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Universidade de São Paulo
Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”
Caracterização morfométrica e molecular de Anastrepha bistrigata
Bezzi e Anastrepha striata Schiner (Diptera: Tephritidae)
Tibério Graco Araújo da Silva
Dissertação apresentada para obtenção do título de
Mestre em Ciências. Área de concentração:
Entomologia
Piracicaba
2008
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2
Tibério Graco Araújo da Silva
Biólogo
Caracterização morfométrica e molecular de Anastrepha bistrigata Bezzi e
Anastrepha striata Schiner (Diptera: Tephritidae)
Orientador:
Prof. Dr. FERNANDO LUIS CÔNSOLI
Dissertação apresentada para obtenção do título de
Mestre em Ciências. Área de concentração:
Entomologia
Piracicaba
2008
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Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)
DIVISÃO DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - ESALQ/USP
Silva, Tibério Graco Araújo da
Caracterização morfométrica e molecular de Anastrepha bistrigata Bezzi e Anastrepha
striata Schiner (Diptera: Tephritidae) / Tibério Graco Araújo da Silva. - - Piracicaba, 2008.
65 p. : il.
Dissertação (Mestrado) - - Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, 2008.
Bibliografia.
1. Genética molecular 2. Morfometria 3. Mosca-das-frutas 4. Zoologia (Classificação)
I. Título
CDD 632.774
S586c
“Permitida a cópia total ou parcial deste documento, desde que citada a fonte – O autor”
3
Dedico a meus pais, minha família e a
todos que, simplesmente por acreditarem,
me trouxeram até aqui
4
AGRADECIMENTOS
Ao Prof. Dr. Fernando Luis Cônsoli, por todos os incentivos e ensinamentos passados
como professor e orientador além do exemplo profissional que sempre me demonstrou.
Agradeço ainda pela confiança depositada em mim, sem a qual a realização desse
trabalho seria impossível;
Ao Prof. Dr. Roberto Antonio Zucchi, pelos diversos ensinamentos, pela sua
colaboração, e auxílio no desenvolvimento da pesquisa, desde sua idealização e
obtenção das amostras até as correções finais;
À Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”, da Universidade de São Paulo
(ESALQ/USP), por me dar a oportunidade de cursar a pós-graduação;
Ao conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), pela
concessão da bolsa de estudos;
Aos pesquisadores Elizabeth Quisbeth Ramos, Keiko Uramoto, Miguel Francisco de
Souza Filho, Marisol Giraldo Jaramillo e Valquiria da Rocha Campos Veloso, que
gentilmente cederam suas amostras, possibilitando a realização desse estudo;
A Dra. Marinéia de Lara Haddad, pelo auxílio e apoio na realização das análises
estatísticas;
Aos professores do Setor de Entomologia por todos os ensinamentos passados, seja
em disciplinas cursadas, seja na convivência diária, que muito contribuíram para minha
formação;
A todos os funcionários do Setor de Entomologia, por serem solícitos e prestativos
sempre que precisei;
5
À Doutoranda Cláudia Fidélis Marinho, pela ajuda e primeiros ensinamentos nos
procedimentos práticos dos estudos moleculares;
À aluna de iniciação científica Aline Sartori Guidolin, pelas inúmeras ocasiões de apoio
e auxilio inestimáveis nas práticas e análises moleculares, sem os quais a realização
das mesmas seria dificultada;
A todos os companheiros do Laboratório, pelo apoio incondicional e auxílio em geral no
andamento das pesquisas, que nunca deixaram de prestar. Agradeço ainda pela
amizade e convivência inigualáveis, que fazia o dia-a-dia no laboratório mais prazeroso;
Aos meus colegas das turmas da pós-graduação em Entomologia que fizeram a rotina
do curso mais agradável, além da ajuda e experiências trocadas nas disciplinas
cursadas.
6
SUMÁRIO
RESUMO……………………….…………………………………………………………..…...…8
ABSTRACT………………………………………………………………………………...……...9
1 INTRODUÇÃO ..............................................................................................................10
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA..........................................................................................12
2.1 Morfometria ................................................................................................................12
2.2 Taxonomia molecular .................................................................................................15
2.3 Espécies estudadas ...................................................................................................20
2.3.1 Anastrepha striata Schiner ......................................................................................20
2.3.2 Anastrepha bistrigata Bezzi.....................................................................................21
3 MATERIAL E MÉTODOS..............................................................................................23
3.1Obtenção dos exemplares...........................................................................................23
3.2 Análise morfométrica................……………………………………………………………23
3.3 Análise molecular .......................................................................................................26
3.3.1 Extração do DNA genômico ....................................................................................26
3.3.2 Amplificação da região da Citocromo Oxidase I......................................................27
3.3.3 Clonagem e Sequenciamento .................................................................................28
3.3.4 Alinhamento e análise das sequências ...................................................................29
3.3.5 Códigos adotados ...................................................................................................31
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO.....................................................................................32
4.1 Análise morfométrica em Anastrepha striata Schiner.................................................32
4.1.1 Morfometria do acúleo.............................................................................................32
4.1.2 Morfometria da asa .................................................................................................35
4.2 Análise morfométrica em Anastrepha bistrigata Schiner............................................41
4.2.1 Morfometria do acúleo.............................................................................................41
4.2.2 Morfometria da asa .................................................................................................41
4.3 Simpatria em Goiás....................................................................................................45
4.4 Análises moleculares .................................................................................................49
4.4.1 Diversidade genética em Anastrepha striata Schiner..............................................49
4.5 Desenvolvimento de iniciadores espécie-especificos.................................................55
7
5 CONCLUSÕES .............................................................................................................58
REFERÊNCIAS....................…………………………………………………………………...59
8
RESUMO
Caracterização morfométrica e molecular de Anastrepha bistrigata Bezzi e
Anastrepha striata Schiner (Diptera: Tephritidae)
Considerando-se a semelhança morfológica e ocorrência simpátrica de
Anastrepha striata Schiner e Anastrepha bistrigata Bezzi, este trabalho propôs
identificar formas para melhor caracterizá-las através de análises morfométricas do
acúleo e asas de populações simpátricas e alopátricas dessas espécies, e molecular,
por meio da análise de seqüências parciais do gene da citocromo oxidase I (COI). O
trabalho também teve por objetivo desenvolver iniciadores espécie-específicos que
possam vir a ser utilizados em estudos ecológicos em regiões em que ambas as
espécies ocorram simpatricamente. As populações analisadas – A. striata (seis
populações) e A. bistrigata (duas populações) foram provenientes de diferentes regiões
do Brasil, Colômbia e Bolívia. Para os estudos morfométricos, os acúleos e asas foram
montados em lâminas para captura e análise de imagens com auxílio de câmera
fotográfica acoplada ao microscópio estereoscópico, utilizando-se de software
apropriado. Foram traçados e mensurados oito segmentos no acúleo e 16 na asa direita
de cada indivíduo, obtendo-se assim as medidas nas quais se basearam as análises.
Nos estudos moleculares, os produtos de amplificação obtidos para a COI foram
seqüenciados e analisados para o estudo da caracterização molecular das diferentes
populações desses insetos e desenvolvimento de iniciadores espécie-específicos. Os
resultados indicam a existência clara de distinção morfométrica entre as duas espécies
e confirmaram as identificações baseadas na largura e comprimento do acúleo. Os
dados morfométricos mostraram também a ausência de padrões geográficos distintos
entre as populações de A. striata e A. bistrigata. A. striata apresentou maior variação
morfométrica entre suas populações quando comparada à diferenciação encontrada
para A.bistrigata. Nas duas espécies, populações encontradas em maiores altitudes
apresentaram maiores dimensões. A análise de nucleotídeos da seqüência da COI
obtida para as populações de A. striata em questão indicou a ocorrência de alta
similaridade entre as mesmas. As análises realizadas também indicaram que a
divergência genética encontrada no fragmento da COI analisado para as diferentes
populações de A. striata não permitiu o agrupamento de acordo com a distribuição
geográfica dessas populações. A análise do fragmento do gene da COI permitiu o
desenvolvimento de iniciadores com divergência suficiente entre as espécies em
questão para permitir a amplificação de porção específica do gene da COI, que
possibilita a diferenciação entre as mesmas. Os iniciadores propostos reúnem
características que permitem a sua utilização em reações de PCR multiplex para a
diferenciação entre espécimes de ambas as espécies.
Palavras-chave: Moscas-das-frutas; Morfometria; Citocromo oxidase; Caracterização
molecular
9
ABSTRACT
Morphometric and molecular characterization of Anastrepha bistrigata Bezzi and
Anastrepha striata Schiner (Diptera: Tephritidae)
Because of the fact that Anastrepha striata Schiner and Anastrepha bistrigata
Bezzi are very similar morphologically and may also occur sympatrically, this study
aimed to propose different ways to characterize them by using wing and aculeus
morphometry, and mitochondrial DNA sequencing. This work also aimed to develop
species-specific primers to allow for the differentiation between both species in
sympatric areas. Six A. striata and two A. bistrigata populations were obtained from
different regions from Brazil, Colombia and Bolivia. Specimens from different
populations had their aculeus and wings removed and slide mounted for image
acquisition under a stereomicroscope and morphometric analysis. Data collection for
morphometry were taken for each specimen on eight segments of the aculeus and on
16 of the right wing. The molecular characterization consisted of the sequencing and
analysis of a fragment of the cytochrome oxidase I (COI) gene, and the development of
species-specific primers. Morphometry did not indicate any consistent variation to allow
for geographical characterization of different populations, but indicated A. striata and A.
bistrigata are consistently different morphologically. Populations of either species from
higher altitudes were larger than the ones at lower altitudes, and A. striata displayed a
much higher intraespecific variation in morphology than A.bistrigata. COI nucleotide
sequences for A. striata were very similar among the populations studied, and the
molecular analysis did not yield groups that were related geographically. The COI
analysis allowed the development of a set of species-specific primers that were
divergent enough to allow for the discrimination of A. striata and A. bistrigata in multiplex
PCR reactions.
Keywords: Fruit flies; Morphometry; Cytochrome oxidase; Molecular taxonomy
10
1 INTRODUÇÃO
Anastrepha striata Schiner e Anastrepha bistrigata Bezzi pertencem ao grupo
serpentina, que foi caracterizado para incluir 11 espécies, três das quais pertenciam ao
grupo striata anteriormente (NORRBOM, 2002). As larvas de ambas as espécies
desenvolvem-se em goiaba, todavia A. striata é mais importante economicamente em
vários países da América Latina.
O grupo serpentina é mais diversificado no sul da América Central e norte da
América do Sul, entretanto, A. striata está mais amplamente distribuída no continente
americano enquanto A. bistrigata ocorre exclusivamente nas regiões Centro-Oeste,
Sudeste e Sul do Brasil (NORRBOM, 2002; NORRBOM et al., 1999).
A identificação das espécies de Anastrepha é baseada nas características do
acúleo e no padrão alar. Muitas vezes, dentro de populações ou até mesmo entre
espécies muito próximas morfologicamente, os limites específicos são difíceis de serem
delimitados, devido principalmente às variações na forma do acúleo, ocasionadas por
fatores genéticos e ambientais, o que pode induzir a identificações incorretas. As
populações de insetos, inclusive dípteros, freqüentemente apresentam variações
genotípicas e fenotípicas correlacionadas às regiões geográficas nas quais ocorrem. A
seleção natural e a deriva genética são as principais causas dessas variações e ambas
são fortemente influenciadas por características ambientais (MAYR, 1942).
Caracteres morfológicos e moleculares adicionais precisam ser explorados para
o melhor conhecimento das relações entre espécies pertencentes aos vários grupos de
espécies no gênero Anastrepha (MacPHERON et al., 1999; NORRBOM et al., 1999). A
tendência atual é aliar diversos métodos de identificação para que se tenham
identificações acuradas das espécies de Anastrepha taxonomicamente semelhantes
(ARAÚJO et al., 1998). É importante estudar o grau de diferenciação populacional das
espécies, pois isso amplia os conhecimentos sobre as variações geográficas e o status
taxonômico do grupo em estudo
Considerando-se a semelhança morfológica entre A. striata e A. bistrigata e a
ocorrência simpátrica delas no Brasil, este estudo tem por objetivo (1) analisar a
variação morfométrica, intra e interespecífica, no acúleo e nas asas de populações
11
simpátricas e alopátricas dessas espécies (2) caracterizá-las molecularmente por meio
da análise de seqüências parcial do gene da citocromo oxidase I (COI) e (3)
desenvolver iniciadores espécie-específicos que possam vir a ser utilizados em estudos
ecológicos em regiões em que ambas as espécies ocorram simpatricamente.
12
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 Morfometria
A morfometria é a formalização matemática das diferenças entre formas
geométricas de objetos. A morfometria geométrica, um dos ramos da morfometria,
permite que se comparem os padrões morfológicos a partir de caracteres multivariados,
levando-se em consideração simultaneamente várias características em uma estrutura
corporal complexa (MONTEIRO; REIS, 1999).
Para se obter dados em morfometria geométrica, são usados marcos anatômicos
(landmarks), os quais consistem em pontos de referência na estrutura corporal
analisada. É fundamental que esses marcos sejam precisamente definidos,
distinguíveis e padronizados, consistindo preferencialmente em pontos extremos ou de
justaposição de tecidos ou estruturas. As medidas são ordenadas em planilhas de
dados. A partir desses dados podem ser feitas diversas abordagens, como a
comparação da magnitude das variações, análise estatística das mesmas, entre outras
(MONTEIRO; REIS, 1999).
Um dos testes estatísticos utilizados é a análise de variáveis canônicas, a qual
fornece uma descrição das diferenças entre os grupos especificados utilizando um
conjunto de dados multivariados.
De forma geral, a maioria dos trabalhos sobre variação morfológica em Diptera
foi realizada com espécies da família Drosophilidae, principalmente com espécies de
Drosophila.
Um dos trabalhos iniciais nesse sentido foi realizado por Stalker e Carson (1947),
que estudaram a variação morfológica de 45 populações naturais de D. robusta
Sturtevant, oriundas de 22 localidades dos EUA. Aqueles autores observaram que
houve sobreposição das medidas, não só entre as localidades, como também dentro de
algumas delas. Os indivíduos de clima frio apresentaram asa longa, cabeça estreita,
fêmur longo e tórax pequeno, quando comparados aos indivíduos de clima quente.
Stalker e Carson (1949) estudaram também o efeito da variação sazonal na morfologia
13
de D. robusta e observaram marcante relação entre a época de coleta dos espécimens
e as medidas obtidas.
Foram verificadas diferenças significativas no comprimento da asa, largura da
cabeça e comprimento da tíbia entre as populações de D. pseudoobscura Frolova,
inclusive entre duas populações coletadas a 10 km de distância uma da outra.
Entretanto, nas populações coletadas em diferentes localidades e mantidas em
condições uniformes de laboratório a 25°C, não houve correlação estatisticamente
significativa entre os parâmetros geoclimáticos avaliados e as medidas obtidas
(SOKOLOFF, 1965).
Os trabalhos sobre variação morfológica relacionada com a distribuição
geográfica em Tephritidae ainda são relativamente escassos. Para espécies de
Rhagoletis nos EUA, foram constatadas correlação entre a localização geográfica e o
comprimento do acúleo de algumas espécies, mais evidente em R. pomonella Walsh.
Esse fato foi relacionado ao hospedeiro, uma vez que espécimes coletados em Pyrus
(Rosaceae) apresentaram variação insignificante, enquanto espécimes obtidos em
Crataegus (Rosaceae) apresentaram acentuada variação geográfica (BUSH, 1966).
Em estudos de biometria de diversas populações de D. paulistorum Dobzhansky
& Pavan, coletadas na América Central e do Sul, foram observadas variações
morfológicas significativas entre as populações, principalmente entre as originárias de
algumas regiões do Brasil e da América Central, indicando que D. paulistorum é
composta por duas subespécies (PASTEUR, 1970).
Em todas as medidas tomadas de populações de D. melanogaster da África e
Europa (França), foram obtidas diferenças significativas entre os dois grupos
geográficos (DAVID et al., 1977).
Foi observada variação morfológica expressiva no edeago de D. serido Vilela &
Sene, do Brasil, Argentina e Paraguai, que possibilitou dividir as populações em cinco
morfotipos, tendo sido observada correlação entre a morfologia dessa estrutura e o tipo
de vegetação existente no local de coleta das populações (SILVA; SENE, 1991).
Em oito populações selvagens de D. melanogaster coletadas na Flórida (EUA) e
em Manitoba (Canadá), as maiores dimensões médias foram observadas nas
populações de locais com latitudes intermediárias, enquanto as de dimensões menores
14
eram de pontos de coleta nos extremos norte e sul. Portanto, o aumento do tamanho
não acompanhou o gradiente de latitude (LONG; SINGH, 1995).
As populações naturais de D. mediopunctata Dobzhansky & Pavan, coletadas
em diversas altitudes, apresentaram variações morfológicas na forma e na medida da
asa, que foram correlacionadas significativamente com a altitude, mas esse fator só
explicou pequena parte dessa variação (BITNER-MATHÉ et al., 1995).
Alencar-Sousa (1998) caracterizou populações de A. fraterculus, A. pickeli e A.
zenildae através de morfometria multivariada. As espécies generalistas (A. fraterculus e
A. zenildae) apresentam populações morfometricamente semelhantes e a espécie
especialista (A. pickeli) apresenta diferenciação bastante acentuada no tamanho das
estruturas analisadas. Entretanto, o autor comentou que as acentuadas diferenças em
A. pickeli fossem devidas a duas supostas espécies.
As populações de A. fraterculus do México, Brasil, Colômbia e Argentina diferem
estatisticamente tomando-se por base parâmetros do acúleo (comprimento do ápice,
comprimento da serra e número de dentes da serra) e das asas (HERNÁNDEZ-ORTIZ
et al., 2004). Segundo esses autores, existem diferenças estatisticamente significantes
entre populações mexicanas e sul-americanas do complexo A. fraterculus, em relação à
forma do ápice do acúleo e morfologia da asa. O grau de variação morfológica entre
populações analisadas do México foi extremamente baixo, o que permite que sejam
consideradas, através de análise discriminante, como um morfotipo distinto. Aqueles
autores concluíram também que as populações do México e América Central são
idênticas e sugeriram que ambas representam uma mesma espécie. Foi também
claramente distinguível um segundo grupo (população da Colômbia) e um terceiro
(populações do Brasil e uma da Argentina). Esses resultados levaram à conclusão de
que os morfotipos mexicano, andino e brasileiro, caracterizados naquele trabalho,
podem ser reconhecidos eventualmente como três entidades taxonômicas distintas.
Aqueles autores sugeriram também que as amostras de A. fraterculus mostraram não
só uma grande diferenciação morfológica entre populações, como também representam
um complexo, o qual inclui diversos morfotipos.
Araújo e Zucchi (2006) caracterizaram cinco espécies de Anastrepha do grupo
fraterculus através de medidas do acúleo. Concluíram que os tamanhos do acúleo e do
15
ápice de A. fraterculus Wiedemann, A. obliqua Macquart, A. sororcula Zucchi, A.
zenildae Zucchi e A. turpiniae Stone variam ao longo da distribuição da espécie e
também entre os exemplares obtidos de uma mesma espécie de hospedeiro. Segundo
aqueles autores, o formato do ápice do acúleo de A. sororcula e de A. obliqua são os
mais distintos entre as cinco espécies estudadas. A. fraterculus, A. zenildae e A.
turpiniae possuem os formatos do ápice do acúleo muito semelhantes, entretanto,
essas espécies podem ser separadas por análise discriminante baseada em oito
medidas do acúleo (ARAUJO et al., 1998).
2.2 Taxonomia molecular
O avanço das técnicas moleculares nas últimas décadas ofereceram quantidade
quase ilimitada de caracteres taxonômicos, o que pode ser de grande ajuda, não só no
esclarecimento de questões taxonômicas e evolutivas, como também na revisão de
classificações já existentes, sendo que, no caso de Anastrepha, análises moleculares
baseadas em seqüências do DNA mitocondrial reforçaram a origem monofilética desse
grupo de moscas, originalmente proposta após análises morfológicas (NORRBOM et
al., 1999; MAcPHERON et al., 1999).
A possibilidade da utilização de técnicas moleculares aplicadas à taxonomia e
sistemática de insetos foi mais um grande avanço para estudos de genética evolutiva e
populacional iniciados na década de 60 com o desenvolvimento de técnicas de
eletroforese de proteínas, inicialmente utilizada em estudos de variabilidade genética
(HUNTER; MARKET, 1957; LEWONTIN; HUBBY; HARRIS, 1966). No final dos anos 70
e início dos anos 80 foram criadas novas técnicas que permitiram o estudo direto do
DNA. Em 1979, estava claro que o DNA mitocondrial (mtDNA) dos animais era a
molécula melhor conhecida do genoma de eucariotos (WILSON et al., 1985). Os
primeiros trabalhos a estudarem o mtDNA foram conduzidos em 1979 e empregavam a
técnica de restrição por polimorfismo de comprimento de fragmentos (RFLP) (AVISE et
al.,1979; BROWN; WRIGHT, 1979; BROWN et al., 1979).
Em relação aos tefritídeos, Shigehito et al. (2000) aplicaram essa técnica no
estudo do complexo Bactrocera dorsalis. Posteriormente ao advento da técnica do
16
PCR, Han e McPheron (1994), os quais já haviam feito estudos filogenéticos da família
Tephritidae utilizando seqüências de DNA nuclear, estudaram as relações entre os taxa
dessa família a partir de seqüências do DNA mitocondrial (mtDNA) (HAN; MCPHERON,
1997). Han (2000) utilizou essa mesma seqüência de mtDNA para estudar com mais
detalhes a tribo Trypetini, pertencente a essa família. Esses trabalhos elucidaram
aspectos da filogenia de tefritídeos que não eram resolvidos apenas por meio de
estudos morfológicos e ecológicos, demonstrando claramente a validade dos dados
moleculares para aperfeiçoar a classificação dos tefritídeos. As relações evolutivas
inferidas nesses estudos, não só são congruentes em grande medida com grupos bem
estabelecidos pelas classificações morfológicas, como também sugerem relações que
não se conheciam até então. Apesar de tudo, muitos aspectos da história filogenética
da família Tephritidae permanecem desconhecidos.
O primeiro estudo a usar seqüências de DNA para analisar as relações entre
diferentes grupos de espécies dentro do gênero Anastrepha foi o realizado por
McPheron et al. (1999), no qual foram analisadas 40 espécies de Anastrepha
pertencentes a 14 grupos específicos, incluindo 10 espécies do grupo fraterculus,
usando seqüências de DNA da subunidade maior do ribossomo (16S rDNA). Esse
estudo não elucidou satisfatoriamente as relações dentro do grupo fraterculus devido à
reduzida variação das seqüências do 16S rDNA.
Smith-Caldas et al. (2001) investigaram a relação filogenética e os limites
específicos entre espécies de Anastrepha pertencentes ao grupo fraterculus usando
seqüências de DNA da subunidade I do gene mitocondrial da citocromo oxidase (COI),
devido ao fato desse gene apresentar regiões variáveis, tornando-o adequado para a
análise de grupos taxonômicos mais proximamente relacionados (LUNT et al., 1996;
STÅHLS; NYBLOM, 2000), sem contar na disponibilidade de iniciadores universais para
a amplificação do gene completo para diversos grupos de insetos (SIMON et al., 1994)
e no fato de que esse marcador têm sido útil no estudo da variabilidade genética entre
populações e das relações filogenéticas em insetos. A importância e aplicação desse
marcador em estudos de taxonomia molecular podem ser verificadas pela sua utilização
no código molecular de identificação de espécies (Barcode) (BROWN et al., 1994;
17
BROWER, 1994; BERNASCONI et al., 2000; MARDULYN; WHITFIELD, 1999;
STÅHLS; NYBLOM, 2000; SCARPASSA et al., 2000).
O posicionamento filogenético e as relações sistemáticas das espécies de
Anastrepha têm sido foco de pesquisas de biólogos evolucionistas há décadas.
Diversas espécies aparentemente são parafiléticas, como A. fraterculus e A. obliqua
(SMITH-CALDAS et al., 2001), enquanto a relação com A. suspensa (Loew) não tem
sido muito investigada e seu atual posicionamento dentro do gênero é baseado numa
pequena quantidade de indivíduos (NORRBOM, 2001). Análises do DNA mitocondrial
de A. fraterculus por PCR-RFLP (STECK; SHEPPARD, 1993) e de proteínas por
eletroforese (MORGANTE et al., 1980; STECK, 1991) indicaram alta diversidade
intraespecífica, sendo que análises filogonéticas mais recentes de A. fraterculus
baseadas em seqüências da COI, revelaram ser essa espécie monofilética e, portanto,
considerada como um complexo de espécies (SMITH-CALDAS et al., 2001).
Consistente para todos os estudos de filogenia de Anastrepha é o fato de que o
complexo de espécies A. fraterculus é mais proximamente relacionado a A. suspensa
(BARR et al., 2005; McPHERON et al., 1999; SMITH-CALDAS et al., 2001) e não a A.
ludens, como previamente relatado (WEEMS, 1965; WEEMS et al., 2001).
No entanto, Morgante et al. (1980) observaram discrepâncias entre os dados
moleculares obtidos por eletroforese de proteínas e os dados morfológicos usados para
inferir relações evolutivas entre Anastrepha. Recentemente, a filogenia molecular,
usando o gene nuclear period sugere que Anastrepha é parafilético em relação a
Toxotrypana (um gênero próximo) (BARR et al., 2005).
Além dos dados de DNA mitocondrial, estudos citológicos indicam que a
morfologia cromossômica pode ser útil para propósitos taxonômicos. No entanto,
somente o cariótipo de 10% das espécies de Anastrepha foi descrito. Selivon et al.
(2005) descreveram os cromossomos mitóticos através do bandeamento-C de cinco
espécies de Anastrepha: A. amita Zucchi, A. turpiniae Stone, A. zenildae Zucchi, A.
grandis (Macquart) e A. leptozona Hendel, e reanalisaram o cariótipo de três outras
espécies, A. distincta Greene, A. obliqua (Macquart) e A. sororcula Zucchi. Foi
observado, nesse estudo, que as espécies do grupo fraterculus apresentam cariótipo
similar. Por outro lado, os cromossomos sexuais acrocêntricos nesse grupo exibem
18
grande variação no comprimento e tamanho e na localização dos blocos de
heterocromatina.
Selivon et al. (2007) analisaram a relação entre os cariótipos de A. striata, A.
bistrigata e A. serpentina. Os cromossomos mitóticos dessas três espécies foram
comparados após coloração seqüencial através de fluorocromos DAPI e cromomicina
A3 (CMA), seguidas de bandeamento-C. Os autores propuseram que o cariótipo de A.
bistrigata pode ter derivado do de A. striata, devido à fusão do autossomo III com o
cromossomo Y, originando o cromossomo neo-Y. Diferenças maiores podem ser
observadas entre os autossomos das outras duas espécies, o que os levou a concluir
que A. striata e A. bistrigata são mais fortemente relacionadas entre si do que com A.
serpentina.
As diferenciações genéticas e fenotípicas a nível populacional podem ser
detectadas através da análise de marcadores morfológicos como forma, coloração,
caracteres cariotípicos e morfométricos. Atualmente, marcadores moleculares são muito
empregados, como, por exemplo, isozimas, microssatélites de DNA, DNA mitocondrial,
espaçadores de DNA ribossômico ITS e NTS (HILLIS; DIXON, 1991; RODERICK,
1996). Marcadores apresentam diversos níveis de resolução, variando conforme o
grupo taxonômico. De uma forma geral, a tendência tem sido buscar análises
combinadas de marcadores que possuam amplo poder de discriminação e atinjam
desde populações em estágios iniciais de divergência até populações onde não há mais
fluxo gênico. Entre as ferramentas mais úteis para o estudo de limite entre populações
e espécies estão as análises cariotípicas (BONNACORSI et al., 1980), os estudos da
variabilidade do DNA mitocondrial e ribossômico (HILLIS; DIXON, 1991) e as análises
morfométricas (ADAMS et al., 2004).
Genes e regiões genéticas que têm sido seqüenciados diferem substancialmente
entre as atuais pesquisas. Genes como os da COI, 16S, 18S e do fator de
alongamento-1a têm sido amplamente utilizados e fornecem informações sobre o grau
de divergência de grupos de insetos. A sistemática molecular de insetos complementa e
amplia o valor de dados morfológicos e ecológicos, contribuindo com informações
fundamentais em relação à biologia evolutiva dos grupos estudados (CATERINO et al.,
2000).
19
As tendências atuais na aplicação da técnica de marcadores de DNA em estudos
da ecologia de insetos mostra que o uso de marcadores do DNA mitocondrial (mtDNA),
microssatélites, RAPD, EST e AFLP tem contribuído significativamente para o melhor
entendimento das bases genéticas da diversidade de insetos e no mapeamento de
genes de importância médica e agrária. Os avanços na tecnologia de ferramentas de
marcadores moleculares podem ser aplicados em pesquisas entomológicas para uma
melhor compreensão da ecologia de insetos ao nível molecular (BEHURA, 2006).
Uma abordagem recente em taxonomia molecular é a adoção do código de
barras do DNA (“DNA barcode”). Parte-se da premissa de que uma seqüência de DNA
curta e padronizada pode ser utilizada na distinção de indivíduos de uma espécie
devido à variação genética interespecífica exceder a variação intraespecífica. Várias
regiões genéticas têm sido empregadas na sistemática ao nível de espécie. No entanto,
defende-se a adoção de um “padrão global” no qual um fragmento de 650 pares de
bases na extremidade 5’ do gene mitocondrial da COI seja designado como a região
barcode para animais (HAJIBABAEI et al., 2007).
O código de barras do DNA pode ser utilizado para a identificação rotineira de
espécies, podendo também evidenciar indivíduos atípicos para a compreensão de
estudos taxonômicos. Em estudos filogenéticos as seqüências do barcode podem ser
adicionadas a um banco de dados de seqüências para análises filogenéticas. Em
estudos de genética populacional essa ferramenta pode fornecer um primeiro sinal de
aumento de divergência natural em populações e facilitar estudos comparativos de
diversidade populacional em várias espécies. Em grupos pouco estudados
taxonomicamente, o código de barras do DNA pode ser levado em consideração antes
da taxonomia tradicional, classificando rapidamente espécimes dentro de grupos
geneticamente divergentes. Fragmentos mais curtos do gene da COI podem também
ser úteis na identificação de espécies com DNA degradado, nas quais a seqüência
padrão de 650 pb não pode ser obtida (HAJIBABAEI et al., 2007).
A região genética da COI tem se mostrado eficiente em estudos de filogenia de
Tephritidae (HAN; McPHERON, 1997). Portanto, essa região foi escolhida nesse estudo
pelo fato de conter em sua seqüência de bases, regiões variáveis, o que possibilita sua
utilização na análise de grupos taxonômicos mais proximamente relacionados (LUNT et
20
al., 1996; STÅHLS; NYBLOM, 2000). Outros motivos que favoreceram sua escolha
foram a disponibilidade de iniciadores (primers) conservados para esse gene em
diversos grupos de insetos (SIMON et al., 1994) e o fato de que seqüências do gene da
COI têm sido empregadas numa série de estudos de relações filogenéticas em insetos
(BROWN et al., 1994; BROWER, 1994; BERNASCONI et al., 1999; MARDULYN;
WHITFIELD, 1999; STÅHLS; NYBLOM, 2000; SCARPASSA et al., 2000).
2.3 Espécies estudadas
2.3.1 Anastrepha striata Schiner
É uma das espécies mais comuns de moscas-das-frutas em toda sua área de
distribuição, atacando principalmente Myrtaceae, principalmente goiabas. É praga de
importância quarentenária pelo USDA e por outras agências regulatórias (NORRBOM,
2001).
Distribuição geográfica. Ocorre desde o México (Sinaloa, Aguascalientes e
Veracruz) América Central, sul do Peru, sul da Bolívia, Brasil e Trinidad (WHITE;
ELSON-HARRIS, 1992). Alguns indivíduos foram coletados nos EUA (sul do Texas e
Califórnia), mas não é considerada estabelecida nesse país (NORRBOM, 2001). No
Brasil, ocorre principalmente nas regiões Norte e Nordeste, havendo também registros
no Centro-Oeste e no estado de São Paulo (MALAVASI et al., 2000).
Identificação. Difere facilmente das demais espécies do gênero, exceto de A.
bistrigata, pelo mesonoto com grande área marrom em forma de “U” freqüentemente
interrompida por uma sutura transversa, porém sem outras marcas marrons;
mediotergito e subescutelo completamente marrons ou pelo menos lateralmente
marrons; pleuritos torácicos e abdome sem áreas marrons; microtríquias do escuto
ausentes em uma larga faixa, às vezes interrompida pela sutura transversa na linha
dorso-central. A. striata também compartilha com A. bistrigata os seguintes caracteres:
bandas alares marrom-alaranjadas, principalmente a seção central da banda S; célula
br com um a área hialina posterior ao pterostigma estendendo-se à largura da célula,
21
alcançando a nervura R
4+5
; extremidade do acúleo larga com pelo menos 0,17 mm e
abruptamente triangular; surstilos laterais com um lobo lateral subapical arredondado
(NORRBOM, 2001).
A. striata pode ser diferenciada de A. bistrigata pelos seguintes caracteres:
oviscapo com menos de 2,8 mm de comprimento; acúleo com menos de 2,5 mm de
comprimento; escuto com áreas marrons normalmente interrompidas na sutura
transversal; sétulas normalmente contrastantes (brancas e marrom escuras), ausentes
numa estreita região lateral à área sem microtríquias pós-suturais; seção distal da
banda S suavemente estreitada a moderadamente larga no ápice da nervura R
2+3
,
sendo 0,44 a 0,63 vez mais larga na célula r
2+3
; ápice do acúleo com 0,24 a 0,31 mm de
comprimento; surstilos laterais ligeiramente mais longos e estreitos e aproximadamente
paralelos. As microtríquias são normalmente mais densas e com aspecto
esbranquiçado (visão anterior oblíqua) quando comparados a A. bistrigata além das
bandas das asas serem ligeiramente mais claras (NORRBOM, 2001).
Hospedeiros. É uma praga importante na região tropical e subtropical do
continente americano, infestando principalmente goiaba e outros frutos de mirtáceas,
embora existam registros de ataques em manga, laranja e pêssego (NORRBOM, 2001).
Outros hospedeiros registrados são Psidium sartorarium, Spondias sp, Persea
americana, Citrus sinensis, Eugena uniflora, Manihot escullenta, Syzgium jambos,
Terminalia catappa e Spondias mombin. (WHITE; ELSON-HARRIS, 1992).
Anastrepha striata tem sido reportada atacando frutos de diversas espécies
vegetais nativas e exóticas. Os hospedeiros incluem 42 espécies pertencentes a 24
gêneros e 18 famílias. Desses, 16 gêneros e 26 espécies são hospedeiros nativos,
quatro gêneros e 12 espécies pertencem á família Myrtaceae (NORRBOM, 2004). No
Brasil estão registrados cinco hospedeiros da família Myrtaceae, um de Anacardiaceae
e um de Passifloraceae (ZUCCHI, 2007).
2.3.2 Anastrepha bistrigata Bezzi
Distribuição. Ocorre nas regiões Centro-Oeste, Sul e Sudeste do Brasil (Goiás,
Rio de Janeiro, Minas Gerais, São Paulo e Santa Catarina) (LIMA, 1934; ZUCCHI,
22
1978; MALAVASI et al., 2000) O registro de A. bistrigata no Peru (KORYTKOWSKI;
OJEDA, 1968), baseado em um único macho, sugere que a espécie foi erroneamente
identificada (NORRBOM, 2001).
Identificação. A morfologia externa é semelhante à de A. striata, mas difere pelas
seguintes características: oviscapo com menos de 3,0 mm de comprimento (2,8mm em
A. striata); acúleo com mais de 3,0 mm de comprimento (2,5 mm em A. striata); sétulas
amarelas e marrons, menos densas, porém mais ou menos contínuas lateralmente à
área pós-sutural sem microtríquias; seção distal da banda S mais delgada no ápice da
R
2+3
; ápice do acúleo com 0,35 a 0,40 mm de comprimento 0,24 a 0,31 mm em A.
striata; surstilos laterais um pouco mais curtos e robustos e ligeiramente divergentes
distalmente. As microtríquias do escuto são menos densas e de aparência não tão
esbranquiçadas em uma visão oblíqua anterior, quando comparadas às de A. striata. As
bandas alares normalmente apresentam coloração marrom-claras.
Hospedeiros. Também está fortemente associada às espécies de Myrtaceae
(principalmente frutos das espécies de Psidium), além de Sapotaceae (espécies de
Pouteria). Há também registros em manga (Anacardiaceae, Mangifera indica)
(NORRBOM, 2004). No Brasil, existem registros de infestação em três espécies de
Myrtaceae e uma de Sapotaceae (ZUCCHI, 2007).
23
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Obtenção dos exemplares
As amostras de Anastrepha striata Schiner foram oriundas de três localidades do
Brasil – Orizona (Goiás), Caxias (Maranhão) e Oiapoque (Amapá) – uma da Bolívia
(Chimoré, Cochabamba) e duas da Colômbia (Toro, Departamento de Valle Del Cauca
e Letícia, Departamento do Amazonas). As amostras de Anastrepha bistrigata Bezzi
foram coletadas em Campinas (São Paulo) e em Orizona (Goiás). Os espécimes foram
obtidos de vários coletores e constituem, portanto, amostras ocasionais em armadilhas
ou diretamente dos frutos. As amostras estavam devidamente rotuladas e os
exemplares fixados em etanol 70%. Os exemplares utilizados para o estudo molecular
foram transferidos para etanol absoluto após o recebimento das mesmas, as quais
foram então armazenadas a -20
o
C. Cada exemplar recebeu um código de identificação
que distingue a espécie e o local de coleta. A confirmação da identificação das espécies
foi baseada no exame ventral do ápice do acúleo. Os voucher-specimens estão
depositados no Museu de Entomologia Agrícola do Departamento de Entomologia,
Fitopatologia e Zoologia Agrícola, ESALQ/USP.
3.2 Análise morfométrica
O acúleo foi extrovertido com auxílio de pinça e estilete, destacado da membrana
eversível e colocado em lâmina microscópica. Para limpeza e clarificação, foi colocada
uma gota de fenol sobre o acúleo por cerca de 48 horas. Posteriormente o acúleo foi
seco em papel filtro e montado em posição ventral entre lâmina e lamínula, contendo
meio de Hoyer. Foram examinados acúleos de 10 fêmeas por localidade.
Foram marcados pontos (landmarks) na imagem do acúleo (Figura 1) e
realizadas as medições dos segmentos entre eles. Cada segmento foi então designado
por um código, como se segue:
L1= Largura do acúleo na base do ápice;
L2 = Largura do acúleo no ponto mais estreito da reentrância do ápice;
24
L3 = Comprimento do ápice do acúleo a partir da reentrância do ápice;
L4 = Comprimento do ápice do acúleo;
L5 = Comprimento da margem do ápice do acúleo;
L6 = Comprimento da margem do ápice do acúleo, de sua base até a
reentrância;
L7 = Comprimento da margem do ápice do acúleo, da reentrância até o ápice;
L8 = Comprimento total do acúleo.
Figura 1 - Ápice do acúleo de Anastrepha striata ilustrando os segmentos adotados para as medições no
mesmo (L1 a L7)
A asa direita foi removida com auxílio de pinça e estilete e montada entre lâmina
e lamínula, utilizando-se álcool 70%. Foram medidas as asas de 10 fêmeas de cada
localidade.
Foram determinados os pontos (landmarks) nas nervuras e foram traçados 16
segmentos, consistindo no perímetro da asa e em transectos perpendiculares e
diagonais (Figura 2). Cada segmento foi então designado por um código:
L1= Distância entre as extremidades distais das nervuras h e R
1
L2 = Distância entre as extremidades distais das nervuras R
1
e R
2+3
25
L3 = Distância entre as extremidades distais das nervuras R
2+3
e R
4+5
L4 = Distância entre as extremidades distais das nervuras R
4+5
e M
L5 = Distância entre as extremidades distais das nervuras M e CuA
1
L6 = Distância entre as extremidades distais das nervuras CuA
1
e A
L7 = Distância entre a extremidade distal da nervura A e o ponto de bifurcação
das nervuras M e CuA
1
L8 = Distância entre o ponto de bifurcação das nervuras M e CuA
1
e a
extremidade distal da nervura h
L9 = Distância entre as extremidades distais das nervuras R
1
e A
L10 = Distância entre a extremidade distal da nervura h e a extremidade distal da
nervura A
L11 = Distância entre as extremidades distais das nervuras R
2+3
e CuA
1
L12 = Distância entre a extremidade distal da nervura R1 e o ponto de bifurcação
das nervuras M e CuA
1
L13 = Distância entre as extremidades distais das nervuras R
1
e CuA
1
L14 = Distância entre as extremidades distais das nervuras R
2+3
e A
L15 = Distância entre as extremidades distais das nervuras R
2+3
e M
L16 = Distância entre as extremidades distais das nervuras R
4+5
e CuA
1
Figura 2 - Asa direita de Anastrepha striata ilustrando os segmentos adotados para as medições (L1 a
L16)
26
As análises morfométricas do acúleo e da asa foram elaboradas em imagens
digitalizadas obtidas pelo sistema de imagens Motic Image Plus 2.0
®
, acoplado a um
microscópio estereoscópico, usando-se o software Motic Images Advanced 3.2
®
. Foram
determinadas as médias e os respectivos intervalos de confiança (P = 0.05) para os
diferentes segmentos mensurados no acúleo e na asa. Através do Software Statistica
7.1 foi efetuada a análise de agrupamento, onde as unidades taxonômicas operacionais
foram os locais e os caracteres foram as medidas (segmentos) tomadas na asa direita e
no acúleo.
3.3 Análise molecular
Fêmeas oriundas das populações analisadas, selecionadas para a extração do
DNA genômico para a condução dos estudos moleculares, tiveram suas asas e
ovipositor mantidos para permitir a confirmação da identificação morfológica do
indivíduo (voucher specimens), os quais foram preservados em etanol 70% e
depositados no Museu de Entomologia Agrícola do Departamento de Entomologia,
Fitopatologia e Zoologia Agrícola, ESALQ/USP. Apenas o tórax e a porção basal do
abdome dos espécimes selecionados para análise molecular foram utilizados para a
extração do DNA genômico. Assim, para cada população, duas fêmeas foram
utilizadas, atentando-se ao fato de terem sido coletadas no mesmo local e em períodos
amostrais próximos, permitindo, assim, que a variabilidade intrapopulacional também
fosse verificada.
3.3.1 Extração do DNA genômico
Os espécimes obtidos para análise foram removidos do conservante original
utilizado nos períodos de coleta em questão (etanol 70%) e transferidos para 100%
etanol para armazenamento a -20
o
C até uso. Para a coleta de tecidos para a extração
de DNA genômico, os espécimes foram dissecados para a obtenção da porção basal
do abdome, a qual foi seca à temperatura ambiente e submetida ao método de sal para
a extração do DNA genômico (ALJANABI; MARTINEZ, 1997). Em cada procedimento
27
de extração foram utilizados o tórax e o abdome de um indivíduo, os quais foram
macerados em 400 µl de solução de homogeneização TEN (10 mMTris-HCl pH 8,0; 2
mM EDTA pH 8,0; 0,4 M NaCl), acrescida de 40 µl de 20% SDS e 8 µl de proteinase-K
(20mg/ml), com auxílio de pistilo estéril. O macerado foi incubado em banho-maria a
55°C (1 h), adicionado de 300 µl de solução saturada de cloreto de sódio (NaCl),
misturado em vortex por 30 segundos e centrifugado a 14,000g por 25 minutos, a 4°C.
Após a centrifugação, o sobrenadante foi coletado e transferido para novo recipiente
estéril, ao qual foi adicionado 1 volume equivalente de etanol 100% refrigerado. Após
agitação em vortex, a amostra foi armazenada a -20°C “overnight”, submetida à
centrifugação a 14,000g por 25 minutos (4°C) para precipitação do material genômico, o
qual foi lavado em dois banhos sucessivos em etanol 70% refrigerado. O DNA
genômico foi sedimentado após centrifugação e mantido à temperatura ambiente para
secar (15 min) após remoção de todo o etanol 70%. O material foi então ressuspenso
em 20 µl de água MILLI-Q e armazenado a -20°C para uso posterior. A qualidade do
DNA genômico extraído foi verificada em gel de agarose 1,0% contendo 0,5 µg/mL de
brometo de etídeo, em tampão TAE (1 mM Tris, 83 nM ácido bórico, 1mM EDTA, pH
8.5), e visualizado em transiluminador.
3.3.2 Amplificação da região da Citocromo Oxidase I
As amostras de DNA genômico obtidas dos espécimes extraídos foram
submetidas à reação em cadeia da polimerase (PCR) para a amplificação de porção do
gene mitocondrial da citocromo oxidase I (COI). Para a amplificação de porção desse
gene foram utilizados os iniciadores C1-N-2191 (GGAGGATTTGGAAATTGATT
AGTTCC) e C1-J-1718 (CCCGGTAAAATTAAAATATAAACTTC), os quais amplificam
fragmento de cerca de 550 pares de bases, dentro da região proposta para a
identificação de espécies através do código de barras do DNA (“DNA barcode”) (Figura
3) (HAJIBABAEI et al., 2007). As reações de amplificação do fragmento da COI para as
populações de Anastrepha striata e A. bistrigata foram conduzidas em volume total de
25 µl, composta por 1µl de gDNA, 5 µl de 5x PCR buffer, 1,5 mM MgCl
2
, 200 µM
dNTP/cada (10mM/cada), 320 pM de cada iniciador, 0,25 unidade de Taq polimerase
28
(Fermentas), em termociclador (icycler Thermal Cicler, BioRad) programado a 95°C por
2 min (1 ciclo), seguido por 40 ciclos a 95°C por 30 s, 45°C por 45 s e 72°C por 1 min,
com extensão final a 72°C por 10 min.
Os produtos de amplificação foram verificados em gel de agarose a 1,5%
contendo 0,5 µg/mL de brometo de etídeo, em tampão TAE, e visualizado em
transiluminador.
Figura 3 - Representação do trecho de DNA onde se encontra o gene da COI e localização dos
iniciadores utilizados na amplificação do fragmento analisado nesse estudo
3.3.3 Clonagem e seqüenciamento
Os produtos de PCR para o gene da COI dos espécimes das diferentes
populações de A. striata e A. bistrigata analisados nesse estudo foram inseridos em
sistema vetor PGENT-Easy (Promega) e clonados em células competentes de
Escherichia coli 5α (New England BioLab.), seguindo recomendações do fabricante. Os
transformantes foram selecionados em placas de LB agar-ampicilina, acrescidas de X-
Gal (50µg/ml). Para cada transformante analisado foram selecionados três clones
positivos, os quais foram crescidos em LB líquido-ampicilina a 37
o
C por 16 h e
submetidos à extração do DNA plasmidial. O DNA plasmidial foi extraído após
crescimento dos clones positivos em meio líquido (16 h a 37
o
C) e sedimentação das
células (12000g x 1 min). O pellet de células foi ressuspenso em 110µl de tampão de
ressuspensão (50mM Tris-HCl, pH7.5; 10mM EDTA), acrescido de 10 µl de RNAse A
(100µg/ml RNase A ). Após a ressuspensão das células, adicionou-se 100µl de tampão
de lise (400mM NaOH, SDS 2%), e o tubo foi gentilmente agitado por inversão (x3). A
29
reação de lise foi interrompida com a adição de 120µl de tampão neutralizador (5M
acetato e potássio, pH 5,5) e a amostra foi novamente agitada por inversão do tubo,
sendo incubada à temperatura ambiente por 3 min e centrifugação a 12.000g (2 min)
para sedimentação dos restos celulares. O sobrenadante foi coletado, transferido para
um novo tubo, ao qual foram adicionados 200 µl de isopropanol gelado e incubação por
1 min à temperatura ambiente. O DNA então foi então sedimentado após centrifugação
a 14.000g por 1 min, o sobrenadante descartado e o pellet de DNA lavado em banhos
sucessivos de 70% etanol, antes de ser seco à temperatura ambiente e ressuspenso
em água Milli-Q autoclavada. O DNA plasmidial coletado foi armazenado a -20ºC até
sua utilização.
Os insertos dos diferentes transformantes foram seqüenciados pela reação do
ABI PRISM Big Dye Terminator Cycle Sequencing, no Centro de Estudos do Genoma
Humano (USP) (http://genoma.ib.usp.br/index_centro.php), utilizando-se dos iniciadores
universais T7 e SP6. Todas as seqüências obtidas foram editadas utilizando-se o
programa BioEdit Software (disponível eletronicamente em http://www.mbio.ncsu.
edu/BioEdit/bioed it.html).
3.3.4 Alinhamento e análise das seqüências
Para se verificar a divergência do DNA mitocondrial entre as diferentes
populações de A. striata, as seqüências obtidas para o gene da COI dessa espécie
foram alinhadas com seqüências disponíveis no banco de dados do National Center for
Bioinformatics (NCBi) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) para populações oriundas de outras
localidades da América Latina. Assim, além das populações do Brasil, Bolívia e
Colômbia analisadas nesse estudo, também foram utilizadas populações do México
(números de acesso DQ116224.1 e DQ116225.1), da Guatemala (números de acesso
DQ116222.1 e DQ116223.1) e Venezuela (números de acesso DQ116226.1 e
DQ116227.1), além de uma outra população do Estado de São Paulo, Brasil (número
de acesso DQ116228.1). As seqüências foram alinhadas utilizando-se da ferramenta
ClustalW do sistema Mega4.0, com os seguintes parâmetros: penalidade por intervalo
aberto (“gap open penalty”) = 15 e penalidade pela extensão do intervalo (“gap
30
extension penalty”) = 6,6 (TAMURA et al., 2007). Após o alinhamento inicial de todas
as seqüências “forward” e reversas, as discrepâncias foram corrigidas manualmente e
os intervalos das seqüências removidos utilizando-se como referência os traços
impressos dos seqüenciamentos.
O método de distância foi utilizado para a reconstrução das árvores filogenéticas
para as diferentes populações de A. striata estudadas, sendo as distâncias estimadas
pelos métodos de Tamura-Nei (TAMURA; NEI, 1993), com fator de correção gama igual
a 2 para corrigir as taxas desiguais no número e tipo de transições e transversões, e
pelo método de parâmetro-2 de Kimura (KIMURA, 1980), ambos disponíveis no pacote
estatístico MEGA4.0 (TAMURA et al., 2007). Devido ao fato de que os diferentes
algoritmos para construção de árvores filogenéticas assumem pressuposições
evolutivas distintas, as seqüências alinhadas foram avaliadas pelos métodos de
Neighbour Joining (NJ) e UPGMA. Os dendogramas produzidos pelos métodos NJ e
UPGMA de análise foram baseados nas distancias calculadas pelo método de Kimura
(KIMURA, 1980), com 1000 repetições para as análises de “bootstrap”. Todas as
análises foram conduzidas utilizando-se do pacote estatístico MEGA4.0.
As comparações entre as seqüências de COI obtidas para A. striata e A.
bistrigata para a busca de iniciadores que facilitassem a realização de estudos
ecológicos em áreas de ocorrência simpátrica foram realizadas após a produção de
seqüência consenso para as populações de A. striata analisadas nesse estudo. A
seqüência consenso foi produzida após alinhamento dos produtos de amplificação
produzidos para as populações de A. striata utilizando o programa BioEdit, sendo essa
seqüência consenso alinhada àquela obtida para A. bistrigata para a localização de
regiões específicas que permitissem o desenho de iniciadores espécie-específicos.
Não foi possível realizar a análise de variação intrapopulacional para a espécie
Anastrepha bistrigata, uma vez que se obteve a seqüência genética da COI de apenas
um haplotipo para cada população amostrada (Goiás e São Paulo) dessa espécie.
Apenas em parte dos indivíduos selecionados para extração e obtenção da amostra de
DNA se obteve sucesso e, das amostras então seqüenciadas, algumas apresentaram
resultados insatisfatórios devido à contaminação, na região genética analisada, pelo
gene wsp do endossimbionte Wolbachia. Outro fator que possivelmente influenciou na
31
não obtenção de seqüências de qualidade foi a degradação do material genético nas
amostras disponíveis devido ao longo período de armazenamento em condições sub-
ótimas de conservação.
3.3.5 Códigos Adotados
Com a finalidade de facilitar a organização dos dados durante os procedimentos
moleculares no processo de alinhamento das seqüências, foram atribuídos códigos
nomeando cada amostra. A tabela 1 indica a espécie e localidade correspondente a
cada código utilizado.
Tabela 1 - Código atribuído, nos estudos moleculares, para cada população analisada
Código Espécie Localização
AS3
A. striata AMAPÁ
APAS7
A. striata AMAPÁ
AS29
A. striata BOLÍVIA
AS72
A. striata COLÔMBIA - AMAZÔNIA
AS79
A. striata COLÔMBIA - AMAZÔNIA
AS85
A. striata COLÔMBIA - VALLE DEL CAUCA
AS89
A. striata COLÔMBIA - VALLE DEL CAUCA
AS24
A. striata GOIÁS
AS27
A. striata GOIÁS
AS34
A. striata MARANHÃO
AS31
A. striata MARANHÃO
AB15
A. bistrigata GOIÁS
AB8
A. bistrigata SÃO PAULO
ABSP5
A. bistrigata SÃO PAULO
32
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Análise morfométrica em Anastrepha striata Schiner
4.1.1 Morfometria do acúleo
As medidas no ápice do acúleo, de forma geral, apresentaram pequena variação.
A largura do acúleo na base do ápice (L1) e o comprimento total do acúleo (L8)
apresentaram maior variação entre as populações. A largura do acúleo no ponto mais
estreito da reentrância do ápice (L2) e o comprimento da margem do ápice do acúleo,
de sua base até a reentrância (L6) apresentaram menor variação entre as populações
analisadas (Figura 4).
O comprimento do acúleo variou de 2,15 a 2,36 mm (Figura 4), ou seja, não
ultrapassou 2,5 mm, concordando com a observação de Norrbom (2001). A largura do
ápice do acúleo variou de 0,197 a 0,211 (Figura 4). Esses valores também estão de
acordo com os dados de Norrbom (2001), que citou que a largura deve ser pelo menos
de 0,17 mm.
A partir da análise de agrupamento por similaridade (cluster), baseada nas
distâncias euclidianas (Figura 5), observa-se maior grau de semelhança entre as
populações da Colômbia (Toro e Letícia). A proximidade geográfica entre as duas
populações da Colômbia pode explicar essa similaridade morfológica entre elas. Os
resultados revelam a formação de um grupo abrangendo as populações do Oiapoque,
Caxias, Toro e Letícia (Figura 5). Essas populações encontram-se em latitude e bioma
semelhantes e, portanto, esses fatores podem favorecer a menor variação morfológica
em relação às dimensões do acúleo. As populações de Orizona (Goiás) e Chimoré
(Bolívia) apresentam menor similaridade em relação às demais populações. O
comprimento do ápice do acúleo e o comprimento da margem do ápice do acúleo foram
distintamente maiores na população de Orizona.
33
L1
0,16
0,17
0,18
0,19
0,2
0,21
0,22
AP BOL CO-AM CO-VA GO MA
Medida (mm)
L2
0
0,02
0,04
0,06
0,08
0,1
0,12
AP BOL CO-AM CO-VA GO MA
Medida (mm)
L3
0,095
0,1
0,105
0,11
0,115
0,12
0,125
0,13
AP BOL CO-AM CO-VA GO MA
Medida (mm)
L4
0,26
0,28
0,3
0,32
0,34
0,36
0,38
AP BOL CO-AM CO-VA GO MA
Medida (mm)
L5
0,28
0,3
0,32
0,34
0,36
0,38
AP BOL CO-AM CO-VA GO MA
Medida (mm)
L6
0
0,1
0,2
0,3
AP BOL CO-AM CO-VA GO MA
Medida (mm)
L7
0
0,05
0,1
0,15
0,2
AP BOL CO-AM CO-VA GO MA
Populações
Medida (mm)
L8
1,8
2
2,2
2,4
2,6
AP BOL CO-AM CO-VA GO MA
Populações
Medida (mm)
Figura 4 - Variação morfométrica de oito medidas do acúleo de Anastrepha striata em seis populações
AP-Amapá/Oipaoque, Bol-Bolívia/Chimoré, CO-AM- Colômbia Amazônia/Letícia, CO-VA-
Colômbia Valle Del Cauca/Toro, GO-Goiás/Orizona, MA-Maranhão/Caxias
34
A população de Chimoré possui acúleo e comprimento da margem do ápice do
acúleo (da reentrância até o ápice) maiores. De forma geral, as medidas do acúleo
dessas duas populações tenderam para ligeiramente maiores que das demais
populações, o que pode ter influenciado na formação do grupo na análise de
agrupamento por similaridade (Figura 5).
Figura 5 - Gráfico das distâncias euclidianas de oito medidas do acúleo de Anastrepha striata em seis
populações
Com base nas distâncias de Mahalanobis (Figura 6), os resultados são similares,
porém a população de Orizona (Goiás) apresentou menor grau de semelhança com as
demais e a de Chimoré (Bolívia) apresentou resultados semelhantes nas duas análises.
35
Figura 6 - Gráfico das distâncias de Mahalanobis de oito medidas do acúleo de Anastrepha striata em
seis populações
4.1.2 Morfometria da asa
De forma geral, houve pouca variação nas medidas dos segmentos analisados
nas asas de A. striata (Figura 7). As medidas com maior variação foram a distância
entre as extremidades distais das nervuras M e CuA
1
(L5), a distância entre as
extremidades distais das nervuras CuA
1
e A (L6), a distância entre as extremidades
distais das nervuras R
1
e A (L9), a distância entre as extremidades distais das nervuras
R
2+3
e CuA
1
(L11) e a distância entre as extremidades distais das nervuras R
4+5
e CuA
1
(L16). A distância entre as extremidades distais das nervuras R
2+3
e R
4+5
(L3), a
distância entre as extremidades distais das nervuras R
4+5
e M (L4), a distância entre o
ponto de bifurcação das nervuras M e CuA
1
e a extremidade distal da nervura h (L8), a
distância entre as extremidades distais das nervuras R
1
e CuA
1
(L13), a distância entre
36
as extremidades distais das nervuras R
2+3
e A (L14) e a distância entre as extremidades
distais das nervuras R
2+3
e M (L15) apresentaram variação menor (Figura 7).
As populações de Toro (Colômbia) e Orizona (Goiás) ocorrem em altitude maior
(cerca de 900 m) e, conseqüentemente, em temperaturas mais amenas, comparadas às
existentes em baixas altitudes. Ambas apresentaram as maiores dimensões em quase
todas as medidas. Contrariamente, a população do Oiapoque apresentou as menores
medidas quando comparada às demais populações (Figura 7).
Diversos estudos têm enfocado a influência da temperatura no tamanho de
certos caracteres morfológicos. Drosophila melanogaster e D. simulans, criadas em oito
diferentes temperaturas, apresentaram tórax e asas maiores (TANTAWY; MALLAH,
1961). O tamanho de várias medidas morfológicas de D. robusta teve correlação com a
temperatura dos locais onde foram coletadas (STALKER; CARSON, 1947). Em D.
melanogaster, houve correlação entre o comprimento da asa e a temperatura das
regiões de ocorrência das populações (IMASHEVA et al., 1994).
No entanto, outros estudos mostram não haver correlação de temperatura com
caracteres os morfológicos. Por exemplo, não houve correlação significativa entre o
tamanho da asa de mosca doméstica coletada em um mesmo ponto e a temperatura
ambiente em cada período do ano (LOMÔNACO; PRADO, 1994). Também não houve
correlação entre e o tamanho de caracteres morfológicos em D. pseudoobscura com a
temperatura do local de coleta (SOKOLOFF, 1965).
Na análise de agrupamento por similaridade, tanto para distâncias euclidianas
como para Mahalanobis, as populações de Oiapoque (Amapá) e de Chimoré (Bolívia)
apresentaram menor grau de semelhança com as demais, estando essa última isolada
das demais. Os resultados indicam haver uma maior semelhança entre as populações
de Orizona (Goiás) e Caxias (Maranhão) e semelhança menor entre as duas
populações da região da Colômbia (Figuras 8 e 9).
Não se observou a formação de grupos distintos de populações estudadas. As
populações com maior similaridade foram as de Orizona e Caxias. Diferentemente do
que foi encontrado na morfometria do acúleo, as populações de Letícia e de Toro
(ambas da Colômbia), não formaram um grupo fortemente relacionado (Figuras 8 e 9).
A relativa dissimilaridade das medidas das asas entre as populações da Amazônia
37
L1
2,2
2,4
2,6
2,8
3
AP BOL CO-AM CO-VA GO MA
Medida (mm)
L2
2
2,1
2,2
2,3
2,4
2,5
2,6
AP BOL CO-AM CO-VA GO MA
Medida (mm)
L3
0
0,5
1
1,5
AP BOL CO-AM CO-VA GO MA
Medida (mm)
L4
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
AP BOL CO-AM CO-VA GO MA
Medida (mm)
L5
1,8
2
2,2
2,4
2,6
AP BOL CO-AM CO-VA GO MA
Medida (mm)
L6
1,6
1,7
1,8
1,9
2
2,1
2,2
AP BOL CO-AM CO-VA GO MA
Medida (mm)
L7
2,2
2,4
2,6
2,8
3
AP BOL CO-AM CO-VA GO MA
Medida (mm)
L8
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
AP BOL CO-AM CO-VA GO MA
Medida (mm)
Figura 7 - Variação morfométrica de 16 medidas tomadas na asa direita de fêmeas de Anastrepha striata
em seis populações. AP-Amapá/Oipaoque, Bol-Bolívia/Chimoré, CO-AM- Colômbia
Amazônia/Letícia, CO-VA- Colômbia Valle Del Cauca/El Toro, GO-Goiás/Orizona, MA-
Maranhão/Caxias
38
L9
2,6
2,8
3
3,2
3,4
3,6
AP BOL CO-AM CO-VA GO MA
Medida (mm)
L10
2,4
2,5
2,6
2,7
2,8
2,9
3
3,1
AP BOL CO-AM CO-VA GO MA
Medida (mm)
L11
2,6
2,8
3
3,2
3,4
3,6
AP BOL CO-AM CO-VA GO MA
Medida (mm)
L12
2,6
2,8
3
3,2
3,4
3,6
AP BOL CO-AM CO-VA GO MA
Medida (mm)
L13
0
1
2
3
4
AP BOL CO-AM CO-VA GO MA
Medida (mm)
L14
0
1
2
3
4
5
6
AP BOL CO-AM CO-VA GO MA
Medida (mm)
L15
0
0,5
1
1,5
2
AP BOL CO-AM CO-VA GO MA
Populações
Medida (mm)
L16
2,4
2,6
2,8
3
3,2
AP BOL CO-AM CO-VA GO MA
Populações
Medida (mm)
Figura 7 - Variação morfométrica de 16 medidas tomadas na asa direita de fêmeas de Anastrepha striata
em seis populações. AP-Amapá/Oipaoque, Bol-Bolívia/Chimoré, CO-AM- Colômbia
Amazônia/Letícia, CO-VA- Colômbia Valle Del Cauca/El Toro, GO-Goiás/Orizona, MA-
Maranhão/Caxias
39
(Letícia) e do vale situado nos Andes Colombianos (Toro) pode ser explicada por
diferenças de temperaturas no hábitat de cada uma, uma vez que as temperaturas da
região dos Andes são consideravelmente menores que as da Amazônia.
Diversos outros fatores ambientais influenciem as dimensões dos insetos e é
muito provável que esses fatores atuem em conjunto. A variação geográfica não é uma
adaptação de uma ou algumas características de um organismo em resposta a um
único fator ambiental, mas de processo amplo, abrangendo a adaptação de múltiplos
caracteres em resposta aos fatores ambientais, atuando mutuamente (GOULD;
JOHNSTON, 1972).
Tem sido observada variação geográfica em muitas espécies de insetos
(POWELL, 1979; NEVO, 1988) podendo ocorrer por processos evolutivos locais
envolvendo interações entre mecanismos genéticos e processos ambientais. É comum
que existam espécies com ampla distribuição, de forma que suas populações habitem
diferentes ambientes, podendo cada uma ficar exposta a diferentes padrões de
variação ambiental. As populações e espécies respondem tanto genotipicamente como
fenotipicamente a essa variedade de condições ambientais, o que ocasiona o
desenvolvimento de fenótipos fixados, que apresentam melhor adaptação ao ambiente
(BAKER, 1995).
De forma geral, quanto maior a distância entre as populações, mais
diferenciadas elas se apresentam em termos de freqüência alélica e de características
fenotípicas diretamente influenciadas pelo genótipo. Uma conseqüência à variação
geográfica é o desenvolvimento de padrões de variação intraespecífica, que podem
causar diferenças em inúmeras características entre duas ou mais populações
(KROHNE, 1980).
Entre os caracteres morfológicos, o tamanho é o que apresenta variação
geográfica mais facilmente observável, pois varia virtualmente em qualquer espécie que
possua distribuição geográfica ampla. As proporções também são muito variáveis na
maioria das espécies animais, principalmente o comprimento relativo de extremidades e
apêndices (MAYR, 1977). Os métodos morfométricos permitem a detecção desse tipo
de variação.
40
Figura 8 - Gráfico das distâncias euclidianas de 16 medidas da asa direita de fêmeas de Anastrepha
striata em seis populações analisadas
Figura 9 - Gráfico das distâncias de Mahalanobis de 16 medidas da asa direita de fêmeas de Anastrepha
striata em seis populações analisadas
41
4.2 Análise Morfométrica em Anastrepha bistrigata Bezzi
4.2.1 Morfometria do Acúleo
As medidas da largura do acúleo na base do ápice (L1), comprimento do ápice
do acúleo (L4), comprimento da margem do ápice do acúleo (L5) e comprimento da
margem do ápice do acúleo, de sua base até a reentrância (L6) apresentaram variação
maior entre as duas populações analisadas. Ao contrário de A. striata, em A. bistrigata
o comprimento total do acúleo (L8) apresentou pouca variação (Figura 10).
Nas duas populações, o comprimento do acúleo mediu mais de 3,0 mm de
comprimento, e a largura do ápice do acúleo também foi acima de 0,17 mm (Figura 9),
concordando com o relatado por Norrbom (2001) Em todas as medidas, a população de
Orizona (Goiás) apresentou dimensões ligeiramente maiores (Figura 10). Essa
tendência também pôde ser observada em algumas medidas do acúleo na população
de A. striata nessa localidade (item 4.1.1).
As condições ambientais podem ser uma das explicações para a diferença no
tamanho do acúleo. A população de Orizona foi coletada numa região de serra,
vegetação dominante de cerrado e altitude média de mais de 900 m; a de Campinas,
em altitude de cerca de 600 m e vegetação de Mata Atlântica. Certamente, diferentes
hospedeiros são explorados nesses ambientes, o que pode influir no tamanho do
acúleo. Por exemplo, em altitudes menores, há redução significativa nas dimensões de
D. robusta (STALKER; CARSON, 1948).
4.2.2 Morfometria da asa
Houve pequena variação nas medidas entre as duas populações. Em 14 das 16
medidas, a população de Orizona (Goiás) apresentou dimensões maiores. De forma
análoga ao que foi discutido para A. striata (item 4.1), as diferenças no clima e na
altitude podem afetar diretamente as dimensões das asas (Figura 11). Em amostras de
D. mediopunctata Dobzhansky; Pavan, coletadas em diferentes altitudes na região do
Maciço do Itatiaia (RJ), a forma e as dimensões da asa correlacionaram com a altitude,
42
no entanto, nem toda variação na forma da asa pôde ser explicada pela diferença de
altitude (BITNER-MATHÉ et al., 1995).
L1
0,18
0,19
0,2
0,21
0,22
SP GO
Medida (mm)
L2
0,09
0,1
0,11
0,12
0,13
SP GO
Medida (mm)
L3
0,11
0,12
0,13
0,14
0,15
SP GO
Medida (mm)
L4
0,34
0,36
0,38
0,4
0,42
0,44
SP GO
Medida (mm)
L5
0,34
0,36
0,38
0,4
0,42
0,44
0,46
SP GO
Medida (mm)
L6
0,2
0,22
0,24
0,26
0,28
0,3
SP GO
Medida (mm)
L7
0,12
0,13
0,14
0,15
0,16
0,17
SP GO
Populações
Medida (mm)
L8
0
1
2
3
4
SP GO
Populações
Medida (mm)
Figura 10 - Variação morfométrica de oito medidas no acúleo de Anastrepha bistrigata em duas
populações . SP- São Paulo/Campinas, GO- Goiás/Orizona
43
L1
2,6
2,7
2,8
2,9
3
3,1
SP GO
Medida (mm)
L2
2,3
2,4
2,5
2,6
2,7
2,8
SP GO
Medida (mm)
L3
1,2
1,25
1,3
1,35
1,4
1,45
1,5
SP GO
Medida (mm)
L4
0,66
0,68
0,7
0,72
0,74
0,76
SP GO
Medida (mm)
L5
2,3
2,4
2,5
2,6
2,7
2,8
SP GO
Medida (mm)
L6
1,8
1,9
2
2,1
2,2
SP GO
Medida (mm)
L7
2,9
3
3,1
3,2
3,3
SP GO
Medida (mm)
L8
0,85
0,9
0,95
1
SP GO
Medida (mm)
Figura 11 - Variação morfométrica de 16 medidas da asa direita de fêmeas de Anastrepha bistrigata em
duas populações. SP- São Paulo/Campinas, GO- Goiás/Orizona
44
L9
3,2
3,3
3,4
3,5
3,6
3,7
SP GO
Medida (mm)
L10
2,8
2,9
3
3,1
3,2
SP GO
Medida (mm)
L11
3,3
3,4
3,5
3,6
3,7
3,8
SP GO
Medida (mm)
L12
3,1
3,2
3,3
3,4
3,5
3,6
SP GO
Medida (mm)
L13
0
1
2
3
4
SP GO
Medida (mm)
L14
4
4,2
4,4
4,6
4,8
5
SP GO
Medida (mm)
L15
1,6
1,65
1,7
1,75
1,8
1,85
SP GO
Populações
Medida (mm)
L16
2,9
3
3,1
3,2
3,3
SP GO
Populações
Medida (mm)
Figura 11 - Variação morfométrica de 16 medidas da asa direita de fêmeas de Anastrepha bistrigata em
duas populações. SP- São Paulo/Campinas, GO- Goiás/Orizona
45
4.3 Simpatria em Goiás
Apenas de uma localidade (Orizona, Goiás), foram recebidas amostras com
exemplares das duas espécies. Tanto na morfometria do acúleo (Figura 12) como na
das asas (Figura 13), pôde-se perceber claramente uma distinção nas medidas.
A.bistrigata apresentou maiores dimensões em praticamente todas as medidas em
Orizona. A exceção foi a medida da distância entre as extremidades distais das
nervuras R
4+5
e M (Figura 13).
Apesar de ocorrerem simpatricamente, estudos demonstraram que não há
cruzamentos naturais entre essas espécies, o que favorece a existência de certo grau
de diferenciação morfológica. Selivon e Morgante (1997) descreveram o
comportamento reprodutivo de A. bistrigata e seu isolamento de A. striata. Observaram
que, em condições de cativeiro, ocorriam tentativas de cópula entre as duas espécies,
geralmente entre machos de A. bistrigata e fêmeas de A. striata. Não foram detectados
espermatozóides nas espermatecas de fêmeas em cruzamentos interespecíficos, o que
sugere a existência de isolamento prezigótico. A atividade diária de acasalamento nas
duas espécies mostrou picos de atividades claramente definidos. De acordo com Aluja
(1993), o período de acasalamento de A. striata em condições de semi-cativeiro ocorre
entre 10:00 e 17:00h, com pico das 15:00 às 16:00h. Os dados de Selivon e Morgate
(1997), sob condições de laboratório, mostraram praticamente o mesmo padrão, com
acasalamentos ocorrendo das 10:00 às 19:00h, concentrando-se das 15:00 às 17:00h.
Anastrepha striata e A. bistrigata também apresentam diferenças nos padrões de
comportamento reprodutivo (MORGANTE et al., 1993). O comportamento de A.striata é
mais complexo, com corte constituída por vários eventos. Em A. bistrigata, não há corte
nem necessidade de reconhecimento preciso de padrões para que o contato seja
estabelecido. Portanto, além do isolamento prezigótico, as diferenças nos padrões de
comportamento reprodutivo e no período das atividades de acasalamento, explicam o
isolamento reprodutivo existente entre essas duas espécies, em regiões onde ocorrem
em simpatria.
46
L1
0,1800
0,1900
0,2000
0,2100
0,2200
A. striata A. bistrigata
Medidas (mm)
L2
0,0000
0,0500
0,1000
0,1500
A. striata A. bistrigata
Medidas (mm)
L3
0,0000
0,0500
0,1000
0,1500
0,2000
A. striata A. bistrigata
Medidas (mm)
L4
0,0000
0,1000
0,2000
0,3000
0,4000
0,5000
A. striata A. bistrigata
Medidas (mm)
L5
0,0000
0,1000
0,2000
0,3000
0,4000
0,5000
A. striata A. bistrigata
Medidas (mm)
L6
0,0000
0,1000
0,2000
0,3000
0,4000
A. striata A. bistrigata
Medidas (mm)
L7
0,0000
0,0500
0,1000
0,1500
0,2000
A. striata A. bistrigata
Medidas (mm)
L8
0
1
2
3
4
A. striata A. bistrigata
Medidas (mm)
Figura 12 - Variação morfométrica de oito medidas do acúleo de Anastrepha striata e A.bistrigata em
duas populações simpátricas (Orizona – Goiás)
47
L1
2,4000
2,6000
2,8000
3,0000
3,2000
A.striata A. bistrigata
Medidas (mm)
L2
2,0000
2,2000
2,4000
2,6000
2,8000
A.striata A. bistrigata
Medidas (mm)
L3
0,0000
0,5000
1,0000
1,5000
2,0000
A.striata A. bistrigata
Medidas (mm)
L4
0,6500
0,7000
0,7500
0,8000
A.striata A. bistrigata
Medidas (mm)
L5
2,0000
2,2000
2,4000
2,6000
2,8000
A.striata A. bistrigata
Medidas (mm)
L6
1,7000
1,8000
1,9000
2,0000
2,1000
2,2000
A.striata A. bistrigata
Medidas (mm)
L7
0,0000
1,0000
2,0000
3,0000
4,0000
A.striata A. bistrigata
Medidas (mm)
L8
0,7000
0,8000
0,9000
1,0000
A.striata A. bistrigata
Medidas (mm)
Figura 13 - Variação morfométrica de 16 medidas da asa direita de fêmeas de Anastrepha striata e de
Anastrepha bistrigata em duas populações simpátricas (Orizona – Goiás)
48
L9
2,8000
3,0000
3,2000
3,4000
3,6000
3,8000
A.striata A. bistrigata
Medidas (mm)
L10
2,4000
2,6000
2,8000
3,0000
3,2000
A.striata A. bistrigata
Medidas (mm)
L11
0,0000
1,0000
2,0000
3,0000
4,0000
A.striata A. bistrigata
Medidas (mm)
L12
2,6000
2,8000
3,0000
3,2000
3,4000
3,6000
A.striata A. bistrigata
Medidas (mm)
L13
2,4000
2,6000
2,8000
3,0000
3,2000
3,4000
A.striata A. bistrigata
Medidas (mm)
L14
3,8000
4,0000
4,2000
4,4000
4,6000
4,8000
5,0000
A.striata A. bistrigata
Medidas (mm)
L15
1,3000
1,4000
1,5000
1,6000
1,7000
1,8000
1,9000
A.striata A. bistrigata
Medidas (mm)
L16
2,6000
2,8000
3,0000
3,2000
3,4000
A.striata A. bistrigata
Medidas (mm)
Figura 13 - Variação morfométrica de 16 medidas da asa direita de fêmeas de Anastrepha striata e de
Anastrepha bistrigata em duas populações simpátricas (Orizona – Goiás)
49
4.4 Análises moleculares
4.4.1 Diversidade genética de Anastrepha striata Schiner
As diferentes populações de A. striata apresentaram freqüências de uso de
nucleotídeos semelhantes na composição de códons do fragmento do gene da
citocromo oxidase I analisado nesse estudo (Tabela 2). Timina e adenina foram os
nucleotídeos mais abundantes, correspondendo a cerca de 33,7-36,2% e 29,2-30,3%
da composição total de nucleotídeos, enquanto citosina e guanina representaram cerca
de 18,4-19,2% e 16,6-17,4% dos nucleotídeos analisados, respectivamente (Tabela 2).
Os nucleotídeos mais abundantes, timina e adenina, dominaram as posições 1 e 3 dos
códons presentes na porção da seqüência do gene da COI das diferentes populações
de A. striata analisadas, enquanto a posição 2 foi preferencialmente ocupada por
timina, seguida de proporções equivalentes de adenina e citosina nessa posição
(Tabela 2).
A análise de nucleotídeos das populações de A. striata em questão também
indicou a ocorrência de alta similaridade entre as seqüências, indicando a existência
média de 483 pares de bases idênticas, em um total médio de 495,7 pares analisados,
sendo os pares TT (167 dos 495,7) e AA (144 dos 495,7) os mais comuns. Também foi
detectada a existência média de sete pares transicionais e seis transversionais. Em
termos médios, foram observadas duas transições na primeira posição do códon, três
na segunda e duas na terceira posição nucleotídica do códon, enquanto as
transversões ocorreram com freqüência média de duas, uma e duas, respectivamente
para as posições um, dois e três do códon.
As análises realizadas também indicaram que a divergência genética encontrada
no fragmento da COI analisado para as diferentes populações de A. striata não permitiu
o agrupamento de acordo com a ocorrência geográfica dessas populações (Figura 14).
Os cladogramas produzidos após a realização de 1000 repetições para “bootstrap” para
os métodos de Neighbour-Joining (NJ) e UPGMA (Figura 14) demonstram a formação
de clados contendo indivíduos de origem geográfica distinta, sendo comum o
posicionamento de haplotipos de uma mesma região em clados distintos, como a
50
Tabela 2 - Freqüência (%) de uso de nucleotídeos nos codons do fragmento do gene da COI analisado para as diferentes populações de
Anastrepha striata
Média geral Posição 1 Posição 2 Posição 3
T(U) C A G T C A G T C A G T C A G
1 33,9 18,4 30,3 17,4 32,9 18,6 29,3 19,2 37,3 21,3 24,3 17,2 31,4 15,4 37,3 16,0
2 34,2 19,1 29,6 17,1 33,1 20,2 28,2 18,4 38,0 21,7 22,9 17,5 31,5 15,5 37,5 15,5
3 34,6 18,9 29,4 17,1 33,7 19,6 28,2 18,4 38,6 21,7 22,3 17,5 31,5 15,5 37,5 15,5
4 34,9 19,0 29,4 16,7 34,1 19,5 28,0 18,3 39,2 21,1 22,9 16,9 31,3 16,3 37,3 15,1
5 34,8 18,7 29,6 16,9 34,1 19,5 28,0 18,3 38,6 21,1 23,5 16,9 31,7 15,6 37,1 15,6
6 33,7 18,6 30,9 16,8 32,7 19,0 30,4 17,9 38,1 20,8 23,8 17,3 30,2 16,0 38,5 15,4
7 34,8 18,7 29,4 17,1 34,8 19,5 27,4 18,3 38,0 21,1 23,5 17,5 31,7 15,6 37,1 15,6
8 34,6 18,8 29,8 16,8 34,1 19,5 28,0 18,3 38,4 21,3 23,8 16,5 31,3 15,7 37,3 15,7
9 34,7 19,0 29,5 16,8 34,1 19,5 28,0 18,3 39,0 21,3 23,2 16,5 31,1 16,2 37,1 15,6
10 34,7 19,0 29,8 16,5 34,1 19,5 28,0 18,3 38,8 21,2 23,6 16,4 31,1 16,2 37,7 15,0
11 34,7 19,0 29,4 16,9 34,1 19,5 28,0 18,3 38,8 21,2 23,0 17,0 31,1 16,2 37,1 15,6
12 34,6 18,9 29,4 17,1 34,1 19,5 28,0 18,3 38,6 21,1 22,9 17,5 31,1 16,2 37,1 15,6
13 34,6 18,9 29,4 17,1 34,1 19,5 28,0 18,3 38,6 21,1 22,9 17,5 31,1 16,2 37,1 15,6
14 34,5 18,8 29,5 17,2 34,4 19,0 28,2 18,4 38,6 21,1 22,9 17,5 30,7 16,3 37,3 15,7
15 34,8 18,8 29,2 17,2 34,5 18,8 27,3 19,4 38,3 21,6 23,4 16,8 31,5 16,1 36,9 15,5
16 34,4 18,9 29,8 16,9 34,1 18,9 28,7 18,3 38,0 22,3 22,9 16,9 31,1 15,6 37,7 15,6
17 33,9 19,2 30,3 16,6 30,6 20,6 30,6 18,2 39,1 20,7 24,3 16,0 32,0 16,3 36,0 15,7
18 36,2 17,1 29,6 17,1 34,8 18,3 28,7 18,3 39,8 18,7 24,1 17,5 34,1 14,4 35,9 15,6
1. AS85COVa, 2. AS31MA, 3. AS34MA, 4. AS27GO, 5. AS79CO, 6. AS3AP, 7. AS89COVa, 8. ASVEDQ116227.1, 9. ASGUDQ116223.1, 10. ASVEDQ116226.1,
11. ASMEDQ116224.1,12. ASMEDQ116225.1, 13. ASGUDQ116222.1, 14. ASBRSPDQ116228.1, 15. AS29BO, 16. AS72CO, 17. AS7AP e 18. (ver Tabela 1 para
identificação das amostras).
51
colocação do haplotipo AS27 de Goiás em um mesmo clado com o haplotipo AS79 da
Colômbia, enquanto os outros haplotipos de Goiás (AS24) e Colômbia (AS72) estão
dispostos em posições distantes (Figura 14). Boa parte dos ramos formados apresenta
valores de bootstrap inferiores a 50%, indicando o baixo suporte dado para a formação
dos mesmos (Figura 14).
No entanto, chama a atenção a formação de um clado bem definido em ambas as
análises, formado por seqüências de haplotipos do México, Guatemala e Venezuela,
incluindo, ainda, um haplotipo de população brasileira, coletado no Estado de São
Paulo (número de acesso no NCBi DQ116228.1), o qual difere dos demais haplotipos
coletados e investigados nesse estudo, como aqueles oriundos do Goiás, Amapá e
Maranhão (Figura 14). Outro clado que ganha destaque pelo suporte que recebe em
ambas as análises é aquele formado por haplotipos do Maranhão, os quais agrupam de
forma definida nas duas análises realizadas (Figura 14). As seqüências de indivíduos
do Amapá, especialmente do haplotipo AS7, são as mais divergentes dentro do grupo
de haplotipos analisados. Os haplotipos da Colômbia e da Bolívia se agrupam de forma
distinta nas análises conduzidas, com alguns haplotipos se mostrando muito próximos a
haplotipos do Brasil, como os de Goiás e Maranhão (Figura 14).
As distâncias genéticas entre as diferentes populações foram estimadas por dois
métodos, cujos resultados apóiam os cladogramas apresentados (Tabela 3). As
distâncias estimadas pelos métodos de Tamura-Nei e Kimura foram extremamente
próximas, sendo os cladogramas construídos utilizando-se o modelo de Kimura. Os
haplotipos AS7 do Amapá e o AS24 de Goiás foram os mais divergentes, apresentando
valores de divergência superiores a 5% em relações a todos os demais haplotipos de
todas as populações analisadas, incluindo o segundo haplotipo da mesma localização
geográfica (Tabela 3). No entanto, a maior divergência observada foi aquela entre
esses mesmos haplotipos, AS7 e AS24, com cerca de 9% de divergência estimada em
ambas as análises (Tabela 3).
O grau de similaridade da seqüência da COI nas populações amostradas é
fortemente relacionado ao fluxo gênico existente nas mesmas. O fluxo gênico, por sua
vez, é dependente da taxa de migração entre as populações e a taxa de migração
depende do número de populações existentes na região. Além disso, outros fatores que
52
Figura 14 - Arvores linearizadas de Neighbour-Joining (NJ) (A) e UPGMA (B) para diferentes populações de A. striata produzidas a partir da
análise de seqüência de nucleotídeos de uma porção de 497pb do gene da citocromo oxidase I (COI). Para ambas as análises foram
conduzidas 1000 repetições de bootstrap, sendo os valores da porcentagem de repetições que confirmam os diferentes ramos
colocados junto aos mesmos.
DQ116227.1 - VE
DQ116223.1 - GT
DQ116225.1 - MX
DQ116222.1 - GT
DQ116224.1 - MX
DQ116226.1 - VE
DQ116228.1 - BR
AS29BO
AS24GO
AS27GO
AS79CO
AS34MA
AS85COVa
AS31MA
AS89COVa
S72CO
AS3AP
AS7AP
54
86
67
77
69
66
52
34
21
35
0.0000.0050.0100.0150.020
DQ116223.1 - GT
DQ116222.1 - GT
DQ116225.1 - MX
DQ116227.1 - VE
DQ116224.1 - MX
DQ116226.1 - VE
DQ116228.1 - BR
AS31MA
AS34MA
AS27GO
AS79CO
AS89COVa
AS72CO
AS29BO
AS85COVa
AS3AP
AS24GO
AS7AP
80
75
68
66
21
12
99
0.0000.0050.0100.0150.0200.0250.0300.0350.040
B
A
53
definem o fluxo gênico de uma população são a distribuição geográfica, o padrão
espacial, as distâncias entre as populações e a capacidade de dispersão da espécie
(FRANKHAN et al., 2002). O fluxo gênico entre grupos de animais em geral, tende a
homogeneizar
a variação genética entre eles (GENOVART et al., 2003).
Populações podem apresentar-se com diversas estruturas, as quais influenciam
o fluxo gênico. Essa estruturação pode se dar na forma de: (1)
populações inteiramente
isoladas sem nenhum fluxo gênico, (2) vários agrupamentos entre os quais o fluxo gênico é
suficiente para que se comportem como uma única e grande população genética, (3)
seguindo o modelo de ilhas onde a taxa migração é igual entre ilhas de igual tamanho e
distância, (4) de acordo com o modelo de “stepping-stones”, onde há fluxo gênico entre
populações vizinhas, (5) baseado no modelo fonte-sumidouro, onde há uma ilha maior que
é fonte de migração de indivíduos para ilhas menores e (6) seguindo o modelo de
metapopulações, onde há várias populações com freqüentes eventos de extinção e
recolonização (BEGON et al., 1996; FRANKHAM et al., 2002).
Quando o ambiente é estável, indivíduos melhor adaptados predominarão,
diminuindo a proporção dos menos adaptados. Isso acarreta certa uniformização
genética na população, reduzindo, assim, a variabilidade genética. Populações naturais
são dinâmicas em muitas dimensões, mudam de tamanho, densidade e localização em
função do tempo e espaço. As populações podem fragmentar-se em muitas
subpopulações ou fundir-se com outras (HEY; MACHADO, 2003). Populações de
diversas espécies são frequentemente subdivididas por fatores geográficos, ecológicos
e comportamentais (GENOVART et al., 2003).
Um exemplo de grupo específico geograficamente distinguível é A. fraterculus.
Smith-Caldas et al. (2001) usando dados da seqüência de DNA do gene da COI,
sugeriram que diferentes habitats encontrados, formados a partir de diferentes altitudes
e climas, por toda a região na qual a espécie se distribui, podem explicar a formação
desses grupos.
Steck (1991) encontrou, na Venezuela, duas populações de A. fraterculus muito
próximas geograficamente, com grandes diferenças alélicas. Isso pode ser explicado
como resultado de seleção natural ou adaptação local de duas populações tendo pouco
ou nenhum fluxo gênico entre si, devido a barreiras geográficas como algumas
elevações ou ainda diferenças climáticas existentes.
54
Tabela 3 - Análise da seqüência de uma porção de 497pb do gene da citocromo oxidase I de populações de Anastrepha striata. Diagonal baixa:
distâncias pelo método de Kimura. Diagonal superior: distâncias pelo método de Tajima-Nei
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
1 * 0,012 0,014 0,019 0,017 0,029 0,023 0,023 0,023 0,025 0,023 0,023 0,023 0,025 0,025 0,025 0,067 0,062
2 0,012 * 0,004 0,012 0,010 0,023 0,017 0,017 0,017 0,019 0,017 0,017 0,017 0,015 0,019 0,019 0,060 0,056
3 0,014 0,004 * 0,008 0,006 0,019 0,012 0,012 0,012 0,015 0,012 0,012 0,012 0,010 0,015 0,014 0,058 0,051
4 0,019 0,012 0,008 * 0,004 0,019 0,012 0,012 0,012 0,015 0,012 0,012 0,012 0,015 0,015 0,015 0,058 0,051
5 0,017 0,010 0,006 0,004 * 0,017 0,010 0,010 0,010 0,012 0,010 0,010 0,010 0,012 0,012 0,012 0,056 0,049
6 0,029 0,023 0,019 0,019 0,017 * 0,023 0,023 0,023 0,025 0,023 0,023 0,023 0,025 0,025 0,025 0,060 0,063
7 0,023 0,017 0,012 0,012 0,010 0,023 * 0,017 0,017 0,019 0,017 0,017 0,017 0,019 0,019 0,015 0,060 0,056
8 0,023 0,017 0,012 0,012 0,010 0,023 0,017 * 0,000 0,002 0,000 0,000 0,000 0,006 0,019 0,019 0,063 0,051
9 0,023 0,017 0,012 0,012 0,010 0,023 0,017 0,000 * 0,002 0,000 0,000 0,000 0,006 0,019 0,019 0,063 0,051
10 0,025 0,019 0,014 0,014 0,012 0,025 0,019 0,002 0,002 * 0,002 0,002 0,002 0,008 0,021 0,017 0,061 0,054
11 0,023 0,017 0,012 0,012 0,010 0,023 0,017 0,000 0,000 0,002 * 0,000 0,000 0,006 0,019 0,019 0,063 0,051
12 0,023 0,017 0,012 0,012 0,010 0,023 0,017 0,000 0,000 0,002 0,000 * 0,000 0,006 0,019 0,019 0,063 0,051
13 0,023 0,017 0,012 0,012 0,010 0,023 0,017 0,000 0,000 0,002 0,000 0,000 * 0,006 0,019 0,019 0,063 0,051
14 0,025 0,014 0,010 0,015 0,012 0,025 0,019 0,006 0,006 0,008 0,006 0,006 0,006 * 0,017 0,021 0,061 0,049
15 0,025 0,019 0,015 0,015 0,012 0,025 0,019 0,019 0,019 0,021 0,019 0,019 0,019 0,017 * 0,021 0,060 0,051
16 0,025 0,019 0,014 0,014 0,012 0,025 0,014 0,019 0,019 0,017 0,019 0,019 0,019 0,021 0,021 * 0,056 0,058
17 0,066 0,060 0,058 0,058 0,055 0,060 0,060 0,062 0,062 0,060 0,062 0,062 0,062 0,060 0,060 0,056 * 0,090
18 0,062 0,056 0,051 0,051 0,049 0,049 0,056 0,051 0,051 0,053 0,051 0,051 0,051 0,049 0,051 0,058 0,090 *
1. AS85COVa, 2. AS31MA, 3. AS34MA, 4. AS27GO, 5. AS79CO, 6. AS3AP, 7. AS89COVa, 8. ASVEDQ116227.1, 9. ASGUDQ116223.1, 10.
ASVEDQ116226.1, 11. ASMEDQ116224.1,12. ASMEDQ116225.1, 13. ASGUDQ116222.1, 14. ASBRSPDQ116228.1, 15. AS29BO, 16. AS72CO,
17. AS7AP e 18. AS24GO (ver Tabela 1 para identificação das amostras).
55
No caso de moscas-das-frutas, uma possível explicação para a maior
variabilidade observada dentro de algumas populações é a de que subpopulações
estejam parcialmente isoladas ou fragmentadas, reduzindo os seus tamanhos efetivos,
o que estaria, conseqüentemente, favorecendo a deriva genética.
Uma grande diversidade em disponibilidade de recursos de oviposição pode ser
responsável por divergências genéticas intrapopulacionais e, em uma escala temporal e
espacial maior, gerar dissimilaridades entre populações de determinada espécie. O
surgimento de adaptações que possibilitem a exploração mais eficiente de hospedeiros,
ou ainda a exploração de novos hospedeiros acarreta maiores graus de diferenciação
genética.
4.5 Desenvolvimento de iniciadores espécie-específicos
A análise comparativa do fragmento do gene da citocromo oxidase I do haplotipo
de A. bistrigata de São Paulo à seqüência consenso produzida para os demais
haplotipos das diferentes populações de A. striata do Brasil determinados nesse estudo,
permitiu o desenvolvimento de iniciadores com divergência suficiente entre as espécies
em questão para permitir a amplificação de porção específica do gene da COI, que leve
à diferenciação entre as mesmas (Figura 15). Os iniciadores propostos, AsCOI69 (5´-
TAA TAT AAG ATT TTG AYT ATT RCC-´3), para A. striata, e AbCOI173 (5´-CTA ACC
CTC CAC TCT A-´3), para A. bistrigata, apesar da alta variabilidade existente entre os
diferentes haplotipos de A. striata analisados e à baixa variabilidade na seqüência de
nucleotídeos em regiões informativas da porção do gene da COI analisado, entre
ambas espécies, reúnem características que permitem a sua utilização em reações de
PCR multiplex para a diferenciação entre espécimes de ambas espécies. O iniciador
AsCOI69, proposto para A. striata, é um iniciador degenerado, com 24 bases, conteúdo
de GC de 20,8% e temperatura de deselicoidização ou de desnaturação (“melting
temperature”) (Tm) média de Tm = 44,7
o
C (Tm mínima = 42,5
o
C; Tm máxima = 46,9
o
C),
enquanto o iniciador para A. bistrigata é mais curto, com apenas 16 bases, conteúdo de
GC de 50% e Tm = 45,7
o
C.
56
Esses iniciadores são propostos para utilização em reações de PCR multiplex
em conjunto com o iniciador reverso da COI
C1-J-1718 (5´-CCC GGT AAA ATT AAA ATA
TAA ACT TC-´3) (Tm = 49,1
o
C, conteúdo de GC = 26,9%), utilizado na produção do
fragmento originalmente avaliado nesse estudo,
em reação de amplificação programada
a 95°C por 2 min (1 ciclo), seguido por 40 ciclos a 95°C por 30 s, 45°C por 45 s e 72°C
por 1 min, com extensão final a 72°C por 10 min, sendo esperado a obtenção de
produto de amplificação de produto de reação com 456-464 pb dependendo da região
de origem do haplotipo de A. striata e de 372 pb para A. bistrigata.
O emprego dos iniciadores espécie-específicos possibilitará a confirmação da
identificação e diferenciação eficiente das espécies
A. striata e A. bistrigata por meio
de
reação de PCR multiplex. Outra importância do desenvolvimento desses
iniciadores é a possibilidade de uma caracterização genética mais precisa a nível
intrapopulacional para as espécies.
No entanto, é fundamental que sejam realizados
estudos mais amplos em relação à eficiência do emprego desses iniciadores, bem
como testes de especificidade dos mesmos em diversas outras populações.
57
Figura 15 - Alinhamento ClustalW2 entre seqüência consenso de porção do gene da COI de haplotipos de populações brasileiras de Anastrepha
striata e seqüência de haplotipo de Anastrepha bistrigata da população de São Paulo. As regiões das seqüências consenso do gene
da COI de A. striata e de A. bistrigata em destaque marcam as regiões selecionadas como iniciadores específicas para as espécies
em questão
10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
ConsensusAS GGAGGATTTGGAAATTGATTAGTTCCYTTRAT--ATTAGGRGCMCCTGA-TATA-GCATTCCCACGAATAAAT---AAYATAA-GATTTTGA-YTATTRC
AbSP GGAGGATTTGGAAATTGATTAGTTCCCTTAATGTATTGGAGGCACCTGAATATATGCATTCCCACGAATAAAGTAAAATATAACGATTTTGAGTTATTGC
Clustal Consensus ************************** ** ** *** * ** ***** **** ***************** ** **** ******** **** *
110 120 130 140 150 160 170 180 190 200
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
ConsensusAS CTCCTTCYCTYACAT-TAYTACTAGTAAGTAGTA-TAGTAGRAAMCGGGGC--TGGTACAGGWTGAACTGTTT--ACCCYCCATT---RTCATCTTYA--
AbSP CTCCTTCTCTTACATCTACTACTAGTAAGTAGTAGTAGTAGAAACCGGAGCGCTGGTACAGGTTGAACTGTTCTAACCCTCCACTCTAATCATCTTTATA
Clustal Consensus ******* ** **** ** *************** ****** ** *** ** ********* ********* **** *** * ******* *
210 220 230 240 250 260 270 280 290 300
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
ConsensusAS ATTGCTCAYGGWKGAGCGTTCAGTAWAGACATTAGCCTATTTTTTCMTTACAYYTAGGCTGGAATTTCATCAATTCTAGGRGCRGTAAMATTTHTATCAC
AbSP GTTGCTCATGGAGGAGC-TTCAGT--AGACTTG---CTATTTTTTCATTACACCTAG-CTGGAATTTCATCAATTCTAGGAGCAGTAAA--TTTTATCAC
Clustal Consensus ******* ** **** ****** **** * ********** ***** *** ********************** ** **** ** ******
310 320 330 340 350 360 370 380 390 400
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
ConsensusAS AAMAGTAATTAATATACGATCTACTGGTATAACATTTGACCGAATACCATTATTTGTATGRGCTGTAGTATTAACAGCACTATTATTACTTYTATCYTTA
AbSP AACAGTAATTAATATACGATCTACTGGTATAACATTTGACCGAATACCATTATTTGTATGAGCTGTAGTATTAACAGCACTATTATTACTTCTATCCTTA
Clustal Consensus ** ********************************************************* ****************************** **** ***
410 420 430 440 450 460 470 480 490 500
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
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Clustal Consensus *********** ************** ** *********** ******** ** * **** ** ** * ********* **** ** ** * *
510 520 530
....|....|....|....|....|....|..
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AbSP AACATTTA-TTTTGATTTTT--TCGGTCACCC
Clustal Consensus ** *** * ** **** * * * ***** **
58
5 CONCLUSÕES
A análise morfométrica de A. striata e A. bistrigata confirma as identificações
baseadas na largura e no comprimento do acúleo.
Não há padrões geográficos distintos, pela análise de agrupamento entre as
populações de A. striata e entre as de A. bistrigata.
A. bistrigata apresenta, morfometricamente, similaridade menor entre suas
populações em relação a A. striata.
As populações de A. striata e de A. bistrigata de altitudes maiores apresentam
dimensões maiores.
As populações de A. striata apresentam alto grau de similaridade na seqüência
genética da COI.
As populações de Toro (Colômbia) e de Orizona (Goiás) apresentam maior
variabilidade intrapopulacional.
O seqüenciamento da região da COI pode ser utilizado em complemento à
caracterização morfológica para as duas espécies.
As análises realizadas indicaram que a divergência genética encontrada no
fragmento da COI analisado para as diferentes populações de A. striata não permitiu o
agrupamento de acordo com a ocorrência geográfica dessas populações.
Os iniciadores propostos reúnem características que permitem a sua utilização
em reações de PCR multiplex para a diferenciação entre espécimes de ambas as
espécies.
59
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