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NEI ANTÔNIO REY
Estudo experimental comparativo do enxerto homólogo
pulmonar tratado pelo processo L-Hydro com o homoenxerto
pulmonar a fresco
Tese apresentada à Faculdade de Medicina da
Universidade de São Paulo para obtenção de título de
Doutor em Ciências
Área de Concentração: Cirurgia Torácica e
Cardiovascular
Orientador: Prof. Dr. Noedir Antônio Groppo Stolf
SÃO PAULO
2008
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Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)
Preparada pela Biblioteca da
Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo
reprodução autorizada pelo autor
Rey, Nei Antônio
Estudo experimental comparativo do enxerto homólogo pulmonar tratado pelo
processo I-hydro com o homoenxerto pulmonar a fresco / Nei Antônio Rey. --
São Paulo, 2008.
Tese(doutorado)--Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo.
Departamento de Cardiologia.
Área de concentração: Cirurgia Torácica e Cardiovascular.
Orientador: Noedir Antonio Groppo Stolf.
Descritores: 1.Transplante homólogo 2.Polietilenoglicóis 3.Valvas cardíacas
4.Ovinos
USP/FM/SBD-209/08
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DEDICATÓRIA
A Deus, pela possibilidade de nossa existência terrena.
À minha esposa Maria Elisabeth e aos meus filhos Rafael, Maria
Carolina, Gabriel e Gustavo.
Aos meus pais, Manoel e Nilda Maria.
Aos meus sogros, José e Lorena, in memoriam.
Ao meu irmão Newton Manoel.
AGRADECIMENTO ESPECIAL
Ao Professor Doutor Noedir Antonio Groppo Stolf, pelo empenho,
amizade e segura orientação.
AGRADECIMENTOS
Ao Professor Luiz Felipe de Pinho Moreira pelo apoio e sugestões na
elaboração desta tese.
Ao Doutor Luiz Alberto Benvenuti pela valiosa contribuição na
realização dos estudos histológicos.
Ao Doutor Ivan Casagrande e a toda a Equipe do Centro de Pesquisa
da Labcor Laboratórios Ltda., pela colaboração na realização dos
experimentos no modelo animal.
Ao Doutor David T. Cheung pelos esclarecimentos fornecidos.
Ao Doutor Domingos Dias Lourenço Filho pela colaboração e
orientação.
Ao Professor Jarbas J. Dinkuysen pelas sugestões e amizade.
Ao GEP do Hospital Conceição (Grupo Hospitalar Conceição do
Ministério da Saúde).
À FAPESP (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São
Paulo), por ter patrocinado aporte financeiro a esta tese.
À Maria Carolina pela ajuda e assistência na elaboração do texto.
ÍNDICE
Pag
Lista de abreviaturas e siglas
Lista de símbolos
Lista de Tabelas
Lista de Figuras
Resumo
Summary
1. Introdução................................................................................................ 1
2. Objetivo.................................................................................................... 8
3. Material e Métodos.................................................................................. 10
3.1. Seleção da amostra............................................................................. 11
3.1.1. Preparo dos homoenxertos............................................................ 12
3.1.1.1. Preparação pelo L-Hydro......................................................... 12
3.1.1.2. Enxertos frescos...................................................................... 13
3.1.2. Preparação dos animais de experimentação................................. 13
3.1.3. Implantes em animais.................................................................... 15
3.1.3.1. Técnica operatória................................................................... 15
3.1.3.2. Cuidados pós-operatórios........................................................ 17
3.1.3.3. Avaliação Clínica e laboratorial................................................ 17
3.1.3.4. Avaliação EcoDopplercardiográfica......................................... 18
3.1.3.5. Avaliação angiográfica............................................................. 19
3.2. Sacrifício dos animais e explante das próteses................................... 20
3.2.1. Avaliação macroscópica................................................................ 20
3.2.2. Avaliação radiológica..................................................................... 21
3.2.3. Avaliação histológica e imuno-histoquímica.................................. 22
3.3. Análise estatística de dados................................................................ 24
4. Resultados............................................................................................... 25
4.1. Análise clínica e laboratorial................................................................ 26
4.2. Análise EcoDopplercardiográfica......................................................... 29
4.3. Análise angiográfica e hemodinâmica................................................. 30
4.4. Análise dos achados radiológicos....................................................... 32
4.5. Avaliação macroscópica...................................................................... 32
4.6. Análise histológica............................................................................... 36
4.6.1. Aspectos da microscopia óptica................................................. 36
4.6.1.1. Análise imuno-histoquímica................................................... 39
4.6.2. Aspectos da microscopia eletrônica de varredura..................... 39
4.6.3. Aspectos da microscopia de transmissão.................................. 40
4.6.4. Descrição individual dos casos e tabelas................................... 43
5. Discussão................................................................................................. 44
6. Conclusões.............................................................................................. 56
7. Anexos...................................................................................................... 58
8. Referências Bibliográficas..................................................................... 71
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AP artéria pulmonar
AHA American Heart Association
CEC Circulação extra-corpórea
CO
2
Gás carbônico
DHL Deidrogenase lática
DN Data do nascimento
Eco 1 Ecocardiograma aos 7 meses
Eco 2 Ecocardiograma aos 10 meses
EV Endovenoso
Hb Hemoglobina
Ht Hematócrito
IM Intramuscular
ISO International Standard Organization
MO
Microscopia Óptica
MEV
Microscopia Eletrônica de Varredura
MET Microscopia Eletrônica de Transmissão
N/A Não avaliado
PEG Polietileno-glicol
PO Pós-operatório
PAP Pressão de artéria pulmonar
PCP Pressão capilar pulmonar
PVC Pressão venosa central
Tcec Tempo de circulação extra-corpórea
TP Tronco pulmonar
U.S. Unitet States of America
VD Ventrículo direito
LISTA DE SÍMBOLOS
UI Unidades internacionais
Mmhg milímetros de mercúrio
G Grama
Kg Quilograma
Kg
-1
por quilograma de peso corpóreo
Fr french
Ml mililitro
Mg miligrama
Mm milímetro
% porcentual
° grau
°C grau Celsius
KV quilovolts
µm micrômetro
LISTA DE TABELAS
Pag.
Tabela 1. Comparação de variáveis clínicas e laboratoriais.............. 28
Tabela 2. Comparação de variáveis ecocardiográficas e
hemodinâmicas...................................................................
31
Tabela 3. Comparação de variáveis obtidas da macroscopia............ 35
Tabela 4. Porcentual de revestimento celular.................................... 37
Tabela 5. Comparação de variáveis da microscopia óptica e
eletrônica............................................................................
43
LISTA DE FIGURAS
Pag.
Figura 1. Esquema cirúrgico de implante do homoenxerto............... 16
Figura 2. Esquema de classificação do grau de calcificação............ 22
Figura 3. Avaliação Macroscópica..................................................... 34
Figura 4. Microscopia Óptica de Luz................................................. 38
Figura 5. Microscopia Eletrônica de Varredura.................................. 40
Figura 6. Microscopia Eletrônica de Transmissão............................. 42
RESUMO
Rey NR. Estudo experimental comparativo do enxerto homólogo pulmonar
tratado pelo processo L-Hydro com o homoenxerto pulmonar a fresco. São
Paulo, 2008, 84p. Tese (Doutorado) − Faculdade de Medicina, Universidade
de São Paulo.
Os substitutos valvares possuem grande importância pela freqüência da sua
utilização e porque de seu bom desempenho depende o sucesso do
procedimento cirúrgico realizado. Vários substitutos valvares têm sido
empregados, todos com complicações inerentes ao material utilizado, como
trombose, calcificação, degeneração, dificuldade de esterilização, custo,
complexidade de produção, etc. Buscando disponibilizar homoenxertos
preservados de maneira mais simples e econômica, avaliamos uma nova
forma de preservação utilizando o polietileno-glicol, método L-Hydro. Este
método consiste na extração controlada de substâncias antigênicas e de
incorporação de um agente antinflamatório e anti-trombótico. Em dez
carneiros jovens substituímos o Tronco Pulmonar, em sete por
homoenxertos pulmonares tratados pelo processo L-Hydro e em três por
homoenxertos pulmonares a fresco, implantados ortotopicamente e seguidos
por 320 dias. Os carneiros foram avaliados por exames laboratoriais e
ecocardiográficos. Ao cabo dos 320 dias foram sacrificados, quando se
procedeu à avaliação hemodinâmica, radiológica, macroscópica e por
microscopia óptica e eletrônica, de varredura e transmissão. Os resultados
foram analisados pelo teste t de Student de amostras independentes para os
dados contínuos, pela análise de variância para as medidas repetidas e pelo
teste exato de Fischer para os dados categóricos. Na evolução clínica e nos
exames laboratoriais não conseguimos estabelecer diferenças significativas
entre os dois grupos. O ecocardiograma revelou diferença quanto ao
gradiente médio pulmonar, significativa aos 10 meses de seguimento, maior
no grupo controle do que no grupo L-Hydro. A avaliação radiológica e
macroscópica não estabeleceu diferenças. Na avaliação microscópica,
óptica e eletrônica, células de revestimento e intersticiais foram encontradas
nos dois grupos igualmente. O porcentual de revestimento celular calculado
nos dois grupos foi semelhante. Nódulos de celularidade foram observados
somente no grupo de homoenxertos a fresco. Em conclusão, estes dados
indicam que os dois grupos apresentaram desempenho clínico e
hemodinâmico semelhante. Ao ecocardiograma o grupo L-Hydro apresentou
melhor desempenho; apresentou também evidências histológicas de
repopulação celular intersticial e endotelial. Na análise macro e
microscópica, óptica e eletrônica, o grupo L-Hydro apresentou macroscopia,
estrutura histológica e ultraestrutural semelhante ao homoenxerto afresco, à
exceção de nódulos de maior celularidade intersticial, presentes apenas no
homoenxerto a fresco.
SUMMARY
Rey NR. L-Hydro treated homologous pulmonary graft vs. pulmonary
homograft fresco: An experimental, comparative study. São Paulo, 2008,
84p. Thesis (Doctorate) − São Paulo University Medical School, São Paulo,
Brazil.
Valve substitutes are highly important in account of their frequent use and
since the success of a surgical procedure depends on their good
performance. A variety of valve substitutes have been used, all presenting
complications pertaining to their materials, such as thrombosis, calcification,
degeneration, sterilization difficulties, cost, production complexity, etc. In an
effort to make available homografts preserved in a simpler and less costly
way, we evaluated a new preservation form using polyethyleneglycol, the L-
Hydro method. This method consists in the controlled extraction of antigenic
substances and the incorporation of an anti-inflammatory and anti-thrombotic
agent. We substituted the pulmonary trunk in ten ovines, seven received L-
Hydro treated pulmonary homografts and three received pulmonary
homografts fresco, orthotopically implanted and followed-up for 320 days.
Ovines where evaluated by means of laboratory tests and echocardiographic
exams. At the end of the 320 days, they were euthanized, and hemodynamic,
radiology, macroscopic, optic and electronic microscopic, scanning and
transmission evaluations were performed. Results were analyzed by Student
t test of independent samples for continuous data, by variance analysis of
repeated measures, and by Fischer exact test for categorical data. We
couldn’t establish relevant differences in clinical evolution and laboratory
tests between both groups. Echocardiogram revealed a difference in the
pulmonary medium gradient, which was significant at the 10 months follow-
up, higher in the control group than in the L-Hydro group. Radiologic and
macroscopic evaluations didn’t established differences. In the optic and
electronic microscopic evaluation, liner and interstitial cells were equally
found in both groups. The cell liner percent calculated in both groups was
similar. Cellularity nodules were observed only in the homograft fresco group.
In conclusion, these data indicate that both groups presented similar clinical
and hemodynamic performances. The L-Hydro group’s echocardiogram
presented a better performance. It also presented histological evidences of
interstitial and endothelial cell repopulation. In the macro and optic and
electronic microscopic analysis, group L-Hydro presented macroscopy,
histological structure and ultra-structural similar to the homograft fresco
group, with the exception of nodules with higher interstitial cellularity, present
only in the homograft fresco group.
Introdução
Introdução
2
1. INTRODUÇÃO
Diversas enfermidades cardiovasculares, congênitas ou adquiridas,
determinam a necessidade de substituição de valvas cardíacas ou a
interposição de condutos valvulados, sendo que por este motivo há mais de
quarenta anos busca-se um substituto valvar ideal.
Estima-se que são realizadas, anualmente, pelo menos 60.000
substituições valvares nos EEUU e 170.000 no mundo
(1;2)
.
A troca valvar muda a evolução da enfermidade, trazendo nova
perspectiva ao doente. Em 1952 HUFNAGEL e Harvey
(3)
implantaram com
sucesso prótese de bola na aorta descendente de paciente com insuficiência
aórtica importante. A seguir, diversos cirurgiões tentaram a abordagem
direta da valva aórtica. O Dr. Albert Star e seu engenheiro associado Lowell
Edwards apresentaram em 1960 um modelo mais avançado de valva
artificial mecânica, com gaiola e bola
(4)
. Por outro lado, os substitutos
biológicos tiveram o seu início com Lam et al
(5)
, implantando homoenxertos
na aorta descendente de cães; Murray
(6)
, em 1955, iniciou o uso clínico de
homoenxertos na aorta torácica. As primeiras substituições valvares
ortotópicas por valva biológica empregaram a valva aórtica do cadáver,
retirada assepticamente, usando como meio de conservação a liofilização ou
Introdução
3
solução de Hanks
(7;8)
. Eram os homoenxertos, que demonstraram bom
resultado a curto prazo, apesar da dificuldade de obtenção.
O desenvolvimento das próteses mecânicas fez com que os
homoenxertos fossem esquecidos, pelo menos até surgirem complicações,
como as decorrentes da anticoagulação e o tromboembolismo.
Surgiu então o conceito de “bioprótese”
(9)
, conjugando material
biológico montado sobre uma base metálica ou plástica.
Entre outros materiais biológicos utilizaram-se a fascia lata
(10)
, a
dura-máter
(11)
, o pericárdio bovino
(12)
e a valva aórtica do porco
(13)
. Estes
materiais tratados por vários métodos de preservação degeneram
progressivamente, necessitando ser substituídos.
Retomado o interesse pelos homoenxertos, estes passaram a ser
retirados de maneira não asséptica, porém limpa, sendo
desinfetados/esterilizados quimicamente ou irradiados, o que determinou
alta incidência de calcificação e ruptura
(13)
. Captação mais liberal, limpa mas
não asséptica foi possível com a utilização de solução com antibióticos
(14)
, o
que possibilitou a retirada em salas de autópsia; mesmo assim, sua
utilização era limitada a poucas semanas. As soluções antibióticas,
inicialmente usadas em concentrações elevadas, levaram a resultados
inferiores aos obtidos com os homoenxertos a fresco. A concentração foi
reduzida e alguns antibióticos eliminados, observando-se então nesses
homoenxertos, conservados a 4 graus centígrados (4ºC), resultados
comparáveis aos bons resultados dos obtidos a fresco
(15;16)
.
Introdução
4
Porém, a escassez de homoenxertos disponíveis e a necessidade
de seu uso dentro de prazo relativamente exíguo, de quatro a seis semanas,
ensejou a conservação dos mesmos pela criopreservação através dos
Bancos de Homoenxertos
(17)
. A criopreservação consiste em preservar o
homoenxerto, congelando-o. Para proteção contra a cristalização é
empregado o dimetilsulfóxido, seguido de estocagem a –196 graus
centígrados (-196ºC), utilizando nitrogênio líquido. Os homoenxertos assim
preparados podem ser estocados por largo período, facilitando a sua
indicação, podendo apresentar em 10-15 anos sobrevida de 50-90% sem
falha estrutural, contra 40-60% das biopróteses
(18;19)
. Atribui-se à
criopreservação a capacidade de preservar a matrix extracelular dos
homoenxertos, o que determinaria o seu bom resultado
(20;21)
. Alguns autores
atribuem a esta técnica a conservação de células como os fibroblastos e
mio-fibroblastos. Estas células regenerariam e recomporiam a matrix,
retardando ou impedindo a sua degeneração. Mesmo a criopreservação não
viabilizaria as células endoteliais, o que por muitos é encarado como
vantagem
(22)
, já que estas células são as maiores responsáveis por possível
reação antígeno-anticorpo desencadeada pelo homoenxerto, que não é
previamente testado contra um painel de leucócitos para determinação de
compatibilidade do sistema HLA. Vários trabalhos tentam provar a
importância da reação antígeno-anticorpo e o conseqüente processo
inflamatório na gênese da degeneração de homoenxertos criopreservados
(23-
26)
.
Introdução
5
Outros autores, analisando 33 homoenxertos criopreservados
explantados, não encontraram evidências de rejeição imunológica, atribuindo
a degeneração dos mesmos a outros fatores biológicos, à sua não
viabilidade a médio e longo prazo, e portanto à sua incapacidade de crescer,
remodelar ou exercer função metabólica ativa
(27)
.
A criopreservação
(28)
, método de preservação de escolha nos dias
atuais, permitiu maior disponibilidade de homoenxertos, de forma
padronizada e com qualidade comprovada.
Alguns inconvenientes ainda permanecem, como a necessária
sofisticação da metodologia, seu alto custo – que restringe sua utilização, a
dificuldade de eliminação de agentes infecciosos e a degeneração no longo
prazo
(1;21;29-31)
.
Tenta-se suprimir as reações imunológicas descelularizando os
homoenxertos, preservando íntegra a matrix
(32-34)
. O homoenxerto
descelularizado pode ser recelularizado “in vitro”, com as células retiradas do
futuro hospedeiro
(35)
, ou recelularizado “in vivo”, na medida em que após o
implante as células do hospedeiro invadam o implante
(35-37)
.
Estes processos tornariam o homoenxerto um autoenxerto, com
células vivas do próprio paciente: um enxerto “vivo” com capacidade de se
recompor, como a própria valva nativa humana. É evidente que o resultado
esperado deste processo de recelularização seria o de se conseguir um
enxerto ideal; vários processos podem ser utilizados para a descelularização
das valvas biológicas
(38-40)
.
Introdução
6
Buscando disponibilizar homoenxertos preservados de maneira mais
simples e econômica, mantendo a qualidade, avaliamos uma nova forma de
preservação, com o uso do polietileno-glicol (PEG), denominada de
preservação pelo método L-Hydro
(41)
. O PEG, que vem sendo empregado
em vários processos de preservação de tecidos desde longa data
(42-45)
,
suprime a reação imunológica e o conseqüente processo inflamatório e
degenerativo. Trata-se de um polímero bastante estável quimicamente,
produzido pela polimerização catalítica heterogênea a partir de monômeros
de óxido de etileno, cujas propriedades são a solubilidade em água, cetonas,
glicerol e etanol. Sua toxicidade é bastante reduzida, por ser quimicamente
inerte e sua eliminação, quando em contato com a corrente sanguínea, se
faz completamente pelo rim, sem que seja metabolizado, o que assegura o
seu emprego clínico como veículo para dissolver fármacos pouco solúveis
em água
(46-48)
. O PEG teria a propriedade de preservação estrutural e
diminuiria a reação imunológica
(49;50)
pela extração de antígenos e
desativação de outros análogos remanescentes sob oxidação química.
Os enxertos tratados pelo PEG seriam reduzidos à sua estrutura
colágena básica, permitindo a repopulação com células do hospedeiro a
médio e longo prazo, o que se poderia chamar de “biointegração” do tecido
implantado.
As propriedades de outros tecidos biológicos tratados pelo PEG,
como a válvula porcina, foram avaliadas e comparadas, mostrando-se
superior a outros métodos de preservação
(51)
, em respeito às características
Introdução
7
biológica, química e mecânica, comparativamente ao enxerto fresco, bem
como a sua biocompatibilidade, confirmando o bom desempenho.
Xenoenxertos valvados porcinos tratados pelo método L-Hydro,
implantados em via de saída de ventrículo direito em carneiros jovens
(52)
,
assim como a Artéria Mamária Interna bovina, tratada pelo método L-Hydro
e usada em carneiros, mostraram bons resultados iniciais
(53)
.
Homoenxertos aórticos tratados pelo polietileno-gligol, implantados
heterotopicamente na porção descendente da aorta torácica em carneiros,
apresentaram bom desempenho
(41)
.
Baseados nestes achados, nos propusemos a comparar, em
carneiros jovens, homoenxertos pulmonares “a fresco” com homoenxertos
pulmonares tratados pelo método L-Hydro, implantados ortotopicamente.
Objetivos
Objetivos
9
2. Objetivos
Comparar morfológica e funcionalmente o homoenxerto pulmonar
tratado pelo Polietilenoglicol (PEG), método L-Hydro, com o homoenxerto
pulmonar a fresco implantado ortotopicamente em carneiros.
Casuística e Métodos
Casuística e Métodos 11
3. CASUÍSTICA E MÉTODOS
Este é um estudo experimental controlado, e os respectivos
experimentos foram realizados no Centro de Pesquisas da Labcor
Laboratórios (Belo Horizonte, Brasil), mediante a aprovação da Comissão
Científica do Instituto do Coração e de Ética do Hospital das Clínicas da
Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo, e seguiram as
normas da American Association for Acreditation of Laboratory Animal
Care
(54)
, tendo sido adotada a Nomina Anatômica Veterinária
(55)
.
3.1. Seleção da amostra
Foram selecionados 14 ovinos receptores da raça Santa Inês (Ovis
aries), treze machos, com idade entre 4 e 6 meses, confirmada pelo tempo
de erupção e pelas mudanças na tábua dental, e com peso entre 18 e 32 kg.
Os animais foram submetidos a exame clínico geral por médico veterinário, e
considerados clinicamente sadios para o procedimento. Todos os animais
receberam número de identificação individual e uma ficha clínica contendo
Casuística e Métodos 12
todos os cuidados a serem recebidos durante a permanência dos mesmos
neste estudo.
Em dez animais (grupo L-Hydro) foram utilizados homoenxertos
tratados pelo método L-Hydro e em quatro foram utilizados homoenxertos
frescos (grupo controle).
Os animais com óbito nas primeiras 24/48 horas, considerados
óbitos cirúrgicos, foram excluídos deste estudo.
3.1.1. Preparo dos homoenxertos
3.1.1.1. Preparação pelo L-Hydro
Os corações dos ovinos foram obtidos em abatedouro credenciado
pelo Ministério da Agricultura e pelo Serviço de Inspeção Federal. Após,
foram transportados em solução salina fria para o laboratório, onde o
preparo se fez em local limpo, mas não em condições estéreis. Todo o
processamento aconteceu num período de até 36 horas do abate do doador.
O tronco pulmonar (artéria e valva) foi dissecado desde a sua bifurcação até
a origem, preservando-se uma pequena aba muscular do ventrículo direito,
suficiente para a realização da anastomose. Foi utilizado o processo L-
Hydro
TM
(Philogenesis Inc., Monrovia, EUA)
(56)
, em três etapas distintas:
Casuística e Métodos 13
1a: extração dos antígenos ovinos e mascaramento dos
remanescentes sob oxidação química controlada pelo uso do ácido
polietilenoglicol; (fórmula: HO.CH2 (CH2-CH2) N-CH2OH).
2a : incorporação ao enxerto de agente antinflamatório não-esteróide
(equivalente à aspirina) e de agente antitrombótico (equivalente à heparina);
3a: esterilização do tecido em fase aquosa de peróxido de
hidrogênio (H2O2).
Concluído o processo de preservação, os enxertos foram estocados
em solução de etanol a 50% até a sua utilização.
3.1.1.2. Enxertos frescos
Os corações de ovelhas foram obtidos em sala cirúrgica contígua,
em condições estéreis, anatomicamente idênticos ao da preparação L-
Hydro. Após a dissecção e preparo do homoenxerto, cada um foi examinado
e considerado em boas condições para uso, sendo então colocado em
solução salina gelada a 4ºC e imediatamente utilizado.
3.1.2. Preparo dos animais de experimentação
Os animais permaneceram em jejum de sólidos por 24 horas e de
líquidos nas seis horas que antecederam a operação, quando foi
Casuística e Métodos 14
administrado 1,0 g de cefalotina intramuscular (IM). Quinze minutos antes da
indução anestésica foi administrado 1mg de sulfato de atropina IM. A
indução anestésica realizou-se através da administração endovenosa (EV)
de 12,5mg.Kg-1 de tiopental sódico. A veia jugular externa esquerda foi
cateterizada e conectada a uma torneira de três vias para a administração
de drogas e soluções eletrolíticas. Neste momento, foram administrados 250
mg de metilprednisolona e 1g de cefalotina EV. A seguir, realizada a
intubação orotraqueal e inserida sonda orogástrica, através da qual eram
administrados 150ml da solução de hidróxido de alumínio; a ventilação
mecânica, estabelecida com volume de 12ml de O2.Kg-1, na freqüência de
12 ciclos por minuto. Em seguida, foi obtido o registro contínuo do traçado
eletrocardiográfico e da temperatura retal, utilizando-se um monitor
multiparamétrico (Bese, Belo Horizonte, Brasil). A anestesia, mantida pela
administração de halotano a 1,5% por via inalatória e de 100mg de cloreto
de suxametônio EV.
No anexo A, encontram-se os dados de identificação dos animai,s
incluindo-se data de nascimento, idade, peso e categoria (L-Hydro e
homoenxerto fresco).
Casuística e Métodos 15
3.1.3. Implantes em animais
3.1.3.1. Técnica operatória
Com o animal posicionado em decúbito lateral direito, após a
antissepsia e colocação de campos estéreis, realizamos toracotomia lateral
esquerda no quarto espaço intercostal. A seguir, o pulmão esquerdo
afastado com afastador maleável sobre compressa úmida expondo o saco
pericárdico, o qual foi incisado longitudinalmente em direção ao ápice do
coração. Neste momento, o animal recebeu heparina sódica na dose de 350
UI.kg-1 EV, e dose adicional de 125mg de metilprednisolona EV. Dissecou-
se o Tronco Pulmonar (TP) até a sua bifurcação com a identificação do
Ligamento Arterioso. Após três minutos da administração de heparina,
introduziu-se na aorta descendente cânula DLP 16Fr (DLP, Grand Rapids,
EUA) com a ponta orientada cranialmente e, no átrio direito, uma cânula
única de dois estágios DLP 30Fr. Após, a circulação extracorpórea (CEC) foi
estabelecida utilizando-se oxigenador de membranas adulto (Vitae, DMG
Equipamentos Médicos Ltda., Rio de Janeiro, Brasil), com volume do
perfusato de 1500ml de Ringer Lactato (Fresenius, Campinas, Brasil). O
fluxo arterial foi mantido entre 50 e 70 ml/kg/min e o fluxo de gás em 0,5l/min
da mistura de 95% de O2 e 5% de CO2, os quais foram ajustados no
transcorrer do procedimento de acordo com os valores da gasometria. Após
a estabilização da CEC em normotermia e com o coração batendo,
procedeu-se à oclusão da Artéria Pulmonar (AP) na sua porção distal (pinça
Casuística e Métodos 16
“DeBakey”) e observação da efetividade da drenagem venosa, com a AP
mantendo-se vazia. Então, foi realizada a secção completa do TP, desde 1 a
2 milímetros acima do plano valvar, ressecando-se as três válvulas, até
distalmente junto à pinça vascular. Procedeu-se assim ao implante do
homoenxerto com a anastomose distal, reposicionando a pinça, em seguida
realizando-se a anastomose proximal, ambas suturas realizadas de maneira
contínua e fio de polipropileno (5-0), retirando-se a pinça vascular distal.
Figura 1. A) Valva e tronco pulmonar: linhas de ressecção no tronco
pulmonar pontilhadas. Valva pulmonar ressecada. B) Interposição
do enxerto homólogo. C) Suturas completadas. Aspecto final.
A hemostasia foi revisada, descontinuada a perfusão extracorpórea,
o volume do oxigenador reposto, as cânulas retiradas e a ação da heparina
revertida com uso de protamina, conforme o peso do animal. Mais uma vez a
hemostasia revisada, o pericárdio suturado parcialmente, o tórax esquerdo
drenado com tubo de ¼ de polegada multiperfurado e realizada a síntese por
planos até a pele.
A B C
Casuística e Métodos 17
A cânula traqueal e o dreno torácico foram retirados ainda na sala
cirúrgica, e em seguida os animais transferidos para a sala de recuperação
pós-operatória
(57)
.
No anexo B, encontram-se discriminados os dados intraoperatórios
(data da operação, tipo e tamanho das próteses e tempo de CEC).
3.1.3.2. Cuidados pós-operatórios
Após cinco horas da retirada da cânula traqueal, a oferta de líquidos
e a dieta com feno foram reinstituídas, sendo administrados antibióticos:
cefalotina/ 1g e gentamicina 3/4mg/Kg, por sete dias. Heparina subcutânea,
5000 UI a cada 12 horas, foi usada nos três primeiros dias. A temperatura
retal dos animais foi monitorada diariamente na primeira semana e, ao
término desta, quando considerados em condições clínicas satisfatórias, os
animais foram transferidos para o biotério, onde permaneceram em
observação diária até completar o tempo de observação de 320 dias.
3.1.3.3. Avaliação clínica e laboratorial
No transcurso dos 320 dias, além da observação diária e
preenchimento da ficha clínica de cada animal pelo veterinário, realizou-se o
controle laboratorial (hemograma, plaquetas, cálcio, fósforo, DHL) aos sete e
Casuística e Métodos 18
onze meses (precedendo o sacrifício dos animais). O peso final foi
comparado ao inicial.
3.1.3.4. Avaliação EcoDopplercardiográfica
Avaliação EcoDopplercardiográfica foi realizada no sétimo e no
décimo mês de pós-operatório, utilizando um equipamento da marca ATL
Ultramark 6 (Philips, Drachten, Holanda) com transdutores de 2,0 e 3,0
megaHertz. As imagens foram obtidas nos cortes transversal, apical e
paraesternal longitudinal em vários planos, gravados no mínimo três ciclos
cardíacos consecutivos, sendo considerados os valores médios, excluindo-
se as imagens não bem definidas.
Foram determinadas a mobilidade, a suficiência da valva, o grau de
regurgitação valvar, os gradientes transvalvares médio e máximo.
O EcoDoppler colorido contínuo, obtido em posição apical, em corte
de quatro câmaras, orientado para a válvula pulmonar, foi utilizado para
determinar o grau de regurgitação do enxerto e, se existente, conforme
orientação da AHA, relacionando o jato de regurgitação com a área da via de
saída do ventrículo direito. O gradiente transvalvar máximo foi obtido pela
medida da velocidade de fluxo sanguíneo trans-enxerto, utilizando a
equação simplificada de BERNOULLI: gradiente= 4 x velocidade de fluxo. O
gradiente médio foi determinado pela planimetria da curva de fluxo
pulmonar. A área valvar pulmonar foi determinada pela “equação de
Casuística e Métodos 19
continuidade”, avaliando-se a velocidade do fluxo na via de saída do
ventrículo direito, sua área e o fluxo trans-enxerto.
3.1.3.5. Avaliação angiográfica
Avaliação angiográfica foi realizada após 320 dias de pós-operatório,
e realizando-se o sacrifício dos animais para o explante das próteses. Foram
coletados de todos os animais, aos seis meses e antes do sacrifício,
amostras de sangue da veia jugular externa para hematimetria e bioquímica.
Os animais foram anestesiados através da administração endovenosa de
tiopental sódico na dose de 12,5mg.kg-1, e em seguida intubados e
ventilados mecanicamente; a anestesia, mantida pela inalação de uma
mistura de oxigênio associada a 1,5% de halotano. O animal foi posicionado
em decúbito lateral direito e, após antissepsia do lado cervical esquerdo, foi
realizada uma incisão longitudinal para a exposição da veia jugular externa,
através da qual se realiza cateterismo direito, utilizando-se um cateter de
Swan-Ganz 7Fr. Foram obtidos os registros da pressão venosa central,
cavidade direita, arterial pulmonar e do débito cardíaco por termodiluição.
Foi realizada, também, a angiografia pulmonar por injeção de contraste à
base de diatrizoato de meglumina (75%) e as imagens gravadas pela
exposição simultânea a fluoroscopia, utilizando-se um fluoroscópio Philips
XG 4002/00.
Casuística e Métodos 20
3.2. Sacrifício dos animais e explante das próteses
Os animais foram anestesiados de acordo com a técnica já descrita,
sacrificados com injeção endovenosa de Cloreto de Potássio (KCl) a 19,1%
e exsanguinados.
A seguir, realizou-se toracotomia esquerda e retirada em bloco do
coração e vasos da base. Os homoenxertos eram expostos por transecção
do ventrículo direito abaixo do sulco atrioventricular e pela transecção da
bifurcação pulmonar. Após, foram lavados em solução salina e fotografados,
procedendo-se à avaliação macroscópica. A seguir foram fixados em
Solução de Karnowski e encaminhados para a mamografia. Após esse
exame foram enviados para retirada de fragmentos para microscopia óptica
de luz e eletrônica, de varredura e de transmissão. Os restos dos animais
foram incinerados.
3.2.1. Avaliação macroscópica
Pelo exame macroscópico analisou-se:
1-funcionalidade e aspectos técnicos do procedimento realizado;
2-integridade dos tecidos do homoenxerto e miocárdio;
3-orientação, direção e mobilidade das válvulas;
4-presença de trombose, vegetação, calcificação e fibrose;
5-presença de solução de continuidade peri-enxerto (vazamento).
Casuística e Métodos 21
Desta análise resultou o levantamento dos seguintes itens
(58)
, para
cada homoenxerto:
a- estenose
b- insuficiência
c- deiscência
d- presença de vegetações
e- rotura/rasgos/abrasão
f- trombos nas válvulas
g- trombos em seio de Valsalva
h- calcificação nas válvulas
i- calcificação em seio de Valsalva
j- flexibilidade das válvulas
k- espessamento das válvulas
l- coaptação das válvulas
3.2.2. Avaliação radiológica
Os enxertos foram submetidos a estudo radiológico para determinar
a distribuição e intensidade dos depósitos de cálcio existentes. Para tanto foi
utilizado o mamógrafo Senographe DMR (GE, Buc, França), com voltagem
de aceleração de 22 kV. O grau de calcificação obedeceu à classificação de
Grabenwöger et al.
(59)
, que se baseia na quantidade de depósitos de cálcio
detectada, considerando quatro áreas diferentes da cúspide valvar: basal,
Casuística e Métodos 22
central, borda livre e comissural. Por este método a calcificação em cada
uma destas quatro áreas é contada como um grau de calcificação,
independente de quantas cúspides estejam afetadas (Figura 2).
Figura 2. Esquema para classificação do grau de calcificação pela
mamografia.
3.2.3. Avaliação histológica e imuno-histoquímica
Os homoenxertos conservados no fixador de Karnowsky foram
inicialmente manipulados retirando-se de uma das válvulas – que se
apresentasse macroscopicamente normal – pequeno fragmento de cerca de
2 x 2mm para análise pela microscopia eletrônica de varredura. Este
fragmento foi fixado em glutaraldeído a 3%, lavado em cacodilato
tamponado e desidratado com acetona até o ponto crítico do dióxido de
Casuística e Métodos 23
carbono, e em seguida recoberto com ouro e examinado no microscópio
eletrônico de varredura JSM-6100.
A seguir procedeu-se à retirada de um fragmento de outra válvula,
medindo cerca de 4 x 4 mm, o qual foi cortado em fragmentos de 1 x 1 x 1
mm, refixados em glutaraldeído a 3% e processados rotineiramente para
exame ao microscópio eletrônico de transmissão.
A seguir todas as peças foram fotografadas e foi retirado segmento
arterial circunferencial contendo toda a valva remanescente, o qual foi
periodicamente seccionado, no sentido longitudinal, para avaliação das
válvulas e dos seios de Valsalva, sendo integralmente processado, de forma
rotineira, para inclusão em parafina. Cortes seqüenciais, a 4µm, foram
corados pela hematoxilina-eosina e von-Kossa (para detecção de depósitos
de cálcio).
Com o auxílio do processador de imagens (Axiovision, Zeiss)
acoplado ao microscópio óptico comum (Axioskop II, Zeiss), foi delineado
manualmente o perímetro total das secções das válvulas presentes na
lâmina histológica (coloração hematoxilina-eosina) e o perímetro total das
mesmas estruturas que apresentavam revestimento celular nas superfícies
(presumivelmente células endoteliais ou em transformação para tal). O
porcentual de revestimento celular foi calculado pela razão entre o perímetro
total de superfície com revestimento celular e o perímetro total das válvulas,
multiplicado por 100.
Casuística e Métodos 24
Os cortes também foram submetidos à técnica imuno-histoquímica
para detecção de fator VIII, CD31, CD34 (marcadores de células endoteliais)
e CD68 (marcador para macrófagos).
3.3. Análise estatística de dados
Os dados contínuos foram apresentados por média e desvio padrão
e os categóricos por contagens. Evitou-se o uso de percentuais devido ao
reduzido tamanho dos grupos em estudo.
A significância estatística das diferenças observadas foi obtida
através de teste t de Student de amostras independentes para os dados
contínuos, da análise de variância (ANOVA) para as medidas repetidas e
pelo teste exato de Fisher nos dados categóricos. O nível de significância
adotado foi de α= 0,05. Os cálculos estatísticos foram executados com o
auxílio do programa SPSS versão 15.0.
Resultados
Resultados
26
4. RESULTADOS
4.1. Análise clínica e laboratorial
Foram operados quatorze animais. Três faleceram até 24/48 horas
de pós-operatório, 02 do grupo L-Hydro e 01 do grupo homoenxertos a fresco
e foram excluídos do estudo, assim sendo a amostra ficou assim distribuída:
Grupo L-Hydro: composto por oito animais implantados com o
homoenxerto pulmonar tratado pelo L-Hydro.
Grupo Controle: composto por três animais, com o homoenxerto a
“fresco”.
Dos onze animais que constituem esta amostra, o de número 03
(teste) foi sacrificado aos 10 dias, pois sofreu traumatismo grave. No anexo B
encontram-se discriminados os dados intraoperatórios (data da operação,
tipo e tamanho das próteses e tempo de CEC).
Dez animais permaneceram em observação diária por 320 dias. O
carneiro de número 01, do grupo L-Hydro, aos 82 dias de PO apresentou
processo infeccioso com aparecimento de nódulos no pescoço que, tratados
com antibióticos, regrediram aos 117 dias. Não houve diferença entre os dois
grupos nos exames laboratoriais e no ganho de peso.
Resultados
27
As médias, erros-padrão, nível descritivo do teste-t de Student das
variáveis: idade, peso inicial e final e ganho ponderal e as variáveis dos
exames laboratoriais, analisadas pela Análise de Variância para medidas
repetidas, constam da tabela 1. Dados completos dos exames laboratoriais e
peso dos animais encontram-se no anexo C.
Resultados
28
Tabela 1. Comparação de variáveis selecionadas entres os grupos L-Hydro
e Controle
L-Hydro Controle
Variável n = 7 n = 3 P P
G
P
I
Idade, meses 5,4 ± 0,8 5,8 ± 0,6 0,47*
Peso inicial, Kg 23,0 ± 4,7 22,3 ± 2,3 0,83*
Peso final, Kg 40,4 ± 9,3 39,0 ± 2,6 0,81*
Ganho ponderal, Kg 17,4 ± 6,0 16,7 ± 4,5 0,85*
Dados Laboratoriais
Hematócrito, % <0,001
A
0,509 0,304
7 meses PO 51,3 ± 5,2 51,7 ± 3,2
11 meses PO 71,3 ± 5,3 75,0 ± 3,5
Hemoglobina, g/dL 0,022
A
0,232 0,737
7 meses PO 13,8 ± 2,1 12,4 ± 1,8
11 meses PO 16,0 ± 1,7 15,2 ± 1,0
Leucócitos, nº/µL
0,151
A
0,407 0,778
7 meses PO 7.150 ± 2.997 5.817 ± 2.157
11 meses PO 6.357 ± 2.854 4.666 ± 577
Cálcio, mg/dL 0,603
A
0,084 0,283
7 meses PO 9,1 ± 0,7 9,9 ± 0,7
11 meses PO 9,3 ± 0,6 9,2 ± 0,4
Fósforo, mg/dL 0,001
A
0,216 0,030
7 meses PO 6,8 ± 0,5 6,8 ± 1,8
11 meses PO 7,6 ± 0,8 9,2 ± 1,6
DHL, U/L 0,340
A
0,019 0,084
7 meses PO 293 ± 48 389 ± 15
11 meses PO 309 ± 42 339 ± 14
Plaquetas, nº/µL
0,153
A
0,443 0,545
7 meses PO
607.143 ±
109.653
533.333 ±
175.594
11 meses PO
614.285 ±
106.904
550.000 ±
150.000
Hemácias, nº/µL
0,796
A
0,145 0,665
7 meses PO 11.721 ± 4.177 15.200 ± 2.227
11 meses PO 11.857 ± 2.115 14.666 ± 1.528
Os dados são apresentados como média±DP;
* significância estatística obtida pelo teste t de Student.
A
obtida através da Análise de Variâncias para medidas repetidas: fator tempo
P
G
: obtida através da Análise de Variâncias para medidas repetidas: fator grupo
P
I
: obtida através da Análise de Variâncias para medidas repetidas: interação
Resultados
29
4.2. Análise EcoDopplercardiográfica
Os carneiros foram submetidos à ecocardiografia aos 7° e no 10°
meses de acompanhamento pós-operatório (Eco 1 e Eco 2).
A função ventricular estava preservada em todos os casos nos dois
grupos, no Eco 1 e Eco 2.
As valvas pulmonares foram bem visibilizadas e abriam-se sem
restrições, exceto no caso número 01, em que não houve boa visibilização.
Não foi evidenciada insuficiência da valva pulmonar em nenhum caso.
No exame realizado aos dez meses, em dois casos do grupo L-
Hydro foram descritos valvas com pouca e difusa calcificação.
Aos 7° e 10° meses foi avaliado o gradiente pulmonar máximo e
médio, a pressão do ventrículo direito (VD) e o diâmetro do enxerto.
Não houve diferença significativa entre os dois grupos, com exceção
do gradiente médio pulmonar (p= 0,01), aos 10 meses. As variáveis
Ecocardiográficas obtidas aos 7 e 10 meses foram analisadas pela Análise
de Variância para medidas repetidas e constam da Tabela 2.
Os dados completos estão discriminados no anexo D.
Resultados
30
4.3. Análise angiográfica e hemodinâmica
Não houve diferença estatística quando comparados os dois grupos
quanto à pressão venosa central (PVC), pressão arterial pulmonar (PAP),
pressão capilar pulmonar (PCP) e débito cardíaco.
Na angiografia pulmonar os dois grupos apresentaram
homoenxertos suficientes, com válvulas de mobilidade normal e sem
estenose, com exceção do caso número 1, do grupo L-Hydro, em que
constatamos insuficiência importante.
As médias, os erros-padrão e o nível descritivo do teste-t de Student
das variáveis hemodinâmicas constam da Tabela 2.
Os dados completos das variáveis angiográficas e hemodinâmicas
encontram-se no anexo E.
Resultados
31
Tabela 2. Comparação de variáveis selecionadas entres os grupos L-
Hydro e Controle
L-Hydro Controle
n = 7 n = 3 P P
G
P
I
Ecocardiograma
Gradiente máximo pulmonar,
mmHg 0,656
A
0,049 0,758
7 meses PO 2,8 ± 2,2 5,4 ± 1,9
10 meses PO 2,8 ± 0,6 5,0 ± 2,3
Gradiente médio pulmonar,
mmHg 0,301
A
0,030 0,957
7 meses PO 1,8 ± 1,4 3,4 ± 0,7
10 meses PO 1,4 ± 0,4 3,0 ± 1,2
Pressão em VD, mmHg <0,001
A
0,418 0,506
7 meses PO 18,8 ± 5,7 22,7 ± 3,4
10 meses PO 34,5 ± 5,9 39,6 ± 2,7
Diâmetro do enxerto
pulmonar 0,335
A
0,268 0,826
7 meses PO 21,0 ± 2,2 19,3 ± 0,6
10 meses PO 22,6 ± 2,3 20,3 ± 6,4
Dados Hemodinâmicos
PVC, cm de H
2
O -0,57 ± 1,31 0,50 ± 0,87 0,24*
PAP, mmHg 8,00 ± 3,51 8,33 ± 2,08 0,88*
PCP, mmHg 3,90 ± 0,89 4,50 ± 4,77 0,78*
Débito cardíaco, ml/
minuto 4035 ± 843 4393 ± 907 0,56*
Os dados são apresentados como média±DP;
* significância estatística obtida pelo teste t de Student.
A
obtida através da Análise de Variâncias para medidas repetidas: fator tempo
P
G
: obtida através da Análise de Variâncias para medidas repetidas: fator grupo
P
I
: obtida através da Análise de Variâncias para medidas repetidas: interação
mmHg= milímetros de mercúrio; Pressão em VD= pressão no ventrículo direito; PVC=
pressão venosa central; PAP= pressão em artéria pulmonar; PCP= pressão em capilar
pulmonar; ml/minuto= mililitros por minuto.
Resultados
32
4.4. Análise dos achados radiológicos
A Mamografia demonstrou ausência de imagens radiopacas
sugestivas de calcificação (Alta Densidade) nas válvulas pulmonares, tanto
no grupo L-Hydro quanto nos homoenxertos a fresco.
Evidência houve de áreas com imagens radiopacas sugestivas de
calcificação (Alta densidade) nas regiões correspondentes às linhas de
sutura, tanto nos enxertos teste quanto nos enxertos controle.
A classificação de GRABENWOGER proposta no material e
métodos não foi utilizada pela ausência de calcificações.
4.5. Avaliação macroscópica
O caso 01, do grupo L-Hydro, apresentou insuficiência valvar às
custas de vegetações fibrinosas, parcialmente calcificadas, localizadas nos
seios de Valsalva, com destruição das válvulas.
Com exceção deste caso, os homoenxertos do grupo L-Hydro e
homoenxerto a “fresco” não apresentaram estenose, insuficiência,
deiscência ou rupturas/abrasão.
Também, com a exceção do caso número 01, todos os outros casos
dos dois grupos apresentaram válvulas flexíveis, coaptadas e não
espessadas.
Resultados
33
Quanto a trombo, em um outro caso do grupo L-Hydro, constatamos
sua existência no tamanho de 2x4mm numa das válvulas. Não constatamos
trombo em válvula, nos casos do grupo a “fresco”.
Verificamos trombo em seio de valsalva em quatro casos do grupo L-
Hydro e em todos os três do grupo a “fresco”.
Calcificação em válvulas verificou-se apenas no caso inicialmente
citado, e no anel valvar em nenhum caso dos dois grupos. Na figura 3
encontram-se alguns dos casos estudados.
Resultados
34
Figura 3. Avaliação Macroscópica. A) Grupo L-Hydro: calcificação de
1x1mm subcomissural. Válvulas flexíveis. B) Grupo controle:
trombo organizado no Seio de Valsalva de 5x7mm. Válvulas
flexíveis. C) Grupo L-Hydro: trombo organizado na borda livre, de
2x4mm. Válvulas flexíveis. D) Grupo L-Hydro: válvulas flexíveis.
Círculo amarelo demonstra o local da calcificação ou trombo.
Resultados
35
As variáveis da avaliação macroscópica, analisadas pelo teste exato
de Fischer, constam da tabela 3. No anexo F encontram-se discriminados os
achados macroscópicos de todos os casos da série, após 320 dias de
seguimento.
Tabela 3. Comparação de variáveis macroscópicas selecionadas entres os
grupos L-Hydro e Controle
L-Hydro Controle
N = 7 n = 3 P
Macroscopia (Calcificações e
Trombos)
Calcificação do anel 0 0 0,99
Calcificação das cúspides 1 0 0,99
Trombo no seio de Valsalva 3 3 0,20
Trombo nas cúspides 1 0 0,99
Macroscopia Geral do
Homoenxerto
Estenose 0 0 0,99
Insuficiência 1 0 0,99
Deiscência 0 0 0,99
Vegetações 1 0 0,99
Ruptura/Abrasão 0 0 0,99
Cúspides
Cúspides flexíveis 6 3 0,99
Cúspides coaptadas 6 3 0,99
Cúspides espessadas 1 0 0,99
Os dados são apresentados como contagens simples nas variáveis categóricas.
P: significância estatística obtida pelo teste exato de Fisher.
Resultados
36
4.6. Análise histológica
4.6.1. Aspectos da microscopia óptica
Observaram-se válvulas pouco retraídas, com adelgaçamento
progressivo em direção à borda livre, que apresentavam celularidade
geralmente escassa ou ausente e aspecto intensamente eosinófilo. De forma
geral, a celularidade intersticial predomina nas regiões próximas ao anel e
parece mais exuberante na metade voltada para a luz ventricular (camada
ventricular e espongiosa); entretanto, nódulos de maior celularidade
intersticial foram observados em áreas intermediárias das válvulas, nos
casos 8, 10 e 11. Células atapetando parte da superfície das válvulas foram
observadas em todos os casos, à exceção do número 1, em ambas as faces
(predominando na ventricular), tanto na região próxima ao anel como na
próxima à borda livre. No caso número 1 foi detectado no miocárdio cisto
parasitário, Sarcociystis spp, achado freqüente em ovinos e não relacionável
ao quadro infeccioso apresentado por este animal. A figura 4 mostra
exemplos de casos de acordo com a descrição acima.
O porcentual de revestimento celular, calculado da maneira já
descrita, está expresso nas medidas da tabela 4. O caso 1 não foi avaliado,
pois havia extensa destruição dos folhetos; entretanto, não foram vistas
células de revestimento superficial nesse caso. Os dois grupos
apresentaram porcentual de revestimento semelhante, analisados pelo teste
t de Student, com p= 0,775.
Resultados
37
Tabela 4. Mostrando o porcentual de revestimento celular.
Caso
Nº. de secções
de folheto
medidas
Perímetro total dos
folhetos (µm)
Perímetro total da
superfície com
revestimento celular
(µm)
Porcentual de
revestimento
celular
2 5 44173,72 10564,27 23,9
4 1 14315,41 3020,93 21,1
5 2 27332,38 2528,69 9,3
6 1 7862,29 5016,68 63,8
7 3 34719,29 9503,28 27,4
8 1 8838,98 16356 18,5
9 2 1109,17 3407,41 30,7
10 3 30986,3 17193,27 55,5
11 3 34209,26 9499,34 27,8
Resultados
38
Figura 4. Microscopia Òptica. A) Grupo L-Hydro: trombo em organização no
seio de Valsalva. B) Grupo Controle: nódulos de maior
celularidade. C) Grupo L-Hydro: Válvula com adelgaçamento
progressivo em direção à borda livre, com celularidade escassa.
D) Grupo L-Hydro: celularidade intersticial predomina nas regiões
próximas ao anel e parece maior na metade voltada para a luz
ventricular. Asteriscos demonstram local do trombo organizado(A)
e local do nódulo demaior celularidade(B).
Resultados
39
4.6.1.1. Análise imuno-histoquímica
As reações para fator VIII, CD31, CD34 e CD68 foram
completamente negativas, mesmo em células que deveriam apresentar
imunoreatividade, o que nos levou a concluir que o material não apresentava
boa preservação antigênica, provavelmente devido ao fixador utilizado
(Karnowsky).
4.6.2. Aspectos da microscopia eletrônica de varredura
Em todos os casos do Grupo L-Hydro e do Grupo homoenxerto a
fresco, à exceção do número 1, notaram-se áreas de superfície
pavimentadas por células arredondadas ou alongadas, por vezes com
disposição paralela, compatível com células endoteliais, como visto na figura
5.
No caso de número 1, observou-se ausência de endotélio,
verificando-se colágeno desnudo.
Todos os nossos casos apresentaram o aspecto de endotélio normal
de ovinos, conforme publicado na literatura
(60)
, ou seja, com células
poliédricas, de revestimento, com aspecto semelhante a paralelepípedo.
Resultados
40
Figura 5. Microscopia Eletrônica de Varredura. A) e B) Grupo L-Hydro:
células poliédricas, de revestimento, endoteliais, semelhantes a
paralelepípedo. C) e D) Grupo Homoenxerto a fresco: mesmo
aspecto.
4.6.3. Aspectos da microscopia de transmissão
Em meio a numerosas fibras de colágeno, verificou-se a presença
de células ultraestruturalmente íntegras, de formato arredondado ou
alongado (mais comumente), com numerosas projeções citoplasmáticas;
núcleo com cromatina condensada na periferia e citoplasma contendo
organelas habituais, notando-se, em algumas, corpúsculos eletro-densos. O
aspecto ultraestrutural compatível com células mesenquimais viáveis,
A B
C D
Resultados
41
provavelmente fibroblastos. Nos casos 5,6,7,9 foram observadas células
revestindo parcialmente as válvulas. Tais células eram semelhantes às
descritas anteriormente, apresentando projeções citoplasmáticas
interdigitantes. No caso 5 notou-se a presença focal de membrana basal
abaixo das citadas células e estruturas de junção celular estavam presentes
nos casos 6 e 9. No caso 9 notou-se a presença de abundante pinocitose e
grânulos citoplasmáticos elétron-densos em algumas dessas células
superficiais. Tais aspectos são compatíveis com células endoteliais,
provavelmente em processo de diferenciação.
Resultados
42
Figura 6. Microscopia Eletrônica de Transmissão. A) Grupo L-Hydro: células
intersticiais preservadas. B) Grupo L-Hydro: abundante pinocitose
e grânulos citoplasmáticos eletrodensos nas células superficiais
compatível com células endoteliais em processo de diferenciação.
C) Grupo homoenxerto a fresco: numerosas células intesticiais
alongadas, bem preservadas. D) Grupo homoenxerto a fresco:
célula intersticial alongada bem preservada. Asteriscos ressaltam
as células intersticiais.
Resultados
43
4.6.4. Descrição individual dos casos e tabelas
Descrição histológica individualizada de cada caso encontra-se no
anexo G.
O resumo dos achados histológicos encontra-se no anexo H.
As médias, os erros-padrão e o nível descritivo do teste-t de Student
das variáveis da avaliação histológica constam da tabela 5.
Tabela 5. Comparação de variáveis selecionadas entres os grupos L-Hydro
e Controle.
L-Hydro Controle
n = 7 n = 3 P
Microscopia Óptica
Células Superficiais 6 3 0,99
Células Inflamatórias 4 1 0,99
Nódulos de maior celularidade 0 3
<0,0
1
Microscopia Eletrônica
Células Superficiais MET 4 0 0,20
Células Superficiais MEV 6 3 0,99
Células Intersticiais MET 7 3 0,99
Os dados são apresentados como contagens simples nas variáveis categóricas.
P: significância estatística obtida pelo teste exato de Fisher.
Células Superficiais MET= presença de células superficiais na microscopia eletrônica de
transmissão; Células Superficiais MEV= presença de células superficiais na microscopia
eletrônica de varredura; Células Intersticiais MET= presença de células intersticiais na
microscopia eletrônica de transmissão.
Discussão
Discussão
45
5. DISCUSSÃO
Pesquisam-se há mais de cinqüenta anos substitutos valvares e
enxertos valvados, pois a necessidade de sua utilização é freqüente em
todas as regiões, desenvolvidas ou não. Impõe-se sempre o uso de um
substituto de qualidade, pois dele depende o sucesso do procedimento
cirúrgico. Outros fatores de relevância são a disponibilidade e o preço.
A criopreservação, método de escolha para preservação dos
homoenxertos, demonstra qualidade; porém, a disponibilidade deixa a
desejar e seu custo pode ser elevado. Alguns eventos, como a degeneração
no longo prazo
(61)
, a calcificação precoce em jovens
(62)
, a dificuldade de uma
esterilização garantida sem agredir as células e a estrutura extra-celular
(63;64)
persistem. Sua sofisticação e alto custo dificulta seu emprego em regiões
menos desenvolvidas, pois complexo mesmo quando disponível o transporte
do enxerto criopreservado.
Ao se optar por substituto valvar biológico, o ideal seria a utilização
de heteroenxertos – com alguma forma de tratamento – pela facilidade de
obtenção, embora a resposta imunológica possa ser maior. A tentativa foi
feita através do método Sinergraft (Criolife, Inc.). Após bons resultados
experimentais, o uso clínico dos heteroenxertos decelularizados revelou-se
Discussão
46
desastroso
(65)
, sendo descontinuado, permanecendo o método empregado
em homoenxertos, com bons desfechos publicados recentemente
(66)
. A
decelularização de heteroenxertos pelo ácido deoxicólico (DOA) mostra bons
resultados experimentais
(67)
e clínicos, aos 24 meses de observação
(68)
.
Outros métodos de decelularização, como o que emprega o dodecilsulfato
de sódio (SDS) em homoenxertos, revela-se promissor.
(69)
O polietilenoglicol (PEG), já testado em outros tipos de tecido
(51-53)
,
se apresenta como método mais simples quando comparado à
criopreservação. É também método de baixo custo e pouco sofisticado. Os
homoenxertos preparados pelo método L-Hydro apresentaram facilidade de
manuseio e de colocação das suturas, e a hemostasia nos orifícios de sutura
fez-se rápida e completa.
O agente de preservação tecidual do método L-Hydro
TM
é o
polietilenoglicol (PEG). Este é um polímero bastante estável quimicamente,
devido ao grande número de oxigênio na cadeia polimérica, tendo grande
propensão à formação de complexos e associando-se a eletrólitos em
soluções diluídas. O PEG é produzido a partir do óxido de etileno, sendo
solúvel em água, cetonas, glicerol e etanol; entretanto, é menos higroscópico
e resiste melhor à decomposição do que estes dois últimos compostos
(63;70)
,
sendo quimicamente inerte e pouco tóxico. Quando absorvido pela
circulação sanguínea, sua excreção se faz completamente pelo rim, sem ser
metabolizado. Tem aplicação clínica como veículo para dissolver fármacos
pouco solúveis em água, como a reserpina e a nitrofurantoína ou aqueles
facilmente hidrolisáveis, como os barbituratos alcalinos
(71-74)
.
Discussão
47
WICOMB et al.
(75)
demonstraram a toxicidade reduzida do PEG,
relatando experimentalmente que a administração de dose elevada, 16 g/kg
durante 12 a 16 horas, não produzia efeitos adversos, e que a administração
prolongada é igualmente inócua.
O PEG mostrou-se eficaz em vários estudos experimentais in vitro
quando adicionado à solução de preservação miocárdica, garantindo a
viabilidade funcional do orgão por tempo mais prolongado (até 24 horas) do
que aquele preconizado com o uso das soluções cardioplégicas
convencionais como a de “Saint Thomas” e da “University of Wisconsin”, que
é de quatro a seis horas
(43;45;76)
. Esta capacidade de preservação mais
prolongada deve-se à ação osmótica do PEG, que estabiliza a membrana
tornando-a menos permeável ao soluto extracelular e, conseqüentemente,
prevenindo o edema celular
(75)
. O PEG mostrou-se igualmente eficaz
quando utilizado na criopreservação de coração de ratos conforme o estudo
de BANKER et al.
(42)
, os quais relataram que a inclusão de PEG permitiu a
redução do conteúdo de água e da formação de gelo tecidual, minimizando
eventuais lesões miocárdicas pelo congelamento.
A preservação L- Hydro
TM
utilizada neste estudo está baseada
também na capacidade imunossupressora do PEG. Antígenos que se
combinam com o PEG manifestam redução de antigenicidade, como
relatado por COLLINS et al
(49)
, que observaram redução de 30% na
incidência de rejeição no grupo de receptores de transplante cardíaco nos
quais os órgãos dos doadores foram preservados com uma solução
contendo PEG a 5%. O estudo de TOKUNAGA et al
(44)
demonstrou aumento
Discussão
48
estatisticamente significante na sobrevivência (11,9 versus 9,6 dias) com
transplante hepático de ratos cujos orgãos foram previamente irrigados com
solução de PEG de alto peso molecular (20.000 daltons). Estes autores
atribuem a ação imunossupressora à ligação do PEG com os antígenos da
membrana celular, formando complexos reversíveis, os quais alteram ou
mascaram sua superfície celular de maneira análoga àquela descrita para a
combinação química específica com os alérgenos, ou seja, interferem na
ativação dos macrófagos e, conseqüentemente, na ativação das células T4,
induzindo ao estado de tolerância aos antígenos do doador, cuja
imunogenicidade torna-se reduzida. De modo semelhante, na preservação
L-Hydro
TM
os antígenos são extraídos e os remanescentes são mascarados
mediante a oxidação química controlada com o uso do PEG.
Cheung afirma que “este é um processo que torna as células não
viáveis, não agredindo a estrutura extracelular, não preocupando-se em
extrair as células, no que difere da decelularização” (comunicação pessoal).
A literatura mostra que homoenxertos aórticos de carneiros tratados
pelo PEG
(41)
e utilizados na aorta descendente permanecem funcionais após
nove meses, com a matrix de colágeno original, sem calcificação e
apresentando reabitação celular.
Nas biopróteses suínas tratadas pelo PEG e implantadas em
carneiros jovens
(51)
, este tratamento permitiu a endotelização espontânea
com boa adesividade celular à matriz colagênica. Vários outros trabalhos
estão em curso utilizando o PEG, como o uso de xenoenxertos
Discussão
49
pulmonares
(52)
, prótese vascular heteróloga
(53)
e biopróteses sem suporte,
todos com resultados iniciais alentadores.
Para conduzir este trabalho “in vivo”, optamos pelo uso do carneiro,
pela semelhança de suas válvulas e estruturas cardíacas com as do coração
humano, em termos de propriedades mecânicas e parâmetros de fluxo
hemodinâmico
(77)
. O tamanho do anel valvular, a freqüência e o débito
cardíaco são também equivalentes
(78)
.
A análise de 1200 animais, mamíferos domésticos, revelou
semelhança de suas válvulas aórtica e pulmonar com as humanas, diferindo
somente na proporção dos componentes do tecido conjuntivo
(79)
.
Escolhemos animais imaturos (juvenis) para uso, pois nestes os
tecidos biológicos calcificam e degeneram progressiva e rapidamente, como
nos pacientes jovens
(80;81)
.
Há dificuldade de trabalhar com tais modelos, haja vista a dificuldade
expressa na literatura devido ao número reduzido de animais utilizados nos
vários trabalhos publicados
(82-85)
.
A International Standards Organization, através da ISO-5840,
propõe, para trabalhos experimentais, o uso de 10 (dez) animais por 20
(vinte) semanas para o grupo “teste”, e de 02 (dois) animais pelo mesmo
período para o grupo controle. Este trabalho tem 07 (sete) animais no grupo
L-Hydro, porém com um seguimento de 45 (quarenta e cinco) semanas, o
que representa um seguimento superior ao recomendado. No grupo
homoenxerto a fresco, o número de animais é maior que o sugerido
(86;87)
.
Discussão
50
O preparo, a técnica cirúrgica e os cuidados com os carneiros
seguiram as rotinas publicadas
(88)
.
Comparamos o grupo L-Hydro com o grupo controle, de
homoenxertos a ”fresco” de uso imediato, constituindo-se pois de enxertos
“homovital”. Assim procedemos para termos como referencial de
comparação, no grupo controle, o “padrão ouro” dos enxertos. Trabalhos
clínicos publicados com o uso de enxertos “homovital” mostram um
excepcional resultado, atingindo até 97% de enxertos livres de degeneração
em 10 anos
(89)
.
Sabemos que qualquer processamento dos homoenxertos, incluindo
a esterilização, tem o potencial de alterar a viabilidade, bem como as
propriedades físicas e antigênicas da valva. Na série de Yacoub
(89)
, a
aplicação do “homovital” foi fator independente de redução de mortalidade,
portanto nosso grupo controle representa o que de melhor se pode obter
com esta técnica.
O número de carneiros no grupo homoenxertos frescos, como já
discutido, ultrapassa o mínimo recomendado pela ISO-5840. Outro fator a
ser levado em conta é o conhecido comportamento dos homoenxertos de
carneiro a “fresco” descrito na literatura
(30;41;91-93)
, os quais, após alguns
meses, apresentam marcada redução da celularidade, podendo apresentar
formação de feixes fibrosos recobrindo parcialmente as válvulas, mostrando
infiltração de macrófagos e camada endotelial com perda da continuidade e
ruptura progressiva da estrutura trilaminar. Nossos casos a “fresco”
apresentaram as alterações descritas na literatura.
Discussão
51
Nos dois grupos, grupo L-Hydro e grupo homoenxertos a “fresco”,
não detectamos diferença estatisticamente significante quanto à idade, peso
inicial e final e ganho ponderal.
Os exames laboratoriais colhidos aos 6 e 11 meses
(78)
não
demonstraram diferenças estatisticamente significativas entre os dois grupos
quanto às variáveis estudadas. O hematócrito e a hemoglobina se
mostraram elevados aos 11 meses, mas sem diferenças entre os grupos.
Atribuímos esta elevação a uma possível desidratação dos animais ao final
do experimento.
O ecocardiograma, nas janelas cranial e caudal esquerda, tem se
mostrado confiável na avaliação pós-operatória em carneiros jovens. Seus
resultados têm sido concordantes com os achados pós-explante, quanto à
presença de calcificação, mensuração de estruturas e informações
hemodinâmicas
(94)
. Usamos pois esta ferramenta, realizando o
ecocardiograma aos sete e dez meses do pós-operatório que, ao mostrar
função ventricular preservada em todos os casos, indicou boa funcionalidade
dos enxertos; revelou válvulas bem visualizadas e com abertura sem
restrições. Houve a exceção do caso 01, no qual as mesmas não foram bem
visualizadas, o que correspondeu ao achado macroscópico, pois neste caso
os folhetos estavam destruídos. Em dois casos, no grupo L-Hydro, a
Ecocardiografia detectou válvulas com calcificação leve e difusa (casos 2 e
9). Estes achados não tiveram correspondência no estudo radiológico,
tampouco no exame macroscópico, sendo que o caso 9 apresentou
calcificação focal na microscopia óptica.
Discussão
52
Aos sete e dez meses de PO, os gradientes pulmonares médio e
máximo mostraram-se com diferença significativa a favor do grupo L-Hydro,
revelando gradientes médios mais elevados no grupo de homoenxertos a
fresco, demonstrando neste aspecto melhor comportamento do grupo L-
Hydro. O anel pulmonar no grupo L-Hydro mostrou aumento estatisticamente
significativo entre o implante e os Eco 1 e Eco2. Entre os dois Ecos,
realizados aos 7 e 10 meses, não houve aumento significativo do anel
pulmonar.
As medidas hemodinâmicas foram registradas conforme as
recomendações do U. S. Department of Health, observando a necessidade
de um débito cardíaco mínimo por ocasião de sua mensuração. Estas
revelaram bom desempenho nos dois grupos, não se estabelecendo
diferenças significativas entre os mesmos.
O exame macroscópico do homoenxerto pulmonar – e
particularmente das valvas pulmonares – obedeceu à sistemática descrita
por Saik e cols., que nos pareceu a mais completa publicada
(95)
. O exame
revelou em todos os casos uma boa integração do enxerto, bem como
válvulas com aspecto normal – à exceção do caso 01 (grupo L-Hydro), que
apresentava válvulas destruídas, exibindo processo infeccioso, com gânglios
cervicais respondendo ao tratamento antibiótico, ao que atribuímos os
achados. O cisto parasitário encontrado no miocárdio deste caso,
Sarcocystis spp, é achado freqüente neste tipo de animal, não se
relacionando ao quadro infeccioso. Calcificações nas válvulas ou no anel
não foram verificadas pelo exame radiológico ou à macroscopia, constituindo
Discussão
53
resultado satisfatório, pois trabalhou-se com carneiros jovens, por um prazo
longo. Presença de trombos nas válvulas ou nos seios de Valsalva revelou-
se achado comum, justificado pelo não uso de anticoagulantes. Ressalte-se
ser este um achado freqüente na literatura
(96)
; nestes aspectos, não
conseguimos detectar diferenças entre os grupos.
Os achados microscópicos, excetuando-se o caso de número 01,
mostraram a presença de camada endotelial nos enxertos, já que tanto a
microscopia ótica quanto a microscopia eletrônica de transmissão (e
especialmente a de varredura) confirmaram a presença de camada de
células de revestimento. Este achado é importante, já que células endoteliais
previnem trombose, produzem substâncias vasoativas, nutrem fibroblastos,
estimulam a produção de colágeno, ajudam a prevenir a insudação lipídica e
a calcificação distrófica
(22)
. O porcentual de revestimento celular foi
semelhante nos dois grupos. As reações imuno-histoquímicas foram
negativas, mesmo em células que obrigatoriamente deveriam apresentar
imunorreatividade. Atribuímos este achado ao uso da Solução de Karnowski.
Foi demonstrada na MET a presença de células intersticiais,
fibroblastos, em todos os casos. Assim, também com os achados
microscópicos não conseguimos estabelecer diferenças entre os dois
grupos. A exceção foi o achado de nódulos de maior celularidade, que foram
significativamente mais frequentes no grupo controle. Presença de nódulos
de maior celularidade nas válvulas foram descritos em homoenxertos
(97)
e
interpretados como forma de ingresso celular do hospedeiro. A presença de
nódulos de celularidade em todos os casos do grupo controle foi por nós
Discussão
54
atribuída a uma repopulação intersticial mais rápida neste tipo de
homoenxerto. Entendemos que o método L-Hydro propiciou uma boa
incorporação do enxerto, pela presença de endotelização e de células
intersticiais na matriz
(98)
em todos os casos, ainda que as células sejam
numericamente diminuídas em relação ao tecido normal.
Fator a ser levado em conta na análise destes resultados é o fato
dos carneiros apresentarem baixa reação antigênica, tanto que usa-se
sangue entre os animais sem preocupação com o sistema ABO/Rh, e sem
conseqüências clínicas.
Neste estudo, que conta com uma amostra de 3 animais no grupo
controle e de 7 no grupo teste, torna-se importante focar o significado dos
achados não significativos e de sua interpretação. Ao usarmos ao longo do
texto a expressão “não foram detectadas diferenças” ao invés da expressão
“os grupos são semelhantes entre si”, estamos procurando utilizar a
evidência fornecida pelos achados. Em outras palavras, não estamos
afirmando categoricamente que existe semelhança entre os grupos, mas sim
que os indícios do estudo não trazem evidências suficientes da existência de
uma diferença entre os grupos
(99)
. Segundo diversos autores estatísticos,
“ausência de evidência não é evidência de ausência”
(100)
.
Homoenxertos criopreservados implantados em ovinos jovens têm
comportamento conhecido na literatura
(30;91;93;101)
. Os achados histológicos
mostram perda da celularidade, desorganização da estrutura trilaminar dos
folhetos e presença de revestimento endotelial irregular. Estes achados são
semelhantes aos encontrados em nossos casos, o que nos leva a supor que
Discussão
55
o método L-Hydro, pela sua simplicidade, pudesse competir com vantagem
com a criopreservação. Deixamos finalmente a sugestão de que se deverá
comparar diretamente os dois métodos de preservação, a criopreservação e
o método L-Hydro, para estabelecer possíveis vantagens de um método
sobre outro.
Conclusões
Conclusões 57
6. CONCLUSÕES
A comparação do homoenxerto pulmonar conservado pelo método
L-Hydro com o homoenxerto fresco, implantado ortotopicamente em
carneiros jovens, seguidos por 320 dias, mostrou:
1. O homoenxerto tratado pelo PEG apresentou desempenho
clínico e hemodinâmico semelhante ao homoenxerto a
fresco. Ao ecocardiograma revelou-se superior ao
homoenxerto a fresco;
2. O homoenxerto tratado pelo PEG apresentou evidências
histológicas de repopulação celular intersticial e endotelial;
3. O homoenxerto tratado pelo PEG apresentou macroscopia,
estrutura histológica e ultraestrutural semelhante ao
homoenxerto a fresco, à exceção de nódulos de maior
celularidade intersticial, presentes apenas no homoenxerto a
fresco.
Anexos
Anexos 59
7. ANEXOS
Anexo A. Dados de identificação dos animais de experimentação: número,
registro, data de nascimento, idade, peso e categoria
Caso Registro DN
Idade/
Meses
Peso
Inicial/kg
Peso
final/kg
Categoria
1 85AM 1/8/03 6 meses 26 44 Teste
2 84AM 1/9/03 5 meses 22 40 Teste
3 100AM 1/10/03 4 meses 21 Teste
4 88AM 1/9/03 5 meses 22 42 Teste
5 71VD 1/10/03 4 meses 19 32 Teste
6 25VD 1/10/03 4 meses 18 25 Teste
7 99AM 1/9/03 5 meses 22 48 Teste
8 89AM 1/8/03 6 meses 25 37 Controle
9 98AM 1/8/03 6 meses 32 52 Teste
10 100VD 1/9/03 5 meses 21 42 Controle
11 02VM 10/9/03 5 meses 21 38 Controle
DN= data nascimento do carneiro
Peso inicial/kg= peso inicial no momento do implante do homoenxerto
Peso final/kg= peso final por ocasião do sacrifício do carneiro
Anexos 60
Anexo B. Variáveis intra-operatórias
Caso Categoria
Tipo de
Homoenxerto
Tamanho Posição TCEC Data
1 Teste L-Hydro 15 Pulmonar 39 9/2/2004
2 Teste L-Hydro 13 Pulmonar 41 9/2/2004
3 Teste L-Hydro 13 Pulmonar 49 10/2/2004
4 Teste L-Hydro 15 Pulmonar 43 10/2/2004
5 Teste L-Hydro 11 Pulmonar 38 11/2/2004
6 Teste L-Hydro 11 Pulmonar 32 11/2/2004
7 Teste L-Hydro 15 Pulmonar 30 11/2/2004
8 Controle
Homovital
Pulmonar 35 12/2/2004
9 Teste L-Hydro 15 Pulmonar 38 12/2/2004
10 Controle
Homovital
Pulmonar 34 12/2/2004
11 Controle
Homovital
Pulmonar 31 13/2/2004
Tipo de homoenxerto= tipo do homoenxerto usado em cada animal
Tamanho= diâmetro do homoenxerto usado em cada carneiro
TCEC= tempo de circulação extracorpórea em minutos
Anexos 61
Anexo C. Dados dos exames laboratoriais (1ª amostra)
Caso hemácias Hb Ht Leucócitos plaquetas cálcio fósforo DHL
1 8000 14,6 50 9400 650000 9 6,8 231
2 11000 15,6 53 6400 500000 9,1 7,1 251
3
4 8000 15,5 52 6400 550000 8,1 7,1 271
5 12000 12,3 44 12900 650000 9,8 6,9 282
6 9550 14,2 51 5450 450000 8,7 7,3 367
7 13500 9,8 48 4400 700000 10,0 6,2 312
8 12800 12,6 48 5250 350000 9,1 8,9 393
9 20000 14,4 61 5100 75000 8,7 ,1 334
10 17200 10,5 53 4000 550000 10,0 5,4 402
11 15600 14,0 54 8200 700000 10,5 6,2 373
Hb= hemoglobina
Ht= hematócrito
DHL= desidrogenase lática
Anexos 62
Dados dos exames laboratoriais (2ª amostra)
Caso Hemácias Hb Ht leucócitos plaquetas cálcio fósforo DHL
1 10000 18,6 73 9000 650000 9,7 7,2 272
2 11000 17,6 80 3800 500000 9,6 7,7 278
3
4 9000 14,4 69 4000 600000 9,6 7,1 283
5 12000 14,5 67 10900 650000 9,3 8,8 366
6 12000 15,9 66 7800 450000 9,3 7,8 272
7 14000 16,3 68 4800 700000 8,0 6,4 362
8 13000 15,4 73 5000 400000 9,2 10,90 341
9 15000 14,4 76 4200 750000 9,5 8,1 329
10 16000 16,0 79 4000 550000 9,6 9,0 351
11 15000 14,1 73 5000 700000 8,9 7,8 324
Hb= hemoglobina
Ht= hematócrito
DHL= desidrogenase lática
Anexos 63
Dados da evolução ponderal, peso inicial e peso final
casos Categoria Peso inicial tempo PO peso final
1 Teste, L-Hydro 26 320 d 44
2 Teste, L-Hydro 22 320 d 40
3 Teste, L-Hydro 21
4 Teste, L-Hydro 22 320 d 42
5 Teste, L-Hydro 19 320 d 32
6 Teste, L-Hydro 18 320 d 25
7 Teste, L-Hydro 22 320 d 48
8 Controle, fresco 25 320 d 37
9 Teste, L-Hydro 32 320 d 52
10 Controle, fresco 21 320 d 42
11 Controle, fresco 21 320 d 38
Peso inicial= peso inicial de cada carneiro
Tempo PO= tempo de acompanhamento pós-operatório
Anexos 64
Anexo D. Variáveis EcoDopplercardiográficas
Resultados obtidos em 09/2004 ( Eco 1)
Caso Categoria
Tempo de
Pós-Operatório
Gradiente
Máximo
Gradiente
Médio
Área
Homoenxerto
Pressão
VD
1 Teste, L-Hydro 240 dias 1,4 0,8 19
2 Teste, L-Hydro 240 dias 0,8 0,5 19 22
3 Teste, L-Hydro
4 Teste, L-Hydro 240 dias 2,7 1,7 22 15
5 Teste, L-Hydro 240 dias 4,3 3,1 21 15
6 Teste, L-Hydro 240 dias 1,3 0,6 19 11,5
7 Teste, L-Hydro 240 dias 7,0 4,3 22 26
8 Controle, fresco 240 dias 4,4 2,7 19 26
9 Teste, L-Hydro 240 dias 2,4 1,7 25 23
10 Controle, fresco 240 dias 4,3 3,3 20 23
11 Controle, fresco 240 dias 7,6 4,1 19 19,15
Anexos 65
Resultados obtidos em 12/2004 (Eco 2)
Caso Categoria
Tempo de
PO
Gradiente
Máximo
Gradiente
Médio
Área
Homoenxerto
Pressão
VD
1 Teste, L-Hydro 330 d 2,0 0,9 22 34
2 Teste, L-Hydro 330 d 2,5 1,3 22 34
3 Teste, L-Hydro 330 d
4 Teste, L-Hydro 330 d 2,2 0,9 26 38
5 Teste, L-Hydro 330 d 2,9 2,1 20 26
6 Teste, L-Hydro 330 d 3,5 1,3 20 30,4
7 Teste, L-Hydro 330 d 3,4 1,7 25 45
8 Controle, fresco 330 d 4,1 2,8 13 N/A
9 Teste, L-Hydro 330 d 2,8 1,4 23 34
10 Controle, fresco 330 d 3,2 1,9 24 41,5
11 Controle, fresco 330 d 7,6 4,2 24 37,7
Tempo de PO= tempo de acompanhamento pós-operatório
Gradiente máximo= gradiente máximo trans-pulmonar
Gradiente Médio= gradiente médio trans-pulmonar
Área homoenxerto= área calculada do homoenxerto pulmonar
Pressão VD= pressão do Ventrículo Direito
Anexos 66
Anexo E. Variáveis angiográficas e hemodinâmicas
Caso Categoria
Tempo
implante
PAP PCP DC
Arteria
Pulmonar
Insuficiente
1 Teste, L-Hydro 327 dias 8 mmhg 3 mmhg 3615 Sim
2 Teste, L-Hydro 326 dias 2 mmhg N/A 5360 Não
3 Teste, L-Hydro
4 Teste, L-Hydro 329 dias 14 mmhg N/A 3060 Não
5 Teste, L-Hydro 325 dias 8 mmhg 3 mmhg 4360 Não
6 Teste, L-Hydro 328 dias 9 mmhg 4 mmhg 2980 Não
7 Teste, L-Hydro 326 dias 7 mmhg 4 mmhg 4610 Não
8 Controle, fresco 327 dias 10 mmhg 9 mmhg 3520 Não
9 Teste, L-Hydro 327 dias 8 mmhg 5 mmhg 4160 Não
10 Controle, fresco 326 dias 9 mmhg 4 mmhg 4330 Não
11 Controle, fresco 324 dias 6 mmhg 0 mmhg 5330 Não
PAP= pressão artéria pulmonar
PCP= pressão capilar pulmonar
DC= débito cardíaco
Anexos 67
Anexo F. Dados dos achados macroscópicos
Caso
ESTENOSE
INSUFICIENCIA.
DEISCENCIA
VEGETAÇÃO
RUPTURA/ABRASÃO
FLEXÍVEIS
COAPTADOS
ESPESSADO
TROMBO SEIO
VALSALVA
TROMBO FOLHETOS
CALCIFICAÇÃO
FOLHETOS
CALCIFICAÇÃO
ANEL
1 Não Sim Não SSN Não NNS Não SSN Não Não Sim Não
2 Não Não Não Não Não Sim Sim Não 1x1 Não Não Não
3
4 Não Não Não Não Não Sim Sim Não 1x2 Não Não Não
5 Não Não Não Não Não Sim Sim Não 1,5x 4 Não Não Não
6 Não Não Não Não Não Sim Sim Não Não Não Não Não
7 Não Não Não Não Não Sim Sim Não Não 2x4 Não Não
8 Não Não Não Não Não Sim Sim Não 1,5x 2 Não Não Não
9 Não Não Não Não Não Sim Sim Não 1x2 Não Não 1x1com
10 Não Não Não Não Não Sim Sim Não 5x7 Não Não Não
11 Não Não Não Não Não Sim Sim Não 4x8 Não Não Não
Anexos 68
Anexo G. Descrição histológica individualizada dos casos
Caso 1. Parasitose de cardiomiócitos ventriculares (provável protozoose).
Discreta constricção fibrosa ao nível da sutura inferior. Grandes
vegetações fibrinosas, parcialmente calcificadas, localizadas nos seios
de Valsalva e remanescentes dos folhetos junto ao anel, que exibem
infiltrado inflamatório e células intersticiais mesenquimais, identificadas
também pela MET. As válvulas acham-se muito escassamente
representadas (provavelmente destruídas em meio às vegetações), não
sendo identificadas células de revestimento superficial em seus
remanescentes, quer pela MO, MET ou MEV.
Caso 2. Trombos de fibrina focalmente nos seios de Valsalva, com área focal de
meteplasia cartilaginosa e calcificação do anel valvar. Áreas focais de
inflamação no anel valvar (relacionada à calcificação?), com permeação
focal do folheto, próximo ao anel. Válvulas com células intersticiais
mesenquimais, identificadas também pela MET e áreas de revestimento
celular superficial identificado pela MO e MEV.
Caso 4. Trombo de fibrina em seio de Valsalva, prolongando-se pela face arterial
da base da válvula, que acha-se portanto parcialmente aderida. Área
focal de discreta inflamação no anel valvar, porém não no folheto.
Folhetos com células intersticiais mesenquimais, identificadas também
pela MET e áreas de revestimento celular superficial (MO e MEV).
Caso 5. Trombo de fibrina em um seio de Valsalva. Células de revestimento
representadas na MO, MET e MEV.
Caso 6. Escassa representação das válvulas, que apresentam células
intersticiais em pequeno número. Células de revestimento representadas
na MO, MET e MEV.
Anexos 69
Caso 7. Trombo visualizado na borda livre de uma válvula, na foto macroscópica
(não representado na histologia). Áreas focais de células inflamatórias
nas bases das válvulas. Células de revestimento representadas na MO,
MET e MEV.
Caso 8. Constrição fibrosa sub-aórtica (anel fibroso). Trombo de fibrina em um
seio de Valsalva. Nódulo de maior celularidade intersticial focalmente, na
região intermédia do folheto. Células de revestimento representadas na
MO e MEV.
Caso 9. Trombo de fibrina e calcificação focal em seios de Valsalva e folhetos.
Intenso processo inflamatório, com deposição de pigmento
hemosiderótico na parede aórtica e folhetos. Células de revestimento
identificadas na MO, MET e MEV. Algumas apresentam estruturas de
junção celular, intensa pinocitose e grânulos citoplamáticos elétron-
densos pela MET (mais típicas para células endoteliais).
Caso 10. Trombo de fibrina em seio de Valsalva e folheto. Processo inflamatório
moderado na parede do homoenxerto, anel e válvula. Nódulo de maior
celularidade intersticial focalmente, na região intermédia do folheto.
MET mostrando numerosas células intersticiais alongadas, bem
preservadas. Células de revestimento superficial identificadas na MO e
MEV.
Caso 11. Trombo de fibrina em seio de Valsalva. Nódulos de maior celularidade
intersticial focalmente, na região intermédia do folheto. MET mostrando
numerosas células intersticiais alongadas, bem preservadas. Células
de revestimento superficial identificadas na MO e MEV.
Anexos 70
Anexo H. Tabela com os achados histológicos.
Caso
Células
Superficiais
MO
Celulas
Superficiais
MEV
Células
Intersticiais
Mesenquimais
Células
Inflamatórias
Folheto
Células
Superficiais
MET
1 Não Não Sim(MET) Sim
2 Sim Sim Sim(MET) Sim(focal)
3
4 Sim Sim Sim(MET) Não
5 Sim Sim Sim(MET) Não Sim
6 Sim Sim Sim(MET) Não Sim
7 Sim Sim Sim(MET) Sim(focal) Sim
8 Sim Sim Sim(MET) Não
9 Sim Sim Sim(MET) Sim Sim
10 Sim Sim Sim(MET) Sim
11 Sim Sim Sim(MET) Não
Células Superficiais MO= presença ou ausência de células superficiais na microscopia ótica;
Células Superficiais MEV= presença ou ausência de células superficiais na microscopia
eletrônica de varredura; Células Intersticiais Mesenquimais= presença de células intersticiais
mesenquimatosas na microscopia eletrônica de transmissão; Células Inflamatórias Folheto=
presença de células inflamatórias nos folhetos, à microscopia ótica de luz; Celulas Superficiais
MET= presença de células superficiais, constatadas na microscopia eletrônica de transmissão.
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