSyGLR
*OkQGXODGH7LQWD
%UkQTXLD
6LImR
%
$
*OkQGXODGH7LQWD
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13
As glândulas são compostas de três tipos de vesículas (vermelho-púrpura, âmbar
e clara) e três tipos de células (células ricas em retículo endoplasmático rugoso, células
granulares e células da vesícula) além de matriz de colágeno e músculo (PRINCE HW DO.
(1998).
A tinta é liberada através de poros na superfície ventral da glândula e o fluxo
direcionado para baixo dentro da cavidade do manto (PRINCE HW DO., 1998) onde pode ser
direcionada pelo sifão e bombeada para fora do manto (WALTERS & ERICKSON, 1986).
A composição da tinta tem sido examinada por vários autores (CHAPMAN &
FOX, 1969; TROXLER HW DO., 1981; MACCOLL HW DO., 1990; PAUL & PENNINGS, 1991;
PRINCE HWDO., 1998). A tinta é em sua maioria composta por pigmentos derivados de algas
vermelhas, sendo o componente majoritário, a ficoeritrina (CHAPMAN & FOX, 1969).
A tinta púrpura de $. FDOLIRUQLFD é composta de 65 % de r-ficoeritrobilina de sua
massa seca (TROXLER HW DO., 1981), mas com uma grande quantidade de material protéico
de função desconhecida. PRINCE HW DO. (1998) têm sugerido que esse componente protéico
pode ser produzido nas células RER da glândula de tinta e estocada em vesículas âmbar,
entretanto, ambas as hipóteses precisam ser testadas.
Recentemente, a composição da tinta de $. GDFW\ORPHOD foi caracterizada
constituindo cerca de 99,5% de água. A análise química da sua massa seca foi composta
principalmente de proteína (acima de 60%), e o restante distribuído entre carboidratos,
lipídeos e cinzas (BEZERRA HW DO., 2004).
Várias hipóteses têm sido propostas para a função da tinta em $SO\VLD e outras
lesmas relacionadas. A tinta pode ser um método de eliminar produtos indesejáveis da
digestão de algas vermelhas, como pigmentos da bile (CHAPMAN & FOX, 1969). Foi
sugerido também que a tinta atuaria como uma cortina de fumaça, escondendo a lesma de
predadores visuais (EALES, 1921; HALSTEAD, 1965), hipótese que seria efetiva apenas
em poças calmas, visto que a tinta seria diluída rapidamente em águas sublitorais
turbulentas (CAREW & KANDEL, 1977). No entanto, a tinta parece não esconder as
lesmas mesmo em pequenas poças de maré naturais (KUPFERMANN & CAREW, 1974),
embora possa permanecer brevemente ao redor do animal por seu componente mucoso.
Como estes animais são lentos e não possuem a habilidade de fazer um recuo rápido, como
NOGUEIRA, V. L. R. 2005 Papel de Proteínas Presentes na Tinta...
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os cefalópodos, seria mais vantajoso que a tinta atuasse para repelir potenciais predadores
(DiMATTEO, 1982).
Recentemente, KICKLIGHTER HW DO. (2005) estudaram a relação das secreções
tinta-opalina de $. FDOLIRUQLFD e observou que elas facilitam o escape das lesmas por uma
combinação de mecanismos, através de falsos estímulos alimentares e por transtorno
sensorial em lagostas. Essas secreções têm quantidades milimolares de aminoácidos que
estimulam o sistema nervoso das lagostas, impedindo assim a sua predação por esses
animais.
Outros autores sugerem que a tinta seja desagradável ou impalatável para os
predadores, agindo, portanto como preventivo da ingestão das lesmas (DiMATTEO, 1981;
1982; PENNINGS, 1994; NOLEN HW DO., 1995).
Duas outras funções foram investigadas na tinta púrpura de $. GDFW\ORPHOD,
como irritação sensorial e depressor metabólico. Embora esta última não tenha sido
encontrada, o fluido age como irritante para várias espécies de invertebrados e peixes. As
observações anteriores de impalatabilidade da tinta não são incompatíveis com esta nova
função, em alguns casos os mesmos dispositivos sensoriais poderiam estar envolvidos
(CAREFOOT HWDO., 1999).
A tinta poderia desempenhar um papel social, comunicando informação sobre o
estado reprodutivo, visto que animais solitários liberam tinta com menor freqüência do que
aqueles em grupos (TOBACH HW DO., 1965). A tinta poderia funcionar ainda como um sinal
apossemático aos potenciais predadores, alertando para outras propriedades tóxicas da
lesma (AMBROSE HW DO., 1979) e como um sinal de alarme intra-específico para a presença
de um predador nas proximidades (FIORITO & GHERARDI, 1990; STOPFER HW DO.,
1993). Estas diferentes funções atribuídas a tinta não são surpreendentes, pois o uso de
vários meios de defesa não é incomum em invertebrados (EDMUNDS, 1966).
NOGUEIRA, V. L. R. 2005 Papel de Proteínas Presentes na Tinta...
15
2.6. $SO\VLDGDFW\ORPHOD
A espécie $. GDF\ORPHOD Rang 1828 (Figura 4) é classificada no filo Mollusca,
classe Gastropoda, subclasse Opisthobranchia, ordem Anaspidae família Aplisiidae,
subfamília Aplisiinae, gênero $SO\VLD. Esta espécie pode ser encontrada no mundo inteiro,
especialmente em regiões tropicais, sendo uma das três espécies cosmopolitas do gênero,
além de $. SDUYXOD e $. MXOLDQD (CAREFOOT, 1987). No continente americano, ocorre
desde o Sul da Flórida, nos Estados Unidos, até o Caribe e no Brasil, do Maranhão a São
Paulo, juntamente com as espécies $. EUDVLOLDQD, $. SDUYXOD e $. MXOLDQD (KANDEL, 1979;
RIOS, 1994).
FIGURA 4 – $SO\VLD GDFW\ORPHOD encontrada na praia de Fleixeiras, Trari, Ceará no
momento da liberação de tinta.
NOGUEIRA, V. L. R. 2005 Papel de Proteínas Presentes na Tinta...
16
As aplísias são herbívoras, alimentando-se de macroalgas verdes e vermelhas.
Muitas vezes encontradas enterradas em poças de maré baixa, e são mais ativas no período
noturno (CAREFOOT, 1989). No litoral cearense, a espécie $. GDFW\ORPHOD é geralmente
encontrada nas regiões intertidal e sublitoral, onde algas verdes do gênero 8OYD ocorrem
abundantemente, embora se alimentem também de várias algas vermelhas, dependendo da
disponibilidade do ambiente (BEZERRA HW DO., 2004).
O sistema nervoso destes moluscos é muito utilizado em experimentos de
neurofisiologia, pelo fato dos seus neurônios serem muito grandes, facilitando a
experimentação. São hermafroditas, simultâneos ou protândricos, ocorrendo copulação com
dois ou mais indivíduos. A fertilização é interna e a postura dos ovos ocorre na forma de
uma fita muscilaginosa muito longa (RUPPERT & BARNES, 1996).
O ciclo de vida das aplísias tem início com a fertilização dos ovos, seguido do
período de desenvolvimento embrionário, eclosão dos ovos, desenvolvimento da larva
veliger, metamorfose larval, fase juvenil e adulta (KANDEL, 1979).
2.7. Proteínas Isoladas de Lesmas-do-Mar
Várias proteínas com diferentes atividades biológicas já foram isoladas de
diversas secreções e tecidos das lesmas, como atividades antibacteriana e antineoplásica na
glândula de albúmen e em ovos de $. NXURGDL, (KAMIYA HW DO., 1986, KISUGI HW DO.,
1987) e na secreção da superfície do corpo de $ MXOLDQD (KAMIYA HW DO., 1989), bem
como atividade antineoplásica no fluido celômico e atividade citolítica na glândula de
albúmen, superfície do corpo de 'RODEHOOD DXULFXODULD (KISUGI HW DO., 1989; IIJIMA HW
DO., 2003).
A partir da tinta púrpura de lesmas-do-mar foram isoladas várias proteínas com
diferentes atividades biológicas, entre elas atividade antineoplásica e antibacteriana em
$SO\VLD NXURGDL, denominada de Aplysianina-P, citolítica em 'ROODEHOD DXULFXODULD
Dolabelanina-P (YAMAZAKI HW DO., 1986; 1989; 1990), antibacteriana e antineoplásica em
$. 3XQFWDWD, conhecida por APIT (NISTRATOVA HW DO., 1992; BUTZKE HW DO., 2004),
antibacteriana e hemaglutinante em $. 'DFW\ORPHOD Dactylomelina-P (MELO HWDO., 1998;
2000), antimicrobiana em $. &DOLIRUQLFD denominada de Escapina, (YANG, HW DO., 2005) e
NOGUEIRA, V. L. R. 2005 Papel de Proteínas Presentes na Tinta...
17
atividade antiviral (RAJAGANAPATHI, HW DO., 2002b) em %XUVDWHOOD OHDFKLL a
Bursatelanina-P.
Segundo MAYER & HAMANN (2005), somente nos anos de 2001-2002 cerca
de 106 compostos bioativos têm sido isolados de organismos marinhos, com diferentes
atividades biológicas entre elas, antihelmíntico, anticoagulante, antimalarial,
antiprotozoário, antituberculose, antitumoral, antiviral, antifúngica e antibacteriana.
A resistência a antimicrobianos em populações bacterianas tem sido um dos
grandes problemas enfrentados pela Saúde Pública atualmente. Encontra-se um aumento
significativo na freqüência do isolamento de bactérias que eram reconhecidamente
sensíveis às drogas de rotina utilizadas em clínicas, mas que apresentam agora resistência à
maioria dos fármacos disponíveis no mercado, como demonstrado por várias bactérias
multiresistentes.
Fontes promissoras de moléculas candidatas que exibem atividade
antimicrobiana tem sido isoladas nos últimos 20 anos de muitas plantas, insetos e outras
espécies de animais (ZASLOFF, 2002). É de grande interesse a pesquisa de compostos
biologicamente ativos a partir de produtos naturais, já que desde antiguidade, esses recursos
são utilizados com propósitos medicinais.
NOGUEIRA, V. L. R. 2005 Papel de Proteínas Presentes na Tinta...
18
2%-(7,926
Este trabalho teve como objetivo avaliar o papel das proteínas da tinta da lesma
$SO\VLD GDFW\ORPHODno mecanismo de defesa do animal.
3.1. Objetivos Específicos
• Analisar a composição de proteínas da tinta;
• Purificar e caracterizar a dactylomelina-P;
• Determinar o espectro de ação da dactylomelina-P, sua concentração inibitória
mínima e sua interação com a bactéria 6WDSK\ORFRFFXVDXUHXV
• Determinar as propriedades biológicas da tinta e da dactylomelina-P;
• Verificar o potencial tóxico da dactylomelina-P;
• Determinar a localização da dactylomelina-P no animal;
NOGUEIRA, V. L. R. 2005 Papel de Proteínas Presentes na Tinta...
19
0$7(5,$,6
4.1. Materiais Biológicos
4.1.1. $SO\VLDGDFW\ORPHOD
Os espécimes do molusco $. GDFW\ORPHOD foram coletados na praia de
Fleixeiras, no município de Trairi, durante marés de sizígea 0,0 ou 0,1 de acordo com a
tábua de marés fornecida pela Capitania de Portos do Estado do Ceará.
4.1.2. Microrganismos
As bactérias e fungos utilizados foram provenientes do Laboratório de
Microbiologia, do Departamento de Biologia da Universidade Federal do Ceará.
4.1.3. Coelho, Camundongos e Ratos
Coelho da raça Nova Zelândia com três meses de idade foi utilizado para
imunização. O animal foi adquirido junto ao biotério do Departamento de Zootecnia da
Universidade Federal do Ceará. Camundongos da raça sZLVV e ratos da raça wLVWDU albinos
foram adquiridos do Biotério Central da Universidade Federal do Ceará.
4.2. Reagentes e Outros Materiais
4.2.1. Proteínas
Albumina sérica bovina (BSA), Marcadores de massa molecular foram
adquiridos da Sigma Co, St Louis, USA.
NOGUEIRA, V. L. R. 2005 Papel de Proteínas Presentes na Tinta...
20
4.2.2. Meios de Cultura
Agar Nutritivo, Agar Muller-Hinton, Ágar Batata e Caldo Nutritivo foram
obtidos da Difco, Becton, Dickinson and Company, USA.
4.2.3. Matrizes para Cromatografias
DE 52 Dietilaminoetil Cellulose e Phenyl Sepharose )DVW )ORZ foram
adquiridas da Sigma Co, St. Louis, USA e Pharmacia-LKB, Uppsala, Suécia.
4.2.4. Reagentes para Eletroforese
Dodecil Sulfato de Sódio (SDS), TEMED (N, N, N’, N’-
tetrametiletilenodiamina), Trizma-base, Metilenobisacrilamida, AFULODPLGD -
mercaptoetanol, Coomassie brilliant blue R-250 e G-250, Nitrato de prata, Sulfato de
amônio e demais reagentes foram comprados das empresas Amersham Biosciences,
Piscataway, USA, Sigma Chemicals Co, St Louis, USA ou Acros Organics, Geel, Belgium.
4.2.5. Materiais para “Dot” e “Western-blotting”
Membranas de PVDF, anticorpo de cabra anti-IgG de coelho conjugado com
peroxidase e os substratos para peroxidase foram adquiridos da Sigma Co, St. Louis, USA.
Todos os demais reagentes utilizados foram de grau analítico.
NOGUEIRA, V. L. R. 2005 Papel de Proteínas Presentes na Tinta...
21
0(72'2/2*,$
5.1. Coleta e Tratamento da Tinta
A tinta foi coletada através do simples manuseio de espécimes de $.
GDFW\ORPHOD encontrados na praia de Fleixeiras, Município de Trairi, Estado do Ceará, em
marés de sizígia 0.0 e 0.1. O tratamento inicial da tinta foi feito segundo a metodologia
sugerida por MELO HW DO. (2000). Para tanto, o SRRO de tinta foi dialisado exaustivamente
contra água destilada em membrana de diálise de 12 kDa de FXWRII, a 4 ºC, e centrifugado a
15.000 J por 20 min. O sobrenadante foi testado quanto à atividade biológica contra a
bactéria 6WDSK\ORFRFXVDXUHXV(Item 5.6.1.), armazenado e congelado até o uso.
5.2. Eletroforese Bi-Dimensional da Tinta
A eletroforese bidimensional foi realizada segundo metodologia de GÖRG HW DO.
(2000). Inicialmente, amostras foram dissolvidas em uma solução de solubilização (7 M de
uréia, 2 M de tiouréia, 2% de CHAPS, 25 mM de DTT, 2% de anfólitos pH 4 a 7 e 10 mM
de Perfabloc) e homogeneizadas por 30 min, à temperatura ambiente. Para a primeira
dimensão, focalização isoelétrica, aproximadamente 20 µg de proteína total foram
carregadas diretamente no gel de focalização com gradiente de pH imobilizado, na faixa de
4 a 7 (Immobiline IPG strips – Amersham Bioscience, Piscataway
, USA). A focalização
das proteínas foi feita em um equipamento Multiphor II (Amersham Pharmacia
Biosciences) acoplado a um circulador termostático. A segunda dimensão foi feita com gel
de poliacrilamida 12,5% na presença de SDS, conforme LAEMMLI (1970), empregando o
sistema vertical Hoefer (Amersham Pharmacia Biosciences). A detecção das proteínas
resolvidas em 2-D/SDS-PAGE foi feita através da afinidade das proteínas pela prata,
conforme BLUM HW DO. (1987). A análise dos géis bi-dimensionais foi feita, inicialmente,
através da digitalização das imagens captadas em ScanJet 4C (Hewlett Packard). Os géis
foram comparados e os “spots” de proteínas tiveram seus atributos determinados (massa
molecular e pI) com o emprego do Software ImageMaster Total Lab (Amersham
Bioscience).
NOGUEIRA, V. L. R. 2005 Papel de Proteínas Presentes na Tinta...
22
5.3. Determinação de Proteína
As determinações de proteínas foram realizadas pelo método proposto por
BRADFORD (1976), utilizando albumina sérica (BSA) bovina como padrão.
5.4.Purificação da Dactylomelina-P
5.4.1. Precipitação da Tinta com Sulfato de Amônio
A tinta foi tratada com sulfato de amônio até 30 % de saturação. Após descanso
de 12 h a 4 ºC, a suspensão foi centrifugada, o precipitado foi ressuspenso em Tris-HCl
50mM, pH 7,0 e o sobrenadante foi precipitado com sulfato de amônio no intervalo de 30-
60 %. A fração 60-90 % foi obtida de forma semelhante. Todas as frações foram dialisadas
contra água destilada e submetidas a eletetroforese em gel de poliacrilamida (LAEMMLI,
1976) e a ensaios de antibiogramas (BAUER HW DO., 1966).
5.4.2. Cromatografia de Troca Iônica
AF
30/60%
foi submetida à cromatografia de troca iônica em coluna de DE 52
dietilaminoetil cellulose (15,5 x 3,5 cm). O gel foi previamente tratado com NaOH 0,5 M
por 30 minutos, lavado com água destilada, tratado com HCl 0,5 M por uma hora, lavado
novamente com água destilada até que atingisse o pH neutro e, finalmente, equilibrado com
o tampão Tris-HCl 0,05 M, pH 7,0. A F
30/60%
foi centrifugada a 15.000 J por 10 minutos a 4
Û& H10 ml do sobrenadante foram aplicados à coluna. Inicialmente a coluna foi percolada
com tampão de equilíbrio, sendo em seguida, aplicado NaCl nas concentrações de 0,2, 0,5 e
1,0 M o equivalente a 2 x o volume da coluna, para eluição de qualquer material adsorvido.
A cromatografia foi realizada a um fluxo de 40 ml/h, sendo coletados 3 ml por tubo. Após a
eluição do útimo pico foram aplicados NaOH 0,5 M, água destilada e HCl 0,5 M, para
eluição de algum material ainda ligado. Além das leituras de absorbância a 280 nm, os
tubos da cromatografia foram submetidos a ensaios de atividade antibacteriana com
NOGUEIRA, V. L. R. 2005 Papel de Proteínas Presentes na Tinta...
23
6WDSK\ORFRFFXV DXUHXV. Os tubos concentrando a atividade antibacteriana (Item 5.6.1.)
foram reunidos, dialisados contra água destilada e liofilizados.
5.4.3. Cromatografia de Interação Hidrofóbica
O pico rentendo atividade antibiótica foi submetido a uma cromatografia de
interação hidrofóbica em uma coluna de Phenyl Sepharose )DVW )ORZ (20 x 1,8 cm),
equilibrada com tampão Tris-HCl 0,05 M, pH 7,0 com 1,7 M de sulfato de amônio. A
amostra foi dissolvida no tampão de equilíbrio, centrifugada a 15.000 J por 10 minutos a
4 Û& H10 ml do sobrenadante foram aplicados à coluna. Inicialmente a coluna foi percolada
com tampão de equilíbrio, sendo em seguida, aplicadas concentrações decrescentes de sal
(1,0, 0,2 e 0 M de sulfato de amônio), e finalmente água destilada, para eluição do material
adsorvido. A cromatografia foi realizada a um fluxo de 40 ml/h, sendo coletados 3 ml por
tubo. Após a eluição do último pico foi aplicado NaOH 0,5 M para eluição de algum
material ainda ligado. As leituras de absorbância foram feitas a 280 nm, os tubos da
cromatografia submetidos a ensaios de atividade antibacteriana contra 6W. DXUHXV. Os tubos
concentrando a atividade antibacteriana foram reunidos, dialisados contra água destilada e
liofilizados.
5.5. Caracterização da Dactylomelina-P
5.5.1. Estimativa da Massa Molecular por PAGE-SDS
A massa molecular da dactylomelina-P foi estimada por eletroforese em gel de
poliacrilamida, na presença de SDS, seguindo a metodologia descrita por LAEMMLI
(1970). Os géis de aplicação e separação encerravam 5% e 12,5% de acrilamida,
respectivamente. A proteína (1mg/ml) foi dissolvida em Tris-HCl 62,5 mM, pH 6,8,
contendo 1% de SDS, glicerol, azul de bromofenol e -mercaptoetanol, aquecida a 100 °C,
durante 10 minutos, e centrifugada a 10.000 g durante 5 minutos, a 4 °C. Foram aplicados
20 µl por poço e a corrida conduzida a uma corrente constante de 20 mA por placa, durante
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24
1,5 hora. As bandas protéicas foram visualizadas corando-se os géis com uma solução a
0,25 % de azul brillhante de Coomassie R-250. Em seguida, fez-se a descoloração com uma
mistura de ácido acético, metanol e água (1:3:7). A massa molecular aparente da
dactylomelina-P foi estimada a partir da curva padrão construída com os Rfs, calculados
segundo as especificações do fabricante (Sigma Co, St Louis, USA), dos seguintes
marcadores de massa molecular: albumina sérica bovina (66,0 kDa); ovoalbumina (45,0
kDa), pepsina (34,7 kDa), tripsinogênio (24,0 k'D
-lactoglobulina (18,4 kDa), lisozima
(14,3 kDa).
5.5.2. Determinação do Ponto Isoelétrico
O ponto isoéletrico da dactylomelina-P foi determinado por eletroforese
bidimensional como descrito no item 5.2.
5.5.3. Composição de Aminoácidos
A análise de aminoácidos da proteína foi conduzida em um sistema Biochrom
20 (Pharmacia-LKB, Uppsala, Suécia). A amostra de proteína liofilizada foi hidrolisada
com HCl 6 N (1 ml), contendo 1% (m/v) de fenol. A hidrólise foi feita em ampolas de vidro
seladas, sob atmosfera de Nitrogênio, a 110 °C em estufa, durante 22 horas. Após a
hidrólise, a ampola foi aberta e o HCl e fenol evaporados, sob pressão reduzida, em
presença de NaOH. O hidrolisado foi lavado com água grau milli-Q e seco sob pressão
reduzida, em presença de pentóxido de fósforo. Depois de seca, a amostra foi redissolvida
em tampão citrato de sódio pH 2,2, filtrada em membrana de 0,45 µm (Millipore) e
submetida à análise. O conteúdo de aminoácidos foi determinado pelo método de
SPACKMAN HW DO. (1958), adaptado para o uso do Sistema Biochrom 20 da Pharmacia-
LKB.
NOGUEIRA, V. L. R. 2005 Papel de Proteínas Presentes na Tinta...
25
5.5.4. Determinação de Carboidratos
O conteúdo de carboidrato da proteína foi determinado pelo método do fenol-
sulfúrico (DUBOIS HW DO., 1956), no qual se utiliza uma curva padrão de glucose como
referência. A natureza glicoprotéica da proteína também foi avaliada por coloração pelo
ácido periódico de Schiff, realizada após eletroforese em gel de poliacrilamida, seguindo o
protocolo do “Kit de detecção de glicoproteína da Sigma” (JAY HW DO.,1990).
5.5.5. Estabilidade Térmica
Para avaliar a estabilidade térmica da proteína, uma solução de 1mg/ml foi
preparada em tampão Tris-HCl 50 mM, pH 7,0 foi aquecida a 45, 50, 55 e 60 °C, em
banho-maria. A cada 5 minutos, durante o intervalo de 1 hora, foram retiradas alíquotas,
que após serem imediatamnete resfriadas, foram centrifugadas a 10.000 J por 5 minutos, e
os sobrenadantes utilizados em ensaios de atividade antibacteriana, pelo método de difusão
com discos contra 6W. DXUHXV (BAUERHW DO.,1966).
5.5.6. Influência do pH na Atividade da Proteína
A estabilidade da proteína em diferentes pHs foi avaliada dissolvendo-se a
proteína liofilizada nos seguintes tampões: Glicina-HCl 0,05 M, pH 2,0 e 3,0; Acetato de
Sódio 0,05 M, pH 4,0 e 5,0; Tris-HCl 0,05 M, pH 6,0 e 7,0; Glicina-NaOH 0,05 M, pH 9,0
e 10,0 e Fosfato de Sódio 0,05 M, pH 11,0 e 12,0. As amostras (100 µg/ml) foram
mantidas, nestas condições, a 4 ºC por 30 min (KAMIYA HW DO., 1989). Após este período,
as soluções foram dialisadas exaustivamente contra tampão Tris-HCl 0,05 M pH 7,0,
liofilizadas e, então, testadas em ensaio de atividade antibacteriana contra 6W. DXUHXV, como
descrito anteriormente.
5.5.7. Resistência a Protease
Uma amostra de proteína encerrando 1mg/ml foi incubada com 1mg de
protease inespecífica (Sigma Co, St Louis, USA) em tampão Tris-HCl 50 mM pH 7,0 à
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26
temperatura ambiente por 18 horas. Após a incubação esta amostra foi submetida a ensaios
de atividade antibacteriana contra 6W. DXUHXV(RAJAGANAPATHI HW DO., 2002).
5.6. Atividades Biológicas da Tinta e da Dactylomelina-P
5.6.1. Atividade Antibacteriana em Meio Sólido
Os ensaios de atividade antibacteriana da tinta e da dactylomelina-P foram
realizados pelo método de difusão em discos descrito por BAUER HW DO. (1966). Foram
utilizadas as bactérias Gram-positivas 6WDSK\ORFRFFXV DXUHXV, %DFLOOXV FHUHXV, %DFLOOXV
VXEWLOLVe 6DUFLQD sp. Entre as bactérias Gram-negativas testadas estavam (VFKHULFKLD FROL,
6HUUDWLD PDUFHVFHQV, 3URWHXV PLUDELOLV, (QWHUREDFWHU DHURJHQHV, (. DJJORPHUDQV, (.
FORDFDH, (. JHUJRYLDH, 6DOPRQHOOD HQWHULWLGLV, 6. W\SKL, 6. W\SKLPXULXP, .OHEVLHOOD
SQHXPRQLDH, $FLQHWREDFWHU sp., 6KLJHOOD IOH[QHUL 9LEULR SDUDKDHPRO\WLFXV e 9LEULR
FKROHUDH, também foram testadas cepas de bactérias marinhas, isoladas do ambiente onde as
lesmas foram encontradas. Culturas de bactérias na concentração de 10
7
UFC/ml foram
semeadas em placas de ágar Muller-Hinton. Em seguida, discos de papel de filtro
embebidos com 30 µl da amostra (100 µgP/ml) foram colocados sobre o meio, sendo as
placas então incubadas a 37 °C por 24 horas. A inibição do crescimento microbiano foi
avaliada pela formação de halos de inibição ao redor dos discos.
5.6.2. Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Mecanismo de Ação
A concentração inibitória mínima foi determinada segundo NAKAJIMA HW DO.
(2003) com modificações. Inicialmente, a turbidez de uma cultura de 6W. DXUHXV de 18 h foi
ajustada para uma absorbância de 0,01 a 600 nm (10
6
células) em espectrofotômetro, e essa
cultura diluída 1000x com o próprio meio antes do uso. Para o ensaio, uma solução
encerrando 1 mg/ml de dactylomelina-P foi diluída seriadamente (1:2; 1:4; 1:8...) em caldo
nutritivo em tubos. 90 µl de cada diluição foram incubados com 10 µl da cultura a 35ºC,
por 18 h. Após o período de incubação, o crescimento da bactéria foi estimado através de
comparação da turbidez com a cultura controle. Após a determinação da CIM, foi
NOGUEIRA, V. L. R. 2005 Papel de Proteínas Presentes na Tinta...
27
verificado o mecanismo de ação, se bactericida ou bacteriostático. Para tanto as células
foram subcultivadas em meio sem a proteína, e incubadas a 35 ºC, por 24 horas, e o
crescimento observado através da presença ou ausência de turbidez.
A concentração inibitória mínima também foi determinada pelo método de
difusão com discos pelo método de BAUER HWDO. (1966), como descrito previamente.
5.6.3. Atividade Antifúngica em Meio Sólido
Os ensaios de atividade antifúngica da tinta e da dactylomelina-P foram
realizados pelo método de difusão em discos descrito por BAUER HW DO. (1966) para
leveduras. As cepas utilizadas nos ensaios foram &DQGLGD DOELFDQV, &. JXLOOLHUPRQGLL, &.
WURSLFDOLV, &. UXJRVD, &. SDUDSVLORVLV, 3LFKLD DQRPDOD, .OX\YHURP\FHV PDU[LDQQXV ..
ODFWLVVLPLODU e 6DFFKDURP\FHV FHUHYLVDH. Culturas de leveduras em concentração de 10
7
células/ml foram semeadas em placas de ágar Batata. Em seguida, discos de papel de filtro
embebidos com 30 µl das amostras (1 mgP/ml) foram colocados sobre o meio, sendo as
placas então incubadas a 37 °C por 24 horas. A inibição do crescimento microbiano foi
avaliada pela formação de halos ao redor dos discos.
Para os ensaios com fungos filamentosos, realizados segundo ROBERTS &
SELITRENNIKOFF (1990), foram usados: &ROOHWRWULFKXP OLQGHPXWKLDQXP, &. PXVDH, &.
JORHVSRULRLGHV, &. WUXQFDWXP, &. NLNXFKL, )XVDULXP VRODQL, ). R[\VSRUXP, $VSHUJLOOXV
QLJHU, $. FKHYDOLHU, 3HQQLFLOLXP KHUJXHL, 3. ROLJDQGUXP, 5KL]RFWRQLD VRODQL, 3KRPRSVLV
sp., 'UHVFKHOHUDsp., 1HXURVSRUD sp., 0XFRU sp. e 5KL]RSXV sp. As culturas de fungos foram
inoculadas como pelets de 8 mm no centro de placas de ágar Batata. As placas foram
incubadas em temperatura ambiente por 48 horas ou mais, dependendo da velocidade de
crescimento de cada fungo. Após o crecimento inicial, discos de papel de filtro embebidos
com 30 µl das amostras (1 mgP/ml) foram colocados sobre o meio, a aproximadamente 5
mm da borda. As placas foram novamente incubadas a temperatura ambiente até o
crescimento restante dos fungos em presença da proteína. A formação de halos ao redor dos
discos indicou inibição do crescimento fúngico.
NOGUEIRA, V. L. R. 2005 Papel de Proteínas Presentes na Tinta...
28
5.6.4. Atividade Antifúngica em Meio Líquido
Para o ensaio de atividade antifúngica em meio líquido, foram testados os
fungos &ROOHWRWULFKXP OLQGHPXWKLDQXP, &. PXVDH, $VSHUJLOOXV QLJHU, 1HXURVSRUD sp.,
0XFRU sp., 5KL]RFWRQLD VRODQL e )XVDULXP R[\VSRUXP. Para a extração de esporos,
inóculos dos fungos filamentosos foram colocados no centro de placas de Petri contendo
ágar Batata e mantidos em temperatura ambiente por vários dias, dependendo da
velocidade de crescimento de cada espécie. Após o período de crescimento, foram
espalhados 5 ml de solução de NaCl 0,15 M estéril sobre o crescimento micelial. Uma
alíquota de cada suspensão de esporos resultante foi quantificada em câmara de
Neubauer, ajustando-se a concentração para 3x10
6
esporos/ml. Para cada amostra, foram
adicionados 50 µl da suspensão de esporos em 250 µl da proteína em caldo malte e
outros 50 µl de esporos em 250 µl de caldo malte, usado como controle. Como controle
positivo foi utilizado a tinta púrpura (BARREIRA, 2003). Os tubos de HSSHQGRUI
contendo as amostras foram incubados em temperatura ambiente durante 72 horas. Em
seguida, foram centrifugados a 10.000 J por 15 minutos a 4 °C, descartando-se os
sobrenadantes e adicionando água destilada para retirar o excesso de amostra. Após nova
centrifugação, os precipitados foram usados no preparo de lâminas coradas com
lactofenol azul de algodão para análise em microscópio óptico.
Para os ensaios em meio liquido com as leveduras foram utilizados os
microrganismos: &DQGLGDWURSLFDOLV, 3LFKLD DQRPDODe 6DFFKDURP\FHVFHUHYLVDH. Para
cada amostra, foram adicionados 50 µl da cultura de levedura (2 x 10
6
cél/ml) em 250 µl
da proteína em caldo malte e outros 50 µl da cultura de levedura em 250 µl de caldo
malte, usado como controle. Os tubos contendo as amostras foram incubados em
temperatura ambiente por 48 horas. Em seguida, foram observadas a turbidez das
culturas em comparação com o controle e além da observação do crescimento no
subcultivo em agar batata.
NOGUEIRA, V. L. R. 2005 Papel de Proteínas Presentes na Tinta...
29
5.6.5. Extração dos Peptídeos da Tinta
A secreção foi inicialmente precipitada com sulfato de amônio para obtenção da
fração F
0/70%
de saturação. Em seguida, esta fração foi submetida à centrifugação a 10.000 J
por 30 minutos a 4 °C e o precipitado ressuspendido em 5 ml de água destilada. Este
extrato foi levado ao banho-maria a 80 °C por 15 minutos e centrifugado novamente a
8.000 J por 10 minutos a 4 °C. O precipitado e o sobrenadante foram então submetidos à
diálise em membrana de 1 kDa de FXW RII e liofilizados para posteriormente serem
submetidos a ensaios de atividade antibiótica (TERRAS HWDO., 1992).
5.6.6. Atividade Hemaglutinante
A atividade hemaglutinante foi determinada segundo a metodologia descrita por
MOREIRA & PERRONE (1977), adaptada para o uso de tubos de ensaio. As amostras de
proteína (1mg/ml) e tinta bruta foram diluídas seriadamente com NaCl 0,15 M (1:2; 1:4;
1:8.; 1:16 etc) e cada diluição foi misturada (1:1) com uma suspensão a 2 % de eritrócitos
de coelho, camundongos e ratos, tratados previamente com protease. Os tubos foram
incubados a 37 °C durante 30 minutos e, depois, por mais 30 minutos à temperatura
ambiente. Após esse tempo, os tubos foram centrifugados a 2.000 J por 1 minuto e a
aglutinação visualizada a olho nu. Os resultados foram expressos como título de
hemaglutinação, o qual foi definido como o recíproco da maior diluição que é capaz de
provocar aglutinação visível, ou como a quantidade mínima de proteína (µg/ml) capaz de
induzir aglutinação visível. Essa concentração foi denotada como uma unidade de atividade
hemaglutinante (UH).
5.6.7. Atividade Anticoagulante
O ensaio de pesquisa de atividade anticoagulante foi realizado de acordo com a
descrição de RAJAGANAPATHI & KATHIRESAN (2002), com algumas modificações.
Foi utilizado neste ensaio sangue total de rato, onde determinou-se o tempo de coagulação
NOGUEIRA, V. L. R. 2005 Papel de Proteínas Presentes na Tinta...
30
imediatamente após sua retirada. A tinta púrpura e a dactylomelina-P foram ressuspendidos
em NaCl 0,15 M (1mgP/ml) e adicionado 1 ml do sangue em cada amostra.
O tempo de coagulação sanguínea de cada amostra foi cronometrado
imediatamente após a adição de sangue.
5.6.8. Determinação da Atividade β-1,3 Glucanásica
5.6.8.1. Preparação do Reagente de Cobre
O reagente de cobre para determinação de açúcares redutores foi preparado
segundo metodologia descrita por SOMOGY (1952). A preparação envolve inicialmente a
mistura de 24 g de carbonato de sódio e 12 g de tartarato de potássio dissolvidos em 250 ml
de água destilada. Em seguida 40 ml de uma solução a 10 % de sulfato de cobre foram
adicionados à mistura, seguidos pela adição de 16 g de bicarbonato de sódio. Após
preparação desta solução, uma solução de sulfato de sódio (0,05 M) em 500 ml de água
destilada foi fervida por 5 minutos e deixada resfriar até a temperatura ambiente. Em
seguida as duas soluções foram reunidas e o volume levado a 1000 ml.
5.6.8.2. Preparação do Reagente de Arsenomolibdato
O reagente de arsenomolibdato foi preparado segundo metodologia descrita por
NELSON (1944). Inicialmente 25 g de molibdato de amônio foram dissolvidos em 450 ml
de água destilada adicionando-se 21 ml de ácido sulfúrico concentrado. Em seguida 3 g de
arsenato de sódio dissolvidos em 25 ml de água destilada foram adicionados à solução. A
mistura foi incubada a 37 °C em estufa por 48 horas.
5.6.8.3. Ensaio para β-1,3 Glucanase
A determinação da atividade β-1,3 glucanásica na solução de proteína (1mg/ml)
foi feita segundo metodologia descrita por FINK HW DO. (1988). O meio de reação foi
composto por 50 µl da amostra, 125 µl de laminarina (2 mg/ml em tampão acetato de sódio
NOGUEIRA, V. L. R. 2005 Papel de Proteínas Presentes na Tinta...
31
50 mM, pH 5,0) e levado a um volume final de 500 µl com tampão acetato de sódio 50
mM, pH 5,0. A mistura foi incubada a 37 °C em estufa por 12 horas. Após o período de
incubação foram adicionados 500 µl do reagente de cobre e a mistura fervida em banho-
maria por 10 minutos, deixada à temperatura ambiente e adicionados 1000 µl do reagente
de arsenomolibdato. A densidade óptica foi medida a 500 nm. As provas em branco foram
feitas de maneira semelhante, com exclusão da laminarina que foi substituída pelo tampão
de ensaio. Uma unidade de atividade glucanásica foi definida como sendo a concentração
da enzima que fornece uma absorbância de 0,001 quando lida a 500 nm.
5.6.9. Análise de Atividade Quitinásica
A análise da atividade quitinásica foi determinada por fluorimetria. A solução
estoque do substrato (4-metilumbeliferil-β-D-N’-N’’-N’’’-triacetilQuitotri-ose) foi
preparada segundo O’BRIEN & COLWELL (1987). A reação padrão foi feita pela adição
de 50 µl de amostra e 5 µL da solução do substrato em presença de 2 ml de tampão
acetato de sódio 50 mM pH 5,0 à temperatura ambiente. A metilumbeliferona liberada foi
medida em espectrofluorímetro utilizando-se um filtro primário (excitação 320 nm) e um
filtro secundário (emissão 460 nm). Uma unidade da atividade foi definida como 1 nmol
de metilumbeliferona liberada por minuto.
5.6.10. Detecção de Atividade Quitinásica Inespecífica em SDS-PAGE
A detecção de atividade quitinásica em gel foi feita segundo a metodologia
descrita por TRUDEL & ASSELIN (1989). Uma eletroforese em gel de poliacrilamida
seguindo a metodologia descrita por LAEMMLI (1970) foi realizada, porém para este
ensaio o gel continha ainda 200 µl de glicolquitina 1 %. Após a corrida, o gel foi incubado
por 24 horas a 37 °C com tampão acetato 0,1 M pH 5,0 contendo 1 % de Triton X-100
(preparada imediatamente antes do uso). Ao término da incubação, o gel foi lavado em
solução reveladora (calcofluor 0,01 % em 0,5 M Tris-HCl pH 8,9, recém preparada). Após
5 minutos, a solução reveladora foi retirada e o gel incubado em água destilada por 1 hora à
temperatura ambiente. Para a visualização do resultado, o gel foi exposto à luz UV.
NOGUEIRA, V. L. R. 2005 Papel de Proteínas Presentes na Tinta...
32
5.7. Avaliação do Potencial Tóxico da Dactylomelina-P
5.7.1. Atividade Hemolítica
A atividade hemolítica da proteína foi investigada segundo descrito por
BERNHEIMER (1988) e MERKER & LEVINE (1986) com algumas modificações. Suspensões
de eritrócitos de camundongos, ratos e coelhos a 1 % foram diluídas em proporção de 1:10 (p/v)
em NaCl 0,15 M contendo várias concentrações da proteína. Em seguida, os tubos foram
incubados a 37 °C por 1 hora. O grau de hemólise foi calculado pela liberação de hemoglobina,
medida por absorbância a 540 nm, após centrifugação a 1000 g por 5 minutos. A lise completa
(100 %) foi obtida por diluição da suspensão de células com água destilada e/ou ainda um
controle negativo com solução de NaCl 0,15 M. Uma unidade hemolítica foi definida como a
concentração de proteína requerida para produzir 50 % de hemólise em suspensão de células a
1 % durante 1 hora.
5.7.2. Atividade Citotóxica
A citotoxicidade da dactylomelina-P foi avaliada pelo método do MTT
(MOSMANN, 1983). Foram utilizadas 4 placas de 96 cavidades por experimento, uma para
cada linhagem celular, do Instituto nacional do Câncer, MD (USA), nas seguintes
concentrações (células/ml): MDA/MB-435 (carcinoma mamário humano, CEM (leucemia
linfocítica): 0,1 x 10
6
; HCT-8 (carcinoma de cólon): 0,7 x 10
5
e HL-60 (leucemia): 0,3 x
10
6
. As substâncias previamente diluídas em DMSO foram diluídas seriadamente em meio
RPMI para obtenção das concentrações finais (0,39- JPl) sendo adicionado l por
poço. Após o período de incubação de 72 h, as placas foram retiradas e centrifugadas a
1500 rpm por 15 minutos. O sobrenadante foi aspirado e foram adicionados lda
solução de MTT 10 % em RPMI, sendo a placa colocada na estufa a 5 % de CO
2
por 3 h.
Em seguida, as placas foram novamente centrifugadas a 3000 rpm por 10 minutos, sendo o
VREUHQDGDQWH DVSLUDGR H R SUHFLSLWDGR UHVVXVSHQGL GR HP
l de DMSO e agitado por 10
minutos, até completa dissolução dos cristais de formazan. As placas foram lidas em
espectrofotômetro a um comprimento de onda de 550 nm.
NOGUEIRA, V. L. R. 2005 Papel de Proteínas Presentes na Tinta...
33
A análise do MTT determina a viabilidade metabólica das células pela análise
da atividade redutiva mitocondrial. Foi descrito primeiramente por MOSMANN (1983),
tendo a capacidade de analisar a viabilidade e o estado metabólico de uma célula. É uma
análise colorimétrica baseada na conversão do sal 3-(4,5-dimetil-2-tiazol)-2,5-difenil-
brometo de tetrazolium (MTT) em azul de formazan, a partir de enzimas mitocondriais
presentes somente nas células metabolicamente ativas. Ou seja, a solução amarela do MTT
é reduzida pela atividade mitocondrial, nas células metabolicamente ativas em um cristal
azul/preto. O estudo citotóxico pelo método do MTT permite definir facilmente a
citotoxicidade, mas não o mecanismo de ação (BERRIDGE HW DO., 1996).
5.7.3. Atividade Tóxica em Camundongos
Camundongos pesando entre 20–25 g foram usados para avaliação da toxicidade
aguda por via intraperitonial. Os camundongos foram observados num intervalo de 48 h
após a administração da dactylomelina-P. A toxicidade foi expressa em mg de proteína/Kg
de massa corpórea necessária para produzir morte em 50 % dos animais testados
(LITCHIFIELD & WILCOXON, 1949).
5.8. Localização da Dactylomelina-P na Lesma $ SO\VLDGDFW\ORPHOD
5.8.1. Produção de Anticorpos Policlonais
A dactylomelina-P foi acumulada para fabricação de anticorpos policlonais
em coelho, que foram usados nos estudos de imunolocalização. Um coelho albino de três
meses de idade da raça Nova Zelândia foi inicialmente submetido à sangria através de
um corte na veia marginal da orelha. O sangue foi deixado coagular a temperatura
ambiente e o soro recolhido centrifugado a 3000 J por 2 minutos. Após este
procedimento, o soro clarificado e livre de hemácias foi armazenado a -20 °C. O animal
foi imunizado, por via intramuscular, com a proteína, na concentração de 1 mgP/ml (0,5
ml de NaCl 0,15 M + 0,5 ml de adjuvante completo de Freund). Após 14 dias da
NOGUEIRA, V. L. R. 2005 Papel de Proteínas Presentes na Tinta...
34
imunização foi aplicado um reforço por via subcutânea de 1mgP/ml, mas sem adjuvante.
A partir do primeiro reforço, foram aplicadas doses semanais nas mesmas condições. O
coelho foi sangrado nos dias 21, 28, 35 e 42 para obtenção dos soros imunes.
5.8.2. Determinação dos Títulos dos Soros Anti-Dactylomelina-P
A determinação dos títulos de anticorpos foi realizada pela técnica do 'RW EORW.
Para tanto, 10 µl das soluções de proteína foram aplicados sobre membranas de PVDF. Em
seguida, as membranas foram incubadas nos soros anti-dactylomelina-P puros e diluídos,
incubadas por 2 horas a 37 °C. As membranas foram lavadas 5 vezes com tampão Tris-HCl
0,05 M pH 7,4, 0,15 M NaCl, 5 % de leite desnatado e 0,05 % de Tween 20, a intervalos de
10 minutos. Após a lavagem, foram incubadas com o anticorpo secundário (IgG de cabra
anti-IgG de coelho conjugada com peroxidase), a 37 °C, por 1 hora. Foram feitas novas
lavagens e ao término, foi adicionada a solução reveladora (OPD e peróxido de hidrogênio,
Sigma Chemicals Co, St Louis, USA) preparada de acordo com as especificações do
fabricante. As membranas foram lavadas com água grau milli-Q, secas e os títulos
estimados. Provas em branco foram feitas substituindo-se os imunessoros pelo soro pré-
imune.
5.8.3. Estudos de Imunolocalização
5.8.3.1. Preparação de Extratos da Hemolinfa e de Órgãos da $SO\VLDGDFW\ORPHOD
Inicialmente, a hemolinfa foi retirada com seringa da cavidade do coração da
lesma. O animal foi colocado no refrigerador para diminuir seu metabolismo de forma a
facilitar a sua dissecação. Foram retirados, cuidadosamente, a glândula de tinta, glândula
opalina, glândula digestiva, glândula de albúmen, papo e coração. Esses órgãos foram
macerados em gral com 5 ml de tampão Tris-HCl 50 mM pH 7,4, 0,15 M de NaCl. Após
maceração, os extratos foram centrifugados a 15.000 J por 10 minutos a 4 °C para obtenção
do sobrenadante. A hemolinfa foi diluída 1:2 no tampão e centrifugada nas mesmas
NOGUEIRA, V. L. R. 2005 Papel de Proteínas Presentes na Tinta...
35
condições dos sobrenadantes. Esses extratos foram utilizados para determinação de
proteínas e ensaios imunoquímicos.
5.8.3.2. :HVWHUQEORW
A presença da dactylomelina-P na hemolinfa e/ou nos demais órgãos da $.
GDFW\ORPHODfoi estudada pela técnica de ZHVWHUQEORW de acordo com a metodologia descrita
por TOWBIN HW DO. (1979). Após eletroforese em gel de poliacrilamida, na presença de
SDS, as proteínas foram transferidas para membranas de PVDF em uma unidade de
transferência semi-seca (Multiphor II, Pharmacia). A eletrotransferência foi feita a corrente
constante de 0,8 mA/cm
2
, por 4 horas. A eficiência da transferência foi checada corando-se
as membranas com vermelho de Ponceau 0,5 % até o aparecimento das bandas protéicas.
Em seguida, a membrana foi lavada com água grau milli-Q para remoção do corante e
procedeu-se o ensaio imunoquímico.
A membrana foi bloqueada durante 1 hora, à temperatura ambiente, com tampão
Tris-HCl 0,05 M pH 7,4 contendo NaCl 0,15 M e leite em pó desnatado 2 % (m/v). Em
seguida, foi incubada com anticorpo anti-dactylomelina-P diluído (1:100) no tampão
bloqueador por 16 horas, sob refrigeração. Após a incubação, a membrana foi lavada 4x, a
intervalos de 10 minutos com o mesmo tampão, isento de leite. A membrana foi, então,
incubada com o anticorpo secundário (IgG de cabra anti-IgG de coelho conjugada com
peroxidase), diluído (1:500) no tampão bloqueador, por 2 horas, à temperatura ambiente,
após o que, foi lavada como anteriormente. A reação foi visualizada após adição da
solução reveladora (OPD e peróxido de hidrogênio, Sigma Chemicals Co, St Louis, USA),
preparada de acordo com as instruções do fabricante. Após o aparecimento da cor, a
membrana foi lavada com água grau milli-Q, secas e guardadas ao abrigo da luz, até serem
fotografadas.
NOGUEIRA, V. L. R. 2005 Papel de Proteínas Presentes na Tinta...
36
5.8.3.3. Localização da Dactylomelina-P na Glândula de Tinta por Imunohistoquímica
Glândulas de tinta retiradas de animais recém dissecados foram embebidas em
tampão fosfato de sódio 50 mM pH 7,2 preparado em água do mar estéril por 1 h e,
então fixada por 2 h, no mesmo tampão contendo 4 % paraformaldeído e 0,01 %
glutaraldeído. Após a fixação, o material passou por três lavagens (de 1 h cada) em
tampão calcodilato de sódio 50 mM pH 7,2 e foi desidratado e infiltrado com resina LR
*ROG. Para desidratação e infiltração as amostras foram incubadas em concentrações
crescentes de metanol e posteriormente de LR * ROG (ao abrigo da luz), da seguinte forma:
metanol 50 % por 30 minutos, metanol 70 % por 1 hora, metanol 90 % por 1 hora,
metanol 50 % + 50 % de LR *ROG por 4 horas, metanol 30 % + 70 % de LR *ROG por 18
horas e 100 % de LR *ROG, por 3 dias. Após esse período, as amostras foram deixadas
polimerizar em resina LR *ROG contendo 0,05 % de benzil e 0,05 % de peróxido de
benzoil (catalizadores) sob a incidência de luz branca por um período de 5 dias. Todas as
etapas foram feitas a - 20 ° C.
Uma vez emblocadas, as amostras foram seccionadas em micrótomo de
navalhas de aço. Cortes seriados de 1 a 3 µm de espessura foram coletados em lâminas e,
montados para análise histoquímica. Os cortes foram incubados em cloreto de amônio 50
mM pH 5,05 por 30 min, para bloqueio de carga., incubados em tampão fosfato de sódio
(PBS) 10 mM, pH 7,4 contendo NaCl 150 mM e BSA 1 % por 20 min para bloqueio de
sítios não específicos e, depois, com o soro pré-imune de coelho (1:100) em PBS-BSA por
20 min. Ao final, foi adicionado o anticorpo anti-dactylomelina-P (1:50, 1:100) em PBS-
BSA por 2 h, em câmara úmida. O material foi lavado com PBS-BSA (10x, 10 minutos).
Após as lavagens, o material foi incubado, em câmara úmida, com anticorpo secundário
(anti-IgG de coelho 1:100 conjugado com ouro coloidal 10 nm) em PBS-BSA por 2 h. O
material foi novamente lavado com PBS-BSA (10x, 10 minutos), com PBS (2x, 10
minutos) e, finalmente, lavado com água grau milli-Q (2x, 10 minutos).
Após esses procedimentos, foi retirado o excesso de água das lâminas e feita a
revelação da reação imunológica através da precipitação de prata, reunindo quantidades
iguais de cada um dos substratos adquiridos comercialmente (.LW ,QWHQ 6(
%/ 6LOYHU
HQKDQFHPHQW) e a mistura vertida sobre as lâminas. Após 8 min, as lâminas foram lavadas,
NOGUEIRA, V. L. R. 2005 Papel de Proteínas Presentes na Tinta...
37
abundantemente com água destilada, secas e observadas em microscópio óptico de campo
claro. As provas controles de marcação foram feitas usando o soro pré-imune de coelho.
5.9. Interação da Dactylomelina-P com a bactéria 6WDSK\ORFRFFXV DXUHXV por Microscopia
Eletrônica de Transmissão
A interação da dactylomelina-P com a bactéria 6W. DXUHXV foi visualizada em
microscópio eletrônico de transmissão. As células foram pré-incubadas com a
dactylomelina-P (500µg/ml) e lavadas, sob centrifugação, com Tris-HCl 100 mM, pH 8,0
(5x). Em seguida, foram lavadas 3 vezes (10 minutos) com tampão fosfato de sódio 100
mM, pH 7,3. As células foram, então, fixadas com uma solução 0,1 % de glutaraldeído e 2
% de paraformaldeído preparada em tampão fosfato de sódio 100 mM, pH 7,3, durante 2
horas, à temperatura ambiente. Após a fixação, foram novamente lavadas com o tampão
fosfato de sódio 100 mM, pH 7,3, como anteriormente. O material foi desidratado em uma
série de metanol a 30 % (30 min), 70 % (1h) e 90 % (1 h), à temperatura ambiente e
infiltrado em resina LR *ROG: 50 % de metanol e 50 % de resina (1 h), 30 % de metanol e
70 % de resina (7 h) e 100 % de resina (12 h) em câmara fria a -20 °C. O material foi
incluído em resina contendo catalisador, por um período de 4 dias, a -20 °C, realizando-se
trocas a cada 24 horas. Após este tratamento, o material foi polimerizado na presença de luz
ultravioleta, a -20 °C, cortado em secções ultrafinas (60nm) e colocadas sobre grades de
níquel forradas com filme IRUPYDU cobertas com carbono. O material foi incubado com
tampão fosfato de sódio (PBS) 10 mM, pH 7,4 com NaCl 0,15 M e 1 % de BSA por 30
minutos e depois, com o anticorpo anti-dactylomelina-P (1:100) por 2 horas. Foram feitas
lavagens com PBS-BSA (5x, 10 minutos). Após as lavagens o material foi incubado com o
anticorpo secundário, anti-IgG de coelho *ROG (1:50) por 2 horas. O material foi novamente
lavado PBS-BSA (5x, 10 minutos) e com água deionizada (5x, 5 minutos). Provas de
automarcação foram feitas substituindo-se o anticorpo anti-dactylomelina-P pelo soro pré-
imune. A observação e confecção das micrografias foram feitas em um microscópio
eletrônico de transmissão (ZEISS 900).
NOGUEIRA, V. L. R. 2005 Papel de Proteínas Presentes na Tinta...
38
5(68/7$'26
6.1. Composição de Proteínas da Tinta de $. GDFW\ORPHOD
A analise da tinta por eletroforese bi-dimensional revelou a presença de
aproximadamente 41 “spots” de proteínas (Figura 5) com predominância de pontos
isoelétricos ácidos e massa moleculares abaixo de 70 kDa. Três regiões do gel merecem
destaque: a primeira na faixa de 60 kDa e pI 5,0, onde se observa a presença de um único
“spot” forte e arrastado; a segunda região onde se concentram a maioria das proteínas, com
massas abaixo de 30 kDa e pIs entre 4,0 e 5,0 e a terceira na região de baixa massa
molecular e pI próximo a pH 7,0, onde se destaca um “spot” proeminente em torno de 15
kDa.
FIGURA 5 – Eletroforese bidimensional em gel de poliacrilamida da tinta (20
µgP) de $. GDFW\ORPHOD. A focalização isoelelétrica da amostra foi feita em membrana de
pHs 4,0 a 7,0. Marcadores de massa molecular: 250 kDa, 160 kDa, 105 kDa, 75 kDa, 50
kDa, 30 kDa, 25 kDa, 15 kDa e 10 kDa.
0U
N
'D
N
'D
N
'D
N
'D
N
'D
N
'D
N
'D
N
'D
N
'D
N
'D
S+
NOGUEIRA, V. L. R. 2005 Papel de Proteínas Presentes na Tinta...
39
6.2. Purificação da Dactylomelina-P
Antes de iniciar a purificação da dactylomelina-P, a tinta bruta foi dialisada
exaustivamente contra água destilada, para eliminação de substâncias de baixas massas
moleculares e pigmentos. A tinta dialisada foi submetida a um ensaio preliminar de
atividade antibacteriana contra a bactéria gram-positiva 6WDSK\OFRFFXV DXUHXV ATCC
25923, a fim de confirmar a reatividade do princípio ativo.
A purificação da dactylomelina-P foi feita de acordo com a metodologia descrita
por MELO HWDO. (2000), com modificações. A tinta dialisada foi precipitada com sulfato de
amônio para obtenção da fração 30-60%, rica em dactylomelina-P, e submetida à
cromatografia de troca iônica seguida de interação hidrofóbica.
Os resultados das determinações de proteína e atividades antibacteriana das
frações obtidas da precipitação estão mostrados na tabela 1.
TABELA 1 – Teor de proteínas e atividade antibacteriana contra 6W. DXUHXV das frações
protéicas obtidas a partir da precipitação da tinta de $. GDFW\ORPHOD com
sulfato de amônio.
)UDo}HV
3URWHtQD7RWDO
PJPOGH7LQWD
'LkPHWURGRKDORPP
OGLVFR
)
)
)
6RE)LQDO
NOGUEIRA, V. L. R. 2005 Papel de Proteínas Presentes na Tinta...
40
Os resultados estão de acordo com aqueles obtidos por Melo HW DO. (2000), com
as frações 0-30% e 30-60% detendo toda a atividade
antibacteriana (Figura 6). Entretanto,
como a fração 30-60% é mais potente e concentra três vezes mais proteínas, esta foi
utilizada para a purificação da dactylomelina-P.
FIGURA 6 – Atividade das frações protéicas e da tinta de $. GDFW \ORPHOD contra a bactéria
6W. DXUHXV. Tb: tinta bruta; Td: tinta dialisada; Frações obtidas por
fracionamento da tinta com sulfato de amônio: F
0/30%
,F
30/60%
eF
60/90%
. Todos
os discos receberam uma alíquota de 30 µl.
O resultado da cromatografia de troca iônica da fração 30-60% está mostrado na
Figura 7. Foram obtidos quatro picos, eluídos sequencialmente com tampão Tris-HCl 0,05
M pH 7,0 contendo 0,2 M , 0,5, e 1,0 de NaCl, e NaOH 0,5 M. A cromatografia foi
monitorada através de medidas de absorbância a 280 nm e atividade antibacteriana contra
6W. DXUHXV.
7E
)
)
)
7G
NOGUEIRA, V. L. R. 2005 Papel de Proteínas Presentes na Tinta...
41
FIGURA 7 – Cromatografia de troca iônica em coluna de DE52-Metilcelulose da F
30/60%
obtida pela precipitação da tinta de $. GDFW\ORPHOD com sulfato de amônio.
60 mg de proteínas da fração foram dissolvidos em 10 ml de Tris-HCl 50
mM, pH 7,0, e aplicados a coluna (15,5 x 3,5 cm), previamente equilibrada
com o mesmo tampão. O pico (DEII) foi eluído com 0,5 M de NaCl incluído
no tampão. Foram coletadas frações de 3,0 ml/tubo a um fluxo constante de
40 ml/h. Absorbância (A
280nm
). Atividade antibiótica (medida em mm do
halo de inibição de 6W. DXUHXV).
O pico DE-II, concentrando toda a atividade antibiótica, foi submetido à
cromatografia de interação hidrofóbica em coluna de Phenyl-Sepharose. O resultado desta
cromatografia está mostrado na Figura 8. Inicialmente foi aplicado o mesmo tampão de
equilíbrio, tampão Tris-HCl 0,05 M pH 7,0 contendo 1,7 M de sulfato de amônio, seguido
da eluição com este tampão mas com 0,2 M de sal. Após a saída do primeiro pico e da
leitura voltar a linha de base, foram aplicados nesta ordem, tampão sem sal, água destilada
0
0,5
1
1,5
2
2,5
1 11 21 31 41 51
)UDo}HV
$EV QP
0
5
10
15
20
25
+DORPP
Absorbância Atividade Antibiótica
0
1D2+
0
0
NOGUEIRA, V. L. R. 2005 Papel de Proteínas Presentes na Tinta...
42
e NaOH 0,5 M. A cromatografia foi monitorada através de medidas de absorbância a 280
nm e atividade antibacteriana contra 6W. DXUHXV.
FIGURA 8 – Cromatografia de interação hidrofóbica em coluna de Phenyl-Sepharose do
pico DEII obtido da cromatografia de troca iônica. 10,0 mg de proteínas
foram dissolvidos em 5 ml de Tris-HCl 50 mM, pH 7,0, com 1,7 M de
sulfato de amônio e aplicados a coluna (10,0 x 2,0 cm), previamente
equilibrada com o mesmo tampão. O pico (PHSII) foi eluído com tampão
sem sulfato de amônio. Foram coletadas frações de 3,0 ml/tubo a um fluxo
constante de 40 ml/h. Absorbância (A
280nm
). Atividade antibiótica (medida
em mm do halo de inibição de 6W. DXUHXV).
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
1 6 11 16 21 26 31 36 41 46
)UDo}HV
$EVQP
0
5
10
15
20
25
+DORPP
Absorbância Atividade Antibiótica
61+ 6
&1+ 6
+
1D2+
NOGUEIRA, V. L. R. 2005 Papel de Proteínas Presentes na Tinta...
43
Os teores de proteínas dos picos das cromatografias estão mostrados Tabela 2.
TABELA 2 – Purificação
a
da proteína com atividade antibacteriana da tinta de $SO\VLD
GDFW\ORPHOD.
)UDomR 3URWHtQD $WLYLGDGH$QWLEDFWHULDQD
PJ3PO
PJPO
ËQGLFHGH
3XULILFDomR
7LQWDEUXWD
)
'(,,
3+6,,
GDFW\ORPHOLQD3
a
Estágios de purificação como descritos em Métodos.
b
mg de proteína referente a 100 ml de tinta.
c
Concentração de proteína capaz de inibir o crescimento de 6W. DXUHXV com formação de halo
de inibição de 16-18 mm.
d
Índice de purificação calculado a partir da razão entre concentrações da tinta pelas frações
protéicas.
e
Dactylomelina-P isolada por cromatografia de interação hidrofóbica em gel de Phenyl-
Sepharose.
NOGUEIRA, V. L. R. 2005 Papel de Proteínas Presentes na Tinta...
44
Os ensaios de atividade antibacteriana das frações e picos das cromatografias estão
reunidos na Figura 9 e a estratégia de purificação utilizada está sumarizada na Figura 10.
FIGURA 9 – Atividade dos picos obtidos das cromatografias de troca iônica (DEII),
interação hidrofóbica (PHSII), da F
30/60 %
e da tinta (Tp) do molusco $.
GDFW\ORPHOD contra bactéria 6W. DXUHXV. A: antibiótico controle:
Vancomicina.
NOGUEIRA, V. L. R. 2005 Papel de Proteínas Presentes na Tinta...
45
FIGURA 10 – Esquema de purificação adotado para o isolamento da dactylomelina-P, uma
proteína com atividade antibacteriana presente na tinta do molusco $SO\VLD
GDFW\ORPHOD.
7LQWDS~USXUD
&HQWULIXJDomR
J PLQ
'LiOLVH
.'DFXWRII
)UDFLRQDPHQWR
1+ 62
)
&URPGH7URFD
,{QLFD
3',,
&URPGH
,QWHUDomR
+LGURIyELFD
'DFW\ORPHOLQD3
$WLYLGDGH
$QWLEDFWHULDQD3$*(6'6
3$*(6'6
$WLYLGDGH
$QWLEDFWHULDQD
NOGUEIRA, V. L. R. 2005 Papel de Proteínas Presentes na Tinta...
46
6.3. Caracterização da Dactylomelina-P
6.3.1. Estimativa da Massa Molecular
A massa molecular aparente da dactylomelina-P, calculada a partir do Rf em gel
de poliacrilamida em presença de SDS, foi 59,8 kDa. A proteína mostra o mesmo perfil na
presença ou ausência de β-mercaptoetanol, tratando-se, portanto, de uma proteína
monomérica (Figura 11).
FIGURA 11 – Eletroforese em gel de poliacrilamida na presença de SDS da fração protéica
e picos das cromatografias obtidos durante a purificação da dactylomelina-
P. Raia 1 – Marcador molecular; Raia 2 – F
30/60%
; Raia 3 – Pico DEII e
Raia 4 – Pico PSII. Amostras: 20 µg/poço.
NOGUEIRA, V. L. R. 2005 Papel de Proteínas Presentes na Tinta...
47
6.3.2. Ponto Isoelétrico
A eletroforese bidimensional da dactylomelina-P confirmou a sua massa
molecular e revelou tratar-se de uma proteína ácida de pI 5,0 (Figura 12).
FIGURA 12 – Ponto isoelétrico (pI 5,0) e massa molecular da dactylomelina-P (60 kDa)
determinados em gel de poliacrilamida por eletroforese bidimensional.
6.3.3. Composição de Aminoácidos
Na composicão de aminoácidos da dactylomelina-P destacam-se as
contribuições majoritárias dos aminoácidos metionina, ácido glutâmico, ácido aspártico,
tirosina, serina e prolina, e baixíssimos teores de histidina e cisteína (Tabela 3).
N'D
S+
NOGUEIRA, V. L. R. 2005 Papel de Proteínas Presentes na Tinta...
48
TABELA 3 – Composição de aminoácidos da dactylomelina-P. Os valores estão expressos
em mg para cada 10 g de proteína liofilizada.
$PLQRiFLGR 'DFW\ORPHOLQD3
Ácido glutâmico
132,42
Ácido aspártico
123,74
Prolina
107,41
Leucina
74,72
Valina
67,86
Treonina
75,27
Glicina 77,42
Alanina 68,25
Serina 109,09
Tirosina 122,69
Arginina
68,05
Fenilalanina
72,39
Lisina
40,86
Isoleucina
30,68
Cisteína 17,22
Metionina
240,22
Histidina
19,87
NOGUEIRA, V. L. R. 2005 Papel de Proteínas Presentes na Tinta...
49
6.3.4. Determinação de Carboidratos
A dactylomelina-P apresenta um baixo teor de açúcar redutor, da ordem de 1%.
A natureza glicoprotéica da dactylomelina-P não foi confirmada através da revelação com
ácido periódico de Schiff em gel de poliacrilamida (Figura 13).
FIGURA 13 – Géis de eletroforeses em poliacrilamida da dactylomelina-P após coloração
com Coomassie brilliant blue (A) e Ácido periódico de Schiff (B). Raia 1 -
controle positivo, Peroxidase; Raia 2 - Dactylomelina-P. Amostras:
1mgP/ml.
6.3.5. Estabilidade Térmica
A proteína manteve sua atividade biológica inalterada após aquecimento a 55 ºC
por 30 minutos. A atividade antibacteriana, entretanto, foi significativamente reduzida com
a elevação da temperatura, sendo a proteína completamente desnaturada a 60 Û& D SDUWLU GH
10 min (Figura 14).
$
%
NOGUEIRA, V. L. R. 2005 Papel de Proteínas Presentes na Tinta...
50
FIGURA 14 – Ação do calor na atividade antibacteriana da dactylomelina-P. C: disco com 30
µl de dactylomelina-3 JPO Qão aquecida; e discos com 30 µlde
dactylomelina-3
JPO DTXHFLGD D H ºC por diferentes
períodos de tempo.
& &
& &
& &
&
NOGUEIRA, V. L. R. 2005 Papel de Proteínas Presentes na Tinta...
51
6.3.6. Influência do pH na Atividade da Dactylomelina-P
A dactylomelina-P teve sua atividade reduzida em meio ácido, sendo
completamente desnaturada a pH 2,0. Ao contrário, sua atividade manteve-se
completamente inalterada em meio alcalino (Figura 15).
FIGURA 15 – Influência do pH na atividade da dactylomelina-P contra 6W. DXUHXV. C: disco
com 30 µl de dactylomelina-P (500µg/ml) em pH 7,0; discos com 30 µlde
dactylomelina-P (500µg/ml) previamente tamponada em diferentes pHs: 2,0
a 12,0.
6.3.7. Resistência a Protease
Não foi detectada nenhuma alteração na atividade antibacteriana da
dactylomelina-P após seu tratamento com protease, mostrando ser a mesma resistente à
digestão com essa enzima.
NOGUEIRA, V. L. R. 2005 Papel de Proteínas Presentes na Tinta...
52
6.4. Atividades Biológicas da Tinta e Dactylomelina-P
6.4.1. Espectro de Ação
A tinta bruta e a dactylomelina-P exibiram ação antibacteriana de amplo
espectro, agindo contra todas as bactérias testadas, incluindo Gram-positivas, Gram-
negativas e algumas cepas marinhas (Tabela 4). Dentre os microrganismos testados, as
gram-positivas foram mais sensíveis, especialmente a bactéria 6W. DXUHXV.
TABELA 4 – Espectro de atividade antibacteriana da tinta do molusco $. GDFW\ORPHOD e da
dactylomelina-P.
%$&7e5,$6 +$/2'(,1,%,d2PP
*UDP±3RVLWLYDV
7LQWD%UXWD
P/GLVFR
'DFW\ORPHOLQD3
JPO
%DFLOOXVFHUHXV
8,1 ± 0,7 16 ± 0,9
%. VXEWLOLV
7,9 ± 1,0 15 ± 0,5
Cepa Marinha 02
11,5 ± 1,0
25 ± 1,9
6DUFLQDVS
11,5 ± 2,1 17 ± 1,2
6WDSK\ORFRFFXVDXUHXV
15,5 ± 1,2 21 ± 1,3
*UDP1HJDWLYDV
$FLQHWREDFWHUsp.
10,3 ± 0,8 15 ± 1,0
Cepa Marinha 01
11,7 ± 1,0
19 ± 1,7
Cepa Marinha 03
11,0 ± 1,3
17 ± 1,1
(QWHUREDFWHUDHURJHQHV
9,8 ± 0,8 10 ± 0,6
(. DJORPHUDQV
9,2 ± 1,2 10 ± 0,3
(FORDFDH
10,5 ± 1,0 13 ±0,3
(JHUJRYLDH
9,2 ± 0,8 10 ± 0,8
(VFKHULFKLDFROL
8,7 ± 0,8 11 ± 0,8
.OHEVLHOODSQHXPRQLDH
8,6 ± 1,1 10 ± 1,2
3URWHXVPLUDELOLV
9,7 ± 1,0 15 ± 1,6
6DOPRQHOODHQWHULWLGLV
9,3 ± 1,0 13 ± 0,6
6. W\SKL
8,3 ± 1,2 13 ± 0,2
6. W\SKLPXULXP
10,0 ± 0,5 13 ±0,5
6HUUDWLDPDUFHVFHQV
10,4 ± 0,9 14 ±0,9
6KLJHOODIOH[QHUL
9,0 ± 0,6 13 ± 0,9
9. &KROHUDH
10,0 ± 0,6 13 ±0,3
9LEULRSDUDKDHPRO\WLFXV
9,0 ± 0,3 15 ± 0,5
&
NOGUEIRA, V. L. R. 2005 Papel de Proteínas Presentes na Tinta...
53
A tinta e a dactylomelina-P não apresentaram qualquer atividade contra as
leveduras testadas. Entretanto, a tinta bruta inibiu de forma significativa o crescimento
vegetativo do fungo filamentoso 0XFRU sp. (Figura 16), embora não tenha mostrado
qualquer efeito sobre as demais espécies testadas (Tabela 5). Já a dactylomelina-P não
mostrou nenhuma atividade sobre o crescimento vegetativo de nenhum fungo filamentoso.
FIGURA 16± Ação da tinta bruta e da dactylomelina-P sobre o crescimento vegetativo do
fungo 0XFRU sp. A: tinta bruta (30 µl); B: dactylomelina-P (1 mg/ml).
%
%
$
$
NOGUEIRA, V. L. R. 2005 Papel de Proteínas Presentes na Tinta...
54
TABELA 5 – Atividade antifúngica em meio sólido da tinta e da dactylomelina-P.
(+): Inibição; (-): Ausência de inibição.
)XQJR
7LQWD%UXWD
POGLVFR
'DFW\ORPHOLQD3
PJ3PO
$VSHUJLOOXVFKHYDOLHU
$. QLJHU
&ROOHWRWULFKXPJORHVSRULRLGHV
&. NLNXFKL
&. OLQGHPXWKLDQXP
&. PXVDH
&. WUXQFDWXP
'UHVFKHOHUDsp
)XVDULXPR[\VSRUXP
). VRODQL
0XFRUsp.
1HXURVSRUDsp.
3HQLFLOOLXPKHUJXHL
3. ROLJDQGUXP
3KRPRSVLVsp.
5KL]RFWRQLDVRODQL
5KL]RSXVsp.
NOGUEIRA, V. L. R. 2005 Papel de Proteínas Presentes na Tinta...
55
A tinta bruta exibiu algum efeito sobre a germinação de conídios ou esporos
fúngicos, enquanto a dactylomelina-P não mostrou nenhuma ação sobre essas células. A
tinta inibiu de forma parcial ou completa a germinação dos esporos e, mesmo quando
houve germinação, não se observou o desenvolvimento além do estágio de hifa primária
(Tabela 6 e Figura 17).
Uma preparação da tinta enriquecida com peptídeos não apresentou nem
atividade contra 6W. DXUHXV nem contra o 0XFRU sp.
TABELA 6 – Atividade antifúngica em meio líquido da tinta bruta e da dactylomelina-P. 1:
Inibição da germinação de esporos; 2: Inibição no desenvolvimento de hifas
7LQWDEUXWD
POGLVFR
'DFW\ORPHOLQD3
PJPO
)XQJR
*HUPLQDomR
&UHVFLPHQWR
YHJHWDWLYR
*HUPLQDomR
&UHVFLPHQWR
YHJHWDWLYR
$VSHUJLOOXVQLJHU -+
&ROOHWRWULFKXP
OLQGHPXWKLDQXP
++
&. PXVDH ++
0XFRUsp. ++
1HXURVSRUDsp. -+
5KL]RSXVsp. -+
(+): Inibição; (-): Ausência de inibição.
NOGUEIRA, V. L. R. 2005 Papel de Proteínas Presentes na Tinta...
56
FIGURA 17 – Fotomicrografias de culturas do fungo &ROOHWRWULFXP OLQGHPXWKLDQXP
desenvolvidas a partir de conídios cultivados em meio contendo
dactylomelina-P ou tinta bruta de $. GDFW\ORPHOD. (A) Controle, conídios
incubados em Caldo Sabouraund; (B) Conídios incubados com a tinta
bruta de $. GDFW\ORPHOD e (C) Conídios incubados com a dactylomelina-P.
Esfregaços corados com lactofenol azul de algodão. Aumento: 400 x.
$%
&
NOGUEIRA, V. L. R. 2005 Papel de Proteínas Presentes na Tinta...
57
6.4.2. Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração Bactericida Mínima (CBM)
A dactylomelina-P mostrou efeito bacteriostático contra 6W. DXUHXV a 0,2 JPO
mas foi bactericida para a mesma bactéria na dose de 4,0 JPO $V &,0 H &%0
promoveram halos de inibição menor ou igual a 12 mm e maior ou igual a 14 mm,
respectivamente, em ensaios por difusão em placa (Figura 18).
FIGURA 18 – Determinação da concentração inibitória mínima (CIM) da dactylomelina-P
para 6W. DXUHXV pelo método de difusão em placa. Discos com concentrações
de dactylomelina-P variando de 4-500 µg/ml.
6.5.4. Interação da dactylomelina-P com a bactéria 6W. DXUHXV
A microscopia eletrônica de transmissão mostrou uma intensa marcação da
dactylomelina-P junto à parede celular e a membrana plasmática da bactéria, prováveis
locais de ação da proteína (Figura 19).
NOGUEIRA, V. L. R. 2005 Papel de Proteínas Presentes na Tinta...
58
FIGURA 19 – Fotomicrografias de células de 6WDSK\ORFRFFXV DXUHXV cultivadas em meio
sem a proteína dactylomelina-P (A) e em meio contendo 500 µg/ml de
dactylomelina-P (B). Aumento 85.000 x.
$
%
NOGUEIRA, V. L. R. 2005 Papel de Proteínas Presentes na Tinta...
59
6.4.3. Atividade Hemaglutinante
A dactylomelina-P e a tinta aglutinaram os eritrócitos de rato, camundongo e
coelho tratados enzimaticamente até as concentrações de 250, 250 e 500 µg/ml,
respectivamente.
6.4.4. Atividade Anticoagulante
A tinta e a dactylomelina-P não só não apresentaram atividade anticoagulante
para eritrócitos de rato como promoveram a coagulação mais rápida desses eritrócitos
quando comparados com o controle positivo.
6.4. 5. Atividades Enzimáticas
Nem a tinta nem a dactylomelina-P mostraram atividade quitinásica nem
glucanásica até a concentração de 1mg/ml.
6.5. Potencial Tóxico da Dactylomelina-P
6.5.1. Atividade Hemolítica
A dactylomelina-P não hemolisou nenhum dos eritrócitos testados até a
concentração de 1mgP/ml.
.
6.5.2. Atividade Citotóxica
A dactylomelina-P não apresentou atividade citotóxica para as linhagens de
células testadas até uma concentração de 25µg/ml.
NOGUEIRA, V. L. R. 2005 Papel de Proteínas Presentes na Tinta...
60
6.5.3. Atividade Tóxica em Camundongos
A dose letal média (DL50) da dactylomelina-P ficou entre 60-100 mg de
proteína por Kg de massa corpórea, sendo considerada como moderadamente tóxica.
6.6. Imunolocalização da Dactylomelina-P
6.6.1. Produção de Anticorpos Policlonais
A via e o esquema de imunização adotados neste trabalho se mostraram
apropriados para a obtenção de anticorpo policlonal anti-dactylomelina-P. Os imunessoros
de 35 e 42 atingiram títulos de até 1:5000, determinados por GRW EORW. Esses anticorpos
foram utilizados nos ensaios de localização da dactylomelina-P no animal e na interação
desta proteína com a bactéria 6W. DXUHXV.
6.6.2. Estudos de Imunolocalização da Dactylomelina-P
A Figura 20 mostra a anatomia interna da lesma $. GDFW\ORPHOD para destacar
que os órgãos usados na preparação dos extratos utilizados nos estudos de
imunolocalização da dactylomelina-P foram retirados sem contaminação cruzada dos
mesmos.
NOGUEIRA, V. L. R. 2005 Papel de Proteínas Presentes na Tinta...
61
FIGURA 20 – Anatomia interna da lesma $SO\VLD GDFW\ORPHOD, destacando dentre outros a
localização do papo, hepatopâncreas, glândula de albúmem e glândula
opalina.
O ensaio de ZHVWHUQ EORW revelou que o anticorpo anti-dactylomelina-P
reconheceu proteínas de massa molecular correspondente a dactylomelina-P nas glândulas
opalina, de tinta e albúmem. Entretanto, o anticorpo não reagiu com nenhuma proteína de
massa molecular semelhante à dactylomelina-P nos extratos da glândula digestiva, coração,
papo e hemolinfa (Figura 21).
6.6.3. Localização da Dactylomelina-P na Glândula de Tinta
Os ensaios de imunohistoquímica revelaram ser a vesícula de tinta o local de
síntese e/ou armazenamento da dactylomelina-P, já que não foi detectada marcação em
nenhuma outra estrutura da glândula da tinta (Figura 22).
NOGUEIRA, V. L. R. 2005 Papel de Proteínas Presentes na Tinta...
62
FIGURA 21 – : HVWHUQ EORW de extratos de órgãos e da hemolinfa da lesma $. GDFW\ORPHOD.
A: Membrana de PVDF revelando as proteínas reconhecidas pelo anticorpo
anti-dactylomelina-P. Raia 1: dactylomelina-P; Raia 2: Pico DEII, Raia 3:
hemolinfa; Raia 4: glândula opalina; Raia 5: glândula digestiva; Raia 6:
coração; Raia 7: glândula de tinta; Raia 8: glândula de albúmen e Raia 9:
Papo. B: Eletroforese em gel de poliacrilamida das amostras para
comparação, corada com Coomassie Brilliant Blue.
%
$
NOGUEIRA, V. L. R. 2005 Papel de Proteínas Presentes na Tinta...
63
FIGURA 22 – Imunohistoquímica da glândula de tinta da lesma $. GDFW\ORPHOD revelada
pelo anticorpo anti-dactylomelina-P. A, B e C: Cortes observados sem
coloração (200, 400, 800x); D: Corte corado com azul de toluidina (400x)
E: Corte controle, preparado com soro pré-imune, observado sem
coloração (200x) e F: Corte controle, preparado com soro pré-imune,
corado com azul de toluidina (400x). As setas apontam os locais da
dactylomelina-P na glândula.
(
)
$
%
&
'
NOGUEIRA, V. L. R. 2005 Papel de Proteínas Presentes na Tinta...
64
',6&8662
Em todos os grupos de organismos encontramos exemplos de ataque, defesa e
respostas comportamentais baseados em compostos químicos. Para os invertebrados
marinhos, que não são capazes de sintetizar anticorpos como os vertebrados, os compostos
químicos, ao lado das defesas estruturais, representam importantes mecanismos de defesa
contra patógenos e/ou predadores (PEREIRA & SOARES, 2002).
As lesmas marinhas dos gêneros $SO\VLD, %XUVDWHOOD e 'RODEHOOD acumulam e/ou
produzem diversos compostos biologicamente ativos incluindo fenóis, glicosídeos,
aglutininas, proteínas antimicrobianas, proteínas citolíticas, proteínas antitumorais, toxinas,
enzimas, etc., a partir de diferentes tecidos e secreções. Acredita-se que muitas dessas
substâncias participam passivamente e/ou ativamente na defesa química desses moluscos
(KAMIYA HW DO., 1986, 1989; KISUGI HW DO., 1989; YAMAZAKI HW DO., 1989 ab, 1990;
IIJIMA HW DO., 1995, 2003; TAKAMATSU HW DO., 1995; MELO HW DO., 1998, 2000;
PETZELT HW DO., 2002; RAGAJANAPATHI HW DO., 2002; JIMBO HW DO., 2003; BUSZKE HW
DO., 2004; YANG HW DO., 2005).
Indiscutivelmente, a secreção mais peculiar da maioria das lesmas marinhas é a
tinta que elas liberam quando importunadas. A tinta possui substâncias de baixa massa
molecular, como os pigmentos derivados de algas vermelhas que esses animais consomem
(CHAPMAN & FOX, 1969), bem como várias proteínas que parecem ser produzidas pelo
animal (COELHO HW DO., 1998). Dentre essas, encontram-se proteínas com atividade
antiviral (RAGAJANAPATHI HW DO., 2002), antibacteriana (MELO HW DO., 2000),
antifúngica (YANG HW DO., 2005) e antitumoral (BUTZKE HW DO., 2005). Embora já se
conheça muito sobre as características físico-químicas de algumas dessas proteínas, com
algumas delas já tendo inclusive sido seqüenciadas (YANG HW DO., 2005; BUTZKE HW DO.,
2005), o conhecimento sobre a síntese, processamento, forma de armazenamento na
glândula de tinta e, principalmente, o papel dessas proteínas no animal, ainda permanece no
campo especulativo.
O presente trabalho foi realizado com o intuito de trazer mais informações
acerca da composição de proteínas da tinta e avançar na caracterização físico-química e
biológica da dactylomelina-P, uma proteína antibacteriana de 60 kDa isolada da tinta de $.
NOGUEIRA, V. L. R. 2005 Papel de Proteínas Presentes na Tinta...
65
GDFW\ORPHODpor MELO HW DO. (2000). Qualquer informação pertinente a esse tema será de
grande contribuição para elucidação da origem desta proteína e de seu possível papel na
defesa do animal.
A análise da tinta bruta por eletroforese bidimensional trouxe, pela primeira vez,
novas informações acerca da riqueza de proteínas e peptídeos constituintes da tinta, além de
informações pertinentes a massa molecular e ponto isoelétrico dessas moléculas. Ao todo
foram discriminados 41 “spots”, a maioria de massa molecular abaixo de 70 kDa, além de
alguns peptídeos de baixa massa molecular, muitos dos quais não revelados por eletroforese
em uma dimensão. O “spot” correspondente a dactylomelina-P se destaca como um “spot”
forte e arrastado, provavelmente devido a interação com os pigmentos da tinta, na região de
60 kDa e pI 5,0. A relativa abundância desta proteína, aliada a outras características ainda a
serem discutidas neste trabalho, reforça a nossa hipótese do seu envolvimento na defesa do
animal contra patógenos e/ou predadores.
Como o próprio nome indica, a tinta é muito pigmentada e isto dificulta bastante
o isolamento de suas proteínas. Apesar dos pigmentos serem precipitados por solventes
orgânicos e ácidos, esses foram evitados neste trabalho por causar a desnaturação da
dactylomelina-P. Assim, optou-se pela diálise em membrana de 12 kDa de FXW RII para
eliminação de parte dos pigmentos e retirada de compostos de baixas massas moleculares.
Após a diálise, e antes de iniciar a purificação, a tinta bruta foi submetida a ensaios de
atividade antibacteriana, para confirmar a reatividade do material de partida.
A tinta dialisada foi centrifugada a 15.000 J por 20 minutos e o sobrenadante
precipitado nas mesmas condições sugeridas por MELO HW DO. (2000), de forma a obter a
fração 30-60%, rica em dactylomelina-P. Os resultados das determinações de proteína
confirmaram ser a fração 30-60% a
que
concentra
a maior quantidade de proteínas e a mais
potente atividade antibacteriana, sendo por isso utilizada nas etapas subseqüentes de
purificação. Neste trabalho foram usados alguns dos passos cromatográficos sugeridos por
MELO HW DO. (2000), com algumas modificações.
A resolução conseguida com a cromatografia de troca iônica neste trabalho foi
superior àquela conseguida por MELO HW DO. (2000). Na realidade a diferença residiu na
concentração de NaCl usada para a eluição do pico retido, ou seja, o pico que concentra a
atividade antibacteriana. Esse material foi completamente eluído com 0,5 M de NaCl, livre
NOGUEIRA, V. L. R. 2005 Papel de Proteínas Presentes na Tinta...
66
da contaminação com as proteínas eluídas com 1,0 M de NaCl, pico III. Como MELO HW
DO. (2000) aplicaram inicialmente 0,15 M de NaCl, obtiveram um pico arrastado, sem
resolução e, quando aplicaram 1,0 M de NaCl, para eluição do restante do material retido,
provavelmente levaram junto as proteínas contaminantes, correspondentes ao pico III deste
trabalho.
Embora a cromatografia de troca iônica seja bastante eficiente para purificação
da dactylomelina-P, esta ainda se apresenta bastante pigmentada. Como esses pigmentos
não foram removidos por filtração em gel como mostrado por MELO HW DO. (2000), esse
passo foi evitado. Assim, o pico DEII foi diretamente cromatografado em coluna de
Phenyl-Sepharose. A dactylomelina-P, pico II da Phenyl-Sepharose, foi eluída com tampão
Tris-HCl 50 mM, pH 7,0 sem sal, resultado semelhante ao descrito por MELO HW DO.
(2000).
A massa molecular da dactylomelina-P calculada por PAGE-SDS neste
trabalho, 59,8 kDa, ficou muito próximo dos 56,2 kDa, determinada por filtração em gel
(MELO HW DO., 2000).
Neste trabalho o ponto isolétrico da dactylomelina-P foi determinado por
eletroforese bidimensional, revelando tratar-se de uma proteína ácida, de pI 5,0. O ponto
isolétrico está de acordo com a sua composição de aminoácidos, rica em aminoácidos
polares carregados negativamente (Asx e Glx) e, com o fato de após seu tamponamento a
pH 7,0, ter sido adsorvida em uma matriz aniônica. O pI da dactylomelina-P é muito
próximo ao pI 4,59 da APIT, uma proteína antitumoral de 60 kDa, isolada da tinta de $.
SXQFWDWD (BUTZKE HW DO., 2005).
Uma outra característica da dactylomelina-P que merece destaque é o elevado
teor de metionina, aminoácido que participa de ligações covalentes do tipo S-S nas
proteínas, conferindo-lhes mais resistência à proteólise. A partir dessa informação é
possível se especular que a dactylomelina-P deva possuir uma estrutura secundária
estabilizada por pontes S-S e, que isso seria bastante apropriado para uma provável função
de defesa contra patógenos exógenos no ambiente marinho, sujeito a diversos tipos de
intempéries.
Quando se analisam algumas características das proteínas aplysianina-P, isolada
da tinta de $. NXURGDL (YAMAZAKI HW DO., 1989a), dolabelanina-P, isolada da tinta de '
NOGUEIRA, V. L. R. 2005 Papel de Proteínas Presentes na Tinta...
67
DXULFXODULD(YAMAZAKI HW DO., 1989b), escapina, proteína de 60 kDa isolada da tinta de
$. FDOLIRUQLFD, (YANG HW DO., 2005), APIT, proteína antitumoral de 60 kDa isolada da tinta
de $. SXQFWDWD (BUTZE HW DO., 2005), com a dactylomelina-P (MELO HW DO., 2000),
percebe-se que elas compartilham a propriedade de apresentarem algum tipo de atividade
biológica, serem liberadas pelo mesmo tipo de glândula, possuírem massa molecular
semelhante (~60 kDa), serem monoméricas, estáveis a variações de pH, resistentes a
proteases e desnaturadas entre 55 a 70 °C. Entretanto, diferem em suas composições de
aminoácidos, no grau de glicosilação e no tipo de atividade biológica.
Dactylomelina-P contém menos de 1% de sua massa de carboidratos neutros,
concentração tão baixa que não foi nem revelada como glicoproteína pelo ácido periódico
de Schiff. A escapina, da $. FDOLIRUQLFD, também possui uma baixa concentração de açúcar,
menos de 0,03% (YANG HW DO., 2005). Já aplysianina-P, dolabelanina-P e APIT são
consideradas glicoproteínas, embora no caso da APIT o conteúdo de carboidrato também
seja muito baixo, descobrindo-se prováveis sítios de glicosilação apenas após a seqüência
da proteína (BUTZKE HW DO., 2005). Esses resultados servem para mostrar que a
glicolização não é um fator essencial para atividade biológica dessas proteínas (YANG HW
DO., 2005).
Dactylomelina-P foi relativamente estável ao calor, preservando sua atividade
biológica quando aquecida a 55 ºC por 30 minutos. A partir desse tempo, houve uma
redução de sua atividade, que foi completamente abolida a 60 Û& DSyV PLQXWRV
Comportamento semelhante é observado para proteínas homólogas isoladas de tintas de
outras espécies de lesmas, que também são desnaturadas entre 55 e 70 °C
(RAJAGANAPATHI, 2002; YAMAZAKI, 1990; BUTZKE HW DO., 2005).
Dactylomelina-P se mostrou bastante estável a variações de pH entre 3-12.
Merece destaque a manutenção de sua atividade em meio alcalino, o que reforça uma
possível função exógena, no meio marinho, que é tipicamente alcalino. Embora sua
atividade biológica tenha sido reduzida em maio ácido, essa só foi completamente abolida a
pH menor que 3,0, o que reforça sua característica de molécula resistente.
Dactylomelina-P mostrou-se resistente à digestão com protease K, uma
endoprotease inespecífica. MELO HW DO. (2000) tinham relatado a resistência da
dactylomelina-P à tripsina. Esses resultados também permitem inferir sobre a resistência
NOGUEIRA, V. L. R. 2005 Papel de Proteínas Presentes na Tinta...
68
dessa proteína, sendo provável que a sua estrutura tridimensional, reforçada pela presença
de ligações S-S, impeça o acesso dessas enzimas a seus sítios de ação. Essa hipótese é
reforçada pelo comportamento da APIT, que é resistente a digestão por tripsina e protease
K na forma nativa, e é digerida por essas enzimas após desnaturada pelo calor (BUTZKE HW
DO., 2005).
Todas as características físico-químicas e moleculares da dactylomelina-P
descritas até aqui, isto é: proteína monomérica, com teor relativamente alto de metionina,
moderadamente resistente ao calor, resistente a tripsina, protease K e a extremos de pH,
aliada ao fato de ser a proteína mais abundante da tinta, reforçam sua possível participação
na defesa do animal. Nesse momento, convém lembrar que as lesmas habitam a região
intertidal e, portanto, estão freqüentemente expostas aos movimentos das marés e sujeitas
as variações de pH, temperatura, luminosidade, salinidade e oxigênio. Portanto, é razoável
supor que para uma molécula desempenhar qualquer atividade nesse meio deva ser
resistente a ele.
Dactylomelina-P mostra um espectro de ação antibacteriano amplo, inibindo de
forma bastante eficiente o crescimento de várias espécies de bactérias Gram-positivas e
Gram-negativas, patogênicas ou não ao homem, e bactérias marinhas. A concentração
inibitória mínima (CIM), determinada para a bactéria 6W. DXUHXV, GH JPO produziu um
halo de inibição de 12 mm, pelo método de difusão em placa. A concentração bactericida
mínima (CBM), GH JP/ produziu halos de 14-16 mm. Portanto, neste trabalho foi
possível chegar a concentração bactericida para a dactylomelina-P, ao contrário de MELO
HWDO. (2000), que só conseguiram determinar a CIM. Esses resultados diferentes podem ser
atribuídos ao grau de purificação das proteínas utilizadas ou até mesmo as condições do
ensaio antibacteriano empregado. O fato de se comportar como uma proteína bacteriostática
ou como bactericida também foi observado com a escapina, uma proteína antibacteriana
isolada da tinta da lesma de $. FDOLIRUQLFD, que pode agir de uma maneira ou de outra
dependendo das condições do meio (YANG HW DO., 2005). Interessante destacar a CIM da
escapina para a bactéria 6W. DXUHXV,
JP/ VHPHOKDQWH D &,0 GD GDFW\ORPHOLQD-P, 0,2
JP/ FRQWUD D PHVPD EDFWéria. YANG HW DO. (2005) isolaram a dactylomelina-P e a
usaram como controle em seus experimentos com a escapina. Dessa forma, os autores
mostraram que a dactylomelina-P também apresenta ação bactericida, e levantaram a
NOGUEIRA, V. L. R. 2005 Papel de Proteínas Presentes na Tinta...
69
hipótese dessas proteínas atuarem do mesmo modo. A confirmação dessa hipótese depende
da análise comparativa de suas seqüências de aminoácidos. Entretanto, pode ser adiantado
que essas proteínas possuem algumas características biológicas diferentes, como será
discutido adiante.
Várias proteínas biologicamente ativas isoladas das lesmas-do-mar mostram
atividade L-amino-oxidásica (IIJIMA HW DO., 2003; JIMBO HW DO., 2003; BUTZKE HW DO.,
2004; YANG HW DO, 2005). As L-amino-oxidases catalisam a desaminação oxidativa de
diversos aminoácidos produzindo H
2
O
2
durante a reação, que necessita de FAD como co-
fator. No caso da APIT e escapina, que pertencem a esta classe de enzimas, os substratos
preferenciais para ambas são os aminoácidos lisina e arginina (BUTZKE HW DO., 2004;
YANG HW DO, 2005). As atividades tumoricida da APIT (BUTZKE HW DO., 2005) e
antibacteriana da escapina (YANG HW DO, 2005) são atribuídas a toxicidade do peróxido de
hidrogênio. Infelizmente, a dactylomelina-P não foi ainda submetida a ensaios para
detecção de atividade L-amino-oxidásica, portanto, não é possível dizer se ela teria ou não
tal atividade.
Como os genes da APIT e escapina já foram clonados e expressados em
(VFKHULFKLD FROL é perfeitamente plausível que essas proteínas, com essas interessantes
atividades biológicas, possam vir a ser produzidas comercialmente para várias aplicações
industriais ou medicinais (YANG HW DO., 2005).
A ação da dactylomelina-P contra diferentes espécies de bactérias é compatível
com um possível papel desta proteína na defesa inespecífica do animal contra patógenos.
Interessantemente, dentre todas as espécies de bactérias Gram-positivas e Gram-negativas
testadas, as cepas marinhas, isoladas de poças onde foram encontradas as lesmas, foram as
mais sensíveis.
Merece destaque a ação da dactylomelina-P sobre o 6W. DXUHXV, uma bactéria
patogênica, com cepas resistentes a vários antibióticos, e que também é encontrada no
ambiente marinho. BATISTA (2004) testou a ação da dactylomelina-P frente a 100 cepas
de 6. DXUHXV, resistentes a vários antibióticos, isoladas de diferentes casos clínicos de
Hospitais de Fortaleza, e encontrou que 100 % das cepas eram sensíveis a dactylomelina-P.
Esse resultado se reveste da maior importância quando o compara com aqueles produzidos
por antibióticos comerciais tais como nitrofurantoína e eritromicina, para os quais mais de
NOGUEIRA, V. L. R. 2005 Papel de Proteínas Presentes na Tinta...
70
50 % dessas cepas se mostraram resistentes. Para a penicilina, por exemplo, 100 % das
cepas foram resistentes. Os isolados (100%) foram sensíveis a vancomicina e aos
antibióticos de última geração como quinupristina/dalfopristina e linezulida. Portanto, a
eficácia da dactylomelina-P é comparável a esses antibióticos. A atuação da dactylomelina-
P também foi superior aos antibióticos rifampicina, oxacilina, cloranfenicol e clindamicina,
que foram eficazes contra apenas 70 % das cepas.
A interação da dactylomelina-P com a bactéria 6W. DXUHXV foi visualizada por
microscopia eletrônica de transmissão que mostrou uma forte marcação nas proximidades
da parede celular e membrana citoplasmática. Isso mostra que a proteína atravessa o
peptideoglicano e chega a membrana onde deve se ligar. Considerando que essa proteína
pode atuar inibindo ou matando bactérias, dependendo da concentração, é provável que sua
ação seja metabólica ao invés de provocar danos mecânicos.
Considerando a potência da dactylomelina-P contra esse número significativo de
cepas de 6W. DXUHXV multiresistentes, fica claro a importância em avançar nas investigações
e testes acerca desta molécula, que se apresenta como uma droga promissora para o
tratamento de infecções estafilocócicas, muito comuns em ambientes hospitalares e
responsáveis por muitas mortes (WISTREICH & LECHTMAN, 1980).
Nem a tinta nem a dacylomelina-P tiveram qualquer efeito sobre leveduras até a
concentração de 1mg/ml. Entretanto, a tinta bruta inibiu o crescimento vegetativo do fungo
0XFRU sp. Todas as outras espécies de fungos testadas, incluindo 5KL]RSXV sp. que pertence
a mesma Ordem do 0XFRU (Mucorales), não foram inibidas pela tinta. Quando se testou o
efeito da tinta diretamente sobre conídios ou esporos verificou-se inibição total ou parcial
da germinação dessas células. Entretanto, o dano causado nessas células pareceu afetar as
etapas subseqüentes de desenvolvimento dos fungos, pois quando houve germinação, não
se observou desenvolvimento além do estágio de hifas primárias. Dactylomelina-P não
mostrou nenhum efeito sobre conídios ou esporos fúngicos. O fato da dactylomelina-P não
mostrar nenhuma ação sobre leveduras e bolores a distingue da escapina que possui
atividade antifúngica (YANG HW DO., 2005).
Com o intuito de descobrir o fator responsável pela atividade antifúngica da
tinta foi preparado um extrato enriquecido com peptídeos, que envolveu o aquecimento da
preparação a 80 ºC por 15 minutos, tratamento este que desnatura a dactylomelina-P. O
NOGUEIRA, V. L. R. 2005 Papel de Proteínas Presentes na Tinta...
71
extrato não apresentou nenhum efeito sobre 6W. DXUHXV nem tampouco sobre o 0XFRU sp.
Portanto, existe um outro fator na tinta responsável pela ação antifúngica que não é nem a
dactylomelina-P nem os peptídeos presentes nessa secreção.
A preparação de dactylomelina-P obtida neste trabalho foi capaz de aglutinar
eritrócitos de ratos, camundongos e coelho. A aglutinação de eritrócitos de coelho também
havia sido relatada por MELO HW DO. (2000), que levantaram a hipótese de tratar-se de uma
quimerolectina, já que eles mostraram que as atividades antibacteriana e hemaglutinante
eram exercidas por sítios independentes (PEUMANS & VAN DAMME, 1995).
Vários invertebrados marinhos possuem aglutininas ou receptores específicos
para essas proteínas que são capazes de aglutinar material estranho incluindo células
sangüíneas de vertebrados, bactérias e células tumorais. Portanto, lectinas mediando defesa
são efetivas contra potenciais organismos invasores. Ainda que a maioria dos estudos seja
feita com eritrócitos de vertebrados, que não são obviamente potenciais invasores, são
relativamente estáveis e carregam em sua superfície estruturas específicas de carboidratos
que podem ser compartilhadas na natureza por outros organismos (KAMIYA & SHIMIZU,
1981.
Dactylomelina-P não apresentou atividade anticoagulante, na realidade foi
observada uma aceleração no processo de coagulação sangüínea, pois amostras de sangue
na presença dessa proteína coagularam na metade do tempo que o sangue em solução
salina. Esse resultado reforça a hipótese do princípio de economia da natureza, onde uma
determinada proteína mostra mais de uma atividade biológica, como as quimerolectinas
(PEUMANS & VAN DAMME, 1995), dolabelanina-A e aplisianinia-P que apresentam
atividade citolítica e antimicrobiana (KISUGI HW DO., 1989; YAMAZAKI HW DO., 1989;
1990), dentre outras.
Nem a tinta bruta nem a dactylomelina-P mostraram atividade quitinásica ou
glucanásica, até a concentração de 1,0 mg/ml, excluindo qualquer participação dessas
enzimas nas atividades encontradas.
Tendo em mente o potencial da dactylomelina-P como um novo antibiótico,
avaliou-se a capacidade dessa proteína em produzir hemólise, citólise e toxicidade aguda.
Esses ensaios, dentre outros, são realizados para avaliação dos efeitos biológicos em um
NOGUEIRA, V. L. R. 2005 Papel de Proteínas Presentes na Tinta...
72
sistema de testes LQ YLWUR e/ou LQ YLYR no estudo pré-clinico para o desenvolvimento de uma
nova droga (CORDELL, 1995).
Dactylomelina-P não causou a lise de eritrócitos de coelho, de ratos e nem de
camundongos. Também não foi citotóxica para nenhuma das linhagens de células tumorais
testadas, pois não houve inibição até a concentração de 25 µg/ml. De acordo como US-
NCI, um extrato é considerado ativo quando possui uma CL
50
menor que 20 µg/ml. Para
substâncias puras, esse valor cai para 4 µg/ml (SUFFNESS & PEZZUTO, 1991). Em
relação à toxicidade aguda em camundongos, a DL
50
ficou entre
60-100 mg/Kg. De acordo
com a classificação de HODGE & STERNER (1944), ela é moderadamente tóxica. Esses
autores classificaram as substâncias conforme a toxicidade aguda para ratos, da seguinte
forma: doses de 100 µg/Kg a 1 mg/Kg (extremamente tóxicas), 1 a 10 mg/Kg (altamente
tóxicas), 10 a 100mg/Kg (moderadamente tóxicas), de 100 a 1 g/Kg (levemente tóxica), de
1 a 10g/Kg (praticamente não tóxicas) e >10g (relativamente não perigosas).
Estudos posteriores necessitam ser feitos para avaliar como a dactylomelina-P
se comporta LQYLYR, relacionando sua dose efetiva e sua dose tóxica.
Os estudos de localização da dactylomelina-P no animal permitiram chegar a
algumas conclusões interessantes. Primeiro, os resultados do :HVWHUQ %ORW mostraram que o
anticorpo anti-dactylomelina-P reconheceu proteínas de massa molecular correspondente a
esta proteína presentes nas glândulas opalina, de tinta e albúmem.
É possível especular que haja de fato homologia entre a dactylomelina-P e as
proteínas de 60 kDa dessas glândulas. Entre os moluscos, especificamente as lesmas-do-
mar, já foram encontradas homologias entre proteínas de diferentes partes do corpo. Por
exemplo, foi demonstrado que a APIT e a escapina, ambas isoladas de tintas de aplísias,
possuem 93% de identidade em suas seqüências de aminoácidos (BUTZKE HW DO., 2004).
Escapina também possui 61% de identidade com ciplasina L, uma proteína isolada de uma
preparação tinta/opalina de A. punctata (PETZELT et al., 2002) e 61% e 60% de identidade
com as aplysianinas A da glândula de albúmem de A. kurodai (KAMIYA et al., 1986) e A.
californica (CUMMINS et al., 2004), respectivamente. Também foi encontrada 48% de
identidade entre escapina e achacina, uma proteína antibacteriana isolada de uma lesma
terrestre Achatina fulica (OBARA et al., 1992). De maneira geral, observa-se uma grande
homologia entre as L-amino oxidases, tendo sido relatado 21% de identidade entre a
NOGUEIRA, V. L. R. 2005 Papel de Proteínas Presentes na Tinta...
73
escapina, por exemplo, e apoxina I, isolada da glândula de veneno da cobra &URWDOXV DWUR[
(TORII et al., 2000).
O anticorpo anti-dactylomelina-P não reagiu com nenhuma proteína de massa
molecular semelhante presente nos extratos da glândula digestiva, coração, papo e nem na
hemolinfa. Algumas fracas interações observadas com alguns componentes de massa
molecular mais alta ou mais baixa, podem ser atribuídas à natureza policlonal do anticorpo,
que reagiu cruzadamente com epítopos dessas moléculas.
Esses resultados reforçam a hipótese de que o local de produção da
dactylomelina-P é a própria glândula de tinta onde ela é liberada juntamente com os
pigmentos, que já se sabe, são de origem da dieta (COELHO HW DO., 1998). BEZERRA HW
DO. (2004) também não encontraram relação imunológica entre as proteínas da tinta e das
algas da dieta.
A análise histológica da glândula de tinta de $. GDFW\ORPHOD mostrou ser esta
formada de vesículas de diferentes diâmetros, permeadas por fibras em várias direções e
também em volta das vesículas, além de algumas células dispersas. O conteúdo das
vesículas se cora com azul de bromofenol, indicando que contém material de natureza
protéica. A glândula é recoberta por um epitélio cúbico voltado para a face externa e um
epitélio colunar, voltado para o manto. A presença de um epitélio colunar indica uma
função secretora. O epitélio cúbico se invagina formando os ductos da vesícula, por onde a
tinta é liberada (BEZERRA, 2001). A glândula de tinta de $. FDOLIRUQLFD apresenta uma
organização semelhante. Entretanto, seu estudo por microscopia eletrônica de transmissão
revelou mais detalhes de seus constituintes. Destacam-se três tipos de células, sendo uma
delas rica em retículo endoplasmático rugoso (RER), onde provavelmente ocorre a síntese
de proteínas secretadas com a tinta. O segundo tipo é formado por células granulares,
menos comuns e maiores do que as células RER. O último tipo compreende as células da
vesícula que formam um estrato adjacente à camada de fibras que envolvem as vesículas
liberadoras de tinta. Acredita-se que esses tipos celulares possam corresponder a diferentes
estágios de desenvolvimento ou maturação de um mesmo tipo de célula. (PRINCE HW DO.,
1998).
Como revelado pela análise imunohistoquímica da glândula de tinta a
dactylomelina-P se encontra apenas nas vesículas. Não foi detectada marcação em nenhum
NOGUEIRA, V. L. R. 2005 Papel de Proteínas Presentes na Tinta...
74
outro local da glândula. Dessa forma, a proteína deve ser sintetizada pelas células que
envolvem as vesículas e, de alguma maneira, é liberada na sua luz.
Esses resultados não permitem afirmar nada sobre o local e forma de ligação
entre a dactylomelina-P e os pigmentos derivados de algas vermelhas. COELHO HW DO.
(1998) mostraram que o pigmento púrpuro é separado das proteínas algais na glândula
digestiva, sendo transportado pela hemolinfa até a glândula de tinta, onde é armazenado nas
vesículas.
Os resultados obtidos neste trabalho contribuem com a idéia levantada por
vários autores de que invertebrados marinhos secretam proteínas para se defenderem do
ataque de patógenos e/ou predadores. A identificação dessas proteínas ou peptídeos em
diferentes grupos filogenéticos, além de contribuir para a compreensão da evolução dos
mecanismos de defesa dos animais, em geral, possibilita a revelação de uma variedade de
novas substâncias que podem ser utilizadas diretamente no desenvolvimento de novos
medicamentos e ou produtos industriais.
&21&/862
Este trabalho mostra, pela primeira vez, que a tinta secretada pela lesma-do-mar
$SO\VLD GDFW\ORPHODé rica em proteínas, contendo mais de 40 proteínas/peptídeos, e que a
dactylomelina é a proteína mais abundante. As características físico-químicas e biológicas
desta proteína corroboram com o seu envolvimento na defesa química do animal.
Na glândula de tinta a dactylomelina é encontrada nas células que envolvem as
vesículas secretoras, onde é sintetizada, portanto, não tendo nenhuma relação com as algas
da dieta, como os pigmentos. Nem todas as vesículas são produtoras desta proteína, já que a
imunohistoquímica revelou de forma clara a existência de vesículas com e sem marcação
com dactylomelina. A proteína não é encontrada em nenhum outro local da glândula, além
das vesículas, onde fica acumulada até ser excretada após estímulos.
A potente atividade antibacteriana da dactylomelina-P, associada a baixa ou
ausência de toxidez a vários sistemas biológicos, a distingue como uma promissora droga
natural para o controle de agentes infecciosos.
NOGUEIRA, V. L. R. 2005 Papel de Proteínas Presentes na Tinta...
76
5()(5Ç1&,$6%,%/,2*5È),&$6
ABBAS, A. K. & LICHTMAN, A. H. ,PXQRORJLD &HOXODU H 0ROHFXODU. Ed. Revinter, 5
a
Edição, 580 p., 2005.
AMBROSE, H. W.; GIVENS, R. P.; CHEN, R. & AMBROSE, K. P. Distastefulness as a
defense mechanism in $ SO\VLDEUDVLOLDQD (Mollusca: Gastropoda). 0DU. % HKDY. 3K\VLRO., v.
6, p. 57-64, 1979.
AVILA, C. Natural products of Opisthobranchia molluscs: A biological review. 2FHDQ.
0DU. %LRO. $QQL. 5HY., v.33, p, 487-559, 1995.
BAKUS, G. J.; TARGETT, N.M. & SCHULTE, B. Chemical ecology of marine
organisms: an overview. -. &KHP. (FRO, v. 12, n. 5, p. 951-987, 1988.
BARREIRA, L. A. &RPSRVLomR TXtPLFD GR IOXLGR S~USXUR GR PROXVFR $SO\VLD
GDFW\ORPHOD 5DQJ H VHX SRVVtYHO SDSHO QD GHIHVD GR DQLPDO Monografia de
Graduação em Ciências Biológicas, Universidade Federal do Ceará, 64 p. Ceará, 2003.
BATISTA, M. G. L. 6XVFHSWLELOLGDGH GH 6WDSK\ORFRFFXV DXUHXV IUHQWH j DomR GD
GDFW\ORPHOLQD3 XPD SURWHtQD LVRODGD GD WLQWD GR PROXVFR $SO\VLD GDFW\ORPHOD.
Monografia de Graduação em Ciências Biológicas, Universidade Federal do Ceará, 49 p.,
Ceará, 2004.
BAUER, A. W.; KIRB, W.M.M.; SHERRIS, J.C. & TURCK, M. Antibiotic susceptibility
testing by standardized single disk method. $PHU. -. &OL. 3DWKRO., v. 45, p. 493-495, 1966.
BERNHEIMER. A. W. Assay of hemolytic toxins. 0HWKRGV (Q]LPRO v. 165, p. 213-217,
1988.
NOGUEIRA, V. L. R. 2005 Papel de Proteínas Presentes na Tinta...
77
BERRIDGE, M. V.; TAN, A. S.; McCOY, K. D. & WANG, R. The biochemical and
cellular basis of cell proliferation assays that use tetrazolium salts. %LRFKHPLFDO v. 4, p. 14-
19, 1996.
BEZERRA, L. E. A. %LRORJLDSRSXODFLRQDO GR PROXVFR $SO\VLD GDFW\ORPHOD 5DQJ
*DVWURSRGD 2SLVWKREUDQFKLD HP GXDV SUDLDV GR OLWRUDO FHDUHQVH H D UHODomR GD GLHWD
DOJDO FRP D SURGXomR GH IOXLGR S~USXUR. Monografia de Graduação em Ciências
Biológicas, Universidade Federal do Ceará, 78 p., 2001.
BEZERRA, L. E. A.; CARVALHO, A. F. U.; BARREIRA, L. A.; NOGUEIRA, V. L. R.;
SILVA, J. R. F.; VASCONCELOS, I. M. & MELO, V. M. M. The relationship between
seaweed diet and purple ink production in $SO\VLD GDFW\ORPHOD Rang, 1828 (Gastropoda:
Opisthobranchia) from northeastern Brazil.-. 6KHOOILVK5HV., v. 23, n. 2, p. 581-584, 2004.
BLUM, H.; BIER, H.; GROSS, H. J. Improved silver staining of plants proteins, RNA and
DNA in poliacrilamida gels. (OHFWURSKRUHVLV, v. 8, p. 93-99, 1987.
BRADFORD, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram
quantities of proteins utilizing the principle of protein-dye binding. $QDO. %LRFKHP., v. 72,
p. 248 – 254, 1976.
BULET, P.; STÖCKLIN, R. & MENIN, L. Anti-microbial peptides: from invertebrates to
vertebrates. ,PPXQRO. 5HY., v. 198, p. 169-184, 2004.
BUTZKE, D.; MACHUY, N.; THIEDE, B.; HURWITZ, R.; GOEDERT, S. & RUDEL, T.
Hydrogen peroxide produced by Aplysia ink toxin kills tumor cells independent of
apoptosis via peroxiredoxin I sensitive pathways. &HOO. 'HDWK 'LIIHU., v. 11, p. 608-617,
2004.
NOGUEIRA, V. L. R. 2005 Papel de Proteínas Presentes na Tinta...
78
BUTZKE, D.; HURWITZ, R.; THIEDE, B.; GOEDERT, S. & RUDEL, T. Cloning and
biochemical characterization of APIT, a new L-amino acid oxidase from $SO\VLD SXQFWDWD.
7R[LFRQ, v. 46, p. 479-489, 2005.
CAREFOOT, T. H. $SO\VLD: Its biology and ecology.2F HDQ. 0DU. $QQ. 5HY. v. 25, p. 167-
284. Margaret Barnes, Ed. Aberdeen University Press, 1987.
CAREFOOT, T. H. A comparison of time/energy budgeting in two species of tropical sea
hares $SO\VLD. -. ([S. 0DU. %LRO. (FRO., v. 131, p. 267-282, 1989.
CAREFOOT, T. H.; PENNINGS, S. C. & DANKO, J. P. A test of novel functions (s) for
the ink of sea hares. -. ([S. 0DU. %LRO. (FRO. v. 234, p. 185-197, 1999.
CAREW, T. J., KANDEL, E. R., Inking in $SO\VLD FDOLIRUQLFD. I. Neural circuit of an all-
or-none behavioral response. -. 1HXURSK\VLRO., v. 40, p. 692-707, 1977.
CARTÉ, B. K. Biomedical potential of marine natural products. %LR6FLHQFH, v. 46, n. 4, p.
271-286, 1996.
CHAPMAN, D. J. & FOX, D. L. Bile pigment metabolism in the sea-hare $SO\VLD. -. ([S.
0DU. %LRO. (FRO., v. 4, p. 71-78, 1969.
CIMINO, G.; DE ROSA, S.; DE STEFANO, S.; MORRONE, R. & SODANO, G. The
chemical defense of nudibranch molluscs. 7HWUDKHGURQ, v. 41, n. 6, p. 1093-1100, 1985.
COELHO, L.; PRINCE, J. & NOLEN, T.G. Processing of defensive pigment in $SO\VLD
FDOLIRUQLFD: acquisition, modification and mobilization of the red algal pigment r-
phycoerythrin by the digestive gland. 7KH-. ([S. %LRO., v. 201, p. 425-438 1998.
COLWELL, R. R. Biotechnology in the marine sciences. 6FLHQFH v. 222, n. 4619, p. 19-23,
1983.
NOGUEIRA, V. L. R. 2005 Papel de Proteínas Presentes na Tinta...
79
CORDELL, G. A. Changing strategies in natural products chemistry. 3K\WRFKHPLVWU\,v.
40, p. 1585-1612, 1995.
CRAGG, G. M. & NEWMAN, D. J. Antineoplastic agents from natural sources:
achievements and future directions. ([S. 2SLQ. ,QYHVWLJ. 'UXJV, v. 9, n. 12, p. 1-15, 2000.
CUMMINS, S. F.; NICHOLS, A. E.; AMARE, A.; HUMMON, A. B. ; SWEEDLER, J. V.
& NAGLE, G. T. Characterization of Aplysia enticing and temptin, two novel water-borner
protein pheromones that act in concert with attractin to stimulate mate attraction. -. %LRO.
&KHP., 279, p. 25614-25622, 2004.
D
IMATTEO, T. The inking behavior of $SO\VLD GDFW\ORPHOD (Gastropoda:
Opisthobranchia): Evidence for distastefulness. 0DU. %HKDY. 3K\VLRO., v. 7, p. 285-290,
1981.
D
IMATTEO, T. The ink of $SO\VLD GDFW\ORPHOD (Rang, 1828) (Gastropoda:
Opisthobranchia) and its role as a defensive mechanism. -. ([S. 0DU. %LRO. (FRO. v. 57, p.
169-180, 1982.
DUBOIS, M.; GILLES, K. A.; HAMILTON, J. K.; REBERS, P. A. & SMITH, F.
Colorimetric method for determination of sugars and related substances. $QDO. &KHP., v.
28, p. 350 -356, 1956.
DUFFEY, S. S. Sequestration of plant natural products by insects. $QQ. 5HY. (QWRPRO., v.
25, p. 447-477, 1980.
EALES, N. B. $SO\VLD. Liverpool Marine Biology Commitee Memoirs, n. 24, W. A.
Herdman & Johnstone, Liverpool University Press, Liverpool, 84 p., 1921.
NOGUEIRA, V. L. R. 2005 Papel de Proteínas Presentes na Tinta...
80
EDMUNDS, M. Protective mechanisms in the Eolidacea (Mollusca: Nudibranchia). -.
/LQQ. 6RF. /RQG. =RRO., v. 47, n. 308, p. 27-71, 1966.
FAULKNER, D. J. & GHISELIN, M. T. Chemical defense and evolutionary ecology of
dorid nudibranchs and some other opisthobranchs gastropods. 0DU. (FRO. 3URJ. 6HU., v. 13,
p. 295-301, 1983.
FAULKNER, D.J. Feeding deterrents in mollusks. 0HP &DO $FG 6FL, v. 13, p. 29-36,
1988.
FAULKNER, D. J. Chemical defenses in marine mollusks. ,Q (FRO. 5RO. 0DU. 1DW. 3URG.
Paul, V. J. (ed) Comstock, Ithaca, NY, p. 119-163, 1992.
FINK, W.; LIEFLAND, M. & MENDGEN, K. Chitinases and β-1,3 glucanases in the
apoplastic compartment of oat leaves ($YHQD VDWLYD /.). 3ODQW 3K\VLRO., v. 88, p. 270–275,
1988.
FIORITO, G. & GHERARDI, F. Behavioral changes induced by ink in $SO\VLD IDVFLDWD
(Mollusca, Gastropoda): Evidence for a social signal role of inking. 0DU. %HK. 3K\VLRO., v.
17, p. 129-135, 1990.
FREITAS, J. C. & MENDES, E. G. Farmacologia marinha: importância e desenvolvimento
no país. &LrQF. &XOW., v. 38, n. 7, p. 1207-1213, 1986.
GÖRG, A.; OBERMAIER, C. & BOGUTH, G. The current state of two- dimensional
electrophoresis with immobilized pH gradients. (OHFWURSKRUHVLV, v. 21, n. 6, p. 1037-1053,
2000.
HASTEALD, B.W. Poisonous and venomous marine animals of the world. ,QYHUWHEUDGHV
US Government Printing Office, Washington DC, v. 1, p. 20-770, 1965.
NOGUEIRA, V. L. R. 2005 Papel de Proteínas Presentes na Tinta...
81
HIGUCHI, R.; MIYAMOTO, T.; YAMADA, K. & KOMORI, T. Cytotoxic and
ichthyotoxic compounds from marine Opisthobranchia and soft coral. 7R[LFRQ, v. 36, n. 11,
p. 1703-1705, 1998.
HOCHLOWSKI, J. E. & FAULKNER, D. J. Antibiotics from the marine pulmonate
6LSKRQDULDGLHPHQHQVLV. 7HWUDK. /HWW., v. 24, p. 1917-1920, 1983.
HODGE, H. C. & STERNER, J. H. tabulation of toxicity classes. ,QG. +\G. 4XDUW., v. 10, p.
94-97, 1944.
IIJIMA, R.; KISUGI, J. & YAMAZAKI, M. Antifungal activity of aplysianin E, a
cytotoxic protein of sea hare ($SO\VLD NXURGDL) eggs. 'HY. &RPS. ,PPXQRO., v. 19, n. 1, p.
13-19, 1995.
IIJIMA, R.; KISUGI, J. & YAMAZAKI, M. A novel antimicrobial peptide from the sea
hare 'RODEHOODDXULFXODULD. 'HY. &RPS. ,PPXQRO., v. 27, p. 305-311, 2003.
IRELAND, C. M.; ROLL, D. M.; MOLINSKI, T. F.; McKEE, T. C.; ZABRISKE, T. M. &
SWERSEY, J. C. Uniqueness of the marine environment: categories of marine natural
products from invertebrates. Ed. Biomedical importance of marine organisms. San
Franscisco. &DOLI. $FDG. 6FL., p. 41-57, 1988.
IRELAND, C.; COPP, B.; FOSTER, M.; Mc DONALD, L.; RADISSKY, D. &
SWERSEY, J. Biomedical potential of marine natural products. 0DU. %LRWHFK.,
Pharmaceutical and bioactive natural products. New York, Plenum Press, v. 1, p. 1-43,
1993.
JACOBS, R. S.; CULVER, P.; LANGDON, R.; O’BRAIN, T. & WHITE, S. Some
pharmacological observations on marine natural products. 7HWUDKHGURQ, v. 41, p. 981–984,
1985.
NOGUEIRA, V. L. R. 2005 Papel de Proteínas Presentes na Tinta...
82
JAY, G.D.; CULP, D. J. & JOHNKE, M. E. Silver staining of extensively glycosylated protein
on sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels: enhancement by carbohydrate binding dyes.
$QDO. %LRFKHP., v. 185, p. 324-330, 1990.
JIMBO, M.; NAKANISHI, F.; SAKAI, R.; MURAMOTO, K. & KAMIYA, H.
Characterization of L-amino acid oxidase and antimicrobial activity of aplysianina A, a sea
hare-derived antitumor-antimicrobial protein. )LVKHULHV6FL., v. 69, p. 1240-1246, 2003.
JOHNSON, P. M. & WILLOWS, A. O. D. Defense in sea hares (Gastropoda,
Opisthobranchia, Anaspidea): Multiple layers of protection from egg to adult. 0DU. )UHVK.
%HKDY. 3K\VLRO., v. 32, p. 147-180, 1999.
KAMIYA, H. & SHIMIZU, Y. A natural agglutinin inhibitable by d-galacturonic acid in
the sea hare $SO\VLD eggs: Characterization and Purification. %XOO. -DS. 6RF. 6FL. )LVK., v.
47, n. 2, p. 255-259, 1981.
KAMIYA, H.; MURAMOTO, K. & YAMAZAKI, M. Aplysianin-A, an antibacterial and
antineoplastic glycoprotein in the albumen gland of a sea hare, $SO\VLD NXURGDL.
([SHULHQWLD, v. 42, p. 1065-1067, 1986.
KAMYIA, H.; MURAMOTO, K.; GOTO, R.; SAKAI, M.; ENDO, Y. & YAMAZAKI, M.
Purification and characterization of an antineoplastic protein secretion of a sea hare $SO\VLD
-XOLDQD. 7R[LFRQ v. 27, n. 12, p., 1269–1277, 1989.
KANDEL, E. R. %HKDYLRUDO %LRORJ\ RI $SO\VLD ± $ FRQWULEXWLRQ WR WKH FRPSDUDWLYH VWXG\
RI RSLVWKREUDQFKPROOXVNVW. H. Freeman and Company, San Francisco, 463 p., 1979.
KICKLIGHTER, C. E.; SHABANI, S.; JOHNSON, P. M. & DERBY, C. D. Sea hares use
nivel antipredatory chemical defenses. &XUU. %LRO., v. 15, p. 549-554, 2005.
NOGUEIRA, V. L. R. 2005 Papel de Proteínas Presentes na Tinta...
83
KISUGI, J.; KAMIYA, H. & YAMAZAKI, M. Purification and characterization of
aplysianin E, an antitumor factor from sea hare eggs. &DQF. 5HV., v. 47, p. 5649-5653, 1987.
KISUGI, J.; KAMAIYA, H.; YAMAZAKI, M. Purification of dolabellanin C, an
antineoplastic glycoprotein in the body fluid of sea hare Dolabella auriculata. 'HY. &RP.
,PPXQRO., v. 13, p. 3-8, 1989.
KISUGI, J.; YAMAZAKI, M.; ISHII, Y.; TANSHO, S.; MURATOMO, K. & KAMIYA,
H. Purification of a novel cytolitic protein from albumen gland of the sea hare 'RODEHOOD
DXULFXODULD. &KHP. 3KDUP. %XOO., v. 37, n. 10, p. 2773-2776, 1989.
KRIEGSTEIN, A. R. Stages in the post-hatching development of $SO\VLD FDOLIRUQLFD. -.
([S. =RRO., v. 199, p. 275-288, 1977.
KUPFERMANN, I. & CAREW, T. J. Behavior patterns of $SO\VLDFDOLIRUQLFD in its natural
environment. %HKDY. %LRO ., v.12, p. 317-337, 1974.
LAEMMLI, U.K. Cleavage of structural protein during the assembly of the head of
bacteriophage T4. 1DWXUH, v. 227, p. 680-685, 1970.
LITCHIFIELD, J. T. J & WILCOXON, F. A simplified method for evaluation of dose
effect experiments. -. 3KDUP. ([S. 7KHUDS\, v. 96, p. 99-104, 1949.
MACCOOL, R.; GALIVAN, J.; BERNS, D. S.; NIMEC, Z.; GUARD-FRIAR, D. W. &
WAGONER, D. The chromophore and polypeptide composition of $SO\VLD ink. %LRO. %XOO.
0DU. %LRO., v. 179, p. 326-331, 1990.
MAYER, A. M. S. & HAMANN, M. T. Marine pharmacology in 2001-2002: Marine
compounds with anthelmintic, antibacterial, anticoagulant, antidiabetic, antifungal, anti-
inflammatory, antimalarial, antiplatelet, antiprozoal, antituberculosis and antiviral
NOGUEIRA, V. L. R. 2005 Papel de Proteínas Presentes na Tinta...
84
activities; affecting the cardiovascular, immune and nervous systems and miscellaneous
mechanisms of action. &RPS. %LRFKHP. 3K\VLRO., Part C, v. 140, p. 265-286, 2005.
MELO, V. M. M.; FONSECA, A. M.; VASCONCELOS, I. M. & CARVALHO, A. F. F.
U. Toxic, antimicrobial and heamagglutinating activities of the purple fluid of the sea hare
$SO\VLD GDFW\ORPHOD Rang 1828. %UD]. -. 0HG. %LRO. 5HV., v. 31, p. 785-791, 1998.
MELO, V. M. M.; DUARTE, A. B. G.; CARVALHO, A. F. F. U.; SIEBRA, E. A. &
VASCONCELOS, I. M. Purification of a novel antibiotic and haemagglutinating protein
from purple fluid of the sea hare $SO\VLD GDFW\ORPHOD Rang 1828. 7R[LFRQ v. 38, n. 10,
p.1415-1427, 2000.
MERKER, M. P. & LEVINE, L. A protein from the marine mollusc $SO\VLD FDOLIRUQLFD
that is hemolytic and stimulates arachidonic acid metabolism in cultured mammalian cells.
7R[LFRQ, v. 24, n. 5, p. 451- 465, 1986.
MOREIRA, R. A. & PERRONE, J. C. Purification and partial characterization of a lectin
from 3KDVHROXVYXOJDULV. 3ODQW3K\VLRO., v. 59, p. 783-787, 1977.
MOSMAN, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival:application to
proliferation and cytotoxicity assays. -. ,PPXQRO. 0HWKRG., v. 65, p. 55-63, 1983.
NAKAJIMA, Y.; ISHIBASHI, J.; YUKUHIRO, F.; ASAOKA, A>; TAYLOR, D. &
YAMAKWA, M. Antibacterial activity and mechanism of action of tick defensin against
Gram-positive bacteria. %LRFK. %LRSK $FWD, v. 1624, p. 125-130, 2003.
NELSON, N. A Photometric Adaptation of the Somogy Method of Determination of
Glucose. -. %LRO. &KHP., v. 153, p. 375-380, 1944.
NOGUEIRA, V. L. R. 2005 Papel de Proteínas Presentes na Tinta...
85
NISTRATOVA, S. N.; MITSKEVICH, I. N.; MIRABETREGALADO, M. E. & JOSEF, N.
Inhibitory effect of purple fluid produced by a mollusk $SO\VLD SXQFWDWD on growth of
Gram-negative marine bacteria. 0LFURELRORJ\ v. 61, n. 5, p. 630-632, 1992.
NOLEN, T. G.; JOHNSON, P. M.; KICKLIGHTER, T. & CAPO, T. Ink secretion by the
marine snail $SO\VLD FDOLIRUQLFD enhances its ability to escape from a natural predator. -.
&RPS. 3K\VLRO. v. 176, p. 239-254, 1995.
OBARA, K.; OTSUKA,-FUCHINO, H.; SATTAYASAI, N.; NONOMURA, Y.;
TSUCHIYA, T. & TAMIYA, T. Molecular cloning of the antibacterial protein of giant
African snail, $FKDFLQDIXOLFD Ferussac. (XU. -. %LRFKHP., v. 209, p. 1-6, 1992.
O’BRIEN, M. & COLWELL, R. R. A rapid test for chitinase activity that uses 4-
methylumberiferyl-N-acetyl-D-glucosaminide. $SS. (QYLURQP. 0LFURELRO., v. 7, p. 1718–
1720, 1987.
OREN, Z. & SHAI, Y. Mode of action of linear amphipathic alpha-helical antimicrobial
peptides. %LRSRO\PHUV, v. 47, p. 451-463, 1998.
PAUL, V. J. & PENNINGS, S. C. Diet–derived chemical defenses in the sea hare
6W\ORFKHLOXVORQJLFDXGD. (Quoy et Gaimard 1824), v. 151, p. 227-243, 1991.
PENNINGS, S. C. & PAUL, V. J. Sequestration of dietary secondary metabolites by three
species of sea hares: location, specificity and dynamics. 0DU. %LRO., v. 117, p. 535-546,
1993.
PENNINGS, S. C. Interspecific variation in chemical defenses in the sea hares
(Opisthobranchia: Anaspidea).-. ([S. 0DU. %LRO. (FRO., v.180, p. 203-219, 1994.
PEREIRA, R. C. & SOARES – GOMES, A. %LRORJLD 0DULQKD. Editora Interciência, Rio
de Janeiro, 363 p., 2002.
NOGUEIRA, V. L. R. 2005 Papel de Proteínas Presentes na Tinta...
86
PETZELT, C.; JOSWIG, G.; STAMMER, H. & WERNER, D. Cytotoxic cyplasin of sea
hare, $SO\VLD SXQFWDWDcDNA cloning, and expression of bioactive recombinants in insect
cells. 1HRSODVLD, v. 4, p. 49-59, 2002.
PEUMANS, W. J. & VAN DAMME, E. J. M. Lectins as plants defense proteins. 3ODQW
3K\VLRO., v. 109, p. 347-352, 1995.
POLATTO, J. M.; OLIVEIRA, J. S. & FREITAS, J.C. Atividade hemolítica e antimitótica
da secreção púrpura de $SO\VLD EUDVLOLDQD (Mollusca: Opistobranchia): resultados
preliminares. ;9,,6LPSyVLR%UDVLOHLURGH%LRORJLD0DULQKD, Centro de Biologia Marinha
da Universidade de São Paulo, 2002.
PRINCE, J.; NOLEN, T. G. & COELHO, L. Defensive ink pigment processing and
secretion in $SO\VLD FDOLIRUQLFD: concentration and storage of phycoerythrobilin in the ink
gland. 7KH-. ([S. %LRO., v. 201, p. 1595-1613, 1998.
RAJAGANAPATHI, R., KATHIRESAN, K. Heparinase in purple fluid of the sea hare,
%XUVDWHOODOHDFKLL. &XUU. 6FL, v. 82, n. 3, p. 264-266, 2002.
RAJAGANAPAHTI, R.; KATHIRESAN, K. & SINGH, T.P. Purification of anti-HIV
protein purple fluid on the sea hare %XUVDWHOODOHDFKLL de Blainville. 0DU. %LRWHFKRQRO. v. 4,
p. 447-453, 2002.
RIOS, E. C. 6HDVKHOOV RI %UD]LO,2
a
Edição. Fundação Universitária do Rio Grande. Museu
Oceanográfico, Rio Grande, 330 p., 1994.
ROBERTS, W. K., SELITRENNIKOFF, C. P. Zeamantin, na antifungal protein from
maize with membrane-permeabilizing activity. -. *HQ. 0LFURELRO., v. 136, p. 1771-1778,
1990.
NOGUEIRA, V. L. R. 2005 Papel de Proteínas Presentes na Tinta...
87
ROGERS, C. N.; STEINBERG, P. D. & DENYS, R. Factors associated with oligophagy in
2 species of sea hares (MOLLUSCA, ANASPIDEA). - ([S 0DU %LRO (FRO, v. 192, n. 1,
p. 47-73, 1995.
ROITT, I.; BROSTOFF, J. & MALE, D ,PXQRORJLD. Ed. Manole, São Paulo, 301 p., 1989.
RUPPERT, E. E. & BARNES, R. D. =RRORJLD GRV ,QYHUWHEUDGRV. Editora Rocca, São
Paulo, 6
a
Edição, 1029 p., 1996.
SAKAMOTO, Y.; NAKAJIMA, T.; MISAWA, S.; ISHIKAWA, H.; ITOH, Y.;
NAKASHIMA, T.; OKANOUE, T.; KASHIMA, K. & TSUJI, T. Acude liver damage with
characteristic hepatocytes by ingestion of $SO\VLD NXURGDL, a sea hare. ,QW. 0pG., v. 37, n.
11, p. 927-929, 1998.
SALZET, M. Vertebrate innate immunity resembles of invertebrate immune responses.
7UHQGV,PPXQRO., v. 22, p. 285-288, 2001.
SOLÉ-CAVA, A. M. & KELECOM, A. Diálogo químico nos mares. &LrQFLD +RMH, v. 8, n.
46, p. 18-29, 1988.
SOMOGY, M. Notes on sugar determination -. %LRO. &KHP., v. 195, p. 19-23, 1952.
SPACKMAN, D. H.; STEIN, W. H. & MOORE, S. Automatic recording apparatus for use
in the chromatography of amino acids. $QDO. &KHP, v. 30, p. 1190-1206, 1958.
STOPFER, M.; CHEN, X. & CAREW, T. J. Evoked ink release in $SO\VLD produces
inhibition of the siphon withdrawal reflex in neighbouring conspecifics %HKDY. 1HXUDO.
%LRO., v. 60, p. 196-204, 1993.
SUFFNESS, S. M. & PEZZUTO, J. M. Assays for cytotoxicity and antitumor activity. ,Q:
K. Hostettmann (ed.), 0HWKRGV3ODQW%LRFKHP., v. 9, p. 71-133, 1991.
NOGUEIRA, V. L. R. 2005 Papel de Proteínas Presentes na Tinta...
88
TAKAMATSU, N; SHIBA, T.; MURAMOTO, K. & KAMIYA, H. Molecular cloning of
defense factor in the albumen gland of the sea hare $SO\VLD NXURGDL. )(%6 /HWW., v. 377, p.
373-376, 1995.
TERRAS, F. R. G.; SCHOOFS, H. M. E.; DE BOLLE, M. F. C.; VAN LEUVEN, F.;
RESS, S. B.; VANDERLEYDEN, J.; CAMMUE, B. P. A. & BROEKAERT, W. F.
Analysis of two novel classes of plant antifungal proteins from radish (5DSKDQXV VDWLYXV
L.) seeds. -. %LRO. &KHP., v. 267, p. 15301-15309, 1992.
THOMPSON, T. E. Defensive adaptations in opisthobranchs. -. 0DU. %LRO. $VVRF. U.K., v.
39, p. 123-134, 1976.
TOBACH, E.; GOLG, P. & ZIEGLER, A. Preliminary observation of the inking behavior
of $SO\VLD (9DUULD). 7KH 9HOLJHU, v. 8, n. 1, p. 16-18, 1965.
TORII, S.; YAMAME, K.; MASHINA, T.; HAGA, N.; YAMAMOTO, K.; FOX, J. W.;
NAITO, M. & TSURUO, T. Molecular cloning and funcional análisis of apoxina I, a snake
venom-derived apoptosis-inducing factor with L-amino acid oxidase activity. %LRFKHPLVWU\,
v. 39, p. 3197-3205, 2000.
TORTORA, G. J.; FUNK, B. R. & CASE, C. L. 0LFURELRORJLD. Editora Artes Médicas,
Porto Alegre, 6
a
Edição, 827 p., 2000.
TOWBIN, H.; STAEHLIN, T. & GORDON, J. Eletroporetic transfer of proteins from
polyacrilamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. 3URF. 1DWO.
$FDG. 6FL., v. 76, p. 4350-4354, 1979.
TROXLER, R. R.; OFFNER, G. D. & CAPO, T. R. Structural studies on aplysioviolin. 7KH
%LRO. %XOO., v. 161, p. 339, 1981.
NOGUEIRA, V. L. R. 2005 Papel de Proteínas Presentes na Tinta...
89
TRUDEL, J. & ASSELIN, A. Detection of chitinase activity after poliacrylamide gel
electrophoresis. $QDO. %LRFKHP., v. 178, p. 362-366, 1989.
VIGERS, A. J.; ROBERTS, W. K. & SELITRENNIKOFF, C. P. A new family of plant
antifungal proteins.0RO. 3ODQW0LFUREH,QWHU, v. 4, p. 315-323, 1991.
VIZIOLI, J. & SALZET, M. Antimicrobial peptides from animals: focus on invertebrates.
75(1'63KDUPDFRO. 6FL., v. 23, n. 11, p. 494-496, 2002.
WALTERS, E. T. & ERICKSON, M. T. Directional control and the functional organization
of defensive responses in $SO\VLD. -. &RPS. 3K\VLRO.PartA, v. 159, p. 339-351, 1986.
WITSTREICH, G. A., LECHTMAN, M. D. 0LFU RELRORJLD GDV 'RHQoDV +XPDQDV. Editora
Guanabara Koogan S. A., Rio de Janeiro, 2ª Edição, 661 p., 1980.
YAMAZAKI, M.; KIMURA, K.; KISUGI, J. & KAMIYA, H. Purification of a cytolytic
factor from purple fluid of a sea hare. )(%6/HWW, v. 198, p. 25-28, 1986.
YAMAZAKI, M.; KIMURA, K.; KISUGI, J.; MURAMOTO, K. & KAMIYA, H. Isolation
and characterization of a novel cytolytic factor in the purple fluid of the sea hare $SO\VLD
NXURGDL. &DQF. 5HV, v. 49, p. 3834-3838, 1989a.
YAMAZAKI, M.; TANSO, S.; KISUGI, J.; MURAMOTO, K. & KAMIYA, H.
Purification and characterization of a cytolytic protein from purple fluid of the sea hare,
'RODEHOODDXULFXODULD. &KHP. 3KDUP. %XOO., v. 37, p. 2179-2182, 1989b.
YAMAZAKI, M.; O HYE, H.; KISUGI, J. & KAMIYA, H. Bacteriostatic and cytolytic
activity of purple fluid from the sea hare. 'HY. &RPS. ,PPXQ., v. 14, p. 379-383, 1990.
NOGUEIRA, V. L. R. 2005 Papel de Proteínas Presentes na Tinta...
90
YANG, H.; JOHNSON, P.M.; KO, K.C.; KAMIO, M.; GERMANN, M. W.; DERBY, C.
D. & TAI, P. C. Cloning, characterization and expression of escaping, a broadly
antimicrobial FAD-cotaining L-amino acid oxidase from ink of the sea hare $SO\VLD
FDOLIRUQLFD. 7KH -. ([S. %LRO., v. 208, p. 3609-3622, 2005
ZASLOFF, M. Antimicrobial peptides of multicellular organisms. 1DWXUH, v. 415, p. 389-
395, 2002.
NOGUEIRA, V. L. R. 2005 Papel de Proteínas Presentes na Tinta...
91
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