( PDF ) Filogeografia e estrutura genética de populações da mungubeira (pseudobombax munguba (mart. & zucc.) dugand, malvaceae

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INSTITUTO NACIONAL DE PESQUISAS DA AMAZÔNIA

UNIVERSIDADE FEDERAL DO AMAZONAS

Programa Integrado de Pós Graduação em Biologia Tropical e Recursos Naturais

FILOGEOGRAFIA E ESTRUTURA GENÉTICA DE

POPULAÇÕES DA MUNGUBEIRA (PSEUDOBOMBAX

MUNGUBA (MART. & ZUCC.) DUGAND, MALVACEAE -

BOMBACOIDEAE) NA AMAZÔNIA BRASILEIRA

Tatiana de Almeida Menicucci

Manaus, Amazonas

Junho, 2007

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INSTITUTO NACIONAL DE PESQUISAS DA AMAZÔNIA

UNIVERSIDADE FEDERAL DO AMAZONAS

Programa Integrado de Pós Graduação em Biologia Tropical e Recursos Naturais

FILOGEOGRAFIA E ESTRUTURA GENÉTICA DE

POPULAÇÕES DA MUNGUBEIRA (PSEUDOBOMBAX

MUNGUBA (MART. & ZUCC.) DUGAND, MALVACEAE -

BOMBACOIDEAE) NA AMAZÔNIA BRASILEIRA

Tatiana de Almeida Menicucci

Orientadora: Dra. Maristerra R. Lemes

Co-Orientador: Dr. Rogério Gribel

Dissertação apresentada como parte dos

requisitos para obtenção do título de Mestre em

Genética, Conservação e Biologia Evolutiva.

Manaus, Amazonas

Junho, 2007

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iii

FICHA CATALOGRÁFICA

G545 Menicucci, Tatiana de Almeida

Filogeografia e estrutura genética de populações da Mungubeira

(Pseudobombax Munguba (Mart. & Zucc.) Dugand, Malvaceae –

Bombacoideae / Tatiana de Almeida Menicucci.

Manaus : INPA/UFAM,

2007.

xiv, 67 f. : il. (algumas color.)

Dissertação de Mestrado -- INPA/UFAM, 2007.

Orientador: Dra. Maristerra R. Lemes.

Co-orientador: Dr. Rogério Gribel

1. Filogeografia -Amazônia 2. Genética de populações 3. Munguba

CDD 19ª ed. 575.01

Sinopse:

Estudou-se a filogeografia e a estrutura genética de populações de P.

munguba na Amazônia brasileira, utilizando marcadores microssatélites e

de seqüências não codificadoras do genoma de cloroplasto. Os dados

gerados permitiram correlacionar as hipóteses biogeográficas da Amazônia

e corroboram a hipótese do Lago Amazônico como determinante na

estruturação genética atual das populações de árvores da várzea na

Amazônia brasileira

Palavras-chave:

Filogeografia, genética de populações, munguba, Amazônia,

microssatélites, cpDNA.

Dedico esta dissertação a meus pais Nélio e

Teresa e meus irmãos Nélio, Renata e Marcelo. A

família da qual tenho a sorte de fazer parte.

AGRADECIMENTOS

À minha mãe, Teresa e meus irmãos Nélio, Renata e Marcelo pelo apoio e carinho não

só nessa, mas em todas as fases da minha vida.

À FAPEAM e ao CNPq, pela bolsa de estudos, ao INPA, ao GCBEV que tornaram

possível a concretização desse trabalho. E em especial ao Laboratório de Genética e Biologia

Reprodutiva de Plantas - LABGEN que de fato possibilitou a realização do trabalho por meio

de projetos financiados aprovados pelos Drs. Maristerra Lemes e Rogério Gribel.

À Dra. Maristerra Lemes e Dr. Rogério Gribel pela orientação, apoio e convivência

durante esses dois anos.

Às outras famílias que tive a sorte de pertencer: Paulinho, Wilde, Luciano, Geise

Adília, Joana, Simão, Carla e Paula. Morar com vocês foi uma experiência única.

Aos amigos do LABGEN: Mahatma, Thieme, Grabiela, Izabela, Joicy, Rafael

Angrizani, Rafael Arruda, Carolina, Raquel, Alessandra e Vanessa por suportar minhas

brincadeiras e palhaçadas e pela ajuda nos momentos em que foi preciso.

Á turma do GCBEV: Aline, Alexandre, Áureo (e Stella), Carlos, Eduardo, Fátima,

Luciano, Raimundo e Walfran. Ter compartilhado esse tempo com vocês foi uma das

melhores partes dessa experiência.

Aos amigos de BH, Marmotas e agregados: Ricardo, Éwerton, Marcelo, Henrique,

Fernando, Léo, Rodrigo, Flávia, Éder, Danny, Rei e tantos outros que se num citei, saibam

que mesmo longe, sempre serão lembrados. Os momentos com vocês foram inesquecíveis.

À fir€™: Lossea, Derahel, Norman, Tota, Tiago, Felipe, Bruno, Monge, Bart, Semi,

Maya, Beto, Apolo, Nikita, Thiago, Marcelo, Flecha, Maguchi e Angel. Vocês se tornaram

minha terceira família, na qual tive apoio e companhia diários, essenciais para a conclusão

dessa fase.

A todos os professores que me permitiram chegar até aqui, especialmente a Dra.

Mônica Buchiarelli e o Dr. Rodrigo Redondo que me ensinaram a gostar de genética e

biologia evolutiva, os maiores responsáveis por minha escolha.

A todos os amigos que deixei de mencionar peço desculpas, todos foram muito

importantes para mim.

E finalmente ao meu pai, Nélio Menicucci. Infelizmente você nunca lerá esse trabalho,

mas tenho certeza que esteve comigo em todos os momentos.

Muito obrigada por tudo!

"Ella está en el horizonte, dice Fernando Birri. Me

acerco dos pasos, ella se aleja dos pasos.

Caminamos diez pasos y el horizonte se corre diez

pasos más allá. Por mucho que yo camine, nunca

la alcanzaré. Para qué sirve la utopía? Para eso

sirve, para caminar."

Eduardo Galeano

vii

RESUMO

A estrutura atual das populações de espécies de plantas não só reflete padrões atuais de

trocas genéticas dentro e entre populações, mas também a história de fluxo gênico, isolamento

entre linhagens e permanência de polimorfismos ancestrais. A filogeografia é um campo de

estudo interessado em reconstruir a história das espécies visando determinar suas origens e

respostas a alterações climáticas e outras perturbações ambientais ocorridas no passado que

possam ter influenciado suas distribuições geográficas. Várias hipóteses biogeográficas têm

sido levantadas para tentar explicar as origens da alta biodiversidade encontrada na

Amazônia. No presente estudo são apresentados os padrões de distribuição da variabilidade

genética e a filogeografia da mungubeira, Pseudobombax munguba (Mart. & Zucc.) Dugand

na Amazônia brasileira, uma espécie arbórea da família Malvaceae que ocorre exclusivamente

ao longo das várzeas amazônicas. Para as análises genéticas foram amostrados 162 indivíduos

de P. munguba pertencentes a 11 populações distribuídas na Amazônia brasileira, utilizando

oito locos microssatélites do genoma de cloroplasto e 35 indivíduos, pertencentes a 9

populações, utilizando seqüências de DNA da região não codificadora do genoma de

cloroplasto trnS/trnG. Na análise dos marcadores microssatélites foram observados 2 a 5

alelos por loco e um total de 35 haplótipos considerando os oito locos analisados em

conjunto. Três populações (Beruri, Catalão e Caxiuanã), situadas no trecho médio e baixo da

calha central do rio Solimões/Amazonas mostraram-se monomórficas. Os índices de

diversidade genética de Nei variaram entre 0,0 e 0,433. A diversidade genética média total foi

de 0,240 para todas as populações analisadas conjuntamente e de 0,301 quando apenas as

populações polimórficas foram consideradas. Uma análise de variância molecular (AMOVA)

utilizando todas as populações mostrou que a maior parte da variação genética encontrada

pode ser explicada pela variação contida dentro das populações (59%), excluindo as

populações monomórficas esse valor subiu para 66%. A análise utilizando o teste de Mantel,

que correlaciona as distâncias genéticas e as distâncias geográficas entre as populações,

analisadas par a par, indicou que não há isolamento por distância entre as populações de P.

munguba na Amazônia brasileira. As seqüências da região não codificadora do genoma de

cloroplasto trnS/trnG apresentaram 10 substituições nucleotídicas e somente três haplótipos

foram identificados para o conjunto de populações de P. munguba analisado. Um desses

haplótipos foi o mais freqüente (88,6%) e amplamente distribuído na Amazônia brasileira e os

outros dois restritos às populações de Cruzeiro do Sul - AC e Caracaraí - RR. Os resultados

obtidos sugerem um fluxo gênico materno bastante restrito entre as populações de P.

viii

munguba na Amazônia brasileira. A pouca variação encontrada tanto nos marcadores

microssatélites quanto nas seqüências do genoma de cloroplasto indicam que a história de

colonização de P. munguba na Amazônia brasileira é recente e que a colonização da calha

central dos rios Solimões e Amazonas é resultado de efeito fundador a partir de um único

haplótipo. Em contraste, a alta variação encontrada nas populações localizadas nas áreas mais

elevadas em relação ao nível do mar sugere que essas populações de P. munguba são as mais

antigas na Amazônia brasileira. Os resultados obtidos com marcadores microssatélites e

seqüências do genoma de cloroplasto de P. munguba sugerem que variações no nível do mar,

ocorridas no final do Plioceno e início do Pleistoceno, afetaram fortemente o padrão de

distribuição da diversidade haplotípica da espécie. Os resultados corroboram a hipótese

biogeográfica do Lago Amazônico como determinante na estruturação genética das

populações de árvores da várzea na Amazônia brasileira.

ABSTRACT

The current structure of plant populations reflects not only the present patterns of

genetic exchange within and between populations, but also historical gene flow, lineage

isolation, and maintenance of ancestral polymorphisms. Phylogeography is a field study

interested in the reconstruction of history of species to understand their origins and responses

to climatic and other environmental changes in the past that may have influenced their

geographical distributions. Several biogeographical hypotheses have been raised to explain

the origins of the high biodiversity found in the Amazon. The present study examined the

distribution patterns of the genetic variability and the phylogeography of Pseudombobax

munguba (Mart. & Zucc.) Dugand, a tree species of the Malvaceae family that occurs

exclusively in the Amazonian seasonally flooded forests. For the genetic analyses, 162

individuals from 11 populations of P. munguba distributed in the Brazilian Amazon were

sampled using eight microsatellite loci of the cloroplast genome, and 35 individuals belonging

to nine populations of P. munguba were analysed based on variation of DNA sequences of the

non-coding region trnS/trnG of the chloroplast genome. The microsatellite analysis found two

to five alleles per locus and a total of 35 haplotypes over all eight loci. Three populations

(Beruri, Catalão e Caxiuanã), located in the Middle and Lower Amazon river, showed no

polymorhisms at all. The Nei genetic diversity indexes varied from 0.0 to 0.433. The mean

genetic diversity was 0.240 for all populations analysed together and 0.301 considering only

the polymorphic populations. An analysis of molecular variance (AMOVA) over all

populations showed that the majority of the genetic variation was found within populations

(59%). If only polymorphic populations have been considered, this value was 66%. The

Mantel test, which correlates genetic and geographical distances between pairs of populations,

indicated no isolation by distance between P. munguba populations in the Brazilian Amazon.

The trnS/trnG non-coding sequences of the cpDNA contained 10 nucleotide substitutions and

three haplotypes were identified in the nine populations of P. munguba. One haplotype was

the most frequent (88.6%) and widely distributed in the Brazilian Amazon. The other two

were restricted to the Cruzeiro do Sul – AC and Caracaraí – RR populations. The results

suggest very restricted maternal gene flow among the P. munguba populations. The low

variation found in the microstellites and DNA sequences of the chloroplast genome indicates

a recent history of colonization of P. munguba in the Brazilian Amazon and that the

colonization in the Central and Lower course of the Amazon river represents a founder effect

from a single haplotype. In contrast, the high variation found in the populations located at

more elevated areas above sea level suggests that these P. munguba populations are the most

ancient ones in the Brazilian Amazon. The data from both microssatelites and DNA

sequences from the chloroplast genome of P. munguba suggest that variations in sea level

probably occurring in the late Pliocen and early Pleistocen strongly affected the patterns of

distribution of the haplotypic diversity in this species. The results corroborate the Amazonian

Lake biogeographical hypothesis as a determinant of the genetic structuring of populations in

tree species of the seasonally flooded forests in the region.

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Localização das populações e número de indivíduos amostrados de P. munguba na

Amazônia Brasileira.................................................................................................... 19

Tabela 2 - Características dos oito locos microssatélites do genoma de cloroplasto

amplificados para P. munguba.................................................................................... 26

Tabela 3 - Haplótipos observados com base na análise de oito locos microssatélites do

genoma de cloroplasto, em 11 populações de P. munguba.......................................... 29

Tabela 4 - Índices de diversidade genética, estimados para as populações de P. munguba com

base na análise de oito locos microssatélites do genoma de

cloroplasto.................................................................................................................... 31

Tabela 5 - Análise de Variância Molecular (AMOVA) com base na análise de oito locos

microssatélites do genoma de cloroplasto de P. munguba considerando onze

populações amostradas................................................................................................. 31

Tabela 6 - Análise de Variância Molecular (AMOVA) com base na análise de oito locos

microssatélites do genoma de cloroplasto de P. munguba considerando somente as

populações polimórficas............................................................................................... 32

Tabela 7 - Matriz de correlação entre distâncias genéticas de Reynolds (abaixo da diagonal) e

distâncias geográficas euclidianas (acima da diagonal, em Km) entre as populações de

P. munguba, analisadas par a par.................................................................................. 32

Tabela 8 - Características dos marcadores utilizados que amplificam regiões não-

codificadoras do genoma do cloroplasto de P. munguba............................................. 36

xii

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Indivíduos adultos de P. munguba......................................................................... 14

Figura 2 - Flor, frutos, sementes e dispersão de P. munguba................................................ 15

Figura 3 - Locais de Coleta de P. munguba............................................................................ 20

Figura 4 - Quantificação do DNA genômico total extraído de amostras de P. munguba....... 25

Figura 5 - Fragmentos amplificados a partir da análise de oito locos microssatélites do

genoma do cloroplasto de P.munguba.......................................................................... 27

Figura 6 - Eletroferogramas mostrando alelos de oito locos microssatélites do cpDNA

amplificados para diferentes indivíduos de P. munguba.............................................. 28

Figura 7 - Freqüência de haplótipos observados na análise de oito locos microssatélites do

genoma de cloroplasto de P. munguba......................................................................... 30

Figura 8 - Relação entre distância genética de Reynolds e distância geográfica (Km) para 11

populações P. munguba, analisadas par a par, com base na variação observada em oito

locos microssatélites do genoma de cloroplasto........................................................... 33

Figura 9 - Relações entre haplótipos a partir de análise de rede (Network), com base na

variação de oito locos microssatélites do genoma do cloroplasto de P. munguba. Cada

círculo se refere a um haplótipo................................................................................... 34

Figura 10 - Amplificação de regiões não codificadoras do cpDNA de P.

munguba....................................................................................................................... 37

Figura 11 - Eletroferogramas mostrando produtos do seqüenciamento de dois indivíduos de

P. munguba para a região trnS/trnG............................................................................ 38

Figura 12 - Alinhamento de seqüências de DNA da região trnS/trnG do genoma do

cloroplasto de P. munguba.......................................................................................... 39

Figura 13 - Relações entre os haplótipos obtidos a partir da análise das seqüências do

espaçador intergênico trnS/trnG do genoma do cloroplasto de P.

munguba....................................................................................................................... 40

Figura 14 - Mapa mostrando a formação do lago amazônico, com base na simulação do

alagamento da bacia amazônica, utilizando a topografia atual em função da elevação

do nível dos oceanos na cota de 120m.......................................................................... 48

xiii

SUMÁRIO

FICHA CATALOGRÁFICA ...............................................................................................III

DEDICATÓRIA.................................................................................................................... IV

AGRADECIMENTOS............................................................................................................V

RESUMO...............................................................................................................................VII

ABSTRACT ........................................................................................................................... IX

LISTA DE TABELAS........................................................................................................... XI

LISTA DE FIGURAS...........................................................................................................XII

SUMÁRIO........................................................................................................................... XIII

I. INTRODUÇÃO.....................................................................................................................1

I.1.

ESTRUTURA GENÉTICA DE POPULAÇÕES DE PLANTAS..................................................2

I.2.

FILOGEOGRAFIA..............................................................................................................3

I.3.

HIPÓTESES BIOGEOGRÁFICAS - AMAZÔNIA...................................................................6

I.4.

MARCADORES MOLECULARES........................................................................................8

I.5.

CLASSIFICAÇÃO DO GÊNERO PSEUDOBOMBAX............................................................11

I.6.

MORFOLOGIA, BIOLOGIA E DISTRIBUIÇÃO DE PSEUDOBOMBAX MUNGUBA................12

I.7.

PSEUDOBOMBAX MUNGUBA E A VÁRZEA......................................................................16

8. JUSTIFICATIVA..............................................................................................................17

II. OBJETIVOS......................................................................................................................18

III. MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................................19

III.1.

MATERIAL BIOLÓGICO E LOCAIS DE COLETA..........................................................19

III.2.

EXTRAÇÃO, QUANTIFICAÇÃO E DILUIÇÃO DO DNA.................................................20

III.3.

AMPLIFICAÇÃO E ANÁLISE DOS LOCOS MICROSSATELITES DO GENOMA DO

CLOROPLASTO (CPDNA).....................................................................................................21

III.4.

AMPLIFICAÇÃO DAS REGIÕES NÃO CODIFICADORAS DO CPDNA............................21

III.5.

SEQÜENCIAMENTO E ANÁLISE DOS PRODUTOS AMPLIFICADOS...............................22

III.6.

ANÁLISE DOS DADOS ..................................................................................................23

VI. RESULTADOS.................................................................................................................25

IV.1. EXTRAÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DO DNA ...................................................................25

IV.2.

AMPLIFICAÇÃO, GENOTIPAGEM E ANÁLISE DOS LOCOS MICROSSATÉLITES DO

GENOMA DO CLOROPLASTO (CPDNA) ...............................................................................25

IV.3.

AMPLIFICAÇÃO, SEQÜENCIAMENTO E ANÁLISE DAS REGIÕES NÃO CODIFICADORAS

DO CP

DNA............................................................................................................................36

V. DISCUSSÃO ......................................................................................................................41

VI. CONCLUSÃO..................................................................................................................52

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................................54

I. INTRODUÇÃO

A estruturação genética de populações de plantas é fortemente influenciada por

padrões de trocas genéticas dentro e entre populações. Variações em fatores relacionados à

reprodução das espécies e à história de vida podem afetar profundamente a natureza dos

padrões de trocas genéticas e, conseqüentemente, a estrutura genética das populações

(Schaal et al., 1998; Gribel, 2003). Muitas espécies atuais que possuem distribuição

contínua podem ter experimentado altos níveis de fragmentação populacional no passado

como conseqüência de alterações climáticas e outras perturbações ambientais (Haffer,

1969; Prance, 1982; Schaal et al., 1998; Hewitt, 2000, 2004; Dynesius & Jansson, 2000;

Cavers et al., 2003).

A filogeografia é um campo de estudo interessado nos princípios e processos que

governam a distribuição geográfica das linhagens genealógicas, especialmente aquelas

intimamente relacionadas, reconhecendo subdivisões de populações ao longo da

distribuição da espécie (Avise, 1998, 2000). Existe atualmente considerável interesse em

reconstruir a história dessas espécies visando determinar suas origens e suas respostas a

essas alterações (Schaal et al., 1998; Hewitt, 2000, 2004; Cavers et al., 2003; Dutech et al.,

2003).

Tentando explicar as origens da alta biodiversidade encontrada na Amazônia, foram

formuladas várias hipóteses: Rios como Barreiras (Wallace, 1849; Capparella, 1988; Ayres

& Clutton-Brock, 1992; Haffer, 1992; Patton et al., 1994); a Teoria dos Refúgios (Haffer,

1969; Vanzolini & Williams, 1970; Cerqueira, 1982; Prance, 1982); Centros de Origem e

Dispersão (Hershkovitz, 1977; Reig, 1984); Gradientes Ecológicos (Endler, 1977, 1982;

Patton et al., 1994); Vicariância Geotectônica (Platnick & Nelson, 1978; Cracraft & Prum,

1988; Futuyma, 1992; Amorim & Pires, 1996); Lago Amazônico (Klammer, 1984); e

Dinâmica dos Rios (Salo et al., 1986).

Ainda são poucos os estudos filogeográficos com espécies de plantas na Amazônia.

Olsen & Schaal (1999) e Olsen (2002) realizaram estudos com Manihot esculenta no norte

e centro-oeste do Brasil, encontrando uma estrutura filogeográfica que pode ser explicada

pelas alterações climáticas após a última grande glaciação. Dutech et al. (2003)

encontraram evidências de que os quatro refúgios sugeridos por Granville (1988) foram de

grande importância para a manutenção da diversidade de Vouacapoua americana na

Guiana Francesa. Segundo Dick et al. (2003), a distribuição dos haplótipos encontrados

nas populações de Symphonia globulifera coincide com as zonas biogeográficas propostas

por Whitmore & Prance (1987). Dick et al. (2007) encontraram em Ceiba pentandra a

estrutura filogeográfica mais fraca já reportada em espécies tropicais amplamente

distribuídas e descartam a ocorrência de eventos vicariantes na espécie.

No presente estudo são apresentados os padrões de distribuição da variabilidade

genética e a filogeografia da mungubeira, Pseudobombax munguba (Mart. & Zucc.)

Dugand na Amazônia brasileira, uma espécie arbórea da família Malvaceae que ocorre

exclusivamente ao longo das várzeas amazônicas.

I.1.

ESTRUTURA GENÉTICA DE POPULAÇÕES DE PLANTAS

Fatores que influenciam os padrões de trocas genéticas dentro e entre populações

afetam diretamente a estruturação genética das populações de plantas (Schaal et al., 1998;

Gribel, 2003). Um desses fatores é o sistema de cruzamento (Ritland, 1983; Murawski &

Hamrick, 1991), sendo possível encontrar desde casos em que ocorre fluxo gênico entre

populações de espécies divergentes (espécies do gênero Quercus, Ferris et al., 1993), até

plantas que se reproduzem exclusivamente por apomixia (Taraxacum officinale, Schaal et

al., 1998).

Outro fator importante é o mecanismo pelo qual os genes migram. O fluxo gênico

em plantas ocorre principalmente de duas formas: por meio de movimento de sementes ou

de pólen (Ennos, 1994; McCauley, 1994

). As plantas apresentam uma grande variedade de

mecanismos de polinização e dispersão, levando a padrões diversos de trocas genéticas que

são influenciados por variação espacial e temporal nos sistemas de cruzamento. Assim,

padrões de trocas genéticas em plantas resultam de uma complexa interação entre sistema

reprodutivo e padrões de dispersão (Hamrick, 1987; Hamrick & Godt, 1990; Schaal et al.,

1998).

Estudos têm mostrado que espécies de plantas tropicais mantêm uma grande

diversidade genética e que a maior parte da variação genética intraespecífica é encontrada

dentro das populações (Buckley et al., 1988; Powell et al., 1995; Aldrich et al., 1998;

Collevatti et al,. 2001; Lemes et al., 2003; Novick et al., 2003), embora Caicedo & Schaal

(2004) tenham encontrado altos níveis de variação tanto dentro quanto entre populações de

Solanum pimpinellifolium. Devido à dispersão somente via semente espera-se encontrar

uma diferenciação ainda maior entre as populações de plantas quando são utilizados

marcadores de herança materna (Ennos, 1994; Powell et al., 1995; Ennos et al., 1999; Lira

et al., 2003).

Modelos clássicos de genética de populações que descrevem a estruturação genética

de populações de plantas assumem que a atual estrutura genética reflete um equilíbrio entre

deriva genética e fluxo gênico (Wright, 1951). Contudo, a troca genética é restrita em

muitos grupos, tanto pela larga distribuição geográfica da espécie, quanto por limitada

dispersão de pólen e/ou sementes (Ehrlich & Raven, 1969). Nesses casos, eventos

históricos, como expansão, fragmentação e efeito gargalo, serão fortes fatores

determinantes da estrutura genética atual dessas populações (Schaal et al., 1998; Hewitt,

2000; Avise, 2000).

I.2.

FILOGEOGRAFIA

Métodos filogeográficos proporcionam os meios de se examinar padrões de

distribuição de variação genética, com o potencial de distinguir aqueles causados por fluxo

gênico atual entre as populações, daqueles derivados de eventos históricos. Extinção e

recolonização, efeito gargalo e efeito fundador são alguns dos tipos de eventos históricos

que deixam sinais genéticos nas gerações subseqüentes (Hewitt, 1996, Schaal et al., 1998;

Dutech et al., 2003).

Alterações climáticas ocorridas no passado (Bennet, 1997; Webb et al., 1997;

Williams et al., 1998; Hewitt, 2000), embora mais fracas nos trópicos que nas latitudes

temperadas (Dynesius & Jansson, 2000), teriam afetado não só a distribuição geográfica de

muitas espécies das florestas tropicais (Prance, 1982; Granville, 1988; Rull, 1998;

Pennington et al., 2000), mas também a distribuição da diversidade genética entre as

populações dessas espécies (Dutech et al., 2003). Existe atualmente considerável interesse

em reconstruir a história dessas espécies visando determinar suas origens e suas respostas a

essas alterações (Schaal et al., 1998; Hewitt, 2000, 2004; Cavers et al., 2003; Dutech et al.,

2003; Dick et al., 2003; Dick et al., 2007).

Alguns estudos filogeográficos com Pinus hartwegii (Matos & Schaal, 2000), com

Dioscorea bulbifera (Terauchi et al., 1991), com pinheiros (Hong et al., 1993) e com

Streptanthus glandulosus (Mayer & Soltis, 1994) mostraram que as populações dessas

espécies estão geneticamente isoladas há muito tempo. Em outros casos, pouca ou

nenhuma variação genética é encontrada, um padrão esperado quando ocorre rápida

expansão a partir de um refúgio, como observado em espécies de regiões temperadas

bastante afetadas pelos efeitos das glaciações, como observado em Fagus sylvatica

(Demesure et al., 1996) e em Heuchera (Soltis et al., 1997). Em Gliricidia (Lavin et al.,

1991) a larga distribuição de um único haplótipo ao longo da distribuição da espécie reflete

uma história de dispersão muito mais rápida, provavelmente realizada por humanos. A

distribuição geográfica da variação genética encontrada por Petit et al. (2002) indica uma

grande influência tanto de glaciações quanto de manejo humano, recente e no passado, nas

oito espécies do gênero Quercus estudadas.

Estudos filogeográficos com espécies de plantas na região neotropical não são

muitos se comparados às regiões temperadas. Olsen & Schaal (1999) e Olsen (2002)

realizaram estudos com Manihot esculenta no norte e centro-oeste do Brasil, encontrando

uma estrutura filogeográfica que pode ser explicada pelas alterações climáticas após a

última grande glaciação e sugerem um centro de domesticação da espécie no estado de

Rondônia.

Caron et al., (2000) encontraram um padrão de distribuição da diversidade genética

em Dicorynia guianensis que pôde ser relacionado a eventos históricos ocorridos durante o

Quaternário na Guiana, onde possivelmente houveram colonizações a partir de vários

refúgios diferentes.

Lira et al. (2003) mostraram que as populações de Caesalpinia echinata no sudeste

e nordeste do Brasil apresentam um padrão de isolamento devido à existência de refúgios

separados durante as glaciações e de uma forte ação de deriva genética no período pós-

glacial. Collevatti et al. (2003) também encontraram indícios da existência de refúgios

separados para Caryocar brasiliense no centro-oeste e sudeste do Brasil, entretanto,

alterações no padrão de dispersão das sementes tiveram um papel importante na

filogeografia dessa espécie.

Cavers et al. (2003) encontraram evidências de repetidas colonizações de Cedrela

odorata na América Central a partir de populações diferenciadas da América do Sul, após

a elevação do Istmo do Panamá.

Dick et al. (2003), em um estudo filogeográfico com populações de Symphonia

globulifera localizadas na América Central, Amazônia e África, atribuíram a expansão da

espécie entre continentes à dispersão marinha, a diferenciação regional encontrada,

principalmente na América Central, à heterogeneidade geográfica local e a ausência de

variação entre as populações localizadas na bacia Amazônica a uma expansão recente da

espécie na região ou a um extensivo fluxo gênico atual. Segundo Dick et al. (2003), a

distribuição dos haplótipos encontrados nas populações de Symphonia globulifera coincide

com as zonas biogeográficas propostas por Whitmore & Prance (1987). A existência de

três refúgios diferentes na América Central durante as glaciações e a heterogeneidade

geográfica da região após a última glaciação, aliadas a efetividade dos Andes como

barreira ao fluxo gênico explica a grande estruturação filogeográfica encontrada entre as

populações da América Central e oeste do Equador, em contraste com a ausência de

variação entre as populações da Amazônia e Guiana. Outras possibilidades seriam a

expansão recente da espécie na Amazônia e Guiana ou um extenso fluxo gênico

contemporâneo entre as populações dessa região.

Dutech et al. (2003) encontraram evidências de que os quatro refúgios sugeridos

por Granville (1988) foram de grande importância para a manutenção da diversidade de

Vouacapoua americana na Guiana Francesa, devido aos eventos de extinção e re-

colonização decorrentes das alterações climáticas durante o Pleistoceno e Holoceno.

González-Rodríguez et al. (2004) observaram no México que as espécies Quercus

affinis e Q. laurina não ficaram restritas a uma ou poucas sub-regiões durante o último

ciclo glacial. Os dados obtidos pelos autores indicam a persistência de um número

considerável de populações ao longo de vários episódios de alterações climáticas durante o

Quaternário, os quais experimentaram recorrentes migrações latitudinais e altitudinais.

Caicedo & Schaal (2004) sugerem que a diferenciação encontrada entre populações

de Solanum pimpinellifolium é mantida por fluxo gênico restrito e que a distribuição atual

da espécie é decorrente de uma gradual colonização ao longo da Costa do Pacífico a partir

de um centro de origem no Peru.

Cloutier et al., (2005), estudando o efeito da dispersão hidrocórica em Carapa

guianensis na bacia Amazônica, encontraram uma forte estrutura populacional regional e

discutem a influencia de algumas hipóteses biogeográficas na filogeografia da espécie.

Lorenz-Lemke et al. (2005) encontraram indícios no Rio Grande do Sul que

Passiflora elegans, além de ter passado recentemente por um efeito gargalo, teria se

originado de uma linhagem de P. actinia. A constituição genética de um híbrido natural,

originado após um contato secundário entre as duas espécies, sugere que a herança dos

plastídios nessas espécies é paterna. Os dados encontrados mostram que ambas as espécies

foram afetadas pelas alterações climáticas durante o Quaternário.

Miller & Schaal (2005) encontraram evidências de múltiplos eventos de

domesticação de Spondias purpurea a partir de linhagens selvagens da espécie na América

Central e que populações domesticadas são um importante reservatório de variação

genética da espécie.

Dick et al. (2007) encontraram tão pouca variação entre indivíduos de Ceiba

pentandra na América do Sul, América Central e África, que descartam a ocorrência de

eventos vicariantes (Gondwana, Boreo-tropical e Andina) na espécie, atribuindo sua ampla

expansão geográfica a eventos de dispersão a longas distâncias por vento ou correntes

marinhas.

I.3.

HIPÓTESES BIOGEOGRÁFICAS - AMAZÔNIA

O amplo debate sobre a influência de alterações climáticas e outras perturbações

ambientais nas florestas neotropicais, levou à formulação de algumas hipóteses para

explicar as origens da alta biodiversidade encontrada na Amazônia (Bush, 1994; Colinvaux

et al., 1996; Morroig & Cerqueira, 1997; Willis & Whittaker, 2000). Entre elas destacam-

se: rios como barreiras (Wallace, 1849; Sick, 1968; Capparella, 1988; Ayres & Clutton-

Brock, 1992; Haffer, 1992; Patton et al., 1994); a teoria dos refúgios (Haffer, 1969;

Vanzolini & Williams, 1970; Cerqueira, 1982; Prance, 1982); centros de origem e

dispersão (Hershkovitz, 1977; Reig, 1984); gradientes ecológicos (Endler, 1977, 1982;

Patton et al., 1994); vicariância geotectônica (Platnick & Nelson, 1978; Cracraft & Prum,

1988; Futuyma, 1992; Amorim & Pires, 1996); lago amazônico (Klammer, 1984); e

dinâmica dos rios (Salo et al., 1986).

Segundo a hipótese dos rios como barreiras, o desenvolvimento do extenso sistema

fluvial Amazônico, graças ao soerguimento dos Andes durante o Cenozóico, iniciou uma

série de eventos vicariantes devido à fragmentação na distribuição de espécies ancestrais

amplamente distribuídas previamente (Morroig & Cerqueira, 1997).

A teoria dos refúgios, ou vicariância ecológica postula que ciclos de alterações

climáticas durante o Terciário e o Pleistoceno, alternando entre períodos secos-frios e

úmido-quentes, associados respectivamente aos períodos glacial e inter-glacial, resultaram

em repetidos eventos de fragmentação em refúgios seguidos de expansão das florestas

tropicais, acontecendo o inverso com os tipos de vegetação aberta e sua fauna associada

(Haffer, 1969; Vanzolini & Williams, 1970).

A hipótese dos centros de origem e dispersão consiste na existência de áreas

biogeográficas estáveis, os centros de origem, a partir dos quais ocorre dispersão através da

transposição de uma barreira pré-existente, causando fragmentações simultaneamente

(Hershkovitz, 1977; Reig, 1984).

A hipótese dos gradientes ecológicos sugere que os padrões atuais de distribuição

são consistentes com a divergência geográfica e adaptações aos fatores eco-geográficos

atuais, independente dos fatos históricos (Morroig & Cerqueira, 1997). O isolamento por

distância permite adaptações genéticas a diferentes áreas, resultando em zonas uniformes

em freqüências genéticas ou fenotípicas separadas por clinas (Endler, 1982).

A vicariância geotectônica relaciona princípios cladistas e eventos geotectônicos da

Terra (Platnick & Nelson, 1978). Diferentemente da teoria dos refúgios, essa hipótese

enfatiza eventos mais antigos, do Terciário ou anteriores (Morroig & Cerqueira, 1997).

A hipótese da dinâmica dos rios sugere que a erosão lateral e alterações na calha

dos rios criam e destroem muitos habitats diferentes devido à própria erosão e deposição de

materiais nas planícies alagadas, influenciando a criação e manutenção de diversidade de

espécies na Amazônia (Salo et al., 1986).

A hipótese do lago amazônico sugere que as oscilações climáticas ocorridas durante

o Terciário e o Quaternário tiveram papéis globais, levando à elevação de até 180 m (“The

Great Fouaratian transgression” - Klammer, 1984) e redução de até 100-130 m (“Würmian

maximum” - Irion, 1984) do nível dos oceanos em relação ao nível atual. Essas alterações

teriam causado diferenças na inclinação dos leitos dos rios em relação à inclinação atual,

alterando a vazão e a força da erosão lateral dos rios. Com a elevação do nível dos

oceanos, as águas marítimas poderiam tanto avançar continente adentro quanto represar a

saída das águas fluviais, causando o extravasamento de muitos rios gerando um grande

lago na Amazônia (Klammer, 1984; Morroig & Cerqueira, 1997).

A história geológica, climática e biogeográfica da América do Sul é complexa e

muito dinâmica e talvez nenhum modelo consiga sozinho explicar a enorme diversidade

das espécies nesta região, mas a combinação de diferentes hipóteses pode ajudar a

esclarecer a história evolutiva e a distribuição das espécies amazônicas (Morroig &

Cerqueira, 1997).

I.4.

MARCADORES MOLECULARES

Devido ao status haplóide, a taxa reduzida de mutação e a falta de recombinação, os

genomas de organelas, mitocondrial (mtDNA) e de cloroplasto (cpDNA), apresentam uma

menor diversidade em suas seqüências gênicas se comparados ao genoma nuclear e são

mais afetados pela seleção por efeito carona. Devido aos baixos níveis de variação nas

seqüências, para se encontrar níveis úteis de variação intraespecífica deve-se procurar

regiões mais mutáveis, como regiões não codificadoras, mas ainda assim a taxa de mutação

é lenta para evidenciar eventos evolutivos muito recentes (Ennos et al., 1999).

Em animais, a maior parte dos estudos filogeográficos envolvem análises de DNA

mitocondrial primariamente ou exclusivamente (Avise, 1998). Entretanto, o mtDNA em

plantas apresenta uma taxa de substituição muito baixa que, combinada com as freqüentes

recombinações intramoleculares, reduzem sua utilidade como fonte de marcadores, sendo

utilizado mais freqüentemente o genoma do cloroplasto (Avise, 1998; Provan, 1999; Petit

& Vendramin, 2007).

Para uma abordagem filogenética, apenas os dados de substituição de bases e

inserções/deleções dentro de regiões não codificadoras do DNA de organelas e do genoma

nuclear são satisfatórios (Schaal et al., 1998). Isso porque a taxa de substituição de bases é

baixa o suficiente para que não ocorram homoplasias, e a taxa de geração de

inserções/deleções não é tão freqüente, o que impossibilitaria o alinhamento das seqüências

(Ennos et al., 1999). Em contraste, todos os outros marcadores (como diferenças em

números de repetições de genes no cloroplasto e regiões de seqüências simples repetidas)

geram homoplasias ou variantes cujas relações evolutivas não podem ser inferidas (Palmer,

1992; Demesure et al., 1996).

Esses fatores impõem limites no uso de marcadores do genoma do cloroplasto para

análises filogenéticas intra-especificas em plantas. Entretanto, por seu padrão de herança

uniparental, predominantemente materna em angiospermas (Harris & Ingram, 1991), e

modelos de evolução, essa molécula possui a capacidade de sinalizar eventos históricos

como migrações, dispersão de sementes e hibridização que não poderiam ser obtidos

apenas com marcadores nucleares (Ennos et al., 1999). Entretanto, a soma de dados

obtidos de vários marcadores, com padrões de herança e taxas evolutivas diferentes,

fornece informações mais completas e úteis na elucidação da historia evolutiva da espécie

estudada (Harris & Ingram, 1991; Schaal et al., 1998).

Entre os marcadores moleculares mais utilizados em estudos genéticos de plantas

estão as seqüências simples repetidas-SSR (Powell et al., 1995; Collevatti et al., 1999;

Lemes et al., 2002; Provan et al., 2001; Collevatti et al., 2001; Lemes et al., 2003;

Collevatti et al., 2003; Novick et al., 2003; Lira et al., 2003), o polimorfismo no

comprimento de fragmentos de restrição obtidos via reação em cadeia da polimerase PCR-

RFLP (El Mousadick & Petit, 1996; Soltis et al., 1997; King & Ferris, 1998; Dumolin-

Lapègue et al., 1997; Caron et al., 2000; Petit et al., 2002; Cavers et al., 2003; Dutech et

al., 2003; González-Rodrígues et al., 2004; Cottrell et al., 2005) e as seqüências de

nucleotídeos de segmentos da molécula de DNA nuclear e de cloroplasto (Oxelman et al.,

1997; Olsen & Schaal, 1999; Olsen, 2002; Collevatti et al., 2003; Hamilton et al., 2003;

Dick et al., 2003; Caicedo & Schaal, 2004; Miller & Schaal, 2005; Lorenz-Lemke et al.,

2005, Dick et al. 2007).

Os marcadores de DNA microssatélites, também conhecidos como Sequências

Simples Repetidas (SSR), são pequenas seqüências de 1 a 6 nucleotídeos repetidas em

tandem, muito freqüentes e distribuídas ao acaso por todo o genoma dos eucariotos (Tautz

& Renz, 1984; Litt & Luty, 1989). Normalmente apresentam locos altamente polimórficos,

com alta diversidade alélica, são co-dominantes, e de grande conteúdo informativo

(Morgante & Olivieri, 1993; Condit & Hubbell, 1991; Powell et al., 1995; Ferreira &

Grattapaglia, 1998). As seqüências flanqueadoras das regiões dos microssatélites são

conservadas entre espécies relacionadas, o que torna possível a transferência de

marcadores entre espécies ou mesmo entre gêneros usando pares de iniciadores

heterólogos (Ferreira & Grattapaglia, 1998). Por suas características, os microssatélites

apresentam um alto poder de discriminação individual, o que os torna uma poderosa

ferramenta em estudos sobre estrutura genética populacional, fluxo gênico e análise de

parentesco (Rafalski et al., 1996; Chase et al., 1996).

A descoberta de SSR polimórficas, no genoma de cloroplasto (cp-SSR) forneceu

uma ferramenta de alta resolução para utilização da molécula de cloroplasto em genética

de populações, contornando o problema dos baixos níveis de variabilidade encontrados

neste genoma (Ennos et al., 1999; Provan, 1999; 2001). Como o genoma de cloroplasto

apresenta herança materna na maioria das angiospermas, os microssatélites de cloroplasto

evidenciam o fluxo gênico que ocorre por meio de dispersão de sementes. Por ser haplóide,

o tamanho efetivo de população para o genoma do cloroplasto é metade do tamanho

efetivo para o genoma nuclear, assim, microssatélites de cloroplasto são bons indicadores

de eventos históricos como efeito gargalo, efeito fundador e deriva genética (Ennos et al.,

1999; Provan, 1999; 2001; Petit & Vendramin, 2007).

Polimorfismos no comprimento de fragmentos obtidos por quebra da fita de DNA

por enzimas de restrição (RFLPs) foram utilizados pela primeira vez para detecção de

mutações em vírus (Godzicker et al., 1974). Amplamente utilizada para acessar variação

na seqüência de nucleotídeos tanto de regiões codificadoras quanto não codificadoras, essa

técnica possui expressão co-dominante além de apresentar altos níveis de polimorfismo.

PCR-RFLP, ou CAPS (“Cleaved Amplified Polymorphic Sequences”) é uma técnica

desenvolvida a partir do RFLP e também consiste na obtenção de polimorfismos em

comprimentos de fragmentos de DNA por enzimas de restrição. Entretanto, os fragmentos

são obtidos pela digestão do produto previamente amplificado de um segmento de DNA de

interesse utilizando reação em cadeia da polimerase (Saiki et al., 1985). A utilização de

várias enzimas de restrição combinadas possibilita encontrar altos níveis de polimorfismos

(Ferreira & Grattapaglia, 1998). Essa tem sido, até o momento, a técnica mais comumente

utilizada em estudos filogeográficos com plantas, tanto em regiões temperadas quanto

tropicais (El Mousadik & Petit, 1996; Dumolin-Lapègue et al., 1997; Soltis et al., 1997;

King & Ferris, 1998; Petit et al., 2002; Cavers et al., 2003; Dutech et al., 2003; Gonzalez-

Rodriguez et al., 2004; Cottrell et al., 2005).

Outra forma de detectar variação útil para estudos genéticos é a busca de

polimorfismos diretamente nas seqüências de nucleotídeos em regiões específicas do DNA

(Ferreira & Grattapaglia, 1998). Locos distintos na mesma molécula apresentam modelos e

tempos de evolução diferentes, como os genomas nuclear e citoplasmático que, além disso,

apresentam tipos de herança diferentes. Esse fato permite a utilização de seqüências

específicas de DNA em vários tipos de estudos. Segmentos que apresentam uma taxa de

evolução lenta podem ser utilizados para reconstruir a relação filogenética de taxa

superiores. Uma taxa de evolução média é útil para inferir relações entre grupos mais

próximos. Para a resolução de questões evolutivas de grupos intimamente relacionados, ou

até questões populacionais intra-específicos, devem ser utilizados segmentos com uma alta

taxa de evolução (Schaal et al., 1998; Ennos et al., 1999; Provan, 1999, 2001).

Existem ainda poucos estudos utilizando seqüências de nucleotídeos para investigar

a filogeografia em plantas tropicais. Na maioria dos estudos realizados foram utilizadas

seqüências de regiões não codificadoras do genoma de cloroplasto, como em Caryocar

brasiliense (Collevatti et al., 2003), duas espécies do gênero Passiflora (Lorenz-Lemke et

al., 2005) e Spondias purpurea (Miller & Schaal, 2005). Destacam-se ainda os estudos

com Manihot esculenta (Olsen & Schaal, 1999; Olsen, 2002), Symphonia globulifera (Dick

et al., 2003), Solanum pimpinellifolium (Caicedo & Schaal, 2004) e Ceiba pentandra (Dick

et al. 2007) que além de sequências do DNA do cloroplasto, também investigaram

seqüências do genoma nuclear.

I.5.

CLASSIFICAÇÃO DO GÊNERO PSEUDOBOMBAX

A família Malvaceae sensu latu compreende as subfamílias Grewioideae,

Byttnerioideae, Sterculioideae, Tilioideae, Dombeyoideae, Brownlowioideae,

Helicteroideae, Malvoideae e Bombacoideae. Diversos estudos utilizando marcadores

moleculares têm confirmado que esse clado é monofilético (Alverson et al., 1998;

Alverson et al., 1999; Bayer et al., 1999; Baum et al., 2004). Análises de seqüências de

genes plastidiais realizadas por Alverson et al. (1999) e Bayer et al. (1999) mostraram que

as subfamílias Bombacoideae e Malvoideae são intimamente relacionadas, formando um

grupo monofilético, denominado Malvatheca (Baum et al., 1998). No entanto, a

composição e as relações, entre alguns taxa dentro desse grupo continuam incertas.

A subfamília Malvoideae possui uma distribuição basicamente subtropical e

temperada e consiste em cerca de 1700 espécies, constituindo a maior parte da diversidade

de espécies do grupo Malvatheca. Relativamente pequena, a subfamília Bombacoideae

contém menos de 250 espécies, sendo predominantemente composta de árvores tropicais

(Baum et al., 2004). Segundo Baum et al. (2004), ambas subfamílias teriam se originado

na América do Sul e a grande diferença em número de espécies entre as duas subfamílias

seria resultado de uma radiação das Malvoideae nas regiões subtropical e temperada, a

partir de uma fonte tropical menos diversa.

A subfamília Bombacoideae compreende a maioria dos gêneros que faziam parte da

antiga família Bombacaceae, menos Durioneae e acrescida de Fremontodendrae (Bayer et

al., 1999), e é um dos poucos grupos de Angiospermas em que a polinização por

vertebrados, principalmente por morcegos, prevalece sobre a polinização por insetos

(Gribel, 1988; 1995).

Pseudobombax é um gênero exclusivamente neotropical, com 20 espécies de

árvores e arbustos, que ocorre do norte da Argentina, Paraguai e Brasil à América Central

(Robyns, 1963; Aubréville, 1975). As espécies de Pseudobombax são geralmente

especializadas em colonizar habitats abertos com algum tipo de restrição no solo para

outras espécies arbóreas, como longos períodos de alagamento (Gribel, 1995).

I.6.

MORFOLOGIA, BIOLOGIA E DISTRIBUIÇÃO DE PSEUDOBOMBAX MUNGUBA

Pseudobombax munguba (Mart. & Zucc.) Dugand é uma espécie arbórea que pode

atingir até 40 metros de altura, é decídua e renova sua folhagem durante o período entre o

surgimento das flores e a maturação dos frutos, aproximadamente de junho a setembro

(Gribel, 1995). Na maioria das espécies do gênero Pseudobombax as flores apresentam

estrutura robusta, tamanho grande e centenas de estames formando um tufo semi-esférico

ou em forma de pincel (Robyns 1963; Gribel, 1988). Em P. munguba as flores são

solitárias, inclinadas, grandes (corola com 10-14 cm de diâmetro) e totalmente brancas,

incluindo anteras e pólen. As flores de P. munguba são polinizadas por uma única espécie

de morcego, Phyllostomus hastatus (Phyllostomidae), um dos maiores morcegos da região

neotropical (Gribel & Gibbs, 2002). Esses morcegos possuem uma grande área de

forrageio, chegando a cobrir distâncias de 10-20 km por dia (Williams & Williams, 1970).

Diferente de todas as outras espécies quiropterófilas, as flores de P. munguba não

produzem néctar (Gribel, 1995).

Estudos sobre o sistema reprodutivo forneceram evidências de altos níveis de

fecundação cruzada em árvores tropicais (O’Malley & Bawa, 1987; O’Malley et al., 1988;

Hamrick & Loveless, 1989; Murawski et al. 1990; Murawski & Hamrick 1991, 1992;

Alvarez-Buylla & Garay, 1994; Hall et al., 1994; Boshier et al., 1995; Alvarez-Buylla et

al., 1996; Lemes, 2000, Collevatti et al., 2001; Dick, 2001; White et al., 2002; Ward et al.,

2005). Vários autores atribuem a prevalência desses altos níveis de fecundação cruzada a

algum tipo de auto-incompatibilidade (Bawa, 1974; Bawa et al., 1985, Bullock, 1985;

O’Malley & Bawa, 1987; Murawski et al., 1990). Pseudobombax munguba apresenta alta

taxa de fecundação cruzada apesar da espécie não apresentar uma barreira de auto-

incompatibilidade esporofítica ou gametofítica típica (Gribel & Gibbs 2002). A produção

final de sementes, contudo, não é afetada pela redução da fertilidade devido à perda de

óvulos auto-fecundados. As sementes são produzidas em grande quantidade através de

fertilização cruzada freqüente, promovida por um polinizador capaz de forragear a longas

distâncias (Gribel & Gibbs, 2002). Também foi observado que P. munguba não apresenta

agasmospermia (Gribel & Abbott, 1996).

Os frutos de P. munguba são elípticos, com 15 a 30 cm de comprimento e cor

vermelha. As cápsulas deiscentes contêm 500-2700 pequenas sementes (2-3 mm de

diâmetro), que pesam 19-32 mg cada. A maturação dos frutos ocorre de 55 a 75 dias após a

abertura das flores (Gribel, 1995). As sementes são envolvidas por uma fibra macia e leve

que ajuda na dispersão pelo vento. Essa fibra é bastante utilizada pelas populações locais

na confecção de travesseiros.

P. munguba é a única espécie do gênero que ocorre nas florestas de várzea,

podendo ser encontrada em áreas sazonalmente inundadas por até quatro meses e nas

várzeas de maré, na região do estuário amazônico (Pires, 1974; Pires & Prance, 1985;

Worbes, 1992; Gribel & Gibbs, 2002; Gribel, 2003). Os habitats alagáveis chamados de

várzea são característicos das bacias sedimentares dos rios de água branca. O nome água

branca se refere aos rios da Amazônia que têm suas cabeceiras nos Andes. A forte erosão

nos Andes fornece o sedimento encontrado nestes rios, dando às águas uma aparência

barrenta. Os rios de águas brancas possuem alta carga de sedimento, pH quase neutro e

condutividades elétricas relativamente altas (Araujo-Lima & Goulding, 1998).

P. munguba também pode ser encontrada nas áreas alagadas do Rio Branco no

estado de Roraima. O Rio Branco é um afluente do Rio Negro que sazonalmente carrega

sedimentos originados dos Tepuis, dando às suas águas uma aparência semelhante aos rios

de água branca (Araujo-Lima & Goulding, 1998).

Fotos: Rogério Gribel

Figura 1 - Indivíduos adultos de P. munguba: A) Em terra; B) Parcialmente submersa; C) Totalmente

submersa.

Fotos: Rogério Gribel

Figura 2 - Flor, frutos, sementes e disperção de P. munguba. A) Flor; B) Frutos e sementes; C e D)

Dispersão de sementes.

I.7. PSEUDOBOMBAX MUNGUBA E A VÁRZEA

A presença de grandes florestas nas planícies alagáveis dos rios de águas barrentas

da Amazônia leva a uma grande disponibilidade de frutas e sementes que são uma

importante fonte de alimento para vários tipos de peixes e outros animais. As larvas de

caraciformes como o tambaqui e de espécies dos gêneros Triportheus, Brycon e Chalceus;

de várias espécies de piranha; de aracus ou piaus (Anostomidae) e de bagres (Pimelodidae,

Doradidae e Auchenipteridae), após deixarem os rios de águas barrentas, entram na

planície inundada onde começam a se alimentar (Araujo-Lima & Goulding, 1998). Claro-

Jr et al. (2004) observaram, em juvenis de Parauchenipterus galeatus, Mylossoma

duriventre e Triportheus elongatus, uma dieta composta basicamente de frutos e sementes.

O mesmo foi observado por Balensiefer & Vogt (2006) em tartarugas da espécie

Podocnemis unifilis. As sementes de P. munguba, ricas em proteínas e óleos, são

efetivamente importantes para as populações nativas de peixes e tartarugas nas áreas de

várzea (Gribel, 1995).

Na várzea dos rios Solimões e Amazonas, P. munguba ocorre em densidades de

cinco árvores por hectare (Araujo-Lima & Goulding, 1998). Uma árvore produz em média

55 frutos por ano, contendo 1.474 sementes cada (Gribel, 1995). Considerando cerca de 1,2

kg de sementes por árvore, a produção total de sementes de munguba foi estimada em

cerca de 78.000 t/ano na várzea do rio Amazonas (Araujo-Lima & Goulding, 1998).

O impacto das ações antrópicas nas áreas de várzea vem aumentando ao longo dos

anos (Monteiro & Sawyer, 2001). Embora P. munguba seja ainda bastante abundante na

Amazônia, a derrubada da mata, seja para exploração de madeira ou para agricultura, pode

causar uma redução da densidade populacional da espécie. Essa redução pode resultar na

diminuição do fluxo gênico e o aumento dos níveis de auto-fecundação, diminuindo a

produção total de sementes com impactos negativos na população de P. munguba, na

ictiofauna e em outros grupos tróficos que também dependem da oferta de alimentos nesse

ambiente (Gribel, 1995; Claro-Jr, 2004).

Essa ameaça à manutenção da biodiversidade é resultado da redução de diversidade

genética que compromete a viabilidade das populações, tornando importantes a detecção e

a quantificação dos níveis naturais da variação genética em populações, principalmente de

espécies de árvores ameaçadas (Bawa, 1993; Alvarez-Buylla et al., 1996; Lemes et al.,

2003).

8. JUSTIFICATIVA

Baseado nas informações expostas anteriormente, o presente trabalho objetiva

investigar a filogeografia e a estrutura genética de populações de P. munguba, informações

indispensáveis para se propor estratégias de conservação para essa espécie tão importante

nas várzeas amazônicas.

Além disso, obter conhecimento dos níveis e padrões de distribuição espacial da

variabilidade genética de espécies florestais ao longo da Amazônia é uma questão atual

muito relevante uma vez que o entendimento dos padrões evolutivos, inter e intra-

populacionais, fornece subsídios importantes para a elucidação não só da história de

colonização da planta mas também serve de contribuição na discussão da história evolutiva

e geológica da própria Amazônia.

II. OBJETIVOS

Investigar a filogeografia e a estrutura genética de populações da Mungubeira

(Pseudobombax munguba), uma importante espécie arbórea das várzeas amazônicas, por

meio da análise de polimorfismos de seqüências e locos microssatélites do genoma do

cloroplasto.

Objetivos específicos:

a) Quantificar a diversidade genética em populações de P. munguba utilizando

marcadores microssatélites e seqüências de regiões não-codificadoras do genoma de

cloroplasto;

b) Caracterizar e comparar os padrões de distribuição da variabilidade genética e os

níveis de diferenciação genética entre as populações de P. munguba, na Amazônia

brasileira, com base na análise de polimorfismos de seqüências de uma região não-

codificadora e de locos microssatélites do genoma do cloroplasto;

c) Relacionar as diversas hipóteses biogeográficas da Amazônia com os padrões de

distribuição da diversidade de haplótipos encontrados no genoma de cloroplasto de P.

munguba na Amazônia brasileira.

III. MATERIAL E MÉTODOS

III.1.

MATERIAL BIOLÓGICO E LOCAIS DE COLETA

No total foram amostrados 162 indivíduos de P. munguba pertencentes a 11

populações distribuídas na Amazônia brasileira (Tabela 1 e Figura 3). As populações

foram definidas como grupos de árvores com potencial contato reprodutivo entre si,

geograficamente relacionadas, ocorrendo num raio de 5 km (cerca de 78 km

). As

populações amostradas estão separadas por distâncias superiores a 140 km ou por grandes

rios. Foram amostrados de 16 a 43 indivíduos por população nas seguintes localidades: 1)

Beruri-AM; 2) Caracaraí-RR, 3) Catalão, Manaus-AM; 4) Cruzeiro do Sul-AC; 5) Floresta

Nacional de Caxiuanã-PA; 6) Rio Japurá-AM; 7) Rio Madeira-AM; 8) Paraná do Mapixi,

Rio Purus-AM; 9) Tabatinga-AM (margem direita); 10) Tabatinga -AM (margem

esquerda); 11) Tefé-AM.

Tabela 1. Localização das populações e número de indivíduos amostrados de P. munguba na Amazônia

Brasileira. As colunas N

e N

apresentam os números de indivíduos de cada população utilizados

nas análises com dados de microssatélites e de regiões não codificadoras do cpDNA,

respectivamente.

População Sigla N¹ N² Localidade / Rio

Coordenadas

geográficas

Altitude

(m)

Beruri B 16 4 Beruri - AM / Purus

3º48’S,

61º26’O

Caracaraí C 3 3 Caracaraí - RR / Branco

1º23’S,

61º15’O

Catalão Ca 16 - Manaus - AM / Amazonas

1º28’S,

60º15’O

Caixiuanã Cx 16 4 Melgaço - PA / Amazonas

1º45’S,

51º28O’

Cruzeiro do Sul CS 15 4 Cruzeiro do Sul - AC / Juruá

7º35’S,

72º54’O

173

Japurá J 16 4 Japurá - AM / Japurá

1º42’S,

67º14’O

Madeira M 15 4 Borba - AM / Madeira

5º37’S,

60º58’O

Paraná do Mapixí PM 16 4 Tapaua - AM / Purus

5º37’S,

64º00’O

Tefé T 16 4 Tefé - AM / Solimões

3º20’S,

64º42’O

Tabatinga - M. Dir. TD 16 4 Tabatinga - AM / Solimões

4º12’S,

69º51’O

Tabatinga - M. Esq. TE 16 - Tabatinga - AM / Solimões

4º27’S,

69º55’O

Total 161 35

Figura 3 - Locais de Coleta de P. munguba. 1) Beruri-AM; 2) Caracaraí-RR, 3) Catalão, Manaus-AM; 4)

Cruzeiro do Sul-AC; 5) Floresta Nacional de Caxiuanã-PA; 6) Rio Japurá-AM; 7) Rio Madeira-

AM; 8) Paraná do Mapixi, Rio Purus-AM; 9) Tefé-AM; 10)Tabatinga-AM (margem direita); 11)

Tabatinga -AM (margem esquerda).

O material biológico utilizado foi tecido vegetal proveniente de folhas ou câmbio,

os quais, após a coleta, foram secos, acondicionados em um recipiente contendo sílica gel e

armazenados a -20ºC no Laboratório de Genética e Biologia Reprodutiva de Plantas

(LabGen) do INPA.

III.2.

EXTRAÇÃO, QUANTIFICAÇÃO E DILUIÇÃO DO DNA

O DNA genômico total foi extraído pelo método CTAB (brometo de

cetiltrimetilamônio) (Doyle & Doyle, 1987), utilizando o protocolo otimizado por Ferreira

& Grattapaglia (1998), com auxílio de um disruptor celular FastPrep (Q Biogene, USA)

para maceração das amostras.

A quantificação do DNA extraído foi feita por comparação com padrões de massa

molecular conhecida (DNA fago Lambda), em gel de agarose 1,5% corado com brometo

de etídeo (Ferreira & Grattapaglia, 1998), analisados em transiluminador sob luz ultra-

violeta e fotodocumentados. Após a quantificação, as amostras foram diluídas em água

ultra-pura e padronizadas a uma concentração de 2,5 ng/µl.

III.3.

AMPLIFICAÇÃO E ANÁLISE DOS LOCOS MICROSSATÉLITES DO GENOMA DO

CLOROPLASTO (CPDNA)

Foi testada a transferibilidade para Pseudobombax munguba de dez pares de

iniciadores (“primers”) originalmente desenvolvidos para Nicotiana tabacum (Weisinger

& Gardner, 1999), os quais amplificam locos microssatélites do genoma do cloroplasto da

maioria das angiospermas, e quatro pares desenvolvidos para Eucalyptus globulus (Steane

et al., 2005). Um dos primers de cada par foi marcado com um fluorocromo (FAM, HEX e

TET/NED) para permitir a análise em seqüenciador automático de DNA.

A amplificação dos locos microssatélites do cpDNA foi realizada via Reação em

Cadeia da Polimerase - PCR num volume total de 10µL contendo 0,4 µM de cada primer;

1 unidade de Taq DNA polimerase; 200 µM de cada nucleotídeo (dNTP); tampão de PCR

1X (10 mM Tris-HCl pH 8,3, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl2); BSA (Bovine Serum Albumin

- 2,5 mg/mL); 7,5mM de MgCl

; 7,5ng de DNA e água ultrapura.

As reações foram realizadas em termociclador PTC-200 (MJ Research) nas

seguintes condições: (1) desnaturação inicial a 94ºC / 5 min, seguida de 30 ciclos de: (2)

desnaturação a 94ºC / 1 min; (3) anelamento na temperatura específica de cada par de

primer/1min, (4) extensão a 72ºC / 1 min, e uma etapa de extensão final a 72ºC / 45 min.

A amplificação dos locos microssatélites foi confirmada pela análise dos produtos

amplificados após eletroforese em gel de agarose 1,5% corado com brometo de etídio, em

transiluminador sob luz ultra-violeta e fotodocumentados. Após, os produtos amplificados

foram diluídos e analisados sob eletroforese em gel de poliacrilamida 5% em seqüenciador

automático de DNA ABI Prism 377 XL (Applied Biosystems Inc.). Para a estimativa do

tamanho dos alelos foram utilizados os padrões internos de peso molecular TAMRA 500 e

ROX (ABI). Os dados genéticos foram coletados e analisados utilizando-se os programas

Genescan e Genotyper (Applied Biosystems Inc.).

III.4.

AMPLIFICAÇÃO DAS REGIÕES NÃO CODIFICADORAS DO CPDNA

Foram testados cinco pares de primers universais que amplificam regiões não-

codificadoras do genoma de cloroplasto das angiospermas, sendo quatro espaçadores

intergênicos, 1) trnH/psbA (Hamilton, 1999), 2) trnS/trnG (Hamilton, 1999) e 3)

psbB/psbF (Hamilton, 1999), 4) atpB/rbcL (Samuel et al., 1997), e um intron 5) rps16

(Oxelman et al., 1997).

A amplificação foi realizada via PCR num volume total de 20µL contendo 1,5 µM

de cada primer; 2,5 unidades de Taq DNA polimerase; 200 µM de cada nucleotídeo

(dNTP); tampão de PCR 1X (10 mM Tris-HCl pH 8,3, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl2); BSA

(Bovine Serum Albumin - 2,5 mg/mL); 23,4mM de MgCl

; 7,5ng de DNA e água

ultrapura.

As reações foram realizadas nas seguintes condições: (1) desnaturação inicial a

94ºC / 4min, seguida de 35 ciclos de: (2) desnaturação a 92ºC / 45 seg; (3) anelamento na

temperatura específica de cada par de primer / 45 seg, (4) extensão a 72ºC / 1 min e 30 seg,

e uma etapa de extensão final a 72ºC / 10 min.

Os produtos amplificados foram analisados sob eletroforese em gel de agarose 1,5%

corado com brometo de etídio para a confirmação da amplificação. Para a estimativa dos

tamanhos dos produtos amplificados foi utilizado padrão 1 Kb plus DNA ladder

(Invitrogen).

III.5.

SEQÜENCIAMENTO E ANÁLISE DOS PRODUTOS AMPLIFICADOS

Os produtos amplificados das regiões não-codificadoras do cpDNA de P. munguba

foram purificados utilizando as enzimas Exonuclease I e Shrimp Alkaline Phosphatase

(ExoSAP-IT - USB Coorporation) de acordo com o protocolo fornecido pelo fabricante,

visando a eliminação de excesso de reagentes que pudessem interferir na qualidade das

seqüências.

Os produtos amplificados foram seqüenciados utilizando-se os primers nos dois

sentidos (forward e reverse). As reações de seqüenciamento foram realizadas em um

volume total de 10 µl com 1,5 µl de um dos primers na concentração 2µM, 2 µl do Kit Big

Dye Terminator III (Applied Biosystems, Inc.), 2 µl de Tampão de Diluição, 2 µl de PCR e

2,5 µl de água ultra-pura. Em seguida as reações foram purificadas utilizando-se solução de

Acetato de Sódio/EDTA (Acetato de Sódio 3M, pH 5,2 e EDTA 125 mM e pH 8.0) e

Etanol.

Os produtos contendo a reação de seqüenciamento foram re-suspensos em tampão

de carregamento composto por quatro partes de formamida para uma parte de azul dextran,

desnaturados a 95ºC/2min e analisados sob eletroforese em gel de poliacrilamida 5% num

seqüenciador de DNA ABI 377 (Applied Biosystems, Inc.). As seqüências obtidas foram

analisadas no programa Sequencing Analysis 3.4.1 (Applied Biosystems Inc.) e editadas

utilizando-se o programa ChromasPro versão 1.34 (Technelysium Pty Ltd). O alinhamento

das seqüências obtidas nos dois sentidos (forward e reverse) e a criação da seqüência

consenso de cada par foram realizadas utilizando-se o programa BioEdit versão 7.0.5.3

(Hall, 1999).

III.6.

ANÁLISE DOS DADOS

Para os dados de microssatélites, chamamos de loco cada sitio de cpSSR e de alelo

cada variante de tamanho no determinado loco. Para os dados de seqüências chamamos de

loco cada sítio variável ao longo das seqüências e de alelo cada variação encontrada em um

mesmo loco em diferentes seqüências. Somente substituições nucleotídicas foram

consideradas como variações. Como a molécula de cloroplasto normalmente não sofre

recombinação, pode ser considerada um único loco e então, tanto para dados de seqüências

quanto de microssatélites, cada combinação única de alelos de diferentes locos foi

denominada de haplótipo.

Para os locos microssatélites foram calculados: número de locos polimórficos (S),

número de alelos por loco, número de haplótipos, freqüência dos haplótipos e a diversidade

genética (H

), que se baseia na probabilidade de dois indivíduos selecionados

aleatoriamente serem diferentes (Nei, 1987).

Para as estimativas das distâncias genéticas entre as populações foi utilizada a

distância (D), definida por Reynolds et al. (1983). Essa distância se baseia em diferenças

entre os números de repetições nas regiões de microssatélites seguindo o modelo de

evolução de microssatélites em análises intra-especificas: o SMM (Stepwise Mutation

Model). Para o teste da hipótese de isolamento por distância, foram correlacionadas as

medidas de distância genética (D) e distância geográfica euclidiana (Km) entre as

poulações de P. munguba, par a par, utilizando-se para tal o teste de Mantel (Mantel, 1967)

implementado pelo programa ARLEQUIN (Schneider et al., 2001).

Para determinar a distribuição da variabilidade genética detectada dentro e entre as

populações foi realizada uma análise de variância molecular (AMOVA, Excoffier et al.

1992) para dados haplotípicos, utilizando-se o programa ARLEQUIN (Schneider et al.

2001). A significância do índice de diferenciação F

foi testada por meio de 1000

permutações utilizando-se teste não paramétrico, segundo Excoffier et al. (1992).

Para os dados de seqüências foram determinadas a variação no comprimento e a

composição nucleotídica das seqüências obtidas. As relações entre os haplótipos obtidos a

partir da variação nos locos microssatélites, quanto nas seqüências do cpDNA, foram

inferidas por meio de uma análise de rede utilizando o método Median-Joining (Bandelt et

al., 1999), com o programa NETWORK (Forster et al. 2000). Esse método combina

características do algorítimo de Kruskal, que encontra a melhor árvore por favorecer

conexões curtas, com o algorítimo heurístico de máxima parcimônia de Farris e adiciona

vértices chamados median vectors, que seriam haplótipos extintos ou não amostrados na

população (Bandelt et al., 1999).

50ng

6 7

100ng

200ng

IV. RESULTADOS

IV.1.

EXTRAÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DO DNA

A extração do DNA genômico total de P. munguba foi realizada com sucesso,

usando o método CTAB descrito por Doyle & Doyle (1987) e modificado por Ferreira &

Grattapaglia (1998). Na figura 4 observa-se a quantificação das amostras de DNA extraído

de oito indivíduos de P. munguba em gel de agarose 1,5% corado com brometo de etídeo.

Figura 4 - Quantificação do DNA genômico total extraído de amostras de P. munguba. As três primeiras

colunas indicam, respectivamente os marcadores de peso molecular 50, 100 e 200 ng. Nas colunas

de 1 a 8, as bandas correspondem ao DNA extraído de oito indivíduos de P. munguba da população

do Rio Madeira - AM.

IV.2. AMPLIFICAÇÃO, GENOTIPAGEM E ANÁLISE DOS LOCOS MICROSSATELITES

DO GENOMA DO CLOROPLASTO

(CPDNA)

Foram otimizadas as condições de PCR de nove dos 14 pares de primers testados

que amplificam locos microssatélites do genoma do cloroplasto de espécies de

angiospermas (ccmp1, ccmp2, ccmp3, ccmp4, ccmp6, ccmp7, ccmp10, emcrc74 e emcrc90)

e confirmada a transferabilidade desses marcadores para P. munguba. As temperaturas de

anelamento otimizadas para cada par de primers, o número de alelos encontrados e os

tamanhos dos fragmentos estão listadas da tabela 2. Dos nove locos SSR otimizados, oito

foram utilizados nas análises genéticas: ccmp2, ccmp3, ccmp4, ccmp6, ccmp7, ccmp10,

emcrc74 e emcrc90. A figura 5 mostra diferentes produtos de amplificação a partir da

análise desses oito locos microssatélites, em gel de agarose 1,5% corado com brometo de

etídio.

Tabela 2 - Características dos oito locos microssatélites do genoma de cloroplasto amplificados para

Pseudobombax munguba. T

: Temperatura de anelamento. Referências: * Weisinger & Gardner,

1999; ** Steane et al., 2005.

cpSSR

Seqüência dos primers

5´ - 3´

(ºC)

Número

de alelos

Tamanho estimado dos

fragmentos (pb)

EMCRC74_FAM

EMCRC74**

6-FAM/GGC CGT GTA CGA GAA GTC AA

CCA AGG GCT ATA GTC ATA GTG ATC C

2 121 a 122

EMCRC90_NED

EMCRC90**

NED/ACA CTA GCC ATT CAG AGT CTA C

ATA GCG ATG GAG TTT TAT GA

2 202 a 205

ccmp2_FAM

ccmp2*

6-FAMGAT CCC GGA CGT AAT CCT G

ATC GTA CCG AGG GTT CGA AT

3 139 a 141

ccmp3_HEX

ccmp3*

HEX/CAG ACC AAA AGC TGA CAT AG

GTT TCA TTC GGC TCC TTT AT

5 134 a 153

ccmp4_TET

ccmp4*

TET/AAT GCT GAA TCG AYG ACC TA

CCA AAA TAT TBG GAG GAC TCT

3 230 a 232

ccmp6_FAM

ccmp6*

6-FAM/CGA TGC ATA TGT AGA AAG CC

CAT TAC GTG CGA CTA TCT CC

4 118 a 121

ccmp7_TET

ccmp7*

TET/CAA CAT ATA CCA CTG TCA AG

ACA TCA TTA TTG TAT ACT CTT TC

3 285 a 287

cmp10_HEX

ccmp10*

HEX/TTT TTT TTT AGT GAA CGT GTC A

TTC GTC GDC GTA GTA AAT AG'

3 103 a 132

123

100pb

200pb

300pb

100pb

200pb

300pb

100pb

200pb

300pb

100pb

200pb

300pb

100pb

200pb

300pb

100pb

200pb

300pb

100pb

200pb

300pb

100pb

200pb

300pb

Figura 5 - Fragmentos amplificados a partir da análise de oito locos microssatélites do genoma do

cloroplasto de P. munguba. A coluna M apresenta o marcador 1 Kb plus DNA ladder, as colunas 1 a

6 apresentam fragmentos de DNA amplificados de diferentes indivíduos de P. munguba. A) Loco

ccmp2, B) ccmp3, C) ccmp4, D) ccmp7, E) ccmp8, F) ccmp10, G) emcrc74, H) emcrc90.

Os oito locos microssatélites analisados mostraram-se polimórficos. Foram

genotipados, com base na análise desses oito locos, um total de 161 indivíduos de P.

munguba pertencentes a 11 populações amostradas na Amazônia brasileira. Na figura 6 são

apresentados eletroferogramas mostrando alelos observados para os oito locos

microssatélites do genoma do cloroplasto de P. munguba. Por se tratar de um genoma

haplóide, observa-se apenas um alelo por loco analisado. O número total de alelos

observado foi 25 sendo que o número de alelos observados por loco variou de 2 a 5

(Tabelas 2 e 3). A análise conjunta dos oito locos microssatélites do cpDNA evidenciou a

presença de 35 haplótipos nas 11 populações de P. munguba. As freqüências dos

haplótipos observados e sua distribuição nas populações estão dispostas na figura 7. Dentre

os 35 haplótipos detectados, um mostrou-se mais freqüente em relação aos demais

(39,75%), ocorrendo em sete populações e 19 foram representados por apenas um

indivíduo. A freqüência dos outros 34 haplótipos variou de 0,62% a 12,42% (Figura 7).

Três populações (Beruri, Catalão e Caxiuanã), todas situadas na calha central dos rios

Solimões e Amazonas mostraram-se monomórficas, ou seja, não apresentaram variação em

nenhum dos locos microssatélites analisados.

Figura 6 - Eletroferogramas mostrando alelos de oito locos microssatélites do cpDNA amplificados para

diferentes indivíduos de P. munguba. Cada pico indica um alelo. Os tamanhos dos alelos encontram-

se indicados na barra superior, em pares de bases. A) Loco ccmp2, B) ccmp3, C) ccmp4, D) ccmp7,

E) ccmp8, F) ccmp10, G) emcrc74, H) emcrc90.

Tabela 3 - Haplótipos observados com base na análise de oito locos microssatélites do genoma de

cloroplasto, em 11 populações de Pseudobombax munguba. N = numero de indivíduos.

Locos

Hap

ccmp 2 ccmp 3 ccmp 4 ccmp 6 ccmp 7 ccmp 10 emcrc 74 emcrc 90

1 140 136 231 119 286 132 122 203 64

2 140 135 231 119 286 132 122 203 20

3 140 135 231 118 286 132 122 203 11

4 140 136 231 118 286 132 122 203 10

5 140 135 231 118 286 131 122 203 5

6 139 137 231 119 286 132 122 203 5

7 140 136 231 119 286 131 122 203 4

8 140 137 231 119 286 131 122 203 4

9 140 153 231 121 286 103 122 205 3

10 140 137 231 118 286 132 122 203 3

11 140 135 231 119 286 131 122 203 3

12 140 153 232 120 286 103 122 205 2

13 139 136 231 119 286 131 122 203 2

14 139 136 231 119 286 132 122 203 2

15 140 136 231 119 286 132 121 203 2

16 139 137 231 118 286 131 122 203 2

17 140 153 231 118 286 103 122 205 1

18 139 137 230 118 286 132 122 203 1

19 140 136 231 121 286 103 122 205 1

20 139 136 232 120 286 103 122 205 1

21 139 153 232 120 286 103 122 205 1

22 140 134 231 119 286 132 122 203 1

23 140 134 231 118 286 132 122 203 1

24 140 135 230 118 286 131 121 203 1

25 140 134 231 118 286 131 122 203 1

26 139 136 231 118 285 132 121 203 1

27 139 136 231 118 286 132 122 203 1

28 140 136 231 118 286 132 121 203 1

29 139 137 231 118 285 132 122 203 1

30 140 137 231 119 286 132 122 203 1

31 139 137 231 118 286 132 122 203 1

32 139 137 231 119 286 132 121 203 1

33 141 136 231 118 286 132 122 203 1

34 140 135 231 119 287 132 122 203 1

35 140 135 231 119 287 131 122 203 1

Total 161

1 2 3 4 5 6 7 8 9 1011121314151617181920212223242526272829303132333435

Haplótipos

Freqüência

Figura 7 - Freqüência dos haplótipos observados na análise de oito locos microssatélites do genoma de

cloroplasto de P. munguba. B) Beruri-AM; C) Caracaraí-RR, Ca) Catalão, Manaus-AM; CS)

Cruzeiro do Sul-AC; Cx) Floresta Nacional de Caxiuanã-PA; J) Rio Japurá-AM; M) Rio Madeira-

AM; PM) Paraná do Mapixi, Rio Purus-AM; TD) Tabatinga-AM (margem direita); TE) Tabatinga -

AM (margem esquerda); T) Tefé-AM.

Como três populações mostraram-se monomórficas, optou-se pela análise dos

dados microssatélites considerando-se primeiramente todas as populações e outra

excluindo as populações monomórficas. Os resultados referentes às medidas de

diversidade genética (H

- Nei, 1987) apresentaram considerável diferença nas duas

situações. Os valores de diversidade genética variaram entre 0,0 e 0,433. A diversidade

genética média total foi de 0,240 para todas as populações analisadas conjuntamente e de

0,301 quando apenas as populações polimórficas foram consideradas. O índice de fixação

) foi mais alto considerando a análise de todas a populações, quando comparado ao

índice obtido excetuando-se as populações monomórficas (Tabela 4).

A tabela 5 mostra a distribuição da variabilidade genética dentro e entre as

populações, inferidas por meio de uma análise de variância molecular utilizando todas as

populações e a tabela 6 mostra somente os dados das populações que apresentaram

variabilidade genética. Em ambas as análises, a maior parte da variação genética

encontrada pode ser explicada pela variação contida dentro das populações, representando

58,67% da variação encontrada, na análise com todas as populações e 66,45% excluindo as

populações monomórficas.

Tabela 4 - Índices de diversidade genética estimados para as populações de P. munguba com base na análise

de oito locos microssatélites do genoma de cloroplasto. H

, diversidade genética (* Diversidade

genética total considerando todas as populações, ** Diversidade genética total considerando somente

as populações polimórficas); F

1: índice de fixação considerando todas as populações; F

2: índice

de fixação considerando somente as populações polimórficas.

População

Nº de

alelos

Haplótipos H

Beruri 8 1 0 0,45364 --

Caracaraí 9 2 0,16667 0,42080 0,35596

Catalão 8 1 0 0,45364 --

Cruzeiro do Sul 20 11 0,43333 0,33411 0,28409

Caxiuanã 8 1 0 0,45364 --

Japurá 13 7 0,19167 0,40053 0,33916

Madeira 13 8 0,19524 0,39978 0,33854

Paraná do Mapixi 14 9 0,21979 0,39274 0,33270

Tefé 13 6 0,16979 0,40659 0,34418

Tabatinga

(margem direita)

12 5 0,14792 0,41265 0,34921

Tabatinga

(margem esquerda)

11 7 0,12708 0,41843 0,35399

Total 0,24032*/0,30142** 0,41330 0,33553

Teste de significância (1023 permutações): P = 0,000

Tabela 5 - Análise de Variância Molecular (AMOVA) com base na análise de oito locos microssatélites do

genoma de cloroplasto de P. munguba considerando onze populações amostradas.

Fonte de Variação gl

Soma dos

Quadrados

Componentes da

Variação

Porcentagem da

Variação

Entre Populações 10 65,899 0,41284 Va 41,33

Dentro das

Populações

150 87,908 0,58606 Vb 58,67

Total 160 153,807 0,99889

Índice de Fixação F

: 0,41330

Teste de significância (1023 permutações): P = 0,000

Tabela 6 - Análise de Variância Molecular (AMOVA) com base na análise de oito locos microssatélites do

genoma de cloroplasto de P. munguba considerando somente as populações polimórficas.

Fonte de Variação gl

Soma dos

Quadados

Componentes da

Variação

Porcentagem da

Variação

Entre Populações 7 47,127 0,42277 Va 33,55

Dentro das

Populações

105 87,908 0,83722 Vb 66,45

Total 112 135,035 1,25999

Índice de Fixação FST: 0,33553

Teste de significância (1023 permutações): P = 0,000

Na tabela 7 é apresentada a matriz que correlaciona as distâncias genéticas e as

distâncias geográficas, entre as populações de P. munguba analisadas par a par. Com base

nos resultados do teste de Mantel, que testa a significância da correlação entre as duas

variáveis analisadas, rejeitou-se a hipótese de isolamento por distância entre as populações

de P. munguba. Nesta análise, o coeficiente de correlação r encontrado foi igual a

0,135192 (p = 0,15) indicando não haver uma relação direta entre distância genética e a

distância geográfica entre as populações de P. munguba na Amazônia brasileira (Figura 8).

Tabela 7 - Matriz de correlação entre distâncias genéticas de Reynolds (abaixo da diagonal) e distâncias

geográficas euclidianas (acima da diagonal, em Km) entre as populações de P. munguba, analisadas

par a par.

Populações B C Ca CS Cx J M PM T TD TE

-- 583,1 211,1 1336,5 1128,1 781,3 197,2 347,9 361,3 935,0 942,4

2,553 -- 541,3 1635,8 1142,2 844,2 675,0 842,1 651,4 1144,2 1164,3

0,0 2,553 -- 1546,0 920,0 964,2 146,7 557,7 559,6 1135,7 1145,7

0,632 0,263 0,632 -- 2460,3 841,2 1491,2 1002,1 1030,1 504,2 475,5

0,0 2,552 0,0 0,632 -- 1855,5 970,0 1455,5 1475,2 2058,0 2068,9

0,990 0,038 0,990 0,632 0,990 -- 980,6 632,9 429,6 338,5 365,6

0,325 0,461 0,325 0,370 0,325 0,471 -- 486,7 558,4 1117,7 1124,7

1,020 0,576 1,020 0,444 1,020 0,550 0,471 -- 271,0 677,7 672,2

0,180 0,500 0,179 0,368 0,179 0,442 0,105 0,484 -- 578,4 594,8

1,010 0,331 1,010 0,476 1,010 0,039 0,522 0,627 0,455 -- 30,0

0,677 0,535 0,677 0,447 0,677 0,165 0,377 0,615 0,257 0,043 --

0,5

1,5

2,5

0 500 1000 1500 2000 2500 3000

Distância Geográfica (Km)

Distância Genética de Reynolds

Figura 8 - Relação entre distância genética de Reynolds e distância geográfica (Km) para 11 populações P.

munguba, analisadas par a par, com base na variação observada em oito locos microssatélites do

genoma de cloroplasto.

Dos 35 haplótipos detectados, a partir da análise da variação encontrada nos oito

locos microssatélites do genoma do cloroplasto de P. munguba, dez foram compartilhados

entre indivíduos de diferentes populações e 25 haplótipos foram exclusivos a alguma das

populações analisadas: um de Tefé - AM, dois de Tabatinga - AM (margem direita), quatro

do Madeira - AM, quatro do Japurá - AM, sete de Cruzeiro do Sul - AM e sete do Paraná

do Mapixí - AM, como pode ser observado nas figuras 7 e 9. O haplótipo encontrado com

maior freqüência (39,75%) representa o único haplótipo encontrado na calha central dos

rios Solimões e Amazonas, de Beruri-AM a Caxiuanã-PA, abarcando uma extensão de

mais de 1.100 Km. Este mesmo haplótipo não foi observado nas populações do Paraná do

Mapixi-AM, Japurá-AM e na margem direita em Tabatinga-AM.

As relações entre os haplótipos de microssatélites de cloroplasto de P. munguba

encontrados, inferidas por meio de uma análise de rede utilizando o método Median-

Joining, são mostradas na figura 9. Para uma melhor visualização, a figura foi editada de

forma que o comprimento das linhas não indica o número de mutações entre os haplótipos

e, portanto, não reflete o grau de relação entre eles. Dois grupos distintos de haplótipos (A

e B), separados por um grande número de mutações podem ser observados.

Cruzeiro do Sul - AC (em vermelho) foi a única população que apresentou

haplótipos nos dois grupos (A e B), além disso, apresentou o maior número de haplótipos

(11), sete deles sendo bastante diferenciados (grupo B) devido a várias mutações e,

inclusive, dois median vectors que os separam dos demais haplótipos encontrados nas

outras regiões da Amazônia (grupo A). Um haplótipo da população de Cruzeiro do Sul -

AC apresentou uma relação próxima aos haplótipos de Paraná do Mapixí - AM (em azul

claro) e os outros quatro, são compartilhados por outras populações.

O haplótipo mais freqüente (círculo maior) é também o que apresenta relações com

um maior número de haplótipos (seis). As relações entre os demais haplótipos não são

claras por serem muito próximas, fato evidenciado pelo entrelaçamento das linhas, pelo

pequeno número de mutações entre os haplótipos e a existência de somente um median

vector.

Entretanto pode-se observar que as três populações localizadas na região noroeste

da Amazônia: Japurá - AM (em laranja), Tabatinga - AM - margem direita (em azul) e

Tabatinga - AM - margem esquerda (em verde), assim como as duas populações

localizadas na região sudeste: Madeira - AM (em amarelo) e Paraná do Mapixí - AM (em

azul), são mais relacionadas entre si que entre as duas regiões.

Figura 9 - Relações entre haplótipos a partir de análise de rede (Network), com base na variação de oito

locos microssatélites do genoma do cloroplasto de P. munguba. Cada círculo se refere a um

haplótipo. O tamanho do círculo é proporcional à freqüência de ocorrência do haplótipo. As linhas

representam as relações entre os haplótipos e os números, quando presentes, representam o número

de mutações entre eles. Linhas que não apresentam números possuem uma única mutação. As cores

mostram as populações que apresentam aquele haplótipo. Nodos pretos representam median vectors

B) Beruri-AM; C) Caracaraí-RR, Ca) Catalão, Manaus-AM; CS) Cruzeiro do Sul-AC; Cx) Floresta

Nacional de Caxiuanã-PA; J) Rio Japurá-AM; M) Rio Madeira-AM; PM) Paraná do Mapixi, Rio

Purus-AM; TD) Tabatinga-AM (margem direita); TE) Tabatinga-AM (margem esquerda); T) Tefé-

AM.

Grupo A

Grupo B

IV.3.

AMPLIFICAÇÃO, SEQÜENCIAMENTO E ANÁLISE DAS REGIÕES NÃO

CODIFICADORAS DO CPDNA

Foram otimizadas as condições de PCR de quatro dos cinco pares de primers

testados que amplificam regiões não codificadoras do genoma do cloroplasto de

angiospermas. As temperaturas ótimas de anelamento de cada par de primers, assim como

os tamanhos estimados dos fragmentos amplificados para P. munguba são apresentados na

tabela 8.

Tabela 8 - Características dos marcadores utilizados que amplificam regiões não-codificadoras do genoma

do cloroplasto de P. munguba. T

: Temperatura de anelamento.

Região

cpDNA

Seqüência dos primers

5´ - 3´

(ºC)

Tamanho estimado do

Fragmento (pb)

Referência

trnH

psbA

ACT GCC TTG ATC CAC TTG GC

CGA AGC TCC ATC TAC AAA TGG

470 Hamilton, 1999

trnS

trnG

GCC GCT TTA GTC CAC TCA GC

GGA CGA ATC ACA CTT TTA CCA C

700 Hamilton, 1999

psbB

psbF

GTTTACTTTTGGGCATGCTTCG

CGCAGTTCGTCTTGGACCAG

800 Hamilton, 1999

atpB

rbcL

GAAGTAGTAGGATTGATTCTC

CCCTACAACTCATGAATTAAG

800 Samuel et al.,1997

A figura 10 mostra os produtos da amplificação obtidos para quatro regiões não-

codificadoras do genoma do cloroplasto de P. munguba após otimização das condições de

PCR. Na figura 10 observa-se ainda, diferença considerável nos tamanhos dos fragmentos

amplificados para um indivíduo (coluna 6) de P. munguba da população de Cruzeiro do

Sul-AC, em relação aos demais (colunas 1 a 5 e 7), para as regiões trnH/psbA e trnS/trnG

(Figuras 10A e 10B, respectivamente).

2345678

500pb

650pb

800pb

650pb

800pb

500pb

650pb

800pb

500pb

650pb

800pb

Figura 10 - Amplificação de regiões não codificadoras do cpDNA de P. munguba. A coluna M mostra o

marcador 1 Kb plus DNA ladder, as colunas 1 a 7 apresentam fragmentos amplificados do cpDNA

de diferentes indivíduos: A) trnH/psbA, B) trnS/trnG, C) psbB/psbF, D) atpB/rbcL.

Para a escolha do marcador mais informativo foi feita uma análise preliminar na

qual foram seqüenciados 18 indivíduos de P. munguba de nove populações (Beruri-AM;

Caracaraí-RR, Cruzeiro do Sul-AC; Floresta Nacional de Caxiuanã-PA; Japurá-AM;

Madeira-AM; Paraná do Mapixi -AM; Tabatinga-AM - margem direita e Tefé-AM), sendo

dois de cada população, utilizando ambos os primers forward e reverse dos quatro pares de

primers otimizados.

Apenas os pares de primers que amplificam regiões intergênicas trnS/trnG (10

substituições) e psbB/psbF (1 substituição) apresentaram polimorfismos nas seqüências

obtidas, sendo dessa forma escolhida para as análises a região trnS/trnG. Na figura 11 são

apresentados eletroferogramas obtidos a partir do seqüenciamento de dois indivíduos que

apresentaram haplótipos diferentes, mostrando uma substituição nucleotídica.

Foram seqüenciados quatro indivíduos de P. munguba das populações Beruri-AM;

Cruzeiro do Sul-AC; Floresta Nacional de Caxiuanã-PA; Japurá-AM; Madeira-AM;

Paraná do Mapixi -AM; Tabatinga-AM - margem direita e Tefé-AM e três de Caracaraí-

RR sendo obtidas um total de 35 seqüências para a região intergênica trnS/trnG, em ambos

os sentidos (forward e reverse). As seqüências trnS/trnG apresentaram comprimentos entre

650 e 705 pb. Essa diferença no tamanho dos fragmentos deveu-se a diversas

inserções/deleções encontradas nas seqüências sendo que a maior variação detectada

correspondeu a de 36 pb como pode ser observado na figura 12. As bases nucleotídicas

foram encontradas nas seguintes proporções: T: 38%, C: 17,8%, A: 32% e G: 12,2%.

Foram detectadas 10 substituições nucleotídicas.

Figura 11 - Eletroferogramas mostrando produtos do seqüenciamento de dois indivíduos de P. munguba para

a região trnS/trnG. As setas indicam uma subsituição (C-T) entre duas seqüências.

Figura 12. - Alinhamento de seqüências de DNA da região trnS/trnG do genoma do cloroplasto de P.

munguba. A) Inserção/Deleção de 36 pb. B) Duas substituições nucleotídicas (C-T e A-C).

A figura 13 mostra as relações entre os haplótipos obtidos a partir da análise de

variações na seqüência da região trnS/trnG do genoma de cloroplasto de P. munguba,

inferidas por meio de uma análise de rede utilizando o método Median-Joining. As

seqüências agruparam-se em três haplótipos. O haplótipo 1 foi o mais freqüente (88,57%),

se relaciona diretamente com os outros dois haplótipos e possui uma ampla distribuição

geográfica, ocorrendo em oito das nove populações estudas. O haplótipo 2, que apresentou

somente uma substituição, foi exclusivo de Caracaraí - RR e foi o único observado nessa

população. O haplótipo 3 foi o mais diferenciado (com nove substituições) e foi encontrado

em dois dos quatro indivíduos analisados da população de Cruzeiro do Sul - AC.

Figura 13 - Relações entre os haplótipos obtidos a partir da análise das seqüências do espaçador intergênico

trnS/trnG do genoma do cloroplasto de P. munguba. Cada círculo refere-se a um haplótipo e o

tamanho indica sua freqüência de ocorrência. As linhas representam as relações entre os haplótipos e

nelas são observadas as posições onde ocorreram as substituições. O comprimento das linhas está

relacionado ao grau de relação entre os haplótipos. As cores representam as populações: B) Beruri-

AM; C) Caracaraí-RR, CS) Cruzeiro do Sul-AC; Cx) Floresta Nacional de Caxiuanã-PA; J) Rio

Japurá-AM; M) Rio Madeira-AM; PM) Paraná do Mapixi, Rio Purus-AM; TD) Tabatinga-AM

(margem direita); T) Tefé-AM.

V. DISCUSSÃO

A variação nos comprimentos dos fragmentos de locos microssatélites é causada

por mutações. Estudos mostram que as taxas de mutação encontradas para esse tipo de

marcador são mais altas (10

-2

a 10

-6

) que de mutações pontuais (Goldstein & Pollock,

1997, Li et al., 2002). Dois tipos de mecanismos mutacionais foram propostos para

explicar essa diferença: “replication slippage” (Tachida & Lizuka, 1992) e “recombination

with out-of-phase aligning” (Harding et al., 1992). Ambos os processos resultam em

alterações no número de repeats e uma conseqüência desses mecanismos de mutação é que

um mesmo estado genético (número de repeats) pode evoluir de duas linhagens diferentes,

por eventos mutacionais distintos, um fenômeno conhecido por homoplasia. Homoplasias

podem causar problemas em análises genéticas populacionais afetando medidas de

diversidade genética, fluxo gênico, distâncias genéticas e em análises filogenéticas, sendo

consideradas um potencial limitador para o uso de locos microssatélites como marcadores

genéticos (Provan et al. 2001).

Entretanto, o pequeno número de alelos reportados para locos cpSSR, comparado

com locos SSR do genoma nuclear (Powell et al., 1995; Provan et al., 1999), parece

sugerir que microssatélites de cloroplasto apresentam uma menor taxa de mutação que

aqueles encontrados no núcleo, como demonstrado por Provan et al. (1999) em seu estudo

com Pinus torreyanna. Além disso, homoplasias têm sido observadas apenas em categorias

taxonômicas acima de gênero (Doyle et al., 1998; Hale et al., 2004), e ainda assim, muitos

pesquisadores têm considerado os níveis de homoplasia baixos o suficiente para permitir

análises genéticas populacionais (Cuenca et al., 2003; Navascués & Emerson, 2005). Em

um estudo comparando simulações computacionais e dados empíricos de uma espécie de

Pinus, Navascués & Emerson (2005) avaliaram os efeitos da homoplasia nas medidas de

diversidade genética baseadas em cpSSR e concluíram que o índice de diversidade

genética de Nei (He) é pouco influenciado por homoplasias e que o uso de um grande

número de locos contribui para diminuir os efeitos negativos das homoplasias nas

estimativas de diversidade genética.

Locos microssatélites no genoma de cloroplasto têm sido utilizados em estudos

populacionais, de sistemática e análises filogeográficas nos últimos anos (Powel 1995;

Provan, 1999; Vendramin et al., 1999; Provan et al., 2001; Palmé & Vendramin, 2002;

Ribeiro et al., 2002; Collevatti et al., 2003; Grivet & Petit, 2003; Lira et al., 2003; Butaud,

2005; Cubas et al., 2005; Ueno et al., 2005; Andrianoelina et al., 2006).

No presente estudo os microssatélites de cloroplasto mostraram-se uma ferramenta

extremamente útil, possibilitando a observação de variação genética suficiente para a

realização de análises populacionais da espécie estudada (Pseudobombax munguba). Além

disso, o padrão de distribuição geográfica da variação genética encontrada em populações

de P. munguba, com base na análise de locos microssatélites do genoma do cloroplasto, ao

longo de sua distribuição na Amazônia brasileira, em conjunto com os dados obtidos de

seqüências do genoma de cloroplasto permitiram o levantamento de hipóteses sobre

evolução e dispersão histórica dessas populações.

O número médio de alelos encontrado por loco cpSSR (3,12) foi comparável aos

observados em populações naturais de outras espécies de plantas, tais como Quercus sp.

(2,33; Deguilloux et al., 2003), Salix reinii (3,2; Lian et al., 2003) Silene paradoxa (2,8;

Mengoni et al., 2001), Pinus pinaster (4,1; Ribeiro et al., 2002) Caesalpina echinata (3,28;

Lira et al., 2003), Caryocar brasiliense (3,2; Collevatti et al., 2003), Magnolia stellata

(3,33; Ueno et al., 2005), Ulex sp (4,3; Cubas et al., 2005), Dalbergia monticola (3,33;

Andrianoelina et al., 2006) e Helianthus annuus (6; Wills & Burke, 2006).

Das 11 populações de P. munguba estudadas, sete apresentaram polimorfismos para

os locos microssatélites analisados, assim como também apresentaram um grande número

de haplótipos (5 a 11 haplótipos por população). A população de Caracaraí-RR apresentou

somente dois haplótipos. Entretanto, esta foi a população com menor número de indivíduos

amostrados (apenas três), o que provavelmente contribuiu para este resultado. Três

populações localizadas ao longo da calha central dos Rios Solimões e Amazonas não

apresentaram variações em nenhum dos locos microssatélites analisados, sugerindo a

existência de algum evento histórico ocorrido nessa região, o qual provavelmente

contribuiu para este resultado. Assim, para não confundir a interpretação dos dados,

considerando eventos antigos e atuais, as análises genéticas foram realizadas de duas

formas; uma na qual todas a populações amostradas foram incorporadas e outra na qual

foram desconsideradas as populações monomórficas.

Como esperado, o índice de diferenciação genética (F

), considerando-se todas as

populações analisadas (0.41), foi maior que o encontrado na análise considerando-se

apenas as populações polimórficas (0,33). Além disso, as análises de variância molecular

mostram que a maior parte da variação genética encontra-se dentro das populações, fato

comprovado pela presença de 24 haplótipos exclusivos de algumas das populações (um de

Tefé - AM, dois de Tabatinga - AM (margem direita), quatro do Madeira - AM, quatro do

Japurá - AM, sete de Cruzeiro do Sul - AM e sete do Paraná do Mapixí - AM) e apenas 10

compartilhados por mais de uma população, evidenciando um fluxo gênico materno

bastante restrito ou até ausente entre as populações.

Os índices de diversidade genética (H

) mostraram que as populações localizadas

próximo às cabeceiras dos tributários da calha Solimões/Amazonas (Cruzeiro do Sul - AC;

Paraná do Mapixi -AM; Madeira - AM; Japurá - AM e Caracaraí - RR), são em média (H

médio = 0,24) mais variáveis que as populações localizadas no médio Solimões (Tefé -

AM; Tabatinga -AM - margem esquerda; Tabatinga - AM - margem direita), cujo H

médio foi igual a 0,15. Já as populações do baixo Solimões e Amazonas (Beruri - AM,

Catalão - AM e Caxiuanã - PA) não apresentaram qualquer polimorfismo nos locos SSR.

As duas populações de Tabatinga - AM apresentaram haplótipos diferentes,

inclusive alguns não compartilhados entre as duas margens. Esse fato pode levar à

conclusão precipitada que o Rio Solimões é uma barreira ao fluxo gênico em P. munguba.

No entanto, devido a dispersão anemocórica, e ocasionalmente hidrocórica, das sementes

de P. munguba o deslocamento das sementes da mungubeira entre diferentes margens de

grandes rios é um evento muito provável. Assim, as duas populações de Tabatinga - AM

poderiam ser consideradas como uma única população com 32 indivíduos. Tabatinga - AM

(margem direita) e Tabatinga - AM (margem esquerda) foram mantidas separadas nas

análises para manter uma igualdade no número de indivíduos amostrados entre as

populações, pois, exceto Caracarai - RR, em todas as outras populações foram genotipados

entre 15 e 16 indivíduos/população. Dessa forma, os dados indicam que o aumento no

número de indivíduos amostrados pode levar à identificação de um maior número de

haplótipos nas populações de P. munguba.

A população de Cruzeiro do Sul - AC, apresentou a maior diversidade genética (H

= 0,43), o maior número de alelos (20) e haplótipos de microssatélites de cloroplasto (11),

sendo a única população a apresentar mais de um haplótipo para os dados de seqüências.

Além disso, esta população apresentou os haplótipos mais diferenciados para ambos os

marcadores. Tais resultados provavelmente refletem um longo período de existência sem

gargalos populacionais significativos quando comparado às outras populações estudadas, o

que ocasionou a essa população tempo suficiente para acumular mutações. Assim, a

população de Cruzeiro do Sul - AC provavelmente é, das 11 populações de P. munguba

estudadas, a mais antiga na Amazônia.

Por outro lado, a baixa variação encontrada nas outras regiões da Amazônia

brasileira indica que as populações aí localizadas são mais recentes ou sofreram gargalos

populacionais em um passado recente que eliminou grande parte da diversidade genética.

A presença de um único haplótipo nas três populações da calha central dos rios Solimões e

Amazonas poderia ser explicada por ação de seleção natural, mas essa hipótese foi

descartada, pois em geral, marcadores microssatélites e seqüências não codificadoras do

genoma de cloroplasto apresentam evolução neutra (Schlötter & Wiehe, 1999; Petit &

Vendramin, 2007). Uma explicação mais provável é que seja resultante de uma

colonização extremamente recente dessa região a partir de um único haplótipo fundador

(Ferris et al., 1999; Avise, 2000). A ausência de polimorfismos mesmo em regiões do

genoma sujeitas a altas taxas de mutações, como os SSRs do cpDNA, sugere que a

irradiação de P. munguba ao longo da calha Solimões-Amazonas ocorreu no Pleistoceno

recente ou mesmo no Holoceno. A ausência de substituições nucleotídicas em seqüências

nas populações mais centrais da Amazônia também indica um curto tempo de divergência

nas seqüências do genoma de cloroplasto analisadas para P. munguba. Como o cloroplasto

é uma molécula única, marcadores de seqüências e locos microssatélites estão ligados e

então o tempo de divergência deve ser o mesmo para ambos os marcadores, corroborando

assim a hipótese de colonização recente.

Os resultados obtidos no presente estudo permitem correlacionar as várias hipóteses

biogeográficas existentes para a Amazônia: Rios como Barreiras (Wallace, 1849;

Capparella, 1988; Ayres & Clutton-Brock, 1992; Haffer, 1992; Patton et al., 1994); a

Teoria dos Refúgios (Haffer, 1969; Vanzolini & Williams, 1970; Cerqueira, 1982; Prance,

1982); Centros de Origem e Dispersão (Hershkovitz, 1977; Reig, 1984); Gradientes

Ecológicos (Endler, 1977, 1982; Patton et al., 1994); Vicariância Geotectônica (Platnick &

Nelson, 1978; Cracraft & Prum, 1988; Futuyma, 1992; Amorim & Pires, 1996); Dinâmica

dos Rios (Salo et al., 1986) e Lago Amazônico (Klammer, 1984).

Rios não parecem ser barreiras geográficas importantes para a dispersão de P.

munguba. A dispersão de sementes pelo vento, e eventualmente pela água, descarta a

hipótese dos rios como barreiras ao fluxo gênico (Wallace, 1849; Capparella, 1988; Ayres

& Clutton-Brock, 1992; Haffer, 1992; Patton et al., 1994) para essa espécie. Ceiba

pentandra, espécie da mesma sub-família e com propágulo similar, não apresenta

diferenciação entre grandes interflúvios amazônicos, além de ter colonizado a África via

dispersão trans-atlântica (Dick et al., 2007).

Variações climáticas, ocorridas no Pleistoceno e em períodos geológicos anteriores

que causaram a retração das florestas tropicais em refúgios durante períodos secos e frios,

como postula a Teoria dos Refúgios (Haffer, 1969; Vanzolini & Williams, 1970;

Cerqueira, 1982; Prance, 1982), provavelmente afetaram em menor grau as planícies de

inundação, sazonalmente alagáveis, da Amazônia em comparação com as florestas de terra

firme. Por exemplo, durante o Würmian máximo (cerca de 18.000 anos antes do presente),

quando ocorreu uma depressão no nível oceânico que pode ter alcançado mais de 100

metros abaixo do nível atual (Irion, 1984), a erosão e o aprofundamento dos vales do rio

Amazonas e seus tributários, provavelmente resultou na retração das florestas de várzea

que ocorriam nas planícies de inundação desses rios. Entretanto, os hábitats de várzea

continuaram existindo ao longo da Amazônia durante os períodos glaciais, apesar de

ocuparem extensões muito menores do que no presente. Assim, essas alterações

provavelmente não afetaram a distribuição de P. munguba, pois esta é uma espécie

associada à várzea.

O teste de Mantel indicou que não há relação entre distância genética e distância

geográfica para as populações de P. munguba na Amazônia brasileira. Não havendo

isolamento por distância, a hipótese dos Gradientes Ecológicos (Endler, 1977, 1982; Patton

et al., 1994), que prevê diferenciação gradual entre as populações em função da sua

separação espacial, foi descartada.

A baixa variação genética encontrada em P. munguba, mesmo em regiões do

genoma sujeito a maiores taxas de evolução como os marcadores moleculares utilizados,

sugere a influência de eventos recentes na história de colonização da espécie na Amazônia,

o que leva à rejeição da hipótese da Vicariância Geotectônica (Platnick & Nelson, 1978;

Cracraft & Prum, 1988; Futuyma, 1992; Amorim & Pires, 1996), por tratar de eventos

geológicos muito antigos, ocorridos no período Terciário.

A hipótese da Dinâmica dos Rios (Salo et al., 1986) postula que a erosão lateral e

alterações na calha dos rios criam e destroem muitos habitats diferentes nas planícies

alagáveis dos rios, influenciando a criação e manutenção de diversidade ao longo na

Amazônia. Em P. munguba, foi encontrada uma variação muito baixa, principlamente na

calha central Solimões / Amazonas e então, essa hipótese também foi descartada.

Dentre as hipóteses biogeográficas analisadas, a do Lago Amazônico (Klammer,

1984) parece explicar melhor o padrão de distribuição da diversidade genética encontrado

para P. munguba no presente estudo. Nessa hipótese, ciclos de alterações climáticas

durante o Terciário e o Pleistoceno, alternando entre períodos secos-frios e úmidos-

quentes, associados respectivamente aos períodos glacial e inter-glacial, afetaram as

florestas tropicais não só como resultado de eventos de fragmentação e expansão (Haffer,

1969; Vanzolini& Williams). Essas oscilações climáticas tiveram papéis globais, levando à

elevação e redução do nível dos oceanos em relação ao nível atual. As várzeas dos grandes

rios amazônicos formam um ambiente particularmente vulnerável às variações climáticas

e, especialmente, a oscilações no nível dos oceanos podem causar perturbações nas

planícies de inundação. Com a elevação do nível dos oceanos, as águas marítimas

poderiam tanto avançar continente adentro, quanto represar a saída das águas fluviais,

causando o extravasamento de muitos rios e gerando amplas áreas alagadas ou mesmo a

formação de um grande lago na Amazônia (Klammer, 1984; Morroig & Cerqueira, 1997).

Segundo Klammer (1984), há cerca de 2,5 milhões de anos, no final do Plioceno, o

nível dos oceanos pode ter atingido 180 m acima do nível atual (“The Great Fouaratian

transgression”) regredindo gradualmente até cerca de 100 m há aproximadamente 750 mil

anos, e desde então, várias transgressões e regressões (nove ou dez) de intensidades

menores parecem ter ocorrido. Na figura 14 observa-se uma simulação do mapa com o

lago amazônico formado, considerando a topografia atual da Amazônia e uma elevação de

120 metros no nível dos oceanos. Observa-se ainda na figura as localizações das

populações de P. munguba amostradas no presente estudo.

O alagamento levaria à eliminação das florestas de várzea e grande parte da floresta

de terra firme na região central da Amazônia. O habitat de várzea provavelmente

continuaria existindo nas áreas marginais mais altas dos rios ricos em sedimentos, como os

rios Madeira, Purus, Juruá, Solimões, Japurá e Branco (circuladas em amarelo na figura

14). Pseudobombax munguba, uma espécie associada às várzeas dos rios de água branca da

Amazônia, teria sua distribuição geográfica altamente influenciada pelos eventos de

introgressão marinha e alagamento. Os demais tributários do rio Amazonas (rios de águas

claras e negras) são pobres em sedimentos, o que não permite a formação de áreas de

várzea em suas planícies e portanto, as cabeceiras desses rios (circuladas em azul claro na

figura 14), embora não fossem atingidos pelas águas do Lago Amazônico, não seriam

propícios para a manutenção de populações de P. munguba.

Populações localizadas em cotas mais altas dos rios de águas brancas (circuladas

em amarelo na figura 14) poderiam sobreviver a vários eventos de introgressão marinha e

alagamento, permanecendo totalmente isoladas em alguns períodos. As populações

situadas em médias altitudes sobreviveriam apenas às introgressões menos severas. Em

eventos mais extremos, essas populações seriam eliminadas. Entretanto, com a diminuição

gradual do nível das águas, essas áreas seriam paulatinamente recolonizadas, a partir das

populações remanescentes das áreas mais altas. Já as populações situadas na calha central

Solimões/Amazonas, especialmente no Baixo Solimões, Amazonas e na região estuarina,

provavelmente sofreram extinções periódicas devido à submersão total, mesmo nos

eventos de introgressões leves. Assim, a recolonização dessas regiões provavelmente foi

um evento muito recente, pois só seria possível após a volta dos cursos dos rios a seus

níveis atuais.

A população de Cruzeiro do Sul - AC por estar localizada em uma das regiões mais

altas (173 m) da Amazônia brasileira, provavelmente sobreviveu a diversos desses eventos,

o que explica a grande variabilidade genética observada e a presença de haplótipos

exclusivos, considerando-se tanto os dados de seqüências de regiões não-codificadoras e de

microssatélites do genoma de cloroplasto.

As populações do Rio Branco são pequenas e isoladas da rede hidrográfica de rios

de águas brancas da Amazônia, pois se separam da calha central por cerca de 280 km do

Rio Negro, onde não ocorrem áreas de várzea. A população de Caracaraí - RR (49 m), a

única coletada no Rio Branco, apresentou um haplótipo exclusivo nos dados de seqüências

de regiões não-codificadoras do genoma de cloroplasto que pode ser explicado por esse

isolamento. Entretanto, o tamanho populacional reduzido das populações aí localizadas,

pode ter contribuído para uma redução na diversidade genética local, por deriva genética.

Assim, um aumento no número de indivíduos amostrados na população de Caracaraí - RR

pode ser importante para corroborar essa hipótese.

As populações que se localizam em altitudes médias: Madeira - AM (32 m), Tefé -

AM (46 m), Purus - AM (54 m), Japurá - AM (63 m) e Tabatinga - AM (68 m), teriam sido

afetadas em diferentes graus, de acordo com o nível alcançado pelas águas, o que poderia

explicar a presença moderada de polimorfismos nos locos microssatélites e a ausência de

variação nas seqüências no genoma do cloroplasto de P. munguba.

Já as populações localizadas em menores altitudes: Beruri - AM (23 m), Catalão -

AM (22 m) e Caxiuanã - PA (10 m), provavelmente foram formadas pela recolonização

extremamente recente da região, após a diminuição do nível das águas, resultando na

ausência total de variação genética em ambos os marcadores do genoma de cloroplasto

utilizados.

Figura 14 - Mapa mostrando a formação do lago amazônico, com base na simulação do alagamento ocorrido

na Amazônia brasileira durante o Pleistoceno, utilizando a topografia atual em função da elevação

do nível dos oceanos na cota de 120 m. As regiões mais altas da Amazônia estão circuladas: em

amarelo as cabeceiras dos rios de água branca e em azul claro as cabeceiras dos demais rios. Os

números indicam a localização das populações atuais. 1) Beruri-AM; 2) Caracaraí-RR, 3) Catalão,

Manaus-AM; 4) Cruzeiro do Sul-AC; 5) Floresta Nacional de Caxiuanã-PA; 6) Rio Japurá-AM; 7)

Rio Madeira-AM; 8) Paraná do Mapixi, Rio Purus-AM; 9); Tefé-AM; 10) Tabatinga -AM (margem

esquerda); 11) Tabatinga-AM (margem direita). A área em azul representa as regiões alagadas. O

mapa foi gerado utilizando-se como ferramenta o programa Global Mapper Software LLC

(http://www.globalmapper.com, 2007).

Os dados obtidos com marcadores de DNA (microssatélites e seqüências de regiões

não-codificadoras) do genoma do cloroplasto de P. munguba indicam então, a possível

existência de um evento moderado de introgressão marinha, ocorrido na Amazônia

brasileira, provavelmente no final do Plioceno ou durante o Pleistoceno, levando à

formação do Lago Amazônico. Populações localizadas em cotas altitudinais mais altas,

como a amostrada em Cruzeiro do Sul (173 m), provavelmente mantiveram-se mais

estáveis e exibem, no tempo atual, uma maior diversidade haplotípica. As populações da

espécie situadas em trechos do curso médio dos rios Japurá, Juruá, Purus, Madeira e

Branco, foram mantidas em função da intensidade da elevação ou, no caso de serem

eliminadas, tiveram um maior tempo para a recolonização. Essa elevação no nível das

águas provavelmente causou a eliminação das populações de P. munguba situadas ao

longo da calha central dos rios Solimões e Amazonas. Com a volta do curso normal dos

rios e a formação das áreas de várzea em sua conformação atual, esses habitats foram

recolonizados, possivelmente a partir de um ou poucos indivíduos de uma das populações

sobreviventes, resultando na existência de um único haplótipo ao longo da calha central,

em função do efeito fundador. A dispersão ao longo dos rios Solimões e Amazonas em

direção ao estuário, pelo haplótipo fundador, pode ter se originado em Cruzeiro do Sul -

AC, Tabatinga - AM, Tefé - AM ou Rio Madeira - AM, que apresentam este mesmo

haplótipo, mas para uma conclusão mais concreta seriam necessárias análises com base em

mais marcadores moleculares e populações.

Ainda são poucos os estudos filogeográficos em plantas realizados na Amazônia

(Caron et al., 2000; Dick et al., 2003; Dutech et al., 2003, Cloutier et al., 2005; Dick et al.,

2007). Dois deles restringem-se a pequenas áreas geográficas (Caron et al., 2000; Dutech

et al., 2003), enquanto os outros três (Dick et al., 2003; Cloutier et al., 2005; Dick et al.,

2007) destacam-se por serem bem mais abrangentes, cobrindo uma ampla área da região

Amazônica, permitindo assim a discussão de algumas hipóteses biogeográficas na

Amazônia.

Dick et al. (2003), utilizando seqüências do espaçador ribossomal (ITS) em um

estudo filogeográfico com populações de Symphonia globulifera localizadas na América

Central, Amazônia e África, atribuíram a expansão da espécie entre continentes à dispersão

marinha e a diferenciação regional encontrada, principalmente na América Central, à

heterogeneidade geográfica local. Apesar de existirem registros fósseis para a espécie

datando de 15 Ma, os autores não encontraram nenhuma variação entre as populações

localizadas na bacia Amazônica e atribuem esse fato a uma expansão recente da espécie na

região ou a um extensivo fluxo gênico atual.

Cloutier et al. (2005), estudando o efeito da dispersão hidrocórica em Carapa

guianensis utilizando marcadores PCR-RFLP, encontraram uma forte estrutura

populacional regional para a espécie e sugerem uma colonização da bacia Amazônica a

partir de múltiplas fontes. Os autores observaram que os haplótipos mais diferenciados

foram encontrados nas áreas mais altas (localizadas no Escudo das Guianas e no Escudo

Brasileiro) e atribuem este fato aos eventos de introgressão oceânica ocorridos no Terciário

e Quaternário.

Dick et al. (2007), estudando a filogeografia de Ceiba pentandra na América do

Sul, América Central e África, encontraram pouca variação em seqüências do espaçador

ribosomal (ITS) e somente dois haplótipos em seqüências de regiões não codificadoras do

genoma de cloroplasto (psbB-psbF). Eles descartam a ocorrência de eventos vicariantes na

espécie, atribuindo sua ampla expansão geográfica a eventos de dispersão a longas

distâncias, da América do Sul para a África, por vento ou correntes marinhas.

A pouca variação genética encontrada nessas três espécies (S. globulifera, C.

guianensis e C. pentandra) ao longo da bacia Amazônica e a alta diferenciação encontrada

nos haplótipos de C. guianensis nas regiões mais altas também poderiam ser explicadas

pelos eventos de introgressão oceânicas e a formação do lago Amazônico, como sugerido

aqui para P. munguba. Com o alagamento das áreas mais baixas, as populações dessas

espécies seriam eliminadas, isolando aquelas populações remanescentes nas áreas mais

altas, permitindo assim o acúmulo de mutações e a diferenciação de haplótipos (C.

guianensis; Cloutier et al., 2005). A volta do leito dos rios a seus níveis atuais

possibilitaria a recolonização, extremamente recente, da Amazônia a partir das áreas mais

altas, levando a uma baixa variação genética por efeito fundador. Além disso, Dick et al.

(2007) sugerem que a fonte de dispersão de C. pentandra da América do Sul para a África

seja localizada na Guiana Francesa, uma das áreas mais altas da Amazônia e, portanto, não

atingidas pelo alagamento.

Dessa forma, os estudos sobre a filogeografia de espécies de plantas neotropicais de

ampla distribuição na Amazônia (Dick et al., 2003; Cloutier et al., 2005; Dick et al., 2007,

presente estudo) parecem concordar e os resultados alcançados corroboram a hipótese do

Lago Amazônico como determinante na estruturação genética de suas populações.

VI. CONCLUSÃO

No presente estudo foram apresentados os padrões de distribuição da variabilidade

genética e a filogeografia da P. munguba na Amazônia brasileira a partir dos quais foi

possível concluir que:

• Marcadores microssatélites do genoma de cloroplasto mostraram-se como uma

ferramenta extremamente útil, possibilitando a realização de análises populacionais e

filogeográficas para P. munguba.

• O grande número de haplótipos exclusivos observados com os marcadores

microssatélites do genoma de cloroplasto, comparando com o número de haplótipos

compartilhados por mais de uma população, sugerem um fluxo gênico materno atual

bastante restrito ou até ausente entre as populações de P. munguba, considerando a ampla

distribuição desta espécie na Amazônia. A utilização de marcadores moleculares de

herança bi-parental seria importante para a realização de análises populacionais mais

abrangentes.

• A pouca variação encontrada tanto nos marcadores microssatélites quanto nas

seqüências do genoma de cloroplasto indicam que a história de colonização de P. munguba

na Amazônia brasileira é recente, iniciando provavelmente durante o Pleistoceno ou

Holoceno.

• A maior variação encontrada na população de Cruzeiro do Sul - AC, localizada em

uma das áreas mais elevadas da Amazônia brasileira, em relação ao nível do mar, indica

que essa é a mais antiga entre as populações amostradas.

• A total ausência de polimorfismos, mesmo em marcadores altamente variáveis

como os microssatélites de cloroplasto, encontrada nas três populações (Beruri - AM,

Catalão - AM e Caxiuanã -AM) da calha central Solimões/Amazonas indicam que essas

populações foram formadas muito recentemente. Tal formação provavelmente ocorreu pela

rápida colonização por efeito fundador a partir de uma única linhagem.

• Os resultados obtidos a partir de marcadores microssatélites e seqüências do

genoma de cloroplasto de P. munguba corroboram a hipótese biogeográfica do Lago

Amazônico como determinante na estruturação genética das populações dessa espécie na

Amazônia brasileira. Além disso, sugerem um recente evento moderado de introgressão

marinha, ocorrido durante o Plioceno ou Pleistoceno, que provavelmente levou à formação

do Lago Amazônico, mantendo estáveis as populações localizadas nas regiões mais altas.

Dependendo do nível das águas, as populações situadas em regiões de altitudes médias

podem ter sido mantidas, ou destruídas e recriadas paulatinamente. Já as populações

situadas das áreas mais baixas foram totalmente eliminadas e as regiões recolonizadas

muito recentemente.

• Um aumento no número de indivíduos de P. munguba amostrados por população

pode levar à identificação de um maior número de haplótipos, com base na análise de

marcadores microssatélites do genoma de cloroplasto, incrementando as análises. Além

disso, a análise de um maior número de populações, localizadas especialmente nas

cabeceiras dos principais rios tributários do Amazonas e além das fronteiras brasileiras,

poderá fornecer dados importantes para um melhor esclarecimento da história de

colonização da espécie na Amazônia.

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