( PDF ) Estudos computacionais da interação de porfirinas e seus complexos de ferro com albumina sérica humana

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Teobaldo Ricardo Cuya Guizado

ESTUDOS COMPUTACIONAIS DA INTERAÇÃO DE

PORFIRINAS E SEUS COMPLEXOS DE FERRO COM

ALBUMINA SÉRICA HUMANA

Dissertação de Mestrado

Dissertação apresentada como requisito parcial para

obtenção do grau de Mestre pelo Programa de Pós-

Graduação em Física do Departamento de Física da

PUC-Rio.

Orientadora: Sônia Renaux Wanderley Louro

Co-Orientador: Pedro Geraldo Pascutti

Rio de Janeiro, março de 2008

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Teobaldo Ricardo Cuya Guizado

Estudos Computacionais da Interação de Porfirinas

e seus Complexos de Ferro com Albumina Sérica Humana

Dissertação apresentada como requisito parcial para obtenção do grau de

Mestre pelo Programa de Pós-Graduação em Física do Departamento de

Física do Centro Técnico Científico da PUC-Rio. Aprovada pela Comissão

Examinadora abaixo assinada.

Profa. Sônia Renaux Wanderley Louro

Orientadora

Departamento de Física – PUC-Rio

Prof. Pedro Geraldo Pascutti

Co-Orientador

UFRJ

Profa. Célia Anteneodo

Departamento de Física – PUC-Rio

Prof. Iouri Borissevitch

USP

Prof. André Silva Pimentel

Departamento de Química – PUC-Rio

José Eugenio Leal

Coordenador Setorial do Centro

Técnico Científico – PUC-Rio

Rio de Janeiro, 28 de março de 2008

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sem autorização da universidade, do autor e da orientadora.

Teobaldo Ricardo Cuya Guizado

Graduou-se em Física na Universidad Nacional Mayor de San Marcos

(Lima-Perú) em 1995 com ênfase em Física,

Iniciou o mestrado em Física na PUC em 2006 na área de Biofísica Molecular.

Ficha Catalográfica

CDD: 530

Cuya Guizado, Teobaldo Ricardo

Estudos computacionais da interação de

porfirinas e seus complexos de ferro com

albumina sérica humana / Teobaldo Ricardo Cuya

Guizado ; orientadora: Sônia Renaux Wanderley

Louro ; co-orientador: Pedro Geraldo Pascutti. –

2008.

138 f. : il. ; 30 cm

Dissertação (Mestrado em Física)–Pontifícia

Universidade Católica do Rio de Janeiro, Rio de

Janeiro, 2008.

Inclui bibliografia

1. Física – Teses. 2. Biofísica. 3. Dinâmica

molecular. 4. Porfirinas. 5. Albumina. I. Louro,

Sônia Renaux Wanderley. II. Pascutti, Pedro

Geraldo. III. Pontifícia Universidade Católica do

Rio de Janeiro. Departamento de Física. IV.

Título.

A mi querido hermano, José Antonio Cuya Guizado

Agradecimentos

A minha orientadora, professora Sônia Renaux Wanderley Louro

por ter me

aceitado e acreditado em minha pessoa. Sua ajuda durante o desenvolvimento do

projeto foi importante, pela sua amizade.

Ao meu co-orientador Pedro Pascutti do Laboratório de Modelagem e Dinâmica

Molecular do Instituto Carlos Chagas Filho da Universidade Federal do Rio de

Janeiro pelo seu ensino, ajuda e amizade.

A todo o pessoal administrativo do Departamento de Física da PUC-Rio,

especialmente a Giza e Julinho pela ajuda sempre oportuna.

A meus colegas do Departamento de Física da Universidade da PUC-Rio, e do

Laboratório de Modelagem e Dinâmica Molecular do Instituto Carlos Chagas

Filho da UFRJ. Especiais menções merecem Arlan Gonçalves, Samuel Pita,

Diego Enry e Pedro Loureiro, pela sua amizade.

À instituição CNPq pelo apoio financeiro.

Resumo

Cuya Guizado, Teobaldo Ricardo; Louro, Sônia Renaux Wanderley;

Pascutti, Pedro Geraldo. Estudos Computacionais da Interação de

Porfirinas e seus Complexos de Ferro com Albumina Sérica Humana.

Rio de Janeiro, 2008. 138p. Dissertação de Mestrado - Departamento de

Física, Pontifícia Universidade Católica do Rio de Janeiro.

A aparição do HIV na década de 80 e de outros vírus presentes no sangue

dos doadores, assim como a expansão de doenças como a hepatite C, tem

estimulado as pesquisas para desenvolver substitutos do sangue. Pesquisas

recentes têm sido realizadas em derivados artificiais da albumina de soro humano

(human serum albumin – HSA) associados com heme, representando uma linha

promissora nesse sentido. No presente trabalho, fazemos um estudo

computacional da ligação do heme e de seu precursor, a protoporfirina IX, com a

HSA, com o objetivo de conhecer os aminoácidos que contribuem à estabilidade

da ligação, a natureza do sítio de ligação, a formação de possíveis sítios

secundários de ligação e a influência das porfirinas na estrutura global da proteína.

Para conseguir este objetivo utilizamos técnicas de cálculo quântico usando a

Teoria do Funcional de Densidade, Docking Molecular e Dinâmica Molecular.

Finalmente fazemos um estudo da correlação existente entre as diferentes regiões

da HSA e de como este padrão muda na presença das porfirinas. Para este

propósito usamos os coeficientes de correlação generalizada baseados na

formulação de Kraskov. Com base nestas informações, discutimos a contribuição

que poderiam fornecer nossos cálculos para a reengenharia do HSA, no sentido de

fornecer-lhe características de hemoproteínas.

Palavras-chaves

Biofísica, Heme, Protoporfirina IX, Dinâmica Molecular, Teoria do

Funcional de Densidade, Hidrofobicidade, Solvatação, RESP, Docking Molecular,

Correlação Generalizada.

Abstract

Cuya Guizado, Teobaldo Ricardo; Louro, Sônia Renaux Wanderley;

Pascutti, Pedro Geraldo. Computational Studies of the Interaction of

Porphyrins and their Iron Complexes with Human Serum Albumin.

Rio de Janeiro, 2008. 138p. Dissertação de Mestrado - Departamento de

Física, Pontifícia Universidade Católica do Rio de Janeiro.

The uprising of HIV and other viruses in the beginning of the 80s, as well as

the expansion of other diseases like hepatitis C has stimulated research in order to

develop blood substitutes. Research based on modified Human Serum Albumin

associated with heme has shown a promissory line in this direction. In the present

work we make a computational study about the heme and its precursor, the

Protoporphyrin IX complexed with HSA, in order to know the contribution of the

main amino acids to the stability of the binding, the character of the binding site,

secondary binding sites formation, and the influence of the porphyrins in the

global protein structure. To find this objective we use quantum calculations based

on Functional Density Theory, Molecular Docking and Molecular Dynamics.

Finally, a correlation study between different regions of HSA and the pattern

modifications caused by the porphyrins were performed, using the generalized

correlation coefficients based on the Kraskov formulation. We also discuss the

contribution that our calculations could give to the reengineering of HSA, to

provide them with hemeprotein characteristics.

Keywords

Biophysics, Heme, Protoporphyrin IX, Molecular Dynamics, Functional

Density Theory, Hydrophobicity, Solvation, RESP, Molecular Docking,

Generalyzed Correlation.

Sumário

1. Introdução 16

1.1

Posicionamento e abordagem do problema

1.1.1

As Porfirinas

1.1.2

A albumina Serica Humana

1.2

Objetivos

1.3

Estrutura dos Capítulos

2. Técnicas computacionais – Aproximação clássica

e aproximação quântica 28

2.1

Aproximação Clássica - Função de interação e equações

de movimento

2.2

O Hamiltoniano e a Função de Interação: Campo de Forças

2.2.1

Interações entre átomos (ou grupos) ligados

2.2.2

Interações não ligadas

2.2.3

Potenciais especiais devido a restrições

2.3

Tratamento das interações entre átomos não ligados,

aproximações.

2.3.1

Exclusão ou modificação de interações

2.3.2

Distância de corte de interações não ligadas

2.3.3

Interações eletrostáticas - limites sobre as interações

eletrostáticas

2.4

Tratamento das fronteiras

2.4.1

Condições periódicas

2.5

Geração da topologia, coordenadas atômicas e adição

do solvente

2.5.1

Topologia do Sistema

2.5.2

Colocando o soluto numa caixa de água

2.6

Mecânica e Dinâmica Molecular

2.6.1

Minimização de energia

2.6.2

Dinâmica Molecular

2.7

Controle da temperatura

2.8

Controle da Pressão

2.9

Função de distribuição radial

2.10

Modelo para a água

2.10.1

O modelo SPC (Single Point Charge)

2.11

Tratamento eletrostático da proteína

2.11.1

Aplicação da Equação de Poisson-Boltzmann para

o cálculo de energias eletrostáticas em proteínas

2.12

Superfícies de interação molecular

2.13 ”Docking” Molecular - Algoritmo Genético

2.14

Correlação em dinâmica de biomoléculas

2.15

Aproximação Quântica - Teoria do Funcional de

Densidade ( DFT)

2.15.1

Introdução à DFT

2.15.2

Descrição da teoria

2.15.3

Descrição matemática

2.15.4

O Método RESP (Restrained Electrostatic Potential)

3. Resultados e Discussão 60

3.1

Cálculo das cargas das porfirinas

3.1.1

Cálculo quântico - programa Gamess

3.1.2 Base escolhida na entrada do Gamess para o cálculo

do ESP 61

3.1.3 Otimizando a geometria das porfirinas 62

3.1.4 Obtenção das cargas a partir do ESP 62

3.2 Geração das topologias para as porfirinas 65

3.3 Solvatação e estabilidade das porfirinas na água 65

3.3.1 Heme e PPIX 67

3.3.2 Grupo carboxil 68

3.3.3 Oxigênio do carboxil 68

3.3.4 O Fe

do heme 69

3.4 DM dos sistemas HSA, HSA-PPIX e HSA-HEME,

Propriedades globais 70

3.4.1 Desvio médio quadrático 71

3.4.2 Desvio médio quadrático 3D 76

3.4.3 Raio de Giro 79

3.4.4 Evolução da energia 81

3.4.5 Flexibilidade dos resíduos na proteína 83

3.5 Superfície de contato intermolecular entre HSA e

as porfirinas 85

3.6 Distância entre os aminoácidos do HSA que mais

interagem com as porfirinas 88

3.6.1 Distância entre os aminoácidos do HSA que mais

interagem com PPIX 88

3.6.2 Distância entre os amino ácidos do HSA que mais

interagem com o HEME 91

3.7 Pontes de hidrogênio entre o HSA e as porfirinas 94

3.8 Análise da superfície eletrostática dos sistemas

HSA, HSA-PPIX e HSA-heme 97

3.9 Prováveis segundos sitio de ligação das porfirinas

no HSA 101

3.10 Existem regiões do HSA correlacionadas ao

subdomínio IB? 102

4. Conclusão e Perspectivas 110

4.1 Conclusões 110

4.2 Perspectivas 111

Referencias Bibliograficas 112

Apêndice A : Inputs do Gammes 118

Apêndice B : Topologia da Protoporfirina ix 129

Apendice C: Protocolo da Dinamica Molecular 138

Lista de figuras

Figura 1.1 Estrutura básica da porfirina 19

Figura 1.2 Bandas de Soret e bandas Q no espectro

de absorção da porfirina. 19

Figura 1.3 Heme (esquerda), PPIX (direita) 20

Figura 1.4 Esquema da estrutura secundaria de HSA com

subdomínios codificados por cores 22

Figura 1.5 Esquema mostrando os sítios de vários ligantes

da albumina sérica humana 24

Figura 2.1 Potencial de Lennard-Jones 34

Figura 2.3 Interações entre primeiros vizinhos (1-2), segundos

vizinhos (1-3) e terceiros vizinhos (1-4) 35

Figura 2.4 Método da dupla distância de corte. 36

Figura 2.5 Condições periódicas em duas dimensões 38

Figura 2.7 A molécula Heme numa caixa de água 40

Figura 2.8 Superfície de energia potencial 41

Figura 2.9 Integração das equações de movimento no

algoritmo de leap-frog 43

Figura 2.10 Função g(r) mostrando a distribuição da matéria

em torno do átomo central 47

Figura 2.11 Modelos de solvente implícito e modelos de

solvente explicito 47

Figura 2.12 Molécula de água no modelo SPC 48

Figura 2.13 Modelo para cálculo da superfície eletrostática 51

Figura 2.14 Constantes dielétricas que caracterizam os diferentes

meios nos quais se aplica a equação de

Poisson-Boltzmann 51

Figura 2.15 Definições de SAS e SM. 52

Figura 2.16 Correlação de variáveis aleatórias 54

Fig 2.17 A obtenção das cargas a partir do ESP para o heme 59

Figura 3.2 PPIX e Heme numa caixa de água 66

Figura 3.3 Gráfico de g(r) para as moléculas de

protoporfirina IX e heme 67

Figura 3.4 Gráfico do g(r) para o grupo carboxil 68

Figura 3.5. Gráfico de g(r) para o oxigênio do carboxil das porfirinas 69

Figura 3.6 Gráfico de g(r) para o íon Fe2+ 70

Figura 3.7 Da esquerda para a direita, HSA-HEME, HSA-PPIX e

HSA, mostrando a conformação da porfirina cada 2 ns 72

Figura 3.8 De cima para baixo, sobreposição da estrutura inicial

e final da HSA, HSA-PPIX e HSA-HEME 73

Figura 3.9 De cima para baixo: Em preto, RMSD da cadeia de

HSA, HSA-PPIX e HSA-HEME em relação à cadeia

da estrutura inicial 74

Figura 3.10 RMSD da PPIX com relação a PPIX na estrutura

inicial 75

Figura 3.11 RMSD do heme no sítio de ligação durante o

primeiro nano segundo da simulação 76

Figura 3.12 RMSD 3D do HSA, mostrando as quatro vistas

principais 77

Figura 3.13 RMSD 3D do HSA-PPIX, mostrando as quatro

vistas principais 78

Figura 3.14 RMSD 3D do HSA-HEME, mostrando as quatro

vistas principais 79

Figura 3.15 Raio de giro da HSA 80

Figura 3.16 Raio de giro do complexo HSA-PPIX 80

Figura 3.17 Raio de giro do complexo HSA-HEME 81

Figura 3.18 Energia total do HSA e seus complexos, mostrando

que o sistema é estável energeticamente 82

Figura 3.19 Energia total do HSA e seus complexos, mostrando

que o sistema já é estável a partir dos 100 ps 82

Figura 3.20 RMSF de HSA e de HSA complexada com PPIX 84

Figura 3.21 RMSF de HSA e de HSA complexada com heme 84

Figura 3.22 RMSF do HSA-heme e do HSA-PPIX 85

Figura 3.23 Área de contacto intermolecular entre HSA

e as porfirinas 87

Figura 3.24 Distância do centro de massas dos aminoácidos

e do ligante PPIX à cadeia de HSA 89

Figura 3.25 Distância entre o OH da TYR-161 e os nitrogênios

NAW e NAE do ligante PPIX 90

Figura 3.26 Distância entre o OH da TYR-161 e os nitrogênios

NBA e NAN do ligante PPIX 90

Figura 3.27 Distância dos principais aminoácidos do HSA

que interagem com o heme ao CM da cadeia 92

Figura 3.28 No lado proximal, TYR-161 interagindo frontalmente

com o Fe2+ do heme; no lado distal TYR-138

interagindo com os nitrogênios do anel 92

Figura 3.29 Distância entre o oxigênio OH-TYR161 e o íon

Fe2+ do heme 93

Figura 3.30 Comparação teórica-experimental da

microvizinhança molecular obtido por raios X e a

microvizinhança molecular obtido em nossos cálculos 93

Figura 3.31 Ligações de hidrogênio da PPIX com HSA e o

com o água nas vizinhanças do sítio de ligação 96

Figura 3.32 Número de ligações de hidrogênio do heme com

a proteína (preto) e com o solvente presente nas

vizinhanças do sítio de ligação 96

Figura 3.33 De cima para baixo: superfície eletrostática do

HSA, HSA-PPIX e HSA-heme depois de 20 ns

de DM 99

Figura 3.34 De cima para baixo: superfície eletrostática do

subdomínio IB do HSA, HSA-PPIX e HSA-heme

depois de 20 ns de DM. 100

Figura 3.35 Segundo provável sitio de ligação da PPIX no HSA 101

Figura 3.36 Potencial eletrostático na superfície da proteína na

região do segundo provável sitio de ligação da PPIX

no HSA 102

Figura 3.37 Padrão de correlação do HSA 103

Figura 3.38 Matriz da diferença entre as matrizes de correlação

total e linear do HSA 104

Figura 3.39 Padrão de correlação generalizada do HSA

e HSA-HEME 105

Figura 3.40 Padrão de correlação generalizada do HSA

e HSA-PPIX 106

Figura 3.41 Padrão de correlação generalizada: HSA e

HSA-HEME, nesta figura mostra-se entre as

paralelas as regiões diretamente correlacionados com

a região compreendida entre os resíduos 100-200 107

Figura 3.42 Região (100-118, vermelho) correlacionada com a

região (460-465, amarelo) 108

Figura 3.43 Região (100-118, vermelho) correlacionada com a

região (306-313, amarelo) 108

Figura 3.44 Região (110-140, vermelho) correlacionada com a

região (500-582, amarelo)

109

Abreviaturas

CHELPG Cargas do potencial eletrostático usando um método

baseado em grade (CHarges from ELectrostatic Potential

based on Grid)

RF Campo de reação (Reaction Field)

DM Dinâmica Molecular

DFT Teoria do Funcional de Densidade (Density Funtional

Theory)

ESP Potencial Eletrostático (Electrostatic Potential)

FDR Função de distribuição radial

HF Hartree –Fock

HSA Albumina sérica humana (Human Serun Albumin)

MM Mecânica Molecular

NMR Ressonância Magnética Nuclear (Nuclear magnetic

resonance)

PDT Terapia Fotodinâmica (Photodynamic Therapy)

PPIX Protoporfirina IX (Protoporphyrin IX)

RESP Restrição do potencial eletrostático (Restrained Electrostatic

Potential).

RMSD Desvio da raiz média quadrática (Root mean square

desviation)

RMSF Flutuação da raiz média quadrática (Root mean square

fluctuation)

SAS Superfície acessível ao solvente

SCI Superfície de contato intermolecular

Introdução

1.1

Posicionamento e abordagem do problema

As pesquisas sobre a interação entre as macromoléculas biológicas e drogas

envolvem um dos mais importantes tópicos no campo das ciências da vida devido

a que os sítios de ligação provêem informação importante sobre o transporte e o

metabolismo de moléculas no corpo humano.

A albumina sérica humana é a proteína mais abundante no soro sanguíneo.

Sua estrutura obtida por difração de Raios X encontra-se no banco de dados de

proteínas, RCSB Protein Data Bank (PDB). Aparece como molécula do mês de

janeiro de 2003, nesse site, junto com um resumo sobre sua importância, escrito

por David S. Goodsell.

Pensemos o quanto é conveniente sermos capazes de comer. Cada uma das

nossas dez trilhões de células precisam de um constante suprimento de nutrição.

Mas não temos que nos preocupar com isso – nós simplesmente comemos nossa

refeição e nosso corpo faz o resto. O alimento é digerido e os pedaços úteis são

distribuídos às células de todo o corpo, usando o fluxo sanguíneo como sistema de

transporte. A distribuição de moléculas solúveis em água, como açúcares, é fácil.

Elas circulam na corrente sanguínea e são capturadas pelas células ao longo do

caminho. Outros nutrientes importantes, no entanto, não são solúveis em água e

precisam de carreadores especiais para levá-los até as células famintas.

A albumina sérica (estrutura 1e7i do PDB) tem o papel de carregar ácidos

graxos no sangue. Ácidos graxos são essenciais para duas funções principais em

nosso corpo. Eles são os blocos para construção dos lipídios, que formam todas as

membranas ao redor e dentro das células; são também ricas fontes de energia e

podem ser quebrados dentro das células para formar adenosina trifosfato (ATP).

Então, nosso corpo mantém uma reserva de ácidos graxos, armazenados como

gorduras. Quando o corpo precisa de energia ou de materiais para construção das

suas estruturas, células de gordura liberam ácidos graxos no sangue. Aí, eles são

capturados pela albumina sérica e distribuídos a partes do corpo distantes.

A albumina humana é uma proteína versátil. Cada molécula dessa proteína

pode carregar sete moléculas de ácidos graxos, que se ligam a fendas profundas na

proteína, enterrando suas caudas ricas em carbono, hidrofóbicas, a salvo da água

circundante. A albumina sérica também se liga a muitas outras moléculas

insolúveis em água. Associa-se, por exemplo, a moléculas de inúmeros fármacos e

pode afetar fortemente a maneira como eles são distribuídos através do corpo.

Como a albumina sérica é muito abundante no sangue e tão fácil de

purificar, ela foi uma das primeiras proteínas a serem estudadas pelos cientistas.

Atualmente, a proteína similar do sangue de boi - albumina sérica bovina ou BSA

(do inglês bovine serum albumin) – é largamente utilizada em pesquisa quando se

necessita de uma proteína genérica.

A hemina (protoporfirina IX complexada com Fe

) liberada durante a

nucleação das células vermelhas ou através da hemólise é capturada pela

Albumina Serica Humana (Human Serum Albumin – HSA) a qual tem uma alta

constante de afinidade para este ligante (K

~ 10

-1

) (Wardell et al., 2002). Esta

forte afinidade tem estimulado esforços para desenvolver albumina como uma

hemoproteína artificial para mimetizar, por exemplo, a capacidade de ligação de

oxigênio da hemoglobina (Hb) e mioglobina (Mb). O heme, grupo prostético das

hemoproteínas, é a protoporfirina IX com um íon Fe

no centro.

Sérios esforços para desenvolver substitutos do sangue começaram na

década de 1980. Esta necessidade se viu aumentada com a aparição do HIV além

de vírus como o da hepatite C e outros vírus presentes no sangue de doadores.

Diferentemente das células vermelhas do sangue, os substituintes artificiais

podem ser esterilizados por pasteurização, ultrafiltração e métodos químicos. Isto

elimina os agentes responsáveis pelas infecções, além de permitir armazenamento

por longos períodos de tempo.

Pesquisas recentes têm demonstrado que derivados artificiais do heme

associados com HSA fornecem uma significante capacidade de ligação com

oxigênio (Tsuchida et al., 1997), representando uma linha promissora no

desenvolvimento de substitutos artificiais do sangue. Um dos estudos mais

importantes no sentido de criar compostos artificiais da sangue usando albumina

estão baseados na mutação da micro-vizinhança molecular do complexo HSA-

heme (Komatsu et al., 2005), mas o problema ainda não resolvido é fazer com que

a ligação do oxigênio ao heme seja reversível no micro entorno do heme em HSA.

Na Ressonância Magnética Nuclear (RMN) outra ferro porfirina, a

Tetrafenilporfirina Sulfonatada complexada com Fe (FeTPPS

) é usada como

marcador e na Terapia Fotodinâmica (FDT) as porfirinas são usadas para destruir

tumores.

Por outro lado a Protoporfirina IX (PPIX) é o precursor de muitas porfirinas

que dela se derivam, por conseguinte um adequado conhecimento dos sítios de

ligação com a HSA nos forneceria informação importante sobre a natureza das

ligações nesse entorno.

Até o momento se sabe que o heme tem um sítio de ligação principal no sub

domínio IB de HSA e que poderia ter outros sítios secundários e que a PPIX

poderia ter características similares (Zunszain et al., 2003; Zhang et al., 2002),

mas até agora não se tem a estrutura cristalina que mostre estes sítios secundários.

O presente trabalho tenta revelar essa interrogação e propõe os possíveis sítios

secundários.

Sem dúvida devemos saber que nos processos in vivo se dão maiores

complicações devido a interações entre drogas e ligantes endógenos, para o HSA.

Isto é especialmente importante no caso de ácidos graxos os quais ocorrem em

níveis de 0.1 e 2 mol por mol de HSA e podem competir ou cooperar com drogas

nos sítios de ligação da proteína. (Zunszain et al., 2003)

1.1.1

As Porfirinas

As porfirinas são moléculas importantes em vários aspectos da vida, muito

se tem escrito sobre elas, nos tomaremos a descrição que delas se da em

http://pt.wikipedia.org/wiki/Porfirina .

A estrutura da porfirina é um macrociclo tetrapirrólico (formado por quatro

anéis pirrol), ligados por ligações metínicas (-CH-), que possui no seu centro um

espaço apropriado para acomodar um íon metálico (Fig. 1.1). Este íon pode-se

ligar aos átomos de nitrogênio presentes na parte central da estrutura. Os

representantes mais comuns desta classe de compostos são o grupo heme, que

contém ferro, a clorofila, que contém magnésio, e os pigmentos biliares. O

principal local de síntese de porfirinas é o fígado, nos hepatócitos.

A aumento no nível de porfirinas em nosso organismo geram patologias

como a porfiria,

Figura 1.1 Estrutura básica da porfirina (http://pt.wikipedia.org/wiki/Porfirina)

Características Fundamentais

Devido a sua estrutura em anel tetrapirrol, um sistema de enlaces duplos

conjugados, as porfirinas se caracterizam por uma intensa banda de absorção perto

de 400 nm, (com coeficiente de absorção molar maior do que 200.000) conhecida

como banda de Soret, propriedade que permite sua detecção e quantificação em

laboratórios. Quando irradiada com luz deste comprimento de onda, as porfirinas

livres mostram uma intensa fluorescência no vermelho. No caso da PPIX a

fluorescencia não e muito intensa e quando e complexada com Fe a fluorescencia

desaparesce.A Banda de Soret é seguida por outras bandas de absorção mais

fracas (bandas Q), em comprimentos de ondas maiores (450 a 700 nm).

Figura 1.2 Bandas de Soret e bandas Q no espectro de absorção da porfirina.

As variações dos substitutos periféricos no anel da porfirina, causam

mudanças de menor importância na intensidade e no comprimento de onda destas

absorções. A protonação de dois dos átomos internos de nitrogênio ou a inserção

de um metal na cavidade da porfirina também muda o espectro de absorção

visível. Estas variações no espectro de absorção podem ser muito proveitosas na

determinação de propriedades características da porfirina.

Importância Biológica

Os complexos de porfirina são essenciais para a vida e têm múltiplas

aplicações. O heme (protoporfirina IX-Fe

, Fig. 1.3), por exemplo, é o grupo

encarregado de fazer a ligação do oxigênio à hemoglobina e, daí, transportá-lo às

diversas partes do corpo.

O precursor na síntese do heme é a protoporfirina IX (PPIX, Fig. 1.3). A

inserção do ferro II na PPIX é realizada por meio da enzima ferroquelatase.

Figura 1.3 Heme (esquerda), PPIX (direita) (Gráfico realizado com o programa

Ghemical)

Quando o ciclo de síntese do grupo heme e interrompido se produz o

aumento das porfirinas precursoras do heme, isto termina gerando uma grave

doença chamada porfíria. A porfíria pode-se classificar como hepática e

eritropoiética, é responsável por ataques neurológicos agudos e problemas de pele,

geralmente erupções de bolhas sensíveis à luz solar e crescimento aumentado de

pêlos.

Carbono

Oxigênio

Nitrogênio

Íon Ferro (II)

Hidrogênio

As propriedades óticas das porfirinas são responsáveis por sua grande

aplicação na área de eletrônica molecular assim como sua incorporação na forma

sintética em células solares.

Aplicações das Porfirinas

Materiais Químicos

Porfirinas e metaloporfirinas têm uma ampla aplicação como fotosensores,

particularmente para aplicações opto-eletrônicas. Por exemplo, a fácil substituição

dos componentes periféricos das porfirinas tem gerado uma série de materiais

líquido-cristalinos incomuns (Chou et al., 2000).

As propriedades ópticas não lineares destes materiais são de especial interesse, em

parte pela transferência de energia com controle molecular, e em parte por

aplicações em comunicação óptica, armazenamento de dados e processamento de

sinais eletro-ópticos. (Chou et al., 2000)

As porfirinas têm presença relevante na nanotecnologia devido à

possibilidade de construir nanotubos por auto agregação. Nesse sentido

numerosos estudos vêm se desenvolvendo. Tem sido demonstrado que os

nanotubos contendo Sn porfirinas são fotocatalíticos e podem reduzir íons

metálicos em solução aquosa (Rotomskis et al., 2004).

Metaloporfirinas como catalisadores para síntese macromolecular

Em 1978 Inoue Takeda e colaboradores em seus estudos de fixação de

dióxido de carbono com metaloporfirinas descobriram o potencial utilidade de

metalo-proteínas como catalisadores para a síntese controlada de macromoléculas.

(Takeda et al., 1978). Em várias metaloporfirinas, estudaram compostos de

alumínio ou zinco no anel central para fixação química do dióxido de carbono.

Terapia Fotodinâmica (PDT, Photodynamic Therapy )

Devido ao comportamento particular das porfirinas sob ação da luz, estas

têm sido aplicadas para combater o câncer. Nos anos 70 (Diamond et al., 1972;

Dougherty et al; 1978) mostrou-se através de probas in vitro e in vivo que

derivados de hemoporfirina (HpD) irradiados com luz têm capacidade de

destruição dos tumores. Atualmente diferentes tipos de porfirinas são investigados

e utilizadas na luta contra o câncer.

1.1.2

A albumina Serica Humana

A albumina sérica é a mais abundante proteína do plasma humano,

produzida no fígado, é um monômero de 66 kDa. Estruturalmente, a albumina é

composta de vários segmentos em alfa hélice, que se agrupam para formar dois

subdomínios (A e B). Três pares idênticos destes subdomínios se unem para

formar a albumina (Fig. 1.4).

Figura 1.4 Esquema da estrutura secundaria de HSA com subdomínios codificados por

cores da seguinte forma: IA,vermelho; IB – vermelho claro; IIA,verde; IIB – verde claro;

IIIA, azul; IIIB – azul claro. (Obtido de Ghuman et al., 2005)

O HSA tem características específicas que são importantes para a estrutura e

função: 18 resíduos de tirosina, 6 resíduos de metionina, 1 resíduos de triptofano,

59 resíduos de lisina, 1 resíduo de cisteína (Cys-34), e 17 pontes disulfetos.

(Wong et al., 2007).

A cisteína livre tem um sulfidril reduzido que é responsável por mais de

75% dos grupos tiol no plasma. O tiol é envolvido em várias reações bioquímicas

que inativam as espécies reativas de oxigênio, dando à albumina um papel

antioxidante importante em nosso corpo (Wong et al., 2007).

A albumina tem uma concentração plasmática típica de 35 - 45 g/l, que

representa 30 a 40% da albumina sintetizada no fígado. O restante encontra-se

distribuído entre os músculos e a pele. Sua principal função fisiológica é manter a

pressão osmótica.

Esta proteína é caracterizada por sua habilidade de ligar uma ampla

variedade de moléculas hidrofóbicas, ácidos graxos, bilirrubina, hemina, tiroxina e

esteróides. Serve como um solubilizador e transportador destes compostos. HSA

tem alta afinidade pelo heme, sendo a constante de dissociação ~10 nM em uma

mistura 3:5 de dimetil sulfóxido e água (Zunszain et al., 2003). Na Fig 1.5 pode se

observar os sítios de ligação principais de diversos ligantes.

Estudos de ligação indicam um só sítio de ligação para a hemina, no

subdomínio IB, o qual corresponde a um dos sítios de ligação para ácidos graxos

(Zunszain et al., 2003).

Um dos fatores mais importantes que afetam a distribuição e a concentração

ativa de muitas drogas no organismo é a afinidade pela HSA. Um grau de

afinidade pela albumina é desejável, para ajudar a solubilizar substâncias que de

outra forma poderiam agregar-se e ser pobremente distribuídas. No caso oposto,

drogas com uma grande afinidade pela proteína requereriam grandes doses para

atingir uma concentração efetiva in vivo, seriam lentamente distribuídas aos sítios

de ação e poderiam não ser eficientemente eliminadas.

Funções fisiológicas da albumina

Pressão Osmótica Coloidal

A função mais importante da albumina é manter a pressão osmótica

coloidal. A albumina provê 60% da pressão osmótica coloidal. A proteína é

negativamente carregada e, por conseguinte atrai íons de sódio, os quais por sua

vez retêm a água. A albumina também atrai outros íons positivos osmoticamente

ativos (efeito Gibbs-Donnan) os quais aumentam a retenção da água (Nguyen et

al., 2006).

Associação de ligantes

A organização estrutural globular da HSA dá a possibilidade de se ligar com

várias substâncias em múltiplos sítios da molécula, unindo-se assim a vários

componentes endógenos e exógenos. Estes compostos incluem ácidos graxos,

bilirrubina, metal, tiroxina e triptofano, assim como drogas que têm características

ácidas ou eletronegativas (e.g. warfarina, diazepan e ibuprofeno). Estas

características fazem com que a HSA seja um dos maiores transportadores de

fármacos no sangue (Fig 1.5).

A HSA pode facilitar a ativação de várias sustâncias, tais como hormônios

ou drogas, ou diminuir a presença de toxinas no plasma. Por exemplo, a ligação

do triptofano a HSA regula a deposição deste nos tecidos. Em pacientes com uma

avançada cirrose e hipoalbuminemia, a diminuição dos sítios de ligação gera uma

quantidade adicional de triptofano livre o qual pode gerar o desenvolvimento de

encefalopatia hepática (Greco et al; 2000).

A ligação de HSA também afeta a farmacocinética e eficácia de muitas

drogas. Por exemplo, drogas com alta afinidade pelo HSA têm que ser

administradas em altas doses para atingir uma efetiva concentração in vivo; sua

distribuição nos sítios de ação poderia ser reduzida ou mesmo eliminada. Apesar

disso, uma alta ligação da droga com a HSA poderia ser desejável porque ajudaria

a solubilizar compostos que de outra forma formariam agregados e seriam

pobremente eliminados.

Figura 1.5 Esquema mostrando os sítios de vários ligantes da albumina sérica

humana (Ghuman et al., 2005).

Efeitos Antioxidantes

Espécies reativas de oxigênio e nitrogênio são extremamente voláteis e

capazes de reagir com outras moléculas, que dão origem à acumulação de

produtos tóxicos finais e dano celular. Estudos in vivo têm mostrado que o HSA

pode ligar e, por conseguinte, remover neutrófilos derivados de espécies reativas

de oxigênio, regulando a sinalização celular que é ativada nos processos

inflamatórios (Kouoh et al., 1999).

HSA também influencia o status redox do plasma ao ligar metais como o

ferro e o cobre que de outra forma se transformariam em formas redox-ativas

(Kragh-Hansen et al., 2002).

Desta forma o HSA tem um papel antioxidante importante em situações de

inflamação.

Patologia

Hipoalbuminemia

Baixos níveis de HSA (hypoalbuminemia) podem ser causados por:

• Doenças no fígado/ Cirrose do fígado (a mais comum)

• Decréscimo na produção de HSA (má nutrição/má absorção)

• Excessiva excreção pelos rins (síndrome nefrótica)

• Excesso de perda no intestino (Redistribuição hemodilução, como na

gravidez, incremento da permeabilidade vascular).

Hyperalbuminemia

• Sinal de desidratação

1.2

Objetivos

Essa dissertação tem os seguintes objetivos principais:

i. Determinar a relação estrutura-solvente das porfirinas, as camadas de

solvatação e seu comportamento hidropático.

ii. Caracterizar, usando técnicas de Dinâmica Molecular, o sitio

principal de ligação, determinando os aminoácidos que compõem

estes sítios e seu rol na estabilidade do ligante.

iii. Determinar possíveis sítios secundários de ligação das porfirinas

PPIX, PPIX-Fe

na HSA, usando técnicas de Docking Molecular.

iv. Determinar o padrão de correlação do HSA e como este muda pela

presença das porfirinas.

1.3

Estrutura dos Capítulos

No capítulo 2 apresentam-se uma descrição da Metodologia e Técnicas

Computacionais usadas no presente estudo. As principais técnicas que usamos

são: Cálculo Quântico, Dinâmica Molecular e Docking Molecular,

O desenvolvimento deste capítulo nos itens 2.1-2.4 e 2.6-2.9 está baseado

no manual do GROMACS (van der Spoel et al., 2005) e no trabalho de Baanden

M. (Baanden M., 2003). Quando as informações apresentadas sejam tomadas de

outras fontes, se fará a respectiva citacão.

No capítulo 3 apresentam-se os Resultados e Discussão do presente trabalho

No capítulo 4 apresentam-se as Conclusões e Perspectivas.

Técnicas Computacionais – Aproximação Clássica e

Aproximação Quântica

O desenvolvimento deste capítulo nos itens 2.1-2.4 e 2.6-2.9 está baseado

no manual do GROMACS (van der Spoel et al., 2005) e no trabalho de Baaden M.

(Baanden M., 2003). Quando as informações apresentadas sejam tomadas de

outras fontes, se fará a respectiva referência.

O comportamento da matéria em nível de partículas constituintes dos

átomos e moléculas é descrito pela Mecânica Quântica, enquanto que em níveis

mais complexos a matéria composta de átomos e moléculas pode ser descrita de

forma aproximada pela Mecânica Clássica não relativística.

Uma aproximação clássica perde detalhes do sistema molecular em estudo,

mas permite acessar propriedades macromoleculares do sistema, assim como

economizar tempo de cálculo.

Os pacotes de Dinâmica Molecular baseados numa aproximação clássica

estão fundamentados em duas aproximações:

1. As leis de Newton são aplicáveis.

2. O movimento dos elétrons é muito mais rápido que o movimento dos

núcleos (Aproximação de Born-Oppenheimer).

Nossos modelos utilizados estão representados por sistemas massa-mola

onde cada átomo é representado por sua massa, um raio e uma carga atômica e as

ligações entre os átomos são representadas por molas (van der Spoel et al., 2005).

As características do sistema massa-mola estão contidas no campo de força. As

interações físicas entre os átomos são levadas em conta e introduzidas no termo de

energia potencial. A partir do modelo físico definido pelos parâmetros do campo

de forças e a representação da energia potencial, nós vamos utilizar as leis de

Newton para estudar a evolução das moléculas definida pelos vetores de posição e

pelos vetores de quantidade de movimento. Desta forma geraremos ensambles

estatísticos de configurações de átomos e moléculas em diversas fases (Berendsen

at al., 1996).

Para se ter uma média temporal estatisticamente significativa de um sistema

qualquer com a DM, seriam necessárias acessar todas as possíveis configurações

do sistema e estabelecer a probabilidade de cada estado conformacional. Há que

se ter em mente, porém, que neste trabalho estamos aplicando a DM sobre um

sistema envolvendo uma única macromolécula e por um intervalo de tempo de

poucas dezenas de nanosegundos. Embora não se possa falar neste caso de

ensemble estatístico, a simulação da dinâmica de proteínas na conformação

biologicamente ativa, nesta escala de tempo, é útil para obter informações sobre a

estabilidade da estrutura, transições conformacionais locais e várias propriedades

de interações com ligantes. Considerando que proteínas expressam sua atividade

biológica em estados conformacionais próximos ao mínimo global em um funil de

energia livre (Onuchic et al., 2004), espera-se que a probabilidade desses estados

bio-ativos sejam bastante alta em relação ao número astronômico de possíveis

conformações desta macromolécula. Mas devemos mencionar que variacões na

estrutura tamben estan relacionadas com a atividade (enzimas).

Em nossos cálculos vamos utilizar o pacote GROMACS (van der Spoel et

al., 2005). Os detalhes referentes a representação de energia e parâmetros da

simulação são próprios deste campo de forças.

Neste capítulo daremos a descrição clássica e explicaremos o hamiltoniano

do sistema, a energia cinética, a energia potencial e a representação das forças,

assim como a aplicação de restrições de distâncias, tratamentos de contorno, etc.

Também veremos os métodos para a Minimização de Energia (ME), Dinâmica

Molecular, tratamento eletrostático, superfícies de interação molecular, docking

molecular e a geração de matrizes de correlação.

No final do capítulo veremos a aproximação quântica no cálculo de cargas

através do método DFT e o formalismo RESP.

2.1

Aproximação Clássica - Função de interação e equações de

movimento

Referimos-nos a cálculos clássicos como aproximações onde são válidas as

leis de Newton. Para descrever corretamente os sistemas devemos estabelecer os

graus de liberdade que serão explicitamente tratados e aqueles que serão

implicitamente tratados e incorporados à função de interação.

Dentro de nosso esquema de cálculo estamos interessados nos graus de

liberdade de posição das coordenadas dos átomos.

Num sistema clássico o hamiltoniano de um sistema molecular é descrito da

seguinte forma:

),(),(),,,( mpKgrVgmrpH

(1)

onde V é a energia potencial, K a energia cinética, p é o momento das partículas, r

a posição, m a massa, e g são parâmetros presentes no campo de forças. A energia

cinética está representada da seguinte forma:

∑ ∑

= =

mpK

1 1

);( (2)

e depende das massas e velocidades, e é independente das coordenadas r da

partícula. V(r;g) corresponde a energia potencial que descreve a interação em

função das coordenadas das partículas.

),..;,..,();(

2,121 NN

gggrrrVxrV = (3)

Em geral V(r;g) depende dos parâmetros do campo de forças indicados por

),..(

2,1 N

gggg =

, e é a soma de termos que representam as distintas interações no

sistema.

Uma partícula nesse sistema está submetida a uma força

que tem a

seguinte representação:

),..,(

21 N

rrrV

∂

−=

(4)

Devemos lembrar que as trajetórias dependem unicamente das forças que

agem sobre os átomos, e não explicitamente das energias.

Usamos as equações de Newton para descrever a evolução da posição na

seguinte forma:

)(

tdr

= (5)

tdv

)(

(6)

Na simulação estas equações são integradas numericamente no tempo.

Inclui-se um termo suplementar Vrestr(r), que é uma função de penalidade

(van der Spoel et al., 2003), dentro da função de interação do sistema que limita o

movimento das partículas de tal forma que o valor simulado da partícula se

aproxima ao valor desejado.

2.2

O Hamiltoniano e a Função de Interação: Campo de Forças

De uma forma geral a energia potencial no campo de forças pode ser escrito

da seguinte forma (van der Spoel et al., 2005: item 4.1, 4.2 e 4.3):

);();();();( grVgrVgrVgrV

especiaisbondednobonded

++= (7)

Onde V

bonded

corresponde aos termos chamados covalentes, V

no bonded

aos

termos chamados não ligados (forcas eletrostáticas e de van der Waals) e V

especiais

aos termos especiais como, por exemplo, as restrições de posição e vínculos em

comprimentos e ângulos de ligação. Assim o Hamiltoniano da equação 1 quedo

descrito por:

),();();();(),,,( mpKgrVgrVgrVgmrpH

especiaisbondednobonded

+++=

2.2.1

Interações entre átomos (ou grupos) ligados

Na expressão para V

bonded

(r;g)

);();();();( grVgrVgrVgrVV

impropdiedroângulobondbonded

+++=

(8)

Esta expressão descreve a variação do comprimento das ligações, a

deformação dos ângulos e as torções devido aos ângulos diedros próprios e

impróprios.

Variação do comprimento das ligações covalentes entre átomos

A interação entre termos ligados é expressa por um potencial de tipo

harmônico, com uma soma feita sobres todas as ligações covalentes n=1,....N

)(

harmonico

bbond

bbKV −=

∑

No GROMACS é utilizada

por razões de eficiência computacional

a expressão

para V

bond

∑

−

bond

bbK

)(

(9)

As unidades para

bb −

e para

K são nm e kJmol

-1

-4

, respectivamente.

Onde:

2−

harmonico

Deformação dos ângulos nos átomos ligados

A seguinte relação e utilizada no GROMACS para representar o termo de

deformação entre átomos ligados por uma ligação covalente (van der Spoel et al.,

2005)

∑

−

θθ

angulo

)cos(cos

(10)

Os ângulos são dados em graus e

em kJmol

-1

KBT,

a soma envolve os

ângulos desde n=1,…N

do sistema molecular.

5961575.0

−

= molKcalE

é a constante de Boltzmann a 300 K.

Termos de torsão, ângulos diedros e impróprios

No campo de força GROMACS a função de interação que representa os

termos harmônicos impróprios da deformação dos ângulos diedros (fora do plano,

fora da configuração tetraédrica) é descrita por:

∑

−

ξξ

improp

KgrV

)(

);( (11)

A soma compreende n=1,...,N

definidos para manter os grupos de átomos

vizinhos dentro de uma configuração espacial determinada, por exemplo para

manter os grupos de átomos em um plano como no caso de um anel aromático.

Em suma, este potencial simula a hibridação de orbitais sp2 ou sp3.

Os termos de torção de ângulos diedros têm a forma (Lindahl et al. 2003):

∑

ϕδ

nnn

diedro

mKgrV

)]cos()cos(1[);( (12)

onde a constante de força

, o angulo diedro

e os valores de

m estão

limitados aos valores

=0,π e

m é um inteiro positivo diferente de zero, por

conseguinte )cos(

= ±1 . A soma é feita sobre todos os ângulos diedros

n = 1,..,N

, selecionados de acordo a topologia da molécula.

2.2.2

Interações não ligadas

As interações entre átomos não ligados são descritos por dois termos, V

para as interações de Lenard-Jones e V

Coul

para as interações eletrostáticas.

∑

ligadosnaopares

rfrfojiij

Coul

LJbondno

RCqqrVjiCjiCrVgrV ]},,,,,,[)],(),,(,[{);(

1612

εε

(13)

Esta soma é estendida a todos os pares de átomos (i,j) salvo as exceções

citadas adiante (2.3.1).

Interações de Lenard-Jones

Estas interações são chamadas também de van der Waals. Dentro do campo

de forças GROMOS96 se utilizam os parâmetros C

em kJmol

-1

e C

kJmol

-1

para a interação entre os átomos i e j a uma distância r

(nm).













−=

)(

),(

)(

),(

ijij

jiC

(14)

O primeiro termo em

)(

r corresponde à repulsão entre dois átomos, de

tal forma que haja certo grau de superposição de suas nuvens eletrônicas, e cuja

origem esta na repulsão entre os núcleos atômicos e no principio de exclusão de

Pauli. O segundo termo

)(

r corresponde à dispersão atrativa de London, a

combinação destes dois fatores dá o perfil de energia de interação mostrada na

Fig. 2.1.

Estas equações levam em consideração as regras para determinar os

parâmetros mistos entre dois átomos

de tipos diferentes.

),().,(),(

666

121212

jjCiiCjiC

(15)

Figura 2.1 Potencial de Lennard-Jones

Interações eletrostáticas

O primeiro termo corresponde às interações eletrostáticas coulombianas e os

outros dois termos correspondem ao campo de reação, o qual simula o efeito de

blindagem causada pelo solvente além do raio de corte das interações

coulombianas.













−

−−=

ijrf

ijo

RFCoul

)(

επε

(16)

O campo de reação no GROMACS é de tipo Poisson-Boltzmann que leva

em conta os efeitos de força iônica. Neste modelo o exterior de uma esfera de raio

ao redor de um soluto e modelado por um meio homogêneo polarizável.

2.2.3

Potenciais especiais devido a restrições

Existem potenciais “especiais” devido a restrições que são impostas sobre o

sistema para se ter resultados próximos à realidade, estes podem ser usados em

casos particulares. Por exemplo, constrições sobre a distância de ligação e

ângulos, ou restrições sobre a posição.

Vemos o caso de restrição de posição.

)(

);(

rrKgrV

−=

∑

(18)

Onde pr é referido a uma restrição de posição (position restraints), a soma

é estendida a todos os N

átomos selecionados,

é a constante de força do

oscilador harmônico e

é a posição de referência. As outras expressões dos

termos para outros casos de forças especiais podem ser vistas na referência van

Gunsteren et al., 1996.

2.3

Tratamento das interações entre átomos não ligados, aproximações.

2.3.1

Exclusão ou modificação de interações

Chamaremos de primeiros vizinhos (posições 1-2, Fig. 2.3) aos átomos i e j

ligados por uma ligação covalente e de segundos vizinhos aos átomos i e k, se k

está ligado a j (posições 1-3, Fig. 2.3).

Figura 2.3. Interações entre primeiros vizinhos (1-2), segundos vizinhos (1-3) e

terceiros vizinhos (1-4)

As interações entre primeiros e segundos vizinhos não serão tomadas em

conta dentro da soma da equação 13, porque estas interações são do tipo

harmônico e não são representados por um potencial de tipo Lenard-Jones. Essas

interações serão levadas em conta na representação dos átomos ligados (2.2.1). As

interações 1-4 entre terceiros vizinhos podem ser excluídas dentro de certos casos,

por exemplo, átomos dentro de um anel aromático. Mas, com maior freqüência,

esta interação é tratada reduzindo o diâmetro das esferas de van der Waals dos

átomos envolvidos, para evitar colisões estéricas.

2.3.2

Distância de corte de interações não ligadas

A soma da equação 13 se estende a todos os pares de átomos exceto aqueles

excluídos pelas considerações do parágrafo precedente. O número de interações

aumenta com o tamanho do sistema estudado.

Grande parte do tempo de cálculo se consome em procurar os pares de

átomos e avaliar suas interações. Com o objetivo de limitar o tempo

computacional nós utilizamos uma dupla distância de corte (twin cutoff) além da

qual as interações “não ligadas” (eletrostáticas e de van der Waals) são

substituídas pelo campo de reação. No método ilustrado na Fig. 2.4, a interação

dos átomos j com o átomo i no interior da zona I, limitada pelo raio R

, é

calculada a partir das posições instantâneas de j para cada passo da dinâmica. Se j

se encontra entre R

< r

< R

, suas interações com o átomo i são calculadas a

partir de uma posição fixa promedio durante um número de passos N

Figura 2.4 Método da dupla distância de corte.

Em geral, o método é aplicado a grupos de átomos e não a átomos isolados.

Neste caso o espaço limitado pelo cut-off é igual à união das esferas ao redor de

cada átomo do grupo. No GROMACS estes são chamados “grupos de cargas”, se

tratando de átomos onde a soma das cargas é neutra (ou inteira, por causa dos

íons).

2.3.3

Interações eletrostáticas - limites sobre as interações eletrostáticas

As interações coulombianas são inversamente proporcionais à distância r

entre os átomos i e j. Em conseqüência, estas interações são de longo alcance e

não podem ser omitidas para as cargas atômicas parciais da ordem de 0.1 a 0.4 e e

até a distâncias de corte típicas de 8 a 10 A

. Dois métodos permitem reduzir os

artefatos devidos ao truncamento de interações não ligadas. Primeiramente, não se

consideram as componentes de alta freqüência da interação coulombiana na região

< r

< R

, como descrito anteriormente. Em segundo lugar, a definição de

“grupos de cargas” (átomos de H podem se unir a átomos de C e formar um

“átomo” CH com uma carga que seria a suma das cargas componentes) dentro do

GROMACS nos permite reduzir certas interações a tipo 1/r

2.4

Tratamento das fronteiras

Em toda simulação deve-se levar em conta o tratamento das fronteiras. No

caso de um líquido ou uma solução, os efeitos de fronteira devem ser reduzidos

com a aplicação de condições periódicas de contorno.

2.4.1

Condições periódicas

Para reduzir os efeitos de fronteira de um sistema finito, nós utilizamos as

condições periódicas de contorno. Os átomos de um sistema são introduzidos

dentro de uma caixa cúbica rodeada de imagens idênticas eqüidistantes R

caixa

como se mostra na Fig. 2.5.

Figura 2.5 Condições periódicas em duas dimensões, mostrando a vista superior e

frontal (acima e embaixo respectivamente)

O cálculo das forças sobre o átomo representado pela esfera cheia dentro da

caixa central se efetua a partir das contribuições de outros átomos desta caixa e

das caixas vizinhas, imagens da caixa central, que se encontram no interior da

distância de corte R

. Quando o átomo abandona a caixa por uma face, ele entra

novamente pela face oposta, transladando a distância R

caixa

, com a mesma

velocidade. A aplicação das condições periódicas de fronteira lembra assim a

ordem dentro de um cristal. Desta forma não há fronteiras no sistema. O artefato

causado por condições indesejadas de um sistema isolado e o efeito de superfície

são substituídos por condições periódicas.

Para evitar que uma molécula possa interagir com uma ou mais de suas

imagens, a menor dimensão da caixa deve exceder em duas vezes a distância de

corte:

ccaixa

RR 2> (19)

Quando uma macromolécula é estudada em solução esta restrição não é

suficiente. Em princípio, uma única molécula de solvente não deve interagir com

ambos os lados da macromolécula. Isto significa que o comprimento de um

determinado lado da caixa deve exceder o comprimento da macromolécula na

mesma direção mais duas vezes o raio de corte R

. Uma estratégia comum é fazer

a camada de solvatação o quanto menor para reduzir o custo computacional,

respeitando-se o estabelecido acima.

2.5

Geração da topologia, coordenadas atômicas e adição do solvente

2.5.1

Topologia do Sistema

Para que os programas de simulação reconheçam as moléculas, nós

devemos fornecer informações sobre as ligações entre átomos, constituição de

cada molécula, massas e cargas a utilizar. Este conjunto de dados é conhecido

como a topologia do sistema. No GROMACS o módulo pdb2gmx permite gerar

topologias a partir de uma biblioteca já existente. As topologias assim geradas

reproduzem valores consistentes com os experimentos quando se trata de

proteínas. Este módulo não é aplicável quando o ligante não se encontra na

biblioteca do GROMACS ou de complexos organometálicos (exceto o heme).

O GROMACS possui a topologia da água pré-estabelecida. Como as

moléculas de água são todas idênticas, só é necessária a topologia de uma só

molécula.

2.5.2

Colocando o soluto numa caixa de água

Para o cálculo em solução o soluto (porfirina, HSA e HSA-porfirinas) deve

ser inserido numa caixa de água e íons Na

e CL

para tentar simular o meio

fisiológico. Este serão reproduzido periodicamente dentro das três dimensões, tal

como é mostrado na figura abaixo.

Figura 2.7 A molécula Heme numa caixa de água (Gráfico realizado com o programa

VMD)

As dimensões da caixa R

caixa

devem ser escolhidas em função das dimensões

dos solutos para evitar os artefatos no cálculo. Para construir esta caixa de

simulação o soluto deve ser localizado no centro de um cubo constituído de uma

concatenação de n

moléculas de solvente.

2.6

Mecânica e Dinâmica Molecular

2.6.1

Minimização de energia

A mecânica molecular nos permite minimizar a energia calculada a partir da

equação (7) com o objetivo de obter as configurações do sistema no estado

fundamental e de reduzir as forças iniciais muito grandes que poderiam produzir

trajetórias sem sentido físico.

Mas atingir o mínimo absoluto é impraticável pelas numerosas

conformações que uma proteína pode apresentar. O método steepest-descent

permite encontrar o mínimo local mais próximo da superfície de energia potencial

(Fig. 2.8), já o método dos Gradientes Conjugados encontra o mínimo de energia

de maneira mais rápida, aproximando-se mais ao mínimo absoluto. A seguir

mostraremos os dois métodos:

Figura 2.8 Superfície de energia potencial: Dependendo da configuração inicial da

proteína ela percorre diferentes caminhos até o mínimo de energia mais próximo ao

absoluto.

O primeiro método utilizado nos nossos cálculos é o método “steepest-

descent” (Courant, 1943). Os n+1 passos de minimização são feitos com base no

cálculo das forcas f(t

) a partir da derivada da equação (7) para a configuração

r(t

) dada, e do cálculo da configuração seguinte r(t

n+1

) com um passo ∆x.

)()()(

1 nnon

txfNtrtr ∆+=

(19)

é um fator de normalização. Ao início do cálculo um valor inicial de ∆x é

dado. Nos passos da simulação, se V(r) decresce então ∆x deve aumentar, se V(r)

aumenta, ∆x diminui. Assim, este método permite descer rapidamente para perto

de um mínimo local, mas isso não assegura a convergência.

No caso do método dos Gradientes Conjugados (Fletcher et al., 1964), a

força (o gradiente) f(t

n+1

) calculada em cada iteração é a conjugada da precedente

para determinar o vetor unitário p(t

n+1

) da direção descendente sobre a

hipersuperficie energética.

)()()(

11 nnnn

tptftp

(20)

)(|)(

tftf

(21)

O passo de minimização s

min

é escolhido levando em conta o gradiente da

iteração precedente. Isto é o que permite a otimização do método com relação ao

método steepest-descent. A nova configuração é obtida por:

)()()(

min1 nnn

tpstrtr +=

(22)

O critério de convergência é feito sobre um número, a força máxima que

atua por átomo. No nosso caso, esse critério (emtol = 100 kcal.mol

-1

.Å

-1

, Força

máxima por unidade de mol aplicada a um átomo ou grupo no Gromacs) é

geralmente obtido aproximadamente em 5000 iterações, segundo a complexidade

do sistema. Geralmente uma minimização de energia é feita primeiro pelo método

steepest-descent e depois pelo método dos Gradientes Conjugados.

2.6.2

Dinâmica Molecular

Princípios

As simulações de dinâmica molecular a partir de uma função de energia

empírica, como dada na equação (7), são amplamente utilizadas para estudar a

estrutura, a dinâmica e aspectos termodinâmicos de sistemas moleculares no

equilíbrio e fora dele. As equações de movimento dos átomos são integradas no

tempo. Para realizar estas integrações o GROMACS utiliza o algoritmo de leap-

frog. Numa simulação de DM a energia total E é sempre constante. Além disso, o

número de átomos N e o volume V da caixa são fixos. Assim, estas simulações se

desenvolvem no formalismo de um ensemble microcanônico (N,V,E). Às vezes é

preferível manter a temperatura constante, mais que a energia, sendo estas

simulações de tipo (N,V,T). Em outros casos é vantajoso simular o sistema à

pressão constante em vez de volume constante, sendo estas simulações do tipo

(N,P,T). Para as simulações (N,V,T) ou (N,P,T) é necessário acoplar o sistema

molecular a um banho térmico ou um banho de pressão respectivamente.

Algoritmos de Verlet e Leap-frog

Os dois algoritmos são equivalentes, em seguida descreveremos o algoritmo

de Verlet (Verlet, 1967).

A partir da diferença das séries de Taylor das velocidades v

-∆t/2) a t=t

+∆t/2) a t=t

nós obtemos:

ttfmttvttv

niinini

∆+∆−=∆+

−

)()2/()2/(

(23)

na qual desprezamos os termos de 3

ordem e ordens superiores. Da mesma

forma, fazendo as diferenças entre as séries de Taylor das posições em r

) a

t=t

∆

t/2 e r

∆

t) a t=t

∆

t/2 dando o seguinte:

tttvtrttr

ninini

∆∆++=∆+

)2/()()( (24)

Estas duas equações permitem a integração no tempo conforme mostrado no

esquema da figura 2.9.

Figura 2.9 Integração das equações de movimento no algoritmo de leap-frog

Para deduzir o algoritmo de Verlet, devem-se eliminar as velocidades nas

equações 23 e 24 e substituir t

por t

∆

t na equação 24, obtendo-se

))(()()(2)( ttfmttrtrttr

niinnini

∆+∆−−=∆+

−

(25)

A particularidade do algoritmo é que a velocidade dos átomos não aparece

explicitamente na equação, e assim um banho térmico por acoplamento de

velocidades não é possível.

O tempo de cálculo necessário é proporcional ao passo de integração ∆t. O

passo de tempo deve ser menor que o menor período de vibração do sistema para

poder desta forma representar adequadamente o movimento do sistema. Em geral

são as vibrações X-H que limitam ∆t a 10

-15

s= 1fs (as vibrações nos átomos de

hidrogênio se da em intervalos de femtosegundo).

2.7

Controle da temperatura

Há muitos métodos para o controle da temperatura nas simulações de DM.

Um método simples que nós utilizamos no nosso sistema é o Método de

Acoplamento Fraco (“weak coupling method”) (Berendsen, 1991) onde a equação

de movimento dos átomos é modificada a fim de obter uma relação de primeira

ordem da temperatura T perto da temperatura de referência T

)]([

)(

tTT

tdT

−=

−

(26)

A temperatura de um ensemble de N

graus de liberdade é definida em

termos da energia cinética desses graus de liberdade. O controle da temperatura

pode se realizar por uma modificação das velocidades dos átomos por um fator de

correção

(t)

]]1

)(

[1[)(

−

∆

(27)

A velocidade de relaxação da temperatura é controlada pelos tempos

relaxação da temperatura

Este parâmetro é ajustado em função do sistema,

deve ser suficientemente pequeno (acoplamento forte) para manter a

temperatura média em T

, mas suficientemente grande (acoplamento fraco) para

evitar perturbar o sistema.

Diferentes partes de um sistema molecular podem apresentar diferentes

tempos de aquecimento. Por conseguinte, é preferível acoplar as diferentes partes

de um sistema separadamente aos banhos térmicos. Acoplando cada um dos três

subsistemas proteína, ligante e solvente a três banhos térmicos com a mesma

temperatura de referência T

(310 K em nosso caso), garante-se uma distribuição

de velocidades tal que nenhum dos subsistemas estará mais quente ou mais frio

em relação à temperatura média global.

2.8

Controle da Pressão

O controle da pressão é realizado por um método de acoplamento fraco

(Berendsen, 1984) como o controle da temperatura, mas neste caso a pressão faz o

papel da temperatura e as posições atômicas das velocidades. As equações de

movimento são modificadas para obter a pressão de relaxação P, numa

aproximação de primeira ordem perto do valor de referência P

)]([

)(

tPP

TdP

−=

−

(28)

A pressão pode ser definida usando o teorema do virial,

)(

)()(

)(

tWtE

kin

−

(29)

Onde

W(t)

é o virial e

V(t)

o volume da caixa de simulação e E

kin

(t) a energia

cinética do sistema. O virial molecular é definido por:

∑

−=

tFtRtW

βα

αβαβ

)()(

)( (30)

Com

αβ

sendo a distância entre os centros de massa das moléculas

no instante

αβ

F a força sobre o centro de massa de

sobre

. Como a pressão

à temperatura constante está relacionada ao volume pela compressibilidade

térmica

, o acoplamento é efetuado por um ajuste das coordenadas atômicas e o

tamanho da caixa de simulação por um fator de correção

. Neste caso o ajuste

isotrópico é obtido por

)]]([1[)(

tPP

−

∆

−=

κµ

(31)

O valor de

para a água, utilizado é 44,6 x 10

-6

bar

-1

[92]. Como o tempo

de relaxação da pressão

é um parâmetro adaptável, não é necessário conhecer

o valor de

do sistema com exatidão.

foi escolhido considerando o valor

para o água (que é o sistema com maior mobilidade).

Como a definição da pressão depende da energia cinética, o acoplamento da

pressão não deverá ser mais forte que o da temperatura.

≥

(58)

Para nosso cálculo, nós utilizamos um valor de 1.0 ps e uma pressão de

referência de 1 atm.

2.9

Função de distribuição radial

Para a correta descrição da posição média das partículas em solução, usamos

a função de distribuição radial g(r) (Funtion radial distribution -FDR). Calculamos

unicamente a função normalizada por pares cortada pela função g(r), a qual nos dá

uma medida de como a matéria está se distribuindo ao redor do átomo ou grupos

de átomos de interesse.

))((

)()(

)(

rdrr

rNdrrN

−+

−

πρ

(32)

O cálculo de

)(rg

envolve a densidade dos átomos

e o número médio

N(r) de átomos j dentro de uma esfera de raio r ao redor do átomo i (Fig. 2.10) e

leva em conta as correlações na distribuição das moléculas provenientes das

forças que elas exercem umas sobre as outras.

Quando g(r) =1 não existe correlação entre as moléculas e não se exerce

influência uma sobre outra. A Energia Livre de Helmholtz pode ser escrita na

forma de um potencial de Campo Médio (PCM), definido como W(r)= - kT ln g(r)

e é usado para determinar a hidropaticidade. Se W(r) < 0 (g(r) > 1) o potencial é

atrativo (comportamento hidrofílico), e é repulsivo no caso contrario (g(r) < 1,

comportamento hidrofóbico) (Manfred, 1996)

O número de átomos contido numa camada é obtido por integração da

função 4πr

g(r) na largura da camada, adicionalmente a amplitude g(r) à distância

r, é necessário analisar os tipos de interação entre átomos e moléculas. Em grupos

polares, por exemplo, uma ligação de hidrogênio acontecendo no limite de r =

0.35 nm conectando doador e aceitador com um ângulo de tolerância hidrogênio-

doador-aceitador de 30

A avaliação da FDR e os enlaces de hidrogênio mostram a possível

localização das camadas de água ao redor de cada átomo presente na molécula,

permitindo-nos analisar o padrão hidrofóbico em cada forma pontual e total.

Figura 2.10 Função g(r) mostrando a distribuição da matéria em torno do átomo central

(azul).

2.10

Modelo para a água

A água é importante em todos os processos da vida conhecida na Terra. Nós

somos 80% água e, por conseguinte muito do êxito que se possa conseguir numa

simulação de DM vai depender do modelo de água utilizado. Além disso, a água

tem propriedades especificas que não são facilmente reproduzidas na simulação

(efeito túnel nos átomos de hidrogênio a T ambiente), e dependendo dos

fenômenos a estudar, eles poderiam ser desprezados. Uma dessas propriedades

específicas é a dependência da densidade com a temperatura, a qual alcança um

máximo perto de ~ 4

Os níveis de detalhe no modelo da água passam desde os modelos de

solvatação contínua até os modelos de solvente explícito (Fig. 2.11).

Figura 2.11 Modelos de solvente implícito (esquerda), modelos de solvente explicito

(direita) (Gráfico obtido e modificado de http://agave.wustl.edu/)

Nível de detalhe

2.10.1

O modelo SPC (Single Point Charge)

Para determinar as interações entre as moléculas de água existem vários

modelos, uns dos mais sucedidos por sua simplicidade e eficiência computacional,

usado em nosso caso, é o modelo SPC (Berendsen et al., 1981) o qual contem o

efeito das cargas. No modelo SPC a molécula de água tem três centros de carga:

as cargas positivas dos átomos de hidrogênio e a carga negativa do oxigênio,

sendo um modelo de 3 sítios.

O fato de assumir cargas pontuais é uma aproximação que não reproduz de

maneira correta o momento dipolar da molécula. Para tentar reproduzir o

resultado experimental, este modelo considera o ângulo H—O—H 109.47

, como

se mostra na Fig. 2.12.

Figura 2.12 Molécula de água no modelo SPC. A carga parcial negativa do átomo de

oxigênio tem duas vezes a carga parcial positiva dos átomos de hidrogênio.

Resultado da concentração da carga e do redimensionamento do ângulo

H—O—H , o momento dipolar no modelo tem um valor próximo ao valor

experimental. A mobilidade da água no modelo é maior que a mobilidade da água

na natureza, pois não contém o par de elétrons isolados (elétrons do oxigênio). No

entanto, este efeito decresce rapidamente com a temperatura.

Além do modelo SPC, existem muitos que consideram efeitos de

polarização, mediante átomos “fantasmas”, para tentar reproduzir os efeitos dos

orbitais eletrônicos do oxigênio, etc.

O momento dipolar efetivo de uma molécula de água em fase liquida é

aproximadamente 2,6 D. Os modelos reproduzem os seguintes valores: SPC, 2.27

D e TIP4P, 2.18 D (modelo de quarto sítio, localiza uma carga negativa sobre um

átomo fantasma perto do oxigênio ao longo do bissetor do ângulo HOH)

(http://en.wikipedia.org/wiki/Water_model).

Propriedades estruturais e termodinâmicas tais como a densidade, função de

distribuição radial, entalpia de vaporização, capacidade calorífica, coeficiente de

difusão e constante dielétrica são usadas para ajustar os parâmetros destes

modelos.

O modelo SPC é um modelo rígido, por conseguinte algumas propriedades

da água não podem ser calculadas. Por exemplo, os aspectos vibracionais só

poderão ser calculados se forem inseridos termos de flexibilidade na função de

energia potencial.

Finalmente um fator importante no momento de escolher o modelo é o custo

computacional. Deve-se tomar em conta que no processo da solvatação do

sistema, uma quantidade apreciável de água é inserida no mesmo. Um modelo

extremamente fino poderia tornar muito custosa a simulação.

2.11

Tratamento eletrostático da proteína

O tratamento eletrostático nos dá informação a respeito dos aspectos

funcionais das diferentes regiões da proteína, sobre a posição dos sítios de

interesses, sobre o componente eletrostático na energia de ligação do ligante, etc.

A grande maioria dos aminoácidos que constituem uma proteína interage

através de forças de longo alcance, essencialmente de natureza eletrostática. Os

campos elétricos gerados por proteínas estendem-se significativamente a uma

distância de 10-15 Å, dependendo de condições de temperatura, solvente e carga

elétrica da proteína (em maiores distâncias, as flutuações térmicas aleatórias do

solvente predominam sobre grande parte do efeito que o campo elétrico da

proteína pode exercer).

Desta forma, para entender as forças de atração-repulsão entre biomoléculas

é necessário compreender as leis da eletrostática que regem as interações

intermoleculares. Os fundamentos da física eletrostática são bem estabelecidos e

podem ser expressos concisamente por equações relativamente simples. Contudo,

a aparente simplicidade destas equações esconde algumas dificuldades conceituais

e numéricas da aplicação das mesmas ao estudo de sistemas complexos. Este é um

problema relevante devido à vasta quantidade de estruturas tridimensionais de

biomoléculas disponíveis recentemente.

2.11.1

Aplicação da Equação de Poisson-Boltzmann para o cálculo de

energias eletrostáticas em proteínas

Um sistema biomolecular sempre está rodeado de um meio o qual pode

estar composto de íons, estes íons interagem eletrostaticamente com a

biomolécula a qual poderia também ter carga elétrica.

Uma das aproximações que tem descrito com sucesso as interações

eletrostáticas em sistemas biomoleculares é a equação de Poisson-Boltzmann

(http://bessie.che.uc.edu/tlb/rctb6/rctb6.html).

)]]()

)(

exp[()]()

)(

exp[()([4))()(.( rv

qnrv

qnrrr

−+−−−+−=∇∇

−+

ρπφε

(33)

Onde o primeiro termo a direita da igualdade representa a contribuição pelas

cargas fixas na biomolécula e os outros termos representam a contribuição dos

íons móveis positivos e negativos respectivamente.

(r) : A constante dielétrica

(r) : Potencial eletrostático

(r) : Densidade de cargas na biomolécula

q: Carga de cada íon positivo ou negativo

: Densidade iônica

: Constante de Boltzmann

v(r)

: é 0 ou

∞

em regiões accessíveis ou inacessíveis para o íon.

Na aproximação de campo fraco, considerando-se um conjunto de cargas

em um meio de constante dielétrica uniforme e de baixa força iônica, a equação

33, pode ser escrita na forma a seguir:

)(4)()]()([.

rrkrr

πρφεφε

−=∇∇

(34)

Figura 2.13 Modelo para cálculo da superfície eletrostática na equação de Poisson-

Boltzmann (Gráfico obtido de http://agave.wustl.edu/)

Onde k é a constante de Debye-Hückel ou blindagem iônica do meio. A forma

da interface dielétrica e a exclusão de íons contidos no interior da proteína são

introduzidos no cálculo através da dependência das constantes

 e k do vetor r.

Em condições onde k = 0, íons estão ausentes e a Equação (34) pode ser reduzida

à equação de Poisson. Devido à diferença de polarizabilidade da água e do interior

da proteína, duas constantes dielétricas ε e ε

são necessárias para representar

realisticamente o sistema (ver Fig. 2.14).

Figura 2.14 Constantes dielétricas que caracterizam os diferentes meios nos quais se

aplica a equação de Poisson-Boltzmann (Gráfico obtido e modificado de

http://agave.wustl.edu/).

2.12

Superfícies de interação molecular

Superfície acessível ao solvente

A superfície acessível ao solvente (SAS) de uma biomolécula é uma forma

de quantificar o efeito hidrofóbico, este conceito tem sua origem no trabalho de

Lee e Richards (Lee et al., 1971) no ano 1971. A área acessível ao solvente

descreve a área na qual o contato entre a proteína e o solvente ocorre.

A SAS é definida como o lugar geométrico dos centros de uma esfera de

prova (representando a molécula do solvente) como se esta rodasse sobre uma

superfície de van der Waals da proteína (Fig. 2.15).

Superfície molecular (ou superfície excluída do solvente)

A superfície molecular (SM) é traçada pela frente interna da esfera de prova

(Fig. 2.15). Está composta de:

• Superfície de contato: a parte da superfície de van der Waals que

pode ser tocada pela esfera de prova.

• Superfície reentrante: formada pela frente interna da esfera de prova

quando esta está em contato com mais de uma molécula.

Figura 2.15 Esquema gráfico que mostra as definições de SAS e SM.

2.13

”Docking” Molecular - Algoritmo Genético

Nos estudos de “docking” fizemos uso do programa AUTODOCK (Morris

et al., 1998), que utiliza o Algoritmo Genético (do inglês, Genetic Algorithm,

GA), para otimizar a interação e descobrir os possíveis sítios de ligação entre as

porfirinas e o HSA. No programa AUTODOCK também foi implementado um

algoritmo genético modificado que introduz passos de busca conformacional local

entre cada passo, possibilitando que as mudanças fenotípicas (adaptações

conformacionais da molécula ao ambiente) possam ser adquiridas pelas próximas

gerações. Este híbrido do Algoritmo Genético é chamado de Algoritmo Genético

Lamarchiano (do inglês, Lamarchian Genetic Algorithm, LGA). O método de

busca local utilizado é baseado no algoritmo de otimização de Solis e Wets (SW)

(Solis e Wets, 1981).

Na terminologia desses algoritmos, uma solução candidata é chamada de

indivíduo e ao conjunto de indivíduos simultaneamente avaliados é dado o nome

de população. Inicia-se com uma população de conformações, orientações e

translações randômicas do ligante. Então o programa executa o número de

avaliações energéticas e gerações (iterações) requisitadas pelo usuário e seleciona

os indivíduos sobreviventes (os melhores adaptados). Uma taxa de mutação e

cruzamento é especificada e introduzida no problema a fim de possibilitar uma

melhor adaptação das gerações futuras (Sousa, 2005). Mais detalhes sobre o

Algoritmo Genético implementado podem ser encontrados no próprio manual do

AUTODOCK.

2.14

Correlação em dinâmica de biomoléculas

Movimentos correlacionados em sistemas moleculares são essenciais para a

função biomolecular, exemplos são os efeitos alostéricos e efeitos cooperativos.

Muitas vezes a função energética da proteína é dominada por contribuições

entrópicas que estão diretamente relacionadas a movimentos atômicos

correlacionados (Lange et al., 2006). A correta compreensão destes movimentos

correlacionados é importante para o entendimento da função da proteína e poderia

melhorar a interpretação dos experimentos de NMR e espalhamento de raios X.

Correlação é uma forma de medir quanto associadas ou relacionadas estão

duas variáveis. O propósito de fazer correlações é fazer predição acerca de uma

variável baseada no conhecimento de outra variável

Coeficientes de Correlação Generalizada

Os coeficientes de correlação generalizada estão baseados na formulação da

Mutua Informação de Kraskov, e residem na definição fundamental de

independência de variáveis aleatórias. A descrição que daremos ésta baseada no

trabalho desenvolvido por ele no ano 2004 (Kraskov et al., 2004). Segundo este

trabalho duas variáveis são independentes se e somente se a distribuição do

conjunto é um produto de suas distribuições marginais,

)()(),( YPXPYXP

(35)

a idéia é expressar a correlação como a diferença entre P(X,Y) e P(X)P(Y) (ver

Fig 2.16).

Figura 2.16 Correlação de variáveis aleatórias são definidas como a desviação de sua

distribuição de probabilidade (cinza) da distribuição de probabilidades das variáveis

aleatórias independentes (preto). (Gráfico obtido de Lange et al., 2006)

Isto equivale a definir a correlação C como a entropia de Shannon

(correlação total) (Lange et al., 2006).

],[][][],[ YXHYHXHYXC

−

(36)

onde H denota a entropia das variáveis aleatórias. Esta relação é equivalente a:

][][],[ YHXHYXH

≤

(37)

a qual é uma igualdade se e somente se as variáveis são independentes. Pode-se

observar que quando não existe correlação entre as variáveis X e Y, C[X,Y]=0,

caso contrário tem um valor positivo.

A matrix de correlacào esta formado pelos coeficientes de corrrelacão e nos

forneceria informacão sobre como estan relacionadas as diferentes regiones da

proteina.

2.15

Aproximação Quântica - Teoria do Funcional de Densidade ( DFT)

Porque usamos o método DFT (do inglês Density Funtional Theory) em

nossos cálculos com as Porfirinas?

A aproximação de Hartree - Fock (HF) descreve a função de onda de N

elétrons por um determinante simples construído de orbitais ocupados, os quais

são variacionalmente determinados minimizando-se a energia. Este cálculo não

incorpora a correlação eletrônica e não é adequado para descrever compostos com

metais de transição (Margulis et al., 2002).

A precisão do método DFT comparado com HF é muito melhor (Ghosh et

al., 2003; Himo et al., 2003, Siegbanhn et al., 2000). Neste tipo de cálculo, a

densidade eletrônica tem um papel central porque a energia e as propriedades

moleculares são derivadas da densidade. A expressão para a energia incorpora a

correlação eletrônica através do termo de correlação de intercâmbio. A aplicação

do DFT precisa de um funcional de intercâmbio adequado e de uma base

adequada. Na literatura há muitos funcionais desde a Aproximacão de Densidade

Local (local density approximation, LDA), passando por funcionais de gradiente

corrigido (generalized gradient approximation, GGA) e funcionais híbridos (com

mistura de HF e termos de intercâmbio) para formas mais avançadas.

Alguns destes funcionais são derivados de primeiros princípios, outros

envolvem uma calibração semi-empírica ajustada a dados teóricos ou

experimentais. Na prática, funcionais de gradiente corrigidos tais como BP86,

BLYP e BPW91 são aplicados adequadamente a espécies enzimáticas. Sem

dúvida, os funcionais híbridos como B3LYP ou B3PW91 (Ghosh et al., 2003;

Himo et al., 2003) estão entre os mais usados. Em particular, B3LYP tem tido

êxito ao reproduzir valores experimentais de entalpias de formação com desvio

médio absoluto de 3 kcal.mol

-1

(Curtiss et al., 2000). B3LYP cálcula muito bem

um número de outras propriedades (Siegbanhn et al., 2000) ainda que não

reproduza bem as barreiras de reação. B3LYP é geralmente o método preferido

para um cálculo DFT em sistemas biológicos e na investigação de precursores e

derivados do heme (Ghosh et al., 2003; Himo et al., 2003).

2.15.1

Introdução à DFT

A teoria do Funcional de Densidade está baseada na noção de que a

energia total, E, de um sistema eletrônico é determinado pela distribuicão da

densidade eletrônica.

Os tempos de computação nos diferentes métodos baseados em HF escalam

como n

a n

onde n é o número de elétrons no sistema estudado. Neste aspecto, o

método DFT é mais bem sucedido porque tem a vantagem de o tempo de

computação escalar com ~ n

Os métodos ab initio baseados no formalismo HF dão precisões de 0,2 Å

para as distâncias de ligação, mas estes métodos têm sido menos bem sucedidos

nos cálculos que envolvem metais de transição (Lüthi et al., 1982). Os parâmetros

geométricos calculados por métodos DFT têm mostrado, há mais de duas décadas,

uma razoável aproximação com os experimentos através das distâncias de ligação

(Dunlap et al., 1986).

A Teoria do Funcional de Densidade é uma aproximação de muito êxito

para a descrição de estados fundamentais de metais, semicondutores, moléculas,

etc.

A idéia principal é descrever um sistema de férmions interagentes via

densidade e não via função de onda de muitos corpos. Para N elétrons em um

sólido, que obedecem ao princípio de Pauli, isto significa que a variável básica

dos sistemas depende das coordenadas espaciais x, y, e z em vez de 3N graus de

liberdade (aproximação de Thomas-Fermi). Desta forma, a energia total passa a

ser escrita como um funcional E[ρ(r)].

A DFT considera o termo de correlação eletrônica no potencial. Os elétrons

se movem tentando evitar a interação eletrônica e assim existem zonas dentro das

quais os elétrons não podem penetrar. Isto é chamado o buraco da correlação de

intercâmbio e vai dar o termo de intercâmbio (Energia de Intercâmbio) (Ziegler et

al., 1991; Gritsenko et al., 1997).

2.15.2

Descrição da teoria

Os métodos tradicionais estão baseados nas funções de onda de muitos

elétrons, uma das ventagems do metodo DFT é substituir a função de onda

eletrônica de muitos corpos pela densidade eletrônica. A implementação mais

comum da teoria é através do método de Kohn-Sham (Kohn et al., 1965), que

reduz o sistema a um conjunto de elétrons interagentes num potencial efetivo. O

potencial efetivo inclui o potencial externo e a interação de Coulomb. Modelar as

últimas duas interações é o problema, sendo a aproximação mais simples a

aproximação de densidade local (Local density aproximation, LDA), a qual está

baseada na energia de intercâmbio de um gás de elétrons.

No entanto, esta aproximação não é precisa o suficiente para os cálculos

necessários em química quântica e é necessário adicionar outros termos ao

potencial efetivo. Isto é especialmente certo quando os sistemas são dominados

pela forças de van der Waals ou quando a dispersão compete significativamente

com outros efeitos (em biomoléculas).

2.15.3

Descrição matemática

O presente item está baseado na informação disponibilizada em

http://en.wikipedia.org/wiki/Density_functional_theory.

No formalismo DFT, a variável chave é a densidade eletrônica

que é

dada por:

∫

= ),...,,,(),....,,(....)(

NNN

rrrrrrrdrdrdNrn

ψψ

(38)

Hohenberg e Kohn provaram em 1964 (Hohenberg et al., 1964) que a

função de onda no estado fundamental podia ser escrita como um

funcional da densidade eletrônica .Em outras palavras que é um único

funcional de

][

ooo

ψψ

(39)

Disto se deriva que a energia no estado fundamental, abaixo, é um funcional

de , onde T e U são a energia cinética e potencial do sistema e V é o potencial

externo:

>++=<= ][||][][

oooooo

nUVTnnEE

ψψ

Onde a contribuição do potencial externo é dada por

O Potencial é redefinido por um potencial não interagente, onde s denota o

sistema não interagente e V é o potencial efetivo no qual as partículas se estão

movendo. V é escolhido tal que:

)(

TTUVV −++= (40)

De tal forma que o funcional na equação pode ser escrito em termos de um

funcional fictício de um sistema não interagente

>+=< ][||][][ nVTnnE

sssss

ψψ

(41)

Desta forma as equações de Kohn-Sham são resolvidas um sistema sem

interação.

O potencial efetivo V

pode ser escrito em mais detalhe:

)]([

)(

rnVrd

rne

sXC

−

∫

(42)

Onde o segundo termo à direita denota o termo de Hartree descrevendo a

repulsão de Coulomb elétron-elétron, e o último termo denota o potencial de

correlação de intercâmbio V

Aqui V

inclui todas as interações de muitas partículas. O cálculo é

autoconsistente pelo fato de que o termo de Hartree e V

depende de n(r), o qual

depende de , que por sua vez depende de .

2.15.4

O Método RESP (Restrained Electrostatic Potential)

Como resultado de um cálculo quântico, nós obtemos o potencial

eletrostático (ElectroStatic Potential - ESP). É a partir do ESP que se gera a

distribuição das cargas nas moléculas.

Fig 2.17 Esquema representando a obtenção das cargas a partir do ESP para o heme

(as cargas mostradas são só ilustrativas, o gráfico foi gerado com o VMD).

Existem diferentes metodologias para gerar cargas através do ESP, sendo

que entre as mais bem sucedidas estão:

• O método CHELPG (CHarges from ELectrostatic Potential using a

Grid based method, (Breneman et al., 1990))

• O método RESP (Bayly et al., 1993)

No caso de sistemas nos quais existem átomos fortemente blindados

(chamados de átomos ocultos) como o ferro no centro do anel porfirínico, o

método CHELPG falha. Entre as falhas do método CHELPG estão a

superestimação ou subestimação das cargas de átomos ocultos e a variação da

distribuição das cargas com a conformação da molécula (Bayly et al., 1993).

Já o método RESP diminui a variabilidade da distribuição das cargas com a

conformação e estima melhor as cargas dos átomos ocultos. O método RESP

envolve uma aproximação em dois níveis de cálculo, onde as cargas dos átomos

como os hidrogênios metil são forçadas a ser equivalentes até o segundo nível do

cálculo. Neste ponto estas cargas são reajustadas, enquanto que as cargas dos

outros átomos são mantidas nos valores do primeiro nível (Bayly et al., 1993).

Os resultados baseados no método RESP dão valores concordantes com a

energia conformacional para pequenas moléculas e também reproduzem

corretamente as energias livres de solvatação (Wang et al., 2000).

Resultados e Discussão

3.1

Cálculo das cargas das porfirinas

O complexo da protoporfirina IX com o Fe

produz o heme. Ambas

moléculas têm carga total -2 em pH=7. O grupo heme é muito importante em

muitos aspectos da vida, sendo responsável pelo armazenamento e distribuição de

moléculas de oxigênio no organismo. Um anel porfirínico consiste de 4 anéis

pirrol conectados todos eles por pontes de metano. Um anel pirrol é um grupo de

4 átomos de carbono e um átomo de nitrogênio unidos em um anel (Fig. 1.3).

É o íon Fe

que dá a capacidade à molécula de se combinar com outros dois

ligantes. No caso da hemoglobina, um dos ligantes é o oxigênio e na HSA um dos

ligantes axiais é a TYR-161, como demonstraremos no presente trabalho. O

monóxido de carbono tem grande afinidade pelo heme e desloca o oxigênio. No

caso da hemoglobina, especialmente quando a concentração de CO no corpo

humano alcança 40% , isto pode produzir efeitos irreversíveis na saude.

3.1.1

Cálculo quântico - programa Gamess

O programa Gamess (General Atomic and Molecular Electronic Structure

System) é desenvolvido pelo grupo de M. S. Gordon, do Departamento de

Química da Universidade do Estado de Iowa e segue a filosofia de código aberto

(Schmidt et al., 1993). Começou a se desenvolver baseado no programa HONDO

existente já no ano 1981.

Entre as muitas capacidades do Gamess mencionaremos brevemente as

seguintes:

1. Calcula funções de onda de campo autoconsistente usando

aproximações RHF (restricted Hartree-Fock), UHF (unrestrited

Hartree-Fock), ROHF (restricted open shell Hartree-Fock), GVB

(generalized valence bond), ou MCSCF (multi-configuration self-

consistent field).

2. Calcula a energia de correlação eletrônica para estas funções de

onda SCF usando a aproximação DFT, entre outras aproximações.

3. Calcula modelos semi-empíricos como MNDO, AM1 ou PM3

usando funções de onda RHF, UHF, ROHF, ou GVB.

4. Otimiza geometrias moleculares usando coordenadas internas ou

cartesianas.

5. Procura estados de transição sobre a superfície de energia

potencial.

6. Computa freqüências dos modos normais de vibração, as

intensidades infravermelhas e intensidades Raman.

Além das já mencionadas, o programa tem muitas outras capacidades

(Schmidt et al., 1993).

3.1.2

Base escolhida na entrada do Gamess para o cálculo do ESP

O “input” do Gamess para o cálculo do ESP pode ser visto no apêndice I.

Os cálculos foram feitos usando o método B3LYP, ou seja, usando a DFT com

termos de correlação e intercâmbio dados pela equação 42. O conjunto de bases

escolhido para todos os cálculos foi a 6-31G** (para otimização de geometria se

usouse 6-31). Essa escolha foi feita para considerar que os metais de transição

apresentam orbitais d e p. Esse conjunto de bases foi padrão para os cálculos do

ESP, de modo que os resultados pudessem ser comparados.

Esses dados são colocados no Gamess através de um input, que contém a

geometria molecular, o conjunto de bases, o método utilizado e que dados se quer

calcular, como, por exemplo, o potencial eletrostático. Também é necessário

colocar a carga total do sistema (em unidades atômicas), assim como sua

multiplicidade de spin.

A multiplicidade do sistema foi escolhida como se todos os elétrons

estivessem emparelhados, menos um, no máximo. Pela equação 2S + 1 (S é o spin

total do sistema), isto resulta em multiplicidade 1 para sistemas com número par

de elétrons (S=0) e multiplicidade 2 para sistemas com número ímpar de elétrons

(S=1).

3.1.3

Otimizando a geometria das porfirinas

Para obter a otimização da geometria se realizou o seguinte (apêndice 1):

• Primeira otimização de geometria por Mecanica Molecular (MM):

Desenhou-se a geometria usando o programa Ghemical

(http://www.uiowa.edu/~ghemical/) e se gerou o arquivo pdb correspondente.

Depois, usando o mesmo programa, foi feita uma otimização de geometria usando

MM e gerando o pdb correspondente.

• Segunda otimização de geometria usando a aproximação ROHF: O

último pdb gerado no passo anterior serve com “input” neste passo.

Usa-se um cálculo:

• RUNTYP: OPTIMIZE (otimização de geometria)

• SCFTYP: ROHF: Para levar em conta os elétrons desemparelhados

das últimas camadas

• GBASIS: N31

• NGAUS: 6 uma combinação linear de 6 gaussianas

• ICHARGE: -2

• MULT: 1

As estruturas otimizadas são mostradas na Fig 1.3. Uma vez obtida a

segunda geometria otimizada procedemos ao cálculo do ESP.

3.1.4

Obtenção das cargas a partir do ESP

Para a obtenção das cargas a partir do ESP se usou o método RESP, já

discutido no item 2.12.4, o qual estima melhor as cargas dos átomos “ocultos”

(átomos com pouca SAS). No caso das porfirinas os átomos que formam o anel

porfirínico têm pouca SAS, assim como também o Fe

Os resultados são mostrados na Tabela1. Da tabela podemos observar o

seguinte:

As cargas obtidas para o heme com a metodologia RESP estão em boa

concordância com as cargas do campo de forças Gromos 53A6, as quais foram

obtidas semiempiricamente para reproduzir os valores experimentais de energia

livre de solvatação e entalpia de formação (Oostenbrink et al., 2005). É assim que

com metodos puramente quanticos consegimos reproduzir cargas ajustadas para

reproduzir valores experimentais o qual nos gera confianza nas cargas que

calcularemos para o PPIX.

Quando o PPIX é complexado com o íon Fe

, as cargas dos átomos de

nitrogênio aumentam de ~ 80%. Apesar dessas diferenças de cargas nos átomos de

nitrogênio, este não tem efeito sobre o caráter hidrofobico da porfirina (Fig. 3.3)

As cargas dos primeiros vizinhos dos átomos de nitrogênio e do grupo

carboxil são influenciadas pela ligação do Fe

. Observa-se importantes alterações

de carga nos primeiros vizinhos dos átomos de nitrogênio, tales como os átomos

14 e 25. Para os átomos de oxigênio do grupo carboxil (1, 3, 21 e 22) as mudanças

são mínimas, da ordem de 8% (Tabela-1).

Observa-se que o átomo 13 tem variações na carga de -0.017 a -0.093,

provavelmente porque ele esta próximo aos átomos de carbono ressonantes 12 e

14. Os átomos 43 e 30 também têm variações de carga, devido a sua proximidade

com os átomos de carbono ressonantes 42 e 29. Observamos mudanças

comformacionais induzidas nestas regiões pelo íon Fe

Fig. 3.1 À esquerda, protoporfirina IX depois de uma otimização de

geometria. Os números estão relacionados com as posições dos átomos na tabela

1. À direita, a PPIX complexada com Fe

(heme) depois de uma otimização de

geometria.

Tabela 1. Cargas RESP obtidas do cálculo DFT (terceira e quinta colunas) e

a distribuição das cargas do GROMOS5A36 para o heme (quarta coluna)

Distribuição das cargas

Átomo PPIX HEME/53A6 HEME/DFT

*Fe 0.400 0.363

1 OBJ -0.593 -0.635 -0.644

2 CBI 0.381 0.270 0.463

3 OBK -0.593 -0.635 -0.644

4 CBH 0.016 0.000 0.019

5 CBG 0.168 0.000 0.084

6 CAX -0.334 0.000 -0.098

7 CAV 0.149 0.000 0.060

8 CBE -0.083 0.000 -0.053

9 CAR 0.159 0.000 -0.071

10 CAQ -0.117 -0.100 -0.069

*HHB 0.100 0.113

11 NAW -0.438 -0.100 -0.095

12 CAY 0.233 0.000 -0.046

13 CBD -0.017 -0.100 -0.093

*HHA 0.100 0.183

14 CBB 0.279 0.000 -0.030

15 NBA -0.298 -0.100 -0.059

16 HBA 0.234

17 CBC -0.364 0.000 -0.108

18 CBL 0.156 0.000 0.055

19 CBM 0.039 0.000 -0.035

20 CBN 0.356 0.270 0.601

21 OBP -0.593 -0.635 -0.644

22 OBO -0.593 -0.635 -0.644

23 CAZ 0.135 0.000 0.061

24 CBF -0.021 0.000 -0.007

25 CAT 0.041 0.000 -0.080

26 CAS -0.036 -0.100 -0.064

*HHD 0.100 0.061

27 CAM 0.174 0.000 -0.108

28 NAN -0.471 -0.100 -0.055

29 CAL -0.052 0.000 -0.026

30 CAO -0.010 0.000 0.070

31 CAP -0.094 0.000 -0.149

32 CAK 0.072 0.000 0.122

33 CAU -0.092 0.000 -0.061

34 CAJ 0.157 0.000 -0.060

35 CAI -0.070 -0.100 -0.154

*HHC 0.100 0.111

36 CAD 0.083 0.000 -0.104

37 NAE -0.249 -0.100 -0.012

38 HAE 0.279

39 CAB 0.067 0.000 -0.152

40 CAA 0.108 0.000 0.111

41 CAH -0.054 0.000 -0.063

42 CAC -0.021 0.000 -0.006

43 CAF -0.020 0.000 0.070

44 CAG -0.074 0.000 -0.112

3.2

Geração das topologias para as porfirinas

PPIX / HEME

A informação sobre a topologia da PPIX não está disponível no campo de

forças Gromos5A36. Para a construção desta topologia usamos o servidor

PRODRG (http://davapc1.bioch.dundee.ac.uk/programs/prodrg/)(Schuettelkopf et

al., 2004) o qual gera parâmetros para as ligações, ângulos e cargas. Inserimos

como entrada para este servidor web um arquivo no formato pdb da PPIX

otimizada geometricamente. Finalmente, no arquivo de saída do servidor,

mudamos as cargas pelas cargas que já tínhamos calculado por meio do cálculo

quântico.

A topologia assim gerada é mostrada no apêndice II.

No caso do heme, a topologia já existe no campo de forças Gromos5A36 e

aqui somente as cargas foram trocadas pelas obtidas no cálculo quântico, o

PRODRG não foi usado neste ultimo caso.

3.3

Solvatação e estabilidade das porfirinas na água

O efeito hidrofóbico tem um papel importante em ‘folding” de proteínas,

reconhecimento molecular e numerosos processos tecnológicos (Ding et al.,

2000). Atualmente, há muitos estudos acerca dos processos de solvatação e

hidratação de hemoproteínas (Lounnaset et al., 1994; Phillps et al., 1995; Gu et

al., 1995), mas poucos sobre a influência da solvatação do heme e seu precursor, a

PPIX.

O contacto hidrofóbico ocorre principalmente na ligação do heme e da PPIX

nos bolsões hidrofóbicos da hemoglobina, mioglobina e transportadores como a

HSA (Wardell et al 2002). Os resultados da solvatação nos dariam elementos para

investigar o comportamento das moléculas num meio semelhante ao fisiológico.

Com o objetivo de estudar a relação estrutura-solvente, formação de pontes

de hidrogênio, camadas de solvatação e o caráter hidropático das porfirinas foi

realizada uma DM de 10 ns. Antes da DM, se realizou uma minimização de

energia para estabilizar o sistema, na qual as porfirinas foram colocadas numa

caixa de água (ver Fig. 3.2) sob as seguintes condições:

1. As moléculas porfirinas foram inseridas numa caixa junto com 6825

moléculas de água, com uma distância de 15 Å entre o soluto e a

parede da caixa.

2. Estabeleceram-se condições periódicas de contorno.

3. Sistema termodinamicamente acoplado a um banho térmico de 310 K.

4. Pressão 1 atm.

5. Modelo de água SPC.

6. O sistema tem carga total -2 e foi neutralizado com dois íons sódio

(Na

7. Tratamento eletrostático PME.

8. As interações de van der Waals e Coulomb foram consideradas com

um corte de 1 nm.

9. Passo na simulação de 2 fs.

10. Trajetórias atômicas colhidas para análise de 10 ns

Figura 3.2 Esquerda e direita: PPIX e Heme numa caixa de água. (gráfico gerado com

VMD)

A minimização de energia (ME) consiste dos seguintes passos:

1. ME com restrição de posição do soluto usando o algoritmo steepest-

descent, para relaxar somente o solvente e evitar a sobreposição dos

raios de van der Waals das moléculas de água.

2. ME sem restrição de posição usando o algoritmo steepest-descent,

para relaxar o sistema soluto-solvente.

3. ME sem restrição de posição usando gradiente conjugado.

A dinâmica molecular (DM) consiste dos seguintes passos:

1. DM de 500 ps com restrição de posição do soluto, com o objetivo de

permitir a formação das camadas de hidratação.

2. DM de 500 ps sem restrição de posição para equilibrar o sistema.

3. Finalmente uma DM de 10 ns para estudar a interação entre as

porfirinas com a água.

A relação agua-porfirina foi analisada usando-se a função de distribuição

radial (FDR) g(r) durante a DM de 10 ns, com os resultados a seguir.

3.3.1

Heme e PPIX

A Fig. 3.3 mostra o gráfico de g(r) para as moléculas protoporfirina IX e

heme. Empregando-se a Energia Livre de Helmholtz na forma W(r)= - kT ln g(r),

demonstra-se que ambas moléculas têm um caráter global hidrofóbico, pois g(r) é

menor que 1, gerando um potencial de força média repulsivo, o qual é típico de

moléculas hidrofóbicas. Além disso, g(r) não mostra picos característicos de

ligações de hidrogênio. A presença do Fe

não tem um efeito global na

hidrofobicidade da PPIX.

Figura 3.3 Gráfico de g(r) para as moléculas de protoporfirina IX e heme. A distância

é em relação às moléculas de água.

3.3.2

Grupo carboxil

O heme e a PPIX têm dois grupos carboxil desprotonados em pH 7.0, com

uma carga total de –1 cada um. Em nosso estudo, o gráfico de g(r) ao redor deste

grupo mostra o caráter total hidrofílico e uma ponte de hidrogênio bem definida,

perto de 0.19 nm. (Fig. 3.4). Nesse caso g(r) atinge valores maiores que 1 e

portanto W(r) será atrativa. Na primeira camada de hidratação podemos observar

que a presença do íon Fe

no anel central diminui a afinidade do carboxil pelo

solvente. Observamos-nos que as cadeias laterais da PPIX onde os grupos

carboxil são localizados se juntam apreciavelmente na presença do Fe

(Fig. 1).

Esta mudança conformacional poderia originar a exclusão de moléculas de água,

diminuindo o g(r).

Figura 3.4 Gráfico do g(r) para o grupo carboxil. A distância é com relação aos

átomos de hidrogênio da água (preto, para o heme e vermelho, para a PPIX)

3.3.3

Oxigênio do carboxil

A Fig. 3.4 mostra que, como um todo, o grupo carboxil tem um caráter

hidrofílico (g(r)>1), mas na Fig. 3.5 pode-se notar que existe um entorno

hidrofílico bem localizado nos oxigênios do carboxil. Podemos observar que o

primeiro e segundo picos indicam uma forte interação atrativa com o solvente.

Nossos resultados sugerem que a presença do íon Fe

no anel porfirínico

não muda significativamente a hidropaticidade do oxigênio dos grupos carboxil.

Figura 3.5. Gráfico de g(r) para o oxigênio do carboxil do PPIX e Heme. A distancia

refere-se aos átomos de hidrogênio das moléculas de água (preto para o heme e

vermelho para o PPIX)

3.3.4

O Fe

do heme

A Fig 3.6 mostra o g(r) das moléculas de água para o íon Fe2+. Aqui mostra-se,

paradoxalmente, que o íon teria um caráter global hidrofóbico pois g(r) é menor

que 1. No entanto, o efeito aqui observado é a blindagem do acesso do Fe2+ à

água pelo anel do heme. A carga parcial do íon Ferro no heme é de cerca de 0,4

(tabela-1), suficiente para atrair moléculas de água (através dos átomos de

oxigênio). O íon forma três camadas de hidratação bem definidas, a primeira em

aproximadamente 0.19 nm.

Figura 3.6 Gráfico de g(r) para o íon Fe

. A distância está referida às moléculas de

água (vermelho) ou ao átomo do oxigênio da agua (preto).

3.4

DM dos sistemas HSA, HSA-PPIX e HSA-HEME, Propriedades globais

A topologia da HSA foi gerada usando o comando pdb2gmx do

GROMACS, as topologias das porfirinas foram inseridas nos arquivos com a

topologia da HSA. O protocolo usado para a DM destos complexos é mostrado no

Apêndice C. As condições de simulação foram as seguintes:

1. Uma distancia do soluto a parede da caixa de 15 Å ao redor da HSA e

do complexo HSA-HEME (No caso do HSA-PPIX usamos uma

distancia do soluto a parede da caixa de 12 Å)

2. Estabeleceram-se condições periódicas de contorno.

3. Sistema termodinamicamente acoplado a um banho térmico de 310K.

4. Pressão 1 atm.

5. Modelo de água SPC.

6. O sistema tem carga total -16 e -18 (para os complexos do HSA-

Porfirinas) e foi neutralizado com Na

7. Tratamento eletrostático PME.

8. As interações de van der Waals e Coulomb foram consideradas com

um corte de 1 nm.

9. Passo na simulação de 2 fs.

10. Trajetórias atômicas colhidas em 20 ns de simulação.

A minimização de energia consiste dos seguintes passos:

1. ME com restrição de posição usando o algoritmo steepest-descent.

2. ME sem restrição de posição usando o algoritmo steepest-descent.

3. ME sem restrição de posição usando gradiente conjugado.

A DM consiste dos seguintes passos:

1. DM de 500 ps com restrição de posição do soluto, com o objetivo de

de permitir a formação das camadas de hidratação.

2. DM de 500 ps sem restrição de posição para equilibrar o sistema.

3. Finalmente uma DM de 20 ns para estudar a evolução dos complexos

na água.

Da Fig. 3.7 podemos observar que a dinâmica molecular da HSA e seus

complexos mostram conformações diferentes. Esta diferença é notória

principalmente na região de random coil (aminoácidos de 105 até 115) do

subdomínio IB, o qual perde flexibilidade por causa do ligante e acompanha a

dinâmica do IB. Isto contribui para afastar os subdomínios IB e IIIB, fazendo mais

notória sua separação, ver Fig. 3.8.

3.4.1

Desvio médio quadrático

Em simulações de Dinâmica Molecular, mesmo após a etapa prévia de

equilíbrio e termalização, quando os átomos do sistema atingem uma distribuição

de velocidades compatível com a temperatura, o relaxamento das estruturas ainda

continua por tempos que vão além de centenas de picosegundos. Isto ocorre

geralmente devido às diferenças entre o ambiente aquoso da simulação de

macromoléculas biológicas e a estrutura cristalina inicial. Para avaliar o

comportamento global das estruturas foi calculado a Raiz do Desvio Medio

Quadratico (Root mean square desviation, RMSD) para os sistemas, no tempo,

tomando como referência a estrutura após as minimizações. Estas análises

permitem acompanhar dinamicamente as variações da estrutura em relação à

estrutura antes da DM. Os resultados são mostrados na Fig. 3.9

Figura 3.7 Da esquerda para a direita, HSA-HEME, HSA-PPIX e HSA, mostrando a

conformação da porfirina cada 2 ns.

Ramdom Coil

Figura 3.8 De cima para baixo, sobreposição da estrutura inicial (marrom) e final

(azul) da HSA, HSA-PPIX e HSA-HEME (o ligante não é mostrado).

IIIB

0 2000 4000

6000

8000 10000 12000 14000

16000

18000 20000

Tempo (ps)

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

RMSD (nm)

0 2000 4000

6000

8000 10000 12000 14000

16000

18000 20000

Tempo (ps)

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

RMSD (nm)

HSA-PPIX

PPIX

0 2000 4000

6000

8000 10000 12000 14000

16000

18000 20000

Tempo (ps)

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

RMSD (nm)

HSA-HEME

HEME

Figura 3.9 De cima para baixo: Em preto, RMSD da cadeia de HSA, HSA-PPIX e

HSA-HEME em relação à cadeia da estrutura inicial. Em vermelho, RMSD dos ligantes

em relação ao ligante na estrutura inicial.

Da Fig. 3.9 podemos observar que o HSA e o HSA-heme conseguem se

estabilizar totalmente a partir dos 10 ns, não sendo assim com o complexo HSA-

PPIX, o qual se estabilizou nos primeiros 1500 ps. Por esta razão, nós tomaremos

como faixa temporal útil para análise de 10 – 20 ns, nos três sistemas.

Podemos observar que os ligantes estabilizam rapidamente e que

acompanham as flutuações globais que a proteína sofre. No caso do complexo

HSA-PPIX no intervalo de 1200 a 1400 ps, a proteína sofre uma grande flutuação

que, como veremos quando analisarmos o raio de giro, isso pode ser devida a um

movimento de rotação ou de “respiração” da proteína. Neste caso, a PPIX

acompanha as mudanças de seu hospedeiro.

No caso dos dois complexos o ligante acompana as mudancas do hospedero,

esto é notório no HSA-HEME no intervalo de 3 - 4ns.

Para ver o tempo de estabilização do ligante na proteína fazemos um zoom

no intervalo de tempo de 0 – 1 ns, como se mostra nas Figuras 3.10 e 3.11.

0 100 200 300 400

500 600

700 800 900 1000

Tempo (ps)

0,05

0,1

0,15

0,2

RMSD (nm)

Figura 3.10 RMSD da PPIX com relação a PPIX na estrutura inicial, como se pode

observar, o ligante se estabiliza nos primeiros 250 ps

0 100 200 300 400

500

600

700 800 900 1000

Tempo (ps)

0,05

0,1

0,15

0,2

RMSD (nm)

Figura 3.11 RMSD do heme no sítio de ligação durante o primeiro nano segundo da

simulação. Como se pode observar, o heme se estabiliza nos primeiros 150 ps.

Nestas últimas duas figuras, observamos que os ligantes se estabilizam

rapidamente no sítio de ligação principal do subdomínio IB. O PPIX se estabiliza

nos primeiros 250 ps. Já o heme se estabiliza mais em aproximadamente 150 ps.

Como veremos mais adiante quando analisaremos as pontes de hidrogênio, esta

diferença no tempo de estabilização poderia ser explicada pelo fato que a LYS-

190 estaria atuando como uma tampa molecular, que fixaria o heme no bolso

hidrofóbico. Como veremos a LYS-190 forma pontes de hidrogênio com os

oxigênios do grupo carboxil do heme.

3.4.2

Desvio médio quadrático 3D

Com o objetivo de se ter uma melhor visualização de quais sub-domínios

mais contribuem com as mudanças no RMSD, analisaremos o RMSD-3D para

cada sistema. Para isto usamos o programa MOLMOL

(http://hugin.ethz.ch/wuthrich/software/molmol/index.html). As Figuras 3.12,

3.13 e 3.14 mostram as quatro vistas principais da proteína.

Nas Figuras 3.13 e 3.14 podemos observar o efeito estabilizador dos ligantes

na proteína, na região mostrada na Fig. 3.12 (seta vermelha). Esta região em

“ramdom coil” se mostra ainda mais estável na presença do heme que da PPIX.

Figura 3.12 RMSD 3D do HSA, mostrando as quatro vistas principais; A: vista frontal;

B: vista posterior; C: vista superior; D: vista inferior. Como podemos observar o HSA tem

4 subdomínios principais com muita mobilidade e são os mais expostos ao solvente. A

figura central no corresponde à conformação A, é só referencial e mostra uma vista

frontal com as posições dos subdomínios.

Figura 3.13 RMSD 3D do HSA-PPIX, mostrando as quatro vistas principais; A: vista

frontal; B: vista posterior; C: vista superior; D: vista inferior. (o ligante não e mostrado). A

figura central no corresponde à conformação A, é só referencial e mostra uma vista

frontal com as posições dos subdomínios.

Figura 3.14 RMSD 3D do HSA-HEME, mostrando as quatro vistas principais; A: vista

frontal; B: vista posterior; C: vista superior; D: vista inferior (o ligante não e mostrado). A

figura central no corresponde à conformação A, é só referencial e mostra uma vista

frontal com as posições dos subdomínios.

3.4.3

Raio de Giro

O raio de giro nos dá informação a respeito da evolução da geometria da

proteína, se esta gira ou se esta realiza movimentos periódicos de contração e

expansão (respiração). Estes movimentos de giro ou de contração acontecen

quando o raio de giro com respeito aos eixos se cruzam. A seguir mostramos o

raio de giro para os três sistemas.

O raio de giro é calculado com o comando g_gyrate do Gromacs usando a

seguinte formula:













∑

Onde m

é a massa do átomo i e r

a posição do átomo com referência ao

centro de massa da molécula.

0 2000 4000

6000

8000 10000 12000 14000

16000

18000 20000

Tempo (ps)

1,5

2,5

Rg (nm)

RgX

RgY

RgZ

Figura 3.15 Raio de giro da HSA

5000

10000

15000

20000

Time (ps)

1,5

2,5

Rg (nm)

RgX

RgY

RgZ

Figura 3.16 Raio de giro do complexo HSA-PPIX

0 2000 4000

6000

8000 10000 12000 14000

16000

18000 20000

Tempo (ps)

1,5

2,5

Rg (nm)

RgX

RgY

RgZ

Figura 3.17 Raio de giro do complexo HSA-HEME

Nestas simulações a HSA e o complexo HSA-PPIX apresentaram grandes

movimentos de domínios, com oscilações e rotações, enquanto o complexo HSA-

HEME permaneceu mais estável, apresentando somente oscilações de pequenas

amplitudes. Porém, esses movimentos não são conclusivos, pois estamos

analisando somente 20 ns e uma única simulação de cada sistema. Assim, não

temos amostragens temporais ou de ensemble suficientes para análise, por

exemplo, de movimentos de baixa freqüência e grandes amplitudes. Na escala de

tempo de dezenas de nanosegundos em complexos macromoleculares com mais

de 100.000 átomos, como o que está em estudo, são possíveis várias análises

sobre flutuações locais, estrutura e estabilidade de ligações de hidrogênio com

ligantes e caracterização da superfície intermolecular, como será feito a seguir.

3.4.4

Evolução da energia

Para ver se o sistema é estável energeticamente, fizemos o gráfico da

evolução da energia total do sistema no tempo. Na Fig. 3.18, podemos ver que os

sistemas HSA e seus complexos são estáveis durante toda a DM. Fazendo um

zoom no intervalo de 0 – 1 ns como mostra a Fig. 3.19, vemos que a partir dos

100 ps, pode-se considerar que o sistema é estável energeticamente.

A diferença de energia entre os sistemas HSA, HSA-heme com referência

ao HSA-PPIX é devido ao número das moléculas de água. No último sistema se

considerou só uma distância do soluto até a parede da caixa de 12 Å,

diferentemente dos 15 Å considerados para os dois primeiros.

0 2000 4000

6000

8000 10000 12000 14000

16000

18000 20000

Tempo (ps)

-1,48e+06

-1,46e+06

-1,44e+06

-1,42e+06

-1,4e+06

-1,38e+06

-1,36e+06

-1,34e+06

-1,32e+06

-1,3e+06

-1,28e+06

-1,26e+06

E (kJ mol

-1

)

HSA

HSA-PPIX

HSA-HEME

Figura 3.18 Energia total do HSA e seus complexos, mostrando que o sistema é

estável energeticamente.

0 100 200 300 400

500

600

700 800 900 1000

Tempo (ps)

-1,48e+06

-1,46e+06

-1,44e+06

-1,42e+06

-1,4e+06

-1,38e+06

-1,36e+06

-1,34e+06

-1,32e+06

-1,3e+06

-1,28e+06

-1,26e+06

E (kJ mol

-1

)

HSA

HSA-PPIX

HSA-HEME

Figura 3.19 Energia total do HSA e seus complexos, mostrando que o sistema já é

estável a partir dos 100 ps.

3.4.5

Flexibilidade dos resíduos na proteína

Usaremos a flutuação da raiz media quadratica (root mean square

fluctuations, RMSF) para fazer um estudo da flexibilidade dos diferentes

subdomínios do HSA e ver o efeito do ligante nessas regiões. A RMSF é

calculada comparando-se as estruturas instantâneas obtidas em cada passo da

simulação com a estrutura inicial antes da DM. Usamos os átomos de carbono alfa

da proteína. Os resultados para cada complexo são mostrados nas Figuras 3.20 e

3.21. Já a Fig. 3.22 mostra a superposição dos complexos HSA-HEME e HSA-

PPIX.

Pode-se observar o seguinte:

A região de “random coil” compreendida entre os aminoácidos 105 e 115

experimenta grandes flutuações (RMSF do HSA, Fig. 3.20), o que é mostrado

tamben no RMSD-3D.

Na Fig. 3.20 para o HSA, os subdomínios que experimentam maior RMSF

são os IIB e IIIB enquanto os que experimentam o menor RMSF são os

subdomínios IIA e IIIA (exceto na região “random coil” entre os amino ácidos

460-480).

Este resultado é interesante tendo presente que os subdomínios IIA e IIIA

são os principais sítios de ligação da proteína, e se esperaria que regioes com

grande flexibilidade fossem tamben as de maior actividade regulatoria. Mas Artali

et al. (2005) já relataram estudos teoricos que confirmam nossos resultados.

Quando o HSA e complexado com o ligante, o RMSF do HSA muda,

mostrando que os “random coils” nos subdomínios IB e IIIA são interdependentes

e a mobilidade de um afeta a mobilidade do outro (Fig. 3.22). Assim, em geral o

padrão do RMSF do HSA muda na presença das diferentes porfirinas.

Quando comparamos os RMSF dos complexos HSA-PPIX e HSA-heme,

observamos que em geral o PPIX tem um efeito estabilizador mais pronunciado

sobre a proteína nas distintas regiões do HSA, da seguinte forma:

Entre os resíduos 260-290, 433-446, 462-473, 493-503, 547-582 o heme

aumenta a flexibilidade da proteína.

A PPIX tem efeitos pontuais importantes nas regiões 347-356 e 361-380

onde a flexibilidade aumenta pronunciadamente.

IIB

0 100 200 300 400

500

600

Residuo

0,2

0,4

0,6

0,8

RMSF (nm)

HSA

HSA-PPIX

Figura 3.20 RMSF de HSA e de HSA complexada com PPIX, mostrando as variações

produzidas nos diferentes subdomínios e os possíveis efeitos alostéricos produzidos na

HSA.

0 100 200 300 400

500

600

Residuo

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

RMSF (nm)

HSA

HSA-HEME

Figura 3.21 RMSF de HSA e de HSA complexada com heme, mostrando as variações

produzidas nos diferentes subdomínios e os possíveis efeitos alostéricos produzidos no

HSA.

IIIA

IIB

IIA

IIIB

IIA

IIB

IIIA

IIIB

0 100 200 300 400

500

600

Residuo

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

RMSF (nm)

HSA-HEME

HSA-PPIX

Figura 3.22 RMSF do HSA-heme e do HSA-PPIX, mostrando as variações produzidas

nos diferentes subdomínios pela presença do íon Fe

3.5

Superfície de contato intermolecular entre HSA e as porfirinas

Quais são os resíduos que mais interagem com as porfirinas?

Para responder a esta pergunta faremos uso do conceito de superfície de

contacto intermolecular (SCI). Com esta informação visualizaremos a distância no

tempo entre os diferentes aminoácidos (e os átomos principais) com referência aos

ligantes.

Para determinar quais são os aminoácidos do HSA que interagem com as

porfirinas calculou-se a SCI entre os aminoácidos da proteína e os ligantes. A SCI

é determinada pela interseção entre a SAS do ligante e a SAS da proteína.

Para isso se gerou um arquivo multi pdb com o comando trjconv do

GROMACS, considerando somente os últimos 10 ns da DM, registrando-se as

posições atômicas com um espaçamento temporal de 100 ps. Para o cálculo da

SCI se usou o programa SURF desenvolvido no Laboratório de Modelagem e

Dinâmica Molecular (LMDM) do Instituto de Biofisica Carlos Chagas Filho.

O programa SURF está baseado no algoritmo de Connolly (Connolly, 1983)

e precisa, além do multi pdb, dados como o raio de prova (1.4 Å) e a densidade de

IIIB

IIIA

IIB

IIA

pontos (1 ponto/Å

). Com estes dados disponíveis, rodo-se o SURF e obtive-se as

áreas de contato intermolecular dos aminoacidos que interagem com as porfirinas.

Com estes dados pode-se recriar o micro entorno molecular de cada uma das

porfirinas, determinar a importância dos aminoácidos na estabilidade do sítio

ativo, determinar a hidropaticidade do sítio de ancoramento, determinar a natureza

da interação entre os resíduos do HSA e as porfirinas, além de várias outras

informações.

Da Fig. 3.23 na qual observamos a área de contato intermolecular HSA-

HEME e HSA-PPIX por resíduo. Os 10 principais aminoácidos do HSA que

interagem como o heme são os seguintes :

ARG-186, TYR-161, ILE-142, LEU-115, ARG-145, TYR-138, HIS-146,

LEU-139, LYS-190, LEU-154

As LEU, ILEU, TYR e HIS são aminoácidos com caráter hidrofóbico e, por

conseguinte, o HEME fica ancorado num bolso predominantemente hidrofóbico.

Estes aminoácidos parecem ser de muita importância na alta afinidade do HSA

pelo HEME.

No caso do HSA com o PPIX, os principais aminoácidos que interagem são

os seguintes:

TYR-138, TYR-161, LEU-139, ILE-142, LEU-154, LEU-115, LEU-135,

PHE-157, ARG-186, ALA-158.

Como podemos ver o PPIX interage com mais leucinas, e fica ancorado no

bolso hidrofóbico do heme. Também podemos observar cinco regiões de interação

claramente definidas centradas nos resíduos: LEU-115, TYR-138, LEU-154,

TYR-161, ARG-186, o que poderia definir um padrão de interação do HSA com

estas porfirinas.

Na região centrada na TYR-138 a PPIX apresenta uma maior SCI

comparada com o heme. Isto é devido à contribuição dos aminoácidos LEU-139 e

TYR-138.

Na região centrada na LEU-154 se observa que a PPIX apresenta maior SCI

devido à contribuição dos aminoácidos LEU-154 e LEU-155.

Na região centrada na TYR-161 se observa que a PPIX apresenta maior SCI

devido a contribuição dos aminoácidos PHE-157 e ALA-158.

Já na região centrada na ARG-186 o heme apresenta maior SCI devido à

contribuição dos aminoácidos ARG-186 e LEU-182.

Figura 3.23 Área de contacto intermolecular entre HSA e as porfirinas

3.6

Distância entre os aminoácidos do HSA que mais interagem com as

porfirinas

3.6.1

Distância entre os aminoácidos do HSA que mais interagem com

PPIX

Para visualizar a relação entre os movimentos dos principais aminoácidos

analizaremos a distância entre os centros de massa (CM) do PPIX e dos três

aminoácidos que mais interagem com a PPIX com respeito ao CM da cadeia da

proteína.

Como sabemos dos resultados do RMSD da PPIX na proteína, esta

estabiliza nos primeiros 250 ps, por conseguinte analisaremos os dados de toda a

DM.

Na Fig. 3.24 vemos que o único aminoácido que poderia estar realizando

algum tipo de enlace com a PPIX seria a TYR-161. A distância mínima é de 1 Å

no tempo de 8470 ps e a distância máxima é de 3,6 Å em 18753 ps.

Observa-se que nos primeiros 4 ns a TYR-161 acompanha o comportamento

do ligante. Depois desse tempo, o aminoácido sofre reacomodações até se

estabilizar definitivamente depois do 10.5 ns, quando passa a seguir o padrão de

conduta da PPIX.

A TYR-138 e LEU-139 seguem o mesmo padrão de conduta do ligante com

uma distância média de separação com referência ao ligante de 7,3 Å e 4,5 Å,

respectivamente.

Quais seriam as causas pelas quais a TYR-161 sofre essa série de reacomodações

no intervalo entre 4 e 10,5 ns?

Para responder a esta pergunta faremos uma análise mais detalhada da

interação TYR-161 e a PPIX considerando os átomos interagentes. Da DM se

observou que o átomo de oxigênio do OH interage com o anel porfirínico, mas

quais são os átomos de nitrogênio do anel que têm função estabilizadora nesta

interação?

Para responder a esta pergunta graficamos a distância entre o oxigênio OH-

TYR161 e os nitrogênios NAW-PPIX e a distância entre oxigênio OH-TYR161 e

o nitrogênio NAE-PPIX.

Observa-se na Fig. 3.25 que o oxigênio permanece ligado com uma

distância média de 4 Å, sendo esta ligação definida a partir dos 10.5 ns.

Na Fig. 3.26 mostramos a distância entre o átomo de oxigênio OH-TYR161

e os átomos de nitrogênio restantes do anel. Observa-se que durante os primeiros

10.5 ns o oxigênio tem uma distância média de 4 Å, para depois se afastar dos

nitrogênios a uma distância média de 5,5 Å. Isto nos indica que a TYR-161 fica

inicialmente armadilhada no anel porfirínico por causa dos nitrogênios e depois

dos 10.5 ns ela se estabiliza basicamente adotando uma posição fixa com

referência aos nitrogênios da Fig. 3.25.

0 2000 4000

6000

8000 10000 12000 14000

16000

18000 20000

Tempo (ps)

1,2

1,4

1,6

1,8

2,2

2,4

2,6

Distancia (nm)

TRY-161

TYR-138

LEU-139

PPIX

Figura 3.24 Distância do centro de massas dos aminoácidos e do ligante PPIX à

cadeia de HSA. Pode-se observar a correlação entre as posições dos aminoácidos e do

ligante.

0 2000 4000

6000

8000 10000 12000 14000

16000

18000 20000

Tempo (ps)

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

Distancia (nm)

OH-TYR161-->NAW-PPIX

OH-TYR161-->NAE-PPIX

Figura 3.25 Distância entre o OH da TYR-161 e os nitrogênios NAW e NAE do ligante

PPIX, mostrando que durante a DM a distância média permanece a mesma.

0 2000 4000

6000

8000 10000 12000 14000

16000

18000 20000

Tempo (ps)

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

Distancia (nm)

OH-TYR161-->NBA-PPIX

OH-TYR161-->NAN-PPIX

Figura 3.26 Distância entre o OH da TYR-161 e os nitrogênios NBA e NAN do ligante

PPIX, mostrando que durante os primeiros 10.5 ns da DM a TYR-161 está quase no

centro do anel porfirínico tendo a mesma distância de 4 Å, em média, com relação aos 4

nitrogênios do anel e que depois dos 10.5 ns ela se afasta dos nitrogênios NBA e NAN

para se estabilizar com os outros nitrogênios restantes.

3.6.2

Distância entre os amino ácidos do HSA que mais interagem com o

HEME

Para visualizar a relação entre os movimentos dos principais aminoácidos

analisaremos a distância entre os centros de massa (CM) do heme e dos três

aminoácidos que mais interagem com a heme com respeito ao CM da cadeia da

proteína.

Como vimos nos resultados do RMSD do heme na proteína, esta estabiliza

nos primeiros 150 ps, por conseguinte analisaremos os dados de toda a DM. Da

Fig. 3.27 podemos dizer o seguinte: em geral os três aminoácidos seguem o

padrão de conduta do heme. Considerando só o intervalo de 10 – 20 ns, os três

aminoácidos não se afastam do padrão do heme.

Visualizando a trajetória da DM do heme no HSA, vemos que o oxigênio

OH da TYR-161 interage frontalmente com o Fe-heme, formando um enlace

pentacoordenado com o Fe (ver Fig. 3.28). A distância mínima é de 2.1 Å, a

distância máxima é 5,9 Å e a distância média é 3,8 Å (ver Fig. 3.29). Valores

experimentais da distância de ligação de Fe ao OH-TYR161 são dados em

(Wardell et al., 2002), no qual a distância do Fe ao plano do heme é de 2,73 Å.

Na Fig. 3.30, mostram-se os gráficos comparando as microvizinhanças

encontradas por difração de raios X (Wardell et al., 2002) e com nossa

metodologia de cálculo. Em nossa DM observamos que a TYR-161 faz pontes de

hidrogênio com os aminoácidos PHE-157, PHE-165 e com as moléculas de água

W6209 e W8834, os quais parecem ter um papel importante na estabilização da

ligação com o íon Fe.

Observam-se estas duas moléculas de água no lado proximal e não se

observam moléculas de água no lado distal (ver Fig. 3.30). Podemos observar que

a TYR-138 se encontra do outro lado do anel porfirínico, podendo ter um papel

semelhante ao da histidina proximal como na hemoglobina.

0 2000 4000

6000

8000 10000 12000 14000

16000

18000 20000

Tempo (ps)

1,5

2,5

Distancia (nm)

TYR-161

TYR-138

ILE-142

HEME

Figura 3.27 Distância dos principais aminoácidos do HSA que interagem com o heme

ao CM da cadeia.

Figura 3.28 No lado proximal, TYR-161 interagindo frontalmente com o Fe

do heme;

no lado distal TYR-138 interagindo com os nitrogênios do anel. A mutação de ambas

TYR por HIS poderia fornecer um entorno semelhante ao da hemoglobina.

0 2000 4000

6000

8000 10000 12000 14000

16000

18000 20000

Tempo (ps)

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

Distancia (nm)

OH-TYR164-->Fe-HEME

Figura 3.29 Distância entre o oxigênio OH-TYR161 e o íon Fe

do heme.

Figura 3.30 Comparação teórica-experimental. Em A, a microvizinhança molecular

obtido por raios X (Wardell et al., 2002); em B, a microvizinhança molecular obtido em

nossos cálculos. Colocou-se o nome de alguns aminoácidos como referência, W denota

moléculas de água no lado proximal.

3.7

Pontes de hidrogênio entre o HSA e as porfirinas

Interações não covalentes são essenciais para manter a estrutura da proteína,

para os processos de reconhecimento e para as interações ligante-proteína.

Ligações de hidrogênio são uma classe de interação não covalente e têm um papel

importante na afinidade do ligante pelo sítio de ligação. Aqui nós mostraremos as

ligações de hidrogênio e identificaremos os átomos doadores e aceitores.

Nas tabelas 2 e 3 mostramos as pontes de hidrogênio diretas formadas entre

as porfirinas e os aminoácidos no bolso hidrofóbico, mostramos tambem o tempo

de prevalencia definido como el porcentaje do tempo no qual se manten a

estrutura de ponte de hidrogenio. Pode-se observar o seguinte:

Heme/PPIX

A LYS-190 faz ligação de hidrogênio com os carboxilatos do heme. A mais

curta e mais forte ocorre entre o hidrogênio do NZHZ2 e o oxigênio O2D do heme

e a mais fraca e de menor prevalência é feita entre o hidrogênio do NH com o

oxigênio O1A do heme. Estes resultados concordam com o observado

experimentalmente por Wardell et al. (2002).

Da DM se observa que a LYS-190 está sempre entre os dois grupos carboxil

e forma pontes salinas permanentemente entre eles. Desta forma a LYS-190, que

está na entrada do bolso hidrofóbico, estaria atuando como uma “tampa” que

ajudaria a fixar o heme. Já as ligações de hidrogênio entre a PPIX e a LYS-190

são desprezíveis.

A ARG-145 faz ligações de hidrogênio com os oxigênios dos grupos

carboxil do heme, tendo maior prevalência com os átomos de oxigênio O1D e

O2D e menor prevalência os átomos de oxigênio O1A e O2A. A DM parece

indicar que a ARG-145 teria o um efeito estabilizador no ligante muito parecido

ao LYS-190.

Já no caso do PPIX este aminoácido ARG-145 forma pontes de hidrogênio

com uma prevalência importante só com o nitrogênio NH1-HH11 e o oxigênio

OBK, assim o efeito estabilizador da ARG-145 é pouco importante na PPIX.

A ARG-114, que se encontra localizada na entrada do bolso hidrofóbico,

forma uma ponte de hidrogênio com o átomo de nitrogênio NH1-HH11 e o átomo

de oxigênio O2D do heme. Já no caso do PPIX este aminoácido forma pontes de

hidrogênio só com os átomos de oxigênios OBK e OBJ de um grupo carboxil do

PPIX.

Tabela 2: Pontes de hidrogênio diretas entre o HSA e o heme e % de prevalência

coluna) numa DM de 20 ns.

Doador

Hidrogênio

Aceptor Prev. (%)

193SER OG 193SER HG 583HEME O2A 2.03

190LYSH NZ 190LYSH HZ2 583HEME O2D 34.63

190LYSH N 190LYSH H 583HEME O1A 20.34

146HISB NE2 146HISB HE2 583HEME O2D 2.85

145ARG NE 145ARG HE 583HEME O1A 9.38

145ARG NE 145ARG HE 583HEME O2A 7.84

145ARG NE 145ARG HE 583HEME O1D 13.52

145ARG NE 145ARG HE 583HEME O2D 17.68

114ARG NH1 114ARG HH11 583HEME O2D 21.54

114ARG NE 114ARG HE 583HEME O1D 3.52

Tabela 3: Pontes de hidrogênio diretas entre o HSA e o PPIX e % de prevalência

coluna) numa DM de 20 ns.

Doador

Hidrogênio

Aceptor Prev. (%)

190LYSH NZ 190LYSH HZ3 583PYP OBP 2.99

190LYSH NZ 190LYSH HZ2 583PYP OBP 4.48

190LYSH NZ 190LYSH HZ3 583PYP OBO 2.49

146HISB NE2 146HISB HE2 583PYP OBP 2.99

145ARG NH2 145ARG HH21 583PYP OBO 3.98

145ARG NH1 145ARG HH11 583PYP OBK 9.95

114ARG NH1 114ARG HH11 583PYP OBJ 14.43

114ARG NH1 114ARG HH11 583PYP OBK 22.89

Nas Figuras 3.31 e 3.32 observamos que PPIX faz em média maior número

de ligações de hidrogênio com as moléculas de água na vizinhança do sítio de

ligação que o heme. Isto é devido a que o heme faz, em média, maior número de

ligações com a proteína (Tabela 2 e figuras 3.31 e 3.32). Nos gráficos dessas

figuras, são consideradas todas as pontes de hidrogênio com o solvente, incluindo

as pontes intermediadas por água.

18000

18500

19000

19500

20000

Tempo (ps)

Numero de ligacoes de hidrogenio

Proteina

Solvente

Figura 3.31 Ligações de hidrogênio da PPIX com HSA (preto) e o com o água nas

vizinhanças do sítio de ligação (vermelho)

18000

18500

19000

19500

20000

Tempo (ps)

Numero de ligacoes de hidrogenio

Solvente

Proteina

Figura 3.32 Número de ligações de hidrogênio do heme com a proteína (preto) e com

o solvente presente nas vizinhanças do sítio de ligação (vermelho)

3.8

Análise da superfície eletrostática dos sistemas HSA, HSA-PPIX e

HSA-heme

A superfície eletrostática (SE) de uma proteína nos dá informação sobre a

distribuição de cargas na superfície da molécula, o que pode indicar prováveis

sítios de ligação de interesse. No nosso caso, a superfície eletrostática de HSA

possibilitaria a previsão do melhor local de interação da proteína com as

porfirinas.

A superfície eletrostática da proteína é colorida de acordo com o potencial

eletrostático. Em vermelho encontram-se regiões de potencial negativo, em azul,

potenciais positivos e em branco, regiões neutras. Nas figuras 3.33 e 3.34

mostramos as superfícies eletrostáticas moleculares de HSA e seus complexos,

calculadas pelo programa APBS (Baker et al., 2001), visualizadas pelo programa

PMV (Sanner et al., 1999) depois de uma DM de 20 ns .

Em um primeiro exame da superfície eletrostático (ver Fig. 3.33, notamos

que o padrão de distribuição das cargas positivas (em azul) e negativo (em

vermelho) da proteína muda conforme o ligante. Dados preliminares do RMSD-

3D (ver Fig. 311, 3.12 e 3.13) e do RMSF (ver Fig. 3.20 e 3.21) indicaram que a

acomodação dos ligantes no subdomínio IB modifica a conformação dele. O

“random coil” presente nessa região perde muita flexibilidade de forma a alterar a

distribuição de cargas na superfície. Essa perda de mobilidade por efeito do

ligante contribui para gerar a separação entre os subdomínios IB, IA, IIA e os sub

domínios IIIA, IIIB como se observa na Fig. 3.33. Além disso, tem-se observado

que a PPIX tem um efeito de diminuir a flexibilidade com relação ao heme. Isso é

visto na superfície eletrostática entre ambos complexos.

Pode-se observar a presença de três regiões de potencial positivo (região

central da proteína) inicialmente isoladas no HSA. A presença dos ligantes gerou

a união desses domínios positivo. A PPIX torna evidente esta união, mas heme

preservou-se esta união de domínios positivos e isolou-se região dos subdomínios

IB e IIA.

Porém, como dito anteriormente, mais dados são necessários para melhor

caracterizar as macro-mudanças conformacionais, as quais estão associadas a

movimentos de grande amplitude, passíveis de análise em MD envolvendo

maiores tempos de simulação ou com o emprego de outras técnicas como cálculo

da Dinâmica Essencial e Modos Normais de Vibração.

Fazendo um zoom no subdomínio IB (ver Fig. 3.34), vemos que o padrão

eletrostático é totalmente alterado na presença do ligante, sugerindo que a

interação ligante–proteína é responsável pela formação do sítio de ligação das

porfirinas, mas deve-se ter presente que no plasma humano os diversos ligantes

que o HSA transporta, como os ácidos graxos, poderiam contribuir para a pré-

formação dos sítios de ligação das porfirinas.

Ja no nosso modelo de calculo nos inserimos as porfirinas em sitios pre-

formados, mas a interacào entre as porfirinas aumento o volumen dessos sitios.

Figura 3.33 De cima para baixo: superfície eletrostática do HSA, HSA-PPIX e HSA-

heme depois de 20 ns de DM (em azul: potencial eletrostático positivo, em vermelho:

negativo).

100

Figura 3.34 De cima para baixo: superfície eletrostática do subdomínio IB do HSA,

HSA-PPIX e HSA-heme depois de 20 ns de DM.

101

3.9

Prováveis segundos sitio de ligação das porfirinas no HSA

Evidências experimentais (Zhang et al., 2002) têm proposto a possível

existência de um segundo sitio de ligação da PPIX com o HSA usando técnicas

baseadas em eletroforese. Nesses estudos não se dá referências sobre a possível

posição do segundo sítio de ligação.

Após realizar a DM de 20 ns do complexo HSA-PPIX fazemos um analise

da superfície e do potencial eletrostático sobre esta para identificar uma região

que tenha uma área e potencial favoráveis para a ligação do PPIX.

Localizou-se a região mostrada na Fig. 3.33 com uma seta vermelha, para

confirmar se esta região poderia ser um segundo sítio de ligação realizou-se um

Docking Molecular usando o programa AUTODOCK.

O resultado do Docking mostra que a região localizada entre os sub

domínios IIA e IIIA seria um possível sitio de ligação (ver Fig. 3.35 e 3.36). Este

resultado poderá ser confirmado fazendo uma DM da porfirina no HSA nesse

sitio. Se o resultado dessa DM mostrasse que a porfirina é estável nesse sitio, teria

se confirmado o segundo sitio de ligação.

Figura 3.35 Segundo provável sitio de ligação da PPIX no HSA

102

Figura 3.36 Potencial eletrostático na superfície da proteína na região do segundo

provável sitio de ligação da PPIX no HSA

Considerando que o heme e o PPIX tem características hidrofóbicas e cargas

iguais, este segundo provável sitio de ligação poderia hospedar também o heme.

3.10

Existem regiões do HSA correlacionadas ao subdomínio IB?

Antes de começar esta última seção devemos mencionar que os resultados

correspondentes a este item, não puderam ser comparados com estudos prévios

experimentais ou teóricos, que correlações os movimentos atômicos nas diferentes

regiões do HSA, porque estes não existem até o momento.

Como vimos nas Figuras 3.20 e 3.21, a ligação da porfirina no subdomínio

IB muda o padrão do RMSF. Isto nos leva a fazer a seguinte pergunta: As

diferentes regiões da HSA correlacionadas?

Escolhemos os elementos carbono alfa (C

, atomos que compoen o

esqueleto da proteina) da cadeia para aplicar a matriz de correlação, porque tomar

a proteína inteira faria inviável nosso cálculo. Devemos mencionar uma vez mais

que um resultado mais conclusivo só será obtido com uma dinâmica longa (tempo

de simulação > 100 ns), em nosso caso tomaremos uma faixa temporal entre 5ns –

20 ns.

Um valor do coeficiente de correlação igual a zero significa que não existe

correlação. Um valor menor que um, mas maior que zero significa que existe

103

correlação. Esta correlação pode ser baixa, média ou alta; para distingui-las

usaremos um código de cores.

Vermelho: Correlação muito baixa (0 – 0.1)

Amarelo : Correlação baixa (0.1-0.2)

Verde : Correlação media (0.2-0.5)

Azul : Correlação alta (0.5-1)

Como primeiros passos determinarão o padrão de correlação total (termos

linearmente correlacionados e termos não linearmente correlacionados) do HSA e

o compararemos com o padrão de correlação linear. Desta forma podemos saber a

contribuição dos termos não lineares no padrão de correlação das direferentes

regiões do HSA.

Na Fig. 3.37, pode-se observar “pequenas mudanças” no padrão de

correlação, estas mudanças são difíceis de visualizar, mas para ter uma melhor

idéia geraremos a matriz da diferença entre a matriz de correlação total e

correlação linear, como é mostrado na Fig. 3.38.

Fig. 3.37 Padrão do HSA: Linear (triangulo superior direito), total (triangulo inferior

esquerdo).

104

Fig. 3.38 Matriz da diferença entre a matriz de correlação total e linear do HSA

Podemos observar que, de forma global, considerar só os movimentos

correlacionados linearmente gera uma perda de informação ~40%.

Da matriz da diferença vemos que existem zonas bem localizadas (zonas em

azul) onde os termos não lineares são importantes.

Nas figuras 3.39 e 3.40, mostramos os padrões de correlação generalizados

do HSA-HEME e do HSA-PPIX

105

Fig. 3.39 Padrão de correlação generalizada: HSA (triangulo superior direito), HSA-

HEME (triangulo inferior esquerdo).

106

Fig. 3.40 Padrão de correlação generalizada: HSA (triangulo superior direito), HSA-PPIX

(triangulo inferior esquerdo).

Agora veremos os efeitos do heme inserido no subdomínio IB e as

mudanças no padrão de correlação. Tentaremos encontrar as regiões da proteína

que poderiam estar correlacionadas com ela. Para isso traçaremos duas verticais

paralelas começando do resíduo 100 até o 200 (subdomínio IB), e duas horizontais

paralelas começando do resíduo 100 até o 200, Fig. 3.41

A região compreendida nessas paralelas e com coeficiente de correlação

diferente de zero, chamaremos de regiões diretamente correlacionadas, e aquelas

que estão fora das paralelas, mas que contribuem com os movimentos atômicos

destas chamaremos de regiões indiretamente correlacionadas. O gráfico inserido

(da Fig. 3.21) na Fig. 3.41 mostra o padrão de RMSD do HSA e do HSA-HEME,

o objetivo é explicar este padrão com base nos movimentos correlacionados dos

átomos.

107

Fig. 3.41 Padrão de correlação generalizada: HSA (triângulo superior direito), HSA-

HEME (triângulo inferior esquerdo). Nesta figura mostra-se entre as paralelas as regiões

diretamente correlacionados com a região compreendida entre os resíduos 100-200.

Da Fig. 3.41, pode-se observar o seguinte, os resíduos 110 a 118 no HSA

estão altamente correlacionados com os resíduos 460-465 (seta vermelha), mas

uma vez que o heme é ligado, esta correlação diminui apreciavelmente. Isto

explica o observado na inserção da Fig. 3.41 ou na Fig. 3.21 (visualizemos estas

regiões na Fig.3.41).

0 100 200 300 400

500

600

Residuo

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

RMSF (nm)

HSA

HSA-HEME

108

Fig. 3.42 Região (100-118, vermelho) correlacionada com a região (460-465, amarelo)

Agora observemos a região em torno ao resíduo 310 (seta preta), que perde

correlação uma vez que o heme é inserido. Isto se manifesta como uma perda de

mobilidade, como se vê na figura inserida na Fig. 3.41. Visualizemos esta região

na Fig. 3.43.

Fig. 3.43 Região (100-118, vermelho) correlacionada com a região (306-313, amarelo)

Esta correlação já não é facilmente evidente, pois as duas regiões se

encontram afastadas, mas fortemente correlacionadas. Observamos da Fig. 3.38

que grande parte destes movimentos correlacionados são não lineares. Isto pode

109

ser explicado pelo fato de considerar um sistema de N massas-molas. Quando

N=2 se têm um sistema com uma alta correlação linear, mais quando N é muito

grande se perde a correlação linear entre a primeira e ultima massa-mola do

sistema, assim para N grande os efeitos não lineares contribuem mais aos

movimentos correlacionados.

Finalmente, veremos que a região entre os 110-140 está diretamente

correlacionada com a região 500-582 (marcada com um “}” na Fig. 3.41) como já

era evidenciado na figura inserida na Fig. 3.41, mas esta região mantém e aumenta

a correlação um vez que o heme é inserido. Visualizemos estas regiões na Fig.

3.44.

Fig. 3.44 Região (110-140, vermelho) correlacionada com a região (500-582, amarelo)

Estudos com maior detalhe serão realizados com uma dinâmica longa destes

sistemas e servirão de base para estudos de efeitos alostéricos, pré-formação de

sitos de ligação por inserção de ligante, efeitos entrópicos, etc.

110

Conclusão e Perspectivas

4.1

Conclusões

1. Considerando a função de distribuição radial g(r) entre grupos de

átomos das porfirinas e as moléculas de água como uma medida da

afinidade destes grupos pelo solvente, demonstramos o caráter não

homogêneo da hidropaticidade das porfirinas. O caráter hidrofóbico

está concentrado no anel porfirínico e o caráter hidrofílico se reduz

aos átomos do grupo carboxil. Os grupos carboxil desprotonados são

importantes no transporte das porfirinas porque eles formam enlaces

de hidrogênio bem definidos com o solvente.

2. Na DM de 20 ns dos complexos HSA-porfirinas, observaram-se

câmbios conformacionais no subdomínio IB por efeito da ligação

com as porfirinas. Observou-se que, apesar de os principais sítios de

ligação de várias drogas localizarem-se nos subdomínios IIA e IIIA,

estes sofrem menos flutuações que os demais o qual concorda com

os resultados experimentais mostrados na literatura.

3. Em geral a PPIX tem um efeito mais estabilizador que o heme no

HSA.

4. Na DM de HSA-heme, determinou-se que a TYR-161 e a TYR-138

ocupam posições semelhantes à da HIS proximal na hemoglobina.

Determinou-se que as moléculas de água no lado distal do heme são

importantes na orientação da TYR-161, na ligação com o íon Fe.

Determinou-se que a LYS-190 poderia estar atuando como uma

“tampa” para o heme no bolso hidrofóbico, confirmando o mostrado

na literatura..

5. Determinou-se o provável segundo sitio de interação entre as

porfirinas e o HSA, tomou-se como referência a PPIX, a qual

111

poderia corroborar os resultados experimentais de Zhang et al.

(2002).

6. Determinou-se o padrão de correlação do HSA para uma DM de

20 ns e sua variação na presença das porfirinas, assim como as

correlações existentes entre as diferentes regiões do HSA. Uma DM

de 100 ns poderia-nos oferecer resultados definitivos.

4.2

Perspectivas

Com base nos resultados obtidos temos as seguintes perspectivas:

1. Realizar mutações das TYR-161 e TYR-138, proximal e distal, e de

aminoácidos que rodeiam o heme, a fim de recriar o entorno hidrofóbico

da hemoglobina. Em particular testar mutações por histidina, para ver se

estas são capazes de controlar a ligação com oxigênio, como na

hemoglobina.

2. Realizar uma DM para determinar se as porfirinas são estáveis no segundo

provável sítio de ligação.

3. Realizar um estudo de correlação de uma DM de 100 ns para comparar

com nossos resultados da DM de 20 ns e para verificar a existência de

movimentos correlacionados que se gerariam numa escala de tempo maior.

112

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117

118

Apêndice A : Inputs do Gammes

Otimização de Geometria do heme

$CONTRL RUNTYP=OPTIMIZE COORD=CARTESIAN EXETYP=RUN

$END

$BASIS GBASIS=N31 NGAUSS=6 $END

$CONTRL SCFTYP=RHF MAXIT=200 MULT=1 $END

$CONTRL ICHARG=-2 $END

$SYSTEM TIMLIM=6000 MEMORY=90000000 $END

$STATPT OPTTOL=0.0001 NSTEP=1000 $END

$BASIS GBASIS=STO NGAUSS=2 $END

$GUESS GUESS=HUCKEL $END

$STATPT OPTTOL=0.0001 NSTEP=1000 $END

$DATA

HEME

C 6 -3.661910 3.681267 0.060634 0.027877

C 6 -2.423211 3.002899 -0.046667 0.110923

C 6 -2.696873 1.588362 -0.020966 0.391591

N 7 -4.080307 1.431462 0.095164 -0.774294

C 6 -4.688276 2.675346 0.152980 0.396551

C 6 -1.734789 0.559033 -0.099498 -0.395207

C 6 -1.948108 -0.794452 -0.129508 0.411487

C 6 -0.900035 -1.843399 -0.193621 0.093444

C 6 -1.556749 -3.060840 -0.157696 0.118978

C 6 -3.009030 -2.750304 -0.094810 0.429775

N 7 -3.214615 -1.423453 -0.075699 -0.724857

C 6 -4.027114 -3.761875 -0.069740 -0.448793

C 6 -5.369010 -3.530014 -0.035383 0.432517

C 6 -6.454000 -4.557200 0.003288 0.040080

C 6 -7.658421 -3.901777 0.104804 0.101728

119

C 6 -7.393110 -2.435100 0.120398 0.444717

N 7 -6.004630 -2.280267 -0.003177 -0.808842

C 6 -9.000339 -4.458117 0.175522 -0.515274

C 6 -8.329065 -1.454462 0.227583 -0.425592

C 6 -8.066169 -0.042329 0.262747 0.407779

C 6 -9.169012 0.967221 0.402160 0.114026

C 6 -8.551978 2.201258 0.439040 0.068334

C 6 -7.077231 1.952750 0.314474 0.426706

N 7 -6.856842 0.544197 0.220509 -0.768140

C 6 -6.251015 -5.982146 -0.054228 -0.133334

C 6 -5.375100 -6.604638 -0.845260 -0.354218

C 6 -1.000081 -4.411200 -0.182714 -0.526749

C 6 0.521347 -1.630725 -0.263499 -0.135075

C 6 1.129662 -0.708280 -1.012202 -0.340840

C 6 -10.573774 0.654711 0.471871 -0.567780

C 6 -9.205805 3.514286 0.553687 -0.328597

C 6 -9.991480 3.682775 1.842640 -0.339232

C 6 -11.492288 3.939333 1.622358 0.630438

O 8 -12.139585 4.454474 2.578798 -0.662226

C 6 -6.099899 2.897630 0.283412 -0.412695

C 6 -1.095308 3.607858 -0.170090 -0.569016

C 6 -3.833018 5.144360 0.030644 -0.359961

C 6 -3.125821 5.860696 1.167020 -0.345849

C 6 -2.186071 6.977588 0.680917 0.621695

O 8 -2.052926 7.996485 1.416512 -0.777873

O 8 -12.028465 3.606031 0.522658 -0.636275

O 8 -1.558943 6.822619 -0.411140 -0.770369

H 1 -6.913392 -6.565464 0.612893 0.135694

H 1 -4.712890 -6.070556 -1.539481 0.144778

H 1 -5.273754 -7.697161 -0.847564 0.133431

H 1 -9.559607 -4.036296 1.055753 0.159518

H 1 -8.983595 -5.571928 0.269522 0.137142

H 1 -9.585010 -4.192690 -0.748889 0.159893

H 1 -3.668392 -4.802564 -0.080811 0.150190

120

H 1 1.118993 -2.324023 0.358009 0.130159

H 1 2.221033 -0.595112 -1.018875 0.127900

H 1 0.585335 -0.013079 -1.664716 0.137997

H 1 -9.391756 -1.739531 0.295091 0.157633

H 1 -0.684495 0.917221 -0.139623 0.160546

H 1 -1.398475 -5.016206 0.671286 0.147577

H 1 0.115792 -4.386190 -0.108953 0.142969

H 1 -1.278630 -4.932634 -1.134053 0.147438

H 1 -6.391773 3.962015 0.365047 0.164622

H 1 -10.813729 0.054320 1.384589 0.117839

H 1 -10.884848 0.033594 -0.425921 0.108544

H 1 -11.199159 1.590510 0.478384 0.275291

H 1 -0.527510 3.149274 -1.017585 0.139082

H 1 -0.508275 3.449670 0.770196 0.140855

H 1 -1.183834 4.720404 -0.347589 0.202512

H 1 -9.927771 3.625038 -0.309833 0.193597

H 1 -8.444335 4.333252 0.463932 0.082440

H 1 -9.573228 4.536813 2.431834 0.102354

H 1 -9.909844 2.763202 2.476361 0.095549

H 1 -4.924441 5.403453 0.041121 0.148583

H 1 -3.405698 5.523951 -0.944258 0.166747

H 1 -2.496669 5.141978 1.752082 0.148565

H 1 -3.877549 6.302531 1.867332 0.155566

Fe 26 -4.919295 -0.384531 -0.009205 1.477452

$END

Otimização de geometría do PPIX

$CONTRL RUNTYP=OPTIMIZE COORD=CARTESIAN EXETYP=RUN

$END

$BASIS GBASIS=N31 NGAUSS=6 $END

$CONTRL SCFTYP=RHF MAXIT=200 MULT=1 $END

$CONTRL ICHARG=-2 $END

$SYSTEM TIMLIM=6000 MEMORY=90000000 $END

121

$STATPT OPTTOL=0.0001 NSTEP=1000 $END

$BASIS GBASIS=STO NGAUSS=2 $END

$GUESS GUESS=HUCKEL $END

$STATPT OPTTOL=0.0001 NSTEP=1000 $END

$DATA

PPIX

C 6.0 -3.25500 3.66000 -0.07700

C 6.0 -1.99400 2.90800 -0.13000

C 6.0 -4.22700 2.75300 -0.03000

C 6.0 -3.52900 1.45700 -0.00400

N 7.0 -2.20800 1.59000 -0.15000

C 6.0 -5.67600 3.02300 -0.01600

C 6.0 -6.56400 2.30000 -0.70500

C 6.0 -3.41600 5.15400 -0.15900

C 6.0 -4.14800 0.29500 0.22100

C 6.0 -3.53000 -1.03900 0.27600

C 6.0 -4.23300 -2.32100 0.49200

C 6.0 -3.36300 -3.34100 0.43200

C 6.0 -2.03000 -2.75500 0.20900

N 7.0 -2.31000 -1.34600 0.12700

C 6.0 -3.70800 -4.76900 0.55400

C 6.0 -3.18800 -5.72100 -0.22700

C 6.0 -0.79400 3.49400 -0.14900

C 6.0 0.51500 2.82400 -0.20600

C 6.0 -0.85000 -3.37700 0.13000

C 6.0 0.46700 -2.75400 -0.08600

C 6.0 -5.72200 -2.45900 0.65600

C 6.0 1.84300 3.47300 -0.28800

N 7.0 0.74300 1.57800 -0.24100

C 6.0 2.79700 2.53300 -0.36700

C 6.0 2.13300 1.22000 -0.33900

C 6.0 1.59000 -3.46200 -0.22000

N 7.0 0.68900 -1.43700 -0.15400

122

C 6.0 2.00900 -1.29100 -0.31400

C 6.0 2.64100 -2.46600 -0.37800

C 6.0 2.69600 0.01000 -0.37800

C 6.0 2.09000 4.95700 -0.24400

C 6.0 1.73800 -4.95800 -0.15700

C 6.0 4.27900 2.76500 -0.49000

C 6.0 4.93200 2.64800 0.90400

C 6.0 6.41900 2.83500 0.79300

O 8.0 6.79300 4.02700 0.33600

O 8.0 7.15200 1.86900 0.65900

C 6.0 4.11200 -2.72100 -0.57900

C 6.0 4.83100 -2.65800 0.78500

C 6.0 6.30600 -2.87600 0.60000

O 8.0 6.63000 -4.06400 0.09500

O 8.0 7.05600 -1.92500 0.45700

H 1.0 -6.04100 3.87500 0.55700

H 1.0 -6.24900 1.46800 -1.33300

H 1.0 -7.62100 2.56000 -0.66700

H 1.0 -3.10500 5.60900 0.79200

H 1.0 -4.46200 5.42500 -0.36100

H 1.0 -2.79300 5.55200 -0.97300

H 1.0 -5.21900 0.32500 0.39800

H 1.0 -4.44900 -5.06100 1.29800

H 1.0 -3.49700 -6.75700 -0.09600

H 1.0 -2.48300 -5.48000 -1.02000

H 1.0 -0.78200 4.58100 -0.12700

H 1.0 -0.86500 -4.45600 0.25100

H 1.0 -6.00100 -2.20600 1.68900

H 1.0 -6.04900 -3.48500 0.43500

H 1.0 -6.23900 -1.77700 -0.03500

H 1.0 3.78100 -0.00200 -0.43700

H 1.0 1.28900 5.46700 0.30800

H 1.0 2.13100 5.35300 -1.26900

H 1.0 3.04000 5.17500 0.26500

123

H 1.0 1.22900 -5.41500 -1.01900

H 1.0 1.28800 -5.33700 0.77300

H 1.0 2.79600 -5.25300 -0.17100

H 1.0 4.48100 3.75800 -0.91600

H 1.0 4.72000 2.01300 -1.16100

H 1.0 4.71500 1.66100 1.33800

H 1.0 4.51500 3.42600 1.56200

H 1.0 4.54400 -1.97500 -1.26200

H 1.0 4.26500 -3.71200 -1.02900

H 1.0 4.42400 -3.44600 1.43800

H 1.0 4.65800 -1.68000 1.25800

H 1.0 -1.91000 1.19100 -1.10900

H 1.0 0.17400 -1.02900 -1.01100

$END

Cálculo do ESP do HEME

$CONTRL RUNTYP= ENERGY DFTTYP=B3LYP EXETYP=RUN

MOLPLT=.TRUE. UNITS=ANGS $END

$BASIS GBASIS=N31 NGAUSS=6 NDFUNC=2 NPFUNC=1 $END

$CONTRL SCFTYP=ROHF MAXIT=200 MULT=1 $END

$CONTRL ICHARG=-2 $END

$BASIS POLAR=POPN31 $END

$SYSTEM TIMLIM=6000 MEMORY=90000000 $END

$STATPT OPTTOL=0.0001 NSTEP=1000 $END

$PDC PTSEL=CONNOLLY CONSTR=NONE VDWSCL=1.4 VDWINC=0.2

LAYER=4 $END

$GUESS GUESS=HUCKEL $END

$scf dirscf=.true. $end

$DATA

HEME

C 6 -3.659290 3.681267 0.060634 0.027877

C 6 -2.422114 3.002899 -0.046667 0.110923

C 6 -2.696873 1.588162 -0.020966 0.391591

124

N 7 -4.080307 1.431462 0.095164 -0.774294

C 6 -4.688276 2.675346 0.152980 0.396551

C 6 -1.732789 0.559933 -0.099498 -0.395207

C 6 -1.948108 -0.794752 -0.129508 0.411487

C 6 -0.900035 -1.843399 -0.193621 0.093444

C 6 -1.558749 -3.060840 -0.157696 0.118978

C 6 -3.009030 -2.750304 -0.094810 0.419775

N 7 -3.211615 -1.423453 -0.075999 -0.724857

C 6 -4.027114 -3.761875 -0.069740 -0.448793

C 6 -5.369010 -3.530014 -0.032383 0.432517

C 6 -6.454000 -4.557200 0.003288 0.040080

C 6 -7.658421 -3.901777 0.104804 0.101728

C 6 -7.393110 -2.435100 0.120398 0.434717

N 7 -6.004630 -2.280267 -0.003177 -0.808842

C 6 -9.010339 -4.458117 0.175522 -0.525274

C 6 -8.329065 -1.453462 0.227583 -0.425592

C 6 -8.066169 -0.042329 0.272737 0.407779

C 6 -9.159012 0.967221 0.402160 0.114026

C 6 -8.551978 2.201258 0.439040 0.068334

C 6 -7.077231 1.952750 0.314474 0.426706

N 7 -6.866842 0.544197 0.220509 -0.768140

C 6 -6.251015 -5.982146 -0.054228 -0.133334

C 6 -5.375100 -6.604638 -0.845260 -0.354218

C 6 -1.000081 -4.411200 -0.182714 -0.526749

C 6 0.521347 -1.630725 -0.263499 -0.135075

C 6 1.129662 -0.708280 -1.012202 -0.340840

C 6 -10.583774 0.644711 0.461871 -0.577780

C 6 -9.205805 3.514286 0.553687 -0.328597

C 6 -9.991480 3.682775 1.842640 -0.339232

C 6 -11.492288 3.939333 1.622358 0.630438

O 8 -12.139585 4.454474 2.578798 -0.662226

C 6 -6.099899 2.897630 0.283412 -0.412695

C 6 -1.095308 3.607858 -0.170090 -0.569016

C 6 -3.833018 5.144360 0.030644 -0.359961

125

C 6 -3.125821 5.860696 1.167020 -0.345849

C 6 -2.186071 6.977588 0.680917 0.621695

O 8 -2.052926 7.996485 1.416512 -0.777873

O 8 -12.028465 3.606031 0.522658 -0.636275

O 8 -1.558943 6.822619 -0.411140 -0.770369

H 1 -6.913392 -6.565464 0.612893 0.135694

H 1 -4.712890 -6.070556 -1.539481 0.144778

H 1 -5.273754 -7.697161 -0.847564 0.133431

H 1 -9.559607 -4.036296 1.055753 0.159518

H 1 -8.983595 -5.571928 0.269522 0.137142

H 1 -9.585010 -4.192690 -0.748889 0.159893

H 1 -3.668392 -4.802564 -0.080811 0.150190

H 1 1.118993 -2.324023 0.358009 0.130159

H 1 2.221033 -0.595112 -1.018875 0.127900

H 1 0.585335 -0.013079 -1.664716 0.137997

H 1 -9.391756 -1.739531 0.295091 0.157633

H 1 -0.684495 0.917221 -0.139623 0.160546

H 1 -1.398475 -5.016206 0.671286 0.147577

H 1 0.115792 -4.386190 -0.108953 0.142969

H 1 -1.278630 -4.932634 -1.134053 0.147438

H 1 -6.391773 3.962015 0.365047 0.164622

H 1 -10.813729 0.054320 1.384589 0.117839

H 1 -10.884848 0.033594 -0.425921 0.108544

H 1 -11.199159 1.590510 0.478384 0.275291

H 1 -0.527510 3.149274 -1.017585 0.139082

H 1 -0.508275 3.449670 0.770196 0.140855

H 1 -1.183834 4.720404 -0.347589 0.202512

H 1 -9.927771 3.625038 -0.309833 0.193597

H 1 -8.444335 4.333252 0.463932 0.082440

H 1 -9.573228 4.536813 2.431834 0.102354

H 1 -9.909844 2.763202 2.476361 0.095549

H 1 -4.924441 5.403453 0.041121 0.148583

H 1 -3.405698 5.523951 -0.944258 0.166747

H 1 -2.496669 5.141978 1.752082 0.148565

126

H 1 -3.877549 6.302531 1.867332 0.155566

Fe 26 -4.919295 -0.384531 -0.009205 1.477452

$END

Calculo do ESP do PPIX

$CONTRL RUNTYP=ENERGY DFTTYP=B3LYP EXETYP=RUN

MOLPLT=.TRUE. UNITS=ANGS $END

$BASIS GBASIS=N31 NGAUSS=6 NDFUNC=2 NPFUNC=1 $END

! DIFFSP=.T. DIFFS=.T. $END

$CONTRL SCFTYP=ROHF MAXIT=200 MULT=1 $END

$CONTRL ICHARG=-2 $END

$BASIS POLAR=POPN31 $END

$SYSTEM TIMLIM=600 MEMORY=80000000 $END

$STATPT OPTTOL=0.0001 NSTEP=1000 $END

$ELPOT IEPOT=1 WHERE=PDC OUTPUT=PUNCH $END

$PDC PTSEL=CONNOLLY CONSTR=NONE VDWSCL=1.4 VDWINC=0.2

LAYER=4 $END

$GUESS GUESS=HUCKEL $END

$scf dirscf=.true. $end

$DATA

ppix

C 6.0 -3.25500 3.66000 -0.07700

C 6.0 -1.99400 2.90800 -0.13000

C 6.0 -4.22700 2.75300 -0.03000

C 6.0 -3.52900 1.45700 -0.00400

N 7.0 -2.20800 1.59000 -0.15000

C 6.0 -5.67600 3.02300 -0.01600

C 6.0 -6.56400 2.30000 -0.70500

C 6.0 -3.41600 5.15400 -0.15900

C 6.0 -4.14800 0.29500 0.22100

C 6.0 -3.53000 -1.03900 0.27600

C 6.0 -4.23300 -2.32100 0.49200

C 6.0 -3.36300 -3.34100 0.43200

C 6.0 -2.03000 -2.75500 0.20900

127

N 7.0 -2.31000 -1.34600 0.12700

C 6.0 -3.70800 -4.76900 0.55400

C 6.0 -3.18800 -5.72100 -0.22700

C 6.0 -0.79400 3.49400 -0.14900

C 6.0 0.51500 2.82400 -0.20600

C 6.0 -0.85000 -3.37700 0.13000

C 6.0 0.46700 -2.75400 -0.08600

C 6.0 -5.72200 -2.45900 0.65600

C 6.0 1.84300 3.47300 -0.28800

N 7.0 0.74300 1.57800 -0.24100

C 6.0 2.79700 2.53300 -0.36700

C 6.0 2.13300 1.22000 -0.33900

C 6.0 1.59000 -3.46200 -0.22000

N 7.0 0.68900 -1.43700 -0.15400

C 6.0 2.00900 -1.29100 -0.31400

C 6.0 2.64100 -2.46600 -0.37800

C 6.0 2.69600 0.01000 -0.37800

C 6.0 2.09000 4.95700 -0.24400

C 6.0 1.73800 -4.95800 -0.15700

C 6.0 4.27900 2.76500 -0.49000

C 6.0 4.93200 2.64800 0.90400

C 6.0 6.41900 2.83500 0.79300

O 8.0 6.79300 4.02700 0.33600

O 8.0 7.15200 1.86900 0.65900

C 6.0 4.11200 -2.72100 -0.57900

C 6.0 4.83100 -2.65800 0.78500

C 6.0 6.30600 -2.87600 0.60000

O 8.0 6.63000 -4.06400 0.09500

O 8.0 7.05600 -1.92500 0.45700

H 1.0 -6.04100 3.87500 0.55700

H 1.0 -6.24900 1.46800 -1.33300

H 1.0 -7.62100 2.56000 -0.66700

H 1.0 -3.10500 5.60900 0.79200

H 1.0 -4.46200 5.42500 -0.36100

128

H 1.0 -2.79300 5.55200 -0.97300

H 1.0 -5.21900 0.32500 0.39800

H 1.0 -4.44900 -5.06100 1.29800

H 1.0 -3.49700 -6.75700 -0.09600

H 1.0 -2.48300 -5.48000 -1.02000

H 1.0 -0.78200 4.58100 -0.12700

H 1.0 -0.86500 -4.45600 0.25100

H 1.0 -6.00100 -2.20600 1.68900

H 1.0 -6.04900 -3.48500 0.43500

H 1.0 -6.23900 -1.77700 -0.03500

H 1.0 3.78100 -0.00200 -0.43700

H 1.0 1.28900 5.46700 0.30800

H 1.0 2.13100 5.35300 -1.26900

H 1.0 3.04000 5.17500 0.26500

H 1.0 1.22900 -5.41500 -1.01900

H 1.0 1.28800 -5.33700 0.77300

H 1.0 2.79600 -5.25300 -0.17100

H 1.0 4.48100 3.75800 -0.91600

H 1.0 4.72000 2.01300 -1.16100

H 1.0 4.71500 1.66100 1.33800

H 1.0 4.51500 3.42600 1.56200

H 1.0 4.54400 -1.97500 -1.26200

H 1.0 4.26500 -3.71200 -1.02900

H 1.0 4.42400 -3.44600 1.43800

H 1.0 4.65800 -1.68000 1.25800

H 1.0 -1.91000 1.19100 -1.10900

H 1.0 0.17400 -1.02900 -1.01100

$END

129

Apêndice B : Topologia da Protoporfirina IX

Topologia da Protoporfirina IX para o campo de forces GROMOS 96

; This file was generated by PRODRG version AA061128.0505

; PRODRG written/copyrighted by Daan van Aalten

; and Alexander Schuettelkopf

;

; Questions/comments to [email protected]

;

; When using this software in a publication, cite:

; A. W. Schuettelkopf and D. M. F. van Aalten (2004).

; PRODRG - a tool for high-throughput crystallography

; of protein-ligand complexes.

; Acta Crystallogr. D60, 1355--1363.

;

[ moleculetype ]

; Name nrexcl

PYP 3

[ atoms ]

; nr type resnr resid atom cgnr charge mass

1 OM 1 PYP OBJ 1 -0.5915 15.9994

2 C 1 PYP CBI 1 0.381 12.0110

3 OM 1 PYP OBK 1 -0.5915 15.9994

4 CH2 1 PYP CBH 1 0.016 14.0270

5 CH2 1 PYP CBG 1 0.168 14.0270

6 C 1 PYP CAX 1 -0.334 12.0110

7 C 1 PYP CAV 1 0.149 12.0110

8 C 1 PYP CBE 2 -0.083 14.0270

9 C 1 PYP CAR 2 0.159 12.0110

10 CR1 1 PYP CAQ 2 -0.117 13.0190

11 NR 1 PYP NAW 2 -0.438 14.0067

130

12 C 1 PYP CAY 2 0.233 12.0110

13 CR1 1 PYP CBD 2 -0.017 13.0190

14 C 1 PYP CBB 2 0.279 12.0110

15 NR 1 PYP NBA 3 -0.298 14.0067

16 H 1 PYP HBA 3 0.234 1.0080

17 C 1 PYP CBC 3 -0.364 12.0110

18 CH2 1 PYP CBL 3 0.156 14.0270

19 CH2 1 PYP CBM 3 0.039 14.0270

20 C 1 PYP CBN 3 0.356 12.0110

21 OM 1 PYP OBP 3 -0.5915 15.9994

22 OM 1 PYP OBO 3 -0.5915 15.9994

23 C 1 PYP CAZ 4 0.135 12.0110

24 C 1 PYP CBF 4 -0.021 14.0270

25 C 1 PYP CAT 4 0.041 12.0110

26 CR1 1 PYP CAS 4 -0.036 13.0190

27 C 1 PYP CAM 4 0.174 12.0110

28 NR 1 PYP NAN 4 -0.471 14.0067

29 C 1 PYP CAL 5 -0.052 12.0110

30 C 1 PYP CAO 5 -0.010 13.0190

31 C 1 PYP CAP 5 -0.094 14.0270

32 C 1 PYP CAK 5 0.072 12.0110

33 C 1 PYP CAU 5 -0.092 14.0270

34 C 1 PYP CAJ 5 0.157 12.0110

35 CR1 1 PYP CAI 5 -0.07 13.0190

36 C 1 PYP CAD 6 0.083 12.0110

37 NR 1 PYP NAE 7 -0.249 14.0067

38 H 1 PYP HAE 7 0.279 1.0080

39 C 1 PYP CAB 7 0.067 12.0110

40 C 1 PYP CAA 7 0.108 12.0110

41 C 1 PYP CAH 7 -0.054 14.0270

42 C 1 PYP CAC 7 -0.021 12.0110

43 C 1 PYP CAF 7 -0.02 13.0190

44 C 1 PYP CAG 7 -0.074 14.0270

[ bonds ]

; ai aj fu c0, c1, ...

1 2 2 0.125 13400000.0 0.125 13400000.0 ; OBJ CBI

2 3 2 0.125 13400000.0 0.125 13400000.0 ; CBI OBK

2 4 2 0.153 7150000.0 0.153 7150000.0 ; CBI CBH

4 5 2 0.153 7150000.0 0.153 7150000.0 ; CBH CBG

131

5 6 2 0.153 7150000.0 0.153 7150000.0 ; CBG CAX

6 7 2 0.133 11800000.0 0.133 11800000.0 ; CAX CAV

6 12 2 0.133 11800000.0 0.133 11800000.0 ; CAX CAY

7 8 2 0.133 11800000.0 0.133 11800000.0 ; CAV CBE

7 9 2 0.133 11800000.0 0.133 11800000.0 ; CAV CAR

9 10 2 0.133 11800000.0 0.133 11800000.0 ; CAR CAQ

9 11 2 0.133 11800000.0 0.133 11800000.0 ; CAR NAW

10 39 2 0.133 11800000.0 0.133 11800000.0 ; CAQ CAB

11 12 2 0.133 11800000.0 0.133 11800000.0 ; NAW CAY

12 13 2 0.133 11800000.0 0.133 11800000.0 ; CAY CBD

13 14 2 0.133 11800000.0 0.133 11800000.0 ; CBD CBB

14 15 2 0.133 11800000.0 0.133 11800000.0 ; CBB NBA

14 17 2 0.133 11800000.0 0.133 11800000.0 ; CBB CBC

15 16 2 0.100 18700000.0 0.100 18700000.0 ; NBA HBA

15 25 2 0.133 11800000.0 0.133 11800000.0 ; NBA CAT

17 18 2 0.153 7150000.0 0.153 7150000.0 ; CBC CBL

17 23 2 0.133 11800000.0 0.133 11800000.0 ; CBC CAZ

18 19 2 0.153 7150000.0 0.153 7150000.0 ; CBL CBM

19 20 2 0.153 7150000.0 0.153 7150000.0 ; CBM CBN

20 21 2 0.125 13400000.0 0.125 13400000.0 ; CBN OBP

20 22 2 0.125 13400000.0 0.125 13400000.0 ; CBN OBO

23 24 2 0.133 11800000.0 0.133 11800000.0 ; CAZ CBF

23 25 2 0.133 11800000.0 0.133 11800000.0 ; CAZ CAT

25 26 2 0.133 11800000.0 0.133 11800000.0 ; CAT CAS

26 27 2 0.133 11800000.0 0.133 11800000.0 ; CAS CAM

27 28 2 0.133 11800000.0 0.133 11800000.0 ; CAM NAN

27 29 2 0.133 11800000.0 0.133 11800000.0 ; CAM CAL

28 34 2 0.133 11800000.0 0.133 11800000.0 ; NAN CAJ

29 30 2 0.133 11800000.0 0.133 11800000.0 ; CAL CAO

29 32 2 0.133 11800000.0 0.133 11800000.0 ; CAL CAK

30 31 2 0.153 7150000.0 0.153 7150000.0 ; CAO CAP

32 33 2 0.133 11800000.0 0.133 11800000.0 ; CAK CAU

32 34 2 0.133 11800000.0 0.133 11800000.0 ; CAK CAJ

34 35 2 0.133 11800000.0 0.133 11800000.0 ; CAJ CAI

35 36 2 0.133 11800000.0 0.133 11800000.0 ; CAI CAD

36 37 2 0.133 11800000.0 0.133 11800000.0 ; CAD NAE

36 42 2 0.133 11800000.0 0.133 11800000.0 ; CAD CAC

37 38 2 0.100 18700000.0 0.100 18700000.0 ; NAE HAE

37 39 2 0.133 11800000.0 0.133 11800000.0 ; NAE CAB

39 40 2 0.133 11800000.0 0.133 11800000.0 ; CAB CAA

132

40 41 2 0.133 11800000.0 0.133 11800000.0 ; CAA CAH

40 42 2 0.133 11800000.0 0.133 11800000.0 ; CAA CAC

42 43 2 0.133 11800000.0 0.133 11800000.0 ; CAC CAF

43 44 2 0.153 7150000.0 0.153 7150000.0 ; CAF CAG

[ pairs ]

; ai aj fu c0, c1, ...

1 5 1 ; OBJ CBG

2 6 1 ; CBI CAX

3 5 1 ; OBK CBG

4 7 1 ; CBH CAV

4 12 1 ; CBH CAY

5 8 1 ; CBG CBE

5 9 1 ; CBG CAR

5 11 1 ; CBG NAW

5 13 1 ; CBG CBD

6 10 1 ; CAX CAQ

6 14 1 ; CAX CBB

7 13 1 ; CAV CBD

7 39 1 ; CAV CAB

8 10 1 ; CBE CAQ

8 11 1 ; CBE NAW

8 12 1 ; CBE CAY

9 13 1 ; CAR CBD

9 37 1 ; CAR NAE

9 40 1 ; CAR CAA

10 12 1 ; CAQ CAY

10 36 1 ; CAQ CAD

10 38 1 ; CAQ HAE

10 41 1 ; CAQ CAH

10 42 1 ; CAQ CAC

11 14 1 ; NAW CBB

11 39 1 ; NAW CAB

12 15 1 ; CAY NBA

12 17 1 ; CAY CBC

13 16 1 ; CBD HBA

13 18 1 ; CBD CBL

13 23 1 ; CBD CAZ

13 25 1 ; CBD CAT

14 19 1 ; CBB CBM

133

14 24 1 ; CBB CBF

14 26 1 ; CBB CAS

15 18 1 ; NBA CBL

15 24 1 ; NBA CBF

15 27 1 ; NBA CAM

16 17 1 ; HBA CBC

16 23 1 ; HBA CAZ

16 26 1 ; HBA CAS

17 20 1 ; CBC CBN

17 26 1 ; CBC CAS

18 21 1 ; CBL OBP

18 22 1 ; CBL OBO

18 24 1 ; CBL CBF

18 25 1 ; CBL CAT

19 23 1 ; CBM CAZ

23 27 1 ; CAZ CAM

24 26 1 ; CBF CAS

25 28 1 ; CAT NAN

25 29 1 ; CAT CAL

26 30 1 ; CAS CAO

26 32 1 ; CAS CAK

26 34 1 ; CAS CAJ

27 31 1 ; CAM CAP

27 33 1 ; CAM CAU

27 35 1 ; CAM CAI

28 30 1 ; NAN CAO

28 33 1 ; NAN CAU

28 36 1 ; NAN CAD

29 35 1 ; CAL CAI

30 33 1 ; CAO CAU

30 34 1 ; CAO CAJ

31 32 1 ; CAP CAK

32 36 1 ; CAK CAD

33 35 1 ; CAU CAI

34 37 1 ; CAJ NAE

34 42 1 ; CAJ CAC

35 38 1 ; CAI HAE

35 39 1 ; CAI CAB

35 40 1 ; CAI CAA

35 43 1 ; CAI CAF

134

36 41 1 ; CAD CAH

36 44 1 ; CAD CAG

37 41 1 ; NAE CAH

37 43 1 ; NAE CAF

38 40 1 ; HAE CAA

38 42 1 ; HAE CAC

39 43 1 ; CAB CAF

40 44 1 ; CAA CAG

41 43 1 ; CAH CAF

[ angles ]

; ai aj ak fu c0, c1, ...

1 2 3 2 126.0 770.0 126.0 770.0 ; OBJ CBI OBK

1 2 4 2 117.0 635.0 117.0 635.0 ; OBJ CBI CBH

3 2 4 2 117.0 635.0 117.0 635.0 ; OBK CBI CBH

2 4 5 2 109.5 520.0 109.5 520.0 ; CBI CBH CBG

4 5 6 2 109.5 520.0 109.5 520.0 ; CBH CBG CAX

5 6 7 2 120.0 560.0 120.0 560.0 ; CBG CAX CAV

5 6 12 2 120.0 560.0 120.0 560.0 ; CBG CAX CAY

7 6 12 2 108.0 465.0 108.0 465.0 ; CAV CAX CAY

6 7 8 2 120.0 560.0 120.0 560.0 ; CAX CAV CBE

6 7 9 2 108.0 465.0 108.0 465.0 ; CAX CAV CAR

8 7 9 2 120.0 560.0 120.0 560.0 ; CBE CAV CAR

7 9 10 2 132.0 760.0 132.0 760.0 ; CAV CAR CAQ

7 9 11 2 108.0 465.0 108.0 465.0 ; CAV CAR NAW

10 9 11 2 120.0 560.0 120.0 560.0 ; CAQ CAR NAW

9 10 39 2 120.0 505.0 120.0 505.0 ; CAR CAQ CAB

9 11 12 2 108.0 465.0 108.0 465.0 ; CAR NAW CAY

6 12 11 2 108.0 465.0 108.0 465.0 ; CAX CAY NAW

6 12 13 2 132.0 760.0 132.0 760.0 ; CAX CAY CBD

11 12 13 2 120.0 560.0 120.0 560.0 ; NAW CAY CBD

12 13 14 2 120.0 505.0 120.0 505.0 ; CAY CBD CBB

13 14 15 2 120.0 560.0 120.0 560.0 ; CBD CBB NBA

13 14 17 2 132.0 760.0 132.0 760.0 ; CBD CBB CBC

15 14 17 2 108.0 465.0 108.0 465.0 ; NBA CBB CBC

14 15 16 2 126.0 575.0 126.0 575.0 ; CBB NBA HBA

14 15 25 2 108.0 465.0 108.0 465.0 ; CBB NBA CAT

16 15 25 2 126.0 575.0 126.0 575.0 ; HBA NBA CAT

14 17 18 2 120.0 560.0 120.0 560.0 ; CBB CBC CBL

14 17 23 2 108.0 465.0 108.0 465.0 ; CBB CBC CAZ

135

18 17 23 2 120.0 560.0 120.0 560.0 ; CBL CBC CAZ

17 18 19 2 109.5 520.0 109.5 520.0 ; CBC CBL CBM

18 19 20 2 109.5 520.0 109.5 520.0 ; CBL CBM CBN

19 20 21 2 117.0 635.0 117.0 635.0 ; CBM CBN OBP

19 20 22 2 117.0 635.0 117.0 635.0 ; CBM CBN OBO

21 20 22 2 126.0 770.0 126.0 770.0 ; OBP CBN OBO

17 23 24 2 120.0 560.0 120.0 560.0 ; CBC CAZ CBF

17 23 25 2 108.0 465.0 108.0 465.0 ; CBC CAZ CAT

24 23 25 2 120.0 560.0 120.0 560.0 ; CBF CAZ CAT

15 25 23 2 108.0 465.0 108.0 465.0 ; NBA CAT CAZ

15 25 26 2 120.0 560.0 120.0 560.0 ; NBA CAT CAS

23 25 26 2 132.0 760.0 132.0 760.0 ; CAZ CAT CAS

25 26 27 2 120.0 505.0 120.0 505.0 ; CAT CAS CAM

26 27 28 2 120.0 560.0 120.0 560.0 ; CAS CAM NAN

26 27 29 2 132.0 760.0 132.0 760.0 ; CAS CAM CAL

28 27 29 2 108.0 465.0 108.0 465.0 ; NAN CAM CAL

27 28 34 2 108.0 465.0 108.0 465.0 ; CAM NAN CAJ

27 29 30 2 120.0 560.0 120.0 560.0 ; CAM CAL CAO

27 29 32 2 108.0 465.0 108.0 465.0 ; CAM CAL CAK

30 29 32 2 120.0 560.0 120.0 560.0 ; CAO CAL CAK

29 30 31 2 115.0 610.0 115.0 610.0 ; CAL CAO CAP

29 32 33 2 120.0 560.0 120.0 560.0 ; CAL CAK CAU

29 32 34 2 108.0 465.0 108.0 465.0 ; CAL CAK CAJ

33 32 34 2 120.0 560.0 120.0 560.0 ; CAU CAK CAJ

28 34 32 2 108.0 465.0 108.0 465.0 ; NAN CAJ CAK

28 34 35 2 120.0 560.0 120.0 560.0 ; NAN CAJ CAI

32 34 35 2 132.0 760.0 132.0 760.0 ; CAK CAJ CAI

34 35 36 2 120.0 505.0 120.0 505.0 ; CAJ CAI CAD

35 36 37 2 120.0 560.0 120.0 560.0 ; CAI CAD NAE

35 36 42 2 132.0 760.0 132.0 760.0 ; CAI CAD CAC

37 36 42 2 108.0 465.0 108.0 465.0 ; NAE CAD CAC

36 37 38 2 126.0 575.0 126.0 575.0 ; CAD NAE HAE

36 37 39 2 108.0 465.0 108.0 465.0 ; CAD NAE CAB

38 37 39 2 126.0 575.0 126.0 575.0 ; HAE NAE CAB

10 39 37 2 120.0 560.0 120.0 560.0 ; CAQ CAB NAE

10 39 40 2 132.0 760.0 132.0 760.0 ; CAQ CAB CAA

37 39 40 2 108.0 465.0 108.0 465.0 ; NAE CAB CAA

39 40 41 2 120.0 560.0 120.0 560.0 ; CAB CAA CAH

39 40 42 2 108.0 465.0 108.0 465.0 ; CAB CAA CAC

41 40 42 2 120.0 560.0 120.0 560.0 ; CAH CAA CAC

136

36 42 40 2 108.0 465.0 108.0 465.0 ; CAD CAC CAA

36 42 43 2 120.0 560.0 120.0 560.0 ; CAD CAC CAF

40 42 43 2 120.0 560.0 120.0 560.0 ; CAA CAC CAF

42 43 44 2 115.0 610.0 115.0 610.0 ; CAC CAF CAG

[ dihedrals ]

; ai aj ak al fu c0, c1, m, ...

2 1 3 4 2 0.0 167.4 0.0 167.4 ; imp CBI OBJ OBK CBH

6 5 12 7 2 0.0 167.4 0.0 167.4 ; imp CAX CBG CAY CAV

7 9 8 6 2 0.0 167.4 0.0 167.4 ; imp CAV CAR CBE CAX

9 11 10 7 2 0.0 167.4 0.0 167.4 ; imp CAR NAW CAQ CAV

12 13 11 6 2 0.0 167.4 0.0 167.4 ; imp CAY CBD NAW CAX

14 13 15 17 2 0.0 167.4 0.0 167.4 ; imp CBB CBD NBA CBC

15 25 16 14 2 0.0 167.4 0.0 167.4 ; imp NBA CAT HBA CBB

17 23 18 14 2 0.0 167.4 0.0 167.4 ; imp CBC CAZ CBL CBB

20 19 21 22 2 0.0 167.4 0.0 167.4 ; imp CBN CBM OBP OBO

23 25 24 17 2 0.0 167.4 0.0 167.4 ; imp CAZ CAT CBF CBC

25 15 26 23 2 0.0 167.4 0.0 167.4 ; imp CAT NBA CAS CAZ

27 26 28 29 2 0.0 167.4 0.0 167.4 ; imp CAM CAS NAN CAL

29 32 30 27 2 0.0 167.4 0.0 167.4 ; imp CAL CAK CAO CAM

32 34 33 29 2 0.0 167.4 0.0 167.4 ; imp CAK CAJ CAU CAL

34 28 35 32 2 0.0 167.4 0.0 167.4 ; imp CAJ NAN CAI CAK

36 35 37 42 2 0.0 167.4 0.0 167.4 ; imp CAD CAI NAE CAC

37 39 38 36 2 0.0 167.4 0.0 167.4 ; imp NAE CAB HAE CAD

39 10 37 40 2 0.0 167.4 0.0 167.4 ; imp CAB CAQ NAE CAA

40 42 41 39 2 0.0 167.4 0.0 167.4 ; imp CAA CAC CAH CAB

42 43 40 36 2 0.0 167.4 0.0 167.4 ; imp CAC CAF CAA CAD

14 15 25 23 2 0.0 209.3 0.0 209.3 ; imp CBB NBA CAT CAZ

15 25 23 17 2 0.0 209.3 0.0 209.3 ; imp NBA CAT CAZ CBC

25 23 17 14 2 0.0 209.3 0.0 209.3 ; imp CAT CAZ CBC CBB

23 17 14 15 2 0.0 209.3 0.0 209.3 ; imp CAZ CBC CBB NBA

17 14 15 25 2 0.0 209.3 0.0 209.3 ; imp CBC CBB NBA CAT

6 7 9 11 2 0.0 209.3 0.0 209.3 ; imp CAX CAV CAR NAW

7 9 11 12 2 0.0 209.3 0.0 209.3 ; imp CAV CAR NAW CAY

9 11 12 6 2 0.0 209.3 0.0 209.3 ; imp CAR NAW CAY CAX

11 12 6 7 2 0.0 209.3 0.0 209.3 ; imp NAW CAY CAX CAV

12 6 7 9 2 0.0 209.3 0.0 209.3 ; imp CAY CAX CAV CAR

27 28 34 32 2 0.0 209.3 0.0 209.3 ; imp CAM NAN CAJ CAK

28 34 32 29 2 0.0 209.3 0.0 209.3 ; imp NAN CAJ CAK CAL

34 32 29 27 2 0.0 209.3 0.0 209.3 ; imp CAJ CAK CAL CAM

137

32 29 27 28 2 0.0 209.3 0.0 209.3 ; imp CAK CAL CAM NAN

29 27 28 34 2 0.0 209.3 0.0 209.3 ; imp CAL CAM NAN CAJ

36 37 39 40 2 0.0 209.3 0.0 209.3 ; imp CAD NAE CAB CAA

37 39 40 42 2 0.0 209.3 0.0 209.3 ; imp NAE CAB CAA CAC

39 40 42 36 2 0.0 209.3 0.0 209.3 ; imp CAB CAA CAC CAD

40 42 36 37 2 0.0 209.3 0.0 209.3 ; imp CAA CAC CAD NAE

42 36 37 39 2 0.0 209.3 0.0 209.3 ; imp CAC CAD NAE CAB

5 4 2 1 1 0.0 1.0 6 0.0 1.0 6 ; dih CBG CBH CBI OBJ

6 5 4 2 1 0.0 5.9 3 0.0 5.9 3 ; dih CAX CBG CBH CBI

4 5 6 12 1 0.0 1.0 6 0.0 1.0 6 ; dih CBH CBG CAX CAY

7 9 10 39 1 180.0 41.8 2 180.0 41.8 2 ; dih CAV CAR CAQ CAB

40 39 10 9 1 180.0 41.8 2 180.0 41.8 2 ; dih CAA CAB CAQ CAR

6 12 13 14 1 180.0 41.8 2 180.0 41.8 2 ; dih CAX CAY CBD CBB

17 14 13 12 1 180.0 41.8 2 180.0 41.8 2 ; dih CBC CBB CBD CAY

19 18 17 14 1 0.0 1.0 6 0.0 1.0 6 ; dih CBM CBL CBC CBB

20 19 18 17 1 0.0 5.9 3 0.0 5.9 3 ; dih CBN CBM CBL CBC

18 19 20 22 1 0.0 1.0 6 0.0 1.0 6 ; dih CBL CBM CBN OBO

15 25 26 27 1 180.0 41.8 2 180.0 41.8 2 ; dih NBA CAT CAS CAM

29 27 26 25 1 180.0 41.8 2 180.0 41.8 2 ; dih CAL CAM CAS CAT

31 30 29 27 1 180.0 5.9 2 180.0 5.9 2 ; dih CAP CAO CAL CAM

28 34 35 36 1 180.0 41.8 2 180.0 41.8 2 ; dih NAN CAJ CAI CAD

42 36 35 34 1 180.0 41.8 2 180.0 41.8 2 ; dih CAC CAD CAI CAJ

44 43 42 36 1 180.0 5.9 2 180.0 5.9 2 ; dih CAG CAF CAC CAD

; Include Position restraint file

#ifdef POSRES

#include ppix_posre.itp

#endif

138

APENDICE C: Protocolo da Dinâmica Molecular

Se mostrara o protocolo da DM do complexo HSA+HEME, para os casos HSA e

HSA+PPIX é similar

(1) Gerando os arquivos *.gro y *.top a partir do *.pdb ignorando os hidrogenîos,

os quais seram adicionados programa pdb2gmx.

pdb2gmx_mpi -f hsa_heme.pdb -o hsa_heme.gro -p hsa_heme.top -ignh -v

(2) Gerando a estrutura dodecahedrica com uma distancia de 1,5 A.entre a parede

da caixa e o soluto.

editconf_mpi -f hsa_heme.gro -o hsa_heme_box.gro -c -d 1.5 -bt dodecahedron

(3) Gerando água dentro da estrutura anterior

genbox_mpi -cp hsa_heme_box.gro -cs -p hsa_heme_box.top -

hsa_heme_box_hoh.gro

(4) Adicionando contra íons

grompp_mpi -f em.mdp -c hsa_heme_box_hoh.gro -o em.tpr -p

hsa_heme_box.top

genion_331_d -s em_ion.tpr -o hsa_heme_box_hoh_ion.gro -g genion.log -p

hsa_heme_box_ion.top -pot hsa_heme_box_ion.pdb -pname NA+ -np 16 -nname

Cl- -nq 0

selecionar SOL

(5) Rodando a Minimização de Energia com restrição de posição de 500 ps (step

Descent)

grompp_mpi -v -f empr.mdp -c hsa_heme_box_hoh_ion.gro -o empr.tpr -p

hsa_heme_box_ion.top

nohup mpirun mdrun_mpi -v -s empr.tpr -deffnm empr >& empr.job &

(6) Rodando Minimização de Energia sem restrição de posição (step descent)

grompp_mpi -v -f em.mdp -c empr.gro -p hsa_heme_box_ion.top -o em.tpr

nohup mpirun -np 2 mdrun_331_mpi_d -v -s em.tpr -deffnm em >& em.job &

(7) Rodando Minimização de Energia com Gradiente conjugado

grompp_mpi -v -f cg.mdp -c em.gro -p hsa_heme_box_ion.top -o cg.tpr -n

index.ndx -t em.trr

nohup mpirun mdrun_mpi -v -s cg.tpr -deffnm cg >& cg.job &

(8) Rodando Dinâmica Molecular de 20 ns

grompp_mpi -v -f dmHSA_heme20ns.mdp -c cg.gro -p hsa_heme_box_ion.top -o

dmHSA_heme20ns.tpr -t cg.trr -n index.ndx

mdrun_mpi -v -s dmHSA_heme20ns.tpr -deffnm dmHSA_heme20ns &

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