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RONALDO LUIZ ERENO
EXPRESSÃO GÊNICA DAS ISOFORMAS DO RECEPTOR DO
HORMÔNIO LUTEINIZANTE(LHR) EM CÉLULAS DA
GRANULOSA ANTES, DURANTE E APÓS O DESVIO
FOLICULAR EM NOVILHAS NELORE
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RONALDO LUIZ ERENO
EXPRESSÃO GÊNICA DAS ISOFORMAS DO RECEPTOR DO
HORMÔNIO LUTEINIZANTE(LHR) EM CÉLULAS DA
GRANULOSA ANTES, DURANTE E APÓS O DESVIO
FOLICULAR EM NOVILHAS NELORE
Tese apresentada à Faculdade de
Medicina Veterinária e Zootecnia da
Universidade Estadual Paulista
“Julio de Mesquita Filho”, Campus
de Botucatu, para a obtenção
do título de Doutor em Medicina
Veterinária, Área de Reprodução
Animal.
Orientador: Prof. Dr. Ciro Moraes Barros
Botucatu-SP
2008
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Dedicatória
Karina
O escritor já disse que a gente
não morre, fica encantado
Pensamos que seja assim mesmo
quando, olhamos a casa vazia de você,
de sua alegria;
Acreditamos que nos encontraremos de novo
num tempo , num espaço
onde poderemos ser felizes
novamente..........
17
Agradecimentos:
A realização deste trabalho, só possível graças a ajuda de muitas
pessoas. A todas elas manifesto minha gratidão, e de forma particular:
A Mariana Machado, pela ajuda durante todo o experimento e
amizade;
Ao prof. Dr. José Buratini Junior, pelo auxílio no delineamento do
experimento e a disponibilização de seu laboratório;
A todos os professores do Departamento de Reprodução Animal e
Radiologia Veterinária da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia –
FMVZ – UNESP – Botucatu, por todo o aprendizado que recebi durante esses
9 anos de Pós Graduação;
Ao amigo Marcelo Pegorer, pelo auxílio neste e em outros trabalhos,
pelas caronas, as trocas de informações e principalmente pela amizade;
Aos amigos Rafael Satrapa e Renato Simões, pelas nossas idas e
vindas ao abatedouro em Santa Cruz do Rio Pardo, pelos radioimunoensaios
de P4 e E2 e tantos outros favores feitos por vocês;
A professora Luzia Trinca, pela realização das análises estatísticas
dos experimentos;
Aos funcionários da Pós Graduação pela prontidão e gentileza
Aos amigos: Andrey, Thaís, Evandro Sartorelli, Ana Cláudia
Barcellos, Paulo e outros que eu possa ter esquecido.
18
Aos amigos, Leonardo, João Vitor, Fabinho e Diego, pelo auxílio no
campo, nas etapas deste experimento;
19
“O que verdadeiramente somos é aquilo que
“O que verdadeiramente somos é aquilo que “O que verdadeiramente somos é aquilo que
“O que verdadeiramente somos é aquilo que
o impossível cria em nós “
o impossível cria em nós “o impossível cria em nós “
o impossível cria em nós “
(Clarice Lispector)
(Clarice Lispector)(Clarice Lispector)
(Clarice Lispector)
20
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS E TABELAS
LISTA DE ABREVIATURAS
Resumo
1. INTRODUÇÃO E OBJETIVO 14
2. REVISÃO DE LITERATURA 17
2.1. Isoformas de LHR (“Splicing “alternativos) 18
2.2. LHR e desenvolvimento folicular 20
2.3. Modulação das isoformas do LHR 22
2.4. Atividade biológica das isoformas do LHR 24
2.5. “Down regulation”do LHR 25
3. MATERIAL E MÉTODO 27
3.1. Experimento 1-Etapa 1: Caracterização do momento
do desvio folicular 27
3.1.2. Ultra-sonografia 28
3.2. Etapa 2: Abate e remoção dos ovários e avaliação
da expressão do LHR 29
3.2.1. Classificação folicular 30
3.2.2. Dissecação dos folículos 30
3.2.3. Obtenção do fluido folicular 30
3.2.4. Isolamento das células da granulosa e extração do
RNA total 31
3.3. Extração do RNA total 31
3.4. RT-PCR 32
3.4.1. Protocolo DNAse I 32
3.4.2. Reação de transcrição reversa (RT) 33
3.4.3. Reação em cadeia da polimerase (PCR) 33
3.4.3. Eletroforese em gel de agarose 35
3.5. Comparação entre as medidas foliculares obtidas
pelo US e paquímetro 35
21
3.6. Análise Estatística 36
4. RESULTADOS 37
4.1. Caracterização do momento do desvio de
crescimento folicular (Experimento 1) 37
4.2. Avaliação da expressão do LHR (
Experimentos 1 e 2
) 40
4.3.Comparação entre as medidas foliculares obtidas
pelo US e paquímetro 45
5. DISCUSSÃO 46
6. CONCLUSÕES 52
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 53
ABSTRACT 66
22
LISTA DE FIGURAS E TABELAS
Figura 1. Protocolo de sincronização da ovulação e
acompanhamento do desenvolvimento folicular ovariano
em novilhas Nelore (DIB = Dispositivo Intravaginal Bovino,
BE = Benzoato de estradiol, PGF
2
α = Prostaglandina F
2
α,
D = Dia, US = Exame Ultra-sonográfico, ↓ = inserção e ↑ =
retirada.
Figura 2- Estrutura e disposição dos exons no gene codificador do
LHR. Os números (1 a 11) indicam os exons; TM =
domínio transmembrânico; IC = região intracelular; UTR =
região não traduzida.
Tabela 1 – Seqüência dos oligonucleotídeos iniciadores utilizados
para amplificação do GAPDH, M1, M2. M3 e M4 e da 17α
hidroxilase.
Figura 3 - Diâmetro (± EPM) dos dois maiores folículos (F1 = folículo
dominante e F2 = folículo subordinado) da onda de
crescimento folicular, a partir de 12 horas antes da
ovulação (- 12) até 132 horas após. Momento do desvio de
crescimento folicular indicado pela seta.
Tabela 2- Momento do desvio (dias após a ovulação) e diâmetro
folicular (mm) determinado pelo método gráfico ou por
regressão linear segmentada, em novilhas Nelore. FD =
folículo dominante, EPM = erro padrão da média.
Tabela 3- Identificação da novilha, grupo experimental, diâmetro
folicular (mm) e porcentagem de expressão relativa ao
GAPDH das isoformas do LHR (M1 a M4) nas células da
granulosa, obtidas de novilhas da raça Nelore sacrificadas
2 (G2), 2,5 (G 2,5 e 3,0 (G3) dias após a ovulação.
28
34
35
38
39
41
23
Figura 4 – Total de folículos por grupo de novilhas da raça Nelore
sacrificadas 2 (G2), 2,5 (G 2,5 e 3,0 (G3) dias após a
ovulação e quantidade de folículos que expressaram LHR
(p=0,74).
Figura 5 – Porcentagem relativa acumulada da expressão das
quatro isoformas do LHR (M1, M2, M3 e M4) nas células
da granulosa dos folículos dos Grupos de novilhas da
raça Nelore sacrificadas 2 (G2), 2,5 (G 2,5 e 3,0 (G3)
dias após a ovulação.
*A expressão das isoformas M1 e M3 foi detectada com
maior intensidade do que as M2 e M4 (p < 0,001).
Figura 6- Imagem ilustrativa de gel de agarose a 3,0% corado em
solução de brometo de etídio. Podem ser visualizadas
bandas correspondentes à amplificação com iniciadores
específicos para o GAPDH (850pb) e da 17α hidroxilase
e das amostras contaminadas com células da teca
Figura 7- Imagem ilustrativa de gel de agarose a 3,0%, corado em
solução de brometo de etídio. Podem ser visualizadas
bandas correspondentes à amplificação com iniciadores
específicos para o GAPDH (850pb) e das isoformas
LHRB3 (1240 pb), LHRB4 (1159 pb), LHRB5 (975 pb) e
LHRB6 (894 pb) nos grupos de folículos de novilhas
Nelore abatidas 2 dias (Grupo G2), 2,5 dias (Grupo
G2,5) E 3 DIAS (Grupo G3) após a ovulação. Controle
positivo (+) e controle negativo (-).
Tabela 4- Grupos de folículos (F5 e F9), diâmetro folicular (mm)
obtido por meio de ultra-sonografia (US) ou com auxílio de
um paquímetro e, diferença (mm) entre as mensurações
obtidas pela US e pelo paquímetro.
42
42
43
44
45
24
LISTA DE ABREVIATURAS
µg -micrograma
µl -microlitro
µm -micrômetro
A -“antisense”
b -espécie bovina (p.ex., bLH)
cAMP -monofosfato de adenosina cíclico
cDNA -ácido desoxirribonucléico complementar
CG -célula da granulosa
CYP17 - 17α-Hidroxilase
DEPC -dietilpirocarbonato
DNA -ácido desoxirribonucléico
DNAse -enzima que degrada o ácido desoxirribonucléico
e -espécie eqüina (p.ex., eCG)
E2 -estradiol
EDTA -ácido etilenodiaminotetracético
FF -fluido folicular
FSH -hormônio folículo estimulante
g -força G
GAPDH -gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase
GnRH -hormônio liberador de gonadotrofinas
h -espécie humana (p.ex., hCG)
IGF -fator de crescimento semelhante à insulina
IGFBP -proteína específica de ligação ao fator de
crescimento semelhante à insulina
LH -hormônio luteinizante
LRBP -proteína específica de ligação ao receptor do LH
mg -miligrama
MgCl
2
-cloreto de magnésio
mL -mililitro
mM -milimolar
mm -milímetro
ng -nanograma
nm -nanômetro
Neg -negativo
°C -grau Celsius
pb -pares de bases
P4 -progesterona
PCR -reação da cadeia em polimerase
pg -picograma
pH -potencial hidrogeniônico
PKC -proteína quinase C
RNA -ácido ribonucléico
mRNA -ácido ribonucléico mensageiro
RNAse -enzima que degrada o ácido ribonucléico
RT -reação de transcrição reversa
25
RT-PCR - reação de transcrição reversa seguida de reação
em cadeia da polimerase
S -“sense”
THS Hormônio estimulante da tireóide
26
ERENO, R.L. Expressão gênica das isoformas do receptor do hormônio
luteinizante(LHR) em células da granulosa antes, durante e após o desvio
folicular em novilhas Nelore. Botucatu, 2008, 67p. Tese (Doutorado em
Medicina Veterinária) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia,
Campus Botucatu, Universidade Estadual Paulista “Julio de Mesquita
Filho”.
RESUMO
Objetivou-se com o presente trabalho, avaliar a expressão das isoformas do
LHR nas células da granulosa de novilhas da raça Nelore (Bos taurus indicus),
antes, durante e após o desvio folicular. Para caracterizar o momento do
desvio folicular (Experimento 1, primeira etapa), novilhas Nelore (n=20) foram
submetidas ao seguinte protocolo de sincronização da ovulação: no D-10
receberam um dispositivo intravaginal liberador de progesterona (1,0 g, DIB
®
,),
associado a aplicação de benzoato de estradiol (BE, 2,5 mg, Estrogin
®,
via IM).
O dispositivo intravaginal foi removido no D-3 e os animais receberam uma
aplicação de PGF
2
α (d-cloprostenol, 500 µg, Prolise
®
, IM). Vinte e quatro horas
mais tarde administrou-se 1,0 mg de BE (via IM) e a partir deste momento, o
crescimento do folículo dominante foi acompanhado através de exame ultra-
sonográfico (US, Aloka SSD 900; transdutor de 7,5 a 9,0 MHz, Japan),
realizado a cada 12 horas até 144 horas após a ovulação. Na segunda etapa
deste experimento avaliou-se a expressão das isoformas do LHR (M1, M2, M3
e M4) nas células da granulosa de folículos obtidos antes, durante e após o
momento esperado para ocorrência do desvio folicular. As mesmas novilhas
utilizadas anteriormente foram submetidas ao protocolo de sincronização da
ovulação descrito acima e separadas em 3 grupos (segunda etapa): Grupo 2
(G2, 2 dias após a ovulação, n=7), Grupo 2,5 (G2,5, 2,5 dias após a ovulação,
n=7) e Grupo 3 (G3, 3 dias após a ovulação, n =7). Os animais foram abatidos
2,0, 2,5 e 3 dias após a ovulação para remoção dos ovários e as células da
granulosa, coletadas dos folículos ovarianos, foram separadas para a extração
do RNA total com Trizol. A expressão gênica das isoformas de LHR foi
mensurada por RT-PCR semi-quantitativo. No experimento 2, um outro lote de
novilhas Nelore (n=21) foi submetidos aos procedimentos, descritos na
segunda etapa do experimento 1, para aumentar o número de amostras de
células da granulosa que expressavam as isoformas dos LHRs. No
27
experimento 1 (primeira etapa), houve emergência de uma nova onda folicular
12 horas antes da ovulação e o momento do desvio folicular ocorreu 2,3 dias
após a ovulação, com o folículo dominante medindo 5,4 mm e o subordinado
4,9 mm de diâmetro. Na segunda etapa, (experimentos 1 e 2) não foi
observada expressão do LHR em folículo de 4,5 a 6,7 mm (G2). A expressão
do LHR foi primeiramente detectada em duas amostras de 7 mm (G2,5) sendo
mais acentuada em amostras do G3 (3 dias após a ovulação, 63,6%). Em
todas as amostras que expressaram o LHR, as quatro isoformas deste receptor
(M1, M2, M3 e M4) estiveram presentes. Conclui-se que a expressão do LHR
ocorre, nas células da granulosa de folículos antrais de novilhas Nelore, a partir
do momento do desvio folicular.
Palavras Chaves: expressão gênica, LHR, Nelore, RT-PCR, Bos taurus
indicus
28
1. INTRODUÇÃO E OBJETIVO
Com o advento da avaliação da atividade ovariana através de ultra-
sonografia transretal, podê-se observar melhor o padrão de crescimento e
regressão dos folículos antrais em formas de onda, durante o ciclo estral das
fêmeas bovinas (FORTUNE et al., 1988; LUCY et al., 1992; GINTHER et al.,
1997a). Em espécies monovularatórias, como os bovinos, a emergência da
onda de crescimento folicular, coincide com um aumento nas concentrações
plasmáticas de FSH, responsável pelo recrutamento de um grupo de folículos
antrais menores que 4 mm de diâmetro (FORTUNE et al., 2001; MIHM &
AUSTIN, 2002), com média de crescimento semelhantes entre si (GASTAL et
al. 2004). Em média, o número de folículos recrutados durante a emergência
da onda folicular variou de 24 folículos para novilhas Holandesas (GINTHER et
al.,1996) a 45 para novilhas Nelore (BURATINI et al., 2000).
À medida que esses folículos se desenvolvem, secretam
quantidades crescentes de inibina e estradiol (WRIGHT & MALMO, 1992;
WILTBANK et al., 1996), levando a uma queda gradativa nas concentrações de
FSH (MIHM et al., 2002), culminando na atresia de muitos folículos (GINTHER
et al., 1996).
O momento em que ocorre a maior diferença na taxa de crescimento
entre os dois maiores folículos da onda é denominado de desvio de
crescimento folicular (GINTHER et al., 1997). Nesta fase, o maior folículo em
crescimento atinge um diâmetro de 8,3 a 8,5 mm em Bos taurus taurus
(GINTHER et al., 1996) e 6,1 mm em Bos taurus indicus (SARTORELLI et al.,
2005).
Os mecanismos envolvidos no processo de desvio folicular são
complexos e não compreendidos completamente. Sabe-se que neste momento
as concentrações de FSH encontram-se em níveis basais (GINTHER et al.,
1997). Fatores intrafoliculares também são candidatos a ativação deste
processo, tais como sistema IGF, esteróides, os peptídeos ativina A/inibina A,
receptores para gonadotrofinas entre outros (ARMSTRONG & WEBB, 1997;
BERISHA et al., 2003, FORTUNE et al., 2004, IRELAND et al., 2004). Porém,
uma das hipóteses para este evento é a aquisição de receptores para LH (LHr)
nas células da granulosa e aumento nas concentrações de estradiol
29
intrafolicular no folículo selecionado dominante (GINTHER et al., 1996;
GINTHER, 2000; BEG et al., 2001).
Xu et al. (1995), caracterizaram a importância da expressão dos
transcritos do LHR nas células da granulosa em bovinos, como ponto chave
para a associação da dependência de FSH para LH. A expressão do RNA
mensageiro (mRNA) do LHR foi detectado nas células da granulosa de
folículos com 8 mm; sendo mais acentuada em folículos com tamanho médio
de 10,8 mm. Porém em folículos menores de 8 mm não observou-se a
expressão para tais receptores (BAO et al. 1997). Beg et al. (2001), avaliaram a
relação entre o desvio folicular e diversas características das células da
granulosa e fluido folicular. Neste estudo foi detectado um aumento em mRNA
para LHR aproximadamente 8 horas antes do início do desvio folicular ou do
aumento das concentrações intra-foliculares de estradiol. Porém, em folículos
de ovários de vacas Nelore, oriundos de abatedouro, a expressão do LHR
ocorreu somente em amostras a partir de 7mm de diâmetro (NOGUEIRA et al.,
2007).
Entretanto, enquanto alguns autores sugerem ser o início da
expressão do LHR, nas células da granulosa, a causa para a aquisição da
dominância folicular (GINTHER et al., 2003), outros afirmam ser um evento
decorrente da dominância já instalada (AUSTIN et al., 2001, FORTUNE et al.,
2001). Fortune et al. (2001) não detectaram a expressão do LHR, no futuro
folículo dominante imediatamente antes da seleção folicular. A primeira
diferença observada, entre os maiores folículos (dominante e subordinado), foi
a indução – mediada pelo FSH - da protease da IGFBP-4, a PAPP-A (MOGET
et al., 2003), que possibilita aumento de IGF livre (biodisponível) que, em
sinergismo com o FSH, induziria ao aumento da síntese de estradiol e do
crescimento folicular (seleção folicular).
A maioria dos trabalhos sobre a expressão de receptores para
gonadotrofinas, com enfoque no momento do desvio de crescimento folicular,
utilizou como modelos experimentais bovinos europeus (Bos taurus taurus) e
os parâmetros dos tamanhos foliculares utilizados nestes experimentos, são
referenciados as imagens obtidas por meio de ultra-sonografia. Portanto, faltam
informações a respeito da expressão de receptores para LH, nesta fase distinta
da dinâmica folicular em fêmeas Nelore (Bos taurus indicus).
30
Objetiva-se com este trabalho confiormar o momento predito para o
desvio de crescimento folicular em novilhas Nelore, avaliar a expressão gênica
de LHR nas células da granulosa de folículos desses animias, antes, durante e
após este evento e comparar as medidas do tamanho folicular obtido por meio
de ultra-som e paquímetro.
31
2. REVISÃO DE LITERATURA
A família dos hormônios glicoprotéicos é formada pelo hormônio
luteinizante (LH), hormônio folículo estimulante (FSH), hormônio estimulante da
tireóide (TSH) e a gonadotrofina coriônica (CG). São heterodímeros e
compostas de uma subunidade α comum e outra β, que é hormônio específica.
Todos os mamíferos sintetizam LH, porém a CG tem sido identificada somente
em primatas e eqüídeos, sendo o eLH e eCG codificados pelo mesmo gene e
ambos têm a mesma seqüência de aminoácidos (PIERCE & PARSONS, 1981).
O receptor do LH possui dois hormônios ligantes, o LH (pituitário) e o
CG (placental, REISINGER et al., 2007), porém este último com mais afinidade
e especificidade (ZHANG & DUFAU, 2003; PUETT et al., 2007).
O LHR pertence à superfamília dos receptores acoplados à proteína
G, assim como os receptores do FSH e do THS (GETHER, 2000; ASCOLI et
al.; 2002, FREDRIKSSON et al. 2003, ZHANG & DUFAU, 2003). O receptor do
LH possui uma grande região extracelular (366 aminoácidos codificados pelos
primeiros 10 exons do gene, sendo 11 no total), sete hélices transmembrânicas
(típica dessa família de receptores), sendo três hélices extracelular, três
intracelulares e uma intracelular na região C terminal (PUETT et al., 2007).
A ligação receptor-hormônio está localizada entre os exons 1-7 no
domínio extracelular do receptor (ZHANG & DUFAU, 2003). Uma seqüência de
aminoácidos próxima à primeira das hélices transmembrânicas, parece ser
essencial à ativação do LHR pelo LH, mas não à ligação (ALVAREZ et al.
1999). Por outro lado, isoformas de RNAm que não expressam o exon 10 são
traduzidos em receptores com a capacidade de serem ativados pelo hCG, mas
não pelo LH (; MÜLLER et al., 2003; REISINGER et al., 2007).
A região extracelular do LHR possui diferentes afinidades com os
ligantes (hCG e LH), dependendo de sua origem. Existem distintas afinidades
de ligação entre o hCG e o LH de origem bovina (bLH) ou humana (hLH) com
os receptores humano e de rato. Nesses estudos, as diferenças de ligação
observadas foram relacionadas aos resíduos de aminoácidos, no domínio
extracelular do LHR, que diferem entre as espécies estudadas (GALET &
ASCOLI, 2005).
32
A proteína G trimérica é acoplada à região intracelular do LHR
(região C terminal) e ativada quando ocorre uma alteração conformacional do
receptor após a ligação do hormônio (LEWIN, 2004). A ativação do LHR pode
desencadear vias diferentes de resposta celular, intermediadas por diferentes
proteínas G na ativação do LHR. A G
i
, pela via de ativação dos canais de K
+
, a
G
q
, através da fosfolipase C e a G
s
ativando a adenil ciclase (SHEMESH,
2001).
A complexidade das vias de ativação da proteína G acoplada ao
LHR pode se estender à proteína quinase C. Existem sugestões que o LHR
possa ativar as proteínas quinase A e C (PKA e PKC). Salvador et al. (2002),
demonstraram que, em cultivo das células da granulosa oriundas de folículos
pré ovulatórios, a ativação do LHR pelo hCG, induziu a resposta celular
(fosforilação/ativação da p42/44 MAPK) predominantemente mediada pela
proteína quinase A, independente da PKC.
O LHR também pode apresentar mutações ativas ou inativas. Nas
mutações ativas, mesmo na ausência de LH circulante ocorre a ativação
crônica do receptor. Na inativa, mesmo quando o ligante esta disponível (LH ou
hCG), não ocorre a ativação do LHR (HUHTANIEMI, 2000).
2.1. Isoformas de LHR (“Splicing”alternativos)
A montagem (“splicing”) do transcrito primário de um gene
interrompido (pré-RNAm), com a remoção do material genético que não
codifica aminoácidos presentes na proteína madura (introns) e o alinhamento
das regiões codificadoras (éxons) é necessária para a formação do RNAm. A
transcrição gênica poderá gerar RNAm contendo todos os exons do gene
(forma completa ou “full-length”) ou algumas formas de RNAm com deleções
totais ou parciais de um ou mais éxons. O “splicing” alternativo surge quando
se produz, a partir da transcrição de um mesmo gene, mais de uma seqüência
de RNAm (transcritos alternativos ou isoformas, LEWIN, 2004).
Não é totalmente entendido o porquê de alguns genes serem mais
intensamente transcritos sob o evento do “splicing” alternativo que outros
genes. Supõe-se que os mamíferos usem este processo para amplificar a
33
síntese de proteínas, mantendo o tamanho do genoma em níveis adequados,
pois um único gene pode codificar mais de uma proteína funcional (LAREAU et
al., 2004).
O “splicing” alternativo pode participar de um mecanismo de
autocontrole da expressão gênica (LAREAU et al., 2004) ou de regulação direta
no DNA, em outros RNAs ou mesmo em proteínas, mediante a formação de
microRNAs a partir do RNA intrônico não codificante (MATTICK, 2004).
No trabalho de Aatsinki at al. (1992), feito com ovários de ratas, foi
demonstrado a ocorrência de 4 transcritos alternativos à forma “full-length”: a)
com a deleção parcial do éxon 9; b) deleções dos éxons 3 e 4; c) deleção
parcial do exon 11; d) deleção parcial do exon 11 e total do exon 5.
Várias isoformas do LHR (produtos de “splicing”alternativo) foram
descritas em ovinos e bovinos e nem todas parecem ser funcionais. A
investigação da região comprometida entre os finais dos exons 9 e 11 revelou
deleção alternativa do exon 10 e parte do exon 11, gerando três transcrios
alternativos (ABDENNEBI et al., 2002; ROBERT et al., 2003). Kawate & Okuda
(1998) relataram três isoformas do LHR em corpo lúteo bovino, denominadas
de F (completa deleção do exon 10), B (deleção final do exon 9 e 11) e G
(comprometimento final do exon 10 e 11). Das três isoformas encontradas,
apenas a F pode sintetizar um receptor completo (regiões extra e intracelular, e
transmembrânica), enquanto que as outras (B e G) produzem uma mudança na
leitura do RNAm , levando a síntese de receptores truncados. Por outro lado,
deleções nos exons 4 ou 5 nunca foram citadas (BACICH et al., 1999;
ABDENNEBI et al., 2002, ROBERT et al., 2003; KAWATE, 2004).
Recentemente, a presença de quatro transcritos alternativos foi
confirmada nas células foliculares de vacas aneloradas. Este estudo revelou a
ocorrência de deleção facultativa do exon 3, além das deleções dos exons 10 e
parte do 11 do LHR (ausência completa do exon 10 e/ou parcial do exon 11
(NOGUEIRA et al., 2005 e 2007).
Durante o ciclo estral de ovinos, também observou-se a montagem
alternativa dos transcritos de LHR (BACICH et al., 1999), no corpo lúteo e
gônadas fetais eqüinas (SAINT-DIZIER et al., 2004a) e no ovário de ratas
(AATSINKI et al., 1992).
34
2.2. LHR e desenvolvimento folicular
As células do folículo ovariano possuem RNAm para o LHR em
fases distintas do desenvolvimento folicular, isto é, desde antes do
aparecimento do antro até a fase pré ovulatória nas células da teca (BAO &
GARVERICK, 1998; BRAW-TAL & ROTH, 2005), ou apenas a partir do desvio
folicular até a fase pré ovulatória nas células da granulosa (XU et al. 1995, BAO
& GARVERICK, 1998). Essa distinção entre os dois tipos celulares
provavelmente tem implicações, na hipótese para o mecanismo da única
ovulação que ocorre predominantemente em bovinos (XU et al., 1995; BEG et
al., 2001; GINTHER et al., 2003).
Enquanto alguns autores sugerem ser o início da expressão do LHR,
nas células da granulosa, a causa para a aquisição da dominância folicular
(GINTHER et al., 2003), outros sugerem ser um evento decorrente da
dominância já instalada (AUSTIN et al., 2001, FORTUNE et al. 2004).
A viabilidade e o grau de capacitação atingidos por um folículo são,
em grande parte, refletidos pela composição bioquímica do fluido presente em
sua cavidade antral. Os produtos resultantes do metabolismo das células do
“cumulus oophorus”, da granulosa mural, e mesmo da teca, são difundidos pelo
fluido folicular, fornecendo um panorama da atividade esteroidogênica e da
biodisponibilidade de fatores de crescimento (como fator semelhante a insulina
do tipo I, IGF-I; e proteína ligadora do IGF-I do tipo 4, IGFBP-4). Estudos em
folículos bovinos demonstraram que existe uma alta correlação entre as
concentrações de IGF-I livre, de IGFBP-4, de estradiol e de progesterona,
presentes no fluido, e a capacidade desses folículos atingirem a dominância e
a capacitação final pré-ovulação (BEG et al., 2001; GINTHER et al., 2001;
FORTUNE et al., 2004). Portanto, uma baixa concentração de IGFBP-4
forneceria grandes quantidades de IGF-I biodisponível para ser utilizado como
promotor de crescimento pelo folículo, amplificando os efeitos de FSH e
promovendo um aumento na produção de estradiol. Essa concentração
reduzida de IGFBP-4 está relacionada a uma maior degradação específica
dessa proteína ligadora por uma enzima proteolítica, denominada de proteína
sérica A associada a prenhez (PAPP-A, MONGET et al., 2003) presente nos
35
folículos dominantes desde a fase de recrutamento até o momento pré
ovulatório (FORTUNE et al., 2004).
Austin et al. (2001), também propuseram que as primeiras
mudanças intrafoliculares que distinguem o folículo, destinado a tornar-se
dominante, dos outros folículos da população em crescimento, seria a
capacidade aumentada em produzir estradiol e a manutenção de baixos níveis
de IGFBPs. Corroborando com essa hipótese, Fortune et al. (2001), não
detectaram a expressão do LHR, no futuro folículo dominante, imediatamente
antes da seleção folicular. A diferença observada, entre os maiores folículos do
grupo (futuro dominante e subordinados), foi a indução da protease IGFBP-4,
mediada pelo FSH.
O desvio de crescimento folicular está associado com o declínio nas
concentrações plasmáticas de FSH, aumento nas concentrações de LHR nas
células da granulosa (ADAMS et al., 2008) e aumento circulante de estradiol
17β. A partir deste momento, o folículo dominante tem seu crescimento
direcionado pela secreção pulsátil de LH (VAN DEN HURK & ZHAO, 2003).
De acordo com Beg et al. (2001), a expressão do LHR foi detectada
em folículos com 8mm de diâmetro, que corresponde a 8 horas antes do
momento previsto para o desvio folicular em taurinos. . No entanto, Bao &
Garverick (1998) sugerem que a expressão do LHR aumenta com o
progressivo desenvolvimento folicular, atingindo o máximo quando o folículo
dominante está próximo do seu maior diâmetro. Recentemente, Nogueira et al.
(2007), demonstraram que apenas uma das amostras (n=6) de folículos, de
vacas Nelore, com 7 mm apresentou expressão de LHR nas células da
granulosa, enquanto que em folículos ≥ 8 mm, a ocorrência foi 87,5% .
Sartori et al. (2001), utilizando vacas Holandesas, demonstraram
que a ovulação foi efetiva somente em folículos com mais de 10 mm de
diâmetro, após a administração de LH. Neste mesmo trabalho não houve
resposta ovulatória nos folículos de 7,0 e 8,5 mm de diâmetro. Embora um
aumento do LHR nas células da granulosa, seja necessário para a aquisição de
dominância folicular, somente este aumento não é suficiente para a instalação
plena da capacidade ovulatória. Tal mecanismo, ainda não elucidado, parece
ser decorrente de um aumento na quantidade de LHR, associado a alterações
nas vias de sinalização intracelular que o LHR possui na fase pós divergência.
36
2.3. Modulação das isoformas do LHR
Existem evidências de um controle diferenciado da expressão das
isoformas do LHR, em células-alvo presentes nos ovários de mamíferos
(MENON et al., 2004).
Em ovinos, a modulação da expressão do LHR está diretamente
relacionada à condição fisiológica da atividade ovariana durante a época do
ano, indicando que os estudos dos transcritos alternativos do LHR poderiam
estar parcialmente relacionado á fisiologia reprodutiva das fêmeas estudadas
(ABDENNEBI et al., 2002). Neste mesmo estudo, relatou-se que em células da
teca de folículos antrais ovinos, há predominância na expressão do transcrito
completo (“full-length”) do LHR durante a estação reprodutiva ou ovulatória.
Entretando, durante a estação de anestro o transcrito mais expresso foi aquele
com deleção do éxon 10 e parcial do éxon 11
Porém, ao contrário das diferenças observadas em diferentes
estações do ano, durante o ciclo estral ovino não foi observada a modulação
dos transcritos do LHR (BACICH et al., 1999). Neste estudo, os autores
detectaram - na expressão do LHR em folículos e corpos lúteos – uma
predominância do transcrito com a deleção parcial do exon 11. Também,
demonstrou-se a tradução in vivo desse transcrito, mediante a detecção da
proteína correspondente ao mRNA. Os autores sugerem que tal abundância
nos transcritos alternativos do LHR, concomitante a tradução pelas células,
deveria representar uma parte do mecanismo pelo qual o LH regula a função
ovariana.
Corroborando resultados observados na espécie ovina, Manikkam et
al. (2001), verificaram que não houve diferença na expressão do LHR nas
células da teca e da granulosa de bovinos entre a primeira e segunda onda de
crescimento folicular.
Evans et al. (2004) observaram que a expressão do gene LHR, em
células da granulosa de folículos bovinos, é altamente correlacionada com a
dominância folicular, ou seja, os genes da aromatase e do LHR foram
expressos nos folículos dominantes e não foram detectados nos subordinados.
Alguns autores observaram correlação positiva entre as
concentrações de estradiol e os receptores de LHR (Berisha et al., 2000; Evans
37
et al. 2004) em raças européias. Entretanto, na em animais anelorados,
Nogueira et al. (2007) não observaram qualquer correlação entre
concentrações foliculares de estradiol e a expressão de LHR nas células da
granulosa.
Embora se tenha observado relação entre a expressão do LHR e a
viabilidade da célula da granulosa no folículo dominante (EVANS et al., 2004),a
mesma correlação não foi suficiente para predizer a competência do oócito em
atingir a fase de blastocisto (ROBERT et al., 2003).Curiosamente, neste
mesmo estudo, oócitos de folículos que expressaram o LHR nas células da
granulosa apresentaram maior taxa de blastocisto. No entanto, Calder et al.
(2003) e (2005) demonstraram a relação entre a qualidade do COC, a
competência do oócito e a expressão do LHR nas células do cumulus
oophorus. Os autores postularam que os transcritos do LHR poderiam ser parte
de genes marcadores para a maturação oocitária in vitro.
A expressão do LHR também pode ser modulada diferencialmente
em alguns tecidos. No útero bovino, a expressão máxima do LHR ocorre
durante a fase de pró-estro/estro, na veia uterina, ou durante a fase luteal no
miométrio, endométrio e cérvix. O tipo de tecido pode modular, inclusive o
produto final da ativação do LHR. Embora no útero bovino, a ativação do LHR
induza a síntese de COX-2 no endométrio e miométrio, o principal produto
desta enzima é a PGF, no endométrio, e PGE no miométrio (SHEMESH, 2001).
A modulação torna-se ainda mais complexa quando é proposta a
existência de 2 genes do LHR em humanos, sendo um dos genes expresso
preferentemente nos ovários (TSAI-MORRIS et al., 1998).
A modulação também pode ocorrer na mobilidade do complexo
receptor-ligante na membrana citoplasmática. Aparentemente, o tipo de ligante
(LH, hCG ou hCG deglicosilado) ou de receptor (LHR funcional ou não
funcional), induzem diferenças estruturais entre os complexos receptor-ligante
formados (ROESS et al., 2000a).
Horvat et al. (1999), acoplaram uma proteína fluorescente (GFP) ao
LHR do rato formando um complexo (rLHR-GFP) intrínseco fluorescente, e
demonstram que o LHR não ocupado ficou distribuído na membrana
plasmática de maneira dispersa e com difusão lateral, enquanto que os LHR
ligados ao LH ou ao hCG, formaram agrupamentos com restrita difusão lateral.
38
Interações entre os próprios receptores foram demonstradas para o
LHR. Parece que o mecanismo de dessensibilização ao agonista, observado
com o LHR em células da granulosa em cultivo e nas células foliculares após o
pico pré-ovulatório de LH, é mediado por auto-associações entre dois ou mais
LHR, a proteína β-arrestina e regiões da membrana citoplasmáticas
denominadas “raft” (ROESS et al., 2000b, HUNZICKER-DUNN et al., 2003,
ROESS & SMITH, 2003). Nessa série de estudos, foi demonstrado que o
padrão de agrupamentos de LHR na membrana citoplasmática (tamanho e
mobilidade lateral) difere quanto ao ligante (LH ou hCG) e o estado funcional
(dessensibilizados ou funcionais).
Herrlich et al., (1996) propuseram um modelo para a ativação do
LHR no momento da ovulação, sendo constituído por duas cascatas de
sinalização (proteínas G
s
e G
i
) onde a adenilciclase e a fosfolipase C seriam
ativadas, respectivamente. Os autores sugeriram que a concentração de LH e
os níveis de LHR deveriam estar suficientemente altos para efetivamente
estimular a adenilciclase e a fosfolipase C.
2.4. Atividade biológica das isoformas do LHR
Kawate et al. (2002) demonstraram que houve transporte e
posicionamento na superfície celular da isoforma do LHR com a deleção do
exon 10. Essa deleção resultou em afinidade diminuída ao LH em relação ao
hCG (GROMOLL et al., 2000; MÜLLER et al., 2003).
Das isoformas detectadas por Kawate et al. (2002) duas traduzem
proteínas funcionais (receptores acoplados a proteína G) com afinidades
distintas em relação aos ligantes. A isoforma completa (“full”) tem afinidade
pelo LH e hCG, enquanto que a isoforma com deleção do exon 10 tem
somente afinidade pelo hCG.
O exon 10 foi considerado essencial para o transporte do LHR
humano até a membrana citoplasmática (ZHANG et al., 1998). Quando os
transcritos alternativos perdem parte do exon 11, ocorre a síntese de um
receptor truncado pela introdução de um códon de parada precoce (ROBERT
et al., 2003, KAWATE, 2004). Esse LHR truncado não seria transportado até a
39
superfície celular, ficando aprisionado no citoplasma. Apesar de conservar a
capacidade de ligação, essa isoforma truncada não está corretamente
posicionada na membrana citoplasmática, além de não ser capaz de ativar a
proteína G, portanto é afuncional (KAWATE et al., 2002, KAWATE, 2004).
Hipóteses de cooperação de dímeros, trímeros ou oligômeros de
receptores, na obtenção de funcionalidade de receptores acoplados à proteína
G (mediando o transporte da isoforma completa, apresentação do ligante ao
receptor, ou o controle da biodisponibilidade do ligante), poderiam incluir uma
função para as isoformas truncadas (ROESS et al., 2000a; PIERCE et al.,
2002; ROBERT et al., 20003; NAKAMURA et al., 2004).
A variação biológica, na expressão do LHR, inclui até uma linhagem
de primatas (Platyrrhini) em que o exon 10 é naturalmente perdido durante a
transcrição (GROMOLL et al., 2003). Não havendo a forma completa (com o
exon 10) e sendo as espécies dessa subclasse sexualmente normais, a
evolução desses animais produziu um sistema único em mamíferos, em que
um hormônio estruturalmente semelhante ao hCG é produzido na hipófise em
detrimento ao LH. Essa gonadotrofina é responsável pela manutenção da
ativação do receptor de LH dessa subclasse de animais (LHR tipo II).
Uma tentativa prática para a ativação de qualquer isoforma de LHR,
presente na superfície celular, seria a administração de hCG ou de ambos os
ligantes (LH e hCG). Nogueira et al. (2005), induziram a ovulação de vacas
superestimuladas com LH (controle) ou LH e hCG (tratado) e não observaram
diferença significativa na produção total de estruturas ou de embriões viáveis.
2.5. “Down regulation”do LHR
A “down rwgulation” do LHR, é controlada por uma proteína ligadora
deste receptor (LRBP) que é ativada, ou sintetizada, em resposta ao pico pré
ovulatório de LH ou de doses farmacológicas de hCG (MENON et al., 2004). A
ligação da LRBP com a região codificante do RNAm forma um complexo
ribonucleoprotéico que inibe a tradução do LHR (NAIR & MENON, 2005).
Após a ligação do LH, ou do hCG, com o LHR, há aumento
intracelular de AMPc que promove a ativação da esteroidogênese e a depleção
40
do colesterol ovariano. Paralelamente há aumento da transcrição de genes
associados à síntese e transporte de colesterol do plasma para o interior da
célula (MENON et al., 2006) ocasionando aumento intracelular do colesterol e
regulação da esteroidogênese. Sob esta condição, a mevalonato quinase (MVK
enzima descrita como LRBP que participa do metabolismo do colesterol) se liga
ao RNAm que iria traduzir o LHR/hCGR e acelera sua degradação promovendo
a “down regulation” do receptor (MENON et al., 2006). A expressão de RNAm
de MVK e a proteína MVK foi induzida em resposta a tratamento prévio com
hCG. Segundo este modelo, a “down regulation” é realizada muito mais pela
rápida degradação do RNAm do LHR do que pela inibição da tradução do
RNAm em LHR. Wang et al. (2007), estabeleceram uma participação direta da
MVK regulando a expressão do LHR e sugeriram uma nova relação entre o
metabolismo do colesterol e a expressão de LHR no ovário.
41
3. MATERIAL E MÉTODO
O experimento foi realizado no município de Ribeirão do Sul, estado de
São Paulo, Brasil (latitude 22°47’03’’ e longitude 49°56’01’’). Foram utilizadas
novilhas nulíparas Nelore puras de origem (PO; Bos taurus indicus, n=20), com
faixa etária entre 20 a 24 meses, peso médio de 450 quilos, suplementadas
(concentrado, PB: 16% e NDT: 60%) 2 vezes ao dia, em regime de pasto
(Coast cross), com uma dieta de manutenção e acesso irrestrito a água e sal
mineralizado. Para facilitar o manejo durante a caracterização do momento do
desvio folicular, os animais foram numerados a fogo (1-20) e separados em 2
grupos (n=10, em cada grupo), sendo que estes, tiveram tratamentos idênticos.
Dez dias após o término de avaliação de um grupo, iniciou-se o estudo do
próximo.
3.1. Experimento 1- Etapa 1: Caracterização do momento do desvio de
crescimento folicular.
Para que todas as novilhas estivessem em estágio de
desenvolvimento folicular similar, foram submetidas ao seguinte protocolo de
sincronização da ovulação: no D-10 receberam um dispositivo intravaginal
liberador de progesterona, previamente utilizados por 8 dias (1,0 g, DIB
®
,
Syntex, Argentina), associado a aplicação de benzoato de estradiol (BE, 2,5
mg, Estrogin
®,
via IM). O dispositivo intravaginal foi removido no D-3 e os
animais receberam uma aplicação de PGF
2
α (d-cloprostenol, 500 µg, Prolise
®
,
IM). Vinte e quatro horas mais tarde administrou-se 1,0 mg de BE (via IM) e a
partir deste momento, o crescimento do folículo dominante foi acompanhado
através de exame ultra-sonográfico (US), realizado a cada 12 horas (Figura 1)
42
↓DIB ↑ DIB
BE PGF
2
α BE Ovulação
D -10 D -3 D -2 D0 D6
Figura 1. Protocolo de sincronização da ovulação e acompanhamento do
desenvolvimento folicular ovariano em novilhas Nelore (DIB = Dispositivo
Intravaginal Bovino, BE = Benzoato de estradiol, PGF
2
α = Prostaglandina F
2
α,
D = Dia, US = Exame Ultra-sonográfico, ↓ = inserção e ↑ = retirada.
3.1.2. Ultra-sonografia
Após a última aplicação de BE (D-2) o desenvolvimento dos folículos
≥ 1 mm de diâmetro foi acompanhado mediante US, realizada a cada 12 horas,
até o sexto dia após a ovulação, de forma a permitir a identificação do início do
desvio folicular.
Considerou-se como o momento da ovulação a média entre a última
vez que o folículo ovulatório foi visto e a primeira ocasião em que o mesmo não
foi detectado no monitor do ultra-som.
O transdutor de ultra-som (Aloka SSD 900; transdutor de 7,5 a 9,0
MHz) foi movimentado sobre a superfície dos ovários e, quando necessário, a
imagem do monitor foi congelada para mensuração do tamanho dos folículos (≥
1mm). Duas imagens diferentes de cada folículo foram congeladas e
mensuradas. Quando se observou acentuada diferença entre as mensurações,
obteve-se uma terceira imagem para confirmar o tamanho correto do folículo.
Após cada exame, foram desenhados diagramas da posição dos folículos em
relação a outras estruturas ovarianas, de forma a permitir a identificação de
cada folículo durante dias sucessivos.
US 12/12 h
43
O momento do desvio de crescimento folicular foi caracterizado
como o momento em que ocorreu a maior diferença na taxa de crescimento
entre os dois maiores folículos da onda.
3.2. Etapa 2: Abate e remoção dos ovários e avaliação da expressão do
LHR
Após a caracterização do desvio de crescimento folicular no
experimento 1, as novilhas foram novamente sincronizadas com o protocolo
citado acima e acompanhados por US para identificar o momento da ovulação
e separadas em 3 grupos: Grupo 2 dias após a ovulação (G2, n=6), 2,5 dias
após a ovulação (G2,5, n=7) e 3 dias após a ovulação (G3, n=7). Nas novilhas
do Grupo 2,5 e 3, o protocolo de sincronização da ovulação teve início 12 e 24
horas mais tarde em relação as novilhas dos grupos 2, respectivamente, para
permitir que os ovários dos animais pudessem ser removidos nos dias 2,0, 2,5
e 3,0 pós-ovulação.
As novilhas utilizadas no Experimento 2, não foram as mesmas
descritas na caracterização do desvio folicular (Experimento 1, realizado no
período entre dezembro/06 e março/07). Neste experimento 1, após a
obtenção dos ovários das novilhas utilizadas no estudo do desvio folicular, a
obtenção das células da granulosa foi realizada por meio de raspagem, com
pipeta de Pasteur adaptada, da cavidade folicular. Quando as amostras de
células da granulosa foram analisadas por RT-PCR, observou-se que a maioria
estava contaminada com células da teca, restando apenas o material de 4
novilhas que compunham o grupo 3. Portanto, outro lote composto por 21
novilhas Nelore PO foi utilizado para a análise da expressão do LHR
(Experimento 2, outubro/07).
As novilhas do experimento 2 foram abatidas, durante 3 dias
consecutivos no Frigorífico Beira Rio, município de Santa Cruz do Rio Pardo-
SP, para a obtenção dos ovários no seguinte esquema: primeiro dia, G2 (12
horas antes do momento previsto para a ocorrência do desvio folicular, ou seja
2 dias após a ovulação), segundo dia, G2,5 (próximo ao momento do
divergência folicular, 2,5 dias após a ovulação) e no terceiro dia, G3 (12 horas
44
após este momento, sendo que 2 novilhas (S e T) deste grupo, estavam a 5
dias após a ovulação, por terem antecipado a ovulação. Os animais foram
embarcados às 4 horas e abatidos as 6 horas da manhã do mesmo dia.
3.2.1. Classificação folicular
Os folículos foram agrupados em 3 classes de acordo com o estágio do
desenvolvimento folicular em que se encontravam no momento do abate: pré
desvio , próximo ao momento do desvio e pós desvio folicular. Para cada
novilha foram dissecados os dois ou três maiores folículos presentes em
ambos os ovários.
3.2.2. Dissecação dos folículos
Os ovários foram acondicionados em sacos plásticos contendo solução
fisiológica resfriada (4ºC), colocados dentro de uma caixa térmica e levados ao
laboratório (a 10 minutos do abatedouro). No laboratório, os folículos foram
dissecados com o auxílio de pinças e tesouras lavadas em tubos corning de 50
mL contendo seqüencialmente: água destilada, solução RNaseZap Ambion® e
água destilada novamente. Cada folículo foi mensurado com um paquímetro,
avaliando-se o diâmetro médio entre a altura e o comprimento.
3.2.3. Obtenção do fluido folicular
O fluido folicular foi aspirado com agulha de calibre 25x10 mm
acoplada a seringa de 1,0 mL, e congelado inicialmente a -196ºC, e
posteriormente em freezer (Forma Scientific
®
) a -80ºC para posterior análise
das concentrações de esteróides (estradiol e progesterona) por
radioimunoensaio. Estas análises serão realizadas posteriormente a
apresentação deste trabalho, devido ao atraso na entrega do KIT Estradiol
45
DSL-4400 (Diagnostics Systems Laboratoris, Texas, USA) e Progesterona DSL
3400 (Diagnostics Systems Laboratoris, Texas, USA).
3.2.4. Isolamento das células da granulosa
As células da granulosa foram isoladas por centrifugação do fluido
folicular e lavagem da cavidade folicular. O fluido folicular foi aspirado com
agulha de calibre 25x10 mm acoplada a seringa de 1,0 mL A seguir, solução
fisiológica estéril foi injetada e retirada da cavidade folicular repetidamente
(cerca de 8 vezes) para recuperação das células murais e o “cumuls oophorus”
(COC). Posteriormente, a solução foi centrifugada (3.300xg por 2 min) para
concentrar as células e possibilitar a remoção da solução fisiológica. O “pellet”
de células resultante foi imerso em 1 mL de solução Trizol, homogeneizado
(homogeneizador de tecidos Polytron – UltraTurrax/T-25) por 1 minuto e
congelado a -80ºC para posterior extração de RNA total através do protocolo
Trizol (Invitrogen). A concentração do RNA total recuperado foi mensurada
por espectrofotometria (Biophotometer-Eppendorf).
3.3. Extração do RNA total
Assim que as amostras foram descongeladas, adicionou-se 200µl de
clorofórmio nos tubos contendo o RNA com 1,0 mL de Trizol
. Após 15
segundos de agitação amostras foram incubadas a temperatura ambiente por
2,5 minutos e centrifugadas a 7.300xg por 15 minutos a 4ºC. O clorofórmio foi
utilizado para separar a amostra em duas fases: uma orgânica e outra
inorgânica ou aquosa. O halo branco é formado por proteínas e o rosa por
DNA. O RNA total permanece solubilizado exclusivamente na fase aquosa,
representada pelo sobrenadante transparente resultante da centrifugação.
Na etapa de precipitação do RNA total, a fase aquosa obtida
anteriormente foi transferida para outro tubo (polipropileno de 1,5 mL –
46
Eppendorf
®
), acrescida de 0,5 mL de álcool isopropílico e incubada à
temperatura ambiente por 10 minutos. Em seguida foi centrifugada a 7.300xg
durante 10 minutos à 4ºC, formando um “pellet”.
O sobrenadante foi removido e o RNA foi lavado com 1 mL de etanol a
75% e novamente centrifugado a 7.300xg por 5 minutos a 4ºC.
Após a retirada do excesso de líquido do tubo com auxílio de uma
pipeta, o RNA foi dissolvido em 10 µL de água GIBCO® e incubado por 10
minutos à 60ºC (Bloco aquecedor – Thermolyne Type 17600
®
) para finalmente
ser armazenado a - 80ºC.
3.4. RT-PCR
A expressão do RNAm codificador do LHR foi investigada por reação
de transcrição reversa seguida de reação em cadeia da polimerase (RT-PCR)
em células da granulosa. A expressão do gene constitutivamente expresso
gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH) foi utilizada como controle
interno da RT-PCR. Antes da reação de transcrição reversa, a fim de evitar que
contaminação com DNA genômico interferisse nos resultados, amostras de 1µg
de RNA total foram incubadas com DNAse (Invitrogen®). A reação de
transcrição reversa foi realizada utilizando-se iniciador (“primer”) oligo (dt), de
acordo com o protocolo SuperScript III (Invitrogen®).
3.4.1. Protocolo DNAse I
Conforme as instruções do protocolo DNAse I - Amplification Grade
(Invitrogen
®
), o RNA total destinado a reação de transcrição reversa foi
transferido para microtubo estéril, onde acrescentou-se 1 µL de tampão (Buffer
Kit DNAse), 1 µL de DNAse I (1 U/µL) e água destilada tratada com DEPC
(dietilpirocarbonato) e autoclavada na quantidade suficiente para completar 10
µL de solução. Essa solução permaneceu à temperatura ambiente durante 15
minutos e, em seguida, foi acrescida de 1 µL de EDTA (25 mM) e incubada a
47
65ºC por 10 minutos. Após a incubação, as amostras foram transferidas para
gelo e imediatamente submetidas à reação de transcrição reversa.
3.4.2. Reação de transcrição reversa (RT)
Para a reação de transcrição reversa, foi utilizado o kit SuperScript III
(Invitrogen
®
), cujo protocolo iniciou-se pela adição em microtubo estéril de 8µL
da solução de RNA total tratada com DNAse I (contendo 1µg de RNA total
proveniente das células da granulosa), 1 µL de oligonucleotídeo iniciador Oligo
(DT) (500 µg/mL) e 1 µL de dNTP Mix (10 mM). Esta solução foi incubada a
65ºC por 5 minutos e, em seguida, incubada em gelo por 1 minuto e meio.
Após a última incubação, adicionou-se à solução 4 µL de tampão “First Strand”
5X, 1 µL de DTT (0,1M), 1 µl de “RNAseOUT Inhibitor” (40 U/µL) e 1µl (200 U)
de SuperScript III RT (transcriptase reversa). Na seqüência, a solução foi
incubada a 50ºC por 50 minutos, seguida de 70ºC por 15 minutos e, finalmente,
em gelo por 2 minutos. Em seguida, as amostras foram mantidas em gelo para
utilização imediata no PCR ou armazenadas a -20ºC.
3.4.3. Reação em cadeia da polimerase (PCR)
Os oligonucleotídeos iniciadores utilizados para amplificação do LHR
foram delineados com base na seqüência para o gene bovino disponível no
GenBank (acesso MM_174381, descrito por NOGUEIRA et al., 2007, Tabela 1).
O oligonucleotídeo iniciador “sense” foi posicionado no exon 9 e o “anti-sense”
no exon 11 (Figura 2), a fim de amplificar todas as regiões do receptor. As 4
isoformas do LHRB pesquisadas foram: M1 (forma completa do gene “full
length”), M2 (deleção do exon 10), M3 (deleção da porção proximal do exon 11)
e M4 (deleção do exon 10 e parte da porção proximal do exon 11). “Primers”
para o gene GAPDH foram incluídos no RT-PCR, já que a expressão deste gene
foi utilizada como referência para a quantificação da expressão dos receptores
48
de LH (técnica semiquantitativa). A fim de detectar a contaminação das amostras
de células da granulosa com as da teca, investigou-se a expressão da CYP17,
característica das células da teca (Tabela 1). As amostras que apresentaram
contaminação foram descartadas do experimento de quantificação da expressão
gênica do LHR (Figura 6).
Para a amplificação desses transcritos pela reação em cadeia da
polimerase (PCR) utilizou-se o protocolo Platinum TaqDNA Polimerase
Invitrogen
®
. Ao produto (0,5 uL cDNA) foi acrescido: 2,5 µL de tampão PCR
10X (fornecido no Kit - Invitrogen
®
); 0,75 µL de MgCl
2
(50mM); 0,5 µL de dNTP
Mix (0,2mM); oligonucleotídeos iniciadores “sense” e “antisense”; 1,25 uL de
Platinum Taq DNA polimerase; água destilada autoclavada para completar 25
µL. Na seqüência, as amostras foram desnaturadas a 94
o
C por 3 minutos no
termociclador (MJ Research PTC 200
®
), as temperaturas e tempos de
desnaturação, anelamento e extensão, específicas para cada gene foram
descritas por Nogueira et al., (2007).
Figura 2- Estrutura e disposição dos exons no gene codificador do LHR. Os
números (1 a 11) indicam os exons; TM = domínio transmembrânico; IC =
região intracelular; UTR = região não traduzida.
LHRBC
LHRBC
49
Tabela 1 – Seqüência dos oligonucleotídeos iniciadores utilizados para
amplificação do GAPDH, M1, M2. M3 e M4 e da 17α hidroxilase.
Gene Alvo Seqüência Fragmento
GAPDH
S 5`tgt tcc agt atg att cca ccc 3’
A 5’tcc acc acc ctg ttg ctg 3’
850 pb
1240 pb (M1)
1159 pb (M2)
975 pb (M3)
LHR
S 5’aaa ctt gcc aac aaa cga 3’
A 5’ata gca agt ctt gtc cag ga 3’
894 pb (M4)
17αhidroxilase
(CYP 17)
S 5’gaa tgc ctt tgc cct gtt ca3’
A 5’cgc gtt tga aca caa ccc tt3’
330 pb
S = “sense”; A = “antisense”; pb = pares de bases.
3.4.5. Eletroforese em gel de agarose
Os produtos da PCR foram submetidos à eletroforese (100V por 4
horas) em gel de agarose a 3,0% em tampão Buffer. O gel foi corado em
solução de brometo de etídio (1µg/mL) durante 30 minutos. O “DNA ladder
100bp” (Invitrogen
®
) foi utilizado como referência para avaliar o tamanho dos
fragmentos amplificados. As imagens dos géis foram visualizadas mediante
exposição do gel à luz UV e digitalizados no equipamento ImageMaster
(PharmaciaBiotech®) para posterior análise por densitometria das bandas.
3.5 Comparação entre as medidas foliculares obtidas pelo US e
paquímetro
Para comparar os diâmetros foliculares obtidos através de exames
ultra-sonográficos com aqueles oriundos de mensurações realizadas com
50
um paquímetro, folículos provenientes de ovários de abatedouro foram
dissecados e mensurados pelos dois métodos. Cada ovário (n=14) foi
colocado dentro de um saco plástico transparente contendo gel (Carbogel
,
Brasil) e o transdutor era movimentado sobre a superfície do saco plástico
para obtenção das imagens e mensuração do diâmetro folicular. Os folículo
selecionados foram divididos em 2 grupos: grupo F5 (diametro folicular 4,9 ±
0,34mm, n =7) e grupo F9 (diâmetro folicular 9,1 ± 0,36mm, n=7). A seguir,
os mesmos folículos utilizados na ultra-sonografia foram dissecados e o
diâmetro dos mesmos foi aferido com um paquímetro (com escala de 1 mm).
3.6 Análise Estatística
A determinação do momento esperado para a ocorrência do desvio ou
divergência folicular, bem como o diâmetro dos dois maiores folículos neste
momento, foi realizado de duas formas: 1) através de análise visual do gráfico
de cada novilha, contendo os dados sobre o crescimento dos dois maiores
folículos ovarianos e 2) por meio do modelo matemático de Regressão Linear
Segmentada descrito por BERGFELT et al. (2003). Para testar se houve
diferença estatística ou não entre os resultados obtidos através da análise
visual (1) ou por meio do modelo matemático (2) e a taxa de crescimento entre
os dois maiores folículos antes do momento do desvio, utilizou-se o Test-t de
Student. Para as comparações entre as medidas foliculares obtidas pelo US e
o paquímetro foi utilizado o Test-t de Student
Para a expressão dos receptores do LH, as comparações foram feitas
entre os grupos 2,5 e 3,0, uma vez que no grupo 2 essa expressão foi nula. A
comparação entre os grupos 2,5 e 3,0 foi realizada por meio de análise de
variância e os dados transformados em Log (X+0,1). As comparações entre as
quatro isoformas do LHR foram feitas através de análise de medidas repetidas.
Foram consideradas significativas as diferenças com valor de p<0,05. A análise
foi realizada utilizando o programa
SAS (Intitute, Cary, NC).
51
4. RESULTADOS
4.1 Caracterização do momento do desvio folicular (experimento1)
Das 20 novilhas utilizadas inicialmente no experimento 1, 5 não
ovularam e 5 perderam condição corporal (aproximadamente 1 ponto de escore
corporal, na escala 1-5, LOWMAN, 1976) durante as avaliações ultra-
sonográficas, conseqüentemente, foram excluídas do experimento.
O uso do método gráfico forneceu resultados semelhantes aos obtidos
por meio de regressão linear segmentada (Tabela 2). Ao analisar
retrospectivamente os diagramas de cada novilha (n=10), observou-se o
surgimento de um grupo de folículos (em média 10,2 ± 4,08 folículos por
novilha), doze horas antes da ovulação, caracterizando a emergência de uma
onda folicular. Neste momento, os diâmetros médios do maior folículo e dos
demais folículos, foram de 2,7 ± 0,11 mm e 2,2 ± 0,21 mm No momento da
ovulação (ou seja, 12 horas após a observação da emergência), o número de
folículos recrutados aumentou para 14,9 ± 2,96.
Em 80% (8) das novilhas o futuro folículo dominante era maior folículo
(2,67±0,09mm) que os subordinados (2,02 ± 0,1mm, p<0,001) já na
emergência da onda, ou seja, 12 horas após a ovulação.
O desvio de crescimento folicular ocorreu 2,3 ± 0,21 dias após a
ovulação e os diâmetros foliculares foram de 5,3 ± 0,21 e de 4,9 ± 0,05 mm,
para o folículo dominante e subordinado, respectivamente (regressão linear
segmentada, Figura 3 e Tabela 2). Nas novilhas 6 e 5, a ocorrência da
divergência folicular foi atípica em relação as demais, ocorrendo 1,5 e 4 dias
após a ovulação, respectivamente.
A taxa de crescimento, determinada a partir de 12 horas antes da
ovulação até o momento do desvio folicular, foi semelhante entre o futuro
folículo dominante (0,53 ± 0,15 mm) e o maior folículo subordinado (0,53 ± 0,22
mm).
52
0
2
4
6
8
10
-
1
2
0
1
2
2
4
3
6
4
8
6
0
7
2
8
4
9
6
1
0
8
1
2
0
1
3
2
Horas em relação a ovulação
Diâmetro folicular (mm)
F1
F2
Figura 3 - Diâmetro (± EPM) dos dois maiores folículos (F1 = folículo
dominante e F2 = folículo subordinado) da onda de crescimento folicular, a
partir de 12 horas antes da ovulação (- 12) até 132 horas após. Momento do
desvio de crescimento folicular indicado pela seta.
53
Tabela 2- Momento do desvio (dias após a ovulação) e diâmetro folicular (mm)
determinados pelo método gráfico ou por regressão linear segmentada, em
novilhas Nelore. FD = folículo dominante, EPM = erro padrão da média.
Método gráfico Regressão linear segmentada
Novilha dias
após ovulação
FD
(mm)
dias
após ovulação
FD
(mm)
2 2,5 4,7 2 4,6
4 2 5,6 1,9 5,6
5 4 6,3 3,8 6,4
6 1,5 4,3 1,5 4,2
9 2 6,5 2 6,5
10 2 5 2 5,1
11 2 6,5 2 6,5
12 2,5 5 2,4 4,8
14 2,5 5,2 2,6 5
15 2 4,4 2,2 4,6
Média±EPM
2,3±0,21
5,3±0,21
2,24±0,19
5,36±0,27
Não houve diferença significativa entre os grupos (método gráfico vs regressão linear
segmentada), Teste-t (p>0,05)
54
4.2. Avaliação da expressão do LHR (experimentos 1 e 2)
O grupo 2 era composto por 6 novilhas, porém, o animal S, antecipou a
ovulação em 48 horas e passou para o grupo 3. Portanto, restaram 5 novilhas
neste grupo. Das 7 novilhas do grupo 2,5, 2 não ovularam e as amostras dos
folículos de outra não expressaram GAPDH e foram excluídas do experimento
(restaram 4 novilhas neste grupo). Das 8 novilhas do grupo 3, as amostras de
duas delas foram negativas para o GAPDH e, conseqüentemente, essa
novilhas foram retiradas do grupo. Além das amostras da novilha 13, as de
outras 4 novilhas oriundas do experimento 1 (novilhas N, O, P e Q), foram
incluídas neste grupo (número total de novilhas do grupo 3 = 11).
No grupo 2 não foi detectada expressão de nenhuma isoforrma de LHR
nos 6 folículos oriundos dos 5 animais deste grupo apesar destes folículos
expressarem o GAPDH. Já nos animais do grupo 2,5 (n=4), dos 8 folículos
examinados, 4 foram classificados como dominantes e destes, dois (50%)
expressaram LHR. Por outro lado, 63,63% dos folículos do grupo 3
classificados como dominantes (n=11) expressaram LHR (Tabela 03 e Figura
7).
Nos folículos classificados como dominantes, de acordo com o exame
ultra-sonográfico realizado no dia da ovulação, não houve diferença
significativa na porcentagem de folículos que expressarm do RNAm do LHR
(p=0,74) nos folículos provenientes dos grupos 2,5 e 3,0 (Figura 4).
Em todas as outras amostras foliculares que expressaram o receptor
do LH, as quatro isoformas estiveram presentes, exceto um folículo da novilha
N, que não expressou a isoforma M4 (Tabela 3).
A expressão das isoformas M1 e M3 foi detectada com maior
intensidade do que as M2 e M4 (p < 0,001, Figura 5).
55
Tabela 3- Identificação da novilha, grupo experimental, diâmetro folicular (mm)
e porcentagem de expressão relativa ao GAPDH das isoformas do LHR (M1 a
M4) nas células da granulosa, obtidas de novilhas da raça Nelore sacrificadas
2 (G2), 2,5 (G 2,5 e 3,0 (G3) dias após a ovulação.
Isoformas do LHR
Novilha Grupo Folículo(mm)
M1 M2 M3 M4
A 2 5,5 - - - -
B 2 5,5 - - - -
B 2 4,5 - - - -
C 2 5,5 - - - -
D 2 5 - - - -
E 2 6,7 - - - -
F 2,5 7 60,23 17,09 51,70 8,09
F 2,5 6 - - - -
G 2,5 7 20,26 2,97 15,08 2,88
G 2,5 5 - - - -
H 2,5 7 - - - -
H 2,5 6 - - - -
I 2,5 7 - - - -
I 2,5 6,2 - - - -
J 3 7 - - - -
J 3 9 35,25 17,55 26,91 12,95
K 3 9 - - - -
L 3 7 - - - -
L 3 8 37,40 12,40 32,71 11,40
M 3 7 - - - -
N
+
3 10 13 1 7 0
N
+
3 5 - - - -
O
+
3 8,5 57 16 47 7
O
+
3 6 - - - -
P
+
3 6,5 - - - -
P
+
3 8,2 - - - -
Q
+
3 7,5 10 3 6 1
Q
+
3 5 - - - -
R 3 10 59,15 25,97 55,68 22,53
R 3 7 - - - -
S 3 14 100,64
19,13 63,61 14,06
S 3 8 11,40 3,03 5,82 2,82
T 3 11 - - - -
T 3 6 - - - -
+
Novilhas provenientes do experimento 1
56
6
0
4
2
11
7
0
2
4
6
8
10
12
número de folículos
G2 G2,5 G3
Total de Folículos
Folículos que
expressaram LHR
Figura 4 – Total de folículos por grupo de novilhas da raça Nelore sacrificadas
2 (G2), 2,5 (G 2,5 e 3,0 (G3) dias após a ovulação e quantidade de folículos
que expressaram LHR (p=0,74).
0
100
200
300
400
Porcentagem relativa acumulada da
expressão da isoforma
M1* M2 M3* M4
Isoformas do LHR
G2
G2,5
G3
Figura 5 – Porcentagem relativa acumulada da expressão das quatro
isoformas do LHR (M1, M2, M3 e M4) nas células da granulosa dos folículos
dos Grupos de novilhas da raça Nelore sacrificadas 2 (G2), 2,5 (G 2,5 e 3,0
(G3) dias após a ovulação.
* A expressão das isoformas M1 e M3 foi detectada com maior intensidade do
que as M2 e M4 (p < 0,001).
57
58
59
4.3. Comparação entre as medidas foliculares obtidas por meio de ultra-
sonografia vs paquímetro
Os folículos selecionados pela ultra-sonografia foram divididos em 2
grupos: grupo F5 (diâmetro folicular = 4,9±0,34mm, n =7) e grupo F9 (diâmetro
folicular= 9,1±0,36mm, n=7) e, a seguir, foram dissecados e mensurados com
o auxílio de um paquímetro. Os diâmetros foliculares determinados por meio de
ultra-sonografia foram significantemente inferiores aos determinados com
paquímetro (Tabela 4).
Tabela 4- Grupos de folículos (F5 e F9), diâmetro folicular (mm) obtido por
meio de ultra-sonografia (US) ou com auxílio de um paquímetro e, diferença
(mm) entre as mensurações obtidas pela US e pelo paquímetro.
GRUPO F5 GRUPO F9
US
(mm)
Paquímetro
(mm)
Diferença
(mm)
US
(mm)
Paquímetro
(mm)
Diferença
(mm)
4 5,3 1,3 10,1 11,2 1,1
4,1 5,6 1,5 9,7 10,5 0,8
4,8 6 1,2 8,8 10,3 1,5
6,2 7,5 1,3 7,5 9 1,5
5,3 5,9 0,6 8,4 10 1,6
5,9 7 1,1 9,5 10,6 1,1
4 5,3 1,3 10,1 11,2 1,1
+
4,9±0,34
b
6±0,32
c
1,18±0,10
a
9,1±0,36
d
10,4±0,28
e
1,24±0,10
a
+
Média ±EPM
a-e
Valores com sobrescritos diferentes, diferem entre si (p<0,05).
60
5. DISCUSSÃO
Neste experimento, a emergência da onda de crescimento folicular
ocorreu 12 horas antes da ovulação, caracterizada pelo recrutamento de um
grupo de folículos ≥1,8 mm. De maneira semelhante, Jaiswal et al. (2004),
observaram o aparecimento de um grupo de folículos de 1 a 3 mm, 48 horas
antes da ovulação. Entretanto, estudos anteriores, definem como emergência
da onda, o momento da visualização de folículos ≥3 mm, 24 horas após a
ovulação (GINTHER et al., 1996; SARTORELI et al., 2005; CASTILHO et al.,
2007). A disparidade entre esses dados pode ser explicada pelos aparelhos de
ultra-som utilizados nos experimentos anteriores. Tanto neste experimento,
como no de Jaiswal et al. (2004), os exames ultrasonográficos foram realizados
com transdutor de 9,0 MHz que permite a visualização de folículos com ≥ 1,0
mm, o que não é possível com aparelhos com probes de 5 a 7,5 MHz,
utilizados nos outros estudos.
A detecção do grupo de folículos de 1 a 3 mm, descritos por
Jaiswal et al. (2004) coincidiu com o início do aumento das concentrações de
FSH. De fato, a emergência da primeira onda folicular ocorre antes da
ovulação, pois, segundo Adams et al. (1992) o aumento nas concentrações de
FSH, inicia-se entre 2 e 4 dias (~48 a 96 h) antes da detecção ultra-sonográfica
de folículos ≥ 4mm, Além disso, vários trabalhos, in vitro, têm demonstrado que
pequenos folículos antrais, com apenas uma camada de células da granulosa
são responsivos ao FSH (RICHARDS & MIDGLEY, 1976, FRICKE et al., 1997;
TANAKA et al., 2001).
O intervalo entre a ovulação e o desvio folicular encontrado neste
estudo foi de 2,3 dias, com o maior folículo medindo 5,3mm e o segundo maior
4,9mm. Estes dados estão de acordos com os descritos anteriormente na raça
Nelore, (desvio folícular 2,4 a 2,8 dias após ovulação e maior folículo medindo
entre 5,4 a 6,2 mm; SARTORELLI et al., 2005; CASTILHO et al., 2007,
GIMENES et al., 2008). Entretanto, em novilhas da raça Holandesa (Bos taurus
taurus) apesar do desvio folicular ocorrer 2 a 3 dias após a ovulação, o
diâmetro do maior folículo (futuro folículo dominante = 8,5 mm) é cerca de 2,5
mm maior que o observado na raça Nelore, enquanto que o segundo maior
folículo possui 7,2 mm no momento do desvio (GINTHER et al., 1996).
61
No presente trabalho, na emergência da onda folicular, o futuro folículo
dominante, já era maior (2,67mm) que os demais folículos (2,02mm) da onda, o
que lhe garantiu, no momento do desvio, uma vantagem de 0,4mm de
diâmetro. De maneira semelhante, em novilhas Hereford cruzadas, o futuro
folículo dominante, foi detectado com 1 mm no momento da emergência antes
que os demais do grupo fossem visualizados; e no momento do desvio, o
diâmetro deste folículo foi 0,7 mm maior do que os demais folículos (JAISWAL
et al., 2004). No entanto, em novilhas Nelore, Castilho et al. (2007), não
observaram diferença em tamanho nos dois maiores folículos da onda no
momento de desvio (5,4 vs 5,3 mm).
A média de crescimento (0,5 mm a cada 12 h) foi semelhante entre o
futuro folículo dominante e seu subordinado até o momento do desvio. Dados
semelhantes são mencionados em estudos com a raça Nelore (SARTORELLI
et al., 2005; CASTILHO et al., 2007). Em novilhas Holandesas, a média de
crescimento foi de 0,5 mm a cada 8 horas (GINTHER et al., 2003).
As disparidades encontradas entre zebuínos e taurinos, quanto ao
tamanho folicular e o momento do desvio, não estão bem elucidadas, porém
podem ser decorrentes de interferências de fatores raciais, climáticos,
nutricionais.
Existem evidências na literatura de que a aquisição de receptores de
LH (LHR, BODENSTEINER et al., 1996, BEG et al., 2001) é importante para a
manutenção do folículo selecionado após a diminuição nos níveis sanguíneos
de FSH. Além disso, discute-se também a possível participação do LH no início
do processo de desvio folicular. Segundo Ginther et al. (2001), as células da
granulosa do futuro folículo dominante adquirem receptores de LH pouco antes
do início do desvio, os quais poderiam ser ativados pelo aumento transitório de
LH .
Nos folículos do Grupo 2 (4,5 a 6,7 mm de diâmetro), não se detectou a
expressão de LHR nas células da granulosa (0/6). Essa expressão, foi
primeiramente detectada em 2 amostras provenientes de folículos com 7 mm
de diâmetro, de duas novilhas (F e G) do grupo G2,5. Entretanto, é provável
que nestas novilhas o momento do desvio tenha ocorrido antes do momento
esperado (2,3-2,8 dias), a exemplo do que ocorreu com a novilha 6
(Experimento 1, 1,5 dias), e, conseqüentemente, estes animais já teriam
62
passado a fase de desvio folicular. Reforçando essa hipótese, a diferença de
tamanho encontrada entre os dois maiores folículos na novilha G foi de 2 mm,
indicando que a dominância morfológica já estava bem definida, no momento
da obtenção de seus folículos. Por outro lado, as células da granulosa dos
folículos das novilhas H e I (ambos com 7 mm), não expressaram LHR,
possivelmente por ainda não terem atingido o momento do desvio folicular.
Estas suposições poderão ser comprovadas após a determinação das
concentrações de estradiol e progesterona no fluido folicular, uma vez que a
relação estradiol/progesterona permite distinguir os folículos dominantes dos
atrésicos.
No presente trabalho, o fato de não se ter observado a expressão do
LHR em nenhuma amostra do grupo 2 (0/6), evidencia que a aquisição de tais
receptores, nas células da granulosa, ocorre somente em folículos com ≥ 7
mm. Estes dados corroboram os já descritos em animais anelorados (a
expressão do LHR foi primeiramente detectada em folículos de 7mm;
NOGUEIRA et al. 2007) e também em novilhas Hereford (expressão ocorrendo
em folículos a partir de 9mm, XU et al., 1995). No entanto, contrariam a
hipótese levantada por Beg et al. (2001), segundos os quais a expressão dos
receptores de LH nas células da granulosa do futuro folículo dominante
ocorreria cerca de 8 h antes do desvio folicular. Considerando-se esta hipótese
(Beg et al., 2001), no presente trabalho a expressão do LHR deveria estar
ocorrendo 8 h antes do desvio, ou seja, em folículos com diâmetro inferior a 5,4
mm, que corresponderia as amostras do Grupo 2. Entretanto, como as
mensurações dos diâmetros dos folículos utilizados para detecção do LHR,
foram feitas com paquímetro, que forneceu resultados em média 1,18 mm
maiores que as obtidos pelo ultra-som, o diâmetro de 5,4 mm obtido por meio
de ultra-sonografia corresponderia a 6,6 mm do paquímetro, ou seja, após
ocorrência do desvio folicular em novilhas Nelore.
Ainda existe controvérsia na literatura com relação ao papel do LH no
processo de desvio folicular. Parte do problema se deve às diferentes técnicas
utilizadas para detectar o RNAm para LHR (hibridização in situ vs RT-PCR) e a
validação das mesmas para as diferentes isoformas do receptor de LH. Evans
& Fortune (1996), não observaram o RNAm do LHR nas células da granulosa
do folículo dominante ou do maior folículo subordinado no segundo e terceiro
63
dias da onda folicular (momento do desvio), ao utilizarem técnica de
hibridização in situ. Utilizando esta mesma técnica, Yuan et al. (1998)
observaram expressão de LHR somente em folículos ≥9mm, 60 horas após a
emergência da onda. Entretanto, por RT-PCR, a expressão do LHR foi
confirmada em folículos com 8 mm de diâmetro, o que corresponde, a 8 horas
antes do momento esperado para a ocorrência do desvio de crescimento
folicular em taurinos (BEG et al., 2001).
Apesar do mecanismo preciso para a seleção do folículo dominante
ainda não estar completamente elucidado, sabe-se que durante este evento
além do possível papel do LH e seus receptores, estão também envolvidos os
fatores de crescimento semelhante a insulina (IGFs), que parecem
desempenhar papel crítico neste processo. Os IGFs são sinérgicos ao FSH na
promoção de crescimento folicular e produção de estradiol (FORTUNE et al.,
2004). O aumento nas concentrações intrafoliculares deste esteróide, bem
como os de ativina A e a diminuição dos níveis de IGFBP-2 e -4, estão
relacionados a dominância folicular (GINTHER et al., 2002; KOJIMA et al.,
2003).
A redução das proteínas ligantes de IGF (IGBPs) tem sido associada a
aumento da atividade proteolítica da proteína sérica A associada a prenhez
(PAPP-A, MONGET et al., 2003) e a expressão de seu RNAm é mais
abundante no folículo dominante em crescimento nos bovinos do que em
folículo pequenos não selecionados (FAYAD et al., 2004, FORTUNE et al.,
2004). Além disso, a PAPP-A é responsável pela degradação de IGFBP-2,
levando ao aumento da biodisponibilidade de IGF (MONGET et al., 2003).
Embora não se tenha encontrado diferenças nas concentrações de IGF total de
folículos dominantes em relação aos subordinados (DE LA SOTA et al., 1996),
a concentração de IGF-I livre foi maior no fluido folicular do maior folículo
comparado ao segundo maior da mesma onda, mesmo antes da observação
de diferenças no diâmetro e na concentração de estradiol (BEG et al., 2002).
Essas observações, sugerem a existência de um sistema modulador da
disponibilidade de IGF intra-folicular, diferencialmente regulado em folículos
dominantes e subordinados, o que permitiria ao maior folículo, ter uma
dominância bioquímica antes do estabelecimento da dominância morfológica
(FORTUNE et al., 2004).
64
O fato da expressão do LHR ter ocorrido nas células da granulosa de
folículos ≥ 7mm, reforça a hipótese de que a capacidade ovulatória folicular é
adquirida após o desvio de crescimento folicular. Sartori et al. (2001),
observaram que em vacas Holandesas, a administração de LH induziu 80% de
ovulação nos animais com folículos ≥ 10mm e nenhum resposta nas vacas com
folículos de 7 ou 8,5 mm. No grupo de vacas com folículos de 7 e 8,5mm
(tamanho folicular próximo ao momento de desvio) não houve ovulação. Em
estudo similar realizado com a raça Nelore, a administração de LH exógeno
promoveu ovulação em 90, 80 e 33% das novilhas com folículos > 10 mm, de
8,5 a 10 mm e de 7 a 8,4 mm, respectivamente (GIMENES et al., 2008). Em
vacas Nelore, a administração de LH induziu ovulação em 90% dos animais
com folículos entre 9 e 10 mm e 20% nas vacas com folículos entre 7,5 e 8,0
mm de diâmetro (comunicação pessoal, SIMÕES, R.A.L.)
Nas novilhas abatidas 3 dias após a ovulação (grupo 3, pós-desvio), foi
possível determinar, de acordo com o diâmetro folicular, quais eram os folículos
dominantes e subordinados. Nestes animais, 63,63% (7/11) dos folículos
classificados como dominantes (7,5 a 14 mm) expressaram as 4 isoformas de
LHR. Curiosamente, duas amostras de uma mesma novilha (novilha S),
obtidas de um folículos de 8 e outro de 14 mm, expressaram o LHR. No
entanto, quando se compara a concentração das isoformas (M1 a M4)
presentes em ambos, nota-se que no menor folículo (8 mm) a intensidade de
expressão foi menos acentuada em relação ao maior (14 mm). Uma possível
explicação para este achado surpreendente seria a ocorrência de um processo
de dominância apenas parcial, exercida pelo folículo de 14 mm, resultando
numa atresia mais tardia do folículo de 8mm. Por outro lado, no folículo de 11
mm da novilha T, não foi detectada expressão de LHR. Este folículo poderia
estar em atresia caso o animal apresentasse ciclo estral de três ou quatro
ondas foliculares.
A presença dos 4 transcritos do LHR foi confirmada em todas as
amostras que expressaram este receptor, exceto um folículo na novilha N, que
não expressou a isoforma M4. Além disso, as isoformas M1 e M3
apresentaram maior intensidade de expressão em relação as M2 e M4, à
semelhança dos resultados obtidos por Nogueira (2005a). O significado
biológico deste predomínio de expressão das isoformas M1 e M3 ainda não é
65
conhecido. Entretanto, ABDENNEBI et al. (2002) relataram que em ovinos o
transcrito com deleção do exon 10 e parcial do 11 (M4), foi mais expresso
durante o anestro estacional, enquanto que durante a fase reprodutiva
predominou a expressão do transcrito completo (M1) e sugeriram que esses
dados poderiam explicar a estacionalidade reprodutiva na espécie ovina. Por
outro lado, em primatas observou-se uma variação biológica, na expressão do
LHR, em que o exon 10 é naturalmente perdido durante a transcrição
(GROMOLL et al., 2003). A isoforma que apresenta deleção do exon 10 (M2),
resulta em afinidade diminuída ao LH em relação ao hCG (Muller et al., 2003).
O exon 10 foi considerado essencial para o transporte do LHR humano até a
membrana citoplasmática (ZHANG et al., 1998). Quando os transcritos
alternativos perdem parte do exon 11 (M3 e M4), ocorre a síntese de um
receptor truncado pela introdução de um códon de parada precoce (ROBERT
et al., 2003, KAWATE, 2004). Esse LHR truncado não seria transpostado até a
superfície celular, ficando aprisionado no citoplasma. Apesar de conservar a
capacidade de ligação, essa isoforma truncada não está corretamente
posicionada na membrana citoplasmática, além de não ser capaz de ativar a
proteína G, portanto é afuncional (KAWATE et al., 2002, KAWATE, 2004).
66
6. CONCLUSÕES
1) Em novilhas Nelore, a emergência da onda de crescimento folicular
ocorre 12 horas antes da ovulação, sendo que neste momento o futuro folículo
dominante já era 0,4mm maior em relação aos seus contemporâneos.
2) O desvio de crescimento folicular ocorre em média, 2,3 dias após a
ovulação e os diâmetros do maior e do segundo maior folículos neste
momento, foram de 5,4 e 4,9mm, respectivamente.
3) As medidas foliculares obtidas por meio de paquímetro, são em
média, 1,18mm maiores daquelas obtidas por ultrasonografia.
4) A expressão das isoformas de LHR ocorre nas células da granulosa
de folículos antrais, a partir do momento do desvio folicular.
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80
Isoforms of luteinizing hormone receptor (LHR) gene expression in granulosa
cells before, during and after follicular deviation in Nelore heifers.
Abstract
The main objective of the present work was to evaluate the expression of LHR
isoforms in granulosa cells from Nelore heifers, before, during and after follicule
deviation. To characterize the time of follicle deviation (Experiment 1, phase 1),
Nellore heifers (n=20) were submitted to the following synchronization protocol:
at Day -10 (D -10) they received an intravaginal progesterone releasing device
(1.0 g, DIB
®
) and estradiol benzoate (BE, 2.5 mg, Estrogin
®
, i.m.). Intravaginal
device was removed on D -3 and animals received PGF
2
α (d-cloprostenol, 500
µg, Prolise
®
, i.m.). Twenty four hours afterwards 1.0 mg de BE (i.m.) was
administered and follicular growth of the dominant follicle was registered by
ultrasonography (US, Aloka SSD 900; 7.5 to 9.0 MHz probe) performed every
12 h until 144 h after ovulation. In the second phase of this experiment
expression of isoforms of LH receptors (M1, M2, M3 and M4) from granullosa
cells obtained from follicles before, during and after the expected time of follicle
deviation, were evaluated. The same heifers used on phase 1 were submitted
to the protocol described above to synchronize ovulation, and randomly
allocated in three groups (phase 2): Group 2 (G2, 2 days after ovulation, i.e.,
before the expect time of deviation, n=7), Group 2.5 (G2.5, 2.5 days after
ovulation, i.e., during deviation, n=7) and Group 3 (G3, 3 days after ovulation,
i.e., after deviation). The animals were slaughtered 2.0, 2.5, and 3 days after
ovulation to remove the ovaries, and granullosa cells from ovarian follicles were
separated for total RNA extraction with Trizol. Gene expression of LHR
isoforms were determined by RT-PCR. In experiment 2, another group of
Nellore heifers (n=21) was exposed to the same procedures described in the
second phase of experiment 1, to increase the number of samples from
granullosa cells that expressed LHR isoforms. In experiment 1 (phase 1), a
new follicular wave emerged 12 h before ovulation, and deviation occurred 2.3
days after ovulation (at this time the diameter of dominant and subordinate
follicles were 5.4 and 4.9 mm, respectively). In the second phase (experiments
1 and 2), there was no expression of LHR in follicles with 4.5 to 6.7 mm (G2).
81
LHR expression was first detected in two samples from 7 mm follicles (G2.5),
and was more evident in samples from G3 (3 days after ovulation). It is
concluded that LHR expression, in granulosa cells from Nelore heifers, occurs
during and after follicle deviation.
Key words: gene expression, LHR, Nelore, RT-PCR, Bos taurus indicus
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