( PDF ) Expressão da dopa-descarboxilase em retina de vertebrados

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ROSILANE TAVEIRA DA SILVA

EXPRESSÃO DA DOPA-DESCARBOXILASE

EM RETINA DE VERTEBRADOS

DISSERTAÇÃO DE MESTRADO SUBMETIDA À

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO VISANDO A

OBTENÇÃO DO GRAU DE MESTRE EM CIÊNCIAS

BIOLÓGICAS (BIOFÍSICA)

Universidade Federal do Rio de Janeiro

Centro de Ciências da Saúde

Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho

2008

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UFRJ

Expressão da dopa-descarboxilase em

retina de vertebradosl

Rosilane Taveira da Silva

Dissertação de Mestrado apresentada ao

Programa de Pós-Graduação em Ciências

Biológicas (Biofísica), IBCCF, da

Universidade Federal do Rio de Janeiro,

como parte dos requisitos necessários à

obtenção do título de Mestre em Ciências

Biológicas (Biofísica).

Orientadores: Patricia Franca Gardino

Jan Nora Hokoç

Rio de Janeiro

Maio/2008

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Da Silva, Rosilane Taveira

Expressão da dopa-descarboxilase em retina de vertebrados / Rosilane

Taveira da Silva. – Rio de Janeiro: UFRJ / IBCCF, 2008.

xiv, 123 f.: 34 il. ; 29,7 cm

Orientadores: Patrícia Franca Gardino e Jan Nora Hokoç.

Dissertação (mestrado) – UFRJ, IBCCF, Programa de Pós-graduação em

Ciências Biológicas (Biofísica), 2008.

Referências Bibliográfica: f. 113-123

1. L-dopa. 2. Catecolaminas. 3. Imunohistoquímica. 4. Dopamina. 5.

Células amácrinas. 6. Biofísica – Tese. I. Gardino, Patricia Franca. II. Hokoç,

Jan Nora. III. Universidade Federal do Rio de Janeiro, IBCCF, Programa de

Pós-graduação em Ciências Biológicas, Biofísica. IV. Título.

Projeto desenvolvido no Laboratório de Neurobiologia da Retina sob orientação da

Prof

. Patricia Franca Gardino e da Prof

Jan Nora Hokoç. O laboratório é

integrante do Programa de Neurobiologia do Instituto de Biofísica Carlos Chagas

Filho, IBCCF, da Universidade Federal do Rio de Janeiro. Além da verba concedida

pelo CNPq, este projeto contou com o apoio financeiro do Programa de Apoio a

Núcleos de Excelência (PRONEX), Financiadora de Estudos e Projetos (FINEP) e da

Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro

(FAPERJ).

FOLHA DE APROVAÇÃO

ROSILANE TAVEIRA DA SILVA

Expressão da dopa-descarboxilase em retina

de vertebrados

Rio de Janeiro, 12 de Maio de 2008

__________________________________________

(Dr

. Patricia Franca Gardino, IBCCF, UFRJ)

__________________________________________

(Dr. Marcelo Felipe Santiago, IBCCF, UFRJ)

__________________________________________

(Dr

. Marilia Zaluar Passos Guimarães,ICB, UFRJ)

__________________________________________

(Dr

. Silvana Allodi, PCM, UFRJ)

__________________________________________

(Dr. Alfres Sholl Franco, IBCCF, UFRJ)

iii

Dedico esse trabalho aos meus pais Josafá (in

memorian) e Maria da Gloria. Vocês que me

ensinaram a valorizar os estudos e sempre acreditar na

vida. Com vocês aprendi que com esforço, trabalho e

dedicação os sonhos podem se tornar realidade.

AGRADECIMENTOS

Primeiramente a meus pais Josafá e Maria da Gloria por terem sempre me

incentivado nos estudos e também pelo carinho e amor com que me criaram. A

minha mãe Gloria que mesmo sem entender direito o que estava acontecendo,

sempre me ajudou com suas palavras sábias nos momentos difíceis. Sempre

presente e acreditando que sou melhor do que realmente sou, sempre me

incentivando e nos últimos anos conduzindo a família com o pai e mãe.

Ao restante da família, minhas irmãs Rosângela e Rosana pelo apoio e incentivo e

aos meus sobrinhos queridos Thamires e Matheus que até agora não entendem

direito o motivo que me levou a ficar nos últimos meses TODO o fim de semana

estudando e estudando e agradeço também ao meu cunhado Francisco por toda

torcida. Família.vocês todos são fundamentais na minha vida!!. Amo vocês!!!!!

As minhas orientadoras Patricia Gardino e Jan Nora. São 11 anos de convivência!!.

Gostaria de agradecer as duas por terem sempre acreditado em mim e também pelo

incentivo nos estudos durante esses anos, afinal quando iniciei no laboratório estava

cursando pré-vestibular!!!. Por todo carinho, atenção e paciência que tiveram

comigo e por terem me permitido realizar este sonho. Chefas, adoro vocês!!!!!!

Ao meu grande e querido amigo Marcelo Einicker (Marcelitos), você foi uma das

primeiras pessoas que conheci quando comecei a trabalhar aqui na Biofísica, dei

muita sorte em ter encontrado em meu caminho uma pessoa tão especial como

você!!!. Agradeço por todo apoio e torcida durante esta caminhada. Você é um

amigo muito especial!!

A galera da antiga!!! Antônio marcos (Ninho), Ronald (tio Ronald), Karin (Ka), Maria

Fernanda (Fê), Adriana Faria (Dri), Marilia (Marilda), Edna Nanami, Pedro Henrique

(Mezenga) e Mair (Mi). Aqueles que estão distantes: Olga, Nelson, Neila e Juliana

Carrazone. Obrigado por todo apoio e torcida, pelas conversas animadas, festinhas,

piadinhas (Ronald) e todos os bons e maus momentos que dividimos durante este

tempo. Vocês são muito queridos!!!!!

Aos Profs Fernando Mello e Maria Christina pela boa convivência e pela contribuição

científica. Suas críticas e sugestões são sempre de grande importância para todos

nós.

Ao prof Ricardo Reis pelo incentivo, apoio, torcida e também pelas conversas

científicas ou não que são sempre muito animadas. Muito obrigado!

A todos os meus amigos da graduação!!!. Em especial agradeço ao Michel

(sepetiba), Nardjara (tocha) e Chico. Vocês são muito queridos!!! Obrigado pelo

apoio.

Aos amigos Leandro (insolente) e Thiago (sabotador), vocês são pessoas muito

queridas!!!! Sempre presente em minha vida nos bons e maus momentos com

paciência, carinho e muita amizade!!! Adoro vocês!!!!

Aos amigos do laboratório pela ajuda, torcida e apoio que sempre me deram.

Gostaria de escrever pelo menos um parágrafo para cada um, mas para economizar

tempo e tinta da impressora vou agradecer de modo geral: Anna Cláudia, Aurizeti

Bernardo, Camila, Cristiano, Clarissa, Carol, Gisele, Isabela, Luis, MCastro, Márcia,

Mario, Nilson, Regina, Renatinha, Raquel e Silmara . Todos vocês fazem parte da

minha história, sou uma pessoa de sorte por trabalhar com pessoas tão especiais

quanto vocês. Muito obrigada a todos vocês por tudo!!!!!!

Ao Prof. Dr. Alfred Sholl Franco pela correção desta tese. Muito obrigada!!!

A minha querida amiga Lu Fragel (ruivinha) por toda ajuda em alguns protocolos,

pelas conversas sempre animadas, pelo cafezinho, pelos momentos fora do

lab....pelas baladas, pelas festinhas e por você estar sempre presente em minha

vida, torcendo por minha felicidade e sempre disposta a ajudar no que for preciso,

pelas conversas em momentos difíceis, pelo desabafo, pelo riso pelo

choro...enfim...adoro você AMIGA!!!!

A minha amiga Ana Letícia. Sei que você esta sempre torcendo pela minha

felicidade!!!. Sua ajuda foi fundamental para o meu ingresso no mestrado lembra do

livro???. Amiga, obrigado por tudo!!!sinto saudades!!!

Ao meu amigo e companheiro de muitos anos...uma pessoa muito especial que eu

não poderia deixar de agradecer....Shan obrigado por tudo!!!! Pelas conversas

sempre animadas, pelas cervejas e pelo papo animado nos tempos da graduação

lembra???. Pelas caronas atuais, que são muito divertidas!!!!

Aos amigos Ricardo Manoel (Graduação) e Sandra (Pós-graduação). Obrigado por

todo apoio e torcida e também pelas conversas sempre animadas no corredor!!!!

Aos amigos Valéria (chefa), Joãozinho, Raquel, Fernando e Ricardinho pelo papo

sempre animado quase toda sexta-feira acompanhado daquela cervejinha lá no

bloco A. Vocês são ótimos!!

A todos os colegas do laboratório de Neurogênese com quem mantenho uma

relação bastante agradável. Aos amigos do laboratório do prof Sergio T. Ferreira, da

bioquímica, por todos os momentos de alegria e de trabalho!!!! Valeu pela torcida

galera!!!!!

Aos amigos Mauricio Tecles, Maria Helena, Gustavo (maninho), Jennifer, Celso

Caruso, Michele, Charles (cabelo) e também a todos os amigos da pós-graduação,

conhecidos e professores do mestrado.

A minha querida amiga Ângela Francisca sempre torcendo e ajudando!!!!! Te

adoro!!!!!!

Por fim, a todos que conheço e que por motivo de esquecimento não teve seu nome

citado anteriormente. Agradeço também a todos aqueles que direta ou indiretamente

contribuíram para a realização deste trabalho. A todos muito obrigada!!!

“Todo homem, por natureza, quer saber”

Aristóteles

vii

RESUMO

Na via de síntese da dopamina (DA), a tirosina é hidroxilada pela enzima tirosina

hidroxilase (TH) formando L-dopa, que por sua vez é descarboxilada em DA pela

ação da enzima dopa-descarboxilase (DDC). Na retina de galinha, a enzima TH

surge somente aos 12 dias embrionários, no entanto existe atividade dopaminérgica

através do receptor D1 antes desta idade. Recentemente, foi mostrado que pode

ocorrer formação de L-dopa, na retina de aves em fases precoces do

desenvolvimento, numa reação catalisada pela enzima tirosinase presente no

epitélio pigmentado (EP). Propôs-se que L-dopa se difundiria para a retina e

formaria DA nas fases iniciais do desenvolvimento da retina, quando TH ainda não

está presente, desde de que a enzima DDC esteja presente no tecido neural. Nosso

objetivo foi verificar a expressão da enzima DDC e caracterizar os tipos celulares

que a contém, na retina de galinha, ao longo do desenvolvimento bem como no

tecido maduro. Neste trabalho utilizando imunohistoquímica em cortes radiais de

retinas com idades entre oito dias embrionários e animais com sete dias após a

eclosão, caracterizamos pela primeira vez na retina de aves, dois tipos de células

amácrinas imunorreativas a DDC com base na localização do corpo celular e no

nível de estratificação dos prolongamentos. Estas foram caracterizadas como

células DDC+ do tipo 1 e do tipo 2. Utilizando a técnica de imunofluorescência foi

possível caracterizar a subpopulação do tipo 1 como as células que contem DDC+ e

que co-localizam com TH+. Estas são as células amácrinas biestratificadas nas

subcamadas 1 e 4 da camada plexiforme interna (CPI). As células DDC+ do tipo 2

possuem somente a enzima DDC e estratificam nas subcamadas S1, S2/S3 e S4 da

CPI. A análise de retinas em montagens planas mostrou que as células DDC+

possuem uma distribuição topográfica homogênea pelo tecido durante todo o

desenvolvimento e na retina madura. Contrariamente, as células TH+ possuem aos

13 dias embrionários uma distribuição preferencial na região superior da retina e

este perfil se torna homogêneo ao longo do amadurecimento do tecido. A análise

quantitativa realizada nas retinas em montagens planas, indicou que a densidade

das células DDC+ é muito maior quando comparada a TH+ em todas as idades

estudadas. Análise da comparação de retinas de três diferentes espécies de

mamíferos adultos (Cebus apella, Didelphis aurita e Rattus novergicus), observamos

que todas as espécies estudadas apresentam células DDC+ indicando um sistema

conservado também em mamíferos. Além disso, em retinas de Didelphis e ratos, as

células DDC+ possuem uma densidade celular maior quando comparadas as TH.

Os resultados apresentados neste trabalho, contribuem para substanciar a proposta

inicial de que na retina de galinha possam existir duas possíveis fontes de DA, uma

baseada numa fonte alternativa de L-dopa oriunda do EP em fases onde a dopamina

ainda não está presente no tecido, e outra baseada na via clássica de DA que ocorre

no tecido mais tardiamente.

viii

ABSTRACT

In the catecholamine synthetic pathway tyrosine is hydroxylated by tyrosine

hydroxylase (TH) to form L-dopa, then, the enzyme dopa descarboxylase (DDC)

converts L-dopa into dopamine (DA). In the chick retina, TH is only detected after

embryonic day 12, although there is dopaminergic activity, at this age, through D1-

like receptors. Recently, it has been shown that L-dopa can also be synthesized in

the chick retina in the early stages of the retina development in a reaction involving

the enzyme tyrosinase that is present in the pigmented epithelium (PE). In this case,

it was proposed that L-dopa could diffuse out to the retinal tissue to form DA when

TH is not detected yet, if DDC is present in the neural tissue. The purpose of this

study was to verify the expression of the enzyme DDC and to characterize the DDC

positive cells in the chick retina during development and in adult tissue. In this work,

using immunohistochemistry in radial sections from embryonic chicken retina of 8

days and post hatched animals we show for the first time, in the chick retina, two

DDC-immunoreactive cells based on morphological criteria, such as localization of

the cell body and stratification levels. These cells were characterized as DDC positive

cells type 1 and 2. By using immunofluorescense technique, it was possible to

characterize DDC-type 1 cells subpopulation as DDC cells that contain DDC and co-

localize with TH. These are bistratified S1 and S4 amacrine cells. The DDC-type 2

cells only contain the enzyme DDC, and stratify in S1, S2/S3 and S4. In whole flat-

mount preparations we showed that the distribution of DDC cells is homogenously

distributed throughout the retina during development and in mature tissue, in

opposition to the TH cells that around embryonic day 13 shows a celll distribution,

which was confined to dorsal retina and became homogeneous during development.

Quantitative analysis in whole flat-mount showed that the DDC positive cells have a

density so far higher than TH positive cells during development and in adult tissue.

Qualitative analysis using different mammals retina, such as Cebus apella, Didelphis

marsupialis and pigmented rats, revealed that the retinas of those animals studied

have DDC positive cells, which suggests a preserved system also in mammals. In

the Didelphis and rats retinas, the DDC positive cells seems to have higher density

as compared to TH. The results presented in this work contribute to substantiate the

original proposal that it may exist two possible sources of DA in the chicken retina:

one based on an alternative source of L-dopa come from pigmented epithelium in

stages when DA is not present yet in the tissue, and another based on the classical

path of the DA that occurs in the tissue later.

LISTA DE FIGURAS.

1– Diagrama do olho de galinha e suas estruturas 17

2– Vias de processamento da informação visual 19

3– Organização e tipos celulares retinianos 22

4– Diagrama mostrando a geração de células na retina de galinha 27

5– Via de síntese das catecolaminas 30

6– Sinapse dopaminérgica 34

7– Principais eventos no desenvolvimento do sistema dopaminérgico em retina de

galinha 36

8– Via alternativa na produção de L-dopa 45

9– Plano de corte do olho de galinha 50

10– Desenho esquemático do mapa retiniano e da área de contagem 58

11– Expressão da enzima DDC em retina de E8 61

12– Expressão da enzima DDC em retina de E10 63

13– Expressão da enzima DDC em retina de E13 65

14– Expressão da enzima DDC em retina de E10 e E13 67

15– Expressão das enzimas TH e DDC em retina de E13 69

16– Expressão da enzima DDC em retina de E19 71

17– Expressão das enzimas TH e DDC em retinas de E19 73

18– Expressão da enzima DDC em retina de E13 e E19 73

19– Expressão da enzima DDC em retina de P7 75

20– Expressão da enzima DDC em retina de E19 e P7 77

21– Expressão das enzimas TH e DDC em retina de P7 78

22– Colocalização das enzimas TH e DDC em retina de E10 e E13 81

23– Colocalização das enzimas TH e DDC em retina de E19 e P7 83

24– Gráfico de densidade das células DDC (+) 86

25– Gráfico de densidade das células TH (+) 87

26- Mapa de distribuição topográfica e densidade das células DDC em E10 88

27- Mapa de distribuição topográfica e densidade das células DDC em E13 89

28– Mapa de distribuição topográfica e densidade das células TH em E13 90

29– Mapa de distribuição topográfica e densidade das células DDC em E19 91

30– Mapa de distribuição topográfica e densidade das células TH em E19 92

31– Mapa de distribuição topográfica e densidade das células DDC em P7 93

32– Mapa de distribuição topográfica e densidade das células TH em P7 94

33– Expressão das enzimas TH e DDC em diferentes espécies 96

34– Modelo proposto para a formação de dopamina através de uma via

alternativa 111

LISTA DE TABELAS.

1- Tabela com os anticorpos primários utilizados 55

2- Tabela com os anticorpos secundários utilizados 55

3- Tabela com dados de 3 de retinas imunorreagidas para DDC 84

4- Tabela com dados de 3 de retinas imunorreagidas para TH 84

LISTA DE ABREVIATURAS

5-HT: 5-hidroxitriptamina.

ABC: Complexo avidina-biotina.

AC: Adenilil ciclase.

AMPc: Monofosfato de adenosina cíclico.

ATP: Trifosfato de adenosina.

BSA: Albumina de soro bovino, do inglês bovine serum albumine.

CCG: Camada de células ganglionares.

CFO: Camada de fibras ópticas.

CMF: Salina sem cálcio e magnésio.

CNE: Camada nuclear externa.

CNI: Camada nuclear interna.

COMT: Catecol-o-metiltransferase.

CPE: Camada plexiforme externa.

CPI : Camada plexiforme interna.

DA: Dopamina.

DDC: Dopa descarboxilase ou descarboxilase de aminoácidos aromáticos.

DAB: 3’3’Diaminobenzidina.

DAT: Transportador de dopamina, do inglês Dopamine transporter.

DDC+: Célula DDC positiva.

DOPAC: Ácido dihidróxifenilacético.

E: Embrião de galinha, o número a seguir indica a idade do embrião (Ex: E8,

embrião com oito dias).

EP: Epitélio pigmentado.

Gi: Proteína G do tipo inibitória.

Gs: Proteína G do tipo estimulatória.

HVA: Ácido homovanílico.

L-dopa: L-dihidroxifenilalanina.

MAO: Monoaminooxigenase.

P: Galinha após a eclosão, o número a seguir indica a idade (Ex: P7, animal com 7

dias após a eclosão).

PBS: Tampão fosfato salina.

PBST: Tampão fosfato salina pH= 7,4 mais 0,25% de triton X-100.

PFA 4%: Solução de paraformaldeído a 4%.

PKA: Proteína cinase A.

SNC: Sistema nervoso central.

TF 0,16M: Tampão fosfato de sódio 0,16 M.

TH: Tirosina hidroxilase.

TH+: Célula TH positiva.

VMAT 2: Transportador vesicular de monoaminas, do inglês vesicular monoamine

transporter 2.

xii

SUMÁRIO

Agradecimentos v

Resumo viii

Abstract ix

Lista de figuras x

Lista de tabelas xi

Lista de abreviaturas xii

1 – INTRODUÇÃO 15

1.1 – Apresentação do problema experimental 15

1.2 – Retina 16

1.2.1 – Organização da retina em vertebrados 17

1.2.2 – A retina como modelo experimental 22

1.2.3 – Desenvolvimento da retina de galinha 24

1.2.4 – Gênese de células na retina de galinha 26

1.3 – Sistema de neurotransmissores na retina 27

1.3.1 – Dopamina 28

1.3.1.1 – Síntese e armazenamento 28

1.3.1.2 – Liberação e término da ação 31

1.3.1.3 – Captação 31

1.3.1.4 – Degradação e difusão 32

1.3.1.5 – Receptores dopaminérgicos 33

1.4 – Papel funcional da dopamina 36

1.5 – Células dopaminérgicas na retina 40

1.6 – Sistema dopaminérgico na retina da galinha 43

2 – OBJETIVOS 46

2.1 – Objetivo geral 46

2.1.1 – Objetivos específicos 46

3 – MATERIAL E MÉTODOS 47

3.1 – Modelo experimental 47

3.2 – Preparo e obtenção do tecido 48

3.2.1 – Preparo de retinas planas 50

3.3 – Imunohistoquímica 51

3.3.1 – Imunohistoquímica para Tirosina hidroxilase (TH) e Dopa

descarboxilase (DDC) 52

3.3.1.1 – Em cortes radiais 52

3.3.1.2 – Em preparações planas 53

3.3.2 – Dupla marcação para TH e DDC em cortes radiais 54

3.4 – Análise dos resultados 56

3.4.1 – Análise morfológica das células DDC+ 56

3.4.2 – Distribuição topográfica e densidade das células TH+ e DDC+ 56

3.4.3 – Colocalização das enzimas TH e DDC 59

3.4.4 – Análise estatística 59

4 – RESULTADOS 60

4.1 – Identificação e análise morfológica das células DDC+ 60

4.2 – Colocalização das enzimas TH e DDC 80

4.3 – Análise quantitativa das células TH+ e DDC+ 84

4.4 – Distribuição topográfica das células TH+ e DDC+ 88

xiii

4.5 – Expressão das enzimas TH e DDC em diferentes espécies 95

5 – DISCUSSÃO 98

6 – CONCLUSÕES 112

7 – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 113

xiv

1 INTRODUÇÃO

1.1 Apresentação do problema experimental

A retina tem sido extensivamente utilizada como modelo experimental para

investigar a geração e diferenciação dos diferentes tipos neuronais bem como, para

o entendimento dos processos de comunicação intercelular através de

neurotransmissores e neuromoduladores. Dentre os diferentes sistemas de

neurotransmissores presentes neste tecido, o sistema dopaminérgico vem sendo

estudado por nosso grupo há bastante tempo (De Mello, 1978; De Mello e De Mello,

1985; De Mello et al., 1982). Vários componentes que fazem parte do sistema

dopaminérgico estão presentes na retina de galinha já em fases bem precoces do

desenvolvimento. Recentemente, Kubrusly e colaboradores (2003) propuseram uma

via alternativa para formação de DA em fases iniciais do desenvolvimento da retina

de galinha, antes da via clássica de síntese de DA que nesta espécie ocorre no

décimo segundo dia embrionário (E12), como foi verificado pela expressão da

enzima limitante da sua síntese tirosina hidroxilase (TH). Nesta proposta a L-dopa,

um precursor na síntese de DA, sintetizada no epitélio pigmentado poderia se

difundir para a retina e formar DA durante o desenvolvimento, quando a TH ainda

não esta presente no tecido. Para isto é preciso que a enzima dopa descarboxilase

(DDC), responsável pela conversão de L-dopa em DA, esteja presente no tecido

neural. De fato, Kubrusly e colaboradores (2003) mostraram que a L-dopa produzida

no epitélio pigmentado é capaz de formar DA no tecido. Mostraram ainda que em

retinas de embriões com oito dias havia marcação para DDC num local próximo ao

epitélio pigmentado, e em retinas mais maduras a marcação foi também observada

em corpos de células localizadas na camada nuclear interna (CNI). Surge então o

interesse em verificar a expressão e caracterizar os tipos celulares que contém a

enzima DDC na retina de galinha em fases iniciais do desenvolvimento, ou seja,

anterior à expressão da TH, como também no tecido adulto, este, aliado ao fato de

que até o momento não existe relato na literatura que descreva sistematicamente a

localização e morfologia de células DDC+ em nenhuma espécie animal. A análise

dos resultados deste trabalho, contribuem para substanciar a proposta inicialmente

feita por Kubrusly e colaboradores de que na retina de galinha possam existir duas

possíveis fontes de DA, uma baseada numa fonte alternativa de L-dopa oriunda do

epitélio pigmentado em fases onde a DA ainda não está presente no tecido

(Kubrusly et al., 2003), e outra baseada na via clássica de DA que ocorre no tecido

mais tardiamente (Gardino et al., 1993).

1.2 Retina

A retina localiza-se na porção posterior do olho (Figura 1), justaposta a uma

camada epitelial pigmentada, seguida das camadas coróide e esclerótica. É um

tecido de fina espessura que forra a face interna do globo ocular. Possui células

sensoriais, os fotorreceptores, especializadas em transduzir sinais luminosos em

sinais neurais. A retina envia aos centros superiores, via nervo óptico, informações

básicas para o processamento da visão. Além deste tecido conter neurônios

sensoriais que respondem à luz, há também um intricado circuito neural que

participa do primeiro estágio do processamento da imagem. A imagem projetada

sobre a retina é decomposta em milhares de informações que irão permitir aos

centros superiores cerebrais a sua recomposição e a percepção consciente. Em

decorrência disso, tais informações não se restringem à simples sinalização sobre

presença ou ausência de luz, pois a retina possui um grau de modulação que lhe

confere um perfil mais complexo onde se observa o processamento inicial da

informação visual (Kolb, 2003).

Figura 1 – Diagrama do olho de galinha e suas estruturas. Modificado de Allodi,

1983.

1.2.1 Organização da retina em vertebrados

A retina de vertebrados é constituída de dois principais extratos: uma camada

única de células neuroepiteliais, chamada de epitélio retiniano ou epitélio

pigmentado, e uma parte mais espessa consistindo de neurônios e de células gliais,

chamada sensorial, também denominada retina neural. A retina neural possui uma

organização laminar composta por três camadas de corpos celulares (CNE, CNI,

CCG) intercaladas por camadas de plexos onde os axônios e dendritos fazem

contato sináptico entre si (CPE, CPI) e por uma camada mais interna de fibras do

nervo óptico (CFO). Em meio a esta organização laminar estão presentes seis tipos

neuronais: fotorreceptores, células horizontais, bipolares, amácrinas e células

interplexiformes, sendo que estas células não foram descritas em retina de galinha,

sendo encontradas em algumas espécies de animais vertebrados, células

ganglionares e dois tipos gliais (em aves), que foram descritos nos estudos pioneiros

de Ramòn y Cajal (Dowling, 1970 e Kolb et al., 2001).

Internamente e adjacente ao epitélio pigmentado do olho localizam-se os

segmentos externos dos fotorreceptores, que contém os pigmentos visuais

responsáveis pela detecção do estímulo luminoso que será transduzido em sinal

neural. Seguem-se os segmentos internos dos fotorreceptores, e os corpos celulares

destes neurônios, formando a CNE. Na retina de vertebrados, os dois tipos

celulares encontrados nesta camada são os cones e os bastonetes, que podem ser

diferenciados pela morfologia de seus segmentos externos. Os cones na maioria

das vezes possuem um segmento externo curto em forma de cone, sendo

responsáveis pela visão fotópica (ambiente com alta luminosidade), relacionados

com a visão diurna e a distinção de cores. Os bastonetes, responsáveis pela visão

escotópica (ambiente com baixa luminosidade), são relacionados com a visão

noturna (Masland, 2001). Justaposta à CNE encontra-se a CPE, onde ocorrem os

contatos sinápticos entre os pedículos dos cones e esférulas dos bastonetes com

células horizontais e bipolares da CNI. A informação visual na retina é transmitida

de forma vertical ao longo do tecido, através dos fotorreceptores que transmitem a

informação para as células bipolares e estas para as ganglionares; e de uma forma

horizontal, com modulação da transmissão sináptica por células horizontais e

amácrinas na CNI, conforme ilustrado na Figura 2.

Figura 2- Esquema ilustrando as duas principais vias de processamento da

informação na retina: A via vertical e a horizontal (setas vermelhas). Modificado de

www.retina.pigeon.psy.tufts.edu.

A CNI é composta por corpos de quatro tipos celulares. Tem-se primeiro as

células horizontais com seus corpos celulares localizados mais externamente, são

neurônios de segunda ordem que interconectam os terminais de fotorreceptores

lateralmente no plano da retina e são representadas por dois subtipos morfológicos

na maioria dos vertebrados (Kolb et al., 2001). Em segundo, as células bipolares,

cujos corpos celulares encontram-se numa região mais central desta camada, são

também neurônios de segunda ordem e coletam informações dos fotorreceptores na

CPE e transmitem-na às células ganglionares na CPI e às células amácrinas; em

terceiro, têm-se as células amácrinas que são interneurônios que interagem no

segundo nível sináptico da via vertical no processamento da informação visual. As

células amácrinas são, então, sinapticamente ativas na CNI e participam da

integração e modulação da mensagem recebida por células ganglionares (Kolb,1994

e Kolb et al., 2001), recebendo informações de células bipolares e de outras células

amácrinas e enviando informações a células bipolares a outras células amácrinas e

a células ganglionares. Isto sugere que este tipo celular possua uma grande

variedade de papéis na função da retina, embora alguns permaneçam ainda

desconhecidos. (Rodieck, 1998.; Morgan, 1991). Algumas funções das células

amácrinas relacionam-se à formação dos campos receptores das células

ganglionares, em particular a geração do antagonismo centro-periferia e, ainda, a

indução da seletividade direcional de células ganglionares a estímulos em

movimento (Cadwell et al., 1978.; Mariani, 1982 e 1983).

Dos interneurônios da CNI, a informação é transmitida aos dendritos das

células ganglionares, cujos corpos celulares formam a CCG. Os axônios das células

ganglionares se organizam em feixes formando a CFO, e saem da retina para

compor o nervo óptico, conduzindo a informação visual inicialmente processada na

retina aos centros superiores (La Cour e Ehinger, 2006, para revisão). São também

observadas células cujos corpos celulares encontram-se localizados em camadas

onde tradicionalmente não deveriam estar situados, como é o caso das células

ganglionares deslocadas, encontradas predominantemente na retina periférica na

CNI. Prada e colaboradores (1989) sugerem a hipótese que estas células devam

constituir um sistema morfofuncional específico, não sendo células que falharam em

encontrar a localização normal durante o processo de migração. Existem também

células amácrinas deslocadas, localizadas na CCG e, mais raramente encontram-se

também na CPI. Na galinha, o número de células amácrinas deslocadas, observado

por diferentes critérios morfológicos e de sobrevivência após axotomia, se encontra

em torno de 30 – 35% de todas as células da CCG (Ehrlich, 1981). Layer e Vollmer

(1982) utilizando “Lúcifer Yellow” como traçador de células amácrinas deslocadas

durante a embriogênese observaram que apenas 23% das células da CCG são

amácrinas deslocadas.

Além dos neurônios descritos acima, a retina possui um tipo de célula glial

mais comum, as células de Müller que se encontram radialmente dispostas ao longo

de toda espessura da retina, estando seus corpos celulares localizados na CNI e

seus prolongamentos estendendo-se até a margem mais distal da retina, onde

formam a membrana limitante externa e até a margem mais interna, logo abaixo da

CFO, onde formam a membrana limitante interna. Além das células de Müller, em

casos particulares encontramos a microglia quando há lesão ou degeneração

tecidual (Kolb et al., 2001). Os diferentes tipos celulares na retina e sua localização

são ilustrados nas Figuras 2 e 3.

Figura 3 – Diagrama mostrando os diferentes tipos celulares na retina e sua

localização. Modificado de Kolb, 2003.

1.2.2 A retina como modelo experimental

A retina tem sido largamente estudada não apenas pelo seu papel na visão

mas também como modelo para o entendimento de mecanismos de comunicação

intercelular através de neurotransmissores e neuromoduladores. A identificação e

análise de substâncias neuromoduladoras e neurotransmissoras na retina têm

contribuído bastante para a compreensão de suas funções não somente ao nível da

circuitaria na retina mas também como exemplo de processamento comparável ao

observado em outras áreas do SNC. A retina possui uma estrutura bastante simples

quando comparada com outras regiões, sendo organizada em camadas de corpos

celulares, ou camadas nucleares, intercaladas por camadas de contatos sinápticos,

ou camadas plexiformes. Assim, a retina possui os mesmos tipos de elementos

funcionais (neurônios e células gliais) e neurotransmissores encontrados em outras

partes do SNC (La Cour e Ehinger, 2006, para revisão).

Além de ser parte integrante do SNC, a retina possui uma localização

anatômica favorável a sua obtenção e manipulação. A porção neural da retina é

transparente e de fina espessura, facilitando sua observação ao microscópio óptico

e permitindo, inclusive, o estudo em preparações planas do tecido íntegro. Além

disso, o grande acúmulo de informações morfológicas, bioquímicas e

eletrofisiológicas tornam a retina um excelente modelo experimental (Coulombre,

1955).

A retina de aves, em particular a retina de galinha, apresenta algumas

vantagens adicionais. Podemos citar a ausência de vasos sangüíneos, a facilidade

de obtenção do tecido em idades embrionárias e a extensa literatura a seu respeito

(La Cour e Ehinger, 2006, para revisão).

A retina de galinha não apresenta fóvea, mas sim uma região denominada

área centralis ou áster, localizada a 2 mm da margem dorsal do disco óptico. O

áster parece se correlacionar com a fóvea, indicando ser uma região de maior

acuidade visual como visto em aves de rapina (Inzunza et al., 1989).

A retina de galinha apresenta ainda uma estrutura denominada pécten (conus

papilaris), estrutura esta vascularizada e pigmentada que é formada a partir de

células gliais do nervo óptico. Localizado na porção ventral da retina, o pécten

inicia-se na inserção do nervo óptico, projetando-se através do humor vítreo em

direção à lente. Esta projeção localiza-se geralmente na metade ventral do olho. O

significado funcional desta estrutura continua desconhecido. De acordo com a

maioria dos estudiosos, a principal função do pécten é nutrir a retina avascularizada

das aves (Mann, 1924; Braekevelt e Richardson, 1996; Kiama et al., 2006). Alguns

autores, baseados em dados bioquímicos, acreditam que esta estrutura funcione

como uma espécie de órgão respiratório para o interior do olho das aves (Brach,

1977; Pettigrew et al, 1990; Jones et al, 2007, para revisão). O pécten, através da

repleção e depleção de seus vasos, talvez tenha também o papel de compensar as

modificações de pressão determinadas pelo fenômeno da acomodação visual

(Rochon-Duvigneaud, 1950; Mann, 1924).

1.2.3. Desenvolvimento da retina de galinha.

O desenvolvimento da retina segue o mesmo padrão de eventos que ocorrem

em outras áreas do SNC. Entretanto, a geração dos diferentes tipos celulares segue

um padrão espaço tempo dependente de cada espécie estudada (Donovan e Dyer,

2005 ; Martins e Pearson, 2008, para revisão).

Em galinha, no segundo dia embrionário - E2 - idade correspondente ao

estágio 13, segundo a classificação de Hamburger e Hamilton (1951), ocorre a

formação do cálice óptico. Inicialmente, as paredes dos cálices ópticos apresentam

uma única camada celular. Em seguida, ocorre uma proliferação na parede mais

interna formando o neuroepitélio, que contém muitas camadas de células

denominadas neuroblastos. Os neuroblastos se diferenciam dando origem a todos

os tipos celulares na retina madura (Mey e Thanos, 2000, para revisão).

Do 4°

ao 8°

dia de incubação (no ovo) a retina aumenta em área e espessura

pela adição de células ao nível adjacente ao epitélio pigmentado. O

desenvolvimento da retina neural durante este período não se limita à proliferação

celular, na região fúndica ou vitreal já é possível observarem-se células ganglionares

grandes, que começam a emitir seus axônios e formar a camada de células

ganglionares (CCG).

As fibras das células de Müller, célula glial predominante na retina de galinha,

estão presentes na região fúndica da retina entre E4 e E5, formando a membrana

limitante interna. Por volta de E8, as fibras destas células são encontradas de

maneira organizada em toda a retina. Neste período, uma última fileira de células é

adicionada na região fúndica da retina, porém, na periferia, o processo ainda

encontra-se em fase de proliferação, sendo, portanto, caracterizado como um

crescimento centro-periferia (Coulombre, 1955).

Entre E8 e E15, inicia-se a formação das camadas plexiformes externa (CPE)

e interna (CPI). Em E8, na região fúndica, já é possível observar-se a CPI, que

aumenta de espessura até E10; de E10 a E12 sua espessura permanece constante

e a partir desta data retoma seu crescimento em espessura até a vida adulta

(Coulombre, 1955). A CPE inicia-se em E9 e se conclui entre E11 e E12. Em E10

prolongamentos de células amácrinas, situados no bordo interno da camada nuclear

interna (CNI), surgem e se estendem em direção a CPI. Neste período também os

segmentos internos dos fotorreceptores são visíveis como pequenas esferas,

aumentam de tamanho até E15, mas a diferenciação dos segmentos externos dos

fotorreceptores ocorre mais tardiamente, somente a partir de E15, quando crescem

rapidamente a partir desta data. De acordo com Coulombre (1955) nesta fase

nenhuma figura mitótica é encontrada na retina. Na década de 70 descreveu-se o

acúmulo de timidina tritiada, indicando haver atividade mitótica em células

remanescentes, na extrema periferia da retina de galinha em estágios mais maduros

do desenvolvimento (Morris et al., 1976). No início dos anos 2000, foi demonstrado

que na retina de galinha existem células proliferantes na zona marginal retiniana, a

qual possui similaridades com progenitores multipotentes e células-tronco de

vertebrados de sangue-frio (Fischer e Reh, 2000). A própria célula de Müller, em

casos de lesão, pode se desdiferenciar, proliferar e gerar novos neurônios e também

outras células de Müller para compor o tecido (Fisher e Reh, 2003). Tomados em

conjunto, estes dados sugerem que estamos longe da compreensão dos fatores

responsáveis pela regulação da proliferação e diferenciação neuronal,

principalmente de células com fenótipos morfológicos e neuroquímicos específicos.

Em E19, a retina já possui função visual como foi verificado pelo início do reflexo

constrictor pupilar (Lindeman, 1947). A diferenciação completa de cones e

bastonetes na região fúndica se completa entre E19 e E20 e se espalha

gradualmente pela periferia da retina por mais um ou dois dias após a eclosão (P1-

P2) (Coulombre, 1955).

1.2.4 Gênese de células na retina de galinha

Dentre os diferentes tipos celulares da retina, as células ganglionares são as

primeiras a saírem do ciclo celular (Fujita e Horii, 1963.; Kahn, 1974.; Prada et al.,

1991). A neurogênese total destas células ocorre entre E2 e E9 (Figura 4) (Farah,

2006, para revisão) . As células de Müller, células gliais predominantes na retina,

são geradas entre E4 e E11 (Coulombre, 1955). Outros tipos celulares são gerados

num período de sobreposição. As células horizontais e os fotorreceptores são

gerados no período compreendido entre E4 e E9 (Adler, 2000, para revisão),

enquanto as células amácrinas são geradas entre E3 e E10 (Fujita e Horii, 1963.;

Kahn, 1973). As células bipolares são as últimas células a se diferenciarem em

retinas de galinha, o que ocorre entre E5 e E13 (Prada et al., 1991).

Figura 4 – Diagrama mostrando a geração de células na retina de galinha.

D=Dorsal, V= Ventral. Modificado de Prada et al., 1991.

1.3 Sistemas de neurotransmissores na retina

Na retina assim como no SNC, sabe-se que a comunicação intercelular se faz

também através de contatos especializados denominados sinapses, que podem ser

de dois tipos: elétricas ou químicas. Nos vertebrados a sinapse química é

predominante, a passagem da informação ocorre pela chegada do potencial de ação

no terminal pré-sináptico, seguida de um influxo de Ca

, vesículas contendo

neurotransmissor se fundem à membrana celular e liberam seu conteúdo na fenda

sináptica. A interação do neurotransmissor com receptores específicos situados na

célula alvo determina a passagem da informação. Esta interação com receptores

pode provocar alterações elétricas, pela abertura ou fechamento de canais iônicos,

ou ativar sistemas enzimáticos que regulam a quantidade de segundo mensageiros.

Várias substâncias químicas já foram identificadas como neurotransmissores ou

neuromoduladores nos diferentes tipos neuronais retinianos, como por exemplo,

glutamato, acetilcolina, glicina, ácido γ-amino butírico (GABA) e DA dentre tantos

outros (Mossinger et al., 1986; Yazulla, 1986; Massey e Redbrurn, 1987; Thoreson e

Witkovsky, 1999, Haeggendal e Malmforms, 1963). A DA é um neurotransmissor

com diversos papéis na retina, sendo encontrada em diferentes tipos celulares

dependendo da espécie. Ênfase especial será dada a este neurotransmissor por ser

objeto de estudo neste trabalho.

1.3.1 Dopamina

Alguns elementos do sistema dopaminérgico aparecem primeiro no

desenvolvimento da retina e a DA é a principal catecolamina encontrada na retina de

vertebrados (Kramer, 1971). Desde a descrição da técnica de fluorescência induzida

por vapor de formaldeído (Falck et al., 1962), conhecida como método de Falck-

Hilarp, foi possível a visualização das aminas biogênicas no tecido nervoso. As duas

aminas podem ser diferenciadas pela coloração que emitem: azul-esverdeada para

catecolaminas e amarelada para as indolaminas.

1.3.1.1 Síntese e armazenamento

A DA é uma amina biogênica que apresenta um anel catecol em sua

estrutura. Ela é sintetizada no citoplasma em duas etapas distintas, na primeira

etapa, o aminoácido L-tirosina sofre hidroxilação por ação da enzima TH sendo

convertido a L-3-4-dihidroxifenilalanina (L-dopa). Na etapa seguinte, a L-dopa é

descarboxilada por ação da DDC em Dopamina (DA) (Nagatsu et al., 1964). Em

neurônios dopaminérgicos esta etapa corresponde à etapa final na via de síntese

das catecolaminas. A DDC possui um baixo Km para L-dopa e assim há

praticamente 100% de eficiência na conversão em DA quando a enzima está

presente. A DDC é também conhecida como descarboxilase de aminoácidos

aromáticos (DAA), sendo, portanto capaz de descarboxilar a serotonina e por esta

razão não é utilizada como marcador dopaminérgico (Kuhar et al., 2006). Todas as

etapas da via de síntese das catecolaminas estão ilustradas na Figura 5.

Figura 5 – Esquema mostrando a via de síntese das catecolaminas. Modificado de

Kuhar et al, 2006.

Depois de sintetizada, a DA é estocada em vesículas pela ação de um

transportador conhecido como VMAT2 (transportador vesicular de monoaminas 2)

no sistema nervoso (Nirenberg et al., 1995,1996). Este transportador consiste de

uma proteína com doze domínios transmembrana, cuja ação pode ser bloqueada

por reserpina (Erickson et al, 1992), o mecanismo de estoque da DA em vesículas é

dependente de adenosina trifosfato (ATP) e está ligado a uma bomba de prótons, o

que também protege a DA da oxidação e ação de enzimas degradadoras no

citoplasma (Uhl e Johnson, 1994).

1.3.1.2 Liberação e término da ação

A liberação de DA é um processo dependente de cálcio, sugerindo que ela

seja liberada a partir de vesículas sinápticas. Uma despolarização no terminal

axônico aumenta o influxo de cálcio no terminal pré-sináptico através de canais

voltagem-dependente, os quais promovem a fusão de vesículas à membrana e a

liberação de seu conteúdo, num processo complexo de exocitose que envolve

diferentes proteínas vesiculares, de membrana e citoplasmáticas. A DA liberada na

sinapse tem sua ação terminada por três mecanismos de retirada deste

neurotransmissor da fenda sináptica: captação, degradação e difusão.

1.3.1.3 Captação

O processo de captação é importante para interromper a ação deste

transmissor e também manter a sua homeostase. A captação é feita por um

transportador localizado na membrana externa de neurônios. O transportador de DA

DAT é uma proteína com 619 aminoácidos, possui 12 domínios transmembrana com

uma porção N-terminal intracelular e um C-terminal extracelular, é membro da

família de transportadores dependentes de Na

/Cl

usando a energia proveniente do

gradiente de sódio gerado pela Na

ATPase (Amara e Kuhar, 1993; Torres et al.,

2003 para revisão). O DAT capta DA logo após sua liberação, modulando sua

concentração na fenda sináptica e o tempo de interação com receptores pré - e pós -

sinápticos (Amara e Arriza, 1993; Chen e Reith, 2000; Torres e Amara, 2007).

1.3.1.4 Degradação e difusão

A DA após ser captada pode ser convertida em ácido dihidroxifenilacético

(DOPAC) pela enzima monoaminooxidase (MAO) localizada na membrana externa

da mitocôndria. Pela sua localização a MAO possui um papel estratégico em inativar

a DA livre dentro dos terminais nervosos, não protegida por vesículas. A DA que foi

liberada pode ser convertida em ácido homovanílico (HVA), provavelmente em sítios

extraneuronais, através da ação seqüencial da MAO e da catecol-o-metiltransferase

(COMT). A DA que não foi captada ou metabolizada pode se difundir para sítios

distantes do local de liberação. Este processo é também chamado de transmissão

por difusão ou parácrina e permite a estimulação de receptores em locais

extrasinápticos (Kuhar et al., 2006).

1.3.1.5 Receptores dopaminérgicos

A ação direta da DA é mediada pela ação desta amina em receptores

específicos. Duas famílias de receptores dopaminérgicos são conhecidas: a família

D1 que compreende os receptores D1 e D5 e a família D2 que compreende os

receptores D2, D3 e D4 (Oak et al., 2000). Todos os subtipos de receptores

dopaminérgicos são membros de uma grande superfamília de receptores

caracterizados por possuírem sete domínios transmembrana, uma porção N-terminal

extracelular e um C-terminal intracelular (Vallone et al., 2000). Os receptores da

família D1, parecem estar ligados à ativação da adenil ciclase (AC) através de uma

proteína G do tipo estimulante (Gs), levando a um aumento nos níveis intracelulares

de adenosina 3’, 5’ monofosfato cíclico (AMPc) e ativação da proteína quinase A

(PKA). Os receptores da família D2, ao contrário, inibem a AC através de uma

proteína G do tipo inibitória (Gi), levando a uma diminuição nos níveis intracelulares

de AMPc (Witkovsky, 2004, para revisão). A Figura 6 ilustra uma sinapse

dopaminérgica.

Figura 6 – Representação esquemática mostrando uma sinapse dopaminérgica.

Modificado de Kuhar et al, 2006 e Torres et al, 2003.

Vários parâmetros do sistema dopaminérgico já foram estabelecidos, os

principais aspectos do sistema dopaminérgico na retina de galinha estão ilustrados

na Figura 7. Os receptores dopaminérgicos possuem ontogênese diferenciada. Os

receptores D1 diferenciam-se muito cedo, por volta de E7 como foi demonstrado

pelo aumento nos níveis intracelulares de AMPc e também pela detecção de

radioligantes específicos (De Mello,1978 e De Mello et al.,1982). Os receptores do

tipo D2 surgem mais tardiamente na retina, sendo detectados entre E11 e E12

(Ventura et al., 1984, Reis et al., 2007, para revisão). A imunorreatividade para o

receptor D1 foi detectada nas CPI e CPE tanto em idades embrionárias quanto na

retina madura (Ventura et al., 1984 e Ventura e De Mello, 1990). De Mello e De

Mello (1985) descreveram uma variação topográfica dos receptores D1 durante o

desenvolvimento embrionário, privilegiando um gradiente dorso-posterior na região

temporal. Guimarães (1999) utilizando o método de imunohistoquímica mostrou

marcação para receptores D2 na retina do animal adulto em células ganglionares e

na subcamada S4 da CPI. Já os receptores D4 encontram-se em maior quantidade

na metade interna da CNI e em fotorreceptores, onde também foi observada

marcação em raros corpos celulares situados na porção mais interna da CNI em

retinas de 10 dias embrionários (Guimarães, 1999).

Figura 7 – Esquema mostrando os principais eventos do desenvolvimento do

sistema dopaminérgico na retina de galinha. E: idade embrionária; TH: tirosina

hidroxilase; CPI: camada plexiforme interna. Modificado de Gardino et al, 1993.

1.4 Papel funcional da DA

Desde o trabalho de Kramer (1971), a DA tem sido apontada como um

neurotransmissor retiniano regulado pela luz. Várias controvérsias existem até hoje

sobre se sua liberação ocorre no claro ou no escuro, pois esta depende da espécie

animal, entretanto algumas ações da DA já foram reconhecidas em quase todas as

camadas retinianas. DA tem um papel modulatório importante no sistema visual de

vertebrados, vários trabalhos têm demonstrado efeitos diretos e indiretos da DA em

neurônios da retina incluindo: a diminuição do tamanho do campo receptivo de

cones em retinas de carpas pelo desacoplamento de células horizontais (Mangel e

Dowling, 1985); a retração de neuritos em células horizontais de peixes teleósteos

através do diacilglicerol e proteína quinase C (Rodrigues e Dowling, 1990); a

diminuição da condutância de junções elétricas entre células horizontais em peixes

(Lasater e Dowling,1985). A DA também parece estar envolvida na modulação da

sobrevivência de neurônios retinianos (Varella et al., 1999). Hampson e

colaboradores (1992) mostraram que a DA exógena possui efeitos nas camadas

mais internas e diminui o acoplamento entre células amácrinas AII em retinas de

coelho, um efeito que parece ser mediado via receptor D1. Li e Dowling (2000)

demonstraram que a depleção de DA na retina tem efeitos significantes na CPI, em

particular na via dos bastonetes. A DA parece diminuir a informação da via de

bastonetes e aumentar o sinal da via de cones (Witkovsky, 2004 para revisão). DA

endógena regula junções comunicantes de células horizontais em retinas de

camundongos, possivelmente atuando em receptores do tipo D1 (He et al., 2000).

DA inibe a liberação de GABA induzida por NMDA em culturas de células retinianas

de mamíferos (Do Nascimento et al., 1998; Castro et al., 1999). Calaza e

colaboradores (2001) mostraram que na retina de galinha, a DA modula a atividade

de receptores NMDA através de uma interação direta neste receptor.

Trabalhos utilizando técnicas de biologia molecular possibilitaram uma

caracterização mais completa e direta das células dopaminérgicas. Sabe-se que

estas células são capazes de gerar potenciais de ação espontaneamente, esta

atividade parece ser inibida por GABA e glicina enquanto cainato aumenta a

atividade nestas células (Gustincich et al, 1997). Os autores sugerem que a

atividade espontânea das células dopaminérgicas é inibida no escuro por células

amácrinas GABAérgicas as quais recebem aferências de células bipolares “OFF”.

Em condições de iluminação, a inibição de GABA é removida e ocorre estimulação

através de bipolares “ON” liberando glutamato. Num outro trabalho, este mesmo

grupo dissecou os componentes desta atividade espontânea e propôs que estas

células funcionariam como um marca-passo, e assim liberariam DA tonicamente na

retina (Feigenspan et al, 1998).

DA parece participar também na regulação do crescimento do olho. Em

primatas jovens os olhos tornam-se anormalmente alongados após serem ocluídos

com lentes de contacto opacas e este efeito é bloqueado pelo uso de apomorfina,

um agonista dopaminérgico (Iuvone et al., 1991). Stone e colaboradores (1989)

verificaram que o alargamento do olho de galinha é acompanhado por uma

diminuição nos níveis de DA.

Estudos realizados com animais albinos mostram que a DA pode ter um papel

importante na produção e diferenciação celular. Animais albinos possuem o gene da

tirosinase defeituoso. A tirosinase é uma enzima presente no epitélio pigmentado

responsável pela síntese de melanina, pela conversão da L-tirosina a L -

dihidroxifenilalanina (L-dopa) no primeiro passo da síntese da melanina e é possível

que esta amina ou seus metabólitos atinjam a retina através da difusão e

desempenhem um papel importante no desenvolvimento da retina em períodos onde

a DA ainda não está expressa. A retina de animais albinos possui um

desenvolvimento anormal, onde as vias de produção celular são distorcidas e

atrasadas, a proliferação celular é elevada o que resulta no espessamento transitório

da retina e no excesso de morte celular (Jeffery, 1997.; Ilia e Jeffery, 1999) Na

maturidade, a região central é pouco desenvolvida, o número de bastonetes é

reduzido e ocorre um cruzamento inadequado de fibras no quiasma óptico (Ilia e

Jeffery, 1996). A aplicação exógena de L-dopa, um precursor da síntese de DA,

durante o desenvolvimento “in vivo” (Ilia e Jeffery 2000; Tibber et al, 2006), “in vitro”

(Ilia e Jeffery, 1999) ou então por métodos de manipulação genética (Lavado et al,

2006; Lavado e Montolin, 2006), corrige as anormalidades que ocorrem durante o

desenvolvimento da retina que caracterizam o fenótipo albino. Em um trabalho mais

recente, Tibber e colaboradores (2007) demonstraram que os níveis de expressão

da conexina 43, uma proteína componente de junções comunicantes que é expressa

na interface entre o epitélio pigmentado e retina neural, são regulados

dinamicamente durante o desenvolvimento e possuem um papel importante na

regulação dos níveis mitóticos e na neurogênese. Em animais albinos os altos

níveis mitóticos foram associados a um aumento significante nos níveis de conexina

43. Neste mesmo trabalho, os autores mostraram que a adição de L-dopa diminui

os níveis de conexina 43 e também a mitose nestes animais, sugerindo que a falta

de L-dopa durante a ontogênese da retina possa levar a uma disfunção no processo

de desenvolvimento por limitar a disponibilidade de DA e, conseqüentemente, o nível

de junções comunicantes entre o epitélio pigmentado e a retina neural.

DA aplicada exogenamente em retinas de ratos albinos, afeta o mecanismo

que regula a fase M do ciclo celular, prolongando esta fase, possivelmente via

receptor D1 (Kralj-Hans et al, 2006). Na retina de pinto Lankford e colaboradores

(1988) demonstraram que a DA inibe o crescimento e a motilidade de cones de

crescimento em culturas, efeito que também parece ser modulado via receptor D1.

Guimarães e colaboradores (2001) mostraram que a DA limita o número e também a

complexidade dos neuritos de células amácrinas dopaminérgicas na retina de

galinha e que a diferenciação do fenótipo dopaminérgico em culturas de células de

retina parece ser mediada via receptor D2.

1.5 Células dopaminérgicas na retina

Os neurônios dopaminérgicos correspondem ao tipo majoritário de neurônios

catecolaminérgicos na retina (Kramer, 1971). Vários trabalhos utilizando diferentes

metodologias têm demonstrado a presença de neurônios catecolaminérgicos na

retina de galinha, que já foram descritos por métodos de histofluorescência (Kato et

al., 1980; Araki et al., 1983; Mariani e Hokoç, 1988) e técnicas de imunohistoquímica

(Kagami et al., 1991; Gardino et al., 1993; Dos Santos e Gardino, 1998), que utilizam

anticorpos específicos contra a TH, enzima limitante na síntese de DA. Assim, a

detecção da TH tem sido utilizada como marcador de células dopaminérgicas em

muitas regiões de SNC (Pearson et al, 1983; Hökfelt et al, 1984; Ikemoto et al,

1998). Muito embora a TH seja usada como marcador dopaminérgico em células de

diferentes regiões do cérebro, alguns neurônios no mesencéfalo possuem a L-dopa

como produto final, pois estas células não possuem a enzima DDC. Células que

possuem a enzima TH e não possuem a enzima DDC foram descritas em várias

regiões do encéfalo de diferentes espécies de mamíferos, inclusive humanos.

Alguns trabalhos mostraram que no cérebro de mamíferos, a DA pode ser

sintetizada por neurônios não dopaminérgicos, ou seja, neurônios que expressam

somente uma das enzimas da via de síntese da DA: TH ou DDC em cooperação

(Ikemoto et al., 1998; Ugrumov et al., 2002; Ugrumov et al., 2004; Ershov et al.,

2005; Weihe et al., 2006).

Dados imunocitoquímicos mostraram a presença da enzima TH e a ausência

das demais enzimas da via de síntese das catecolaminas, para diversas espécies

estudadas, como por exemplo: macaco reso (“Rhesus”), gato e coelho (Hokoç e

Mariani,1988), indicando que estes neurônios são provavelmente dopaminérgicos.

Em algumas espécies de peixes e mamíferos as células dopaminérgicas foram

identificadas como células interplexiformes (Dowling e Ehinger, 1975). Duas

subpopulações de células TH positivas (TH+) foram primeiro demonstradas na retina

de ratos, ambas são células amácrinas localizadas na porção mais interna da

camada CNI (Nguyen-Legros et al., 1994). De acordo com a terminologia

introduzida por Mariani e Hokoç (1988), as células do tipo1 possuem o corpo celular

grande, intensamente marcado e enviam prolongamentos para subcamada S1 da

CPI (Nguyen-Legros et al.,1997), as do tipo 2 são pequenas, fracamente

imunorreativas, são multipolares em primatas, e seus prolongamentos atingem a

subcamada S3 da CPI (Mariani e Hokoç, 1988). Su-já Oh e colaboradores (1999)

mostraram duas populações de células TH+ na retina de cobaias com morfologia

parecida às já descritas, as células do tipo 1, enviado prolongamentos para

subcamada S1 da CPI, enquanto as do tipo 2 enviam seus prolongamentos para a

subcamada S3 da CPI. O mesmo padrão foi observado por Zhang e colaboradores

(2004) em neurônios retinianos que foram marcados transgenicamente com uma

proteína fluorescente vermelha regulada pelo promotor da TH em retinas de

camundongos. Em primatas dois tipos de células TH+ já foram identificados na

retina (Guimarães e Hokoç, 1997; Mariani e Hokoç, 1988). Em peixe dourado foi

observada marcação para TH também em prolongamentos situados na CPE,

mostrando que nesta espécie as células dopaminérgicas são células interplexiformes

(Osborne et al., 1984).

As células dopaminérgicas na retina de galinha pertencem a um subtipo de

células amácrinas, que compreende cerca de 2% a 5% da população de células

amácrinas (Nguyen-Legros e Savy, 1988). Esta quantificação, no entanto, varia

conforme o método utilizado. Kagami e colaboradores (1991) demonstraram que as

células TH+ surgem na retina de galinha em E11, cujos corpos celulares encontram-

se localizados na porção mais externa da CNI, 10 a 15 fileiras de corpos celulares

acima de seu bordo interno. Em E12, período em que se inicia a formação de

sinapses na retina de galinha (sinaptogênese), as células TH+ são encontradas na

porção central da CNI, apresentando uma marcação mais intensa do que em E11,

embora os neuritos ainda não sejam evidentes (Kagami et al., 1991). A distribuição

topográfica das células TH+ em E12 encontra-se principalmente na parte ventral da

retina temporal de acordo com este autor. Em E13 os corpos celulares são ainda

encontrados na porção central da CNI. Estes achados não estão totalmente de

acordo com dados de Gardino e colaboradores (1993), que mostraram, em cortes

transversais de retina, células TH+ a partir de E12. Nesta idade os autores

descrevem células com corpo celular alongado, localizados na porção mais interna

da CNI e fracamente imunopositivas, algumas células possuem um único processo

que emerge do soma em direção a CPI. Em E13, os corpos celulares são mais

arredondados e os prolongamentos destas células em direção a CPI são claramente

visíveis, a distribuição topográfica nesta fase indicou uma predominância de células

na porção superior da retina.

Com o desenvolvimento do tecido, o número de prolongamentos aumenta

consideravelmente. Em E16 a marcação se torna intensa e a arborização é visível

nas subcamadas S1 e S4 da CPI sendo que em S1 a arborização é mais intensa

que em S4, este padrão se mantém até a maturidade da retina. Este tipo celular foi

caracterizado como célula amácrina biestratificada nas subcamadas S1 e S4 da CPI.

O gradiente de distribuição topográfica presente em retinas jovens (E13-E14)

desaparece e se torna homogêneo com a maturidade do tecido. Posteriormente,

Dos Santos e Gardino (1998) descreveram uma segunda população de células TH+

na retina de galinha, esta população foi primeiro observada em E14 e difere da

anterior por possuir o soma relativamente menor, marcação mais fraca que a

descrita por Gardino e colaboradores (1993) e se localizam preferencialmente na

porção ventral da retina. Estas células enviam prolongamentos para S1 e S4 na

CPI. Com base nos achados de Gardino e colaboradores (1993) e Dos Santos e

Gardino (1998) a retina de pinto possui duas populações de células TH+ que diferem

com base na ontogênese, intensidade da reação imunohistoquímica e distribuição

topográfica.

1.6 Sistema dopaminérgico na retina de galinha

Gardino e colaboradores (1993) mostraram que a gênese e distribuição das

células dopaminérgicas no tecido retiniano íntegro de embriões de galinha

completam seu ciclo mitótico entre E3 e E7. Logo após, em E7 os receptores

dopaminérgicos do tipo D1 já se encontram em atividade (De Mello,1978), assim

como o sistema de captação de DA (E9) (Kato et al.,1984). Além disso, há células

que já expressam o transportador de DA (DAT) (Kubrusly et al. 2003).

Entretanto, a TH só é expressa a partir de E12 (Gardino et al 1993). Uma

pergunta que surge então é saber se DA poderia ser sintetizada a partir de uma via

alternativa, que não a via clássica das catecolaminas. Kubrusly e colaboradores

(2003) mostraram que com a adição de L-Dopa, um precursor da DA, as células

retinianas embrionárias são capazes de produzir DA e induzir o aumento nos níveis

intracelulares de AMPc, atuando em receptores do tipo D1. Dessa forma, parece

possível que a enzima DDC presente no tecido retiniano seja capaz de formar DA,

desde que se forneça a L-Dopa ao tecido. No ambiente natural do tecido, L-Dopa

pode ser produzido a partir da enzima tirosinase presente no epitélio pigmentado.

De fato, resultados preliminares mostraram que aos oito dias embrionários a enzima

DDC já está sendo expressa na região externa da retina, próxima ao epitélio

pigmentado. Kubrusly e colaboradores (2003) mostraram que pode ocorrer

formação de L-dopa na retina de galinha, numa reação catalisada pela enzima

tirosinase presente no epitélio pigmentado. Nesse caso, propôs-se que L-dopa se

difundiria para a retina e formaria DA nas fases iniciais do desenvolvimento da

retina, quando TH ainda não está presente como mostra a Figura 8. A presença da

enzima DDC nas fases iniciais do desenvolvimento, anterior ao surgimento da TH,

sugere que este mecanismo possa estar ocorrendo.

Figura 8 – Desenho esquemático mostrando uma possível via alternativa na

produção de L-dopa. Em A um neurônio que expressa a enzima TH. Em B um

neurônio que ainda não expressa a enzima TH e expressa a enzima DDC, este

neurônio pode converter a L-dopa produzida no epitélio pigmentado em DA. DAT=

transportador de monoaminas; D1, D2, D3, D4, D5 = receptores de DA; cAMP =

monofosfato de adenosina cíclico. Modificado de Kubrusly, 2003.

Com base nos dados apresentados anteriormente, surge então a proposta de

verificar a expressão da enzima DDC na retina de galinha durante o

desenvolvimento e também verificar a distribuição espacial e temporal das células

DDC+, considerando que esses parâmetros ainda não foram identificados em

nenhuma espécie estudada.

2 OBJETIVOS

2.1 Objetivo geral

Verificar a expressão da enzima Dopa – descarboxilase (DDC) em retinas de

galinha durante o desenvolvimento e no animal adulto.

2.1.1 Objetivos específicos

1. Identificar os tipos celulares e analisar a morfologia das células que contém a

enzima DDC durante o desenvolvimento embrionário e no tecido adulto e comparar

com a expressão de TH.

2. Verificar a colocalização das enzimas TH e DDC durante o desenvolvimento e no

animal adulto

3. Analisar a densidade das células DDC+ e comparar com a de células TH+.

4. Verificar a distribuição topográfica da enzima DDC e comparar com a expressão

de TH.

5. Comparar o padrão de expressão da enzima DDC em retina de diferentes

espécies animais.

3 MATERIAL E MÉTODOS

3.1 Modelo experimental

Foram utilizados ovos de galinha da raça White Leghorn obtidos de uma

granja local (Rio de Janeiro) em diferentes idades embrionárias e animais após a

eclosão. Os embriões foram estagiados de acordo com Hamburguer e Hamilton

(1951). Neste trabalho utilizamos no mínimo três e no máximo cinco retinas de

animais diferentes em cada idade estudada. Os protocolos experimentais de

obtenção de retinas foram aprovados pelo Comitê de Ética do Centro de Ciências da

Saúde (CCS) da UFRJ protocolo N

IBCCF 001. Os ovos, contendo os embriões,

foram mantidos em câmara aquecida (37

C) e umidificada. Os animais após a

eclosão foram mantidos em biotério, dentro de gaiola adaptada com uma lâmpada

incandescente presa ao teto para mantê-los aquecidos (39

C). Desta forma, os

animais foram mantidos sob iluminação constante.

Foram utilizados neste trabalho retinas de um gambá sul-americano Didelphis

aurita, macho adulto, nascido em cativeiro no biotério do Instituto de Biofísica Carlos

Chagas Filho (IBCCF), do Centro de Ciências da Saúde, UFRJ; um macaco (Cebus

apella) adulto oriundo da região sudeste do Brasil e fornecido ao IBCCF com a

autorização do IBAMA; e dois ratos (Rattus novergicus) adultos mantidos em biotério

do IBCCF. Os animais receberam água e comida sem restrições.

3.2 Preparo e obtenção do tecido

Animais de diferentes idades embrionárias E8, E10, E13, E19 e sete dias

após a eclosão (P7) foram sacrificados por decapitação. Seguia-se a retirada dos

olhos, da córnea e do humor vítreo. A parte posterior do olho que contém a retina foi

então fixada em diferentes soluções fixadoras de acordo com o anticorpo utilizado.

Na imunohistoquímica para TH, as retinas foram fixadas em solução de

paraformaldeído 4% (PFA 4%) em tampão fosfato 0,16 M, pH 7,2 (TF 0,16M), por 2

horas, e para DDC as retinas foram fixadas em solução de paraformaldeído 4% mais

1% de ácido pícrico em TF 0,16M, por 1 hora. Após três lavagens em tampão

fosfato salina pH 7,4 (PBS), o tecido foi crioprotegido com soluções crescentes de

sacarose (10%, 20% e 30%) diluída em TF 0,16M. Após no mínimo 24 horas na

solução de sacarose 30%, as retinas foram colocadas sobre uma placa de alumínio,

o excesso de líquido foi retirado sendo feito um corte, perpendicular ao pecten, na

presença de meio de inclusão aquoso (OCT (optimal cutting temperature) – Sakura

Finetek, Torrance, CA) como mostrado na Figura 9. Em seguida, as retinas foram

congeladas em nitrogênio líquido (-196ºC), formando um bloco. Este bloco

congelado, por sua vez, foi colocado em um suporte para criostato (LEICA CM 3050

S) e posicionado adequadamente para a realização dos cortes. Os cortes radiais

entre 12µm e 14µm foram obtidos no criostato sob temperatura de -20ºC; todos os

cortes foram obtidos a partir da região ventral da retina (onde foi feito o corte

perpendicular ao pecten) em direção a dorsal e coletados sobre lâmina histológica

previamente tratada com solução de gelatina 0,5% (0,5g de gelatina (Sigma) mais

0,002g de alúmen de cromo (sigma) diluídos em 100mL de água destilada). Cortes

das diferentes idades utilizadas neste trabalho foram colhidos em uma mesma

lâmina para serem processados conjuntamente. As lâminas contendo os cortes

ficavam à temperatura ambiente por no mínimo 6 horas para secagem dos mesmos

e em seguida foram congeladas até o dia do experimento.

O gambá e o macaco adultos foram previamente pesados e anestesiados. O

gambá era anestesiado por via intraperitoneal com pentobarbital sódico (30mg/Kg de

peso corporal). O macaco era anestesiado por via intramuscular com cloridrato de

ketamina (50mg/Kg de peso corporal) em seguida, este anestésico foi associado ao

pentobarbital na dose de 30mg/Kg, endovenosamente, que garantiu uma anestesia

profunda antes do procedimento de enucleação. Os ratos foram anestesiados por

via intramuscular com xilazina (5mg/Kg de peso corporal) e ketamina (75mg/Kg de

peso corporal).

Depois de anestesiados, os animais foram enucleados e logo após foram

sacrificados conforme previsto pelo Comitê de Ética do Centro de Ciências da Saúde

(CCS) da UFRJ. O preparo das retinas de macaco, gambá e ratos foi semelhante ao

protocolo utilizado para retinas de galinha com poucas modificações. As retinas

foram fixadas em PFA 4% diluído em TF 0,1M por 2hs. Os cortes radiais entre 12 e

14µm foram obtidos da região inferior em direção à região superior da retina.

Figura 9 – Desenho esquemático mostrando o plano de corte feito no olho. Após

retirar o excesso de líquido, era feito um corte perpendicular na região do pécten na

presença de meio de inclusão aquoso (OCT). Em seguida, a parte dorsal do olho

era congelada em nitrogênio líquido e posicionada em suporte para criostato, este

era então posicionado adequadamente para a realização dos cortes. A linha

pontilhada indica o plano de corte. P= pécten.

3.2.1 Preparo de retinas planas

Logo após a enucleação, as retinas foram dissecadas livres da esclera,

coróide e epitélio pigmentado em salina sem cálcio e magnésio (CMF) aplanadas e

fixadas entre lamínulas em solução fixadora. Na imunohistoquímica para TH as

retinas foram fixadas em solução de PFA 4% diluído em TF 0,16M por duas horas.

Após este período era feita uma lavagem de três vezes por 10 minutos em TF 0.16M

para retirar o excesso de fixador. Em seguida, as retinas foram guardadas na

geladeira até o dia do experimento. Utilizando PFA 4% ou PFA 4% mais 1% de

ácido pícrico ambos diluídos em TF 0,16M por duas horas não obtivemos uma

marcação satisfatória para a DDC. Isto poderia ser explicado pela espessura da

retina que poderia dificultar a penetração do anticorpo e também pelo fixador que foi

utilizado. A detecção in situ de antígenos em células e tecidos depende da maneira

na qual o material foi fixado; a ligação antígeno – anticorpo depende da estrutura

tridimensional das duas proteínas envolvidas, no caso do antígeno, este pode ser

seriamente alterado durante a fixação por uma ligação cruzada com os grupos

aldeídos do fixador, mascarando, desta forma, os epitopos presentes na proteína.

Decidiu-se, então, utilizar um método de fixação, descrito na literatura e bastante

utilizado por vários autores (Beil et al., 1994.; Davis et al., 1997.; Izumi et al., 2000.;

Leria et al., 2004). Neste protocolo, após dissecadas e aplanadas entre lamínulas

as retinas foram colocadas em uma placa de acrílico contendo 10 mL de solução de

formaldeído 2% diluído em TF 0,16M à temperatura ambiente (± 25

C). Logo após,

as placas foram colocadas no centro de um microondas convencional, o qual era

programado para funcionar na potência 3 durante exatamente 17 segundos.

Ao final deste tempo a temperatura do fixador aumentava sendo que esta não

ultrapassava 40

C. Após a fixação as retinas foram lavadas por 3 vezes, 10 minutos,

em PBS e imediatamente processadas imunohistoquimicamente. Deste modo, com

o tempo e a concentração do fixador diminuídos, foi possível uma melhor

preservação tecidual e antigênica, o que permitiu uma boa marcação.

3.3 Imunohistoquímica

Esta técnica tem como objetivo a identificação de antígenos através da sua

interação com anticorpos específicos, permitindo a visualização de constituintes

tissulares ou celulares, a partir da formação do complexo antígeno – anticorpo.

Entretanto, esta interação antígeno – anticorpo por si só, não pode ser visualizada,

havendo a necessidade de conjugar este anticorpo direta ou indiretamente, a um

marcador que permita sua visualização. Deste modo, o antígeno poderá ser

visualizado graças à presença de um marcador, que pode encontrar-se conjugado

direta ou indiretamente ao anticorpo primário, ou a uma molécula que reconheça o

complexo antígeno – anticorpo, neste caso o anticorpo secundário. Neste trabalho

utilizamos anticorpos secundários, marcados com biotina (biotinilado) e a técnica do

complexo avidina – biotina (ABC), que através de uma reação química pode ser

facilmente identificado. Também utilizamos anticorpos secundários conjugados a

moléculas fluorescentes para experimentos de dupla marcação.

3.3.1 Imunohistoquímica para TH e DDC

3.3.1.1 Em cortes radiais de retina

Cortes de retinas de galinha de E8, E10, E13, E19 e P7 e também de

macaco, gambá e ratos adultos foram previamente descongelados e lavados com

PBS por 10 minutos. Em seguida, os cortes foram pré-incubados em uma solução

de incubação (albumina de soro bovino (BSA – Sigma) 5% em PBS mais 0,25% de

triton X-100 (Sigma)) por 1 hora. Após remoção desta solução, o material foi

incubado com os anticorpos primários dirigidos contra TH (AB 151 Chemicon,

originado em coelho) na diluição de 1:10.000 ou DDC (AB 1569 Chemicon, originado

em coelho) na diluição de 1:200 em PBST por uma noite. No dia seguinte, as

lâminas foram lavadas três vezes por 10 minutos em PBS para retirar o anticorpo

primário. Em seguida as preparações foram incubadas com o anticorpo secundário

biotinilado dirigido contra coelho (Vector) na diluição de 1:200 em PBST, por 2 horas.

Em seguida, as lâminas foram lavadas por 3 vezes 10 minutos em PBS e incubadas

com o complexo ABC (Vector, Kit Elite Vectastain) diluído em PBST na concentração

de 1:50, por 2 horas. Finalmente, após 3 lavagens de 10 minutos em PBS, as

retinas foram reagidas com o cromógeno DAB (3’3’Diaminobenzidina 0,1mg/mL,

diluído em tampão Tris 0,05M na presença de 0,015% de peróxido de hidrogênio),

por 10 minutos, para serem, em seguida lavadas 3 vezes por 10 minutos em PBS e

montadas em glicerol tamponado (40% de glicerol diluído em tampão fosfato 0,2M)

para posterior análise ao microscópio.

3.3.1.2 Em preparações planas

A imunohistoquímica para TH e DDC das preparações planas foi feita

segundo o método “free-floating”, onde o tecido inteiro, sob imersão, era incubado

em pequenos poços. O volume de todas as soluções utilizadas foi de 500µL,

suficiente para cobrir todo o tecido. Os anticorpos utilizados nestas preparações,

bem como as soluções nas quais estes foram diluídos e suas respectivas

concentrações, foram os mesmos utilizados nos cortes radiais. Após a fixação, o

tecido foi lavado 3 vezes, por 10 minutos, em PBS e incubado em solução de pré -

incubação por 1 hora a temperatura ambiente. Após este período foi colocado o

anticorpo primário (TH) e o tecido foi levado à geladeira por 48 horas. Em seguida, o

anticorpo primário foi retirado e o tecido lavado por três vezes por 10 minutos em

PBS e posteriormente incubado com o anticorpo secundário por 2 horas. Após 3

lavagens por 10 minutos em PBS, as retinas foram incubadas com o complexo ABC

diluído em PBST, por 2 horas, a temperatura ambiente. Após três lavagens de 10

minutos cada em PBS a reação foi visualizada com o uso do cromógeno DAB por 30

minutos para posterior quantificação das células marcadas. Todas as etapas de

incubação com anticorpos e lavagens foram realizadas sob agitação constante.

Para DDC, após a etapa de fixação e lavagem, as retinas foram

imediatamente processadas para imunohistoquímica. O protocolo usado foi

semelhante àquele padronizado para a detecção de TH (descrito anteriormente),

sendo que o anticorpo primário permanecia no tecido por somente 24 horas na

geladeira.

3.3.2 Dupla marcação para TH e DDC em cortes radiais

Cortes de retinas de E8, E10, E13, E19 e P7 foram previamente

descongelados e lavados com PBS por 10 minutos. Em seguida, os cortes foram

pré-incubados em solução de pré-incubação por 1 hora. Após remoção dessa

solução, o material foi incubado com a mistura dos anticorpos primários dirigidos

contra TH (AB 151, originado em coelho) e DDC (AB119, originado em ovelha) que

foram diluídos juntos na proporção de 1:10.000 e 1:500, respectivamente, em PBST

e incubados por 24hs a 4ºC. No dia seguinte, os cortes foram lavados em PBS três

vezes, por 10 minutos, e incubados com a mistura dos anticorpos secundários

conjugados fluorescentes Alexa 555 (Molecular Probes) na diluição de 1:300 que se

liga a IgG de coelho e, portanto, reconhece a TH (coloração vermelha) e Alexa 488

(Molecular probes) na diluição 1:200 que se liga a IgG de ovelha e revela a presença

da enzima DDC com coloração verde, ambos diluídos em PBST. Esta incubação

permanecia por, no mínimo, duas horas à temperatura ambiente. Em seguida, os

cortes foram lavados em TF 0,16M e as lâminas montadas com solução saturada de

n-propil-galato em PBS (0,2M em PBS e 90% de glicerol). Estes cortes foram

armazenados a 4

C e protegidos da luz até serem levados ao microscópio confocal

para análise.

Todos os controles das reações imunohistoquímicas foram obtidos pela

substituição do anticorpo primário, pela solução de pré-incubação. As etapas

seguintes foram feitas de acordo com os protocolos descritos anteriormente.

Todos os anticorpos utilizados neste trabalho estão listados nas tabelas abaixo.

Anticorpo Fabricante Espécie de

origem

Antígeno Diluição

Anti Dopa

Descarboxilase

(AB 1569)

Chemicon

coelho DDC 1:200

Anti Dopa

Descarboxilase

(AB 119)

Chemicon

ovelha DDC 1:500

Anti- Tirosina

Hidroxilase

(AB 151)

Chemicon coelho TH 1:10.000

Tabela 1- Tabela com as descrições dos anticorpos primários utilizados.

Anticorpo Fabricante Espécie de

origem

Antígeno Diluição

Alexa fluor

555 (A 21429)

Molecular

Probes

cabra IgG de

coelho

1:200

Alexa fluor

488 (A 11015)

Molecular

Probes

jumento IgG de

ovelha

1:300

X- coelho Vector cabra IgG de

coelho

1:200

Tabela 2- Tabela com as descrições dos anticorpos secundários utilizados.

3.4 Análise dos resultados

3.4.1 Análise morfológica das células DDC+

Utilizamos a imunohistoquímica em cortes radiais de retinas para

caracterização morfológica das células DDC+. Os parâmetros utilizados neste

trabalho foram a localização e morfologia do corpo celular, intensidade da reação

imunohistoquímica e os níveis de estratificação dendrítica, que seguiu a

classificação de Cajal (1933). A caracterização morfológica final das células DDC+

foi realizada em animais P7, pois nesta idade a retina se encontra totalmente

diferenciada. As células DDC+ foram analisadas em microscópio óptico (Axioskop –

Zeiss), utilizando diferentes aumentos. As fotomicrografias foram feitas no mesmo

microscópio com o auxílio de câmara fotográfica Nikon (Coolpix 995).

3.4.2 Distribuição topográfica e densidade de células TH e DDC positivas

Para análise da distribuição topográfica e densidade das células TH+ e

DDC+, utilizamos as preparações planas, nas quais as retinas, após serem

processadas imunohistoquímicamente, foram montadas em lâmina com glicerol

tamponado a 40%, sempre com a face mais externa da retina voltada para a lâmina.

Após montagem das retinas sobre a lâmina, um contorno ou mapas das mesmas

foram desenhados sobre papel milimetrado. Resumidamente, com o auxílio de um

ampliador fotográfico, o contorno da retina era gerado, obtendo-se um mapa

ampliado. Era construída uma escala nos eixos X e Y com o auxílio da escala

presente na platina do microscópio. A densidade da enzima DDC foi estimada em

microscópio óptico (Axioskop – Zeiss), utilizando uma lente objetiva com aumento de

100X, cuja ocular era acoplada a um retículo. Apenas as células contidas no retículo

foram contadas, respeitando-se a exclusão de contagem das células contidas nas

bordas esquerda e inferior e incluindo aquelas com intersecção nas bordas superior

direita. As contagens foram feitas em intervalos de 1mm por toda extensão de retina

como mostrado na Figura 10. O mesmo procedimento foi utilizado na análise da

densidade da enzima TH sendo que nesta utilizamos uma objetiva com aumento de

40X. O cálculo da área amostral foi obtido pela multiplicação da área do retículo

pelo aumento da objetiva que foi utilizada. A área amostral correspondente à

contagem das células DDC+ foi de 0,0092mm

e da TH foi de 0,060mm

, após a

contagem os resultados foram normalizados e a densidade final foi expressa em

número de células/ mm

. Os mapas de distribuição topográfica das preparações

planas foram construídos a partir dos desenhos obtidos em papel milimetrado, que

foram escaneados e posteriormente analisados.

Figura 10 – Desenho esquemático do mapa retiniano gerado e da área de

contagem. Após desenhar o perfil da retina em papel milimetrado, foi construída

uma escala correspondente à escala da platina do microscópio. Obtinha-se, então,

as coordenadas nos eixos de X e Y. Estas coordenadas foram utilizadas como guias

para a realização das contagens. O esquema mostra uma pequena área na retina

(quadrado preto) que corresponde às coordenadas 90/10 em X e Y respectivamente,

a seta vermelha mostra em grande aumento a área amostral onde as células foram

quantificadas na perspectiva do observador. Este exemplo ilustra uma retina de

E13, imunorreagida para DDC onde se observam 23 células positivas utilizando uma

objetiva com aumento de 100X.

3.4.3 Colocalização das enzimas TH e DDC em retinas

Utilizamos a dupla marcação com anticorpos secundários conjugados à

moléculas fluorescentes para revelar a colocalização ou não de células TH+ e DDC+

em cortes radiais de retinas de embriões com diferentes idades. Após a reação

imunohistoquímica vários cortes foram analisados ao microscópio confocal (Zeiss –

LSM 510 META). Todas as fotomicrografias fluorescentes mostradas neste trabalho

foram feitas em microscópio AXIOVERT 200M, equipado com óptica fluorescente e

acoplado ao módulo Apotome

(Zeiss).

3.4.4 Análise estatística

A análise estatística foi realizada com o auxílio do programa Graphpad Prism

aplicando-se o teste de análise de variância (One-way ANOVA), seguido pelo teste

de comparação múltipla de Bonferroni. Diferenças foram consideradas significativas

quando P<0,05. Os resultados foram expressos como média ± erro padrão da

média (SEM) de no mínimo três retinas de animais diferentes para cada idade

analisada.

4 RESULTADOS

4.1 Identificação e análise morfológica das células DDC+

De acordo com Coulombre (1955) em E8 a retina se caracteriza pelo

aparecimento das CPE e CPI, sendo esta última bem visível na região fúndica da

retina. A análise imunohistoquímica de cortes radiais de retinas de E8 mostrou a

presença de corpos celulares com marcação para a enzima DDC (Figura 11 B).

Nesta idade, os corpos celulares das células DDC+ apresentam-se fracamente

marcados, localizados no limite entre as CNI e CPI, com um formato entre o

fusiforme e o oval, como mostrado na Figura 11 C, e em maior aumento na Figura

11 D. Uma fraca marcação na região próxima a CPE, CPI e CFO foi observada

(Figura 11 B). Nesta idade foi possível verificar a presença de prolongamentos

destas células na CPI (Figura 10 D), embora estes fossem raros. Vemos nesta

idade células do tipo amácrinas positivas e imunomarcação nas CPE, CPI e CFO.

Figura 11 – Fotomicrografias de cortes transversais de retinas de galinha (E8) na

região central, contendo células imunorreativas à enzima DDC. Em A, controle da

reação imunohistoquímica. Em B, imunorreatividade para DDC, ilustrando célula

marcada na CNI (seta preta). Observamos também fraca marcação nas CPE (seta

vermelha), CFO (cabeça de seta) e forte marcação na CPI (seta branca). Em C e D,

maior aumento mostrando corpo celular fracamente marcado (seta preta). Em D, a

seta branca mostra um prolongamento para a CPI. CPE, camada plexiforme

externa, CPI, camada plexiforme interna, CNI, camada nuclear interna, CFO,

camada de fibras ópticas. Barra de calibração = 20µm.

Em E10, a retina apresenta as CPI e CPE já formadas e os prolongamentos

de células amácrinas localizadas na CNI são visíveis, estendendo-se em direção à

CPI, onde arborizam horizontalmente junto com outros terminais (Coulombre, 1955).

Nesta idade, notamos células com marcação imunohistoquímica, localização e

morfologia bastante distintas. A Figura 12 B mostra células também fracamente

marcadas, apresentando corpo celular fusiforme ou oval, que se localizam em

diferentes posições na CNI. Em um maior aumento na Figura 12 C e D, observam-

se células que possuem o corpo celular localizado na porção mais interna da CNI,

mas também células com corpo celular localizado numa região mais distal da CNI,

uma a duas fileiras de corpos celulares acima do bordo interno da CNI.

Nesta idade observamos uma fraca marcação na CPE (Figura 12 B), sendo

mais freqüente a observação de finos prolongamentos celulares que se projetam em

direção a CPI como mostrado na Figura 12 D. Comparando-se às células DDC+ em

E8 (Figura 11 D) vemos em E10 (Figura 12 D) um aumento na imunorreatividade

para a DDC. No entanto, as imunorreatividades difusas visualizadas em E10 estão

menores qualitativamente, quando comparadas àquelas observadas em E8

(comparar Figuras 11 B e 12 B).

Figura 12 – Fotomicrografia de cortes transversais de retinas de galinha (E10)

contendo células imunorreativas a enzima DDC. Em A, controle, da reação

imunohistoquímica. Em B, células DDC+ marcadas na face interna da CNI (seta

preta) e células marcadas na porção mais externa da CNI (seta vermelha); Fraca

marcação foi observada na CPE (cabeça de seta). C mostra um maior aumento com

uma célula localizada na face interna da CNI (seta preta) e seu prolongamento (seta

branca). D mostra célula na face interna da CNI (seta preta) e seu prolongamento

(seta branca) e também célula na face externa da CNI (seta vermelha) enviando

prolongamento para a CPI (seta branca). CPE, camada plexiforme externa, CPI,

camada plexiforme interna, CNI, camada nuclear interna. Barra de

calibração=20µm.

Em E13 a retina apresenta todas as camadas já definidas; no entanto,

ocorrem ainda algumas modificações perceptíveis quanto à espessura das camadas

retinianas. As CPI e CPE tendem a se tornar mais espessas, indicando um

crescimento dos prolongamentos celulares que formam estas neurópilas. Inicia-se

também, nesta fase, a diferenciação dos segmentos externos dos fotorreceptores

(Coulombre, 1955). Nesta idade, o soma das células DDC+ apresenta-se

arredondado, oval ou fusiforme. Observamos corpos celulares localizados na

porção mais interna da CNI e também corpos celulares localizados na porção mais

externa desta camada, duas a três fileiras de células acima de seu bordo interno

como mostra a Figura 13 B, em maior aumento na Figura 13 C. Nesta idade

podemos notar uma fraca imunorreatividade na CPI, porém restrita a uma

subcamada, sugerindo um início de arborização dos prolongamentos destas células.

A marcação na CPE persiste sendo que sua intensidade parece aumentada quando

se compara a E10 (comparar as Figuras 12 B e 13 B).

Figura 13 – Fotomicrografia de cortes transversais de retinas de galinha (E13)

contendo células imunorreativas a enzima DDC. Em A, controle da reação

imunohistoquímica. Em B, células DDC+ marcadas na face interna da CNI (seta

preta), células na porção mais externa da CNI (setas vermelhas) e uma fraca

marcação na CPE (cabeça de seta). C mostra um maior aumento com células

localizadas na face interna da CNI (seta preta) e seus prolongamentos (seta branca)

a seta vermelha aponta uma célula mais distal na CNI. CPE, camada plexiforme

externa, CPI, camada plexiforme interna, CNI, camada nuclear interna, CCG,

camada de célula ganglionar. Barra de calibração = 20µm.

Nesta idade observamos ainda prolongamentos maiores e mais fortemente

marcados como mostra a Figura 14 A e B, estes se estendem em direção a CPI e

parecem mais desenvolvidos que em E10 (Figura 14 C), onde observamos células

DDC+ com um único prolongamento que sai do corpo celular em direção a CPI

(Figura 14 A). Outras células, embora mais raras, possuem uma ramificação lateral

em S 1 e outra que se estende em direção a subcamadas mais internas da CPI

como mostrado na Figura 14 B.

Figura 14 – Fotomicrografia de cortes transversais de retinas de galinha E13 (A e B),

e em E10 (C), contendo células imunorreativas a enzima DDC. Em A, uma célula

DDC+ (seta preta) enviando um único prolongamento em direção a CPI (seta

branca). Em B, uma célula DDC+ (seta preta) enviando dois prolongamentos, um no

plano lateral e outro em direção a subcamadas (S) mais internas da CPI (setas

brancas). C mostra uma célula DDC+ em E10 (seta preta) enviando um

prolongamento (seta branca). Barra de calibração = 20µm.

Em E13 já se encontra terminado o período de migração das células

amácrinas deslocadas, o que ocorre entre E5 e E9 (Prada et al., 1987), e a enzima

TH já está presente no tecido retiniano de acordo com Gardino e colaboradores

(1993). A Figura 15 mostra exemplos de células TH+ e DDC+ na retina de E13.

Quando comparamos a morfologia destas células notamos certa semelhança entre

elas, observamos células TH+ (Figura 15 A) e DDC+ (Figura 15 C) que emitem dois

prolongamentos, um no plano lateral da CPI e outro em direção a subcamadas mais

internas da CPI. E também são observadas células TH+ (Figura 15 B) e DDC+

(Figura 15 D) que emitem um único prolongamento em direção a CPI, o qual

aparentemente se ramifica em regiões mais profundas da CPI. A partir desta idade,

uma forte marcação imunohistoquímica foi observada tanto no corpo celular quanto

nos prolongamentos celulares, indicando um aumento nos níveis da enzima DDC, já

que todos os cortes de retina das diferentes idades analisadas neste estudo foram

colocadas sobre a mesma lâmina, o anticorpo foi utilizado na mesma diluição (1:200)

e o processamento foi simultâneo.

Figura 15 – Fotomicrografia de cortes transversais de retinas de galinha E13

contendo células imunorreativas a enzima DDC e a TH. Em A, uma célula TH+

enviando dois prolongamentos em direção a CPI (seta branca). Em B, uma célula

TH+ enviando um prolongamento em direção a CPI (seta branca). C mostra uma

célula DDC+ (seta preta) enviando dois prolongamentos (seta branca) e D mostra

duas células DDC+, a seta branca mostra um único prolongamento em direção a

CPI. Barra de calibração = 20µm.

Em E19 a retina já apresenta função visual, como revelado pelo início do

reflexo constrictor pupilar (Lindeman, 1947). A diferenciação de cones e bastonetes

se completa do 19º

dia embrionário ao 20º na região do fúndica e gradualmente se

espalha para a periferia da retina neural até dois dias após a eclosão (Coulombre

1955). Nesta idade, a morfologia e localização do corpo das células DDC+

apresentam as mesmas características básicas vista em E13. No entanto, o soma

apresenta-se mais oval em todas as células. Observamos marcação na CPE e uma

marcação difusa na CNE. Notamos corpos celulares em diferentes porções da CNI,

alguns se localizam na porção mais interna da CNI enquanto outros se localizam

duas ou três fileiras de células acima do bordo interno desta camada como mostra a

Figura 16 B e em maior aumento na Figura 16 C.

Figura 16 – Fotomicrografia de cortes transversais de retinas de embrião de galinha

em E19 contendo células imunorreativas a enzima DDC. Em A, controle da reação

imunohistoquímica. Em B, células DDC+ no bordo interno da CNI (seta preta) e

células DDC+ na face mais externa da CNI (setas vermelhas). Cabeça de seta

mostra marcação na CPE e a seta branca mostra uma marcação difusa na CNE.

Em C, um maior aumento mostrando células no bordo interno (seta preta) e também

células da face externa (seta vermelha) ambas enviando prolongamentos (setas

brancas). CNE, camada nuclear externa, CPE, camada plexiforme externa, CNI,

camada nuclear interna, CPI, camada plexiforme interna, CCG, camada de célula

ganglionar. Barra de calibração = 20µm.

Observamos que as células DDC+ que possuem o corpo celular na porção

interna da CNI enviam um prolongamento em direção a subcamadas mais internas

da CPI como mostra a Figura 16 C e também células que emitem dois

prolongamentos um lateral em direção a S1 e outro em direção a subcamadas mais

internas da CPI. Como mostrado na Figura 17 A, notamos também uma marcação

em três níveis da CPI. Estas células quando comparadas as células TH+ (Figura 17

B), possuem certa semelhança com relação à localização do corpo celular e níveis

de ramificação. De acordo com Gardino e colaboradores (1993), nesta idade as

células TH+ já apresentam o padrão de biestratificação nas subcamadas S1 e S4 da

CPI, como mostra a Figura 17 B. Nas células DDC+ que possuem o corpo numa

região mais externa da CNI notamos apenas um único prolongamento que sai do

soma em direção a CPI como mostra a Figura 16 C.

Quando comparamos a intensidade da reação imunohistoquímica entre

células DDC+ em E13 e E19, podemos notar que esta é maior no corpo e

prolongamentos em E19 (Figura 18 B), além do claro aumento de complexidade da

arborização destas células na CPI como mostra a Figura 18 B.

Figura 17 – Fotomicrografia de cortes transversais de retinas de embrião de galinha

em E19 contendo células imunorreativas as enzimas DDC e TH. Em A, células

DDC+ no bordo interno da CNI (seta preta) enviando um prolongamento lateral (seta

preta) e outro em direção a S4 (setas brancas), podemos notar marcação em três

níveis da CPI. Em B, uma célula TH+ (seta preta) enviando um prolongamento

lateral em S1 (seta branca) e outro em direção a S4 (seta branca). S1, subcamada 1

da CPI, S4 subcamada 4 da CPI. Barra de calibração = 20µm.

Figura 18 – Fotomicrografia de cortes transversais de retinas de embrião de galinha

em E13 e E19 contendo células imunorreativas a enzima DDC. Em A, célula DDC+

(E13) no bordo interno da CNI (seta preta) enviando um prolongamento (setas

brancas). Em B, uma célula DDC+ (seta preta) enviando dois prolongamentos.

Notar a diferença na intensidade da reação, a seta vermelha mostra uma célula

DDC+ com o corpo menor. Barra de calibração = 20µm.

A retina do animal em P7 já está totalmente diferenciada (Coulombre, 1955).

Por isso, o padrão morfológico definitivo para as células DDC+ pode ser melhor

descrito. A análise sistemática de retinas nesta idade mostrou que na retina de

galinha existem pelo menos duas subpopulações de células DDC+ como ilustrado

na Figura 19 B e, em maior aumento, na Figura 19 C e D. A primeira subpopulação,

que neste trabalho chamaremos de célula DDC+ do tipo 1, apresenta o corpo celular

fortemente marcado, arredondado, localizado na face interna da CNI, que enviam

seus prolongamentos para S1 e S4 da CPI (Figura 19 B e D). Observamos

também, células DDC + do tipo 1 que possuem o corpo celular menor e mais

fracamente imunorreativo como mostra a Figura 19 C. A segunda população de

células DDC +, que neste trabalho chamaremos de célula DDC+ do tipo 2, apresenta

o corpo celular oval ou alongado, fortemente imunorreativo, refletindo um alto nível

da enzima DDC no animal adulto como mostra a Figura 19 B e em maior aumento a

Figura 19 C. Além da marcação em S1 e S4, descrita anteriormente para as células

DDC do tipo 1, observamos também marcação no limite entre S2/S3, sugerindo que

as células DDC arborizam em pelo menos três níveis na CPI.

Figura 19 – Fotomicrografia de cortes transversais de retinas de galinha (P7)

contendo células imunorreativas a enzima DDC. Em A, controle da reação

imunohistoquímica. Em B, um exemplo de célula DDC+ tipo 1 (seta preta) e tipo 2

(seta vermelha). Notar forte marcação em S1, bordo de S2/S3 e S4 da CPI, e na

CNE. C, mostra células do tipo 1 fortemente marcadas (seta preta), seus

prolongamentos (seta branca) e células do tipo 1 com corpo menor e marcação

menos intensa (cabeça de seta vermelha). A seta vermelha aponta uma célula do

tipo 2. Em D, uma célula do tipo 1 (seta preta) enviando dois prolongamentos um

em direção a S1 e outro em S4 (setas brancas). Barra de calibração = 20µm.

Em P7, observamos células do tipo 2 com uma imunomarcação intensa em

seus prolongamentos e pudemos notar que estes por vezes se ramificam na CPI

como mostra a Figura 20 A e B. Comparadas às células DDC+ em E19, o perfil

destas células se mostrou bastante parecido. Na retina do animal adulto

observamos o mesmo perfil básico de marcação. Entretanto, podemos notar uma

intensidade de marcação mais forte no corpo celular e nos prolongamentos das

células DDC+ em P7 (comparar Figuras 20 C e D).

As células DDC+ do tipo 1, quando comparadas às TH+, continuam a

apresentar semelhança com relação à localização do corpo celular e aos níveis de

arborização na CPI. Células DDC+ do tipo 1 (Figura 21 B) possuem o corpo celular

localizado no bordo interno da CNI, assim como as TH+ (Figura 21 A), as quais

também enviam dois prolongamentos, um lateral em direção à subcamada S1 da

CPI e outro que arboriza em S4. Não foi possível evidenciar em qual subcamada da

CPI estas células do tipo 2 arborizam. Entretanto, três níveis de estratificação S1,

bordo de S2/S3 e S4 são também observados nesta idade (Figura 19 B). S1

corresponde à subcamada mais externa da CPI, na região limítrofe entre a CNI e

CPI e S4, mais internamente, corresponde à subcamada 4 de Cajal (1933). A

intensidade de marcação nestas subcamadas indica nitidamente que a arborização

das células DDC+ aumenta em área e complexidade com o desenvolvimento do

tecido. Nesta idade continuamos a notar fraca marcação na CPE mas uma forte

imunorreatividade na CNE, o que possivelmente indica a presença da enzima DDC

nestas camadas.

Figura 20 – Fotomicrografia de cortes transversais de retinas de galinha em P7 e

E19 contendo células imunorreativas a enzima DDC. Em A, exemplo de células

DDC+ do tipo 2 (seta vermelha) e vários prolongamentos na CPI (setas brancas).

Em B, célula do tipo 2 (seta vermelha) enviando prolongamentos que podem se

ramificar (seta branca). C, mostra células do tipo 1 (seta preta) e do tipo 2 (seta

vermelha) em E19. Em D, células dos tipos 1 (seta preta) e 2 (seta vermelha) em

P7. Seta branca mostra um prolongamento fortemente imunorreativo. Barra de

calibração = 20µm.

Figura 21 – Fotomicrografia de cortes transversais de retinas de galinha em P7

contendo células imunorreativas as enzimas DDC e TH. Em A, Célula TH+ do tipo 1

(seta preta) enviando prolongamentos para S1 e S4 (setas brancas). Em B, célula

DDC+ do tipo 1 (seta preta) enviando prolongamentos em direção a S1 e S4 na CPI

(setas brancas) Barra de calibração = 20µm.

Podemos afirmar que na retina de galinha a enzima DDC é expressa em

fases iniciais do desenvolvimento (E8), anterior a expressão da enzima TH, que se

inicia por volta de E12. Duas subpopulações de células DDC+ são encontradas na

retina de galinha, a primeira, DDC+ do tipo 1, se assemelha em localização do corpo

e níveis de arborização às células amácrinas biestratificadas em S1 e S4 descritas

por Gardino e colaboradores (1993) e Dos Santos e colaboradores (1998), enquanto

as células DDC+ do tipo 2 possuem localização do corpo e níveis de arborização

distintos das do tipo 1. Considerando que o corpo destas células se localizam uma a

duas fileiras de células acima do bordo interno da CNI, estas se encontram na

camada de células amácrinas de acordo com Cajal e, portanto, podemos

caracterizar este tipo como sendo um subtipo de célula amácrina DDC+ na retina de

galinha.

4.2 Colocalização das enzimas TH e DDC

Tendo-se observado que as células DDC+ do tipo 1 se assemelham às

células TH+ na retina de galinha, a próxima etapa foi verificar se células que

possuem a enzima TH eram também positivas para a DDC. Realizamos

experimentos de dupla marcação para as enzimas TH e DDC, em cortes radiais de

retinas de diferentes idades embrionárias e em animais após a eclosão.

A análise sistemática dos cortes de retinas de E10 (Figura 22 B) mostra o

padrão de marcação para DDC em corpos de células localizadas no bordo interno da

CNI. A imunomarcação para TH foi ausente nesta idade, como mostra a Figura 22

A. Este dado corrobora os achados de Gardino e colaboradores (1993), mostrando

que a TH na retina desta espécie surge em E12.

Em retinas de E13, idade na qual a enzima TH já está presente na retina,

notamos que existem células que somente possuem a enzima DDC (Figura 22 D).

Estas células não mostraram imunomarcação para TH, como pode ser observado na

Figura 22 C. Nesta mesma idade observamos células que possuem a enzima TH

(Figura 22 F) e a mesma célula possui marcação para a DDC como ilustrado na

Figura 22 G.

Figura 22 – Fotomicrografias de cortes transversais de retinas de embrião de galinha

em E10 e E13 contendo células imunorreativas as enzimas DDC e TH. Em A, retina

de E10 mostrando que não existe imunomarcação para TH. Em B, exemplo de

células DDC+ na CNI (seta branca) em E10. Em C, retina E13 imunorreagida para

TH, onde não se observa célula marcada, D mostra o mesmo campo que em C,

onde observamos uma célula DDC+ (seta branca). E, mostra dupla marcação para

TH e DDC (seta branca). Em F, um exemplo de célula TH+ (seta branca), e em G a

mesma célula possui marcação para DDC (seta branca). Em H, sobreposição das

imagens (amarelo). Barra de calibração = 20µm.

Em retinas de animais em estágios mais avançados do desenvolvimento

como E19 e P7, o perfil de marcação para TH e DDC apresentou as mesmas

características básicas observadas em E13. Em E19 podemos observar células

onde as duas enzimas, TH e DDC, colocalizam (Figura 23 A, C e E). E células que

somente possuem a enzima DDC como mostra a Figura 23 C e E. Em retinas de

P7, onde o perfil das células DDC+ já se encontra num padrão definitivo, notamos

que onde há colocalização de TH e DDC o corpo celular fica localizado na face

interna da CNI, sendo emitidos dois prolongamentos, um lateral em direção a S1 e

outro mais profundo em direção a S4 da CPI, como pode ser visto comparando as

Figuras 23 B, D e F.

Nesta idade observamos células que somente contém a enzima DDC, não

possuindo a enzima TH Figura 23 B e D. Estas células possuem o corpo celular

localizado numa região mais externa da CNI, não tendo sido possível observar a

emissão de prolongamentos. Aparentemente este tipo celular se encontra em

número maior quando comparados às células duplamente marcadas.

Figura 23 – Fotomicrografias de cortes transversais de retinas de galinha em E19 e

P7 contendo células imunorreativas as enzimas DDC e TH. Em A, retina de E19

mostrando uma célula TH+ (seta Larga). Em C, esta mesma célula apresenta

imunomarcação para DDC (seta larga). Observamos também uma célula que

somente possui a enzima DDC (seta fina). E, mostra a sobreposição de imagem

(amarelo). Em B, retina de P7 com exemplo de duas células TH+ (seta larga). Em

D, mesmo campo mostrando as células em B são também DDC+ (seta larga) e

notamos células que contém somente a enzima DDC (seta fina). F, mostra a

sobreposição de imagem (amarelo). Barra de calibração = 20µm.

4.3 Análise quantitativa

Utilizamos preparações planas para análise da densidade e distribuição

topográfica das células DDC e TH positivas. Em retinas de E8 a imunomarcação

para DDC não foi satisfatória nas montagens planas, o que prejudicaria a

quantificação e análise das células positivas. Decidiu-se por iniciar estas análises

utilizando retinas de E10, pois nesta idade a imunomarcação foi satisfatória e nos

permitiu uma análise confiável.

Dados do número de campos contados, área amostral total, porcentagem da

área da retina que foi quantificada e densidade média de três retinas de animais

diferentes de cada idade estudada, são mostrados na Tabela 3 para DDC e Tabela 4

para TH. Os valores são expressos como média ± erro padrão da média.

Idade N

de campos

contados

Área amostral

total em mm

% da retina

que foi

quantificada

Densidade

média

(células/mm

)

E10 84 ± 2,3 0,770 ± 0,02 0,853 ± 0,02 1445 ±47

E13 130 ± 2,3 1,197 ± 0,02 0,91 ± 0,05 720 ± 36

E19 108 ± 6,9 0,99 ± 0,06 0,953 ± 0,10 475 ± 12

P7 126 ± 10 1,158 ± 0,10 0,836 ± 0,01 222 ± 3

Tabela 3 – Análise quantitativa das células DDC+ ao longo do desenvolvimento.

Cada valor representa a média ± SEM de três retinas de animais diferentes.

Idade Nº de campos

contados

Área amostral

total em mm

% da retina

que foi

quantificada

Densidade

média

(células/mm

)

E13 140 ± 0,66 8,4 ± 0,04 5,36 ± 0,12 55 ± 6

E19 106 ± 7,6 6,36 ± 0,45 6,67 ± 0,33 35 ± 2

P7 103 ± 9,8 6,22 ± 0,58 5,80 ± 0,05 26± 2

Tabela 4 – Análise quantitativa das células TH+ ao longo do desenvolvimento. Cada

valor representa a média ± SEM de três retinas de animais diferentes.

A análise de densidade de células DDC+ mostrou que em retinas de E10 há

uma densidade média de 1445 ± 47 células/mm

como mostra a Figura 24 e a

Tabela 3. Em retinas de E13, a densidade média observada para DDC foi de 720 ±

36 células/ mm

, que corresponde a uma diminuição de 50,17% quando comparada

a E10 (Tabela 3). A análise da densidade média das células TH+ mostrou que em

E13 a densidade encontrada foi de 55 ± 6 células/ mm

como mostra a Figura 25 e

Tabela 4. A TH em E 13 possui uma densidade média bem menor quando

comparada a DDC como pode ser observado comparado-se as Figuras 24 e 25 e as

Tabelas 3 e 4. Retinas de E19, apresentam uma densidade média de células DDC+

de 475 ± 12 células/mm

(Figura 24 e Tabela 3), indicando uma diminuição de 34%

na densidade das células DDC+ em relação a E13. A Figura 25 mostra a densidade

média das células TH+ em E19, que é de 35 ± 2 células/mm

, sendo que este valor

corresponde a uma diminuição de 35,8% na densidade em relação a E13. Pudemos

constatar que as retinas de animais adultos (P7) mostraram uma densidade média

de 222 ± 3 células DDC+/ mm

(Figura 24 e tabela 3), o que indica uma diminuição

de 53,3% em relação à densidade de células DDC+ em E19. A densidade média

para a enzima TH em retinas de P7 foi de 26,25 ± 1,67 células/ mm

, como mostram

a Figura 25 e a Tabela 4, indicando que em relação a E19 houve uma diminuição de

26,25%.

Podemos afirmar, com base nestes resultados, que a enzima DDC possui

uma densidade média alta em animais jovens (E10) e esta densidade diminui

durante o desenvolvimento da retina. A enzima TH possui uma densidade média

muito menor quando comparada a DDC; porém, assim como foi observado para

DDC, a densidade da TH também diminui durante o desenvolvimento da retina,

conforme os dados de Gardino e colaboradores (1993).

E10

E13

E19

500

1000

1500

Densidade (n

de células/mm

Figura 24 – Densidade de células DDC positivas durante o desenvolvimento. Os

valores são expressos como média ± SEM de três retinas de cada idade analisada.

** p< 0,001

E19

Densidade (n

de células/mm

)

Figura 25 – Densidade de células TH positivas durante o desenvolvimento. Os

valores são expressos como média ± SEM de três retinas de cada idade analisada.

* p< 0,01 e ** p< 0,001.

4.4 Distribuição topográfica

A análise dos mapas de distribuição topográfica em retinas de E10 mostrou

que as células DDC+ possuem uma distribuição homogênea por toda a retina

(Figura 26).

Figura 26 – Mapa de densidade e distribuição topográfica de células imunorreativas

a enzima DDC em retina de galinha (E10). Cada ponto no mapa representa o local

onde as células positivas foram contadas e os números correspondem a densidade

de células positivas/mm

. No detalhe mesma retina com escala logarítmica de

círculos onde 0-10 10-100 100-1000 1000-10000 células/mm

. P= Pécten,

V= ventral, D= Dorsal. Barra de calibração = 1mm.

Em retinas de E13 a distribuição topográfica das células DDC+ permanece

homogênea como mostra a Figura 27, mesmo tendo ocorrido um crescimento na

área da retina promovido pelo espessamento das CPI e CPE.

Figura 27 – Mapa de densidade e distribuição topográfica de células imunorreativas

a enzima DDC em retina de galinha (E13). Cada ponto no mapa representa o local

onde as células positivas foram contadas e os números correspondem a densidade

de células positivas/mm

. No detalhe mesma retina com escala logarítmica de

círculos onde 0-10 10-100 100-1000 1000-10000 células/mm

. P= Pécten,

V= ventral, D= Dorsal. Barra de calibração = 1mm.

Em E13 a TH já esta presente no tecido. Assim, a análise de distribuição

topográfica das células TH+ mostrou uma distribuição de células preferencialmente

na porção superior da retina (Figura 28). Estes dados estão de acordo com os

achados de Gardino e colaboradores (1993) que descreveram nesta fase uma

predominância de células TH+ na porção superior da retina.

Figura 28 – Mapa de densidade e distribuição topográfica de células imunorreativas

a enzima TH em retina de galinha (E13). Cada ponto no mapa representa o local

onde as células positivas foram contadas e os números correspondem a densidade

de células positivas/mm

. No detalhe mesma retina com escala logarítmica de

círculos onde 0-10 10-100 100-1000 1000-10000 células/mm

. P= Pécten,

V= ventral, D= Dorsal. Barra de calibração = 1mm.

Retinas de animais em estágios mais avançados do desenvolvimento como

em E19 e P7, mostraram o mesmo padrão de distribuição topográfica das células

DDC+ observado em idades mais precoces (E10 e E13). A Figura 29 ilustra o

padrão de distribuição topográfica em retinas E19. As células DDC+ permanecem

homogeneamente distribuídas pelo tecido. A distribuição topográfica das células

TH+ nesta idade já apresenta um padrão homogêneo (Figura 30).

Figura 29 – Mapa de densidade e distribuição topográfica de células imunorreativas

a enzima DDC em retina de galinha (E19). Cada ponto no mapa representa o local

onde as células positivas foram contadas e os números correspondem a densidade

de células positivas/mm

. No detalhe mesma retina com escala logarítmica de

círculos onde 0-10 10-100 100-1000 1000-10000 células/mm

. P= Pécten,

V= ventral, D= Dorsal. Barra de calibração = 1mm.

Figura 30 – Mapa de densidade e distribuição topográfica de células imunorreativas

a enzima TH em retina de galinha (E19). Cada ponto no mapa representa o local

onde as células positivas foram contadas e os números correspondem a densidade

de células positivas/mm

. No detalhe mesma retina com escala logarítmica de

círculos onde 0-10 10-100 100-1000 1000-10000 células/mm

. P= Pécten,

V= ventral, D= Dorsal. Barra de calibração = 1mm.

No animal (P7), o padrão de distribuição das células DDC+ permanece

homogêneo (Figura 31). Alguns campos amostrais apresentaram contagem zero.

Estes se mostraram aleatórios na área da retina, não possuindo uma região

preferencial. A distribuição topográfica das células TH+ na retina madura apresenta

o mesmo perfil daquele descrito em E19, como mostra a Figura 32, onde podemos

notar ainda, assim como visto para DDC em P7, a presença de alguns campos

aleatórios com contagem zero.

Figura 31 – Mapa de densidade e distribuição topográfica de células imunorreativas

a enzima DDC em retina de galinha (P7). Cada ponto no mapa representa o local

onde as células positivas foram contadas e os números correspondem a densidade

de células positivas/mm

. No detalhe mesma retina com escala logarítmica de

círculos onde 0-10 10-100 100-1000 1000-10000 células/mm

. P= Pécten,

V= ventral, D= Dorsal. Barra de calibração = 1mm.

Figura 32 – Mapa de densidade e distribuição topográfica de células imunorreativas

a enzima TH em retina de galinha (P7). Cada ponto no mapa representa o local

onde as células positivas foram contadas e os números correspondem a densidade

de células positivas/mm

. No detalhe mesma retina com escala logarítmica de

círculos onde 0-10 10-100 100-1000 1000-10000 células/mm

. P= Pécten,

V= ventral, D= Dorsal. Barra de calibração = 1mm.

4.5 Presença da enzima DDC em outras espécies

O sistema dopaminérgico é bastante conservado entre diferentes espécies

animais. Nossos resultados mostraram que a densidade da enzima DDC na retina

de galinha é muito maior quando comparada a TH, mesmo no animal adulto. Deste

modo, decidimos verificar a expressão da enzima DDC e comparar com a da TH, em

diferentes espécies animais.

Utilizamos cortes radiais de duas retinas de um macaco (Cebus apella), duas

retinas de um gambá (Didelphis aurita) e quatro retinas de dois ratos pigmentados

adultos (Rattus norvegicus). A análise qualitativa de retinas de macaco mostrou

marcação para enzima TH em corpos celulares localizados na CNI. Entretanto,

também notamos marcação nas CPE, CPI e CCG (Figura 33 A). Estes dados estão

de acordo com os dados de Guimarães e Hokoç (1997). A imunomarcacão para

DDC neste animal mostrou uma marcação em corpos celulares na CNI e CCG, bem

como nas CPE e CPI, sendo que para esta enzima a marcação parece mais intensa

(comparar as Figuras 33 A e B). Na retina de gambá observamos marcação para

TH em corpos celulares localizados na CNI e uma marcação na S1 da CPI (Figura

33 C). Para a DDC, notamos um número maior de corpos celulares marcados na

CNI quando comparado a TH e também uma marcação mais intensa na CFO como

pode ser observado na Figura 33 D. Em retinas de ratos notamos células TH+ na

CNI e prolongamentos marcados em S1 (Figura 33 E). Para DDC notamos um

número aparentemente maior de células marcadas na CNI e também na CCG

(Figura 33 F).

Figura 33 – Fotomicrografias de cortes transversais de retinas de diferentes espécies

de animais adultos contendo células imunorreativas as enzimas DDC e TH. Em A,

retina de macaco mostrando células TH+ na CNI (seta preta) notar também

marcação nas CPI, CPE e CCG; em B, marcação para DDC em células na CNI (seta

preta) no mesmo animal. Em C, retinas de gambá com células TH+ na CNI (seta

preta) e marcação em S1. Em D, imunomarcação para DDC mostrando várias

células marcadas na CNI e também marcação na CCG no mesm0o animal. Em E,

retina de rato com um exemplo de célula TH+ (seta preta) e marcação em S1. F,

mostra várias células DDC+ na CNI e também na CCG (setas pretas) em rato. Barra

de calibração = 20µm.

Com base nestes dados preliminares, podemos sugerir que assim como

observado em galinha, retinas de mamíferos e primatas possuem um número maior

de células DDC+ quando comparada ao número de células TH+, sugerindo um certo

grau de conservação do padrão DDC entre as espécies. No entanto, se faz

necessário uma análise sistemática e quantitativa para que esta sugestão possa ser

confirmada.

5 DISCUSSÃO

Os resultados apresentados neste trabalho mostram por imunohistoquímica

na retina de galinha, que a enzima DDC é detectada em fases iniciais do

desenvolvimento (E8), anterior à expressão da enzima TH que nesta espécie surge

em torno de E12 (Gardino et al., 1993). Duas subpopulações de células DDC+

foram encontradas na retina de galinha. A primeira possui o corpo celular

fortemente imunorreativo, arredondado e localizado no bordo interno da CNI e

enviam prolongamentos para a CPI. Estas células foram denominadas neste

trabalho, de células DDC+ do tipo 1. A segunda população, denominada neste

trabalho de célula DDC+ do tipo 2, possui a localização do corpo distintos das do

tipo 1. As células DDC+ do tipo 2 possuem o corpo celular localizado no centro da

CNI, em geral duas a três fileiras de células acima do bordo interno desta camada.

De acordo com a descrição de Cajal (1933), podemos classificar estas duas

populações de células DDC como subtipos de células amácrinas na retina de

galinha. A partir de E13 o soma das células DDC+ adquire um padrão de

localização definitivo, como verificado no animal adulto, sendo que a intensidade da

reação imunohistoquímica no corpo e prolongamentos destas células aumenta com

o desenvolvimento do tecido. Em retinas de animais P7, onde o padrão definitivo

das células DDC+ foi descrito, observamos células DDC+ do tipo 1 que possuem o

corpo celular menor e mais fracamente imunorreativos que as outras. Nesta idade,

Dos Santos e colaboradores (1998) descreveram uma segunda população de

células TH+ que já se encontra presente na retina. Este tipo de célula TH+ possui o

corpo celular localizado no bordo interno da CNI e difere das células amácrinas

biestratificadas em S1 e S4 descritas por Gardino e colaboradores (1993) por

possuírem o corpo celular menor e mais fracamente imunorreativo. A célula DDC+

do tipo 1 pode corresponder às células descritas por Dos Santos e colaboradores

(1998) como as células amácrinas TH+ do tipo 2.

No animal adulto notamos imunorreatividade na CNE. Esta camada contém

dois principais tipos celulares: os cones e os bastonetes, que diferem na morfologia

de seus segmentos externos. Além disso, a diferenciação bioquímica de

fotorreceptores tem sido extensivamente estudada. Estas células contêm

pigmentos, como o cromóforo retinaldeído, e são as principais células sensíveis à luz

da retina. A retina de galinha contém um tipo de bastonete e quatro tipos de cones;

cada um deles é caracterizado por conter uma opsina com diferente absorbância

espectral (Mey e Thanos, 2000 Para revisão). Bruhn e Cepko (1996) mostraram na

retina de galinha diferenças regionais na distribuição de cones que possuem opsinas

sensíveis aos comprimentos de onda na faixa do vermelho, verde, azul, ultra-violeta

e também rodopsina, que é específica de bastonetes. A análise utilizada neste

trabalho não nos permitiu diferenciar cones de bastonetes. Para tal, seria

necessária a realização de experimentos utilizando as técnicas de microscopia

eletrônica que nos permitiria identificar este tipo celular com base na morfologia de

seus segmentos externos ou também de experimentos de dupla marcação para a

enzima DDC e diferentes opsinas. Em retina de aves encontra-se um número maior

de cones que bastonetes e é possível que seja este tipo celular na retina de galinha

que contenha a enzima DDC. O fato é que em outras espécies a presença da DDC

foi também detectada em camadas mais externas. Encontramos na literatura que

em retina de peixe zebra (zebrafish), a DDC está presente em fotorreceptores,

células interplexiformes e também em células horizontais (Page-McCaw et al., 2004).

Em retinas de ratos albinos, a DDC está presente em células amácrinas e também

no segmento interno de fotorreceptores (Nguyen-Legros et al., 1994). Nossas

100

análises qualitativas, feitas em retinas de diferentes espécies de mamíferos adultos,

mostraram uma densidade maior de células DDC+ comparadas ao número de

células TH+, pelo menos em retinas de gambá e ratos pigmentados, assim como

visto neste trabalho em galinha. Isto sugere um certo grau de conservação deste

sistema entre as espécies estudadas.

Uma possível função para a presença da DDC observada por nós na CNE

seria que esta enzima, presente nos segmentos internos dos fotorreceptores,

poderia participar da via de síntese de melatonina e, deste modo, regular a

sensibilidade visual, como foi proposto para outras espécies (Nguyen-Legros et al.,

1994; Page-McCaw et al, 2004). Assim, é possível que na retina os fotorreceptores

e a enzima DDC participe da via de síntese da melatonina (Iuvone et al., 2005). A

melatonina é um neurohormônio produzido pela glândula pineal em vários

vertebrados e uma de suas principais funções é regular o sono; ela é liberada de

maneira circadiana, tendo seus níveis elevados à noite e diminuídos durante o dia

(Iuvone et al., 2005). Entretanto, a marcação de DDC observada por nós não se

restringe ao segmento interno, mas parece estar distribuída por todo o fotorreceptor.

Outra possibilidade baseia-se nos achados de Kubrusly e colaboradores

(2003), que levantaram a hipótese de que a L-dopa produzida no epitélio

pigmentado se difunda para a retina e na CNE a DDC presente nos fotorreceptores

produza DA, que se difundiria para a retina neural.

Até o momento não existe relato na literatura que descreva sistematicamente

a localização e morfologia de células DDC+ na retina de galinha sendo o nosso, o

primeiro trabalho a caracterizar este tipo celular nesta espécie.

Nossos dados de dupla marcação para TH e DDC mostraram claramente que

das duas subpopulações de células DDC+ presentes na retina de galinha, as células

101

DDC+ do tipo 1, que se apresentaram duplamente imunorreativas, correspondem às

células amácrinas biestratificadas em S1 e S4, conforme caracterizadas no trabalho

de Gardino e colaboradores (1993); enquanto as células que somente possuem a

enzima DDC, cujo soma fica localizado na face mais externa da CNI, correspondem

as células DDC+ do tipo 2, descritas neste trabalho. O fato da retina de galinha

possuir células que contenham somente a enzima DDC, poderia sugerir a existência

de um sistema independente que suportaria a hipótese que L-dopa difundida do

epitélio pigmentado, possa formar DA também em regiões mais internas do tecido.

A existência de um sistema independente de formação de DA por uma via

distinta da via clássica não nos parece tão fantasiosa, uma vez que nas idades

embrionárias precoces, antes da presença da TH na retina de aves (E12) (Gardino

et al., 1993), vários componentes do sistema dopaminérgico já estão presentes na

retina de galinha. Por exemplo, os receptores D1 expressam-se muito cedo, por

volta de E7, como foi demonstrado pelo aumento nos níveis intracelulares de AMPc

e também pela detecção de radioligantes específicos (De Mello,1978 e De Mello et

al.,1982). Ainda em E7 os receptores dopaminérgicos do tipo D1 já se encontram

em atividade (De Mello,1978), assim como o sistema de captação de DA (E9) (Kato

et al.,1984). Além disso, o DAT já se encontra presente em retinas de E6 e a

quantidade de proteína permanece constante até a maturidade do tecido (Kubrusly

et al., 2003). Além do mais Kubrusly e colaboradores (2003) mostraram que em

cultura de células retinianas a adição de L-Dopa, um precursor da DA, torna estas

células capazes de produzir DA e induzir o aumento nos níveis intracelulares de

AMPc, atuando certamente em receptores do tipo D1. Dessa forma, parece possível

que a enzima DDC presente no tecido retiniano conforme mostrado no presente

trabalho seja capaz de formar DA, desde que se forneça a L-dopa ao tecido. No

102

ambiente natural do tecido, L-dopa pode ser produzida a partir da enzima tirosinase

presente no epitélio pigmentado. De fato, em E8 a enzima DDC já está sendo

expressa na região externa da retina, próxima ao epitélio pigmentado e Kubrusly e

colaboradores (2003) mostraram que pode ocorrer formação de L-dopa na retina de

galinha, numa reação catalisada pela enzima tirosinase presente no epitélio

pigmentado. Nesse caso, propôs-se que L-dopa se difundiria para a retina e

formaria DA nas fases iniciais do desenvolvimento da retina, quando TH ainda não

está presente.

Os resultados apresentados neste trabalho favorecem a idéia de que as

células DDC+ presentes na retina de galinha poderiam converter a L-dopa

proveniente do epitélio pigmentado em DA, isto em fases iniciais do

desenvolvimento, ou seja, anterior à expressão da TH. Recentemente foi

demonstrado que a DDC é expressa na camada neuroblástica e na CNI em retinas

de ratos recém nascidos, sugerindo que progenitores neuronais ou células pós

mitóticas poderiam produzir e potencialmente secretar DA proveniente de L-dopa

(Kralj-Hans et al., 2006). Nestes animais ainda não existem relatos de que esta via

de síntese de DA independente da TH esteja presente em estágios mais imaturos

como em galinha. Em ratos, a imunorreatividade para TH foi primeiro detectada em

retinas de P3 (Mitrofanis et al., 1988.; Nguyen-Legros et al., 1994). Wu e Cepko

(1993), utilizando um método modificado de marcação, obtiveram marcação para TH

em retinas de E19. Neste trabalho, a análise qualitativa feita em retinas de ratos

pigmentados adultos, demonstrou a existência de um número maior de células

DDC+, quando comparadas ao número de células TH+, sugerindo um certo grau de

conservação deste sistema entre as espécies. De acordo com nossos dados, as

células DDC+ na retina de galinha surgem quatro a cinco dias anteriormente às

103

células TH+. Parece provável que em retinas de ratos esta via também possa estar

presente em estágios embrionários.

Tomados em conjunto, esses dados sugerem duas possíveis fontes de DA

durante o desenvolvimento da retina. Uma de células amácrinas que expressam

ambas as enzimas TH e DDC e a outra proveniente de uma segunda população de

células que expressa somente a DDC desde fases iniciais do desenvolvimento. No

entanto, o maior número de células DDC+ mesmo em animais adultos, sugere que

alternativamente possa haver produção de DA no tecido maduro ou possa fazer

parte de uma outra via neuroquímica.

A enzima DDC é também conhecida como descarboxilase de aminoácidos

aromáticos, podendo, desta forma, descarboxilar a serotonina. Células

serotoninérgicas foram identificadas na retina de galinha durante a sinaptogênese

(E12) e no desenvolvimento pós-natal. Estas são células amácrinas que enviam

dois prolongamentos em direção a CPI, um em S1 e outro em direção a S4 e S5

(Rios et al., 1997; Fosser et al., 2005). Vários autores sugerem que neurônios

retinianos participam da via que controla o crescimento do olho, sendo

especificamente sugerido que a falta de foco possa alterar o processamento das

células amácrinas, levando estas a secretar fatores que alteram o crescimento do

olho (Feldkaemper et al., 1999; Goss e wickham, 1995). Um dos

neurotransmissores que é encontrado em células amácrinas é a serotonina (5-

hidroxitriptamina, 5-HT) (Vaney, 1986.; Millar et al., 1988.; Pourcho, 1996.; Rios et

al., 1997). Entretanto, existe pouca informação sobre o efeito da serotonina sobre o

crescimento do olho e miopia. A serotonina tem um papel modulatório e pode

interagir com outros sistemas de neurotransmissores, como por exemplo, o sistema

dopaminérgico. George e colaboradores (2005) mostraram que o bloqueio de

104

receptores de serotonina diminui a expansão da câmara vítrea associada com a

miopia promovida pelo uso de lentes. O número de células positivas para serotonina

está aumentado neste modelo de retina de galinhas míopes. Isto sugere que

manipulações no sistema serotoninérgico podem alterar o processo de crescimento

do olho, no entanto o papel definitivo deste transmissor neste processo permanece

desconhecido.

Em um outro trabalho, Fosser e colaboradores (2005) mostraram que a

serotonina está envolvida no refinamento da informação visual, pois em retinas de

galinhas que foram adaptadas ao escuro (luz vermelha), ocorre uma alteração na via

de estratificação destas células. Neste caso, a poda na árvore dendrítica mostrou-se

alterada e também observou-se um aumento na concentração de serotonina em

animais adaptados ao escuro. No nosso trabalho não foi nosso objetivo verificar se

as células DDC + são também 5-HT+. Para tanto, seria necessária a realização de

experimentos de dupla marcação para DDC e 5-HT. Entretanto, não descartamos a

possibilidade de que estas células participem da via da serotonina, considerando o

papel e a presença deste neurotransmissor retina de galinha.

Distribuição topográfica e densidade das células DDC+ e TH+

A análise da distribuição topográfica das células TH+ e DDC+ mostrou que a

enzima DDC possui uma distribuição homogênea por toda a retina desde as fases

precoces do desenvolvimento, como visto em E10. A área amostral utilizada para

quantificação das células DDC+ foi de 0,0092mm

e nas três retinas analisadas a

porcentagem da retina quantificada esteve em cerca de menos de 1% da área total

da retina em todas as idades. Devido ao grande número de células positivas por

área amostral, foi necessário o uso de uma lente objetiva de grande aumento

(100X), o que nos permitiu uma análise bastante confiável com relação ao número

105

de células, embora tenha contribuído para uma diminuição na área amostral total

quantificada por retina. O padrão de distribuição homogêneo observado para DDC

em E10, permaneceu no tecido até a maturidade. A enzima TH em E13 possui um

padrão de distribuição preferencial na região superior da retina, estes dados estão

de acordo com o trabalho de Gardino e colaboradores (1993). Em E19 a distribuição

destas células se tornou homogênea pelo tecido, e este padrão se manteve na retina

do animal adulto, como foi observado em P7. A área amostral utilizada para

quantificação das células TH+ foi de 0,060mm

e nas três retinas analisadas a

porcentagem da retina quantificada foi de aproximadamente 6%, relativamente à

enzima DDC, esta corresponde a uma porcentagem maior da retina foi quantificada,

isto porque utilizamos uma lente objetiva com aumento de 40X, o que gerou uma

área amostral maior.

A retina acompanha o crescimento do olho do animal, este crescimento é

promovido pela adição de células à camada neuroblástica nas fases iniciais do

desenvolvimento e também pelo aumento da espessura das CPI e CPE em fases

mais tardias (Coulombre, 1955). O padrão de distribuição homogêneo observado

para as células DDC+ e TH+ acompanhado pela redução da densidade pode ser

atribuído ao fato das células estarem acompanhando o crescimento da retina.

As células que contém a enzima DDC possuem uma densidade média alta

em animais jovens (E10). Esta densidade diminui durante o avanço do

desenvolvimento da retina. As células que contém a enzima TH possuem uma

densidade média muito menor quando comparada à de células DDC. Assim, como

foi observado para DDC, a densidade da TH também diminui com o

desenvolvimento da retina. Nguyen-Legros e colaboradores (1994), analisando

retinas de ratos albinos em montagens planas, não observaram diferença entre as

106

densidades de células TH+ e DDC+, além do que, para estes autores, todas as

células TH+ são também DDC+. Ou seja, nesta espécie não existem células DDC+

que não possuam a enzima TH, de acordo com os autores. Em nossa análise de

retinas de ratos pigmentados, notamos um número maior de células DDC+

comparadas as TH+, como foi observado em galinha. Seria interessante verificar a

densidade das células DDC+ e TH+ nesta espécie de mamífero. No entanto, estas

divergências também podem ser devidas ao uso de anticorpos de diferentes

procedências.

A densidade média das células DDC+ diminuiu em torno de 50% de E10 para

E13; 34% de E13 para E19, e 53% de E19 para P7. A densidade média das células

TH+ também diminui durante o desenvolvimento; de E13 para E19 a densidade

diminui em torno de 35%; de E19 para P7 a densidade diminui em torno de 26%.

Alguns mecanismos podem ser responsáveis por esta diminuição: o primeiro seria a

morte celular natural que ocorre na retina em momentos definidos. Em retinas de

galinha o fenômeno de morte celular natural das células ganglionares ocorre entre o

8º e o 17º dia, sendo que o pico de maior densidade de núcleos picnóticos encontra-

se entre E11 e E15 (Hughes e Mcloon, 1979.; Straznicky e Chehade, 1987). Na

CNI, núcleos picnóticos são observados em E8, sendo que o pico de maior

densidade destes núcleos encontra-se em E11 (Cook et al., 1998.; Vecino et al.,

2004). Podemos especular, então, que a morte natural na CNI possa reduzir o

número de células amácrinas em geral e conseqüentemente o das células DDC+,

apenas nos períodos entre E10 e E13.

A segunda hipótese seria que o próprio crescimento de área da retina, que

como mencionado anteriormente, poderia contribuir, ao menos em parte, para a

107

diminuição na densidade das células TH e DDC positivas observadas ao longo do

desenvolvimento.

Uma terceira explicação seria que algumas células estariam deixando de

expressar a enzima DDC durante o desenvolvimento da retina e iniciariam a

expressão de outras substâncias no citoplasma. Como se sabe, muitos aspectos da

diferenciação neuronal são controlados por um plano central de desenvolvimento e

que durante o mesmo vários fatores intrínsecos, tais como o programa genético da

célula, a interação célula-célula, bem como fatores extrínsecos são conhecidos por

promover a diferenciação celular. Moléculas sinalizadoras são assimetricamente

distribuídas pela retina em estágios precoces do desenvolvimento, e por isso são

capazes de gerar diferentes condições no microambiente de progenitores que

ocupam diferentes posições no tecido (Adler, 2000, para revisão).

Embora células que já estejam comprometidas com um fenótipo especifico

necessitem de sinais indutivos adicionais para desenvolver seu fenótipo maduro, a

falta destes sinais poderiam levar a uma diminuição na densidade de células DDC+

e TH+, ou então, este sinal poderia estar diminuindo a sobrevivência ou aumentado

a morte destas células especificamente (Adler, 2000, para revisão). De fato, na

retina de galinha, durante o desenvolvimento, existe uma correlação temporal e

espacial entre a síntese de AMPc e o aparecimento das células dopaminérgicas (De

Mello, 1978 e De Mello e De Mello, 1985). O sistema enzimático da adenil ciclase-

sensível à DA já está presente na retina em E7 e, nesta idade a adição de DA a

retinas de galinha promove um aumento nos níveis intracelulares de AMPc atingindo

um valor máximo em E8 e mantido até a maturidade do tecido (De Mello, 1978). O

fato de que a DA promove um aumento nos níveis intracelulares de AMPc antes da

formação de sinapses na CPI na retina de galinha (E12), indica que o efeito desta

108

amina sobre o receptor não é mediado por comunicação sináptica e que talvez

dependa da DA difundida no tecido, e que esta viria de uma fonte alternativa.

A DA pode ser usada como sinal durante o desenvolvimento, e de fato,

Guimarães e colaboradores (2001) mostraram que a diferenciação de células

dopaminérgicas in vitro está sob a influência de substâncias que modulam

positivamente os níveis intracelulares de AMPc, tais como a forscolina. Os autores

observaram também que, por outro lado, os níveis de DA podem influenciar

negativamente a determinação do número final de células dopaminérgicas

produzidas por precursores já comprometidos com o fenótipo dopaminérgico.

Borba e colaboradores (2005), mostraram que o Polipeptídeo da pituitária

ativador da adenilil ciclase (PACAP) é também um fator importante na definição do

fenótipo dopaminérgico em retina de galinha. Este peptídeo também aumenta os

níveis intracelulares de AMPc, bem como o número de células TH+ em culturas de

células retinianas desta espécie. Assim, diferentes fatores poderiam estar

controlando tanto o número de células TH+ como de células DDC+ durante o

desenvolvimento da retina. A nossa proposta é que a L-dopa produzida no epitélio

pigmentado poderia se difundir para a retina neural e, as células DDC+ encontradas

desde fases iniciais do desenvolvimento, poderiam converter L-dopa em DA. Estas

células além de produzir DA poderiam também potencialmente secretar DA no

tecido, e, desta forma, a própria DA regularia o número de células DDC+ na retina,

como foi mostrado por Guimarães e colaboradores (2001) para a as células TH+.

É interessante notar que a presença de células que expressam a enzima DDC

já em E8 é simultâneo ao final do período de geração das células amácrinas

dopaminérgicas (E7). Assim, temos que uma das enzimas da via da síntese da DA

aparece no tecido concomitante a vários outros eventos, tais como: surgimento do

109

receptor D1 (De Mello, 1978), sistema de captação de DA, e expressão do DAT

(Kato et al., 1984; Kubrusly et al., 2003) sem que a DA esteja ainda presente no

tecido.

Em outros sistemas de neurotransmissores isto também ocorre. Por exemplo,

GABA e acetilcolina são detectados em fases iniciais do desenvolvimento e surgem

na retina de galinha em torno de E6 (Hokoç et al, 1990; Hamassaki-Britto et al, 1994;

Gardino et al, 1996; Calaza et al, 2000). De fato, a gênese e diferenciação de

células colinoceptivas são eventos que ocorrem simultaneamente. Porém, a

geração de células que contém a enzima de síntese de GABA (descarboxilase do

ácido glutâmico – GAD), assim como a expressão de GABA não são eventos

simultâneos na retina de galinha, à semelhança da TH. No caso do GABA, no

entanto, ocorre que este pode ser produzido a partir de putrescina como uma via

alternativa (De Mello, 1976.; Abe et al., 1990.; Yamasaki et al., 1999) e antecedendo

à da enzima de síntese GAD, assim explicando a sua presença em idades precoces.

No caso da DA cuja primeira expressão de sua enzima de síntese (TH) ocorre

em E12, propomos que a L-dopa oriunda do epitélio pigmentado poderia se difundir

para a retina e, tendo em vista que a maquinaria necessária para sua conversão em

DA estaria disponível, bem como para seu acúmulo e liberação, essa poderia ser

uma explicação plausível para uma via alternativa de formação de DA em idades

precoces.

Um outro papel fisiológico importante para DA em fases iniciais do

desenvolvimento pode ser melhor entendido no albinismo. Animais albinos possuem

a via alternativa na produção de DA defeituosa levando a uma diminuição nos níveis

de L-dopa proveniente do epitélio pigmentado. A retina destes animais possui um

desenvolvimento anormal e dados da literatura mostram que a conversão de L-dopa

110

em DA nas fases iniciais do desenvolvimento pode corrigir estas anormalidades que

caracterizam o fenótipo albino (Jeffery, 1997; Ilia e Jeffery, 2000).

Neste trabalho mostramos que células que possuem a enzima DDC, capaz de

converter L-dopa em DA, já estão presentes na retina de galinha desde fases

precoces do desenvolvimento. Estes dados dão suporte à proposta incial feita por

Kubrusly e colaboradores (2003) de que a L-dopa, produzida no epitélio pigmentado,

poderia se difundir para a retina neural e formar dopamina em fases precoces do

desenvolvimento quando a TH ainda não está presente. Estes dados sugerem

ainda que a DA sintetizada nestas idades poderia exercer diferentes efeitos tróficos

durante a diferenciação da retina, como por exemplo, a regulação do número de

células DDC+ durante o desenvolvimento. A Figura 34 ilustra a via alternativa de

formação de DA durante o desenvolvimento como proposto por Kubrusly e

colaboradores.

111

Figura 34- Desenho ilustrativo mostrando a formação de dopamina na retina de

galinha à partir de uma fonte alternativa de L-dopa proveniente do EP. Em A,

exemplo de células DDC+ (em vermelho) na CNI em fases precoces do

desenvolvimento onde a TH não está presente. B, sinapse dopaminérgica com

célula DDC+ em maior detalhe. Tyr, tirosinase, EP, epitélio pigmentado, D1, D2, D3,

D4 e D5, receptores dopaminérgicos, Gs, proteína G do tipo estimulante, Gi,

proteína G do tipo inibitória, DAT, transportador de DA.

112

6 CONCLUSÕES

9 As células DDC+ foram caracterizadas como células amácrinas, localizadas

na CNI.

9 Duas populações de células DDC+ foram identificadas baseadas na

localização do soma e nível de arborização: tipo 1 com soma localizado no

bordo interno da CNI e tipo 2, que possui o soma localizado uma a duas

fileiras de células acima do bordo interno da CNI.

9 Observamos marcação difusa para DDC nas CNE e CPE durante o

desenvolvimento e no animal adulto.

9 Todas as células TH+ são também DDC+.

9 Existem células que somente possuem a DDC, caracterizadas como células

DDC+ do tipo 2.

9 As células DDC+ do tipo 1 correspondem às células amácrinas

biestratificadas descritas por Gardino e colaboradores (1993). Estas possuem

ambas as enzimas TH e DDC.

9 As células DDC+ possuem uma distribuição topográfica homogênea pela

retina, durante o desenvolvimento e no tecido maduro.

9 A densidade das células DDC+ é maior quando comparada a das células TH+

em todas as idades analisadas.

9 A densidade das células DDC+ e TH+, diminui durante o desenvolvimento.

9 A enzima DDC está presente em diferentes espécies de mamíferos adultos

como macaco, gambá e ratos pigmentados.

9 A DDC está expressa com densidade maior quando comparada a TH, em

retinas de gambá e ratos adultos, assim como em galinha.

113

7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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