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Lima, M.A.B Aspectos Fisiológicos do Efeito do Cádmio em...
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
DEPARTAMENTO DE MICOLOGIA
PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA DE FUNGOS
ASPECTOS FISIOLÓGICOS DO EFEITO DO CÁDMIO EM
Cunninghamella elegans: MECANISMOS DE TOLERÂNCIA,
CAPACIDADE DE SORÇÃO E ACUMULAÇÃO DE
POLIFOSFATO
MARCOS ANTONIO BARBOSA DE LIMA
Recife-PE
2007
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MARCOS ANTONIO BARBOSA DE LIMA
ASPECTOS FISIOLÓGICOS DO EFEITO DO CÁDMIO EM
Cunninghamella elegans: MECANISMOS DE TOLERÂNCIA,
CAPACIDADE DE SORÇÃO E ACUMULAÇÃO DE
POLIFOSFATO
Tese apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Biologia de Fungos da
Universidade Federal de Pernambuco,
como parte dos requisitos, para obtenção
do título de Doutor em Ciências
Biológicas, na área de Biologia de
Fungos.
Orientadora: Profª. Drª. Galba Maria de Campos Takaki
Co-orientadora: Profª. Drª. Aline Elesbão do Nascimento
Recife-PE
2007
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“O pensamento é grande, rápido
e livre; é a luz do mundo e a
glória maior do ser humano.”
Bertrand Russell
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AGRADECIMENTOS
À Deus, por ter permitido alcançar este objetivo.
A meus pais João Barbosa da Cruz e Sueli Barbosa de Lima pela minha educação e pelo
incentivo e apoio fundamental durante minha formação acadêmica.
À Profª. Drª. Galba Maria de Campos Takaki pela orientação no decorrer desses exatos
10 anos de trabalho e por ter sido decisiva na minha formação acadêmica.
À Profª. Drª. Aline Elesbão do Nascimento pela amizade, presteza e constantes
ensinamentos durante esses 10 anos de convívio e trabalho;
À Luciana Franco pelo companheirismo, amizade, apoio, incentivo e carinho.
À Bruno Távora, pela importante ajuda concedida na análise das amostras por
espectrofotometria de absorção atômica.
A Patrícia Mendes e Petrusk Homero pela constante ajuda no transcorrer desse trabalho;
À Humberto e Salatiel técnicos do Núcleo de Pesquisa em Ciências Ambientais-
NPCIAMB, pela solicitude e presteza dos seus serviços;
À Universidade Católica de Pernambuco, na pessoa do Reitor Pe. Pedro Rubens
Ferreira Oliveira, pelo acesso e utilização das instalações do Núcleo de Pesquisas em
Ciências Ambientais-NPCIAMB;
À Coordenadora do Programa de Pós-graduação em Biologia de Fungos, Profª. Drª.
Leonor Costa Maia pela presteza dos trabalhos realizados;
Aos Professores do Programa de Pós-graduação em Biologia de Fungos pela atenção e
conhecimentos transmitidos.
A CAPES, pela concessão da bolsa de Doutorado.
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SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS........................................................................................................... I
RESUMO.............................................................................................................................IV
ABSTRACT .........................................................................................................................V
1. INTRODUÇÃO ..............................................................................................................06
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA......................................................................................08
2.1. POLUIÇÃO AMBIENTAL POR METAIS PESADOS..........................................08
2.1.1. Considerações Gerais..................................................... ........................ ...................08
2.1.2. Toxicidade do Cádmio ...............................................................................................10
2.1.3. Interação dos Microrganismos com Metais Pesados..................................................13
2.2. PROCESSOS BIOTECNOLÓGICOS DE REMOÇÃO DE METAIS..................15
2.2.1. Biorremediação...........................................................................................................17
2.2.2. Cunninghamella elegans ............................................................................................18
2.3. POLIFOSFATO INORGÂNICO...............................................................................19
2.3.1. Considerações Gerais .................................................................................................19
2.3.2. Papel do Polifosfato na Tolerância a Metais Pesados ................................................22
2.4. ULTRA-ESTRUTURA E CITOESQUELETO DE ACTINA................................23
3. REFERÊNCIAS .............................................................................................................25
Lima, M.A.B Aspectos Fisiológicos do Efeito do Cádmio em...
PRIMEIRO ARTIGO
TÍTULO - Toxicidade do Cádmio para Cunninghamella elegans: alterações ultra-
estruturais e do citoesqueleto de actina............................................................................38
RESUMO.............................................................................................................................40
INTRODUÇÃO ..................................................................................................................41
MATERIAIS E MÉTODOS..............................................................................................43
Microrganismos e Condições de Cultivo .............................................................................43
Histoquímica para Citoesqueleto de Actina .........................................................................43
Técnica de rotina ..................................................................................................................44
Citoquímica para Detecção de Carboidratos de Superfície..................................................44
RESULTADOS...................................................................................................................46
DISCUSSÃO.......................................................................................................................58
AGRADECIMENTOS.......................................................................................................65
REFERÊNCIAS .................................................................................................................65
SEGUNDO ARTIGO
TÍTULO – Acumulação e Degradação de Polifosfato por Cunninghamella elegans em
Resposta ao Cádmio............................................................................................................71
RESUMO.............................................................................................................................73
INTRODUÇÃO ..................................................................................................................74
MATERIAIS E MÉTODOS..............................................................................................76
Métodos Microbiológicos.....................................................................................................76
Microrganismo e Condições de Cultivo............................................................................76
Curvas de Crescimento......................................................................................................76
Métodos Analíticos...............................................................................................................76
Determinação de fósforo ...................................................................................................76
Extração das Frações do Polifosfato..................................................................................77
RESULTADOS...................................................................................................................78
DISCUSSÃO ......................................................................................................................82
AGRADECIMENTOS.......................................................................................................86
REFERÊNCIAS .................................................................................................................87
Lima, M.A.B Aspectos Fisiológicos do Efeito do Cádmio em...
TERCEIRO ARTIGO
TÍTULO - Remoção e Acumulação de Cádmio por Cunninghamella elegans em
Crescimento Contínuo........................................................................................................91
RESUMO.............................................................................................................................93
INTRODUÇÃO ..................................................................................................................94
MÉTODOS..........................................................................................................................96
Microrganismo e Condições de Cultivo...............................................................................96
Cinética de Remoção de Cádmio..........................................................................................96
Acumulação de cádmio ........................................................................................................97
RESULTADOS E DISCUSSÃO .......................................................................................98
Remoção de Cádmio.............................................................................................................98
Eficiência de Remoção de Cádmio.....................................................................................100
Acumulação Celular de Cádmio.........................................................................................102
CONCLUSÕES.................................................................................................................104
AGRADECIMENTOS.....................................................................................................104
REFERÊNCIAS ...............................................................................................................104
CONCLUSÕES GERAIS ................................................................................................109
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I
LISTA DE FIGURAS
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
Figura 1. Mecanismos de interação entre metais e microrganismos..............................14
Fonte: Birch e Bachofen, 1990.
Figura 2. Estrutura química do polifosfato inorgânico...................................................20
Fonte: Reusch, 2000.
PRIMEIRO ARTIGO
Figura 1. Microscopia de Fluorescência de amostras de Cunninghamella elegans
controle, tratadas com FITC-faloidina. Notar as diferentes formas de apresentação do
citoesqueleto de actina: grumos, filamentos e placas em diferentes áreas das hifas (Õ).
Barra 10µm......................................................................................................................46
Figura 2. Microscopia de Fluorescência de amostras de Cunninghamella elegans
submetidas ao cultivo em presença de 5,62mg/L de cádmio, e tratadas com FITC-
faloidina. Notar as diferentes formas de apresentação do citoesqueleto de actina: grumos
e placas em diferentes áreas das hifas (Õ). Barra 10µm.................................................47
Figura 3. Microscopia de Fluorescência de amostras de Cunninghamella elegans
submetidas ao cultivo em presença de 11,24mg/L de cádmio, e tratadas com FITC-
faloidina. Notar as diferentes formas de apresentação do citoesqueleto de actina: grumos
e filamentos em diferentes áreas das hifas (Õ). Barra 10µm..........................................48
Figura 4. Microscopia de Fluorescência de amostras de Cunninghamella elegans
submetidas ao cultivo em presença de 22,10mg/L de cádmio, e tratadas com FITC-
faloidina. Notar as diferentes formas de apresentação do citoesqueleto de actina:
grumos, filamentos, placas e “caps” em diferentes áreas das hifas (Õ). Barra
10µm................................................................................................................................49
Lima, M.A.B Aspectos Fisiológicos do Efeito do Cádmio em...
II
Figura 5. Eletromicrografias de amostras de Cunninghamella elegans controle, técnica
de rotina. Parede Celular (f); Membrana Citoplasmática (x); Vacúolos ()..............50
Figura 6. Eletromicrografias de amostras de Cunninghamella elegans cultivada em
5,62mg/L de cádmio, técnica de rotina. Parede Celular (►); Membrana Citoplasmática
(x); Vacúolos (); Grânulos (¨)...................................................................................51
Figura 7. Eletromicrografias de amostras de Cunninghamella elegans, cultivada em
11,24 mg/L de cádmio, técnica de rotina. Parede Celular (►); Membrana
Citoplasmática (x); Vacúolos (); Grânulos (¨)..........................................................52
Figura 8. Eletromicrografias de amostras de Cunninghamella elegans, cultivada em
22,10 mg/L de cádmio, técnica de rotina. Parede Celular (►); Membrana
Citoplasmática (x); Vacúolos (); Grânulos (¨); Corpos Eletrondensos (Ø).............53
Figura 9. Eletromicrografias de amostras de Cunninghamella elegans, cultura controle,
técnica citoquímica com vermelho de rutênio. Parede Celular (►); Membrana
Citoplasmática (x); Vacúolos (); Produtos de Reação (Ï)........................................54
Figura 10. Eletromicrografias de amostras de Cunninghamella elegans, cultura tratada
com 5,62 mg/L de cádmio, técnica citoquímica com vermelho de rutênio. Parede
Celular (►); Membrana Citoplasmática (x); Vacúolos (); Produtos de Reação
(Ï)...................................................................................................................................55
Figura 11. Eletromicrografias de amostras de Cunninghamella elegans, cultura tratada
com 11,24mg/L de cádmio, técnica citoquímica com vermelho de rutênio. Parede
Celular (►); Membrana Citoplasmática (x); Vacúolos (); Produtos de Reação
(Ï)...................................................................................................................................56
Lima, M.A.B Aspectos Fisiológicos do Efeito do Cádmio em...
III
Figura 12. Eletromicrografias de amostras de Cunninghamella elegans, cultura tratada
com 22,10mg/L de cádmio, técnica citoquímica com vermelho de rutênio. Parede
Celular (►); Membrana Citoplasmática (x); Vacúolos (); Produtos de Reação
(Ï)...................................................................................................................................57
SEGUNDO ARTIGO
Figura 1. Crescimento de C. elegans na presença de cádmio. Amostras controle (-♦-) e
tratadas com cádmio nas concentrações 5,62mg/L (-■-), 11,24mg/L (-▲-) e 22,10mg/L
(--).................................................................................................................................78
Figura 2. Consumo de fósforo inorgânico por C. elegans na presença de cádmio.
Amostras controle (-♦-) e tratadas com cádmio nas concentrações 5,62mg/L (-■-),
11,24mg/L (-▲-) e 22,10mg/L (--)...............................................................................79
Figura 3. Frações do polifosfato durante crescimento de C. elegans em diferentes
concentrações de cádmio. Amostras controle (A) e tratadas com cádmio nas
concentrações 5,62mg/L (B), 11,24mg/L (C) e 22,10mg/L (D). Fração ácido-solúvel
(1), Fração base-solúvel (2), Fração ácido-insolúvel (3), PoliPi total (4).......................80
TERCEIRO ARTIGO
Figura 1. Percentual de remoção de cádmio do meio de cultura por Cunninghamella.
elegans. ...........................................................................................................................98
Figura 2. Eficiência de remoção de cádmio por Cunninghamella.
elegans...........................................................................................................................101
Figura 3. Acumulação de cádmio por Cunninghamella elegans. 3 dias (coluna cinza
clara) e 6 dias (Coluna cinza escura) de contato com 5.62 mg/L, 11.24 mg/L e
22.10mg/L de cádmio....................................................................................................102
Lima, M.A.B Aspectos Fisiológicos do Efeito do Cádmio em...
IV
RESUMO
A contaminação ambiental por metais pesados é uma questão séria e mundial. O
aumento das atividades industriais e a deterioração de alguns ecossistemas, devido
acumulação de metais têm intensificado a poluição ambiental. O cádmio, metal pesado
muito utilizado em processos industriais, é um dos elementos químicos mais tóxicos, o
que o torna um relevante contaminante ambiental. Os fungos são organismos de grande
importância prática por causa de sua ampla aplicação em diversas áreas da
biotecnologia, sobretudo na área ambiental. Neste trabalho, os aspectos fisiológicos do
efeito do cádmio concernente à resistência/tolerância a metais, metabolismo do
polifosfato, alterações histoquímicas e ultra-estruturais, foram avaliados em
Cunninghamella elegans. Os resultados obtidos demonstraram que o cádmio induziu
variações na forma, arranjo e distribuição do citoesqueleto de actina, bem como na
estrutura fina do fungo associado a mudanças de eletrondensidade, vacuolização,
alteração na textura do citoplasma e presença de inclusões e granulações eletrondensas.
A citoquímica com vermelho de rutênio revelou, por sua vez, alteração de
permeabilidade celular e composição de carboidratos de superfície. Além do que foi
observado que C. elegans é capaz resistir, crescer, remover e acumular cádmio em
diferentes concentrações e que possivelmente usa o polifosfato como mecanismo de
detoxificação, haja vista que seu conteúdo variou muito em função da concentração do
metal. Os dados obtidos neste trabalho revelam que C. elegans exibe potencial de uso
em biorremediação de metais.
Palavras-Chave: Cunninghamella elegans, Cádmio, Ultraestrutura, Polifosfato, Sorção
Lima, M.A.B Aspectos Fisiológicos do Efeito do Cádmio em...
V
ABSTRACT
Environmental contamination by heavy metal is a serious and worldwide problem. The
progress in industrial activities and the ecosystems deterioration due to metals
accumulation have been intensified the pollution. Cadmium, a heavy metal very used in
industrial processes, is one of the most toxic, which contributes being a relevant
environmental contaminant. Fungi are organisms of great practical importance due to its
large application in several biotechnological areas, especially in the environmental
areas. In this work, the physiological aspects of cadmium effects related to metal
tolerance/resistance, polyphosphate metabolism, histochemical and ultrastructural
changes were evaluated in Cunninghamella elegans. The results obtained revealed that
cadmium induced alterations in form, arrange and distribution of actin cytoskeleton, and
changes in the fine structure such as eletrondensity, vacuolization and cytoplasmatic
texture and granulation. The cytochemical aspects by using ruthenium red showed
cellular permeability and surface carbohydrate composition alteration. It was observed
that C. elegans is able to resist, grow, remove and accumulates cadmium at different
concentrations and possibly uses the polyphosphate as a detoxification mechanism
considering that its content values changes according to metal concentrations. The date
obtained in this study demonstrates that C. elegans exhibit potential for metal
bioremediation.
Keywords: Cunninghamella elegans, Cadmium, Ultrastructure, Polyphosphate,
Sorption
Lima, M.A.B Aspectos Fisiológicos do Efeito do Cádmio em...
6
1. INTRODUÇÃO
O aumento crescente do processo de industrialização tem elevado o descarte de
metais pesados no meio ambiente, resultando assim na degradação de alguns
ecossistemas, colocando assim em risco a saúde humana e animal (Fellenberg, 1990;
Prasad, 1995).
Os microrganismos apresentam uma grande capacidade de captar e acumular
metais pesados através de diversos processos, que podem ser ou não dependentes do
metabolismo. Estes processos microbianos são economicamente viáveis quando
comparados aos processos físico-químicos convencionais utilizados no tratamento de
efluentes contaminados com metais pesados (Gomes et al., 1998).
Entre os microrganismos presentes no ecossistema, os fungos apresentam
grandes vantagens, principalmente, a de tolerar a presença de metais pesados tóxicos em
altas concentrações, pois possuem paredes celulares espessas, as quais apresentam em
sua constituição biopolímeros como polissacarídios e polifosfatos que exibem
excelentes propriedades de ligação a metais pesados (Gupta et al., 2000).
A tolerância aos metais pesados em um grande número de microrganismos tem
sido correlacionada com a presença de um homopolímero de cadeia longa de fosfatos
inorgânicos, denominado de polifosfato inorgânico (PoliPi) (Keasling, 1997).
Cunninghamella elegans tem sido descrita na literatura pela capacidade de
acumular fósforo na forma de polifosfato (Lima, et al., 2003). Além do que, esta espécie
tem grande habilidade de metabolizar várias substancias xenobióticas recalcitrantes, tais
como: hidrocarbonetos aromáticos policíclicos - HAPs (Shiosaki et al., 2001),
azocorantes utilizados na indústria têxtil (Ambrósio e Campos-Takaki, 2004), produtos
tóxicos advindos da combustão de óleo diesel (Shiosaki et al., 2001; Cerniglia e Gibson,
Lima, M.A.B Aspectos Fisiológicos do Efeito do Cádmio em...
7
1977). Paralelamente, Souza et al., 2005, mostraram que C. elegans foi capaz de crescer
na presença do metal cobre.
Devido ao grande potencial apresentado por Cunninghamella elegans, e os
poucos relatos a respeito de sua capacidade de tolerância a metais pesados, esta pesquisa
foi realizada visando ampliar o conhecimento acerca do processo de acumulação de
polifosfato inorgânico associado à habilidade de remoção de cádmio, bem como dos
efeitos deste metal sobre a estrutura celular da espécie C. elegans, através dos seguintes
objetivos:
• Investigar o efeito do cádmio sobre a estrutura fina, permeabilidade celular e
carboidratos de superfície de C. elegans;
• Investigar o efeito do cádmio sobre o citoesqueleto de actina de C. elegans;
• Avaliar o comportamento do polifosfato de C. elegans durante crescimento em meio
contendo cádmio;
• Analisar a eficiência de sorção e acumulação de cádmio de meio de cultura por C.
elegans.
Lima, M.A.B Aspectos Fisiológicos do Efeito do Cádmio em...
8
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1. POLUIÇÃO AMBIENTAL POR METAIS PESADOS
2.1.1. Considerações Gerais
O grande aumento populacional associado ao incremento nas atividades
industriais, tem resultado em uma descarga cada vez maior de substâncias xenobióticas
e recalcitrantes no meio ambiente. Este fato, por sua vez, tem intensificado a poluição
ambiental em uma escala cada vez maior, que vem alterando a composição química das
águas, do solo, da atmosfera e dos sistemas biológicos, colocando em perigo não
somente o bem-estar, como também a sobrevivência de diversos seres vivos (Freitas et
al., 2001; Fellenberg, 1990).
Define-se como poluição qualquer alteração física, química ou biológica que
produza qualquer modificação no ciclo biológico normal, interferindo na composição da
fauna e da flora do meio ambiente (Aguiar e Novaes, 2002).
A água é um dos recursos naturais mais afetados pelo aumento da poluição, que
vem comumente recebendo diversos resíduos contaminados com altas concentrações de
substâncias poluentes como: compostos fenólicos, defensivos agrícolas, produtos
petroquímicos e metais pesados. Isto vem provocando mudanças nas características
físicas, químicas e biológicas das águas, interferindo assim na sua qualidade e
impossibilitando o seu uso para o consumo humano (Gomes et al., 1998; Aguiar e
Novaes, 2002).
A indústria química é responsável pela maioria dos descartes contendo inúmeras
substâncias poluentes encontradas na natureza. Dentre os principais poluentes,
destacam-se os metais e seus derivados, pois são diretamente prejudiciais à saúde
Lima, M.A.B Aspectos Fisiológicos do Efeito do Cádmio em...
9
humana e aos ecossistemas, comprometendo sensivelmente à manutenção dos processos
vitais (Freitas et al., 2001).
Os metais pesados constituem um grupo heterogêneo de elementos químicos,
incluindo, metais, semi-metais e não metais, que possuem número atômico maior que
20 ou peso específico superior a 5 g.cm
3
, sendo considerados elementos traços por
serem encontrados na natureza em partes por milhão (ppm) (Malavolta, 1994).
Estes elementos existem naturalmente no ambiente e são necessários em
concentrações mínimas para manutenção dos processos vitais dos seres vivos (sendo
denominados de oligoelementos ou micronutrientes). Diversos metais, tais como o
ferro, cobre, zinco, cobalto, manganês, cromo, molibdênio, vanádio, selênio, níquel e
estanho, participam do metabolismo e da formação de muitas proteínas, enzimas,
vitaminas e pigmentos respiratórios essenciais aos diversos organismos (Griffin, 1994).
No entanto, quando ocorre o aumento de suas concentrações, normalmente
acima de 10 vezes, efeitos deletérios começam a surgir, provocando diversos
desequilíbrios. Os metais pesados estão entre os vários poluentes existentes, que têm
recebido atenção especial, uma vez que alguns são extremamente tóxicos para uma
grande variedade de organismos, mesmo em quantidades muito baixas, da ordem de
mili ou até mesmo microgramas (Griffin, 1994; Hughes e Poole, 1989).
Além do mais, os metais pesados são contaminantes ambientais persistentes
uma vez que não podem ser degradados ou destruídos. Dessa forma, tendem a
acumular-se na cadeia alimentar, gerando sérios problemas ecológicos e de saúde
(Malik, 2004).
Diversos setores industriais são responsáveis pela contaminação ambiental por
metais, entre as quais podemos destacar: as indústrias de papel, petroquímica, de cloro,
fertilizantes, refinarias de petróleo, usinas siderúrgicas, indústrias de metais não-
Lima, M.A.B Aspectos Fisiológicos do Efeito do Cádmio em...
10
ferrosos, vidro, cimento, cerâmica, indústria têxtil, indústria de couros e usinas
termoelétricas, entre outras (Fellenberg, 1990).
De acordo com a organização mundial de saúde, os metais que causam maior
preocupação são: alumínio, cromo, manganês, ferro, cobalto, níquel, cobre, zinco,
cádmio, mercúrio e o chumbo. Diferentemente de outros contaminantes ambientais, os
metais, como constituintes naturais da crosta terrestre, não devem ser eliminados,
devido a sua importância para o metabolismo dos seres vivos, já que atuam como co-
fatores para a ativação de vários zimogênios participantes do metabolismo de
organismos vivos (Ikeda et al., 2000).
Dentre os metais contaminantes, o cádmio e o mercúrio, são considerados os
mais perigosos, pois além de não haver participação destes íons em nenhuma via
metabólica, já é bem estabelecida a participação destes metais em episódios de
envenenamento de humanos e animais, principalmente silvestres, resultantes da ingestão
de alimentos contaminadas (Friberg et al., 1974). Em adição, o cádmio tem meia-vida
de aproximadamente 10 anos, o que o torna um contaminante cumulativo (Waalkes,
2000). Além disso, atualmente, o cádmio tem sido alvo de muitos estudos, já que figura
entre os metais que têm apresentado os mais altos níveis de emissão para o meio
ambiente nas últimas décadas (Nascimento e Pereira, 1997).
2.1.2. Toxicidade do Cádmio
O contato com poluentes ambientais contendo o elemento cádmio pode ocorrer
mesmo que não se resida ou se trabalhe em áreas geográficas altamente poluídas. O
público em geral pode ser exposto ao cádmio, predominantemente, por meio da água e
alimentos contaminados, mas também pela inalação da fumaça de cigarros. No entanto,
a alimentação é a principal fonte de contaminação, onde cerca de 70% da exposição
Lima, M.A.B Aspectos Fisiológicos do Efeito do Cádmio em...
11
ocorre por via oral, decorrente da utilização de águas contaminadas na irrigação ou
mesmo pelo solo contaminado (Prasad, 1995).
As concentrações de cádmio nos alimentos ocorrem, em ordem decrescente,
maiores nos vegetais, depois em carnes e pescados e, finalmente, nos ovos e produtos
lácteos (Garcia e Hernandéz, 1993).
O cádmio é um elemento químico altamente tóxico para seres humanos,
podendo ser absorvido através dos tratos respiratório e intestinal. A intoxicação aguda
tem como conseqüências náuseas, salivação, vômitos, dores abdominais e diarréia. A
intoxicação crônica pode levar a disfunção renal, anemia, bronquite crônica, enfisema
pulmonar, arteriosclerose, hipertensão e câncer (Bernard e Lauwerys, 1984; Hallenbick,
1984).
No homem e em animais, o cádmio é absorvido pelo intestino em duas fases,
inicialmente através das células da mucosa intestinal e a seguir passa à circulação
sangüínea através dos enterócitos, sendo transportado pelo sangue até o fígado onde
induz a síntese da metalotioneína, uma proteína quelante de metais pesados que
seqüestra o cádmio nas células hepáticas, proporcionando uma pequena liberação do
complexo cádmio-metalotioneína no sangue. Tal complexo é filtrado pelos glomérulos e
reabsorvido pelos túbulos proximais, podendo ser degradado por enzimas lisossomais
das células tubulares renais, ou concentrar-se em vários órgãos como, rins, fígado,
sistema nervoso, intestinos, ossos, pele e testículos comprometendo o perfeito
funcionamento dos mesmos (Groten e Blanderen, 1994).
Adicionalmente, o cádmio foi designado um carcinógeno humano e um potente
carninógeno animal pela “International Agency for Research on Cancer” e o “US
National Toxicology Program”. A exposição ocupacional ao cádmio está diretamente
associada ao câncer de pulmão e possivelmente câncer de próstata (Roman et al., 2002).
Lima, M.A.B Aspectos Fisiológicos do Efeito do Cádmio em...
12
A toxicidade do cádmio também pode afetar o crescimento das plantas, a
redução da taxa de fotossíntese e provocar alterações nas atividades enzimáticas,
possivelmente devido a sua afinidade pelos grupos cisteínas das proteínas (Coobet,
2000).
Além do potencial de causar danos aos seres humanos, animais e vegetais o
cádmio também apresenta toxicidade para uma grande variedade de organismos,
destacando-se os microrganismos onde os principais efeitos ocorrem sobre o
crescimento e processo de replicação do ácido desoxirribonucléico (Koropatnick e
Leibbrandt, 1995). Além do mais, os íons metálicos podem ainda acarretar mudanças na
permeabilidade celular, inibição da síntese protéica e interferir nos processos
respiratórios (Bononi, 1998). Adicionalmente, metais pesados têm marcantes efeitos na
ultra-estrutura dos microrganismos, nos quais se observa alterações de forma e tamanho
da célula e das organelas (Nishikawa, 2003).
O cádmio, particularmente, inibe as funções das proteínas que possuem pontes
dissulfeto por causa de sua afinidade pelos grupos sulfidrilas. Além do mais, o cádmio
compete com vários íons divalentes como Ca
2+
, Zn
2+
e Mn
2+
por sítios de ligação de
metais nos sistemas biológicos. Este metal, pode ainda ligar-se a nucleotídios levando a
quebra da fita de ADN (Wang et al., 1997).
A contaminação do solo por metais pesados pode ocasionar alterações na
diversidade microbiana, normalmente com seleção de microrganismos tolerantes, uma
vez que algumas espécies podem ser eliminadas, enquanto outras podem aumentar o
tamanho da população (Giller et al., 1998).
Lima, M.A.B Aspectos Fisiológicos do Efeito do Cádmio em...
13
2.1.3. Interação dos Microrganismos com Metais Pesados
Os microrganismos exibem alta capacidade de crescer em elevadas
concentrações de metais. Esta habilidade pode ser resultado de diversos mecanismos
intrínsecos ou induzidos, bem como de fatores ambientais, que podem reduzir a
toxicidade dos metais (Gomes et al., 1998). Freqüentemente, os termos resistência e
tolerância são usados como sinônimos. Gadd (1992) definiu resistência como a
habilidade de sobreviver a metais tóxicos por mecanismos de detoxificação produzidos
em resposta direta ao metal. A tolerância, por outro lado, seria a habilidade de
sobreviver à toxicidade de metais por meio de propriedades intrínsecas do organismo.
Os microrganismos desenvolveram diferentes mecanismos de
resistência/tolerância aos metais pesados, dentre os quais: seqüestro intra e extracelular;
bombas de efluxo; redução e deposição enzimática conforme Figura 1 (Birch e
Bachofen, 1990; Gomes et al., 1998; Nies, 1999). Qualquer um desses processos resulta
em diminuição da toxicidade do metal.
Comumente a tolerâcia/resistência dos microrganismos a metais pesados está
diretamente relacionada à capacidade de acumulação. Os processos de acumulação de
metais por microrganismos podem ou não depender do metabolismo. Microrganismos
possuem dois mecanismos distintos de acumulação de metais. O primeiro envolve a
adsorção físico-química à superfície celular, constituindo um processo independente do
metabolismo que é denominado de “biossorção”. O segundo é exclusivamente
dependente do metabolismo celular e envolve transporte ativo dos metais para o interior
da célula, sendo conhecido como “bioacumulação” (Gomes et al., 1998; Kapoor e
Viraraghavan, 1995).
Dessa maneira, a detoxificação de metais via bioacumulação é baseada em
sistemas de transporte. Em bactérias, o cádmio é internalizado pelo sistema de
Lima, M.A.B Aspectos Fisiológicos do Efeito do Cádmio em...
14
transporte do magnésio, enquanto que em plantas o cádmio entra pelo sistema de
transporte do cálcio. Em Sacharonmyces cerevisiae, cádmio é ligado pela glutationa,
resultando no complexo cádmio-bis-glutationato, o qual é transportado para o interior
de vacúolos (Nies, 1999).
Figura 1. Esquema resumido dos mecanismos de interação entre metais e
microrganismos. Fonte: Birch e Bachofen, 1990.
O fenômeno de biossorção está intimamente relacionado à superfície celular e
varia significativamente entre grupos, gêneros e espécies de microrganismos. A
predominância de grupos carregados negativamente em vários biopolímeros que
formam a parede celular confere um caráter aniônico à superfície celular, resultando na
atração passiva dos íons de metais a mesma. Sendo assim, a ligação dos íons metálicos
ocorre por interações eletrostáticas destes com grupos funcionais (OH
-
, HPO
4
-2
, R-
COO
-
, -SH
-
, NH
2
-
) presentes em carboidratos, lipídios e proteínas da superfície celular
(Gomes et al., 1998; Vieira e Volesky, 2000). Atualmente, a biossorção é o processo
mais usado na biorremediação de metais pesados, sendo muito eficiente no tratamento
de efluentes, porém seu potencial em solo é menos avançado (Barkay e Schaefer, 2001).
A bioacumulação é um processo mais lento do que a biossorção e pode ser
inibida pela ausência de nutrientes tais como glicose, nitrogênio e fósforo, e pela ação
Lima, M.A.B Aspectos Fisiológicos do Efeito do Cádmio em...
15
de inibidores metabólicos e fatores ambientais (Gomes et al., 1998). Este processo de
acumulação de metais envolve tanto mecanismo passivo quanto ativo, pois os íons
metálicos precisam ligar-se a parede celular para depois serem internalizados (Malik,
2004).
Enquanto a biossorção é um fenômeno que ocorre em microrganismos vivos e
mortos, a bioacumulação é apenas mediada por microrganismos vivos. Sendo assim, a
bioacumulação é um processo dependente do crescimento, em contraste com a
biossorção que é crescimento independente (Gupta et al., 2000). Em adição, células
vivas podem interagir de diversas formas com metais, tanto por mecanismos passivos,
utilizados por células mortas, quanto por mecanismos que requerem atividade
metabólica (Gomes et al., 1998).
Os processos de bioacumulação apresentam algumas vantagens em relação à
biossorção no tocante a sua utilização em biorremediação de metais pesados, como
capacidade de remoção contínua de metais e potencial de otimização através do
desenvolvimento de espécies mais resistentes (Malik, 2004).
2.2. PROCESSOS BIOTECNOLÓGICOS DE REMOÇÃO DE METAIS
PESADOS
O termo biotecnologia pode ser conceituado como a utilização de sistemas
biológicos para a obtenção de produtos e ou serviços de interesse econômico ou social.
A biotecnologia é baseada na busca e descoberta de recursos biológicos industrialmente
exploráveis. As etapas do processo de busca e descoberta biotecnológica passa
resumidamente pela coleta de material biológico adequado, seguida da seleção e triagem
de materiais com as características desejadas, seleção final das melhores amostras e
Lima, M.A.B Aspectos Fisiológicos do Efeito do Cádmio em...
16
culmina com o desenvolvimento de um produto comercial ou processo industrial (Bull
et al, 2000).
A biotecnologia é reconhecida como uma das tecnologias promissoras no século
21, devido ao seu potencial de solucionar problemas globais através de produtos,
serviços e ou processos para saúde, produção de alimentos e poluição ambiental, bem
como à promessa de desenvolvimento industrial sustentável através da utilização de
recursos renováveis (Bull et al., 1998).
A biotecnologia aplicada ao meio ambiente, embora ainda considerada uma área
de pesquisa emergente, mostra-se potencialmente capaz de responder com soluções
efetivas para uma grande variedade de problemas relativos à poluição ambiental. Nesse
sentido, não apenas proporciona métodos para o tratamento de rejeitos industriais, mas
também pode contribuir para a biorremediação de ambientes já contaminados.
Adicionalmente, pode ainda viabilizar o aproveitamento destes rejeitos para produção
de materiais de interesse econômico (Kapoor e Viraraghavan, 1995; Gomes et al.,
1998).
Já está bem estabelecida, a aplicação biotecnológica de microrganismos tanto de
origem natural como geneticamente modificados, os quais apresentam a capacidade de
transformar alguns produtos em novas substâncias, mais valiosas ou ainda transformar
resíduos poluentes em substâncias inofensivas, e algumas vezes úteis. Este aspecto da
microbiologia é de suma importância, principalmente em relação ao desenvolvimento
de processos de recuperação ambiental e tem revolucionado a microbiologia industrial,
através do desenvolvimento de processos comerciais denominados de “Biorremediação”
que permitem a utilização de um elevado número de microrganismos com habilidade de
decompor e remover diversos poluentes químicos (Pelczar, 1996).
Lima, M.A.B Aspectos Fisiológicos do Efeito do Cádmio em...
17
2.2.1. Biorremediação
A Biorremediação é um processo tecnológico pelo qual sistemas biológicos são
utilizados para tratar a poluição e restaurar a qualidade ambiental por meio da
degradação e/ou biossorção de poluentes. Existem várias formas de biorremediação: a)
Bioestimulação, estimulação dos microrganismos presentes no local através do controle
das condições de crescimento, como adição de nutrientes. b) Bioaumentação, introdução
de microrganismos previamente isolados de outros locais ou do mesmo local da
contaminação, com a habilidade de eliminar o poluente. c) Remediação utilizando
metabólitos microbianos, como enzimas e surfactantes capazes de imobilizar o
contaminante. A biorremediação tem recebido grande atenção atualmente, devido a sua
importância econômica e promissora aplicação na indústria.
Embora, todo material biológico demonstre habilidade para captação de metais,
várias pesquisas vêm sendo direcionadas para o uso de sistemas microbianos, onde tanto
a biomassa viva quanto inativada (morta) são empregadas. Muitos microrganismos,
incluindo bactérias, algas e fungos, possuem a habilidade para remover metais pesados
do meio ambiente. A capacidade de remoção, assim como, o mecanismo de acumulação
pode variar amplamente de acordo com a espécie microbiana, ou até mesmo a linhagem.
Células, produtos excretados, parede celular e polissacarídeos têm potencial para
remover metais de solução. Fatores externos como pH, temperatura, ausência ou
presença de nutrientes e outros metais também influenciam no mecanismo atuante e,
conseqüentemente, na eficiência e seletividade de acumulação (Cotoras, 1992;
Nakajima e Sakagushi, 1986).
Na área de tratamento de efluentes líquidos existe um grande potencial para a
exploração principalmente de bactérias, fungos e algas. A remoção de metais
empregando microrganismos selecionados tem se tornado bastante promissora, já que os
Lima, M.A.B Aspectos Fisiológicos do Efeito do Cádmio em...
18
mesmos podem apresentar alta seletividade e alta taxa de remoção. Seu emprego
também apresenta a vantagem de possuírem potencial para regeneração da biomassa,
possibilitando a reutilização em novas etapas de remoção, após a recuperação do metal
captado (Gallun et al., 1987; Volesky e Hollan, 1995).
Entre os sistemas biológicos utilizados, os fungos são de grande interesse
biotecnológico, sendo, dentre os seres vivos, os que mais têm contribuído com produtos
e processos de importância fundamental para o bem estar da humanidade. Os fungos são
organismos que apresentam marcante versatilidade metabólica, característica que
permite o seu desenvolvimento em condições ambientais adversas, como pH baixo,
altas temperaturas, alta salinidade e presença de substâncias tóxicas tais como metais
pesados. Além do que, os fungos são mais tolerantes a metais pesados do que as
bactérias (Rajapaksha et al., 2004). O somatório destas características faz dos fungos
filamentosos importantes agentes na remediação de áreas contaminadas com metais
tóxicos (Griffin, 1994; Bononi, 1998).
Estes microrganismos podem ainda apresentar-se morfologicamente como
leveduriforme ou filamentosos. Esta última forma acrescenta aos fungos a vantagem de
utilização em biorremediação de solos contaminados, pois permitem a fácil penetração
do fungo no solo e sua interação com o poluente (Espósito e Azevedo, 2004).
2.2.2. Cunninghamella elegans
O gênero Cunninghamella é um dos mais importantes pertencentes à Ordem
Mucorales, foi descrito por Matruchot em 1903 como um fungo filamentoso que
poderia ser encontrado em solo, materiais de origem vegetal ou outros substratos
orgânicos. As principais espécies representantes do gênero são Cunninghamella
bertholletiae, C. elegans e C. echinulata, sendo esta última à única considerada
Lima, M.A.B Aspectos Fisiológicos do Efeito do Cádmio em...
19
potencialmente patógena, podendo causar infecções em hospedeiros imunologicamente
comprometidos (Alexopoulos et al., 1996).
Em especial, C. elegans Lendner 1905, tem sido indicada por muitos autores
como um fungo modelo capaz de metabolizar uma ampla variedade de compostos
tóxicos recalcitrantes utilizando a fase I (oxidativa) e fase II (conjugativa) (Ambrósio e
Campos-Takaki, 2004). Esta espécie tem sido extensivamente utilizada como modelo
microbiológico para o metabolismo de drogas farmacêuticas para células animais
através do sistema de enzimas citocromo P-450 (Zhang, 1996); na degradação de
hidrocarbonetos aromáticos policíclicos - HAPs (Shiosaki et al., 2001), na
biodegradação de azocorantes utilizados na indústria têxtil (Ambrósio e Campos-
Takaki, 2004), na biodegradação de produtos tóxicos advindos da combustão de óleo
diesel (Shiosaki et al., 2001; Cerniglia e Gibson, 1977), e na biorrecuperação de metais
pesados (Franco et al., 2004). C. elegans pode ainda ser utilizada como fonte alternativa
para a produção de quitina e quitosana apresentando rendimentos iguais ou superiores
aos obtidos com a utilização de fontes tradicionais de obtenção, como as carapaças de
crustáceos (Andrade et al., 2000; Franco et al., 2004;).
2.3. POLIFOSFATO INORGÂNICO
2.3.1. Considerações Gerais
Um grande número de organismos incluindo bactérias, fungos, plantas e animais
estocam energia na forma de um polímero de fosfato, que pode conter de três a milhares
de unidades repetidas de fosfato, o qual é denominado de polifosfato inorgânico (PoliPi)
(Kulaev, 2000).
O primeiro isolamento de PoliPi originado de microrganismos ocorreu no final do
século dezoito, quando Libermann obteve, a partir de biomassa de leveduras uma
Lima, M.A.B Aspectos Fisiológicos do Efeito do Cádmio em...
20
substância que se assemelhava à forma de grânulos de volutina ou metacromáticos e por
isso, denominou-os equivocadamente de “metafosfatos” (Harold, 1966).
Estruturalmente, o PoliPi foi descrito como um homopolímero de ortofosfatos
unidos através de ligações fosfoanidrido que termodinamicamente são consideradas de
alta energia. Cada átomo de fósforo é ligado ao vizinho através de dois átomos de
oxigênio, formando uma cadeia linear. O grau de polimerização pode apresentar valores
de duas a milhares de unidades de fosfato (Kulaev et al., 2004).
Figura 2. Estrutura química do polifosfato inorgânico.
Fonte: Reusch, 2000.
Em eucariotos, o PoliPi ocorre principalmente no citoplasma, na superfície
celular, no periplasma e na membrana plasmática (Kulaev, 1979). A diferença básica
entre as células eucarióticas e procarióticas, é o melhor desenvolvimento da
compartimentalização de processos bioquímicos que ocorre em eucariotos, nos quais
estes processos ocorrem em organelas especializadas. Assim como nas bactérias, em
eucariotos o PoliPi está localizado em todos os compartimentos celulares estudados
(Kulaev e Kulakovskaya, 2000).
Vários relatos científicos fundamentam a presença de polifosfato inorgânico em
todos os tipos de células, o que sugere uma função biológica fundamental à vida,
estando a sua função dependente da sua quantidade, localização celular, tamanho da
cadeia e fonte biológica (Kornberg e Ault-Riche, 1999; Kumble e Kornberg, 1995).
Dentre as suas funções podem ser destacadas: reserva de fosfato e energia;
estoque e quelação de metais; formação de canais de membrana; participação no
transporte de fosfato; envolvimento na função e formação do envelope celular; controle
Lima, M.A.B Aspectos Fisiológicos do Efeito do Cádmio em...
21
da atividade gênica, regulação da atividade enzimática e uma função vital em respostas
celulares ao estresse ambiental e na adaptação a fase estacionária de crescimento (Wood
e Clarck, 1988; Kulaev e Kulakovskaya, 2000; Kornberg et al., 1999).
O acúmulo de PoliPi pelos microrganismos apresenta várias implicações
biotecnológicas, médicas e industriais. Um desses processos envolve o acúmulo de
polifosfato por microrganismos submetidos a ciclos alternados anaeróbicos/aeróbicos.
Este fenômeno é a base do processo de tratamento de efluentes contaminados com
fosfato, designado de “remoção melhorada de fosfato biológico” (Kulaev, 2000).
Por outro lado, estudos recentes mostraram que uma mutação no gene que
codifica a polifosfatocinase (ppK), enzima responsável pela síntese do polifosfato,
influencia a motilidade de bactérias patogênicas. Tendo em vista que a motilidade é
essencial para a invasão e o estabelecimento da infecção em um hospedeiro, tal
resultado sugere uma relação entre polifosfato e patogenicidade bacteriana (Rashid e
Kornberg, 2000).
Além disso, a seqüência gênica que codifica a produção da polifosfatocinase em
diversas espécies bacterianas apresenta alto grau de conservação e pode ser considerado
um alvo atrativo para o desenvolvimento de drogas antimicrobianas, pois a homologia
para células animais não tem sido observada (Kornberg et al., 1999).
A lista de microrganismos patógenos que apresentam a seqüência conservada é
ampla, destacando-se: Pseudomonas aeruginosa, Salmonella spp. Vibrio cholerae,
Klebisiella pneumoniae, Helicobacter pylori e Mycobacterium tuberculosis, entre
outros (Rashid et al., 2000).
Lima, M.A.B Aspectos Fisiológicos do Efeito do Cádmio em...
22
2.3.2. Papel do Polifosfato Inorgânico na Tolerância a Metais Pesados
Classicamente, os grânulos contendo polifosfato (grânulos de volutina ou
metacromáticos) foram identificados no início do século XX, com a aplicação da
microscopia óptica. A partir de então, o polifosfato tem sido estudado com o emprego
de diversas técnicas, como por exemplo, microanálise por Raios X, ressonância nuclear
magnética, métodos diferenciados de extração bioquímica e cromatografia (Campos
Takaki et al., 1983; Greenfield et al., 1987; Ohtomo et al., 2004). A partir destes estudos
a composição química dos grânulos de polifosfato foi determinada, evidenciando além
da presença de fósforo, a de muitos metais tais como: Na, K, Ca, Ma, Zn, Ba e Al. Tais
análises suscitaram a dedução de que o polifosfato pode estar envolvido na quelação de
metais (Wood e Clarck, 1988). A capacidade de quelação de metais do ambiente se deve
às propriedades polianiônicas do polifosfato (Kornberg et al., 1999).
Sendo assim, a relação entre PoliPi e estoque/tolerância/detoxificação de metais
pesados tem sido descrita nos últimos anos por muitos autores. Aiking et al., (1984)
demonstraram que Klebsiella aerogenes acumula fósforo durante crescimento na
presença de cádmio. Em Staphylococcus aureus, o PoliPi está envolvido na remoção de
níquel (Gonzalez e Jensen, 1998). Adicionalmente, Pan-Hou et al., (2002) indicam que
o polifosfato está envolvido na resistência ao metal mercúrio e Suresh et al., (1986)
observaram que o polifosfato de superfície de Acinetobacter lwoffi é degradado em
resposta ao cádmio.
Entretanto, evidências sugerem que o PoliPi é degradado durante crescimento na
presença de metais pesados (Keasling e Hupf, 1996). Por outro lado, Keasling et al.,
(1998) afirmam que a habilidade de síntese e degradação do PoliPi é mais importante
para tolerância aos metais pesados do que apenas a capacidade de acumular grande
quantidade de polifosfato intracelular como sustentam alguns estudos.
Lima, M.A.B Aspectos Fisiológicos do Efeito do Cádmio em...
23
Um mecanismo acerca da participação do PoliPi no processo de detoxificação de
metais pesados foi proposto por Keasling (1997), onde o PoliPi presente na membrana
celular seqüestraria o íon metálico e o transportaria para dentro da célula. Por outro
lado, a entrada do metal pesado na célula estimula a atividade de exopolifosfatases, as
quais liberam Pi a partir do PoliPi formando um complexo metal-fosfato que é uma
molécula inerte podendo permanecer dentro ou ser transportada para fora da célula.
Recentes estudos com diferentes microrganismos têm corroborado esta hipótese
(Alvarez e Jerez, 2004; Remonsellez et al., 2006).
A aparente relação entre a presença de PoliPi e o incremento da resistência aos
metais pesados indicam fortemente o potencial de utilização de organismos, selvagens
ou modificados geneticamente para o acúmulo de polifosfato, no processo de
biorremediação de ambientes contaminados com tais poluentes (Keasling et al., 2000).
2.4. ULTRA-ESTRUTURA E CITOESQUELETO DE ACTINA
Os fungos são constituídos pelos principais componentes encontrados nos
demais organismos eucarióticos, não apresentando plastos de qualquer natureza. As
organelas dos fungos são similares àquelas dos demais eucariotos e incluem núcleo,
mitocôndria, retículo endoplasmático, vacúolos, ribossomos, Golgi, inclusões lipídicas e
corpos eletrondensos (Carlile e Watkinson, 1996).
A superfície celular dos fungos é composta por três matrizes contíguas e
interconectadas: componente capsular ou exocelular, a parede celular e a membrana
plasmática. A bicamada lipídica é composta de fosfolipídios e quantidade substancial de
proteínas e esteróis (Griffin, 1994).
Aspectos ultraestruturais de fungos têm sido elementos fundamentais na
pesquisa sobre desenvolvimento e germinação de esporos, interação hospedeiro-
Lima, M.A.B Aspectos Fisiológicos do Efeito do Cádmio em...
24
patógeno, comportamento nuclear, estudos de organelas, assim como no conhecimento
das relações entre estruturas e funções. Por conseguinte, a microscopia eletrônica tem
contribuído sobremaneira na elucidação de diversos aspectos morfológicos e
citoquímicos (Mims et al., 2001 e 2002; Shari’a et al., 2002; Nascimento et al., 2000;
Lima et al. 2003).
Desde as primeiras pesquisas ultraestruturais, os micologistas têm acompanhado
o desenvolvimento das diversas metodologias em todas as áreas da microscopia
eletrônica, e as têm usado como instrumentos geradores de informações sobre a
estrutura de fungos. Sendo assim, aspectos morfológicos ao nível ultra-estrutural
juntamente com dados fisiológicos e bioquímicos possibilitarão maior entendimento
sobre os diversos grupos de fungos (Klomparens, 1990). Nos últimos anos a
microscopia eletrônica vem sendo usada no entendimento da interação dos fungos com
o seu meio e suas formas de adaptação ao estresse ambiental.
Estudos sobre a distribuição e arranjos dos integrantes do citoesqueleto em
diferentes tipos celulares, têm recebido muita atenção atualmente. Em fungos, os
estudos sobre citoesqueleto, mostram que a microscopia óptica tem possibilitado mais
resultados positivos do que a microscopia eletrônica. Na microscopia óptica a utilização
da faloidina, proteína que tem alta afinidade pela actina, complexada ao isotiocianato de
fluoresceína, permite a observação daquele filamento “in situ”. Os elementos do
citoesqueleto podem estar envolvidos na motilidade de organelas ou atuam
direcionando o movimento de vesículas (Carlile e Watkinson, 1996).
Três tipos básicos de filamentos de proteínas são responsáveis pelas atividades
do citoesqueleto: filamentos de actina; microtúbulos e filamentos intermediários. Cada
tipo de filamento é formado por diferentes subunidades protéicas: actina (filamentos de
actina); tubulina (microtúbulos) e uma família de proteínas fibrosas relacionadas –
Lima, M.A.B Aspectos Fisiológicos do Efeito do Cádmio em...
25
vimentina ou laminina (filamentos intermediários) (Alberts et al., 1994). Os fungos
apresentam elementos do citoesqueleto, mas suas funções não estão completamente
elucidadas. Entre os componentes do citoesqueleto, a actina parece ser o mais
importante para o crescimento apical em levedura e fungos filamentosos (Heath, 1990).
Actina tem sido localizado em fungos filamentosos por métodos citoquímicos e
imunocitoquímicos em sítios de formação de parede tais como ápice de hifas e em
locais de formação de septos (Czymmek et al., 1995; Srinivasan et al., 1996).
Dessa forma, estudos que melhorem o conhecimento e a compreensão acerca do
comportamento de microrganismos em resposta a metais pesados são fundamentais o
desenvolvimento das pesquisas em biorremediação.
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38
PRIMEIRO ARTIGO
TOXICIDADE DO CÁDMIO PARA Cunninghamella elegans:
ALTERAÇÕES ULTRA-ESTRUTURAIS E DO CITOESQUELETO DE
ACTINA
Trabalho submetido para publicação no periódico Journal of Basic Microbiology.
Lima, M.A.B Aspectos Fisiológicos do Efeito do Cádmio em...
39
TOXICIDADE DO CÁDMIO PARA Cunninghamella elegans:
ALTERAÇÕES ULTRA-ESTRUTURAIS E DO CITOESQUELETO DE
ACTINA
Marcos Antonio Barbosa de Lima
a, b
, Patrícia Mendes de Souza
a,b
Aline Elebão do Nascimento
a
,
Wanderley de Souza
c
Galba Maria de Campos Takaki
a, b
a
Núcleo de Pesquisas em Ciências Ambientais – Universidade Católica de
Pernambuco, Recife, Pernambuco, Brasil
b
Programa de Pós-Graduação em Biologia de Fungos – Universidade
Federal de Pernambuco, Recife, Pernambuco, Brasil
c
Laboratório de Ultraestrutura Celular, Instituto de Biofísica Carlos
Chagas Filho - Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, RJ,
Brasil
Lima, M.A.B Aspectos Fisiológicos do Efeito do Cádmio em...
40
RESUMO
No presente trabalho, Cunninghamella elegans, fungo filamentoso modelo para
processos de degradação de xenobióticos, foi estudado quanto ao seu comportamento
estrutural frente à presença de cádmio. Para tanto este fungo foi cultivado em presença
de cádmio nas concentrações 5,62mg/L, 11,24mg/L e 22,10mg/L e submetidas ao
estudo por microscopia óptica de fluorescência e por microscopia eletrônica de
transmissão, com uso das técnicas de rotina e citoquímica com vermelho de rutênio. Os
resultados da microscopia de fluorescência revelaram diferenças nos padrões de actina,
relativas à forma, ao arranjo e a distribuição. Por sua vez, a microscopia eletrônica de
transmissão revelou alterações na estrutura fina das amostras, como espessamento das
hifas, aumento da eletrondensidade, variações na estrutura citoplasmática, aumento de
vacuolização e surgimento de inclusões e grânulos eletrondensos. A citoquímica para
vermelho de rutênio revelou a presença de sítios de reação na superfície celular, bem
como no citoplasma, demonstrando que ocorreu alteração na permeabilidade celular. Os
resultados demonstram, pela primeira vez, os efeitos do cádmio sobre a ultraestrutura e
o citoesqueleto de actina deste fungo.
Palavras-Chave: Toxicidade, Cunninghamella elegans; Cádmio; Ultraestrutura;
Citoesqueleto de actina,
Lima, M.A.B Aspectos Fisiológicos do Efeito do Cádmio em...
41
INTRODUÇÃO
Os microrganismos são hábeis em sua afinidade por metais, podendo acumulá-
los, utilizando diversos mecanismos fisiológicos. Estudos no campo da biotecnologia
incluem pesquisas com microrganismos biorremediadores de tais elementos químicos.
Para remoção de metais de efluentes industriais ou domésticos em grande escala
microrganismos altamente eficientes no seqüestro de íons metálicos como bactérias,
fungos, actinomicetos e algas têm sido utilizados. A interação entre microrganismos e
metais pesados pode ter inúmeras implicações para o meio ambiente (Volesky, 1995;
Wang & Yang, 1996; Kratochvil & Volesky, 1998; Gravilesca, 2004).
Todos os organismos desenvolveram mecanismos para lidar com uma ampla
variedade de situações de estresse. Existe uma quantidade substancial de dados acerca
do comportamento de microrganismos sob condições de estresse induzido por metais
sendo avaliados através de atividades enzimáticas, contagem celular, respiração,
determinação de carbono e nitrogênio da biomassa. Os mecanismos para a aparente
resistência/tolerância aos metais estão diretamente ligados aos processos
metabólicos/fisiológicos. Deve ser ressaltado o papel da superfície celular nos
mecanismos de interação com agentes externos para o estabelecimento do
desenvolvimento celular (Gadd, 1993; Hall, 2002; Rosen, 2002; Nies, 1999).
Alguns estudos demonstram que metais pesados induzem o surgimento de
alterações morfológicas em diferentes tipos celulares. A ação do cádmio varia de acordo
com o tempo de incubação e a sua concentração. Tais modificações podem estar
relacionadas a alterações na estrutura/permeabilidade da membrana citoplasmática,
produzindo progressiva alteração de forma e perda de atividade metabólica.
Adicionalmente, íons metálicos reconhecidamente induzem a despolimerização do
Lima, M.A.B Aspectos Fisiológicos do Efeito do Cádmio em...
42
citoesqueleto de actina (Templeton, 2000; L`azou et al., 2002; Kumar & Prasad, 2004;
Deckert, 2005; Zalizniak & Nugegoda, 2006).
O objetivo deste estudo foi examinar em Cunninghamella elegans, fungo
amplamente utilizado como modelo para estudos de biodegradação/biotransformação de
xenobióticos, as modificações induzidas pelo cádmio, ao nível celular, especialmente
sobre o arranjo e a distribuição do citoesqueleto de actina, bem como sobre a estrutura
fina com uso da técnica de rotina e citoquímica com vermelho de rutênio.
Lima, M.A.B Aspectos Fisiológicos do Efeito do Cádmio em...
43
MATERIAIS E MÉTODOS
Microrganismo e Condições de Cultivo – O isolado de Cunninghamella elegans IFM
46109, oriundo da coleção de culturas do Research Center for Pathogenic Fungi and
Microbial Toxicosis, Chiba University/Japan foi mantido em Batata Dextrose Agar
(BDA) a 5
0
C. O fungo foi repicado em meio BDA para produção de esporos e incubado
a 28ºC por 6 dias. Após este período, um total de 10
5
esporos/mL foram coletados e
inoculados no Meio Sintético para Mucorales (SMM) descrito por Hesseltine e
Anderson (1957), acrescido de cloreto de cádmio contendo cádmio nas concentrações
de 5,62 mg/L, 11,24 mg/L e 22,10 mg/L e incubados a 28ºC sob agitação orbital de 150
rpm por 3 dias. Amostras controle foram crescidas no meio SMM sem cádmio nas
mesmas condições descritas acima.
Histoquímica para Citoesqueleto de Actina - Amostras de culturas foram coletadas e
lavadas em tampão salina fosfato (PBS), pH 7,2. Em seguida foram aderidas a lâminas
de vidro cobertas com poli-L-lisina, durante 1 hora a 37
0
C. As células foram fixadas
em solução de paraformaldeído 4% em tampão PBS por 30 minutos a 28ºC. Seguindo-
se novamente lavagem em tampão PBS, duas vezes. Posteriormente as amostras foram
submetidas a permeabilização com uma solução contendo triton X100 0,1% em tampão
PBS, durante 30 minutos a 28ºC e incubada em Faloidina marcada com isotiocianato de
fluoresceína, durante 15 horas a 4
o
C. Posteriormente, as amostras foram novamente
lavadas com PBS, cobertas com solução de albumina 0,1% em PBS e as lâminas
montadas com glicerina tamponada pH 9,2. As amostras assim preparadas foram
observadas em Microscópio de Fluorescência OLYMPUS, BH2 e fotografadas.
Lima, M.A.B Aspectos Fisiológicos do Efeito do Cádmio em...
44
Técnica de Rotina (De Souza, 2000) - Amostras coletadas com três dias de
crescimento, oriundas dos meios de cultura com diferentes concentrações de cádmio,
foram lavadas em solução salina tamponada, pH 7,2, por duas vezes, durante 10
minutos. Em seguida foram fixadas com glutaraldeído 2,5% em tampão fosfato 0,1 M
pH 7,4 durante 1 hora, a 28ºC. Finda a etapa de fixação, todas as amostras foram
novamente lavadas com tampão fosfato, duas vezes durante 10 minutos. Seguiu-se a
pós-fixação com tetróxido de ósmio 1%, em tampão fosfato 0,1 M, durante 1 hora a
28ºC, em condições de escuridão. Em seguida, as amostras foram, mais uma vez
lavadas com tampão fosfato 0,1M, sendo posteriormente destinadas ao processo de
desidratação. Para a desidratação das amostras foi utilizada acetona, em proporções de
50%, 70%, 90% (intervalos de 5 minutos para cada troca) até a proporção de 100% (três
vezes, 10 minutos cada troca). Seguiu-se o processo de embebição com misturas de
acetona e resina epoxi, nas concentrações de 2:1, 1:1, 1:2 (6 horas em cada etapa) e
finalmente resina epoxi pura durante 12 horas. O emblocamento foi realizado com
resina epoxi pura, sendo a polimerização total atingida pela incubação em estufa a 60ºC,
durante 72 horas. Após a polimerização, os blocos foram submetidos a ultramicrotomia,
para obtenção de cortes ultrafinos, os quais foram depositados em grades de cobre com
300 Mesh. As grades contendo as amostras foram observadas e fotografadas ao
microscópio eletrônico de transmissão, JEOL CX-100.
Citoquímica para Detecção de Carboidratos de Superfície (Luft, 1971) - Após a
coleta, as amostras foram lavadas em PBS por duas vezes durante 10 minutos,
seguindo-se a fixação em glutaraldeído 2,5% em tampão cacodilato 0,1Μ, pH 7,2
contendo vermelho de rutênio na concentração de 0,5 mg/mL, durante 1 hora, a 28ºC.
Em seguida, as amostras foram lavadas em tampão cacodilato 0,1Μ, pH 7,2 contendo
Lima, M.A.B Aspectos Fisiológicos do Efeito do Cádmio em...
45
vermelho de rutênio na concentração de 0,5 mg/mL por três vezes durante 5 minutos.
Posteriormente, as amostras foram submetidas a pós-fixação com tetróxido de ósmio
1% em tampão cacodilato 0,1Μ, pH 7,2 contendo vermelho de rutênio na concentração
de 0,5 mg/mL durante 1 hora. Após esse intervalo as amostras foram, mais uma vez,
lavadas em tampão cacodilato 0,1Μ, pH 7,2 contendo vermelho de rutênio na
concentração de 0,5 mg/mL. A partir deste ponto, as amostras foram submetidas aos
processos de desidratação, embebição, emblocamento, ultramicrotomia, observação e
fotomicrografias como descrito no item anterior.
Lima, M.A.B Aspectos Fisiológicos do Efeito do Cádmio em...
46
RESULTADOS
Os resultados obtidos com a microscopia óptica de fluorescência estão
apresentados nas figuras 1-4. Os sítios de ligação do marcador faloidina-FITC aparecem
como estruturas de alta fluorescência. A figura 1 apresenta hifas de C. elegans
cultivadas em meio sem cádmio por três dias. Verificou-se, nas hifas submetidas à
marcação com Faloidina-FITC, padrões diferenciados de forma, arranjo e distribuição
do citoesqueleto de actina, com sítios de marcação fluorescente.
A B
Õ
Õ
Õ
Õ
Õ
Õ
Õ Õ
D C
Õ
Õ
Figura 1. Microscopia de Fluorescência de amostras de Cunninghamella elegans
controle, tratadas com FITC-faloidina. Notar as diferentes formas de apresentação do
citoesqueleto de actina: grumos, filamentos e placas em diferentes áreas das hifas (Õ).
Barra 10µm.
Lima, M.A.B Aspectos Fisiológicos do Efeito do Cádmio em...
47
Pode-se observar fluorescência delineando as paredes celulares, ao longo das
hifas, bem como uma marcação amorfa no citoplasma (figura 1A). Arranjos sob a forma
de placas e filamentos são também visualizados (figuras 1A e D). Arranjos globulares e
em grumos podem ser observados (Figuras 1B e C).
A análise das micrografias de hifas submetidas ao tratamento com 5,62 mg/L de
cádmio permite verificar diferenças em comparação as hifas das culturas controle.
Marcação fluorescente é observada na região citoplasmática associada à parede celular e
essencialmente sob a forma de grumos e placas transversais ao longo das hifas (Figuras
2A-D)
A B
Õ
Õ
Õ
Õ
D
Õ
Õ
Õ
Õ
C
Õ
Õ
Figura 2. Microscopia de Fluorescência de amostras de Cunninghamella elegans
submetidas ao cultivo em presença de 5,62mg/L de cádmio, e tratadas com FITC-
faloidina. Notar as diferentes formas de apresentação do citoesqueleto de actina: grumos
e placas em diferentes áreas das hifas (Õ). Barra 10µm.
Lima, M.A.B Aspectos Fisiológicos do Efeito do Cádmio em...
48
Amostras de hifas submetidas a 11,24 mg/L de cádmio estão apresentadas na
Figura 3A-C. É possível notar que a intensidade da fluorescência é menor do que
àquelas apresentadas pelas hifas controle e hifas tratadas com 5,62 mg/L. Uma
marcação mais amorfa ao longo da parede celular e sob a forma de pequenos grumos,
assim como, filamentos delgados distribuídos irregularmente no citoplasma foi
visualizada nas micrografias.
A B
Õ
Õ
Õ
Õ
Õ
Figura 3. Microscopia de Fluorescência de amostras de Cunninghamella elegans
submetidas ao cultivo em presença de 11,24mg/L de cádmio, e tratadas com FITC-
faloidina. Notar as diferentes formas de apresentação do citoesqueleto de actina: grumos
e filamentos em diferentes áreas das hifas (Õ). Barra 10µm.
Por outro lado, amostras tratadas com 22,10 mg/L de cádmio exibem marcação
fluorecente sob a forma de poucos e pequenos grumos no citoplasma. Intensa marcação
amorfa fluorescente ao longo da hifa é visualizada. Alguns filamentos são também
observados (figura 4A-D).
C
Õ
Õ
C
Õ
Lima, M.A.B Aspectos Fisiológicos do Efeito do Cádmio em...
49
A B
Õ
Õ
Õ
Õ
Õ
Õ
Õ
Õ
D
Õ
C
Õ
Õ
Figura 4. Microscopia de Fluorescência de amostras de Cunninghamella elegans
submetidas ao cultivo em presença de 22,10mg/L de cádmio, e tratadas com FITC-
faloidina. Notar as diferentes formas de apresentação do citoesqueleto de actina:
grumos, filamentos, placas e “caps” em diferentes áreas das hifas (Õ). Barra 10µm.
O estudo ultraestrutural foi realizado para verificar os possíveis efeitos do
cádmio sobre a estrutura fina de C. elegans, com uso da técnica de rotina. As amostras
controle exibem citoplasma homogêneo e com poucos vacúolos. A parede celular
apresenta-se delgada e eletrondensa (Figuras 5A-D).
Lima, M.A.B Aspectos Fisiológicos do Efeito do Cádmio em...
50
A
B
*
Figura 5. Eletromicrografias de amostras de Cunninghamella elegans controle, técnica
de rotina. Parede Celular (
*
); Membrana Citoplasmática (x); Vacúolos ().
Observa-se um aumento no número de grânulos no citoplasma das hifas expostas
ao tratamento com 5,62mg/L de cádmio. Adicionalmente, intensa distribuição de
granulação eletrondensa é observada em todo o citoplasma ao redor de vacúolos, bem
como na região da membrana citoplasmática. Nota-se que o citoplasma se apresenta
intensamente vacuolizado (Figura 6A-C).
x
D
*
370ηm
710ηm
500ηm
500ηm
*
C
*
Lima, M.A.B Aspectos Fisiológicos do Efeito do Cádmio em...
51
A B
§
§
w
§
§
Figura 6. Eletromicrografias de amostras de Cunninghamella elegans cultivada em
5,62mg/L de cádmio, técnica de rotina. Parede Celular (
*
); Membrana Citoplasmática
(x); Vacúolos (); Grânulos (¨).
Células submetidas ao cultivo em presença de 11,24mg/L de cádmio exibem
parede celular com maior eletrondensidade e inúmeros grânulos são observados nas
suas diferentes camadas, bem como na região da membrana citoplasmática. O
citoplasma apresenta-se vacuolizado e extremamente heterogêneo (Figura 7A-B).
§
§
§
§
370ηm
*
710ηm
710ηm
*
*
C
Lima, M.A.B Aspectos Fisiológicos do Efeito do Cádmio em...
52
©
A B
*
§
¨
§
x
¨
¨
370ηm
500ηm
¨
Figura 7. Eletromicrografias de amostras de Cunninghamella elegans, cultivada em
11,24 mg/L de cádmio, técnica de rotina. Parede Celular (
*
); Membrana Citoplasmática
(x); Vacúolos (); Grânulos (¨).
Amostras tratadas com 22,10mg/L de cádmio apresentam citoplasma altamente
heterogêneo e irregularmente granular. Pontos eletrondensos são visualizados na
membrana citoplasmática e na parede celular (Figura 8A-C).
Lima, M.A.B Aspectos Fisiológicos do Efeito do Cádmio em...
53
A B
Ø Ø
¨
Ø
¨
Ø
Ø
Figura 8. Eletromicrografias de amostras de Cunninghamella elegans, cultivada em
22,10 mg/L de cádmio, técnica de rotina. Parede Celular (
*
); Membrana Citoplasmática
(x); Vacúolos (); Grânulos (¨); Corpos Eletrondensos (Ø).
Uma análise citoquímica utilizando o vermelho de rutênio foi realizada para
verificar o efeito do cádmio sobre a composição de carboidratos ácidos da superfície
celular, bem como para identificar possíveis efeitos do metal na permeabilidade da
membrana citoplamática. Os resultados obtidos estão apresentados nas figuras 9 -12.
Ø
Ø
¨
x
370ηm
500ηm
*
*
*
370ηm
C
Ø
Lima, M.A.B Aspectos Fisiológicos do Efeito do Cádmio em...
54
A figura 9A-C exibe hifas de culturas controle. O uso do marcador permite
observar a presença de produtos de reação citoquímica na superfície externa da parede
celular. Tal marcação apresenta-se sob a forma de grânulos isolados e eletrondensos,
bem como sob a forma de um delgado depósito distribuído de forma irregular na
superfície das hifas. Adicionalmente, produtos de reação são observados na face interna
da membrana citoplasmática.
Ð
Ð
A B
Ð
Ð
Î
x
*
Ð
Ð
Ð
710ηm
500ηm
710ηm
C
Ð
*
Figura 9. Eletromicrografias de amostras de Cunninghamella elegans, cultura controle,
técnica citoquímica com vermelho de rutênio. Parede Celular (
*
); Membrana
Citoplasmática (x); Vacúolos (); Produtos de Reação (Ï).
Lima, M.A.B Aspectos Fisiológicos do Efeito do Cádmio em...
55
Hifas cultivadas em presença de 5,62mg/L de cádmio apresentam superfície
celular intensamente marcada. Nota-se que todas as camadas da parede celular exibem
produtos de reação homogeneamente distribuídos. Tais produtos apresentam-se como
fibrilas e grânulos. Intensa marcação também é visualizada na região da membrana
citoplasmática. Produtos de reação são visualizados na face citoplasmática da
membrana e dispersos no citoplasma (Figura 10A-B).
A B
Î
Î
Í
y
Î
Í
Ï
Í
*
*
Í
500ηm
370ηm
Figura 10. Eletromicrografias de amostras de Cunninghamella elegans, cultura tratada
com 5,62 mg/L de cádmio, técnica citoquímica com vermelho de rutênio. Parede
Celular (
*
); Membrana Citoplasmática (x); Vacúolos (); Produtos de Reação (Ï).
O tratamento das hifas com 11,24mg/L de cádmio resultou em uma redução da
intensidade de marcação na superfície da parede celular. Inúmeras estruturas
membranosas no citoplasma apresentam depósitos de alta densidade eletrônica. Intensa
marcação é observada na região do citoplasma abaixo da membrana. Grandes inclusões
de alta eletrondensidade, próximos a membrana citoplasmática, são também
Lima, M.A.B Aspectos Fisiológicos do Efeito do Cádmio em...
56
visualizados. Pequenas granulações eletrondensas são observadas distribuídas pelo
citoplasma (Figura 11A–D).
Í
A B
Í
Î
Ð
Í
*
Î
Î
Î
Î
Î
Î
Î
C D
►
x
370ηm
710ηm
370ηm
250ηm
*
Î
Figura 11. Eletromicrografias de amostras de Cunninghamella elegans, cultura tratada
com 11,24mg/L de cádmio, técnica citoquímica com vermelho de rutênio. Parede
Celular (
*
); Membrana Citoplasmática (x); Vacúolos (); Produtos de Reação (Ï).
A figura 12A-D apresenta células expostas a 22,10mg/L de cádmio. Nota-se
intensa deposição de produtos de reação na membrana celular. Na parede celular uma
Lima, M.A.B Aspectos Fisiológicos do Efeito do Cádmio em...
57
fina deposição regularmente distribuída é percebida. Grânulos de alta densidade
eletrônica são notados por todo o citoplasma.
A B
Î
*
Î
Î Î
Î
Î
Î
Î
Î
C D
x
x
*
Ï
100ηm
150ηm
250ηm
710ηm
*
Figura 12. Eletromicrografias de amostras de Cunninghamella elegans, cultura tratada
com 22,10mg/L de cádmio, técnica citoquímica com vermelho de rutênio. Parede
Celular (
*
); Membrana Citoplasmática (x); Vacúolos (); Produtos de Reação (Ï).
Pode-se, dessa forma verificar que o cultivo em presença de cádmio induziu
alterações no comportamento do citoesqueleto de actina, bem como na composição de
Lima, M.A.B Aspectos Fisiológicos do Efeito do Cádmio em...
58
carboidratos ácidos da parede celular e na permeabilidade da membrana citoplasmática
das células expostas. Tais variações, sem dúvida, estão diretamente associadas à
concentração do metal utilizado.
DISCUSSÃO
A sobrevivência em um ambiente contaminado com metais pesados, ao longo do
tempo, induziu nos microrganismos a habilidade de crescimento, a qual pode resultar de
mecanismos intrínsecos ou induzidos (resistência/tolerância). Dessa forma, estudos que
culminem com o entendimento do comportamento desses organismos em presença de
metais são fundamentais para propósitos de remediação (Gadd, 1993; Nies, 1999).
A ligação de metais a superfície celular, seqüestro via proteínas ou
polipeptídeos, ou complexação em vacúolos poderia minimizar os efeitos tóxicos dos
metais nas células, em função da diminuição de sua efetiva concentração intracelular
(Gomes, 1998; Gadd, 1993; Hall, 2002). Contudo, esses mecanismos de tolerância são
pouco entendidos.
Inúmeros estudos associados ao processo de sorção de metais por
microrganismos revelam variações em relação às respostas nas habilidades de
crescimento, tolerância, e resistência, que dependem diretamente do tipo de metal, de
sua concentração e de espécie microbiana. Além do mais, o potencial de sorção é
também avaliado em função da idade das células, da temperatura ambiente e dos
mecanismos específicos de captação de metal pelas células. Paralelamente, alguns
estudos demonstram que o contato com metais pesados induz alterações morfológicas
em microrganismos, observadas essencialmente, como variações na permeabilidade das
membranas e na habilidade de acumulação intracelular (Kapoor & Viraraghavan 1995;
Lima, M.A.B Aspectos Fisiológicos do Efeito do Cádmio em...
59
Burgstaller, 1997; Gardea-Torresdey et al., 1997; Levyal et al., 1997; Blaudez et al.,
2000).
O cádmio é um íon metálico divalente que exibe potente toxicidade para muitos
tipos celulares e organismos (Bhattacharyya et al., 2000; Jarup, 2002). Nas células
renais induz um rearranjo do citoesqueleto de actina em cultura de células e as estimula
a contrair de forma irregular (L'Azou et al., 2002; Takahashi et al., 2004).
Os mecanismos comuns de toxicidade celular do cádmio verificados em
eucariotos ocorrem através de danos oxidativos a macromoléculas importantes, tais
como aumento na peroxidação de lipídeos e inibição de enzimas anti-oxidativas como
superóxido dismutase e a glutation redutase (Stohs & Bagchi, 1995; Bhattacharyya et
al., 2000; Waisberg et al., 2003).
Fungos filamentos servem como organismos modelo para uma série de
mecanismos e processos celulares. Entre estes, estudos acerca do crescimento e da
morfogênese são fundamentais. O crescimento celular depende diretamente da expansão
apical da hifa, que é um processo complexo, que envolve interações reguladas entre a
síntese e a expansão da parede celular e membrana plasmática, diversos movimentos
intracelulares e a regulação da turgência. O citoesqueleto é o principal agente regulador
e integrador desses processos. Dentre os elementos do citoesqueleto, os filamentos de
actina contribuem para a morfogênese, transporte e exocitose de vesículas para a parede
celular, localização de proteínas de membrana, forma do ápice da hifa, secreção de
enzimas e a marcação do posicionamento para expansão apical. Dessa forma,
modificações nesse componente do citoesqueleto poderiam culminar com modificações
nas taxas de crescimento e na morfologia micelial (Shari’a et al., 1999; Bartnicki-Garcia
et al., 2000; Heath et al., 2000).
Lima, M.A.B Aspectos Fisiológicos do Efeito do Cádmio em...
60
Os resultados obtidos neste trabalho demonstram que o cultivo em presença de
cádmio resultou em variações de forma, arranjo e distribuição de actina nas hifas, como
observado através da marcação com a faloidina-FITC. Sendo assim, demonstra-se, pela
primeira vez o citoesqueleto de actina de C. elegans.
A dinâmica da polimerização e tipos de actina é essencial para a polarização
celular e morfogênese (Wendland, 2001). A polarização do citoesqueleto de actina no
ápice das hifas é requerida para seu crescimento, o que significa que qualquer alteração
na dinâmica de polimerização entre as diferentes formas da actina resultaria em
diferentes formas de expansão apical e, portanto alterações no crescimento (Wendland,
2001). A polarização resultaria no agrupamento da actina cortical sob a forma de placas
na região do ápice da hifa, no processo de secreção de novos polímeros para a região e,
sua conseqüente expansão (Momany, 2002).
Os resultados apresentados demonstraram que os arranjos de actina e sua
distribuição são dependentes da concentração de cádmio, e que quanto maior a
concentração de cádmio, hifas mais curtas, ramificadas e espessas são visualizadas. Tal
dado sugere o motivo pelo qual o crescimento polarizado dos ápices das hifas é
visivelmente reduzido nas amostras tratadas em relação ao controle. Paralelamente, as
formas de apresentação do citoesqueleto de actina também foram modificadas pelo
cultivo em presença do metal, indicando que a dinâmica de polimerização da actina é
essencial para a expansão das hifas.
Por outro lado, embora poucos sejam os estudos com fungos, dados sobre o
comportamento da morfologia celular em função da presença de metais pesados são
relatados. Por exemplo, a presença de cobre em meio de cultura induziu alterações
morfológicas em Mucor rouxii. A ligação do metal via mecanismo passivo, permite a
observação do surgimento de grupos químicos funcionais na superfície celular, o que
Lima, M.A.B Aspectos Fisiológicos do Efeito do Cádmio em...
61
conduz a uma alta habilidade de ligação e conseqüentemente a variações na morfologia
celular, gerando micélios altamente ramificados e encurtados (Gardea-Torresdey et al.,
1997).
Uma extensa ramificação nas hifas de C. elegans foi observada quando do
cultivo em presença de cádmio. Contudo, tal processo de modificação na morfologia
micelial é relativa a concentração do íon metálico e foi visualizado nas amostras
submetidas a microscopia de fluorescência.
A introdução da microscopia eletrônica como ferramenta para a análise da
estrutura fina de inúmeros tipos celulares, sem dúvida, trouxe uma melhor compreensão
do comportamento celular em função da composição química e física do ambiente.
Alguns efeitos do cádmio sobre a estrutura celular são conhecidos. Alterações
associadas à intensa vacuolização, atividade enzimática, condensação do citoplasma,
aumento da eletrondensidade da matriz citosólica, redução de cristas mitocondriais,
plasmólise e condensação da matriz cromatínica são citadas (Park e Lees, 2004; Pawert
et al., 1996; Nishikawa, 2003).
O emprego do método de rotina para microscopia eletrônica de transmissão
permitiu detectar variações na estrutura fina de C. elegans em função do cultivo em
presença de diferentes concentrações de cádmio. Variações relativas a eletrondensidade,
estrutura do citoplasma, vacuolização e comportamento da superfície celular foram
visualizadas neste estudo, corroborando os dados da literatura e, demonstrando pela
primeira vez tal comportamento nesta espécie.
A acumulação intracelular de metais está intimamente associada com parede
celular e vacúolos, porém outras organelas e estruturas celulares também podem ser
envolvidas (Blackwell, 1995). No presente estudo foi observado que durante cultivo na
presença de concentrações crescentes de cádmio, as hifas exibiram muitos corpos
Lima, M.A.B Aspectos Fisiológicos do Efeito do Cádmio em...
62
eletrondensos, além de intensa granulação no citoplasma, no interior de vacúolos,
associados à parede celular e membrana citoplasmática.
Nishikawa et al., (2003), demonstraram a presença de depósitos de cádmio na
membrana citoplasmática e principalmente em vacúolos da microalga Clamydomonas
acidophila. Além disso, Cunningham et al. (1993), observaram que Clostridium
thermoaceticum apresentou grande quantidade de precipitado eletrondenso durante
crescimento na presença de cádmio, e propuseram ser este um mecanismo utilizado para
mediar a resistência ao metal. Neste sentido, Aiking et al. 1984, também observaram o
surgimento de muitas partículas eletrondensas no citolplasma de Klebsiella aerogenes
durante seu crescimento na presença do cádmio.
Sendo assim, pode-se inferir que as granulações encontradas em diferentes
regiões celulares de C. elegans sejam devido à precipitação de cádmio. Todavia, é
necessário determinar a composição química desses grânulos para demonstrar que C.
elegans é capaz de utilizar a precipitação como mecanismo de tolerância ao cádmio.
Sabe-se que a quantidade de cádmio ligada à superfície celular pode representar
uma substancial fração do metal que é acumulado pelo micélio e pode ser parte dos
mecanismos pelos quais os fungos podem tolerar os metais. Foi demonstrado que
modificações químicas nas paredes celulares isoladas podem modificar a habilidade de
acumulação de íons metálicos (Kappor e Viraraghavan, 1995). O bloqueio de
grupamentos amino, carboxílicos ou hidroxílicos reduzem a quantidade de íons
acumulados, indicando que os mesmos exibem papel essencial na ligação de metal
(Brady e Duncan, 1994). Adicionalmente, o cádmio foi encontrado ligado a sítios
negativamente carregados associados com componentes da parede celular como quitina,
celulose e melanina (Galli et al., 1994; Turnau et al. 1994). Sem dúvida, os polímeros
de superfície são essenciais na habilidade de captação de metais do meio. Contudo, a
Lima, M.A.B Aspectos Fisiológicos do Efeito do Cádmio em...
63
maioria dos estudos está relacionada aos polímeros extraídos das células e não aos
mesmos nas células vivas.
Estudo bioquímico das variações na distribuição subcelular de cádmio em fungo
demonstram que o metal localiza-se na parede celular, no citoplasma e em vacúolos
(Blaudez et al., 2000).
Em leveduras, a toxicidade e a acumulação de cádmio estão relacionadas à
produção de glicoproteínas extracelulares. Foi demonstrado que durante o período de
adaptação dos organismos a presença do metal ocorre uma variação na composição de
polímeros de superfície celular através de análises bioquímicas e por espectrometria.
A habilidade de resistência/tolerância e acumulação de metais está associada a
composição sacarídica dos exopolímeros da parede celular que determinam a forma de
sorção e captação, e que gera adaptação dos organismos a presença de altas
concentrações de metais (Bartinicki-Garcia et al., 2000).
O vermelho de rutênio corresponde a um complexo catiônico positivamente
carregado, e que foi introduzido nos protocolos de microscopia eletrônica por Luft
(1964). O marcador apresenta habilidade de produzir excelente definição e localização
de polissacarídeos em células vegetais e animais. Adicionalmente, por ser excluído do
citoplasma em presença de membrana íntegra, o composto tem sido aplicado em ensaios
para avaliar possíveis alterações de permeabilidade e fluidez. Neste estudo, a utilização
do vermelho de rutênio foi realizada com o intuito de verificar uma possível alteração
na permeabilidade, bem como variações no perfil de polímeros da parede celular de
hifas submetidas ao tratamento com cádmio. Uma busca na literatura revela poucos
trabalhos com a citoquímica para vermelho de rutênio em fungos.
Variações na composição, distribuição e quantidade de polímeros de paredes
celulares de fungos são comuns (Bartinicki-Garcia, 1968). Carboidratos nas superfícies
Lima, M.A.B Aspectos Fisiológicos do Efeito do Cádmio em...
64
de parede celular de fungos, com o emprego de técnicas citoquímicas aplicando-se,
especialmente, lectinas como marcadores, são relatados (Souza, 1989).
Os dados obtidos no estudo ultraestrutural revelam variações na marcação
citoquímica de polímeros de superfície, sugerindo que o cultivo em presença de cádmio
induz alterações na expressão/composição de polímeros da superfície celular de C.
elegans. Ressalte-se que tal variação está diretamente relacionada a concentração do
metal no meio de cultivo.
Considerando que nos resultados obtidos no presente trabalho produtos de
reação citoquímica foram visualizados no citoplasma, pode-se sugerir que ocorre
variação na permeabilidade das hifas.
Nascimento et al., (2000) analisaram os efeitos do Tween 80 sobre a
ultraestrutura de Candida lipolytica e verificaram que o surfactante sintético induz
variações na distribuição de polímeros da superfície celular. Ocorre variação no padrão
de marcação da superfície celular como resposta a presença do surfactante.
Após sua entrada nas células, os íons metálicos são compartimentalizados,
estrategicamente, em diferentes organelas subcelulares (vacúolos e mitocôndrias). No
entanto, as estratégias são diferentes para metais essenciais e não-essenciais. Para os
essenciais, limitações na internalização, ativa excreção e estocagem em forma inerte, ou
excreção do metal estocado são comumente observadas. Por outro lado, para os não-
essenciais a estocagem é uma alternativa fundamental, onde a concentração interna
aumenta com a elevação da concentração no meio (Vivjer et al., 2004).
Estudos associados ao comportamento do citoesqueleto de actina e à citoquímica
ultraestrutural em fungos são escassos. Dessa forma, análises mais sistematizadas
devem ser realizadas para ampliar o conhecimento acerca das respostas ao nível celular
Lima, M.A.B Aspectos Fisiológicos do Efeito do Cádmio em...
65
de sistemas para biorremediação. Dessa forma, o presente trabalho é o primeiro a relatar
os efeitos do cádmio sobre a actina e estrutura fina de Cunninghamella elegans.
AGRADECIMENTOS
Os autores são gratos ao CNPq, FINEP, PRONEX e a CAPES pelo suporte técnico e
financeiro para desenvolvimento do presente estudo.
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SEGUNDO ARTIGO
ACUMULAÇÃO E DEGRADAÇÃO DE POLIFOSFATO POR
Cunninghamella elegans EM RESPOSTA AO CÁDMIO
Trabalho a ser submetido para publicação no periódico Brazilian Journal of
Microbiology.
Lima, M.A.B Aspectos Fisiológicos do Efeito do Cádmio em...
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ACUMULAÇÃO E DEGRADAÇÃO DE POLIFOSFATO POR
Cunninghamella elegans EM RESPOSTA AO CÁDMIO
Marcos Antonio Barbosa de Lima
1,2
, Patrícia Mendes de Souza
1,2
Aline Elesbão do Nascimento
1
, Galba Maria de Campos Takaki
1,2
1. Núcleo de Pesquisas em Ciências Ambientais - Universidade Católica de
Pernambuco (UNICAP), Recife, PE, Brasil.
2. Programa de Pós-Graduação em Biologia de Fungos - Departamento de
Micologia Universidade Federal de Pernambuco (UFPE), Recife, PE,
Brasil.
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RESUMO
Recentemente tem sido postulado que o polifosfato pode participar na tolerância
de algumas bactérias e algas a metais pesados. Para avaliar esta possibilidade em
Cunninghamella elegans, microrganismo capaz de acumular grande quantidade de
fósforo na forma de polifosfato, este fungo foi cultivado na presença de concentrações
crescentes de cádmio. C. elegans foi capaz de crescer no meio contendo concentrações
de cádmio de 5,62mg/L, 11,24mg/L 22,10mg/L. Nestas condições C. elegans consumiu,
respectivamente 18%, 18% e 15% a mais de fósforo e produziu quantidade de biomassa
aproximadamente igual às células que cresceram na ausência do cádmio. Por outro lado,
foram constatadas alterações das frações do polifosfato em função do tempo de cultivo e
concentração inicial de cádmio. A fração ácido-insolúvel do polifosfato exibiu maior
grau de variação de seu conteúdo em resposta ao aumento do metal no meio de cultivo.
A importância das distintas frações de polifosfato na capacidade de tolerância de C.
elegans ao cádmio é discutida.
Palavras-chave: Cunninghamella elegans, Polifosfato, Acumulação, Cádmio,
Tolerância
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INTRODUÇÃO
O Polifosfato (PoliPi) é um polímero linear formado por resíduos de ortofosfato,
unidos por ligações fosfoanidrídicas, termodinamicamente equivalentes ao fosfato de
alta energia do Tri-Fosfato de Adenosina (ATP) e pode conter de três a mais de mil
resíduos de fosfato (1).
A maioria dos microrganismos estudados, incluindo bactérias, cianobactérias,
fungos, protozoários e algas acumulam polifosfato, o qual pode atingir 10-20% do peso
seco da célula (1,2). A ubiqüidade deste polímero, a sua produção em quantidades que
excedem os requerimentos de fosfato fisiológico, bem como a necessidade de grande
investimento de energia metabólica para sua produção, sugere que o polifosfato tem
funções específicas e fundamentais à vida (3-4).
O metabolismo do PoliPi em microrganismos oscila muito em função das
condições ambientais resultando em uma variação dinâmica de concentração de 100 a
mais de 1000 vezes. Esta marcante variabilidade de conteúdo conseqüentemente afeta
muitas funções celulares (5-6).
O processo de extração com vários reagentes pode dividir o polifosfato em distintas
frações, as quais diferem em localização celular e peso molecular (1,2). A diferença de
localização pode resultar em funções distintas (7). Estudos têm demonstrado que o
conteúdo e o comprimento das cadeias das diferentes frações do PoliPi depende da fase
de crescimento (8), assim como das condições de cultivo (9, 10).
Muitas funções biológicas para o PoliPi têm sido sugeridas ou demonstradas, como:
tampão para álcalis, quelante de metais, controle da expressão gênica, bomba de fosfato,
regulador para respostas celulares ao estresse e para sobrevivência na fase estacionária
de crescimento (3-7). Recentemente, o PoliPi tem associado a tolerância de
microrganismos a metais pesados tóxicos.
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Cunninghamella elegans espécie reconhecida devido a sua capacidade de degradar
xenobióticos recalcitrantes danosos ao meio ambiente. Além do mais, Lima et. al. (9)
demonstraram que C. elegans pode acumular grande quantidade de polifosfato.
Sendo assim, o presente trabalho, tem como objetivo investigar a tolerância de
C. elegans ao cádmio e o possível envolvimento do metabolismo do polifosfato neste
processo.
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MATERIAIS E MÉTODOS
Métodos Microbiológicos
Microrganismo e condições de cultivo: Cunninghamella elegans IFM 46109
gentilmente cedida pela coleção de culturas do Research Center for Pathogenic Fungi
and Microbial Toxicosis, Chiba University/Japan foi mantida em BDA (Batata Dextrose
Agar) a 5°C e transferida para o mesmo meio em intervalos de seis meses. O meio BDA
também foi usado para esporulação a 28°C, durante 5 dias. Uma Suspensão de esporos
com concentração de 10
5
células/mL foi preparada e transferida para frascos de
Erlenmeyer de 125 mL de capacidade contendo 50 mL de Meio Sintético para
Mucorales (SMM) descrito por Hesseltine and Anderson (11) acrescido de solução de
cloreto de cádmio nas concentrações de 5,62mg/L; 11,24mg/L e 22,10mg/L. Culturas
controle foram crescidas no meio original sem a preseça de cádmio. Os frascos foram
incubados durante 15 dias, a 28°C, sob agitação orbital de 250 rpm. Todos os
experimentos foram realizados usando três réplicas.
Curvas de crescimento: A biomassa coletada nos intervalos de 3, 6, 9, 12 e 15 dias de
crescimento foram submetidas a liofilização e mantidas em dessecador a vácuo até peso
constante. O valor final obtido correspondeu a média aritimética de três réplicas de cada
amostras.
Métodos Analíticos
Determinação de fósforo: Alíquotas do sobrenadante de cultura foram coletadas nos
intervalos de 3, 6, 9, 12 e 15 dias de crescimento. O consumo de fosfato foi determinado
segundo o método de Fiske e Subbaro (12). Uma curva padrão foi construída usando
solução de fosfato de potássio (0.5 to 5.0 g/L). O valor final correspondeu a média
aritimética de três réplicas.
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Extração das frações de polifosfato: A extração seqüencial do polifosfato foi realizada
de acordo com o método descrito por Smirnov et al. (13). Uma quantidade padronizada
de biomassa seca (100mg) foi tratada inicialmente com 3mL de ácido perclórico 0,5N a
0ºC por 30 minutos. O extrato resultante foi centrifugado a 12.000g a temperatura de
0ºC por 5 minutos. O sobrenadante correspondeu a fração ácido-solúvel do PoliPi. O
resíduo foi ressuspenso em hidróxido de sódio 0.05 N, pH 12, a 0°C por 30 minutos e a
fração álcali-solúvel do PoliPi foi obtida depois da centrifugação a 12.000g, sob a
temperatura de 0ºC por 5 minutos. O resíduo remanescente foi novamente tratado com
ácido perclórico 0,5 N por 30 minutos, a 90°C e a fração ácido-insolúvel do polifosfato
foi obtida por centrifugação a 12.000g, por 5 minutos, a temperatura de 27ºC. O
conteúdo de ortofosfato e fósforo lábil foram determinados nas frações ácido-solúvel e
álcali-solúvel. A quantidade de fósforo lábil, considerada polifosfato, foi determinada
pela diferença do conteúdo do ortofosfato (Pi) antes e após a hidrólise em HCl a 100°C
por 45 minutos de acordo com o método de Macgrath e Quinn (14). O fosfato liberado
foi determinado pelo método de Fiske e Subbarow (12). O polifosfato total corresponde
a soma das três frações obtidas.
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RESULTADOS
Na figura 1 observa-se os efeitos de diferentes concentrações de cádmio no
crescimento de C. elegans.
0
1
2
3
4
5
6
7
0 3 6 9 12 15
Tempo (dias)
Biomassa seca (g/L)
Figura 1. Crescimento de C. elegans na presença de cádmio. Amostras controle (-♦-) e
tratadas com cádmio nas concentrações 5,62mg/L (-■-), 11,24mg/L (-▲-) e 22,10mg/L
(--).
A curva de crescimento controle exibiu fase exponencial até o terceiro dia e
estacionária do sexto ao décimo quinto dia de incubação. Por outro lado, as culturas
submetidas ao tratamento com cádmio não apresentaram as fases típicas de crescimento,
mas sim um crescimento ascendente, contínuo e linear durante todo o tempo de cultivo
(figura 1). Todavia, pode-se observar que houve uma diminuição da taxa de crescimento
proporcional a concentração inicial do metal e ao tempo de cultivo, quando o fungo é
cultivado na presença de cádmio. Sendo assim, a redução mais drástica no crescimento
ocorreu após 3 dias, na concentração inicial de 22,10mg/L de cádmio, correspondendo a
83% em comparação ao crescimento controle.
A partir do sexto dia de cultivo, a diferença de crescimento entre as culturas
controle e tratadas com cádmio diminuiram progressivamente até o final do cultivo. Por
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conseguinte, a produção final de biomassa foi 5,8g/L para amostras controle, 5,4g/L;
5,8g/L; e 4,5g/L; respectivamente para as concentrações de 5,62mg/L; 11,24mg/L e
22.10mg/L de cádmio. Dessa forma, as distintas concentrações de cádmio limitaram
circunstancialmente o crescimento de C. elegans, porém não o inibiram.
Com relação as curvas de consumo de fósforo (figura 2), observou-se uma
diminuição contínua ao longo do crescimento, tanto das culturas controle quanto das
cultivadas com cádmio. Entretanto, até o terceiro dia de cultivo as culturas controle
consumiram mais fósforo do que àquelas tratadas com todas as concentrações do metal.
Por conseguinte, a partir do sexto dia de crescimento em diante o micélio de C. elegans
cultivado com cádmio passou a consumir mais fósforo do que o grupo de células
controle.
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
0369121
Tempo (dias)
Concentração de fosfato mg/dL
5
Figura 2. Consumo de fósforo inorgânico por C. elegans na presença de cádmio.
Amostras controle (-♦-) e tratadas com cádmio nas concentrações 5,62mg/L (-■-),
11,24mg/L (-▲-) e 22,10mg/L (--).
Observou-se ainda que, no nono dia de crescimento as culturas crescidas nas
concentrações de 5,62mg/L e 11,24mg/L de cádmio esgotaram quase que
completamente o fósforo disponível no meio de cultura. Ao final do crescimento o
consumo total de fósforo pelas culturas controle correspondeu a 80%, ao passo que, o
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das culturas tratadas com cádmio nas concentrações de 5,62mg/L, 11,24mg/L e
22,10mg/L foi de 99%, 99% e 95%, respectivamente.
0
50
100
150
200
1234
Frações do PoliPi
PoliPi, m
g
Pi/
g
Biom assa
3 dias 6 dias 9 dias 12 dias 15 dias
0
50
100
150
200
1234
Frações do PoliPi
PoliPi, m
g
p
i/
g
Biom assa
3 dias 6 dias 9 dias 12 dias 15 dias
B
A
0
50
100
150
200
1234
Frações do PoliPi
PoliPi
,
m
g
Pi/
g
Biom assa
3 dias 6 dias 9 dias 12 dias 15 dias
0
50
100
150
200
250
1234
Frações do PoliPi
PoliPi
,
m
g
Pi/
g
biom assa
3 dias 6 dias 9 dias 12 dias 15 dias
C D
Figura 3. Frações do polifosfato durante crescimento de C. elegans em diferentes
concentrações de cádmio. Amostras controle (A) e tratadas com cádmio nas
concentrações 5,62mg/L (B), 11,24mg/L (C) e 22,10mg/L (D). Fração ácido-solúvel
(1), Fração base-solúvel (2), Fração ácido-insolúvel (3), PoliPi total (4).
Para verificar o efeito do cádmio no metabolismo do polifosfato, os níveis deste
polímero foram determinados durante o crescimento de C. elegans em meio de cultivo
sem e com cádmio em diferentes concentrações (Figura 3A-3D).
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A figura 3A, apresenta o comportamento das frações do polifosfato durante
crescimento de C. elegans na ausência de cádmio (culturas controle). Pode-se observar
que a fração álcali-solúvel foi acumulada ao longo do crescimento atingindo um pico
máximo de 122,5mgPi/g de biomassa. Em contraste, não ocorreram variações
significativas das frações ácido-solúvel e ácido-insolúvel ao longo do crescimento.
Portanto, está evidente a prevalência da fração álcali-solúvel, sendo a fração que mais
contribuiu para o conteúdo do polifosfato total. Dessa forma o comportamento do
polifosfato total é determinado pela fração álcali-solúvel.
Por outro lado, durante crescimento na presença de 5,62mg/L de cádmio (figura
3B), observou-se degradação da fração álcali-solúvel, cujo valor máximo foi 53%
menor do que o obtido na ausência do metal. Nesta condição, destaca-se que os níveis
da fração ácido-insolúvel aumentaram muito alcançando um pico de 97,3mg Pi/g de
biomassa, ou seja 58% superior ao apresentado na ausência do cádmio. Ao mesmo
tempo, a fração ácido-solúvel diminui ao longo do tempo, todavia continua a exibir
valores inferiores aos das outras frações.
Com o aumento da concentração de cádmio para 11,24mg/L (figura 3C), a
fração álcali-solúvel voltou a predominar, muito embora com pico máximo de 98mg
Pi/g de biomassa, valor inferior ao exibido no controle. Entretanto, ao longo do tempo
observou-se que a mesma foi continuamente degradada até o final do cultivo. Mais uma
vez o comportamento da fração total foi influenciado pela fração álcali-solúvel. A
fração ácido-insolúvel retornou aos níveis semelhantes das culturas controle durante
todos os intervalos de crescimento. Paralelamente, a fração ácido-solúvel, da mesma
forma que na condição anterior, diminui ao longo do tempo, todavia continua a exibir
valores inferiores aos das outras frações.
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Por fim, na concentração de cádmio de 22,10mg/L (figura 3D), não observou-se
alteração significativa da concentração álcali-solúvel, quando comparado com a
condição anterior, que praticamente não oscila durante todo o crescimento. Enquanto
que, a fração ácido-insolúvel apresenta níveis praticamente iguais ao da fração álcali-
solúvel considerando a concentração média do todo o crescimento, a fração ácido-
solúvel não foi detectada nos intervalos de 12 e 15 dias de crescimento.
DISCUSSÃO
Os efeitos tóxicos do cádmio sobre os microrganismos são bem conhecidos e
envolvem vários mecanismos, como ligação a biomoléculas (enzimas e ácido
desoxirribonucléico - ADN) e indução de estresse oxidativo. Dessa maneira, os metais
interferem com muitos processos fisiológicos diferentes de acordo com sua
concentração. Estes efeitos resultam, principalmente, na diminuição das taxas de
crescimento e/ou inibição total, assim como morte celular (15,16).
Entretanto, muitos microrganismos exibem a habilidade de crescer em altas
concentrações de metal tóxico o que pode ser resultado de mecanismos intrínsecos ou
induzidos, bem como, de fatores ambientais que podem reduzir a toxicidade do metal
(17).
O cádmio alterou o padrão de crescimento normal da bactéria Sphingomonas
paucimobilis, de modo que não se observou as fases típicas de crescimento. Além disso,
o cádmio foi inibitório uma vez que não se observou aumento de crescimento no meio
com metal (18). Adicionalmente, o cádmio tem efeito limitante e inibitório para as
características de crescimento de muitas espécies de fungos (19-21).
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Os resultados deste estudo demonstram que C. elegans cresce continuamente na
presença de diferentes concentrações de cádmio, produzindo ao final de 15 dias de
cultivo 5,4g/L, 5,8g/L e 4,5g/L de biomassa, nas concentrações de cádmio de 5,62mg/L,
11,24mg/L e 22,10mg/L, respectivamente contra 5,8g/L do grupo controle. Portanto, C.
elegans foi capaz de resistir ao cádmio até a concentração de 22.10mg/L, o que sugere o
desenvolvimento de adaptação fisiológica ao metal.
Em adição, a produção de biomassa de C. elegans em presença de cádmio foi
igual ou superior à produção da maioria dos fungos relatados por Massaccesi et al. (19),
crescendo em concentração de 10mg/L de cádmio. Além disso, Souza et al. (22)
revelam que C. elegans crescendo em meio contendo 2mM de cobre produziu 57,3% a
mais de biomassa do que as culturas controle.
Os microrganismos empregam uma série de mecanismos diferentes para
adaptação aos metais pesados (23). Aiking et al. (24), sugere que acumulação de fosfato
por Klebsiella aerogenes é um mecanismo de detoxificação do cádmio.
Podemos observar nesta pesquisa que as culturas tratadas com cádmio, a partir
do sexto dia de cultivo, período em que as curvas de crescimento começaram a
apresentar forte ascensão, exibiram maior consumo de fósforo do que a culturas
controle. Ao final do cultivo, as células cultivadas nas concentrações de 5,62mg/L,
11,24mg/L e 22,10mg/L consumiram 18%, 18% e 15% a mais de fósforo
respectivamente, do que a cultura controle.
É importante ressaltar que mesmo com crescimento 53% inferior às culturas
controle, a cultura tratada com 22,10mg/L de cádmio, no nono dia de crescimento,
exibiu consumo 17% superior ao controle. Sendo assim, está evidente que o
requerimento de fósforo pelas células cultivadas na presença de cádmio foi muito maior
do que a cultura do grupo controle. Também está evidente que os níveis de fósforo
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consumidos pelas células cultivadas com cádmio, e que exibiram baixa taxa de
crescimento, excedem as necessidades fisiológicas normais. Dessa forma, tais resultados
sugerem que o fósforo está sendo usado para suportar o crescimento do fungo na
presença do metal. Por conseguinte, pode-se sugerir que o fósforo esteja envolvido no
processo de detoxificação de cádmio em C. elegans.
Aiking et al. (24), afirmam que a acumulação de fosfato por Klebsiella
aerogenes, durante crescimento em meio com cádmio, pode ser considerada um
mecanismo primário de detoxificação, uma vez que pode ocorrer a formação de fosfato
de cádmio, sal pouco solúvel que pode precipitar diminuindo assim a toxicidade do
metal. Nishikawa et al. (31), demonstraram que Chlamydomonas acidophila apresentou
depósitos eletrondensos no interior de vacúolos, constituído de cádmio e fosfato,
quando do crescimento na presença deste metal.
Os microrganismos, incluindo os fungos, estocam fosfato principalmente na
forma de um polímero denominado de polifosfato. Em termos fisiológicos, o polifosfato
em fungos, tem sido considerado de acordo com sua solubilidade em ácido. Assim
obtêm-se o polifosfato solúvel e insolúvel em ácido, entretanto outras frações podem ser
identificadas dependendo da sua solubilidade em outros solventes (2,4,25).
Neste trabalho foi utilizado, com sucesso, o método descrito em Smirnov et al.
(13), o qual permitiu a extração de três distintas frações do polifosfato: fração ácido-
solúvel; fração ácido-insolúvel e fração álcali-solúvel.
Em fungos, o polifosfato está localizado na parede celular, citoplasma e
vacúolos, assumindo diferentes funções de acordo com sua localização (4).
Campos-Takaki et al. (26), revelaram a presença de polifosfato nas paredes de
espécies de Zygomycetes com o emprego da análise por Raios X. Paralelamente,
Shari’a et al. (27), demonstraram a presença de polifosfato na superfície celular,
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membrana citoplasmática, vacúolos e citoplasma de três espécies de Zygomycetes. Por
outro lado, Lima et al. (9), detectaram polifosfato na forma de grânulos elétrondensos
em diferentes compartimentos celulares de C. elegans, como parede celular, vacúolos,
membrana e citoplasma.
Embora as funções fisiológicas do polifosfato não tenham sido totalmente
comprovadas, recentemente este polímero tem sido associado à tolerância de
microrganismos a metais pesados. Tem sido sugerido que os microrganismos usam o
polifosfato para detoxificar os metais pesados (28,29).
Os resultados obtidos demonstraram pela primeira vez o comportamento das
distintas frações do polifosfato em C. elegans cultivada em meio com cádmio. Portanto
os dados aqui apresentados indicam que a participação na tolerância a metais, não é
característico para todas as frações do polifosfato.
Não há consenso na literatura a respeito da forma como o polifosfato
desempenha seu papel na tolerância aos metais pesados.
Inicialmente, devido à capacidade do polifosfato quelar metais, foi proposto que
a capacidade de acumular grande quantidade deste polímero seria suficiente para reduzir
a toxicidade dos metais e assim determinar a resistência de um microrganismo (2). Pan-
Hou et. al. (30) obtiveram resultados que corroboram esta hipótese.
Recentemente, evidências experimentais suscitaram duas novas hipóteses para
explicar a relação do polifosfato com resistência a metais. A primeira afirma que a
habilidade de degradar polifosfato a ortofosfato é tão importante para tolerância a
metais quanto a capacidade de estocá-lo. Por outro lado, mais recentemente, tem sido
proposto que a habilidade de síntese e degradação também é importante no processo de
tolerância a metais. Evidências para ambas as hipóteses têm sido demonstradas (31-35).
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Os resultados aqui obtidos demonstraram alterações das frações do polifosfato
em função do tempo de crescimento e principalmente da concentração de cádmio. No
tocante ao polifosfato total, que consiste na soma das três frações, constatou-se que a
concentração média do polímero ao longo do crescimento aumentou 6,3% na presença
de 5,62mg/L do metal, reduziu 6,3% em 11,24mg/L e culminou com aumento de 20%
em 22,10mg/L de cádmio. Estes resultados estão em concordância com a última
hipótese, haja vista que, observou-se um balanço entre síntese e degradação do
polifosfato de acordo com o aumento da concentração do cádmio.
Com base na concentração média do cádmio durante o crescimento, verificou-se
que a fração ácido-insolúvel apresentou maior grau de flutuação em função do aumento
do conteúdo do cádmio no meio de cultura. Na concentração inicial de cádmio de
5,62mg/L, os níveis desta fração do polifosfato aumentaram 139% em comparação com
as culturas controle, seguido de uma marcante redução de 50% quando da elevação do
cádmio para 11,24mg/L e finalizando com um novo aumento de 85% em 22,10mg/L de
cádmio.
Por conseguinte as frações de polifosfato que exibiram os maiores níveis de
flutuação, em termos de concentração média durante crescimento, em ordem
decrescente foram: fração ácido-insolúvel > álcali-solúvel > ácido-solúvel. Portanto,
podemos inferir que a fração ácido-insolúvel está envolvida no processo de tolerância
de C. elegans ao cádmio. Todavia, estudos mais aprofundados precisam ser realizadas
para confirmar tais resultados e esclarecer a importância relativa de cada fração do
polifosfato na tolerância a metais.
AGRADECIMENTOS
Os autores agradecem a CAPES, CNPq, FINEP e UNICAP pelo suporte técnico
e financeiro.
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91
TERCEIRO ARTIGO
REMOÇÃO E ACUMULAÇÃO DE CÁDMIO POR
Cunninghamella elegans EM CRESCIMENTO CONTÍNUO
Trabalho a ser submetido para publicação no periódico Bioresource Tecnology.
Lima, M.A.B Aspectos Fisiológicos do Efeito do Cádmio em...
92
REMOÇÃO E ACUMULAÇÃO DE CÁDMIO POR
Cunninghamella elegans EM CRESCIMENTO CONTÍNUO
Marcos Antonio Barbosa de Lima
a, b
, Bruno Esteves Távora
a
,
Aline Elesbão do Nascimento
a
,
Arminda Saconi Messias
a
Kazutaka Fukushima
c
, Galba Maria de Campos Takaki
a, b
a
Núcleo de Pesquisas em Ciências Ambientais – Universidade Católica de
Pernambuco, Recife, Pernambuco, Brasil.
b
Programa de Pós-Graduação em Biologia de Fungos – Universidade
Federal de Pernambuco, Recife, Pernambuco, Brasil.
c
Centro de Pesquisas em Toxicoses Microbianas e Fungos Patogênicos –
Universidade de Chiba, Chiba, Japão.
Lima, M.A.B Aspectos Fisiológicos do Efeito do Cádmio em...
93
Resumo
O fungo filamentoso Cunninghamella elegans tem sido largamente utilizado devido sua
habilidade de metabolizar substâncias xenobióticas e recalcitrantes nocivas ao meio
ambiente. Neste sentido, o presente trabalho objetivou avaliar a capacidade de remoção
e acumulação de cádmio do meio de cultura por C. elegans. Os resultados obtidos
revelaram que o total de cádmio removido foi dependente da concentração usada. C.
elegans removeu 92-95% do cádmio adicionado ao meio de cultura ao final do tempo
experimental. A acumulação celular do cádmio correspondeu a 75% do metal removido
e a taxa de sorção máxima foi 290mg do metal/g de biomassa. Os resultados obtidos
nesta pesquisa são superiores aos encontrados na literatura, indicando que C. elegans
tem grande potencial de utilização em biorremediação in situ e ex situ de metais, em
especial o cádmio.
Palavras-Chave: Metais Pesados; Cádmio; Sorção; Acumulação; Cunninghamella
elegans
Lima, M.A.B Aspectos Fisiológicos do Efeito do Cádmio em...
94
1. Introdução
A poluição ambiental causada por metais pesados tóxicos devido ao
desenvolvimento industrial é um dos mais importantes problemas deste século. Em
particular, o cádmio é um poluente danoso a vários ecossistemas e para saúde humana.
O cádmio, junto com chumbo, tem sido reconhecido como um dos maiores problemas
de saúde pública e ambiental. Em humanos, o cádmio pode causar insuficiência renal e
pulmonar, lesões ósseas e hipertensão (Jarup et al., 1998; Sharma, 1995). Além do mais,
este metal é um agente carcinogênico, embriotóxico, teratogênico e mutagênico (Satoh
et al., 2002; Waalkes, 2000). As principais fontes de contaminação por cádmio são as
indústrias de pigmentos, plásticos e de baterias (Holan et al., 1993; Volesky et al.,
1993).
A descontaminação de metais pesados do solo e da água de áreas próximas a
indústrias tem sido um grande desafio. O uso de microrganismos para remoção de
metais de locais contaminados tem recebido atenção cada vez maior (Vieira e Volesky,
2000). A alta eficiência e baixo custo em concentrações reduzidas de metais fazem dos
processos biotecnológicos, os mais vantajosos em comparação aos métodos físico-
químicos empregados na remoção de metais (Gomes, 1998; Gupta et al. 2000)
.
Alguns microrganismos são capazes de tolerar e remover metais pesados
(Gomes, 1998; Volesky and Holan, 1995). A capacidade de sorção de metais por
microrganismos tem atraído grande atenção devido ao seu potencial de prover uma
alternativa econômica e eficiente quando comparado aos processos convencionais de
remediação de ambiente contaminado com metais pesados (Lloyd and Lovley, 2001).
Os microrganismos capazes de crescer na presença de metais pesados e que apresentem
uma significativa capacidade de sorção têm potencial de utilização em biorremediação
(Gadd, 1993; Kapoor and Viraraghavan, 1995). Microrganismos vivos e mortos ou seus
Lima, M.A.B Aspectos Fisiológicos do Efeito do Cádmio em...
95
derivados podem ser usados para remoção de metais pesados de efluentes (Baik et al.,
2002; Franco et al., 2004).
Entretanto, células vivas e em crescimento apresentam a vantagem de remoção
ativa contínua de metais pesados após adsorção física e potencial de otimização por
manipulação genética (Malik, 2004; Volesky e Holan, 1995). Os fungos, assim como
outros microrganismos, podem acumular metais do ambiente. Além do mais, os fungos
são capazes de crescer, produzir grande quantidade de biomassa usando meio de
crescimento de baixo custo e ao mesmo tempo pode ser manipulado geneticamente e
morfologicamente (Kapoor e Viraraghavan, 1995). Adicionalmente, relatos demonstram
que os fungos são mais tolerantes aos metais pesados do que as bactérias (Rajapaksha
et. al., 2004).
Todavia, há carência de informações acerca da habilidade de sorção de metais
pesados por Cunninghamella elegans. Esta espécie de fungo, membro representativo da
Ordem Mucorales, tem sido muito estudada, devido a sua capacidade de metabolizar
xenobióticos, incluindo hidrocarbonetos aromáticos policíclicos, corantes téxteis e
várias drogas farmacêuticas (Cerniglia et al., 1984; Zhang et al., 1996; Pothuluri et al.,
1998; Ambrosio et al., 2004). Portanto, esta pesquisa teve como objetivo investigar as
propriedades de sorção de cádmio de C. elegans.
Lima, M.A.B Aspectos Fisiológicos do Efeito do Cádmio em...
96
2. Métodos
2.1. Microrganismo e condições de cultivo
Cunninghamella elegans IFM 46109 gentilmente cedida pela coleção de
culturas do Research Center for Pathogenic Fungi and Microbial Toxicosis, Chiba
University- Japan, foi mantida em BDA (Batata Dextrose Agar) a 5°C, sendo
transferida para BDA a cada intervalo de seis meses. O BDA também foi usado para
esporulação a 28°C, durante 5 dias.
Suspensão de esporos na concentração de 10
5
células/mL foi preparada e
transferida para frascos de Erlenmeyer de 125 mL de capacidade contendo 50 mL de
Meio Sintético para Mucorales (SMM) descrito por Hesseltine and Anderson (1957)
acrescido de cloreto de cádmio nas concentrações de 5.62mg/L; 11.24mg/L e
22.10mg/L. As culturas controle foram crescidas no meio original sem cádmio. Os
frascos foram incubados durante 15 dias, a 28°C sob agitação de 250 rpm. Todos os
experimentos foram realizados usando três réplicas.
2.2. Cinética de remoção de cádmio
Para avaliar a remoção de cádmio pelo micélio de C. elegans, amostras de
sobrenadante de cultura foram coletadas em intervalos de 3, 6, 9, 12 e 15 dias de
cultivo. A concentração do metal foi determinada por espectrofotometria de absorção
atômica, com lâmpada específica para cádmio e em comprimento de onda específico.
Uma curva padrão foi produzida. Experimentos foram conduzidos em triplicata e os
valores médios foram usados na análise. O percentual de remoção de cádmio foi
calculado através da seguinte relação: concentração de cádmio removido/concentração
de cádmio inicial x 100.
Lima, M.A.B Aspectos Fisiológicos do Efeito do Cádmio em...
97
A eficiência de remoção de metal pesado, q (mg metal/g biomassa seca) foi
calculada usando a seguinte equação: q = (C
0
-
C
f
)/m, onde C
0
e C
f
são a concentração
inicial e final do metal (mg/L), respectivamente e m a biomassa seca (g).
2.3. Acumulação de cádmio
O cádmio presente no micélio de C. elegans foi avaliado. A biomassa coletada
com 3 e 6 dias de incubação na presença de cádmio em diferentes concentrações foi
lavada três vezes com ácido tetrácetico etilenodiamina (EDTA) na concentração de
0.1M, durante 10 minutos. Após este período, a biomassa foi seca e digerida com uma
solução ácida constituída por ácido nítrico (HNO
3
)
e
perclórico
(HClO
4
) concentrado na
proporção de (9:1), durante 6 h a 150°C. Em seguida, o material digerido foi diluído
com HCL 1N e analisado para determinação do cádmio por espectrofotometria de
absorção atômica. Estes experimentos foram realizados em triplicata e os valores
médios foram usados.
Lima, M.A.B Aspectos Fisiológicos do Efeito do Cádmio em...
98
3. Resultados e discussão
3.1. Remoção de cádmio
A figura 1 apresenta a evolução do percentual de remoção de cádmio em
diferentes concentrações iniciais em função do tempo.
0
20
40
60
80
100
03691215
Tempo (dias)
% de remoção de cádmio
5,62mg/L
11,24mg/L
22,10mg/L
Fig. 1. Percentual de remoção de cádmio do meio de cultura por C. elegans.
Uma análise da figura 1 mostra que o processo de sorção pode ser dividido em
dois estágios. O primeiro estágio da cinética de sorção para a concentração inicial do
metal de 5.62mg/l terminou ao terceiro dia de contato sendo responsável por 78% do
cádmio removido. Para as maiores concentrações do metal, 11.24mg/l e 22.10mg/l, o
primeiro estágio da cinética de sorção foi mais longo, correspondendo a seis dias de
contato, onde 78% e 70% do cádmio adicionado foi removido, respectivamente.
Estes resultados confirmam informações da literatura as quais têm demonstrado
que células metabolicamente ativas quando utilizadas para remoção de metais
apresentam um padrão de sorção bifásico. No estágio inicial a taxa de sorção é muito
alta e ocorre em um curto período de tempo, no segundo estágio a taxa de sorção é
muito baixa e ocorre em um período de tempo maior e sua contribuição para a sorção
total de metal é muito pequena (Donmez and Aksu, 2001; Malik, 2004).
Lima, M.A.B Aspectos Fisiológicos do Efeito do Cádmio em...
99
A taxa de sorção de cádmio foi dependente da concentração inicial do metal,
variando proporcionalmente com o conteúdo do cádmio usado. O percentual de
remoção de cádmio ao final do tempo experimental foi 95%, 92% e 92% para as
concentrações iniciais 5.62 mg/L, 11.24 mg/L e 22.10mg/L de cádmio, respectivamente.
A mais alta remoção de cádmio de 95% ocorreu na menor concentração inicial
do metal usado, 5.62mg/L. Entretanto, o valor máximo da capacidade de remoção foi
obtido com a concentração de 22.1 mg/L (maior concentração inicial) de cádmio, e
correspondeu a 20.4 mg/L em 15 dias. Assim sendo, a taxa de remoção de cádmio foi
inversamente proporcional a concentração de metal inicial.
Comportamento semelhante foi obtido por Devars et al. (1998). Além disso,
esses autores demonstraram que duas cepas de Euglena gracilis, alga fotossintética,
foram capazes de remover apenas 67% e 64% de cádmio do meio nas concentrações
inicias de 50μM ou 5,62 mg/L e 100μM ou 11,24mg/L, respectivamente. Nestas
mesmas concentrações iniciais a remoção de cádmio por C. elegans foi 28% maior.
Massaccesi et al. (2002), estudando a capacidade de remoção de cádmio de 7
espécies de fungos filamentosos do solo, isolados de uma área industrial poluída com
metais pesados, durante crescimento em meio com 10mg/L de cádmio, observaram que
o percentual máximo de remoção do metal ficou em torno de 70%. Resultado inferior ao
apresentado por C. elegans na presença da mesma concentração de cádmio.
Neste sentido, dentre 8 espécies de leveduras utilizadas para remoção de cádmio,
na concentração de 22mg/L, do meio de cultivo, a maior taxa de remoção correspondeu
a 29% obtida pela espécie Sporobolomyces roseus (Breierova et al., 2002).
Matsunaga et al. (1999) demonstraram que a capacidade máxima de remoção de
cádmio de 5 cepas de Cianobactérias foi 10,8% e de 19 cepas da alga verde Chlorella
correspondeu a 48,7%. Os resultados obtidos neste trabalho evidenciam que C. elegans
Lima, M.A.B Aspectos Fisiológicos do Efeito do Cádmio em...
100
exibe uma grande capacidade de remoção de cádmio em concentrações tóxicas deste
metal.
A sorção do cádmio atingiu o equilíbrio em doze dias de incubação, em todas as
concentrações iniciais utilizadas, indicando que o tempo de equilíbrio foi independente
da concentração de metal inicial. O tempo de equilíbrio depende do tipo de biomassa,
metal utilizado e estado fisiológico da biomassa, variando segundo estes parâmetros.
Aksu e Kutsal, 1991 e Nourbakhsh et al., 1994 apresentaram valores para o tempo de
equilíbrio os quais variam de 15 minutos a mais dez dias.
Neste trabalho, embora a maior quantidade de cádmio tenha sido removida nos
intervalos iniciais de incubação, 3 e 6 dias, o equilíbrio só foi alcançado no décimo
segundo dia.
3.2. Eficiência de remoção do cádmio
A Figura 2 mostra a relação entre a concentração de metal biosorvido e a
biomassa produzida. A eficiência de remoção foi determinada através da equação: q =
(C
0
-
C
f
)/m. As isotermas de equilíbrio não foram determinadas, porque o fungo está
metabolicamente ativo, assim a sorção do cádmio pode não ficar restrita a fenômeno de
superfície.
Lima, M.A.B Aspectos Fisiológicos do Efeito do Cádmio em...
101
0
50
100
150
200
250
300
350
3 6 9 12 15
Tempo (dias)
q (mg Cd/g biomassa seca)
5,62mgCd/L
11,24mgCd/L
22,1mgCd/L
Fig. 2. Eficiência de remoção de cádmio por C. elegans.
Os resultados demonstraram que o valor de q aumentou com a elevação na
concentração inicial de cádmio. A mais alta eficiência de remoção ocorreu nos estágios
iniciais de incubação, ou seja, nos intervalos de 3 e 6 dias. Após este período, o valor de
q declinou continuamente com o tempo experimental, como resposta a diminuição da
proporção cádmio/biomassa. A sorção máxima do cádmio correspondeu a 290mg/g no
terceiro dia de experimento.
Recentemente, Malik (2004) em uma revisão bibliográfica relatou que a
eficiência máxima de sorção de cádmio para vários fungos foi 184mg/g para a espécie
Gliocladium roseum. Em adição, Kapoor e Viraraghavan (1995) divulgaram valores de
remoção máxima de cádmio que variaram entre 0.4 and 71mg/g para várias espécies de
fungos. Volesky e Holan (1995) observaram que o maior nível de remoção de cádmio
por Saccharomyces cerevisiae ocorreu durante a fase exponencial de crescimento e
correspondeu a 70mg Cd/g.
Massacesi et al. (2002), relataram que a eficiência máxima de remoção de
cádmio por 7 espécies de fungos foi pouco mais de 180mg Cd/g e Doyle et al. (1975)
observaram que Aspergillus niger foi capaz de remover 154,8mg Cd/g de biomassa.
Lima, M.A.B Aspectos Fisiológicos do Efeito do Cádmio em...
102
O desempenho na sorção de cádmio pelo micélio de C. elegans quando
comparado aos resultados divulgados na literatura citada anteriormente pode ser
considerado promissor, haja vista os altos valores obtidos neste estudo.
Por outro lado, El-Morsy (2004) observou que a biomassa de Cunninghamella
echinulata é capaz de remover com alta eficiência metais como Pb, Cu e Zn de soluções
aquosas. Além do mais, Franco et al., (2004) demonstraram que quitina e quitosana
extraída de C. elegans apresentou excelente desempenho de remoção de íons de Pb
+2
,
Fe
+2
e Cu
+2
.
3.3. Acumulação celular do cádmio
Os resultados de acumulação de cádmio por C. elegans são apresentados na
figura 3. As células foram lavadas com EDTA antes da análise sugerindo acumulação
intracelular.
0
50
100
150
200
250
5.62 mg Cd/L 11.24 mg Cd/L 22.10 mg Cd/L
Cádmio (mg/g biomassa seca)
Fig. 3. Acumulação de cádmio por C. elegans. 3 dias (coluna cinza clara) e 6 dias
(coluna cinza escura) de contato com 5.62 mg/L, 11.24 mg/L e 22.10mg/L de cádmio.
A acumulação de cádmio pelas hifas aumentou com a concentração de metal
externa, porém não com o tempo de incubação, exceto para a concentração inicial de
Lima, M.A.B Aspectos Fisiológicos do Efeito do Cádmio em...
103
5.62mg/l. Dessa maneira, nas concentrações de 11.24mg/L e 22.10mg/L de cádmio
houve saturação da biomassa com de 3 dias de cultivo.
Padrão de acumulação de cádmio similar foi reportado por Nishikawa et al.,
(2003) usando a microalga Chlamydomonas acidophila. Entretanto a taxa de
acumulação foi muito baixa quando comparada aos dados obtidos neste trabalho com C.
elegans. Costa and Duta (2001) testando diferentes espécies de Bacillus também
observaram um aumento de sorção relacionado a concentração inicial de cádmio no
meio.
A acumulação máxima de 212mg/g foi obtida pelas células tratadas com
22.10mg/l de cádmio em seis dias de incubação. Este valor correspondeu a 75% do
cádmio sorvido, indicando que o principal processo de remoção de cádmio por C.
elegans foi bioacumulação.
Entre os microrganismos, várias espécies de fungos estão sendo estudadas ou já
estão sendo utilizados em processos de remediação de metais pesados. O potencial de
remoção de metais pesados de soluções aquosas de espécies pertencentes aos gêneros
Aspergillus, Penicillium, Trichoderma, Neurospora, Rhizopus, Mucor e Saccharomyces
têm sido descrito por diversos autores (Kapoor and Viraraghavan, 1995; Kapoor et al.,
1999; Plaza et al., 1996; Yan and Viraraghavan, 2003).
A espécie C. elegans exibiu a habilidade de acumular cádmio quando
metabolicamente ativo. Malik (2004) relatou que células em crescimento ativo têm
várias vantagens de utilização em remediação de metais do que células inativas.
Neste trabalho, a capacidade de C. elegans remover e acumular cádmio foi
avaliada pela primeira vez, indicando o seu potencial como um biosistema para
bioremediação.
Lima, M.A.B Aspectos Fisiológicos do Efeito do Cádmio em...
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4. Conclusões
Neste estudo, um isolado de C. elegans metabolicamente ativo foi usado com
sucesso para remoção e acumulação de cádmio. C. elegans foi capaz de remover 92-
95% do cádmio do meio de cultura. Paralelamente, exibiu uma eficiência de remoção de
290mg/g em meio de cultura contendo 22.10mg/L de metal após 3 dias de incubação.
Além do mais, os resultados deste estudo mostraram que este fungo foi capaz de
acumular 75% do cádmio sorvido.
Agradecimentos
Os autores agradecem a CAPES, CNPq, FINEP e UNICAP pelo suporte técnico e
financeiro.
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CONCLUSÕES GERAIS
PRIMEIRO ARTIGO
# O cultivo em presença de cádmio induziu o surgimento de variações na forma,
arranjos e distribuição do citoesqueleto de actina em C. elegans;
# As variações no citoesqueleto foram diretamente proporcionais à concentração do
metal;
# O cádmio induziu alterações de eletrondensidade, vacuolização, na textura do
citoplasma e no surgimento de inclusões e granulações citoplasmáticas;
# O cádmio induziu variações na expressão/distribuição de carboidratos ácidos na
superfície das células;
# O cádmio alterou a permeabilidade da membrana citoplasmática, uma vez que foi
observada a existência de produtos de reação citoquímica para o vermelho de rutênio no
citoplasma das células tratadas com este metal.
SEGUNDO ARTIGO
# Cunninghamella elegans é capaz de resistir e crescer em meio de cultura contendo
cádmio na concentração de 22,10mg/L;
# O requerimento de fosfato em Cunninghamella elegans aumenta durante o
crescimento na presença de cádmio em diferentes concentrações;
# As distintas frações do polifosfato exibiram variações em seu conteúdo em resposta ao
cádmio;
# A fração ácido-insolúvel do polifosfato apresentou maior grau de variação de seu
conteúdo em presença do cádmio.
Lima, M.A.B Aspectos Fisiológicos do Efeito do Cádmio em...
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TERCEIRO ARTIGO
# O fungo filamentoso Cunninghamella elegans tem grande capacidade de remover e
acumular cádmio de meio de cultura;
# Cunninghamella elegans demonstrou elevado coeficiente de remoção (q) de cádmio
de meio de cultura.
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