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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JULIO DE MESQUITA FILHO”
FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA
ANÁLISE BIOQUÍMICA DO LÍQUIDO AMNIÓTICO E
ALANTOIDEANO DO EQUUS CABALLUS EM DIFERENTES
FASES DA GESTAÇÃO
LUIZ FRANCISCO ZANELLA
Tese apresentada à Faculdade de Medicina
Veterinária e Zootecnia da Universidade
Estadual Paulista , “Julio de Mesquita Filho”,
Campus de Botucatu, como requisito para
obtenção do título de Doutor em Medicina
Veterinária, Área de Reprodução Animal.
Orientador: Nereu Carlos Prestes
Botucatu - SP
Junho - 2008
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FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉCNICA DE AQUISIÇÃO E TRATAMENTO
DA INFORMAÇÃO
DIVISÃO TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CAMPUS DE BOTUCATU - UNESP
BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: Selma Maria de Jesus
Zanella, Luiz Francisco.
Análise bioquímica do líquido amniótico e alantoideano do Equus caballus
em diferentes fases da gestação / Luiz Francisco Zanella. – Botucatu [s.n.],
2008.
Tese (doutorado) – Universidade Estadual Paulista, Faculdade de
Medicina Veterinária e Zootecnia, Botucatu, 2008.
Orientador: Nereu Carlos Prestes
Assunto CAPES: 50504002
1. Eqüino - Reprodução
CDD 636.20824
Palavras-chave: Análise bioquímica; Eqüino; Líquidos fetais
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ii
COMPOSIÇÃO DA BANCA EXAMINADORA
Nome do autor: ZANELLA, Luiz Francisco.
Título:
Análise bioquímica do líquido amniótico e alantoideano do equus
caballus em diferentes fases da gestação.
.
Tese apresentada à Faculdade de Medicina
Veterinária e Zootecnia da Universidade
Estadual Paulista , “Julio de Mesquita Filho”,
Campus de Botucatu, como requisito para
obtenção do título de Doutor em Medicina
Veterinária, Área de Reprodução animal.
Banca Examinadora:
Prof. Dr. Nereu Carlos Prestes _____________________________________
FMVZ – UNESP – Botucatu
Profa. Dra. Fernanda da Cruz Landim- Alvarenga _____________________
FMVZ – UNESP – Botucatu
Profa. Dra. Regina Kiomi Takahira __________________________________
FMVZ – UNESP – Botucatu
Prof. Dr. Wilter Russiano Vivente ___________________________________
FCAV – UNESP - Jaboticabal
Profa. Dra. Mara Regina Stipp Balarin _______________________________
UEL – Londrina
Botucatu, 30 de Junho de 2008.
iii
Dedico este trabalho a
Aninha, o maior presente
Que o universo me deu...
iv
AGRADECIMENTOS
A realização deste trabalho foi possível graças à colaboração direta e indireta
de muitas pessoas. A todas elas minha eterna gratidão:
Aos funcionários da seção de Pós-graduação da Faculdade de Medicina
Veterinária e Zootecnia – Unesp Campus de Botucatu.
Ao Departamento de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária pela
oportunidade concedida para a realização do Curso de Doutorado e, a acolhida
calorosa que recebi. Muito obrigado!
Ao Prof. Dr. Nereu Carlos Prestes pela orientação, exemplo, amizade,
paciência e confiança. Muito Obrigado! Esforçarei-me ao máximo para ser um
profissional como o senhor... eu prometo!
Ao Prof. Dr. Gercio Luiz Bonesi pelo fornecimento do material biológico, sem o
qual, esse trabalho não seria realizado. Muito obrigado!
À doutoranda Carla Fredrichesen pela ajuda “quando os compromissos e a
distancia me impediam de estar presente”.
Ao Prof. Dr. Agostinho Ludovico, ex-coordenador do curso de Medicina
Veterinária da UNOPAR, pelo apoio e incentivo enquanto coordenador. Muito
obrigado!
Ao Prof. Dr. Werner Okano, atual coordenador do curso de Medicina
Veterinária da UNOPAR, pelo apoio e incentivo. Muito obrigado!
Aos Profs. Dr. Luiz César Silva e Ms.Luiz Álvaro responsáveis pelo Laboratório
de Moléstias Infecciosas da UNOPAR, pelas orientações e realização da
eletroforese. Muito obrigado!
v
Ao Prof. Ms. Flávio A. Barca Jr. pelo delineamento estatístico do experimento.
Muito obrigado!
A Profa. Regina Kiomi Takahira pelas orientações e realização dos exames
bioquímicos. Muito obrigado!
À residente Lia Rezende do Laboratório Clínico pelo auxílio para a realização
dos exames bioquímicos. Muito obrigado!
Aos alunos Paulo da Silva (Tamarãna) e Caroline Manfrin (Carol) pelo
companheirismo no “dia a dia” e, auxílio na realização da parte experimental.
Sem vocês, seria mais difícil! Muito obrigado!
Aos amigos Raquel Cristina Gonçalves, Luiz Fernando C. Coelho, Silvia M.
Trapp e José Adauto Gonçalves pelo apoio e companheirismo durante esses
anos. Muito obrigado!
A Profa. Aline Tramontini pela confecção do Abstract. Muito obrigado!
A Minha esposa “Profa.” Mirian companheira de todas as horas, pelo apoio
incondicional e, principalmente, pela compreensão das horas ausentes... Muito
obrigado!
A “Deus” por conceder-me a graça da vida! O muito obrigado! Ainda é dizer
muito pouco...
vi
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS........................................................................................viii
LISTA DE TABELAS...........................................................................................x
RESUMO..........................................................................................................xiii
ABSTRACT......................................................................................................xiv
1. INTRODUÇÃO...............................................................................................1
2. REVISÃO DE LITERATURA.........................................................................04
3. OBJETIVOS..................................................................................................12
4. MATERIAL E MÉTODOS..............................................................................13
4.1 Grupos experimentais.................................................................................13
4.2. Colheita das amostras...............................................................................13
4.3. Determinação da idade fetal......................................................................13
4.4. Análise bioquímica dos líquidos fetais.......................................................16
4.5. Identificação da alfa-fetoproteína...............................................................18
4.6. Análise estatística......................................................................................19
5. RESULTADOS..............................................................................................20
6. DISCUSSÃO..................................................................................................42
7. CONCLUSÕES..............................................................................................51
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.............................................................53
9. Artigos Científicos.......................................................................................60
vii
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 01- Amniocentese para colheita de liquidos fetais em terço inicial da
gestação............................................................................................................14
FIGURA 02 - Amniocentese para colheita de liquidos fetais em terço médio da
gestação............................................................................................................14
FIGURA 03 - Liquido amniótico e alantoideano eqüino.....................................14
FIGURA 04 - Ilustração da aferição do comprimento do embrião com idade
gestacional de 1 mês.........................................................................................15
FIGURA 05 - Ilustração da aferição do comprimento do feto com idade
gestacional de 8 meses.....................................................................................15
FIGURA 06 - Representa o gráfico para a Fosfatase alcalina em U/L no líquido
amniótico............................................................................................................21
FIGURA 07- Representa o gráfico da glicose em mg/dL no líquido amniótico 22
FIGURA 08 - Representa o gráfico da Proteína Total em mg/dL no líquido
amniótico............................................................................................................23
FIGURA 09 - Representa o gráfico da Uréia em mg/dL no líquido amniótico...24
FIGURA 10 - Representa o gráfico da creatinina em mg/dL no líquido
amniótico............................................................................................................25
FIGURA 11 - Representa o gráfico do Cálcio em mg/dL no líquido amniótico..26
FIGURA 12 - Representa o gráfico do íon Cálcio em mEq/L no líquido
amniótico............................................................................................................27
FIGURA 13 - Representa o gráfico do íon Na em mEq/L no líquido amniótico.28
viii
FIGURA 14 - Representa o gráfico do íon K em mEq/L no líquido amniótico...29
FIGURA 15 - Representa o gráfico para a Fosfatase alcalina em U/L no
líquido alantoideano...........................................................................................30
FIGURA 16 - Representa o gráfico da glicose em mg/dL no líquido
alantoideano......................................................................................................31
FIGURA 17 - Representa o gráfico da Proteína Total em mg/dL no líquido
alantoideano......................................................................................................32
FIGURA 18 - Representa o gráfico da Uréia em mg/dL no líquido
alantoideano......................................................................................................33
FIGURA 19 - Representa o gráfico da creatinina em mg/dL no líquido
alantoideano......................................................................................................34
FIGURA 20 - Representa o gráfico do Cálcio em mg/dL no líquido
alantoideano......................................................................................................35
FIGURA 21 - Representa o gráfico do íon Cloreto em mEq/L no líquido
alantoideano......................................................................................................36
FIGURA 22 - Representa o gráfico do íon Sódio em mEq/L no líquido
alantoideano......................................................................................................37
FIGURA 23 - Representa o gráfico do íon Potássio em mEq/L no líquido
alantoideano..................................................................................................... 38
FIGURA 24 - Representa o gráfico obtido da comparação da análise
bioquímica do líquido amniótico e alantoideano, para cada fase do período
gestacional.........................................................................................................40
FIGURA 25 - Ilustração da eletroforese em gel de poliacrilamida a 12%.........41
ix
LISTA DE TABELAS
TABELA 01. Expressa os valores da média, desvio padrão, valor mínimo, valor
máximo, e amplitude dos dados da Fosfatase Alcalina em U/L no líquido
amniótico............................................................................................................21
TABELA 02. Expressa os valores da média, desvio padrão, valor mínimo, valor
máximo, e amplitude dos dados da glicose em mg/dL no líquido amniótico.....22
TABELA 03. Expressa os valores da média, desvio padrão, valor mínimo, valor
máximo, e amplitude dos dados da Proteína Total em mg/dL no líquido
amniótico............................................................................................................23
TABELA 04. Expressa os valores da média, desvio padrão, valor mínimo, valor
máximo, e amplitude dos dados da Uréia em mg/dL no líquido amniótico........24
TABELA 05. Expressa os valores da média, desvio padrão, valor mínimo, valor
máximo, e amplitude dos dados da Creatinina em mg/dL no líquido
amniótico............................................................................................................25
TABELA 06. Expressa os valores da média, desvio padrão, valor mínimo, valor
máximo, e amplitude dos dados do Cálcio em mg/dL no líquido
amniótico........................................................................................................... 26
TABELA 07. Expressa os valores da média, desvio padrão, valor mínimo, valor
máximo, e amplitude dos dados do íon Cloreto em mEq/L no líquido
amniótico............................................................................................................27
TABELA 08. Expressa os valores da média, desvio padrão, valor mínimo, valor
máximo, e amplitude dos dados do íon Sódio em mEq/L no líquido
amniótico............................................................................................................28
x
TABELA 09. Expressa os valores da média, desvio padrão, valor mínimo, valor
máximo, e amplitude dos dados do íon Potássio em mEq/L no líquido
amniótico............................................................................................................29
TABELA 10. Expressa os valores da média, desvio padrão, valor mínimo, valor
máximo, e amplitude dos dados da Fosfatase Alcalina em U/L no líquido
alantoideano......................................................................................................30
TABELA 11. Expressa os valores da média, desvio padrão, valor mínimo, valor
máximo, e amplitude dos dados da glicose em mg/dL no líquido
alantoideano......................................................................................................31
TABELA 12. Expressa os valores da média, desvio padrão, valor mínimo, valor
máximo, e amplitude dos dados da Proteína Total em mg/dL no líquido
alantoideano......................................................................................................32
TABELA 13. Expressa os valores da média, desvio padrão, valor mínimo, valor
máximo, e amplitude dos dados da Uréia em mg/dL no líquido alantoideano..33
TABELA 14. Expressa os valores da média, desvio padrão, valor mínimo, valor
máximo, e amplitude dos dados da Creatinina em mg/dL no líquido
alantoideano......................................................................................................34
TABELA 15. Expressa os valores da média, desvio padrão, valor mínimo, valor
máximo, e amplitude dos dados do Cálcio em mg/dL no líquido
alantoideano......................................................................................................35
TABELA 16. Expressa os valores da média, desvio padrão, valor mínimo, valor
máximo, e amplitude dos dados do íon Cloreto em mEq/L no líquido
alantoideano..................................................................................................... 36
TABELA 17. Expressa os valores da média, desvio padrão, valor mínimo, valor
máximo, e amplitude dos dados do íon Sódio em mEq/L no líquido
alantoideano......................................................................................................37
xi
TABELA 18. Expressa os valores da média, desvio padrão, valor mínimo, valor
máximo, e amplitude dos dados do íon Potássio em mEq/L no líquido
alantoideano......................................................................................................38
TABELA 19. Expressa os valores das médias obtidas da comparação
estatística entre o liquido amniótico e alantoideano dos elementos bioquímicos
analisados para cada fase do período gestacional............................................39
xii
Nome do autor: ZANELLA, L. F. Análise bioquímica do líquido amniótico e
alantoideano do Equus caballus em diferentes fases da gestaçao. 2008.p.
Tese de Doutorado em Medicina Veterinária, Área de Reprodução Animal.
Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade Estadual
Paulista, Botucatu.
Resumo
Os líquidos fetais possuem diversas funções que são vitais para o feto. Para a
espécie eqüina até o presente momento, não está totalmente definida a
composição bioquímica do líquido amniótico no decorrer da gestação. O
presente trabalho teve como objetivo verificar a composição bioquímica do
liquido amniótico e alantoideano das éguas em diferentes fases da gestação.
Para isso analisou-se 60 amostras de fluidos fetais, empregando-se kits
comerciais para se determinar a concentração bioquímica da Fosfatase
Alcalina, Glicose, Proteínas Totais, Uréia, Creatinina, Cálcio, Cloreto, Sódio e
Potássio durante a gestação. A concentração da alfa-fetoproteína foi avaliada
empregando-se a eletroforese em gel de poliacrilamida. A concentração da
Fosfatase Alcalina no liquido amniótico foi maior quando comparada ao liquido
alantoideano nas três fases da gestação (p < 0,05). Para a glicose o valor
médio entre os dois fluidos não apresentou variações (p < 0,05). Para a
Proteína total o valor médio do liquido amniótico foi maior que o alantoideano (p
< 0,05). A Uréia sofreu variações na concentração entre as fases, mas não há
diferenças dos valores médios (p > 0,05) entre os fluidos. Para a Creatinina os
valores presentes no liquido alantoideano são mais altos que os valores do
liquido amniótico (p < 0,05). As concentrações dos íons Cloreto e Sódio
apresentaram–se mais elevados (p < 0,05) no liquido amniótico. As
concentrações dos íons Cálcio e Potássio foram mais elevadas nos líquidos
alantoideanos (p<0,05). A eletroforese identificou duas bandas protéicas que
podem ser a alfa-fetoproteína, ela parece aumentar a concentração durante o
período gestacional. Porém, faltam estudos na espécie eqüina para a
comparação dos resultados do presente trabalho.
Palavras-Chave: eqüino, líquidos fetais, análise bioquímica.
xiii
Author’s name: ZANELLA, L. F. Biochemical assay of the amniotic and
allantoic fluids of Equus caballus in different stages of pregnancy. 2008.p.
Doctorate Thesis in Veterinary Medicine, Area of Animal Reproduction. School
of Veterinary Medicine and Zootechnology, Universidade Estadual Paulista,
Botucatu.
Abstract
Fetal fluids play a vital role in the development of the fetus. The biochemical
composition of the amniotic fluid along pregnancy in horses had not been
described until this present study. Sixty samples of fetal fluids were collected
and the concentrations of Alkaline Phosphatase (FA), Glucose, Total Proteins
(PT), Urea, Creatinin, Calcium (Ca), Chloride (Cl), Sodium (Na) and Potassium
(K) along pregnancy were determined using commercially available kits. The
levels of alpha-fetoprotein (AFT) were measured by polyacrylamide gel
electrophoresis. During the three stages of pregnancy the concentrations of FA
in the amniotic fluid were higher than those determined in the allantoic fluid (p <
0,05). The glucose levels did not differ between the fluids (p < 0,05). The mean
values for the concentrations of PT were higher in the amniotic fluid than in the
allantoic (p < 0,05). The urea levels differ among the pregnancy stages, but
there were no differences in the mean values of urea (p > 0,05) between the
two fluids. The concentrations of creatinin obtained in the allantoic fluid were
higher than those obtained in the amniotic fluid (p < 0,05). The concentrations
of Cl and Na were elevated (p < 0,05) in the amniotic fluid. The levels of the
ions Ca e K were higher in the allantoic fluid (p<0,05). Polyacrylamide gel
electrophoresis identified two protein bands that could be alpha-fetoprotein,
which appears to have its concentration increased during pregnancy. There is a
need for more studies in the biochemical composition of fetal fluids in horses to
compare the results obtained in this study.
Keywords: horse, fetal fluids, biochemical assays.
1
1. INTRODUÇÃO:
Para a espécie eqüina até o presente momento, não está totalmente
definida a composição bioquímica do líquido amniótico no decorrer da
gestação. Os trabalhos que versam sobre o assunto são escassos. Portanto,
ainda não existem métodos capazes de determinar, com exatidão, o grau de
maturação de alguns órgãos. (VAALA, HOUSE, 2002). Assim, ainda é difícil
estabelecer, juntamente com outros métodos aplicados em perinatologia, a
idade gestacional do concepto eqüino e, por conseguinte, estabelecer o nível
de estresse que esse produto irá enfrentar no momento do parto (WILLIANS et
al., 1992; VAALA, HOUSE, 2002).
O embrião eqüino, assim como os outros mamíferos, se desenvolve no
interior do útero materno. As funções vitais para o desenvolvimento e a
manutenção da vida fetal como a oxigenação, nutrição e a remoção das
excretas nitrogenadas são realizadas pela circulação placentária e, neste
contesto, os líquidos fetais desempenham papéis fundamentais tanto na
gestação como no parto das éguas (PRESTES, 2006).
Após a fertilização do óvulo, na ampola do oviduto, tem início o processo de
clivagem pelo qual o zigoto se divide em pequenas células denominadas de
blastômeros (LANDIM-ALVARENGA, 2006). Por volta do 4.º ao 6.ºdia após a
ocorrência da fecundação, o embrião do eqüino deixa a tuba e migra para o
corno uterino (FLOOD, 1992). Neste momento, o embrião encontrar-se-á no
estádio de mórula ou blastocisto inicial. As células do embrião compactado se
dividem para formar uma mórula de 32 células, que se caracteriza, por
apresentar um pequeno grupo de células no interior da estrutura rodeada
externamente por outro grupo de células. São estas células localizadas
externamente que formarão o trofoblasto. Posteriormente, ele originará o cório
ou, como também é conhecida, a porção materna da placenta. Já as células da
mórula, localizadas internamente, originarão o embrião (GUINTER, 1998).
O embrião eqüino ainda não se encontra fixado à parede uterina pois, se
movimenta livremente no interior do útero materno e possui uma cápsula de
glicoproteína entre o trofoblasto e a zona pelúcida cuja função, ainda não foi
completamente esclarecida. Alguns pesquisadores acreditam que esta
2
estrutura esteja relacionada com a proteção do embrião, promovendo atividade
mecânica contráctil do útero .(QUINN et al., 2004; STOUT et al., 2004).
A implantação do embrião no útero da égua ocorre entre o 25.º e o
40.ºdia de gestação (FLOOD, 1992; GUINTER, 1998). Pesquisas recentes
evidenciaram a participação de diversas substâncias no mecanismo de
regulação da implantação, dentre elas, merecem destaque as citocinas, os
hormônios, as enzimas e outros fatores como (insulin growth factorII e o
epidermal growth factor) (LANDIM-ALVARENGA, 2006).
Uma vez estabelecida a implantação, tem-se o início do processo de
placentação, que consiste na justaposição das vilosidades do corio fetal com as
criptas da mucosa uterina. A placenta é um órgão situado entre a mãe e o feto
e cuja função está relacionada com: suprimento de oxigênio e nutrientes,
remoção de detritos proveniente do metabolismo fetal bem como, produção de
hormônios e regulação do ambiente uterino. A placenta no eqüino se forma por
nidação superficial e, portanto, ela é classificada como adeciduada ou
semiplacenta.
O número de camadas de tecido uterino que se relaciona com o tecido
fetal varia entre as espécies. Portanto, para a classificação das placentas
também se deve levar em consideração o número de camadas que constituem
o tecido uterino (LANDIM-ALVARENGA, 2006) e o tipo de arranjo entre as
vilosidades do cório e do alantóide (GRUNERT, BIRGEL, 1989). Sendo assim,
a placenta eqüina é considerada epitélio-corial.
Para aumentar a área de contato entre a parte fetal e a uterina, foram
formadas estruturas denominadas de vilosidades e microvilosidades. Portanto,
com base na relação anatômica que se estabelece entre o cório e o epitélio
uterino, pode-se evidenciar quatro tipos de configurações. Nas éguas essa
configuração é do tipo difusa (LEISER, KAUFMANN. 1994), pois o alantocório
apresenta-se fixado ao endométrio uterino por microcotilédones distribuídos de
maneira difusa por todo corno do útero, com exceção de uma pequena área no
interior da cérvix denominada de estrela cervical (TROEDSSON, SAGE, 2001).
Uma particularidade dessa espécie, no que diz respeito à placentação, é
que nas primeiras semanas de vida o eqüino apresenta a placenta do tipo
coriovitelínica. Entre a quarta e a quinta semana, conforme o alantóide se
3
desenvolve, a placenta se torna corioalantoideana (GUINTER, 1998; LANDIM-
ALVARENGA, 2006).
À medida que ocorre o desenvolvimento do embrião, o trofoblasto se
funde com as membranas internas das células da mesoderme, formando o
cório. O cório envolve externamente todo o embrião e as outras três
membranas fetais: o âmnio, o saco vitelino e o alantóide.
O saco vitelino nos mamíferos se torna vestigial em poucas semanas,
mas nos eqüinos ele é bastante proeminente nas quatro primeiras semanas de
vida do embrião, e parece ter um papel importante na nutrição embrionária
(FLOOD, 1992; PRESTES, 2006).
O âmnio é formado a partir de dobras do trofoblasto juntamente com a
mesoderme avascular, e circunda completamente todo o embrião. Ele é
constituído por dois folhetos e entre eles há o espaço amniótico contendo o
liquido amniótico (ASBURY, LeBLANC. 1993).
Antes que a parede abdominal se feche, já no estágio fetal, uma
projeção do intestino se estende em direção ao tecido mesodérmico solto. Esta
estrutura forma o saco alantoidiano que também é constituída por dois folhetos
embrionários. Um folheto interno que se encontra bem próximo ao folheto
interno do âmnio formando o alantoâmnio e um externo, que se funde ao cório
formando o alantocório. Entre o alantoâmnio e o alantocório evidencia-se o
espaço alantoidiano que recobre todo o embrião eqüino (BJÖKMAN, 1973;
LEISER, KAUFMANN, 1994; LANDIM-ALVARENGA, 2006).
O alantoâmnio e o alantocório juntam-se aos vasos umbilicais sendo
duas artérias e uma veia e formam assim o cordão umbilical. O cordão também
contém o úraco, estrutura responsável pela conexão entre a bexiga fetal e a
cavidade alantoidiana. O cordão estabelece o contato entre os envoltórios
maternos e fetais (ASBURY, LeBLANC. 1993; LEISER, KAUFMANN. 1994).
4
2. Revisão de literatura:
O líquido amniótico no início da gestação é produzido a partir de
secreções do epitélio amniótico e da urina fetal. Posteriormente, com o
desenvolvimento da gestação, o esfíncter vesical impede a liberação da urina
fetal para a cavidade amniótica e a saliva e as secreções nasais fetais passam
a fazer parte da composição do líquido amniótico (ARTHUR, 1969).
Considerando que este fluido envolve diretamente o feto, nele podem
ser encontrados pêlos, células epiteliais, resto de escamação cutânea e, nos
fetos traumatizados, pode-se ainda, encontrar a presença de mecônio. Nos
eqüinos o volume deste fluido varia de três a sete litros e sua coloração normal
é amarelada com ligeira viscosidade e, a presença de floculações não é
considerada normal.(GRUNERT, BIRGEL,1989).
O líquido alantoidiano possui origem renal, geralmente composto pela
urina fetal, o seu volume, na espécie eqüina, é de 4 -10 litros e sua coloração é
marrom claro, opaco e ligeiramente turvo (GRUNERT, BIRGEL,1989; FLOOD,
1992; GUINTER, 1998).
Os líquidos fetais possuem diversas funções que são vitais para o feto
dentre elas, destacam-se : 1. Proteção contra choques externos, variações de
temperatura e desidratação (GRUNERT, BIRGEL, 1989; WILLIIAMS et al.,
1992; ASBURY, LeBLANC, 1993), 2. Evitar a aderência da pele do feto à
membrana amniótica, 3. Promover a lubrificação e a dilatação da via fetal
durante a fase de expulsão no parto (GRUNERT, BIRGEL, 1989; ASBURY e
LeBLANC, 1993) 4. Também, permite a livre movimentação e o crescimento do
fetal no interior do útero (ARTHUR, 1969). 5. Inibir o crescimento bacteriano
(LANDIM-ALVARENGA, 2006).
Nas mulheres a amniocentese e a subseqüente análise do liquido
amniótico são utilizadas para detectar principalmente: doenças congênitas,
defeitos de tubo neural, idade gestacional e maturidade fetal pulmonar. O
exame é indicado para mulheres acima de 35 anos devido à maior
probabilidade de anormalidades cromossômicas fetais (CAMPANA., et al
2003).
O grau de maturação pulmonar dos neonatos humanos é avaliado
dosando-se a porcentagem de fosfatidilglicerol e pela relação da taxa de
5
lecitina/esfingomielina presentes no líquido amniótico, pois eles são
constituintes do surfactante pulmonar dos fetos maturos (WILLIANS et al.,
1992). A técnica é realizada por cromatografia o que a torna inviável para a
rotina da clínica veterinária. (MARTÍNEZ et al., 1999). Outra substância que
está envolvida com a determinação da maturação pulmonar é o cortisol sérico
(VAALA, HOUSE, 2002).
O fator hormonal mais importante no inicio do desencadeamento do
parto é a remoção do bloqueio da contratilidade causado pela ação da
progesterona (LANDIM-ALVARENGA, 2006; ERENO et al., 2007). Entretanto
as observações em caprinos, ovinos, bovinos e humanos indicam que na fase
final da gestação ocorre também um aumento significativo na concentração
plasmática de cortisol fetal devido a estímulos no eixo hipotálamo–hipófise
(BANJANIN et al., 2004; ERENO et al., 2007; RODRIGUES et al., 2007)
Acredita-se então que a maturação do hipotálamo do feto resultaria no
desenvolvimento de sinapses do núcleo paraventricular, permitindo um
aumento na função neuroendócrina fetal. Assim o hipotálamo passaria a
responder aos efeitos dos hormônios placentários (LANDIM-ALVARENGA,
2006).
A maturidade renal, pode ser avaliada através da dosagem de uréia e
creatinina presentes no liquido amniótico, no momento do parto pois diversos
trabalhos mostram que há um aumento na concentração dessas substâncias
no liquido alantoideano ao longo da gestação (WILLIANS et al., 1992). O rim
fetal é afuncional durante o seu período de formação, porém sua contribuição
no final do processo de maturação fetal é importante para a sobrevida do
concepto (LUMBERS et al.,1985)
Na obstetrícia humana algumas enfermidades e a viabilidade fetal
podem ser precisamente determinadas através do exame ultrassonográfico do
feto no interior do útero, associado à composição bioquímica do líquido
amniótico obtida por amniocentese, guiada por ultrassonografia (SCHIMIDT et
al., 1991; VAALA, HOUSE, 2002).
Em medicina veterinária, os primeiros estudos para se analisar a
fisiologia e o comportamento bioquímico do liquido amniótico, obtido por
amniocentese foram realizados primeiramente em ovinos (McDOUGALL,1949;
ALEXANDER et al., 1958; MELLOR e SLATER, 1972). BONGSO E BASRUR
6
(1975) afirmaram que a amniocentese apresentaria aplicação limitada em
medicina veterinária devido a alguns fatores como: anatomia do útero
gravídico, dos sacos fetais e dos fluidos fetais. No entanto, (PRESTES et al.,
2001) realizaram a dosagem bioquímica dos seguintes elementos: glucose,
uréia, creatinina, Gama glutamil transferase (GGT), sódio, potássio, cloro,
proteínas totais e pH no liquido amniótico de ovinos utilizando a amniocentese
aos 70, 100 e 145 dias de gestação e com sucesso. Dos 26 animais utilizados
no experimento apenas 01 ovelha, portadora de parto gemelar abortou após a
segunda colheita realizada aos 100 dias de gestação devido a repetidas
punções nas duas vesículas. Os resultados encontrados permitiram aos
autores concluírem que o valor do pH diminuiu ao longo da gestação. A
concentração de glicose apresentou uma redução durante o período
gestacional. Os valores estatísticos para a uréia mostraram não haver
diferença entre 70, 100 e 145 dias. Os valores encontrados para a creatinina
evidenciaram um aumento com o avanço da gestação. Os valores de GGT
mostraram-se similar nos três momentos especificados para as colheitas,
através de laparotomia.
Os valores encontrados para o sódio permitiram os autores concluírem
que houve uma redução ao longo dos três estágios. Já o potássio apresentou
aos 100 dias a maior concentração. Os valores encontrados para o cloreto
apresentaram o mesmo comportamento do sódio isto é, sofreram aumento no
decorrer da gestação. Os valores encontrados para a proteína total foram
baixos 0,14, 0,23 e 0,24g/dl aos 70, 100 e 145 dias da gestação
respectivamente.
Em bovinos os primeiros autores a realizarem amniocentese foram
(LEIBO, RALL, 1990). Recentemente, Breukelman et al., (2005) estudaram as
características intra-uterina da morte fetal embrionária, no terço inicial da
gestação correlacionando a aparência do concepto, com a taxa de freqüência
cardíaca, perfil bioquímico da glicoproteína associada à prenhez, (PAG) e
prostaglandina F2ά (PGF2ά) após a indução da morte fetal com aglepristone.
Esses autores evidenciaram a ocorrência da diminuição do liquido alantoideano
durante o período de estresse fetal que antecede a morte dos fetos bovinos.
Eles encontraram também, pouca alteração na taxa de freqüência cardíaca em
contraste ao que se observa na espécie humana.
7
Linderberg et al., (2002) empregaram a técnica de amniocentese
descrita por Zepperitz e Grün (1991) em vacas em terço final de gestação, Os
animais foram previamente infectados experimentalmente com o vírus da
diarréia viral bovina (BVD). O objetivo do trabalho era obter líquidos fetais em
condições de “campo” para se detectar a presença do vírus, empregando-se a
técnica de (PCR). O procedimento foi aplicado em 09 vacas e nenhuma
apresentou complicações decorrentes da amniocentese e, os autores puderam
estabelecer um diagnóstico pré-natal de infecção por BVD, utilizando os
líquidos fetais.
Li et al., (2005) estudaram as alterações da composição bioquímica dos
fluidos fetais no terço inicial da gestação em bovinos clonados. Eles pretendiam
encontrar respostas para a maior ocorrência de hidroalantóide e hidroâmnio
nas vacas que gestam fetos obtidos através de clonagem. Eles concluíram que
as principais mudanças são decorrentes de alterações no metabolismo e na
atividade de transporte dos tecidos que constituem a placenta mas, algumas
alterações da composição bioquímica ainda permanecem sem explicações.
MOYA et al., (2006) analisaram por citologia do liquido amniótico obtido
no momento do parto, 60 novilhas nelores sendo que 20 foram inseminadas
artificialmente, 20 se apresentavam gestantes pela técnica de transferência de
embriões e, outras 20 apresentavam-se gestantes pela técnica de fertilização
“in vitro” após aspiração folicular. A análise da citologia do liquido amniótico é
utilizada em medicina humana. Ela é um método seguro empregado para a
avaliação e caracterização epidermal dos fetos em gestações avançadas
(AGORASTOS,1970 apud MOYA et al., 2006). O resultado do trabalho permitiu
aos autores concluírem que apesar de não ter havido diferenças estatísticas
entre os três grupos estudados em questão, a citologia do liquido amniótico das
células coradas pelo corante Hematoxilina-Shorr é um método confiável para
se determinar o grau de maturidade fetal.
LOVELL et al., (1995) realizaram amniocentese guiada por ultra-som em
cabras cujo período gestacional se encontrava entre 59–65 dias, com a
finalidade de se estabelecer o diagnóstico pre-natal de manosidose um
distúrbio catabólico que acomete a espécie caprina e bovina. Segundo relatos
dos autores a amniocentese se mostrou segura e fácil de se realizar nos
8
caprinos. Dos 13 animais utilizados no experimento apenas um abortou
provavelmente, em virtude de ter ocorrido a punção de um placentoma.
As avaliações dos fluidos fetais em cães são escassas. Barreto (2006)
empregou o procedimento cirúrgico (cesariana) para a obtenção dos fluidos
fetais de cadelas, com o intuito de avaliar a maturidade pulmonar dos fetos
desta espécie e, relatou que o teste de Clements modificado pode ser
empregado para a avaliação da viabilidade fetal e maturidade pulmonar.
Afirmou também, que a análise celular com Azul de nilo (0,1%) permite a
observação de células morfologicamente diferentes permitindo assim, avaliar a
maturidade pulmonar fetal. Outro dado analisado pela autora foi a densidade
óptica dos líquidos fetais. Ela concluiu que valores superiores a 0,150 são
indicativos de maturidade pulmonar para a espécie canina.
Em outro estudo BARRETO et al., (2006) avaliaram a composição
bioquímica dos fluídos alantoideano e amniótico totalizando 20 amostras
obtidas de 06 cadelas entre 30 a 40 dias de gestação. As variáveis analisadas
foram: proteínas totais, glicose, uréia, creatinina, cloretos totais e glicose. Dos
constituintes propostos para a análise, os valores de proteínas totais
apresentaram diferença estatística entre os fluidos alantoideano e amniótico.
Esse resultado reflete o fato das proteínas se constituírem nos elementos mais
abundantes dos fluidos fetais e que sofrem maior influência da fisiologia fetal. A
avaliação dos outros elementos não apresentou diferença estatística, podendo
refletir então a sincronia dos fluidos na manutenção do equilíbrio eletrolítico
nestes dois compartimentos.
As primeiras tentativas de amniocentese na espécie eqüina, antes do
desenvolvimento da ultrassonografia, causaram um alto índice de abortos nas
éguas gestantes, fato que desencorajou as pesquisas sobre a aplicabilidade do
procedimento para a espécie e que devido à conformação anatomofisiológica
das estruturas não ocorriam na espécie humana (ASBURY, LeBLANC, 1993).
Porém, com o advento da ultrassonografia tornou-se possível realizar a
amniocentese trans-abdominal guiada por ultra-som (RENAUDIN et al., 1997;
VINCE et al.,2002). Com isso, é possível identificar com precisão, a cavidade
amniótica e alantoideana, o que elevou o índice de sucesso do procedimento
(SCHIMIDT et al.,1991).
9
Recentemente LYLE et al., (2006) desenvolveram uma técnica para
colocação de cateter no interior da cavidade alantoideana com a finalidade de
se poder obter amostras de liquido alantoideano em vários momentos. O
procedimento foi realizado utilizando-se 29 éguas no período compreendido
entre 2003 – 2005. Os animais foram sedados empregando-se a associação de
dois fármacos detomidina e butorfanol e, em seguida, procedeu-se a infiltração
local com lidocaína a 2% na parede abdominal das fossas paralombares. A
associação dos procedimentos de laparoscopia guiada por ultrassonografia
permitiu uma excelente visualização do útero e da cavidade alantoideana e
elevou significativamente a taxa de sucesso do procedimento. Outro fator que
colaborou sobremaneira, para elevar a taxa de eficiência da técnica, segundo
os autores, foi o emprego de cateteres de borracha utilizados para nefrostomia.
Os cateteres foram mantidos nas éguas do estudo conduzido em 2004 por 06
dias em média. Em outro experimento conduzido em 2005 com o cateter para
nefrostomia, com a mesma finalidade foi possível mantê-lo fixado nas éguas
por até 9 dias em média. Este procedimento possibilitou a colheita de fluido
alantoideano nos momentos da cirurgia, 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 36, 42, 50
horas após a colocação do cateter.
As complicações relatadas pelos autores foram: falhas na fixação do
cateter resultando em desprendimento dos mesmos, fato que ocorreu em 03
animais. Mas, a mais grave das complicações encontradas foi a infecção ao
redor do ponto de fixação do cateter que ocorria, em média, após o quinto dia
de pós-operatório. Em algumas éguas essa infecção chegou mesmo, a se
estender para o interior da cavidade alantoideana. No entanto esse fato não
trouxe maiores complicações para as éguas pois, no ano seguinte os mesmos
animais foram novamente aproveitados para outro experimento com a mesma
finalidade sem contudo, apresentarem problemas para a fecundação e
gestação (LYLE et al., 2006).
MURCHIE et al., (2003) realizaram uma técnica de microdiálise do
liquido alantoideano eqüino através de laparotomia trans-abdominal, com a
finalidade de se detectar a concentração de algumas drogas. Dentre elas
merecem destaque a penicilina G, gentamicina e o flunexim meglumine
presentes no liquido alantoideano de éguas gestantes. Das 9 éguas utilizadas
10
para a realização do experimento, somente 01 abortou segundo relatos do
autor.
Smith et al. (1997) conseguiram com sucesso detectar a presença de
herpesvírus tipo I no líquido amniótico de éguas gestantes, antes mesmo da
ocorrência do abortamento.
Kochhar et al., (1997) avaliaram os líquidos fetais de 22 éguas as quais
se encontravam numa mesma propriedade. Em 11 delas o parto transcorreu
normalmente. As outras 11 éguas no entanto, apresentaram partos distócicos.
Os fluidos foram colhidos no momento da parição por centese da bolsa
alantoideana e amniótica. Nas éguas portadoras de distocias, a proteína total
apresentou valores menores já os valores obtidos para a uréia, creatinina e
glicose, nesse grupo foram mais altos. O valor do sódio no liquido alantoideano
foi bem menor quando comparado ao valor encontrado no liquido amniótico. Os
valores obtidos para a dosagem dos íons potássio e cálcio mostraram que os
mesmos apresentaram-se maiores no fluido alantoideano. No entanto, os
autores destacam a ausência de trabalhos e estudos que possam servir como
parâmetros para se avaliar as diferenças na composição bioquímica dos
líquidos fetais das éguas. A intensidade e o tipo do trabalho de parto podem
interferir na composição bioquímica dos fluidos fetais nesta espécie (Kochhar et
al., 1997)
Segundo JONKER (2004) a viabilidade fetal na espécie eqüina pode ser
avaliada através de dosagens dos parâmetros bioquímicos, hormonais e
exames ultra-sonográficos dos líquidos fetais e da placenta. Mas para tanto, se
faz necessário mais estudos para se identificar a composição dos líquidos
fetais em cada fase da gestação da égua.
A alfa-fetoproteína é uma glicoproteína sintetizada pelo saco vitelino
fetal no início da gestação CAMPANA et al., (2003) e, posteriormente, pelo
fígado do feto (KANEKO, 1997). A sua função ainda não é completamente
conhecida (KANEKO, 1997). Outrossim, ela é considerada um marcador
bioquímico importante para o diagnóstico pré-natal de alguns defeitos de
formação congênita fetal em humanos (ALVAREZ-NAVA et al., 2003;
CAMPANA et al., 2003; GORDON et al., 2003). Níveis elevados indicam
defeitos do tubo neural (anencefalia, espinha bífida), cistos sacrocccígeos,
11
obstrução esofágica, ou intestinal, necrose hepática, defeitos da parede
abdominal, obstrução urinária e anormalidades renais, defeitos na
osteogênese, defeitos congênitos de pele, baixo peso fetal, oligoidrâmnio,
gestação múltipla. Já os níveis baixos indicam trissomias cromossômicas como
síndrome de Down, doença trofoblástica gestacional e morte fetal (ALVAREZ-
NAVA et al., 2003; CAMPANA et al., 2003; GORDON et al., 2003).
Em bovinos SMITH et al., (1979) avaliaram a distribuição da AFP por
radioimunoensaio nos fluidos fetais entre o terceiro e o quarto mês de gestação
e, encontraram para o líquido alantoideano valores de 27- 31µg/mL e 3 µg/mL
próximo ao parto. Para o liquido amniótico os valores encontrados foram 17- 25
µg/mL entre o terceiro e o quarto mês de gestação e valores < 5 µg/mL próximo
ao parto.
Em humanos a massa molecular da AFP é de 69 kDa (MAESTRI et al.,
1998). Em cães BARRETO, (2006) relatou que a massa molecular da AFP
seria de 66 kDa para o liquido amniótico podendo ser determinada pela técnica
de eletroforese em Gel de Poliacrilamida PAGE.
SEPULVEDA et al. (1995) relataram que em humanos é possível a
ocorrência de elevadas taxas de AFP no liquido amniótico sem contudo, ser
identificado ao exame ultra-sonográfico qualquer anormalidade de mal
formação, evidenciando a importância de se associar as técnicas para a
avaliação da conformação fetal.
12
3. Objetivos:
3.1 Gerais:
Determinar a composição bioquímica dos líquidos fetais da espécie eqüina na
fase inicial,intermediária e final da gestação
3.2 Específicos:
1. identificar os parâmetros fisiológicos dos principais eletrólitos presentes no
liquido amniótico durante a gestação das éguas.
2. determinar os parâmetros fisiológicos dos principais eletrólitos presentes no
liquido alantoideano durante a gestação das éguas.
3. estabelecer parâmetros bioquímicos que possam fornecer informações para
a clínica obstétrica eqüina.
13
4. Materiais e Métodos:
4.1. Grupos experimentais:
Foram utilizadas amostras de líquidos amnióticos e alantoideanos de
éguas gestantes. Os animais foram divididos em três grupos experimentais,
com vinte animais em cada grupo. Esta divisão se fundamentou nos três
períodos clássicos da gestação (terço inicial, médio e final). O terço inicial
compreende o período até os 90 dias de gestação. O médio compreende o
período entre os 90 a 240 dias de gestação e o final corresponde à idade
gestacional a partir dos 270 dias de gestação.
4.2. Colheita das amostras
As amostras dos líquidos fetais foram obtidas diretamente do útero das
éguas que foram abatidas no frigorífico especializado em abate e
comercialização de carne eqüina, localizado na cidade de Apucarana, no
estado do Paraná. No mesmo dia do abate das éguas, os úteros das mesmas
eram transportados para o laboratório de Anatomia Patológica da faculdade de
Medicina Veterinária da UNOPAR localizado na cidade de Arapongas. Onde
então, se realizava a dissecção do útero e posteriormente das membranas
corioalantoideana e a amniótica em seguida, se realizava alantoideocentese e
amniocentese com o auxílio de agulhas 30x08
1
e seringas estéreis
2
de 20ml.
Figuras 1 e 2. Os materiais colhidos eram colocados em tubos de ensaios de
20 mL previamente identificados Figura 3 em duplicata quando possível. Uma
vez que, para os fetos com idade gestacional de até 03 meses a média dos
volumes obtidos foi de 02 mL. Em seguida, as amostras foram congeladas e
estocadas em freezer a -20C° para posterior avaliação (WILLIANS et al.,1992).
4.3. Determinação da idade fetal
O período gestacional na qual a égua se encontrava, no momento da
colheita, foi determinado utilizando-se a metodologia proposta por ROBERTS,
(1986). Figuras 4 e 5.
1
Agulhas hipodérmicas BD
2
Seringas estéreis BD.
14
FIGURA 01:Foto ilustrativa da amniocentese no terço inicial de gestação.
FIGURA 02: Foto ilustrativa da amniocentese realizada no terço médio da
gestação, mostrando parede uterina (1); Membrana corioalantoideana (2);
Membrana amniótica (3).
FIGURA 03: Foto ilustrativa mostrando em A liquido alantoideano e B
líquido amniótico.
1 Útero
2 Membrana
corioalantoideana
3 Membrana
aminiótica
A
B
15
FIGURA 04: Foto ilustrativa do embrião com idade gestacional de 1 mês.
FIGURA 05: Foto ilustrativa da aferição do comprimento do feto com idade
gestacional de 8 meses.
16
4.4. Análise bioquímica dos líquidos fetais:
Foram pesquisados e quantificados os seguintes elementos nos líquidos
fetais das éguas: fosfatase alcalina, glicose, proteínas totais, uréia, creatinina,
lactato desidrogenase e os íons cálcio, cloreto, sódio e potássio. Outra
substancia que se procurou identificar e avaliar o seu comportamento ao longo
do período gestacional foi a alfa-fetoproteína.
Todas as dosagens foram realizadas no espectrofotômetro CELM,
modelo SB-190, com exceção do sódio e potássio cuja dosagem foi realizada
no fotômetro de chama CELM, modelo FC-280.
Para a dosagem da fosfatase alcalina
3
a técnica empregada foi o método
cinético, baseado na hidrólise do p-nitrofenilfosfato pela fosfatase alcalina no
soro ou plasma em pH 9,8 cuja velocidade de formação (em comprimento de
onda de 450 ηm) é proporcional à atividade da enzima presente.
Para a dosagem do LDH
4
a técnica empregada foi o método cinético
para determinação no plasma ou soro. A técnica baseia-se na conversão do
piruvato pela LDH em lactato, transformando o NADH2 em NAD. A velocidade
de diminuição da absorbância em 340 ηm é proporcional à atividade
desidrogenásica presente.
A proteína total
5
foi dosada pelo método colorimétrico (Bradford
mofificado) que utiliza corante Coomassie azul brilhante para detectar
quantidades mínimas de proteínas. Esse corante forma um complexo com
albumina e diferentes variedades de globulinas existentes no líquor e urina. A
leitura em espectrofotômetro é realizada 610 ηm.
Para a dosagem da glicose
6
o método utilizado foi o enzimático-
colorimétrico segundo Trinder para determinação de glicose em soro, plasma,
ou outros líquidos biológicos. Baseia-se na atividade das enzimas glicose
oxidase e peroxidase, em comprimento de onda de 505 ηm.
3
- Fosfatase alcalina - Kit Katal.
4
LDH - Kit Katal
5
Proteínas Totais - Kit Microprote-Doles
6
Glicose - Kit Celm.
17
A creatinina
7
foi dosada pelo método cinético para determinação da
creatinina em soro, plasma, urina e líquido amniótico. A creatinina reage com o
ácido pícrico em meio alcalino, e mede-se a velocidade de formação do picrato
alcalino, obtendo-se duas leituras espectrofotométricas em 510 ηm.
A Uréia
8
foi dosada pelo método enzimático-colorimétrico para
determinação da uréia no sangue e urina. Ele baseia-se na hidrólise da uréia
pela enzima uréase, com produção de gás carbônico e íons amônio, em 600
ηm. A cor formada é proporcional à concentração de uréia presente na
amostra.
O Cálcio
9
foi dosado pelo método colorimétrico empregado para soro,
plasma ou urina. O cálcio reage com a cresolftaleína complexona (púrpura de
ftaleína) em meio alcalino formando um complexo intensamente corado, em
570 ηm. A absorbância é proporcional à quantidade de cálcio presente na
amostra
O íon Cloreto
10
foi dosado pelo método colorimétrico para determinação
da concentração de cloretos em amostras de soro, urina e líquor, através de
reação de ponto final. Ela baseia-se na reação dos íons cloreto com tiocianato
de mercúrio. Os íons tiocianato quando combinados com os íons férricos
formam tiocianato férrico, de coloração amarela com intensidade proporcional à
concentração de cloretos. Leitura realizada em 470 ηm
Os ions Sódio e Potássio
11
foram dosados pelo método de fotometria de
chama para determinação de íons sódio, potássio e lítio em amostras de soro
livre de hemólise. Isto se baseia-se na excitação térmica de metais alcalinos,
com emissão de uma onda de freqüência discreta, a qual pode ser isolada por
um filtro ótico. A emissão é proporcional ao número de átomos excitados e,
portanto, determina a concentração do íon na amostra.
7
- Creatinina – Kit Katal
8
-Uréia – Kit Katal
9
-Cálcio – Kit Katal
10
-Cloreto – Kit Labtest
11
-Sódio e Potássio – Kit CELM
18
4.5. A alfa-fetoproteína foi identificada empregando-se a eletroforese em
Gel de Poliacrilamida (PAGE)
4.5.1 Preparo do Gel de Poliacrilamida
O gel de 1 mm de espessura foi polimerizado entre duas placas de vidro,
com auxílio de espaçadores colocados entre elas, nos lados e na parte inferior.
As placas foram presas uma contra a outra com garra metálica forte, sendo
uma posicionada no meio de cada um dos lados e duas na parte inferior. Os
bordos externos e os espaçadores foram lacrados com ágar 2% (fundido) e as
placas presas foram colocadas em posição vertical sobre uma superfície plana.
A solução de gel de separação a 12%, foi preparada e colocada entre as
duas placas de vidro. Acima dela, colocou-se uma camada de água deionizada,
após a polimerização do gel de separação (aproximadamente 20 a 30 minutos),
descartou-se a água deionizada, enxugou-se o topo do gel com um papel
toalha e a placa foi completada com a solução do gel de empilhamento 3,5%.
Um pente foi introduzido na solução de gel de empilhamento antes de
sua polimerização. Durante a polimerização o pente forma 14 canaletas (ou
poços), onde foram aplicadas as amostras.
Após a polimerização do gel de empilhamento, o espaçador inferior foi
removido e as placas, com o gel de poliacrilamida no seu interior, foram fixadas
em uma cuba de eletroforese do tipo vertical.
O reservatório inferior e o superior da cuba foram preenchidos com o
tampão de corrida e o pente foi cuidadosamente removido do gel de
empilhamento, deixando as canaletas livres para se adicionar as amostras.
4.5.2. Corrida Eletroforética
As amostras preparadas foram aplicadas nas canaletas, com o auxilio de
um micropipetador e ponteira; a primeira canaleta à esquerda sempre recebia a
amostra padrão (padrão proteínas soro eqüino) que servia como controle
positivo; as demais canaletas recebiam as amostras a serem testadas.
Terminada a distribuição das amostras, os eletrodos da fonte de energia
elétrica foram conectados a cuba e a corrida eletroforética foi realizada a 12
19
mÅ por aproximadamente 02 horas (30 minutos após o azul de bromofenol ou
corante traçador ter atingido o final do gel de separação).
Após a corrida, o gel de separação foi removido das placas para um recipiente
plástico e corado com corante comassie Blue e documentado por meio de
fotografia.
4.6. Análise estatística:
Os dados foram analisados utilizando o pacote estatístico BioEstat 4.0
(AYRES et al.; 2005) sendo que os valores das classes (variáveis) que
apresentaram distribuição normal e variâncias semelhantes (Proteína e Uréia
do Líquido Amniótico) foram realizados através do teste de análise de
variância (ANOVA) e para verificação das diferenças entre os terços
gestacionais teste de Tukey. Nas classes a serem avaliadas que não
obedeciam aos critérios de distribuição normal e/ou variâncias semelhantes
(demais classes do líquido Amniótico e todas do Líquido Alantóideano), os
valores foram analisados pelo teste não paramétrico de Kruskal-Wallis (ZAR,
1998) e as comparações necessárias através do teste de Student-Newman-
Keuls. O valor de significância mínima foi estabelecido em p<0,05.
20
5. Resultados
Foram colhidos um total de 60 amostras de liquido alantoideano e
amniótico, sendo 20 para gestações com idades iguais ou menores a 03
meses, 20 para gestações com idades entre 4 – 8 meses e, 20 para gestações
com idades maiores ou iguais a 9 meses.
Os valores encontrados para média, desvio padrão, valor mínimo, valor
máximo, e amplitude dos dados, para cada variável do liquido amniótico estão
representados nas Tabelas numeradas de 01 a 09 acompanhados dos seus
respectivos Gráficos. Figuras 06 – 14.
Os valores encontrados para média, desvio padrão, valor mínimo, valor
máximo, e amplitude dos dados, para cada variável do líquido alantoideano
estão representados nas Tabelas numeradas de 10 a 18 acompanhados dos
seus respectivos Gráficos. Figuras 15 – 23.
A comparação estatística das médias entre o liquido amniótico e
alantoideano dos elementos bioquímicos analisados para cada fase do período
gestacional, estão representados na Tabela 19 acompanhada do seu
respectivo Gráfico. Figura 24.
21
TABELA 01. Expressa os valores da média, desvio padrão, valor mínimo, valor
máximo, e amplitude dos dados da Fosfatase Alcalina (FA) em U/L no líquido
amniótico.
Letras iguais na mesma linha indicam não haver diferença significativa p< 0,05.
1- Terço inicial da gestação.
2- Terço médio da gestação.
3- Terço final da gestação.
Ponto vermelho indica o valor da média.
Traço dentro da caixa revela o valor da mediana.
Asterisco revela valores com perfis anormais.
FIGURA 06. Representa o gráfico para a Fosfatase Alcalina em U/L no líquido
amniótico.
FA – Liq. Amniótico
Terço
Inicial
Terço
Médio
Terço
Final
Média 69.62
a
104.23
b
51.46
a
Desvio Padrão 44.40 44.71 15.40
Mínimo 19.40 45.40 26.70
Máximo 162.80 197.90 84.20
Amplitude dos
dados 143.40 152.50 57.50
22
TABELA 02. Expressa os valores da média, desvio padrão, valor mínimo, valor
máximo, e amplitude dos dados da glicose em mg/dL no líquido amniótico.
Glicose – Liq. Amniótico
Terço
Inicial
Terço
Médio
Terço
Final
Média 7,51
a
12,26
a
4,01
b
Desvio Padrão 6,06 8,59 4,94
Mínimo 1,30 2,70 0,20
Máximo 25,50 30,30 16,80
Amplitude dos dados 24,20 27,60 16,60
Letras iguais na mesma linha indicam não haver diferença significativa p< 0,05.
1- Terço inicial da gestação.
2- Terço médio da gestação.
3- Terço final da gestação.
Ponto vermelho indica o valor da média.
Traço dentro da caixa revela o valor da mediana.
Asterisco revela valores com perfis anormais.
FIGURA 07: Representa o gráfico da glicose em mg/dL no líquido amniótico.
23
TABELA 03. Expressa os valores da média, desvio padrão, valor mínimo, valor
máximo, e amplitude dos dados da Proteína Total em mg/dL no líquido
amniótico.
PT – Liquido Amniótico
Terço
Inicial
Terço
Médio
Terço
Final
Média 35,78
a
51,95
b
30,72
a
Desvio Padrão 9,79 11,10 10,93
Mínimo 13,00 34,50 13,90
Máximo 50,35 70,50 61,20
Amplitude dos dados 37,35 36,00 47,30
Letras iguais na mesma linha indicam não haver diferença significativa p< 0,05.
1- Terço inicial da gestação.
2- Terço médio da gestação.
3- Terço final da gestação.
Ponto vermelho indica o valor da média.
Traço dentro da caixa revela o valor da mediana.
Asterisco revela valores com perfis anormais.
FIGURA 08: Representa o gráfico da Proteína Total em mg/dL no líquido
amniótico.
24
TABELA 04. Expressa os valores da média, desvio padrão, valor mínimo, valor
máximo, e amplitude dos dados da Uréia em mg/dL no líquido amniótico.
Uréia – Liqui.
Amniótico
Terço
Inicial
Terço
Médio
Terço
Final
Média 59,99
b
49,32
a
43,45
a
Desvio Padrão 15,71 11,63 11,59
Mínimo 34,50 30,60 23,60
Máximo 93,90 78,90 61,70
Amplitude dos dados 59,40 48,30 38,10
Letras iguais na mesma linha indicam não haver diferença significativa p< 0,05.
1- Terço inicial da gestação.
2- Terço médio da gestação.
3- Terço final da gestação.
Ponto vermelho indica o valor da média.
Traço dentro da caixa revela o valor da mediana.
Asterisco revela valores com perfis anormais.
FIGURA 09. Representa o gráfico da Uréia em mg/dL no líquido amniótico.
25
TABELA 05. Expressa os valores da média, desvio padrão, valor mínimo, valor
máximo, e amplitude dos dados da Creatinina em mg/dL no líquido amniótico.
Creatinina – Liq.
Amniótico
Terço
Inicial
Terço
Médio
Terço
Final
Média 0,30
a
1,93
b
4,27
c
Desvio Padrão 0,28 2,31 2,12
Mínimo 0,10 0,10 1,30
Máximo 1,20 8,70 8,30
Amplitude dos dados 1,10 8,60 7,00
Letras iguais na mesma linha indicam não haver diferença significativa p< 0,05.
1- Terço inicial da gestação.
2- Terço médio da gestação.
3- Terço final da gestação.
Ponto vermelho indica o valor da média.
Traço dentro da caixa revela o valor da mediana.
Asterisco revela valores com perfis anormais.
FIGURA 10. Representa o gráfico da creatinina em mg/dL no líquido amniótico.
26
TABELA 06. Expressa os valores da média, desvio padrão, valor mínimo, valor
máximo, e amplitude dos dados do Cálcio em mg/dL no líquido amniótico.
Ca – Liq. Amniótico
Terço
Inicial
Terço
Médio
Terço
Final
Média 5,43
a
8,37
b
5,69
a
Desvio Padrão 2,07 4,55 2,30
Mínimo 2,40 2,70 2,50
Máximo 9,40 19,50 11,00
Amplitude dos
dados 7,00 16,80 8,50
Letras iguais na mesma linha indicam não haver diferença significativa p< 0,05.
1- Terço inicial da gestação.
2- Terço médio da gestação.
3- Terço final da gestação.
Ponto vermelho indica o valor da média.
Traço dentro da caixa revela o valor da mediana.
Asterisco revela valores com perfis anormais.
FIGURA 11. Representa o gráfico do Cálcio em mg/dL no líquido amniótico.
27
TABELA 07. Expressa os valores da média, desvio padrão, valor mínimo, valor
máximo, e amplitude dos dados do íon Cloreto em mEq/L no líquido amniótico.
Cl – Liq. Amniótico
Terço
Inicial
Terço
Médio
Terço
Final
Média 19,54
a
33,83
b
21,20
a
Desvio Padrão 4,42 9,38 4,41
Mínimo 12,15 23,70 11,20
Máximo 25,77 52,50 29,20
Amplitude dos
dados 13,62 28,80 18,00
Letras iguais na mesma linha indicam não haver diferença significativa p< 0,05.
1- Terço inicial da gestação.
2- Terço médio da gestação.
3- Terço final da gestação.
Ponto vermelho indica o valor da média.
Traço dentro da caixa revela o valor da mediana.
Asterisco revela valores com perfis anormais.
FIGURA 12. Representa o gráfico do íon Cálcio em mEq/L no líquido
amniótico.
28
TABELA 08. Expressa os valores da média, desvio padrão, valor mínimo, valor
máximo, e amplitude dos dados do íon Sódio em mEq/L no líquido amniótico.
Na – Liq. Amniótico
Terço
Inicial
Terço
Médio
Terço
Final
Média 96,95
a
130,15
b
92,10
a
Desvio Padrão 31,20 12,89 26,94
Mínimo 49,00 102,00 39,00
Máximo 137,00 155,00 143,00
Amplitude dos
dados 88,00 53,00 104,00
Letras iguais na mesma linha indicam não haver diferença significativa
p< 0,05.
1- Terço inicial da gestação.
2- Terço médio da gestação.
3- Terço final da gestação.
Ponto vermelho indica o valor da média.
Traço dentro da caixa revela o valor da mediana.
Asterisco revela valores com perfis anormais.
FIGURA 13. Representa o gráfico do íon Sódio (Na) em mEq/L no líquido
amniótico.
29
TABELA 09. Expressa os valores da média, desvio padrão, valor mínimo, valor
máximo, e amplitude dos dados do íon Potássio em mEq/L no líquido
amniótico.
K – Liq. Amniótico Terço Inicial
Terço Médio
Terço Final
Média 8,10
a
5,99
a
6,61
a
Desvio Padrão 5,19 1,49 3,44
Mínimo 3,00 3,80 2,40
Máximo 21,00 8,80 14,00
Amplitude dos dados
18,00 5,00 11,60
Letras iguais na mesma linha indicam não haver diferença significativa p< 0,05.
1- Terço inicial da gestação.
2- Terço médio da gestação.
3- Terço final da gestação.
Ponto vermelho indica o valor da média.
Traço dentro da caixa revela o valor da mediana.
Asterisco revela valores com perfis anormais.
FIGURA 14. Representa o gráfico do íon potássio (K) em mEq/L no líquido
amniótico.
30
TABELA 10. Expressa os valores da média, desvio padrão, valor mínimo, valor
máximo, e amplitude dos dados da Fosfatase Alcalina em U/L no líquido
alantoideano.
Letras iguais na mesma linha indicam não haver diferença significativa p< 0,05.
1- Terço inicial da gestação.
2- Terço médio da gestação.
3- Terço final da gestação.
Ponto vermelho indica o valor da média.
Traço dentro da caixa revela o valor da mediana.
Asterisco revela valores com perfis anormais.
FIGURA 15. Representa o gráfico para a Fosfatase alcalina em U/L no líquido
alantoideano.
FA – Liq. Alantóideano
Terço Inicial
Terço Médio
Terço Final
Média 18,76
a
19,21
a
19,98
a
Desvio Padrão 13,32 9,25 4,79
Mínimo 10,50 9,70 11,30
Máximo 63,20 38,10 29,20
Amplitude dos dados 52,70 28,40 17,90
31
TABELA 11. Expressa os valores da média, desvio padrão, valor mínimo, valor
máximo, e amplitude dos dados da glicose em mg/dL no líquido alantoideano.
Letras iguais na mesma linha indicam não haver diferença significativa p< 0,05.
1- Terço inicial da gestação.
2- Terço médio da gestação.
3- Terço final da gestação.
Ponto vermelho indica o valor da média.
Traço dentro da caixa revela o valor da mediana.
Asterisco revela valores com perfis anormais.
FIGURA 16. Representa o gráfico da glicose em mg/dL no líquido alantoideano
Glicose – Liq. Alantoideano
Terço Inicial
Terço Médio
Terço Final
Média 7,19
a
16,43
b
5,16
a
Desvio Padrão 5,60 8,23 3,84
Mínimo 1,10 6,30 1,60
Máximo 22,20 28,40 16,70
Amplitude dos dados 21,10 22,10 15,10
32
TABELA 12. Expressa os valores da média, desvio padrão, valor mínimo, valor
máximo, e amplitude dos dados da proteína total em mg/dL no líquido
alantoideano.
Letras iguais na mesma linha indicam não haver diferença significativa p< 0,05.
1- Terço inicial da gestação.
2- Terço médio da gestação.
3- Terço final da gestação.
Ponto vermelho indica o valor da média.
Traço dentro da caixa revela o valor da mediana.
Asterisco revela valores com perfis anormais.
FIGURA 17. Representa o gráfico da Proteína Total em mg/dL no líquido
alantoideano.
PT Liq. Alantoideano
Terço
Inicial
Terço
Médio
Terço
Final
Média 10,81
b
40,53
a
32,07
a
Desvio Padrão 8,72 19,26 7,94
Mínimo 1,16 16,50 21,30
Máximo 32,65 96,00 44,30
Amplitude dos dados 31,49 79,50 23,00
33
TABELA 13. Expressa os valores da média, desvio padrão, valor mínimo, valor
máximo, e amplitude dos dados da Uréia em mg/dL no líquido alantoideano.
Uréia – Líq.
Alantoideano
Terço
Inicial
Terço
Médio
Terço
Final
Média 65,74
a
61,84
a
41,68
b
Desvio Padrão 19,78 17,63 9,76
Mínimo 26,40 38,50 29,20
Máximo 97,50 87,00 61,50
Amplitude dos dados 71,10 48,50 32,30
Letras iguais na mesma linha indicam não haver diferença significativa p< 0,05.
1- Terço inicial da gestação.
2- Terço médio da gestação.
3- Terço final da gestação.
Ponto vermelho indica o valor da média.
Traço dentro da caixa revela o valor da mediana.
Asterisco revela valores com perfis anormais.
FIGURA 18. Representa o gráfico da Uréia em mg/dL no líquido alantoideano.
34
TABELA 14. Expressa os valores da média, desvio padrão, valor mínimo, valor
máximo, e amplitude dos dados da Creatinina em mg/dL no líquido
alantoideano.
Letras iguais na mesma linha indicam não haver diferença significativa p< 0,05.
1- Terço inicial da gestação.
2- Terço médio da gestação.
3- Terço final da gestação.
Ponto vermelho indica o valor da média.
Traço dentro da caixa revela o valor da mediana.
Asterisco revela valores com perfis anormais.
FIGURA 19. Representa o gráfico da creatinina em mg/dL no líquido
alantoideano.
Creatinina – Liq.
Alantoideano
Terço
Inicial
Terço
Médio
Terço
Final
Média 0,41
a
7,60
b
13,91
c
Desvio Padrão 0,42 5,07 3,13
Mínimo 0,00 1,00 6,90
Máximo 1,50 15,80 18,00
Amplitude dos dados 1,50 14,80 11,10
35
TABELA 15. Expressa os valores da média, desvio padrão, valor mínimo, valor
máximo, e amplitude dos dados do Cálcio em mg/dL no líquido alantoideano.
Ca – Liq. Alantoideano
Terço Inicial
Terço Médio
Terço Final
Média 4,12
b
17,66
a
20,15
a
Desvio Padrão 2,98 4,21 8,93
Mínimo 1,40 9,10 8,00
Máximo 10,00 28,80 46,80
Amplitude dos dados 8,60 19,70 38,80
Letras iguais na mesma linha indicam não haver diferença significativa p< 0,05.
1- Terço inicial da gestação.
2- Terço médio da gestação.
3- Terço final da gestação.
Ponto vermelho indica o valor da média.
Traço dentro da caixa revela o valor da mediana.
Asterisco revela valores com perfis anormais.
FIGURA 20. Representa o gráfico do Cálcio em mg/dL no líquido alantoideano.
36
TABELA 16. Expressa os valores da média, desvio padrão, valor mínimo, valor
máximo, e amplitude dos dados do íon Cloreto em mEq/L no líquido
alantoideano.
Letras iguais na mesma linha indicam não haver diferença significativa
p< 0,05
1- Terço inicial da gestação.
2- Terço médio da gestação.
3- Terço final da gestação.
Ponto vermelho indica o valor da média.
Traço dentro da caixa revela o valor da mediana.
Asterisco revela valores com perfis anormais.
FIGURA 21. Representa o gráfico do íon Cloreto em mEq/L no líquido
alantoideano.
Cl – Liq. Alantoideano
Terço Inicial
Terço Médio
Terço Final
Média 7,54
b
4,82
a
2,95
a
Desvio Padrão 3,29 3,42 1,49
Mínimo 2,68 0,75 1,20
Máximo 16,57 11,50 5,70
Amplitude dos dados 13,89 10,75 4,50
37
TABELA 17. Expressa os valores da média, desvio padrão, valor mínimo, valor
máximo, e amplitude dos dados do íon sódio em mEq/L no líquido
alantoideano.
Na – Liq. Alantoideano
Terço Inicial
Terço Médio
Terço Final
Média 18,15
b
41,00
a
48,40
a
Desvio Padrão 10,39 27,55 21,46
Mínimo 5,00 14,00 14,00
Máximo 49,00 96,00 105,00
Amplitude dos dados 44,00 82,00 91,00
Letras iguais na mesma linha indicam não haver diferença significativa
p< 0,05.
1- Terço inicial da gestação.
2- Terço médio da gestação.
3- Terço final da gestação.
Ponto vermelho indica o valor da média.
Traço dentro da caixa revela o valor da mediana.
Asterisco revela valores com perfis anormais.
FIGURA 22. Representa o gráfico do íon Sódio em mEq/L no líquido
amniótico.
38
TABELA 18. Expressa os valores da média, desvio padrão, valor mínimo,
valor máximo, e amplitude dos dados do íon Potássio em mEq/L no líquido
alantoideano.
Letras iguais na mesma linha indicam não haver diferença significativa p< 0,05.
1- Terço inicial da gestação.
2- Terço médio da gestação.
3- Terço final da gestação.
Ponto vermelho indica o valor da média.
Traço dentro da caixa revela o valor da mediana.
Asterisco revela valores com perfis anormais.
FIGURA 23. Representa o gráfico do íon Potássio em mEq/L no líquido
alantoideano.
K – Liq. Alantoideano
Terço Inicial
Terço Médio
Terço Final
Média 7,60
a
12,09
b
8,13
a
Desvio Padrão 5,61 4,32 10,52
Mínimo 1,00 6,20 0,00
Máximo 25,00 21,80 34,20
Amplitude dos dados 24,00 15,60 34,20
39
TABELA 19. Expressa os valores das médias obtidas da comparação
estatística entre o liquido amniótico e alantoideano dos elementos bioquímicos
analisados para cada fase do período gestacional.
Variáveis bioquímicas
analisadas/fase da gestação
Líquido
Alantóide
(Valores
Médios)
Líquido
Amniótico
(Valores
Médios)
FA – Terço Inicial 18,76
aA
69,62
aB
FA – Terço Médio 19,21
aA
104,23
bB
FA – Terço Final 19,98
aA
51,46
aB
FA – Valor Médio da Gestação 19,31
A
75,10
B
Glicose – Terço Inicial 7,19
aA
7,51
aA
Glicose – Terço Médio 16,43
bA
12,26
aA
Glicose – Terço Final 5,16
aA
4,01
bB
Glicose – Valor Médio da
Gestação 9,59
A
7,92
A
Proteína – Terço Inicial 10,81
bA
35,78
aB
Proteína – Terço Médio 40,53
aA
51,95
bB
Proteína – Terço Final 32,07
aA
30,72
aA
Proteína – Valor Médio da
Gestação 27,80
A
39,48
B
Uréia – Terço Inicial 65,74
aA
59,99
bA
Uréia – Terço Médio 61,84
aA
49,32
aB
Uréia – Terço Final 41,68
bA
43,45
aA
Uréia – Valor Médio da Gestação 56,42
A
50,92
A
Creatinina –Terço Inicial 0,41
aA
0,30
aA
Creatinina –Terço Médio 7,60
bA
1,93
bB
Creatinina –Terço Final 13,91
cA
4,27
cB
Creatinina –Valor Médio da
Gestação 7,30
A
2,16
B
Ca – Terço Inicial 4,12
bA
5,43
aA
Ca – Terço Médio 17,66
aA
8,37
bB
Ca – Terço Final 20,15
aA
5,69
aB
Ca – Valor Médio da Gestação 13,97
A
6,50
B
Cl – Terço Inicial 7,54
bA
19,54
aB
Cl – Terço Médio 4,82
aA
33,83
bB
Cl – Terço Final 2,95
aA
21,20
aB
Cl – Valor Médio da Gestação 5,10
A
24,86
B
Na – Terço Inicial 18,15
bA
96,95
aB
Na – Terço Médio 41,00
aA
130,15
bB
Na – Terço Final 48,40
aA
92,10
aB
Na – Valor Médio da Gestação 35,85
A
106,40
B
K – Terço Inicial 7,60
aA
8,10
aA
K – Terço Médio 12,09
bA
5,99
aB
K – Terço Final 8,13
aA
6,61
aA
K – Valor Médio da Gestação 9,27
A
6,90
B
Letras maiúsculas diferentes na mesma linha indicam haver diferença
significativa (p<0,05) e letras minúsculas diferentes na mesma coluna,
considerando a mesma variável, indicam haver diferença significativa (p<0,05).
40
0%
20%
40%
60%
80%
100%
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Líquido Amniótico
Líquido Alantóide
FIGURA 24. Representa o gráfico obtido da comparação da análise bioquímica do líquido amniótico e alantoideano, para
cada fase do período gestacional.
41
A eletroforese em gel de poliacrilamida a 12% dos líquidos amnióticos
apresentou uma banda protéica acima da banda referente à albumina e,
revelou a presença de uma banda protéica, imediatamente abaixo da banda da
albumina, ambas são visualmente detectáveis, a partir do terço médio da
gestação como mostra a Figura 25 da página 41.
A eletroforese em gel de poliacrilamida a 12% dos líquidos
alantoideanos não revelou a presença de bandas protéicas próximas a banda
da albumina, para as três fases do período gestacional determinadas para este
experimento.
A seta amarela aponta para a banda proteica da albumina.
A seta verde evidencia a banda proteica referente à cadeia pesada de anticorpos.
A seta preta destaca a banda protéica abaixo da banda da albumina e a seta vermelha destaca
a banda proteica acima da banda da albumina.
FIGRURA 25: Foto da eletroforese em gel de poliacrilamida a 12% mostrando
as bandas protéicas dos líquidos amnióticos.
42
6. Discussão
Ao consultarmos a literatura, chama à atenção a escassez de trabalhos
a respeito da fisiologia obstétrica e, principalmente, sobre a composição
bioquímica dos líquidos amnióticos e alantoideanos nos eqüinos, embora, se
encontre diversos trabalhos voltados para a assistência ao parto da égua e
sobre o diagnóstico da gestação nesta espécie.
Um dos principais empecilhos para o desenvolvimento da fisiologia
obstétrica nos eqüinos foi sem dúvida, a dificuldade de se obter com relativa
segurança os fluídos amnióticos e alantoideano nas éguas, fato que não
ocorreu no ser humano e em outras espécies animais como os ovinos, caprinos
e até mesmo, os bovinos. Contudo, a amniocentese na égua durante muitos
anos desencadearam problemas como infecções uterinas que inviabilizava a
continuidade da vida intra-uterina do concepto e até mesmo, a ocorrência de
abortamentos em virtude de traumas decorrentes de varias perfurações da
cavidade alantoideana e amniótica para a obtenção dos fluidos fetais
(ASBURY, LEBLANC, 1993).
O advento da ultrassonografia permitiu acompanhar o posicionamento
do cateter durante a realização do procedimento cirúrgico de laparocentese
trans-abdominal (RENAUDIN et al., 1997; VINCE et al.,2002). Este fato trouxe
grandes avanços para o procedimento (SCHIMIDT et al.,1991) somados ao
desenvolvimento de novos materiais para a confecção de sondas destinadas a
cateterizar órgãos delicados como os rins dos humanos, (MURCHIE et al.,
2003; LYLE et al., 2006). Muito embora, pelo fato do custo dos equipamentos
ser elevado inviabiliza a realização do procedimento, na rotina obstétrica da
maioria dos hospitais veterinários.
Diante desse fato, optou-se por trabalhar com peças oriundas de
abatedouro especializado no comercio da carne eqüina, para a obtenção dos
fluidos fetais. Com isso, o custo financeiro para a realização do experimento
tornou-se bem menor, o que permitiu a sua realização.
A colheita dos fluidos fetais, das bolsas amnióticas e alantoideanas dos
fetos que se encontravam com 03 meses ou mais de idade gestacional
transcorreram sem problemas. Haja vista, a grande quantidade de volume dos
fluidos. No entanto, o mesmo não aconteceu para os fetos com idade
43
gestacional abaixo de 03 meses, pois o reduzido volume das amostras colhidas
durante o experimento, dificultou as mensurações propostas. O volume médio
obtido para este grupo foi de 2 mL.
Foram colhidos um total de 60 amostras de liquido alantoideano e
amniótico, sendo 20 para gestações com idades iguais ou menores que 03
meses, 20 pra gestações entre 4 – 8 meses e 20 para gestações com idade
maiores ou iguais a 9 meses e respectivamente classificados como grupo 1, 2
e 3.
Os valores das médias encontradas para a fosfatase alcalina FA no
liquido amniótico revelaram a ocorrência de um aumento significativo no terço
médio da gestação. Assim, para os valores das médias entre o terço inicial e
terço médio obteve-se p = 0,003 e
para o terço médio e final obteve-se p =
0,004. No entanto, entre o terço inicial e final não houve variações estatísticas
significantes p = 0,254. No entanto, os valores das médias da FA no liquido
alantoideano não sofreram variações significativas ao longo do período
gestacional p > 0,05.
Todavia, não foi possível comparar esses resultados com os de outros
autores devido à escassez de trabalhos, sobre esse tema na literatura. Porém,
os valores da FA no liquido amniótico se apresentaram bem mais elevados nos
três momentos do experimento quando comparados aos observados para o
liquido alantoideano. Assim, os resultados estatísticos são parecidos aos
observados por KOCHHAR et al., (1997) para a espécie eqüina. Embora os
valores das médias dos dois trabalhos sejam diferentes. No presente estudo
para o terço final da gestação no liquido amniótico ela foi de 51,46 U/L
resultado bem inferior ao relatado pelo outro autor que foi de 96.95U/L. Para o
fluido alantoideano o presente estudo encontrou a média de 19,98 U/L
enquanto o outro autor observou a média de 25,63U/L. Agora ao se comparar
as médias da FA entre os dois fluidos evidenciou-se o que a FA se encontra
em maior quantidade no liquido amniótico, com diferenças significantes para os
três estágios da gestação. A FA está correlacionada com a maturidade fetal,
formação óssea fetal e principalmente, com a função renal. Nos estágios
iniciais, da gestação em humanos, acredita-se que o aumento da sua
intensidade está ligado a descamação do epitélio intestinal (HAHNEMANN,
1974).
44
No presente estudo, os valores das médias para a glicose no liquido
amniótico, no terço final da gestação, apresentou um valor significativamente
menor. Portanto, quando se compara os valores dos terço iniciais e médio não
se observa diferenças estatísticas. No entanto, entre o terço inicial e final há
diferenças significantes p = 0,254. O mesmo ocorre entre o terço médio e o
final p = 0,0001. Para o liquido alantoideano a glicose apresentou um aumento
significativo no terço médio da gestação. Assim, evidenciam-se diferenças
estatísticas entre o terço inicial e médio, p = 0,003 e, entre o terço médio e o
final, p = 0,001. Agora quando se compara as médias da glicose do liquido
alantoideano com as médias do liquido amniótico observa-se que a quantidade
de glicose presente no liquido alantoideano é maior e possui significância para
o terço final da gestação. Estes resultados são contrários aos relatados por
KOCHHAR et al., (1997) que encontraram valores mais altos para o liquido
amniótico. Assim, ao se comparar os resultados dos dois trabalhos nota-se que
os valores das médias do liquido alantoideano são bastante semelhantes. Já os
valores encontrados para o líquido amniótico são diferentes sendo 4,01mg/dL
para o presente experimento e 20,1mg/dL para os resultados do outro autor, no
terço final da gestação.
Ademais, cumpre lembrar que as éguas eram abatidas nas primeiras
horas da manhã e as amostras foram congeladas no período da tarde portanto,
transcorreu certo tempo após a morte dos animais e o congelamento das
amostras, e este fato pode sim vir a interferir nos resultados das dosagens
obtidas neste experimento, em virtude da glicólise que continua a ocorrer
mesmo após a morte dos animais.
Outro fator que certamente influenciou os resultados das dosagens da
glicose neste experimento é o stress que os animais são submetidos
imediatamente antes do abate.
Em ovinos PRESTES et al., (2001) encontraram valores diferentes
estatisticamente para a glicose ao compararem a quantidade presente no
liquido amniótico aos 70, 100, e 145 dias de gestação. Os autores relatam
também, que houve uma redução dos valores ao longo do período gestacional
na ovelha. Fato que se assemelha ao observado neste experimento e que
provavelmente se deve a ingestão de glicose decorrente do reflexo de
deglutição fetal. Ademais, a concentração de glicose pode se apresentar de
45
maneira diferente entre as espécies pois, BARRETO et al., (2006) dosou a
glicose nos fluidos fetais de cadelas aos 30 e 40 dias de gestação e não
encontrou variações dos valores entre o liquido alantoideano e amniótico.
As médias encontradas para a proteína total no liquido amniótico
durante este experimento, revelam que houve um aumento significativo no
terço médio da gestação. Portanto entre o terço inicial e médio há diferencças
significativas p < 0,01. Entre o terço inicial e final não há diferenças p > 0,05 e,
entre os o terço médio e final há diferenças significativas, p < 0,01. No liquido
alantoideano, os valores encontrados revelam um aumento no terço médio da
gestação o qual permaneceu até o terço final. Contudo, os valores encontrados
neste estudo, em questão, para o liquido alantoideano são muito diferentes
daqueles resultados obtidos por KOCHHAR et al., (1997) para o terço final da
gestação, sendo que o mesmo fato se repete para a PT presente no liquido
amniótico. Ao se comparar os valores entre os fluídos fetais observa-se
maiores quantidades de PT no liquido amniótico para o terço inicial e médio. Já
para o terço final os valores das médias se equivalem.
No entanto o comportamento dos valores das médias da PT no liquido
amniótico ao longo da gestação não foi semelhante ao observado por Prestes
et al., (2001) para a espécie ovina. Onde a PT se elevou aos 100 dias de
gestação e permaneceu praticamente constante. Não obstante, os valores
encontrados neste experimento se assemelham aos obtidos em outras
espécies no que tange a pequena quantidade de proteína presente nos fluidos
fetais (REDDY et al., 1995; PRESTES et al., 2001; BARRETO et al., 2006).
Pois, para se poder analisar a PT neste experimento, houve a necessidade de
se empregar o método colorimétrico (Bradford mofificado) que é capaz de
detectar quantidade mínima de proteína. Uma vez que, o kit empregado para
se avaliar a PT na rotina, não foi sensível, o bastante, para se dosar as
proteínas presentes nos líquidos fetais da égua.
A média dos valores para a uréia no liquido amniótico apresentou um
valor mais elevado e significativo, segundo os cálculos estatísticos, na fase
inicial da gestação p < 0,05. O mesmo fato foi observado no liquido amniótico
de ovinos por PRESTES et al., (2001). Posteriormente, para o terço médio e
final os valores não sofreram alterações. O valor da média no presente estudo,
para o teço final da gestação foi de 43,45 mg/dL resultado muito semelhante ao
46
encontrado por KOCHHAR et al., (1997), que relataram um valor de 41,7 mg/dL
para o liquido amniótico de éguas que não apresentaram partos distócicos.
A média dos valores da uréia no liquido alantoideano revelaram não
haver diferenças de valores entre o terço inicial e médio da gestação p = 0,624.
Porém, ocorreu uma diminuição do valor no terço final da gestação onde p <
0,005. Tal fato pode ser decorrente da grande quantidade de urina presente no
saco alantoideano no terço final da gestação (MELLOR et al., 1975). A média
obtida neste trabalho para a uréia no terço final de gestação foi de 41,68 mg/dL
valor próximo ao encontrado por KOCHHAR et al., (1997) que foi de 27,75+
9,48 mg/dL. Contudo, quando comparamos os valores da uréia no liquido
amniótico e alantoideano observou-se que os valores foram diferentes apenas
no terço médio da gestação onde a média do liquido alantoideano se
apresentou mais elevada. Esse resultado difere dos observados por BARRETO
et al., (2006) em cadelas, ao dosar a uréia entre 30 e 40 dias de gestação.
Pois, esses autores não encontraram diferenças estatísticas entre o liquido
alantoideano e amniótico.
A média dos valores da creatinina presente no liquido amniótico se
elevou ao longo do período gestacional. Os valores apresentaram diferenças
significativas entre o terço inicial e o médio p = 0,004 e, entre o terço médio e o
terço final p = 0,003. No entanto, os valores obtidos para a creatinina no terço
final de gestação, neste experimento foi de 4,27mg/dL valor bem menor que os
relatados por KOCHHAR et al., (1997) que foi de 19,38+4,67mg/dL. Para o
liquido alantoideano o valor observado também apresentou variações
significantes ao longo da gestação. Os valores apresentaram diferenças
significativas entre o terço inicial e o médio p = 0,001 e, entre o terço médio e o
terço final p = 0,01. Entretanto, o valor observado de 13,91mg/dL é muito
inferior aos obtido por KOCHHAR et al., (1997) que foi de 68,7mg/dL. Ao
compararmos os valores entre os líquidos amnióticos e alantoideanos observa-
se valores estatisticamente diferentes para o terço médio e final da gestação,
sendo os valores presentes no liquido alantoideano superior ao do liquido
amniótico. Essa observação no presente trabalho está em conformidade com o
resultados encontrados por KOCHHAR et al., (1997). O aumento da taxa de
creatinina está correlacionado com a maturidade renal (PRESTES et al., 2001)
e também; com a atividade muscular fetal (KOCHHAR et al., 1997). E segundo
47
VAALA, (1999) os fetos eqüinos que são acometidos pela síndrome da asfixia
no pré-parto apresentam alteração do valor da creatinina em função da
redução do fluxo sanguíneo destinado a perfusão renal. Porém, essa
observação da diferença dos valores entre os fluidos fetais para a creatinina
não foi observado nas cadelas por BARRETO et al., (2006).
A média do íon cálcio do liquido amniótico, no terço médio da gestação
foi de 8,37mg/dL apresentando uma elevação significativa quando comparada
com o terço inicial p = 0,01 e final da gestação p = 0,04. Para o liquido
alantoideano, o íon cálcio apresentou uma elevação ao longo da gestação,
sendo que a média obtida no terço inicial foi de 4,12mg/dL mais baixa e
estatisticamente diferente das médias observadas para o terço médio que foi
de 17,66 mg/dL e também, para o terço final que foi de 20,15mg/dL onde p =
0,001. Todavia, ao se comparar os valores obtidos entre os líquidos fetais
observa-se que no terço inicial da gestação os valores são semelhantes
enquanto que para o terço médio e final há diferenças estatísticas significantes
e a quantidade de íon ca se apresenta mais elevada no liquido alantoideano.
Esses resultados se assemelham aos obtidos por KOCHHAR et al., (1997)
porém a unidade utilizada por esses autores foi mEq/L. Os mesmos autores
atribuem a maior concentração de ions Calcio no liquido alantoideano a
atividade renal. Ademais, faltam trabalhos sobre o assunto para se estabelecer
novas comparações.
A média da concentração do íon cloreto (Cl) no liquido amniótico no
terço médio do período gestacional foi de 33,83mEq/L, se apresentando mais
alta e estatisticamente diferente das medias obtidas no terço inicial e final da
gestação. Este fato não foi observado por PRESTES et al., (2001) em liquido
amniótico de ovelhas. Onde os autores encontraram valores estatisticamente
diferentes no decorrer da gestação. No liquido alantoideano houve uma
redução significativa estatisticamente da concentração do íon Cl do terço inicial
para o terço médio. Este valor permaneceu sem sofrer alteração significativa,
entre este momento e o terço final da gestação. Não obstante, ao se comparar
os valores de Cl encontrados no liquido alantoideano e amniótico evidencia-se
uma concentração mais elevada e, estatisticamente significativa, no liquido
amniótico. Isto se fez presente nos três períodos do experimento.
48
A média da concentração do íon sódio (Na) no liquido amniótico se
apresentou mais alta no terço médio 130,15mEq/L Ela é estatísticamente
significante quando comparada ao terço inicial e final. A concentração
encontrada no terço final foi de 92,10 mEq/L. Esse valor é menor ao observado
por KOCHHAR et al., (1997). Porém esse fato não foi observado por PRESTES
et al., (2001) em ovinos, que encontraram uma redução significativa da
concentração de Na ao longo da gestação. No liquido alantoideano as médias
da concentração de Cl não sofreram variações significativas durante a
gestação. Entretanto, ao se comparar os valores da concentração deste íon
presente no liquido alantoideano e amniótico observa-se que a concentração é
mais alta e significativa no liquido amniótico, nos três momentos gestacionais
determinados para a realização do experimento. Sendo que a maior diferença
se deu no terço médio da gestação. Esse resultado não se assemelha ao
observado por BARRETO et al., (2006) em cadelas.
As médias da concentração de potássio K não sofreram variações
significativas no liquido amniótico ao longo do período gestacional. Para o terço
final da gestação a média encontrada foi de 6,61mEq/L. Esse valor esta bem
próximo ao observado por KOCHHAR et al., (1997) que encontraram uma
concentração de 9,2mEq/L. Para o liquido alantoideano a média da
concentração do K foi de 12,09 mEq/L se apresentando mais elevada e
estatisticamente diferente no terço médio. Para o terço final a concentração de
K foi de 8,13mEq/L valor também bastante próximo dos encontrados por
KOCHHAR et al., (1997). Outrossim ao se comparar as médias das
concentrações do K presente nos líquidos fetais observa-se que no terço médio
a concentração é maior e, significativa no liquido alantoide. Isso está
relacionado com o aumento da produção da urina fetal mas também, com o
aumento da atividade metabólica do feto durante a gestação (KOCHHAR et al.,
1997; PRESTES et al., 2001).
Não foi possível de se realizar a dosagem do Lactato deshidogenase
(LDH) empregando-se o método cinético para determinação no plasma ou soro
A técnica baseia-se na conversão do piruvato pela LDH em lactato,
transformando o NADH2 em NAD. Os resultados obtidos foram muito dispares.
Tentou-se então, utilizar um kit de outra marca. Porém, sem sucesso e, para se
verificar se os kits estavam sem problemas, dosou-se a LDH de um cão. O
49
resultado obtido estava dentro dos padrões de normalidade. No entanto
KOCHHAR et al., (1997) em seu trabalho relata a dosagem de LDH Entretanto,
o autor não menciona a técnica empregada.
A corrida eletroforética foi realizada empregando-se a solução de gel de
separação a 12% seguindo a metodologia preconizada por BARRETO (2006)
para a eletroforese do liquido amniótico de cadelas. Ademais, foi nessa
concentração que se conseguiu uma melhor distribuição e consequentemente,
melhor visualização das bandas protéicas, pois quando se aumentou a
concentração do gel de separação para 15% a corrida de proteínas
praticamente não ocorreu e, ao se diminuir as concentrações para 10% e 8%
não ocorriam às separações das bandas protéicas ao longo do gel.
A eletroforese para a observação da AFP foi realizada utilizando-se 07
amostras de líquidos amnióticos de éguas em terço inicial de gestação, 07
amostras de líquidos em terço médio e 07 amostras de líquidos em terço final
de gestação. Uma vez que, já se sabe que a albumina bovina possui um peso
molecular de 68 kDa LANE, (1985) pode-se estimar o peso da albumina eqüina
e, a partir de então, procurou-se identificar se havia a presença de uma banda
protéica abaixo da banda de albumina e acima da banda protéica da cadeia
pesada de anticorpos, cujo peso molecular é de 55 kDa (LANE, 1985). A alfa-
fetoproteína é uma alfa-globulina KANEKO, (1997) cujo peso molecular na
espécie humana é de 69 kda CAMPANA et al., (2003) e na espécie canina é de
66 kDa (BARRETO, 2006).
Em todas as amostras analisadas pode-se visualizar com facilidade a
banda protéica referente à albumina. Para as amostras do terço inicial de
gestação não se observou a presença de uma banda protéica imediatamente
abaixo da banda da albumina em 5 das 7 amostras analisadas. No entanto,
para as mostras do terço médio já foi possível, visualizar a presença de uma
banda protéica de coloração leve, o que indica baixa concentração de proteína,
imediatamente abaixo da banda da albumina. Isso se deu em todas as
amostras analisadas. A interpretação da eletroforese das amostras dos líquidos
amnióticos do terço final da gestação, revelou a presença de bandas protéicas
com coloração mais intensa e portanto, mais fácil de se visualizar que a
observada nas amostras do terço médio. Isto indica, um provável aumento da
50
concentração protéica, no entanto a separação entre as bandas da AFP e
albumina são tênues devido à proximidade do peso molecular dessas
moléculas. Essas observações parecem ser contrárias as relatadas por SMITH
et al., (1979) que através de radioimunoensaio encontraram uma concentração
mais elevada de AFP nos fluidos fetais em bovinos, para o terceiro e quarto
mês de gestação.
Outro fenômeno que chamou a atenção na eletroforese foi a presença
de uma banda protéica imediatamente acima da banda de albumina indicando
portanto, que há outra proteína de peso molecular discretamente maior que a
albumina para a espécie eqüina no liquido amniótico.
A eletroforese das amostras dos líquidos alantoideanos não permitiu
identificar de forma clara a presença de bandas protéicas que de acordo com o
seu peso molecular pudessem ser reconhecidas como sendo a AFP. Isso pode
estar relacionado com baixas concentrações da AFP nos líquidos
alantoideanos pesquisados, a necessidade de ajuste da técnica somado a falta
do conhecimento do peso molecular exato da AFP dos eqüinos. Todos esses
fatores foram limitantes para a obtenção deste resultado.
51
7. Conclusões
1) Para o liquido amniótico observa-se que:
• a fosfatase alcalina, a Proteína total, os íons Cálcio, Cloreto e
Sódio são mais elevados no terço médio do período gestacional.
• a concentração da uréia é maior na fase inicial da gestação.
• a concentração de creatinina se eleva durante a gestação.
• a concentração do íon Potássio não se eleva durante as fases
gestacionais determinadas para este experimento.
2) Para o liquido alantoideano observa-se que:
• a fosfatase alcalina não apresenta variações significantes ao longo
do período gestacional.
• a glicose e o ion potássio apresentam aumento no terço médio da
gestação
• a proteína total, os íons Calcio e Sódio apresentam valores menores
no terço inicial da gestação.
• a concentração do íon cloreto é menor no início da gestação.
• a concentração da uréia é menor na fase final da gestação
• a concentração do íon cloreto é maior na fase inicial da gestação.
• a concentração da creatinina se elevou durante a gestação.
3) As comparações das médias das concentrações dos liqiuidos fetais
revelam que:
• as concentrações da Fosfatase alcalina, Proteína total, íons cloreto,
Sódio, são maiores no liquido amniótico nas três fases da gestação.
• as concentrações da Glicose e da Uréia não apresentam diferenças
durante a gestação
• as concentrações dos íons Cálcio, Potássio são maiores no liquido
alantoideano.
4) A eletroforese do líquido amniótico possibilitou identificar uma banda
protéica imediatamente abaixo da banda referente à banda da albumina,
52
e uma banda imediatamente acima. Estas bandas protéicas
aumentaram de tamanho ao longo do período gestacional o que sugere
um aumento da concentração protéica, mas novos estudos precisam ser
realizados para se determinar quais destas bandas proteicas é a alfa-
fetoproteína equina.
5) Há necessidade de novos trabalhos sobre avaliações bioquímicas dos
fluidos fetais na espécie eqüina.
53
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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60
61
Normas Editoriais para Publicação
Apresentação dos Trabalhos
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3.8. Quadros e Tabelas: os quadros e/ou tabelas deverão ser acompanhados de
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necessidade de referência ao texto. Assinalar, no texto, por seu número de ordem,
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3.10. Citações: deverão seguir o sistema de chamada alfabética (NBR 10520 da
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das referências a trabalhos que tenham sido consultados e mencionados no texto
do artigo são da responsabilidade do autor.
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publicação do trabalho na SEMINA, comprometendo-se a não publicá-lo em outro
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ANÁLISE BIOQUÍMICA DO LÍQUIDO AMNIÓTICO E
ALANTOIDEANO EQÜINO DURANTE A GESTAÇÃO.
BIOCHEMICAL PARAMETERS OF THE AMNIOTIC AND
ALLANTOIC FLUIDS OF HORSES DURING PREGNANCY.
64
Titulo:
Análise bioquímica do líquido amniótico e alantoideano eqüino durante a
gestação.
Resumo
Os líquidos fetais possuem diversas funções que são vitais para o feto. Para a espécie eqüina até
o presente momento, não está totalmente definida a composição bioquímica do líquido
amniótico no decorrer da gestação. Analisou-se 60 amostras de fluidos fetais, empregando-se
kits comerciais para se determinar a concentração bioquímica para a espécie eqüina da Fosfatase
Alcalina (FA), Glicose, Proteínas Totais (PT), Uréia, Creatinina, Cálcio (Ca), Cloreto (Cl),
Sódio (Na) e Potássio (K) durante a gestação. A concentração da alfa-fetoproteína (AFT) foi
avaliada empregando-se a eletroforese em gel de poliacrilamida. A concentração da FA no
liquido amniótico foi maior quando comparada ao liquido alantoideano nas três fases da
gestação (p < 0,05). Para a glicose o valor médio entre os dois fluidos não apresentou variações
(p < 0,05). Para a PT o valor médio do liquido amniótico foi maior que o alantoideano (p <
0,05). A Uréia sofreu variações na concentração entre as fases, mas não há diferenças dos
valores médios (p > 0,05) entre os fluidos. Para a Creatinina os valores presentes no liquido
alantoideano são mais altos que os valores do liquido amniótico (p < 0,05). As concentrações
dos íons Cl e Na apresentaram–se mais elevados (p < 0,05) no liquido amniótico. As
concentrações dos íons Ca e K foram mais elevadas nos líquidos alantoideanos (p<0,05).
Porém, faltam estudos na espécie eqüina para a comparação dos resultados do presente trabalho.
Palavras-Chave: eqüino, líquidos fetais, análise bioquímica.
65
Author’s name: ZANELLA, L. F. Biochemical parameters of the amniotic and
allantoic fluids of horses during pregnancy. 2008.p. Doctorate Thesis in Veterinary
Medicine, Area of Animal Reproduction. School of Veterinary Medicine and
Zootechnology, Universidade Estadual Paulista , Botucatu.
Abstract
Fetal fluids play a vital role in the development of the fetus. The biochemical
composition of the amniotic fluid along pregnancy in horses had not been described
until this present study. Sixty samples of fetal fluids were collected and the
concentrations of Alkaline Phosphatase (FA), Glucose, Total Proteins (PT), Urea,
Creatinin, Calcium (Ca), Chloride (Cl), Sodium (Na) and Potassium (K) along
pregnancy were determined using commercially available kits. The levels of alpha-
fetoprotein (AFT) were measured by polyacrylamide gel
electrophoresis. During the
three stages of pregnancy the concentrations of FA in the amniotic fluid were higher
than those determined in the allantoic fluid (p < 0,05). The glucose levels did not differ
between the fluids (p < 0,05). The mean values for the concentrations of PT were higher
in the amniotic fluid than in the allantoic (p < 0,05). The urea levels differ among the
pregnancy stages, but there were no differences in the mean values of urea (p > 0,05)
between the two fluids. The concentrations of creatinin obtained in the allantoic fluid
were higher than those obtained in the amniotic fluid (p < 0,05). The concentrations of
Cl and Na were elevated (p < 0,05) in the amniotic fluid. The levels of the ions Ca e K
were higher in the allantoic fluid (p<0,05). Although there is a need for more studies in
the biochemical composition of fetal fluids in horses to compare the results obtained in
this study.
Keywords: horse, fetal fluids, biochemical assays.
66
Introdução
O líquido amniótico no início da gestação é produzido a partir de secreções do epitélio
amniótico e da urina fetal. Posteriormente, com o desenvolvimento da gestação, o esfíncter
vesical impede a liberação da urina fetal para a cavidade amniótica e a saliva e as secreções
nasais fetais passam a fazer parte da composição do líquido amniótico (ARTHUR, 1969).
Considerando que este fluido envolve diretamente o feto, nele podem ser encontrados
pêlos, células epiteliais, resto de escamação cutânea e, nos fetos traumatizados, pode-se ainda,
encontrar a presença de mecônio. Nos eqüinos o volume deste fluido varia de três a sete litros e
sua coloração normal é amarelada com ligeira viscosidade e, a presença de floculações não é
considerada normal.(GRUNERT, BIRGEL,1989).
O líquido alantoidiano possui origem renal, geralmente composto pela urina fetal, o seu
volume, na espécie eqüina, é de 4 -10 litros e sua coloração é marrom claro, opaco e
ligeiramente turvo (GRUNERT, BIRGEL,1989; FLOOD, 1992; GUINTER, 1998).
Os líquidos fetais possuem diversas funções que são vitais para o feto dentre elas,
destacam-se : 1. Proteção contra choques externos, variações de temperatura e desidratação
(GRUNERT, BIRGEL, 1982; WILLIIAMS et al., 1992; ASBURY, LEBLANC, 1993), 2.
Evitar a aderência da pele do feto à membrana amniótica, 3. Promover a lubrificação e a
dilatação da via fetal durante a fase de expulsão no parto (GRUNERT, BIRGEL, 1982;
ASBURY e LEBLANC, 1993) 4. Também, permite a livre movimentação e o crescimento do
fetal no interior do útero (ARTHUR, 1969). 5. Inibir o crescimento bacteriano (LANDIM-
ALVARENGA, 2006).
Nas mulheres a amniocentese e a subseqüente análise do liquido amniótico são
utilizadas para detectar principalmente: doenças congênitas, defeitos de tubo neural, idade
gestacional e maturidade fetal pulmonar. O exame é indicado para mulheres acima de 35 anos
devido à maior probabilidade de anormalidades cromossômicas fetais (CAMPANA., et al
2003).
O grau de maturação pulmonar dos neonatos humanos é avaliado dosando-se a
porcentagem de fosfatidilglicerol e pela relação da taxa de lecitina/esfingomielina presentes no
67
líquido amniótico, pois eles são constituintes do surfactante pulmonar dos fetos maturos
(WILLIANS et al., 1992). A técnica é realizada por cromatografia o que a torna inviável para a
rotina da clínica veterinária. (MARTÍNEZ et al., 1999). Outra substância que está envolvida
com a determinação da maturação pulmonar é o cortisol sérico (VAALA, HOUSE, 2002).
O fator hormonal mais importante no inicio do desencadeamento do parto é a remoção
do bloqueio da contratilidade causado pela ação da progesterona (LANDIM-ALVARENGA,
2006; ERENO et al., 2007). Entretanto as observações em caprinos, ovinos, bovinos e humanos
indicam que na fase final da gestação ocorre também um aumento significativo na concentração
plasmática de cortisol fetal devido a estímulos no eixo hipotálamo–hipófise (BANJANIM et al.,
2004; ERENO et al., 2007; RODRIGUES et al., 2007) Acredita-se então que a maturação do
hipotálamo do feto resultaria no desenvolvimento de sinapses do núcleo paraventricular,
permitindo um aumento na função neuroendócrina fetal. Assim o hipotálamo passaria a
responder aos efeitos dos hormônios placentários (LANDIM-ALVARENGA, 2006).
A maturidade renal, pode ser avaliada através da dosagem de uréia e creatinina
presentes no liquido amniótico, no momento do parto pois diversos trabalhos mostram que há
um aumento na concentração dessas substâncias no liquido alantoideano ao longo da gestação
(WILLIANS et al., 1992). O rim fetal é afuncional durante o seu período de formação, porém
sua contribuição no final do processo de maturação fetal é importante para a sobrevida do
concepto (LUMBERS et al.,1985)
Na obstetrícia humana algumas enfermidades e a viabilidade fetal podem ser
precisamente determinadas através do exame ultrassonográfico do feto no interior do útero,
associado à composição bioquímica do líquido amniótico obtida por amniocentese, guiada por
ultrassonografia (SCHIMIDT et al., 1991; VAALA, HOUSE, 2002).
Em medicina veterinária, os primeiros estudos para se analisar a fisiologia e o
comportamento bioquímico do liquido amniótico, obtido por amniocentese foram realizados
primeiramente em ovinos (McDOUGALL,1949; ALEXANDER et al., 1958; MELLOR e
SLATER, 1972). BONGSO E BASRUR (1975) afirmaram que a amniocentese apresentaria
aplicação limitada em medicina veterinária devido a alguns fatores como: anatomia do útero
68
gravídico, dos sacos fetais e dos fluidos fetais. No entanto, (PRESTES et al., 2001) realizaram a
dosagem bioquímica dos seguintes elementos: glucose, uréia, creatinina, Gama GT, sódio,
potássio, cloro, proteínas totais e pH no liquido amniótico de ovinos utilizando a amniocentese
aos 70, 100 e 145 dias de gestação e com sucesso. Dos 26 animais utilizados no experimento
apenas 01 ovelha, portadora de parto gemelar abortou após a segunda colheita realizada aos 100
dias de gestação devido a repetidas punções nas duas vesículas. Os resultados encontrados
permitiram aos autores concluírem que o valor do pH diminuiu ao longo da gestação. A
concentração de glicose apresentou uma redução durante o período gestacional. Os valores
estatísticos para a uréia mostraram não haver diferença entre 70, 100 e 145 dias. Os valores
encontrados para a creatinina evidenciaram um aumento com o avanço da gestação. Os valores
de Gama-GT mostraram-se similar nos três momentos especificados para as colheitas, através
de laparotomia.
Os valores encontrados para o sódio permitiram os autores concluírem que houve uma
redução ao longo dos três estágios. Já o potássio apresentou aos 100 dias a maior concentração.
Os valores encontrados para o cloreto apresentaram o mesmo comportamento do sódio isto é,
sofreram aumento no decorrer da gestação. Os valores encontrados para a proteína total foram
baixos 0,14, 0,23 e 0,24g/dl aos 70, 100 e 145 dias da gestação respectivamente.
Em bovinos os primeiros autores a realizarem amniocentese foram (LEIBO, RALL,
1990). Recentemente, Breukelman et al., (2005) estudaram as características intra-uterina da
morte fetal embrionária, no terço inicial da gestação correlacionando a aparência do concepto,
com a taxa de freqüência cardíaca, perfil bioquímico da glicoproteína associada à prenhez,
(PAG) e prostaglandina F2ά (PGF2ά) após a indução da morte fetal com aglepristone. Esses
autores evidenciaram a ocorrência da diminuição do liquido alantoideano durante o período de
estresse fetal que antecede a morte dos fetos bovinos. Eles encontraram também, pouca
alteração na taxa de freqüência cardíaca em contraste ao que se observa na espécie humana.
Linderberg et al., (2002) empregaram a técnica de amniocentese descrita por Zepperitz
e Grün (1991) em vacas em terço final de gestação, Os animais foram previamente infectados
experimentalmente com o vírus da (BVD). O objetivo do trabalho era obter líquidos fetais em
69
condições de “campo” para se detectar a presença do vírus, empregando-se a técnica de (PCR).
O procedimento foi aplicado em 09 vacas e nenhuma apresentou complicações decorrentes da
amniocentese e, os autores puderam estabelecer um diagnóstico pré-natal de infecção por
(BVD), utilizando os líquidos fetais.
Li et al., (2005) estudaram as alterações da composição bioquímica dos fluidos fetais no
terço inicial da gestação em bovinos clonados. Eles pretendiam encontrar respostas para a maior
ocorrência de hidroalantóide e hidroâmnio nas vacas que gestam fetos obtidos através de
clonagem. Eles concluíram que as principais mudanças são decorrentes de alterações no
metabolismo e na atividade de transporte dos tecidos que constituem a placenta mas, algumas
alterações da composição bioquímica ainda permanecem sem explicações.
MOYA et al., (2006) analisaram por citologia do liquido amniótico obtido no momento
do parto, 60 novilhas nelores sendo que 20 foram inseminadas artificialmente, 20 se
apresentavam gestantes pela técnica de transferência de embriões e, outras 20 apresentavam-se
gestantes pela técnica de fertilização “in vitro” após aspiração folicular. A analise da citologia
do liquido amniótico é utilizada em medicina humana. Ela é um método seguro empregado para
a avaliação e caracterização epidermal dos fetos em gestações avançadas. AGORASTOS,1970
apud (MOYA et al., 2006). O resultado do trabalho permitiu aos autores concluírem que apesar
de não ter havido diferenças estatísticas entre os três grupos estudados em questão, a citologia
do liquido amniótico das células coradas pelo corante Hematoxilina-Shorr é um método
confiável para se determinar o grau de maturidade fetal.
LOVELL et al., (1995) realizaram amniocentese guiada por ultra-som em cabras cujo
período gestacional se encontrava entre 59–65 dias, com a finalidade de se estabelecer o
diagnóstico pre-natal de manosidose um distúrbio catabólico que acomete a espécie caprina e
bovina. Segundo relatos dos autores a amniocentese se mostrou segura e fácil de se realizar nos
caprinos. Dos 13 animais utilizados no experimento apenas um abortou provavelmente, em
virtude de ter ocorrido a punção de um placentoma.
As avaliações dos fluidos fetais em cães são escassas. Barreto (2006) empregou o
procedimento cirúrgico (cesariana) para a obtenção dos fluidos fetais de cadelas, com o intuito
70
de avaliar a maturidade pulmonar dos fetos desta espécie e, relatou que o teste de Clements
modificado pode ser empregado para a avaliação da viabilidade fetal e maturidade pulmonar.
Afirmou também, que a análise celular com Azul de nilo (0,1%) permite a observação de
células morfologicamente diferentes permitindo assim, avaliar a maturidade pulmonar fetal.
Outro dado analisado pela autora foi a densidade óptica dos líquidos fetais. Ela concluiu que
valores superiores a 0,150 são indicativos de maturidade pulmonar para a espécie canina.
Em outro estudo BARRETO et al., (2006) avaliaram a composição bioquímica dos
fluídos alantoideano e amniótico totalizando 20 amostras obtidas de 06 cadelas entre 30 a 40
dias de gestação. As variáveis analisadas foram: proteínas totais, glicose, uréia, creatinina,
cloretos totais e glicose. Dos constituintes propostos para a análise, os valores de proteínas
totais apresentaram diferença estatística entre os fluidos alantoideano e amniótico. Esse
resultado reflete o fato das proteínas se constituírem nos elementos mais abundantes dos fluidos
fetais e que sofrem maior influência da fisiologia fetal. A avaliação dos outros elementos não
apresentou diferença estatística, podendo refletir então a sincronia dos fluidos na manutenção do
equilíbrio eletrolítico nestes dois compartimentos.
As primeiras tentativas de amniocentese na espécie eqüina, antes do desenvolvimento
da ultrassonografia, causaram um alto índice de abortos nas éguas gestantes, fato que
desencorajou as pesquisas sobre a aplicabilidade do procedimento para a espécie e que devido à
conformação anatomofisiológica das estruturas não ocorriam na espécie humana (ASBURY,
LEBLANC, 1993).
Porém, com o advento da ultrassonografia tornou-se possível realizar a amniocentese trans-
abdominal guiada por ultra-som (RENAUDIN et al., 1997; VINCE et al.,2002). Com isso, é
possível identificar com precisão, a cavidade amniótica e alantoideana, o que elevou o índice de
sucesso do procedimento (SCHIMIDT et al.,1991).
Recentemente LYLE et al., (2006) desenvolveram uma técnica para colocação de
cateter no interior da cavidade alantoideana com a finalidade de se poder obter amostras de
liquido alantoideano em vários momentos. O procedimento foi realizado utilizando-se 29 éguas
no período compreendido entre 2003 – 2005. Os animais foram sedados empregando-se a
71
associação de dois fármacos detomidina e butorfanol e, em seguida, procedeu-se a infiltração
local com lidocaína a 2% na parede abdominal das fossas paralombares. A associação dos
procedimentos de laparoscopia guiada por ultrassonografia permitiu uma excelente visualização
do útero e da cavidade alantoideana e elevou significativamente a taxa de sucesso do
procedimento. Outro fator que colaborou sobremaneira, para elevar a taxa de eficiência da
técnica, segundo os autores, foi o emprego de cateteres de borracha utilizados para nefrostomia.
Os cateteres foram mantidos nas éguas do estudo conduzido em 2004 por 06 dias em média. Em
outro experimento conduzido em 2005 com o cateter para nefrostomia, com a mesma finalidade
foi possível mantê-lo fixado nas éguas por até 9 dias em média. Este procedimento possibilitou
a colheita de fluido alantoideano nos momentos da cirurgia, 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 36, 42, 50
horas após a colocação do cateter.
As complicações relatadas pelos autores foram: falência da fixação do cateter
resultando em desprendimento dos mesmos, fato que ocorreu em 03 animais. Mas, a mais grave
das complicações encontradas foi a infecção ao redor do ponto de fixação do cateter que ocorria,
em média, após o quinto dia de pós-operatório. Em algumas éguas essa infecção chegou mesmo,
a se estender para o interior da cavidade alantoideana. No entanto esse fato não trouxe maiores
complicações para as éguas pois, no ano seguinte os mesmos animais foram novamente
aproveitados para outro experimento com a mesma finalidade sem contudo, apresentarem
problemas para a fecundação e gestação (LYLE et al., 2006).
MURCHIE et al., (2003) realizaram uma técnica de microdiálise do liquido
alantoideano eqüino através de laparotomia trans-abdominal, com a finalidade de se detectar a
concentração de algumas drogas. Dentre elas merecem destaque a penicilina G, gentamicina e o
flunexim meglumine presentes no liquido alantoideano de éguas gestantes. Das 9 éguas
utilizadas para a realização do experimento, somente 01 abortou segundo relatos do autor.
No entanto, para a espécie eqüina até o presente momento, não está totalmente definida
a composição bioquímica do líquido amniótico no decorrer da gestação. Os trabalhos que
versam sobre o assunto são escassos. Portanto, ainda não existem métodos capazes de
determinar, com exatidão, o grau de maturação de alguns órgãos. (VAALA, HOUSE, 2002).
72
Assim, ainda é difícil estabelecer, juntamente com outros métodos aplicados em perinatologia, a
idade gestacional do concepto eqüino e, por conseguinte, estabelecer o nível de estresse que esse
produto irá enfrentar no momento do parto (WILLIANS et al., 1992; VAALA, HOUSE, 2002).
Smith et al. (1997) conseguiram com sucesso detectar a presença de herpesvírus tipo I
no líquido amniótico de éguas gestantes, antes mesmo da ocorrência do abortamento.
Kochhar et al., (1997) avaliaram os líquidos fetais de 22 éguas as quais se encontravam
numa mesma propriedade. Em 11 delas o parto transcorreu normalmente. As outras 11 éguas no
entanto, apresentaram partos distócicos. Os fluidos foram colhidos no momento da parição por
centese da bolsa alantoideana e amniótica. Nas éguas portadoras de distocias, a proteína total
apresentou valores menores já os valores obtidos para a uréia, creatinina e glicose, nesse grupo
foram mais altos. O valor do sódio no liquido alantoideano foi bem menor quando comparado
ao valor encontrado no liquido amniótico. Os valores obtidos para a dosagem dos íons potássio
e cálcio mostraram que os mesmos apresentaram-se maiores no fluido alantoideano. No entanto,
os autores destacam a ausência de trabalhos e estudos que possam servir como parâmetros para
se avaliar as diferenças na composição bioquímica dos líquidos fetais das éguas. A intensidade e
o tipo do trabalho de parto podem interferir na composição bioquímica dos fluidos fetais nesta
espécie (Kochhar et al., 1997)
Segundo JONKER (2004) a viabilidade fetal na espécie eqüina pode ser avaliada
através de dosagens dos parâmetros bioquímicos, hormonais e exames ultra-sonográficos dos
líquidos fetais e da placenta. Mas para tanto, se faz necessário mais estudos para se identificar a
composição dos líquidos fetais em cada fase da gestação da égua.
4. Materiais e Métodos:
Foram utilizadas amostras de líquidos amnióticos e alantoideanos de éguas gestantes. Os
animais foram divididos em três grupos experimentais, com vinte animais em cada grupo. Esta
divisão se fundamentou nos três períodos clássicos da gestação (terço inicial, médio e final). O
terço inicial compreende o período até os 90 dias de gestação. O terço médio compreende o
período entre os 90 a 240 dias de gestação e o terço final corresponde à idade gestacional a
partir dos 270 dias de gestação.
73
Colheita das amostras: As amostras dos líquidos fetais foram obtidas diretamente do útero das
éguas que foram abatidas no frigorífico especializado em abate e comercialização de carne
eqüina. No mesmo dia do abate das éguas, se realizava a dissecção do útero e posteriormente
das membranas corioalantoideana e a amniótica em seguida, se realizava alantoideocentese e
amniocentese com o auxílio de agulhas 30x08
12
e seringas estéreis
13
de 20ml. Os materiais
colhidos eram colocados em tubos de ensaios em duplicata quando possível, e congelados e
estocados em freezer a -20C° para posterior avaliação (WILLIANS et al.,1992). O período
gestacional na qual a égua se encontrava, no momento da colheita, foi determinado utilizando-se
a metodologia proposta por ROBERTS, (1986).
Análise bioquímica dos líquidos fetais: Foram pesquisados e quantificados os seguintes
elementos nos líquidos fetais das éguas: fosfatase alcalina, glicose, proteínas totais, uréia,
creatinina, lactato desidrogenase e os íons cálcio, cloreto, sódio e potássio.
Todas as dosagens foram realizadas no espectrofotômetro CELM, modelo SB-190, com
exceção do sódio e potássio cuja dosagem foi realizada no fotômetro de chama CELM, modelo
FC-280.
Para a dosagem da fosfatase alcalina
14
a técnica empregada foi o método cinético,
baseado na hidrólise do p-nitrofenilfosfato pela fosfatase alcalina no soro ou plasma em pH 9,8
cuja velocidade de formação (em comprimento de onda de 450 ηm) é proporcional à atividade
da enzima presente.
Para a dosagem do LDH
15
a técnica empregada foi o método cinético para determinação
no plasma ou soro. A técnica baseia-se na conversão do piruvato pela LDH em lactato,
transformando o NADH2 em NAD. A velocidade de diminuição da absorbância em 340 ηm é
proporcional à atividade desidrogenásica presente.
12
Agulhas hipodérmicas BD
13
Seringas estéreis BD.
14
- Fosfatase alcalina - Kit Katal.
15
LDH - Kit Katal
74
A proteína total
16
foi dosada pelo método colorimétrico (Bradford mofificado) que
utiliza corante Coomassie azul brilhante para detectar quantidades mínimas de proteínas. Esse
corante forma um complexo com albumina e diferentes variedades de globulinas existentes no
líquor e urina. A leitura em espectrofotômetro é realizada 610 ηm.
Para a dosagem da glicose
17
o método utilizado foi o enzimático-colorimétrico segundo
Trinder para determinação de glicose em soro, plasma, ou outros líquidos biológicos. Baseia-se
na atividade das enzimas glicose oxidase e peroxidase, em comprimento de onda de 505 ηm.
A creatinina
18
foi dosada pelo método cinético para determinação da creatinina em soro,
plasma, urina e líquido amniótico. A creatinina reage com o ácido pícrico em meio alcalino, e
mede-se a velocidade de formação do picrato alcalino, obtendo-se duas leituras
espectrofotométricas em 510 ηm.
A Uréia
19
foi dosada pelo método enzimático-colorimétrico para determinação da uréia
no sangue e urina. Ele baseia-se na hidrólise da uréia pela enzima uréase, com produção de gás
carbônico e íons amônio, em 600 ηm. A cor formada é proporcional à concentração de uréia
presente na amostra.
O Cálcio
20
foi dosado pelo método colorimétrico empregado para soro, plasma ou urina.
O cálcio reage com a cresolftaleína complexona (púrpura de ftaleína) em meio alcalino
formando um complexo intensamente corado, em 570 ηm. A absorbância é proporcional à
quantidade de cálcio presente na amostra
O íon Cloreto
21
foi dosado pelo método colorimétrico para determinação da
concentração de cloretos em amostras de soro, urina e líquor, através de reação de ponto final.
Ela baseia-se na reação dos íons cloreto com tiocianato de mercúrio. Os íons tiocianato quando
combinados com os íons férricos formam tiocianato férrico, de coloração amarela com
intensidade proporcional à concentração de cloretos. Leitura realizada em 470 ηm
16
Proteínas Totais - Kit Microprote-Doles
17
Glicose - Kit Celm.
18
- Creatinina – Kit Katal
19
-Uréia – Kit Katal
20
-Cálcio – Kit Katal
21
-Cloreto – Kit Labtest
75
Os ions Sódio e Potássio
22
foram dosados pelo método de fotometria de chama para
determinação de íons sódio, potássio e lítio em amostras de soro livre de hemólise. Isto se
baseia-se na excitação térmica de metais alcalinos, com emissão de uma onda de freqüência
discreta, a qual pode ser isolada por um filtro ótico. A emissão é proporcional ao número de
átomos excitados e, portanto, determina a concentração do íon na amostra.
4.6. Análise estatística:
Os dados foram analisados utilizando o pacote estatístico BioEstat 4.0 (AYRES et al.;
2005) sendo que os valores das classes (variáveis) que apresentaram distribuição normal e
variâncias semelhantes (Proteína e Uréia do Líquido Amniótico) foram realizados através do
teste de análise de variância (ANOVA) e para verificação das diferenças entre os terços
gestacionais teste de Tukey. Nas classes a serem avaliadas que não obedeciam aos critérios de
distribuição normal e/ou variâncias semelhantes (demais classes do líquido Amniótico e todas
do Líquido Alantóideano), os valores foram analisados pelo teste não paramétrico de Kruskal-
Wallis (ZAR, 1998) e as comparações necessárias através do teste de Student-Newman-Keuls.
O valor de significância mínima foi estabelecido em p<0,05.
5. Resultados:
Foram colhidos um total de 60 amostras de liquido amniótico e alantoideano, sendo 20 para
gestações com idades iguais ou menores a 03 meses, 20 para gestações com idades entre 4 – 8
meses e, 20 para gestações com idades maiores ou iguais a 9 meses.
As médias dos valores para Fosfatase alcalina (FA), Glicose, Proteínas totais (Pt) Uréia,
Creatinina, Cálcio (Ca), Cloreto (Cl), Sódio (Na) e Potássio (K) para cada fase gestacional
encontram-se na Tabela 1.
22
-Sódio e Potássio – Kit CELM
76
Tabela 1: Análise bioquímica dos líquidos amniótico e alantoideano eqüino durante a
gestação.
Análise
Bioquímica
Líquido Amniótico Líquido Alantoidiano
Terço
Inicial
Terço
Médio
Terço
Final
Terço
Inicial
Terço
Médio
Terço
Final
FA 69.62
a
104.23
b
51.46
a
18,76
a
19,21
a
19,98
a
Glicose 7,51
a
12,26
a
4,01
b
7,19
a
16,43
b
5,16
a
Proteína total 35,78
a
51,95
b
30,72
a
10,81
b
40,53
a
32,07
a
Uréia 59,99
b
49,32
a
43,45
a
65,74
a
61,84
a
41,68
b
Creatinina 0,30
a
1,93
b
4,27
c
0,41
a
7,60
b
13,91
c
Ca 5,43
a
8,37
b
5,69
a
4,12
b
17,66
a
20,15
a
Cl 19,54
a
33,83
b
21,20
a
7,54
b
4,82
a
2,95
a
Na 96,95
a
130,15
b
92,10
a
18,15
b
41,00
a
48,40
a
K 8,10
a
5,99
a
6,61
a
7,60
a
12,09
b
8,13
a
Letras iguais na mesma linha e no mesmo líquido fetal indicam não haver diferença significativa
(p>0,05).
6. Discussão
Ao consultarmos a literatura, chama à atenção a escassez de trabalhos a respeito da
fisiologia obstétrica e, principalmente, sobre a composição bioquímica dos líquidos amnióticos
e alantoideanos nos eqüinos, embora, se encontre diversos trabalhos voltados para a assistência
ao parto da égua e sobre o diagnóstico da gestação nesta espécie.
Um dos principais empecilhos para o desenvolvimento da fisiologia obstétrica nos
eqüinos foi sem dúvida, a dificuldade de se obter com relativa segurança os fluídos amnióticos e
alantoideano nas éguas, fato que não ocorreu no ser humano e em outras espécies animais como
os ovinos, caprinos e até mesmo, os bovinos. Contudo, a amniocentese na égua durante muitos
anos desencadearam problemas como infecções uterinas que inviabilizava a continuidade da
vida intra-uterina do concepto e até mesmo, a ocorrência de abortamentos em virtude de
traumas decorrentes de varias perfurações da cavidade alantoideana e amniótica para a obtenção
dos fluidos fetais (ASBURY, LEBLANC, 1993).
O advento da ultrassonografia permitiu acompanhar o posicionamento do cateter
durante a realização do procedimento cirúrgico de laparocentese trans-abdominal (RENAUDIN
et al., 1997; VINCE et al.,2002). Este fato trouxe grandes avanços para o procedimento
(SCHIMIDT et al.,1991) somados ao desenvolvimento de novos materiais para a confecção de
77
sondas destinadas a cateterizar órgãos delicados como os rins dos humanos, (MURCHIE et al.,
2003; LYLE et al., 2006). Muito embora, pelo fato do custo dos equipamentos ser elevado
inviabiliza a realização do procedimento, na rotina obstétrica da maioria dos hospitais
veterinários.
Diante desse fato, optou-se por trabalhar com peças oriundas de abatedouro
especializado no comercio da carne eqüina, para a obtenção dos fluidos fetais. Com isso, o custo
financeiro para a realização do experimento tornou-se bem menor, o que permitiu a sua
realização.
A colheita dos fluidos fetais, das bolsas amnióticas e alantoideanas dos fetos que se
encontravam com 03 meses ou mais de idade gestacional transcorreram sem problemas. Haja
vista, a grande quantidade de volume dos fluidos. No entanto, o mesmo não aconteceu para os
fetos com idade gestacional abaixo de 03 meses, pois o reduzido volume das amostras colhidas
durante o experimento, dificultou as mensurações propostas. O volume médio obtido para este
grupo foi de 2 mL.
Foram colhidos um total de 60 amostras de liquido alantoideano e amniótico, sendo 20
para gestações com idades iguais ou menores que 03 meses, 20 pra gestações entre 4 – 8 meses
e 20 para gestações com idade maiores ou iguais a 9 meses e respectivamente classificados
como grupo 1, 2 e 3.
Os valores das médias encontradas para a fosfatase alcalina (FA) no liquido amniótico
revelaram a ocorrência de um aumento significativo no terço médio da gestação. Assim, para os
valores das médias entre o terço inicial e terço médio obteve-se p = 0,003 e para o terço médio
e final obteve-se p = 0,004. No entanto, entre o terço inicial e final não houve variações
estatísticas significantes p = 0,254. No entanto, os valores das médias da (FA) no liquido
alantoideano não sofreram variações significativas ao longo do período gestacional p > 0,05.
Todavia, não foi possível comparar esses resultados com os de outros autores devido à
escassez de trabalhos, sobre esse tema na literatura. Porém, os valores da FA no liquido
amniótico se apresentaram bem mais elevados nos três momentos do experimento quando
comparados aos observados para o liquido alantoideano. Assim, os resultados estatísticos são
78
parecidos aos observados por KOCHHAR et al., (1997) para a espécie eqüina. Embora os
valores das médias dos dois trabalhos sejam diferentes. No presente estudo para o terço final da
gestação no liquido amniótico ela foi de 51,46 U/L resultado bem inferior ao relatado pelo outro
autor que foi de 96.95U/L. Para o fluido alantoideano o presente estudo encontrou a média de
19,98 U/L enquanto o outro autor observou a média de 25,63U/L. Agora ao se comparar as
médias da FA entre os dois fluidos evidenciou-se o que a FA se encontra em maior quantidade
no liquido amniótico, com diferenças significantes para os três estágios da gestação. A FA está
correlacionada com a maturidade fetal, formação óssea fetal e principalmente, com a função
renal. Nos estágios iniciais, da gestação em humanos, acredita-se que o aumento da sua
intensidade está ligado a descamação do epitélio intestinal (HAHNEMANN, 1974).
No presente estudo, os valores das médias para a glicose no liquido amniótico, no terço
final da gestação, apresentou um valor significativamente menor. Portanto, quando se compara
os valores dos terço iniciais e médio não se observa diferenças estatísticas. No entanto, entre o
terço inicial e final há diferenças significantes p = 0,254. O mesmo ocorre entre o terço médio e
o final p = 0,0001. Para o liquido alantoideano a glicose apresentou um aumento significativo
no terço médio da gestação. Assim, evidenciam-se diferenças estatísticas entre o terço inicial e
médio, p = 0,003 e, entre o terço médio e o final, p = 0,001. Agora quando se compara as
médias da glicose do liquido alantoideano com as médias do liquido amniótico observa-se que a
quantidade de glicose presente no liquido alantoideano é maior e possui significância para o
terço final da gestação. Estes resultados são contrários aos relatados por KOCHHAR et al.,
(1997) que encontraram valores mais altos para o liquido amniótico. Assim, ao se comparar os
resultados dos dois trabalhos nota-se que os valores das médias do liquido alantoideano são
bastante semelhantes. Já os valores encontrados para o líquido amniótico são diferentes sendo
4,01mg/dL para o presente experimento e 20,1mg/dL para os resultados do outro autor, no terço
final da gestação. Nenhum outro estudo dosou a glicose no decorrer da gestação na espécie
eqüina.
Em ovinos PRESTES et al., (2001) encontraram valores diferentes estatisticamente para
a glicose ao compararem a quantidade presente no liquido amniótico aos 70, 100, e 145 dias de
79
gestação. Os autores relatam também, que houve uma redução dos valores ao longo do período
gestacional na ovelha. Fato que se assemelha ao observado neste experimento e que
provavelmente se deve a ingestão de glicose decorrente do reflexo de deglutição fetal. Ademais,
a concentração de glicose pode se apresentar de maneira diferente entre as espécies pois,
BARRETO et al., (2006) dosou a glicose nos fluidos fetais de cadelas aos 30 e 40 dias de
gestação e não encontrou variações dos valores entre o liquido alantoideano e amniótico.
As médias encontradas para a proteína total no liquido amniótico durante este
experimento, revelam que houve um aumento significativo no terço médio da gestação. Portanto
entre o terço inicial e médio há diferencças significativas p < 0,01. Entre o terço inicial e final
não há diferenças p > 0,05 e, entre os o terço médio e final há diferenças significativas, p < 0,01.
No liquido alantoideano, os valores encontrados revelam um aumento no terço médio da
gestação o qual permaneceu até o terço final. Contudo, os valores encontrados neste estudo, em
questão, para o liquido alantoideano são muito diferentes daqueles resultados obtidos por
KOCHHAR et al., (1997) para o terço final da gestação, sendo que o mesmo fato se repete para
a PT presente no liquido amniótico. Ao se comparar os valores entre os fluídos fetais
observam-se maiores quantidades de PT no liquido amniótico para o terço inicial e médio. Já
para o terço final os valores das médias se equivalem.
No entanto o comportamento dos valores das médias da PT no liquido amniótico ao
longo da gestação não foi semelhante ao observado por Prestes et al., (2001) para a espécie
ovina. Onde a (PT) se elevou aos 100 dias de gestação e permaneceu praticamente constante.
Não obstante, os valores encontrados neste experimento se assemelham aos obtidos em outras
espécies no que tange a pequena quantidade de proteína presente nos fluidos fetais (REDDY et
al., 1995; PRESTES et al., 2001; BARRETO et al., 2006). Pois, para se poder analisar a (PT)
neste experimento, houve a necessidade de se empregar o método colorimétrico (Bradford
mofificado) que é capaz de detectar quantidade mínima de proteína. Uma vez que, o kit
empregado para se avaliar a (PT) na rotina, não foi sensível, o bastante, para se dosar as
proteínas presentes nos líquidos fetais da égua.
80
A média dos valores para a uréia no liquido amniótico apresentou um valor mais
elevado e significativo, segundo os cálculos estatísticos, na fase inicial da gestação p < 0,05. O
mesmo fato foi observado no liquido amniótico de ovinos por PRESTES et al., (2001).
Posteriormente, para o terço médio e final os valores não sofreram alterações. O valor da média
no presente estudo, para o teço final da gestação foi de 43,45 mg/dL resultado muito semelhante
ao encontrado por KOCHHAR et al., (1997), que relataram um valor de 41,7 mg/dL para o
liquido amniótico de éguas que não apresentaram partos distócicos.
A média dos valores da uréia no liquido alantoideano revelaram não haver diferenças de
valores entre o terço inicial e médio da gestação p = 0,624. Porém, ocorreu uma diminuição do
valor no terço final da gestação onde p < 0,005. Tal fato pode ser decorrente da grande
quantidade de urina presente no saco alantoideano no terço final da gestação (MELLOR et al.,
1975). A média obtida neste trabalho para a uréia no terço final de gestação foi de 41,68 mg/dL
valor próximo ao encontrado por KOCHHAR et al., (1997) que foi de 27,75+ 9,48 mg/dL.
Contudo, quando comparamos os valores da uréia no liquido amniótico e alantoideano
observou-se que os valores foram diferentes apenas no terço médio da gestação onde a média do
liquido alantoideano se apresentou mais elevada. Esse resultado difere dos observados por
BARRETO et al., (2006) em cadelas, ao dosar a uréia entre 30 e 40 dias de gestação. Pois, esses
autores não encontraram diferenças estatísticas entre o liquido alantoideano e amniótico.
A média dos valores da creatinina presente no liquido amniótico se elevou ao longo do
período gestacional. Os valores apresentaram diferenças significativas entre o terço inicial e o
médio p = 0,004 e, entre o terço médio e o terço final p = 0,003. No entanto, os valores obtidos
para a creatinina no terço final de gestação, neste experimento foi de 4,27mg/dL valor bem
menor que os relatados por KOCHHAR et al., (1997) que foi de 19,38+4,67mg/dL. Para o
liquido alantoideano o valor observado também apresentou variações significantes ao longo da
gestação. Os valores apresentaram diferenças significativas entre o terço inicial e o médio p =
0,001 e, entre o terço médio e o terço final p = 0,01. Entretanto, o valor observado de
13,91mg/dL é muito inferior aos obtido por KOCHHAR et al., (1997) que foi de 68,7mg/dL. Ao
compararmos os valores entre os líquidos amnióticos e alantoideanos observa-se valores
81
estatisticamente diferentes para o terço médio e final da gestação, sendo os valores presentes no
liquido alantoideano superior ao do liquido amniótico. Essa observação no presente trabalho
está em conformidade com o resultados encontrados por KOCHHAR et al., (1997). O aumento
da taxa de creatinina está correlacionado com a maturidade renal (PRESTES et al., 2001) e
também; com a atividade muscular fetal (KOCHHAR et al., 1997). E segundo VAALA, (1999)
os fetos eqüinos que são acometidos pela síndrome da asfixia no pré-parto apresentam alteração
do valor da creatinina em função da redução do fluxo sanguíneo destinado a perfusão renal.
Porém, essa observação da diferença dos valores entre os fluidos fetais para a creatinina não foi
observado nas cadelas por BARRETO et al., (2006).
A média do íon cálcio do liquido amniótico, no terço médio da gestação foi de
8,37mg/dL apresentando uma elevação significativa quando comparada com o terço inicial p =
0,01 e final da gestação p = 0,04. Para o liquido alantoideano, o íon cálcio apresentou uma
elevação ao longo da gestação, sendo que a média obtida no terço inicial foi de 4,12mg/dL mais
baixa e estatisticamente diferente das médias observadas para o terço médio de 17,66 mg/dL e
também, para o terço final de 20,15mg/dL onde p = 0,001. Todavia, ao se comparar os valores
obtidos entre os líquidos fetais observa-se que no terço inicial da gestação os valores são
semelhantes enquanto que para o terço médio e final há diferenças estatísticas significantes e a
quantidade de íon ca se apresenta mais elevada no liquido alantoideano. Esses resultados se
assemelham aos obtidos por KOCHHAR et al., (1997) porém a unidade utilizada por esses
autores foi mEq/L. Os mesmos autores atribuem a maior concentração de ions Ca no liquido
alantoideano a atividade renal. Ademais, faltam trabalhos sobre o assunto para se estabelecer
novas comparações.
A média da concentração do íon cloreto (Cl) no liquido amniótico no terço médio do
período gestacional foi de 33,83mEq/L, se apresentando mais alta e estatisticamente diferente
das medias obtidas no terço inicial e final da gestação. Este fato não foi observado por
PRESTES et al., (2001) em liquido amniótico de ovelhas. Onde os autores encontraram valores
estatisticamente diferentes no decorrer da gestação. No liquido alantoideano houve uma redução
significativa estatisticamente da concentração do íon (Cl) do terço inicial para o terço médio.
82
Este valor permaneceu sem sofrer alteração significativa, entre este momento e o terço final da
gestação. Não obstante, ao se comparar os valores de (Cl) encontrados no liquido alantoideano e
amniótico evidencia-se uma concentração mais elevada e, estatisticamente significativa, no
liquido amniótico. Isto se fez presente nos três períodos do experimento.
A média da concentração do íon sódio (Na) no liquido amniótico se apresentou mais
alta no terço médio 130,15mEq/L Ela é estatísticamente significante quando comparada ao terço
inicial e final. A concentração encontrada no terço final foi de 92,10 mEq/L. Esse valor é menor
ao observado por KOCHHAR et al., (1997). Porém esse fato não foi observado por PRESTES
et al., (2001) em ovinos, que encontraram uma redução significativa da concentração de (Na) ao
longo da gestação. No liquido alantoideano as médias da concentração de (Cl) não sofreram
variações significativas durante a gestação. Entretanto, ao se comparar os valores da
concentração deste íon presente no liquido alantoideano e amniótico observa-se que a
concentração é mais alta e significativa no liquido amniótico, nos três momentos gestacionais
determinados para a realização do experimento. Sendo que a maior diferença se deu no terço
médio da gestação. Esse resultado não se assemelha ao observado por BARRETO et al., (2006)
em cadelas.
As médias da concentração de potássio (K) não sofreram variações significativas no
liquido amniótico ao longo do período gestacional. Para o terço final da gestação a média
encontrada foi de 6,61mEq/L. Esse valor esta bem próximo ao observado por KOCHHAR et al.,
(1997) que encontraram uma concentração de 9,2mEq/L. Para o liquido alantoideano a média da
concentração do (K) foi de 12,09 mEq/L se apresentando mais elevada e estatisticamente
diferente no terço médio. Para o terço final a concentração de (K) foi de 8,13mEq/L valor
também bastante próximo dos encontrados por KOCHHAR et al., (1997). Outrossim ao se
comparar as médias das concentrações do (K) presente nos líquidos fetais observa-se que no
terço médio a concentração é maior e, significativa no liquido alantoide. Isso está relacionado
com o aumento da produção da urina fetal mas também, com o aumento da atividade metabólica
do feto durante a gestação (KOCHHAR et al., 1997; PRESTES et al., 2001).
83
Não foi possível de se realizar a dosagem do Lactato deshidogenase (LDH)
empregando-se o método cinético para determinação no plasma ou soro A técnica baseia-se na
conversão do piruvato pela LDH em lactato, transformando o NADH2 em NAD. Os resultados
obtidos foram muito dispares. Tentou-se então, utilizar um kit de outra marca. Porém, sem
sucesso e, para se verificar se os kits estavam sem problemas, dosou-se a (LDH) de um cão. O
resultado obtido estava dentro dos padrões de normalidade. No entanto KOCHHAR et al.,
(1997) em seu trabalho relata a dosagem de (LDH) Entretanto, o autor não menciona a técnica
empregada.
Conclusões
As análises bioquímicas dos líquidos fetais eqüinos realizadas neste experimento revelaram que:
- Fosfatase alcalina: no liquido amniótico apresentou um aumento no terço médio e, valores sem
diferenças significantes entre o terço inicial e final da gestação. No liquido alantoideano não
houve variações significantes ao longo do período gestacional. A concentração no liquido
amniótico foi significativamente maior quando comparada ao liquido alantoideano nas três fases
da gestação.
- Glicose: no liquido amniótico não apresentou variação entre as três fases da gestação. No
liquido alantoideano apresentou aumento no terço médio e, valores sem diferenças significantes
entre o terço inicial e final da gestação. A concentração da glicose foi significativamente maior
no liquido alantoideano quando comparada ao liquido amniótico no terço final da gestação, mas
o valor médio entre os dois fluidos não apresentou diferenças estatísticas.
- Proteína total: no liquido amniótico apresentou aumento no terço médio e, valores sem
diferenças significantes entre o terço inicial e final da gestação. No liquido alantoideano, ela
apresentou valor estatisticamente menor no terço inicial da gestação. Posteriormente, não sofreu
variações entre o terço médio e o final. A concentração apresentou-se estatisticamente superior
no liquido amniótico no terço inicial e médio da gestação, quando comparada ao liquido
alantoideano, sendo o valor médio do liquido amniótico estatisticamente superior.
- Uréia: no liquido amniótico apresentou valor estatisticamente superior no terço inicial da
gestação. Posteriormente, não sofreu variações entre o terço médio e final. No liquido
84
alantoideano apresentou valor estatisticamente inferior na fase final da gestação. A concentração
foi significativamente maior no liquido alantoideano no terço médio da gestação, mas não há
diferenças estatísticas entre os valores médios dos dois fluidos ao longo do período gestacional.
- Creatinina: mostrou-se elevada significativamente durante a gestação nos fluidos fetais a partir
do terço médio. Os valores presentes no liquido alantoideano são significativamente maiores
que os valores encontrados no liquido amniótico e o seu valor médio, também é estatisticamente
maior.
- Íon cálcio: no liquido amniótico apresentou um aumento no terço médio e, valores sem
diferenças significantes entre o terço inicial e final da gestação. A concentração no liquido
alantoideano elevou-se significativamente no terço médio da gestação e, permaneceu elevada no
terço final sem apresentar diferença estatística, entre o terço médio e final. A partir do terço
médio os valores foram estatisticamente maiores no liquido alantoideano, sendo o seu valor
médio estatisticamente maior.
- Íon cloreto: no liquido amniótico apresentou aumento significativo no terço médio e, valores
sem diferenças estatísticas entre o terço inicial e final da gestação. No liquido alantoideano
apresentou-se estatisticamente superior no terço inicial da gestação posteriormente, manteve-se
sem diferenças entre o terço médio e final. Ele apresentou-se estatisticamente maior no liquido
amniótico nas três fases gestacionais.
- Íon sódio: no liquido amniótico apresentou aumento significativo no terço médio e, valores
sem diferenças estatísticas entre o terço inicial e final da gestação. A concentração no liquido
alantoideano elevou-se significativamente no terço médio da gestação e, permaneceu elevada no
terço final sem apresentar diferença estatística, entre o terço médio e o final. Também,
apresentou-se estatisticamente maior no liquido amniótico nas três fases gestacionais.
- Íon potássio: não apresentou variações estatísticas no liquido amniótico durante as fases
gestacionais. No liquido alantoideano apresentou aumento significativo no terço médio e,
valores sem diferenças estatísticas entre o terço inicial e final da gestação. A concentração no
liquido alantoideano elevou-se significativamente no terço médio da gestação e posteriormente,
85
houve diminuição significativa, voltando a apresentar uma concentração próxima a do terço
inicial. Porém, o valor médio no liquido alantoideano é estatisticamente maior.
Contudo há escassez de trabalhos sobre avaliações bioquímicas dos fluidos fetais na espécie
eqüina para que se possam estabelecer comparações com os resultados obtidos neste estudo.
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