( PDF ) Avaliação da produção de hidrogênio por bactéria fototrófica púrpura não-sulfurosa em reator em batelada

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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

ESCOLA DE ENGENHARIA DE SÃO CARLOS

DEPARTAMENTO DE HIDRÁULICA E SANEAMENTO

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM HIDRÁULICA E SANEAMENTO

Ana Carolina Franco Ferreira de Andrade

AVALIAÇÃO DA PRODUÇÃO DE HIDROGÊNIO POR BACTÉRIA

FOTOTRÓFICA PÚRPURA NÃO-SULFUROSA EM REATOR EM BATELADA

Dissertação apresentada à Escola de Engenharia de São

Carlos da Universidade de São Paulo, como parte dos

requisitos para obtenção do Título de Mestre em

Hidráulica e Saneamento.

Orientadora: Profa. Dra. Maria Bernadete A. Varesche

São Carlos - SP

Junho de 2007

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Aos meus pais Aristides e Rita, por todo o

apoio e compreensão.

Agradecimentos

À Professora Dra. Maria Bernadete A. Varesche pela amizade, apoio, orientação, e por

acreditar no meu trabalho.

Às secretárias do Departamento de Hidráulica e Saneamento, Sá e Pavi, pela atenção e

ajuda nos assuntos burocráticos.

Aos docentes e funcionários do Departamento de Hidráulica e Saneamento da EESC-

USP pela dedicação e orientação que dispensam a seus alunos.

À Beth Moraes e Janja pela paciência, amizade e constante ajuda no laboratório.

Aos amigos do LPB: Alexandre, Arnaldo, Bruna, Clara, Dani, Eloísa, Gunther,

Leonardo, Lorena, Lucas, Luiz Ricardo, Márcia, Mércia, Sandra, Tiago e tantos outros que

compartilharam trabalho e momentos de descontração no LPB.

À Kátia e Tininha pela amizade, paciência e grande ajuda.

À Érika, Júlia e Noemi pela amizade, companheirismo, ajuda e momentos de

descontração.

Aos amigos eternos Carol, Fer, Géssia, Thaís e Lu pelo apoio, amizade, paciência,

conselhos e momentos de descontração.

Aos amigos de Cerqueira que mesmo distante sempre me apoiaram.

Ao Murilo pela amizade, apoio, companheirismo e muita paciência.

Aos meus irmãos Daniel e Karen, companheiros de brigas e grandes alegrias.

À minha mãe Rita e ao meu pai Aristides, exemplo a ser seguido.

À CAPES pela bolsa concedida.

A todos que, de alguma forma, contribuíram para a realização deste trabalho.

“É preciso pensar para acertar, calar para

resistir e agir para vencer”

Renato Kebl

RESUMO

ANDRADE, A. C. F. F. Avaliação da produção de hidrogênio por bactéria fototrófica

púrpura não-sulfurosa em reator em batelada. 2007. Dissertação (Mestrado) – Escola de

Engenharia de São Carlos, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2007.

As necessidades de energia global são, na sua maioria, dependentes de combustíveis

fósseis. Hidrogênio é uma energia limpa alternativa a esses combustíveis. Bactérias

fototróficas produzem hidrogênio a partir de compostos orgânicos por meio de processo

anaeróbio dependente de luz. Assim, este trabalho visou avaliar o efeito das concentrações

iniciais de ácido acético e biomassa, e a influência da intensidade luminosa, na produção de

hidrogênio por bactéria fototrófica púrpura não-sulfurosa. Foram utilizados reatores em

batelada de 2000 mL, com volume útil de 1000 mL e headspace de 1000 mL preenchido com

hélio. Nos reatores foi adicionado ácido acético e glutamato de sódio (0,8 mmol/L) como

fontes de carbono e nitrogênio, respectivamente, e cultura de bactéria fototrófica púrpura não-

sulfurosa previamente purificada. O aumento da concentração inicial de ácido acético de

10 mmol/L para 17 mmol/L não promoveu mudanças significativas tanto no crescimento

celular, quanto, na produção de hidrogênio (8,3 mL H

/g massa seca.h e 8,8 mL H

/g massa

seca.h, respectivamente), para intensidade luminosa de 9000 – 10.000 lux. Nessa mesma

intensidade luminosa, o aumento da concentração de biomassa inicial de 0,02 g/L para

0,04 g/L favoreceu o aumento da produção de hidrogênio de 8,8 mL H

/g massa seca.h para

10,6 mL H

/g massa seca.h, respectivamente. A produção de hidrogênio diminuiu

acentuadamente de 10,6 mL H

/g massa seca.h para 1,0 mL H

/g massa seca.h com a

diminuição da intensidade luminosa de 9000 – 10.000 lux para 4000 – 5000 lux. Na ausência

de luz não ocorreu crescimento e produção de hidrogênio. A cultura manteve-se

predominantemente avermelhada e as análises microscópicas mostraram a predominância de

bacilos curvos, Gram-negativos, aglomerados em formações de roseta; características típicas

de alguns gêneros de bactérias fototróficas púrpuras não-sulfurosas. Todos os ensaios foram

realizados à temperatura de 30 ± 1°C. A análise da estrutura da comunidade microbiana foi

realizada por reação de polimerização em cadeia (PCR) de fragmentos do gene RNAr 16S,

seguida de eletroforese em gel de gradiente desnaturante (DGGE), e revelou que não houve

variações relevantes na estrutura das populações microbianas em função das diferentes

condições de cultivo.

Palavras-chave: produção de hidrogênio, ácido acético, bactéria fototrófica púrpura não-

sulfurosa.

ABSTRACT

ANDRADE, A. C. F. F. Evaluation of hydrogen production by purple non-sulfur

phototrophic in batch reactor. 2007. M.Sc. Dissertation – Escola de Engenharia de São

Carlos, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2007.

The global energy requirements are mostly dependent on fossil fuels. Hydrogen is a

clean energy alternative to these fuels. Phototrophic bacteria produce hydrogen from organic

compounds by an anaerobic light-dependent electron transfer process. Therefore, this study

aimed at to evaluate the effect of the initial concentrations of acetic acid and biomass, and the

influence of the light intensity on hydrogen production by purple non-sulfur phototrophic

bacteria. The experiments were performed in batch operation, in reactors of 2000 mL, with

culture volume of 1000 mL and headspace of 1000 mL, filled with helium. Acetic acid and

sodium glutamate (0.8 mmol/L) were used as sources of carbon and nitrogen, respectively,

and culture of purple non-sulfur phototrophic bacteria previously purifided. The increase of

the initial acetic acid concentration from 10 mmol/L to 17 mmol/L did not promote significant

changes in the cell growth and in the hydrogen production (8.3 mL H

/g dry weight.h and

8.8 mL H

/g dry weight.h, respectively), under a light intensity of 9000 - 10,000 lux. In this

same light intensity, the increase of the initial biomass concentration from 0.02 g/L to

0.04 g/L resulted in an increase in the hydrogen production from 8.8 mL H

/g dry weight.h to

10.6 mL H

/g dry weight.h, respectively. The hydrogen production suddenly decreased from

10.6 mL H

/g dry weigh.h to 1.0 mL H

/g dry weight.h with the reduction of the light

intensity from 9000 - 10,000 lux to 4000 - 5000 lux. Hydrogen production was not observed

in absence of light. The culture remained predominantly purple and the microscopic analysis

showed the predominance of rod-shaped cells, Gram-negative, accumulated in formation of

rosettes; typical characteristics of some types of purple non-sulfur phototrophic bacteria. The

analysis of the structure of the microbial community was carried out by reaction of

polymerization in chain (PCR) of the RNAr 16S, followed of denaturing gradient gel

electrophoresis (DGGE), and reveled that the structure of the microbial populations did not

change significantly in function of the different conditions of culture.

Key words: hydrogen production, acetic acid, purple non-sulfur phototrophic bacteria.

iii

LISTA DE FIGURAS

Figura 3.1. Esquema geral de produção de hidrogênio por bactérias

fototróficas púrpuras não-sulfurosas

Figura 4.1. Fluxograma experimental 22

Figura 4.2. Reator em batelada (5000 mL) 28

Figura 4.3. Reator anaeróbio em batelada 29

Figura 5.1. Microscopia óptica de contraste de fase das seguintes amostras:

(a) inóculo e (b) reatores em batelada de enriquecimento

Figura 5.2. Bacilos curvos Gram-negativos em microscopia óptica de luz

comum

Figura 5.3. Curva-padrão de crescimento de bactéria fototrófica púrpura

não-sulfurosa

Figura 5.4. Crescimento celular e consumo de ácido acético da cultura de

bactérias fototróficas púrpuras não-sulfurosas em reatores em batelada

Figura 5.5. Produção de hidrogênio para diferentes concentrações de ácido

acético da cultura de bactérias fototróficas púrpuras não-sulfurosas em

reatores em batelada

Figura 5.6. Crescimento celular e consumo de ácido acético para diferentes

concentrações iniciais da cultura de bactérias fototróficas púrpuras não-

sulfurosas em reatores em batelada

Figura 5.7. Produção de hidrogênio para diferentes concentrações iniciais

da cultura de bactérias fototróficas púrpuras não-sulfurosas em reatores

em batelada

Figura 5.8. Efeito da intensidade luminosa no crescimento celular (a);

consumo de ácido acético (b) e na produção de hidrogênio (c)

Figura 5.9. Microscopia óptica de contraste de fase das amostras dos

reatores em batelada alimentados com ácido acético nas seguintes

concentrações: (a) 10 mmol/L e (b) 17 mmol/L

Figura 5.10. Microscopia óptica de contraste de fase das amostras dos

reatores em batelada inoculados com as seguintes concentrações de

biomassa: (a) 0,02 g/L e (b) 0,04 g/L

Figura 5.11. Microscopia óptica de contraste de fase das amostras dos

reatores em batelada mantidos sob iluminação de: (a) 9000 a 10.000 lux e

(b) 4000 a 5000 lux

Figura 5.12. Microscopia óptica de contraste de fase das amostras dos

reatores em batelada mantidos no escuro

Figura 5.13. Resultados das análises de DGGE dos fragmentos dos

produtos de PCR amplificados com primers do Domínio Bacteria para as

amostras: I – inóculo; 1 – ensaio com 10 mmol/L de ácido acético; 2 –

ensaio com 17 mmol/L de ácido acético; 3 – ensaio com 0,04 g/L de

biomassa; 4 – ensaio mantido sob iluminação de 4000 a 5000 lux; 5 – ensaio

mantido no escuro

Figura 5.14. Crescimento celular da cultura de bactérias fototróficas

púrpuras não-sulfurosas, na presença de diferentes substratos orgânicos

Figura 5.15. Produção de hidrogênio pela cultura de bactérias fototróficas

púrpuras não-sulfurosas, na presença de diferentes substratos orgânicos

Figura 5.16. Predomínio de bacilos curvos aglomerados em formações de

roseta, em microscopia óptica de contraste de fase de amostras dos frascos

alimentados com: (a) acetato de sódio, (b) benzoato de sódio, (c) citrato de

sódio, (d) fenol, (e) lactato de sódio e (f) metanol

Figura 5.17. Predomínio de bacilos curvos aglomerados em formações de

roseta, em microscopia óptica de contraste de fase de amostras dos frascos

alimentados com: (a) piruvato de sódio e (b) propionato de sódio

Figura 5.18. Microscopia óptica de contraste de fase de amostra do frasco

alimentado com succinato de sódio

Figura 5.19. Predomínio de bacilos retos, em microscopia óptica de

contraste de fase de amostra do frasco alimentado com glutamato de sódio

Figura 5.20. Bacilos curvos aglomerados em formações de roseta, bacilos

retos e filamentos, em microscopia óptica de contraste de fase de amostras

dos frascos alimentados com: (a) butirato de sódio, (b) etanol, (c) frutose e

(d) glicose

Figura 5.21. Foto dos frascos utilizados no ensaio de caracterização

nutricional, mostrando as diferentes colorações da cultura em suspensão,

na presença de diferentes substratos orgânicos

LISTA DE TABELAS

Tabela 3.1 – Estudos sobre produção de hidrogênio por bactérias

fototróficas

Tabela 4.1 - Composição do meio de cultura ATCC 112 23

Tabela 4.2 - Composição do meio de cultura para produção de hidrogênio 24

Tabela 4.3 - Composição da solução traço de metais 24

Tabela 4.4 - Composição dos reatores anaeróbios utilizados nos ensaios de

produção de hidrogênio

Tabela 4.5 - Primers utilizados nas análises de PCR/DGGE 35

Tabela 4.6 - Programação do termociclador para amplificação dos

fragmentos do DNAr 16S

Tabela 5.1 – Resultados obtidos nos ensaios de produção de hidrogênio 48

Tabela 5.2 – Crescimento celular, produção de hidrogênio, morfologias

predominantes e coloração da cultura no ensaio de caracterização

nutricional

LISTA DE ABREVIATURAS

ATP - adenosina trifosfato

CAT - ciclo dos ácidos tricarboxílicos

– dióxido de carbono

- óxidos de carbono

DGGE – eletroforese em gel de gradiente desnaturante

DNA – ácido desoxirribonucléico

DNAr – DNA ribossomal

FISH – hibridação in situ fluorescente

– gás hidrogênio

– gás nitrogênio

– amônia

- íon amônio

- óxidos de nitrogênio

PCR – reação de polimerização em cadeia

pH – potencial hidrogeniônico

PHB - poli-β-hidroxibutirato

RNA – ácido ribonucléico

RNAr – RNA ribossomal

rpm – rotação por minuto

- óxidos de enxofre

Tg - tempo de geração

µ - velocidade específica de crescimento

SUMÁRIO

RESUMO i

ABSTRACT ii

LISTA DE FIGURAS iii

LISTA DE TABELAS v

LISTA DE ABREVIATURAS vi

1 INTRODUÇÃO 1

2 OBJETIVOS 3

2.1 Objetivos específicos 3

3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 4

3.1 Hidrogênio como combustível 4

3.2 Produção biológica de hidrogênio 5

3.2.1 Microrganismos produtores de hidrogênio 6

3.2.2 Enzimas envolvidas na produção biológica de hidrogênio 7

3.2.3 Aparato fotossintético 8

3.2.4 Esquema geral da produção fototrófica de hidrogênio 10

3.2.5 Substratos para produção fototrófica de hidrogênio 12

3.2.6 Sistema híbrido 16

4 MATERIAL E MÉTODOS 20

4.1 Fluxograma experimental 20

4.2 Composição e preparo do meio de cultura e soluções estoque 23

4.2.1 Meio de crescimento 23

4.2.2 Meio de cultura para produção de hidrogênio 23

4.2.3 Solução traço de metais 24

4.2.4 Solução de vitamina B

4.2.5 Solução de acetato de sódio 25

4.2.6 Solução de glutamato de sódio 25

4.2.7 Soluções estoque dos substratos orgânicos 26

4.3 Enriquecimento de bactérias fototróficas púrpuras não-sulfurosas 27

4.4 Enriquecimento em condições específicas para produção de hidrogênio 27

4.5 Curva-padrão de crescimento 27

4.6 Ensaios de produção de hidrogênio 29

4.7 Determinação da velocidade específica de crescimento e tempo de

geração

4.8 Caracterização nutricional 31

4.9 Análises cromatográficas 32

4.9.1 Determinação de hidrogênio 32

4.9.2 Determinação de ácido acético 33

4.10 Análise da intensidade luminosa 33

4.11 Análise da diversidade microbiana 34

4.11.1 Exames microscópicos 34

4.11.2 Análise de biologia molecular 34

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO 37

5.1 Ensaios de enriquecimento 37

5.2 Curva-padrão de crescimento 38

5.3 Ensaios de produção de hidrogênio 39

5.3.1 Exames microscópicos 49

5.3.2 Biologia molecular 51

5.4 Caracterização nutricional 52

6 CONCLUSÕES 61

7 RECOMENDAÇÕES 63

8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 64

APÊNDICE 1 – Curva-padrão de crescimento de bactéria fototrófica

púrpura não-sulfurosa

APÊNDICE 2 – Tempo de experimento, valores de absorbância e

concentração de massa seca obtidos nos reatores anaeróbios em batelada

APÊNDICE 3 – Tempo de experimento, área cromatográfica e valores de

hidrogênio acumulado no headspace dos reatores anaeróbios em batelada

APÊNDICE 4 – Tempo de experimento e consumo de ácido acético nos

reatores anaeróbios em batelada

APÊNDICE 5 – Determinação da velocidade específica de crescimento e

tempo de geração

APÊNDICE 6 – Determinação da velocidade máxima de produção de

hidrogênio nos reatores anaeróbios em batelada

APÊNDICE 7 – Valores de massa seca e produção de hidrogênio do ensaio

de caracterização nutricional

ANEXO 1 – Curva de calibração do hidrogênio 89

1 INTRODUÇÃO

Durante os últimos anos (1980-2004), quase 90% da demanda de energia mundial foi

satisfeita por combustíveis fósseis (INTERNATIONAL ENERGY ANNUAL, 2004). A

ampla utilização destes combustíveis está causando mudanças no clima global devido,

principalmente, a emissão de poluentes como óxidos de carbono (CO

), óxidos de nitrogênio

(NO

), óxidos de enxofre (SO

), fuligem e compostos orgânicos, que são liberados na

atmosfera durante a queima do combustível fóssil. O conhecimento da quantidade finita

destes combustíveis na Terra e seu uso indiscriminado têm estimulado o desenvolvimento de

novas fontes de energia menos poluentes e mais sustentáveis (DAS e VEZIROGLU, 2001).

Hidrogênio é considerado a energia limpa do futuro, pois gera somente água durante

sua combustão, apresenta elevada conversão de energia por unidade de massa e pode ser

convertido em energia elétrica, energia mecânica ou calor (KONDO et al., 2002). Prevê-se

que a contribuição de hidrogênio para o consumo de energia global aumentará

aproximadamente 50% ao final do século 21, devido ao desenvolvimento de eficientes

tecnologias de utilização do hidrogênio como combustível (HE et al., 2006).

Hidrogênio pode ser produzido por vários processos, incluindo eletrólise da água,

reforma termocatalítica de compostos orgânicos ricos em hidrogênio e processos biológicos.

Hidrogênio é produzido quase que exclusivamente pela reforma a vapor do metano (LEVIN et

al., 2004). A produção do hidrogênio (biohidrogênio), usando microrganismos, é uma

promissora área de desenvolvimento tecnológico a partir de ampla variedade de fontes

renováveis.

Bactérias fototróficas são indicadas na literatura corrente como um dos mais

promissores sistemas anoxigênicos para a produção biológica de hidrogênio. Os principais

benefícios são os seguintes: elevado potencial teórico de produção; ausência de produção de

oxigênio, o qual causa inativação de sistemas enzimáticos responsáveis pela produção de

hidrogênio; capacidade de utilização de amplo espectro de luz; habilidade no consumo de

substratos orgânicos derivados de resíduos e, conseqüentemente, potencial para ser usado em

associação com tratamento de águas residuárias (DAS e VEZIROGLU, 2001).

O processo de fermentação anaeróbia no tratamento de águas residuárias tem como

principais produtos o ácido acético e butírico. Pouco se sabe sobre a conversão destes ácidos a

hidrogênio por bactérias fototróficas, e se esta conversão seria vantajosa a fim de acoplar a

produção de energia com o tratamento de resíduos orgânicos. Dessa forma, este trabalho visou

avaliar a produção de hidrogênio por bactéria fototrófica púrpura não-sulfurosa em reator em

batelada, utilizando ácido acético como fonte de carbono.

2 OBJETIVOS

O objetivo principal deste trabalho foi avaliar a produção de hidrogênio por cultura

purificada de bactéria fototrófica púrpura não-sulfurosa em reator em batelada.

2.1 Objetivos específicos

• Avaliar o efeito das concentrações iniciais de ácido acético e biomassa na

produção de hidrogênio por bactéria fototrófica púrpura não-sulfurosa;

• Verificar a influência da intensidade luminosa na produção fototrófica de

hidrogênio, utilizando ácido acético como fonte de carbono;

• Caracterizar a diversidade microbiana da cultura purificada de bactéria fototrófica

púrpura não-sulfurosa por meio de técnicas tradicionais de microbiologia e de

biologia molecular;

• Avaliar o crescimento e a produção de hidrogênio da cultura purificada, na

presença de diferentes substratos orgânicos.

3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

3.1 Hidrogênio como combustível

As necessidades de energia global são, na sua maioria, dependentes de combustíveis

fósseis (INTERNATIONAL ENERGY ANNUAL, 2004). Contudo, sabe-se que as reservas

desses combustíveis são escassas, e que esses compostos geram, como produto de sua

combustão, substâncias potencializadoras do efeito estufa. Logo, a percepção de que as

reservas de combustíveis fósseis são limitadas e de seus efeitos adversos ao ambiente têm nos

forçado a investigar fontes alternativas de energia.

Hidrogênio é o elemento mais abundante, compondo quase três quartos de toda a

massa do universo. Entretanto, hidrogênio não ocorre naturalmente como gás na Terra, mas

combinado com outros elementos, tais como oxigênio, carbono e nitrogênio. Para que o

hidrogênio possa ser utilizado como fonte energética, ele deve ser separado destes outros

elementos e extraído na sua forma molecular, ou seja, hidrogênio gasoso (H

Os vários processos de obtenção de hidrogênio incluem eletrólise da água, reforma

termocatalítica de compostos orgânicos ricos em hidrogênio e processos biológicos.

Entretanto, quase 95% do hidrogênio produzido provêm de reações do gás natural ou frações

de óleo com vapor a elevadas temperaturas (reforma a vapor), ou seja, a tecnologia

convencional de produção industrial de hidrogênio requer o consumo imediato ou indireto de

combustíveis fósseis, resultando em emissão de dióxido de carbono (CO

) e exaustão de

combustíveis (LEVIN et al., 2004).

Muitas pesquisas têm sido conduzidas no desenvolvimento de tecnologia de produção

de hidrogênio limpa, que dispensa a necessidade de combustíveis fósseis. Logo, o sistema de

produção global de hidrogênio, inicialmente baseado em combustíveis fósseis, está mudando

progressivamente em direção a fontes renováveis. Os pesquisadores exploram o uso de fontes

como luz solar e biomassa para produzir hidrogênio economicamente.

Segundo Momirlan e Veziroglu (2005), hidrogênio é usado, principalmente, na

manufatura de amônia, refinamento do petróleo e síntese de metanol. É também utilizado no

programa espacial da NASA (National Aeronautics and Space Administration) como

combustível de aeronaves espaciais, e em células que fornecem calor, eletricidade e água para

os astronautas. Além disso, há diversos estudos sobre a aplicação de hidrogênio na indústria

automobilística na forma de células combustíveis, dispositivos que convertem diretamente

hidrogênio em eletricidade, assim como para gerar energia elétrica em residências e

indústrias.

De acordo com He et al. (2006), a contribuição do hidrogênio para o consumo de

energia global aumentará aproximadamente 50% ao final do século 21, devido ao

desenvolvimento de eficientes tecnologias de uso final, tornando o hidrogênio o principal

abastecedor de energia. Entretanto, para este fim, será necessário que o hidrogênio seja

produzido de maneira renovável e em larga escala.

3.2 Produção biológica de hidrogênio

Processos de produção biológica do hidrogênio são considerados ambientalmente

corretos quando comparados aos processos termoquímicos e eletroquímicos. Processos

biológicos são, geralmente, controlados por organismos fotossintéticos ou fermentativos e

operados a temperatura e pressão ambientes, requerendo menores quantidades de energia.

Além disso, a produção biológica de hidrogênio não somente leva a novo caminho para

utilização de recursos como também facilita o tratamento de águas residuárias, uma vez que

pode utilizar ampla variedade de resíduos como fonte de carbono e energia (DAS e

VEZIROGLU, 2001).

3.2.1 Microrganismos produtores de hidrogênio

Vários microrganismos, tais como bactérias fototróficas anoxigênicas, cianobactérias,

algas ou bactérias fermentativas, são comumente utilizados para produção biológica de

hidrogênio. Entre estes, as bactérias fototróficas anoxigênicas são organismos potenciais para

produção em larga escala devido as suas elevadas eficiências de conversão e utilização de

variedade de substrato, tanto para crescimento, como para produção de hidrogênio (KOKU et

al., 2002).

As bactérias fototróficas anoxigênicas correspondem a grupo de microrganismos

metabolicamente diverso e amplamente distribuído em ambientes anaeróbios expostos à luz.

Os fototróficos anoxigênicos são semelhantes às plantas verdes por possuírem a habilidade de

converter a energia da luz em energia química para o crescimento. Entretanto, diferentemente

das plantas, não produzem oxigênio e, assim, são anoxigênicos. Além disso, possuem

bacterioclorofila, que absorve principalmente a luz infravermelha (máximo de absorção entre

800 e 925 nm), ao invés da luz vermelha de comprimento de onda curta (máximo de absorção

entre 430 e 680 nm) absorvida pela clorofila das plantas.

As células bacterianas também contêm carotenóides, pigmentos insolúveis em água

que absorvem a energia da luz e a transmitem à bacterioclorofila. A cor destes carotenóides é

a base para a divisão das bactérias fototróficas anoxigênicas em dois grupos principais: as

bactérias “púrpuras” (laranja a vermelho-púrpura) e as “verdes” (verde a marrom). Tais

bactérias são agrupadas, ainda, em relação à utilização de sulfetos, sendo divididas em

sulfubactérias, púrpuras e verdes, e bactérias púrpuras e verdes não sulfurosas (MADIGAN et

al., 2004).

A produção de hidrogênio dependente da luz realizada por bactéria fototrófica foi

primeiramente observada por Gest e Kamen (1949) em culturas de Rhodospirillum rubrum

Bactérias púrpuras não-sulforosas produzem hidrogênio e CO

por meio da decomposição

dependente da luz utilizando vários compostos orgânicos como doadores de elétrons para a

fotossíntese. Esta reação ocorre sob iluminação, na presença de atmosfera inerte, anaeróbia,

sob condições de limitação de nitrogênio, a partir da degradação de substratos orgânicos.

3.2.2 Enzimas envolvidas na produção biológica de hidrogênio

Todos os processos biológicos de produção de hidrogênio são fundamentalmente

dependentes da presença de enzima produtora de hidrogênio. Bactérias fototróficas têm sido

estudadas por sua capacidade de produzir hidrogênio através da ação de seu sistema

nitrogenase (HALLENBECK e BENEMANN, 2002).

A enzima nitrogenase normalmente reduz nitrogênio molecular (N

) a amônia (NH

mas também pode catalisar a produção de hidrogênio na ausência de N

, de acordo com a

reação:

+ 2e

+ 4ATP → H

+ 4ADP + 4P

(1)

A eficiência de operação da nitrogenase requer elevadas quantidades de adenosina

trifosfato (ATP) e poder de redução. Por esta razão, síntese e atividade desta enzima estão

sujeitas a controles regulatórios rigorosos. Um problema na aplicação de bactérias fototróficas

na produção de hidrogênio a partir de águas residuárias é como o íon amônio (NH

), que

geralmente está presente na composição dessas águas, afeta a produção, e como evitar seu

efeito inibitório, uma vez que NH

reprime a síntese da nitrogenase (ZHU et al., 2001).

Entretanto, esta inibição é reversível, e a nitrogenase recupera sua atividade quando o NH

consumido ou removido.

A presença de outra enzima, a hidrogenase, parece ser uma característica comum de

bactérias fototróficas (KALIA et al., 2003). Contudo, uma vez que a produção de hidrogênio é

atribuída principalmente a nitrogenase, a atividade de produção de hidrogênio pela

hidrogenase é desprezível. Esta enzima é geralmente aceita como “antagonista metabólico” da

nitrogenase, assumindo a função de consumidora de hidrogênio (HALLENBECK e

BENEMANN, 2002). Logo, a atividade da hidrogenase é crítica para a produção

fotoheterotrófica de hidrogênio, e são numerosos os esforços para eliminar a capacidade dos

organismos de sintetizar esta enzima, o que resulta, usualmente, em aumento na produção de

hidrogênio.

Ooshima et al. (1998) investigaram a produção de hidrogênio por Rhodobacter

capsulatus ST410, uma linhagem mutante da bactéria fototrófica Rhodobacter capsulatus

B100. A linhagem mutante ST410 exibiu carência da atividade hidrogenase e apresentou

produção de hidrogênio (3,3 L H

/L cultura) maior que a linhagem selvagem B100

(2,1 L H

cultura), quando foram utilizados 30 mmol/L de malato e 7 mmol/L de glutamato

como fontes de carbono e nitrogênio, respectivamente, a 33ºC e intensidade luminosa de

6600 lux.

3.2.3 Aparato Fotossintético

A energia requerida para crescimento, bem como para a atividade de produção de

hidrogênio da nitrogenase são fornecidas pelo aparato fotossintético, que converte energia

luminosa em energia química (ATP). O aparato fotossintético é composto de um “complexo

antena” de dez a centenas de moléculas de pigmentos que absorvem luz e um “centro de

reação”, que consiste de uma molécula extremamente especializada a qual transforma energia

luminosa em energia química (AKKERMAN et al., 2002).

Oxigênio é o regulador primário da síntese do aparato fotossintético; sua presença

reprime imediatamente a síntese de moléculas de bacterioclorofila, que são responsáveis pela

absorção de luz. O efeito é reversível e a síntese é retomada assim que o oxigênio é eliminado.

A luz também controla a síntese, mas seu efeito não é tão efetivo quanto o do oxigênio. Em

atmosfera anaeróbia, o número de vesículas fotossintéticas produzidas varia inversamente

com a intensidade de luz incidente (KOKU et al., 2002).

A produção de hidrogênio é catalisada pela nitrogenase sob suprimento de ATP e

poder de redução, ambos fornecidos pelo sistema fotossintético. A eficiência de conversão de

energia luminosa a hidrogênio é o fator chave na produção de hidrogênio. Logo, a avaliação

dessa eficiência é necessária antes que tais sistemas possam ser aplicados em escala real.

Quando a luz penetra na suspensão celular e vai para o fundo do reator, sua

intensidade declina exponencialmente. Uma vez que a produção de hidrogênio depende da

disponibilidade de energia luminosa, a produção de hidrogênio decresce com aumento da

profundidade. Nakada et al. (1995) investigaram a saturação de luz e estimaram a taxa de

produção de hidrogênio e a eficiência de conversão a várias profundidades de penetração de

luz em reator, usando Rhodobacter sphaeroides RV e iluminação superficial. Os autores

demonstraram que a velocidade de produção de hidrogênio decresceu rapidamente com o

aumento da profundidade de penetração devido à distribuição heterogênea de luz.

Contudo, sob forte intensidade de luz (acima de 10.000 lux) ocorre saturação

luminosa, porque o sistema fotossintético fornece quantidades excessivas de ATP e poder de

redução

comparada à capacidade da nitrogenase. Esta é a razão porque a eficiência de

conversão decresce sob elevadas intensidades luminosas. Há, ainda, outra razão para a

redução da eficiência de conversão luminosa, nomeada “efeito sombreador”, no qual a

penetração de luz é limitada pelos pigmentos no sistema fotossintético, que estão presentes

em excesso para o crescimento celular (KONDO et al., 2002). Em ambos os mecanismos de

redução da eficiência de conversão, a quantidade de pigmentos é considerada essencial.

Barbosa et al. (2001) estudaram o efeito da intensidade luminosa na produção de

hidrogênio por três diferentes linhagens de bactérias fototróficas, utilizando acetato como

fonte de carbono. Os autores demonstraram que sob baixa intensidade luminosa

(40 µmol fótons/m

.s) ocorreu maior eficiência luminosa e menor produção de H

. De acordo

com os autores, a grande diferença entre eficiências luminosas quando baixa (40 µmol

fótons/m

.s)

e alta intensidade de luz (680 µmol fótons/m

.s)

são fornecidas deve ser devido

ao fato de que para altas intensidades luminosas nem toda luz é absorvida. A outra razão

poderia ser o fornecimento de energia em excesso da capacidade da enzima de produção de

hidrogênio (nitrogenase) quando a intensidade de luz é alta, levando à baixa eficiência de

conversão.

Um método promissor para suprimir saturação luminosa é reduzir os pigmentos

fotossintéticos dos complexos captadores de luz em células bacterianas. Kondo et al. (2002)

tentaram solucionar o problema de saturação luminosa produzindo linhagem mutante, MTP4,

com quantidade reduzida de pigmentos, a partir de uma linhagem selvagem de Rhodobacter

sphaeroides RV. Os autores utilizaram lactato de sódio (50 mmol/L) como fonte de carbono e

verificaram que a supressão da saturação de luz aumentou a taxa de produção de hidrogênio,

sob intensidade luminosa de 16.000 lux, a 30ºC por 24 horas. Logo, MTP4 foi capaz de

produzir mais hidrogênio que R. sphaeroides RV.

3.2.4 Esquema geral da produção fototrófica de hidrogênio

De acordo com Koku et al. (2002), o esquema geral de produção fototrófica de

hidrogênio pode ser descrito como na Figura 3.1. O substrato orgânico entra no ciclo dos

ácidos tricarboxílicos (CAT), ou ciclo do ácido cítrico, onde é oxidado para produzir CO

elétrons. Trabalhando em paralelo está o aparato da membrana fotossintética, o qual converte

a energia luminosa em ATP. Este ATP é encaminhado para a nitrogenase junto com os

prótons e elétrons. Prótons são fornecidos em parte pelo ciclo CAT, e o restante é fornecido

pela ação da ATP-sintase do aparato fotossintético. Finalmente, a nitrogenase reduz os

prótons a hidrogênio molecular. Hidrogenase funciona primariamente na direção de consumo

de hidrogênio, produzindo ATP, prótons e elétrons. A quantidade líquida de hidrogênio

produzido é, então, a quantidade produzida pela nitrogenase menos a consumida pela

hidrogenase.

Figura 3.1. Esquema geral de produção de hidrogênio por bactérias fototróficas púrpuras não-

sulfurosas

Fonte: Koku et al. (2002)

De acordo com o esquema descrito acima, a produção de hidrogênio por bactérias

fototróficas púrpuras não-sulfurosas acontece através da ação do ciclo do ácido cítrico

anaeróbio dependente da luz (ciclo CAT). Quando a nitrogenase é inibida ou reprimida, a

atividade do ciclo CAT é severamente limitada e caminhos alternativos, como a síntese de

polissacarídeos, podem ser seguidos. Efeito similar ocorre quando a relação

carbono/nitrogênio é baixa, resultando em acúmulo de amônia e inibição da nitrogenase

(KOKU et al., 2002).

elétrons

Aparato

fotossintético

Hidrogenase

, elétrons

fora da

membrana

luz

Ciclo TCA Nitrogenase

ATP

sintase

Biossíntese

e produtos de

crescimento

substrato

ATP

elétrons

Aparato

fotossintético

Hidrogenase

, elétrons

fora da

membrana

luz

Ciclo TCA Nitrogenase

ATP

sintase

Biossíntese

e produtos de

crescimento

substrato

ATP

Aparato

fotossintético

Hidrogenase

, elétrons

fora da

membrana

fora da

membrana

luz

Ciclo CAT Nitrogenase

ATP

sintase

Biossíntese

e produtos de

crescimento

substrato

ATP

Nitrogenase

ATP

sintase

Biossíntese

e produtos de

crescimento

substrato

Biossíntese

e produtos de

crescimento

substrato

Entre os processos metabólitos alternativos à produção de hidrogênio tem-se a

formação do material de reserva, poli-β-hidroxibutirato (PHB), particularmente importante do

ponto de vista de desenvolvimento do processo, uma vez que o PHB tem valor econômico

como polímero biodegradável.

Vincenzini et al. (1997) estudaram a viabilidade do processo de fotoprodução de

hidrogênio molecular e material de reserva celular (poli-β-hidroxibutirato, PHB), utilizando

culturas semi-contínuas em batelada de Rhodopseudomonas palustris 42OL em condições de

limitação de nitrogênio, a 30°C e contínua iluminação com lâmpada incandescente de

1000 W. A condição de limitação de nitrogênio estimula não só a produção de H

dependente

da nitrogenase, como também o acúmulo intracelular de reservas de carbono. Sob tal

condição, R. palustris converteu preferencialmente o substrato malato (7 g/L) em H

enquanto que o acúmulo de PHB teve importância relativamente menor.

3.2.5 Substratos para produção fototrófica de hidrogênio

Bactérias fototróficas púrpuras não-sulforosas são capazes de utilizar ampla variedade

de substratos como fontes de carbono e nitrogênio. Embora estes substratos possam ser

utilizados para crescimento, somente uma porção deles está disponível para produção de

hidrogênio. Em geral, os substratos preferidos são ânions de ácidos orgânicos tais como

lactato e malato. Os caminhos metabólicos de utilização são extensos e podem diferir entre

espécies ou entre diferentes linhagens da mesma espécie (KOKU et al., 2002).

Dois critérios são freqüentemente usados para avaliar o desempenho da produção de

hidrogênio a partir de um substrato específico. O primeiro refere-se à velocidade de produção

de hidrogênio (quantidade/tempo) com base na concentração de biomassa ou peso seco

bacteriano. O segundo refere-se à eficiência de conversão do substrato, ou seja, quanto foi

utilizado para produção de hidrogênio e não para crescimento ou biossíntese. Este último é a

razão entre mols reais de hidrogênio produzidos pela quantidade teórica que teria sido obtida

se todo o substrato fosse utilizado para produção de hidrogênio e dióxido de carbono, de

acordo com a seguinte reação hipotética:

+ (2x – z)H

O → (y/2 + 2x – z)H

+ xCO

(2)

Zürrer e Bachofen (1979) estudaram a produção fototrófica de hidrogênio em culturas

em batelada de Rhodospirillum rubrum S-1, a 30°C e intensidade luminosa de 10.000 lux.

Velocidades de produção de 0,065 L H

/L.h foram alcançadas, utilizando glutamato

(15 mmol/L) como fonte de nitrogênio e lactato (50 mmol/L) como doador de elétrons.

Fedorov et al. (1998) avaliaram a produção de hidrogênio por Rhodobacter

sphaeroides GL-1 imobilizada em espuma de poliuretano, em reator de fluxo contínuo, com

ácido lático (40 mmol/L) como fonte de carbono. A velocidade de produção foi

0,061 L

/L.h, com eficiência de conversão de 86% de ácido lático, sob intensidade luminosa

de 16.000 lux. De acordo com os autores, geralmente, as velocidades volumétricas de

produção de hidrogênio por células imobilizadas são maiores que por células livres. Os

autores concluíram que a espuma de poliuretano é uma matriz apropriada para imobilizar

bactéria púrpura para produção de hidrogênio, contudo a principal desvantagem residiu na

lentidão do procedimento de imobilização.

Eroglu et al. (1999) investigaram o efeito das concentrações iniciais de ácido málico

(7,5; 15 e 30 mmol/L) e glutamato de sódio (1, 2 e 10 mmol/L) na produção de hidrogênio por

Rhodobacter sphaeroides O.U.001. Fotobiorreator de coluna, que consistia de cilindro de

vidro com volume interno de 400 mL, foi operado a 32°C e iluminado com lâmpada de

tungstênio à intensidade luminosa de 10.000 lux. Os autores observaram que excesso de

glutamato de sódio (10 mmol/L) intensificou o crescimento celular, porém inibiu a produção

de hidrogênio. Todavia, elevadas concentrações de ácido málico (30 mmol/L) e reduzidas

concentrações de glutamato de sódio (1 mmol/L) aumentaram, tanto o crescimento celular,

como a produção de hidrogênio. A máxima velocidade de produção de hidrogênio observada

foi 0,01 L H

/L.h, com meio de crescimento contendo concentrações iniciais de 15 mmol/L de

ácido málico e 2 mmol/L de glutamato de sódio.

Barbosa et al. (2001) utilizaram quatro diferentes ácidos orgânicos de cadeia curta,

lactato (50 mmol/L), malato (15 mmol/L), acetato (6, 11 e 22 mmol/L) e butirato

(27 mmol/L), como fonte de carbono para produção de hidrogênio, e três diferentes linhagens

de bactérias fototróficas: Rhodopseudomonas sp., Rhodopseudomonas palustris e uma

linhagem não-identificada, em reatores em batelada. Os experimentos foram realizados a

30°C e a fonte de nitrogênio utilizada foi glutamato de sódio (0,8 mmol/L). Duas lâmpadas de

halogênio/tungstênio foram colocadas em lados opostos dos reatores, sendo as intensidades

luminosas estudadas de 40 e 600 µmol fótons/m

.s. As maiores eficiências de conversão

(72,8%) e velocidade de produção de hidrogênio (0,025 L H

/L.h) foram atingidas por

Rhodopseudomonas sp. com acetato (22 mmol/L) como fonte de carbono.

Fang et al. (2005) utilizaram como substrato para produção fototrófica de hidrogênio

acetato (10 a 50 mmol/L) e butirato (10 a 60 mmol/L), que são os principais produtos da

fermentação. Por meio de experimentos em batelada foram avaliados os efeitos do pH inicial

(entre 5,0 e 10,0) e das concentrações individuais dos substratos na produção de hidrogênio.

Os experimentos foram conduzidos a 32°C e sob intensidade luminosa de 10.000 lux. Foram

obtidas como máximas produções 2,5 mol H

/mol acetato em pH inicial 8,0 tratando

10 mmol/L de acetato e 3,7 mol H

/mol butirato em pH inicial 9,0 tratando 10 mmol/L de

butirato. As análises do perfil das bandas de DGGE de fragmentos de DNAr 16S e imagens de

FISH, revelaram a predominância de bactérias semelhantes a Rhodobacter capsulatus com

mais de 80% de abundância relativa, na biomassa utilizada para produção fototrófica de

hidrogênio.

Quatro diferentes linhagens mutantes de Rhodobacter capsulatus (IR1, IR3, IR4 e

JP91) foram testadas por He et al. (2005) por sua habilidade em produzir hidrogênio. Foram

utilizados fotobiorreatores (3,5 L) com lactato (30 mmol/L) e glutamato (5 mmol/L) como

fontes de carbono e nitrogênio, respectivamente. A temperatura foi controlada a 30°C e a

iluminação foi fornecida por duas lâmpadas incandescentes de 120 W cada, dispostas a

distância de 1 m dos reatores. A linhagem IR3 foi a que apresentou maior produção de

hidrogênio, com eficiência de conversão de substrato de 84,8% e produção de 3,9 L H

/L de

cultura.

A produção biológica de hidrogênio vem sendo amplamente estudada, uma vez que

não consome recursos fósseis. Sendo assim, é de importância considerável a utilização de

substratos complexos, como águas residuárias, uma vez que a produção de energia e o

tratamento dessas águas podem ocorrer simultaneamente.

A fotoprodução de hidrogênio por células de Rhodopseudomonas palustris e

Rhodospirillum molischianum, imobilizadas em gel de ágar, foi investigada por Vincenzini et

al. (1982). Os reatores foram iluminados com lâmpadas de tungstênio a 5500 lux. Foram

utilizados efluentes de refinaria de açúcar e de indústria de papel como doadores de elétrons.

As máximas produções foram de 2,2 e 2,6 L H

/L cultura, para R. palustris e R. molischianum

respectivamente, a partir do efluente de indústria de papel.

Sasikala et al. (1992) utilizaram água residuária diluída (10% v/v) proveniente de

destilaria e verificaram produção de hidrogênio de 0,996 L H

/L com cultura de Rhodobacter

sphaeroides O.U.001 com células planctônicas e 3,094 L H

/L com células imobilizadas em

alginato de cálcio. Segundo os autores, o crescimento e a produção de hidrogênio por células

planctônicas são inibidos se a concentração de água residuária for maior que 10% devido às

elevadas concentrações de substrato, resultando em estresse osmótico e/ou presença de

inibidores. Contudo, quando se utilizou célula imobilizada houve atenuação da inibição,

devido a concentrações relativamente menores dos constituintes da água residuária em função

da difusão do substrato na matriz na qual as células estavam imobilizadas.

Produção de hidrogênio a partir de água residuária de produção de queijo de soja

(tofu) foi examinada por Zhu et al. (1999) utilizando bactéria fototrófica anoxigênica

Rhodobacter sphaeroides RV imobilizada em gel de agar. Células foram cultivadas em

condições de anaerobiose e sob iluminação de lâmpadas de tungstênio com intensidade

luminosa na superfície do gel de 8000 lux. A produção de hidrogênio foi acompanhada até

120 h, e atingiu rendimento de 1,9 L H

/L cultura, o que correspondeu a quase 15% da

máxima produção teórica a partir da água residuária utilizada. De acordo com os autores, a

imobilização protegeu a produção de hidrogênio da inibição por amônio, uma vez que a

difusão deste na matriz do gel foi dificultada.

Yetis et al. (2000) utilizaram água residuária de refinamento de açúcar (sugar refinery

wastewater – SRWW) como fonte de carbono para produção de hidrogênio por Rhodobacter

sphaeroides O.U.001, em experimentos em batelada. A temperatura foi mantida a 32°C e a

intensidade luminosa em 10.000 lux na superfície externa dos reatores. Os autores obtiveram

nenhuma ou pouca produção de hidrogênio sob diferentes diluições de água residuária,

entretanto, quando malato foi adicionado à água residuária diluída a 20%, para ajustar o

conteúdo de carbono a 70 mmol/L, obteve-se máxima produção de 2,67 L H

/L de cultura.

Os resultados obtidos demonstram a possibilidade de utilizar bactérias fototróficas

anoxigênicas em processos de produção de hidrogênio concomitante ao tratamento de águas

residuárias.

3.2.6 Sistema híbrido

Abordagem promissora para altas taxas de produção de hidrogênio a partir de águas

residuárias é o pré-tratamento dos resíduos por fermentação acidogênica, a fim de produzir

substratos favoráveis à produção fototrófica. Em tal sistema, também conhecido como

híbrido, a fermentação anaeróbia de resíduos orgânicos produz intermediários como ácidos

orgânicos de baixa massa molecular, que são então convertidos a hidrogênio por bactérias

fototróficas à custa de energia luminosa, em uma segunda etapa.

Fascetti et al. (1998) cultivaram células de Rhodobacter sphaeroides RV em soluções

contendo lactato, derivadas da acidogênese de resíduos sólidos municipais. Os experimentos

mostraram que a solução ácida obtida de tal rejeito foi substrato adequado para o crescimento

de R. sphaeroides. Todavia, a produção de hidrogênio requereu adição de microelementos

externos, tais como ferro e, principalmente, molibdênio. Quando estes elementos estiveram

presentes, reatores operados com tempo de detenção hidráulica (TDH) de 25 h, temperatura

de 30°C, pH 7,2 e iluminação contínua de 10.000 lux, obtiveram produção estável de

hidrogênio durante 8 a 10 dias com velocidade de 100 mL H

/g peso seco.h.

Yokoi et al. (1998) observaram a produção de hidrogênio por cultura em batelada de

duas fases, composta por Clostridium butyricum e Rhodobacter sp. M-19, e também por

cultura mista de C. butyricum e Rhodobacter sp. M-19, ambas cultivadas anaerobiamente a

30°C e sob iluminação de 5000 lux. Foram obtidos rendimentos de 3,6 mol H

/mol glicose e

6,6 mol H

/mol glicose para cultura de duas fases e cultura mista, respectivamente, indicando

a superioridade da segunda sobre a primeira.

Efetiva produção de hidrogênio a partir de água residuária contendo amido foi

investigada por Yokoi et al. (2002) utilizando Clostridium butyricum, Enterobacter aerogenes

e Rhodobacter sp. M-19. A bactéria fototrófica Rhodobacter sp. M-19 foi cultivada a 35°C,

sob iluminação de 5000 lux, por lâmpadas incandescentes. Foram realizados ensaios em

batelada com cultura mista de Clostridium butyricum e Enterobacter aerogenes em água

residuária contendo amido, sendo, posteriormente, o sobrenadante desta cultura utilizado

como fonte de carbono nos ensaios em batelada com Rhodobacter sp. M-19. Totalizando as

produções individuais alcançadas pelas culturas, obteve-se rendimento total de

7,2 mol H

/mol glicose.

Na Tabela 3.1 estão descritos os resumos dos trabalhos sobre produção de hidrogênio

por bactérias fototróficas anoxigênicas. Cabe ressaltar a dificuldade de padronização de

unidades com relação à máxima produção de hidrogênio obtida em cada trabalho, uma vez

que cada autor utiliza diferentes unidades de medida e, em alguns trabalhos os dados

fornecidos são insuficientes para realização de conversão de unidades.

Tabela 3.1 – Estudos sobre produção de hidrogênio por bactérias fototróficas

Organismo Fonte de

carbono

Fonte de

nitrogênio

Temp

(°C)

Luz Reator Máxima

produção de H

Referência

Rhodospirillum

rubrum S-1

Lactato

(50

mmol/L)

Glutamato

(15

mmol/L)

30 10000

lux

Batelada 0,065 L H

-1

Zürrer &

Bachofen

(1979)

Rhodobacter

sphaeroides GL-1

Ác. lático

(40

mmol/L)

(NH

)

mmol/L)

31 16000

lux

Fluxo

contínuo

0,061 L H

-1

Federov et

al. (1998)

Rhodobacter

sphaeroides

O.U.001

Ác.

málico

(7,5; 15 e

mmol/L)

Glutamato

(1; 2 e 10

mmol/L)

32 10000

lux

Coluna 0,01 L H

-1

Eroglu et

al. (1999)

Rhodopseudomonas

sp.

Rhodopseudomonas

palustris

Linhagem não-

identificada

Lactato

(50

mmol/L)

Malato

(15

mmol/L)

Acetato

(6; 11 e 22

mmol/L)

Butirato

(27

mmol/L)

Glutamato

(0,8

mmol/L)

30 40 e

600

µmol

fótons

-2

-1

Batelada 0,025 L H

-1

Barbosa et

al. (2001)

Cultura fototrófica

mista

Acetato

(10 a 50

mmol/L)

Butirato

(10 a 60

mmol/L)

____ 32 10000

lux

Batelada 2,5 mol H

/mol

acetato

3,7 mol H

/mol

butirato

Fang et al.

(2005)

Rhodobacter

capsulatus

Lactato

(30

mmol/L)

Glutamato

mmol/L)

30 240W Batelada 3,9 L H

-1

cultura

He et al.

(2005)

Rhodopseudomonas

palustris

Rhodospirillum

molischianum

Efluente

indústria

de papel

_____ 30 5500

lux

Gel de ágar 2,2 L H

-1

cultura

2,6 L H

-1

cultura

Vincenzini

et al.

(1982)

Rhodobacter

sphaeroides

O.U.001

Efluente

destilaria

_____ 30 3000

lux

Céls. livres/

imobilizadas

alginato de

cálcio

0,996 L H

-1

cultura

3,094 L H

-1

cultura

Sasikala et

al. (1992)

Rhodobacter

sphaeroides RV

Efluente

de usina

de soja

_____ 30 8000

lux

Gel de ágar 1,9 L H

-1

cultura

Zhu et al.

(1999)

Rhodobacter

sphaeroides

O.U.001

Efluente

refinaria

de açúcar

_____ 32 10000

lux

Batelada 2,67 L H

-1

cultura

Yetis et al.

(2000)

4 MATERIAL E MÉTODOS

4.1 Fluxograma experimental

Para a realização dos experimentos foi utilizado, como inóculo, bactéria fototrófica

púrpura não-sulfurosa previamente purificada por Saavedra et al. (2005), proveniente da lagoa

de estabilização anaeróbia de Cajati, Vale do Ribeira (São Paulo – Brasil).

As atividades experimentais realizadas neste trabalho estão descritas cronologicamente

na Figura 4.1. O inóculo foi enriquecido em meio ATCC 112 (VAN NIEL, 1944) específico

para bactérias fototróficas púrpuras não-sulfurosas. Após crescimento microbiano, foi

realizada lavagem da biomassa, por centrifugação para retirada de compostos intermediários

do final do crescimento celular. O inóculo foi então enriquecido novamente, porém em

condições específicas para produção de hidrogênio (meio FANG et al., 2005), com a

finalidade de adaptar a cultura as novas condições de cultivo.

Para medida de crescimento foi realizado ensaio relacionando massa seca celular e

densidade óptica. Os ensaios de produção de hidrogênio foram realizados em triplicata de

reatores em batelada. Para avaliar a influência da concentração inicial de ácido acético como

fonte de carbono na produção de hidrogênio, os reatores foram suplementados com ácido

acético nas concentrações 10 mmol/L e 17 mmol/L. Para verificar a influência da biomassa

inicial, foram realizados ensaios em batelada utilizando-se inóculo nas concentrações de

0,02 g/L e 0,04 g/L. Ensaios em batelada também foram realizados a fim de se verificar a

influência da luminosidade na produção de hidrogênio, sendo os reatores mantidos sob

intensidade luminosa de 9000 a 10.000 lux, 4000 a 5000 lux, ou mantidos no escuro.

Para verificar o comportamento da comunidade microbiana nos reatores em batelada

foram realizados, ao longo do tempo, exames de microscopia óptica de contraste de fase, além

do acompanhamento temporal, por cromatografia gasosa, do consumo de ácido acético e

produção de gás hidrogênio. O crescimento celular foi verificado por meio da leitura de

absorbância (660 nm) e do cálculo de massa seca utilizando-se a curva-padrão de

crescimento. Determinou-se a velocidade específica de crescimento (µ) e tempo de geração da

cultura, de acordo com Vareshe (1997). A caracterização da diversidade microbiana da

cultura purificada de bactéria fototrófica púrpura não-sulfurosa foi realizada por meio da

técnica do PCR/DGGE.

Ensaio de caracterização nutricional foi realizado em batelada, com a finalidade de se

avaliar o crescimento e a produção de hidrogênio da cultura purificada, na presença de

diferentes substratos orgânicos, na concentração de 20 mmol/L cada, como acetato de sódio,

benzoato de sódio, butirato de sódio, citrato de sódio, etanol, fenol, frutose, glicose, glutamato

de sódio, lactato de sódio, metanol, piruvato de sódio, propionato de sódio e succinato de

sódio. Nestes ensaios, foram realizadas análises de crescimento celular, por meio da leitura de

absorbância (660 nm) e cálculo de massa seca utilizando-se a curva-padrão de crescimento, e

produção de gás hidrogênio por cromatografia gasosa, após 384 h de operação. Também foi

realizado exame de microscopia óptica de contraste de fase para caracterização morfológica.

Todos os frascos foram mantidos, após inoculação da cultura, em câmara de

germinação a 30 ± 1°C. Para iluminação foram usadas lâmpadas fluorescentes de 20 W, e a

intensidade luminosa foi medida utilizando-se luxímetro.

Figura 4.1. Fluxograma experimental

4.2 Composição e preparo do meio de cultura e soluções estoque

4.2.1 Meio de crescimento

O meio utilizado para crescimento da cultura foi o meio ATCC 112 (VAN NIEL,

1944), o qual foi preparado pela dissolução dos componentes em água ultrapurificada, na

ordem apresentada na Tabela 4.1. O pH foi ajustado a 7,0-7,2 com solução 1 mol/L de

hidróxido de sódio. Após esse procedimento, o meio foi mantido sob atmosfera de nitrogênio

(99,999%) durante 20 minutos. Ainda, sob fluxo desse gás, o meio foi distribuído em frascos

de antibiótico de 100 mL, com volume útil de 50 mL. Então, os frascos foram fechados com

tampas de butila, lacrados com selos de alumínio e esterilizados por autoclavação a 121°C e

1 atm, por 20 minutos.

Tabela 4.1 - Composição do meio de cultura ATCC 112

Componentes Quantidade –q.s.p. 1000 mL de água

ultrapurificada

HPO

1,0 g

MgSO

0,5 g

Extrato de levedura 10,0 g

Fonte: Van Niel (1944)

4.2.2 Meio de cultura para produção de hidrogênio

O meio utilizado nos ensaios de produção de hidrogênio foi preparado pela dissolução

dos componentes em água ultrapurificada, de acordo com a ordem apresentada na Tabela 4.2.

O pH foi ajustado a 7,0-7,2 com solução 1 mol/L de hidróxido de sódio. Posteriormente, o

meio foi esterilizado por filtração utilizando sistema Millipore e membrana 0,22 µm,

previamente esterilizados por autoclavação; depois distribuído em reatores, sob atmosfera de

hélio (99,999%).

Tabela 4.2 - Composição do meio de cultura para produção de hidrogênio

Componentes Quantidade –q.s.p. 1000 mL de água

ultrapurificada

500 mg

MgSO

.7H

O 400 mg

NaCl 400 mg

CaCl

.2H

O 50 mg

Fe(III)-citrato 3,9 mg

Solução traço de metais 20 mL

Solução vitamina B

1 mL

Fonte: Fang et al. (2005)

4.2.3 Solução traço de metais

A solução traço de metais, adicionada ao meio de cultura para produção de hidrogênio,

foi preparada pela dissolução dos componentes em água ultrapurificada, de acordo com a

ordem apresentada na Tabela 4.3. Após homogeneização da solução, introduziu-se, por 20

minutos, atmosfera de nitrogênio (99,999%). Depois, a solução foi distribuída em frascos de

antibiótico, também sob atmosfera de N

. Os frascos foram fechados, lacrados, esterilizados

por autoclavação a 121°C e 1 atm por 20 minutos e, então, armazenados sob refrigeração.

Tabela 4.3 - Composição da solução traço de metais

Componentes Quantidade –q.s.p. 1000 mL de água

ultrapurificada

30 mg

MoO

.2H

O 3 mg

ZnSO

.7H

O 10 mg

CoCl

.6H

O 20 mg

CuCl

.2H

O 1 mg

MnCl

.4H

O 3 mg

NiCl

.6H

O 2 mg

Fonte: Fang et al. (2005)

4.2.4 Solução de vitamina B

A solução estoque de vitamina B

foi preparada pela dissolução de 40 mg desse

reagente em 1000 mL de água ultrapurificada. Após homogeneização da solução, introduziu-

se, por 20 minutos, atmosfera de nitrogênio (99,999%). Posteriormente, o meio foi

esterilizado por filtração utilizando sistema Millipore e membrana 0,22 µm, previamente

esterilizados por autoclavação. A solução foi distribuída em frascos de antibiótico, sob fluxo

de N

e, então, armazenada sob refrigeração.

4.2.5 Solução de acetato de sódio

A solução estoque de acetato de sódio foi preparada através da dissolução de 41 g de

acetato de sódio em 1000 mL de água ultrapurificada. Após homogeneização da solução,

introduziu-se, por 10 minutos, atmosfera de nitrogênio (99,999%). A solução foi distribuída

em frascos de antibiótico, também sob fluxo de N

. Os frascos foram fechados, lacrados,

esterilizados por autoclavação a 121°C e 1 atm por 20 minutos e, então, armazenados em

temperatura ambiente.

4.2.6 Solução de glutamato de sódio

A solução estoque de glutamato de sódio foi preparada através da dissolução de 15,0 g

de glutamato de sódio em 1000 mL de água ultrapurificada. Após a homogeneização da

solução, introduziu-se, por 10 minutos, atmosfera de nitrogênio (99,999%). A solução foi

distribuída em frascos de antibiótico, sob atmosfera do mesmo gás. Os frascos foram

fechados, lacrados, esterilizados por autoclavação a 121°C e 1 atm por 20 minutos e, então,

armazenados em temperatura ambiente.

4.2.7 Soluções estoque dos substratos orgânicos

As soluções estoque dos substratos orgânicos utilizados no ensaio de caracterização

nutricional foram preparadas como descrito a seguir.

As soluções de benzoato de sódio, butirato de sódio, citrato de sódio, frutose, glicose,

piruvato de sódio, propionato de sódio e succinato de sódio foram preparadas pela dissolução,

separadamente, de 2,9 g; 2,2 g; 5,9 g; 3,6 g; 3,6 g; 2,2 g; 1,9 g e 5,4 g; respectivamente, dos

compostos, em balões volumétricos de 100 mL, completados com água ultrapurificada. Após

homogeneização, as soluções foram distribuídas em frascos de antibiótico, sob atmosfera de

(99,999%). As soluções foram esterilizadas em autoclave e armazenadas em temperatura

ambiente.

A solução de lactato de sódio foi preparada pela neutralização de 1,6 mL de ácido

lático (91%) com 0,8 g de hidróxido de sódio (NaOH). Após essa reação, completou-se balão

volumétrico de 100 mL com água ultrapurificada. Depois, a solução foi distribuída em frasco

de antibiótico, sob atmosfera de N

(99,999%), autoclavada e armazenada em temperatura

ambiente.

A solução de fenol foi preparada pela adição de 1,9 g de fenol e 0,8 g de hidróxido de

sódio (NaOH), em balão volumétrico de 100 mL, sendo o volume completado com água

ultrapurificada. Posteriormente, a solução foi distribuída em frasco de antibiótico, sob

atmosfera de N

(99,999%), autoclavada e armazenada em temperatura ambiente.

As soluções de etanol e metanol foram preparadas adicionando-se 1,2 mL e 0,8 mL

desses compostos, respectivamente, em balões volumétricos de 100 mL, sendo o volume

completado com água ultrapurificada. Após, as soluções foram armazenadas em temperatura

ambiente.

4.3 Enriquecimento de bactérias fototróficas púrpuras não-sulfurosas

O inóculo foi enriquecido em meio específico para bactérias fototróficas, meio ATCC

112, de acordo com Van Niel (1944), e acetato de sódio na concentração 10 mmol/L. Foram

utilizados frascos de antibiótico de 100 mL, com volume útil de 50 mL. Após inoculação da

cultura, na concentração de 10% (v/v), os frascos foram incubados sob atmosfera de He

(99,999%), mantidos em câmara de germinação a 30 ± 1ºC, sob iluminação de 9000 a

10.000 lux.

4.4 Enriquecimento em condições específicas para produção de hidrogênio

Após crescimento microbiano, foi realizada lavagem da biomassa, a fim de separar

células viáveis de meio de cultura e restos celulares, centrifugando-a a 10.000 rpm e 20°C,

durante 5 minutos. O sobrenadante foi então descartado e o pellet ressuspendido em meio

específico segundo Fang et al. (2005).

Posteriormente à lavagem da biomassa, o inóculo foi enriquecido novamente, porém

em condições específicas para produção de hidrogênio, com a finalidade de adaptar a cultura

as novas condições de cultivo. Nesta etapa, foram utilizados frascos de Duran de 1000 mL,

com volume útil de 500 mL, aos quais adicionou-se meio Fang et al. (2005), acetato de sódio

(10 mmol/L), glutamato de sódio (0,8 mmol/L) e cultura previamente lavada (10% v/v). Os

frascos foram, então, incubados sob atmosfera de He (99,999%) e mantidos em câmara de

germinação a 30 ± 1ºC, sob iluminação de 9000 a 10.000 lux.

4.5 Curva-padrão de crescimento

Para medida de crescimento foi realizado ensaio para relacionar massa seca e

densidade óptica (660 nm). Para tal, foram utilizados frascos de Duran de 5000 mL, sendo

1000 mL de headspace preenchido com He (99,999%), e 4000 mL de meio de reação

(Figura 4.2), os quais foram preenchidos com meio de cultura específico (FANG et al., 2005),

acetato de sódio (10 mmol/L), glutamato de sódio (0,8 mmol/L) e inóculo (10% v/v). Após

inoculação da cultura, os frascos foram incubados sob atmosfera de He (99,999%), mantidos

em câmara de germinação a 30 ± 1ºC, sob iluminação de 9000 a 10.000 lux. A cada 24 horas,

foram retiradas amostras para análise de absorbância, de acordo com Standard Methods for

Examination of Water and Wastewater (1998), e de massa seca, segundo metodologia

adaptada de Kondo et al. (2002). Para esta última análise, foram retirados 45 mL de amostra,

a qual foi centrifugada (20°C; 10.000 rpm; 5 min); posteriormente, o sobrenadante foi

descartado e o pellet ressuspendido em água destilada. Então, este foi transferido para

cápsulas de porcelana calcinadas e, previamente pesadas, as quais foram mantidas em estufa a

110°C, até seu peso tornar-se constante.

A obtenção desta curva padrão de crescimento deveu-se à restrição de volume a ser

retirado dos reatores nos ensaios de produção de hidrogênio. Sendo assim, a medida de

crescimento foi obtida por meio da densidade óptica em espectrofotômetro a 660 nm e,

utilizando-se a curva padrão, obteve-se a massa seca em g/L.

Figura 4.2. Reator em batelada (5000 mL)

He (1L)

Meio de reação (4L)

4.6 Ensaios de produção de hidrogênio

Os ensaios de produção de hidrogênio foram realizados em reatores em batelada, em

triplicata, de acordo com a Tabela 4.4. Foram utilizados frascos de Duran de 2000 mL, sendo

1000 mL de headspace preenchido com He (99,999%), e 1000 mL de meio de reação

(Figura 4.3).

Tabela 4.4 - Composição dos reatores anaeróbios utilizados nos ensaios de produção de hidrogênio

Ensaio Meio de

cultura

Ácido

acético

(mmol/L)

Glutamato

de sódio

(mmol/L)

Biomassa

inicial

(g/L)

Temperatura

(°C)

Iluminação

(lux)

Fang et al.

(2005)

10 0,8 0,02 30 ± 1 9000 a

10.000

Fang et al.

(2005)

17 0,8 0,02 30 ± 1 9000 a

10.000

Fang et al.

(2005)

18 0,8 0,04 30 ± 1 9000 a

10.000

Fang et al.

(2005)

22 0,8 0,04 30 ± 1 4000 a

5000

Fang et al.

(2005)

22 0,8 0,04 30 ± 1 Ausência

de luz

Figura 4.3. Reator anaeróbio em batelada

He (1L)

Meio de reação (1L)

Para avaliar a influência da concentração inicial de ácido acético como fonte de

carbono na produção de hidrogênio, os reatores foram alimentados com as seguintes

condições: meio de cultura específico (FANG et al., 2005), glutamato de sódio (0,8 mmol/L)

como fonte de nitrogênio, inóculo (0,02 g/L), e ácido acético (10 mmol/L e 17 mmol/L,

separadamente). Após inoculação da cultura, os frascos foram incubados sob atmosfera de He

(99,999%) e mantidos em câmara de germinação a 30 ± 1ºC, sob iluminação de 9000 a

10.000 lux.

Para verificar a influência da biomassa inicial na produção de hidrogênio, foram

realizados ensaios em batelada utilizando-se as seguintes condições: meio Fang et al. (2005),

glutamato de sódio (0,8 mmol/L), ácido acético (18 mmol/L), e inóculo nas concentrações de

0,02 g/L e 0,04 g/L. Após inoculação da cultura, os frascos foram incubados sob atmosfera de

He (99,999%) e mantidos em câmara de germinação a 30 ± 1ºC, sob iluminação de 9000 a

10.000 lux.

Ensaios em batelada também foram realizados a fim de se verificar a influência da

intensidade luminosa na produção de hidrogênio. Os reatores foram preenchidos com meio

Fang et al. (2005), glutamato de sódio (0,8 mmol/L), ácido acético (22 mmol/L) e inóculo na

concentração 0,04 g/L. Após inoculação da cultura, os frascos foram incubados sob atmosfera

de He (99,999%) e mantidos em câmara de germinação a 30 ± 1ºC, sob iluminação de 9000 a

10.000 lux, 4000 a 5000 lux, ou na ausência de luz.

4.7 Determinação da velocidade específica de crescimento e tempo de geração

Para a quantificação celular foi adotada leitura de absorbância. Para tal, 3,0 mL de

amostra foram retiradas de maneira asséptica, colocadas em tubos Falcon estéreis e

centrifugadas a 10.000 rpm e 20°C durante 5 minutos. O sobrenadante foi descartado, o pellet

ressuspendido em água destilada e, então, submetido à leitura de absorbância a 660 nm, em

espectrofotômetro. Posteriormente, a medida de absorbância (660 nm) obtida foi introduzida

na curva-padrão de crescimento, obtendo-se, assim, a massa seca celular (g/L).

A determinação da velocidade específica na fase exponencial de crescimento (µ) foi

feita graficamente. Neste método, projetaram-se os valores do logaritmo neperiano (ln) da

concentração celular versus o tempo de cultivo, e identificaram-se os pontos que possuíam a

maior probabilidade de alinharem-se numa mesma reta. Estes pontos correspondem à fase

exponencial de crescimento, na qual a velocidade é máxima e constante (VARESCHE, 1997).

Por meio do cálculo da regressão linear dos pares de pontos, determinou-se a equação da reta,

cujo coeficiente angular correspondeu ao valor de µ.

Estabelecida a fase exponencial de crescimento, e a partir do cálculo da velocidade

específica de crescimento (µ), foi possível calcular o tempo de geração da cultura (Tg), a

partir da seguinte equação:

Tg = ln2/µ (Equação 1)

4.8 Caracterização nutricional

A caracterização do crescimento microbiano e da produção de hidrogênio da cultura

purificada, na presença de diferentes substratos orgânicos, foi realizada em batelada, em

triplicatas de reatores. Foram utilizados frascos de antibiótico de 100 mL, sendo 50 mL de

headspace preenchido com He (99,999%), e 50 mL de meio de reação. Estes frascos foram

preenchidos com meio de cultura específico (FANG et al., 2005), glutamato de sódio

(0,8 mmol/L) como fonte de nitrogênio, inóculo (20% v/v) e, como fonte de carbono, diversos

substratos orgânicos, na concentração de 20 mmol/L, como acetato de sódio, benzoato de

sódio, butirato de sódio, citrato de sódio, etanol, fenol, frutose, glicose, lactato de sódio,

metanol, piruvato de sódio, propionato de sódio e succinato de sódio. Também foi realizado

ensaio sem fonte de carbono, apenas com glutamato de sódio (0,8 mmol/L) como substrato.

Após inoculação da cultura, os frascos de antibiótico foram incubados sob atmosfera de He

(99,999%) e mantidos em câmara de germinação a 30 ± 1ºC, sob iluminação de 9000 a

10.000 lux.

4.9 Análises cromatográficas

4.9.1 Determinação de hidrogênio

A concentração de hidrogênio produzido foi avaliada por meio da retirada de 0,1 mL

de amostra da fase gasosa, utilizando seringa “gas tight” com trava. A análise foi realizada em

cromatógrafo gasoso GC-2010 SHIMADZU, equipado com detector de condutividade

térmica. A coluna utilizada foi a Carboxen 1010 plot 30 m x 0,53 mm, sendo o gás de arraste

argônio sob fluxo de 21,9 cm/s. As temperaturas do forno, da coluna e do detector foram

30°C, 200°C e 230°C, respectivamente.

Para o cálculo da concentração de gás hidrogênio (mL de H

/L) foi preparada curva

analítica (calibração) do hidrogênio (ANEXO 1). Os valores das áreas de hidrogênio obtidos

foram convertidos, por meio da curva-padrão, a mL de H

nas CNTP. Durante todo o

experimento, os frascos não foram despressurizados, a fim de se manter concentrações

acumuladas do gás.

Os dados experimentais foram ajustados a sigmóide de Boltzmann (Equação 2) por

meio do software Microcal Origin

6.0, minimizando a somatória dos erros ao quadrado. A

sigmóide ajustada foi posteriormente derivada, utilizando mesmo software, a fim de se

determinar as velocidades máximas de produção de hidrogênio.

(Equação 2)

4.9.2 Determinação de ácido acético

A concentração de ácido acético foi determinada por cromatografia gasosa, de acordo

com metodologia desenvolvida por Moraes et al. (2000). A cada 24 horas foram retirados

2 mL de amostra dos reatores, sendo adicionado a estas 10 µL de solução NaOH (2 mol/L), e

congeladas em tubos de ensaio para posterior análise.

Na ocasião da análise, as amostras foram descongeladas, e adicionou-se aos tubos de

ensaio 1,0 g de NaCl sólido, 100 µL de solução H

(1 mol/L), 100 µL de solução de ácido

crotônico (700 mg/L) e 0,60 mL de éter etílico. Os frascos foram tampados, agitados em

Vortex por 30 s, centrifugados a 2500 rpm por 30 s, e armazenados em congelador para

posterior injeção no cromatógrafo.

Utilizou-se cromatógrafo Hewlett-packard, modelo CG, HP 6890, com coluna HP –

INNOWAX de comprimento 30 m e diâmetro interno 25 µm. O gás de arraste usado foi o

hidrogênio, com vazão de 30 mL/min e detector de ionização de chama. O aparelho foi

operado sob as seguintes condições: temperatura do detector 300°C e do injetor 250°C – a

coluna foi aquecida a 100°C por 3 minutos e em seguida aplicou-se gradiente de temperatura

(rampa de aquecimento) de 5°C/min até atingir 180°C; fluxo de ar 300 mL/min. O limite de

detecção do ácido acético no método utilizado foi de 5,13 mg/L. O volume injetado foi de

1 µL, utilizando-se seringa SGE de 10 µL.

4.10 Análise da intensidade luminosa

Para iluminação foram usadas lâmpadas fluorescentes de 20 W, sendo utilizadas

quatro lâmpadas nos ensaios mantidos sob intensidade luminosa de 9000 a 10.000 lux, duas

lâmpadas nos ensaios de 4000 a 5000 lux, e nenhuma lâmpada quando os ensaios foram

realizados na ausência de luz. A cada novo ensaio, realizava-se a reposição de lâmpadas

novas. A intensidade luminosa foi medida em vários pontos da câmara de germinação,

utilizando-se luxímetro Testo, modelo 545. Este era colocado próximo aos reatores com o

sensor de leitura voltado para as lâmpadas. No momento da leitura de intensidade luminosa a

câmara era fechada e procedia-se a leitura.

4.11 Análise da diversidade microbiana

4.11.1 Exames microscópicos

As características morfológicas do inóculo e da comunidade microbiana presente nos

ensaios de enriquecimento e de produção de hidrogênio foram observadas através de

microscopia óptica de contraste de fase, utilizando microscópio Leica DMLB, com sistema de

captura de imagem Optronics e software Image Pro-Plus. Também foi realizada coloração de

Gram, segundo metodologia da Scientific Services of Cultures Collections da Alemanha

(DSM, 1991) para diferenciação dos microrganismos em Gram positivos ou Gram negativos.

4.11.2 Análise de biologia molecular

A avaliação da diversidade microbiana foi realizada através da técnica de reação de

polimerização em cadeia (PCR) do gene do RNAr 16S, seguida da eletroforese em gel com

gradiente desnaturante (DGGE). O DNA foi extraído segundo protocolo de Griffiths et al.

(2000). Na amplificação dos fragmentos do RNAr 16S foram utilizados primers específicos

do Domínio Bacteria (NIELSEN et al., 1999). Os fragmentos de RNAr 16S amplificados

foram separados pela eletroforese em gel de gradiente desnaturante (DGGE). A Tabela 4.5

descreve os primers do domínio Bacteria utilizados nas análises de PCR/DGGE.

Tabela 4.5 - Primers utilizados nas análises de PCR/DGGE

Microrganismos Primers e seqüência (5’ - 3’) Referência

Bibliográfica

Domínio Bacteria 968 FGC (5’ – AAC CGC GAA GAA CCT

TAC – 3’)

1392 R (5’ – AACG GGC GGT GTG TAC –

3’)

GC clamp (5’- CGC CCG CCG GGG CGC

CCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG

GGGG – 3’)

Nielsen et al. (1999)

A partir do DNA extraído da amostra foram obtidos fragmentos do RNAr 16S,

utilizando a técnica da amplificação, através da reação de polimerização em cadeia (PCR)

com primers homólogos às regiões conservadas do gene RNAr 16S. Na reação de

amplificação foram usadas as seguintes soluções: 0,5 µL de Taq DNA polymerase (5U/µL); 5

µL de tampão PCR 10X; 1,5 µL de MgCl

(50 mmol/L); 5 µL de dNTP (2 mmol/L); 0,5 µL

de “primer forward” (100 pmol/L); 0,5 µL do “primer reverse” (100 pmol/L) e 2 µL de DNA

extraído. O aparelho utilizado nessa técnica foi o termociclador “Gene Amp. PCR System

2400” (Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, Conn). As condições usadas na programação do

aparelho para amplificação do fragmento do RNAr 16S estão descritas na Tabela 4.6.

Tabela 4.6 - Programação do termociclador para amplificação dos fragmentos do RNAr 16S

Microrganismos Nº de

ciclos

Desnaturação

Inicial

Desnaturação Anelamento Extensão Extensão

Final

Resfriamento

Domínio

Bacteria

35 94ºC

5 min

94ºC

1,30 min

38ºC

45 s

72ºC

1 min

72ºC

5 min

4ºC

O procedimento para realização do DGGE consistiu na preparação da solução do gel

na concentração de 30% e 70% do gel de gradiente desnaturante (gel acrilamida - 40%;

solução 50X de TAE - Tris Ácido Acético EDTA; formamida e uréia), para o Domínio

Bacteria. O gel foi preparado com 111 µL de APS (perssulfato de amônia - 10%); 11 µL de

temed (tetrametiletilenodiamina). Após a solidificação do gel (1 h), as placas contendo o gel

foram colocadas em suporte apropriado e transferido para cuba de DGGE. Nesta cuba foram

adicionados 7 L de água destilada e 140 mL de TAE 50X. A temperatura de “corrida” do gel

foi constante (65ºC), voltagem de 175 Volts, com duração de 16 h. O gel foi retirado da cuba

e corado com solução de coloração (TAE 1x contendo 1µg/mL de brometo de etídeo) por 20

minutos e depois transferido para o fotodocumentador Eagle Eye TM III (Stratagene)

acoplado ao computador e software Eagle Slight UV para visualização das bandas, sob

exposição à UV de 254 nm.

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1 Ensaios de enriquecimento

A microscopia óptica de contraste de fase do inóculo mostrou a predominância de

bactérias no formato de bacilos retos (Figura 5.1a). Após enriquecimento nas condições

específicas para produção de hidrogênio, houve predominância de células no formato de

bacilos curvos e aparecimento de aglomerados no formato de rosetas (Figura 5.1b). De acordo

com Bergey`s Manual of Systematic Bacteriology (1989), este aglomerado é típico de alguns

gêneros de bactérias fototróficas púrpuras não-sulfurosas, onde células individuais ligam-se

umas as outras através de seus flagelos polares. O seqüenciamento de amostras do inóculo de

bactérias fototróficas anoxigênicas provenientes da sub-superfície de lagoa anaeróbia,

utilizando primers pufM.750R e pufM.557F, mostrou 92% de similaridade com

Rhodopseudomonas palustris (Saavedra et al., 2005).

(a) (b)

Figura 5.1. Microscopia óptica de contraste de fase das seguintes amostras: (a) inóculo e (b) reatores

em batelada de enriquecimento

A técnica de coloração de Gram realizada em amostras do inóculo e da comunidade

microbiana presente nos ensaios de enriquecimento revelou a predominância de

microrganismos Gram-negativos (Figura 5.2). Todos os gêneros de bactérias fototróficas

púrpuras não-sulfurosas são Gram-negativos (BERGEY, 1989).

Figura 5.2. Bacilos curvos Gram-negativos em microscopia óptica de luz comum

5.2 Curva-padrão de crescimento

A massa seca celular (MSC, g/L) da cultura purificada de bactéria fototrófica púrpura

não-sulfurosa utilizada neste trabalho foi proporcional à absorbância a 660 nm (A

660

) e pôde

ser calculada de acordo com a seguinte relação:

MSC

bactéria fototrófica

= 0,66 A

660

(3)

A curva-padrão de crescimento é mostrada na Figura 5.3, e os valores de crescimento

estão apresentados no APÊNDICE 1.

y = 0,66x

= 0,99

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,000 0,050 0,100 0,150 0,200 0,250

Absorbância (660 nm)

Massa seca (g/L)

Figura 5.3. Curva-padrão de crescimento de bactéria fototrófica púrpura não-sulfurosa

5.3 Ensaios de produção de hidrogênio

Os ensaios de produção de hidrogênio tiveram duração aproximada de 408 horas. Os

valores de massa seca, produção de hidrogênio acumulado e consumo de ácido acético estão

apresentados nos APÊNDICES 2, 3 e 4, respectivamente.

O ácido acético foi escolhido como fonte de carbono por ter sido a fonte utilizada por

Saavedra et al. (2005) nas condições de purificação da cultura, e também por ser um dos

principais produtos do processo de fermentação anaeróbia. O efeito da concentração inicial de

ácido acético no crescimento celular é mostrado na Figura 5.4. Comparando-se as curvas de

crescimento dos ensaios onde se utilizou 10 mmol/L e 17 mmol/L de concentração inicial de

ácido acético, pode-se notar que ambas apresentaram-se muito semelhantes, com fase lag até

100 h, e início da fase estacionária após 250 h de experimento. Entretanto, após 200 h os

reatores alimentados com 17 mmol/L de acético passaram a apresentar concentração de

biomassa ligeiramente mais elevada (0,18 g/L massa seca) em relação àqueles alimentados

com 10 mmol/L do mesmo ácido (0,15 g/L massa seca). Isto deve ter ocorrido porque, após a

fase de adaptação da cultura, provavelmente, a maior quantidade de substrato (17 mmol/L)

favoreceu o crescimento celular.

Velocidades específicas de crescimento (µ) de 0,0084 h

-1

e 0,01 h

-1

, e tempos de

geração (Tg) de 82,5 h e 69,3 h foram obtidos para as culturas crescidas nos ensaios com

10 mmol/L e 17 mmol/L de ácido acético (APÊNDICE 5), respectivamente.

Os resultados evidenciaram, também, que em ambos os ensaios não houve consumo

total do ácido acético, sendo que no ensaio com menor concentração (10 mmol/L) ocorreu

consumo máximo de 78% em 384 h. Todavia, no ensaio com maior concentração

(17 mmol/L) foi verificado consumo máximo de 51%, também em 384 h de experimento

(Figura 5.4).

Najafpour et al. (2004) utilizaram bactéria fototrófica Rhodospirillum rubrum em

culturas em batelada para produção de hidrogênio, e observaram que, para concentração

inicial de acetato de 37 mmol/L, ocorreu ligeira utilização da fonte orgânica, enquanto que

para concentrações menores (13 – 24 mmol/L) o consumo foi significativamente mais

elevado. Fang et al. (2005) trabalharam com cultura mista fototrófica e acetato a várias

concentrações, e observaram que a eficiência de degradação do acetato diminuiu com o

aumento da concentração inicial de 10 a 21 mmol/L, sendo que 99,4 e 96,3% de acetato foram

consumidos, respectivamente. Todavia, para concentração inicial de 49 mmol/L ocorreu

consumo de somente 76,5%. No presente trabalho, a eficiência de consumo do ácido acético

também apresentou decréscimo de 78 para 51%, quando a concentração inicial foi elevada de

10 mmol/L para 17 mmol/L.

Com relação à produção de hidrogênio, as respostas da cultura a diferentes

concentrações de ácido acético (10 mmol/L e 17 mmol/L) foram semelhantes (Figura 5.5).

Tanto no ensaio com 10 mmol/L de ácido acético, como com 17 mmol/L, a produção de

hidrogênio apresentou fase lag de aproximadamente 100 h, e início da fase estacionária após

280 h. Como mencionado anteriormente, o mesmo ocorreu com o crescimento celular

indicando, provavelmente, que ambos podem estar estreitamente relacionados.

As máximas produções alcançadas nos ensaios com 10 mmol/L e 17 mmol/L de ácido

acético foram 8,3 mL H

/g massa seca.h e 8,8 mL H

/g massa seca.h, respectivamente.

Barbosa et al. (2001) obtiveram 14 mL H

/g massa seca.h com Rhodopseudomonas palustris,

como máxima produção de hidrogênio, em ensaios em batelada com 16 mmol/L de acetato de

sódio. Sasikala et al. (1991) atingiram produção máxima de 7,2 mL H

/g massa seca.h,

utilizando bactéria fototrófica Rhodobacter sphaeroides e 21 mmol/L de malato, em reatores

em batelada.

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0 50 100 150 200 250 300 350 400 450

Tempo (h)

Concentração de

biomassa (g/L)

Ácido acético

(mmol/L)

massa seca (10 mmol/L acético) massa seca (17 mmol/L acético)

ác. acético (10 mmol/L acético) ác. acético (17 mmol/L acético)

Figura 5.4. Crescimento celular e consumo de ácido acético da cultura de bactérias fototróficas

púrpuras não-sulfurosas em reatores em batelada

100

120

140

0 50 100 150 200 250 300 350 400 450

Tempo (h)

Hidrogênio acumulado (mL)

10 mmol/L ác. acético 17 mmol/L ác. acético

Figura 5.5. Produção de hidrogênio para diferentes concentrações de ácido acético da cultura de

bactérias fototróficas púrpuras não-sulfurosas em reatores em batelada

Eroglu et al. (1999) investigaram a produção de hidrogênio utilizando cultura

fototrófica Rhodobacter sphaeroides em fotobiorreator de coluna. Os autores observaram que

o tempo necessário para início da produção de hidrogênio variou de 40 a 80 horas, e que

existiu uma relação entre concentração celular e velocidade de produção de hidrogênio.

Ainda, segundo os autores, o volume de gás hidrogênio produzido, a duração de produção de

hidrogênio e a máxima concentração celular aumentaram com a concentração de malato.

Barbosa et al. (2001) observaram diminuição do hidrogênio produzido, de 214 para 27 mL H

por frasco, quando a concentração de acetato foi reduzida de 22 para 6 mmol/L. Para

concentrações de 6 a 11 mmol/L de acetato ocorreu limitação na produção de hidrogênio,

aproximadamente 50 h após inoculação. Foi constatado por Fang et al. (2005) aumento da

produção de hidrogênio com o aumento da concentração de acetato de 10 a 50 mmol/L em

cultura mista fototrófica. Também segundo os autores, a fase lag de produção de hidrogênio

não foi afetada pela concentração inicial de acetato. Nath et al. (2005) também observaram

que o aumento da concentração de acetato de 6 para 42 mmol/L resultou em subseqüente

aumento na produção de hidrogênio. No presente trabalho, o aumento da concentração inicial

de ácido acético de 10 para 17 mmol/L, não favoreceu aumento significante na concentração

de biomassa (0,15 e 0,18 g/L massa seca, respectivamente), e na velocidade máxima de

produção de hidrogênio (8,3 e 8,8 mL H

/g massa seca.h, respectivamente).

Também foram realizados ensaios em batelada com a finalidade de se verificar a

influência da concentração inicial de biomassa na produção de hidrogênio. Nestes ensaios foi

utilizado inóculo nas concentrações de 0,02 g/L e 0,04 g/L da cultura de bactéria fototrófica

púrpura não sulfurosa. A Figura 5.6 mostra a influência das diferentes concentrações iniciais

de biomassa no crescimento celular. Verificou-se que os ensaios com diferentes

concentrações iniciais de inóculo apresentaram o mesmo padrão de crescimento. Entretanto,

no ensaio com maior concentração de biomassa (0,04 g/L) a fase lag durou aproximadamente

24 h, enquanto que no ensaio de menor concentração (0,02 g/L), esta fase teve duração

aproximada de 100 h. Em ambos os ensaios, a fase estacionária iniciou-se após 250 h.

Velocidades específicas de crescimento (µ) de 0,01 h

-1

e 0,0082 h

-1

, e tempos de

geração (Tg) de 69,3 h e 84,5 h foram obtidos para as culturas crescidas nos ensaios com

0,02 g/L e 0,04 g/L de biomassa inicial, respectivamente (APÊNDICE 5).

O consumo de ácido acético nos ensaios com diferentes concentrações de biomassa

inicial (0,02 g/L e 0,04 g/L) é apresentado na Figura 5.6. Os resultados mostraram que, assim

como nos ensaios anteriores, não houve consumo total, sendo que para a concentração de

biomassa de 0,02 g/L ocorreu 51% de consumo máximo em 384 h. Por outro lado, no ensaio

com maior concentração (0,04 g/L) ocorreu 70% de utilização do substrato orgânico em 408 h

de experimento.

Em relação à produção de hidrogênio (Figura 5.7), observou-se que no ensaio onde a

concentração de biomassa inicial era maior (0,04 g/L), ocorreu diminuição da fase lag de 100

para 50 h, quando comparado com aquele cuja biomassa foi de 0,02 g/L. A fase estacionária,

em ambos os ensaios, iniciou-se aproximadamente após 280 h de experimento.

As produções máximas alcançadas nos ensaios com 0,02 g/L e 0,04 g/L de biomassa

inicial foram 8,8 mL H

/g massa seca.h e 10,6 mL H

/g massa seca.h, respectivamente.

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0 50 100 150 200 250 300 350 400 450

Tempo (h)

Concentração de

biomassa (g/L)

Ácido acético

(mmol/L)

massa seca (0,02 g/L biomassa) massa seca (0,04 g/L biomassa)

ác. acético (0,02 g/L biomassa) ác. acético (0,04 g/L biomassa)

Figura 5.6. Crescimento celular e consumo de ácido acético para diferentes concentrações iniciais da

cultura de bactérias fototróficas púrpuras não-sulfurosas em reatores em batelada

100

120

140

0 50 100 150 200 250 300 350 400 450

Tempo (h)

Hidrogênio acumulado (mL)

0,02 g/L biomassa 0,04 g/L biomassa

Figura 5.7. Produção de hidrogênio para diferentes concentrações iniciais da cultura de bactérias

fototróficas púrpuras não-sulfurosas em reatores em batelada

Para verificar a influência da intensidade luminosa na produção de hidrogênio foram

realizados ensaios em batelada, sob iluminação de 9000 a 10.000 lux, 4000 a 5000 lux, ou

então com reatores mantidos na ausência de luz. O efeito da intensidade luminosa no

crescimento celular é mostrado na Figura 5.8a.

Comparando-se as curvas de crescimento dos ensaios sob diferentes intensidades

luminosas, pode-se notar que aqueles mantidos sob iluminação de 9000 a 10.000 lux e 4000 a

5000 lux apresentaram padrão de crescimento muito semelhante, com fase lag de 24 h.

Porém, no ensaio mantido sob iluminação de 4000 a 5000 lux, a fase estacionária teve início

após 190 h, enquanto que no ensaio de 9000 a 10.000 lux, essa fase iniciou-se após 250 h do

início do experimento. Tais resultados sugeriram que maior intensidade luminosa favoreceu o

crescimento celular. Os reatores mantidos na ausência de luz não apresentaram nenhum

aumento de biomassa.

Velocidades específicas de crescimento (µ) de 0,0082 h

-1

e 0,0088 h

-1

, e tempos de

geração (Tg) de 84,5 h e 78,8 h foram obtidos para as culturas crescidas nos ensaios sob

iluminação de 9000 a 10.000 lux e 4000 a 5000 lux, respectivamente (APÊNDICE 5).

A variação temporal do consumo de ácido acético nos ensaios sob diferentes

intensidades luminosas está mostrado na Figura 5.8b. Os resultados mostraram que não houve

consumo total de ácido acético, embora no ensaio com intensidade luminosa mais elevada

(9000 – 10.000 lux) ocorreu consumo máximo de 70% em 408 h. Todavia, no ensaio com

menor intensidade de luz (4000 – 5000 lux) observou-se consumo máximo de 57% em 288 h

de experimento. No ensaio mantido no escuro praticamente não ocorreu consumo do substrato

orgânico.

A produção de hidrogênio obtida para diferentes intensidades luminosas é mostrada na

Figura 5.8c. Quando os reatores foram mantidos sob iluminação de 9000 a 10.000 lux, a

produção de hidrogênio apresentou fase lag de até 50 h e início da fase estacionária após

280 h. Nos reatores mantidos sob iluminação de 4000 a 5000 lux, a fase lag durou até 72 h, e

a fase estacionária iniciou-se somente após 340 h de experimento. Ainda, no ensaio onde a

iluminação foi mais elevada (9000 a 10.000 lux), a produção de hidrogênio acumulado foi

maior do que no ensaio com menor iluminação (4000 a 5000 lux).

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0 50 100 150 200 250 300 350 400 450

Tempo (h)

Concentração de biomassa

(g/L)

9000 - 10000 lux 4000 - 5000 lux escuro

0 50 100 150 200 250 300 350 400 450

Tempo (h)

Ácido acético (mmol/L)

9000 - 10000 lux 4000 - 5000 lux escuro

100

120

140

0 50 100 150 200 250 300 350 400 450

Tempo (h)

Hidrogênio acumulado (mL)

9000 - 10000 lux 4000 - 5000 lux

Figura 5.8. Efeito da intensidade luminosa no crescimento celular (a); no consumo de ácido acético (b)

e na produção de hidrogênio (c)

(a)

(b)

(c)

Como dito anteriormente, quando a cultura de bactérias fototróficas púrpuras não-

sulfurosas foi mantida no escuro não houve crescimento celular. Nestas mesmas condições, a

produção de hidrogênio foi nula.

A máxima produção alcançada no ensaio mantido sob iluminação de 9000 a

10.000 lux foi 10,6 mL H

/g massa seca.h.

Os valores de hidrogênio acumulado obtido no ensaio sob iluminação de 4000 a

5000 lux não se ajustaram adequadamente a sigmóide de Boltzmann. Sendo assim, foi

realizado ajuste linear, e a máxima produção de hidrogênio obtida neste ensaio foi

1,0 mL H

/g massa seca.h. De acordo com os resultados, a diminuição na intensidade

luminosa provocou proeminente redução na velocidade de produção de hidrogênio.

Nakada et al. (1995) estudaram a relação entre penetração de luz e produção de

hidrogênio por cultura de bactéria fototrófica Rhodobacter sphaeroides. A intensidade de luz

na superfície do reator foi mantida a 20.000 ou 40.000 lux e, segundo os autores, baixas

intensidades luminosas (20.000 lux) não foram favoráveis à produção de hidrogênio por

bactérias fototróficas. Segundo Kondo et al. (2002), a produção de hidrogênio por bactérias

fototróficas é determinada preferencialmente pela uniformidade de luz no reator. No presente

trabalho, baixas intensidades luminosas (4000 a 5000 lux) não foram favoráveis à produção

de hidrogênio, enquanto que intensidades mais elevadas (9000 a 10.000 lux) mostraram

resultados de produção de hidrogênio maiores, por bactérias fototróficas púrpuras não-

sulfurosas.

Os valores das velocidades de produção de hidrogênio estão apresentados no

APÊNDICE 6.

Os períodos da fase lag de crescimento e de produção de hidrogênio, a máxima

concentração de biomassa alcançada, a velocidade específica de crescimento (µ), o tempo de

geração (Tg) e a velocidade máxima de produção de hidrogênio para cada ensaio estão

mostrados na Tabela 5.1.

Tabela 5.1 – Resultados obtidos nos ensaios de produção de hidrogênio

Ensaio* Fase lag

crescimento

(h)

Máxima

concentração

biomassa (g/L)

-1

)

(h)

Fase lag

produção

(h)

Velocidade máxima

produção H

(mL H

/g massa seca.h)

100 0,19 0,0084 82,5 100 8,3

100 0,22 0,0100 69,3 100 8,8

24 0,23 0,0082 84,5 50 10,6

24 0,20 0,0088 78,8 72 1,00

*ensaio 1: 10 mmol/L ácido acético; 0,02 g/L biomassa inicial; 9000 – 10.000 lux

ensaio 2: 17 mmol/L ácido acético; 0,02 g/L biomassa inicial; 9000 – 10.000 lux

ensaio 3: 18 mmol/L ácido acético; 0,04 g/L biomassa inicial; 9000 – 10.000 lux

ensaio 4: 22 mmol/L ácido acético; 0,04 g/L biomassa inicial; 4000 – 5000 lux

De acordo com os resultados obtidos, a máxima concentração de biomassa alcançada

foi independente da concentração inicial de ácido acético ou de biomassa, variando de 0,19 a

0,23 g/L. Contudo, quando se utilizou maior concentração de biomassa (0,04 g/L), o

crescimento apresentou diminuição da fase lag de 100 para 24 h. As velocidades específicas

de crescimento e tempos de geração pouco variaram entre os ensaios, mostrando, assim, não

terem relação direta com as concentrações de ácido acético e biomassa.

A velocidade máxima de produção de hidrogênio pouco variou (8,3 a 8,8 mL H

massa seca.h) com o aumento da concentração de ácido acético inicial de 10 para 17 mmol/L.

Porém, com o aumento da concentração de biomassa de 0,02 para 0,04 g/L ocorreu aumento

significativo na velocidade de produção de hidrogênio (8,8 para 10,6 mL H

/g massa seca.h),

assim como diminuição da fase lag de 100 para 50 h. A diminuição na intensidade luminosa

de 9000 – 10.000 lux para 4000 – 5000 lux promoveu diminuição rigorosa na velocidade de

produção de hidrogênio; ou seja, de 10,6 para 1,0 mL H

/g massa seca.h.

O ensaio realizado no escuro não apresentou crescimento celular, produção de

hidrogênio e consumo de ácido acético. Tal fato deve ter ocorrido porque, embora bactérias

fototróficas apresentem ampla diversidade metabólica, a cultura utilizada neste trabalho já

estava adaptada à condição fototrófica de crescimento. Além disso, segundo Koku et al.

(2002) bactérias fototróficas púrpuras não-sulfurosas exibem crescimento marginal e

nenhuma produção de hidrogênio sob condições anaeróbias na ausência de luz.

5.3.1 Exames microscópicos

A microscopia óptica de contraste de fase da cultura nos ensaios alimentados com

10 mmol/L e 17 mmol/L de ácido acético apresentaram predominância de bacilos curvos,

aglomerados em formações de roseta (Figura 5.9). Estes mesmos aglomerados, assim como os

bacilos curvos, também foram predominantes nos ensaios com diferentes concentrações

iniciais de biomassa (Figura 5.10). O mesmo ocorreu nos ensaios mantidos sob iluminação de

9000 a 10.000 lux e 4000 a 5000 lux (Figura 5.11). Já o ensaio mantido no escuro apresentou

redução visível da concentração de biomassa celular, assim como aparecimento de células

amorfas e debris celulares (Figura 5.12).

(a) (b)

Figura 5.9. Microscopia óptica de contraste de fase das amostras dos reatores em batelada alimentados

com ácido acético nas seguintes concentrações: (a) 10 mmol/L e (b) 17 mmol/L

(a) (b)

Figura 5.10. Microscopia óptica de contraste de fase das amostras dos reatores em batelada inoculados

com as seguintes concentrações de biomassa: (a) 0,02 g/L e (b) 0,04 g/L

(a) (b)

Figura 5.11. Microscopia óptica de contraste de fase das amostras dos reatores em batelada mantidos

sob iluminação de: (a) 9000 a 10.000 lux e (b) 4000 a 5000 lux

Figura 5.12. Microscopia óptica de contraste de fase das amostras dos reatores em batelada mantidos

no escuro

5.3.2 Biologia molecular

É importante ressaltar que, para a caracterização microbiana, as amostras foram

coletadas na fase exponencial de crescimento. O objetivo dessa análise foi promover a

comparação e a avaliação da cultura de bactérias fototróficas púrpuras não-sulfurosas,

verificando possíveis alterações em função das diferentes concentrações iniciais de ácido

acético e biomassa, e também devido a mudanças na intensidade luminosa fornecida.

Os resultados da análise do PCR/DGGE podem ser observados na Figura 5.13, que

mostra o gel de DGGE das amostras dos ensaios de produção de hidrogênio. Assim, por meio

da análise das bandas de DGGE para o domínio Bacteria e pelas letras de A a F, pode-se

verificar elevada similaridade de bandas, ou seja, não houve variações relevantes na estrutura

das populações microbianas. As populações representadas pelas bandas A, B e C foram

favorecidas pelas condições nutricionais e ambientais adotadas, em relação a condição do

inóculo. A população indicada pela banda D foi favorecida em todas as condições, inclusive

no inóculo. Já a população representada pela banda F foi mais sensível quando mantida no

escuro. Todavia, a população mostrada pela banda E foi favorecida somente na condição de

ausência de luminosidade.

Figura 5.13. Resultados das análises de DGGE dos fragmentos dos produtos de PCR amplificados com

primers do Domínio Bactéria para as amostras: I – inóculo; 1 – ensaio com 10 mmol/L de ácido

acético; 2 – ensaio com 17 mmol/L de ácido acético; 3 – ensaio com 0,04 g/L biomassa; 4 – ensaio

mantido sob iluminação de 4000 a 5000 lux; 5 – ensaio mantido no escuro

5.4 Caracterização nutricional

O ensaio de caracterização nutricional foi realizado com a finalidade de se avaliar o

crescimento celular e produção de hidrogênio pela cultura purificada de bactérias fototróficas

púrpuras não-sulfurosas, na presença de diversos substratos orgânicos. Este ensaio teve

duração de 384 h, e os resultados obtidos estão apresentados no APÊNDICE 7.

Como controle de crescimento foi utilizado reator contendo acetato de sódio

(20 mmol/L) e glutamato de sódio (0,8 mmol/L), por se tratar da condição utilizada nos

ensaios anteriores. O valor inicial de biomassa deste frasco foi 0,020 g/L. Após 384 h, este

ensaio controle apresentou concentração de biomassa de 0,250 g/L (Figura 5.14).

No ensaio de caracterização, a biomassa inicial dos frascos alimentados com diferentes

fontes de carbono variou de 0,020 a 0,026 g/L de massa seca. Após 384 h de experimento

observou-se crescimento elevado em butirato de sódio (0,114 g/L massa seca), piruvato de

sódio (0,146 g/L massa seca), propionato de sódio (0,189 g/L massa seca) e succinato de

sódio (0,161 g/L massa seca). Ainda, quando se utilizou citrato de sódio, o valor de massa

seca obtido foi maior que o controle (0,271 g/L massa seca e 0,250 g/L massa seca,

respectivamente). Também, verificou-se crescimento moderado em benzoato de sódio

(0,052 g/L massa seca), etanol (0,085 g/L massa seca), frutose (0,075 g/L massa seca), glicose

(0,089 g/L massa seca) e metanol (0,082 g/L massa seca). Contudo, não houve crescimento da

cultura na presença de fenol (0,027 g/L massa seca), lactato de sódio (0,017 g/L massa seca),

e quando a única fonte orgânica fornecida foi o glutamato de sódio (0,034 g/L massa seca).

Estes resultados podem ser visualizados na Figura 5.14.

Imhoff e Trüper (1989) não observaram crescimento para a bactéria fototrófica

Rhodopseudomonas palustris, na presença de formiato e glutamato. Contudo, os mesmos

autores constataram crescimento moderado em frutose e glicose, e crescimento elevado na

presença de aspartato, benzoato, etanol e propionato. Zhang et al. (2002), trabalhando com a

bactéria fototrófica Rhodopseudomonas faecalis sp. nov., observaram elevado crescimento em

acetato, piruvato, lactato, malato, succinato e butirato; moderado crescimento em fumarato e

propionato; e nenhum crescimento em benzoato, citrato, etanol, metanol e glutamato. No

presente trabalho, utilizando cultura purificada de bactéria fototrófica púrpura não-sulfurosa,

com predomínio de Rhodopseudomonas palustris, obteve-se elevado crescimento em butirato,

citrato, piruvato, propionato e succinato. Moderado crescimento foi observado em benzoato,

etanol, frutose, glicose e metanol; e nenhum crescimento em fenol, glutamato e lactato.

Com relação à produção de hidrogênio, o ensaio controle, com acetato de sódio,

atingiu produção de 3,4 mL de H

acumulado em 384 h de experimento, enquanto que nos

ensaios com citrato de sódio, frutose, glicose, piruvato de sódio, propionato de sódio e

succinato de sódio, as produções alcançadas foram de 3,69 mL H

; 1,76 mL H

; 2,06 mL H

;

2,40 mL H

; 2,80 mL H

e 1,64 mL H

; respectivamente (Figura 5.15). Entretanto, quando se

utilizou benzoato de sódio, butirato de sódio, etanol, fenol, lactato de sódio, metanol e

glutamato de sódio como fonte de carbono, a produção de hidrogênio foi nula.

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

acet

to de

ódio

benz

ato d

sódi

utir

ato

só

dio

itra

de s

dio

eta

nol

fru

gli

ose

glutamato d

sódi

lac

to de

sódio

eta

nol

pir

uva

sód

pion

to de

ódio

ccin

to de

ódio

Concentração

de biomassa (g/L)

0 h

384 h

Figura 5.14. Crescimento celular da cultura de bactérias fototróficas púrpuras não-sulfurosas, na

presença de diferentes substratos orgânicos

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

acetato de

itr

sód

utose

glicose

iruvato de sódi

propionato de

ódi

ccina

o de sódio

Hidrogênio

acumulado (mL)

Figura 5.15. Produção de hidrogênio pela cultura de bactérias fototróficas púrpuras não-sulfurosas, na

presença de diferentes substratos orgânicos

De acordo com Koku et al. (2002), ampla variedade de substratos pode ser utilizada

por bactérias fototróficas para crescimento, porém somente alguns destes estão disponíveis

para produção de hidrogênio. Hillmer e Gest (1977), utilizando bactéria fototrófica

Rhodopseudomonas capsulata, observaram produção elevada de hidrogênio na presença de

lactato, piruvato e succinato; produção moderada em glicose, frutose e malato; e baixa

produção na presença de butirato, propionato e sacarose. No presente trabalho, onde se

utilizou cultura purificada de bactérias fototróficas, com predomínio de Rhodopseudomonas

palustris, observou-se produção elevada de hidrogênio na presença de acetato e citrato;

produção moderada em frutose, glicose, piruvato, propionato e succinato. Nenhuma produção

foi observada em benzoato, butirato, etanol, fenol, glutamato, lactato e metanol.

A microscopia óptica de contraste de fase de amostra da cultura dos frascos

alimentados com acetato de sódio, benzoato de sódio, citrato de sódio, fenol, lactato de sódio,

metanol, piruvato de sódio e propionato de sódio, apresentou predomínio de bacilos curvos,

aglomerados em formações de roseta (Figuras 5.16 e 5.17). Quando se utilizou succinato de

sódio, embora ainda houvesse predominância de bacilos curvos, observou-se a presença de

poucas células (Figura 5.18). Já no ensaio onde se utilizou apenas glutamato de sódio, houve

predomínio de bacilos retos (Figura 5.19). Entretanto, quando a fonte de carbono utilizada foi

butirato de sódio, etanol, frutose ou glicose, ocorreu não só o aparecimento de bacilos curvos

formando aglomerados do tipo roseta, mas também bacilos retos e filamentos (Figura 5.20).

(a) (b)

(e) (f)

Figura 5.16. Predomínio de bacilos curvos aglomerados em formações de roseta, em microscopia

óptica de contraste de fase de amostras dos frascos alimentados com: (a) acetato de sódio, (b) benzoato

de sódio, (c) citrato de sódio, (d) fenol, (e) lactato de sódio e (f) metanol

(a) (b)

Figura 5.17. Predomínio de bacilos curvos aglomerados em formações de roseta, em microscopia

óptica de contraste de fase de amostras dos frascos alimentados com: (a) piruvato de sódio e (b)

propionato de sódio

Figura 5.18. Microscopia óptica de contraste de fase de amostra do frasco alimentado com succinato

de sódio

Figura 5.19. Predomínio de bacilos retos, em microscopia óptica de contraste de fase de amostra do

frasco alimentado com glutamato de sódio

(a) (b)

Figura 5.20. Bacilos curvos aglomerados em formações de roseta, bacilos retos e filamentos, em

microscopia óptica de contraste de fase de amostras dos frascos alimentados com: (a) butirato de

sódio, (b) etanol, (c) frutose e (d) glicose

Neste ensaio de caracterização, a coloração da cultura em suspensão variou de

transparente, amarelada a púrpura (Figura 5.21). Um resumo do crescimento celular, produção

de hidrogênio, morfologias predominantes e coloração da cultura em suspensão, do ensaio de

caracterização nutricional, é mostrado na Tabela 5.2.

Figura 5.21. Foto dos frascos utilizados no ensaio de caracterização nutricional, mostrando as

diferentes colorações da cultura em suspensão, na presença de diferentes substratos orgânicos

Tabela 5.2 – Crescimento celular, produção de hidrogênio, morfologias predominantes e coloração da

cultura no ensaio de caracterização nutricional

Substratos

orgânicos

(20 mmol/L)

Cresc. Produção

de H

(mL)

Morfologias

predominantes

Coloração da

cultura

acetato de sódio

+ 3,4 bacilos curvos púrpura

benzoato de sódio

± 0 bacilos curvos rosa claro

butirato de sódio

bacilos curvos, bacilos

retos e filamentos

rosa

citrato de sódio

+ 3,69 bacilos curvos púrpura

etanol

bacilos curvos, bacilos

retos e filamentos

rosa claro

fenol

─ 0 bacilos curvos amarela

frutose

1,76

bacilos curvos, bacilos

retos e filamentos

rosa claro

glicose

2,06

bacilos curvos, bacilos

retos e filamentos

rosa claro

glutamato de sódio

─ 0 bacilos retos transparente

lactato de sódio

─ 0 bacilos curvos transparente

metanol

± 0 bacilos curvos rosa claro

piruvato de sódio

+ 2,40 bacilos curvos rosa

propionato de sódio

+ 2,80 bacilos curvos rosa

succinato de sódio

+ 1,64 bacilos curvos púrpura

+: crescimento elevado; ± crescimento moderado; ─ nenhum crescimento

De acordo com Bergey`s Manual of Systematic Bacteriology (1989), a bactéria

fototrófica Rhodopseudomonas palustris apresenta coloração da cultura de púrpura a marrom;

apresenta formato ovóide ou bacilar, as vezes levemente curvado; pode utilizar como fonte de

carbono acetato, butirato, citrato, fumarato, glutamato, lactato, malato, piruvato, propionato e

succinato; algumas linhagens utilizam etanol, frutose, glicose e metanol; e é a única espécie

do gênero capaz de utilizar benzoato.

De acordo com os resultados obtidos no ensaio de enriquecimento, a cultura

fototrófica utilizada só não teve seu crescimento favorecido na presença de fenol, glutamato

de sódio e lactato de sódio. Nos substratos orgânicos onde o crescimento celular foi de

elevado a moderado, ocorreu produção de hidrogênio, com exceção dos substratos benzoato

de sódio, butirato de sódio, etanol e metanol. Logo, estes substratos favoreceram o

crescimento da cultura fototrófica, mas não foram utilizados para produção de hidrogênio.

Em todos os substratos orgânicos utilizados, a morfologia predominante foi a de

bacilos curvos, formando aglomerações de roseta, com exceção do glutamato de sódio, que

mostrou predominância de bacilos retos. Além disso, substratos como butirato de sódio,

etanol, frutose e glicose, favoreceram o surgimento de bactérias no formato de bacilos retos e

filamentos. A coloração da cultura em suspensão pôde ser associada ao crescimento, uma vez

que apresentou coloração de púrpura a rosa quando o crescimento foi elevado; coloração rosa

claro quando o crescimento foi moderado; e coloração transparente a amarelada quando não

houve crescimento celular.

6 CONCLUSÕES

As principais conclusões deste trabalho foram:

• A cultura purificada de bactéria fototrófica púrpura não-sulfurosa mostrou potencial

de produção de hidrogênio em reatores em batelada;

• O aumento da concentração inicial de ácido acético de 10 mmol/L para 17 mmol/L

não promoveu mudanças significativas tanto no crescimento celular quanto na

produção de hidrogênio;

• O aumento da concentração inicial de biomassa de 0,02 g/L para 0,04 g/L favoreceu o

aumento da produção de hidrogênio;

• A diminuição na intensidade luminosa de 9000 a 10.000 lux para 4000 a 5000 lux

promoveu diminuição rigorosa na velocidade de produção de hidrogênio;

• Análises microscópicas da comunidade microbiana presente nos ensaios de

enriquecimento e de produção de hidrogênio mostraram a predominância de

microrganismos com formato de bacilos curvos, Gram-negativos, aglomerados em

formações de roseta; características típicas de alguns gêneros de bactérias fototróficas

púrpuras não-sulfurosas com potencial de produzir hidrogênio;

• A análise de PCR/DGGE das amostras dos ensaios de produção de hidrogênio revelou

elevada similaridade de bandas, ou seja, não houve variações relevantes na estrutura

da comunidade microbiana em função das diferentes concentrações iniciais de ácido

acético e biomassa, e também, devido a mudanças na intensidade luminosa fornecida;

• No ensaio de caracterização nutricional, a cultura fototrófica não teve seu crescimento

favorecido na presença de fenol, glutamato de sódio e lactato de sódio; sendo que a

produção de hidrogênio ocorreu nos substratos orgânicos onde o crescimento celular

foi de elevado a moderado, como acetato de sódio, citrato de sódio, frutose, glicose,

piruvato de sódio, propionato de sódio e succinato de sódio. A microscopia óptica de

contraste de fase revelou a predominância de bacilos curvos em todos os substratos

orgânicos utilizados, com exceção do glutamato de sódio, que mostrou predominância

de bacilos retos.

7 RECOMENDAÇÕES

Em relação a estudos posteriores, sugere-se:

• Avaliar o crescimento e a produção de hidrogênio da cultura fototrófica

púrpura não-sulfurosa, utilizando efluente de reator anaeróbio acidogênico

como fonte de nutrientes;

• Utilizar a bactéria fototrófica em sistema contínuo, para produção de

hidrogênio.

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APÊNDICE 1 – Curva-padrão de crescimento de bactéria fototrófica púrpura não-

sulfurosa

Absorbância (660 nm) Massa seca (g/L)

Tempo

(h) Reator 1 Reator 2 Média Reator 1 Reator 2 Média

0,011 0,012 0,012 0,0133 0,0156 0,0144

0,028 0,034 0,031 0,0267 0,0467 0,0367

0,047 0,050 0,049 0,0578 0,0467 0,0522

0,071 0,069 0,070 0,0578 0,0511 0,0544

0,100 0,107 0,104 0,0689 0,0867 0,0778

120

0,133 0,140 0,137 0,1111 0,1067 0,1089

144

0,178 0,169 0,174 0,1178 0,1289 0,1233

168

0,199 0,198 0,199 0,1378 0,1511 0,1444

APÊNDICE 2 – Tempo de experimento, valores de absorbância e concentração de

massa seca obtidos nos reatores anaeróbios em batelada

Ensaio 1 - Ácido acético (10 mmol/L) e biomassa inicial (0,02 g/L)

Absorbância (660 nm)

Tempo (h) reator 1 reator 2 reator 3 média

Concentração média

de massa seca

(g/L)

0,025 0,028 0,031 0,028 0,018

0,048 0,044 0,046 0,046 0,030

0,051 0,058 0,055 0,055 0,036

0,066 0,071 0,068 0,068 0,045

0,078 0,093 0,079 0,083 0,055

120

0,102 0,113 0,090 0,102 0,067

144

0,129 0,149 0,126 0,135 0,089

168

0,161 0,191 0,161 0,171 0,113

192

0,167 0,204 0,180 0,184 0,121

216

0,204 0,266 0,211 0,227 0,150

240

0,248 0,306 0,257 0,270 0,178

288

0,279 0,315 0,267 0,287 0,189

360

0,291 0,321 0,272 0,295 0,194

384

0,265 0,298 0,281 0,281 0,186

408

0,263 0,278 0,274 0,272 0,179

Ensaio 2 - Ácido acético (17 mmol/L) e biomassa inicial (0,02 g/L)

Absorbância (660 nm)

Tempo (h) reator 1 reator 2 reator 3 média

Concentração média

de massa seca

(g/L)

0,028 0,030 0,031 0,030 0,020

0,043 0,044 0,039 0,042 0,028

0,060 0,051 0,054 0,055 0,036

0,071 0,064 0,061 0,065 0,043

0,082 0,078 0,068 0,076 0,050

120

0,115 0,101 0,083 0,100 0,066

144

0,196 0,119 0,114 0,143 0,094

168

0,241 0,162 0,148 0,184 0,121

192

0,317 0,176 0,182 0,225 0,149

216

0,332 0,233 0,235 0,267 0,176

240

0,323 0,284 0,269 0,292 0,193

288

0,347 0,296 0,272 0,305 0,201

360

0,368 0,307 0,263 0,313 0,206

384

0,399 0,301 0,316 0,339 0,224

408

0,368 0,292 0,264 0,308 0,203

Ensaio 3 - Ácido acético (18 mmol/L) e biomassa inicial (0,04 g/L)

Absorbância (660 nm)

Tempo (h) reator 1 reator 2 reator 3 média

Concentração média

de massa seca

(g/L)

0,058 0,054 0,054 0,055 0,037

0,066 0,066 0,070 0,067 0,044

0,084 0,096 0,102 0,094 0,062

0,097 0,116 0,120 0,111 0,073

0,121 0,125 0,138 0,128 0,084

120

0,141 0,161 0,163 0,155 0,102

144

0,171 0,209 0,216 0,199 0,131

192

0,244 0,306 0,285 0,278 0,184

216

0,308 0,298 0,326 0,311 0,205

240

0,335 0,315 0,346 0,332 0,219

264

0,328 0,336 0,337 0,334 0,220

288

0,324 0,316 0,382 0,341 0,225

360

0,298 0,309 0,375 0,327 0,216

384

0,311 0,275 0,319 0,302 0,199

408

0,294 0,285 0,350 0,310 0,204

Ensaio 4 - Ácido acético (22 mmol/L) e biomassa inicial (0,04 g/L)

Absorbância (660 nm)

Tempo (h)

reator 1

reator 2

média

Concentração média

de massa seca

(g/L)

0,053 0,056 0,055 0,036

0,065 0,073 0,069 0,046

0,080 0,085 0,083 0,054

0,106 0,116 0,111 0,073

0,138 0,140 0,139 0,092

120

0,166 0,158 0,162 0,107

144

0,230 0,212 0,221 0,146

168

0,254 0,214 0,234 0,154

192

0,290 0,278 0,284 0,187

216

0,264 0,290 0,277 0,183

240

0,275 0,308 0,292 0,192

264

0,258 0,287 0,273 0,180

288

0,276 0,324 0,300 0,198

336

0,258 0,324 0,291 0,192

408

0,290 0,327 0,309 0,204

Ensaio 5 - Ácido acético (22 mmol/L) e biomassa inicial (0,04 g/L)

Absorbância (660 nm)

Tempo (h) reator 1 reator 2 reator 3 média

Concentração média

de massa seca

(g/L)

0,052 0,053 0,052 0,052 0,035

0,051 0,052 0,052 0,051 0,034

0,032 0,041 0,045 0,032 0,026

0,039 0,041 0,045 0,039 0,028

0,043 0,045 0,048 0,043 0,030

120

0,048 0,050 0,048 0,048 0,032

144

0,039 0,042 0,049 0,039 0,029

168

0,043 0,044 0,042 0,043 0,028

192

0,045 0,042 0,051 0,045 0,030

216

0,038 0,037 0,044 0,038 0,026

240

0,043 0,044 0,049 0,043 0,030

288

0,037 0,038 0,040 0,037 0,025

336

0,038 0,040 0,039 0,038 0,026

408

0,039 0,050 0,045 0,039 0,029

APÊNDICE 3 – Tempo de experimento, área cromatográfica e valores de hidrogênio

acumulado no headspace dos reatores anaeróbios em batelada

Ensaio 1 - Ácido acético (10 mmol/L) e biomassa inicial (0,02 g/L)

Área cromatográfica do hidrogênio

Tempo (h) reator 1 reator 2 reator 3 média

Concentração média

de H

no headspace

(mL/L)

0 0 0 0,0 0

22467,7 14414,0 21245,6 19375,8 0

52955,5 59994,2 62364,8 58438,2 0

107676,8 124807,8 108539,2 113674,6 3,18

159869,7 193323,1 157941,9 170378,2 14,12

120

225226,2 285445,0 224684,0 245118,4 28,54

144

287770,2 342083,3 307075,5 312309,7 41,51

168

367733,2 495078,2 381681,9 414831,1 61,29

192

406845,3 507490,6 433505,1 449280,3 67,94

216

487178,9 534511,2 513575,1 511755,1 79,99

240

430133,5 687966,7 478687,1 532262,4 83,95

288

556122,3 686707,5 512677,8 585169,2 94,16

360

587748,4 640510,4 739790,5 656016,4 107,83

384

744087,9 795304,2 418840,2 652744,1 107,20

408

344858,0 496936,4 413259,9 418351,4 61,97

Ensaio 2 - Ácido acético (17 mmol/L) e biomassa inicial (0,02 g/L)

Área cromatográfica do hidrogênio

Tempo (h) reator 1 reator 2 reator 3 média

Concentração média

de H

no headspace

(mL/L)

0,0 0,0 0,0 0,0 0

0,0 6558,8 9460,7 5339,8 0

35973,2 52346,4 49161,2 45826,9 0

100499,4 109107,4 96394,3 102000,4 0,93

120473,6 120337,4 124141,8 121650,9 4,72

120

216929,2 202809,0 202369,8 207369,3 21,26

144

302701,1 279857,9 260674,2 281077,7 35,48

168

356544,7 351248,8 347302,9 351698,8 49,11

192

488624,4 452069,8 428868,3 456520,8 69,34

216

574379,3 445679,0 486010,3 502022,9 78,12

240

525286,8 528568,0 556313,9 536722,9 84,81

288

543178,3 696164,9 712259,8 650534,3 106,77

360

568341,2 712329,9 854292,8 711654,6 118,57

384

577625,7 649614,0 506375,7 577871,8 92,75

408

426073,3 630607,3 567467,4 541382,7 85,71

Ensaio 3 - Ácido acético (18 mmol/L) e biomassa inicial (0,04 g/L)

Área cromatográfica do hidrogênio

Tempo (h) reator 1 reator 2 reator 3 média

Concentração média

de H

no headspace

(mL/L)

0,0 0,0 0,0 0,0 0

8773,8 15084,1 13786,3 12548,1 0

85949,8 88375,6 97855,3 90726,9 0

176462,2 189226,5 206384,6 190691,1 18,04

257270,6 229386,1 285935,1 257530,6 30,94

120

336646,6 406056,5 467081,5 403261,5 59,06

144

388025,5 425553,1 441516,4 418365,0 61,97

192

480542,8 509432,9 452006,5 480660,7 73,99

216

595584,7 521077,5 517226,2 544629,5 86,34

240

558231,2 517579,6 542406,3 539405,7 85,33

264

709454,8 693725,4 712329,9 705170,0 117,32

288

701981,6 606475,9 640058,6 649505,4 106,57

360

636035,8 613443,3 661242,0 636907,0 104,14

384

735316,5 695110,4 836143,2 755523,4 127,03

408

628287,7 631516,2 834093,8 697965,9 115,92

Ensaio 4 - Ácido acético (22 mmol/L) e biomassa inicial (0,04 g/L)

Área cromatográfica do hidrogênio

Tempo (h) reator 1 reator 2 média

Concentração média

de H

no headspace

(mL/L)

0,0 0,0 0,0 0

11254,2 28700,6 19977,4 0

20339,3 23750,3 22044,8 0

104754,6 106089,6 105422,1 1,59

162316,8 151666,2 156991,5 11,54

120

188703,7 163108,7 175906,2 15,19

144

244094,5 188172,6 216133,6 22,95

168

257788,3 166829,1 212308,7 22,21

192

331582,5 198490,2 265036,4 32,39

216

374395,6 184706,5 279551,1 35,19

240

467500,6 187442,3 327471,5 44,43

264

454019,7 225101,5 339560,6 46,77

288

532721,5 242669,4 387695,5 56,06

336

650319,9 290802,0 470561,0 72,04

408

636245,8 278207,8 457226,8 69,47

APÊNDICE 4 – Tempo de experimento e consumo de ácido acético nos reatores

anaeróbios em batelada

Ensaio 1 – Ácido acético (10 mmol/L) e biomassa inicial (0,02 g/L)

Ácido acético (mmol/L)

Tempo (h) reator 1 reator 2 reator 3 média

Consumo médio de

ácido acético

(%)

9,41 11,36 9,48 10,08 0

9,25 9,53 9,78 9,52 6

9,75 8,25 9,62 9,21 9

8,96 7,76 8,51 8,41 17

9,02 7,34 7,85 8,07 20

120

7,41 7,03 6,90 7,11 29

144

6,79 5,86 6,30 6,32 37

168

6,28 5,35 5,52 5,72 43

192

4,78 3,44 4,56 4,26 58

216

4,73 2,76 4,68 4,06 60

240

3,82 2,78 3,97 3,52 65

288

3,40 2,39 3,62 3,14 69

360

2,74 1,32 3,28 2,45 76

384

1,78 2,14 2,74 2,22 78

408

3,65 2,32 3,10 3,02 70

Ensaio 2 - Ácido acético (17 mmol/L) e biomassa inicial (0,02 g/L)

Ácido acético (mmol/L)

Tempo (h) reator 1 reator 2 reator 3 média

Consumo médio de

ácido acético

(%)

17,35 19,07 15,29 17,23 0

17,31 17,00 16,34 16,88 2

15,40 16,41 18,78 16,86 2

14,27 15,50 16,25 15,34 11

15,59 15,11 15,51 15,40 11

120

16,65 14,78 15,28 15,57 10

144

14,54 14,20 13,54 14,09 18

168

11,94 13,46 13,78 13,06 24

192

10,07 12,04 9,42 10,51 39

216

8,18 11,29 10,20 9,89 43

240

8,51 9,58 9,29 9,12 47

288

10,06 9,96 9,23 9,75 43

360

10,81 10,00 9,50 10,11 41

384

7,80 9,23 8,26 8,43 51

408

8,03 9,21 12,16 9,80 43

Ensaio 3 - Ácido acético (18 mmol/L) e biomassa inicial (0,04 g/L)

Ácido acético (mmol/L)

Tempo (h) reator 1 reator 2 reator 3 média

Consumo médio de

ácido acético

(%)

18,13 19,04 16,50 17,89 0

17,51 15,61 15,77 16,30 9

16,63 15,48 15,56 15,89 11

15,29 17,19 14,51 15,66 12

14,27 12,77 17,32 14,78 17

192

11,24 12,99 16,60 13,61 24

240

14,01 14,95 15,41 14,79 17

264

15,57 14,57 14,53 14,89 17

288

14,99 13,70 15,20 14,63 18

360

9,18 5,53 6,56 7,09 60

384

6,08 5,45 5,19 5,57 69

408

5,44 5,20 5,54 5,39 70

Ensaio 4 - Ácido acético (22 mmol/L) e biomassa inicial (0,04 g/L)

Ácido acético (mmol/L)

Tempo (h) reator 1 reator 2 média

Consumo médio de

ácido acético

(%)

22,96 20,55 21,75 0

22,02 21,39 21,70 0

21,92 20,44 21,18 3

19,67 20,13 19,90 9

17,13 17,04 17,09 21

120

22,81 18,01 20,41 6

144

24,71 13,41 19,06 12

168

17,61 20,07 18,84 13

192

20,47 14,04 17,25 21

216

10,08 10,08 10,08 54

240

10,10 10,45 10,27 53

264

10,46 8,64 9,55 56

288

9,03 9,62 9,33 57

336

9,41 9,52 9,47 56

408

9,82 9,95 9,88 55

Ensaio 5 - Ácido acético (22 mmol/L) e biomassa inicial (0,04 g/L)

Ácido acético (mmol/L)

Tempo (h) reator 1 reator 2 reator 3 média

Consumo médio de

ácido acético

(%)

20,92 22,19 22,43 21,85 0

21,96 21,98 22,41 22,12 8

21,87 21,43 17,16 20,15 0

26,25 20,15 19,70 22,03 9

20,11 20,22 19,17 19,83 5

120

18,61 25,52 18,14 20,75 0

192

29,30 23,48 20,32 24,36 0

216

24,46 23,84 20,45 22,92 0

240

27,35 20,65 21,96 23,32 5

288

23,31 18,65 20,14 20,70 0

336

23,08 21,34 21,11 21,85 0

408

21,39 22,95 23,83 22,72 0

APÊNDICE 5 – Determinação da velocidade específica de crescimento e tempo de

geração

Ensaio 1 - Ácido acético (10 mmol/L) e biomassa inicial (0,02 g/L)

y = 0,0084x - 3,6947

= 0,9944

-4

-3

-2

-1

0 50 100 150 200 250

Tempo (h)

ln(massa seca)

Ensaio 2 - Ácido acético (17 mmol/L) e biomassa inicial (0,02 g/L)

y = 0,0101x - 3,8761

= 0,9933

-4

-3

-2

-1

0 50 100 150 200 250

Tempo (h)

ln(massa seca)

Ensaio 3 - Ácido acético (18 mmol/L) e biomassa inicial (0,04 g/L)

y = 0,0082x - 3,2369

= 0,9903

-4

-3

-2

-1

0 50 100 150 200 250

Tempo (h)

ln(massa seca)

Ensaio 4 - Ácido acético (22 mmol/L) e biomassa inicial (0,04 g/L)

y = 0,0088x - 3,2888

= 0,9902

-4

-3

-2

-1

0 50 100 150 200 250

Tempo (h)

ln(massa seca)

APÊNDICE 6 – Determinação da velocidade máxima de produção de hidrogênio nos

reatores anaeróbios em batelada

Ensaio 1 - Ácido acético (10 mmol/L) e biomassa inicial (0,02 g/L)

Tempo (h)

Velocidade de produção de hidrogênio

(mL H

/g massa seca.h)

0 0,09425

6,5 0,11759

13,0 0,17569

19,5 0,26203

26,0 0,38972

32,5 0,57731

39,1 0,85011

45,6 1,24091

52,1 1,78849

58,6 2,53121

65,1 3,49205

71,6 4,65277

78,1 5,92208

84,6 7,11748

91,1 7,99209

97,6 8,32126

104,1 8,01112

110,6 7,15025

117,2 5,96083

123,7 4,69062

130,2 3,52478

136,7 2,55728

143,2 1,80811

149,7 1,25511

156,2 0,86011

162,7 0,58423

169,2 0,39445

175,7 0,26523

182,2 0,17786

188,7 0,11904

195,3 0,07958

201,8 0,05316

208,3 0,03549

214,8 0,02368

221,3 0,01580

227,8 0,01054

234,3 0,00703

240,8 0,00469

247,3 0,00313

253,8 0,00209

260,3 0,00139

266,8 0,00093

273,4 0,00062

279,9 0,00041

286,4 0,00027

292,9 0,00018

299,4 0,00012

305,9 0,00008

312,4 0,00005

318,9 0,00004

325,4 0,00002

331,9 0,00002

338,4 0,00001

344,9 0,00001

351,5 0

358,0 0

364,5 0

371,0 0

377,5 0

384,0 0

Máxima velocidade de produção de hidrogênio

-50 0 50 100 150 200 250 300 350 400

mL H

/g massa seca/h

Tempo (h)

Ensaio 2 - Ácido acético (17 mmol/L) e biomassa inicial (0,02 g/L)

Tempo (h)

Velocidade de produção de hidrogênio

(mL H

/g massa seca.h)

0 0,00490

6,9 0,00684

13,8 0,01225

20,7 0,02195

27,7 0,03931

34,6 0,07033

41,5 0,12566

48,4 0,22390

55,3 0,39706

62,2 0,69823

69,2 1,20987

76,1 2,04422

83,0 3,31265

89,9 5,02651

96,8 6,92913

103,7 8,41448

110,6 8,80375

117,6 7,89192

124,5 6,14193

131,4 4,26341

138,3 2,72423

145,2 1,64788

152,1 0,96349

159,1 0,55208

166,0 0,31266

172,9 0,17590

179,8 0,09859

186,7 0,05514

193,6 0,03080

200,5 0,01720

207,5 0,00960

214,4 0,00535

221,3 0,00299

228,2 0,00167

235,1 0,00093

242,0 0,00052

248,9 0,00029

255,9 0,00016

262,8 0,00009

269,7 0,00005

276,6 0,00003

283,5 0,00002

290,4 0,00001

297,4 0

304,3 0

311,2 0

318,1 0

325,0 0

331,9 0

338,8 0

345,8 0

352,7 0

359,6 0

366,5 0

373,4 0

380,3 0

387,3 0

394,2 0

401,1 0

408,0 0

Máxima velocidade de produção de hidrogênio

0 100 200 300 400

mL H

/g massa seca/h

Tempo (h)

Ensaio 3 - Ácido acético (18 mmol/L) e biomassa inicial (0,04 g/L)

Tempo (h)

Velocidade de produção de hidrogênio

(mL H

/g massa seca.h)

0 0,05688

6,1 0,08023

12,2 0,14594

18,3 0,26472

24,4 0,47781

30,5 0,85478

36,6 1,50516

42,7 2,57854

48,8 4,21851

54,9 6,41604

61,0 8,77480

67,1 10,44548

73,2 10,59556

79,3 9,14169

85,4 6,83237

91,5 4,56438

97,6 2,81937

103,7 1,65635

109,8 0,94419

115,9 0,52892

122,0 0,29339

128,1 0,16185

134,2 0,08901

140,3 0,04887

146,4 0,02681

152,5 0,01470

158,6 0,00806

164,7 0,00442

170,8 0,00242

176,9 0,00133

183,1 0,00073

189,2 0,00040

195,3 0,00022

201,4 0,00012

207,5 0,00007

213,6 0,00004

219,7 0,00002

225,8 0,00001

231,9 0,00001

238,0 0

244,1 0

250,2 0

256,3 0

262,4 0

268,5 0

274,6 0

280,7 0

286,8 0

292,9 0

299,0 0

305,1 0

311,2 0

317,3 0

323,4 0

329,5 0

335,6 0

341,7 0

347,8 0

353,9 0

360,0 0

Máxima velocidade de produção de hidrogênio

-50 0 50 100 150 200 250 300 350 400

mL H

/g massa seca/h

Tempo (h)

Ensaio 4 - Ácido acético (22 mmol/L) e biomassa inicial (0,04 g/L)

Tempo (h) mL H

/g massa seca

21,67

125,78

120

142,05

144

157,35

168

143,83

192

172,79

216

192,47

240

230,96

264

260,03

288

283,11

y = 1,0373x - 16,289

= 0,9424

100

200

300

400

500

0 50 100 150 200 250 300

Tempo (h)

mL H2/g massa seca

APÊNDICE 7 – Valores de massa seca e produção de hidrogênio do ensaio de

caracterização nutricional

Massa seca (g/L)

0 h 384 h

Substratos

orgânicos

(20 mmol/L)

reator

média reator

reator

média

acetato de

sódio

0,020 0,021 0,019 0,020 0,321 0,222 0,208 0,250

benzoato de

sódio

0,020 0,020 0,021 0,020 0,030 0,058 0,068 0,052

butirato de

sódio

0,020 0,020 0,018 0,020 0,121 0,090 0,129 0,114

citrato de

sódio

0,023 0,021 0,022 0,022 0,292 0,315 0,205 0,271

etanol

0,020 0,018 0,022 0,020 0,000 0,075 0,095 0,085

fenol

0,026 0,024 0,024 0,025 0,027 0,026 0,000 0,027

frutose

0,028 0,026 0,025 0,026 0,079 0,087 0,060 0,075

glicose

0,026 0,024 0,024 0,025 0,088 0,071 0,108 0,089

glutamato de

sódio

0,024 0,020 0,022 0,022 0,034 0,025 0,042 0,034

lactato de

sódio

0,018 0,020 0,020 0,020 0,026 0,015 0,012 0,017

metanol

0,023 0,021 0,016 0,020 0,079 0,076 0,090 0,082

piruvato de

sódio

0,022 0,021 0,024 0,022 0,184 0,149 0,106 0,146

propionato

de sódio

0,022 0,024 0,019 0,022 0,183 0,209 0,177 0,189

succinato de

sódio

0,027 0,024 0,023 0,025 0,112 0,176 0,195 0,161

Área cromatográfica do hidrogênio Substratos

orgânicos

(20 mmol/L) reator 1 reator 2 reator 3 média

Produção média de H

no headspace

(mL)

acetato de sódio

465514,3 433042,5 ─ 449278,4 3,40

benzoato de

sódio

1043,9 ─ 2485,9 1764,9 0,00

butirato de

sódio

57311,2 44629,6 60814,2 54251,7 0,00

citrato de sódio

554296,6 404632,0 ─ 479464,3 3,69

etanol

─ 1256,8 ─ 1256,8 0,00

fenol

─ 1734,3 ─ 1734,3 0,00

frutose

331096,5 224013,2 285084,1 280064,6 1,76

glicose

174453,1 325373,8 433815,6 311214,2 2,06

glutamato de

sódio

0,0 0,0 0,0 0,0 0,00

lactato de sódio

8390,2 ─ ─ 8390,2 0,00

metanol

0,0 0,0 0,0 0,0 0,00

piruvato de

sódio

534549,2 292578,3 210112,7 345746,7 2,40

propionato de

sódio

312665,6 483946,7 365208,2 387273,5 2,80

succinato de

sódio

─ 429339,1 105002,4 267170,8 1,64

ANEXO 1 – Curva de calibração do hidrogênio

y = 51824,29x + 97193,16

= 1,00

1000000

2000000

3000000

4000000

5000000

6000000

0 20 40 60 80 100 120

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