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Andrea Gil F. de Arruda
ESTUDO COMPARATIVO DA ATIVAÇÃO DE
MACRÓFAGOS DE LINHAGENS DE CAMUNDONGOS
GENETICAMENTE SELECIONADOS PARA A
REATIVIDADE INFLAMATÓRIA AGUDA
Dissertação apresentada ao Instituto de
Ciências Biomédicas da Universidade de São
Paulo, para obtenção do Título de Mestrado
em Ciências (Imunologia).
São Paulo
2008
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Andrea Gil F. de Arruda
ESTUDO COMPARATIVO DA ATIVAÇÃO DE
MACRÓFAGOS DE LINHAGENS DE
CAMUNDONGOS GENETICAMENTE
SELECIONADOS PARA A REATIVIDADE
INFLAMATÓRIA AGUDA
Dissertação apresentada ao Instituto de
Ciências Biomédicas da Universidade de São
Paulo, para obtenção do Título de Mestrado
em Ciências (Imunologia).
Orientadora: Dra. Nancy Starobinas
Área de concentração: Imunologia
São Paulo
2008
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Este trabalho foi desenvolvido no
laboratório de Imunogenética do
Instituto Butantan com apoio
financeiro da FAPESP.
Dedico este trabalho aos meus pais,
Álvaro e Rosana, que me incentivaram
e tornaram possível sua realização.
AGRADECIMENTOS
Agradeço a minha orientadora, Doutora Nancy Starobinas, que foi essencial para que
este trabalho fosse realizado, e também acrescentou muito para o meu amadurecimento
profissional. Obrigado pela atenção, pelos ensinamentos e dedicação dispensada.
Aos meus pais pela valiosa educação, pelos princípios, valores morais e éticos que me
fizeram quem sou hoje. Tenho com vocês, o mais belo exemplo de união e o verdadeiro
significado da palavra família. Obrigado pela compreensão, paciência e acima de tudo,
por acreditarem em meus sonhos e ajudarem a torná-los realidade.
Á minha irmã, Camila, pelo carinho, amizade e constante incentivo. Não podendo me
esquecer da minha sobrinha Giovanna uma grande alegria em nossas vidas.
Aos meus avós e familiares por sempre estarem torcendo por mim. À minha avó Luiza,
com carinho especial, minha eterna gratidão por todas as rezas, por acreditar e me
apoiar em todos os momentos difíceis da minha vida. E ao meu avô Júlio, eternamente
no meu coração.
Ao Daniel, agradeço por seu apoio, amor, carinho e paciência, que foi fundamental
para que eu pudesse realizar meus estudos e meus sonhos. Obrigado por me apoiar nos
momentos mais difíceis e vibrar comigo nas minhas conquistas.
Aos meus colegas e amigos do laboratório de Imunogenética: Layra, Iana, Francisca,
Débora, Patrícia, Luciana, Alessandra, Tatiana, Ludmila, Andrea, Cristiano, Jussara,
Simone, Talita, Vinícius pelo carinho, amizade, por todas às vezes que precisei de
auxílio, por todas as alegrias e momentos de descontração nestes anos.
Às professoras Dra Sônia Jancar, Dra Eliana Faquim e Dra Karina Bortolucci pelas
idéias sugeridas na banca de qualificação que me ajudaram na confecção final da tese.
Aos meus amigos de pós-graduação pela agradável convivência durante estes anos e
momentos inesquecíveis de descontração, em especial à turma do cursão Tati, Nati,
Pati, Juciane, Josias, Carol, Layra, Débora, Paulo Vitor, Otávio e Daniel.
Aos pesquisadores do laboratório de Imunogenética: Dra. Olga Ibañez, Dr. Marcelo
De Franco, Dra Wafa Cabrera, Dr Orlando Ribeiro e Dra Solange Massa pela
atenção, disponibilidade e competentes sugestões na elaboração deste trabalho.
Á Marinalva Lima, Neusa, Tânia e Ronaldo pela dedicação no preparo dos materiais
utilizados durante os experimentos.
Á Doutora Karina Bostolucci pelas valiosas contribuições em meu trabalho e por
gentilmente ceder os anticorpos. E à sua aluna de doutorado, Alexandra, pelo auxílio
na execução dos experimentos.
À todas as pessoas que contribuíram de alguma maneira na realização deste trabalho.
RESUMO
ARRUDA, A. G. F. Estudo comparativo da ativação de macrófagos das linhagens
de camundongos selecionadas para reatividade inflamatória aguda. 85 f.
Dissertação (Mestrado em Imunologia) – Instituto de Ciências Biomédicas,
Universidade de São Paulo, São Paulo, 2008.
As linhagens de camundongos selecionadas para a máxima (AIRmax) ou
mínima (AIRmin) reatividade inflamatória aguda, demonstram diferenças significativas
quanto a capacidade de produzir infiltrado diferencial de células neutrofílicas. Esses
animais apresentam diferenças na susceptibilidade ao desenvolvimento de tumores,
sendo os animais AIRmax mais resistentes do que camundongos AIRmin, como
também na resposta contra infecções por patógenos intracelulares, choque endotóxico
por LPS, artrite experimental e cicatrização, fenótipos nos quais os macrófagos são as
principais células efetoras. Este projeto tem como principal objetivo caracterizar a
atividade de macrófagos residentes ou induzidos com tioglicolato no exsudato
peritoneal nas linhagens AIRmax e AIRmin. Nas primeiras 6 horas do estímulo, o
tioglicolato induz a migração preferencial de neutrófilos, após este período, induz a
migração de células mononucleares sendo o máximo de migração de macrófagos
atingida após 96 horas. Em ambas as linhagens, macrófagos induzidos por tioglicolato
possuíam uma capacidade de fagocitar partículas de zimosan aumentada em relação aos
macrófagos residentes. Em nossos resultados pudemos observar algumas diferenças
interlinhagens onde macrófagos da linhagem AIRmax respondem mais em resposta ao
estímulo de LPS em relação à expressão de citocinas pro-inflamatórias TNF-α, IL-6,
IL-12 e IL-1β, expressão do receptor pro-inflamatório TREM1 e sua proteína
adaptadora DAP12, como também quanto a liberação de H
2
O
2
e síntese de NO, o que é
condizente com o fenótipo de alta inflamação aguda selecionada nos animais AIRmax.
Por outro lado, pudemos observar que as células residentes da linhagem AIRmin eram
capazes de sintetizar maiores quantidades das citocinas IL-10 e TGF-β em relação à
linhagem AIRmax, enquanto que, após o estímulo de tioglicolato, os macrófagos
peritoneais obtidos da linhagem AIRmax é que produziam e expressavam maiores
quantidades destas citocinas anti-inflamatórias.
Palavras-chave: Macrófagos; Inflamação; Citocinas.
ABSTRACT
ARRUDA, A. G. F. Comparative study of macrophage activation from lines of mice
selected for acute inflammatory reactions. 85 f. Dissertation (Master in Immunology)
– Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2008.
Lines of mice genetically selected for maximal (AIRmax) or minimal
(AIRmin) acute inflammatory reaction (AIR) demonstrated significant differences in
the capacity to produce differential infiltrate of neutrophil cells. These mice present
distinct susceptibility to tumors development, being the AIRmax animals more resistant
than AIRmin mice. Moreover these lines show different responses against intracellular
pathogens, endotoxic shock induced by LPS, experimental arthritis and wound healing
phenotypes in which macrophages are the major effectors cells. The aim of this work is
the characterization of the activity of resident or thioglicollate-induced macrophages in
the peritoneal exudates from AIRmax and AIRmin mice. After 6 hours, thioglicollate
induces the migration of neutrophils preferentially and, after this period, it induces
mononuclear cells migration, being the maximal macrophage migration achieved at 96
hours. On both lines, thioglicollate-induced macrophages showed a higher phagocytic
activity of zymosan particles than resident macrophages. Some differences between the
lines were observed: the macrophages from AIRmax mice produced higher response
when stimulated with LPS, than the AIRmin cells, regarding the expression of pro-
inflammatory cytokines, such as, TNF-α, IL-6, IL-12 and IL-1β; expression of pro-
inflammatory receptor TREM1 and its adapter protein DAP12. Furthermore, we also
found a higher release of H
2
O
2
and NO synthesis; all these observations are consistent
with the high acute inflammation selected phenotype observed in AIRmax mice. On the
other hand we observed that resident cells from AIRmin mice secret higher amounts of
IL-10 and TGF-β when compared with the AIRmax cells, however after thioglicollate
stimulus, the peritoneal macrophages from AIRmax mice secreted and expressed higher
levels of those anti-inflammatory cytokines.
Key words: Macrophages; Inflammation; Citokines.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1- Determinação do número de células totais no peritônio de animais das
linhagens AIRmax e AIRmin..........................................................................................31
Figura 2- Análise fenotípica de células peritoneais das linhagens AIRmax e
AIRmin............................................................................................................................33
Figura 3- Avaliação da produção NO por macrófagos peritoneais dos animais AIRmax
e AIRmin.........................................................................................................................36
Figura 4- Quantificação de H
2
O
2
em células peritoniais dos animais AIRmax e
AIRmin............................................................................................................................37
Figura 5- Quantificação de citocinas pro-inflamatórias por macrófagos residentes das
linhagens AIRmax e AIRmin..........................................................................................39
Figura 6- Quantificação de citocinas pro-inflamatórias por macrófagos induzidos por
tioglicolato das linhagens AIRmax e AIRmin................................................................42
Figura 7- Quantificação de citocinas anti-inflamatórias por macrófagos residentes das
linhagens AIRmax e AIRmin..........................................................................................44
Figura 8- Quantificação de citocinas anti-inflamatórias por macrófagos induzidos por
tioglicolato das linhagens AIRmax e AIRmin.................................................................45
Figura 9- Expressão relativa de Dap12, Trem1 e Trem2 quantificadas em tempo real
macrófagos residentes das linhagens AIRmax e AIRmin...............................................46
Figura 10- Expressão relativa de Dap12, Trem1 e Trem2 quantificadas em macrófagos
induzidos por tioglicolato das linhagens AIRmax e AIRmin..........................................48
Figura 11- Fagocitose de zimosan por macrófagos residentes das linhagens AIRmax e
AIRmin............................................................................................................................50
Figura 12- Fagocitose de zimosan por macrófagos induzidos por tioglicolato das
linhagens AIRmax e AIRmin..........................................................................................51
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AIR - Reação Inflamatória Aguda
LPS - Lipolissacarídeo (Lipopolysaccharide)
TGF-β - Fator de Crescimento Transformador – Beta (Transforming growth factor)
TNFα - Fator de Necrose Tumoral-Alfa (Tumor necrosis factor)
RT-PCR- Reação de polimerização em cadeia de transcrição reversa (Reverse
transcriptase polimerase chain reaction)
NO- Óxido nítrico (Niric oxide)
PBS- Salina tamponada com fosfato (Phosphate buffered saline)
TLR- Receptor semelhante ao Toll (Toll-like receptor)
mAb- Anticorpo monoclonal (Monoclonal antibody)
IL- Interleucina
IFN- Interferon
Ip.- Intraperitoneal
FITC- Isotiacianato de fluoresceína (Fluorescein isothiocyanate)
SFB- Soro fetal bovino (Fetal calf serum)
FACS- Separador de células fluorescentes (Fluorescence-activated assay)
ELISA- Ensaio imunoenzimático (Enzyme-linked immunoabsorbent assay)
CY- Cy-chrome
q-PCR- RT-PCR em tempo real (real time RT-PCR)
PI- Iodeto de propídeo
PE- Ficoeritrina
H
2
O
2
- Peróxido de hidrogênio
IF- Índice fagocítico
TREM- Inicializador de receptor expresso em células mielóides (Triggering receptors
expressed on myeloid cells)
QTL- Loci de traço quantitativo (Quantitative trait loci)
NF-kB- Fator de transcrição nuclear k B (Nuclear factor k B)
CD- Grupos de diferenciação (moléculas de superfície celular que servem como
marcadores (Cluster of differentiation)
PMA- Phorbol miristato acetato (Phorbolmyristate acetate)
GM-CSF- Fator estimulador de colônias de granulócitos e macrófagos
M-CSF- Fator estimulador de colônias de macrófagos
Ct – Ciclo inicial (Threshold cicle)
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO......................................................................................13
1.1 Linhagens geneticamente selecionadas para reatividade inflamatória aguda.. 13
1.2 Inflamação e macrófagos ....................................................................................... 17
1.3 Receptores transmembrânicos .............................................................................. 19
2 OBJETIVO.............................................................................................22
3 MATERIAL E MÉTODOS...................................................................23
3.1 Animais.................................................................................................................... 23
3.2 Reação Inflamatória e obtenção de macrófagos.................................................. 23
3.3 Citometria de fluxo................................................................................................. 24
3.4 Quantificação da produção de óxido nítrico (NO) .............................................. 24
3.5 Quantificação da liberação de peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
).......................... 25
3.6 Determinação da produção de citocinas pró-inflamatórias................................ 25
3.7 Extração de RNA total de células.......................................................................... 26
3.8 Síntese de DNA complementar (cDNA)................................................................ 26
3.9 Quantificação das citocinas por PCR em tempo real (qPCR)............................ 27
3.10 Fagocitose de zimosan.......................................................................................... 29
3.11 Análise Estatística................................................................................................. 30
4 RESULTADOS.......................................................................................31
4.1 Inflamação peritonial induzida por tioglicolato em animais das linhagens
AIRmax e AIRmin........................................................................................................ 31
4.2 Análise fenotípica das células peritoneais de animais das linhagens AIRmax e
AIRmin.......................................................................................................................... 32
4.3 Ativação de macrófagos peritoneais das linhagens AIRmax e AIRmin quanto a
secreção de NO e liberação de H
2
O
2
........................................................................... 34
4.3 Quantificação de citocinas pró e anti-inflamatórias quanto à produção e
expressão gênica............................................................................................................ 37
4.5 Avaliação da expressão gênica de moléculas reguladoras da transdução de
sinais via TLR em macrófagos da linhagem AIRmax e AIRmin............................. 45
4.6 Atividade fagocítica em macrófagos das linhagens AIRmax e AIRmin............ 48
5 DISCUSSÃO...........................................................................................52
6 CONCLUSÕES......................................................................................67
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS....................................................68
INTRODUÇÃO
______________________________________________________________________
___________________________________________________________________ 13
1 INTRODUÇÃO
1.1 Linhagens geneticamente selecionadas para reatividade inflamatória aguda
Alguns estudos mostraram que a intensidade da inflamação, quando induzida
por partículas inertes (látex, Kaolin), microorganismos vivos ou mortos (Listeria
monocytogenes e BCG) e substâncias biológicas (caseína, peptona e tioglicolato) é
variável entre linhagens isogênicas de camundongos, indicando que a reação
inflamatória aguda é uma característica que possui um controle poligênico (STERNICK
et al., 1983; CZUPRYNSKI et al., 1985).
Um bom modelo experimental para estudar a influência do controle genético
na resposta inflamatória são as linhagens de camundongos geneticamente selecionados
para máxima (AIRmax) ou mínima (AIRmin) reatividade inflamatória aguda (AIR-
acute inflammatory reaction), produzidas no Laboratório de Imunogenética do Instituto
Butantan, seguindo protocolos de seleção genética bidirecional e considerando as
características de alta ou baixa reatividade inflamatória aguda (IBAÑEZ et al., 1992).
Para a seleção das linhagens, foi utilizado como agente inflamatório o
BIOGEL P-100 (microesferas de poliacrilamida), injetado no tecido subcutâneo. A
intensidade da resposta inflamatória aguda foi avaliada após 24 horas através da análise
do exsudato inflamatório, utilizando como parâmetros a celularidade e o
extravasamento de proteínas (FONTAN e FAUVE, 1983). O processo de seleção
genética bidirecional iniciou-se a partir de uma população geneticamente polimórfica
(F
0
), produzida pelo intercruzamento equilibrado de oito linhagens isogênicas de
camundongos de origens independentes (A, DBA2, P, SWR, CBA, SJL, BALB/c e
C57BL/6). Após várias gerações de acasalamentos não-consangüíneos, foram obtidas
duas linhagens significantemente diferentes quanto à reatividade inflamatória aguda -
AIRmax e AIRmin, sendo esta diferença caracterizada principalmente pela migração
desigual de leucócitos para o sítio da injeção do agente selecionador. Após 20 gerações
de seleção estimou-se a provável participação de 7-11 loci gênicos na determinação do
caráter selecionador (IBAÑEZ et al., 1992; BIOZZI, et al., 1998), e admitiu-se ter sido
atingido o limite de seleção (diminuição da variação fenotípica), quando os alelos
envolvidos na determinação do fenótipo inflamatório estariam segregados em
homozigose em cada linhagem, porém mantendo-se um background heterogêneo.
INTRODUÇÃO
______________________________________________________________________
___________________________________________________________________ 14
A resposta inflamatória aguda foi avaliada em outros compartimentos e
observou-se que a mesma não é limitada à resposta no tecido subcutâneo, mas é um
fenômeno geral que se aplica a todos os tecidos vascularizados e que também ocorre
em resposta a outros agentes flogísticos tais como carragenina, zimozan e bactérias
vivas ou inativadas, permanecendo visível em todos os casos, a diferença entre as
linhagens (IBAÑEZ et al., 1992; ARAÚJO et al., 1998).
Vários experimentos foram realizados demonstrando que a resposta imune
específica mediada por anticorpos não foi afetada pelo processo seletivo, uma vez que
as linhagens AIRmax e AIRmin produzem títulos semelhantes de anticorpo após a
imunização com doses ótimas de antígenos complexos como eritrócitos de carneiro,
ovalbumina e Salmonella typhimurium inativada. A resposta imune específica mediada
por células também foi investigada através de experimentos de reações de
hipersensibilidade do tipo tardio (HT) a eritrócitos de carneiro e Salmonella
typhimurium, também não sendo observadas diferenças significativas entre as linhagens
(ARAÚJO et al., 1998).
Por outro lado, com relação à resistência natural à infecção experimental por
Salmonella typhimurium e Listeria monocytogenes, foi demonstrado que os
camundongos AIRmax são mais resistentes, havendo diferenças acima de 1000 vezes e
de cerca de 100 vezes nas doses letais que matam 50% dos animais (DL
50
) para as duas
bactérias respectivamente, sendo esta resistência devida à maior capacidade dos
camundongos AIRmax em controlar o crescimento bacteriano no baço e em produzir
uma alta resposta inflamatória local com liberação de citocinas. Além disso, esta
linhagem foi demonstrada ser mais susceptível ao choque endotóxico do que animais da
linhagem AIRmin (ARAÚJO et al., 1998).
Visto também que tanto a infecção por S. typhimurium, quanto a sensibilidade
aos efeitos tóxicos do LPS são influenciadas pelo gene natural resistance associated
macrophage protein 1 (Nramp1), também conhecido como Slc11a1, a frequência dos
dois allelos que determinam fenótipos de susceptibilidade (s) e de resistência (r) foram
determinadas em nosso laboratório e observou-se que a presença de Slc11a1
SS
foi de
25% na população inicial (Fo) da seleção experimental, e mudou para 60% em animais
AIRmin e para 9% em AIRmax, após 30 gerações do processo seletivo. Este desvio de
freqüências sugere que o processo de seleção afetou esta região cromossômica
(ARAÚJO et al., 1998).
INTRODUÇÃO
______________________________________________________________________
___________________________________________________________________ 15
O gene Nramp1 codifica uma proteína transportadora que é expressa em
membranas de fagossomos de macrófagos (VIDAL et al., 1993) e sua falta funcional
causa acumulação de íons dentro do fagossomo, favorecendo a replicação de patógenos
(HACKAM et al., 1998). Este gene é considerado pleotrópico, interferindo com a
ativação de macrófagos (BARTON et al., 1995), burst oxidativo, produção de IFN-γ,
TNF-α. e IL-1β (KITA et al., 1992), como também com a expressão de moléculas de
MHC classe II em reposta à patógenos intracelulares (WOJCIECHOWSKI et al.,
1999).
Com intuito de avaliar a interação do gene Slc11a1 com QTL fixados na
seleção de camundongos AIRmax e AIRmin, foram produzidas sublinhagens nas quais
os alelos R e S de Slc11a1 foram fixados em homozigose no fundo genético de AIRmax
e AIRmin, demonstrando inflamação aguda mais severa frente ao estímulo local com
Biogel em animais Slc11a1
RR
em comparação à Slc11a1
SS
, e implicando
na regulação da
AIR (BORREGO et al., 2006).
Em outros estudos, os animais AIRmax demonstraram uma eficiente atividade
de reparo tecidual da orelha, enquanto o mesmo não foi observado em animais AIRmin.
Em relação às sublinhagens Slc11a1, os animais AIRmax Slc11a1
SS
, demonstraram
capacidade de regeneração mais alta do que animais AIRmax Slc11a1
RR
, sugerindo que
a presença do alelo S de Slc11a1 e um menor infiltrado neutrofílico favoreçam o reparo
tecidual da orelha. Por meio de análise de QTL foram detectados 2 loci inflamatórios
modulando o reparo de orelha, nos cromossomos 1 e 14. Estes resultados sugerem o
envolvimento de QTL modificadores da resposta inflamatória no fenótipo de reparo
tecidual (DE FRANCO et al., 2007).
Os camundongos AIRmax sintetizam maior quantidade de fatores
quimiotáticos no foco inflamatório; produzem maior número de neutrófilos, devido a
uma intensa atividade da medula óssea, e estas células são mais resistentes à apoptose
espontânea, em relação aos camundongos AIRmin. Estes achados podem justificar a
grande diferença quantitativa observada entre as linhagens, em relação ao infiltrado
celular encontrado no exsudato inflamatório após estímulo flogístico com o Biogel
(RIBEIRO et al., 2003).
As linhagens AIRmax e AIRmin também demonstraram diferenças quanto a
resistência e susceptibilidade à artrite induzida por pristane (PIA). Foi observado que,
após 200 dias da injeção de PIA, 65% dos camundongos AIRmax apresentaram sinais
INTRODUÇÃO
______________________________________________________________________
___________________________________________________________________ 16
clínicos de artrite enquanto que somente 7% dos animais AIRmin apresentaram estes
mesmos sinais (VIGAR et al., 2000).
A interferência da constituição genética destas linhagens na resistência ou
susceptibilidade à tumorigênese também vem sendo investigada. Os camundongos
AIRmax mostraram-se mais resistentes à carcinogênese química de pele induzida por
DMBA + TPA, enquanto o oposto foi observado em camundongos AIRmin (BIOZZI et
al., 1998). Quando foram utilizados protocolos de indução de tumores de pulmão por
uretana ou de indução de metástases pulmonares a partir da implantação de melanoma,
os animais AIRmax também se mostraram significativamente mais resistentes do que
os AIRmin (MARIA et al., 2001). No caso da tumorigênese pulmonar induzida pela
uretana, foi demonstrado ainda a fixação diferencial, respectivamente em AIRmax e
AIRmin, dos alelos de resistência e suscetibilidade do locus Pas1, situado na região
distal do cromossomo 6. Estes resultados demonstraram que o locus Pas1, que é o
principal fator genético que atua na tumorigênese pulmonar em camundongos, está
também envolvido na regulação da AIR (GARIBOLDI et al., 1993; MARIA et al.,
2003).
Além disso, em estudo de co-segregação ou linkage, em população F2
resultante do intercruzamento de AIRmax e AIRmin pode-se observar uma correlação
individual entre o aumento da AIR com a resistência ao tumor, e a diminuição da AIR
com susceptibilidade, indicando que uma parte dos genes que determinam o grau da
resposta inflamatória estão relacionados com os genes envolvidos na resistência e
susceptibilidade à carcinogênese (MARIA et al., 2003).
Considerando a diferença na intensidade da resposta inflamatória aguda,
representada essencialmente por infiltrado diferencial de células, além da diferente
susceptibilidade ao desenvolvimento de tumores, à resistência natural contra infecções,
ao choque endotóxico por LPS, à artrite experimental, e à cicatrização, fenótipos aos
quais os macrófagos participam como células efetoras, caracterizamos a atividade de
macrófagos nas linhagens AIRmax e AIRmin.
INTRODUÇÃO
______________________________________________________________________
___________________________________________________________________ 17
1.2 Inflamação e macrófagos
A reposta para uma injúria pode ser classificada em três estágios: inflamação,
proliferação e regeneração. Esta resposta envolve uma série de eventos com o objetivo
final de restaurar a integridade perdida. Após o reconhecimento de um sinal
endógeno/exógeno de perigo, tem início uma série de alterações bioquímicas e
vasculares, com infiltração de diversos tipos de células imunes efetoras, com a
subsequente remoção do tecido inflamado e, por fim, a geração de um novo tecido.
Os macrófagos possuem um papel crucial nas diversas fases da resposta
inflamatória. Dentre suas funções está a ligação da imunidade inata com a imunidade
adaptativa, por terem a capacidade de fagocitar, processar e apresentar os antígenos aos
linfócitos T (VILLACRES-ERIKSON, 1995); também a remoção de células
apoptóticas (ADEREM e UNDERHILL, 1999); resolução de processos inflamatórios
(LEIBOVICH e ROSS, 1975); angiogênese (POLVERINI et al., 1977); reparo e
remodelamento tissular (WERB e GORDON, 1975).
Estas células são capazes de secretar uma variedade de citocinas (IL-1, IL-6,
IL-12, TNF-α, IL-10, TGF-β ,IL-15, IL-18, IFN- α e -β, GM-CSF, M-CSF), fatores
angiogênicos (VEGF), quimiocinas (IL-8, GRO, IP-10, ENA-78), fatores coagulantes,
PGE2, leucotrienos, reativos do oxigênio e intermediários do nitrogênio, componentes
do complemento e várias enzimas, como as proteases, em resposta a patógenos e sinais
de perigo. A secreção destes fatores depende do tipo de estímulo e da localização que o
macrófago se encontra (PLOWDEN et al., 2004).
Um dos mecanismos microbicidas utilizados pelos macrófagos envolve a
produção de metabólitos tóxicos do oxigênio, como o ânion superóxido (0
2
-
), o
peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
), o hipoclorito (HOCl) e o radical hidroxila, que ajudam
na eliminação de microorganismos (FANTONE e WARD, 1982). Outro mecanismo
importante é a síntese de óxido nítrico (NO) que possui múltiplas funções, entre elas a
regulação do fluxo sanguíneo, neurotransmissão e dor, além da sua função microbicida
quando reage com o superóxido gerando o peroxinitrito, que é uma molécula citotóxica
(MONCADA et al., 1991).
Os macrófagos iniciam a reposta imune através do reconhecimento de padrões
moleculares, frequentemente encontrados na superfície de microorganismos. Vários
tipos de receptores para padrões moleculares estão presentes nestas células, como os
receptores do tipo lectina que se ligam a carboidratos (por exemplo, manose e
β-
INTRODUÇÃO
______________________________________________________________________
___________________________________________________________________ 18
glucanos) (MC GREAL et al., 2005); receptores tipo scavenger envolvidos no
reconhecimento tanto de lipoproteínas de baixa densidade (LDL) modificadas
(envolvidas no processo de aterosclerose), como de eritrócitos e células apoptóticas,
além de uma variedade de patógenos; receptores semelhantes a NOD (NLRs), que
reconhecem patógenos intracelulares; e receptores semelhantes ao Toll (TLRs).
(GREAVES e GORDON, 2005).
Os macrófagos são células heterogêneas e estão presentes em vários tecidos e
órgãos. A heterogeneidade dessas células é refletida tanto em seus aspectos
morfológicos e fenotípicos, como metabólicos e funcionais (GORDON e TAYLOR,
2005; MANTOVANI et al., 2004; MILLS et al., 2000). De maneira geral, os
macrófagos são caracterizados fenotipicamente pela expressão de altos níveis da cadeia
CD11b da integrina Mac-1 e da glicoproteína F4/80 (TAYLOR et al., 2003). Porém a
expressão destas moléculas não é homogênea entre as diferentes subpopulações de
macrófagos. Um bom exemplo da expressão diferencial destes marcadores pode ser
observado em macrófagos esplênicos, nas quais, as células encontradas na polpa
vermelha apresentam alta expressão de F4/80, enquanto os macrófagos da polpa branca
apresentam uma baixa expressão deste marcador (GORDON e TAYLOR, 2005,
TAYLOR et al., 2003).
Seus progenitores são originados nos sacos embrionários de embriões em
desenvolvimento e diferenciam-se em macrófagos tissulares monocíticos sob a
influência de vários fatores de crescimento, incluindo o fator estimulador de colônias de
granulócitos e macrófagos (GM-CSF) e o fator estimulador de colônias de macrófagos
(M-CSF). Em adultos, os progenitores de macrófagos são os promonócitos, que se
desenvolvem a partir de células tronco pluripotentes residentes na medula-óssea. Os
macrófagos derivados de monócitos possuem vida curta e não proliferam em sítios
inflamatórios; contudo, macrófagos tissulares podem sobreviver por no mínimo 6
semanas, mantendo o seu número estável através de proliferação homeostática.
Macrófagos estão presentes na medula-óssea, fígado, pele, baço, pulmão, cérebro, timo,
linfonodos, placas de Peyer, órgãos reprodutores, cavidade peritonial, e no interstício de
órgãos, tais como, coração, rim e pâncreas. Sua larga distribuição indica sua essencial e
importante função como sensores de sinais de perigo exógenos e endógenos
(PLOWDEN et al., 2004).
INTRODUÇÃO
______________________________________________________________________
___________________________________________________________________ 19
1.3 Receptores transmembrânicos
Os macrófagos possuem funções bem descritas na defesa do organismo contra
as infecções. Este fato se deve a uma variedade de receptores presentes na membrana
que são capazes de reconhecer padrões moleculares presentes em microorganismos,
podendo resultar no processo de fagocitose e capacidade microbicida pela ativação de
genes inflamatórios. Estes receptores são responsáveis pelo reconhecimento de
estruturas bem conservadas tanto em microorganismos quanto em células apoptóticas,
induzindo, respectivamente, o desenvolvimento de respostas pro-inflamatórias ou anti-
inflamatórias (GORDON, 2003). Os mecanismos reguladores destas respostas ainda
não estão totalmente esclarecidos, entretanto sabe-se que compostos capazes de ativar
um grupo de receptores transmembrânicos chamados de toll-like receptors (TLR)
podem induzir a transcrição de genes necessários para iniciar o processo inflamatório
(BARTON e MEDZHITOV, 2003).
Após o reconhecimento de seus ligantes cognatos, os TLRs induzem a
expressão de uma variedade de genes de defesa do hospedeiro. Estes incluem citocinas
inflamatórias e quimiocinas, peptídeos antimicrobianos, moléculas co-estimulatórias,
moléculas de MHC, e outros efetores necessários para proteção do organismo contra
patógenos invasores (MEDZHITOV e JANEWAY, 2000).
Até o momento são conhecidos diferentes TLRs, sendo que todos possuem
uma estrutura molecular semelhante, com um domínio de reconhecimento extracelular
composto por repetições ricas em leucinas (LRRs), um domínio transmembrânico
simples e um domínio de sinalização intracelular TIR (Toll/IL-1 receptor homology).
Estes receptores diferem entre si de acordo com as especificidades dos ligantes, padrões
de expressão e, presumidamente, nos genes alvos que podem induzir. (BRODSKY e
MEDZHITOV, 2007). Sua sinalização intracelular requer uma molécula adaptadora,
MyD88, e algumas serina/treonina quinases, as IRAKs (quinase associada ao receptor
da IL-1). Estes componentes causam a ativação do fator nuclear NF-κB e de proteínas
quinase ativadas por mitógenos (MAPK), levando a regulação positiva da expressão de
moléculas co-estimulatórias de superfície, e a eventual secreção de citocinas, tais como,
IL-1β, IL-6, IL-8, IL-12 e TNF-α em células apresentadoras de antígenos
(MEDZHITOV et al., 1996). Uma outra via de ativação de NF-κB, é a via
independente de MyD88, a qual requer outras proteínas adaptadoras, como o TRIF
(DOYLE et al., 2006).
INTRODUÇÃO
______________________________________________________________________
___________________________________________________________________ 20
Dentre os ligantes de receptores do tipo Toll, pode-se citar o LPS, uma
endotoxina presente nas membranas de bactérias gram-negativas, que interage com o
TLR4 e, com a ajuda de uma proteína acessória, a MD2, causa a ativação de fatores de
transcrição como o NF-kB, que induz a expressão de uma variedade de genes pro-
inflamatórios. As partículas de zimosan, que interagem com o TLR2/6 (ULEVITCH e
TOBIAS, 1999); o RNA fita dupla (que mimetiza RNA viral), TLR3; a flagelina,
TLR5; o DNA CpG não metilado ou DNA bacteriano, TLR9; o RNA fita simples,
TLR7 e TLR8. O ligante de TLR10 ainda não é conhecido, enquanto, o TLR11 parece
reconhecer bactéria uropatogênica (HARGREAVES e MEDZHITOV, 2005).
Existem diversos mecanismos importantes na regulação da sinalização via
TLRs, que são responsáveis pelas diferenças entre a expressão de genes e proteínas
inflamatórias após uma sinalização via TLR. Um destes mecanismos é a diferença
encontrada na
expressão gênica da proteína adaptadora Dap12 e dos receptores
transmembrânicos Trem1 e Trem2.
Proteínas TREM (“triggering receptors expressed on myeloid cells”),
consistem uma família de receptores de superfície celular relacionados, pertencente à
superfamília das Imunoglobulinas, encontrados em células mielóides e, dependendo da
sua isoforma, podem regular positiva ou negativamente a ativação e diferenciação
destas células. Seus ligantes ainda não são conhecidos (COLONNA e FACCHETTI,
2003).
TREM1 humano é uma glicoproteína de 30-KDa, que consiste em um único
domínio extracelular semelhante ao da imunogloblina do tipo V, uma região
transmembrânica carregada com resíduos de lisina e uma cauda citoplasmática curta.
Este receptor compartilha homologia com o receptor de célula NK, NKp44 (CANTONI
et al., 1999), com o receptor leucocitário CMRF-35 (JACKSON et al., 1992) e com o
receptor de polimunoglobulina (RAGHAVAN e BJORKMAN, 1996). É expresso nos
estágios tardios da diferenciação de células mielóides (GINGRAS et al., 2002) e se
associa com DAP12 para sinalização e função (BOUCHON et al., 2000). A ativação da
via de sinalização TREM1/DAP12 promove o recrutamento e ativação de proteínas
tirosina quinases, levando à fosforilação de resíduos de tirosina em diversos tipos de
proteínas, mobilização de Ca
2+
, rearranjo do citoesqueleto de actina e ativação de vários
complexos de transcrição (BOUCHON et al., 2000; GINGRAS et al., 2002).
O receptor TREM1 além de ser encontrado em neutrófilos do sangue e
monócitos/macrófagos, é também expresso em altos níveis por infiltrado neutrofílicos,
INTRODUÇÃO
______________________________________________________________________
___________________________________________________________________ 21
células epiteliais da pele humana e linfonodos infiltrados por bactérias Gram positivas e
negativas (COLONNA, 2003).
TREM1 foi caracterizado como um iniciador e amplificador da resposta
inflamatória em neutrófilos e monócitos (BOUCHON et al., 2000). A utilização de
anticorpos agonistas anti-TREM1 destaca a importância deste receptor em um processo
inflamatório, induzindo o aumento da síntese de TNF-α e IL-10 produzidos por
monócitos ativados por LPS, e também na estimulação da liberação de mieloperoxidase
por granulócitos. O bloqueio de TREM1 também reduz a inflamação e aumenta a
sobrevivência de camundongos à infecções bacterianas que causam síndromes
hiperinflamatórias sistêmicas. Assim, TREM1 tem função de amplificar respostas
proinflamatórias induzidas por TLR. Sabe-se também que o LPS e outros ligantes de
TLR podem aumentar a expressão de Trem1, sugerindo que estes receptores cooperam
para aumentar a resposta inflamatória (COLONNA e FACCHETTI, 2003).
Enquanto TREM1 parece agir principalmente através da ativação de
monócitos e granulócitos, TREM2 é amplamente encontrado em fagócitos
mononucleares, incluindo macrófagos, células dendríticas, microglia e osteoclastos. Em
células macrofágicas, foi demonstrado que os receptores TREM2 potencializam a
fagocitose, e inibem a produção de citocinas induzidas por TLR. Este receptor ainda
regula o desenvolvimento e função de células dendríticas, como também na microglia e
osteoclastos (COLONNA, 2003).
Macrófagos derivados da medula-óssea de camundongos deficientes de
Trem2, aumentam a produção de citocinas inflamatórias (TNF e IL-6) em resposta a
agonistas de TLR (LPS, zimosan e CpG), demonstrando a sua função na inibição da
resposta macrofágica a ligantes de TLR (TURNBULL et al., 2006).
As proteínas TREM encontram-se associadas à molécula sinalizadora DAP12,
uma proteína pequena, composta por uma cauda extracelular curta, um domínio
transmembrânico curto e um motivo de ativação do imunoreceptor baseado em tirosina
(ITAM) citoplasmático. Este motivo é o único domínio de sinalização identificado
nesta molécula e é responsável pelas suas diversas funções, como ativar células NK e
amplificar ou inibir respostas inflamatórias (TURNBULL e COLONNA, 2007).
O balanço de sinais ativadores e inibitórios, gerados pela ligação destes
receptores controlam a fagocitose mediada por macrófagos e neutrófilos, liberação de
citocinas pro-inflamatórias e a explosão respiratória (COLONNA e FACCHETTI,
2003).
OBJETIVOS
______________________________________________________________________
___________________________________________________________________ 22
2 OBJETIVO
O presente projeto tem por objetivo caracterizar a atividade macrofágica
em camundongos geneticamente selecionados para máxima (AIRmax) ou mínima
(AIRmin) reatividade inflamatória aguda. Para tanto, utilizaremos alguns parâmetros
quantitativos como:
• Produção de óxido nítrico (NO) e liberação de peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
)
• Secreção e expressão gênica de citocinas pró (TNF-α, IL-12, IL-6, IL-1β) e anti-
inflamatórias (TGF- β e IL-10)
• Expressão gênica de moléculas reguladoras da transdução de sinais via TLR
(Trem1, Trem2 e Dap12).
• Capacidade fagocítica utilizando partículas de Zimozan
MATERIAL E MÉTODOS
______________________________________________________________________
___________________________________________________________________ 23
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Animais
Foram utilizados camundongos com aproximadamente 3 meses, machos e
fêmeas, pesando em média 20 g das linhagens AIRmax e AIRmin criados e mantidos
em condições padrão de alimentação e água ad libitum no biotério do Laboratório de
Imunogenética do Instituto Butantan. A utilização dos animais foi aprovada pela
Comissão de Ética em experimentação animal do Instituto de Ciências Biomédicas da
USP.
3.2 Reação Inflamatória e obtenção de macrófagos
Para obtenção dos macrófagos, os animais experimentais foram inoculados
i.p. com 1 mL de uma solução estéril contendo tioglicolato de Brewer 3% (Sigma),
como controle foram utilizados células de peritônio de animais sem o estímulo. Após
6, 24, 48, 72, 96 e 168 horas do estímulo, os camundongos foram sacrificados de
acordo com as normas do Comitê de Bioética do Instituto Butantan, e o exsudato
peritonial retirado em 5 mL de PBS estéril e gelado (4 ºC) com o auxílio de uma
seringa. A suspensão celular foi centrifugada a 1100rpm por 10 minutos à 4 ºC, e a
concentração celular ajustada para o desejado em meio RPMI 1640 (Sigma) contendo
10% de soro fetal bovino inativado (SFB- Cultilab), suplementado com HEPES 20mM,
Bicarbonato de Sódio 11mM, L-Glutamina 2mM e 1% de Estreptomicina. A
viabilidade celular foi determinada com corante Azul de Tripan 0,2% sendo sempre
maior que 95%. A suspensão celular foi colocada em placas de cultura de 24 ou 96
poços conforme o experimento. Após 2h de incubação em estufa de 37° C com 5%
CO2, as células não aderentes foram descartadas juntamente com o sobrenadante das
culturas, de modo que somente os macrófagos permaneceram aderidos nas placas de
cultura. Os macrófagos assim obtidos foram utilizados na realização de todos os
protocolos experimentais descritos a seguir.
MATERIAL E MÉTODOS
______________________________________________________________________
___________________________________________________________________ 24
3.3 Citometria de fluxo
As células totais obtidas do exsudato peritonial foram acertadas para 1.10
5
células/mL e semeadas (10
3
células/poço) em uma placa de 96 poços, fundo redondo, e
incubadas por 15 minutos, à 4 ºC, no escuro, com 100 µL de PBS contendo 0,5 µg do
anticorpo anti-CD16/CD32 receptor FcγIII/II (clone:2.462-FcBlock). Em seguida,
foram adicionadas 200 µL de PBS contendo 0,5 µg dos anticorpos monoclonais para
F4/80 (Serotec), GR-1, B220, CD3 (Pharmigen) marcados com fluoresceína (FITC),
ficoeritrina (PE) ou Cy-Crome, gentilmente cedidos pela Doutora Karina Bortolucci. A
placa foi incubada por 30 minutos, à 4 ºC, no escuro, e em seguida foi lavada duas
vezes com PBS. A placa foi coberta e centrifugada por 10 minutos à 1200 rpm em cada
lavagem. As células foram ressuspendidas em 100 µL de PBS contendo 2% de SFB e
transferidas para tubos próprios para leitura do citômetro (FACs calibur- Becton
Dickinson), contendo 300 µL PBS contendo 2% de SFB. Foram adquiridos cem mil
eventos, sendo que as células mortas foram excluídas da análise pela incorporação de
iodeto de propídeo (PI). As análises foram feitas no programa FlowJo (Becton
Dickinson).
3.4 Quantificação da produção de óxido nítrico (NO)
As células totais obtidas do exsudato peritonial foram acertadas para 1.10
7
células/mL, semeadas (1.10
6
células/poço) em uma placa de 96 poços, fundo redondo, e
incubadas por 48 horas em estufa 37 ºC e 5% de CO
2
, na presença ou não de LPS
(1µg/mL) e/ou IFN-γ (5ng/mL). Após este período, o sobrenadante das culturas foi
recolhido e 50 µL foram adicionados a 50µL do Reagente de Griess (sulfonilamida 1%
em ácido fosfórico 5% e N-(1-naftil)etilenediamine 0,1% - Sigma Chemical Co.). A
absorbância foi determinada em leitor de ELISA automático (Labsystems Multiscan
EIA), utilizando-se filtro de 540 nm e um branco composto de 50 µL de RPMI-1640
mais 50 µL de Reagente de Griess. Os resultados obtidos em densidade óptica (D.O.)
foram transformados em µM de NO
2
-
/1.10
6
células, mediante equação de regressão
linear com base em uma curva padrão feita com concentrações conhecidas de NaNO
2
(2,5, 5, 10 e 25 µM).
MATERIAL E MÉTODOS
______________________________________________________________________
___________________________________________________________________ 25
3.5 Quantificação da liberação de peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
)
Foi utilizado o método descrito por PICK e MIZEL, 1981. O número de
células foi acertado para 2x10
6
/mL em solução de vermelho fenol (140 nM NaCl; 10
nM de tampão fosfato ph7; 5,5 nM de dextrose; 0,56 nM de vermelho fenol; 0,01
mg/mL de peroxidase raiz forte tipoII). Alíquotas de 100 µl, foram distribuídas em
placa de 96 wells (NUNC) sendo que à metade dos poços foi adicionado 10µL de PMA
(20ng/poço – Phorbolmyristate acetato de PMA, Sigma Chemical Co.). A placa foi
então incubada por duas horas na estufa, à 37 °C e a uma atmosfera de 5 % de CO
2
.
Após este período, 10 µl de NaOH 1N foi adicionado a cada poço para interromper a
reação. A absorbância foi determinada em leitor de ELISA automático (Labsystems
Multiscan EIA), utilizando-se filtro de 620 nm e um branco composto de solução de
vermelho fenol e NaOH 1N. Os resultados obtidos em densidade óptica (D.O.) foram
transformados em nanomoles de H
2
O
2
/2x10
5
células, mediante equação de regressão
linear com base em uma curva padrão feita com concentrações conhecidas de peróxido
de hidrogênio (0, 5, 1, 2 e 4 nmoles).
3.6 Determinação da produção de citocinas pró-inflamatórias
Todas as amostras obtidas através da inoculação i.p. com 1 mL de uma
solução estéril contendo tioglicolato de Brewer 3% (Sigma) ou PBS (controle), foram
submetidas à cultura de 6 ou 24 horas. Após este período, tiveram os sobrenadantes
coletados para dosagem da produção local de citocinas através da técnica de ELISA
(ensaio imunoenzimático-Enzyme-Linked Imunosorbent Assay). As citocinas avaliadas
foram: TNFα, IL-6, IL-12p40, IL-1β, IL-10 (anticorpos: R & D System), e TGF-β1
(Promega).
Brevemente, placas de 96 poços NUNC-MAXISORP foram sensibilizadas
com 100 µL de anticorpos monoclonais específicos de captura para as citocinas e
incubadas por 12 horas, a 4 ºC. As placas foram lavadas 3 vezes com PBS-Tween
0,05% e bloqueadas por 2 horas com 200 µL de PBS 1% SFB. Após este período, as
placas foram lavadas novamente, e 50 µL das amostras ou da curva padrão foram
adicionados, seguindo incubação por 2 horas a temperatura ambiente. Após nova
lavagem, foram adicionados 100 µL do anticorpo de detecção biotinilado específico
MATERIAL E MÉTODOS
______________________________________________________________________
___________________________________________________________________ 26
para cada citocina, seguindo incubação por 2 horas a temperatura ambiente. As placas
foram lavadas novamente e incubadas com uma solução de Peroxidase conjugada à
avidina (Genzyme Diagnostics) 1,25 ng/mL diluída em PBS, com 1% de SFB, durante
20 minutos a 37
o
C. Após lavagem das placas, foram adicionados 100 µL de reagente
TMB (Sigma) para revelar a reação. Após 30 minutos, a reação foi interrompida com
ácido sulfúrico 30% e a absorbância lida à 570 nm com correção para 450 nm. A
concentração das citocinas presentes nas amostras foram calculadas com base na curva
padrão realizada com concentrações conhecidas da citocina recombinante.
3.7 Extração de RNA total de células
Os macrófagos cultivados com diferentes estímulos e tempos tiveram seu
RNA extraído após a adição de trizol (Invitrogen) sobre as mesmas. Às amostras foram
adicionadas 0,2 mL de clorofórmio, agitando-se vigorosamente por 15 segundos,
seguindo incubação no gelo por 10 minutos. Após este período, os tubos foram
centrifugados a 11000 rpm por 15 minutos, e a fase aquosa foi cuidadosamente
recolhida em outro tubo. Adicionou-se então 0,5 mL de álcool isopropílico e as
amostras foram incubadas durante 10 minutos no gelo, e em seguida centrifugadas a
11000 rpm por 10 minutos. O sobrenadante foi descartado e o precipitado de RNA total
foi adicionado de 1mL de etanol 75%, e centrifugado a 8500 rpm por 5 minutos. O
sobrenadante foi novamente descartado e após secagem de aproximadamente 10
minutos, o RNA foi ressuspenso em 50 µL de água livre de RNAse. A integridade do
RNA total presente na amostra foi verificada através de análise em gel de agarose 1%,
contendo brometo de etídio. Para a verificação da pureza das amostras, a concentração
de RNA total foi determinada através da leitura da absorbância em espectrofotômetro,
no comprimento de onda de 260 nm, observando-se a relação entre 1,8 e 2,0 sobre a
leitura a 280 nm. As amostras foram estocadas a -70 °C.
3.8 Síntese de DNA complementar (cDNA)
A síntese de cDNA foi feita através de uma reação de transcrição reversa a
partir do RNA total purificado. Para cada amostra, foram feitas soluções contendo 100
µg/mL de RNA total, e 10 µL desta solução foram adicionados de 1 µL de oligo(dT)
12-
MATERIAL E MÉTODOS
______________________________________________________________________
___________________________________________________________________ 27
18
(50 µM) e 1 µL de água livre de Rnase, sendo incubados em seguida por 10 minutos
à 65
ºC
. Foram então adicionados a cada tubo, 4 µL de tampão específico para a reação
(5X), 1 µL de dNTP (10 mM), 2 µL de DTT (0,1 M) e 1 µL da enzima SuperScript
(200 U/µL) (Invitrogen) por tubo, seguindo nova incubação à 50
ºC
por 50 minutos. A
reação foi bloqueada por uma incubação de 15 minutos à 70
ºC
.
3.9 Quantificação das citocinas por PCR em tempo real (qPCR)
As amostras foram analisadas e quantificadas por RT-PCR em tempo real. As
amostras de cDNA foram individualmente adicionadas a reações contendo as
seqüências de "primers" (0,5 µM); 12,5 µL do Qiagen QuantiTect SYBR Green PCR
Master Mix (GmbH) e água para ajustar o volume final de 25 µL por tubo.
As reações foram incubadas no termociclador PT-200 (MJ Research, Inc.
Whatertown) e submetidas inicialmente a uma fase de ativação da enzima polimerase a
95° C por 15 min. (“hot start”). As seqüências alvos foram amplificadas por 45 ciclos
constituídos de etapas sucessivas de desnaturação (95° C por 20 segundos), e
anelamento (60° C por 20 segundos).
A detecção da fluorescência do SYBR Green incorporado ao material dupla
fita amplificado a cada ciclo foi efetuada pelo aparelho Chromo 4 (MJ Research, Inc.
Whatertown).
As seqüências dos primers utilizados (
β
2
microglobulina, Il-1
β
, Il-6, Il-12,
Tnf-
α
, Tgf-β, Il-10, Dap12, Trem1 e Trem2) foram:
PRIMER FORWARD REVERSE
β
ββ
β
2
5’-TGACCGGCTTGTATGCTATC-3’
5’-CAGTGTGAGCCAGGATATAG-3’
Il-1β
5’-GAGATTGAGCTGTCTGCTCA-3’
5’-AAGGAGAACCAAGCAACGAC-3’
Il-6
5’-GTACTCCAGAAGACCAGAGG-3’
5’-TGCTGGTGACAACCACGGCC-3’
Tnf-
α
αα
α
5’-TTGACCTCAGCGCTGAGTTG-3’
5’-CCTGTAGCCCACGTCGTAGC-3’
Il-12p40
5’-CAGTACACCTGCCACAAAGGA-3’
5’-GTGTGACCTTCTCTGCAGACA-3’
MATERIAL E MÉTODOS
______________________________________________________________________
___________________________________________________________________ 28
Tgf-β
5’-ACCGCAACAACGCCATCTAT-3’
5’-GTAACGCCAGGAATTGTTGC-3’
Il-10
5’-TCAAACAAAGGACCAG
CTGGACAACATACTG-3’
5’-CTGTCTAGGTCCTGGA
GTCCAGCAGACTCAA-3’
Dap12
5’-CAGGATGGAAGAGCACAACA-3’
5’-GGGAAGTTCACCAAACA-3’
Trem1
5’-CAGGATGGAAGACGACAACA-3’
5’-GGGAACTTCACCCGAAACA-3’
Trem2
5’-AGAGTGATGGTGACGGTTCC-3’
5’-TATGACGCCTTGAAGCACTG-3’
Após a aquisição dos dados estes foram analisados pelo programa “Opticon
Monitor Analysis Software 2.03”. A cada amostra foi atribuído um valor de CT (“Cycle
Threshold”) referente ao número de ciclos necessários para que a fluorescência
incorporada às duplas fitas amplificadas comece a aumentar acima da fluorescência de
fundo das reações, ou seja, no início da fase log de amplificação das seqüências alvos.
O valor do CT depende diretamente de quantas cópias destas seqüências alvos
havia inicialmente em cada amostra. Assim, quanto menor o número de cópias do gene
de interesse na amostra, maior a quantidade de ciclos necessários para a fluorescência
aumentar além do limiar da fluorescência de fundo da reação. E quanto maior o número
de cópias, menor o número de ciclos de amplificação necessários para a fluorescência
aumentar além deste limite.
Após a fase de amplificação, o produto da reação foi submetido a uma fase de
dissociação, onde a temperatura varia de 55° C a 90° C e a fluorescência da reação foi
adquirida a cada 1° C, registrando-se a temperatura em que ocorreu a dissociação ou
desnaturação da dupla fita do material amplificado. Esta temperatura reflete o tamanho
do fragmento amplificado e, portanto, a especificidade do material amplificado em cada
amostra.
Para o cálculo da expressão relativa foi utilizado o método de 2
-∆∆Ct
(LIVAK
et al., 2001) que consiste em subtrair o Ct (“threshold cicle”) do gene de interesse pelo
Ct do gene constitutivo, obtendo-se o ∆Ct, em seguida subtrai-se esse ∆Ct pelo ∆Ct
médio da amostra calibradora (cuja expressão será considerada 1), obtendo-se o ∆∆Ct
e, por fim, calcula-se o 2
-∆∆Ct
, que representa quantas vezes o gene de interesse está
aumentado ou diminuído em relação ao calibrador. Quando o gene não apresenta Ct,
MATERIAL E MÉTODOS
______________________________________________________________________
___________________________________________________________________ 29
por não amplificar nos 45 ciclos usados no experimento, ou quando apresenta Ct maior
que 35, considera-se o Ct como 35, para poder se calcular o 2
-∆∆Ct
. Os animais AIRmin
controles foram utilizados como os calibradores e os resultados representados em log2
feito a partir média de 2
-∆∆Ct
obtida.
Foi utilizado como gene constitutivo a β2 microglobulina. A fim de se avaliar
se algum dos tratamentos utilizados neste trabalho afeta a expressão gênica da β2
microglobulina e, consequentemente, invalidaria o cálculo da expressão relativa do
gene de interesse, foram feitas reações com cada tratamento e comparadas as
expressões de β2 microglobulina antes e após o tratamento, pelo método 2
-∆∆CT
,
notando-se que não houve diferenças significativas e que, portanto, este gene pode ser
usado como controle constitutivo neste modelo experimental.
Para o cálculo do 2
-∆∆Ct
ser válido é necessário demonstrar que as eficiências
de amplificação do gene alvo e do gene constitutivo são aproximadamente iguais. Para
isso, foi feita uma curva de diluição do cDNA utilizado e calculado o ∆Ct. Para todos
os primers utilizados, obteve-se eficiências de amplificação semelhantes entre os genes
alvos e a β2 microglobulina.
3.10 Fagocitose de zimosan
Nos ensaios de fagocitose foram utilizadas placas de cultura de 24 poços, nos
quais foram colocadas lamínulas de vidro redondas. Os macrófagos foram plaqueados e
incubados para adesão conforme descrito no item acima, de modo a conter 1x10
6
macrófagos/poço. Em seguida, os macrófagos foram incubados com partículas de
zimozan (Sigma) (0,75 mg/mL) ou em meio de cultura, e então mantidos em estufa de
37° C com 5% CO
2
por 1 hora para a fagocitose. Após este período, as lamínulas foram
retiradas da placa de cultura, lavadas em PBS, e coradas por Diff–Quick para
quantificação da fagocitose ao microscópio comum (objetiva de imersão). A
porcentagem de macrófagos contendo partículas no seu interior foi contada, assim
como o número de partículas por célula, para determinação do índice fagocítico (IF). O
IF corresponde ao produto percentual de macrófagos fagocitantes pelo número médio
de partículas por macrófagos fagocitante (FADOK et al., 1998).
IF= (%macrófagos fagocitantes) x (nº médio de partículas fagocitadas por macrófago fagocitante)
MATERIAL E MÉTODOS
______________________________________________________________________
___________________________________________________________________ 30
3.11 Análise Estatística
Os resultados obtidos foram analisados pelo método One-Way ANOVA, e
múltiplas comparações pelo teste de Tukey. Todas as análises e gráficos foram
realizados utilizando-se o software GraphPad Prism 4.0 ( Graph Pad Software, Inc., San
Diego, CA, EUA). O nível de significância estabelecido foi de p<0,05.
RESULTADOS
______________________________________________________________________
___________________________________________________________________ 31
4. RESULTADOS
4.1 Inflamação peritonial induzida pelo tioglicolato em animais das linhagens
AIRmax e AIRmin
Os animais foram submetidos à injeção intraperitonial de 1mL de Tioglicolato
e após 6, 24, 48, 72, 96 e 168 horas (sete dias) o lavado peritonial foi colhido.
Podemos verificar na figura 1 um aumento do número de células no peritônio
de animais AIRmax após a injeção de tioglicolato em relação ao número de células
observado em animais controles, sendo este aumento significativo após 6, 24, 48 e 96
horas da injeção, indicando que o tioglicolato estaria agindo como um estímulo e
recrutando um maior número de células infiltrantes para o peritônio. Nos animais
AIRmin uma migração significativa de células também pode ser observado, porém,
somente após 96 horas da injeção de tioglicolato. Após 7 dias do estímulo, os animais
apresentaram um número de células totais muito semelhante ao número observado nos
animais controles.
Foi observada uma diferença estatisticamente significativa entre as linhagens
AIRmax e AIRmin apenas após 6 horas da injeção de tioglicolato, nos quais, os animais
AIRmax apresentaram um maior número de leucócitos infiltrados em relação aos
animais AIRmin.
Figura 1- Determinação do número de células totais no peritônio de animais das linhagens
AIRmax e AIRmin.
Os animais AIRmax e AIRmin foram inoculados i.p. com tioglicolato
e as células totais do lavado peritonial foram obtidas após 6, 24, 48, 72, 96 horas e 7 dias da
inoculação. Os animais controles não receberam tioglicolato. Cada valor representa a média ±
SEM, com n=3-5 animais por grupo. * P<0,05 indica diferença significativa interlinhagens
(AIRmax x AIRmin). § P<0,05 indica diferença significativa entre grupos controles e
injetados com tioglicolato da mesma linhagem.
0.0
2.5
5.0
7.5
10.0
12.5
Cont
6h 24h
72h 96h
7dias
48h
§
§
§
§
§
*
nº de células totais(*10
6
)
AIRmax
AIRmin
TIO
Sem TIO
RESULTADOS
______________________________________________________________________
___________________________________________________________________ 32
4.2 Análise fenotípica das células peritoneais de animais das linhagens AIRmax e
AIRmin
Para caracterizar as diferentes populações celulares presentes no peritônio das
linhagens AIRmax e AIRmin após o estímulo de tioglicolato, as células totais do lavado
peritonial obtidas após 6, 24, 48, 72, 96 e 168 horas da inoculação, foram analisadas
por citometria de fluxo.
Podemos observar na figura 2A, que as células peritoneais obtidas nas
linhagens AIRmax e AIRmin controles são constituídas por uma população de
macrófagos expressando alta intensidade de fluorescência para F4/80, além de uma
pequena população de neutrófilos (GR1
+
).
Após 6 horas da inoculação i.p. de tioglicolato, foram observadas uma elevada
migração de neutrófilos para a cavidade peritonial, sendo este fenômeno mais intenso
em animais da linhagem AIRmax. Em contrapartida a este aumento, foi verificada uma
diminuição acentuada na população de macrófagos. A partir de 24 horas, nossos
resultados indicam um aumento na porcentagem de macrófagos, sugerindo um
repovoamento do peritônio por estas células, sendo o período de uma semana após o
estímulo, tempo suficiente para o peritônio assemelhar-se a um animal controle.
Entre as populações presentes no peritônio, os linfócitos caracterizados pela
marcação de B220/CD3, constituem uma população bastante representativa em animais
das linhagens AIRmax e AIRmin controles como também, em animais estimulados
previamente com tioglicolato. A inoculação de tioglicolato induziu uma migração
acentuada de neutrófilos após 6 horas do estímulo em animais AIRmax. Este efeito,
porém não significativo, também foi observado nos animais da linhagem AIRmin
(Figura 2B).
Em relação à população de macrófagos, pudemos verificar um aumento
significativo do número destas células somente nas linhagens AIRmax, após 24 e 48
horas da inoculação de tioglicolato, em relação aos animais controles. Sendo observado
após 96 horas do estímulo, um aumento significativo do número de macrófagos em
animais AIRmax e AIRmin em relação aos seus respectivos controles.
RESULTADOS
______________________________________________________________________
___________________________________________________________________ 33
GR1
+
Cont
Tio 48h
Tio 96h
Tio 72h
Tio 24h
Tio 6h
Tio
7dias
AIRmax
AIRmin
A.
RESULTADOS
______________________________________________________________________
___________________________________________________________________ 34
Figura 2- Análise fenotípica de células peritoneais das linhagens AIRmax e AIRmin. A expressão
de GR1 e F4/80 em células peritoneais, após estímulo de tioglicolato, foi avaliada por
citometria de fluxo, incubando-se as células com monoclonais marcados com fluorocromos.
Os números apresentados nas figuras representam os valores relativos das células GR1
+
e
F4/80
+
em cada grupo. O primeiro gate foi utilizado para excluir as células inviáveis, que
incorporaram o PI. O segundo gate foi utilizado para excluir as células pequenas e pouco
granulosas (A). O número de células de cada população celular presente no lavado peritonial
foi obtido multiplicando-se o número relativo pelo número total de células presentes no
lavado peritonial (B). Os experimentos foram repetidos 3 vezes, mostrando o mesmo perfil de
resultados. Cada valor representa a média ± DP, com n=5 para cada grupo. * P<0,05 indica
diferença significativa interlinhagens (AIRmax x AIRmin); § P<0,05 indica diferença
significativa entre grupos controles e injetados com tioglicolato da mesma linhagem.
4.3 Ativação de macrófagos peritoneais das linhagens AIRmax e AIRmin quanto a
secreção de NO e liberação de H
2
O
2
Para verificar se existem diferenças quanto à síntese de NO por macrófagos de
animais AIRmax e AIRmin, as células aderentes do peritônio obtidas em diversos
tempos após a injeção de tioglicolato, foram ativadas ou não por LPS, e deixadas em
cultura por 48 horas.
O NO foi sintetizado em todos os sobrenadantes coletados nos quais os
macrófagos haviam sido previamente obtidos por inoculação de tioglicolato e ativados
com LPS. Verificou-se também uma diferença entre a síntese de NO entre os
camundongos AIRmax e AIRmin, inoculados com tioglicolato e co-cultivados com
LPS, onde as células macrofágicas de animais AIRmax produziram uma maior
quantidade de NO, estatisticamente significativa, no período de 48 à 96 horas após o
estímulo de tioglicolato (Figura 3A).
Sabe-se que o promotor da iNOS, a enzima responsável pela síntese de NO,
apresenta dois importantes sítios de ligação a fatores de transcrição. Um destes sítios é
responsivo ao NF-κB, que é ativado pela sinalização via TLR e o outro é responsivo ao
0
1
2
3
4
5
6
Control Tio 6h Tio 24h
Tio 48h Tio 72h Tio 96h Tio 7dias
§
neutrófilo
s
macrófagos
linfócitos
AIRmax
AIRmin
§
§
§
*
§
nº de células (*10
6
)
B.
RESULTADOS
______________________________________________________________________
___________________________________________________________________ 35
IRF-1, que é induzido pela sinalização do receptor para IFN-γ (BASTOS et al., 2007).
Portanto, fomos verificar a importância de cada uma destas vias de sinalização na
regulação da síntese de NO nas duas linhagens. Para tanto, utilizamos o IFN-γ
recombinante como ativador da via do IRF-1 e o agonista de TLR4, o LPS, como
ativador da via do NF-κB.
Na figura 3B, foi observada um perfil aumentado da síntese de NO em todos
os sobrenadantes, exceto após sete dias, nas quais os macrófagos eram induzidos por
tioglicolato e ativados com LPS e IFN-γ em relação aos respectivos controles. Apesar
dos macrófagos das linhagens AIRmax retirados após 48 e 96 horas de estímulo com
tiglicolato continuarem sintetizando quantidades significativamente maiores de NO na
presença de LPS e IFN-γ, podemos observar que houve sinergismo entre o LPS e IFN-
γ somente nos cultivos de células dos animais AIRmin, com aumento significativo dos
níveis de NO no período de 48 à 96 horas após o estímulo in vivo.
RESULTADOS
______________________________________________________________________
___________________________________________________________________ 36
Figura 3- Avaliação da produção NO por macrófagos peritoneais dos animais AIRmax e AIRmin.
Macrófagos peritoneais de animais AIRmax e AIRmin obtidos após prévia inoculação com
tioglicolato (6, 24, 48, 72, 96 horas e 7 dias), foram incubados por 48 horas tratados ou não in
vitro com LPS (A) ou ativadas por LPS e tratadas ou não por IFN-γ (B). Após este período, os
sobrenadantes foram coletados e quantificados em leitor de ELISA para NO. Os experimentos
foram repetidos 3 vezes. Cada valor representa a média ± DP, com n=5 para cada grupo. *
P<0,05 indica diferença significativa interlinhagens (AIRmax x AIRmin); § P<0,05 indica
diferença significativa entre grupos controles e injetados com tioglicolato da mesma
linhagem; # P<0,05 indica diferença significativa em relação ao respectivo controle.
Também foi quantificada a liberação de peróxido de hidrogênio em culturas
de células das linhagens AIRmax e AIRmin. Para isto, células peritoneais foram
coletadas após estímulos de 6, 24, 48, 72, 96 e 168 horas de tioglicolato e avaliadas na
presença ou não de PMA (Figura 4).
O gráfico apresenta os grupos ativados por PMA, já que somente na presença
deste estímulo é que pôde ser verificada a liberação de H
2
O
2
. As células de animais
controles das linhagens AIRmax e AIRmin, e as células obtidas após 7 dias da injeção
de tioglicolato não secretaram peróxido de hidrogênio mesmo na presença de PMA
.
Verificou-se um aumento na liberação de H
2
O
2
em células
de animais
AIRmax e AIRmin comparados com células de animais controles, sendo este aumento
significativo nas células dos animais AIRmax tratados previamente com tioglicolato
0
5
10
15
20
Controle 6h 24h 48h
72h 96h
7dias
LPS - + - + - + - + - + - + - + - + - + - + - + - + - + - +
§
§
§
§
§
§
§
§
§
§
#
#
#
#
#
#
#
#
#
*
*
*
NO (
µ
µ
µ
µ
Mol)
0
5
10
15
20
LPS + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
IFN-γ - + - + - + - + - + - + - + - + - + - + - + - + - + - +
Controle 6h 24h 48h 72h
96h
7dias
*
*
§
§
§
§
§
§
§
§
§
#
#
#
§
NO (
µ
µ
µ
µ
Mol)
A.
B.
AIRmax
AIRmin
TIO
Sem TIO
RESULTADOS
______________________________________________________________________
___________________________________________________________________ 37
nos períodos de 6, 24 e 72 horas, em relação aos animais AIRmin sob o mesmo
tratamento.
Figura 4- Quantificação de H
2
O
2
em células peritoniais dos animais AIRmax e AIRmin. Os animais
AIRmax e AIRmin foram inoculados i.p. com tioglicolato e as células totais do lavado
peritonial obtidas após 6, 24, 48, 72, 96 horas e 7 dias da inoculação, tiveram o número
acertado para 2x10
5
/mL em solução de vermelho fenol, ativadas por PMA (20ng/poço),
seguida de incubação por duas horas em estufa. Após este período, a absorbância foi
determinada em leitor de ELISA. Os experimentos foram repetidos 2 vezes. Cada valor
representa a média ± SEM, com n=5 para cada grupo. * P<0,05 indica diferença significativa
interlinhagens (AIRmax x AIRmin); § P<0,05 indica diferença significativa entre grupos
controles e injetados com tioglicolato da mesma linhagem.
4.4 Quantificação de citocinas pró- e anti-inflamatórias quanto à secreção e
expressão gênica
Com o intuito de avaliar o perfil basal e induzido, seguido da adição de LPS,
da produção de citocinas pro-inflamatórias por macrófagos das linhagens AIRmax e
AIRmin, as células aderentes residentes do peritônio, foram deixadas em cultura por 6 e
24 horas, e foram avaliadas utilizando-se dois métodos: ELISA e RT-PCR em tempo
real.
Somente nas culturas de 24 horas foi possível detectar a secreção de IL-1β,
pela técnica de ELISA, podendo-se assim, observar um aumento desta citocina na
linhagem AIRmax em relação aos animais AIRmin (Figura 5Aa). Em relação à
expressão de Il-1β, observa-se um aumento na quantidade de mRNA após 24 horas em
cultura, dependente da ativação com LPS. É possível notar também que os macrófagos
provenientes dos animais AIRmax respondem com um aumento da expressão de Il-1β
após a adição de LPS de forma mais intensa que os originados de camundongos
AIRmin (Figura 5Ba), uma diferença significativa entre macrófagos da linhagem
AIRmax e AIRmin pode ser notada no tempo de 24 horas, ativados in vitro com LPS,
0
5
10
15
20
Cont
6h
24h 72h 96h
7dias
48h
§
§
§
§
§
§
§
§
*
*
*
§
§
Η
Η
Η
Η
2
2
2
2
Ο
Ο
Ο
Ο
2
2
2
2
(nMoles)
AIRmax
AIRmin
TIO
Sem TIO
RESULTADOS
______________________________________________________________________
___________________________________________________________________ 38
nas quais as células de animais AIRmin apresentaram uma menor expressão desta
citocina em relação à linhagem AIRmax.
Em ambas as linhagens pode ser verificado uma tendência a aumentar a
produção e a expressão gênica da citocina IL-6 (Figura 5Ab e 5Bb) quando as células
eram estimuladas in vitro com LPS em comparação com seus respectivos controles,
sendo este aumento significativo nas células de 24 horas de animais AIRmax. Quanto à
expressão gênica de Il-6, também pode ser verificado, em ambas as linhagens, uma
maior expressão nas células mantidas em cultura por 6 horas em relação as células
mantidas em cultura por 24 horas.
As células obtidas de animais AIRmax sintetizaram significativamente
maiores quantidades de IL-12 com 24 horas, quando comparadas ao tempo de 6 horas,
como também, em relação às células da linhagem AIRmin (Figura 5Ac).
Avaliando a expressão de Il-12 na linhagem AIRmax, pudemos observar um
aumento na expressão da citocina em células de 6 horas após o tratamento com LPS
(Figura 5Bc).
Não foi possível quantificar a citocina TNF-α pela técnica de ELISA (Figura
5Ad). Porém, ao quantificar a expressão gênica da citocina utilizando qPCR, pudemos
verificar um aumento significativo da citocina em 6 horas das células de animais
AIRmin ativados com LPS em relação ao seu respectivo controle (sem LPS), como
também em relação as mesmas células, porém após 24 horas de cultura (Figura 5Bd).
Em relação às células de animais AIRmax, observou-se um aumento significativo da
expressão gênica de Tnf-α nas células de 6 horas em relação às de 24 horas. Este
aumento também pode ser visualizado em relação às células de 6 horas da linhagem
AIRmin. Quando ativadas com LPS, as células de 24 horas de animais AIRmax,
aumentaram a expressão de Tnf-α em relação ao seu respectivo controle.
RESULTADOS
______________________________________________________________________
___________________________________________________________________ 39
Figura 5- Quantificação de citocinas pro-inflamatórias por macrófagos residentes das linhagens
AIRmax e AIRmin. Células aderentes do peritônio de camundongos AIRmax e AIRmin,
obtidos após estímulo in vivo com PBS, foram incubados por 6 ou 24 horas em estufa 37 ºC
e 5 % de CO
2
tratados ou não in vitro com LPS. Após este período, os sobrenadantes foram
coletados e quantificados pela técnica de ELISA (A) ou tiveram os mRNAs extraídos, e
transformados em cDNA, e a expressão gênica determinada pela técnica de RT-PCR em
tempo real (B) das citocinas IL-1β (a), IL-6 (b), IL-12p40 (c) e TNF-α (d). Os experimentos
foram repetidos 3 vezes. Cada valor representa a média ± SEM, com n=10. * P<0,05 indica
diferença significativa interlinhagens (AIRmax x AIRmin); e § P<0,05 indica diferença
significativa entre grupos de 6 e 24 horas da mesma linhagem; # P<0,05 indica diferença
significativa em relação ao respectivo controle.
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
LPS - + - + - + - +
§
§
#
P g /m L (IL -6 )
6 horas
24 horas
-10
-5
0
5
LPS - + - + - + - +
§
§
§
§
#
6 horas
24 horas
E x pre s s ã o re la tiva
(Il-6)
0
100
200
300
400
500
600
700
800
LPS - + - + - + - +
*
§
6 horas
24 horas
Pg/m L (IL-1 2p40)
a.
B.
c.
d.
b.
c.
d.
a.
b.
0
50
100
150
200
250
300
350
LPS - + - + - + - +
6 horas
24 horas
P g/m L (TN F -
α
α
α
α
)
A.
0
100
200
300
400
500
600
700
LPS - + - + - + - +
#
§
§
§
6 horas
24 horas
§
P g/m L (IL -1
β
β
β
β
)
AIRmax
AIRmin
PBS
-10
-5
0
5
LPS - + - + - + - +
#
§
§
§
6 horas
24 horas
*
Ex pressã o relativa
(Il-1ß)
-4
-3
-2
-1
0
1
2
3
LPS - + - + - + - +
§
6 horas
24 horas
Ex pre ss ã o rela tiv a
(Il-1 2p 4 0)
-2.5
0.0
2.5
5.0
LPS - + - + - + - +
#
§
§
#
6 horas
24 horas
*
Expressão relativa
(Tnf-a)
RESULTADOS
______________________________________________________________________
___________________________________________________________________ 40
Após 96 horas do processo inflamatório desencadeado pela presença do
tioglicolato na cavidade peritonial em animais das linhagens AIRmax e AIRmin, as
células aderentes do peritônio foram coletadas e colocadas em cultura por 6 ou 24 horas
na presença ou não LPS. Após este período, foram quantificados pela técnica de ELISA
e RT-PCR em tempo real para avaliação quanto à produção e expressão gênica das
citocinas.
Na figura 6Aa, podemos observar uma significativa síntese de IL-1β por
macrófagos cultivados por 24 horas e tratados com LPS da linhagem AIRmax, em
relação aos macrófagos controles da mesma linhagem e as células da linhagem
AIRmin, como também as células de animais AIRmax cultivadas por 6 horas sob o
mesmo tratamento.
Quanto à expressão gênica de Il-1β, podemos observar um aumento em
macrófagos de 24 horas das linhagens AIRmax e AIRmin estimulados com tioglicolato
e ativados por LPS, sendo este significativo quando comparado com seus respectivos
controles, e uma diferença significativa entre as linhagens, nas quais, os macrófagos de
24 horas de animais AIRmax ativados por LPS, apresentavam uma maior expressão da
citocina em relação as células de animais AIRmin sob o mesmo tratamento. (Figura
6Ba).
Em ambas as linhagens, verificamos um aumento significativo quanto à
síntese de IL-6 (Figura 6Ab) em macrófagos estimulados in vitro com LPS quando
comparados com seus respectivos controles. Já utilizando a técnica de qPCR, este
aumento da expressão de Il-6 na presença de LPS foi encontrado significativo em
células de animais AIRmax. Como também, pode ser observado em ambas as
linhagens, um aumento significativo na expressão gênica da citocina em células de 6
horas em relação às de 24 horas (Figura 6Bb).
Na Figura 6Ac, podemos observar maior produção de IL-12 nas células
obtidas de animais AIRmax cultivadas por 24 horas, quando comparadas às cultivadas
por 6 horas. Também na avaliação por qPCR da citocina Il-12, verificou-se um
aumento significativo da expressão gênica de Il-12 em macrófagos de animais AIRmax
previamente estimulados com tioglicolato e tratadas com LPS por 24 horas. Enquanto
que, células da linhagem AIRmin apresentaram uma menor expressão desta citocina em
animais ativados com o mesmo estímulo em comparação às células obtidas de AIRmax
(Figura 6Bc). Pudemos observar que o tratamento com LPS em macrófagos da
RESULTADOS
______________________________________________________________________
___________________________________________________________________ 41
linhagem AIRmax aumentou ainda, a expressão da citocina em células de 24 horas, em
relação ao seu respectivo controle e, as células deixadas em tratamento por 6 horas.
Observamos na figura 6Ad que a produção de TNF-α por macrófagos das
linhagens AIRmax e AIRmin, previamente estimulados in vivo com tioglicolato,
permaneceu abaixo da linha de detecção deste ensaio.
Na figura 6Bd foi avaliada a expressão gênica da citocina Tnf-α, na qual
pudemos verificar que macrófagos de animais AIRmax ativados com LPS aumentavam
significativamente a expressão gênica da citocina em relação aos seus respectivos
controles, enquanto que o oposto pode ser observado em relação as células da linhagem
AIRmin. Pode-se, ainda, observar que as células derivadas de camundongos AIRmax e
cultivadas com LPS por 6 horas apresentam uma expressão significativamente maior
que as obtidas de animais AIRmin e cultivadas nas mesmas condições.
RESULTADOS
______________________________________________________________________
___________________________________________________________________ 42
Figura 6- Quantificação de citocinas pro-inflamatórias por macrófagos induzidos por tioglicolato
das linhagens AIRmax e AIRmin. Células aderentes do peritônio de camundongos AIRmax
e AIRmin, obtidos após estímulo in vivo com tioglicolato, foram incubados por 6 ou 24
horas em estufa 37 ºC e 5 % de CO
2
tratados ou não in vitro com LPS. Após este período, os
sobrenadantes foram coletados e quantificados pela técnica de ELISA (A) ou tiveram os
mRNAs extraídos, e transformados em cDNA, e a expressão gênica determinada pela técnica
de RT-PCR em tempo real (B) das citocinas IL-1β (a), IL-6 (b), IL-12p40 (c) e TNF-α (d). Os
experimentos foram repetidos 3 vezes. Cada valor representa a média ± SEM, com n=10. *
P<0,05 indica diferença significativa interlinhagens (AIRmax x AIRmin); e § P<0,05 indica
diferença significativa entre grupos de 6 e 24 horas da mesma linhagem; # P<0,05 indica
diferença significativa em relação ao respectivo controle.
0
50
100
150
200
250
LPS - + - + - + - +
6 horas
24 horas
P g /m L ( T N F -
α
α
α
α
)
0
250
500
750
LPS - + - + - + - +
#
#
#
#
6 horas
24 horas
P g /m L (IL -6 )
-7.5
-5.0
-2.5
0.0
2.5
LPS - + - + - + - +
§
§
§
§
#
#
6 horas
24 horas
Expressão relativa
(Il-6)
a.
a.
b.
b.
d.
d.
c.
c.
-1
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
LPS - + - + - + - +
*
#
#
§
6 horas
24 horas
Expressão relativa
(Il-12 p40)
AIRmax
AIRmin
TIO
-6
-5
-4
-3
-2
-1
0
1
2
3
LPS - + - + - + - +
*
#
#
§
6 horas
24 horas
#
Expressão relativa (Tn f-a )
A.
0
100
200
300
400
500
600
700
LPS - + - + - + - +
§
6 horas
24 horas
P g/m L (IL-12 p4 0 )
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
LPS - + - + - + - +
§
#
#
6 horas
24 horas
*
P g/m L (IL-1
β
β
β
β
)
-5
0
5
10
LPS - + - + - + - +
*
#
#
6 horas
24 horas
Ex pre s s ão re lativ a
(Il1-ß )
B.
RESULTADOS
______________________________________________________________________
___________________________________________________________________ 43
As mesmas técnicas foram realizadas para determinar a síntese e expressão
gênica das citocinas anti-inflamatórias TGF-β e IL-10 em macrófagos das linhagens
AIRmax e AIRmin.
Pudemos verificar que, quando ativadas por LPS, as células, em ambas as
linhagens, secretavam quantidades significativamente maiores de IL-10, sendo esta
citocina mais secretada no período de 6 horas de cultura. Também foram observadas
diferenças significativas entre as linhagens, nas quais as células de animais AIRmin
após cultura de 6 horas sintetizavam maiores quantidades de IL-10. Enquanto que, na
presença de LPS, as células de 24 horas da linhagem AIRmin é que produziam maiores
quantidades de IL-10 em relação a linhagem AIRmax (Figura 7Aa). Quanto à expressão
gênica da Il-10, pode-se observar que as células obtidas de animais AIRmin
apresentaram uma menor expressão após 24 horas de cultura, independente da presença
de LPS, quando comparadas com as células mantidas em cultura por 6 horas. Também
foi possível observar uma expressão significativamente maior nas células obtidas de
animais AIRmax, mantidas em cultura por 24 horas, na ausência de LPS, quando
comparadas às células obtidas de animais AIRmin e mantidas nas mesmas condições
(Figura 7Ba).
É importante ressaltar quanto à produção de TGF-β, que em ambas as
linhagens, a maior produção da citocina ocorreu após 24 horas de cultura. As células
aderentes do peritônio de animais AIRmin produziram significativamente maiores
quantidades da citocina em relação aos animais AIRmax, independente do tratamento
com LPS e em todos os tempos avaliados (Figura 7Ab).
Na figura 7Bb, podemos verificar que diferentemente do observado pela
técnica de ELISA, a maior expressão gênica de Tgf-β ocorreu nas células após 6 horas
de cultura. Outro fato importante a ser observado, é que as células de 24 horas da
linhagem AIRmax tiveram um aumento significativo na expressão de Tgf-β após o
tratamento com LPS.
RESULTADOS
______________________________________________________________________
___________________________________________________________________ 44
Figura 7- Quantificação de citocinas anti-inflamatórias por macrófagos residentes
das linhagens
AIRmax e AIRmin. Células aderentes do peritônio de camundongos AIRmax e AIRmin,
obtidos após estímulo in vivo com PBS, foram incubados por 6 ou 24 horas em estufa 37 ºC
e 5 % de CO
2
tratados ou não in vitro com LPS. Após este período, os sobrenadantes foram
coletados e quantificados pela técnica de ELISA (A) ou tiveram os mRNAs extraídos, e
transformados em cDNA, e a expressão gênica determinada pela técnica de RT-PCR em
tempo real (B) das citocinas IL-10 (a) e TGF-β (b). Os experimentos foram repetidos 3 vezes.
Cada valor representa a média ± SEM, com n=10. * P<0,05 indica diferença significativa
interlinhagens (AIRmax x AIRmin); e § P<0,05 indica diferença significativa entre grupos de
6 e 24 horas da mesma linhagem; # P<0,05 indica diferença significativa em relação ao
respectivo controle.
Não houve diferenças significativas entre os macrófagos nas linhagens
AIRmax e AIRmin, induzidos por tioglicolato, quanto a produção e expressão de IL-10
(Figuras 8Aa e 8Ba), porém pode ser visualizado que o tratamento com LPS induziu
significativamente uma maior síntese de IL-10, em ambas as linhagens, tanto com 6
quanto com 24 horas de cultura. Sendo, ainda, o tratamento com LPS mais eficiente em
induzir a produção de IL-10 quando as células permaneceram em cultura por 6 horas.
Os resultados da expressão gênica de Il-10, mostram uma menor expressão
desta citocina em macrófagos obtidos de animais AIRmax e AIRmin, induzidos por
tioglicolato in vivo, e mantidos em cultura por 24 horas quando comparados com os
mantidos em cultura por apenas 6 horas.
Ao avaliar a produção TGF-β em macrófagos das linhagens AIRmax e
AIRmin obtidos pela injeção prévia de tioglicolato, verificamos uma maior síntese por
células da linhagem AIRmax quando ativadas in vitro com LPS. Sendo que estes
a.
a.
0
100
200
300
400
500
600
700
LPS - + - + - + - +
§
§
#
#
#
#
*
*
6 horas
24 horas
Pg/m L (IL-1 0)
0
100
200
300
400
500
600
700
LPS - + - + - + - +
6 horas
24 horas
*
§
§
§
§
*
*
*
P g/m L (TG F-
β
β
β
β
)
b.
b.
AIRmax
AIRmin
PBS
A.
B.
-9
-8
-7
-6
-5
-4
-3
-2
-1
0
1
2
LPS - + - + - + - +
*
§
§
6 horas
24 horas
Ex pre s s ã o re la tiv a
(Il-10 )
-2.5
-2.0
-1.5
-1.0
-0.5
0.0
0.5
1.0
1.5
LPS - + - + - + - +
§
§
#
6 horas
24 horas
E x pre ss ã o re la tiv a (T g f-ß )
RESULTADOS
______________________________________________________________________
___________________________________________________________________ 45
macrófagos da linhagem AIRmax apresentaram uma maior produção, estatisticamente
significativa, de TGF-β, quando comparados aos respectivos controles (Figura 8Ab).
Pode ser visualizado na figura 8Bb, um aumento significativo da expressão de
Tgf-
β
em macrófagos de 6 horas induzidos por tioglicolato e ativados por LPS da
linhagem AIRmax, em relação aos animais da linhagem AIRmin sob as mesmas
condições.
Figura 8- Quantificação de citocinas anti-inflamatórias por macrófagos induzidos por tioglicolato
das linhagens AIRmax e AIRmin. Células aderentes do peritônio de camundongos AIRmax
e AIRmin, obtidos após estímulo in vivo com tioglicolato, foram incubados por 6 ou 24
horas em estufa 37 ºC e 5 % de CO
2
tratados ou não in vitro com LPS. Após este período, os
sobrenadantes foram coletados e quantificados pela técnica de ELISA (A) ou tiveram os
mRNAs extraídos, e transformados em cDNA, e a expressão gênica determinada pela técnica
de RT-PCR em tempo real (B) das citocinas IL-10 (a) e TGF-β (b). Os experimentos foram
repetidos 3 vezes. Cada valor representa a média ± SEM, com n=10. * P<0,05 indica
diferença significativa interlinhagens (AIRmax x AIRmin); e § P<0,05 indica diferença
significativa entre grupos de 6 e 24 horas da mesma linhagem; # P<0,05 indica diferença
significativa em relação ao respectivo controle.
4.5 Avaliação da expressão gênica de moléculas reguladoras da transdução de
sinais via TLR em macrófagos da linhagem AIRmax e AIRmin
Nesta próxima etapa do projeto, foram realizadas a quantificação da expressão
gênica de Dap12, Trem1 e Trem2 em macrófagos da linhagem AIRmax e AIRMin
estimulados ou não in vivo com tioglicolato, e ativados ou não, in vitro, com LPS.
-7
-6
-5
-4
-3
-2
-1
0
1
2
3
4
LPS - + - + - + - +
§
#
#
6 horas
24 horas
Ex pressão relativa
(Il-10)
a.
b.
a.
b.
0
100
200
300
400
LPS - + - + - + - +
6 horas
24 horas
#
#
*
*
P g /m L (T G F-
β
β
β
β
)
-3
-2
-1
0
1
2
3
LPS - + - + - + - +
*
6 horas
24 horas
Expres são relativ a
(T g f-ß )
0
100
200
300
400
500
600
700
LPS - + - + - + - +
§
§
#
#
#
#
6 horas
24 horas
Pg/m L (IL-10)
AIRmax
AIRmin
TIO
B.
A.
RESULTADOS
______________________________________________________________________
___________________________________________________________________ 46
Ao verificar a expressão gênica de Dap12 em células aderentes do peritônio,
foi observado, em ambas as linhagens, maior expressão deste receptor nas células de 6
horas tratadas ou não com LPS, em relação às células deixadas em cultura por 24 horas.
E ainda que as células de animais AIRmax apresentavam uma expressão
significativamente maior deste receptor em relação à linhagem AIRmin (Figura 9A).
Este aumento na expressão nas células de 6 horas da linhagem AIRmax e
AIRmin, foi também observada em relação à quantificação do receptor Trem1 na
Figura 9B. Como também, o aumento na expressão deste receptor pro-inflamatório em
células ativadas por LPS durante 24 horas na linhagem AIRmax, em relação as células
da linhagem AIRmin sob as mesmas condições, apresentando um perfil de expressão
muito semelhante ao da Dap12.
Em relação à expressão gênica do receptor de função anti-inflamatória
(Trem2), não foram observadas diferenças significativas entre as linhagens (Figura 9C).
Figura 9- Expressão relativa de Dap12, Trem1 e Trem2 quantificadas em macrófagos residentes das
linhagens AIRmax e AIRmin. Células aderentes do peritônio de camundongos AIRmax e
AIRmin, obtidos após estímulo in vivo com PBS, foram incubados por 6 ou 24 horas em
estufa 37 ºC e 5 % de CO
2
tratados ou não in vitro com LPS. Após este período, tiveram os
mRNAs extraídos, e transformados em cDNA, e a expressão gênica de Dap12 (A), Trem1 (B)
e Trem2 (C) foram, então, quantificada pela técnica de RT-PCR em tempo real. Os
experimentos foram repetidos 3 vezes. Cada valor representa a média ± SEM, com n=10. *
P<0,05 indica diferença significativa interlinhagens (AIRmax x AIRmin); e § P<0,05 indica
diferença significativa entre grupos de 6 e 24 horas da mesma linhagem; # P<0,05 indica
diferença significativa em relação ao respectivo controle.
A expressão gênica de Dap12 em macrófagos induzidos por tioglicolato foi
demonstrada na figura 10A, onde pode-se observar, em ambas as linhagens, que os
C.
-6
-5
-4
-3
-2
-1
0
1
2
3
4
LPS - + - + - + - +
§
§
§
§
*
6 horas
24 horas
Ex pre s são re lativ a (Tre m 1 )
A.
AIRmax
AIRmin
PBS
B.
-7.5
-5.0
-2.5
0.0
2.5
LPS - + - + - + - +
§
#
6 horas
24 horas
E x pre s s ã o re la tiv a
(T r e m 2 )
-7.5
-5.0
-2.5
0.0
2.5
5.0
7.5
LPS - + - + - + - +
§
§
§
§
*
*
*
6 horas
24 horas
Ex pre s s ã o re la tiv a
(D ap 12 )
RESULTADOS
______________________________________________________________________
___________________________________________________________________ 47
macrófagos expressam significativamente maiores quantidades do MRNA da proteína
adaptadora após cultura de 6 horas, quando comparada com os macrófagos de 24 horas.
Outra diferença significativa também observada, foi um aumento da expressão de
Dap12 em células de 24 horas tratadas com LPS da linhagem AIRmax, em relação aos
animais AIRmin. Já quanto à linhagem AIRmin, foi visualizada uma diminuição
significativa na expressão de Dap12 quando as células de 24 horas eram ativadas com
LPS.
Ao verificar a expressão gênica do receptor Trem1, foi observado um aumento
significativo na sua expressão em células cultivadas por 24 horas, obtidas de animais
AIRmin previamente inoculados com tioglicolato, em relação as células de 6 horas de
cultura do mesmo grupo. Macrófagos cultivados por 24 horas da linhagem AIRmin
também apresentaram uma diminuição significativa da expressão de Trem1 na presença
de LPS. O perfil oposto pode ser observado quando estas células eram deixadas em
cultura por 6 horas (Figura 10B). Em relação à linhagem AIRmax, macrófagos ativados
por LPS por 24 horas expressavam maiores quantidades de Trem1 em relação a
linhagem AIRmin. Além disso, as células de animais AIRmax mostraram uma
tendência em aumentar a expressão destes receptores pro-inflamatórios após estímulo
de LPS.
Na figura 10C pode ser observado, que macrófagos induzidos por tioglicolato,
diminuíram a expressão gênica do receptor Trem2 após estímulo com LPS, em ambas
as linhagens e tempos em cultura.
RESULTADOS
______________________________________________________________________
___________________________________________________________________ 48
Figura 10- Expressão relativa de Dap12, Trem1 e Trem2 quantificadas em macrófagos induzidos
por tioglicolato das linhagens AIRmax e AIRmin. Células aderentes do peritônio de
camundongos AIRmax e AIRmin, obtidos após estímulo in vivo com tioglicolato, foram
incubados por 6 ou 24 horas em estufa 37 ºC e 5 % de CO
2
tratados ou não in vitro com
LPS. Após este período, tiveram os mRNAs extraídos, e transformados em cDNA, e a
expressão gênica de Dap12 (A), Trem1 (B) e Trem2 (C) foram, então, quantificada pela
técnica de RT-PCR em tempo real.. Os experimentos foram repetidos 3 vezes. Cada valor
representa a média ± SEM, com n=10. * P<0,05 indica diferença significativa interlinhagens
(AIRmax x AIRmin); e § P<0,05 indica diferença significativa entre grupos de 6 e 24 horas
da mesma linhagem; # P<0,05 indica diferença significativa em relação ao respectivo
controle.
4.6 Atividade fagocítica em macrófagos das linhagens AIRmax e AIRmin
Em vista da importância dos macrófagos como células efetoras na imunidade
inata e adaptativa, responsáveis pela eliminação de micoorganismos, entre outras
funções, e pertencentes ao sistema fagocitário mononuclear, empregamos ensaio in
vitro de fagocitose de partículas inertes de zimosan por macrófagos das linhagens
AIRmax e AIRmin.
As células aderentes do exsudato peritonial foram cultivadas na presença de
partículas zimosan em estufa 37 ºC e 5 % de CO
2
por 1 hora e, após remoção das
partículas não fagocitadas, as células foram observadas microscopicamente para
quantificação do percentual de macrófagos fagocitantes e do número médio de
partículas fagocitadas por macrófago fagocitante (Índice Fagocítico - IF).
As figuras 11 e 12 ilustram o IF (A) e o percentual de fagocitose (B), das
células aderentes do peritônio de animais AIRmax e AIRmin, obtidas após estímulo in
C.
A.
-1
0
1
2
3
4
5
6
LPS - + - + - + - +
§
*
#
#
6 horas
24 horas
*
Ex press ão relativa
(Tr em 1 )
AIRmax
AIRmin
TIO
-8
-7
-6
-5
-4
-3
-2
-1
0
1
2
3
LPS - + - + - + - +
§
§
§
§
*
#
6 horas
24 horas
Ex pressão relativ a
(D ap 12)
-5.0
-2.5
0.0
2.5
LPS - + - + - + - +
6 horas
24 horas
Ex pre s s ão rela tiv a
(T re m 2 )
B.
RESULTADOS
______________________________________________________________________
___________________________________________________________________ 49
vivo com PBS ou tioglicolato, respectivamente. Não foi verificado nenhuma diferença
entre as linhagens AIRmax e AIRmin, quanto a atividade fagocítica de macrófagos
residentes ou induzidos por tioglicolato.
No entanto, pode-se observar uma maior capacidade de fagocitar partículas de
zimosan em macrófagos induzidos por tioglicolato em ambas as linhagens em relação
às células aderentes residentes do exsudato peritonial, indicando que macrófagos de
animais estimulados in vivo fagocitaram mais intensamente partículas de zimosan.
Pode-se observar na figura 11C, que as células obtidas estavam
morfologicamente diferenciadas em uma forma amebóide. Enquanto que, o tratamento
com tioglicolato resultou na obtenção de macrófagos de morfologia mista contendo
tanto células redondas, como também, células em formato de fibroblastos (Figura 12C).
RESULTADOS
______________________________________________________________________
___________________________________________________________________ 50
Figura 11- Fagocitose de zimosan por macrófagos residentes
das linhagens AIRmax e AIRmin.
Macrófagos peritoneais de camundongos AIRmax e AIRmin, obtidos após estímulo in vivo
com PBS, e aderidos em lamínula de vidro foram incubados por 1 hora em estufa 37 ºC e 5
% de CO
2
na presença de partículas zimosan (0,75mg/mL). As partículas não fagocitadas
foram lavadas, e as lamínulas coradas por Diff Quick e observadas ao microscópio comum
para determinação do IF (A) e % fagocítica (B). As fotos representativas de macrófagos
fagocitando partículas de zimosan com aumento de 10, 20 e 40 vezes, respectivamente, em
microscopia óptica (C). Os experimentos foram repetidos pelo menos 3 vezes. Cada valor
representa a média ± SEM, com n=5 para cada grupo.
0
100
200
IF
A.
0
25
50
75
% Fagocitose
B.
AIRmax
AIRmin
PBS
A
A
I
I
R
R
m
m
a
a
x
x
C
A
A
I
I
R
R
m
m
i
i
n
n
C
C.
RESULTADOS
______________________________________________________________________
___________________________________________________________________ 51
Figura 12- Fagocitose de zimosan por macrófagos
induzidos por tioglicolato das linhagens AIRmax
e AIRmin. Macrófagos peritoneais de camundongos AIRmax e AIRmin, obtidos após
estímulo in vivo com Tioglicolato de Brewer 3%, e aderidos em lamínula de vidro foram
incubados por 1 hora em estufa 37 ºC e 5 % de CO
2
na presença de partículas zimosan
(0,75mg/mL). As partículas não fagocitadas foram lavadas, e as lamínulas coradas por Diff
Quick e observadas ao microscópio comum para determinação do IF (A) e % fagocítica
(B). As fotos representativas de macrófagos fagocitando partículas de zimosan com
aumento de 10, 20 e 40 vezes, respectivamente, em microscopia óptica (C). Os
experimentos foram repetidos pelo menos 3 vezes. Cada valor representa a média ± SEM,
com n=5 para cada grupo.
A.
B.
0
25
50
75
% Fagocitose
0
100
200
IF
A
A
I
I
R
R
m
m
i
i
n
n
T
T
I
I
O
O
A
A
I
I
R
R
m
m
a
a
x
x
T
T
I
I
O
O
C.
AIRmax
AIRmin
TIO
DISCUSSÃO
______________________________________________________________________
___________________________________________________________________ 52
5 DISCUSSÃO
O recrutamento de células mielóides durante reações inflamatórias tem papel
importante na propagação e regulação da inflamação. No início do estágio agudo,
macrófagos residentes do tecido, granulócitos, mastócitos, como também o sistema
complemento e mediadores solúveis inflamatórios, contribuem para a resposta do
hospedeiro à injúria. Tardiamente, macrófagos são recrutados para lesão inflamatória e
têm papel dominante na manutenção e resolução da inflamação (SAVILL, 1997).
Além disso, os macrófagos, presentes em diversos tecidos do organismo, são
considerados sensores da quebra de homeostasia no tecido, que reconhecem o non self,
iniciam e conduzem a resposta imunológica.
Vista a importância dos macrófagos em um ambiente inflamatório e em nosso
modelo de camundongos selecionados seguindo protocolos de seleção genética
bidirecional, considerando as características de alta ou baixa reatividade inflamatória
aguda (IBAÑEZ et al., 1992), este projeto tem como principal objetivo a avaliação e
comparação da ativação das células macrófagicas presentes no exsudato peritonial dos
animais AIRmax e AIRmin.
A cavidade peritonial murina é geralmente utilizada para verificar o
surgimento das células de linhagem macrofágicas durante a inflamação. Apesar de
aproximadamente 1 milhão de macrófagos peritoneais possam ser obtidos em
camundongos não-tratados, mais do dobro deste número pode ser obtido após 48 à 96
horas de injeção intraperitonial de agentes indutores estéreis tais como, tioglicolato de
Brewer, caseína e peptona protease, entre outros.
Neste estudo, a inflamação experimental foi induzida pela injeção de um
agente irritante estéril, o tioglicolato, na cavidade peritonial do camundongo. A injeção
induziu uma resposta inflamatória aguda, acompanhada pela migração local de células
fagocíticas. Na tentativa de observar as mudanças dos macrófagos neste processo, o
tioglicolato foi injetado para induzir a inflamação, e células peritoneais foram coletadas
em diversos tempos.
Nossos dados indicam que em ambas as linhagens, os animais previamente
injetados por via i.p. com tioglicolato apresentaram um maior infiltrado celular no sítio
inflamatório, em relação aos animais sem o estímulo.
DISCUSSÃO
______________________________________________________________________
___________________________________________________________________ 53
A fim de identificar e caracterizar fenotipicamente as populações celulares
presentes no infiltrado peritonial, utilizamos a marcação com anticorpos conjugados
com fluocromos contra GR1, CD3/B220 e F4/80, seguida de leitura em citômetro de
fluxo.
O epítopo GR1, encontrado em dois receptores Ly-6G e Ly-6C, é utilizado
para identificação de neutrófilos devido sua alta expressão neste tipo celular. Este
epítopo também vem sendo utilizado para identificação de monócitos, subtipos de
células T e macrófagos, e em pré-DCs plasmocitóides, já que é observada a expressão
de GR1 nestas células (LAGASSE e WEISSMAN, 1996). Philip e colaboradores
(2003) demonstraram que neutrófilos são os únicos a expressar GR1 Ly-6G, e a maioria
dos outros tipos de células que exibem GR1 está atribuída ao Ly-6C. Cabe aqui
ressaltar que o anticorpo utilizado neste projeto marca ambos os receptores, Ly-6G e
Ly-6C, podendo assim, verificar a presença de células GR1
+
e F4/80
+
, principalmente
após a injeção de tioglicolato, em ambas as linhagens.
A Molécula GR1 além de estar presente em monócitos inflamatórios, está
envolvida no processo de migração (GEISSMANN et al., 2003; GORDON e
TAYLOR, 2005; TAYLOR et al., 2003). Além disso, esta molécula vem sendo descrita
como um marcador de ativação de macrófagos (MORDUE e SIBLEY, 2003; SWIRSKI
et al., 2007).
F4/80 é um dos melhores marcadores para caracterizar macrófagos teciduais,
mas é expresso em baixos níveis em macrófagos alveolares e monócitos, e não é
expresso em algumas populações presentes na polpa branca do baço e timo (AUSTYN
e GORDON, 1981). Contudo, este marcador não é exclusivo de macrófagos, pode ser
encontrado em populações de eosinófilos (MCGARRY e STUWART, 1991), e
subtipos de células dendríticas (VREMEC et al., 2000). Este marcador não é detectado
em linfócitos T e B, e é regulado negativamente em macrófagos peritoneais induzidos
por tioglicolato e células dendríticas
ativadas por GM-CSF, IFN-γ, anti-CD4 e LPS
(CAMINSCHI et al., 2001).
Nossos resultados mostraram que macrófagos residentes apresentavam um
fenótipo distinto dos macrófagos induzidos, onde os macrófagos residentes
expressavam níveis mais altos de F4/80
do que os macrófagos obtidos após prévia
injeção de tioglicolato. Porém, após 7 dias do estímulo, a expressão do marcador F4/80
foi semelhante ao encontrado na situação controle.
DISCUSSÃO
______________________________________________________________________
___________________________________________________________________ 54
Entre as populações presentes no peritônio, os linfócitos (B220/CD3
+
)
claramente predominam, constituindo uma população bastante representativa em
animais das linhagens AIRmax e AIRmin, mesmo após a prévia estimulação com
tioglicolato. Após 6 horas da inoculação de tioglicolato foi induzida uma diminuição na
população de macrófagos em relação ao número encontrado nos animais sem o
estímulo, sendo estes eventos mais pronunciantes em animais da linhagem AIRmax em
relação aos animais AIRmin. A seguir, foi verificado um aumento significativo de
macrófagos induzidos por tioglicolato após 96 horas em ambas as linhagens.
Outra diferença observada entre as linhagens, foi que após 6 horas da injeção
de tioglicolato, os animais AIRmax apresentavam um maior número de neutrófilos em
relação aos animais AIRmin. Isto pode ser explicado pelo fato das linhagens AIRmax e
AIRmin serem selecionadas geneticamente para o fenótipo de infiltrado celular e
extravasamento protéico 24 horas após a injeção de Biogel, sendo observado em
animais AIRmax um maior número de neutrófilos infiltrantes após o estímulo
selecionador em relação aos animais AIRmin.
Sabe-se que o número de neutrófilos encontrados no exsudato de
camundongos AIRmax é maior comparado com animais AIRmin, devido a 3 fatores:
maior capacidade da medula-óssea em produzir neutrófilos maduros; maior produção
de fatores quimiotáticos pelas células residentes ou infiltrantes após tratamento com
Biogel e maior resistência à apoptose das células do exsudato (RIBEIRO et al., 2003).
Além disso, sabe-se que em um processo inflamatório, as primeiras células a
serem recrutadas no local da inflamação são as células polimorfonucleares e os
macrófagos possuem um aparecimento mais tardio, sendo os grandes responsáveis pela
remoção de restos celulares para que ocorra o clearance do local alterado.
Os dados, em conjunto, mostram o potencial do tioglicolato na indução da
migração celular para o compartimento peritonial, em animais das linhagens AIRmax e
AIRmin. Nas primeiras 6 horas do estímulo, o tioglicolato parece induzir a migração
preferencial de neutrófilos, e após este período, se torna um potente indutor para a
entrada de macrófagos, preferencialmente após 96 horas, em ambas as linhagens.
Este mesmo perfil também pode ser observado em infecções, como exemplo a
infecção por L. monocytogenes que induz um influxo de monócitos e macrófagos para o
sítio da infecção. O recrutamento máximo de monócitos ocorre em 48 a 72 horas após a
infecção, sendo considerado mais tardio devido ao recrutamento de neutrófilos no
início da infecção (NORTH et al., 1970). As células expressando GR1 estão presentes
DISCUSSÃO
______________________________________________________________________
___________________________________________________________________ 55
nas primeiras 24 horas em reposta imunológicas (CZUPRYNSKI et al., 1994;
ROGERS et al., 1993).
Turchyn e colaboradores (2007), também demonstraram que ao injetar i.p.
7,5% de Caseína em camundongos BALB/c e coletar o lavado peritonial com 24, 48 e
72 horas da injeção, a existência de uma maior freqüência de neutrófilos após 24 horas
(46%), seguido por um declínio após 48 (11%) e 72 (1,5%) horas. Inversamente, os
níveis de macrófagos F4/80
+
aumentaram de 20% às 24 horas, para 31% às 48 horas, e
atingiu 36% às 72 horas.
Acredita-se que o desaparecimento de macrófagos peritoneais residentes após
6 horas do estímulo de tioglicolato, ocorra por meio de uma resposta fisiológica
conhecida como MDR (macrophage disappearance reaction) em resposta à um certo
estímulo no compartimento peritonial (BARTH et al., 1995).
Os dados da literatura indicam que a MDR pode ocorrer em reposta a uma
reação inflamatória não-específica aguda ou em hipersensibilidades do tipo tardia,
sendo caracterizada pelo desaparecimento de macrófagos peritoneais, com um influxo
concomitante de neutrófilos e o subseqüente reaparecimento de macrófagos peritoneais
residentes após 24-48 horas da injeção (BARTH et al., 1995).
Ainda, o MDR pode representar uma resposta benéfica ao hospedeiro,
resultando na ativação de macrófagos peritoneais e na regulação positiva de suas
funções. Foi proposto que macrófagos residentes em compartimentos peritoneais
estavam propensos a sofrerem uma série de sinais de ativação seqüenciais durante a
MDR em reações inflamatórias agudas, incluindo a produção de citocinas inflamatórias
e aumento da fagocitose (BARTH et al., 1995).
Estudos demonstraram a presença de agregados celulares de macrófagos e
outras células aderidos na parede do peritônio 24 horas após a injeção de estímulos
inflamatórios. Acredita-se que, o antígeno Mac-1 (CD11b/CD18), uma molécula de
adesão celular a qual é expresso em macrófagos peritoneais, poderia mediar à ligação
de macrófagos no mesotélio peritonial. O ligante para Mac-1, molécula de adesão
intracelular1 (ICAM-1) é expresso em células endoteliais e pode ser regulado
positivamente na presença das citocinas IL-1, TNF- α, e IFN-γ. Também é possível que
ICAM-1 seja expresso em células mesoteliais e possa ser regulado positivamente pela
produção de citocinas produzidas em resposta à inflamação aguda. Portanto, um
estímulo inflamatório poderia aumentar a ligação de macrófagos peritoneais nas células
do endotélio peritonial via ligação de Mac-1-ICAM-1(MELNIKOFF et al., 1989).
DISCUSSÃO
______________________________________________________________________
___________________________________________________________________ 56
Uma alternativa seria a explicação de que o MDR pode ser uma reposta
deletéria do hospedeiro. Teoricamente, o seqüestro de macrófagos durante o MDR pode
atrasar a formação de respostas imunológicas não específicas do hospedeiro à
patógenos ou às células tumorais, como também, a apresentação antigênica pelos
macrófagos às células T (BARTH et al., 1995).
Existem 2 subtipos de monócitos do sangue periférico, caracterizados pela
diferente expressão de células de superfície de receptores de quimiocinas e moléculas
de adesão. Um subtipo (Ly6C
+
CD62L
+
) foi demonstrado migrar para sítios
inflamatórios, incluindo a cavidade peritonial induzida por tioglicolato. O outro subtipo
de monócito (Ly6C
-
CD62L
-
), não migra para o peritônio inflamado, mas, ao invés
disto, parece ser o precursor de macrófagos peritoneais residentes. Devido à diferença
fenotípica e funcional encontrada entre os monócitos que resultam em macrófagos
residentes e induzidos, existe a possibilidade destes macrófagos resultantes serem
também diferentes funcionalmente e fenotipicamente (GEISSMANN et al., 2003;
SUNDERKÖTTER et al., 2004).
Vista a presença de diferenças fenotípicas entre macrófagos residentes e
induzidos no exsudato peritonial, porém não significativas entre linhagens AIRmax e
AIRmin, verificamos a existência de diferenças funcionais entre as linhagens.
A primeira análise funcional foi quanto à síntese de NO. Esta molécula é
produzida pela enzima NOS induzido (iNOS) em macrófagos e em outras células,
possuindo muitas funções na resposta inflamatória. Em macrófagos, monócitos e outras
células a indução do iNOS e a presença de L-arginina são suficientes para iniciar a
produção de NO. A indução de iNOS pode ser iniciada por citocinas inflamatórias IFN-
γ, TNF-α e IL-1. Contudo, o melhor indutor conhecido é o LPS ou endotoxina de
Escherichia coli. Células mielóides possuem na sua membrana um receptor para LPS, a
proteína CD14. O LPS, utilizando a proteína transportadora LBP (LPS binding protein),
é ancorado ao CD14 e assim, com a ajuda da proteína acessória MD2, interage com o
TLR4 e, desencadeia uma cadeia de fosforilação de proteínas que leva à ativação do
fator de transcrição NF-κB, o qual é responsável pela transcrição do MRNA do iNOS
(MACMICKING et al., 1997; MEDZHITOV e JANEWAY, 2000).
Ao quantificar os níveis secretados de NO na presença de LPS, foi observada
uma diferença quanto ao perfil de reposta entre macrófagos peritoneais de AIRmax e
AIRmin, já que macrófagos induzidos da linhagem AIRmax ativados por LPS,
secretaram maiores níveis NO. Também pode ser observado, em ambas as linhagens,
DISCUSSÃO
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uma produção basal de NO por macrófagos residentes do exsudato peritonial, ativados
ou não por LPS, e em macrófagos induzidos não ativados por LPS.
Bastos e colaboradores (2007), observaram que o promotor da iNOS,
apresentava dois importantes sítios de ligação a fatores de transcrição. Um destes sítios
é responsivo ao NF-κB, que é ativado pela sinalização via TLR. O outro é responsivo
ao IRF-1, que é induzido pela sinalização do receptor para IFN-γ. Portanto, uma forma
de ativar a iNOS é utilizar os dois agonistas (LPS e IFN-γ) sinergisticamente, ou na
ausência de IFN-γ seria utilizar altas doses de LPS (maiores que 10 µg).
Ao verificar a produção de NO utilizando o IFN-γ junto ao agonista de TLRs,
foi observado que somente com células de animais AIRmin ocorreu sinergismo entre os
dois agentes, com a síntese de maiores quantidades de NO na presença de IFN-γ e LPS.
Já as células da linhagem AIRmax sintetizavam semelhantes quantidades na presença
de LPS ou de ambos os agonistas.
Em nosso modelo, foram identificadas diferenças quanto à liberação de H
2
O
2
somente em leucócitos estimulados in vivo com tioglicolato das linhagens AIRmax e
AIRmin. Sendo a maior liberação observada nas células dos animais AIRmax,
principalmente após 24 e 72 horas do estímulo.
O aumento significativo na liberação de H
2
O
2
por leucócitos induzidos após 6
horas de tioglicolato nos animais AIRmax, provavelmente está relacionado com
aumento da população neutrofílica no número total de células do exsudato peritonial
neste grupo.
Uma possível explicação para a parcial inibição ou baixa produção de espécies
reativas do nitrogênio mediadas por macrófagos seria a presença de IL-10, TGF-β, IL-4
ou prostaglandina E2, que inibem a produção de iNOs (MA et al., 2003).
Sabe-se também que na presença das citocinas TNF-α e IFN-γ, os macrófagos
aumentam o seu burst oxidativo e passam a produzir derivados reativos do oxigênio e
do nitrogênio, como a H
2
O
2
e o NO (DING et al., 1988; LORSBACH e RUSSEL,
1992; TAVARES DE LIMA et al., 1998).
Os produtos de macrófagos ativados incluem a produção de citocinas pro-
inflamatórias, tais como TNF-α, IL-1 e IL-6, que são as principais citocinas para o
início e manutenção da inflamação. Os indutores da transcrição dos genes pro-
inflamatórios são os produtos de microorganismos, vários dos quais atuam através da
família de receptores semelhantes ao Toll (TLR) por meio do reconhecimento de
DISCUSSÃO
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padrões moleculares associados à patógenos (PAMPs). Um dos mais estudados ligantes
de TLR é o LPS. A estimulação por LPS em macrófagos inicia uma cascata de
sinalização complexa, nas quais, ocorre o recrutamento da proteína adaptadora MyD88
para o receptor TLR4, ativando assim, a cascata de sinalização que culminará na
translocação nuclear de NF-κB.
Na tentativa de quantificar a produção de citocinas inflamatórias, células do
exsudato peritonial residentes e induzidas por tioglicolato foram cultivadas na presença
ou não de LPS in vitro. As mesmas culturas as quais tiveram seus sobrenadantes
coletados e utilizadas nos ensaios de ELISA, tiveram seus RNAs extraídos e transcritos
em cDNA para realização do ensaio de qPCR, a fim de avaliar e comparar a secreção
de citocinas e sua expressão transcripcional.
A técnica de PCR em tempo real, permite identificar a fase exponencial de
amplificações e, por este motivo, vem sendo utilizada para a quantificação de cDNA
com alta eficiência, sensibilidade e reprodutibilidade. A curva de amplificação é obtida
através do monitoramento da fluorescência emitida, a qual aumenta sua intensidade de
maneira proporcional à quantidade de produto amplificado (GIULIETTI et al., 2001).
Nas culturas de macrófagos residentes das linhagens AIRmax e AIRmin, foi
possível observar produção de IL-1β somente nos sobrenadantes de células de animais
AIRmax. Já em macrófagos induzidos por tioglicolato, verificamos um aumento de
síntese da proteína e expressão gênica nas células de animais AIRmax após 24 horas de
cultura em relação às da linhagem AIRmin.
Podemos também observar em nossos resultados, um aumento na produção e
expressão de Il-1β em resposta a estimulação por LPS, em macrófagos cultivados por
24 horas da linhagem AIRmax induzidos por tioglicolato, e ainda, que esta expressão
foi maior em relação às células residentes do exsudato peritonial sob as mesmas
condições. Isto também foi verificado por Turchyn e colaboradores (2007), em
macrófagos de animais BALB/c induzidos por caseína.
Em ratos, macrófagos peritoneais residentes são capazes de produzirem
maiores quantidades de prostaglandinas do que macrófagos induzidos por tioglicolato,
isto ocorre devido a diferenças na expressão de ciclooxigenases 1 e 2 (WATANABE et
al., 1998). Em camundongos C57BL/6, macrófagos residentes foram mais susceptíveis
ao estímulo por LPS do que macrófagos induzidos por tioglicolato quanto à produção
de IL-6.
DISCUSSÃO
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Apesar da síntese de pro-IL-1β em cultura de macrófagos ser efetivamente
induzida pela estimulação de LPS, o processamento dependente de caspase-1 e a
liberação de IL-1β são acelerados por uma etapa adicional de ativação pela ligação de
adenosina trifosfato ao seu receptor em macrófagos, P2X7 (HUMPHREYS, et al.,
1998; FERRARI et al., 2006). Nossos resultados demonstraram que células do
exsudato peritonial induzidas por tioglicolato são capazes de secretar IL-1β sem a
necessidade da suplementação com adenosina trifosfato. Corroborando com os dados
observados em células do exsudato peritonial induzidas por caseína e ativadas por LPS
(TURCHYN et al., 2007).
Resultados realizados em nosso laboratório demonstraram uma grande
diferença na susceptibilidade e resistência ao choque endotóxico entre as linhagens
AIRmax e AIRmin, com DL50 de 154,3 e 358,8µg de LPS, respectivamente
(BORREGO et al., 2006). Sabe-se que o IL-1β tem um papel crucial no choque séptico,
sendo sintetizada como um precursor inativo (pro-IL-1β) em resposta à ativação por
agonistas de TLR. A sinalização crucial que é transduzida por TLRs para a indução da
expressão de pro- IL-1β é provavelmente ativada via NF-κB, e o processamento da
forma biologicamente ativa, e conseqüente liberação desta citocina, é gerada pela
ativação de caspase-1 através de um complexo protéico citossólico conhecido como
inflammasome (MARIATHASAN e MONACK, 2007).
Pudemos verificar que a presença de LPS induziu, em ambas as linhagens, um
aumento na produção da citocina IL-6 por macrófagos residentes e induzidos por
tioglicolato. Podemos também observar que ambos os tipos de macrófagos obtidos de
animais AIRmax apresentaram uma maior tendência em sintetizar e expressar a citocina
IL-6 em relação às células da linhagem AIRmin.
Em relação à citocina IL-12, foi observada uma maior produção com 24 horas
de cultura por macrófagos residentes da linhagem AIRmax, quando comparados à
linhagem AIRmin. A mesma diferença entre as linhagens também pode ser observada
quanto à expressão de Il-12, porém após 6 horas. Já os macrófagos induzidos por
tioglicolato, produziram e expressaram maiores quantidades de IL-12 pela linhagem
AIRmax em 24 horas.
Não foi possível detectar a produção de TNF-α pela técnica de ELISA nos
sobrenadantes de cultura de macrófagos residentes ou induzidos por tioglicolato, em
DISCUSSÃO
______________________________________________________________________
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ambas as linhagens. Provavelmente além da baixa sensibilidade do nosso ensaio, esta
citocina pode ter sido produzida anteriormente ao tempo verificado.
Ao quantificar o mRNA do Tnf-α pelo método de RT-PCR em tempo real foi
encontrada uma maior expressão da citocina em macrófagos residentes de 6 horas da
linhagem AIRmax, em relação a linhagem AIRmin. Este mesmo perfil também pode
ser observado em macrófagos induzidos por tioglicolato ativados por LPS. O fato dos
macrófagos residentes de animais AIRmax não terem respondido ao LPS, enquanto foi
verificado um aumento na expressão de Tnf-α na presença de LPS em células de
animais AIRmin, pode ser explicado pelo pico de expressão de TNF-α ocorrer após um
menor tempo de ativação com LPS em relação ao que foi avaliado (6 horas).
Quando cultivadas na presença de LPS, células residentes do exsudato
peritonial de camundongos BALB/c secretaram TNF-α em uma maneira dose-
dependente, não sendo observados diferenças quanto à magnitude e a cinética de
secreção da citocina em relação aos tipos de células, residentes ou induzidos por
caseína (TURCHYN et al., 2007).
Os dados em conjunto, em relação às citocinas pró-inflamatórias estudadas,
indicam uma maior expressão em macrófagos peritoneais de animais AIRmax que da
linhagem AIRmin, o que é condizente com a característica de alta inflamação aguda
dos animais AIRmax. Importante ressaltar que, a maior expressão em relação à Il-1β,
Il-6, Il-12, Tnf-α em macrófagos residentes da linhagem AIRmax ocorreu após 6 horas
de cultura, enquanto que em macrófagos induzidos e ativados por LPS, os maiores
níveis de expressão de Il-1β e Il-12 foram encontrados após 24 horas de cultura.
A respota transcripcional em macrófagos derivados da medula óssea para o
sinal de LPS foi examinada em detalhes por Wells e colaboradores (2003) em análises
do perfil de expressão. Foi demonstrado que os RNAs mensageiros codificadores de
citocinas pro-inflamatórios, quimiocinas, e outros fatores de transcrição de resposta
imediata, são induzidos transientemente, com um pico entre 2 e 7 horas em modelos de
camundongos, e depois declinam rapidamente. Uma segunda onda de ativação
transcripcional leva ao aparecimento de mRNAs que permanecem elevados por no
mínimo 21 horas. Do ponto de vista de uma resposta inflamatória típica in vivo, os
primeiros genes pro-inflamatórios seriam induzidos com a entrada dos macrófagos no
sítio inflamatório, com papel de controlar a ameaça ou dano. Os genes tardios incluem
citocinas anti-inflamatórias, tais com IL-10 e TGF-
β, e vários outros produtos
DISCUSSÃO
______________________________________________________________________
___________________________________________________________________ 61
direcionados para o clearence do local e, prevenção do recrutamento e ativação de
células adicionais.
Em relação às citocinas anti-inflamatórias estudadas, é interessante notar que
as células residentes do exsudato peritonial de animais AIRmin apresentam maiores
quantidades destas citocinas em relação a linhagem AIRmax, já que foi observada uma
maior produção de TGF-β e IL-10 em animais da linhagem AIRmin. Porém, em
macrófagos induzidos por tioglicolato e ativados por LPS observou-se uma maior
produção e expressão de TGF-β nos animais AIRmax, e uma expressão semelhante de
IL-10 entre as duas linhagens. Acreditamos que esta maior expressão de TGF-β
observada seja a responsável pela característica dos animais AIRmax de resolverem
mais rapidamente o processo inflamatório, enquanto que a inflamação nos animais
AIRmin tende a se cronificar, já que não ocorre um aumento de expressão de citocinas
anti-inflamatórias nestes animais previamente injetados com tioglicolato (MARIA, et
al., 2003).
Sabe-se que os sinais TLR estimulam não somente citocinas pro-
inflamatórias, mas também citocinas anti-inflamatórias, como a IL-10. Corroborando
assim, com nossos resultados, nas quais a presença de LPS induziu um aumento
significativo na produção de IL-10, em ambas as linhagens, tanto pelas células
residentes do exsudato peritonial, como pelos macrófagos induzidos por tioglicolato.
A IL-10 potencialmente inibe as funções de célula apresentadoras de
antígenos, tais como, células dendríticas e macrófagos através da repressão da produção
de citocinas inflamatórias e a inibição da expressão de moléculas co-estimulatórias e
MHC classe II. Assim, esta citocina está envolvida no controle da resposta imune (LI e
FLAVELL, 2008).
Dados previamente publicados em nosso Laboratório demonstram que
animais da linhagem AIRmax são mais resistentes a infecções intracelulares por
Salmonella typhimurium e Listeria monocytogenes do que os AIRmin. Esta diferença
entre as linhagens foi relacionada com a alta capacidade dos animais AIRmax de
controlar o crescimento bacteriano no baço (ARAÚJO et al., 1998). Além disso, esta
linhagem apresenta uma maior susceptibilidade ao choque endotóxico (BORREGO, et
al., 2006). Estes resultados sugerem a existência de diferenças quanto à produção de
citocinas pró-inflamatórias, notadamente TNF devido à sua importância na patologia do
choque séptico. Além disto, no nosso modelo experimental foi verificado uma maior
DISCUSSÃO
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ativação dos macrófagos nos animais AIRmax, o que explicaria a diferença na
susceptibilidade a patógenos intracelulares, já que estas linhagens não são selecionadas
para resposta imune adaptativa (ARAÚJO et al., 1998). Observamos, em nossos
resultados diferenças na produção de espécies reativos do oxigênio e do hidrogênio e
em relação à secreção de citocinas pro-inflamatórias.
Estudos prévios demonstraram que camundongos AIRmax são mais
resistentes no desenvolvimento de vários tumores em relação aos animais AIRmin,
incluindo metástase espontânea de melanoma murino. A atividade citotóxica da célula
natural killer (NK) envolvida na imunovigilância contra desenvolvimento de tumores
demonstrou-se maior em animais da linhagem AIRmax em relação aos animais
AIRmin. Estes achados foram associados com a habilidade das células do baço de
animais AIRmax em produzir in vitro maiores níveis de TNF-α, IL-12p40 e IFN-γ, mas
não da citocina anti-inflamatória IL-10 (KANENO et al., 2006).
Vigar e colaboradores (2000), observaram que animais AIRmax com artrite
induzida por pristane produziam maiores níveis de TNF-α do que camundongos
AIRmin. Como também animais da linhagem AIRmax tratados intraperitonialmente
com veneno da cobra Bothops jararaca secretam mais TNF-α e IFN-γ comparados
com camundongos AIRmin (CARNEIRO et al., 2003). Em nosso modelo foi observada
uma maior expressão de TNF-α em macrófagos de animais AIRmax.
A descoberta da família de receptores semelhantes ao Toll (TLRs) iniciou-se
com a identificação do Toll, um receptor que é expresso em Drosophila e foi descrito
ser essencial para o estabelecimento da polaridade dorso-ventral durante a
embriogênese. Mais tarde descobriu-se que este receptor também tinha uma função
importante na imunidade inata dos insetos contra infecções fúngicas. Macrófagos
murinos expressam receptores TLR1 a 11, o que reflete a importância deste tipo celular
na iniciação de respostas inflamatórias. Estes receptores são responsáveis por diversas
respostas, dependendo do tipo celular onde eles são ativados. Em macrófagos, células
epiteliais e outros leucócitos, eles são importantes para a produção de citocinas pro-
inflamatórias e produtos anti-microbiais (HARGREAVES e MEDZHITOV, 2005).
A diferenciação e a ativação das células mielóides é regulada por sinais
recebidos através de receptores presentes na superfície celular e por receptores
intracelulares que reconhecem ligantes solúveis ou presentes nas superfícies celulares.
Estes receptores podem ser classificados em dois grandes grupos, um que reconhece
DISCUSSÃO
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eventos específicos, como os receptores TLRs, por exemplo, que sinalizam a presença
de patógenos microbiais e que determinam a natureza qualitativa da resposta. Existem,
também, receptores que recebem informações mais gerais e que determinam a natureza
quantitativa da resposta, modulando positivamente ou negativamente o primeiro grupo.
Entre este segundo grupo, encontra-se os receptores TREM (KLESNEY-TAIT et al.,
2006).
TREM1 é um receptor que ativa neutrófilos e monócitos/macrófagos, capaz
de amplificar a resposta iniciada via TLR contra desafios microbiais e potencializa a
secreção de quimiocinas e citocinas pro-inflamatórias em reposta à infecções
bacterianas ou fúngicas Este receptor, sinaliza através da proteína adaptadora DAP12.
(COLONNA e FACCHETTI, 2003).
DAP12 é uma proteína adaptadora para vários receptores da superfamília das
imunoglobulinas e da família lectina do tipo C, dependendo do receptor ao qual se liga,
esta pode ativar ou inibir a produção de citocinas mediadas por TLR (HARGREAVES
e MEDZHITOV, 2005).
Em adição, Bouchon e colaboradores (2000) referem-se ao LPS e outros
ligantes de TLR como reguladores positivos da expressão de TREM1. Assim, acredita-
se que TREM1 e TLR cooperam entre si para produção de uma alta resposta
inflamatória.
Estes achados corroboram nossos resultados, nas quais, macrófagos da
linhagem AIRmax demonstraram regulação positiva da expressão gênica de Trem1 na
presença do ligante de TLR, o LPS. É interessante notar que macrófagos residentes das
duas linhagens apresentam expressão de Trem1 e Dap12 bastante semelhantes, e que,
na condição de 24 horas, após a estimulação via TLRs os macrófagos residentes e
induzidos de animais AIRmax mostraram aumentar significativamente a expressão
destas moléculas enquanto que os AIRmin, diminuir. Isso ajuda a explicar porque os
macrófagos dos animais AIRmax apresentaram uma maior expressão de citocinas pró-
inflamatórias quando comparados aos dos AIRmin.
Dados recentes e não publicados de nosso Laboratório também mostraram
através da técnica de microarray uma diferença na expressão de Trem1 entre as
linhagens AIRmax e AIRmin, sendo a expressão aumentada nas células de medula
óssea dos animais AIRmax controle, estimulados com biogel (24 horas) ou TPA (30
dias).
DISCUSSÃO
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___________________________________________________________________ 64
Outro receptor da famíla do TREM é o TREM2, que apresenta funções
antagônicas ao TREM1. Macrófagos derivados da medula óssea de camundongos
deficientes em TREM2 produzem mais citocinas pró-inflamatórias, TNF e IL-6 em
resposta aos agonistas de TLRs, LPS, zimosan e CpG, demonstrando que TREM2 inibe
a resposta de macrófagos à sinalização via TLRs (KLESNEY-TAIT et al., 2006).
Sabe-se que expressão de Trem2 é rapidamente regulada negativamente em
resposta à ativação induzida por LPS ou IFN-γ, não sendo verificada expressão deste
receptor em modelos utilizando produtos microbianos (COLONNA, 2003). Em nossos
resultados, apesar dos macrófagos injetados in vivo com tioglicolato provenientes de
ambas as linhagens apresentarem uma repressão gênica muito semelhante deste
receptor, foi observada uma diminuição estatisticamente diferente da expressão gênica
após estímulo com LPS com 6 horas em macrófagos residentes de animais AIRmin,
enquanto que esta redução não ocorre em AIRmax.
Ainda, Trem2 não é expresso em macrófagos peritoneais residentes, e sim em
células recrutadas para o peritônio por tioglicolato, e esta fração de Trem2 positiva
tende a aumentar com o tempo após a injeção de tioglicolato, principalmente após 4
dias (HAMERMAN et al., 2005; KLESNEY-TAIT et al., 2006). Em nossos resultados
só foi possível detectar a expressão de Trem2 com 24 horas de cultura em macrófagos
induzidos por tioglicolato na linhagem AIRmax.
Sabe-se que a progressiva divergência fenotípica entre as linhagens AIRmax e
AIRmin durante as sucessivas gerações ocorreu devido à acumulação de alelos dotados
de efeitos aditivos e opostos na resposta inflamatória. A análise do processo seletivo
indicou o envolvimento de no mínimo 11 QTL (quantitative trait loci) na regulação da
resposta inflamatória (BIOZZI et al., 1998). Em experimentos que estão sendo
realizados em nosso laboratório que analisam o desequilíbrio de ligação de SNPs nas
linhagens AIRmax e AIRmin, observamos que os genes da família Trem, que estão
presentes no cromossomo 17, estão em uma região onde os marcadores segregaram
diferentemente em AIRmax e AIRmin.
Enfatizando que os macrófagos são capazes de secretar diferentes citocinas
em resposta a estimulação por LPS dependendo das linhagens as quais são obtidas, e a
diferença encontrada quanto à moléculas reguladoras da transcrição de sinais via TLR,
verificamos se macrófagos da linhagem AIRmax ou AIRmin diferiam em outras
atividades fenotípicas, como a fagocitose.
DISCUSSÃO
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___________________________________________________________________ 65
Os macrófagos peritoneais induzidos por tioglicolato, em ambas as linhagens,
mostraram-se mais eficientes quanto à fagocitose de partículas de zimosan do que os
macrófagos residentes. Assim, nossos dados indicam que não existe diferença entre
linhagens AIRmax e AIRmin quanto à atividade de fagocitose de partículas de zimosan.
A fagocitose, tendo como alvo partículas de zimosan, por macrófagos é um processo de
duas etapas, iniciando pelo reconhecimento e ligação, seguido da internalização
(SAMBRANO et al., 1997).
Pudemos verificar que a morfologia dos macrófagos diferiu de acordo com o
estímulo in vivo utilizado, nas quais, macrófagos induzidos por tioglicolato
apresentaram um formato de células redondas e fibroblastóides, enquanto que
macrófagos residentes do peritônio das linhagens AIRmax e AIRmin, permaneceu o
predomino de células arredondadas.
Analisando os resultados em conjunto, nós demonstramos que a porcentagem
de células F4/80
+
aumentou significativamente após a injeção de tioglicolato em ambas
as linhagens, e que estes macrófagos eram células mais ativadas, já que possuíam uma
capacidade fagocítica aumentada, produziam maiores quantidades de NO e H
2
O
2
em
relação aos macrófagos residentes, além de
altas quantidades de citocinas.
Foram
também observadas a existência de algumas diferenças interlinhagens, como a maior
resposta de macrófagos da linhagem AIRmax frente ao estímulo de LPS em relação à
produção de citocinas inflamatórias, expressão moléculas reguladoras de sinalização
intracelular de TLR, síntese de NO e também quanto à secreção de H
2
O
2
.
Por fim, acreditamos que apesar de as linhagens AIRmax e AIRmin serem
selecionadas geneticamente para os fenótipos de infiltrado celular, preferencialmente
neutrófilos, e extravasamento proteico frente ao estímulo de Biogel por 24 horas, esta
seleção genética pode estar influenciando em algumas funções das células macrofágicas
do exsudato peritonial, e assim, contribuindo para a polarização entre as linhagens
AIRmax e AIRmin em relação a diferentes fenótipos. Sendo os animais AIRmax mais
resistentes à infecção por Salmonella typhimurium, à carcinogênse de pele e pulmão,
mais sensíveis na carcinogênese de cólon, ao choque endotóxico por LPS, artrite
experimental, como também maior regeneração tecidual
do que os animais da linhagem
AIRmin.
As diferenças fenótipicas encontradas entre os macrófagos das linhagens
poderão ser utilizadas como fenótipos parciais, em especial a diferente produção de IL-
1β, que é um mediador central da resposta inflamatória, para a identificação de genes
DISCUSSÃO
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___________________________________________________________________ 66
candidatos envolvidos na regulação da AIR que estão sendo mapeados nestas duas
linhagens.
CONCLUSÃO
______________________________________________________________________
___________________________________________________________________ 67
6 CONCLUSÕES
Tomados em conjunto nossos resultados permitem concluir que:
• Os animais previamente injetados com tioglicolato apresentam um maior
infiltrado celular na cavidade peritonial em relação aos animais sem o estímulo.
• Nas primeiras 6 horas do estímulo, o tioglicolato induz a migração preferencial
de neutrófilos, e após este período, se torna um potente indutor para a entrada de
macrófagos, preferencialmente após 96 horas, em ambas as linhagens.
• Na linhagem AIRmax, macrófagos induzidos por tioglicolato
e
ativados por
LPS, secretam maiores níveis de NO. Enquanto que macrófagos de animais
AIRmin são responsivos a sinalização induzida por IFN-γ e LPS.
• Na linhagem AIRmax, leucócitos peritoneais induzidos por tioglicolato
sintetizam maiores quantidades de H
2
O
2.
• Na linhagem AIRmax, macrófagos peritoneais expressam maiores quantidades
de citocinas pró-inflamatórias TNF-α, IL-6, IL-12 e IL-1β.
• Na linhagem AIRmin, macrófagos peritoneais residentes sintetizam maiores
quantidades de citocinas TGF-β e IL-10, enquanto que, após o estímulo de
tioglicolato, os macrófagos peritoneais obtidos da linhagem AIRmax é que
produzem mais e expressam maiores níveis de genes de citocinas anti-
inflamatórias.
• Em ambas as linhagens, macrófagos peritoneais residentes apresentam uma
expressão gênica muito semelhante do receptor pro-inflamatório TREM1 e sua
proteína adaptadora DAP12.
• Macrófagos da linhagem AIRmax demonstram uma regulação positiva da
expressão gênica de DAP12 e TREM1 na presença de LPS, enquanto que o
oposto foi verificado para os animais AIRmin.
• Ambas as linhagens apresentam uma repressão gênica de TREM2 em
macrófagos induzidos por tioglicolato e uma diminuição da expressão do
receptor anti-inflamatório em macrófagos residentes da linhagem AIRmin
quando ativados por LPS.
•
Os macrófagos peritoneais induzidos por tioglicolato são mais eficientes quanto
à fagocitose de partículas de zimosan do que os macrófagos residentes, porém
não foram observadas diferenças entre as linhagens
.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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