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MARIELE PORTO CARNEIRO LEÃO
CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR (PCR) E INFECÇÃO DE
Metarhizium anisopliae var. acridum e Metarhizium anisopliae var.
anisopliae EM Zaprionus indianus
RECIFE
2006
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MARIELE PORTO CARNEIRO LEÃO
CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR (PCR) E INFECÇÃO DE
Metarhizium anisopliae var. acridum e Metarhizium anisopliae var.
anisopliae EM Zaprionus indianus
ORIENTADORA: Profª Drª Elza Áurea de Luna Alves Lima
CO-ORIENTADOR: Prof Dr. José Ferreira dos Santos
Recife-PE
2006
Dissertação apresentada ao
Curso de Pós-Graduação em
Biologia de Fungos do
Departamento de Micologia
da Universidade Federal de
Pernambuco, como parte do
requisito para obtenção do
título de Mestre.
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CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR (PCR) E INFECÇÃO DE
Metarhizium anisopliae var. acridum e Metarhizium anisopliae var.
anisopliae EM Zaprionus indianus
MARIELE PORTO CARNEIRO LEÃO
ORIENTADORA: Profª Drª Elza Áurea de Luna Alves Lima
CO-ORIENTADOR: Prof Dr. José Ferreira dos Santos
BANCA EXAMINADORA
_________________________________________________________
Profª Drª Elza Áurea de Luna Alves Lima (Departamento de Micologia UFPE)
_________________________________________________________
Profª Drª Cristina Maria de Souza Motta (Departamento de Micologia UFPE)
________________________________________________________________
Profª Drª Tania Tassinari Rieger (Departamento de Genética / UFPE)
SUPLENTES
_________________________________________________________
Profª Drª Neiva Tinti de Oliveira (Departamento de Micologia / UFPE)
Profª Drª Auristela Correia de Albuquerque (UFRPE)
4
“Embora os mestres e os livros sejam
auxiliares necessários, é do esforço próprio que
se consegue os mais completos e brilhantes
resultados”.
Garfield
5
DEDICO
Com muita gratidão, sinceridade e
reconhecimento, aos meus pais, que cedo me
ensinaram, pelo exemplo, que vale a pena ser
honesta e lutar por um ideal.
6
AGRADECIMENTOS
A Deus, por sua infinita graça e seu imenso amor por mim.
Aos meus pais, Nelson Carneiro Leão Neto e Suely Carmo Porto Carneiro
Leão, pelo amor, apoio, incentivo, confiança e pela ajuda na escolha do caminho
certo.
Aos meus irmãos, Nilton Porto Carneiro Leão e Nelson Carneiro Leão, pelo
carinho, união e o contínuo estímulo em todos os momentos.
A Sérgio Henrique Freire de Moura, pelo carinho, apoio, paciência, amor e
estímulo nas horas de desânimo frente às dificuldades.
À Profª da UFPE, minha orientadora, Drª Elza Áurea de Luna Alves Lima, pela
confiança, paciência, bem como pelo exemplo de dedicação, de doação de
dignidade pessoal e sobre tudo de amor.
À meu Co-orientador, Profº Dr. José Ferreira dos Santos pelas sugestões
durante o decorrer do trabalho
À UFPE e ao Departamento de Micologia, que facilitaram minhas pesquisas
durante esse trabalho.
Ao CENARGEN – EMBRAPA, pela liberação das linhagens empregadas
nesse trabalho.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)
pelo suporte financeiro e técnico-científico no decorrer deste trabalho.
7
Em especial a Bereneuza Tavares Ramos Valente Brasileiro e Meirana Xavier
Vila Nova pelo apoio, intercambio de conhecimentos e ajuda e paciência durante o
decorrer desse trabalho.
Aos meus colegas de Laboratório de Citologia e Genética: Ana Paula
Almeida, Ana Paula Duarte, Virgínia, Neide e Francisco pela convivência
harmoniosa.
Às minhas colegas do Departamento de Genética Nara e Kelma pela ajuda na
obtenção da mosca Zaprionus indianus.
A todos aqueles que contribuíram de alguma forma para a realização do
Curso de Mestrado.
8
SUMÁRIO
Páginas
LISTA DE FIGURAS
LISTA DE TABELAS
RESUMO
ABSTRACT
1. INTRODUÇÃO ....................................................................................... 15
2. REVISÃO DE LITERATURA ................................................................. 17
2.1 – Aspectos taxonômicos e biológicos de Metarhizium................ 17
2.2 - Utilização de Metarhizium ssp. para o biocontrole de insetos-
pragas..............................................................................................20
2.3 – Zaprionus indianus........................................................................23
2.4 – Marcadores Moleculares...............................................................27
2.4.1- PCR (Polimerase Chain Reaction)............................................27
2.4.2- Região ITS do DNA ribossomal.................................................28
2.4.3- Microssatélite (GTG)
5
................................................................31
2.4.4- Intron Splice Site Primer............................................................32
3. MATERIAL E MÉTODOS ...................................................................... 33
3.1 – Local de Realização dos Experimentos ..................................... 33
3.2 – Linhagens Fúngicas Utilizadas.................................................... 33
3.3 – Linhagem da Mosca utilizada....................................................... 33
3.4 – Meios de Cultura ......................................................................... 33
9
3.4.1 – Batata-Dextrose-Agar (BDA) .................................................... 33
3.4.2 – Meio Mínimo(MM) .................................................................... 33
3.4.3 – Meio para Drosophila................................................................. 34
3.5 – Análise da variabilidade genética detectada por
marcadores moleculares ............................................................. 34
3.5.1 – Obtenção de micélio para extração do DNA genômico ....... 34
3.5.2 – Extração de DNA .................................................................... 34
3.5.3 – Quantificação do DNA.............................................................. 36
3.5.4 – Amplificação de DNA pela técnica de PCR.............................36
3.5.4.1-Região ITS do rDNA................................................................36
3.5.4.2-Microssatélite (GTG)
5
.............................................................. 37
3.5.4.3-Intron Splice Site Primer......................................................... 37
3.6 –Análise Estatística .........................................................................38
3.7 –Teste de Patogeniciade .................................................................39
3.7.1 – Bioensaios.................................................................................39
3.7.2 – Suspensões de esporos fúngicos...........................................39
3.7.3 – Quantificação do inóculo.........................................................39
3.7.4 – Infecção “in vitro” de larvas Zaprionus indianus...................40
3.7.5 – Reisolamento do fungo de Zaprionus indianus......................40
3.7.6 – Análise Estatística.....................................................................40
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO .............................................................41
4.1– Teste de Patogenicidade............................................................ 41
4.2– Análise das regiões de Microssatélite, intron e ITS antes da
Infecção de Zaprionus indianus.............................................. 45
4.3– Análise das regiões de Microssatelite, Intron e ITS após
reisolamento de Zaprionus indianus pós
infecção experimental.................................................................51
5. CONCLUSÕES ......................................................................................53
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .....................................................54
10
LISTA DE FIGURAS
Páginas
FIGURA 1. Zaprionus indianus. (A e B) Faixas brancas demarcadas
por linhas negras paralelas. (C) Espinhos complexos nos fêmures
das patas anteriores. Campos (2005)........................................................... 25
FIGURA 2. (A) Fruto de figo sadio. (B) Larvas de Zaprionus indianus no
ostíolo do fruto. (C) Dano em figo causado por Zaprionus indiauns.
(D) Larvas dentro do fruto. Stein et al. (1999). ............................................. 26
FIGURA 3. Estrutura do agregado gênico com representação das
regiões ITS1, ITS2 e a subunidade 5.8S do rDNA com iniciadores
ITS5 eITS4. Adaptado de Fungaro (2000).................................................... 30
FIGURA 4. Representação esquemática da técnica de extração de DNA
para fungos filamentosos. Brasileiro (2003)................................................. 35
FIGURA 5. Perfil de amplificação de DNA das 2 linhagens de
Metarhizium anisopliae e Fusarium solani das regiões de (GTG)
5
(A)
e Intron (B). Nas pistas M, marcador de peso molecular 100 pb;
Nas pistas 1, 2 e 3, encontram-se os DNAs das linhagens
Metarhizium anisopliae var. acridum, Metarhizium anisopliae
var. anisopliae e Fusarium solani................................................................. 45
FIGURA 6.
Dendrograma construído pelo método de agrupamento
UPGMA, utilizando o coeficiente de Jaccard a partir dos perfis de (GTG)
5
obtidos de linhagens de Metarhizium anisopliae var. acridum,
Metarhizium anisopliae var. anisopliae e Fusarium solani ........................... 48
11
FIGURA 7. Dendrograma construído pelo método de agrupamento
UPGMA, utilizando o coeficiente de Jaccard a partir dos perfis de Intron
obtidos de linhagens de Metarhizium anisopliae var. acridum,
Metarhizium anisopliae var. anisopliae e Fusarium solani ........................... 48
FIGURA 8. Perfil da região ITS do rDNA dos isolados de
Metarhizium anisopliae, pelos primers ITS4 e ITS5, em gel de agarose.
Na pista M, marcador de peso molecular 100pb, nas pistas 1, 2 e 3
encontra-se o DNA das linhagens de
Metarhizium anisopliae var. acridum,
M. anisopliae var. anisopliae e Fusarium solani ................................................ 50
FIGURA 9. Perfil de amplificação de DNA das 2 linhagens Metarhizium
das regiões de (GTG)
5
(A) e Intron (B). Nas pistas M, marcador de peso
molecular 100pb; Nas pistas 1e 5 encontra-se o DNA da linhagem
Metarhizium anisopliae var. acridum antes da passagem pela mosca e nas
pistas 2 e 6 o DNA após passagem pela mosca; Nas pistas 3 e 7
encontra-se o DNA da linhagem Metarhizium anisopliae var. anisopliae
antes da passagem pela mosca e nas pistas 4 e 8
encontra-se o DNA após a passagem pela mosca ...................................... 51
FIGURA 10. Perfil da região ITS do rDNA dos isolados de
Metarhizium anisopliae, pelos primers ITS4 e ITS5, em gel de agarose.
Na pista M, marcador de peso molecular 100pb, nas pistas 1 e 2, encontra-se
o DNA das linhagens de Metarhizium anisopliae var. acridum antes e após
passagem por Zaprionus indiauns respectivamente; Nas pistas 3 e 4 o
DNA de Metarhizium anisopliae var anisopliae............................................ 52
12
LISTA DE TABELAS
Páginas
TABELA 1. Primers utilizados para amplificar o DNA das
linhagens de Metarhizium............................................................................ 36
TABELA 2. Média e desvio do número de moscas que emergiram por vidro,
infectadas por Metarhizium anisopliae var. acridum e
Metarhizium anisopliae var. anisopliae após 8 dias avaliação.................... 43
TABELA 3. Percentual do ritimo de emergência de Zaprionus indianus
infectadas por Metarhizium anisopliae var. acridum e
Metarhizium anisopliae var. anisopliae durante os 8 dias avaliação ............ 44
13
CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR (PCR) E INFECÇÃO DE METARHIZIUM
ANISOPLIAE VAR. ACRIDUM E METARHIZIUM ANISOPLIAE VAR. ANISOPLIAE
EM ZAPRIONUS INDIANUS
MARIELE PORTO CARNEIRO LEÃO
RESUMO
Foram analisadas as linhagens Metahizium anisopliae var. acridum e Metarhizium
anisopliae var. anisopliae quanto à patogênicidade sobre Zaprinus indianus, utilizando as
concentrações 10
4
, 10
5
, 10
6
, 10
7
, 10
8
conídios/mL considerando o percentual de emergência
de adultos. De acordo com a metodologia empregada verificou-se que as duas linhagens
apresentaram ação contra Z. indianus. Os marcadores moleculares ITS (Internal Trancride
Spacer) do rDNA, Intron Splice Site Primer e Microssatélite (SSR- Simple Sequence
Repeats)
,
foram utilizados para avaliar a diversidade genética entre as linhagens antes e após
a passagem pela mosca. A análise de agrupamento usando o método de UPGMA baseada nas
distâncias genéticas dos marcadores moleculares confirmou a diversidade genética
reconhecida no gênero Metarhizium. O microssatélite (GTG)
5
e o intron do grupo mRNA
nuclear tiveram a mesma sensibilidade em detectar a variabilidade genética entre as linhagens
de Metarhizium . Os produtos de amplificação dos loci ITS1-5.8-ITS2 do rDNA com os
iniciadores ITS4 e ITS5 foram eficientes em demonstrar que as linhagens estudadas pertence
à espécie Metarhizium anisopliae, apesar da diversidade genética demonstrada pelos
marcadores (GTG)
5
e EI1. Os perfis de amplificações da região microssatélite, intron e ITS
após a passagem por Z. indianus comprovaram que as linhagens reisoladas foram às mesmas
que foram utilizadas para infectar.
Palavras-chave: Metarhizium, região ITS-rDNA, Intron Splice Site Primer,
Microssatélite e Zaprionus indianus
14
MOLECULAR CHARACTERIZATION (PCR) AND INFECTION METARHIZIUM
ANISOPLIAE VAR. ACRIDUM AND METARHIZIUM ANISOPLIAE VAR.
ANISOPLIAE ON ZAPRIONUS INDIANUS
MARIELE PORTO CARNEIRO LEÃO
ABSTRACT
The Metarhizium anisopliae var. acridum and M. anisopliae var. anisopliae strains
were analysed for the pathogenicity to the fly Zaprionus indianus, using the concentrations
10
4
, 10
5
, 10
6
, 10
7
, 10
8
conidia/mL, considering the percentage of adults’ emergency. In
agreement with the used methodology, it was verified that both fungi strains presented action
against Z. indianus. The ITS (Internal Trancribed Spacer) molecular markers of rDNA,
Intron Splice Site Primer and Microsatelite (SSR- Simple Sequence Repeats) were used to
evaluate the genetic diversity before and after passing through the fly. The grouping analysis
using the UPGMA method, based on the genetic distances of molecular markers, confirmed
the recognized genetic diversity of the genus Metarhizium. The microsatelite (GTG)
5
and the
introns of nuclear mRNA group showed the same sensitive to detect the genetic variability
among Metarhizium strains. The amplification products of the rDNA locus ITS1-5.8-ITS2
with the ITS4 and ITS5 primers were efficient to demonstrate that the strains analysed
belongs to the Metarhizium anisopliae specie, although genetic diversity was demonstrated by
markers (GTG)
5
e EI1. The amplification profiles of microsatelite, intron and ITS regions
after passing through the Z. indianus proved that the reisolateds strains were the same that
were used for infection.
Key Words: Metarhizium, ITS-rDNA region, Intron Splice Site Primer,
Microsatelite and Zaprionus indianus
15
1. INTRODUÇÃO
Zaprionus indianus, mosca de origem africana, foi introduzida no Brasil, de forma
acidental (VILELA, 1999). Esta espécie ainda não foi considerada uma praga na sua região de
origem, onde apresenta o comportamento normal verificado para os organismos da família,
cujas larvas e adultos se alimentam das leveduras, de frutos caídos ao solo em decomposição
(BEGON, 1982). Entretanto, após sua invasão no Brasil, dadas às condições favoráveis, este
drosofilídeo sofreu significativa modificação de comportamento e parece ter atingido o status
de praga, realizando a postura em frutos em início de maturação. A mosca deposita seus ovos
no ostíolo do fruto, e as larvas penetram no interior levando à inutilização dos mesmos pela
introdução de leveduras e bactérias. Estes frutos tornam-se impróprios para o consumo, como
ocorreu na região de Valinos (SP) como figos produzidos para exportação, causando grande
prejuízo e tornando essa mosca conhecida no Brasil como a mosca-do-figo (VILELA et al.,
2001).
Na região Nordeste a mosca-do-figo foi encontrada em 2000, na região do Vale do Rio
São Francisco (Sobradinho, BA), pela equipe do Setor de Drosofilídeos do Laboratório de
Genética Animal (Departamento de Genética, CCB) da UFPE e no mesmo ano esta mosca foi
encontrada nas zonas da mata e litorânea dos estados de Pernambuco e Paraíba, demonstrando
grande capacidade de disseminação (SANTOS et al., 2003).
Na região Sul a mosca-do-figo parece restrita aos frutos cultivados, como figos, caqui,
pêssegos e laranjas, indicando que o seu controle poderia ser facilmente empreendido, uma
vez que não haveria reservatórios em áreas naturais para reinfestação das culturas (VILELA,
1999; VILELA et al., 2001). Na região Nordeste as populações de Z. indianus adotaram uma
estratégia diferente de disseminação, atacando frutos nativos, como umbu, sirigüela, jaca,
sapoti e jenipapo, formando reservatórios naturais de onde poderá reinfestar áreas de
fruticultura, podendo ser considerada a mais nova ameaça potencial desta mosca nas áreas de
fruticultura, como o Vale do Rio São Francisco (SANTOS et al., 2003). Embora ainda não
tenha causado prejuízos econômicos na região Nordeste, a melhor adaptação ao ambiente
natural, desta mosca, poderá levar com o aumento das populações, a infestações de difícil
controle, devido às reinfestações provenientes de áreas naturais adjacentes.
A ameaça da Z. indianus à fruticultura paulista está levando à necessidade do
desenvolvimento urgente de métodos para seu controle biológico, visando à sua prevenção.
Esta necessidade provavelmente se estenderá em breve a outros estados, principalmente da
região Nordeste, onde o clima quente favorece o desenvolvimento e disseminação da Z.
16
indianus. Devido à recente invasão, ainda não foram identificados inimigos naturais com
potencial para utilização no manejo da praga. Uma alternativa promissora de controle
biológico da mosca-do-figo, com maior rapidez de desenvolvimento, segurança e efetividade,
poderá ser a utilização de fungos entomopatogênicos (ONOFRE et al., 2002).
A eficiência e especificidade da utilização de fungos entomopatogênicos, como
Metarhizium anisopliae, M. flavoviride e Beauveria bassiana, foi demonstrada para o controle
de dípteros como da mosca Chrysomya albiceps, causadora da miíase de animais e humanos
(FEIJÓ, 2004; FEIJÓ et al., 2004; MARCIEL et al), da mosca doméstica (STEINKRAUS et
al., 1990), da mosca africana tsé-tsé (KAAYA & OKECH, 1990; KAAYA e MUNYINYI,
1995), dos mosquitos flebotomínios transmissores de leishmaniose (REITHINGER et al.,
1997) e da mosca-branca (ZAKI, 1998; OROZCO-SANTOS et al., 2000; BROWNBRIDGE
et al., 2001).
A busca de métodos eficientes de monitoramento é prioridade para o manejo adequado
dessa mosca, tornando-se base para as ações de prevenção e controle. Diferentes métodos de
genética molecular, como a técnica de PCR (GARDES & BRUNS, 1996), que é bastante
utilizada para caracterização de linhagens de leveduras (BARROS-LOPES et al., 1996;
MELO, 2000; PATARO et al., 2000; GUERRA et al., 2001), tem sido utilizada com sucesso
para a identificação e monitoramento de fungos filamentosos (HENRION et al., 1994;
HEGEDUS & KHACHATOURIANS, 1995; BUSCOT et al., 1996; GUIMARÃES & SÁ,
2000; BRASILEIRO et al., 2004; DESETÈFANO et al., 2004).
O presente trabalho teve por objetivo testar a susceptibilidade da mosca do figo
(Zaprionus indianus), aos fungos entomopatogênicos M. anisopliae var. acridum e M.
anisopliae var. anisopliae, como também testar o emprego da técnica de PCR com primers
específicos para genes de DNA ribossômico, antes e após a passagem pelo inseto, visando
monitorar e desenvolver um método de controle biológico eficaz e seguro, para evitar
prejuízos à fruticultura regional e nacional.
17
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1. Aspectos taxonômicos e biológicos de Metarhizium.
Metarhizium anisopliae (Metsch) Sorokin
Espécies de Metarhizium são os fungos mais utilizados nos dias atuais em controle
biológico. Metarhizium anisopliae, foi descrita pela primeira vez 1879, em isolados de larvas
do inseto Anisopliae austriaca, pelo zoologista e patologista Metschnikoff, recebendo o nome
de Entomophthora anisopliae (KENDRICK, 1971; LUNA-ALVES LIMA, 1985; ALVES,
1998; XAVIER-SANTOS et al., 1999a). Nos anos que seguiram a este relato, esta espécie foi
alvo de várias denominações, no entanto, em 1883, Sorokin conferiu ao isolado de
Metschnikoff a denominação de M. anisopliae, e esta passou a ser aceita e utilizada até os
dias atuais. (LUNA-ALVES LIMA, 1989).
Em estudos baseados no trabalho de Johnston, que separa os conídios de M. anisopliae
em forma longa e curta, Tulloch (1976) admitiu para esta espécie duas variedades, as quais
foram separadas se acordo com o tamanho dos conídios, onde M. anisopliae (Mestch.)
Sorokin var. anisopliae apresenta conídios que variam de 3,5 – 9,0µm. e M. anisopliae
(Mestch.) Sorokin var. major Johnston apresenta conídios que variam de 9,0-18,0µm. Por
outro lado, Gams & Rozsypal (1973) descreveram pela primeira vez, a espécie de M.
flavoviride isolada de larvas de pupas de curculionídeos e dos solos cultivados na Europa. Os
autores empregaram características morfológicas e mensuração de conídios e tipo de fiálide
para estabelecer o táxon e diferenciá-lo de M. anisopliae. Entretanto Rombach et al (1986)
estenderam este conceito e propuseram uma nova variedade. A partir de então a taxonomia de
M. flavoviride passou a ter duas variedades: M. flavoviride Gams & Rozsypal var. flavoviride
e M. flavoviride Gams & Rozsypal var. minus Rombach Humber & Roberts. Driver et al.
(2000), baseado nos padrões de RAPD, na seqüência ITS do DNA ribossômico, analisaram
123 isolados de espécies identificadas como M. anisopliae, M. flavoviride ou M. album. Os
resultados confirmaram a predominância de M. anisopliae, embora tenham sido reconhecidos
quatro agrupamentos: M.anisopliae var. anisopliae, M.anisopliae var. majus e dois isolados
descritos como variedades novas M. anisopliae var. lepiditum e M. anisopliae var. acridum,
um outro grupo representado por duas variedades, M. flavoviride var. novazealandicum e M.
flavoviride var. pemphigum. Após a publicação desse estudo as linhagens brasileiras isoladas
de gafanhoto tidas com M. flavoviride passaram a ser denominadas de M. anisaopliae var.
acridum.
18
Estas variedades foram aceitas pela comunidade científica (GILLESPIE et al., 2000;
MAGALHÃES et al., 2000; ARTHURS & THOMAS, 2001, BLANFORD & THOMAS,
2001; OUEDRAGO et al., 2003; ALBURQUEQUE et al., 2005; RANGEL et al., 2005).
O ciclo parassexual é uma alternativa de sexo encontrado em alguns Anamorfos dos
Ascomycotina e Basidiomycotina. Messias & Azevedo (1980), descreveram pela primeira vez
o ciclo parassexual de M. anisopliae a partir de linhagens mutantes homocarióticas haplóidies,
e obtiveram linhagens diplóides que foram confirmadas pela haploidização, utilizando a
substância Cloroneb. As estruturas reprodutivas em M. anisopliae são representadas por
conidióforos e conídios. Os conidióforos são estruturas especializadas, hialinas, simples ou
ramificadas que dão origem as fiálides, também hialinas, onde ocorre a mitose. Em M.
anisopliae, a formação dessas estruturas segue o modelo fiálidico proposto por Hughes
(1953), que culmina com produção de conídios de coloração esverdeada Hammil (1972), de
inserção basipetal (LUNA-ALVES LIMA, 1985). A mesma autora também demonstrou que
os conídios de M. anisopliae apresentam variação quanto à forma, à disseminação e ao
número de núcleos. Através de estudos citológicos, em oito linhagens selvagens, nove
mutantes e dez diplóides, encontrou grande variação nos conídios onde observou formas
cilíndricas, globosas, ovóides, elípticas, triangulares, alantoides e hialodídimas. Esta última
foi descrita pela primeira vez na literatura.
Entre os fungos utilizados no controle biológico de pragas ou com potencial para
tanto, M. anisopliae é o que mais tem merecido atenção dos pesquisadores por isso maior
número de informação foi acumulada a seu respeito conforme constataram MONTEIRO et al.
(1998). Esses autores citam ainda, que o fungo apresenta estrutura reprodutiva semelhante a
um esporodóquio na descrição de outros autores. Contudo, essa forma semelhante ao
esporodóquio, é na verdade a justaposição dos conidióforos que se entrelaçam frouxamente,
devido às grandes ramificações das estruturas hifais, mas os conidióforos continuam
individualizados (LUNA-ALVES LIMA, 1985; XAVIER-SANTOS, 1999b; KUKLINSKY-
SOBRAL et al., 2004).
O ciclo biológico de M. anisopliae se inicia coma a germinação dos conídios. Estes,
em condições adequadas emitem um tubo germinativo que após diferenciação hifal, forma o
micélio; neste, a medida que o fungo se desenvolve, surgem em parte determinada, os
conidióforos. Entre o terceiro e quinto dia de crescimento os conídios se apresentam de cor
branca, tornado-se esverdeados com o amadurecimento da colônia (RIBEIRO et al., 1992).
Na fase parasitária, o fungo desenvolve estruturas denominadas apressórios (FERRON, 1978),
19
estrutura que facilita a penetração do fungo no hospedeiro, através de processos mecânicos e
enzimáticos.
Os apressórios penetram no inseto, diferenciam-se em estrutura leveduriforme as quais
secretam toxina que culmina com a morte do inseto. As hifas se exteriorizam formam os
conidióforos e conídios, estes são dispersos e o ciclo se reinicia (ZACHARUK, 1971; LUNA-
ALVES LIMA & TIGANO, 1989).
Ribeiro et al. (1992) através de estudos com a linhagem de M. anisopliae (PL43)
isolada de Mahanarva posticata em Pernambuco, verificaram que o micélio formado por hifas
de parede delgada, septada, hialina, crescido em meio completo, apresenta variação da
condição nuclear confirmando os achados de Luna-Alves Lima (1985). Os seguimentos
uninucleados e binucleados foram mais acentuados em relação aos multinucleados.
No Brasil, M. anisopliae var. anisopliae assume grande importância, por ter sido
empregado no primeiro projeto de sucesso no controle biológico, com aplicação no campo,
para o controle da cigarrinha da cana-de-açúcar Mahanarva posticata, sendo um dos
programas mais bem sucedidos no mundo (FERRON, 1981; ALVES, 1998; FARIA &
MAGALHÃES, 2001).
Lima (2005) fez um estudo de caracterização molecular de espécies de Metarhizium e
patogenicidade sobre a broca da cana-de-açucar Diatraea saccharalis. A autora analisou 15
linhagens de Metarhizium isoladas de diferentes regiões e hospedeiros quanto as
características genéticas e 7 linhagens quanto a patogenicidade e observou que não houve
correlação entre grupos e regiões geográficas. Das sete linhagens analisadas no teste de
patogenicidade, a 4415, a 4400 e a 4897 causaram maior percentual de mortalidade das larvas.
Também não houve correlação entre os agrupamentos gerados pelas técnicas moleculares e o
percentual de mortalidade de larvas de D. saccharalis
20
2.2 Utilização de Metarhizium spp. para o biocontrole de insetos-praga
O uso indiscriminado de agrotóxicos tem provocado prejuízo à agricultura, ao longo
dos anos e o controle biológico tem sido empregado como uma alternativa para esse problema
(ALVES, 1998; AZEVEDO & WOLFF, 2000). Neste contexto, o controle biológico, tem
despertado o interesse dos pesquisadores, pois se tem mostrado eficiente, econômico e
duradouro, ausência de resíduos tóxicos, inocuidade aos homens e aos animais, além de não
apresentar efeitos negativos, como a perda da eficiência e a deterioração do meio ambiente,
causado pelos produtos químicos utilizados no controle de populações em desequilíbrio e que
terminam por comprometer os insetos que não são alvos (MAGALHÃES et al., 2000).
O interesse pelo uso de fungos para o controle de pragas da agricultura tem aumentado
nos últimos anos, à medida que foram sendo evidenciados os problemas advindos da
utilização dos inseticidas químicos. Alguns dos gêneros de fungos entomopatogênicos atuam
no controle microbiano incidindo sobre pragas, reduzindo a população destas, que são de
importância econômica para a agricultura. A variedade natural desses fungos é uma das suas
principais vantagens neste controle, onde, através de técnicas laboratoriais aprimoradas torna-
se possível a sua separação com características adequadas para serem utilizados como
inseticidas biológicos. (AZEVEDO, 1998; AZEVEDO, 2001).
Inúmeras espécies de insetos são controladas por Metatrhizium e Beauveria, dentre os
quais, destacam-se Diatraea saccharalis, Plutella xylostella (traça das crucíferas), Ostrinia
nubilalis e Cydia pomonella (traça das frutas) (HUNGHES et al., 2004). M. anisopliae
coloniza uma ampla faixa de hospedeiros, por isso é uma das espécies mais utilizadas no
controle microbiano de insetos. Esta espécie é bastante utilizada no controle de pragas que
causam prejuízos às culturas de interesse agrícola em todo o mundo.
No continente africano, Maniania et al. (1994) realizaram experimentos no campo, no
Quênia, para avaliar o potencial da espécie M. anisopliae no controle biológico de Chilo
partellus, na cultura do milho e observaram que embora o fungo não tenha sido patogênico
em massa de ovos, houve uma redução significativa no número de larvas e no nível de danos
às folhas. Por outro lado no continente australiano, Milner et al. (1996) avaliaram 12 isolados
de M. anisopliae contra o grilo Teleogryllus commodus, uma peste dos pastos, e selecionaram
a linhagem FI1099 para uso no campo que induziu uma mortalidade de 40 a 60% na dosagem
de 2 a 4 x 10
13
conídios/ha 21 dias após a inoculação.
21
Na Europa, Chandler (1997) estudou a patogênicidade de 25 linhagens de M.
anisopliae contra Pemphigus bursarius, uma peste da alface, do Reino Unido e observaram
que somente uma linhagem foi capaz de controlar os afídeos, apresentando uma CL
50
de 2,45
x 10
6
conídios/mL
-1
, 10 dias após a inoculação. Já na Espanha, Herrera et al. (1999)
avaliaram 10 isolados de M. anisopliae contra ninfas de Bemisia tabaci (mosca-branca), uma
das principais pragas na cultura mundial podendo ocasionar 40 a 70% de perdas na produção.
Os resultados alcançados mostraram que cinco dos 10 isolados testados foram patogênicos
para as ninfas.
Entretanto Kanga et al. (2003) no intuito de diminuir as perdas econômicas causadas
nas indústrias, avaliaram o potencial de M. anisopliae contra o ácaro Varroa destructor. Os
pesquisadores relataram que o tempo necessário para a morte de 90% dos adultos em
laboratório foi de 4,16 dias quando utilizado uma concentração de 1,1 x 10
3
conídios/mL
-2
e a
CL
90
foi de 7,13x10
3
conídios/mL
-2
quando aplicados em colméia. M. anisopliae também teve
sua ação comprovada no continente asiático, quando Chen et al. (2000) avaliaram esta espécie
no campo, para o controle de Lissorhoptrus oryzophilus, uma praga que causa sérias perdas
econômicas na cultura do arroz, na China. Os autores constataram, na fase de pré-oviposição,
uma redução de 92,5% na população de adulto de L. oryzophilus, 13 dias pós-inoculação,
quando utilizado uma concentração de 10
14
conídios/ha.
M. anisopliae é o agente de controle biológico mais importante nas condições
climáticas brasileiras, devido à variabilidade genética que resulta no surgimento de muitas
linhagens com diferentes níveis de virulência, especificidade, produção de conídios,
resistência à ultra-violeta e patogenicidade a vários insetos. No Brasil vêm sendo utilizado
contra inseto da ordem Homoptera, da família Cercopideae, conhecidos como cigarrinhas da
cana-de-açúcar (Mahanarva posticata e M. fimbriolata) e das pastagens (Zulia entreriana e
Deois flavopicta) (ALVES, 1998; MENDONÇA, 2005).
Magalhães et al. (2000) verificaram em estudos sobre a esporulação de M. anisopliae
var. acridum e Beauveria bassiana em Rhamanatocerus schistocercoides (gafanhoto) em
ambientes secos e úmidos e inoculados a 30
0
e 25
0
C respectivamente, que ambas espécies
foram patogênicas ao R. schistocercoides, sendo que M. anisopliae var. acridum produziu
mais conídios internamente do que B. bassiana a 53% e 75% de umidade relativa, não
havendo esporulação externamente nessas mesmas unidades. Entretanto M. anisopliae var
acridum mostrou-se melhor, produzindo mais conídios do que B. bassiana em 100% de
umidade relativa. No mesmo sentido de obter informação sobre o biocontrole de R.
schistocercoides, Faria & Magalhães (2001) demonstraram o uso de M. anisopliae var.
22
acridum como biorregulador de populações R. schistocercoide, no Brasil. Esse fungo, em
condições de campo, apresenta uma taxa de redução populacional de bandos de ninfas,
superior a 80%. A mesma variedade fúngica vem sendo tratada como micoinseticida no
combate ao gafanhoto Stiphra robusta que ataca plantações de caju.
Onofre et al. (2001) avaliaram a patogenicidade in vitro de quatro linhagens de M.
anisopliae var. anisopliae e M. flavoviride var. flavoviride em Boophilus microplus e
concluíram que as linhagens são efetivas como agentes no controle biológico de B. microplus,
com M. flavoviride var. flavoviride a mais efetiva. Os autores sugeriram que a patogenicidade
desta linhagem e o desenvolvimento de um método de aplicação deste fungo, para o controle
de carrapato pode resultar no melhoramento da produtividade e na redução da poluição
ambiental através do uso em menor quantidade de inseticidas químicos. No ano seguinte,
Onofre et al. (2002) avaliaram a patogenicidade de duas linhagens de M. anisopliae var.
anisopliae e duas linhagens de M. flavoviride var. flavoviride em larvas ingurgitadas de B.
microplus. Os resultados demonstraram que M. anisopliae var. anisopliae é menos
patogênicos que M. flavoviride var. flavoviride. Entretanto, ambos as espécies controlaram
este parasita com eficiência. Os mesmos autores ressaltaram também a importância de espécie
M. anisopliae para o controle de importantes pragas como: Anthonomus grandis, bicudo-do
algodoeiro e espécies de formigas do gênero Atta. Além disso, a comprovada patogenicidade
de M. anisopliae contra insetos de interesse médico como: Triatoma infestan, Glossina
morsitans morsitans (mosca-tsé-tsé) e os mosquitos Aedes aegypti e Anopheles stephens.
Athayde (2002) e Athayde et al. (2001) realizaram testes de laboratórios com M.
anisopliae, M. flavoviride e B. bassiana em B. microplus. Os resultados obtidos foram
satisfatórios, mostrando a eficiência destes fungos e com base nos resultados alcançados por
M. flavoviride, sugeriram que este seja explorado como novo agente a ser investigado contra
essa praga bovina. Por outro lado Nascimento (2003) avaliou em condições de laboratório, a
ação de M. anisopliae var. anisopliae, M. anisolpiae var. acridum e B. bassiana contra
Rhipicephalus sanguineus. Os resultados comprovaram a patogenicidade desses fungos,
sugerindo assim, a utilização dos mesmos como possíveis controladores de R. sanguineus, o
carrapato do cão.
Recentemente, Feijó (2004) verificou através de testes laboratoriais que B. bassiana,
M. anisopliae var. anisolpiae e M. flavoviride var. flavoviride apresentaram ação contra ovos,
larvas e adultos de Chrysomya albiceps, sugerindo assim a possibilidade do emprego desses
fungos no controle dessa mosca, que, acarreta prejuízos consideráveis aos rebanhos bovinos,
causando infecções denominadas “bicheira”. No mesmo ano, Ferreira (2004) através de
23
experimentos, in vitro, com linhagens de M. anisopliae var. acridum e M. flavoviride var.
flavoviride, mostrou que todas as linhagens utilizadas apresentaram atividades quitinolítica
em substrato com cutícula de carrapatos e exoesqueleto de camarão, sendo que M. flavoviride
var. flavoviride apresentou maior nível de atividade quitinolítica. Os resultados obtidos
sugeriram o desenvolvimento de estudo utilizando diferentes exoesqueletos como uma
maneira de se detectar os níveis da atividade quitinolítica e a produção de quitinase com vista
à seleção das linhagens fúngicas mais patogênicas às pragas de interesse veterinário e
agroindustrial.
2.3 Zaprionus indianus
A família Drosophilidae apresenta distribuição geográfica mundial e é composta por
cerca de 3.000 espécies de moscas de pequeno porte, com 2,5-3,0 mm de comprimento, de
olhos vermelhos brilhantes e asas pequenas hialinas, sendo poucas espécies com manchas ou
veias enfumaçadas, agrupadas em 62 gêneros, comumente chamadas de moscas-das-frutas
(WHEELER, 1981; SANTOS et al., 2003). Seu corpo pode variar possuindo de cores claras a
escuras, ou até mesmo apresentando ornamentações como as espécies do gênero Zaprionus e
os drosophilideos havaianos (GRIMALDI, 1990). A ordem Diptera está entre as mais
largamente estudadas na classe Insecta e de maior interesse nas áreas de genética,
desenvolvimento e evolução (REIS & EBERT, 1996; FORTINI & BONINI, 2000).
O Gênero Zaprionus está composto atualmente por dois sub-gêneros, Anaprionus e
Zaprionus sensu strito e um total de 56 espécies (TSACAS & CHASSAGNARD, 1990). É
caracterizado por ter cerdas do mesonotum arrajados em arcos distintos e faixas longitudinais
branco-prateadas na região dorsal da cabeça e torax. (COQUILETT, 1901).
A espécie Z. indianus é a mais comum do seu gênero no continente africano.
Provavelmente pelo desconhecimento da ocorrência da espécie em toda região Afrotropical,
Gupta (1970) propôs o epiteto indianus em alusão à procedência dos exemplares-tipo,
coletados na Índia. De acordo com Tsacas (1985), está espécie também encontra-se referida
na literatura sobre os seguintes sinônimos: Z. intermis , Z. paravittiger e Z. collarti, sendo
que o último foi proposto em substituição ao primeiro, publicado em 1938, pois foi constatado
que o epíteto inermis estava pré-ocupado no gênero Zaprionus pelo homônimo Z. inermis. Por
outro lado, nas ultimas décadas, ela tem sido identificada incorretamente por vários autores
24
como sendo Z. vittiger Coquillett (1901), como a qual pode ser facilmente confundida se
analisada exclusivamente com relação à morfologia externa (TSACAS 1985, 1990).
Z. indianus parece ter sido a única do Gênero a escapar da região de origem.
Atualmente, ela esta se espalhando rapidamente por áreas tropicais sendo encontradas na
Índia, Arábia Saudita, nas ilhas dos oceanos Índicos, Atlânticos e recentemente invadiu a
região Paleártica e o Brasil (CHASSAGNARD & KRRAIJEVELD, 1991; VILELA, 1999;
TIDON et al., 2003; SANTOS et al., 2003). Trata-se de uma espécie que apresenta
característicamente faixas brancas estreitas e demarcadas por linhas negras paralelas que se
estendem da cabeça até o final do escutelo e mesonotum (GUPTA, 1970). São moscas de
abdômen claro, com fêmures das patas anteriores possuindo espinhos, complexos, longos com
a segunda ponta pequena, acoplada à base (Figura 1). Numa análise mais minuciosa, observa-
se que a borda da genitália masculina tem a extremidade não denteada e acoplada ao corpo do
distifalus (TSACAS & CHASSAGNADR, 1990). É uma espécie polífaga, com capacidade de
se desenvolver em diversos frutos de diferentes origens geográficas, facilitando assim sua
expansão e como a maioria dos drosofilídeos alimentam-se fundamentalmente de bactérias e
leveduras que participam da fermentação de substratos ricos em carboidratos, especialmente
frutos em decomposição. Além disto, o ciclo reprodutivo relativamente rápido em ambientes
de temperatura elevada e o aumento do comércio internacional de frutas são apontados como
prováveis fatores para o sucesso da invasão e dispersão da espécie pelo mundo (VILELA et
al., 2001).
25
Figura 1. Zaprionus indianus. (A e B) Faixas brancas demarcadas por linhas negras paralelas (seta);
(C)Espinhos complexos nos fêmures das patas anteriores (seta). Fonte: Campos (2005)
O primeiro registro publicado sobre a ocorrência de Z. indianus, no continente
americano data de 1999, pelo Prof. Dr. Carlos R. Vilela do Instituto de Biociências da
Universidade de São Paulo, faz referência a exemplares observados em frutos de caqui, no
município de Santa Isabel, (SP) (VILELA, 1999). Nesta mesma época, na região de Valinos
(SP), durante a safra de figo (Ficus carica) da variedade roxo – valinhos, foi constatada a
presença de uma grande quantidade de Z. indianus se alimentando e fazendo postura no
ostíolo do fruto em início de maturação. Uma grande quantidade de larvas também foi
observada dentro de alguns frutos, tornando-os impróprios para consumo humano, assumindo
um comportamento de praga incomum entre drosofilídeos (VILELA et al., 2001). (Figura 2).
Além da pequena massa de ovos colocados no ostíolo, os adultos depositam bactérias e
leveduras que proporcionam a fonte de alimentos para as larvas e desencadeiam o inicio do
processo de decomposição prematuro que se propaga para o interior dos frutos, tornando-os
impróprios para consumo (STEIN et al.; 1999; VILELA et al., 2001). Esse processo
fermentativo associados com a infecção de frutos por estas moscas, foi atribuído à ação de
uma única levedura em particular, Candida tropicalis, indicando uma relação muito estreita
com a espécie introduzida Z. indianus (GOMES et al., 2005).
26
Figura 2. (A) Fruto de figo sadio; (B) Larvas de Zaprionus indianus no ostíolo do fruto (seta); (C)
Dano em figo causado por Zaprionus indiauns; (D) Larvas dentro do fruto (seta). Fonte:
Stein et al. (1999)
A mosca do figo já foi encontrada em 74 espécies botânicas de 31 famílias. Entre estas
plantas, inúmeras são nativas do continente americano (abacate, abacaxi, cajá-mirim, goiba,
mamão) ou foram aqui introduzidas (banana, carambola, cítricos, manga, nêspera, figo)
(VILELA et al., 2001). Esta possibilidade é potencialmente mais danosa em regiões de
fruticultura como o Vale do Rio São Francisco (Estados de Pernambuco e Bahia), onde estão
estabelecidos vários agronegócios voltados para fruticultura de exportação (SANTOS et al.;
2003). O estabelecimento desse inseto como praga da fruticultura, poderá implicar em
prejuízos sócio-econômicos e ambientais, em decorrência das possíveis medidas ao seu
controle. O eventual emprego de controle químico poderá resultar em um aumento
significante do custo da produção e inviabilizar a exportação das frutas, uma vez em que
vários países, especialmente os europeus, impõem rigorosa restrição de frutas com resíduos de
determinados produtos químicos. Face às características topográficas da região, esse método
de controle também poderá causar danos imprevisíveis aos ecossistemas e à saúde humana,
uma vez que os agricultores residem nas propriedades e estas estão localizadas contiguamente
às áreas urbanas (VILELA et al., 2001).
27
2.4 Marcadores Moleculares
2.4.1. PCR (Polimerase Chain Reaction)
O desenvolvimento do processo de amplificação via PCR, causou grande impacto nos
estudos genéticos, dando origem a outras classes de maçadores moleculares que têm
revolucionado a genética molecular, pois funciona como uma ferramenta relativamente
simples, rápida e segura para a identificação e caracterização de diversos organismos e
contribue para o entendimento de vários processos biológicos, com aplicação na taxonomia e
filogenia principalmente em fungos (FERREIRA & GRATTAPAGLIA, 1998; LEAL-
BERTIOLI, 1998; INGLIS, 1995; FUNGARO, 2000).
A reação em cadeia da polimerase é a amplificação enzimática de uma seqüência
específica de DNA, visando à produção de milhões de cópias desta seqüência. A PCR explora
a capacidade de duplicação do DNA. Uma fita simples de DNA é usada como molde para a
síntese de novas cadeias complementares sob a ação da enzima polimerase do DNA, capaz de
adicionar os nucleotídios presentes na reação, segundo a fita molde. A polimerase do DNA
requer, entretanto, um “ponto de início” ligado à fita molde que servirá de apoio para que os
nucleotídeos subseqüentes sejam adicionados. Esse ponto de início da síntese é fornecido por
um oligonucleotídio que se hibridiza (se anela) à fita molde simples, o qual é denominado de
primer. Ambas as fitas simples iniciais servem de fita molde para a síntese, desde que se
forneça primers específicos a cada uma delas. Dessa forma, a região do DNA genômico a ser
sintetizado é definida pelo primers, que se anelam especificamente às suas seqüências
complementares na fita molde, delimitando o fragmento de DNA que se deseja amplificar. Na
pratica o que se faz é adicionar em um microtubo uma quantidade muito pequena de DNA
genômico, mais os quatro nucleotídios que compõem a cadeia de DNA (dCTP, dATP, dGTP e
dTTP), a Taq polimerase, os oligonucleotídios e a solução tampão, a qual fornecerá as
condições de pH e salinidade para que a síntese se processe. O microtubo é submetido a uma
alta temperatura (geralmente 94
o
C por 5 minutos) para provocar o rompimento das pontes de
hidrogênio entre as cadeias de DNA, causando a desnaturação da molécula. A temperatura é
rebaixada (30 a 65
o
C por 30 segundos) quando, então, os primers têm a oportunidade de se
anelarem às suas seqüências complementares do DNA genômico.
28
Finalmente, a temperatura é colocada em torno de 72
o
C (por 2 a 5 minutos),
temperatura ideal para que a Taq polimerase utilizada na reação atue, dirigido a síntese de
novas cadeias. Repetindo-se esses três tipos de passos, desnaturação, anelamento e síntese,
por cerca de 30 ciclos, produziremos mais de 250 milhões de cópias de uma determinada
seqüência de DNA em fita dupla, uma vez que o número de cópias cresce de modo
exponencial a cada ciclo. Os produtos de amplificação são separados por eletroforese em gel
de agarose (FARAH, 2000). Este processe têm permitido avanços significativos em áreas
aplicadas, dentre as quais a identificação de genótipos, o diagnóstico de doenças,
melhoramento genético de plantas, animais e microrganismos (GARDES, 1996; FUNGARO
& VIEIRA, 1998; DESTÉFANO et al., 2004).
2.4.2 Região ITS do DNA ribossomal.
O DNA que codifica para o RNA ribossomal apresenta-se como um agregado gênico,
compostos pelos genes 18S, 5,8S e 28S. Estes genes são separados por regiões denominadas
ITS1 e ITS2 (Figura 3), as quais são transcritas e processadas para dar origem ao RNA
ribossômico maduro (WHITE et al., 1990). O uso de seqüências de rDNA apresenta
vantagens de serem estáveis e ocorrem em múltiplas cópias no genoma, o que as torna
facilmente amplificáveis via PCR. Além disso, algumas regiões altamente conservadas e
outras variáveis têm permitido a análise de diferentes níveis taxonômicos, incluindo espécies
relacionadas (EDEL et al., 1996). Todavia a região 18S é a mais conservada e por isso é
utilizada apenas na comparação de organismos distantemente relacionados. A porção 28S é a
mais variável, sendo apropriada para a comparação para a comparação de diferentes gêneros
ou, em alguns casos de diferentes espécies. As regiões ITS evoluem rapidamente sendo
apropriadas para discriminar espécies relacionadas ou até mesmo variedades de uma mesma
espécie. O fato das regiões serem flanqueadas por segmentos conservados, serem
relativamente curtas 500 a 800pb e aparecem em grande número de cópias no genoma permite
que sejam amplificadas e seqüenciadas com facilidade (FUNGARO, 2000; GUIMARÃES &
SÁ, 2002).
29
Segundo Leal-Bertioli (1998) as informações de regiões conservadas permitem a
construção de iniciadores para sua amplificação a partir de genomas diversos. As analises
podem ser obtidas da presença ou ausência de produtos, clivagem dos produtos de PCR,
gerando RFLPs, assim como o sequenciamento direto dos mesmos. Os exemplos mais
comuns para estes são a amplificação de genes de rRNA, mtRNA, tRNA e microssatélites.
Paul (2001) ressalta que o DNA ribossomal nuclear é constituído por regiões transcritas e não
transcritas. ITS1 e ITS2 são regiões varáveis e podem se amplificadas pela técnica PCR
usando iniciadores universais ITS5 e ITS4. O mesmo autor utilizou esta técnica para
comparar Pythium longandrum sp nov. com espécies correlatadas. As técnicas de
amplificação e posterior sequenciamento do gene 5.8S com regiões intergênicas (ITS1 e
ITS2) também foram aplicadas para Metarhizium. A analise filogenética dos dados do
sequenciamento mostrou que M. anisopliae constitui um grupo monofiletico, e M. flavoviride
e M. album representam duas linhagens evolucionárias separadas (CURRAN et al., 1994;
SOSA-GÓMEZ et al., 1998).
Uma ferramenta bastante apropriada para análises de DNA, é a investigação sobre as
variações no tamanho dos fragmentos gerados de distintas amostras de DNA clivadas com
enzimas de restrição, pela comparação entre o número e tamanho dos fragmentos produzidos
pela digestão do DNA com ou sem uma posterior etapa de hibridização com sondas marcadas
(MARQUES et al., 2002). As enzimas de restrição cortam o DNA em sítios específicos, onde
cada enzima reconhece uma seqüência característica de nucleotídios. A alteração em ao
menos um nucleotídio pode criar ou destruir um sítio de restrição. Por isso, quando existe
variação ou polimorfismo entre indivíduos na posição dos sítios de corte e no comprimento de
DNA entre eles, ocorrem fragmentos de restrição de diferentes tamanhos (SANTOS, 2001). A
combinação de amplificação da região ITS e a restrição dos produtos de amplificação (RFLP-
ITS) pode ser útil para identificar a maioria dos fungos ao nível de espécie ou grupos de
espécies. Este método é rápido, simples, relativamente barato e facilmente adaptável para
novos grupos de fungos (GARDES & BRUNS, 1996).
Análises de restrição de ITS e 5.8 de ITS têm auxiliado na taxonomia de espécies
fúngicas. (NEUVÈ et al., 1994; LEAL, 1996) observaram nas espécies Beauveria brongniartii
e M. anisopliae alta variabilidade intraespecífica, sendo esta região útil para caracterização de
isolados destas espécies. Pipe et al. (1995) analisaram RFLPs de genes rRNA em Metarhizium
30
observando a homogeneicidade dos isolados brasileiros que foram obtidos de dercopídeos,
distinguindo-se dos isolados de M. flavoviride, embora tenham sido obtidos do mesmo
hospedeiro, nas Filipinas. Driver et al. (2000) baseado nas seqüências do gene ribossomal
28S, analisaram 123 linhagens de Meatarhizium, sugerindo duas novas variedades para as
espécies M. anisopliae e M. flavoviride.
Figura 3. Estrutura do agregado gênico com representação das regiões ITS1, ITS2 e a subunidade
5.8S do rDNA com iniciadores ITS5 eITS4. Adaptado de Fungaro (2000).
31
2.4.3 Microssatélite
As regiões de microssatélites são também conhecidas como seqüências simples
repetidas (SSR- Simple Semquence Repeats) e consistem de pequenas seqüências com 1 a 4
nucleotídios de comprimento que repetem em tamdem em um dado locos distribuídos ao
longo do genoma. Tais seqüências são mais freqüentes nos genomas dos eucarióticos,
distribuindo ao acaso e formam loci genéticos muito mais polimórficos do que os loci
hiperpemeáveis constituídos por minissatelites (FERREIRA & GRATTAPAGLIA, 1998). Os
motivos de microssatélites são pequenos, usualmente menores do que 10-pb (RICHARD et
al., 1999; GUY-FRANCK & PÂQUES, 2000).
Repetições de nucleotídios envolvendo as bases A ou T são muito mais freqüentes do
que repetições com as bases G ou C. Por outro lado, no caso dos dinucleotídeos, as seqüências
repetidas CA e CT são mais comuns do que as repetições CG. Embora os microsstélites
ocorram na maioria das vezes em posições extragênicas ou dentro de introns, seqüências deste
tipo também foram descritas em regiões codificantes dos genes (FARAH, 2000). Os métodos
que detectam o polimorfismo nos loci de seqüências repetidas simples geram um grande
número de alelos detectáveis oferecendo boa reprodutibilidade.
Estes marcadores têm revolucionado algumas áreas da genética, sendo bastante
utilizados para mapeamento genético e físico de genomas, para identificação e discriminação
de genótipos e estudos de genética de populações (GROPPE et al., 1995; FERREIRA &
GRATTAPAGLIA, 1998). Devido a sua alta mutabilidade os microssatélites possuem um
significante papel na evolução do genoma produzindo e mantendo a variação genética
quantitativa (KASHI et al., 1997). O alto grau de mutações altera os seus comprimentos e
consequentemente, estas mudanças resultam em polimorfismo entre indivíduos. Este alto grau
de polimorfismo que detecta permite uma discriminação precisa entre indivíduos
proximamente relacionados. Além de serem altamente polimórficos, os microssatélites usam
quantidades mínimas de DNA, equivalentes às usadas no RAPD. As condições de
amplificação e da reação são espécies-específicas e a variação na quantidade de produtos
amplificados pela PCR é resultado do número de unidades repetidas (BECERRA &
PAREDES, 2000).
Marcadores moleculares baseados em microssatélites podem ser obtidos para a
discriminação de Taxa, o que é chamado de “microsatelite fingerprinting”. Este método tem
32
sido testado em vários fungos, detectando polimorfismo inter e intraespecíficos, auxiliando
também nos estudos de melhoramento genético de plantas. A utilização da técnica tem
auxiliado a identificação e caracterização de fungos (LEAL-BERTIOLI, 1998; ENKERLI et
al., 2001; AVENOT et al., 2005; ENKERLI et al., 2005).
Os primers de microssatélites com motivos de (AT)n, (CA)n, (CT)n, (GT)n, (TG)n.
(ACA)n, (ACC)n, (ACG)n, (ACT)n, (AGC)n, (AGG)n, (AGT)n, (ATC)n, (GAC)n, (GTG)n,
(GACA)n, (GATA)n, (TGTC)n são usualmente utilizados para amplificação de regiões
repetidas. Esta ferramenta produz padrão de amplificação que revela o possível polimorfismo
de DNA na seqüência de nucleotídios entre os dois sítios de microssatelites no genoma de
fungos, gerando o que é denominado de perfil ISSR (Inter Simple Sequence Repeats).
2.4.4. Intron Splice Site Primer
Todos os cromossomos eucarióticos, incluindo o homem, um arquivo de DNA com a
mensagem para a síntese de uma cadeia polipepitídica, é geralmente, interrompido por certas
porções que não tem função codificante e, portanto, não aparecem representadas na proteína.
Tais porções não codificantes são referidas como introns, enquanto as regiões com a
informação codificada sãos exons (FARAH, 2000).
Os introns podem ser classificados em 4 classes gerais, intron do grupo I, intron do
grupo II, intron de mRNA nuclear e intron do tRNA nuclear baseadas no mecanismo de
splicing (CECH, 1990; SUGA et al., 2000). Os introns do Grupo I e do Gupo II são
classificados de acordo com suas organizações internas e têm uma capacidade intrínseca de
auto-remoção por montagem (BRASILEIRO 2003). Podem ser utilizados como marcadores
moleculares, podendo implementar informações valiosas para o estudo das relações
taxonômicas e dos estudos de diversidade intra e interespecifica, bem como, estudos de
heterogeneicidade com introns de genes que codificam proteínas, como β-tubulina (HAN et
al., 2002 ). Em estudo realizado com M. anisopliae var. anisopliae, foram identificados
introns do grupo I em espaços na região 28S do rDNA revelando a presença de 5 grupos
distintos desta estruturas em diferentes sítios de inserção (MAVRIDOU et al. 2000). Pires
(2002) utilizou o iniciador EI1 para investigar a diversidade genética de vinte linhagens de B.
bassiana, obtendo cinco grupos distintos.
33
3-MATERIAL E MÉTODOS
3.1. Local de Realização dos Experimentos
Departamento de Genética da Universidade Federal de Pernambuco e Laboratório de
Citologia e Genética do Departamento de Micologia da UFPE.
3.2. Linhagens fúngicas utilizadas
As linhagens de Metarhizium anisopliae var. acridum CG (291) e Metarhizium
anisopliae var. anisopliae (Bio2) foram fornecidas pela Micoteca (URM) do Departamento de
Micologia da Universidade Federal de Pernambuco. A linhagem de Fusarium soloni, utilizada
como out grup, foi coletada da mandioca (Manihot esculenta).
3.3. Linhagens da mosca utilizadas
A linhagem VV1 da mosca-do-figo Zaprionus indianus é criada rotineiramente no
Laboratório de Genética Animal da UFPE, não havendo dificuldade para obtenção de grande
número de larvas, conforme a metodologia de Campos (2003).
3.4. MEIOS DE CULTURA
3.4.1. Meio Batata-Destrose-Ágar (BDA)-OXOID
3.4.2 Meio Mínimo ( PONTECORVO et al. 1953)
NaNO
3
..............................................6,0g
KH
2
PO
4
............................................1,5g
KCl....................................................0,5g
MgSO
4
.7H
2
O....................................0,5g
FeSO
4
...............................................0,01g
ZnSO
4
...............................................0,01g
Glicose.............................................10g
Água destilada q.s.p. .......................1000mL
34
3.4.4. Meio para Drosophila
Água destilada................................................800mL
Banana madura amassada.................................50g
Farinha de milho............................................100g
Fermento fresco...............................................30g
Nipagin em 10 mL de ácool 95
o
......................4g
3.5. ANÁLISE DA VARIABILIDADE GENÉTICA DETECTADA POR
MARCADORES MOLECULARES
3.5.1. Obtenção de micélio para extração do DNA genômico
Os fungos obtidos de culturas monospóricas, foram cultivados em frascos Erlemmeyer
de 250mL contendo 100mL de Meio Mínimo líquido. Após inoculação foram mantidos sob
agitação de 250 giros a 28
0
C por 120 horas. Em seguida, o micélio foi coletado por filtração a
vácuo e lavado com água destilada autoclavada. Foi determinado o peso úmido para a
extração do DNA e estocado a -20
0
C.
3.5.2 Extração de DNA
A Extração do DNA foi realizada pela técnica de Raeder & Broda (1985). O Micélio
foi triturado em nitrogênio líquido até a completa pulverização e transferido para tubos de
microcentrífuga onde se adicionou 800µl de tampão de extração (Tris-HCl 200mM pH 8.0;
NaCl 250mM; ETDA 25mM; Dodecil Sulfato de Sódio 1%). Após homogeinização, os
microtubos de microcentrifuga foram incubados por 15 minutos a 65
0
C. Posteriormente,
foram realizadas as extrações com fenol saturado (Invitrogen Life Technologies). A fase
aquosa foi recuperada e transferida para um novo tubo de microcentrífuga e adicionou-se um
volume de clorofane (fenol e clorofil na propoção 1:1). Mas uma vez foi homogenizado e
centrifugado a 12000 giros por 15 minutos. A fase aquosa foi recuperada e transferida para
um novo tubo de microcentrífuga onde foi adicionado um volume de clorofil (clorofórmio e
álcool isoamilico na proporção 24:1), e novamente centrifgado. Recuperou-se mais uma vez a
fase aquosa, que foi colocada em outro tubo de microcentrifuga, adicionou-se o NaCl 0,3M e
dois volumes de etanol absoluto resfriado a -20
0
C, fase em que foi possível visualizar o DNA
precipitado. As amostras foram submetidas novamente a centrifugação a 12000 giros por 15
35
min, para promover a fixação de DNA de tubo de microcentrífuga. O sobrenadante foi
descartado e ao precipitado adicionou-se etanol 70% e centrifugou-se para lavagem do DNA.
O sobrenadante outra vez foi descartado e os tubos invertidos para secagem completa do
DNA. Este foi cuidadosamente ressuspendido em tampão TE pH 8,0 (Tris-Hcl 1M e ETDA
0,5) e guardado sob refrigeração a 4
0
C. (Figura 4)
Figura 4. Representação esquemática da técnica de extração de DNA para fungos filamentosos.
Fonte: Brasileiro (2003)
Figura 4. Representação esquemática da técnica de extração de DNA para fungos filamentosos.
Fonte: Brasileiro (2003)
36
3.5.3. Quantificação do DNA
A quantificação foi realizada por espectrofotometria utilizando-se comprimento de
onda de 260nm após diluição das amostras de 1:200. Para o cálculo da concentração de DNA
utilizou-se a relação 1 DO = 50µg/mL (SAMBROOK et al.1989).
3.5.4. Amplificação de DNA pela técnica de PCR
Após quantificação do DNA, as amostras foram diluídas em água milli-Q para uma
concentração final de 5ng/µl em um volume de 50µl. As amostras de DNA foram submetidas
a PCR utilizando primers descritos na Tabela 1 nas condições descritas abaixo em
termociclador MJ Research.
Tabela 1. Primers utilizados para amplificar o DNA das linhagens de Metarhizium
Iniciadores Seqüências Marcador
molecular
Referências
(GTG)
5
GTGGTGGTGGTGGTG
ISSR Liecfeft et al. (1993)
EI1
CTGGCTTGGTGTATGT
Intron Barros-Lopes et
al.(1996)
ITS4
TCCTCCGCTTATTGTATGC
rDNA Whit et al. (1990)
ITS5
GGAAGTAAAAGTCGTAACAA
rDNA Whit et al. (1990)
3.5.4.1 Região ITS do rDNA
As reações de amplificação foram feitas para um volume final de 25µL: do tampão
(Tris-HCl 20mM pH 8,4; KCl 50mM) Mg Cl
2
1,5 mM, dNTP 0,2 mM, 12,5 pmols do
indicador, Taq DNA polimerase 2U (Invitrogen Life Technologies) e 50ng do DNA,
conforme descrito por White et al. (1990). Para amplificação de região ITS foi utilizado o
termociclador (MJ Research) com a seguinte programação: desnaturação inicial 95
0
C por 4
minutos, 40 ciclos a 92
0
C por 1 minuto, 55
0
C por 1 minuto, 72
0
C por 2 minutos e extenção
final a 72
0
C por 5 minutos. Os produtos de amplificação dos locus ITS-5.8S-ITS2 do rDNA
foram separados por eletroforese em gel de agarose 1% a V/cm em tampão de corrida 1X
TBE (pH 8,0), utilizando-se marcador de peso molecular 100pb (Invitrogen Life
Technologies). Os produtos de amplificação foram corados em solução de Brometo de etídio
37
por 20 minutos em gel de agarose, observado em transluminador ultravioleta e fotografados
em sistema Polaroid.
3.5.4.2. Micossatélites (GTG)
5
As reações de amplificação foram feitas para volume final de 25µL nas seguintes
condições: tampão (Tris-HCl 20mM pH 8,4; KCl 50mM), MgCl
2
0,75Mm, dNTP 0,25µm,
0,25µm do primer, Taq DNA polimerase 0,1U ( Operon Tecnologies CA) e 50ng de DNA.
Para a amplificação foi utilizando o termociclador (Hibaid) com a seguinte programação:
um ciclo de desnaturação de cinco minutos a 94
o
C seguido de 40 ciclos de desnaturação a
94
o
C por 15 segundos, anelamento a 55
o
C por 90 segundos e extensão final a 72
o
C por seis
minutos. Os produtos de amplificação foram separados por eletroforese em gel de agarose
1,3%, a 3 V/cm
-1
em tampão de corrida 1X (pH 8,0), utilizando-se marcador de peso
molecular 1 Kb(Invetrogen Life Technologies). O gel após a migração eletroforética, foi
corado em solução de brometo de etídio por 20 minutos, observado em transluminador
utravioleta e fotografado em sistema Polaroid.
3.5.4.3 Intron Splice Site Primer
As reações de amplificação foram feitas para um volume final de 25µm nas seguintes
condições: tampão (Tris-HCl 20mM pH 8,4; KCL 50mM), MgCl
2
3mM, dNTP 0,25µm, 0,25
pmols do primer, Taq DNA polimerase 0,1U (Operon Tecnologies CA) e 50ng de DNA,
como descrito por Barros Lopes et al. (1996). Para a amplificação foi utilizando o
termociclador (Hibaid) com a seguinte programação: uma etapa de desnaturação 94
o
C por 3
minutos seguido de 40 ciclos de 1minuto a 94
o
C, 2 minutos a 45
o
C e 1 minuto e 30
segundos a 74
o
C, seguido por uma extensão final de 5 minutos a 74
o
C. Os produtos de
amplificação foram separados por eletroforese em gel de agarose 1,3%, a 3 V/cm
-1
em tampão
de corrida 1X TBE (pH 8,0), utilizando-se marcador de peso molecular 1Kb (Invetrogen Life
Technologies). O gel após a migração eletroforética, foi corado em solução de brometo de
etídio por 20 minutos observado em transluminador utravioleta e fotografado em sistema
polaroide.
38
3.6. ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os dados obtidos pelos três marcadores moleculares foram analisados pelo programa
NTSYS-PC (Numerical Taxonomy System of Multivariate Programs) (ROHLF, 1988). Esses
dados foram introduzidos na forma de variáveis binárias, ou seja, o número 1(um) indicando a
presença de bandas, e o número (zero), ausência. Desse modo, foi construída uma matriz de
similaridade, utilizando-se o coeficiente de Jaccard (JACCARD, 1908) calculado de acordo
com a seguinte fórmula:
J = A/(P-D) onde: A = Número de concordância positivas, ou seja, de variáveis
presentes;
P = Número total de variáveis;
D = Número de concordâncias negativas, ou seja, variáveis
ausentes.
A partir da construção da matriz de similaridade foi gerado um dendrograma pelo
método de agrupamento UPGMA (Umweighted Pair Group Method With Arithmetical
Averrage).
39
3.7. TESTE DE PATOGENICIDADE
3.7.1. Bioensaios
Os bioensaios foram elaborados para avaliar a patogenicidade de M. anisopliae var.
acridum e M. anisopliae var. anisopliae sobre as larvas de 3
o
. estágio da mosca-do-figo,
sendo realizados em sala climatizada a 28 + 1
0
C e umidade relativa a 60+ 10%.
3.7.2. Suspensões de esporos fúngicos
Sacos de prolipropileno contendo 100g de arroz parboilizado, previamente
autoclavado, foram inoculados, foi inoculado com 10mL da suspensão de 10
8
conídios/mL
dos fungos crescidos durante 12 dias em BDA. Após a inoculação, foi realizada a
homogeneização do arroz contido nos sacos e incubados em BOD a + 1
0
C, e após 12 dias,
foram mensuradas as concentrações utilizadas.
3.7.3. Quantificação do inóculo
A contagem de conídios foi feita com auxilio de câmara de Neübauer, segundo a
metodologia de Moraes & Alves (1986). Um grama de arroz, contendo o fungo, foi
homogeneizado em 100 mL de água destilada com “Tween” 80 (0,05% v/v). Após agitação, a
suspensão foi quantificada e ajustada para uma concentração de 10
8
conidios/mL. A partir
desta, foram feitas diluições sucessivas até se obter as concentrações 10
7
, 10
6
, 10
5
e 10
4
conídios/mL.
40
3.7.4. Infecção “in vitro” de larvas de Z. indianus
O bioensaio foi realizado com um grupo controle contendo água destilada com
“Tween” 80 (0,05% v/v) e cinco tratamentos nas concentrações de 10
8
, 10
7
, 10
6
, 10
5
, 10
4
conídios/ml. Para cada concentração testada, foram utilizadas cinco repetições com 10 larvas
e cada bioensaio foi repetido 3 vezes. As larvas foram colocadas em placas de Petri contendo
10mL de cada suspensão, durante 1 minuto. Em seguida as placas foram invertidas para o
escoamento do excesso da suspensão. As larvas foram mantidas em vidros com o meio para
Drosophila em BOD a + 25
o
C para observação diária do percentual de emergência das
moscas segundo a técnica de ALVES (1998), modificada.
3.7.5. Reisolamento do fungo a partir das larvas e pupas Z. indianus
Uma parcela das larvas e pupas mortas foi lavada em solução de hipoclorito de sódio a
4%, álcool a 70% e água deionizada, por 1 minuto em cada solução. Para cada lavagem, secos
em papel de filtro autoclavado e incubados em BOD a 28 + 1
0
C com 80% de umidade
relativa, onde foram observadas a conidiogenêse dos fungos. O fungo reisolado foi semeado
em BDA de conformidade com ALVES (1998), para obtenção de micélio para extração do
DNA genômico.
3.7.6. Análise Estatística
Para análise dos dados foi utilizada técnica de estatística inferencial e foram utilizados
os testes: t-Student com variâncias iguais ou desiguais e o teste de Mann-Whitney (para a
comparação entre as espécies fúngica em cada concentração com 8 dias de avaliação) e teste F
através da técnica ANOVA (para a comparação entre as concentrações em cada espécie
fúngica com 8 dias de avaliação) e os testes de comparações pareadas de Tukey com
variâncias diferentes para a comparação entre os pares de concentrações em cada espécie.
Os dados foram digitados e processados no programa SPSS (Statistical Package for the
Social Sciences) na versão 11. A margem de erro ou nível de signficância utilizada na decisão
dos testes estatísticos foi de 5%.
41
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1. Teste de Patogenicidade
As investigações sobre o percentual de emergência das moscas adultas a partir de
larvas de 3º estágio da mosca Z. indianus infectadas por M.anisopliae var. acridum e
M.anisopliae var. anisopliae demonstraram de um modo geral que as duas linhagens
apresentaram elevada patogenicidade, diferindo estatisticamente do grupo controle que não
foi observada mortalidade causada pelos fungos. O número médio de moscas que emergiram
8 dias pós inoculação está sumarizado na Tabela 2. Os resultados permitiram assegurar que o
número de emergência das moscas foi inversamente proporcional à concentração utilizada e
que o número de emergência variou de 9,40 e 1,33% nos tratamentos de menor concentração
(10
4
conídios/mL) e maior concentrações (10
8
conídios/mL), quando utilizado M. anisopliae
var. acridum. Para M. anisopliae var. anisopliae o número de emergência variou de 9,33 e
1,33% nas concentrações de 10
4
e 10
8
conídios/mL, não apresentando estatisticamente
diferenças significantes entre os dois fungos, com exceção da concentração de 10
5
onde o
número de emergência foi de 8,47 e 7,00% para M.anisopliae var. acridum e M. anisopliae
var. anisopliae. No entanto quando feitas comparações pareadas entre as concentrações
observou-se que em M. anisopliae var. acridum, com exceção das comparações do controle
(9,87%) com 10
4
(9,40%) e 10
5
(98,47)
e das concentrações de 10
7
(2,60%) com 10
8
(1,33%),
os demais pares mostraram diferenças significantes. Já em M. anisopliae var. anisopliae as
comparações que não demonstraram diferença significante foram entre o controle (9,87%) e a
concentração de 10
4
(9,33%) e entre as concentrações de 10
7
(1,67%)
com 10
8
(1,33%). Esse
modo de ação, também, foi reportado por Carswell et al. (1998) com M. anisopliae contra a
Musca domestica e da mosca da fruta Bactrocera tryoni obtendo 100% de mortalidade das
duas espécies após 9 dias pós-inoculação. Herrera et al. (1999) avaliaram em laboratório 10
isolados de M. anisopliae contra B. tabaci no campo e observaram bons resultados quando
utilizado a concentração de 10
7
conídios/mL de cada isolado aplicado nas ninfas de B. tabaci.
Freitas et al. (2001) avaliando também a patogenicidade de M. anisopliae contra a mosca B.
tabaci observaram 72,60% de mortalidade contra ninfas tratadas. Athayde et al. (2001), em
trabalhos conduzidos sobre estudo da biologia do carrapato bovino (Boophillus microplus)
sobre a ação de M. anisopliae, Metarhizium flavoviride (atualmente Metarhizium anisopliae
var. acridum) e Beauveria bassiana em concentrações de 10
4
, 10
5
, 10
6
, 10
7
, 10
8
conídios/mL e
encontrou resultados semelhantes aos obtidos neste trabalho.
42
Os dados obtidos sobre o ritimo de emergência de adultos a partir de larvas de 3º
estágio infectadas de Z. indiauns (Tabela 3) demonstraram que os sintomas de infecção foram
observados pela diminuição do ritimo de emergência quando comparado com o controle, visto
que no controle foi detectado (23,58%) de emergência no 3º dia, enquanto nas concentrações
utilizadas foi detectada emergência de (5,33%) na concentração de 10
4
conídios/mL para M.
anisopliae var. acridum e para M. anisopliae var. anisopliae foi detectada emergência de
(6,00%) e de (2,67%) nas concentrações de 10
4
e 10
5
conídios/mL respectivamente, a partir do
4º dia. Os resultados assemelham-se aos dados relatados por Feijó (2004) ao estudar a
biologia de Chrysomya. albiceps sobre a ação de M. anisopliae onde detectou emergência dos
adultos a partir do 4º dia. Os dados mostram que durante todo o período de avaliação o
percentual de moscas que emergiu variou de uma linhagem para outra, com diferenças entre
as concentrações utilizadas, porém, no 8º dia foi observado o mesmo percentual de
emergência (13,33%) na concentração 10
8
conídios/mL para as duas linhagens utilizadas.
Darwish & Zayed (2002) enfatizaram que os efeitos da infecção em larvas são demonstrados
em estágios posteriores, como a redução da emergência de adultos. Os resultados permitiram
asseguram também, que 10
8
conídios/mL apresentou o menor índice de emergência de moscas
tanto para M.anisopliae var. acridum quanto para M. anisopliae var. anisopliae. Figueiredo et
al. (2002) obtiveram resultados semelhantes ao utilizarem a concentração 10
8
conídios/mL de
M. anisopliae em larvas de Castnia licus (broca gigante da cana de açúcar), não observando
diferenças significantes entre as linhagens utilizadas no estudo. O trabalho demonstrado por
Feijó (2004) sobre a ação de M. anisopliae var. acridum, M. anisopliae var. anisopliae e B.
bassiana sobre C. albiceps assemelha-se ao encontrado nesse trabalho, indicando que a
concentração de 10
8
conídios/mL apresentou menores índices de emergências de moscas.
Lima (2005) também observou que esta concentração alcançou alto índice de mortalidade em
larvas de Diatraea saccharalis. O sintoma de infecção também foi observado pela
exteriorização dos conídios (conidiogênese) no corpo do inseto colonizado. No início da
conidiogênese as larvas e pupas apresentaram coloração branca passando para verde nos dias
seguintes, devido o amadurecimento dos conídios.
A capacidade de sobrevivência e virulência desse agente foi ressaltada por Alves
(1998), relatando que M. anisopliae é o melhor agente fúngico contra insetos nas condições
climáticas brasileiras, devido principalmente à variabilidade genética que resulta no
aparecimento de muitas linhagens com diferentes níveis de agressividade, especificidade,
produção de conídios, resistência à ultravioleta e patogênicidade a vários insetos. Já que as
condições ambientais exercem grande influência sobre os entomopatógenos e sendo essas
43
adversas, o controle microbiano torna-se prejudicado, justificando-se as pesquisas com
finalidade de se selecionar, induzir e melhorar linhagens que apresentam características úteis
para o êxito de seu emprego no campo (AZEVEDO, 2000).
Os dados obtidos com a utilização de M. anisopliae var. acridum e M. anisopliae var.
anisopliae demonstraram que os fungos têm ação patogênica para Z. indianus, expressando
elevado potencial de infecção, podendo ser utilizado em programa de controle biológico dessa
mosca.
Tabela 2 – Média e desvio do número de moscas que emergiram por vidro, infectadas por
Metarhizium anisopliae var. acridum e Metarhizium anisopliae var. anisopliae após 8 dias avaliação
Fungo
Concentração M. anisopliae var. acridum M. anisopliae var. anisopliae Valor de p
Média ± Desvio padrão Média ± Desvio padrão
Controle
9,87
(A)
± 0,35 9,87
(A)
± 0,35
p
(1)
= 1,0000
10
4
9,40
(A)
± 0,74 9,33
(A)
± 0,72
p
(1)
= 0,7660
10
5
8,47
(A)
± 2,00 7,00
(B)
± 1,96
P
(1)
= 0,0510
10
6
4,80
(C)
± 1,21 4,87
(C)
± 2,39
P
(2)
= 0,9240
10
7
2,60
(D)
± 1,59 1,67
(D)
± 1,29
P
(3)
= 0,0890
10
8
1,33
(D)
± 1,59 1,33
(D)
± 1,50
P
(1)
= 0,9470
Valor de p
p
(4)
< 0,0001* p
(4)
< 0,0001*
Medidas seguidas da mesma letra não diferem estaticamente entre si pelo teste de Tukey ao nível de 5% probabilidade.
44
Tabela 3 – Percentual do ritimo de emergência de Zaprionus indianus infectadas por Metarhizium
anisopliae var. acridum e Metarhizium. anisopliae var. anisopliae durante 8 dias avaliação
Dias de avaliação
Fungo Concentração 3 4 5 6 7 8
M. anisopliae var.
acridum
Controle
23,58 24,67 58,67 86,67 94,00 98,67
10
4
0,00 5,33 28,67 59,33 82,00 94,00
10
5
0,00 0,00 23,33 58,95 77,33 84,67
10
6
0,00 0,00 20,67 36,00 42,67 48,00
10
7
0,00 0,00 2,00 18,67 24,00 26,00
10
8
0,00 0,00 0,00 9,33 12,00 13,33
M. anisopliae var.
anisopliae
Controle
23,58 30,67 67,33 88,00 92,00 98,67
10
4
0,00 6,00 30,00 48,00 73,33 93,33
10
5
0,00 2,67 26,67 47,67 60,67 70,00
10
6
0,00 0,00 20,00 36,00 45,33 48,67
10
7
0,00 0,00 2,00 10,67 15,33 16,67
10
8
0,00 0,00 2,00 10,00 10,67 13,33
45
4.2. ANÁLISE DAS REGIÕES DE MICROSSATELITE, INTRON E ITS ANTES DA
INFECÇÃO DE ZAPRIONUS INDIANUS
O perfil de amplificação das regiões de SSR com o iniciador (GTG)
5
e o perfil de
amplificação da região intron, utilizando o iniciador EI1 nas linhagens de M. anisopliae antes
de passar por Z. indiauns e Fusarium solani esta ilustrado na Figura 5. M. anisopliae var.
acridum apresentou 15 fragmentos variando em torno de 300 a acima de 2070pb. M.
anisopliae var anisopliae apresentou 13 fragmentos variando em torno de 300 a acima de
2070pb e Fusarium solani apresentou 14 fragmentos variando de 310pb a acima 2070pb,
utilizando o inciador (GTG)
5
. Para o iniciador EI1 foram evidenciados 11 fragmentos
variando em torno de 510 pb a 2070pb e 12 fragmentos variando de 510 pb a 1800pb para M.
anisopliae var. acridum e M. anisopliae var. anisopliae respectivamente. Fusarium solani
apresentou 6 fragmentos variando aproximadamente de 410 a 1100pb.
Figura 5. Perfil de amplificação de DNA das 2 linhagens de Metarhizium anisopliae e Fusarium solani
das regiões de (GTG)
5
(A) e Intron (B). Nas pistas M, marcador de peso molecular 100 pb;
Nas pistas 1, 2 e 3, encontram-se o DNA das linhagens Metarhizium anisopliae var.
acridum, Metarhizium anisopliae var. anisopliae e Fusarium solani.
2 1 1 2
3
3
B
A
M M M
200▬
1500▬
2070▬
600▬
46
Na análise do dendrograma da região de microssatelite (Figura 6) pode-se observar
que o iniciador (GTG)
5
mostrou-se bastante eficiente em detectar variabilidade intraespecífica
nas linhagens de M. anisopliae e Fusarium solani, evidenciando a segregação dos genótipos
das linhagens de Metarhizium e de Fusarium solani. As duas linhagens de Metarhizium
apresentaram cerca de aproximadamente 60% de similaridade entre si e cerca de 15% de
fragmentos comuns com F. solani. Resultados semelhantes obteve Lima (2005) analisando o
perfil de amplificação com o mesmo marcador constatando que o iniciador (GTG)
5
foi
eficiente em detectar diferenças entre linhagens de M. anisopliae.
A análise do dendrograma referente à região de Intron (Figura 7), mostrou maior
variabilidade genética do que a do dendrograma da região de microssátelite entre as linhagens
de Metarhizium e Fusarium, notando-se M. anisopliae var acridum e M. anisopliae var.
anisopliae apresentaram cerca de 60% de similaridade entre si e F. solani com cerca de 7% de
similaridade com essas linhagens, mostrando alta dissimilaridade com diferenças genômicas
que realçam a relação interaespécifica com as linhagens de Metarhizium e F. solani. A
diversidade genética encontrada com os iniciadores EI1, neste trabalho, também foi observada
em Beauveria bassiana (Pires, 2002) que constatou alta similaridade entre as linhagens.
Mavridou et al. (2000) em estudo realizado com M. ansopliae var. anisopliae, identificou
introns do grupo I na região 28S do rDNA revelando a presença de 5 grupos distintos desta
estrutura em diferentes sítios de inserção. A variabilidade genética encontrada nas regiões de
intron com primer EI1 neste estudo foi também detectada em S. cereviseae no trabalho de
Barros-Lopes et al. (1996) que conseguiram demonstrar o polimorfismo genético em
linhagens de levedura comerciais via PCR, obtidos com 4 primers que são complementares
para intron splice sites demonstrando o polimorfismo genético, em linhagens de leveduras
comerciais. Por outro lado, Pataro et al. (2000) detectaram a alta variabilidade molecular
observada entre linhagens isoladas de vários tanques com diferentes idades de fermentação
durante a produção de aguardente em 3 destilarias do estado de Minas Gerais, utilizando o
primer EI1. Brasileiro et al. (2004) também detectou alta variabilidade molecular
intraespecifica entre as linhagens de Fusarium solani isolados de diferentes hospedeiros,
através do iniciador EI1. Lima (2005) empregou o iniciador EI1 e para investigar o
polimorfismo entre 15 linhagens de Metarhizium anisopliae evidenciando alta similaridade
entre as linhagens. A autora também constatou que o iniciador de microssatélite foi mais
eficiente em detectar diferenças entre as linhagens, contrastando com os dados obtidos neste
trabalho, onde foi evidenciado que os iniciadores de microssatélite (GTG)
5
e intron
apresentaram a mesma sensibilidade em detectar diferenças, constituindo-se em ferramentas
47
extremamente úteis e apropriadas para medir e caracterizar a variabilidade genética ao nível
inter e intraespecífico.
Barve et al. (2001) utilizaram 13 iniciadores de mocrossatelites para estudar a
variabilidade genética de 4 raças de F. oxysporum f. sp. ciceri. Estes autores verificaram que
apenas os primers (AGT)
5
, (ATC)
5
e (GATA)
4
foram polimorficos. Não há referência na
literatura corrente sobre o uso do iniciador (GTG)
5
para analisar a diversidade genética inter e
intraespecíca em linhagens do gênero Metarhizium. Isto sugere que o (GTG)
5
pode apresentar
potencial para detectar diferenças genéticas entre linhagens de M. anisopliae, como foi
postulado para outras espécies de fungos, como S. cerevisiae (LIECKFELDT at al., 1993;
BALEIRAS COUTO et al., 1996), Suillus grevillei (ZHIHUA et al., 2000), S. paradoxus
(NAUMOVA et al., 2000), Cenococcum geophilum (PORTUGAL et al., 2001),
Phytophthora capsici (YOUN & JIN, 2001), espécies de Exophiala (YOUN & KYOUNG,
2002).
48
Figura 6. Dendrograma construído pelo método de agrupamento UPGMA, utilizando o coeficiente de
Jaccard a partir dos perfis de (GTG)
5
obtidos de linhagens de Metarhizium. anisopliae var.
acridum, Metarhizium anisopliae var. anisopliae e Fusarium solani.
Figura 7. Dendrograma construído pelo método de agrupamento UPGMA, utilizando o coeficiente de
Jaccard a partir dos perfis de intron obtidos de linhagens de Metarhizium anisopliae var.
acridum, Metarhizium anisopliae var. anisopliae e Fusarium solani.
49
A análise dos produtos de amplificação do loci ITS1-5.8-ITS2 do rDNA utilizando os
iniciadores ITS4 e ITS5 antes da passagem pela mosca Z. indianus, apresentou fragmento de
600pb para as linhagens de M. anisopliae enquanto Fusarium solani apresentou 500 pb,
indicando que não obstante a variabilidade genética detectada nas linhagens de M. anisopliae,
foi possível confirmar que as linhagens pertence a mesma espécie, como também demonstrou
que a sensibilidade da técnica de ITS foi adequada para este estudo, conforme pode ser
observado na Figura 8. Lima (2005) obteve o mesmo resultado quando analisando 15
linhagens de Metarhizium anisopliae. Por outro lado Curran et al. (1994) usaram amplificação
e sequênciamento do gene 5.8S, regiões intergênicas ITS1 e ITS2 e análise filogenéticas e
constataram que M. flavoviride e M. ablum representam a mesma linha evolucionária, porém
diferente de M.anisopliae possuindo uma linha monofilética.
As técnicas moleculares principalmente os genes ribossomais e suas regiões ITS têm
contribuído extremamente para a identificação de espécies, estudos taxonômicos, análise
filogenética, que muito auxiliam os estudos morfológicos de identificação de espécies e
segregação de linhagens, facilitando e enriquecendo os estudos biológicos dos fungos
entomopatogênicos (DRIVER et al., 2000; MARTÌNEZ-CULEBRAS et al., 2000; HAJEK et
al. 2003; ENKERLI et al., 2005).
Esses resultados reforçam a eficiência do emprego desses marcadores, para
demonstrar a diversidade genética entre as linhagens de espécies entomapatogênicas de
Anamorfos. Visto que para muitos desses fungos já foi detectada a parassexualidade,
fenômeno que está envolvido diretamente com a variabilidade genética (AZEVEDO, 1998a;b;
2005) a exemplo de M. anisopliae que teve o ciclo parassexual descrito em 1980 (MESSIAS
& AZEVEDO 1980) e Beauveria bassiana em 1991 (PACOLA-MEIRELES & AZEVEDO
1991).
50
Figura 8. Perfil da região ITS do rDNA dos isolados de Metarhizium anisopliae e Fusarium solani,
pelos primers ITS4 e ITS5, em gel de agarose. Na pista M, marcador de peso molecular 100
bp, nas pistas 1, 2 e 3 encontra-se o DNA das linhagens de Metarhizium anisopliae var.
acridum, Metarhizium anisopliae var anisopliae e Fusarium solani.
M
123
600▬
pb
500▬
51
4.3. ANÁLISE DAS REGIÕES DE MICROSSATELITE, INTRON E ITS APÓS O
REISOLAMENTO DE ZAPRIONUS INDIANUS PÓS-INFECÇÃO EXPERIMENTAL.
O perfil de amplificação das regiões de SSR com o iniciador (GTG)
5
e o perfil de
amplificação da região intron, utilizando o iniciador EI1 das linhagens de M. anisopliae var.
acridum e M. anisopliae var. anisopliae, está ilustrado na Figura 9. Os produtos do loci ITS1
e ITS2 do rDNA utilizando os iniciadores ITS4 e ITS5 nas linhagens de Metarhizium
anisopliae são mostrados na Figura 10. Os resultados permitem assegurar que os fenótipos
reisolados que causaram a infecção na mosca, foram os mesmos recuperados depois de
utilizados para infectar as moscas, portanto não havendo diferença genética antes e pós a
passagem pelo inseto.
Figura 9.Perfil de amplificação de DNA das 2 linhagens Metarhizium das regiões de (GTG)5 (A) e
Intron (B). Nas pistas M, marcador de peso molecular 100 pb; nas pistas 1e 5 encontra-se o
DNA da linhagem Metarhizium. anisopliae var. acridum antes da passagem pela mosca e
na pistas 2 e 6 o DNA após passagem pela mosca; nas pistas 3 e 7 encontra-se o DNA da
linhagem Metarhizium anisopliae var. anisopliae antes da passagem pela mosca e nas pistas
4 e 8 encontam-se o DNA após a passagem pela mosca .
A B
1 4 76 3 52 8
M M M
52
Figura 10. Perfil da região ITS do rDNA dos isolados de Metarhizium anisopliae, pelos primers ITS4
e ITS5, em gel de agarose. Na pista M, marcador de peso molecular 100pb, nas pistas 1 e 2,
encontra-se o DNA das linhagens de Metarhizium anisopliae var. acridum antes e após
passagem por Zaprionus indiauns; nas pistas 3 e 4 o DNA de Metarhizium anisopliae var
anisopliae.
A aplicação das técnicas moleculares em bioensaio permite uma maior agilidade na
detecção e identificação levando a um diagnóstico precoce da micose no inseto
(DESTÉFANO et al., 2004). Os dados obtidos neste trabalho reforçam a necessidade de
monitorar os fenótipos ao nível de genoma fúngico, antes e após a aplicação do fungo no
campo, a fim de que seja obtida uma resposta ecológica e uma segurança na certificação da
ação efetiva e específica das linhagens ao nível de gênero e espécie, utilizadas no controle
biológico desta mosca, principalmente quando for utilizado um grade número de linhagens,
visto que os estudos morfológicos e moleculares juntos, só irão dar maior confiabilidade ao
emprego de agentes entomopatogênicos em programa de controle biológico no campo.
M
M
41 2 3
53
5. CONCLUSÕES
• M. anisopliae var. acridum e M. anisopliae var. anisopliae causaram infecção em
larvas e pupas de Z. indianus, podendo ser utiizados no controle biológico dessa
mosca.
• M. anisopliae var. acridum e M. anisopliae var. anisopliae diminuíram a percentagem
de emergência dos adultos oriundos das larvas infectadas.
• M. anisopliae var. acridum e M. anisopliae var. anisopliae aumentaram o tempo de
metamorfose atrasando a eclosão
• O menor percentual de emergência foi registrado no tratamento utilizando a
concentração de 10
8
conídios/mL.
• Os marcadores moleculares (GTG)
5
e EI1
mostraram-se eficientes em demonstrar o
polimorfismo genético entre as linhagens de Metarhizium.
• Os marcardor (GTG)
5
e o EI1 demonstram a mesma sensibilidade em detectar a
diversidade genética das duas linhagens utilizada no trabalho.
• Os marcadores moleculares Intron slice site primer e ISSR confirmaram a
variabilidade genética reconhecida em Metarhizium.
• O marcador EI1 foi mais eficiente em detectar a variabilidade genética entre as
linhagens de Metarhizium anisoplaie e Fusarium solani.
• A análise ITS confirmou que as linhagens M. anisopliae var. acridum e M. anisopliae
var. anisopliae pertencem a mesma espécie.
• As técnica utilizadas mostraram eficientes em monitorar os fenótipos ao nível de
genoma fúngico, antes e após a passagem por Z. indianus.
54
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