( PDF ) Filogeografia do gênero neotropical fluviphylax (cyprinodontiformes: poeciliidae) das bacias do amazonas e do orinoco

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Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia – INPA

Universidade Federal do Amazonas – UFAM

Programa de Pós-Graduação em Biologia Tropical e Recursos

Naturais – PPGBTRN

FILOGEOGRAFIA DO GÊNERO NEOTROPICAL Fluviphylax

(CYPRINODONTIFORMES: POECILIIDAE) DAS BACIAS DO

AMAZONAS E DO ORINOCO

EDUARDO RODRIGUES DE SOUZA

Manaus, Amazonas

Setembro, 2008

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Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia – INPA

Universidade Federal do Amazonas – UFAM

Programa de Pós-Graduação em Biologia Tropical e Recursos

Naturais – PPGBTRN

FILOGEOGRAFIA DO GÊNERO NEOTROPICAL Fluviphylax

(CYPRINODONTIFORMES: POECILIIDAE) DAS BACIAS DO

AMAZONAS E DO ORINOCO

ORIENTADOR: PhD. TOMAS HRBEK

Co-orientadora: Dra. Izeni Pires Farias

Manaus, Amazonas

Setembro, 2008

Dissertação apresentado ao Programa

Integral de Pós-Graduação em Biologia

Tropical e Recursos Naturais (PIPG-

BTRN), do convênio INPA/UFAM, como

parte dos requisitos para obtenção do título

de Mestre em Ciências Biológicas, área de

concentração em Genética, Conservação e

Biologia Evolutiva.

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iii

FICHA CATALOGRÁFICA

S729f Souza, Eduardo Rodrigues de

Filogeografia do gênero neotropical Fluviphylax (Cyprinodontiformes: Poeciliidae)

das bacias do Amazonas e do Orinoco/Eduardo Rodrigues de Souza. – Manaus:

INPA/UFAM, 2008

xvi + 123f.: il., (algumas color)

Dissertação de Mestrado – INPA/UFAM.

Orientador: Dr. Tomas Hrbek

Co-orientadora: Dra. Izeni Pires Farias

Área de concentração: Genética, Conservação e Biologia Evolutiva.

1- Filogenia, 2- Fluviphylax, 3- Sistemática. I. título

CDD 19

ed. 597.929811

SINOPSE

Estudou-se a sistemática filogenética e filogeografia das espécies do gênero

Fluviphylax utilizando a associação das ferramentas moleculares, gene COI e região

controle do DNA mitocondrial, e métodos baseados em dados morfométricos e

morfológicos. No presente estudo foi possível evidenciar os processos que

influenciaram a distribuição geográfica das linhagens do gênero Fluviphylax e suas

relações filogenéticas e identificação de uma nova espécie para o gênero.

Palavras-chave:

Filogenia, Fluviphylax, gene COI, DNA mitocondrial, Sistemática,

Filogeografia, Região Controle

Aos meus pais, Altides R. de Souza e Marlene G. de Souza

Aos meus irmãos Altides R. S. Junior e Felipe R. Souza

À minha querida Mayara L. F. Rocha

À minha tia Eroni R. de Souza

AGRADECIMENTOS

Agradeço em especial aos meus queridos pais, Altides Rodrigues de Souza e

Marlene Gloria de Souza pelos valiosos ensinamentos e incondicional apoio.

Obrigado por acreditarem nos meus sonhos, permitindo que os tornasse realidade.

Mesmo longe, vocês sempre estiveram presentes em todos os momentos da minha

vida. Dedico a vocês mais esse grande momento em minha vida. Agradeço a todo

instante por tê-los como pais e exemplo de vida, OS AMO MUITO.

Aos meus maninhos Junior e Felipe pela agradável convivência e pelas

confidencialidades e apoio. Obrigado pela compreensão e paciência nos momentos

difíceis de que necessitei de silêncio e concentração. E “valeu” pelos momentos

inesquecíveis que tivemos juntos e por muitos que teremos ainda.

À tia Ero pelo fundamental apoio em toda minha caminhada estudantil,

ajudando na aquisição de livros e preciosas informações e táticas para passar na

sonhada UFMG. Saber que você acredita em mim foi importante para seguir sempre

lutando. Sua ajuda foi imprescindível para minha chegada até aqui. Dedico a você

mais essa conquista.

À minha querida Mayara - Meu Bem – pelo carinho e amor dedicado. A

distância pode causar saudades e afastar dois olhares, mas nunca causar o

esquecimento e a separação dos nossos corações. Obrigado pela compreensão,

ajuda e presença, mesmo com tamanha distância física.

Agradeço aos amigos Alexandre, Fernanda e Rodrigo pelo acolhimento em

Manaus e companheirismo. Durante esse tempo, formamos uma família e como uma

boa família mineira não deixamos faltar o apreciado doce de leite e a famosa

cachaça mineira tão apreciada por nossos amigos em Manaus.

Ao Nelson Flausino (Junior) amigo e companheiro de república. Morar com

essa figura ímpar e cômica foi bastante divertido. Quando você está presente tudo

pode acontecer, até mesmo o impossível, diríamos que você é o desastre em

pessoa. Mesmo com suas músicas chatas e o mau humor ao acordar foi bom dividir

a república, e assim você se tornou um grande amigo. Obrigado pela ajuda e

amizade, sucesso no doutorado.

Aos amigos César, Letícia e ao pessoal da Bio/UFMG que mesmo longe

sempre mantiveram contato, transmitindo alegria e motivação.

Agradeço a todos os amigos do laboratório LEGAL pela ajuda e trabalho em

equipe, principalmente nas noites de sábado e domingo de intenso trabalho. À

Natasha pela ajuda indispensável nas coletas e pela grande dedicação e força de

vontade fundamental nos momentos difíceis que passamos durante as viagens, que

nem mesmo a malária conseguiu abalar. Ao William e Daniel pela ajuda teórica e no

manuseio dos complicados softwares para análise dos dados.

Aos orientadores Tomas e Izeni pelo acolhimento e entusiasmo. Entusiasmo

esse contagiante e perceptível em seus olhos. Agradeço imensamente por

aceitarem me orientar e a imensa paciência que tiveram comigo. Orientar é uma

tarefa difícil que exige muita paciência, dedicação e compreensão, e essas

qualidades vocês sempre as tiveram. Sinto-me honrado por participar da equipe do

LEGAL, que antes de tudo é uma grande família.

Agradeço aos moradores e ribeirinhos de cada local que passei pela

Amazônia. Pessoas simples e humildes sempre dispostas a ajudar e dividir o pouco

que têm. Dedico a vocês esse trabalho, do qual também participaram. Espero ter

contribuído para aumentar nossos conhecimentos sobre a Amazônia e que essa

informação junto a tantas outras possa ajudar na sua conservação.

vii

Agradeço a Stuart Willis, Janice Cunha e Dr. Jansen Zuanon pelo material

biológico cedido, e ao Dr. José Gomes pela possibilidade das coletas através de sua

excursão no Médio e Alto rio Negro.

Agradeço ao programa de Pós-Graduação em Biologia Tropical e Recursos

Naturais do convênio INPA/UFAM, ao curso de Genética, Conservação e Biologia

Evolutiva (GCBEV) do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia.

Agradeço a Universidade Federal do Amazonas pela utilização do Laboratório

de Evolução e Genética Animal (LEGAL) coordenado pela professora Izeni Pires

Farias.

Agradeço ao CNPq pela concessão da bolsa de estudos e ao programa

BECA (Instituto Internacinal de Educação do Brasil - IEB) e a fundação The George

Maier Fund de American Killifish Association pelo financiamento desse projeto. Ao

IBAMA pela colaboração expedindo as licenças para as coletas.

viii

RESUMO

A sistemática e taxonomia do gênero Fluviphylax foi conduzida utilizando a

associação das ferramentas moleculares, gene COI e região controle do DNA

mitocondrial, e métodos baseados em dados morfológicos. Adicionalmente, a

filogeografia e a genética de populações das espécies de Fluviphylax baseando-se

em segmentos do gene COI e região controle do DNA mitocondrial foram estudadas

para compreender os processos ecológicos e eventos históricos que atuaram e

atuam sobre essas espécies. Os espécimes de Fluviphylax analisados nesse

trabalho distribuem-se ao longo das bacias Amazônica e Orinoco, e nos afluentes

dos rios do estado do Amapá e Ilha de Marajó. Nesse estudo foi proposta uma

hipótese filogenética, baseada nos dados moleculares, para as espécies do gênero

Fluviphylax, assim como, foi identificado uma nova espécie que habita o alto rio

Negro e a bacia do Orinoco (Venezuela). A hipótese filogenética obtida é

concordante com trabalhos prévios baseados em morfologia, no entanto, não foi

possível resolver as relações de parentesco evolutivo entre as espécies Fluviphylax

sp., F. zonatus, F. pygmaeus e F. simplex. Os estudos filogeográficos indicaram a

existe de seis regiões geográficas distintas, as quais foram ocupadas por linhagens

monofiléticas e concordantes com a distribuição geográfica. A distribuição dos

Fluviphylax é influenciada por processos como o sistema de inundação da área da

várzea, a diferenciação limnológica das drenagens e os aspectos geológicos de

formação dos rios. Acredita-se que o ancestral comum dos Fluviphylax habitava

bacia Amazônica e as drenagens do Atlântico e apartir dessas localidades

dispersou-se para a bacia do Orinoco. Os estudos populacionais evidenciaram uma

forte estruturação das populações analisadas, com exceção das populações de F.

palikur e F. simplex localizadas respectivamente, nas drenagens do Atlântico (estado

do Amapá) e Ilha de Marajó, e ao longo da calha Solimões e Amazonas. Apesar da

Ilha de Marajó está separado do estado do Amapá pelo rio Amazonas, barreira física

à dispersão de F. palikur, as populações dessa espécie não apresentaram estrutura

populacional e houve o compartilhamente de haplótipos entre essas áreas. As

populações de F. simplex da calha Solimões/Amazonas se comportaram como uma

única população panmítica, provavelmente devido à influência do sistema de

inundações na região da várzea, que facilita a conexão entre as populações dos

organismos aquáticos que habitam essa área.

ABSTRACT

A systematic and taxonomic study of the genus Fluviphylax was conducted

using molecular methods, the COI gene and the control region of the mitochondrial

DNA, and morphological methods. Additionally, a phylogeographic and population

genetic study of Fluviphylax species was performed using the COI and control region

sequence data in order to understand ecological processes and historical events that

have acted on these species. The specimens analyzed in this study are distributed in

the Amazon and Orinoco basins, and in the drainages of the state of Amapá and on

the Marajó Island. This study resulted in the identification of a new species of

Fluviphylax located in the upper Negro River and the Orinoco basin of Venezuela,

and a phylogenetic hypothesis based on molecular characters was proposed for the

species of the genus Fluviphylax. The molecular phylogenetic hypothesis

corroborated the previously proposed phylogeny base on morphological characters;

however, the relationships between species of the clade formed by Fluviphylax sp.,

F. zonatus, F. pygmaeus and F. simplex were unresolved. Populational studies

indicated strong structuring among the analyzed localities with the exception of

populations of F. palikur and F. simplex located, respectivement, in Atlantic drainage

(Amapá state) and Marajó island, and along the main Solimões and Amazonas River

channels. Amazon river separates Marajó island from Amapá state and serves as a

physical barrier to F. palikur dispersion. Despite this fact, populations of this species

showed no populational structure and there has been sharing of haplotypes among

those areas. The F. simplex populations, distribuited in Solimões/Amazoans channel,

are behaving as one large panmictic population probably as a result of the annual

innundations of the várzea system which facilitates connectivity among populations

of the aquatic species inhabiting this region.

SUMÁRIO

FICHA CATALOGRÁFICA

iii

AGRADECIMENTOS

RESUMO

viii

ABSTRACT

LISTA DE TABELAS

xii

LISTA DE FIGURAS

xiii

LISTA DE APÊNDICE

xvi

INTRODUÇÃO GERAL

Gênero Fluviphylax 3

Distribuição e ecologia do gênero Fluviphylax 4

Relação filogenética das espécies de Fluviphylax 8

Marcadores moleculares 10

DNA mitocondrial: gene COI e região controle 12

CAPíTULO 1 – Filogenia e filogeografia do gênero Fluviphylax 14

1.0 - Introdução

1.1 - Objetivo

1.1.1 - Geral 16

1.1.2 - Específicos 16

1.2 - Material e métodos

1.2.1 - Área amostral e método de coleta 17

1.2.2 - Métodos moleculares 18

1.2.2.1 - Extração e amplificação do DNA 18

1.2.2.2 - Amplificação por reação em cadeia da polimerase (PCR) 19

1.2.2.3 - Purificação e seqüenciamento do produto da PCR 20

1.2.3 - Análise dos dados 20

1.2.3.1 - Edição e alinhamento das seqüências 20

1.2.3.2 - Análises filogenéticas 21

1.2.3.3 - Análises populacionais 22

1.2.3.4 - Rede de haplótipos e análise dos clados hierarquizados - NCA 23

1.3 - Resultados

1.3.1 - Reconstrução filogenética 24

1.3.2 - Análises populacionais 28

1.4 - Discussão

1.4.1 - Filogeografia 35

1.4.2 - Estrutura populacional dentro das espécies Fluviphylax 39

1.5 – Considerações finais

CAPíTULO 2 – Delimitação das espécies de Fluviphylax por meio de caracteres

morfomerísticos e moleculares

2.0 - Introdução

2.1 - Objetivo

2.1.1 - Geral 46

2.1.2 - Específicos 46

2.2 - Material e métodos

2.2.1 - Área amostral e método de coleta 47

2.2.2 – Extração de DNA genômico 48

2.2.3 – Amplificação por reação em cadeia da polimerase (PCR) 48

2.2.3.1 - Purificação e seqüenciamento do produto de PCR 49

2.2.3.2 - Edição e alinhamento das seqüências 49

2.2.4 – Medidas morfométricas e morfológicas 50

2.2.5 – Análise dos dados 51

2.2.5.1 - Análises filogenéticas 51

2.2.5.2 - Análises de agrupamento populacional (PAA) 52

2.2.5.3 - Análises morfométrica e morfológica 53

2.3 - Resultados

2.3.1 - Análises filogenéticas 53

2.3.2 – Análise de agrupamento populacional (PAA) 63

2.3.3 - Análises morfométricas 64

2.3.4 – Análises morfológicas 68

2.3.5 – Nota: morfologia externa da espécie F. palikur 72

2.4 - Discussão

2.4.1 - Relação filogenética do gênero Fluviphyalax 74

2.4.2 – Análises de agrupamento populacional (PAA) 76

2.4.3 - Distinção morfométrica e morfológica 78

2.4.4 - Morfologia externa de F. palikur 78

2.5 - Considerações finais

2.6 - Referências bibliográficas

2.7 - Apêndice

xii

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Índices de fixação a partir de análises do gene COI. Matriz de distância par-a-par Ф

(abaixo da diagonal), número efetivo de migrantes (Nm) entre as populações (acima da diagonal) e

AMOVA.................................................................................................................................................33

Tabela 2

- Índices de fixação a partir de análises da região controle. Matriz de distância par-a-

par Ф

(abaixo da diagonal), número efetivo de migrantes (Nm) entre as populações (acima

da diagonal) e AMOVA............................................................................................................33

Tabela 3 - Medidas de diversidade genética observadas para o gene COI do DNA mitocondrial de

Fluviphylax dos 125 indivíduos amostrados e separados em seis áreas macro-geográficas na bacia

Amazônica. N = número de indivíduos amostrados; S = número de sítios segregantes; NH = número

de haplótipos; Ĥ = diversidade gênica; π =diversidade nucleotídica de Nei.........................................34

Tabela 4 - Medidas de diversidade genética observadas para região controle do DNA mitocondrial de

Fluviphylax dos 134 indivíduos amostrados e separados em sete áreas macro-geográficas na bacia

Amazônica. N = número de indivíduos amostrados; S = número de sítios segregantes; NH = número

de haplótipos; Ĥ = diversidade gênica; π = diversidade nucleotídica de Nei........................................35

Tabela 5: Média da Composição de nucleotídeos em porcentagem e número de sítios informativos e

variáveis das seqüências analisadas....................................................................................................54

Tabela 6: Haplótipos gerados pelo programa Collapse1.2 a partir das seqüências do gene COI e

região controle (RC)..............................................................................................................................55

Tabela 7: Matriz de distância-p par-a-par inter e intra-específica gerados a partir das análises de MP

e MV para os conjuntos de dados do gene COI e região controle.......................................................63

Tabela 8: Número de sítios (caracteres) apomórficos únicos dos sítios variáveis do gene COI e região

controle..................................................................................................................................................64

Tabela 9: Correlação entre os componentes e os resíduos das variáveis morfométricas....................65

Tabela 10: Correlação entre componentes e variáveis dos caracteres morfológicos...........................69

Tabela 11: Medidas morfométricas da espécie F. palikur e localidade amostrada...............................73

xiii

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Características marcantes do gênero Fluviphylax: tamanho corporal e olho. (A) F.

pygmaeus, coletado no lago Piauí, cidade de Borba, Amazonas (Foto: Eduardo R. Souza); (B) F.

obscurus nadando na superfície do rio Ereré (rio Negro), em detalhe os olhos brilhantes (Fotos Fábio

O. Lira)...................................................................................................................................................04

Figura 2 - Habitat das espécies de Fluviphylax. Foto (A) lago as margem do rio

(02°07'21.1"N/50°53'29.5"'W), localizado entre a cidade de Calçoene e Tartarugalzinho, Amapá. (B)

Área inundada à margem da estrada, próximo à cidade de Tartarugalzinho, Amapá. Essa região é

constituída de extensas áreas de savanas, que inundam com a chuva. (C) margem do lago

Esperança, próximo à cidade de Santa Izabel do Rio Negro. A vegetação à margem da lagoa é

constituída por árvores de grande porte e mata fechada. (D) Área alagada ao lado de um riacho

localizado na cidade de Salvaterra, Ilha de Marajó. Ao redor encontra-se macrófitas e gramíneas

próximas à margem. (Fotos: Eduardo R. Souza & Tomas Hrbek)........................................................05

Figura 3 - Distribuição das espécies Fluviphylax conforme Costa (1996), Costa & La Bail (1999) e

Lasso et al. (2005). Os pontos representam as localidades-tipos das espécies de Fluviphylax. Em

azul, rio Negro próximo à cidade de Barcelos; vermelho, rio Negro no arquipélago de Anavilhanas;

verde, rio Madeiro próximo à cidade de Borba, amarelo, rio Amazonas próximo à cidade de Parintins;

e laranjado, rio Oiapoque, Amapá. O circulo vermelho destaca o canal do Cassiquiara. Mapa

modificado de Marilyn J. Weitzman.......................................................................................................07

Figura 4 - Espécies do gênero Fluviphylax (modificado de Costa (1996) e Costa & Le Bal (1999)).

Legenda: (A) F. pygmaeus; (B) F. obscurus; (C) F. simplex; (D) F. zonatus e (E) F. palikur................08

Figura 5 - Relação filogenética do gênero Fluviphylax, proposta por Costa (1996) e Costa & Le Bail

(1999). A tribo Procatopodini foi incluída como grupo irmão de Fluviphylacini (sensu Ghedotti, 2000).

Os caracteres sinapomórficos podem ser acompanhados no texto acima...........................................09

Figura 6 - Esquema do genoma mitocondrial típico de vertebrados. Em vermelho, região controle (D-

loop) e gene COI, alvo deste estudo. Em marrom, os 22 genes tRNA. Figura modificada de Hrbek &

Farias, 2008...........................................................................................................................................11

Figura 7 - Localidades amostradas para as espécies de Fluviphylax. Os pontos representados pela

mesma cor correspondem a uma mesma área macro-geográfica. No total foram representadas seis

áreas macro-geográficas: Alto rio Negro/Orinoco – rio Negro (Azul); Médio rio Negro – rio Negro

(Laranjado); Manaus – lago Tarumã e rio Preto da Eva (Rosa); Madeira – rio Madeira (Verde);

Solimões/Amazoans – rio Purus, Solimões, Amazonas e Trombetas (Vermelho); Amapá/Marajó –

drenagens do Atlântico, riacho próximo à Salvaterra e igarapé Copudas (Marron). Mapa modificado

de Marilyn J. Weitzman.........................................................................................................................18

Figura 8 - Árvore filogenética do gene Citrocromo Oxidase I, baseada no método de Máxima

Verossimilhança. Hipótese filogenética reconstruída usando o programa Treefinder (Jobb et al.,

2004), com robustez de 1000 replicas não paramétricas de bootstrap. O modelo evolutivo definido

pelo programa Modeltest foi o HKY + G. A seqüência do gene COI da espécie Rivulus hartii foi usada

como grupo externo, (acesso Genbank AF002619). O ponto vermelho indica a politomia entre os

clados Fluviphylax sp., F. simplex, F. pygmaeus e F. zonatus. As siglas representam as iniciais dos

nomes dos rios coletados e os números seguem a ordem de captura dos indivíduos coletados,

conforme organização do banco de dados da coleção.........................................................................26

Figura 9 - Árvore filogenética da região controle, baseada no método de Máxima Verossimilhança.

Hipótese filogenética reconstruída usando o programa Treefinder (Jobb et al., 2004), com robustez de

1000 replicas não paramétricas de bootstrap. O modelo evolutivo definido pelo programa Modeltest

foi HKY + G. A seqüência da região controle da espécie Phallichthys amates foi usada como grupo

externo (acesso Genbank DQ377041). As siglas representam as iniciais dos nomes dos rios

coletados e os números seguem a ordem de captura dos indivíduos coletados, conforme organização

do banco de dados da coleção..............................................................................................................27

xiv

Figura 10 - Rede de haplótipos geradas pelo NCA a partir das 125 seqüências do gene COI. Cinco

redes de haplótipos diferentes foram obtidas, dessas foram representadas somente as que

apresentaram significância estatística. A – rede de haplótipos da área Alto rio Negro/Orinoco

(Fluviphylax sp.) possui 12 haplótipos. B - rede de haplótipos da área Solimões-Amazonas (F.

simplex) possui 10 haplótipos. As siglas representam as iniciais dos nomes dos rios coletados e os

números seguem a ordem de captura dos indivíduos coletados, conforme organização do banco de

dados da coleção...................................................................................................................................29

Figura 11 - Rede de haplótipos geradas pelo NCA a partir das 134 seqüências da região controle.

Cinco redes de haplótipos diferentes foram obtidas. A – rede de haplótipos da área Amapá-Marajó (F.

palikur) contendo 12 haplótipos. B - rede de haplótipos da área Médio rio Negro (F. obscurus s.s.)

com 5 haplótipos. C - rede de haplótipos da área Madeira (F. pygmaeus) com 5 haplótipos. D - rede

de haplótipos das áreas Solimões/Amazonas (F. simplex) com 6 haplótipos. E - rede de haplótipos da

área Alto rio Negro/Orinoco (Fluviphylax sp.) com 4 haplótipos. As siglas representam as iniciais dos

nomes dos rios coletados e os números seguem a ordem de captura dos indivíduos coletados,

conforme organização do banco de dados da coleção.........................................................................30

Figura 12: Localidades amostradas para as espécies de Fluviphylax. Os pontos em azul representam

os locais amostrados de Fliviphylax sp.; amarelo, F. obscurus s.s.; rosa, F. zonatus; vermelho, F.

simplex; verde F. pygmaeus; e marrom, F. palikur. O circulo vermelho destaca o canal do

Cassiquiara. O mapa foi criado no Online Map Creations http://www.aquarius.geomar.de/omc/.........47

Figura 13: Relação filogenética reconstruída a partir de seqüências do gene Citocromo Oxidase I sob

os critérios de Máxima Parcimônia. Reconstrução filogenética realizada com 1000 buscas heurísticas

e adições aleatórias (random), implementando algoritmo Tree Bisection and Reconnection (TBR) com

1000 replicas de bootstrap. Reconstrução filogenética realizada apenas com seqüências

representando cada um dos haplótipos gerados pelo programa Collapse1.2, as freqüências de cada

haplótipo são mostradas na tabela 6. Como grupo externo foi utilizado a seqüência do gene COI da

espécie Rivulus hartii obtida no Genbank pelo acesso AF002619.......................................................59

Figura14: Relação filogenética reconstruída a partir de seqüências do gene Citocromo Oxidase I sob

os critérios de Máxima Verossimilhança. Hipótese filogenética reconstruída usando o programa

Treefinder (Jobb et al., 2004), com robustez de 1000 replicas não paramétricas de bootstrap. O

modelo evolutivo definido pelo modeltest foi o HKY85 + G. Como grupo externo foi utilizado a

seqüência do gene COI da espécie Rivulus hartii

obtida no Genbank pelo acesso

AF002619..............................................................................................................................................60

Figura 15: Relação filogenética reconstruída a partir de seqüências da Região Controle sob os

critérios de Máxima Parcimônia. Reconstrução filogenética realizada com 1000 buscas heurísticas e

adições aleatórias (random), implementando algoritmo Tree Bisection and Reconnection (TBR) com

1000 réplicas de bootstrap. Reconstrução filogenética realizada apenas com as seqüências de cada

um dos haplótipos gerados pelo programa Collapse1.2, as freqüências de cada haplótipo são

mostradas na tabela 6. Como grupo externo foi utilizado a seqüência da região controle da espécie

Phallichthys amates obtida no Genbank pelo acesso DQ377041.......................................................61

Figura 16: Relação filogenética reconstruída a partir de seqüências da Região Controle sob os

critérios de Máxima Verossimilhança. Hipótese filogenética reconstruída usando o programa

Treefinder (Jobb et al., 2004), com robustez de 1000 replicas não paramétricas de bootstrap. O

modelo evolutivo definido pelo modeltest foi HKY85 + G. Como grupo externo foi utilizado a

seqüência da região controle da espécie Phallichthys amates obtida no Genbank pelo acesso

DQ377041.............................................................................................................................................62

Figura 17: Gráficos de dispersão das variáveis residuais resumidos em componentes principais.

Caracteres morfométricos analisados: comprimento da cabeça (CC); altura do corpo (AC) e

comprimento total (CT)..........................................................................................................................66

Figura 18:

Quadrados mínimos (Least Squares Means). Efeito dos componentes principais (fatores)

sobre os clados filogenéticos, usando o modelo linear generalizado (generalized linear model).........67

Figura 19: Gráficos de dispersão dos componentes principais (fatores) 1; 2 e 3, dos caracteres

morfológicos, após resumidos em PCA.................................................................................................70

Figura 20: Quadrados mínimos (Least Squares Means). PCA dos fatores dos dados morfológicos em

relação aos clados formados pelas análises moleculares.....................................................................71

Figura 21: Desenho esquemático e foto da espécie F. palikur. A – desenho esquemático feito por

Costa & Le Bail (1999) a partir do holótipo, macho, 12,0 mm comprimento padrão (MZUSP 52941); B

– fotografia do espécime de 16,5 mm de comprimento total da espécie F. palikur, coletado próximo à

cidade de Calçoene, estado do Amapá (Foto Eduardo R. Souza)........................................................72

Figura 22: Hipótese de relações filogenéticas entre as espécies do gênero Fluviphylax. A,

reconstrução filogenética baseada em dados morfológicos proposta por Costa (1996) e Costa & Le

Bail (1999); B, filogenia baseada em seqüências do gene COI e região controle do DNA mitocondrial,

adaptadas a partir dos resultados propostos no presente trabalho......................................................75

xvi

LISTA DE APÊNDICE

Apêndice A – Localidades amostradas e georeferenciamento............................................................91

Apêndice B – Caracteres apomórficos das espécies de Fluviphylax baseados em seqüências do

gene COI...............................................................................................................................................92

Apêndice C - Caracteres apomórficos das espécies de Fluviphylax baseados em seqüências da

região controle.......................................................................................................................................99

Introdução Geral

Os sistemas fluviais neotropicais apresentam a maior drenagem do

mundo. A bacia Amazônica é o maior sistema dessa drenagem, possuindo uma

área de aproximadamente 7.050.000 km

, entrelaçada por inúmeros rios e

riachos dos mais variados tamanhos. Essa bacia compreende a região norte e

central do Brasil, parte da Venezuela, Colômbia, Equador, Peru e Bolívia (Sioli,

1984). A bacia do Orinoco é a terceira maior da América do Sul, com uma área

de 948.000 km

, situada a norte da bacia Amazônica e compreendendo todo o

território Venezuelano e a porção a leste da Colômbia (Lasso et al., 2004). O

Canal do Cassiquiara, também conhecido como Canal Casiquiare ou

Cachequerique, é um canal natural com 326 km de comprimento que se

desenvolve entre a margem esquerda do rio Orinoco, na Venezuela, e a

margem direita do rio Negro, afluente do rio Amazonas. O Cassiquiara interliga

duas das mais importantes bacias hidrográficas do mundo: a do Amazonas, a

maior do mundo e a do Orinoco, a terceira maior da América do Sul (Lundberg

et al., 1998; Pérez-Hernández & Lew, 2001; Lasso et al., 2004).

A ictiofauna de água doce da América do Sul e Central, região

Neotropical, apresentam a maior diversidade de peixes do mundo. Estima-se

que os peixes de água doce Neotropical compreendem 8.000 espécies dentre

as aproximadas 33.000 espécies de peixes existentes no mundo, equivalendo

a aproximadamente 24% de toda a diversidade de peixes mundial e um oitavo

de toda a biodiversidade dos vertebrados (Schaefer, 1998; Vari & Malabarba,

1998).

A bacia Amazônica apresenta a maior diversidade de ictiofauna de água

doce do mundo. As espécies são constituídas basicamente por grupos

recentes, sendo 43% Characiformes, 39% Suliriformes, 3% Gymnotiformes e

os 15% restante pelos Cyprinodontiformes e demais ordens (Roberts, 1972). A

grande diversidade da ictiofauna Neotropical, assim como de outros

organismos aquáticos, está intimamente relacionada à dinâmica de formação

dos rios (Lundberg et al., 1998; Montoya-Burgos, 2003). Esses eventos

paleogeográficos têm produzido variadas mudanças na distribuição e evolução

das espécies, diversidade e extinção da biota aquática (Lundberg et al., 1998;

Hubert & Renno, 2006).

Apesar dos esforços e do significante progresso na sistemática e

taxonomia a fim de compreender a diversidade neotropical (e.g. Costa, 1998a;

Malabarba et al., 1998; Reis et al., 2003; Kullander & Ferreira, 2006), há uma

lacuna no conhecimento sobre determinados grupos de peixes de água doce

neotropical. A compreensão sobre a evolução dessa ictiofauna permanece

limitada por obstáculos como: escassez de informações sobre as relações

filogenéticas dentro e entre os muitos grupos de peixes da região neotropical, e

a informação fragmentada quanto à diversidade ao nível específico da maioria

dos táxons habitantes dessa região (Vari & Malabarba, 1998). Segundo Vari &

Malabarba (1998), apesar da abordagem filogenética em níveis superiores,

numerosas questões permanecem sem respostas em níveis taxonômicos

inferiores para muitos grupos dentro das ordens Gymnotiformes e

Cyprinodontiformes e família Cichlidae.

Nas últimas décadas, muitos trabalhos têm sido publicados com o

objetivo de explicar os processos relacionados à origem e manutenção desta

biodiversidade. E nesse contexto, cada vez mais, é crescente o uso de

ferramentas moleculares para entender esses processos (e.g. Hrbek & Larson,

1999; Murphy & Collier, 1999; Lovejoy & de Araújo, 2000; Sivasundar et al.,

2001; Hubert & Renno, 2006; Lovejoy et al., 2006; Hrbek et al., 2007). Assim

como muitos trabalhos fundamentados em ferramentas moleculares,

principalmente em dados de DNA mitocondrial, vêm sendo empregados em

associação com dados morfológicos a fim de entender a taxonomia e

sistemática (Farias et al., 2000; Wiens & Penkrot, 2002; López Fernández et

al., 2005; Hrbek et al., 2006). Tendo em vista a importância dos processos que

geram a diversidade biológica e do conhecimento para avaliar a biodiversidade

da fauna de peixes de água doce, no presente trabalho estudou-se a filogenia e

filogeografia do gênero Fluviphylax. As taxonomias propostas do gênero

Fluviphylax é recente e baseada apenas em dados morfológicos (Costa, 1996;

Costa & Le Bail, 1999). No presente estudo as análises basearam-se em dados

morfológicos e em dois marcadores moleculares, a saber: gene Citocromo

Oxidase I e região controle do DNA mitocondrial.

Gênero Fluviphylax

As espécies do gênero Fluviphylax, também conhecidas popularmente

como “Barrigudinhos”, “Guaru” e “Killifish” (Lucinda, 2003), são os menores

vertebrados conhecidos da América do Sul. O adulto atinge comprimento

padrão de no máximo 22 mm, sendo o terceiro menor vertebrado do mundo.

Fluviphylax é endêmico das bacias do Amazonas e Orinoco e no rio Oiapoque,

distribuído desde o oeste da bacia Amazônica até a foz, a leste (Costa, 1996;

Costa & Le Bail, 1999).

O gênero Fluviphylax pertence à ordem Cyprinodontiformes e à família

Poeciliidae. Esse gênero é cladisticamente definido com base em 15

sinapomorfias, entre essas a miniaturização corporal e olhos extremamente

grandes, cerca de 50% do tamanho da cabeça (Costa, 1996). A história

taxonômica do grupo é simples e recente. A primeira espécie descrita e

alocada no atual gênero Fluviphylax foi Potamophylax pygmaeus. Myers (1955)

elegeu o gênero Potamophylax para abrigar a nova espécie, P. pygmaeus.

Entretanto, Potamophylax já existia como gênero e pertencia à ordem

Trichoptera. Diante disto, Whitley (1965) propôs o nome Fluviphylax em

substituição a Potamophylax.

O nome Fluviphylax se originou a partir da justaposição de fluvius, do

latim riacho ou rio, e phylax do grego guardar, designando ao gênero o termo

“guardar os rios”. Fluviphylax era um gênero monotípico até 1996, quando

Costa (1996) o revisou e descreveu três novas espécies: F. simplex, ocorrendo

ao longo dos afluentes do rio Purus, Solimões e Amazonas (cidade de Codajás

a Santarém) e rio Trombetas; F. zonatus, no baixo rio Negro (arquipélago de

Anavilhanas e Manaus); e F. obscurus, médio rio Negro (cidade de Barcelos).

Em 1999, Costa & Le Bail descreveram uma espécie adicional, Fluviphylax

palikur, ocorrendo na bacia do rio Oiapoque, fronteira entre a Guiana Francesa

e o estado do Amapá (Brasil). Atualmente, a diversidade conhecida para o

gênero Fluviphylax compreende cinco espécies: F. zonatus, F. palikur, F.

pygmaeus, F. obscurus e F. simplex (Myers, 1955; Costa, 1996; Costa & Le

Bail, 1999).

Distribuição e ecologia do gênero Fluviphylax

O gênero Fluviphylax é representado por pequenos peixes, em que o

adulto atinge comprimento padrão de 22 mm e os indivíduos podem alcançar a

maturidade sexual com 11 mm de comprimento padrão. Uma característica

marcante desse grupo é a presença de olhos extremamente grandes,

abrangendo 50% do tamanho da cabeça, que brilham radiantemente ao incidir

a luz solar (figura 1) (Costa, 1996).

Figura 1: Características marcantes do gênero Fluviphylax: tamanho corporal e olho.

(A) F. pygmaeus, coletado no lago Piauí, cidade de Borba, Amazonas (Foto: Eduardo

R. Souza); (B) F. obscurus nadando na superfície do rio Ereré (rio Negro), em

detalhe os olhos brilhantes (Foto: Fábio O. Lira).

Esses peixes habitam rios, igarapés ou lagos, sendo esses ambientes

encontrados em savanas (Amapá), mata de galeria (Amazonas) ou à margem

dos afluentes de grandes rios (Solimões, Negro e Amazonas). Os Fluviphylax

são nadadores de superfície e ficam em ambientes lênticos, além de serem

encontrados próximos as macrófitas (figura 2).

As espécies de Fluviphylax habitam ambientes bastante diferenciados.

As espécies F. obscurus, F. zonatus habitam as margens dos afluentes dos

rios, riachos, “igapós” e igarapés de água preta. Esses ambientes em sua

grande maioria estão localizados sob área de floresta. As espécies F. simplex e

F. pygmaeus habitam terrenos cobertos por mata e alagados (área de várzea),

igarapés e margens dos rios (figura 2). Diferente das demais espécies, F.

palikur habita pequenos riachos e áreas de savana alagada, localizado no

estado do Amapá e Ilha de Marajó. No período das chuvas, as áreas de savana

formam imensas áreas alagadas, porém, com baixa profundidade e expostas

diretamente à radiação solar. A fim de protegerem-se da radiação solar os

peixes escondem-se entre as relvas (figura 2B).

Figura 2: Habitat das espécies de Fluviphylax. Foto (A) lago as margem do rio

(02°07'21.1"N/50°53'29.5"'W), localizado entre a cidade de Calçoene e Tartarugalzinho, Amapá.

(B) Área inundada à margem da estrada, próximo à cidade de Tartarugalzinho, Amapá. Essa

região é constituída de extensas áreas de savanas, que inundam com a chuva. (C) margem do

lago Esperança, próximo à cidade de Santa Izabel do Rio Negro. A vegetação à margem da

lagoa é constituída por árvores de grande porte e mata fechada. (D) Área alagada ao lado de um

riacho localizado na cidade de Salvaterra, Ilha de Marajó. Ao redor encontra-se macrófitas e

gramíneas próximas à margem. (Fotos: Eduardo R. Souza & Tomas Hrbek).

Costa & Le Bail (1999) encontraram F. palikur próximo a macrófitas

aquáticas como Eichornia sp., Nymphaea sp. e Cabomba sp.. As macrófitas

aquáticas são componentes importantes da complexidade e heterogeneidade

de habitats, assim suportando comunidades biológicas diversas (Tonn &

Magnusson, 1982). Apresentam um papel central no fluxo de energia nos

ecossistemas, sendo importantes na cadeia trófica dos ecossistemas aquáticos

amazônicos (Botero et al., 2003; Petry et al., 2003). As macrófitas formam um

substrato onde algas e bactérias podem se desenvolver, detritos podem ser

depositados, servindo de alimento, e assim contribuindo para a abundância

local de invertebrados (Junk, 1973). Macrófitas também podem influenciar a

seleção de habitat e as relações ecológicas de peixes (Savino & Stein, 1989).

Peixes de pequeno porte freqüentemente utilizam as raízes e folhas das

macrófitas como refúgio contra a predação, onde essas estruturas vegetais

funcionam como uma barreira física e visual para predadores (Savino & Stein,

1989). A ocorrência de Fluviphylax está relacionada à presença de vegetação a

margem e a macrófitas, e em geral eles a utilizam como refúgio contra a

predação (obs. pess.). Goulding et al. (1988) relataram a presença de

Fluviphylax como presa de pequenos ciclídeos, assim como, observou que F.

obscurus alimentava-se de microalgas, detritos e invertebrados. Essa mesma

situação foi observada durante as coletas realizadas nesse trabalho.

As espécies Fluviphylax formam cardumes de até 50 indivíduos no lago

Ayapuá, rio Purus (obs. pess.). Esses também podem formar cardumes

multiespecíficos com pequenos caracídeos que ocorrem em simpatria (Costa &

Le Bail, 1999, obs. pess.). Em algumas ocasiões puderam-se observar

indivíduos de Fluviphylax nadando solitariamente em um pequeno lago à

margem do rio Negro (Comunidade de São Felipe, em São Gabriel da

Cachoeira, AM) (obs. pess.).

O gênero Fluviphylax distribui-se em duas principais bacias da América

do Sul, bacias do Amazonas e do Orinoco, e nas drenagens do Atlântico do

estado do Amapá (figura 3). As bacias do Amazonas e Orinoco são interligadas

pelo Canal Cassiquiara, canal natural de 326 km de comprimento que se

desenvolve entre a margem esquerda do rio Orinoco, na Venezuela, e a

margem direita do rio Negro, afluente do rio Amazonas, na fronteira entre a

Venezuela e a Colômbia. Os Fluviphylax estão distribuídos nos rios localizados

no estado do Amapá que não se conectam a bacia Amazônica (como os rios

Calçoene, Tartarugalzinho e Tartaruga Grande) e em tributários do rio

Oiapoque, o qual forma um limite natural e geográfico entre o Brasil e a Guiana

Francesa.

Figura 3: Distribuição das espécies Fluviphylax conforme Costa (1996), Costa & La Bail (1999)

e Lasso et al. (2005). Os pontos representam as localidades-tipos das espécies de Fluviphylax.

Em azul, rio Negro próximo à cidade de Barcelos; vermelho, rio Negro no arquipélago de

Anavilhanas; verde, rio Madeiro próximo à cidade de Borba, amarelo, rio Amazonas próximo à

cidade de Parintins; e laranjado, rio Oiapoque, Amapá. O circulo vermelho destaca o canal do

Cassiquiara. Mapa modificado de Marilyn J. Weitzman.

F. simplex ocorre desde a cidade de Codajás (rio Solimões) até a cidade

de Santarém (rio Amazonas), enquanto F. zonatus ocorre do arquipélago de

Anavilhanas a Manaus (baixo rio Negro). F. pygmaeus é endêmico da bacia do

rio Madeira, sendo coletado nas proximidades da cidade de Borba, Amazonas

(Costa, 1996). F. obscurus ocorre próximo à cidade de Barcelos/AM (Costa,

1996), porém, inventários faunísticos têm relatado a presença dessa espécie

na bacia do Orinoco (Arrington & Winemiller, 2003; Hoeinghaus et al., 2004;

Lasso et al., 2005). F. palikur distribui-se apenas na bacia do rio Oiapoque,

limite entre Brasil e Guiana Francesa (Costa & Le Bail, 1999).

Arco

Monte

Arco

Guru

F. obscurus

F. zonatus

F. simplex

F. pygmaeus

F. palikur

Relação filogenética das espécies de Fluviphylax

O gênero Fluviphylax pertence à tribo Fluviphylacini, subfamília

Procatopodinae e a família Poeciliidae. Fluviphylax está relacionado aos

poeciliídeos da América do Sul e Central e aos aplocheiliquitíneos da África

(Costa, 1996; Ghedotti, 2000). Essa relação baseia-se em características

como: macho maior que as fêmeas, em contraposição aos demais poecilídeos,

e ausência do osso parietal (Parenti, 1981).

O gênero foi cladisticamente definido por Costa (1996) com base em 15

sinapomorfias, a saber: olhos extremamente grandes, aproximadamente 50%

do tamanho da cabeça; miniaturização; ausência do vômer; processo dorsal da

maxila reduzido; ausência da cartilagem interarcual; ausência dos dentes do

quarto ceratobranquial; ausência do interhial; basihial alongado; pós-temporal

em forma de foice; porção anterior do opérculo estreito; nadadeira caudal com

17 a 20 raios; sistema sensorial cefálico reduzido; e melanóforos concentrados

na metade dorsal e ventral do corpo. Atualmente, a diversidade conhecida do

gênero Fluviphylax compreende cinco espécies descritas: F. simplex, F.

zonatus, F. pygmaeus, F. obscurus e F. palikur (Costa, 1996; Costa & Le Bail,

1999) (figura 4).

Figura 4: Espécies do gênero Fluviphylax (modificado de Costa (1996) e Costa & Le Bail (1999)).

Legenda: (A) F. pygmaeus; (B) F. obscurus; (C) F. simplex; (D) F. zonatus e (E) F. palikur.

A B

C D

O grupo monofilético constituído por F. zonatus, F. simplex e F.

pygmaeus compartilham a forma pontiaguda e alongada do processo do

cleitrum. Fluviphylax obscurus juntamente com outros poecilídeos possuem o

processo do cleitrum curto. F. simplex e F. pygmaeus são espécies irmãs

relacionadas devido à ausência da cartilagem rostral, estrutura presente nos

ciprinodontiformes, e à redução ventral do processo do pós-temporal, em

contraste ao processo alongado das espécies F. obscurus e F. zonatus (Costa,

1996).

Segundo Costa (1996) nenhuma autapomorfia foi encontrada em F.

obscurus, já os machos de F. zonatus apresentam de seis a 12 barras escuras

no corpo como autapomorfia. Em espécimes adultos de F. simplex, o canal do

sistema sensorial da cabeça é aberto, contrapondo-se aos outros Fluviphylax e

muitos ciprinodontiformes, em que o canal é aberto somente na fase juvenil. F.

pygmaeus apresenta cinco autapomorfias: mesetmóide subtriangular, processo

anterodorsal do pré-opérculo alongado, nadadeira pélvica do macho alongada,

nadadeira anal do macho alongada e presença de quatro raios

branquiostegais. Além do mais, F. pygmaeus é a única espécie com oito a 10

raios na nadadeira anal, número modal nove, mas essa característica não

representa um caráter apomórfico (Costa, 1996).

A hipótese de parentesco entre as espécies de Fluviphylax segundo

Costa (1996) e Costa & Le Bail (1999) é apresentada abaixo.

Figura 5: Relação filogenética do gênero Fluviphylax,

proposta por Costa (1996) e Costa & Le Bail (1999). A

tribo Procatopodini foi incluída como grupo irmão de

Fluviphylacini (sensu Ghedotti, 2000). Os caracteres

sinapomórficos podem ser acompanhados no texto

acima.

sina

omorfias

F. palikur distingui-se das demais espécies do gênero por uma mancha

preta precedida por uma mancha amarela na borda posterior da nadadeira

dorsal do macho. Outros caracteres plesiomórficos podem distinguir essa

espécie de suas congêneres como: 13 ou 14 raios na nadadeira anal, 27

escamas em série longitudinal, 29 ou 30 vértebras, origem da nadadeira dorsal

no começo da base do penúltimo raio da nadadeira anal, processo anterior

alongado e anteriormente dirigido do quinto ceratobranquial, porção média do

quarto ceratobranquial não reduzido, segundo faringo-branquial não reduzido,

sobreposição da porção dorsal do terceiro faringo-branquial (Costa & Le Bail

(1999).

Apesar da descrição de três novas espécies por Costa (1996) e uma por

Costa & Le Bail (1999) para Fluviphylax, baseado em dados morfológicos, a

distinção entre algumas espécies não são nitidamente observadas. Os

espécimes localizados no alto rio Negro e bacia do Orinoco, Venezuela, apesar

de serem identificados como F. obscurus em trabalhos de levantamento, esses

não foram examinados morfologicamente. Desta forma, analisou-se por meio

de testes estatísticos e análise de componente principal (PCA) os caracteres

sinapomórficos da morfologia externa e merísticos das espécies de Fluviphylax

proposto por Costa (1996) e Costa & Le Bail (1999).

Marcadores Moleculares

A delimitação de espécie e a reconstrução da relação filogenética das

espécies estão entre os maiores objetivos da sistemática e taxonomia. Além de

dados morfológicos, os marcadores moleculares vêm sendo vastamente

empregados na delimitação de espécies. Estudos recentes têm usado dados

de seqüências de DNA, principalmente análises de DNA mitocondrial (DNAmt),

em associação com dados morfológicos para estudar as variações em

espécies amplamente distribuídas e espécies crípticas (Wiens & Penkrot,

2002).

O genoma mitocondrial (DNAmt) dos vertebrados, em geral, consiste em

uma molécula circular de dupla fita, com tamanho de 15.000 a 17.000 pb

(pares de bases), aproximadamente 10

vezes menor que o genoma nuclear

(Ballard & Whitlock, 2004). O DNAmt constitui-se de 37 genes (figura 6), dos

quais 24 estão relacionados à maquinaria de tradução (22 RNA transportador e

2 RNA ribossômico) e 13 genes envolvidos em subunidades de proteínas da

cadeia transportadora de elétrons, onde os carboidratos e gorduras são

oxidados, gerando dióxido de carbono, água e ATP (Adenosina trifosfato). Em

adição a esses 37 genes, existe a região controle, que apresenta na porção

anterior um segmento conhecido como D-loop, que dispõem de uma região rica

em A+T que exerce controle sobre a replicação do DNAmt e transcrição do

RNA. O DNAmt apresenta características interessantes como a ausência, em

geral, de íntrons, DNA repetitivo, pseudogenes e regiões intergênicas (Avise,

1986; Avise et al., 1987; Ballard & Whitlock, 2004).

O DNAmt é considerado um excelente marcador molecular para a

análise genética por estar distribuído em uma variedade de organismos; pela

facilidade em isolá-lo; por possuir estrutura genética simples; por exibir simples

modo de transmissão genética, em geral, sem recombinação ou outros

rearranjos; por oferecer um conjunto de estados de caráter qualitativo onde

hipótese filogenéticas e análises microevolutivas podem ser inferidas; e por

apresentar rápida evolução em comparação ao DNA nuclear (Avise, 2000).

DNA mitocondrial

Arapaima gigas

16433 bp

Figura 6: Esquema do genoma mitocondrial típico de vertebrados. Em vermelho, região

controle (D-loop) e gene COI, alvo deste estudo. Em marrom, os 22 genes de tRNA. Figura

modificada de Hrbek & Farias, 2008.

Do ponto de vista filogenético o genoma mitocondrial é considerado um

único locus, devido ao fato de os caracteres estarem ligados genealogicamente

pelo modo de transmissão assexual da molécula, com genealogia materna

dentro e entre espécies (Avise, 1986; Avise, 2000).

Apesar das vantagens de se usar o DNA mitocondrial como marcador

molecular, alguns autores argumentam que a delimitação de espécie não pode

se basear apenas em dados de DNAmt (Moritz, 1994; Sites Jr. & Crandall,

1997). Esse argumento refere-se ao fato do DNAmt estar mais propenso a

sofrer introgressão, o que poderia resultar em uma significante diferença

genealógica entre a árvore do gene e a árvore da espécie (Ballard & Whitlock,

2004). Mesmo tendo a introgressão como uma desvantagem, o DNAmt

apresenta importantes características que contribuem para a delimitação de

espécies. Em vários casos análises de DNAmt têm mostrado uma resolução na

definição de espécies, que por muitas vezes não é resolvida por marcadores

nucleares e morfológicos (Hebert et al., 2003; Hebert et al., 2004). Tendo em

vista as vantagens do DNAmt, nesse trabalho foi utilizado marcadores

moleculares baseados em seqüências do gene COI e região controle do DNA

mitocondrial em associação com métodos baseados em dados morfológicos.

DNA mitocondrial: gene COI e região controle

Recentemente, tem sido proposto que a seqüência do gene citocromo

oxidase I (COI) possa servir como base para um sistema de identificação global

de animais, o DNA barcoding. O objetivo do DNA barcoding é relacionar

espécimes de posição taxonômica desconhecida em uma espécie e aumentar

a descoberta de novas espécies (Hebert et al., 2003; Moritz & Cicero, 2004). O

gene mitocondrial COI é uma subunidade do complexo citocromo oxidase, que

é parte da cadeia transportadora de elétrons. Esse gene foi escolhido por

apresentar seqüências nucleotídicas altamente conservativas, possibilitando o

estudo comparativo dessas seqüências entre espécies. A alta conservação da

seqüência do gene COI permite desenvolver iniciadores (primers) universais

com bastante sucesso (Palumbi, 1996). Devido a sua alta conservação, as

substituições de aminoácidos são raras dentro de espécies, mas salientes

mudanças são comuns quando comparado a outros genes do DNAmt com

poucas diferenças nas seqüências de aminoácidos. As seqüências do gene

COI são muito usadas para reconstrução filogenética de profundos ramos

evolutivos (Palumbi & Benzie, 1991).

A região controle é uma porção do DNAmt que não possui função

codificadora e em vertebrados e equinodermos possui uma região rica em A+T,

que apresenta seqüências específicas que determinam o início da replicação

da fita pesada do DNAmt e transcrição de ambas as fitas do DNAmt. Em

peixes, a região controle apresenta aproximadamente 1,1 quilopares de bases

com um domínio central conservado e duas porções ricas em A + T,

extremamente variáveis, nas extremidades 5’ e 3’ (Meyer, 1993). As regiões

conservadas da região controle são flanqueadas por regiões altamente

variáveis. Essas regiões variáveis contêm muitos sítios polimórficos, que vêem

sendo enfocados nos estudos populacionais de mamíferos (Palumbi, 1996). A

região controle apresenta alta taxa de substituição, possibilitando adquirir bons

dados para estudar a estrutura populacional e o nível de fluxo gênico entre as

populações de peixes (Santos et al. 2007). A taxa de substituição da região

controle é maior que a do gene COI, assim, adicionalmente aos estudos

populacionais e de fluxo gênico realizados, será possível comparar a

delimitação de espécie entre o gene COI e a região controle.

Nesse estudo, foram utilizadas seqüências do gene COI e da região

controle para realizar estudos populacionais e auxiliar na delimitação de

espécies do gênero Fluviphylax.

CAPÍTULO 1

Filogenia e filogeografia do gênero Fluviphylax

1.0 – Introdução

A filogeografia permite compreender os princípios e processos que

governam a distribuição geográfica das linhagens genealógicas, principalmente

a nível intra-específico (Avise, 1998; 2000). Sendo uma sub-disciplina da

biogeografia, a filogeografia enfatiza os aspectos históricos da distribuição

espacial contemporânea das linhagens. A análise e interpretação da

distribuição das linhagens requerem o conhecimento de genética molecular,

genética de população, filogenética, demografia, etologia e história geográfica

(Avise, 1998; 2000). Assim, análises filogeográficas dos organismos aquáticos

da bacia Amazônica refletem os processos biológicos e geológicos dessa

região.

Os estudos filogeográficos e genéticos das populações de organismos

aquáticos da bacia Amazônica concentram-se em espécies de grande porte e

de interesse econômico. Essas espécies incluem o peixe-boi, Trichechus

inunguis (Cantanhede et al., 2005), o jacaré-tinga, Caiman crocodilus (Farias et

al., 2004; Vasconcelos et al., 2006), o jacaré-açú, Melanosuchus niger (Farias

et al., 2004; de Thoisy et al., 2006; Vasconcelos et al., 2008), a tartaruga

gigante da Amazônia, Podocnemis expansa (Pearse et al., 2006), o pirarucu,

Arapaima gigas (Hrbek et al., 2005; Farias et al., 2007), o tambaqui, Colossoma

macropomum (Santos et al., 2007) e a dourada, Brachyplatystoma rousseauxii,

e a piramutaba, Brachyplatystoma vaillantii (Batista et al., 2005).

Todas estas espécies são excessivamente exploradas. Por exemplo, a

população do jacaré-açú foi reduzida a aproximadamente 10% do tamanho da

população original e essa atualmente se encontra fortemente fragmentada

(Ross, 1998; de Thoisy et al., 2006). O peixe-boi amazônico foi intensivamente

caçado quase chegando à extinção (Best, 1984). Similarmente, a tartaruga

gigante da Amazônia (Pearse et al., 2006) e o pirarucu têm sido explorados por

vários séculos, e mais fortemente neste último (Hrbek et al., 2005; Farias et al.,

2007). Esses eventos antropogênicos têm causado fortes efeitos demográficos,

gerando a diminuição do tamanho efetivo da população e ocasionando um

aumento do efeito da deriva genética nessas espécies (Pearse et al., 2006;

Farias et al., 2007). Além disso, os modelos filogeográficos observados nos

animais amazônicos freqüentemente refletem eventos antropogênicos afetando

os processos naturais (Hrbek et al., 2005; Pearse et al., 2006; Vasconcelos et

al., 2006) e obscurecendo o real processo natural que forma o modelo

filogeográfico dos vertebrados aquáticos da Amazônia.

Para se chegar a um modelo filogeográfico adequado, e ao

entendimento dos processos que dirigem esse modelo, é necessário estudar

organismos com ampla distribuição e que não tenham sido sujeitos à

exploração antropogênica, como é o caso dos pequenos peixes do gênero

Fluviphylax. Atualmente, a riqueza conhecida para o gênero compreende cinco

espécies: F. zonatus, F. palikur, F. pygmaeus, F. obscurus e F. simplex (Costa,

1996; Costa & Le Bail, 1999). Os Fluviphylax são nadadores de superfície, que

habitam ambientes de águas lênticas e áreas inundadas como a várzea.

Distribuídos pela bacia Amazônica e Orinoco, assim como, nos afluentes dos

rios do estado do Amapá e Ilha de Marajó, é de se esperar que a filogeografia

dos Fluviphylax reflita processos geológicos e biológicos que atuaram e atuam

nessas regiões. Por exemplo, a separação da Ilha de Marajó do estado do

Amapá, possivelmente influenciou na estrutura populacional do Fluviphylax

dessa região. Outro fator que pode atuar nos padrões filogeográficos do gênero

é o sistema de inundação de áreas como a várzea (Junk et al., 1989) que

permite maior interconexão biológica dos organismos que habitam essa região,

como relatado nos estudos de Colossoma macroponum (Araújo-Lima &

Goulding, 1998; Santos et al., 2007), Prochilodus nigricans (Farias et al., 2006),

Arapaima gigas (Hrbek et al., 2005), Brachyplatystoma rousseauxii e B.

vaillantii (Batista et al., 2005; Batista & Alves-Gomes 2006).

Dados filogeográficos são de grande importância para a conservação

das espécies, avaliação da biodiversidade e identificação de processos que

geram a diversidade biológica (Smith et al., 2001; Avise, 2004). Nesse estudo

foi analisado a filogeografia e a genética de população dos indivíduos das

espécies de Fluviphylax distribuídos ao longo da bacia Amazônica e Orinoco, e

nos afluentes dos rios do estado do Amapá e Ilha de Marajó (drenagem do

Atlântico) de modo a compreender os processos ecológicos e os eventos

históricos que atuaram e atuam sobre os organismos.

1.1 - Objetivo

1.1.1 - Geral

Avaliar as hipóteses filogenéticas e a filogeografia do gênero Fluviphylax para

entender os processos que influenciaram os padrões de distribuição de suas

espécies.

1.1.2 - Específicos

- Seqüenciar o gene COI e região controle do DNA mitocondrial;

- Correlacionar a hipótese filogenética proposta com a distribuição geográfica

das espécies de Fluviphylax;

- Propor uma hipótese filogeográfica para o gênero;

- Estimar os níveis de variabilidade genética presente em Fluviphylax;

- Verificar a presença ou ausência de fluxo gênico entre populações nos locais

coletados.

1.2 - Material e métodos

1.2.1 - Área amostral e método de coleta

Os espécimes de Fluviphylax foram coletados nos afluentes ao longo da

calha principal dos rios Negro, Solimões, Purus, Amazonas e Trombetas, na

Ilha de Marajó, nos afluentes dos principais rios do estado do Amapá (Brasil) e

no lago Laguna Larga na bacia do Orinoco (rio Cinaruco, Venezuela). Os dados

de georeferenciamento das localidades amostradas, com as respectivas

espécies coletadas estão representados no apêndice A. As localidades

amostradas foram agrupadas em seis regiões macro-geográficas: Alto rio

Negro/Orinoco, Médio rio Negro, Manaus, Solimões/Amazonas, Madeira,

Amapá/Ilha de Marajó. As regiões macro-geográficas foram definidas de

acordo com a distribuição de cada espécie. Para as espécies F. obscurus l.s.

(latu sensu), distribuídas no alto e médio rio Negro, foram estabelecidas duas

regiões macro-geográficas, uma para representar Fluviphylax sp. e a outra para

F. obscurus s.s. (strictu sensu). No mapa da figura 7, as regiões macro-

geográficas foram representadas por pontos com distintas colorações.

Os espécimes foram coletados com puçás de mão para aquário com

malhas de 5 mm de diâmetro. Os indivíduos forma anestesiados em solução de

MS-222 (Finquel) e em seguida preservados em etanol 95%, para

procedimento de análises laboratoriais. Em laboratório, os espécimes de cada

localidade amostrada foram previamente identificados seguindo os passos da

chave de identificação proposta por Costa (1996) e Costa & Le Bail (1999). O

material biológico foi depositado na Coleção de Tecidos de Genética

Animal/CTGA do Laboratório de Evolução e Genética Animal (LEGAL), Instituto

de Ciências Biológicas da Universidade Federal do Amazonas.

Figura 7: Localidades amostradas para as espécies de Fluviphylax. Os pontos representados

pela mesma cor correspondem a uma mesma área macro-geográfica. No total foram

representadas seis áreas macro-geográficas: Alto rio Negro/Orinoco – rio Negro (Azul); Médio

rio Negro – rio Negro (Laranjado); Manaus – lago Tarumã e rio Preto da Eva (Rosa); Madeira –

rio Madeira (Verde); Solimões/Amazoans – rio Purus, Solimões, Amazonas e Trombetas

(Vermelho); Amapá/Marajó – drenagens do Atlântico, riacho próximo à Salvaterra e igarapé

Copudas (Marron). Mapa modificado de Marilyn J. Weitzman.

1.2.2 - Métodos moleculares

1.2.2.1 - Extração de DNA genômico

Para cada exemplar, foi coletada uma pequena porção do tecido

muscular diretamente do pedúnculo caudal, assim, o DNA genômico total foi

extraído usando-se o método padrão de extração via fenol/clorofórmio

modificado de Sambrook et al. (1989). O tecido foi digerido em solução de

tampão de lise (Tris HCl 10 mM, EDTA 10 mM, SDS 1% e NaCl 0,3 M), SDS

Barcelos

São Gabriel da

Cachoeira

Lago Laguna LargaCinaruco,

Venezuela

Sta Izabel

Samauma e Kalafate

Reserva Amanã

Rio Solimões

Rio Branco

Lago Ayapuá -

Purus

Borba,

Rio Madeira

Manaus

Tombetas

Ig. Copudas

Salvaterra

Tartarugalzinho

Km 486

Santarém

Janauacá

Calçoene

10% e proteinase K (20 mg/µl). Em seguida, respectivas lavagens com solução

de fenol, fenol/clorofórmio/álcool isoamílico (25:24:1) e clorofórmio/álcool

isoamílico (24:1) foram realizadas para retirar as proteínas. A precipitação do

DNA procedeu-se utilizando etanol absoluto e posteriormente etanol 70%. O

DNA extraído foi quantificado, em transiluminador sob luz UV, por comparação

com marcador de peso molecular conhecido após eletroforese horizontal

padrão, em gel de agarose (Bioagency) 0,8% e corado com brometo de Etídeo

(EtBr, 0,5 µg/mL).

1.2.2.2 - Amplificação por reação em cadeia da polimerase (PCR)

O gene COI e a região controle do DNA mitocondrial foram amplificados

via reação em cadeia da polimerase (PCR) com os iniciadores (primers) COIf2

forward e COIr4 reverse desenvolvidos no presente trabalho para o gene COI.

Para a região controle foram utilizados os iniciadores Lprof 5'-

ACTCTCACCCCTAGCTCCCAAAG-3' forward e TDK-D 5’-

CCTGAAGTAGGAACCAGA-3’ reverse (Kocher et al., 1989).

As reações das PCRs para a região controle e gene COI foram

realizadas em um volume final de 25 µL contendo: 9,6 µL de água milli-q, 1,0

BSA (10 mg/mL), 2,4 µL de MgCl (25 mM), 3,0 µL de buffer 10X, 3,0 µL de

dNTP (10 mM), 1,5 µL de primer reverso (2 µM), 1,5 µL de primer forward (2

uM), 1,0 µL de Taq polimerase (5 U/µL) e 1,0 µL de DNA (~ 50 ng/µL). A

amplificação foi realizada nas seguintes condições: desnaturação inicial a 95°C

por 60 segundos; 35 ciclos para desnaturação a 94°C por 40 segundos,

hibridização a 50°C por 40 segundos, extensão a 72°C por 60 segundos e

extensão final a 72°C por 5 minutos.

As amplificações foram realizadas em termociclador PXE 0.2 Thermal

Cycler. O produto de PCR foi quantificado e visualizado, em transiluminador

sob luz UV, quanto à qualidade da reação após eletroforese em gel de agarose

(Bioagency) a 1,0%, e corado com brometo de Etídeo (EtBr, 0,5 µg/mL).

1.2.2.3 - Purificação e seqüenciamento do produto da PCR

O produto da PCR foi purificado usando-se o kit GFXTM PCR DNA Kit

(GE-Healthcare), e diluído em 20 µl de tampão de diluição. Os respectivos

iniciadores forward utilizados na amplificação de DNA também foram usados

na reação de seqüenciamento do gene COI e região controle. As reações de

seqüenciamento foram realizadas utilizando-se Kit de seqüenciamento

“DYEnamic

ET dye terminator Kit (GE-Healthcare). Os ciclos de reação de

seqüenciamento foram realizados em volume final de 10 μl contendo 4,0 μl de

DNA, 2,0 μl de primer a 0,2 μM e 2,0 μl do mix ET. Posteriormente as amostras

foram submetidas ao termociclador, com as seguintes condições: 35 ciclos com

desnaturação a 95°C por 20 segundos, hibridização a 55°C por 15 segundos e

extensão a 60°C por 60 segundos.

Os produtos amplificados do ciclo de seqüenciamento foram precipitados

usando-se a precipitação padrão por acetato de amônio/etanol. Posteriormente

esses produtos foram ressuspendidos em 10 μl de formamida Hi-Di e as

seqüências lidas no seqüenciador automático MegaBace 1000 (GE-

Healthcare).

1.2.3 - Análise dos dados

1.2.3.1 - Edição e alinhamento das seqüências

As seqüências do gene COI e região controle foram alinhadas no

programa Clustal W (Thompson et al., 1996) implementado no programa

BioEdit, usando-se as configurações padrão e editadas manualmente no

programa BioEdit 5.0.06 (Hall, 1999). Após a edição manual de cada

seqüência, foram acrescentados gaps aos sítios que apresentaram deleções

ou inserções (indels), com a finalidade de manter a homologia entre os sítios. A

falta de nucleotídeos no final de algumas seqüências foi tratada como sítios

sem informação (missing). Os sítios variáveis foram checados no programa

MEGA 4.0 (Kumar et al., 2004) e as seqüências alinhadas do gene COI foram

traduzidas em aminoácido para verificar a presença de códon de parada .

1.2.3.2 - Análise filogenética

As relações filogenéticas construídas sob o critério ótimo de Máxima

Verossimilhança para o gene COI e região controle foram estimadas usando-se

o programa Treefinder (Jobb et al., 2004), com robustez de 1000 replicas não

paramétricas de bootstrap. Os modelos de evolução molecular para o gene

COI e região controle foram determinados usando-se o critério de informação

Akaike (AIC) (Akaike, 1974) utilizando o programa Modeltest 3.7 (Posada &

Crandall, 1998). O melhor modelo evolutivo de substituição de nucleotídeos

determinado para o gene COI e região controle foi o modelo HKY (Hasegawa

et al., 1985) com sítios variáveis seguindo discreta distribuição gama (G).

As seqüências de 521 pb do gene COI de Rivulus hartii (acesso

Genbank AF002619) e a seqüência de 374 pb da região controle de

Phallichthys amates (acesso Genbank DQ377041) foram usadas como grupos

externos na reconstrução filogenética baseada no gene COI e região controle,

respectivamente, das espécies de Fluviphylax. As reconstruções filogenéticas

sob os critérios de Máxima Verossimilhança basearam-se em 125 seqüências

com 521 pb do gene COI, para quatro espécies de Fluviphylax. No total foram

obtidas seqüências de 125 indivíduos, sendo: 10 F. zonatus, 40 F. obscurus, 60

F. simplex e 15 F. pygmaeus. Nas análises do gene COI não foram incluídas

seqüências de F. palikur, localidades Amapá e Ilha de Marajó, pois os primers

utilizados foram inespecíficos, hibridizando-se a outras regiões do genoma

dessa espécie.

As reconstruções filogenéticas sob os critérios de Máxima

Verossimilhança basearam-se em 134 seqüências de 374 pb da região

controle. Foram obtidas seqüências de 134 indivíduos, sendo: 43 F. palikur, 35

F. obscurus, 44 F. simplex, 12 F. pygmaeus. As seqüências dos indivíduos

provenientes do rio Tarumã e de rio Preto da Eva, área macro-geográfica

Manaus, foram excluídas das análises da região controle devido à baixa

qualidade das mesmas.

1.2.3.3 - Análises populacionais

Por meio das seqüências do gene COI foram realizados estudos

populacionais de F. obscurus latu sensu (Fluviphylax sp. e F. obscurus) e F.

simplex. Os estudos populacionais de F. obscurus l.s. abrangeram 40

indivíduos distribuídos em duas populações, Alto rio Negro/Orinoco (n = 18) e

Médio rio Negro (n = 22). Para os estudos populacionais de F. simplex foram

analisados 60 indivíduos de quatro populações, rio Purus (n = 30), Reserva do

Amanã (n = 10), lago do Janauacá (n = 12) e Santarém/Trombetas (n = 8).

A partir das seqüências da região controle do DNA mitocondrial

realizaram-se os estudos populacionais de F. obscurus l.s., F. palikur e F.

simplex. O estudo de população de F. obscurus s.l. abrangeu 35 indivíduos

distribuídos em duas populações, Alto rio Negro/Orinoco (n = 35) e Médio rio

Negro (n = 16). Para F. palikur, 43 indivíduos distribuídos em quatro

populações foram estudados: rio Calçoene (n = 10), Km 486 (n = 14),

Tartarugalzinho (n = 9) e Ilha de Marajó (n = 10). Para F. simplex foram

analisados 44 indivíduos distribuídos em três populações, Santarém/Trombetas

(n = 7), lago Janauacá (n = 10) e rio Purus (n = 27).

O nível de variação genética intra-específico das amostragens acima

mencionadas foram medidas por meio do número de haplótipos observados em

cada população, dos índices de diversidade gênica (Ĥ) e diversidade

nucleotídica (π) calculados pelo método de Nei (1987) e número de sítios

segregantes (polimórficos). Adicionalmente foram estimados os níveis de

estruturação das subdivisões populacionais e os níveis de fluxo gênico (Nm),

inferidos a partir das comparações par-a-par dos valores obtidos de Ф

Análise de Variância Molecular (AMOVA), implementada no programa Arlequin

3.1 (Excoffier et al., 2005). A correção de Bonferroni (Rice, 1989) foi aplicada

para todas as análises que envolveram múltiplas comparações.

Realizou-se o teste D de Tajima (1989) e Fs de Fu (1997) para examinar

se as amostras de diferentes localidades estão em desequilíbrio de mutação-

deriva genética. Um desvio significante do equilíbrio genético do DNA

mitocondrial é pressuposto para uma recente expansão populacional ou

bottleneck em situações em que não há nenhuma vantagem seletiva entre os

haplótipos existentes. O teste de Tajima examina a relação entre o número de

sítios segregantes e a diversidade nucleotídica (Tajima, 1989). O teste Fs de

Fu, mais sensível ao efeito de seleção que o teste D de Tajima, baseia-se na

probabilidade de observar determinado número de alelos em uma amostra de

determinado tamanho, condicionado ao número médio observado das

diferenças par-a-par (Fu, 1997).

O teste de correlação entre a distância genética e a distância geográfica

não foi realizado nas análises populacionais desse estudo, pois o número de

populações estudadas para cada espécie não ultrapassou quatro populações,

comprometendo a confiabilidade do teste.

1.2.3.4 - Rede de haplótipos e análise dos clados hierarquizados - NCA

A rede de haplótipos e análise dos clados hierarquizados (NCA) foram

realizadas para as 125 seqüências do gene COI e para as 134 seqüências da

região controle. A rede de haplótipos foi construída baseada no método de

parcimônia estatística de Templeton et al. (1992). Esse método gera a

estimativa do número máximo de diferenças entre os haplótipos como

resultado de substituições únicas com confiabilidade estatística de 95%

(Posada & Crandall, 2001). Essas análises foram implementadas no programa

TCS (Clement et al., 2000). As ambigüidades de conexões resultantes das

mutações homoplásticas foram resolvidas usando-se as informações da

topologia de Máximo Verossimilhança.

A hierarquização da rede de haplótipos foi construída baseada no

método de parcimônia estatística, utilizando o algoritmo descrito por Templeton

et al. (1987) e Templeton & Sing (1993). A distância geográfica entre as áreas

macro-geográficas foram medidas a partir do ponto médio de cada região

macro-geográfica, seguindo o curso dos rios utilizando o programa Arcview GIS

3.2. Para inferir a existência de associação significante entre as distâncias

geográficas e a rede de haplótipo, como resultado dos níveis de restrição de

fluxo gênico, foi usada a análise dos clados hierarquizados (Nested Clade

Analysis - NCA) desenvolvido por Templeton et al. (1995) e implementado no

programa GEODIS 2.4 (Posada et al., 2000). A partir da genealogia gênica,

freqüência de haplótipos e distâncias geográficas, o NCA gera inferências que

permitem discriminar eventos históricos (e.g. fragmentação, expansão, etc.) e

processos atuais (e.g. fluxo gênico). A interpretação dos dados seguiu a chave

de inferência de Templeton (2004).

1.3 - Resultados

1.3.1 - Reconstrução filogenética

Para o gene mitocondrial COI obteve-se um de total 521 pb para 125

indivíduos do gênero Fluviphylax, enquanto que para a região controle foram

obtidos 374 pb para 134 indivíduos. A composição das bases de nucleotídeos

das seqüências do gene COI e região controle apresentaram proporção de

bases anti-guanina. Tanto para o gene COI (A = 25.4%, G = 18.5%, T = 32.9%,

C = 23.2%) como para a região controle (A = 32.9%, G = 15.7%, T = 33%, C =

18.4%) a base timina (T) apresentou-se em maior proporção em relação às

demais bases.

A hipótese filogenética baseada no método de Máxima Verossimilhança

(MV) das seqüências do gene COI e região controle apresentaram resultados

semelhantes. Nas análises do gene COI não foram incluídas as seqüências de

F. palikur, localidades Amapá e Ilha de Marajó, pois os primers utilizados foram

inespecíficos, hibridizando-se a outra região do genoma dessa espécie. As

seqüências dos indivíduos provenientes do rio Tarumã e do rio Preto da Eva,

área macro-geográfica Manaus, foram excluídas das análises da região

controle devido à baixa qualidade das seqüências.

Na hipótese filogenética para o gene COI e região controle foram obtidos

seis clados distintos e bem suportados, dentre as seis áreas macro-

geográficas. Os clados obtidos foram os representados por Fluviphylax sp.

(Alto rio Negro/Orinoco - Fluviphylax obscurus latu sensu); Fluviphylax

obscurus (Médio rio Negro - Fluviphylax obscurus strictu sensu); F. pygmaeus

(Madeira); F. simplex (Solimões/Amazonas); F. palikur (Amapá/Marajó) e F.

zonatus (Manaus) (figura 8 e 9).

Nas hipóteses filogenéticas, os espécimes de Fluviphylax do rio Orinoco,

Alto rio Negro e Médio rio Negro foram agrupados em dois clados bem

suportados: Fluviphylax sp. (Alto rio Negro e rio Orinoco) e F. obscurus s.s.

(Médio rio Negro). Os clados Fluviphylax sp. (Alto rio Negro/Orinoco) e F.

obscurus s.s. (Médio rio Negro) apresentaram suporte de bootstrap de 95% e

96%, respectivamente, baseados nos dados do gene COI e bootstrap de 99% e

66%, respectivamente, em relação aos dados da região controle (figura 8 e 9).

A partir dos resultados da hipótese filogenética baseada no gene COI e região

controle foi possível evidenciar uma nova espécie para o gênero Fluviphylax.

Essa nova espécie, Fluviphylax sp., distribui-se na área macro-geográfica Alto

rio Negro/Orinoco e foi mais relacionada à espécie F. simplex, distribuída na

área macro-geográfica Solimões/Amazonas, do que à espécie F. obscurus s.s.

(Médio rio Negro). Apesar do baixo valor de bootstrap, Fluviphylax sp. e F.

simplex formaram um grupo monofilético na hipótese filogenética proposta a

partir do gene COI e região controle. Esse grupo monofilético foi relacionado ao

clado formado pelas espécies F. zonatus (Manaus) e F. pygmaeus (Madeira) e

juntos apresentaram uma politomia (figura 8).

F. zonatus foi restrita a área macro-geográfica de Manaus e apresentou

valores de bootstrap de 100% na hipótese filogenética a partir do gene COI. Na

área do Amapá/Marajó foram encontrados apenas indivíduos da espécie F.

palikur, que formaram um clado bem suportado com valor de bootstrap de

100% nas análises da região controle. A região macro-geográfica

Solimões/Amazonas (Amaná-Purus-Janauacá-Santarém-Trombetas), onde os

extremos correspondem a uma área de aproximadamente 1400 km de

extensão, apresentou apenas indivíduos da espécie F. simplex (figura 7).

F. pygmaeus foi encontrada apenas na área macro-geográfica do

Madeira e formou um único clado monofilético bem suportado com valores de

bootstrap de 99% e 100% para o gene COI e região controle, respectivamente.

Figura 8: Árvore filogenética do gene Citrocromo

Oxidase I, baseada no método de Máxima

Verossimilhança. Hipótese filogenética reconstruída

usando o programa Treefinder (Jobb et al., 2004),

com robustez de 1000 replicas não paramétricas de

bootstrap. O modelo evolutivo definido pelo programa

Modeltest foi o HKY + G. A seqüência do gene COI

da espécie Rivulus hartii foi usada como grupo

externo, (acesso Genbank AF002619). O ponto

vermelho indica a politomia entre os clados

Fluviphylax sp., F. simplex, F. pygmaeus e F.

zonatus. As siglas representam as iniciais dos nomes

dos rios coletados e os números seguem a ordem de

captura dos indivíduos coletados, conforme

organização do banco de dados da coleção.

Fluviphylax sp.

Área macro-geográfica:

Alto rio Negro/Orinoco

(Sta. Izabel + São Gabriel + rio Orinoco-

Venezuela)

F. simplex

Área macro-geográfica:

Solimões/Amazonas

(Reserva Amanã + Purus + Lago

Janauacá + Trombetas + Santarém)

F. zonatus

Área macro-geográfica: Manaus

(rio Rio Perto da Eva + Igarapé

Tarumã)

F. pygmaeus

Área macro-geográfica:

Madeira

F. obscurus s.s.

Área macro-geográfica: Médio rio Negro

(Sta. Izabel + Barcelos + rio Branco)

ARACA.1, 3, 5

ARACA.2

RCB.2

RCB.3

RCB.4

RCB.5

IAHA.1

IAHA.2

IAHA.5

IAHA.3, 4

RJX.2, 3, 4, 5

TAPA.1, 2, 3, 4, 5

JNCii_3

BACU.1, 2

BACU.3

LAAii.4, 8, 10, 12

BACU.5

BACU.4

JNCi.1, 2, 3, 4, 5, 6

JNCii.1, 2, 4, 5, 6

LAAi.1, 2, 3, 4

LAAii.1, 2, 3, 5, 6, 7, 9, 11

LUA.1

STR.2

STR.5

STR.1

STR.4

LUA.4

STR.3

KALA.1

KALA.2, 3, 4, 5

SAM.1, 2, 3

SAM.4

SAM.5

LUA.2

LUA.3

MUSSU.1

MUSSU.2

MUSSU.3

100

BREU.1

BREU.2

BREU.3

BREU.4

BREU.5

100

VEN.2

VEN.3

VEN.1

100

CURI.1

CURI.2

CURI.3

CURI.4

CURI.5

MAXI.1

MAXI.4

MAXI.2

MAXI.5

MAXI.3

MGC..1

MGC.5

MGC.4

MGC.2

MGC.3

RPI.1, 3

RBM.1

100

JATU.1

JATU.4

JATU.2

JATU.3

RBM.3, 4, 5

JATU.5

RBM.2

RPI.2, 5, 6

EVA.1

EVA.4

EVA.2

EVA.3

MAO.5

EVA.5

MAO.1

MAO.3

MAO.4

MAO.2

100

0.0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

Rivulus_hartii

Figura 9: Árvore filogenética da região controle,

baseada no método de Máxima Verossimilhança.

Hipótese filogenética reconstruída usando o

programa Treefinder (Jobb et al., 2004), com robustez

de 1000 replicas não paramétricas de bootstrap. O

modelo evolutivo definido pelo programa Modeltest foi

HKY + G. A seqüência da região controle da espécie

Phallichthys amates foi usada como grupo externo

(acesso Genbank DQ377041). As siglas representam

as iniciais dos nomes dos rios coletados e os

números seguem a ordem de captura dos indivíduos

coletados, conforme organização do banco de dados

da coleção.

F. palikur

Área macro-geográfica: Amapá/Marajó

(Afluentes dos rios estado do Amapá +

Ilha de Marajó)

Fluviphylax sp.

Área macro-geográfica:

Alto rio Negro/Orinoco

(Sta. Izabel + São Gabriel

+ rio Orinoco-Venezuela

)

F. simplex

Áreas macro-geográficas:

Solimões/Amazonas

(Reserva Amanã + Purus + Lago

Janauacá + Trombetas + Santarém)

F. pygmaeus

Área macro-geográfica:

Madeira

Phallichthys amates

AMAPA_10.1, 2, 3, 4, 5

AMAPA_11.1, 2, 3, 4, 5

MARAJO_26.2

MARAJO_26.3

MARAJO_26.4

SALV.5

MARAJO_26.5

AMAPA_4.1, 3, 5

AMAPA_5.1, 2, 3, 4, 5

CALC.1

CALC.2

CALC.3

CALC.4, 5

TG.2

TG.2, 3, 5

TZ.1, 2, 3, 4, 5

SALV.6

SALV.1

SALV.2, 3, 4

100

BACU.1, 2, 4, 5

JNCi.1, 2, 5, 6

JNCii.1, 2, 3, 4, 5, 6

LAAi.1, 2, 3, 4, 5, 6

LAAii.1, 2, 3, 4, 5, 6, 7

LAAii.8, 9, 10, 11, 12

STR.3

BREU.1

BREU.2

BREU.3

BREU.4

BREU.5

100

MUSSU.1

MUSSU.2

TROM.1

STR.1

STR.4, 5

CURI.1, 2, 3, 4, 5

MAXI.1, 2, 3, 4, 5

MGC.1

MGC.2, 3, 4, 5

VEN.6

JATU.1

JATU.2

JATU.4

RBM.1

RPI.4

100

RBM.2

RPI.2

RPI.6

RBM.3

RBM.4, 5

RPI.1

100

IAHA.1

IAHA.2

IAHA.5

IAHA.3, 4

RJX.2

TAPA.1

RJX.3, 4, 5

TAPA.2, 3, 4, 5, 6

ARACA.1

ARACA.2, 3, 4

100

0.0

0.02

0.04

0.06

0.08

0.1

0.12

0.14

0.16

0.18

0.2

0.22

0.24

F. obscurus s.s.

Área macro-geográfica: Médio rio Negro

(Sta. Izabel + Barcelos + rio Branco)

1.3.2 - Análises populacionais

Pela análise de NCA das 125 seqüências de 521 pb do gene COI gerou-

se cinco redes de haplótipos não conectadas das seguintes áreas macro-

geográficas: Manaus (F. zonatus); Solimões/Amazonas (F. simplex); Alto rio

Negro/Orinoco (Fluviphylax sp.); Médio rio Negro (F. obscurus s.s.) e Madeira

(F. pygmaeus). As redes de haplótipos das áreas Manaus, Médio rio Negro e

Madeira não apresentaram significância estatística em nenhum nível

hierárquico dos clados agrupados, logo não foram demonstradas.

A área macro-geográfica Solimões/Amazonas (F. simplex) formou uma

única rede haplotípica, no qual o clado de hierarquia 2-4 (figura 10B)

apresentou fluxo gênico restrito com isolamento por distância. O clado 2-1 e o

clado final apresentaram expansão contínua. Contrastando a esse resultado,

os testes D de Tajima e Fs de Fu não foram significantes, assim, as

populações da área Solimões/Amazonas (populações de F. simplex) não estão

em desequilíbrio genético com relação ao DNA mitocondrial (tabela 3 e 4).

A rede de haplótipo da área macro-geográfica Alto rio Negro/Orinoco

(Fluviphylax sp.) apresentou significância na análise de alto nível hierárquico

dos clados agrupados. Contudo, a amostragem geográfica foi inadequada para

discriminar entre fragmentação e isolamento por distância, segundo

interpretação da chave de inferência do NCA publicada por Templeton em

novembro de 2005 (http://darwin.uvigo.es/software/geodis.html). Os testes D de

Tajima e Fs de Fu não foram significantes (tabela 3 e 4).

Na análise de NCA de 134 seqüências dos 373 pb da região controle foi

definido cinco redes de haplótipos: Médio rio Negro (F. obscurus s.s.); Alto rio

Negro/Orinoco (Fluviphylax sp.); Solimões/Amazonas (F. simplex);

Amapá/Marajó (F. palikur); e Madeira (F. pygmaeus) (figura 11 A, B, C e D). A

rede de haplótipo formado pela área macro-geográfica Alto rio Negro/Orinoco

(Fluviphylax sp.) mostraram significante restrição ao fluxo gênico com

isolamento por distância, quando analisado em conjunto os clados de alto nível

hierárquico. O mesmo resultado foi obtido nas análises da rede de haplótipos

da área macro-geográfica do Madeira (F. pygmaeus).

Figura 10: Rede de haplótipos geradas pelo NCA a partir das 125 seqüências do gene COI.

Cinco redes de haplótipos diferentes foram obtidas, dessas foram representadas somente as

que apresentaram significância estatística. A – rede de haplótipos da área Alto rio

Negro/Orinoco (Fluviphylax sp.) possui 12 haplótipos. B - rede de haplótipos da área Solimões-

Amazonas (F. simplex) possui 10 haplótipos. As siglas representam as iniciais dos nomes dos

rios coletados e os números seguem a ordem de captura dos indivíduos coletados, conforme

organização do banco de dados da coleção.

Figura 11: Rede de haplótipos geradas pelo NCA a partir das 134 seqüências da região

controle. Cinco redes de haplótipos diferentes foram obtidas. A – rede de haplótipos da área

Amapá-Marajó (F. palikur) contendo 12 haplótipos. B - rede de haplótipos da área Médio rio

Negro (F. obscurus s.s.) com 5 haplótipos. C - rede de haplótipos da área Madeira (F.

pygmaeus) com 5 haplótipos. D - rede de haplótipos das áreas Solimões/Amazonas (F.

simplex) com 6 haplótipos. E - rede de haplótipos da área Alto rio Negro/Orinoco (Fluviphylax

sp.) com 4 haplótipos. As siglas representam as iniciais dos nomes dos rios coletados e os

números seguem a ordem de captura dos indivíduos coletados, conforme organização do

banco de dados da coleção.

A rede de haplótipos Solimões/Amazonas (F. simplex) apresentou

significância para o clado 1-1 com extensa e contínua expansão e no clado de

alto nível hierárquico significância para fluxo gênico restrito e/ou dispersão,

mas com um pouco de dispersão a longa distância. Na análise de NCA a rede

de haplótipos formada pela área Amapá/Marajó (F. palikur) apresentou

significante fragmentação no passado e/ou colonização por longa distância

para o clado 2-1. O clado final de alto nível hierárquico apresentou significante

restrição de fluxo gênico ou dispersão, mas com um pouco de dispersão a

longa distância. Os testes de D de Tajima e Fs de Fu não foram significantes,

confirmando que as populações de F. palikur não estão em desequilíbrio

mutação-deriva genética (tabela 4).

Os resultados da AMOVA e distância par-a-par evidenciaram uma forte

estruturação das populações de F. obscurus l.s. do Alto rio Negro/Orinoco e

Médio rio Negro nas análises do gene COI e região controle (tabelas 1 e 2).

Esses resultados corroborando com os resultados da hipótese filogenética que

separaram F. obscurus l.s. em dois clados (Fluviphylax sp. e F. obscurus s.s.)

bem suportados e distantemente relacionados. Com relação ao gene COI, F.

obscurus l.s. apresentou Ф

= 0,8946 com significante valor de p < 0,05 após

correção de Boferroni. A variação inter e intrapopulacional foram de 89,46% e

10,54%, respectivamente. Resultados semelhantes foram obtidos utilizando a

região controle do DNA mitocondrial com Ф

= 0,9154 e variação inter e

intrapopulacional de 91,54% e 8,45%, respectivamente. A distância par-a-par

entre a população do Alto rio Negro/Orinoco e Médio rio Negro foram de 0,8946

(p < 0,01) e 0,9154 (p < 0,01) para o gene COI e região controle,

respectivamente.

Os resultados da AMOVA e par-a-par para F. simplex não evidenciaram

estrutura populacional nas análises obtidas pelo gene COI e região controle

(tabelas 1 e 2). O valor de Ф

para o gene COI e região controle foi de 0,0445

e 0,2676, respectivamente. Pela análise do gene COI a variação inter e

intrapopulacional foram de 46,45% e 53,55%, respectivamente. Pelos

resultados da região controle, a variação intrapopulacional (73,23%) foi maior

que a interpopulacional (26,77%). Os dados da matriz de distância

apresentados nas tabelas 1 e 2 para o gene COI e região controle,

respectivamente, corroboram com o baixo nível de estruturação populacional

evidenciado pelo Ф

e alto fluxo gênico (Nm) entre as populações. Com base

na distância par-a-par as populações do lago Janauacá e rio Purus

apresentaram Ф

= 0,08835 (p = 0,05) e 0,07303 (p = 0,05) respectivamente

para gene COI e região controle. Apesar do valor de p não ser significante o

número de migrantes por geração foi de Nm = 5,1590 e 6,3461,

respectivamente para o gene COI e região controle. As populações do rio

Purus e Santarém apresentaram Ф

= 0,22395 (p < 0,05; Nm = 1,7326) e

0,43300 (p < 0,05; Nm = 0,93891), respectivamente para o gene COI e região

controle.

Com base na região controle do DNA mitocondrial foram analisadas

quatro populações de F. palikur, sendo três localizadas no estado do Amapá

(Calçoene, Km 486 e Tartarugalzinho) e uma no Ilha de Marajó. Os resultados

da AMOVA evidenciaram falta de estruturação populacional com Ф

= 0,4255

e variação inter e intrapopulacional de 42,55% e 57,45% (tabelas 1 e 2). Os

resultados da distância par-a-par entre as populações Tartarugalzinho e

Calçoene foi de Ф

= 0,20489, contudo, o valor de p não foi significante e o

número de migrantes por geração foi de Nm = 1,9403. Entre as populações de

Calçoene e Km 486 o valor de Ф

foi de 0,3410 (p > 0,05) e o número de

migrantes por geração de Nm = 0,9662. As populações da Ilha do Marajó e

Tartarugalzinho apresentaram Ф

= 0,37245 (p = 0,05) e Nm = 0,8424. As

análises de desequilíbrio genético (Tajima, 1989; Fu, 1997) não foram

significativas para nenhuma das populações analisadas, indicando que todas

as localidades amostradas não estão em desequilíbrio genético, tanto em

relação ao gene COI quanto à região controle (Tabela 3 e 4).

Tabela 1: Índices de fixação a partir de análises do gene COI. Matriz de distância par-a-par

(abaixo da diagonal), número efetivo de migrantes (Nm) entre as populações (acima da

diagonal) e AMOVA.

Nota: Em parênteses abaixo dos valores de par-a-par estão representados os valores de P

sem correção de Bonferroni. (

) Fluviphylax latu sensu (Fluviphylax sp. + F. obscurus s.s.). (*)

Indica significante valor de Ф

P < 0,05 após correção de Bonferroni para múltiplas

comparações.

Tabela 2: Índices de fixação a partir de análises da região controle. Matriz de distância par-a-

par Ф

(abaixo da diagonal), número efetivo de migrantes (Nm) entre as populações (acima da

diagonal) e AMOVA.

Nota: Em parênteses abaixo dos valores de par-a-par estão representados os valores de P

sem correção de Bonferroni.(

) Fluviphylax latu sensu (Fluviphylax sp. + F. obscurus s.s.). (*)

Indica significante valor de Ф

P < 0,05 após correção de Bonferroni para múltiplas

comparações.

Localidades

AMOVA

Inter-

específico

Intra-

específico

F. obscurus l.s.

Alto Negro Médio Negro

1: Alto Negro/Orinoco

- 0,8946 89,46% 10,54%

2: Médio Negro 0,89465

(< 0,0001)

F. simplex

Purus Amanã Janauacá Santarém

1: Purus

0,3303 5,1590 1,7326 0,4645 46,45% 53,55%

2: Amanã 0,60219*

(< 0,0001)

0,0155 0,3755

3: Janaucá 0,08835

(0,0597)

0,96992*

(< 0,0001)

0,8482

4: Santarém/

Trombetas

0,22395*

(0,0082)

0,57109*

(< 0,0001)

0,37087*

(< 0,0001)

Localidades

AMOVA

Inter-

específico

Intra-

específico

F. obscurus l.s.

Alto Negro Médio Negro

1: Alto Negro/Orinoco

- 0,9154 91,54% 8,46%

2: Médio Negro

0,91542*

(< 0,0001)

F. simplex

Santarém Janauacá Purus

1: Santarém

0,6547 0,9389

2: Janauacá

0,43300*

(0,0005)

6,3461 0,2676 26,77% 73,23%

3: Purus

0,34749*

(0,0032)

0,07303

(0,2939)

F. palikur

Calçoene Km 486 Tartarugalzinho Marajó

1: Calçoene

0,9662 1,9403 0,7613

2: Km 486

0,34100*

(0,0064)

0,3758 0,3782 0,4255 42,55% 57,45%

3: Tartarugalzinho

0,20489

(0,0427)

0,57088*

(< 0,0001)

0,8424

4: Marajó

0,39640*

(0,0001)

0,56933*

(< 0,0001)

0,37245*

(< 0,0001)

Em relação ao gene COI, as populações analisadas apresentaram alta

diversidade gênica e baixa diversidade nucleotídica, com exceção da

população de F. simplex do lago Janauacá. Dessa população foram analisados

12 indivíduos, dos quais as seqüências do gene COI não apresentaram sítios

segregantes e apenas um haplótipo, inviabilizando a estimativa da diversidade

gênica e nucleotídica. De F. obscurus l.s., a população do Alto rio

Negro/Orinoco (Fluviphylax sp.) apresentou a maior diversidade gênica (Ĥ =

0,9542±0,0301), com 12 haplótipos das 18 seqüências analisadas (Tabela 3). A

menor diversidade gênica (Ĥ = 0,3778±0,1813) foi evidenciada na população

do Amanã (F. simplex), com apenas 3 haplótipos das 10 seqüências

estudadas.

Os resultados obtidos pelas análises da região controle foram

semelhantes aos obtidos pelas análises do gene COI. As populações

apresentaram alta diversidade gênica e baixa diversidade nucleotídica, com

exceção da população de F. simplex do lago Janauacá que apresentou apenas

um haplótipo das 10 seqüências analisadas (Tabela 4). A maior diversidade

gênica obtida foi para a população Médio rio Negro F. obscurus l.s. (Ĥ =

0,7661±0,1371). A menor diversidade gênica foi observada na população do rio

Purus, F. simplex, (Ĥ = 0,3134±0,0955). Dessa população foram analisadas 27

seqüências, das quais foram representadas por apenas dois haplótipos. Assim

como nas análises do gene COI, as populações apresentaram baixa

diversidade nucleotídica (Tabela 4).

Tabela 3: Medidas de diversidade genética observadas para o gene COI do DNA mitocondrial

de Fluviphylax dos 125 indivíduos amostrados e separados em seis áreas macro-geográficas

na bacia Amazônica. N = número de indivíduos amostrados; S = número de sítios segregantes;

NH = número de haplótipos; Ĥ = diversidade gênica; π =diversidade nucleotídica de Nei.

Nota: Os resultados dos testes de D de Tajima e Fs de Fu não foram significativos (P > 0.05).

(

) F. obscurus latu sensu (Fluviphylax sp. + F. obscurus s.s.)

Localidades N

π D de Tajima Fs de Fu

F. obscurus l.s.

Alto Negro/Orinoco 18 31 12 0,9542±0,0301 0,078010±0,0096 0,11687 -0,96313

Médio Negro 22 16 6 0,7229±0,0854 0,011923±0,0066 1,50870 4,04800

F. simplex

Purus 30 14 6 0,6759±0,0763 0,006442±0,0038 -0,16767 2,18781

Amanã 10 2 3 0,3778±0,1813 0,000768±0,0009 -1,40085 -1,16394

Janauacá 12 0 1 - - - -

Santarém/Trombetas 8 13 4 0,8214±0,1007 0,013230±0,0079 1,89779 3,06379

Tabela 4: Medidas de diversidade genética observadas para região controle do DNA

mitocondrial de Fluviphylax dos 134 indivíduos amostrados e separados em sete áreas macro-

geográficas na bacia Amazônica. N = número de indivíduos amostrados; S = número de sítios

segregantes; NH = número de haplótipos; Ĥ = diversidade gênica; π = diversidade nucleotídica

de Nei.

Nota: Os resultados dos testes de D de Tajima e Fs de Fu não foram significativos (P > 0,05).

(

) F. obscurus latu sensu (Fluviphylax sp. + F. obscurus s.s.)

1.4 - Discussão

1.4.1 - Filogeografia

As espécies do gênero Fluviphylax são amplamente distribuídas nos

afluentes ao longo das bacias Amazônica, Orinoco e nos afluentes dos rios

localizados a leste do estado do Amapá, que não se conectam a bacia

Amazônica, por exemplo, os rios Oiapoque e Calçoene. As espécies de

Fluviphylax são representadas por peixes com tamanho máximo de 2 cm, que

habitam lagos e pequenos rios de baixa correnteza (Costa, 1996; Costa & Le

Bail, 1999). Interessantemente, as espécies desse gênero não se distribuem

entre os arcos de Monte Alegre e Gurupa (figura 3), localizado entre a cidade

de Santarém e a oeste da Ilha de Marajó (Cunha, J. & Zuanon, J. comunicação

pessoal; obs. pess.).

Localidades N

π D de Tajima Fs de Fu

F. obscurus l.s.

Alto

Negro/Orinoco

16 12 4 0,5750±0,1150 0,012299±0,007247 0,49324 3,82809

Médio Negro 19 6 5 0,7661±0,0671 0,004850±0,003274 -0,14598 0,30591

F. simplex

Santarém/

Trombetas

7 7 5 0.8571±0.1371 0.009897±0.006620 1,14309 -0,52339

Janauacá 10 0 1 - - - -

Purus 27 5 2 0.3134±0.0955 0.004258±0.002917 0,58324 4,83993

F. palikur

Calçoene 10 4 2 0,5556±0,0745 0,006122±0,004163 2,19475 4,32458

Km 486 14 2 3

0.5824±0.0919 0.001756±0.001632

0,03649 -0,03956

Tartarugalzinho 9 4 3

0.6944±0.1470 0.003061±0.002491

0,02527 -0,82233

Marajó 10 6 5

0.7556±0.1295 0.006183±0.004196

0,24092 -0,34004

Os resultados filogenéticos evidenciaram seis clados monofiléticos de

Fluviphylax que habitam áreas distintas, sendo que cada uma é habitada por

apenas uma espécie de Fluviphylax: os rios a leste do estado do Amapá e Ilha

de Marajó, habitados somente pela espécie F. palikur; os afluentes da calha

Solimões/Amazonas (Reserva Amanã a Trombetas e Santarém), F. simplex;

bacia do rio Madeira, F. pygmaeus; Baixo rio Negro (Arquipélago de

Anavilhanas, rio Tarumã e rio Preto da Eva), F. zonatus; Médio rio Negro

(Santa Izabel, Barcelos e rio Branco), F. obscurus s.s.; e Alto rio Negro/Orinoco

(Santa Izabel, São Gabriel da Cachoeira e bacia do Orinoco), Fluviphylax sp..

Na hipótese filogenética a partir da região controle, a espécie F. palikur,

distribuída na área geográfica Amapá/Marajó, é o grupo irmão das demais

espécies (F. obscurus (F. pygmaeus (F. simplex, Fluviphylax sp.))). A

distribuição de F. palikur entre o estado do Amapá e a Ilha de Marajó

possivelmente ocorreu quando essas duas áreas geográficas eram

conectadas. Atualmente essas áreas são separadas pelo rio Amazonas,

representando uma barreira física à dispersão dos F. palikur, pois esses não se

encontram em águas com grande correnteza. Os dados de genética de

população de distância par-a-par e AMOVA evidenciaram uma falta de

estrutura populacional entre as localidades amostradas com Ф

= 0,4255 (p <

0,05) e a variação intra-específica (57,45%) foi maior que a inter-específica

(42,55%). Apesar da falta de estruturação populacional as quatro populações

analisadas apresentaram baixo fluxo gênico. O maior fluxo gênico foi entre as

populações de Calçoene e Tartarugalzinho com Nm = 1,9403 e distância par-a-

par de Ф

= 0,20489, porém não significante (p > 0,05).

Os resultados de NCA sugerem que as populações de F. palikur

sofreram fragmentação no passado, conforme resultados dos clados inferiores

(clado 2-1), e estão passando por um processo de fluxo gênico restrito. Essa

inferência suporta a hipótese de que apenas uma população habitava a região

do Amapá e Ilha de Marajó, contudo, após a separação da Ilha do Marajó essa

população panmítica foi separada em duas. Apesar do isolamento e do baixo

fluxo gênico entre a Ilha de Marajó e Amapá estas populações ainda

compartilham haplótipos, gerando o resultado de fluxo gênico restrito entre as

áreas.

O clado formado pela espécie F. obscurus s.s., área macro-geográfica

Médio rio Negro, foi grupo irmão do clado (F. zonatus, F. pygmaeus,

(Fluviphylax sp., F. simplex)). Não foi possível verificar o relacionamento entre

os clados F. zonatus; F. pygmaeus; e o clado Fluviphylax sp. e F. simplex, pois

esses foram um clado politômico. A espécie F. obscurus s.s. distribui-se desde

o baixo rio Branco (estado de Roraima) até o rio Jurubaxi, próximo à cidade de

Santa Izabel do Rio Negro. As espécies Fluviphylax sp. e F. obscurus s.s. não

formaram um grupo monofilético e estão distantemente relacionadas, sendo

que Fluviphylax sp. é grupo irmão de F. simplex. Fluviphylax sp. e F. obscurus

s.s. apresentaram forte estrutura populacional com Ф

= 0,89465 e Ф

0,9154 em relação ao gene COI e região controle, respectivamente (Tabelas 1

e 2). A variação inter-espécifica foi relativamente alta 89,64% e 91,54% em

relação ao gene COI e região controle. Os resultados filogenéticos obtidos

tanto para gene COI quanto para região controle sugerem que Fluviphylax sp. é

grupo irmão de F. simplex. Não foi possível verificar a correlação entre a

distância genética e a distância geográfica entre essas espécies devido ao

baixo número de populações amostradas.

Diante dos resultados filogenéticos e da distribuição geográfica das

espécies Fluviphylax, acredita-se que o ancestral comum do gênero

Fluviphylax habitava a bacia Amazônica e as drenagens do Atlântico,

localizada no estado do Amapá. Atualmente as drenagens do Atlântico não são

conectadas à bacia do Amazonas, contudo, provavelmente no passado ocorreu

uma conexão entre essas áreas, via extensão do delta do rio Amazonas a leste

(Vasconcelos et al., 2006). Após a separação geográfica da bacia Amazônica

das drenagens do Atlântico, o ancestral de F. palikur ficou restrito as drenagens

do Atlântico, localizada no estado do Amapá, e na foz do rio Amazonas,

enquanto o ancestral de todos os demais Fluviphylax restringiu-se à bacia

Amazônica. Estudos de genética de população com Caiman crocodilus e

Melanochusus niger relataram diferenciações genéticas entre as populações

localizadas na drenagem do Atlântico (Amapá e Guiana Francesa) e bacia

Amazônica (Farias et al., 2004; de Thoisy et al., 2006; Vasconcelos et al., 2006;

Vasconcelos et al., 2008). Tais autores sugerem que os jacarés da bacia

Amazônica colonizaram ou dispersaram para as drenagens do Atlântico e que

possivelmente esse evento tenha ocorrido durante a última grande glaciação

do Pleistoceno, quando o nível do mar estava abaixo de 200 metros em relação

ao nível atual. Com o baixo nível do mar, o delta do rio Amazonas estendeu a

leste, em relação à posição atual, e muitas das drenagens do Atlântico

atualmente isoladas foram conectadas à bacia Amazônica permitindo a

expansão dos jacarés.

O deslocamento do ancestral de F. palikur entre as drenagens do

Atlântico localizadas no Amapá e os rios da foz do Amazonas, provavelmente

ocorreu por meio de áreas alagadas. A região do Amapá é formada por áreas

de florestas e áreas de savana e mangue, correspondendo respectivamente a

70% e 30% do território (Vieira et al., 2006). No período das chuvas as áreas

de savana se alagam, permitindo a conexão entre a biota aquática local,

possibilitando assim a distribuição de F. palikur entre rios que não apresentam

conectividade, como é o caso dos rios a leste do Amapá e rios da foz do

Amazonas. Estudos de biogeografia histórica dos caracídeos da América do

Sul (Hubert & Renno, 2006) sugerem que a dispersão dos caracídeos entre o

Orinoco ao longo das drenagens das Guianas tenha ocorrido por meio de áreas

alagadas ou fina camada de água doce ao longo da costa. Outros trabalhos

também têm relatado dispersão ao longo da costa do Escudo das Guianas para

refúgios aquáticos pontuais (Renno et al., 1990; Renno et al., 1991; Montoya-

Burgos, 2003). Esses estudos reforçam a hipótese de que as áreas de savana

alagadas contribuem para a dispersão da biota aquática, como no caso de F.

palikur.

A linhagem de F. simplex é grupo irmão de Fluviphylax sp., contudo, o

clado formado por ambas as espécies apresentou baixo suporte, com bootstrap

de 55% e 58% para os dados do gene COI e região controle, respectivamente.

Possivelmente o ancestral comum das linhagens de F. simplex e Fluviphylax

sp. tenha se dispersado da região do alto rio Solimões para a região do alto rio

Negro via áreas alagadas. A conexão entre essas regiões teria ocorrido

próximo à reserva Amanã, pois nessa área encontram-se cabeceiras dos

tributários do rio Negro e rio Solimões, assim esse contato teria sido realizado

durante o período de chuva e cheia dos rios, possibilitando a ocorrência de

áreas alagadas.

Atualmente, a espécie Fluviphylax sp. habita desde o alto rio Negro até a

bacia do Orinoco. A dispersão entre o alto rio Negro e Orinoco possivelmente

ocorreu via Canal do Cassiquiara. Muitos estudos têm relatado a dispersão da

ictiofauna entre a bacia do Amazonas e Orinoco via Canal do Cassiquiara

(Lovejoy & de Araújo, 2000; Sivasundar et al., 2001; Hubert & Renno, 2006).

1.4.2 - Estrutura populacional dentro das espécies Fluviphylax

O nível de diversidade gênica observado entre as populações analisadas

para as quatro espécies (Fluviphylax sp., F. obscurus s.s., F. simplex e F.

palikur) foram relativamente altos tanto em relação ao gene COI, quanto a

região controle do DNA mitocondrial. Em contrapartida, o nível de diversidade

nucleotídica observado foi relativamente baixo (tabelas 3 e 4).

As populações de F. palikur localizadas na Ilha de Marajó e nas

drenagens do Atlântico (Amapá) não apresentaram estruturação populacional

(tabelas 2). Inferências baseadas no resultado de NCA sugerem fluxo gênico

restrito e dispersão, mas com alguma dispersão por longa distância para alto

nível hierárquico agrupado. O clado de nível hierárquico 2-1 sugere uma

expansão gradual no passado seguido por fragmentação. Os testes de D de

Tajima e F

de Fu para a região controle, que não está sob pressão seletiva,

não foram significativos e as populações estão fora do desequilíbrio genético,

assim como, não sofrem nenhuma significante expansão populacional ou

contração. Assim, suporta a hipótese de que no passado os Fluviphylax

distribuídos no Amapá expandiram-se para a Ilha de Marajó. Após a separação

da Ilha de Marajó do Amapá as populações dessas regiões passaram a ter um

fluxo gênico restrito. As populações de F. palikur estão isoladas das demais

populações de Fluviphylax da bacia Amazônica. Estudos de estrutura

populacional em Caiman crocodilus e Melanosuchus niger da América do Sul

também têm demonstrado diferenciação genética entre as populações da

Guiana Francesa e calha principal do Amazonas (Farias et al., 2004; de Thoisy

et al., 2006; Vasconcelos et al., 2006; Vasconcelos et al., 2008).

A espécie Fluviphylax sp. é grupo irmão de F. simplex e não forma um

grupo monofilético com a espécie F. obscurus s.s.. Isso nos leva a inferir que o

ancestral de Fluviphylax sp. e F. simplex tenha colonizado a região do alto rio

Negro via alto rio Solimões por meio de áreas alagadas. Os resultados NCA

para Fluviphylax sp. inferem que a amostragem é inadequada para discriminar

entre fragmentação e isolamento por distância. A hipótese de isolamento por

distância não pôde ser aceita ou rejeitada, pois não foi possível realizar o teste

de Mantel, devido ao baixo número de populações analisadas.

A espécie F. zonatus está restrita ao Arquipélago de Anavilhanas, à

drenagem do rio Preto da Eva e ao rio Tarumã, afluente do rio Negro. Os rios

dessas regiões são caracterizados como rios de água preta, segundo

classificação limnológica de Sioli (1984).

A área de distribuição da espécie F. zonatus está distante a 50 Km da

área de ocorrência da espécie F. simplex. Os F. zonatus habitam rios de água

preta, provenientes do escudo Guianense, enquanto os F. simplex habitam rios

de água branca, localizados em áreas sedimentares e de várzea. A especiação

pode ocorrer de várias maneiras, assim, não se sabe se a diferença entre os

habitats tem impulsionado a especiação ou são apenas correlacionados. As

diferenças geológicas e/ou ecológicas potencialmente poderiam ter conduzido

à especiação dessas espécies. Farias & Hrbek (2008) estudaram a

diversificação do complexo de espécies do gênero Symphysodon e sugeriram

que a diferença genotípica entre os grupos de acarás-disco “Heckel”, “blue” e

“brown” possa ser devido a diferença química da água. O grupo ácara-disco

“Heckel” (Symphysodon discus), distribuído nos afluentes de água preta do rio

Negro, apresentou restrito fluxo gênico em relação ao grupo “brown” (S.

aequifasciatus), que distribui-se em rios de águas branca como os rios Madeira

e Amazonas. Similarmente, esses autores observaram sinal de fragmentação

no passado entre o grupo acará-disco “blue” (S. aequifasciatus), distribuído no

rio Solimões, e “brown” mais “Heckel”, contudo, essa diferença pode ser

causada e/ou mantida por diferenças limnológicas. Caso seja confirmada essa

hipótese, a especiação ecológica pode estar reforçando a diferença entre

esses grupos de acarás-disco.

Farias et al. (2004) relataram diferenciação entre as populações de

Melanosuchus niger do Arquipélago de Anavilhanas e do lago Janauacá, e

sugeriram que essa diferenciação esteja sendo dirigida pela diferença

ecológica e/ou limnológica entre essas regiões. Esse resultado vem sendo

corroborado por demais estudos (de Thoisy et al., 2006; Vasconcelos et al.,

2006) em genética de população envolvendo os crocodilianos dessas áreas

geográficas.

A população de F. pygmaeus é endêmica do rio Madeira. As águas do

rio Madeira são caracterizadas como águas brancas, similares às

características limnológicas da calha central Solimões-Amazonas.

Atualmente a espécie F. simplex distribui-se desde o rio Amazonas

próximo à cidade de Santarém e rio Trombetas até os rios Solimões e Purus,

próximo à reserva Amanã. Essa vasta área geográfica apresenta

aproximadamente 1400 km de comprimento seguindo o curso dos rios. Os

resultados de análise populacional sugerem que F. simplex apresenta-se como

uma população panmítica com alta diversidade genética e fluxo gênico.

Resultados semelhantes foram encontrados em estudos de Arapaima

gigas (Hrbek et al., 2005) e Colossoma macropomum (Santos et al., 2007),

sugerindo que para as duas espécies exista uma única população com ampla

distribuição, ao longo de toda a calha e tributários do rio Amazonas. Em geral,

os peixes panmíticos apresentam alta diversidade genética devido ao grande

tamanho populacional, pois em populações com grande tamanho efetivo e alta

taxa de migração os efeitos da deriva genética são minimizados (Santos et al.,

2007).

O alto fluxo gênico de F. simplex se deve à associação com áreas

alagadas, como a várzea. A interconexão dos rios e áreas alagadas ocorre por

meio dos “pulsos” de inundação, que é a principal força que permite a interação

entre a biota do sistema de várzea (Junk et al., 1989). A baixa estruturação

genética de F. simplex se deve a esse grande ecossistema continuo (várzea).

Estudos com Colossoma macropomum (Santos et al., 2007), dourada e

piramutaba (Batista et al., 2005; Batista & Alves-Gomes, 2006), Prochilodus

nigricans (Farias et al., 2006) e Arapaima gigas (Hrbek et al., 2005) têm

evidenciado a comprovação de que a várzea funciona como um elo para a

interação da biota. O alto fluxo gênico e o padrão de distribuição geográfico

concordam com os estudos de vertebrados da várzea e corrobora com a

hipótese de Junk et al. (1989) de que a várzea funciona como um corredor para

a interação da biota.

1.5 - Considerações finais

O estudo filogeográfico de Fluviphylax permitiu sugerir processos que

influenciam a distribuição geográfica das linhagens desse gênero. O sistema de

inundação da área da várzea, a diferenciação limnológica das drenagens e os

aspectos geológicos de formação dos rios são alguns desses processos que

contribuem para a atual distribuição espacial e diversidade intragenérica.

A partir dos estudos filogenéticos e de genética de população foi

possível evidenciar uma nova espécie para o gênero Fluviphylax. A nova

espécie Fluviphylax sp. distribui-se desde a cidade de Santa Izabel do Rio

Negro (Alto rio Negro) até o rio Cinaruco (Venezuela) bacia do Orinoco.

Possivelmente o canal do Cassiquiara esteja permitindo o intercambio biológico

entre os indivíduos dessa nova espécie. A partir desse estudo sugere-se que a

nova espécie seja analisada taxonomicamente, a fim de contribuir para o

aumento da diversidade de espécies dentro do gênero Fluviphylax.

A espécie F. palikur, grupo irmão de todos os demais Fluviphylax,

atualmente é restrita às drenagens do Atlântico (Amapá) e Ilha de Marajó.

Possivelmente processos geológicos como o surgimento dos arcos tectônicos

isolou a linhagem ancestral de Fluviphylax. A separação da Ilha de Marajó do

Amapá é um processo mais recente que também está influenciando na

estruturação populacional da espécie. As áreas de savana alagadas do Amapá

estão possibilitando a distribuição dessa espécie entre os rios que drenam para

o Atlântico e que não apresentam conectividade.

As linhagens de F. zonatus (restritas aos rios de água preta provenientes

do escudo Guianense), F. pygmaeus (endêmica do rio Madeira), e Fluviphylax

sp. (distribuída do Alto rio Negro à bacia do Orinoco), possivelmente

apresentam o mesmo tempo de especiação e tenham surgido a partir de

eventos de radiação ou colonização, e após esses eventos fatores ecológicos e

geológicos atuaram sobre essas linhagens permitindo a diferenciação genética

observada. O sistema de inundação das áreas de várzea é a principal força

que permite a interação entre os F. simplex, contribuindo para sua dispersão e

fluxo gênico, uma vez que os Fluviphylax não habitam a calha dos principais

rios, mas sim seus afluentes.

Para determinar os eventos e processos responsáveis pela atual

distribuição espacial da espécie F. obscurus s.s. necessita-se de mais estudos

devido sua atual distribuição e relacionamento com as demais espécies do

gênero. Para a espécie Fluviphylax sp. o Canal do Cassiquiara está

possibilitando a dispersão dos indivíduos entre o alto rio Negro e bacia do

Orinoco, Venezuela. No presente trabalho apenas um ponto na bacia do

Orinoco foi amostrado, desta forma sugere-se que mais locais sejam

amostrados para realização de estudos populacionais dessa espécie.

CAPÍTULO 2

Delimitação das espécies de Fluviphylax por meio de caracteres

morfomerísticos e moleculares

2.0 - Introdução

A região neotropical apresenta a maior riqueza de peixes de água doce

do mundo. Essa riqueza está intimamente relacionada aos eventos

paleogeográficos, como soerguimento dos Andes, mudanças de cursos de rios,

repetidas incursões e regressões de águas marítimas. Esses eventos

paleogeográficos produziram variadas mudanças nas distribuições das

espécies e causaram eventos vicariantes, contribuindo para o aumento da

diversidade (Lundberg et al., 1998; Montoya-Burgos, 2003; Hubert & Renno,

2006). Atualmente muitos esforços têm sido feitos com a finalidade de se

compreender a diversidade e a história filogenética da fauna de peixes de água

doce neotropical (Malabarba et al., 1998; Ghedotti, 2000; Reis et al., 2003;

Lucinda & Reis, 2005b; Kullander & Ferreira, 2006), entretanto, as informações

nessa área ainda são escassas. Muitas questões permanecem não resolvidas

em vários níveis taxonômicos e em algumas linhagens nenhuma informação

encontra-se disponível (Vari & Malabarba, 1998). Os obstáculos à

compreensão dessa fauna incluem a sua riqueza e complexidade, a vasta

extensão dos sistemas aquáticos, e os limitados recursos humanos e de infra-

estrutura destinados à pesquisa desta ictiofauna (Böhlke et al., 1978).

Os peixes ciprinodontiformes são usualmente pequenos e muito

coloridos, alguns são utilizados para aquariofilia como os peixes da subfamília

Rivulinae e amplamente utilizados em experimentos como as espécies do

gênero Fundulus (Parenti, 1981). Apesar dos ciprinodontiformes apresentarem

interessantes características como complexidade comportamental, estilo de

vida único e polimorfismo cromático, pouca atenção tem sido dedicada em

esclarecer a relação filogenética dentro da ordem (Costa, 1998b). A

classificação proposta por Parente (1981) para a ordem Cyprinodontiformes

tem sido amplamente adotada, contudo, estudos filogenéticos dos táxons

neotropicais vêm sendo debatidos, principalmente envolvendo as famílias

Poeciliidae, Rivulidae e Anablepidae (Costa, 1990; Ghedotti, 1998; Hrbek &

Larson, 1999; Ghedotti, 2000; Lucinda, 2005a; Hrbek, 2007). O gênero

Fluviphylax (família Poeciliidae) pertencia à subfamília Aplocheilichthyinae

(Parenti, 1981; Costa, 1996), entretanto, atualmente esse gênero encontra-se

alocado na subfamília Procatopodinae, sendo grupo irmão dos killifishes

africanos (Myers, 1955; Ghedotti, 2000).

A história taxonômica do gênero Fluviphylax é recente, e a primeira

espécie descrita e incluída no atual gênero Fluviphylax foi Potamophylax

pygmaeus (Myers, 1955). Entretanto o nome Potamophylax era pré-ocupado

por outro gênero dentro da ordem Trichoptera. Diante disto, Whitley (1965)

propôs o nome Fluviphylax em substituição a Potamophylax. Costa (1996)

revisou o gênero e descreveu três novas espécies (F. zonatus, F. simplex e F.

obscurus) e em 1999 Costa & Le Bail descreveram a espécie F. palikur. O

gênero Fluviphylax apresenta uma recente história taxonômica (Myers, 1955;

Costa, 1996; Costa & Le Bail, 1999) e poucas informações sobre sistemática,

taxonomia e ecologia de suas espécies estão disponíveis. Os estudos (e.g.

Costa, 1996; Costa & Le Bail, 1999) envolvendo a sistemática de Fluviphylax

baseiam-se apenas em dados morfológicos e os espécimes identificados como

F. obscurus localizados no alto rio Negro e bacia do Orinoco não foram

amostrados para análises taxonômica e sistemática.

Atualmente, estudos usando ferramentas moleculares vêm sendo

empregados em conjunto com métodos taxonômicos baseados em dados

morfológicos para compreender a filogenia das espécies (Farias et al., 2000;

Wiens & Penkrot, 2002; López Fernández et al., 2005; Hrbek et al., 2006). Essa

associação tem contribuído de forma positiva para o esclarecimento e

compreensão de questões referente à taxonomia e sistemática, principalmente

quando se trata de espécies crípticas e com recente histórico de especiação

(Hrbek et al., 2002; Wiens & Penkrot, 2002; López Fernández et al., 2005;

Hrbek et al., 2006; Menezes et al., 2008). Tendo em vista os benefícios da

associação das ferramentas moleculares com métodos baseados em dados

morfológicos, assim como, a escassa informação sobre o gênero Fluviphylax,

foi estudada a filogenia e a delimitação de espécie para os Fluviphylax por

meio de dados morfológicos e marcadores moleculares, a saber: gene COI e

região controle do DNA mitocondrial.

2.1 - Objetivo

2.1.1 - Geral

Estudar a relação filogenética e a delimitação de espécie entre os Fluviphylax,

utilizando a associação entre marcadores moleculares e morfológicos.

2.1.2 - Específicos

- Seqüenciar segmentos do gene mitocondrial COI e região controle do DNA

mitocondrial;

- Gerar hipóteses sobre os padrões de relações filogenéticas entre as espécies

de Fluviphylax;

- Estimar os parâmetros genéticos inter e intra-específicos para as espécies do

gênero;

- Evidenciar a existência de uma nova espécie de Fluviphylax;

- Analisar caracteres morfométricos e da morfologia externa conforme chave de

identificação de Costa (1996) e Costa & Le Bail (1999);

- Verificar por meio de análises estatísticas a eficácia dos dados morfológicos e

morfométricos em separar as espécies de Fluviphylax;

- Descrever a morfologia externa de Fuviphylax palikur coletada nas drenagens

do Atlântico (Amapá) e foz do rio Amazonas (Ilha de Marajó).

2.2 - Material e métodos

2.2.1 - Área amostral e método de coleta

Os espécimes de Fluviphylax foram coletados nos afluentes ao longo da

calha principal dos rios Negro, Solimões, Purus, Amazonas, Trombetas, na Ilha

de Marajó e nos afluentes dos principais rios do estado do Amapá (Brasil), e no

lago Laguna Larga na bacia do Orinoco (rio Cinaruco, Venezuela), figura 12.

Os dados de georeferenciamento das localidades amostradas, com as

respectivas espécies coletas estão representados no apêndice A.

Os espécimes foram coletados com puçás de mão para aquário com

malhas de 5 mm de diâmetro. Os indivíduos foram anestesiados em solução de

MS-222 (Finquel) e em seguida preservados em etanol 95%, para

procedimento das análises. Em laboratório, os espécimes de cada localidade

amostrada foram previamente identificados seguindo os passos da chave de

identificação proposto por Costa (1996) e Costa & Le Bail (1999).

Figura 12: Localidades amostradas para as espécies de Fluviphylax. Os pontos em azul

representam os locais amostrados de Fliviphylax sp.; amarelo, F. obscurus s.s.; rosa, F.

zonatus; vermelho, F. simplex; verde F. pygmaeus; e marrom, F. palikur. O circulo vermelho

destaca o canal do Cassiquiara. O mapa foi criado no Online Map Creations

htt

://www.a

uarius.

eomar.de/omc/.

Barcelos

São Gabriel da

Cachoeira

Lago Laguna LargaCinaruco,

Venezuela

Sta Izabel

Samauma e Kalafate

Reserva Amanã

Rio Solimões

Rio Branco

Lago Ayapuá -

Purus

Borba,

Rio Madeira

Manaus

Tombetas Ig. Copudas

Salvaterra

Tartarugalzinho

Km 486

Santarém

Janauacá

Calçoene

2.2.2 - Extração de DNA genômico

No total foram extraídos tecidos de 134 indivíduos do gênero Fluviphylax

para obtenção das seqüências do gene mitocondrial Citocromo Oxidase I (COI)

e Região Controle (RC). Para cada exemplar, foi coletada uma pequena porção

do tecido muscular diretamente do pedúnculo caudal, assim, o DNA genômico

total foi extraído usando-se o método padrão de extração via fenol/clorofórmio

modificado de Sambrook et al. (1989). O tecido foi digerido em solução de

tampão de lise (Tris HCl 10 mM, EDTA 10 mM, SDS 1% e NaCl 0,3 M), SDS

10% e proteinase K (20 mg/µl). Em seguida, lavagens com solução de fenol,

fenol/clorofórmio/álcool isoamílico (25:24:1) e clorofórmio/álcool isoamílico

(24:1) respectivamente foram realizadas para retirar as proteínas. A

precipitação do DNA procedeu-se utilizando etanol absoluto e posteriormente

etanol 70%. O DNA extraído foi quantificado, em transiluminador sob luz UV,

por comparação com marcador de peso molecular conhecido após eletroforese

horizontal padrão, em gel de agarose (Bioagency) 0,8% e corado com brometo

de Etídeo (EtBr, 0,5 µg/mL).

2.2.3 - Amplificação por reação em cadeia da polimerase (PCR)

O gene COI e a região controle (D-loop) foram amplificados via reação

em cadeia da polimerase (PCR) com os iniciadores (primer) COIf2 forward e

COIr4 reverse para o gene COI desenvolvidos no presente trabalho. Para a

região controle foram utilizados os iniciadores Lprof 5'-

ACTCTCACCCCTAGCTCCCAAAG-3' forward e TDK-D 5’-

CCTGAAGTAGGAACCAGA-3’ reverse (Kocher et al., 1989).

As reações das PCRs para a região controle e gene COI foram

realizadas em um volume final de 25 µL contendo: 9,6 µL de água milli-q, 1,0

µL BSA (10 mg/mL), 2,4 µL de MgCl (25 mM), 3,0 µL de buffer 10X, 3,0 µL de

dNTP (10 mM), 1,5 µL de primer reverso (2 µM), 1,5 µL de primer forward (2

uM), 1,0 µL de Taq polimerase (5 U/µL) e 1,0 µL de DNA (~ 50 ng/µL). As

amplificações foram realizadas nas seguintes condições: desnaturação inicial a

95°C por 60 segundos; 35 ciclos para desnaturação a 94°C por 40 segundos,

hibridização a 50°C por 40 segundos, extensão a 72°C por 60 segundos e

extensão final a 72°C por 5 minutos.

As amplificações foram realizadas em termociclador PXE 0.2 Thermal

Cycler. O produto de PCR foi quantificado e visualizado, em transiluminador

sob luz UV, quanto à qualidade da reação após eletroforese em gel de agarose

(Bioagency) a 1,0% e corado com brometo de Etídeo (EtBr, 0,5 µg/mL).

2.2.3.1 - Purificação e seqüenciamento do produto da PCR

O produto da PCR foi purificado usando-se o kit GFXTM PCR DNA Kit

(GE-Healthcare), e diluído em 20 µl de tampão de diluição. Os respectivos

iniciadores forward utilizados na amplificação de DNA também foram usados

na reação de seqüenciamento do gene COI e região controle. As reações de

seqüenciamento foram realizadas utilizando-se Kit de seqüenciamento

“DYEnamic

ET dye terminator Kit (GE-Healthcare). Os ciclos de reação de

seqüenciamento foram realizados em volume final de 10 μl contendo 4,0 μl de

DNA, 2,0 μl de primer a 0,2 μM. Posteriormente as amostras foram submetidas

ao termociclador, com a seguinte condições: 35 ciclos com desnaturação a

95°C por 20 segundos, anelamento a 55°C por 15 segundos e extensão a 60°C

por 60 segundos.

Os produtos amplificados da reação de seqüenciamento foram

precipitados usando-se a precipitação padrão por acetato de amônio/etanol.

Posteriormente esses produtos foram ressuspendidos em 10 μl de formamida

Hi-Di e as seqüências lidas no seqüenciador automático MegaBace 1000 (GE-

Healthcare).

2.2.3.2 - Edição e alinhamento das seqüências

As seqüências do gene COI e região controle foram alinhadas no

programa Clustal W (Thompson et al., 1996) implementado no programa

BioEdit Version 5.0.06 (Hall, 1999), usando as configurações padrão e editadas

manualmente. Após a edição manual de cada seqüência, os sítios que

apresentaram deleções ou inserções (indel) foram acrescentados gaps com a

finalidade de manter a homologia entre os sítios. A falta de nucleotídeos no

final de algumas seqüências foi tratada como sítio sem informação (missing).

Os sítios variáveis foram checados no programa MEGA 4.0 (Kumar et al.,

2004) e as seqüências alinhadas do gene COI foram traduzidas em aminoácido

para verificar códon de parada inesperado.

2.2.4 - Medidas morfométricas e morfológicas

Os caracteres morfométricos foram obtidos utilizando paquímetro de

precisão 0,01 mm e lupa. As medidas foram realizadas em indivíduos das cinco

espécies de Fluviphylax. Os locais amostrados podem ser visualizados no

mapa da figura 12 e os dados sobre georeferenciamento e nome das

localidades com as respectivas espécies coletadas estão representados no

apêndice A. Para as análises morfométricas foram coletados caracteres de 394

indivíduos, sendo 148 F. palikur, 106 F. simplex, 20 F. zonatus, 49 F. obscurus

s.s., 45 Fluviphylax sp., e 26 F. pygmaeus. Os caracteres morfométricos

avaliados foram: comprimento total (CT), altura do corpo (AC) e comprimento

da cabeça (CC).

Os caracteres da morfologia externa avaliados foram os mesmos

descritos na chave de identificação proposta por Costa (1996) e Costa & Le

Bail (1999). Para a avaliação das características morfológicas externas foram

analisados 270 indivíduos, incluído as seis espécies de Fluviphylax definidas

nesse trabalho. Os caracteres da morfologia externa analisados foram: formato

da nadadeira anal; formato da nadadeira pélvica; ponto de origem da nadadeira

dorsal; abertura do canal pré-opercular nas fases jovem e adulto; presença de

mancha preta na borda posterior da nadadeira dorsal dos machos; presença de

barras transversais no corpo. Além desses, dois caracteres merísticos foram

analisados: número de raios na nadadeira anal e dorsal.

A diferença entre o número de indivíduos analisados e dos caracteres

morfométricos e morfológicos se deve ao estado de conservação dos

espécimes, comprometendo a avaliação do total de 394 indivíduos coletados.

2.2.5 - Análise dos dados

2.2.5.1 - Análises filogenéticas

Seqüência do gene COI de Rivulus hartii (acesso Genbank AF002619) e

seqüência da região controle de Phallichthys amates (acesso Genbank

DQ377041) foram usadas como grupos externos na reconstrução filogenética

das espécies de Fluviphylax. As reconstruções filogenéticas sob o critério de

Máxima Parcimônia (MP) e Máxima Verossimilhança (MV) foram realizadas

para o gene COI e região controle do DNA mitocondrial. Para a reconstrução

sob o critério de Máxima Parcimônia foi usando o programa PAUP* (Swofford,

2002), enquanto para a Máxima Verossimilhança o programa Treefinder (Jobb

et al., 2004).

As reconstruções filogenéticas sob os critérios de MP e MV para o gene

COI basearam-se em 125 seqüências (de 125 indivíduos amostrados) com 521

pb para quatro espécies de Fluviphylax, sendo 10 seqüências obtidas de F.

zonatus, 40 de F. obscurus l.s., 60 de F. simplex e 15 de F. pygmaeus. As

reconstruções filogenéticas sob os critérios de MP e MV da região controle

basearam-se em 134 seqüências (134 indivíduos amostrados) com 374 pb,

sendo 43 seqüências obtidas de F. palikur, 35 de F. obscurus l.s., 44 de F.

simplex e 12 de F. pygmaeus.

As filogenias sob os critérios de MP para o gene COI e região controle

foram obtidas a partir dos haplótipos presentes na amostragem total. As 125

seqüências do gene COI e 134 seqüências da região controle apresentaram

um total de 41 e 31 haplótipos, respectivamente, utilizando o programa

Collapse 1.2 (disponível na web darwin.uvigo.es). O método de reconstrução

filogenética a partir dos haplótipos não influência na análise e permite obter

maior desempenho computacional. As filogenias sob os critérios de MP para o

gene COI e região controle foram estimadas por meio de 1000 buscas

heurísticas com adições aleatórias de seqüências (random) e implementação

do algoritmo tree bisection and reconnection (TBR). A robustez da topologia da

árvore de MP foi testada usando-se 1000 replicas de bootstrap com simples

adição e troca de ramos TBR.

Para realizar as reconstruções filogenéticas sob os critérios de MV,

foram determinados os modelos evolutivos para o gene COI e região controle

usando-se o critério de informação Akaike (AIC) (Akaike, 1974) implementado

no programa Modeltest 3.7 (Posada & Crandall, 1998). O melhor modelo

evolutivo de substituição de nucleotídeos determinado para ambos marcadores

mitocondriais foi o modelo HKY (Hasegawa et al., 1985) com sítios variáveis

seguindo discreta distribuição gama (G). Após definido o modelo evolutivo, a

robustez da topologia da árvore mais verossímil foi testada usando 1000

replicas não paramétricas de bootstrap, por meio do programa Treefinder (Jobb

et al., 2004).

A diferenciação intra e inter-específica (distância-p) foi estimada para os

grupos monofiléticos formados pelas reconstruções filogenéticas, utilizando-se

o programa MEGA 4.0 (Kumar et al., 2004).

2.2.5.2 - Análises de agrupamento populacional (PAA)

Os sítios apomórficos das seqüências do gene COI e região controle

foram analisados e dispostos em tabelas (Apêndice B e C), utilizando o

programa MEGA 4.0 (Kumar et al., 2004). A partir dos sítios informativos

variáveis foi realizado a análise de agrupamento populacional (Population

Aggregation Analysis - PAA), seguindo método formulado por Davis & Nixon

(1992). Esse método é utilizado para identificação de espécies filogenéticas e

baseia-se em dois princípios básicos: primeiro, todos os indivíduos de uma

população local são assumidos como pertencentes da mesma espécie; e

segundo, os caracteres idênticos compartilhados entre os indivíduos de duas

ou mais populações evidenciam uma co-especificidade. Fundamentado nesses

dois princípios operacionais, as espécies filogenéticas são delimitadas por

sucessivas rodadas de agrupamentos de populações locais não distintas.

Nesse trabalho assume-se o conceito filogenético de espécie formulado

por Rosen (1978;1979). Esse conceito pressupõe que toda população ou grupo

de populações definidos por algum caractere apomórfico único são unidades

evolutivas significantes.

2.2.5.3 - Análises morfométrica e morfológica

As análises dos caracteres morfométricos comprimento total (CT), altura

do corpo (AC) e comprimento da cabeça (CC) foram analisados

separadamente dos caracteres morfológicos, contudo o mesmo procedimento

foi realizado para ambos os bancos de dados.

Para os dados morfométricos realizou-se uma regressão dos quadrados

mínimos (least squares) para remover o efeito do tamanho padrão. Os resíduos

gerados foram utilizados para as análises, sendo resumidos nas análises de

componentes principais. Os fatores dos componentes principais foram

visualizados por meio do gráfico de dispersão, em que se consideraram os

eixos cartesianos (eixo x e y), representados pelos fatores de interesse.

Diferenças entre os fatores dos componentes principais entre as espécies

foram testadas usando-se o modelo linear generalizado (generalized linear

model). As variáveis independentes (clados) foram tratadas como fixas. Os

dados morfológicos não foram transformados usando-se a regressão dos

quadrados mínimos, mas foram analisados da mesma forma como os dados

morfométricos transformados nos resíduos.

Os agrupamentos usados nos eixos cartesianos e no modelo linear

generalizado foram formados de acordo com os clados obtidos pelas análises

filogenéticas. Os clados representaram as espécies: F. palikur localidades Ilha

de Marajó e Amapá; Fluviphylax sp., localidade alto rio Negro e Orinoco; F.

pygmaeus, rio Madeira; F. zonatus, Manaus e rio Preto da Eva; F. obscurus

s.s., médio rio Negro; e F. simplex, afluentes da calha Solimões-Amazonas.

Todas as análises foram realizadas no programa SYSTAT 10.2.05 (Systat

Software, Inc.).

2.3 - Resultados

2.3.1 - Análises filogenéticas

Para o gene mitocondrial COI obteve-se um de total 521 pb para 125

indivíduos do gênero Fluviphylax, enquanto que para a região controle (RC)

foram obtidos 374 pb para 134 indivíduos. O alinhamento das seqüências do

gene COI apresentou 158 sítios variáveis, dos quais 153 foram informativos

para parcimônia. O alinhamento da região controle apresentou 111 sítios

variáveis, dos quais 106 foram informativos para parcimônia. A composição das

bases de nucleotídeos das seqüências do gene COI e região controle

apresentaram proporção de bases anti-guanina (tabela 5). Para ambos os

marcadores moleculares a base timina (T) apresentou-se em maior proporção.

Tabela 5: Média da Composição de nucleotídeos em porcentagem e número de sítios

informativos e variáveis das seqüências analisadas.

Foram analisados 521 e 374 sítios para as seqüências do gene COI e região

controle (RC), respectivamente. (T) timina, (C) citosina, (A) adenina e (G) guanina.

O gene COI e a região controle apresentaram proporções de bases anti-guanina,

característica do DNA mitocondrial.

A partir das 125 seqüências de 521 pb do gene COI foram gerados

41 haplótipos (tabela 6). Os haplótipos 17 (F. simplex) e 21 (F. obscurus)

apresentam as maiores freqüências dos indivíduos coletados com 29 e 11

seqüências, respectivamente. No geral, 18 haplótipos apresentaram

somente uma seqüência do gene COI (haplótipos únicos). Todas as 29

seqüências do haplótipo 17 pertencem a indivíduos da espécie F. simplex

que se distribuem desde o rio Purus até o rio Amazonas, próximo à cidade

de Santarém e abrangendo também o rio Trombetas. O haplótipo 21 foi

representado pelos indivíduos da espécie F. obscurus que se distribuem ao

longo do rio Negro.

Para a região controle, das 134 seqüências com 374 pb, foram

gerados 31 haplótipos (tabela 6). Os haplótipos 12 (F. palikur) e 19

(Fluviphylax sp.) apresentaram freqüências de 10 seqüências da região

controle, enquanto o haplótipo 21 foi constituído por 33 seqüências de F.

simplex distribuídos ao longo do rio Purus, lago Janauacá e rio Amazonas

até a cidade de Santarém. O haplótipo 12 foi representado por F. palikur

distribuídos nos afluentes ao longo do estado do Amapá.

Médio (%)

Sítios

informativos

Sítios

variáveis

Sítios

Conservados

Tamanho da

Seqüência

T C A G

COI

32,9 23,2 25,4 18,5 153 158 363 521

33,0 18,4 32,9 15,7 106 111 263 374

Tabela 6: Haplótipos gerados pelo programa Collapse1.2 a partir das seqüências do gene

COI e região controle (RC).

Haplótipos

Freqüência

das

Seqüências

Localidades Haplótipos

Freqüência

das Seqüências

Localidades

COI

Rivulus hartii

Phallichthys

amates

1 1 CURI.2 1 1 ARACA.1

2 3 CURI.1, 4, 5 2 3 ARACA.2-4

3 1 CURI.3 3 4 MGC.1, 3-5

4 3 MAO.1, 3, 4 4 1 MGC.2

5 1 MAO.2 5 1 TROM.1

6 1 MAO.5 6 1 VEM.6

7 2 MAXI.1, 4 7 5 TZ.1, 3, 4; TG.1, 3

8 2 MAXI.2 8 3

TZ.2, 5;

MARAJO_26.5

9 1 MAXI.3 9 1 TG.2

10 2 MGC.1, 5 10 1 TG.5

MGC.2

AMAPA_4.1, 3-5;

AMAPA_5.5;

AMAPA_11.3-5

MGC.3

AMAPA_5.1-3;

AMAPA_10.1-5;

AMAPA_11.1-2

13 1 MGC.4 13 1 AMAPA_5.4

14 2 VEM.1, 3 14 5 SALV.1-4, 6

15 1 VEM.2 15 2

SALV5;

MARAJO26.4

16 5 BREU.1-5 16 5 CALÇ1-5

BACU.1, 2,4;

LAA(2).1-3, 5-7, 9, 11;

LAA(1).1-4; JNC(1).1-6;

JNC(2).1-6; LUA.4; STR.4

MARAJO_26.2

18 5 BACU.3; LAA(2).4, 8, 10, 12 18 1 MARAJO_26.3

19 1 BACU.5

19 10

CURI.1-5;

MAXI.1-5;

20 3 IAHA.1, 2, 5 20 3 STR.1, 4, 5

IAHA.3, 4;

RJX.2-5;

TAPA.1-4, 6

STR.3; BACU1, 2,

4, 5;LAA(2).1-12;

LAA(1).1-6;

JNC(2).1-6

JNC(1).1, 2, 5, 6

22 3 KALA.1; LUA.2, 3 22 5 BREU.1-5

23 8 KALA.2-5; SAM.1-5 23 2 MUSSU.1-2

24 1 EVA.1 24 2 RBM.1; RPI.4

25 2 EVA.2, 3 25 3 RBM.2; RPI.2, 6

26 1 EVA.4 26 4 RBM.3-5, RPI.1

27 1 EVA.5 27 2 JATU.1, 2

28 1 RBM.1 28 1 JATU.4

29 4 RBM.2; RPI2, 6, 5

29 4

RJX.2; TAPA.1

IAHA.3,4

30 5 RBM.4, 3, 5; JATU.2, 3 30 7

RJX.3, 5; TAPA.2-

Tabela 6: Continuação

31 2 RPI.1, 3 31 3 IAHA.1, 2, 5

32 3 RCB.2, 3, 4

33 1 RCB.5

34 1 SAM.4

35 3 MUSSU.1-3

36 2 JATU.1,4

37 1 JATU.5

38 3 LUA.1, STR.2, 5

39 2 STR.1, 4

40 3 ARACA.1, 3, 5

41 1 ARACA.2

Foram gerados 41 e 31 haplótipos a partir das seqüências de COI e região controle,

respectivamente. A seqüência do gene COI da espécie Rivulus hartii e a seqüência da

região controle (RC) da espécie Phallichthys amates foram usadas como grupo externo

(outgrup). Os haplótipos mais freqüentes estão em negrito. Localidades: afluentes do

estado do Amapá (CALÇ; 4; 5; 10; 11;TZ; TG); Ilha de Marajó (26; SALV); rio Orinoco

(VEN); rio Solimões próximo a reserva Amanã (SAM; KALA); rio Purus (LUA, LAA(1);

LAA(2); BREU; BACU); rio Negro próximo a São Gabriel da Cachoeira (IAHA, CURI), rio

Negro próximo a Santa Izabel do Rio Negro (MAXI, MGC, RJX, TAPA); rio Negro próximo

a Barcelos (ARACA); baixo rio Branco (RCB); rio Amazonas próximo a Manaus (JNC(1) e

JNC(2); MAO; EVA); rio Madeira (JATU, RPI, RBM); rio Amazonas próximo a Santarém

(STR) e rio Trombetas (MUSSU; TROM).

As análises de MP e MV para o gene COI e região controle

evidenciaram a formação de seis clados distintos bem suportados:

Fluviphylax sp. (Alto rio Negro – Santa Izabel do Rio Negro, São Gabriel da

Cachoeira e bacia do Orinoco); F. obscurus s.s. (Médio rio Negro – rio

Jurubaxi, Barcelos, rio Branco); F. pygmaeus (bacia do rio Madeira); F.

simplex (rio Solimões, Purus, lago Janauacá, Amazonas e Trombetas); F.

palikur (Amapá e Ilha de Marajó) e F. zonatus (Manaus e rio Preto da Eva)

(figura 13 a 16). Interessantemente, nas análises filogenéticas de MP e MV

para ambos os marcadores moleculares, F. obscurus s.s. que habita o

baixo rio Negro até a cidade de Barcelos formou um clado separado da

espécie Fluviphylax sp. que habita o alto rio Negro e a bacia do Orinoco.

Fluviphylax sp. fora diagnosticada como F. obscurus em levantamentos

faunísticos realizados por Arrington & Winemiller (2003), Hoeinghaus et al.

(2004) e Lasso et al. (2005).

Nas análises do gene COI não foram incluídas seqüências de F.

palikur, localidades Amapá e Ilha de Marajó, pois os primers utilizados

foram inespecíficos, hibridizando-se a outra região do genoma dessa

espécie. As seqüências dos indivíduos de F. zonatus provenientes do rio

Tarumã e do rio Preto da Eva foram excluídas das análises da região

controle devido à baixa qualidade das mesmas.

A árvore filogenética de MP, gerada pelas seqüências do gene COI,

não apresentou resolução para os ramos dos clados F. simplex, F. zonatus,

F. pygmaeus e Fluviphylax sp., desta forma, não foi possível verificar a

relação filogenética entre esses clados. Apesar da politomia encontrada,

cada espécie foi agrupada dentro de um clado bem suportado. Quase

todos os clados apresentaram suporte de bootstrap de 100%, exceto o

clado F. pygmaeus com suporte de 99%. O clado formado pela espécie F.

obscurus s.s. é grupo irmão de todos os demais clados (figura 13).

Os resultados encontrados na reconstrução filogenética sob MV para

o gene COI foram semelhantes aos resultados da filogenia sob MP. O

clado formado pelo agrupamento (F. zonatus, F. pygmaeus, (F. simplex,

Fluviphylax sp.)) apresentou suporte de bootstrap de 79%. Os clados F.

simplex e Fluviphylax sp. foram agrupados, contudo, com baixo suporte de

booststrap (55%). Assim como na relação filogenética sob MP, F. obscurus

s.s. apresentou-se como grupo irmão do clado remanescente (figura 14).

Nos resultados filogenéticos de MP para a região controle, as

espécies de Fluviphylax também formaram clados bem suportados. Os

clados dos F. palikur e F. pygmaeus apresentaram suporte de bootstrap de

100%. Os clados Fluviphylax sp., F. simplex e F. obscurus s.s

apresentaram suporte de boostrap de 99%, 97% e 85%, respectivamente,

figura 15. O clado F. palikur é grupo irmão do clado (F. obscurus s.s, (F.

pygmaeus, F. simplex, Fluviphylax sp.)) e esse apresentou suporte de

bootstrap de 100%. F. obscurus s.s. é grupo irmão do clado politômico (F.

pygmaeus, F. simplex e Fluviphylax sp.). Não foi possível estabelecer a

relação filogenética entre os clados F. pygmaeus, F. simplex e Fluviphylax

sp..

Os relacionamentos filogenéticos sob o critério de MV para a região

controle foram semelhantes aos resultados para MP. O agrupamento

Fluviphylax sp. e F. simplex apresentaram suporte de bootstrap de 58%,

desta forma, esse agrupamento não é confiável. O clado F. palikur

posicionou-se como grupo irmão de (F. obscurus s.s., (F. pygmaeus, F.

simplex e Fluviphylax sp.)), por sua vez F. obscurus s.s. mostrou-se como

grupo irmão do clado (F. pygmaeus, F. simplex, Fluviphylax sp.). Não foi

possível determinar a relação entre F. pygmaeus, F. simplex e Fluviphylax

sp. (figura 16).

Figura 13: Relação filogenética reconstruída a partir de seqüências do gene Citocromo

Oxidase I sob os critérios de Máxima Parcimônia. Reconstrução filogenética realizada com

1000 buscas heurísticas e adições aleatórias (random), implementando algoritmo Tree

Bisection and Reconnection (TBR) com 1000 replicas de bootstrap. Reconstrução

filogenética realizada apenas com seqüências representando cada um dos haplótipos

gerados pelo programa Collapse1.2, as freqüências de cada haplótipo são mostradas na

tabela 6. Como grupo externo foi utilizado a seqüência do gene COI da espécie Rivulus

hartii obtida no Genbank pelo acesso AF002619.

Fluviphylax sp.

alto rio Negro

Sta. Izabel + São Gabriel +

rio Orinoco (Venezuela)

F. simplex

Solimões (Reserva Amanã) +

Purus (RDS Ayauá) + Lago

Janauacá (confluência

Solimões-Amazonas) +

Amazonas + Trombetas

F. zonatus

rio Perto da Eva +

Igarapé Tarumã

F. pygmaeus

Bacia rio Madeira

F. obscurus s.s.

médio rio Negro

Sta. Izabel + Barcelos

+ rio Branco

Figura 14: Relação filogenética reconstruída a partir

de seqüências do gene Citocromo Oxidase I sob os

critérios de Máxima Verossimilhança. Hipótese

filogenética reconstruída usando o programa

Treefinder (Jobb et al., 2004), com robustez de 1000

replicas não paramétricas de bootstrap. O modelo

evolutivo definido pelo modeltest foi o HKY85 + G.

Como grupo externo foi utilizado a seqüência do gene

COI da espécie Rivulus hartii obtida no Genbank pelo

acesso AF002619.

Fluviphylax sp.

alto rio Negro

Sta. Izabel + São Gabriel +

rio Orinoco (Venezuela)

F. simplex

Solimões (Reserva Amanã) +

Purus (RDS Ayauá) + Lago

Janauacá (confluência

Solimões-Amazonas) +

Amazonas + Trombetas

F. zonatus

rio Perto da Eva + Igarapé

Tarumã

F. pygmaeus

Bacia rio Madeira

F. obscurus s.s.

médio rio Negro

Sta. Izabel + Barcelos + rio Branco

ARACA.1, 3, 5

ARACA.2

RCB.2

RCB.3

RCB.4

RCB.5

IAHA.1

IAHA.2

IAHA.5

IAHA.3, 4

RJX.2, 3, 4, 5

TAPA.1, 2, 3, 4, 5

JNCii_3

BACU.1, 2

BACU.3

LAAii.4, 8, 10, 12

BACU.5

BACU.4

JNCi.1, 2, 3, 4, 5, 6

JNCii.1, 2, 4, 5, 6

LAAi.1, 2, 3, 4

LAAii.1, 2, 3, 5, 6, 7, 9, 11

LUA.1

STR.2

STR.5

STR.1

STR.4

LUA.4

STR.3

KALA.1

KALA.2, 3, 4, 5

SAM.1, 2, 3

SAM.4

SAM.5

LUA.2

LUA.3

MUSSU.1

MUSSU.2

MUSSU.3

100

BREU.1

BREU.2

BREU.3

BREU.4

BREU.5

100

VEN.2

VEN.3

VEN.1

100

CURI.1

CURI.2

CURI.3

CURI.4

CURI.5

MAXI.1

MAXI.4

MAXI.2

MAXI.5

MAXI.3

MGC..1

MGC.5

MGC.4

MGC.2

MGC.3

RPI.1, 3

RBM.1

100

JATU.1

JATU.4

JATU.2

JATU.3

RBM.3, 4, 5

JATU.5

RBM.2

RPI.2, 5, 6

EVA.1

EVA.4

EVA.2

EVA.3

MAO.5

EVA.5

MAO.1

MAO.3

MAO.4

MAO.2

100

0.0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

Rivulus_hartii

Figura 15: Relação filogenética reconstruída a partir de seqüências da Região Controle sob os

critérios de Máxima Parcimônia. Reconstrução filogenética realizada com 1000 buscas

heurísticas e adições aleatórias (random), implementando algoritmo Tree Bisection and

Reconnection (TBR) com 1000 réplicas de bootstrap. Reconstrução filogenética realizada

apenas com as seqüências de cada um dos haplótipos gerados pelo programa Collapse1.2, as

freqüências de cada haplótipo são mostradas na tabela 6. Como grupo externo foi utilizado a

seqüência da região controle da espécie Phallichthys amates obtida no Genbank pelo acesso

DQ377041.

Fluviphylax sp.

alto rio Negro

Sta. Izabel + São Gabriel +

rio Orinoco (Venezuela)

F. simplex

Solimões (Reserva Amanã) +

Purus + Lago Janauacá +

Amazonas + Trombetas

F. palikur

Amapá + Ilha de Marajó

F. pygmaeus

Bacia rio Madeira

F. obscurus s.s.

médio rio Negro

Sta. Izabel + Barcelos +

rio Branco

Phallichth

s amates

Figura 16: Relação filogenética reconstruída a partir

de seqüências da Região Controle sob os critérios de

Máxima Verossimilhança. Hipótese filogenética

reconstruída usando o programa Treefinder (Jobb et

al., 2004), com robustez de 1000 replicas não

paramétricas de bootstrap. O modelo evolutivo

definido pelo modeltest foi HKY85 + G. Como grupo

externo foi utilizado a seqüência da região controle da

espécie Phallichthys amates obtida no Genbank pelo

acesso DQ377041.

F. palikur

Áreas macro-geográficas: Amapá e Marajó

(Afluentes dos rios estado do Amapá +

Ilha de Marajó)

Fluviphylax sp.

Área macro-geográfica:

Alto rio Negro

(Sta. Izabel + São Gabriel

+ rio Orinoco-Venezuela

)

F. simplex

Áreas macro-geográficas: Solimões e

Amazonas

(Reserva Amanã + RDS Ayauá + Lago

Janauacá + Trombetas + Santarém)

F. pygmaeus

Área macro-geográfica:

Madeira

Phallichthys amates

AMAPA_10.1, 2, 3, 4, 5

AMAPA_11.1, 2, 3, 4, 5

MARAJO_26.2

MARAJO_26.3

MARAJO_26.4

SALV.5

MARAJO_26.5

AMAPA_4.1, 3, 5

AMAPA_5.1, 2, 3, 4, 5

CALC.1

CALC.2

CALC.3

CALC.4, 5

TG.2

TG.2, 3, 5

TZ.1, 2, 3, 4, 5

SALV.6

SALV.1

SALV.2, 3, 4

100

BACU.1, 2, 4, 5

JNCi.1, 2, 5, 6

JNCii.1, 2, 3, 4, 5, 6

LAAi.1, 2, 3, 4, 5, 6

LAAii.1, 2, 3, 4, 5, 6, 7

LAAii.8, 9, 10, 11, 12

STR.3

BREU.1

BREU.2

BREU.3

BREU.4

BREU.5

100

MUSSU.1

MUSSU.2

TROM.1

STR.1

STR.4, 5

CURI.1, 2, 3, 4, 5

MAXI.1, 2, 3, 4, 5

MGC.1

MGC.2, 3, 4, 5

VEN.6

JATU.1

JATU.2

JATU.4

RBM.1

RPI.4

100

RBM.2

RPI.2

RPI.6

RBM.3

RBM.4, 5

RPI.1

100

IAHA.1

IAHA.2

IAHA.5

IAHA.3, 4

RJX.2

TAPA.1

RJX.3, 4, 5

TAPA.2, 3, 4, 5, 6

ARACA.1

ARACA.2, 3, 4

100

0.0

0.02

0.04

0.06

0.08

0.1

0.12

0.14

0.16

0.18

0.2

0.22

0.24

F. obscurus s.s.

Área macro-geográfica: Médio rio Negro

(Sta. Izabel + Barcelos + rio Branco)

As análises de distância-p inter e intra-específicas foram realizadas

para os clados formados pelas reconstruções filogenéticas de MP e MV. O

maior valor de distância-p inter-específico encontrado em relação ao gene

COI foi obtido entre os clados F. simplex em comparação com os clados F.

zonatus e F. obscurus s.s. com distância-p de 0,19 em ambas

comparações. Os clados F. simplex e Fluviphylax sp. obtiveram a menor

distância-p com 0,12. A distância-p intra-específica para o gene COI variou

de 0,01 a 0,02 (tabela 7).

Tabela 7: Matriz de distância-p par-a-par inter e intra-específica gerados a partir das

análises de MP e MV para os conjuntos de dados do gene COI e região controle.

Gene COI

Distância-p inter clados

Intra

clados

Região Controle

Distância-p inter clados

Intra

clados

1 2 3 4 5

1 – Fluviphylax sp. 0,02 1 – Fluviphylax sp. 0,02

2 - F. obscurus s.s. 0,14 0,01 2 - F. obscurus s.s. 0,13 0,00

3 - F. simplex

0,12 0,16

0,01 3 - F. simplex 0,11

0,09

0,02

4 - F. zonatus 0,13 0,15

0,16

0,01 4 - F. pygmaeus 0,14 0,10 0,10 0,02

5 - F. pygmaeus

0,15 0,14 0,13 0,13 0,02 5 - F. palikur

0,29 0,25 0,28 0,29

0,01

Com relação às seqüências da região controle, o clado F. palikur

apresentou expressiva distância-p inter-específica em comparação com os

demais clados, o valor da distância variou entre 0,25 a 0,29. Os clados

Fluviphylax sp. e F. obscurus s.s. apresentaram distância de 0,13. A menor

distância encontrada foi entre os clados F. simplex e F. obscurus s.s., com

valor par-a-par de 0,09. O valor da distância-p intra-específica para os

clados variou de 0,01, clados F. palikur, a 0,02 para o clado F. pygmaeus,

F. simplex e Fluviphylax sp. O clado F. obscurus s.s. apresentou distância

intra-específica igual a 0,00 (tabela 7).

2.3.2 – Análise de agrupamento populacional (PAA)

Na análise de agrupamento populacional (PAA) foram distinguidas

seis espécies, que apresentaram caracteres apomórficos únicos:

Fluviphylax sp., F. obscurus s.s., F. simplex, F. zonatus, F. pygmaeus e F.

Nota: Em negrito foram representados os maiores e menores valores de distância-p

inter-específica.

Tabela 8: Número de sítios (caracteres) apomórficos únicos dos

sítios variáveis do gene COI e região controle.

palikur. Os sítios apomórficos do gene COI e região controle podem ser

acompanhados, respectivamente, nas tabelas dos apêndices B e C.

A nova espécie Fluviphylax sp. foi diferenciada das demais espécies

por sete e cinco sítios (caracteres) apomórficos únicos para o gene COI e

região controle, respectivamente. F. obscurus, F. zonatus e F. simplex

apresentaram 16, 14 e 13 sítios apomórficos únicos para o gene COI. F.

palikur apresentou 44 sítios apomórficos únicos para a região controle,

enquanto as demais espécies não ultrapassaram 5 sítios apomórficos

únicos. As espécies aqui definidas foram diagnosticadas conforme a

presença de apomorfias únicas para o grupo.

Sítios apomórficos únicos

Espécies

Gene COI Região Controle

Fluviphylax sp.

F. obscurus s.s.

16 4

F. simplex

13 4

F. pygmaeus

5 4

F. zonatus

14 -

F. palikur

- 44

2.3.3 - Análises morfométricas

As variáveis comprimento total (CT), comprimento da cabeça (CC) e

altura do corpo (AC) foram transformados em classes de medidas (resíduos)

por regressão. Na tabela 9 estão listados os componentes principais (fatores) e

o coeficiente de cada variável morfométrica sobre os componentes.

Após a regressão, foi verificado a influência dos resíduos CT, AC e CC

sobre os componentes principais (fatores). As variáveis residuais altura do

corpo (resíduo AC) e comprimento da cabeça (resíduo CC) apresentaram

maior influência sobre a fator 1, com coeficientes de grandeza numérica igual a

0,774 e 0,769 respectivamente. Convêm ressaltar que cada fator é composto

pela participação das três variáveis residuais analisadas (AC, CC e CT). A

variável residual CT foi dominante sobre o fator 2 e contribuiu com um

coeficiente de grandeza numérica de 0,980, sendo a variável residual de maior

importância, enquanto que os valores para as demais variáveis residuais foram

menores.

Tabela 9: Correlação entre os componentes e os resíduos das variáveis morfométricas

Variáveis Componente principal (Fatores)

1 2 3

RESIDUAL_AC

0,774

0,138 -0,618

RESIDUAL_CC

0,769

-0,177 0,614

RESIDUAL_CT 0,030

0,980

0,198

Variância explicada por componente 1,192 1,010 0,798

Porcentagem total da variância explicada 39,73% 33,68% 26,59%

Os caracteres morfométricos coletados foram transformados em resíduo por

regressão dos quadrados mínimos. (AC) altura do corpo; (CC) comprimento da cabeça

e (CT) comprimento total.

As variâncias explicadas para os fatores 1, 2 e 3 foram 1,192, 1,010 e

0,798 respectivamente. Os fatores 1 e 2 juntos explicam 78,40% da variância

total. A porcentagem do total de variância explicada para cada componente foi

de 39,73% para o fator 1; 33,68% para o fator 2 e 26,59% para explicar o fator

3 (Tabela 9). Nota-se que os fatores em geral apresentaram relativamente o

mesmo percentual para explicar a variância.

Nos estudos gráficos de dispersão dos componentes principais, em que

os eixos cartesianos foram representados pelos fatores de interesse, não foi

possível distinguir os clados definidos pela filogenia molecular, pois houve uma

sobreposição dos resíduos resumidos nos componentes principais. As

representações gráficas das dispersões dos resíduos resumidos podem ser

observadas na figura 17. Os fatores 1, 2 e 3 foram plotados em coordenadas

cartesianas e nenhum agrupamento foi observado.

Figura 17: Gráficos de dispersão das variáveis residuais resumidos em componentes

principais. Caracteres morfométricos analisados: comprimento da cabeça (CC); altura do corpo

(AC) e comprimento total (CT).

-3 -2 -1 0 1 2 3 4

FACTOR(1)

-4

-3

-2

-1

(

)

zonatus

sp.nov.

simplex

pygmaeus

palikur

obscurum

CLADE

-3 -2 -1 0 1 2 3 4

FACTOR(1)

-3

-2

-1

(

)

zonatus

sp.nov.

simplex

pygmaeus

palikur

obscurum

CLADE

-4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4

FACTOR(2)

-3

-2

-1

(

)

zonatus

sp.nov.

simplex

pygmaeus

palikur

obscurum

CLADE

F. obscurus s.s.

F. palikur

F. pygmaeus

F. simplex

Fluviphylax sp.

F. zonatus

F. obscurus s.s.

F. palikur

F. pygmaeus

F. simplex

Fluviphylax sp.

F. zonatus

F. obscurus s.s.

F. palikur

F. pygmaeus

F. simplex

Fluviphylax sp.

F. zonatus

FATOR (2)

FATOR (3) FATOR (3)

FATOR (1)

FATOR (2)

CLADO

Least Squares Means

CLADE

-2

-1

(

)

FATOR (3)

Least Squares Means

CLADE

-1

(

)

Least Squares Means

CLADE

-1.0

-0.5

0.0

0.5

1.0

(

)

FATOR (1)

FATOR (2)

Após verificar a dispersão gráfica dos fatores representados na figura

17, foi verificada a influência de cada fator sobre os clados filogenéticos,

usando o modelo linear generalizado. Os resultados gráficos podem ser

visualizados na figura 18. Por meio do fator 1 foi possível distinguir os clados

formados pelas espécies F. obscurus s.s. e F. zonatus, com significância de P

< 0,05, figura 18A. Por esse fator não foi possível distinguir os demais clados.

O fator 2 não apresentou significância em distinguir os clados (P > 0,05). Pelo

fator 3 foi possível distinguir o clado F. zonatus com significância de P < 0,05,

assim como, observado nos resultados apresentados para o fator 1.

Figura 18:

Quadrados mínimos (Least Squares Means). Efeito dos componentes principais

(fatores) sobre os clados filogenéticos, usando o modelo linear generalizado (generalized linear

model).

Os resultados estatísticos, resumidos em gráficos, evidenciaram a

sobreposição dos clados, com exceção para o F. zonatus e F. obscurus.

2.3.4 - Análises morfológicas

O critério para análise dos caracteres morfológicos por PCA foi a

ausência e presença dos mesmos: nadadeira anal arredondada e curta (NAR);

nadadeira pélvica curta (NPC); origem da nadadeira dorsal próximo à base

vertical do penúltimo raio da nadadeira anal (OND); canal pré-opercular aberto

em jovens e adultos (CPO); mancha preta na borda posterior da nadadeira

dorsal dos machos (MPD) e barras transversais no corpo (PBC).

Adicionalmente, analisou-se o número de raios na nadadeira dorsal (RND) e

nadadeira anal (RNA).

Os caracteres morfológicos foram resumidos por análise de componente

principal. Oito fatores principais foram gerados, contudo, somente os fatores 1,

2 e 3 apresentaram valores de auto-valor (Eigenvalue) superior a 1. A

porcentagem de variância explicada pelos três primeiros fatores foi de 79,78%,

sendo assim, os demais fatores não foram resumidos por PCA. No fator 1, as

variáveis que mais contribuíram foram: OND (0,965), MPD (0,918) e RNA

(0,963). As variáveis PBC e RND contribuíram com valor de grandeza de 0,808

e 0,772, respectivamente para o fator 2. Para o fator 3 apenas a variável NPC

foi expressiva com valor de grandeza de 0,972 (tabela 10). As porcentagens de

variância explicadas pelos fatores (componentes) são: 45,76% para fator 1;

18,00% para fator 2 e 16,02% para fator 3.

Tabela 10: Correlação entre componentes e variáveis dos caracteres morfológicos.

Variáveis residuais Componentes principais

1 2 3 4 5 6 7 8

Caractere NAR -0,854 -0,059 0,468 -0,154 0,014 -0,057 0,134 -0,051

Caractere NPC 0,024 0,167

0,972

-0,110 0,072 0,042 -0,079 0,031

Caractere OND

0,965

0,187 0,121 0,033 0,013 0,087 -0,054 -0,083

Caractere CPO 0,104 0,285 -0,210

-0,929

-0,018 0,001 -0,009 0,003

Caractere MPD

0,918

0,194 0,126 0,037 0,023 -0,318 0,033 0,007

Caractere PBC -0,309

0,808

0,005 0,173 -0,471 0,009 0,006 0,002

Caractere RND -0,350

0,772

-0,174 0,155 0,476 0,018 0,013 0,001

Caractere RNA

0,963

0,080 0,111 0,009 -0,000 0,172 0,151 0,031

Variância explicada

por componente

3,661

1,441

1,282

0,956

0,455

0,144

0,051

0,011

Porcentagem total da

variância explicada

45,76%

18,00%

16,02%

11,94%

5,68%

1,79%

0,63%

0,14%

(NAR) Presença de nadadeira anal arredondada e curta; (NPC) presença de nadadeira pélvica

curta; (OND) origem da nadadeira dorsal próximo à base vertical do penúltimo raio da nadadeira

anal; (CPO) canal pré-opercular aberto em jovens e adultos; (MPD) mancha preta na borda

posterior da nadadeira dorsal dos machos; (PBC) presença de barras transversais no corpo; (RND)

número de raios na nadadeira dorsal e (RNA) número de raios na nadadeira anal.

Pela dispersão dos fatores em coordenadas cartesiana foi possível

distinguir os clados F. pygmaeus e F. palikur (figura 19A). O clado F. pygmaeus

foi distinguido dos demais clados em todas as comparações entre os fatores.

Os espécimes de F. pygmaeus são endêmicos do rio Madeira e apresentam a

nadadeira pélvica bastante alongada, sendo essa característica presente

apenas nessa espécie.

Pela dispersão gráfica entre os fatores 1-3 e 1-2 foi possível distinguir o

clado F. palikur, contudo, esse o clado não foi evidenciado quando analisado a

dispersão entre os fatores 2 e 3 (figura 19 A, B, C).

Figura 19: Gráficos de dispersão dos componentes principais (fatores) 1; 2 e 3, dos

caracteres morfológicos, após resumidos em PCA.

-4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4

FACTOR(1)

-3

-2

-1

(

)

zonatus

sp.nov.

simplex

pygmaeus

palikur

obscurum

CLADE

-4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4

FACTOR(1)

-4

-3

-2

-1

(

)

zonatus

sp.nov.

simplex

pygmaeus

palikur

obscurum

CLADE

-3 -2 -1 0 1 2 3 4 5 6

FACTOR(2)

-4

-3

-2

-1

(

)

zonatus

sp.nov.

simplex

pygmaeus

palikur

obscurum

CLADE

F. obscuru s.s.

F. palikur

F. pygmaeus

F. simplex

Fluviphylax sp.

F. zonatus

F. obscurus s.s.

F. palikur

F. pygmaeus

F. simplex

Fluviphylax sp.

F. zonatus

F. obscurus s.s.

F. palikur

F. pygmaeus

F. simplex

Fluviphylax sp.

F. zonatus

FATOR (3)

FATOR (2)

FATOR (3)

CLADO

FATOR (2)

FATOR (1)

Após a distribuição gráfica dos fatores de interesse, foi analisada

estatisticamente a capacidade de cada fator em distinguir os agrupamentos,

usando o modelo linear generalizado. Sob o fator 1 apenas F. simplex e

Fluviphylax sp. não foram diferenciadas, sobrepondo-se os intervalos de

confiança (figura 20A). Tendo como referência o fator 2, o clado F. zonatus

distinguiu-se em relação aos demais clados (figura 20B). Em comparação ao

fator 3, o clado F. pygmaeus distingue-se expressivamente em relação aos

demais (figura 20C). Todos os fatores apresentaram índice de significância de

P < 0,05 em distinguir os clados.

Figura 20: Quadrados mínimos (Least Squares Means). PCA dos fatores dos dados morfológicos

em relação aos clados formados pelas análises moleculares

Least Squares Means

CLADE

-4

-3

-2

-1

(

)

Least Squares Means

CLADE

-2

(

)

FATOR (1)

Least Squares Means

CLADE

-1

(

)

FATOR (2)

FATOR (3)

2.3.5 - Nota: morfologia externa da espécie F. palikur

Os espécimes de F. palikur apresentaram a porção anterior do corpo até

a base da nadadeira dorsal cilíndrica e a porção antero-posterior do corpo

bastante alongada. A porção dorso-ventral mostrou-se delgada. A nadadeira

anal mostrou-se pontiaguda com projeção do 10º e 11º raios. Assim como a

nadadeira anal, a nadadeira caudal apresentou duas projeções, sendo essas o

alongamento dos três primeiros e três últimos raios da nadadeira caudal (figura

21).

3 mm

Figura 21: Desenho esquemático e foto da espécie F. palikur. A – desenho

esquemático feito por Costa & Le Bail (1999) a partir do holótipo, macho, 12,0

mm comprimento padrão (MZUSP 52941); B – fotografia do espécime de 16,5

mm de comprimento total da espécie

F. palikur, coletado próximo à cidade de

Calçoene, estado do Amapá (Foto: Eduardo R. Souza).

Em média, os F. palikur apresentaram comprimento padrão igual a 1,43

mm e comprimento total de 1,86 mm. Os espécimes das localidades

Tartarugalzinho e Amapá (10) apresentaram maior comprimento padrão, 1,54

mm e 1,78 mm respectivamente, em relação aos espécimes das demais

localidades. Os dados para os demais espécimes estão representados na

tabela 11.

Tabela 11: Medidas morfométricas da espécie F. palikur e localidade amostrada.

Nota: CP, comprimento padrão; CT, comprimento total; CC, comprimento da cabeça; e AC,

altura da cabeça. Os dados foram medidos com paquímetro com precisão de 0.01 mm. As

medidas estão representadas em centímetros.

Média

Localidade

N°

Ind.

CP CT CC AC

Georeferenciamento

Ilha de Marajó - Selvaterra km23

1,46 1,86 0,40 0,25 00°46'53,72"S/48°32'15,30"W

Ilha de Marajó - Cach. do Arari (26)

16 1,34 1,76 0,34 0,21

01°00'46,50"S/48°57'13,14"W

Amapá - (04) km 486

1,48 1,86 0,41 0,26 01°47'10,38"N/50°52'37,20"W

Amapá - (05)

1,46 1,91 0,40 0,27 01°53'52,14"N/50°52'07,80"W

Rio Calçõene Amapá (06)

1,32 1,67 0,39 0,22 02°11'13,14"N/50°54'23,64"W

Amapá (10) sobre ponte

1,78 2,31 0,47 0,62 02°07'21,12"N/50°53'29,58"'W

Amapá (11)

1,22 1,62 0,33 0,21 01°54'33,66"N/50°52'08,22"W

Riacho Tartarugalzinho

1,54 2,00 0,43 0,26 01°28'17,22"N/50°53'50,04"W

Tartarugal Grande

1,27 1,71 0,34 0,21 01°23'52,38"N/50°55'28,74"W

Total

148

1,43 1,86 0,39 0,28

2.4 - Discussão

2.4.1 - Relação filogenética do gênero Fluviphylax

Interessantemente, os resultados moleculares suportam a existência de

uma nova espécie para o gênero Fluviphylax. A nova espécie foi relacionada à

espécie F. simplex, contudo, com baixo suporte de bootstrap. Fluviphylax sp.

possui uma distribuição no alto rio Negro até a bacia do rio Orinoco. Essa nova

espécie foi coletada nas redondezas da cidade de Santa Izabel do Rio Negro;

lago Maxí, situado entre Santa Izabel do Rio Negro e São Gabriel da

Cachoeira; no baixo rio Curicuari próximo à cidade de São Gabriel da

Cachoeira; e no rio Cinaruco, bacia do Orinoco, Venezuela. Os detalhes dos

locais de coleta e georeferenciamento estão expressos no apêndice A. Estudos

enfocando inventários faunísticos e composição de assembléias de peixes no

alto rio Negro e na bacia do Orinoco (e.g. Arrington & Winemiller, 2003;

Hoeinghaus et al., 2004; Lasso et al., 2005) têm relatado a presença de F.

obscurus, contudo, esses indivíduos não foram analisados por métodos

morfológicos nem moleculares. Costa (1996) somente analisou os espécimes

de F. obscurus próximas à cidade de Barcelos/AM, muito provavelmente os

indivíduos coletadas no alto rio Negro e bacia do Orinoco seja da nova espécie

Fluviphylax sp.. Em álcool, os indivíduos da espécie Fluviphylax sp.

apresentaram uma coloração alaranjada, enquanto F. obscurus são marrom

escuro.

O gênero Fluviphylax possui uma recente história taxonômica, e os

estudos enfocando suas espécies são escassos. A primeira e única filogenia

reconstruída para determinar a relação dentre as espécies de Fluviphylax foi

proposta por Costa (1996) (figura 22). Costa & Le Bail (1999) descreveram uma

nova espécie para o gênero, F. palikur, e propuseram que essa fosse grupo

irmão de todas as demais espécies do gênero. Costa (1996) sugere que F.

obscurus é grupo irmão do clado (F. zonatus, (F. simplex, F. pygmaeus)). O

único caráter que agrupa o clado (F. zonatus, (F. simplex, F. pygmaeus)) é o

processo dorsal do cleitro delgado e alongado.

A espécie F. zonatus foi definida como grupo irmão do clado F. simplex

e F. pygmaeus, sendo que esse grupo é suportado pela ausência da cartilagem

rostral e processo ventral do pós-temporal reduzido.

Figura 22: Hipótese de relações filogenéticas entre as espécies do gênero Fluviphylax. A,

reconstrução filogenética baseada em dados morfológicos proposta por Costa (1996) e Costa &

Le Bail (1999); B, filogenia baseada em seqüências do gene COI e região controle do DNA

mitocondrial, adaptadas a partir dos resultados propostos no presente trabalho.

Os resultados encontrados no presente trabalho corroboram com Costa

(1996) e Costa & Le Bail (1999), contudo, existem ressalvas quanto à relação

das espécies F. zonatus, F. simplex e F. pygmaeus (figura 22). Tanto sob os

critérios de MP quanto de MV para região controle, a espécie F. palikur

apresentou-se como grupo irmão de F. simplex e F. pygmaeus, com alto índice

de suporte de bootstrap. F. obscurus s.s. mostrou-se como grupo irmão do

clado (F. simplex, F. zonatus, F. pygmaeus, Fluviphylax sp.), sob os critérios de

MP para ambos marcadores moleculares, exceto para a espécie F. zonatus

que não foi relatada utilizando a região controle. As espécies Fluviphylax sp. e

F. simplex formaram um grupo, contudo, com baixo suporte sob os critérios de

MV para ambos marcadores. Desta forma, nesse trabalho não foi possível

determinar a relação filogenética entre as espécies F. simplex, F. zonatus, F.

pygmaeus, Fluviphylax sp.. Provavelmente, esses clados divergiram-se em um

curto espaço de tempo entre si. Todas as espécies de Fluviphylax foram

monofiléticas.

Pelos resultados de distância-p par-a-par foi observado pouca variação

intra-específica nos clados gerados nas análises filogenéticas (tabela 7). O

valor de distância-p intra-específico variou de 0,01 a 0,03. Os maiores valores

de distância-p intra-específicos (0,03) foram encontrados para os clados

obscu

Fluviphylax sp. e F. pygmaeus a partir das seqüências da região controle. A

distância-p inter-específica entre os clados Fluviphylax sp. e F. obscurus foram

de 0,14 e 0,22, respectivamente, para o gene COI e região controle. Esses

dados corroboram com a proposta da nova espécie Fluviphylax sp., pois essas

espécies são separadas geneticamente (tabela 7).

A espécie F. palikur apresentou altos valores de distância-p inter-

específico em comparação às demais espécies, isso sugere que F. palikur

apresenta grande diferença genética, confirmando o relacionamento

filogenético encontrado para a espécie.

2.4.2 – Análises de agrupamento populacional (PAA)

No presente trabalho adotou-se o conceito filogenético de espécie

formulado por Rosen (1978; 1979). O autor define o conceito filogenético de

espécie como “um grupo de indivíduos restrito geograficamente com alguns

caracteres apomórficos únicos representa uma unidade evolutiva significante”.

A partir dessa definição Rosen (1978;1979) argumenta que toda população ou

grupos de populações distinguidas por algumas apomorfias definidas são

potencialmente informativos, se eles diferem de outras populações

qualitativamente ou apenas quantitativamente. Desta forma, uma espécie é

uma população ou grupo de populações definidas por um ou mais fatores

apomórficos.

Seguindo a metodologia proposta por Davis & Nixon (1992) para

análises de agrupamento populacional (PAA), os sítios variáveis parcimoniosos

do gene COI e região controle foram analisados como estados de caracteres

apomórficos para delimitar as espécies, conforme definido por Rosen (1978;

1979). A partir dessa metodologia foram evidenciadas seis espécies para o

gênero Fluviphylax: Fluviphylax sp., F. obscurus s.s., F. zonatus, F. simplex, F.

palikur e F. pygmaeus.

Costa (1996) e Costa & Le Bail (1999) descreveram quatro espécies de

Fluviphylax (F. obscurus s.s., F. zonatus, F. simplex e F. palikur) e revisaram a

espécie F. pygmaeus, baseando-se em caracteres morfológicos e merísticos

adotando o conceito filogenético de espécie definido por Rosen (1978; 1979).

A partir dos caracteres apomórficos moleculares foi possível diferenciar as

cinco espécies de Fluviphylax já descritas e evidenciar uma nova espécie para

o gênero. Essa nova espécie (Fluviphylax sp.) foi diagnosticada por seis e

cinco caracteres apomórficos únicos para o gene COI e região controle,

respectivamente.

2.4.3 - Distinção morfométrica e morfológica

Nas análises dos caracteres morfométricos somente foram distinguidas

as espécies F. obscurus e F. zonatus. Para as demais espécies, os estados de

caracteres diagnosticados não apresentaram diferenças nítidas e houve uma

sobreposição das variáveis, quando visualizados em Análise de Componentes

Principais (PCA). Esses caracteres não são apropriados para a distinção de

todas as espécies de Fluviphylax.

Os indivíduos da espécie F. zonatus, coletados na cidade de Manaus

(rio Tarumã), apresentaram as medidas morfométricas superiores às medidas

das demais espécies. Surpreendentemente, todos os espécimes apresentaram

comprimento total superior a 17,0 mm, houve casos de indivíduos com

comprimento total de 24,0 mm e comprimento padrão de 18,5 mm. Os

espécimes estudados por Costa (1996) apresentaram comprimento padrão

variando de 9,0-15,9 mm.

Pelas análises dos dados morfológicos foi possível discernir dois

agrupamentos, um formado pela F. pygmaeus e o outro pela espécie F. palikur.

Os caracteres mancha preta na nadadeira dorsal (MPD) e origem da nadadeira

dorsal próximo à base vertical do penúltimo raio da nadadeira anal (OND)

foram os caracteres (variáveis) preponderantes na influência do fator 1. O

número de raios na nadadeira dorsal (RND) e barras no corpo (PBC)

apresentaram maior influência sobre o fator 2 e apenas o caráter nadadeira

pélvica curta (NPC) apresentou forte influência sobre o fator 3.

Apenas a espécie F. palikur apresentou os caracteres MPD e OND, que

foram preponderantes sobre o fator 1. Devido a tal fato, este clado mostrou-se

distinto, quando plotados os fatores 1-2 e 1-3 nos eixos cartesianos. Quando os

fatores 2-3 foram plotados, esse clado foi sobreposto aos demais, por não

apresentar os caracteres com maior influência sobre os fatores 2 e 3.

O clado F. pygmaeus foi distinguido em todas as plotagens entre os

fatores 1, 2 e 3 nos eixos cartesianos. F. pygmaeus não apresenta o caráter

nadadeira pélvica curta (NPC), desta forma, foi possível distingui-la das demais

espécies.

Quando verificado a influência de cada fator sobre os clados, as

espécies F. palikur e F. zonatus foram distinguidas, pois foram as espécies que

apresentaram as características preponderantes nos fatores 1, 2. Já espécie F.

pygmaeus foi distinguida pelo fator 3 devido ser a única que não apresenta o

caráter que predomina sobre o fator 3.

Nas análises de PCA dos caracteres morfométricos e morfológicos não

foi possível diferenciar entre F. simplex e Fluviphylax sp. Todas as demais

espécies foram diferenciadas e diagnosticadas. Apesar de F. simplex e

Fluviphylax sp. não terem sido diferenciadas pelos caracteres morfológicos e

morfométricos, cada espécie foi diferenciada e diagnosticada pelos caracteres

moleculares. O mesmo foi evidenciado para as demais espécies utilizando a

análise de agrupamento populacional (PAA).

2.4.4 - Morfologia externa de F. palikur

O holótipo da espécie F. palikur, proveniente do rio Taparabu, tributário

do rio Oiapoque/AP, descrita por Costa & Le Bail (1999) não apresenta as

projeções da nadadeira caudal e anal como os espécimes de F. palikur

coletados no estado do Amapá e Ilha de Marajó. Tanto o holótipo quanto os

espécimes provenientes do Amapá e Ilha de Marajó tratam-se de indivíduos da

espécie F. palikur. Provavelmente, o holótipo e os demais espécimes descritos

por Costa & Le Bail (1999) sejam indivíduos pequenos que não completaram o

desenvolvimento sexual (figura 21).

2.5 - Considerações finais

A hipótese filogenética entre as espécies F. simplex, Fluviphylax sp., F.

zonatus e F. pygmaeus é duvidosa, pois provavelmente esses clados

divergiram-se em um curto espaço de tempo por eventos de colonização ou

radiação. A espécie F. palikur, distribuída nas drenagens do Atlântico e foz do

rio Amazonas, mostrou-se como grupo irmão de todas as demais espécies de

Fluviphylax. Essa espécie apresentou alta diferenciação genética em

comparação com as demais espécies.

Os dados genéticos evidenciaram a existência de uma nova espécie

para o gênero Fluviphylax. Essa espécie distribui-se no alto rio Negro, com

ocorrência no lago Cinaruco, bacia do Orinoco, Venezuela. Sugerimos que

análises osteológicas sejam realizadas, a fim de descrever essa nova espécie

e complementar as informações disponíveis.

A partir dos caracteres morfológicos e merísticos foi possível diferenciar

e diagnosticar apenas F. palikur, F. zonatus, F. obscurus s.s. e F. pygmaeus,

contudo, Fluviphylax sp. e F. simplex não foram diferenciadas entre si. Em

contrapartida, utilizando os sítios informativos parcimoniosos como apomórficos

únicos e seguindo a metodologia de análise de agrupamento populacional

(PAA) foi possível diagnosticar e diferenciar Fluviphylax sp. e F. simplex, assim

como as demais espécies.

A espécie F. simplex apresenta uma imensa área de distribuição, desde

o rio Solimões próximo à reserva Amanã até o rio Trombetas e proximidades

da cidade de Santarém, totalizando uma distância de 1400 km seguindo o

curso do rio. Nas análises filogenéticas essa espécie formou um grupo

monofilético e com baixa divergência genética intra-específica. Isso se deve ao

fato da espécie habitar áreas que estão sob influência do sistema de inundação

(várzea), o que permite a interconexão entre a área de ocorrência dessa

espécie.

A história taxonômica do gênero Fluviphylax é extremamente recente e

até o presente momento nenhum trabalho envolvendo análise genética foi

realizado. O presente trabalho buscou aumentar o conhecimento sobre a

diversidade e evolução da fascinante fauna de peixes de água doce,

principalmente sobre os Fluviphylax.

2.6 - Referências bibliográficas

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2.7 - Apêndice

Apêndice A – Localidades amostradas e georeferenciamento.

Espécie Local de coleta Sigla Coordenada sul

F. simplex Igarapé do Kalafate - Amanã Solimões KALA 02°39'37.2"S/64°35'39.0"W

F. simplex Igarapé Samauma - Amanã Solimões SAM 02°35'58.3"S/64°37'32.8"W

F. simplex Lago Uauaçu – rio Purus LUA 04°25'50.0"S/62°16'60.0"W

F. simplex Lago Ayapuá 1 e 2 – rio Purus LAA 04°27'45.2"S/62°12'08.0"W

F. simplex Lago do Breu – rio Purus BREU 04°08'58.0”S/62°20'02.6"W

F. simplex Lago do Bacuri – rio Purus BACU 04°22'03.7"S/62°08'24.9"W

F. simplex Lago Janauacará 1 e 2 – rio Amazonas JNC 03°28'43.0"S/60°17'06.0"W

F. simplex Lago Mussurá - Trombetas MUSSU 01°26'11.9"S/56°26'21.9"W

F. simplex Trombetas TROM 01°28'09.8"S/56°23'58.8"W

F. simplex Santarém STR 02°26'12.6"S/54°55'24.4"W

Fluviphylax sp Venezuela - Laguna Larga -Rio Cinaruco VEN 06°33'17.9"N/67°25'7.6"W

Fluviphylax sp Baixo Rio Curicuari CURI 00°13'24.3"S/66°48'10.6"W

Fluviphylax sp Lago Maxí - Rio Marié MAXI 00º26'41.1"S/66°25’42.8"W

Fluviphylax sp

Santa Izabel do Rio Negro

Margem da Cidade

MGC

00°24'59.0"S/65°01'00.2"W

F. obscurus Santa Izabel do Rio Negro - Lago Tapajé TAPA 00°31'09.3"S/64°49'54.1"W

F. obscurus Santa Izabel do Rio Negro - rio Jurubaxi RJX 00°31'09.1"S/64°49'54.6"W

F. obscurus Igarapé Iaha IAHA 00°24’58.7"S/64°36’24.0"W

F. obscurus Lago Araçá – rio Negro, Barcelos ARACA 00°32’02.3"S/62°55’44.40"W

F. obscurus Igarapé Xeriuini - Rio Branco RCB 01°14'27.9"S/61°43'21.0"W

F. zonatus Manaus – igarapé Tarumã, rio Negro MAO 00°58'01.9"S/62°55'50.5"W

F. zonatus Rio Preto da Eva EVA 02°57'09.3"S/59°29'57.1"W

F. pygmaeus Repressa da estrada Borba/Mapiá RBM 04°27'12.5"S/59°35'17.6"W

F. pygmaeus Lago do Jatuarana - Rio Madeira JATU 04°24'06.6"S/59°32'40.2"W

F. pygmaeus Rio Piaui - Rio Madeira RPI 04°17'51.7"S/59°44'21.0"W

F. palikur Ilha de Marajó - Selvaterra km23 SALV 00°46'53.7"S/48°32'15.3"W

F. palikur Igarapé Copudas - Cachoeira do Arari (26) MARAJO_26 01°00'46.5"S/48°57'13.1"W

F. palikur Amapá - (04) km 486 AMAPA_04 01°47'10.3"N/50°52'37.2"W

F. palikur Amapá - (05) AMAPA_05 01°53'52.1"N/50°52'07.8"W

F. palikur Rio Calçõene Amapá (06) CALC 02°11'13.1"N/50°54'23.6"W

F. palikur Amapá (10) sobre ponte AMAPA_10 02°07'21.1"N/50°53'29.5"W

F. palikur Amapá (11) AMAPA_11 01°54'33.6"N/50°52'08.2"W

F. palikur Riacho Tartarugalzinho TZ 01°28'17.2"N/50°53'50.0"W

F. palikur Tartarugal Grande TG 01°23'52.3"N/50°55'28.7"W

Apêndice B – Caracteres apomórficos das espécies de Fluviphylax baseados em seqüências do gene COI.

Seqüências do gene COI

Tipo de dados: Nucleotídeos

Número de seqüências=125

Número de sítios informativos para parcimônia=153

Identicação=. Missing=? Indel=-;

Domínio=Dados;

[ 111111111 1111111111 1111111112 2222222222 2222222222 ]

[ 1111222 2334445556 6667778899 9011222233 4445556667 7778889990 1112223333 4445566666 ]

[ 2581247036 9281473690 2581473625 8436035847 3692581470 3692581473 2581470369 5681403679 ]

#curi2_{Fluviphylax sp} ATTTCTTTCG CTCACTCCCG TTGAACACCA TATTCCACTT CTCGTTTAGC TTCATCTACA TCCCAGAATT ATACACGAGT

#curi4_{Fluviphylax sp} .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........

#curi1_{Fluviphylax sp} .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........

#curi3_{Fluviphylax sp} .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........

#curi5_{Fluviphylax sp} .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........

#maxi1_{Fluviphylax sp} .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........

#maxi2_{Fluviphylax sp} .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ......A...

#maxi3_{Fluviphylax sp} .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........

#maxi4_{Fluviphylax sp} .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........

#maxi5_{Fluviphylax sp} .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ......A...

#mgc1_{Fluviphylax sp.1} .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ...T......

#mgc2_{Fluviphylax sp.1} .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ...T......

#mgc3_{Fluviphylax sp.1} .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ...T......

#mgc4_{Fluviphylax sp.1} .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........

#mgc5_{Fluviphylax sp.1} .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ...T......

#ven1_{Fluviphylax sp.1} G.......T. .C....T... .......... .......... T......TA. .......... C.T.G..... .....T....

#ven2_{Fluviphylax sp.1} G.......T. .C....T... .......... .......... T......TA. .......... ..T.G..... .....T....

#ven3_{Fluviphylax sp.1} G.......T. .C....T... .......... .......... T......TA. .......... C.T.G..... .....T....

#breu1_{F. simplex} .AC.....T. TATGT..TTT ..A....T.. .T..T....C .C..CA..AT GC....C.G. .....A..CC .C.TGTCC..

#breu2_{F. simplex} .AC.....T. TATGT..TTT ..A....T.. .T..T....C .C..CA..AT GC....C.G. .....A..CC .C.TGTCC..

#breu3_{F. simplex} .AC.....T. TATGT..TTT ..A....T.. .T..T....C .C..CA..AT GC....C.G. .....A..CC .C.TGTCC..

#breu4_{F. simplex} .AC.....T. TATGT..TTT ..A....T.. .T..T....C .C..CA..AT GC....C.G. .....A..CC .C.TGTCC..

#breu5_{F. simplex} .AC.....T. TATGT..TTT ..A....T.. .T..T....C .C..CA..AT GC....C.G. .....A..CC .C.TGTCC..

#bacu1_{F. simplex} .AC.....TA TATGT..TTT ..A.G..T.. .T..T....C .C..CA..AT GC......A. .....A..CC .C.TGTCC..

#bacu2_{F. simplex} .AC.....TA TATGT..TTT ..A.G..T.. .T..T....C .C..CA..AT GC......A. .....A..CC .C.TGTCC..

#bacu3_{F. simplex} .AC...C.TA TATGT..TTT ..A.G..T.. .T..T....C .C..CA..AT GC......A. .....A..CC .C.TGTCC..

#bacu4_{F. simplex} .AC.....TA TATGT..TTT ..A.G..T.. .T..T....C .C..CA..AT GC......A. .....A..CC .C.TGTCC..

#bacu5_{F. simplex} .AC...C.TA TATGT..TTT ..A.G..... .T..T....C .C..CA..AT GC......A. .....A..CC .C.TGTCC..

#kala1_{F. simplex} .AC.....TA TATGT..TTT ..A.G..T.. .T..T....C .C..CA..AT GC......G. .....A..CC .C.TGTCC..

#kala2_{F. simplex} .AC.....TA TATGT..TTT ..A.G..T.. .T..T....C .C..CA..AT GC......GG .....A..CC .C.TGTCC..

#kala3_{F. simplex} .AC.....TA TATGT..TTT ..A.G..T.. .T..T....C .C..CA..AT GC......GG .....A..CC .C.TGTCC..

#kala4_{F. simplex} .AC.....TA TATGT..TTT ..A.G..T.. .T..T....C .C..CA..AT GC......GG .....A..CC .C.TGTCC..

#kala5_{F. simplex} .AC.....TA TATGT..TTT ..A.G..T.. .T..T....C .C..CA..AT GC......GG .....A..CC .C.TGTCC..

#laa21_{F. simplex} .AC.....TA TATGT..TTT ..A.G..T.. .T..T....C .C..CA..AT GC......A. .....A..CC .C.TGTCC..

#laa22_{F. simplex} .AC.....TA TATGT..TTT ..A.G..T.. .T..T....C .C..CA..AT GC......A. .....A..CC .C.TGTCC..

#laa23_{F. simplex} .AC.....TA TATGT..TTT ..A.G..T.. .T..T....C .C..CA..AT GC......A. .....A..CC .C.TGTCC..

#laa24_{F. simplex} .AC...C.TA TATGT..TTT ..A.G..T.. .T..T....C .C..CA..AT GC......A. .....A..CC .C.TGTCC..

#laa25_{F. simplex} .AC.....TA TATGT..TTT ..A.G..T.. .T..T....C .C..CA..AT GC......A. .....A..CC .C.TGTCC..

#laa26_{F. simplex} .AC.....TA TATGT..TTT ..A.G..T.. .T..T....C .C..CA..AT GC......A. .....A..CC .C.TGTCC..

#laa27_{F. simplex} .AC.....TA TATGT..TTT ..A.G..T.. .T..T....C .C..CA..AT GC......A. .....A..CC .C.TGTCC..

#laa28_{F. simplex} .AC...C.TA TATGT..TTT ..A.G..T.. .T..T....C .C..CA..AT GC......A. .....A..CC .C.TGTCC..

#laa29_{F. simplex} .AC.....TA TATGT..TTT ..A.G..T.. .T..T....C .C..CA..AT GC......A. .....A..CC .C.TGTCC..

#laa210_{F. simplex} .AC...C.TA TATGT..TTT ..A.G..T.. .T..T....C .C..CA..AT GC......A. .....A..CC .C.TGTCC..

#laa211_{F. simplex} .AC.....TA TATGT..TTT ..A.G..T.. .T..T....C .C..CA..AT GC......A. .....A..CC .C.TGTCC..

#laa212_{F. simplex} .AC...C.TA TATGT..TTT ..A.G..T.. .T..T....C .C..CA..AT GC......A. .....A..CC .C.TGTCC..

#laa11_{F. simplex} .AC.....TA TATGT..TTT ..A.G..T.. .T..T....C .C..CA..AT GC......A. .....A..CC .C.TGTCC..

#laa12_{F. simplex} .AC.....TA TATGT..TTT ..A.G..T.. .T..T....C .C..CA..AT GC......A. .....A..CC .C.TGTCC..

#laa13_{F. simplex} .AC.....TA TATGT..TTT ..A.G..T.. .T..T....C .C..CA..AT GC......A. .....A..CC .C.TGTCC..

#laa14_{F. simplex} .AC.....TA TATGT..TTT ..A.G..T.. .T..T....C .C..CA..AT GC......A. .....A..CC .C.TGTCC..

#jnci1_{F. simplex} .AC.....TA TATGT..TTT ..A.G..T.. .T..T....C .C..CA..AT GC......A. .....A..CC .C.TGTCC..

#jnci3_{F. simplex} .AC.....TA TATGT..TTT ..A.G..T.. .T..T....C .C..CA..AT GC......A. .....A..CC .C.TGTCC..

#jnci2_{F. simplex} .AC.....TA TATGT..TTT ..A.G..T.. .T..T....C .C..CA..AT GC......A. .....A..CC .C.TGTCC..

#jnci4_{F. simplex} .AC.....TA TATGT..TTT ..A.G..T.. .T..T....C .C..CA..AT GC......A. .....A..CC .C.TGTCC..

#jnci5_{F. simplex} .AC.....TA TATGT..TTT ..A.G..T.. .T..T....C .C..CA..AT GC......A. .....A..CC .C.TGTCC..

#jnci6_{F. simplex} .AC.....TA TATGT..TTT ..A.G..T.. .T..T....C .C..CA..AT GC......A. .....A..CC .C.TGTCC..

#jncii1_{F. simplex} .AC.....TA TATGT..TTT ..A.G..T.. .T..T....C .C..CA..AT GC......A. .....A..CC .C.TGTCC..

#jncii2_{F. simplex} .AC.....TA TATGT..TTT ..A.G..T.. .T..T....C .C..CA..AT GC......A. .....A..CC .C.TGTCC..

#jncii3_{F. simplex} .AC.....TA TATGT..TTT ..A.G..T.. .T..T....C .C..CA..AT GC......A. .....A..CC .C.TGTCC..

#jncii4_{F. simplex

} .AC.....TA TATGT..TTT ..A.G..T.. .T..T....C .C..CA..AT GC......A. .....A..CC .C.TGTCC..

#jncii_5_{F. simplex} .AC.....TA TATGT..TTT ..A.G..T.. .T..T....C .C..CA..AT GC......A. .....A..CC .C.TGTCC..

#jncii6_{F. simplex} .AC.....TA TATGT..TTT ..A.G..T.. .T..T....C .C..CA..AT GC......A. .....A..CC .C.TGTCC..

#lua2_{F. simplex} .AC.....TA TATGT..TTT ..A.G..T.. .T..T....C .C..CA..AT GC......G. .....A..CC .C.TGTCC..

#lua4_{F. simplex} .AC.....TA TATGT..TTT ..A.G..T.. .T..T....C .C..CA..AT GC......A. .....A..CC .C.TGTCC..

#lua1_{F. simplex} .AC.....TA TATGT..TTT ..A.G..T.. .T..T....C .C..CA..AT GC......A. .....A..CC .C.TGTCC.A

#lua3_{F. simplex} .AC.....TA TATGT..TTT ..A.G..T.. .T..T....C .C..CA..AT GC......G. .....A..CC .C.TGTCC..

#str1_{F. simplex} .AC.....TA TATGT..TTT ..A.G..T.. .T..T....C .C..CA..AT GC......A. .....A..CC .C.TGTCC.A

#str3_{F. simplex} .AC.....TA TATGT..TTT ..A.G..T.. .T..T....C .C..CA..AT GC......A. .....A..CC .C.TGTCC..

#str2_{F. simplex} .AC.....TA TATGT..TTT ..A.G..T.. .T..T....C .C..CA..AT GC......A. .....A..CC .C.TGTCC.A

#str4_{F. simplex} .AC.....TA TATGT..TTT ..A.G..T.. .T..T....C .C..CA..AT GC......A. .....A..CC .C.TGTCC.A

#str5_{F. simplex} .AC.....TA TATGT..TTT ..A.G..T.. .T..T....C .C..CA..AT GC......A. .....A..CC .C.TGTCC.A

#sam1_{F. simplex} .AC.....TA TATGT..TTT ..A.G..T.. .T..T....C .C..CA..AT GC......GG .....A..CC .C.TGTCC..

#sam2_{F. simplex} .AC.....TA TATGT..TTT ..A.G..T.. .T..T....C .C..CA..AT GC......GG .....A..CC .C.TGTCC..

#sam3_{F. simplex} .AC.....TA TATGT..TTT ..A.G..T.. .T..T....C .C..CA..AT GC......GG .....A..CC .C.TGTCC..

#sam4_{F. simplex} .AC.....TA TATGT..TTT ..A.G..T.. .T..T....C .C..CA..AT GC......GG .....A..CC .C.TGTCC..

#sam5_{F. simplex} .AC.....TA TATGT..TTT ..A.G..T.. .T..T....C .C..CA..AT GC......GG .....A..CC .C.TGTCC..

#mussu1_{F. simplex} .ACC....TA TGT.T..TTT ..A.G..T.. .T..T....C .C.ACA..AT GC......G. .....A..CC .C.TGTCC..

#mussu2_{F. simplex} .ACC....TA TGT.T..TTT ..A.G..T.. .T..T....C .C.ACA..AT GC......G. .....A..CC .C.TGTCC..

#mussu3_{F. simplex} .ACC....TA TGT.T..TTT ..A.G..T.. .T..T....C .C.ACA..AT GC......G. .....A..CC .C.TGTCC..

#ara1_{F. obscurus s.s.} .A..TA..G. TAT.T..TTT .GA..A.TAG G...TTGA.. AC.A.AGCA. G.T..T.TT. .T..GAT.C. .C...TAG.C

#ara2_{F. obscurus s.s.} .A..TA..G. TAT.T..TTT .GA..A.TAG G...TTGA.. AC.A.AGCA. G.T..T.TT. .T..GAT.C. .C...TAG.C

#ara3_{F. obscurus s.s.} .A..TA..G. TAT.T..TTT .GA..A.TAG G...TTGA.. AC.A.AGCA. G.T..T.TT. .T..GAT.C. .C...TAG.C

#ara5_{F. obscurus s.s.} .A..TA..G. TAT.T..TTT .GA..A.TAG G...TTGA.. AC.A.AGCA. G.T..T.TT. .T..GAT.C. .C...TAG.C

#rcb2_{F. obscurus s.s.} .A..TA..A. TAT.T..TTT .GA..A.TAG A...TTGA.. AC.A.AGCA. G.T..T.TT. .T..GAT.C. .C...TAG.C

#rcb3_{F. obscurus s.s.} .A..TA..A. TAT.T..TTT .GA..A.TAG A...TTGA.. AC.A.AGCA. G.T..T.TT. .T..GAT.C. .C...TAG.C

#rcb4_{F. obscurus s.s.} .A..TA..A. TAT.T..TTT .GA..A.TAG A...TTGA.. AC.A.AGCA. G.T..T.TT. .T..GAT.C. .C...TAG.C

#rcb5_{F. obscurus s.s.} .A..TA..A. TAT.T..TTT .GA..A.TAG A...TTGA.. AC.A.AGCA. G.T..T.TT. .T..GAT.C. .C...TAG.C

#tapa1_{F. obscurus s.s.}GA..TA..G. TAT.T...TT .GA..A.TA. A...TTGG.. AC.A.AGCA. A.T..T.TT. .T..GAT.C. GC...TAG.C

#tapa2_{F. obscurus s.s.}GA..TA..G. TAT.T...TT .GA..A.TA. A...TTGG.. AC.A.AGCA. A.T..T.TT. .T..GAT.C. GC...TAG.C

#tapa3_{F. obscurus s.s.}GA..TA..G. TAT.T...TT .GA..A.TA. A...TTGG.. AC.A.AGCA. A.T..T.TT. .T..GAT.C. GC...TAG.C

#tapa4_{F. obscurus s.s.}GA..TA..G. TAT.T...TT .GA..A.TA. A...TTGG.. AC.A.AGCA. A.T..T.TT. .T..GAT.C. GC...TAG.C

#tapa6_{F. obscurus s.s.}GA..TA..G. TAT.T...TT .GA..A.TA. A...TTGG.. AC.A.AGCA. A.T..T.TT. .T..GAT.C. GC...TAG.C

#iaha1_{F. obscurus s.s.}GA..TA..G. TAT.T...TT .GA..A.TA. A...TTGG.. AC.A.AGCA. A.T..T.TT. .T..GAT.C. GC...T.G.C

#iaha2_{F. obscurus s.s.}GA..TA..G. TAT.T...TT .GA..A.TA. A...TTGG.. AC.A.AGCA. A.T..T.TT. .T..GAT.C. GC...T.G.C

#iaha3_{F. obscurus s.s.}GA..TA..G. TAT.T...TT .GA..A.TA. A...TTGG.. AC.A.AGCA. A.T..T.TT. .T..GAT.C. GC...TAG.C

#iaha4_{F. obscurus s.s.}GA..TA..G. TAT.T...TT .GA..A.TA. A...TTGG.. AC.A.AGCA. A.T..T.TT. .T..GAT.C. GC...TAG.C

#iaha5_{F. obscurus s.s.}GA..TA..G. TAT.T...TT .GA..A.TA. A...TTGG.. AC.A.AGCA. A.T..T.TT. .T..GAT.C. GC...T.G.C

#rjx2_{F. obscurus s.s.} GA..TA..G. TAT.T...TT .GA..A.TA. A...TTGG.. AC.A.AGCA. A.T..T.TT. .T..GAT.C. GC...TAG.C

#rjx3_{F. obscurus s.s.} GA..TA..G. TAT.T...TT .GA..A.TA. A...TTGG.. AC.A.AGCA. A.T..T.TT. .T..GAT.C. GC...TAG.C

#rjx4_{F. obscurus s.s.

} GA..TA..G. TAT.T...TT .GA..A.TA. A...TTGG.. AC.A.AGCA. A.T..T.TT. .T..GAT.C. GC...TAG.C

#rjx5_{F. obscurus s.s.} GA..TA..G. TAT.T...TT .GA..A.TA. A...TTGG.. AC.A.AGCA. A.T..T.TT. .T..GAT.C. GC...TAG.C

#mao1_{F. zonatus} .CC....G.A TG...C...T A.AG.GG.A. A..C.T...C GC.A.AC... ....CT.... .T....T.C. ..G.CT.CA.

#mao2_{F. zonatus} .CC....G.A TG...C...T A.AG.GG.A. A..C.T...C GC.A.AC... ....CT.... .T...AT.C. ..G.CT.CA.

#mao3_{F. zonatus} .CC....G.A TG...C...T A.AG.GG.A. A..C.T...C GC.A.AC... ....CT.... .T....T.C. ..G.CT.CA.

#mao4_{F. zonatus} .CC....G.A TG...C...T A.AG.GG.A. A..C.T...C GC.A.AC... ....CT.... .T....T.C. ..G.CT.CA.

#mao5_{F. zonatus} .CC....G.A TA...C...T A.AG.GG.A. A....T...C AC.A.AC... ....CT.... .T....TGC. ...TCT.CA.

#eva1_{F. zonatus} .CC....G.A TA...C...T A.AG.GG.A. A..C.T..CC AC.A.AC... ....CT.... .T....TGC. ...TCT.CA.

#eva2_{F. zonatus} .CC....G.A TA...C...T A.AG.GT.A. A..C.T...C AC.A.AC... ....CT.... .T....TGC. ...TCT.CA.

#eva3_{F. zonatus} .CC....G.A TA...C...T A.AG.GT.A. A..C.T...C AC.A.AC... ....CT.... .T....TGC. ...TCT.CA.

#eva4_{F. zonatus} .CC....G.A TA...C...T A.AG.GG.A. A..C.T..CC AC.A.AC... ....CT.... .T....TGC. ...TCT.CA.

#eva5_{F. zonatus} .CC....G.A TG...C...T A.AG.GG.A. A..C.T...C GC.A.AC... ....CT.... .T....T.C. ..G.CT.CA.

#rbm1_{F. pygmaeus} .C.CTA..TA TATC.....T G.A..TG.A. ..C.T....C AC.A.A..AT A.A.A...A. ..T..A.... GC..GTCTAC

#rbm2_{F. pygmaeus} .C...A..T. TATTT....T GCA..TG.A. ....T....C ACTA.A..A. A.AGA...T. ...T.A..C. .C..GTCCAC

#rbm4_{F. pygmaeus} .C...A..TA TATTT....T GCA..TG.A. ....T....C AC.A.A..A. A.AGA...T. ...T.A..C. .C..GTCTAC

#rbm3_{F. pygmaeus} .C...A..TA TATTT....T GCA..TG.A. ....T....C AC.A.A..A. A.AGA...T. ...T.A..C. .C..GTCTAC

#rbm5_{F. pygmaeus} .C...A..TA TATTT....T GCA..TG.A. ....T....C AC.A.A..A. A.AGA...T. ...T.A..C. .C..GTCTAC

#rpi1_{F. pygmaeus} .C.CTA..TA TATC.....T G.A..TG.A. ..C.T....C AC.A.A..AT A.A.A...A. .....A.... GC..GTCTAC

#rpi2_{F. pygmaeus} .C...A..T. TATTT....T GCA..TG.A. ....T....C ACTA.A..A. A.AGA...T. ...T.A..C. .C..GTCCAC

#rpi6_{F. pygmaeus} .C...A..T. TATTT....T GCA..TG.A. ....T....C ACTA.A..A. A.AGA...T. ...T.A..C. .C..GTCCAC

#rpi3_{F. pygmaeus} .C.CTA..TA TATC.....T G.A..TG.A. ..C.T....C AC.A.A..AT A.A.A...A. .....A.... GC..GTCTAC

#rpi5_{F. pygmaeus} .C...A..T. TATTT....T GCA..TG.A. ....T....C ACTA.A..A. A.AGA...T. ...T.A..C. .C..GTCCAC

#jatu1_{F. pygmaeus} .C...A..TA TATTT....T GCA..TG.A. ....T....C AC.A.A..A. A.AGA...T. ...T.A..C. .C..GTCCAC

#jatu2_{F. pygmaeus} .C...A..TA TATTT....T GCA..TG.A. ....T....C AC.A.A..A. A.AGA...T. ...T.A..C. .C..GTCTAC

#jatu3_{F. pygmaeus} .C...A..TA TATTT....T GCA..TG.A. ....T....C AC.A.A..A. A.AGA...T. ...T.A..C. .C..GTCTAC

#jatu4_{F. pygmaeus} .C...A..TA TATTT....T GCA..TG.A. ....T....C AC.A.A..A. A.AGA...T. ...T.A..C. .C..GTCCAC

#jatu5_{F. pygmaeus} .C...A..T. TATTT....T GCA..TG.A. ...CT..T.C ACTA.A..A. A.AGA...T. ...T.A..C. .C..GTCCAC

[ 2222222233 3333333333 3333333333 3333333333 3344444444 4444444444 4444444444 445]

[ 7788999900 0111222233 3444445566 6677788889 9900011122 3334444566 6777788888 990]

[ 2547036902 5147036923 8145783623 5845703692 5814736958 1470349814 7016925678 470]

#curi2_{Fluviphylax sp} CACCTAACCG CTCGTAGGCC CATATCACCC GCCCACCACT AATTCCCTAA CCTCCAATTA CCCCTTTACT CCT

#curi4_{Fluviphylax sp} .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ...

#curi1_{Fluviphylax sp} .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ...

#curi3_{Fluviphylax sp} .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ...

#curi5_{Fluviphylax sp} .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ...

#maxi1_{Fluviphylax sp} .......... .......... ..C....... .......... .........G ......G... .......... ...

#maxi2_{Fluviphylax sp} .......... .......... ..C....... .......... .......... ......G... .......... ...

#maxi3_{Fluviphylax sp} .......... .......... ..C....... .......... .......... ......G... .......... ...

#maxi4_{Fluviphylax sp} .......... .......... ..C....... .......... .........G ......G... .......... ...

#maxi5_{Fluviphylax sp} .......... .......... ..C....... .......... .......... ......G... .......... ...

#mgc1_{Fluviphylax sp} .........A .......... TGC....... .......... .......... .......... .....C.... ...

#mgc2_{Fluviphylax sp} .......... .......... T.C....... .......... .......... .......... .....C.... ...

#mgc3_{Fluviphylax sp} .......... .......... T.C....... .......... .......... .......... .....C.... ...

#mgc4_{Fluviphylax sp} .........A ........T. TGC....... .......... .......... .......... .....C.... ...

#mgc5_{Fluviphylax sp} .........A .......... TGC....... .......... .......... .......... .....C.... ...

#ven1_{Fluviphylax sp} .......... T.....AA.. .CC....... ....G..... ........GG ........C. ....CC.... ...

#ven2_{Fluviphylax sp} .......... T.....AA.. .CC....... ....G..... ........GG ........C. ....CC.... ...

#ven3_{Fluviphylax sp} .......... T.....AA.. .CC....... ....G..... ........GG ........C. ....CC.... ...

#breu1_{F. simplex} ...T..G.T. .CTA.GCA.. .TCGC..... ..T.GT.C.. ...CT...GG .A.T...AC. ..T.CCC... .T.

#breu2_{F. simplex} ...T..G.T. .CTA.GCA.. .TCGC..... ..T.GT.C.. ...CT...GG .A.T...AC. ..T.CCC... .T.

#breu3_{F. simplex} ...T..G.T. .CTA.GCA.. .TCGC..... ..T.GT.C.. ...CT...GG .A.T...AC. ..T.CCC... .T.

#breu4_{F. simplex} ...T..G.T. .CTA.GCA.. .TCGC..... ..T.GT.C.. ...CT...GG .A.T...AC. ..T.CCC... .T.

#breu5_{F. simplex} ...T..G.T. .CTA.GCA.. .TCGC..... ..T.GT.C.. ...CT...GG .A.T...AC. ..T.CCC... .T.

#bacu1_{F. simplex} ...T..G.T. .C.A.GC... .TCGC..... ..T.GT.C.. ...CT...G. .A.T...ACG ..T.CCC... .T.

#bacu2_{F. simplex} ...T..G.T. .C.A.GC... .TCGC..... ..T.GT.C.. ...CT...G. .A.T...ACG ..T.CCC... .T.

#bacu3_{F. simplex} ...T..G.T. .C.A.GC... .TCGC..... ..T.GT.C.. ...CT...G. .A.T...ACG ..T.CCC... .T.

#bacu4_{F. simplex} ...T..G.T. .C.A.GC... .TCGC..... ..T.GT.C.. ...CT...G. .A.T...ACG ..T.CCC... .T.

#bacu5_{F. simplex} ...T..G.T. .C.A.GC... .TCGC..... A.T.GT.C.. ...CT...G. .A.T...ACG ..T.CCC... .T.

#kala1_{F. simplex} ...T..G.T. .CTA.GC... .TCGC..... ..T.GT.C.. ...CT...GG .A.....AC. ..T.CCC... .T.

#kala2_{F. simplex} ...T..G.T. .CTA.GC... .TCGC..... ..T.GT.C.. ...CT...GG .A.....AC. ..T.CCC... .T.

#kala3_{F. simplex} ...T..G.T. .CTA.GC... .TCGC..... ..T.GT.C.. ...CT...GG .A.....AC. ..T.CCC... .T.

#kala4_{F. simplex} ...T..G.T. .CTA.GC... .TCGC..... ..T.GT.C.. ...CT...GG .A.....AC. ..T.CCC... .T.

#kala5_{F. simplex} ...T..G.T. .CTA.GC... .TCGC..... ..T.GT.C.. ...CT...GG .A.....AC. ..T.CCC... .T.

#laa21_{F. simplex} ...T..G.T. .C.A.GC... .TCGC..... ..T.GT.C.. ...CT...G. .A.T...ACG ..T.CCC... .T.

#laa22_{F. simplex} ...T..G.T. .C.A.GC... .TCGC..... ..T.GT.C.. ...CT...G. .A.T...ACG ..T.CCC... .T.

#laa23_{F. simplex} ...T..G.T. .C.A.GC... .TCGC..... ..T.GT.C.. ...CT...G. .A.T...ACG ..T.CCC... .T.

#laa24_{F. simplex} ...T..G.T. .C.A.GC... .TCGC..... ..T.GT.C.. ...CT...G. .A.T...ACG ..T.CCC... .T.

#laa25_{F. simplex} ...T..G.T. .C.A.GC... .TCGC..... ..T.GT.C.. ...CT...G. .A.T...ACG ..T.CCC... .T.

#laa26_{F. simplex} ...T..G.T. .C.A.GC... .TCGC..... ..T.GT.C.. ...CT...G. .A.T...ACG ..T.CCC... .T.

#laa27_{F. simplex} ...T..G.T. .C.A.GC... .TCGC..... ..T.GT.C.. ...CT...G. .A.T...ACG ..T.CCC... .T.

#laa28_{F. simplex} ...T..G.T. .C.A.GC... .TCGC..... ..T.GT.C.. ...CT...G. .A.T...ACG ..T.CCC... .T.

#laa29_{F. simplex} ...T..G.T. .C.A.GC... .TCGC..... ..T.GT.C.. ...CT...G. .A.T...ACG ..T.CCC... .T.

#laa210_{F. simplex} ...T..G.T. .C.A.GC... .TCGC..... ..T.GT.C.. ...CT...G. .A.T...ACG ..T.CCC... .T.

#laa211_{F. simplex} ...T..G.T. .C.A.GC... .TCGC..... ..T.GT.C.. ...CT...G. .A.T...ACG ..T.CCC... .T.

#laa212_{F. simplex} ...T..G.T. .C.A.GC... .TCGC..... ..T.GT.C.. ...CT...G. .A.T...ACG ..T.CCC... .T.

#laa11_{F. simplex} ...T..G.T. .C.A.GC... .TCGC..... ..T.GT.C.. ...CT...G. .A.T...ACG ..T.CCC... .T.

#laa12_{F. simplex} ...T..G.T. .C.A.GC... .TCGC..... ..T.GT.C.. ...CT...G. .A.T...ACG ..T.CCC... .T.

#laa13_{F. simplex} ...T..G.T. .C.A.GC... .TCGC..... ..T.GT.C.. ...CT...G. .A.T...ACG ..T.CCC... .T.

#laa14_{F. simplex} ...T..G.T. .C.A.GC... .TCGC..... ..T.GT.C.. ...CT...G. .A.T...ACG ..T.CCC... .T.

#jnci1_{F. simplex} ...T..G.T. .C.A.GC... .TCGC..... ..T.GT.C.. ...CT...G. .A.T...ACG ..T.CCC... .T.

#jnci3_{F. simplex} ...T..G.T. .C.A.GC... .TCGC..... ..T.GT.C.. ...CT...G. .A.T...ACG ..T.CCC... .T.

#jnci2_{F. simplex} ...T..G.T. .C.A.GC... .TCGC..... ..T.GT.C.. ...CT...G. .A.T...ACG ..T.CCC... .T.

#jnci4_{F. simplex} ...T..G.T. .C.A.GC... .TCGC..... ..T.GT.C.. ...CT...G. .A.T...ACG ..T.CCC... .T.

#jnci5_{F. simplex} ...T..G.T. .C.A.GC... .TCGC..... ..T.GT.C.. ...CT...G. .A.T...ACG ..T.CCC... .T.

#jnci6_{F. simplex} ...T..G.T. .C.A.GC... .TCGC..... ..T.GT.C.. ...CT...G. .A.T...ACG ..T.CCC... .T.

#jncii1_{F. simplex} ...T..G.T. .C.A.GC... .TCGC..... ..T.GT.C.. ...CT...G. .A.T...ACG ..T.CCC... .T.

#jncii2_{F. simplex} ...T..G.T. .C.A.GC... .TCGC..... ..T.GT.C.. ...CT...G. .A.T...ACG ..T.CCC... .T.

#jncii3_{F. simplex} ...T..G.T. .C.A.GC... .TCGC..... ..T.GT.C.. ...CT...G. .A.T...ACG ..T.CCC... .T.

#jncii4_{F. simplex} ...T..G.T. .C.A.GC... .TCGC..... ..T.GT.C.. ...CT...G. .A.T...ACG ..T.CCC... .T.

#jncii_5_{F. simplex} ...T..G.T. .C.A.GC... .TCGC..... ..T.GT.C.. ...CT...G. .A.T...ACG ..T.CCC... .T.

#jncii6_{F. simplex} ...T..G.T. .C.A.GC... .TCGC..... ..T.GT.C.. ...CT...G. .A.T...ACG ..T.CCC... .T.

#lua2_{F. simplex} ...T..G.T. .CTA.GC... .TCGC..... ..T.GT.C.. ...CT...GG .A.....AC. ..T.CCC... .T.

#lua4_{F. simplex} ...T..G.T. .C.A.GC... .TCGC..... ..T.GT.C.. ...CT...G. .A.T...ACG ..T.CCC... .T.

#lua1_{F. simplex} ...T..G.T. .C.A.GC... .TCGC..... ..T.GT.C.C ...CT...G. .A.T...ACG ..T.CCC... .T.

#lua3_{F. simplex} ...T..G.T. .CTA.GC... .TCGC..... ..T.GT.C.. ...CT...GG .A.....AC. ..T.CCC... .T.

#str1_{F. simplex} ...T..G.T. .C.A.GC... .TCGC..... ..T.GT.C.. ...CT...G. .A.T...ACG ..T.CCC... .T.

#str3_{F. simplex} ...T..G.T. .C.A.GC... .TCGC..... ..T.GT.C.. ...CT...G. .A.T...ACG ..T.CCC... .T.

#str2_{F. simplex} ...T..G.T. .C.A.GC... .TCGC..... ..T.GT.C.C ...CT...G. .A.T...ACG ..T.CCC... .T.

#str4_{F. simplex} ...T..G.T. .C.A.GC... .TCGC..... ..T.GT.C.. ...CT...G. .A.T...ACG ..T.CCC... .T.

#str5_{F. simplex} ...T..G.T. .C.A.GC... .TCGC..... ..T.GT.C.C ...CT...G. .A.T...ACG ..T.CCC... .T.

#sam1_{F. simplex} ...T..G.T. .CTA.GC... .TCGC..... ..T.GT.C.. ...CT...GG .A.....AC. ..T.CCC... .T.

#sam2_{F. simplex} ...T..G.T. .CTA.GC... .TCGC..... ..T.GT.C.. ...CT...GG .A.....AC. ..T.CCC... .T.

#sam3_{F. simplex} ...T..G.T. .CTA.GC... .TCGC..... ..T.GT.C.. ...CT...GG .A.....AC. ..T.CCC... .T.

#sam4_{F. simplex} ...T..G.T. .CTA.GT... .TCGC..... ..T.GT.C.. ...CT...GG .A.....AC. ..T.CCC... .T.

#sam5_{F. simplex} ...T..G.T. .CTA.GC... .TCGC..... ..T.GT.C.. ...CT...GG .A.....AC. ..T.CCC... .T.

#mussu1_{F. simplex} ...T..G.T. ACTA.GC... .TCGC..... ..T.GTTC.. ...CT...GG .A.T...AC. ..T.CCC..C .T.

#mussu2_{F. simplex} ...T..G.T. ACTA.GC... .TCGC..... ..T.GTTC.. ...CT...GG .A.T...AC. ..T.CCC..C .T.

#mussu3_{F. simplex} ...T..G.T. ACTA.GC... .TCGC..... ..T.GTTC.. ...CT...GG .A.T...AC. ..T.CCC..C .T.

#ara1_{F. obscurus s.s.} T......... ..TA..AATT T....TC... ATGT.TT..C .C...T.C.. ..CTT..... .....C.GTC ...

#ara2_{F. obscurus s.s.} T.....G... ..TA..AATT T....TC... ATGT.TT..C .C...T.C.. ..CTT..... .....C.GTC ...

#ara3_{F. obscurus s.s.} T......... ..TA..AATT T....TC... ATGT.TT..C .C...T.C.. ..CTT..... .....C.GTC ...

#ara5_{F. obscurus s.s.} T......... ..TA..AATT T....TC... ATGT.TT..C .C...T.C.. ..CTT..... .....C.GTC ...

#rcb2_{F. obscurus s.s.} T......... ..TA...ATT T....TC... ATGT.TT..C .C...T.C.. ..CTT..... .....C.GTC ...

#rcb3_{F. obscurus s.s.} T......... ..TA...ATT T....TC... ATGT.TT..C .C...T.C.. ..CTT..... .....C.GTC ...

#rcb4_{F. obscurus s.s.} T......... ..TA...ATT T....TC... ATGT.TT..C .C...T.C.. ..CTT..... .....C.GTC ...

#rcb5_{F. obscurus s.s.} T......... ..TA...ATT T....TC... ATGT.TT..C .C...T.C.. ..CTT..... .....C.GTC ...

#tapa1_{F. obscurus s.s.}T......T.. ..TA...ATT T.....C... ATGT..T..C .CC..T.C.. ..CTT..... .....C.GTC ...

#tapa2_{F. obscurus s.s.}T......T.. ..TA...ATT T.....C... ATGT..T..C .CC..T.C.. ..CTT..... .....C.GTC ...

#tapa3_{F. obscurus s.s.}T......T.. ..TA...ATT T.....C... ATGT..T..C .CC..T.C.. ..CTT..... .....C.GTC ...

#tapa4_{F. obscurus s.s.

}T......T.. ..TA...ATT T.....C... ATGT..T..C .CC..T.C.. ..CTT..... .....C.GTC ...

#tapa6_{F. obscurus s.s.}T......T.. ..TA...ATT T.....C... ATGT..T..C .CC..T.C.. ..CTT..... .....C.GTC ...

#iaha1_{F. obscurus s.s.}T......T.. ..TA...ATT T.....C... ATGT..T..C .CC..T.C.. ..CTT..... .....C.GTC ...

#iaha2_{F. obscurus s.s.}T......T.. ..TA...ATT T.....C... ATGT..T..C .CC..T.C.. ..CTT..... .....C.GTC ...

#iaha3_{F. obscurus s.s.}T......T.. ..TA...ATT T.....C... ATGT..T..C .CC..T.C.. ..CTT..... .....C.GTC ...

#iaha4_{F. obscurus s.s.}T......T.. ..TA...ATT T.....C... ATGT..T..C .CC..T.C.. ..CTT..... .....C.GTC ...

#iaha5_{F. obscurus s.s.}T......T.. ..TA...ATT T.....C... ATGT..T..C .CC..T.C.. ..CTT..... .....C.GTC ...

#rjx2_{F. obscurus s.s.} T......T.. ..TA...ATT T.....C... ATGT..T..C .CC..T.C.. ..CTT..... .....C.GTC ...

#rjx3_{F. obscurus s.s.} T......T.. ..TA...ATT T.....C... ATGT..T..C .CC..T.C.. ..CTT..... .....C.GTC ...

#rjx4_{F. obscurus s.s.} T......T.. ..TA...ATT T.....C... ATGT..T..C .CC..T.C.. ..CTT..... .....C.GTC ...

#rjx5_{F. obscurus s.s.} T......T.. ..TA...ATT T.....C... ATGT..T..C .CC..T.C.. ..CTT..... .....C.GTC ...

#mao1_{F. zonatus} T.TTCG...A .C........ ..C..T.TT. A.TT.T..TC C.....TCGG T..TT...C. ...TA.C..C ...

#mao2_{F. zonatus} T.TTCG.... .C........ ..C..T.TT. A.TT.T..TC C.....TCGG T..TT...C. ...TA.C..C ...

#mao3_{F. zonatus} T.TTCG...A .C........ ..C..T.TT. A.TT.T..TC C.....TCGG T..TT...C. ...TA.C..C ...

#mao4_{F. zonatus} T.TTCG...A .C........ ..C..T.TT. A.TT.T..TC C.....TCGG T..TT...C. ...TA.C..C ...

#mao5_{F. zonatus} T.TTCG.... .C....AA.. ..C..T.TT. ATTT.T..TC C.....TCGG T..TT...C. ...TA.C..C ...

#eva1_{F. zonatus} T.TTCG.... .C.A..AA.. ..C..T.TT. ATTT.T..TC C.....TCGG T..TT...C. ...TA....C ...

#eva2_{F. zonatus} T.TTCG.... .C....AA.. ..C..T.TT. ATTT.T..TC C.....TCGG T..TT...C. ...TA.C..C ...

#eva3_{F. zonatus} T.TTCG.... .C....AA.. ..C..T.TT. ATTT.T..TC C.....TCGG T..TT...C. ...TA.C..C ...

#eva4_{F. zonatus} T.TTCG.... .C....AA.. ..C..T.TT. ATTT.T..TC C.....TCGG T..TT...C. ...TA.C..C ...

#eva5_{F. zonatus} T.TTCG.... .C.A...... ..C..T.TT. A.TT.T..TC C.....TCGG T..TT...C. ...TA.C..C ...

#rbm1_{F. pygmaeus} .G.T..G.TA .CTA..AA.. ...GCT..TT A.TT.T..T. ..C...T.GG ...TTC.CCG TT.T.CC..C TTA

#rbm2_{F. pygmaeus} .G.T..G..A TCTAC.A.T. ...GCT...T A.TT.T.... ..C..TTCGG ....TC.... TT.T..C..C TTA

#rbm4_{F. pygmaeus} .G.T..G..A TCTAC.A.T. ...GCT...T A.TT.T..T. ..C..TTC.. ...TTC.... TT.T..C..C TTA

#rbm3_{F. pygmaeus} .G.T..G..A TCTAC.A.T. ...GCT...T A.TT.T..T. ..C..TTC.. ...TTC.... TT.T..C..C TTA

#rbm5_{F. pygmaeus} .G.T..G..A TCTAC.A.T. ...GCT...T A.TT.T..T. ..C..TTC.. ...TTC.... TT.T..C..C TTA

#rpi1_{F. pygmaeus} .G.T..G.TA .CTA..AA.. ...GCT..TT A.TT.T..T. ..C...T.GG ...TTC.CCG TT.T.CC..C TTA

#rpi2_{F. pygmaeus} .G.T..G..A TCTAC.A.T. ...GCT...T A.TT.T.... ..C..TTCGG ....TC.... TT.T..C..C TTA

#rpi6_{F. pygmaeus} .G.T..G..A TCTAC.A.T. ...GCT...T A.TT.T.... ..C..TTCGG ....TC.... TT.T..C..C TTA

#rpi3_{F. pygmaeus} .G.T..G.TA .CTA..AA.. ...GCT..TT A.TT.T..T. ..C...T.GG ...TTC.CCG TT.T.CC..C TTA

#rpi5_{F. pygmaeus} .G.T..G..A TCTAC.A.T. ...GCT...T A.TT.T.... ..C..TTCGG ....TC.... TT.T..C..C TTA

#jatu1_{F. pygmaeus} .G.T..G..A TCTAC.A.T. ...GCT...T A.TT.T..T. ..C..TTC.. ...TTC.... TT.T..C..C TTA

#jatu2_{F. pygmaeus} .G.T..G..A TCTAC.A.T. ...GCT...T A.TT.T..T. ..C..TTC.. ...TTC.... TT.T..C..C TTA

#jatu3_{F. pygmaeus} .G.T..G..A TCTAC.A.T. ...GCT...T A.TT.T..T. ..C..TTC.. ...TTC.... TT.T..C..C TTA

#jatu4_{F. pygmaeus} .G.T..G..A TCTAC.A.T. ...GCT...T A.TT.T..T. ..C..TTC.. ...TTC.... TT.T..C..C TTA

#jatu5_{F. pygmaeus} .G.T..G..A TCTAC.A.T. ...GCT...T A.TT.T.... ..C..TTCGG ....TC.... TT.T..C..C TTA

Apêndice C - Caracteres apomórficos das espécies de Fluviphylax baseados em seqüências da região controle.

Seqüências da região controle

Tipo de dados=Nucleotídeo

Número de seqüências=134

Número de sítios informativos para parcimônia=106

Identicação=. Missing=? Indel=-;

Domínio=Dados;

[ 11 1111111111 1111111111 1111111111 1111111111 11111]

[ 2224444455 6667777777 8999999900 0011111222 2223333444 4555555556 6666666678 99999]

[ 5891356936 7891234568 0234567956 7923567124 5683568458 9023456780 1234568915 01468]

#mgc1_Fluviphylax sp.1 ATTCTAAATA ATGAATTACT GAATTACTAT CTGGAAT-AC GTAAAAATAA TAGATAGATA TAA-TAAATA AAGCC

#mgc2_Fluviphylax sp.1 .......... .......... .......... .C.....-.. .......... .......... ...-...... .....

#mgc3_Fluviphylax sp.1 .......... .......... .......... .......-.. .......... .......... ...-...... .....

#mgc4_Fluviphylax sp.1 .......... .......... .......... .......-.. .......... .......... ...-...... .....

#mgc5_Fluviphylax sp.1 .......... .......... .......... .......-.. .......... .......... ...-...... .....

#ven6_Fluviphylax sp.1 ???....... .......... A.T.A..... ..C..T.-.. .......... C......... ...-...... .....

#CURI1_Fluviphylax sp.1 .......... .......... A..C...... .CA....-.. .......... ....C....T ...-...... .....

#CURI2_Fluviphylax sp.1 .......... .......... A..C...... .CA....-.. .......... ....C....T ...-...... .....

#CURI3_Fluviphylax sp.1 .......... .......... A..C...... .CA....-.. .......... ....C....T ...-...... .....

#CURI4_Fluviphylax sp.1 .......... .......... A..C...... .CA....-.. .......... ....C....T ...-...... .....

#CURI5_Fluviphylax sp.1 .......... .......... A..C...... .CA....-.. .......... ....C....T ...-...... .....

#MAXI1_Fluviphylax sp.1 .......... .......... A..C...... .CA....-.. .......... ....C....T ...-...... .....

#MAXI2_Fluviphylax sp.1 .......... .......... A..C...... .CA....-.. .......... ....C....T ...-...... .....

#MAXI3_Fluviphylax sp.1 .......... .......... A..C...... .CA....-.. .......... ....C....T ...-...... .....

#MAXI4_Fluviphylax sp.1 .......... .......... A..C...... .CA....-.. .......... ....C....T ...-...... .....

#MAXI5_Fluviphylax sp.1 .......... .......... A..C...... .CA....-.. .......... ....C....T ...-...... .....

#str1_F. simplex ...T....AC ...TT...AA ..G..T.... ..A..T.C.A T..G.T..GT ....A...CC ...-....A. .....

#str3_F. simplex ...T....AC ...TT...AA ..G..T.... ..A..T.C.A T..G.T...T ....A...CC ...-....A. .....

#str4_F. simplex ...T....AC ...TT...AA ..G..T.... ..A..T.C.A T..G.T..GT ....A...CC ...-....A. .....

#str5_F. simplex ...T....AC ...TT...AA ..G..T.... ..A..T.C.A T..G.T..GT ....A...CC ...-....A. .....

#BREU1_F. simplex ...T....AC ...TT...AA ..G..T.... ..A.GT.C.A T.CG.TT..T ....A...CC ...-....G. .....

#BREU2_F. simplex ...T....AC ...TT...AA ..G..T.... ..A.GT.C.A T.CG.TT..T ....A...CC ...-....G. .....

#BREU3_F. simplex ...T....AC ...TT...AA ..G..T.... ..A.GT.C.A T.CG.TT..T ....A...CC ...-....G. .....

#BREU4_F. simplex ...T....AC ...TT...AA ..G..T.... ..A.GT.C.A T.CG.TT..T ....A...CC ...-....G. .....

#BREU5_F. simplex ...T....AC ...TT...AA ..G..T.... ..A.GT.C.A T.CG.TT..T ....A...CC ...-....G. .....

100

#MUSSU1_F. simplex ...T.T..AC ...TT...AA ..G..T.... ..A..T.C.A T.CG.T..CT ....C...CC ...-....A. .....

#MUSSU2_F. simplex ...T.T..AC ...TT...AA ..G..T.... ..A..T.C.A T.CG.T..CT ....C...CC ...-....A. .....

#BACU1_F. simplex ...T....AC ...TT...AA ..G..T.... ..A..T.C.A T..G.T...T ....A...CC ...-....A. .....

#BACU2_F. simplex ...T....AC ...TT...AA ..G..T.... ..A..T.C.A T..G.T...T ....A...CC ...-....A. .....

#BACU4_F. simplex ...T....AC ...TT...AA ..G..T.... ..A..T.C.A T..G.T...T ....A...CC ...-....A. .....

#BACU5_F. simplex ...T....AC ...TT...AA ..G..T.... ..A..T.C.A T..G.T...T ....A...CC ...-....A. .....

#LAA2_1_F. simplex ...T....AC ...TT...AA ..G..T.... ..A..T.C.A T..G.T...T ....A...CC ...-....A. .....

#LAA2_2_F. simplex ...T....AC ...TT...AA ..G..T.... ..A..T.C.A T..G.T...T ....A...CC ...-....A. .....

#LAA2_3_F. simplex ...T....AC ...TT...AA ..G..T.... ..A..T.C.A T..G.T...T ....A...CC ...-....A. .....

#LAA2_4_F. simplex ...T....AC ...TT...AA ..G..T.... ..A..T.C.A T..G.T...T ....A...CC ...-....A. .....

#LAA2_5_F. simplex ...T....AC ...TT...AA ..G..T.... ..A..T.C.A T..G.T...T ....A...CC ...-....A. .....

#LAA2_6_F. simplex ...T....AC ...TT...AA ..G..T.... ..A..T.C.A T..G.T...T ....A...CC ...-....A. .....

#LAA2_7_F. simplex ...T....AC ...TT...AA ..G..T.... ..A..T.C.A T..G.T...T ....A...CC ...-....A. .....

#LAA2_8_F. simplex ...T....AC ...TT...AA ..G..T.... ..A..T.C.A T..G.T...T ....A...CC ...-....A. .....

#LAA2_9_F. simplex ...T....AC ...TT...AA ..G..T.... ..A..T.C.A T..G.T...T ....A...CC ...-....A. .....

#LAA2_10_F. simplex ...T....AC ...TT...AA ..G..T.... ..A..T.C.A T..G.T...T ....A...CC ...-....A. .....

#LAA2_11_F. simplex ...T....AC ...TT...AA ..G..T.... ..A..T.C.A T..G.T...T ....A...CC ...-....A. .....

#LAA2_12_F. simplex ...T....AC ...TT...AA ..G..T.... ..A..T.C.A T..G.T...T ....A...CC ...-....A. .....

#laa1_1_F. simplex ...T....AC ...TT...AA ..G..T.... ..A..T.C.A T..G.T...T ....A...CC ...-....A. .....

#LAA1_2_F. simplex ...T....AC ...TT...AA ..G..T.... ..A..T.C.A T..G.T...T ....A...CC ...-....A. .....

#LAA1_3_F. simplex ...T....AC ...TT...AA ..G..T.... ..A..T.C.A T..G.T...T ....A...CC ...-....A. .....

#LAA1_4_F. simplex ...T....AC ...TT...AA ..G..T.... ..A..T.C.A T..G.T...T ....A...CC ...-....A. .....

#LAA1_5_F. simplex ...T....AC ...TT...AA ..G..T.... ..A..T.C.A T..G.T...T ....A...CC ...-....A. .....

#LAA1_6_F. simplex ...T....AC ...TT...AA ..G..T.... ..A..T.C.A T..G.T...T ....A...CC ...-....A. .....

#trom1_F. simplex ???T.T..AC ...TT...AA ..G..T.... ..A..T.C.A T.CG.T..CC ....C.A.CC ...-....A. .....

#JNCII1_F. simplex ...T....AC ...TT...AA ..G..T.... ..A..T.C.A T..G.T...T ....A...CC ...-....A. .....

#JNCII2_F. simplex ...T....AC ...TT...AA ..G..T.... ..A..T.C.A T..G.T...T ....A...CC ...-....A. .....

#JNCII3_F. simplex ...T....AC ...TT...AA ..G..T.... ..A..T.C.A T..G.T...T ....A...CC ...-....A. .....

#JNCII4_F. simplex ...T....AC ...TT...AA ..G..T.... ..A..T.C.A T..G.T...T ....A...CC ...-....A. .....

#JNCII5_F. simplex ...T....AC ...TT...AA ..G..T.... ..A..T.C.A T..G.T...T ....A...CC ...-....A. .....

#JNCII6_F. simplex ...T....AC ...TT...AA ..G..T.... ..A..T.C.A T..G.T...T ....A...CC ...-....A. .....

#JNCI1_F. simplex ...T....AC ...TT...AA ..G..T.... ..A..T.C.A T..G.T...T ....A...CC ...-....A. .....

#JNCI2_F. simplex ...T....AC ...TT...AA ..G..T.... ..A..T.C.A T..G.T...T ....A...CC ...-....A. .....

#JNCI5_F. simplex

...T....AC ...TT...AA ..G..T.... ..A..T.C.A T..G.T...T ....A...CC ...-....A. .....

#JNCI6_F. simplex ...T....AC ...TT...AA ..G..T.... ..A..T.C.A T..G.T...T ....A...CC ...-....A. .....

#araca1_F. obscurus s.s. .AGT..G.AC ...T....GA ..G..T..T. ..A..T.CTT .AG.....C. ....A...CC ..-T...... .....

#araca2_F. obscurus s.s. .AGT..G.AC ...T....AA ..G..T..T. ..A..T.CTT .AG.....C. ....A...CC ..-T...... .....

#araca3_F. obscurus s.s. .AGT..G.AC ...T....AA ..G..T..T. ..A..T.CTT .AG.....C. ....A...CC ..-T...... .....

#araca4_F. obscurus s.s. .AGT..G.AC ...T....AA ..G..T..T. ..A..T.CTT .AG.....C. ....A...CC ..-T...... .....

#RJX2_F. obscurus s.s. .AGT..G.AC ...T....AA ..G..T..T. ..A..T.ATT .AG....... ....A...CC ..T-...... .....

101

#RJX3_F. obscurus s.s. .AGT..G.AC ...T....AA ..G..T..T. ..A..T.CTT .AG....... ....A...CC ..T-...... .....

#rjx4_F. obscurus s.s. .AGT..G.AC ...T....AA ..G..T..T. ..A..T.CTT .AG....... ....A...CC ..T-...... .....

#RJX5_F. obscurus s.s. .AGT..G.AC ...T....AA ..G..T..T. ..A..T.CTT .AG....... ....A...CC ..T-...... .....

#TAPA1_F. obscurus s.s. .AGT..G.AC ...T....AA ..G..T..T. ..A..T.ATT .AG....... ....A...CC ..T-...... .....

#TAPA2_F. obscurus s.s. .AGT..G.AC ...T....AA ..G..T..T. ..A..T.CTT .AG....... ....A...CC ..T-...... .....

#TAPA3_F. obscurus s.s. .AGT..G.AC ...T....AA ..G..T..T. ..A..T.CTT .AG....... ....A...CC ..T-...... .....

#TAPA4_F. obscurus s.s. .AGT..G.AC ...T....AA ..G..T..T. ..A..T.CTT .AG....... ....A...CC ..T-...... .....

#TAPA5_F. obscurus s.s. .AGT..G.AC ...T....AA ..G..T..T. ..A..T.CTT .AG....... ....A...CC ..T-...... .....

#TAPA6_F. obscurus s.s. .AGT..G.AC ...T....AA ..G..T..T. ..A..T.CTT .AG....... ....A...CC ..T-...... .....

#IAHA1_F. obscurus s.s. .AGT..G.AC ...T....AA ..G..T..T. ..A..T.CTT .AG....... ....A...CC ..T-C..... .....

#IAHA2_F. obscurus s.s. .AGT..G.AC ...T....AA ..G..T..T. ..A..T.CTT .AG....... ....A...CC ..T-C..... .....

#IAHA3_F. obscurus s.s. .AGT..G.AC ...T....AA ..G..T..T. ..A..T.ATT .AG....... ....A...CC ..T-...... .....

#IAHA4_F. obscurus s.s. .AGT..G.AC ...T....AA ..G..T..T. ..A..T.ATT .AG....... ....A...CC ..T-...... .....

#IAHA5_F. obscurus s.s. .AGT..G.AC ...T....AA ..G..T..T. ..A..T.CTT .AG....... ....A...CC ..T-C..... .....

#tz1_F. palikur CA.TA.G..C .AA.TA.-TA AGT.ATTCCA T.A.-TCT.A .AG.T...G. GTTTATTT.C AT.ACTGTA. .T.TT

#tz2_F. palikur CA.TA.G..C .AA.TA.-TA AGT.ATTCCA T.A.-TCT.A .AG.T..... GTTTATTT.C AT.ACTGTA. .T.TT

#tz3_F. palikur CA.TA.G..C .AA.TA.-TA AGT.ATTCCA T.A.-TCT.A .AG.T...G. GTTTATTT.C AT.ACTGTA. .T.TT

#tz4_F. palikur CA.TA.G..C .AA.TA.-TA AGT.ATTCCA T.A.-TCT.A .AG.T...G. GTTTATTT.C AT.ACTGTA. .T.TT

#tz5_F. palikur CA.TA.G..C .AA.TA.-TA AGT.ATTCCA T.A.-TCT.A .AG.T..... GTTTATTT.C AT.ACTGTA. .T.TT

#tg1_F. palikur CA.TA.G..C .AA.TA.-TA AGT.ATTCCA T.A.-TCT.A .AG.T...G. GTTTATTT.C AT.ACTGTA. .T.TT

#tg2_F. palikur CA.TA.G..C .AA.TA.-TA AGT.ATTCCA T.A.-CCT.A .AG.T...G. GTTTATTT.C AT.ACTGTA. .T.TT

#tg3_F. palikur CA.TA.G..C .AA.TA.-TA AGT.ATTCCA T.A.-TCT.A .AG.T...G. GTTTATTT.C AT.ACTGTA. .T.TT

#tg5_F. palikur CA.TA.G..C .AA.TA.-TA AGT.ATTCCA T.A.-CCT.A .AG.T..... GTTTATTT.C AT.ACTGTA. .T.TT

#amapa4_1_F. palikur CA.TA.G..C .AA.TA.-TA AGT.ATTCCA T.AA-TCT.A .AG.T..... GTTTATTT.C AT.ACTGTA. .T.TT

#amapa4_3_F. palikur CA.TA.G..C .AA.TA.-TA AGT.ATTCCA T.AA-TCT.A .AG.T..... GTTTATTT.C AT.ACTGTA. .T.TT

#amapa4_4_F. palikur CA.TA.G..C .AA.TA.-TA AGT.ATTCCA T.AA-TCT.A .AG.T..... GTTTATTT.C AT.ACTGTA. .T.TT

#amapa4_5_F. palikur CA.TA.G..C .AA.TA.-TA AGT.ATTCCA T.AA-TCT.A .AG.T..... GTTTATTT.C AT.ACTGTA. .T.TT

#amapa5_1_F. palikur CA.TA.G..C .AA.TA.-TA AGT.ATTCCA T.AA-TCT.A .AG.T...G. GTTTATTT.C AT.ACTGTA. .T.TT

#amapa5_2_F. palikur CA.TA.G..C .AA.TA.-TA AGT.ATTCCA T.AA-TCT.A .AG.T...G. GTTTATTT.C AT.ACTGTA. .T.TT

#amapa5_3_F. palikur CA.TA.G..C .AA.TA.-TA AGT.ATTCCA T.AA-TCT.A .AG.T...G. GTTTATTT.C AT.ACTGTA. .T.TT

#amapa5_4_F. palikur CA.TA.G..C .AA.TA.-TA AGT.ATTCCA T.AA-TCT.A .AGGT..... GTTTATTT.C AT.ACTGTA. .T.TT

#amapa5_5_F. palikur CA.TA.G..C .AA.TA.-TA AGT.ATTCCA T.AA-TCT.A .AG.T..... GTTTATTT.C AT.ACTGTA. .T.TT

#amapa10_1_F. palikur CA.TA.G..C .AA.TA.-TA AGT.ATTCCA T.AA-TCT.A .AG.T...G. GTTTATTT.C AT.ACTGTA. .T.TT

#amapa10_2_F. palikur

CA.TA.G..C .AA.TA.-TA AGT.ATTCCA T.AA-TCT.A .AG.T...G. GTTTATTT.C AT.ACTGTA. .T.TT

#amapa10_3_F. palikur CA.TA.G..C .AA.TA.-TA AGT.ATTCCA T.AA-TCT.A .AG.T...G. GTTTATTT.C AT.ACTGTA. .T.TT

#amapa10_4_F. palikur CA.TA.G..C .AA.TA.-TA AGT.ATTCCA T.AA-TCT.A .AG.T...G. GTTTATTT.C AT.ACTGTA. .T.TT

#amapa10_5_F. palikur CA.TA.G..C .AA.TA.-TA AGT.ATTCCA T.AA-TCT.A .AG.T...G. GTTTATTT.C AT.ACTGTA. .T.TT

#amapa11_1_F. palikur CA.TA.G..C .AA.TA.-TA AGT.ATTCCA T.AA-TCT.A .AG.T...G. GTTTATTT.C AT.ACTGTA. .T.TT

#amapa11_2_F. palikur CA.TA.G..C .AA.TA.-TA AGT.ATTCCA T.AA-TCT.A .AG.T...G. GTTTATTT.C AT.ACTGTA. .T.TT

#amapa11_3_F. palikur CA.TA.G..C .AA.TA.-TA AGT.ATTCCA T.AA-TCT.A .AG.T..... GTTTATTT.C AT.ACTGTA. .T.TT

102

#amapa11_4_F. palikur CA.TA.G..C .AA.TA.-TA AGT.ATTCCA T.AA-TCT.A .AG.T..... GTTTATTT.C AT.ACTGTA. .T.TT

#amapa11_5_F. paliku CA.TA.G..C .AA.TA.-TA AGT.ATTCCA T.AA-TCT.A .AG.T..... GTTTATTT.C AT.ACTGTA. .T.TT

#salv6_F. palikur CA.TA.G..C .AA.TA.-TA AGT.ATTCCA T.A.-TCT.A .AG.T..... GTTTATTT.C AT.AATGTA. .T.TT

#salv1_F. palikur CA.TA.G..C .AA.TA.-TA AGT.ATTCCA T.A.-TCT.A .AG.T..... GTTTATTT.C AT.AATGTA. .T.TT

#salv2_F. palikur CA.TA.G..C .AA.TA.-TA AGT.ATTCCA T.A.-TCT.A .AG.T..... GTTTATTT.C AT.AATGTA. .T.TT

#salv3_F. palikur CA.TA.G..C .AA.TA.-TA AGT.ATTCCA T.A.-TCT.A .AG.T..... GTTTATTT.C AT.AATGTA. .T.TT

#salv4_F. palikur CA.TA.G..C .AA.TA.-TA AGT.ATTCCA T.A.-TCT.A .AG.T..... GTTTATTT.C AT.AATGTA. .T.TT

#salv5_F. palikur CA.TA.G..C GAA.TA.-TA AGT.ATTCCA T.A.-TCT.A .AG.T..... GTTTATTT.C AT.ACTGTA. .T.TT

#calc1_F. palikur CA.TA.GG.C .AA.TA.-TA AGT.ATTCCA T.A.-CCT.A .AG.T..... GTTTATTT.C AT.ACTGTA. .T.TT

#calc2_F. palikur CA.TA.GG.C .AA.TA.-TA AGT.ATTCCA T.A.-CCT.A .AG.T..... GTTTATTT.C AT.ACTGTA. .T.TT

#calc3_F. palikur CA.TA.GG.C .AA.TA.-TA AGT.ATTCCA T.A.-CCT.A .AG.T..... GTTTATTT.C AT.ACTGTA. .T.TT

#calc4_F. palikur CA.TA.GG.C .AA.TA.-TA AGT.ATTCCA T.A.-CCT.A .AG.T..... GTTTATTT.C AT.ACTGTA. .T.TT

#calc5_F. palikur CA.TA.GG.C .AA.TA.-TA AGT.ATTCCA T.A.-CCT.A .AG.T..... GTTTATTT.C AT.ACTGTA. .T.TT

#marajo26_2_F. palikur CA.TA.G..C GAA.TA.-TA AGT.ATTCCA T.A.-TCT.A .AG.T..... GTTTATTT.C AT.ACTGTA. .T.TT

#marajo26_3_F. palikur CA.TA.G..C GAA.TA.-TA AGT.ATTCCA T.A.-TCT.A .AG.T..... GTTTATTT.C AT.ACTGCA. .T.TT

#marajo26_4_F. palikur CA.TA.G..C GAA.TA.-TA AGT.ATTCCA T.A.-TCT.A .AG.T..... GTTTATTT.C AT.ACTGTA. .T.TT

#marajo26_5_F. palikur CA.TA.G..C .AA.TA.-TA AGT.ATTCCA T.A.-TCT.A .AG.T..... GTTTATTT.C AT.ACTGTA. .T.TT

#RBM1_F. pygmaeus ...T..G.AC ....T.AGAA ..G..T..T. ..A..TATC. T......AC. ....A...C. .T.T...... CTC..

#RBM2_F. pygmaeus ...T..G.AC ....T...AA ..G..T..T. ..A..TATC. T.......G. ....A...CT .T.C.....T CTC..

#RBM3_F. pygmaeus ...T..G.AC ...GT...AA ..G..T..T. ..A..TATC. T.......G. ....A...CT .T.C.....T CTC..

#RBM4_F. pygmaeus ...T..G.AC ...GT...AA ..G..T..T. ..A..TATC. T.......G. ....A...CT .T.C.....T CTC..

#rbm5_F. pygmaeus ...T..G.AC ...GT...AA ..G..T..T. ..A..TATC. T.......G. ....A...CT .T.C.....T CTC..

#RPI1_F. pygmaeus ...T..G.AC ...GT...AA ..G..T..T. ..A..TATC. T.......G. ....A...CT .T.C.....T CTC..

#RPI2_F. pygmaeus ...T..G.AC ....T...AA ..G..T..T. ..A..TATC. T.......G. ....A...CT .T.C.....T CTC..

#RPI4_F. pygmaeus ...T..G.AC ....T.AGAA ..G..T..T. ..A..TATC. T......AC. ....A...C. .T.T...... CTC..

#RPI6_F. pygmaeus ...T..G.AC ....T...AA ..G..T..T. ..A..TATC. T.......G. ....A...CT .T.C.....T CTC..

#JATU1_F. pygmaeus ......G.AC ...GT...AA ..G..T..T. ..A..TATC. T.......G. ....A...CT .T.C.....T CTC..

#JATU2_F. pygmaeus ......G.AC ...GT...AA ..G..T..T. ..A..TATC. T.......G. ....A...CT .T.C.....T CTC..

#JATU4_F. pygmaeus ......G.AC ...GT...AA ..G..T..T. ..A..TATC. T.......G. ....A...CT .T.C.....T CTC..

[ 2222222222 2222222223 3333333333 3]

[ 1111222233 3445557770 0112223444 5]

[ 2478018903 6492341244 9125891389 5]

#mgc1_Fluviphylax sp.1 TAGAGTTTTC CTGCAAACTT CGCTTATCAC A

#mgc2_Fluviphylax sp.1 .......... .......... .......... .

#mgc3_Fluviphylax sp.1 .......... .......... .......... .

#mgc4_Fluviphylax sp.1 .......... .......... .......... .

#mgc5_Fluviphylax sp.1 .......... .......... .......... .

#ven6_Fluviphylax sp.1 .......... .......... .......... .

#CURI1_Fluviphylax sp.1 .......... ......G... .......... .

103

#CURI2_Fluviphylax sp.1 .......... ......G... .......... .

#CURI3_Fluviphylax sp.1 .......... ......G... .......... .

#CURI4_Fluviphylax sp.1 .......... ......G... .......... .

#CURI5_Fluviphylax sp.1 .......... ......G... .......... .

#MAXI1_Fluviphylax sp.1 .......... ......G... .......... .

#MAXI2_Fluviphylax sp.1 .......... ......G... .......... .

#MAXI3_Fluviphylax sp.1 .......... ......G... .......... .

#MAXI4_Fluviphylax sp.1 .......... ......G... .......... .

#MAXI5_Fluviphylax sp.1 .......... ......G... .......... .

#str1_F. simplex .......... .......... ........TT T

#str3_F. simplex .......... .......... ........TT T

#str4_F. simplex .......... .......... ........TT T

#str5_F. simplex .......... .......... ........TT T

#BREU1_F. simplex .......... .......... ........T. T

#BREU2_F. simplex .......... .......... ........T. T

#BREU3_F. simplex .......... .......... ........T. T

#BREU4_F. simplex .......... .......... ........T. T

#BREU5_F. simplex .......... .......... ........T. T

#MUSSU1_F. simplex .......... .......... ........TT T

#MUSSU2_F. simplex .......... .......... ........TT T

#BACU1_F. simplex .......... .......... ........TT T

#BACU2_F. simplex .......... .......... ........TT T

#BACU4_F. simplex .......... .......... ........TT T

#BACU5_F. simplex .......... .......... ........TT T

#LAA2_1_F. simplex .......... .......... ........TT T

#LAA2_2_F. simplex .......... .......... ........TT T

#LAA2_3_F. simplex .......... .......... ........TT T

#LAA2_4_F. simplex .......... .......... ........TT T

#LAA2_5_F. simplex .......... .......... ........TT T

#LAA2_6_F. simplex .......... .......... ........TT T

#LAA2_7_F. simplex .......... .......... ........TT T

#LAA2_8_F. simplex .......... .......... ........TT T

#LAA2_9_F. simplex .......... .......... ........TT T

#LAA2_10_F. simplex

.......... .......... ........TT T

#LAA2_11_F. simplex .......... .......... ........TT T

#LAA2_12_F. simplex .......... .......... ........TT T

#laa1_1_F. simplex .......... .......... ........TT T

#LAA1_2_F. simplex .......... .......... ........TT T

#LAA1_3_F. simplex .......... .......... ........TT T

#LAA1_4_F. simplex .......... .......... ........TT T

104

#LAA1_5_F. simplex .......... .......... ........TT T

#LAA1_6_F. simplex .......... .......... ........TT T

#trom1_F. simplex .......... .......... ........TT T

#JNCII1_F. simplex .......... .......... ........TT T

#JNCII2_F. simplex .......... .......... ........TT T

#JNCII3_F. simplex .......... .......... ........TT T

#JNCII4_F. simplex .......... .......... ........TT T

#JNCII5_F. simplex .......... .......... ........TT T

#JNCII6_F. simplex .......... .......... ........TT T

#JNCI1_F. simplex .......... .......... ........TT T

#JNCI2_F. simplex .......... .......... ........TT T

#JNCI5_F. simplex .......... .......... ........TT T

#JNCI6_F. simplex .......... .......... ........TT T

#araca1_F. obscurus s.s. ..CT.AA... ..T....... ........TT .

#araca2_F. obscurus s.s. ..CT.AA... ..T....... ........TT .

#araca3_F. obscurus s.s. ..CT.AA... ..T....... ........TT .

#araca4_F. obscurus s.s. ..CT.AA... ..T....... ........TT .

#RJX2_F. obscurus s.s. ..CT.AA... ..T....... ........TT .

#RJX3_F. obscurus s.s. ..CT.AA... ..T....... ........TT .

#rjx4_F. obscurus s.s. ..CT.AA... ..???????? ?????????? ?

#RJX5_F. obscurus s.s. ..CT.AA... ..T....... ........TT .

#TAPA1_F. obscurus s.s. ..CT.AA... ..T....... ........TT .

#TAPA2_F. obscurus s.s. ..CT.AA... ..T....... ........TT .

#TAPA3_F. obscurus s.s. ..CT.AA... ..T....... ........TT .

#TAPA4_F. obscurus s.s. ..CT.AA... ..T....... ........TT .

#TAPA5_F. obscurus s.s. ..CT.AA... ..T....... ........TT .

#TAPA6_F. obscurus s.s. ..CT.AA... ..T....... ........TT .

#IAHA1_F. obscurus s.s. ..CT.AA... ..T....... ........TT .

#IAHA2_F. obscurus s.s. ..CT.AA... ..T....... ........TT .

#IAHA3_F. obscurus s.s. ..CT.AA... ..T....... ........TT .

#IAHA4_F. obscurus s.s. ..CT.AA... ..T....... ........TT .

#IAHA5_F. obscurus s.s. ..CT.AA... ..T....... ........TT .

#tz1_F. palikur CCCT..AGGT AGTA.GGACA TTAGAGA.TT .

#tz2_F. palikur

CCCT..AGGT AGTA.GGACA TTAGAGA.TT .

#tz3_F. palikur CCCT..AGGT AGTA.GGACA TTAGAGA.TT .

#tz4_F. palikur CCCT..AGGT AGTA.GGACA TTAGAGA.TT .

#tz5_F. palikur CCCT..AGGT AGTA.GGACA TTAGAGA.TT .

#tg1_F. palikur CCCT..AGGT AGTA.GGACA TTAGAGA.TT .

#tg2_F. palikur CCCT..AGGT AGTA.GGACA TTAGAGA.TT .

#tg3_F. palikur CCCT..AGGT AGTA.GGACA TTAGAGA.TT .

105

#tg5_F. palikur CCCT..AGGT AGTA.GGACA TTAGAGA.TT .

#amapa4_1_F. palikur CCCT..AGGT AGTA.GGACA TTAGAGA.TT .

#amapa4_3_F. palikur CCCT..AGGT AGTA.GGACA TTAGAGA.TT .

#amapa4_4_F. palikur CCCT..AGGT AGTA.GGACA TTAGAGA.TT .

#amapa4_5_F. palikur CCCT..AGGT AGTA.GGACA TTAGAGA.TT .

#amapa5_1_F. palikur CCCT..AGGT AGTA.GGACA TTAGAGA.TT .

#amapa5_2_F. palikur CCCT..AGGT AGTA.GGACA TTAGAGA.TT .

#amapa5_3_F. palikur CCCT..AGGT AGTA.GGACA TTAGAGA.TT .

#amapa5_4_F. palikur CCCT..AGGT AGTA.GGACA TTAGAGA.TT .

#amapa5_5_F. palikur CCCT..AGGT AGTA.GGACA TTAGAGA.TT .

#amapa10_1_F. palikur CCCT..AGGT AGTA.GGACA TTAGAGA.TT .

#amapa10_2_F. palikur CCCT..AGGT AGTA.GGACA TTAGAGA.TT .

#amapa10_3_F. palikur CCCT..AGGT AGTA.GGACA TTAGAGA.TT .

#amapa10_4_F. palikur CCCT..AGGT AGTA.GGACA TTAGAGA.TT .

#amapa10_5_F. palikur CCCT..AGGT AGTA.GGACA TTAGAGA.TT .

#amapa11_1_F. palikur CCCT..AGGT AGTA.GGACA TTAGAGA.TT .

#amapa11_2_F. palikur CCCT..AGGT AGTA.GGACA TTAGAGA.TT .

#amapa11_3_F. palikur CCCT..AGGT AGTA.GGACA TTAGAGA.TT .

#amapa11_4_F. palikur CCCT..AGGT AGTA.GGACA TTAGAGA.TT .

#amapa11_5_F. palikur CCCT..AGGT AGTA.GGACA TTAGAGA.TT .

#salv6_F. palikur .CCT..AGGT AGTA.GGACA TTAGAGA.TT .

#salv1_F. palikur .CCT..AGGT AGTA.GGACA TTAGAGA.TT .

#salv2_F. palikur .CCT..AGGT AGTA.GGACA TTAGAGA.TT .

#salv3_F. palikur .CCT..AGGT AGTA.GGACA TTAGAGA.TT .

#salv4_F. palikur .CCT..AGGT AGTA.GGACA TTAGAGA.TT .

#salv5_F. palikur CCCT..AGGT AGTA.GGACA TTAGAGA.TT .

#calc1_F. palikur CCCT..AGGT AGTA.GGACA TTAGAGA.TT .

#calc2_F. palikur CCCT..AGGT AGTA.GGACA TTAGAGA.TT .

#calc3_F. palikur CCCT..AGGT AGTA.GGACA TTAGAGA.TT .

#calc4_F. palikur CCCT..AGGT AGTA.GGACA TTAGAGA.TT .

#calc5_F. palikur CCCT..AGGT AGTA.GGACA TTAGAGA.TT .

#marajo26_2_F. palikur CCCT..AGGT AGTA.GGACA TTAGAGA.TT .

#marajo26_3_F. palikur CCCT..AGGT AGTA.GGACA TTAGAGA.TT .

#marajo26_4_F. palikur

CCCT..AGGT AGTA.GGACA TTAGAGA.TT .

#marajo26_5_F. palikur CCCT..AGGT AGTA.GGACA TTAGAGA.TT .

#RBM1_F. pygmaeus ....TA.... ..A.T.G... ........TT .

#RBM2_F. pygmaeus ....TA.... ....T..... .......ATT .

#RBM3_F. pygmaeus ....CA.... ..A.T.G... ........TT .

#RBM4_F. pygmaeus ....CA.... ..A.T.G... ........TT .

#rbm5_F. pygmaeus ....CA.... ..A.T.G... ........TT .

106

#RPI1_F. pygmaeus ....CA.... ..A.T.G... ........TT .

#RPI2_F. pygmaeus ....TA.... ....T..... .......ATT .

#RPI4_F. pygmaeus ....TA.... ..A.T.G... ........TT .

#RPI6_F. pygmaeus ....TA.... ....T..... .......ATT .

#JATU1_F. pygmaeus .....A.... ....T.G... ........TT .

#JATU2_F. pygmaeus .....A.... ....T.G... ........TT .

#JATU4_F. pygmaeus .....A.... ....T.G... ........TT .

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