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Fábio Sérgio Barbosa da Silva
Fase assimbiótica, produção, infectividade e
efetividade de fungos micorrízicos arbusculares (FMA)
em substratos com adubos orgânicos
Recife
Fevereiro/2006
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Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
2
Universidade Federal de Pernambuco
Centro de Ciências Biológicas
Departamento de Micologia
Pós-Graduação em Biologia de Fungos
(Nível Doutorado)
Fábio Sérgio Barbosa da Silva
Fase assimbiótica, produção, infectividade e efetividade de fungos
micorrízicos arbusculares (FMA) em substratos com adubos orgânicos
Tese apresentada ao Curso de Pós-
graduação em Biologia de Fungos da
Universidade Federal de Pernambuco,
como parte dos requisitos para obtenção
do grau de Doutor.
Área de concentração:
Micologia Aplicada
Orientadora:
Dra. Leonor Costa Maia
Co-orientadora:
Dra. Adriana M. Yano-Melo
Recife
Fevereiro/2006
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Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
3
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
4
“Para ser grande, sê inteiro: nada
Teu exagera ou exclui.
Sê todo em cada coisa. Põe quanto és
No mínimo que fazes.
Assim em cada lago a lua toda
Brilha, porque alta vive“
(Do Poema Para Ser Grande, Ricardo Reis).
À minha mãe (in memorian)
Dedico
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
5
Agradecimentos
A Deus, pela dádiva de estar vivo e saudável e pelo fortalecimento diante das
adversidades e caminhos tortuosos, indispensáveis para o amadurecimento
espiritual.
À espiritualidade amiga, por me fortalecer diante dos obstáculos e me
direcionar a prática do bem.
À minha querida e amada mãe (in memorian) pelo exemplo de humildade,
perseverança e amor.
À minha família pelo imenso apoio.
À Coordenação de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pela concessão da
bolsa de estudos.
À Dra. Leonor Costa Maia, pela orientação e ensinamentos desde o início da
caminhada entre os fungos micorrízicos, confiança depositada e por ter acreditado na
minha capacidade interior.
À Dra. Adriana Mayumi Yano-Melo, pela imensa ajuda em todas as etapas da
Tese, por sempre acreditar que poderia ir mais longe.
Aos professores do Programa, pelos conhecimentos transmitidos, em especial
à Dra. Sandra Farto Botelho Trufem e ao Dr. José Luiz Bezerra.
À Embrapa Semi-Árido, pelo uso das instalações para condução e avaliação
dos experimentos em campo.
Ao Dr. Natoniel Franklin de Melo, pelo auxílio e discussões valiosas durante a
idealização e desenvolvimento dos experimentos em campo.
Ao Dr. Geraldo Milanez de Resende, pela imprescindível ajuda nas
recomendações para adubação, delineamento experimental e análise dos dados dos
ensaios em campo.
À Dra. Sônia Valéria Pereira, pela transmissão de conhecimentos sobre
atividade microbiana.
Ao Dr. Luiz Balbino Morgado, pela permanência no Laboratório de
Microbiologia do solo (Embrapa Semi-Árido).
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
6
À Dra. Tereza Correia, por disponibilizar o Lab. de Glicoproteínas para análise
de glomalina, bem como pelas sugestões.
À Dra. Uided Maaze Tibúrcio Cavalcante, pela disponibilidade em ajudar,
especialmente, nas análises estatísticas.
Ao pesquisador Venézio Felipe dos Santos, pelo auxílio com análises
estatísticas da Tese.
À Dra. Lindete Martins, pela amizade e conversas agradáveis.
Aos funcionários do Campo Experimental de Bebedouro e do Laboratório de
Biotecnologia (Embrapa Semi-Árido), pelo auxílio indispensável na condução e
avaliação dos experimentos em campo.
À Michele Dalvina, pela solicitude, paciência e ajuda na purificação da
glomalina.
À Aline Melo, Danielle Karla e Nicácio Freitas, pela ajuda dispensada e
inúmeros momentos de descontração, deixando o trabalho mais agradável.
À Maryluce Albuquerque pelo apoio nos momentos difíceis e pela sincera
amizade demonstrada em vários momentos desta caminhada.
À Helena M. Q. Bezerra, pela várias referências bibliográficas conseguidas.
Aos colegas do Laboratório de Micorrizas pelo convívio.
Por fim, a todos que de alguma forma contribuíram para a conclusão deste
trabalho.
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
7
SUMÁRIO
Pág.
LISTA DE FIGURAS
XI
LISTA DE TABELAS
XIV
RESUMO GERAL
XVIII
ABSTRACT
XX
INTRODUÇÃO GERAL
22
CAPÍTULO 1 – REVISÃO GERAL
28
1. Adubação orgânica na agricultura 29
2. Atividade microbiana em solos com fertilizantes orgânicos 33
2.1. Atividade de hidrólise do diacetato de fluoresceína (FDA) 37
2.2. Evolução de CO
2
39
3. Simbiose micorrízica arbuscular 41
3.1. Papel de FMA na atividade microbiana em solos com adubo orgânico 43
3.2. Glomalina 44
3.3. Germinação de FMA em substratos orgânicos 49
3.4. Colonização intra e extraradicular por FMA em solos com adubo
orgânico 54
3.5. Eficiência de FMA em solos com resíduos orgânicos 62
4. Produção de inóculo de FMA 66
4.1. Considerações gerais 66
4.2. Uso de resíduos orgânicos para produção de inóculo de FMA 71
4.3. Infectividade e estocagem de inóculo 73
5. Seleção de inoculantes de FMA para aplicação na agricultura 76
6. A cultura do maracujazeiro-doce 81
7. Referências Bibliográficas 88
CAPÍTULO 2 - Production and infectivity of inoculum of arbuscular
mycorrhizal fungi multiplied in a substrate supplemented with Tris-HCl
buffer 143
Abstract
145
Introduction
146
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
8
Material and methods
147
Results
148
Discussion
149
Acknowledgements
152
References
152
CAPÍTULO 3 - Utilização de resíduos orgânicos na produção de inóculo e na
infectividade de fungos micorrízicos arbusculares após estocagem 156
Resumo
158
Introdução
159
Material e métodos
160
Resultados
163
Discussão
168
Agradecimentos
171
Referências Bibliográficas
171
CAPÍTULO 4 - Partially purified extract of glomalin stimulates in vitro
growth of Gigaspora albida mycelia 176
Abstract
178
Introduction
179
Material and methods
180
Results
181
Discussion
181
Acknowledgements
185
References
185
CAPÍTULO 5 - Influência de resíduos orgânicos sobre a fase assimbiótica de
Gigaspora albida Schenck & Smith (Glomeromycota) 189
Resumo
191
Introdução
192
Material e métodos
193
Resultados
195
Discussão
202
Referências Bibliográficas
205
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
9
CAPÍTULO 6 - Fungos micorrízicos arbusculares multiplicados em substrato
com adubo orgânico favorecendo a formação de mudas orgânicas de
Passiflora alata Curtis: uma questão de adaptação? 210
Resumo
212
Introdução
213
Material e métodos
214
Resultados
216
Discussão
219
Conclusões
223
Referências Bibliográficas
223
CAPÍTULO 7 - Substratos orgânicos na produção de mudas micorrizadas de
maracujazeiro-doce e na atividade microbiana do solo. 227
Resumo
229
Introdução
230
Material e métodos
231
Resultados
232
Discussão
236
Conclusão
238
Referências Bibliográficas
238
CAPÍTULO 8 - Produtividade e qualidade de frutos de maracujazeiro-doce
em cultivo associado com fungos micorrízicos arbusculares, no Vale do
Submédio São Francisco-PE 244
Resumo
246
Abstract
247
Introdução
248
Material e métodos
249
Resultados e Discussão
252
Conclusões
259
Referências Bibliográficas
259
CAPÍTULO 9 - Produção de glomalina e atividade microbiana na rizosfera
de maracujazeiros-doce em função do uso de vermicomposto e fontes de
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
10
inóculo micorrízico 264
Resumo
266
Introdução
267
Material e métodos
268
Resultados e Discussão
270
Referências Bibliográficas
279
CONCLUSÕES GERAIS
284
CONSIDERAÇÕES FINAIS
286
PERSPECTIVAS PARA TRABALHOS FUTUROS
289
ANEXOS
292
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
11
LISTA DE FIGURAS
Pág.
Capítulo 3
Figura 1. Produção de esporos de FMA, associados a Panicum miliaceum, em
solo adubado com composto orgânico, 50 dias após a inoculação.... 163
Figura 2. Produção de esporos de FMA, associados a Panicum miliaceum, em
areia adubada com composto orgânico, 50 dias após a inoculação... 164
Figura 3. Produção de esporos de FMA, associados a Panicum miliaceum, em
solo adubado com terra vegetal composta, 70 dias após a
inoculação................................................................................................... 165
Figura 4. Produção de esporos de FMA, associados a Panicum miliaceum, em
areia adubada com terra vegetal composta, 70 dias após a
inoculação................................................................................................... 165
Figura 5. Produção de esporos de FMA, associados a Panicum miliaceum, em
solo adubado com esterco bovino, 50 dias após a inoculação............. 166
Figura 6. Produção de esporos de FMA, associados a Panicum miliaceum, em
areia adubada com esterco bovino, 50 dias após a inoculação........... 166
Capítulo 4
Figure 1. Germination rate of spores of Gigaspora albida multiplied (60 days)
in soil with (number 1) and without (number 2) addition of organic
compound, in medium supplemented with increasing
concentrations of partially purified glomalin extract, at the 7
th
(a)
and 14
th
(b) days. …………………………………………………………. 182
Figure 2. Mycelial growth of Gigaspora albida multiplied (60 days) in soil with
(number 1) or without (number 2) addition of organic compound, in
medium supplemented with increasing concentrations of partially
purified glomalin extract, at the 7
th
(a) and 14
th
(b) days after
inoculation.……………………………….…......………………………… 183
XI
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
12
Capítulo 5
Figura 1. Índice germinativo (A) e crescimento micelial (B) de Gigaspora
albida, multiplicado em substrato com (Número 1) ou sem (Número
2) adição de composto orgânico, em solo adubado com composto
orgânico (CO), terra vegetal (TV) ou esterco bovino (EB).....................
Figura 2. Índice germinativo de isolados de Gigaspora albida, produzidos em
substrato com (número 1) ou sem (número 2) adubo orgânico,
mantido em solo com proporções crescentes de composto orgânico,
independentemente da época de avaliação.............................................
196
197
Figura 3. Crescimento micelial de isolados de Gigaspora albida, produzidos
em substrato com (Número 1) ou sem (Número 2) adubo orgânico,
em solo com proporções crescentes de composto orgânico, aos 7 e 14
dias de inoculação........................................................................................ 198
Figura 4. Crescimento micelial de isolados de Gigaspora albida, produzidos
em substrato com (Número 1) ou sem (Número 2) adubo orgânico,
mantidos em solo com proporções crescentes de terra vegetal,
independentemente da época de avaliação............................................. 199
Figura 5. Índice germinativo e crescimento micelial de Gigaspora albida em
solo adubado com proporções crescentes de esterco bovino,
independentemente da fonte de inóculo e da época de avaliação....... 200
Figura 6. Células auxiliares produzidas no micélio assimbiótico de Gigaspora
albida (número 1) multiplicado em solo com composto orgânico: (a)
hifas e células auxiliares (seta); (b, c) detalhe das células auxiliares
alteradas pela ausência de ornamentações.............................................. 201
Capítulo 7
Figura 1. Colonização micorrízica total, arbuscular e hifálica de Gigaspora
albida nas raízes de Passiflora alata cultivada em solo, solo e terra
vegetal (S+TV), solo e esterco bovino (S+EB) e solo e palha de coco
(S+PC), 46 dias após inoculação................................................................ 234
XII
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
13
Capítulo 8
Figura 1. Número de frutos por hectare, produtividade, sólidos solúveis
totais (SST), acidez total titulável (ATT) e relação SST/ATT de
frutos de maracujazeiro-doce, pré-inoculados com Gigaspora albida
provindo da multiplicação em solo com (Org) ou sem (S) composto
orgânico e cultivado em solo com adubo químico ou orgânico........... 253
Capítulo 9
Figura 1. Colonização micorrízica por Gigaspora albida multiplicado em solo
com (Org) ou sem (S) composto orgânico, em raízes de Passiflora
alata cultivada em solo adubado com fertilizantes químicos e
orgânicos, no Vale do Submédio São Francisco, Petrolina, PE............. 273
Figura 2. Glomalina facilmente extraível (GFE) de agregados (<1 mm) de solo
adubado com fertilizantes químicos ou orgânicos, após cultivo por
dez meses com maracujazeiro-doce associado a Gigaspora albida,
multiplicado em solo com (Org) ou sem (S) composto orgânico, no
Vale do Submédio São Francisco, Petrolina, PE...................................... 275
Figura 3. Glomalina facilmente extraível (GFE) de agregados (1-2 mm) de
solo adubado com fertilizantes químicos ou orgânicos, após cultivo
durante dez meses com maracujazeiro-doce associado a Gigaspora
albida, multiplicado em solo com (Org) ou sem (S) composto
orgânico, no Vale do Submédio São Francisco, Petrolina, PE............. 275
Figura 4. Evolução de CO
2
em solo adubado com fertilizantes químicos ou
orgânicos e após cultivo durante dez meses com maracujazeiro-
doce associado a Gigaspora albida, multiplicado em solo com (Org)
ou sem (S) composto orgânico, no Vale do Submédio São Francisco,
Petrolina, PE................................................................................................. 277
XIII
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
14
LISTA DE TABELAS
Pág.
Capítulo 1
Tabela 1. Exemplos de hospedeiros utilizados na produção de inóculo de
fungos micorrízicos arbusculares (FMA)............................................... 67
Tabela 2. Principais métodos para produção de inóculo de FMA........................ 69
Capítulo 2
Table 1. Production of spores (spores g
-1
substrate) of Acaulospora longula,
Gigaspora albida, Glomus etunicatum and Scutellospora heterogama after
85 days associated with Panicum miliaceum, irrigated with nutrient
solution (Hoagland and Arnon, 1950), modified by Jarstfer and
Sylvia (1992) and supplemented with Tris-HCl………………………… 148
Table 2. Infectivity (%) of the inocula of AMF produced in a sand vermiculite
substrate irrigated with Hoagland and Arnon nutrient solution
modified and supplemented with Tris-HCl buffer, calculated at time
0 (without storage) and after maintenance for 120 days at 4 ºC and at
room temperature (28 ºC)…………………………………………………. 149
Capítulo 3
Tabela 1. Caracterização química e físico-química dos resíduos orgânicos e
dos substratos diluentes, utilizados na produção de inóculo de FMA. 161
Tabela 2. Infectividade de inóculo de FMA, em milho, após multiplicação em
substrato com 10% de composto orgânico, em solo (S) ou em areia
(A), tendo como hospedeiro o painço, antes e após manutenção a 4
ºC e a 28 ºC, por 120 dias.............................................................................. 167
Tabela 3. Infectividade de inóculo de FMA, em milho, após multiplicado em
substrato com 10% de terra vegetal em areia tendo como hospedeiro
painço, antes e após manutenção a 4 ºC e a 28 ºC, por 120
dias................................................................................................................... 168
XIV
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
15
Capítulo 4
Table 1. Chemical characterization of the substrates used for multiplication of
Gigaspora albida……………………………………………………………... 180
Capítulo 5
Tabela 1. Caracterização química dos substratos utilizados para multiplicação
de Gigaspora albida......................................................................................... 193
Tabela 2. Caracterização química dos resíduos orgânicos utilizados nos
experimentos..................................................................................................
Tabela 3. Índice germinativo e crescimento micelial de esporos de Gigaspora
albida em solo adubado com composto orgânico (CO), terra vegetal
(TV) ou esterco bovino não maturado (EB), independentemente da
época de avaliação e das proporções dos resíduos...................................
194
200
Capítulo 6
Tabela 1. Condições da produção e densidade dos inóculos de FMA................. 214
Tabela 2. Caracterização química dos substratos utilizados para multiplicação
dos FMA e para cultivo do maracujazeiro-doce ................................... 215
Tabela 3. Diâmetro do caule, altura, massa seca da parte aérea e área foliar de
mudas de maracujazeiro-doce, inoculadas com FMA multiplicados
em substrato com adubo orgânico e cultivadas em solo com ou sem
composto orgânico, 42 dias após a inoculação...................................... 217
Tabela 4. Percentual de colonização micorrízica total (CT), por hifas (CH) e
arbúsculos (CA) e produção de glomalina em mudas de
maracujazeiro-doce, inoculadas com isolados de FMA
multiplicados em substrato com adubo orgânico e cultivadas em
solo com ou sem composto orgânico, 42 dias após a inoculação, em
casa de vegetação........................................................................................ 218
Tabela 5. Percentual de colonização vesicular por Acaulospora longula,
multiplicado em substrato com (Org) ou sem (S) adubo orgânico,
nas raízes de maracujazeiro-doce cultivado em solo com ou sem
XV
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
16
composto orgânico, 42 dias após a inoculação, em casa de
vegetação...................................................................................................... 219
Tabela 6. Número de esporos de FMA na rizosfera de mudas de
maracujazeiro-doce inoculadas com isolados multiplicados em solo
e em substrato com adubo orgânico, independentemente do tipo de
substrato de cultivo, 42 dias após a inoculação..................................... 219
Capítulo 7
Tabela 1. Caracterização química dos substratos utilizados para produção de
mudas de maracujazeiro-doce.................................................................. 231
Tabela 2. Níveis de significância para adubação, fungos e interação entre as
variáveis avaliadas..................................................................................... 233
Tabela 3. Influência da composição do substrato na área foliar (AF), massa
seca da parte aérea (MSPA), diâmetro do caule (DC) e respiração
microbiana (RM), em mudas de maracujazeiro-doce
independentemente da micorrização com Gigaspora albida, 46 dias
após inoculação, em casa-de-vegetação.................................................. 233
Tabela 4. Influência da micorrização com Gigaspora albida na área foliar (AF),
massa seca da parte aérea (MSPA), diâmetro do caule (DC) e
respiração microbiana (RM), em mudas de maracujazeiro-doce 46
dias após inoculação, em casa-de-vegetação ......................................... 234
Tabela 5. Influência da composição do substrato de cultivo e da micorrização
com Gigaspora albida na atividade enzimática geral do solo, altura e
produção foliar de mudas de maracujazeiro-doce, 46 dias após
inoculação, em casa-de-vegetação........................................................... 235
XVI
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
17
Capítulo 8
Tabela 1. Caracterização química dos substratos utilizados para: a)
multiplicação de Gigaspora albida; b) preparo das mudas de
Passiflora alata; c) do vermicomposto utilizado na adubação
orgânica para cultivo do maracujazeiro-doce........................................ 250
Tabela 2. Níveis de significância para adubação e fungos e interação dos
parâmetros avaliados na produtividade do maracujazeiro-doce no
Vale de São Francisco, Petrolina, PE........................................................ 257
Tabela 3. Valores médios para as características de frutos de maracujazeiro-
doce, micorrizado com Gigaspora albida (produzido em solo com
(Org) ou sem (S) 10% de composto orgânico) e cultivado em solo
adubado com fertilizantes químicos ou orgânicos................................ 258
Capítulo 9
Tabela 1. Caracterização química dos substratos utilizados para multiplicação
de Gigaspora albida, preparo das mudas de Passiflora alata e como
adubação orgânica para cultivo do maracujazeiro-doce...................... 269
Tabela 2. Níveis de significância para adubação, fungos e interação entre as
variáveis estudadas, em cultivo do maracujazeiro-doce no Vale de
São Francisco, Petrolina, PE...................................................................... 271
Tabela 3. Influência da fertilização química e orgânica nas características
químicas do solo após cultivo durante dez meses do maracujazeiro-
doce associado a Gigaspora albida.............................................................. 272
Tabela 4. Influência da fertilização química e orgânica na concentração de
glomalina total (GT) em duas classes de agregados (<1 e 1-2 mm),
na densidade de esporos de FMA (DE) e na atividade enzimática
geral (AEG) de solo após cultivo do maracujazeiro-doce associado
a Gigaspora albida durante dez meses....................................................... 272
Tabela 5. Coeficientes de correlação simples (r) entre as variáveis estudadas.... 278
XVII
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
18
RESUMO GERAL
Adubos orgânicos têm baixo custo que podem constituir alternativa para produção de
inoculante de fungos micorrízicos arbusculares (FMA), sendo necessário verificar o seu efeito
sobre os fungos propagados nesses substratos. Foi investigado o efeito de adubos orgânicos
sobre FMA e de ambos sobre a produção de mudas e produtividade de maracujazeiro-doce.
Em laboratório foram avaliados: fase assimbiótica de Gigaspora albida, em meio com
glomalina e em solo com adubos orgânicos. Em casa de vegetação determinou-se: substratos
eficientes para produção de inóculo infectivo, eficiência micorrízica na produção de mudas
orgânicas de maracujazeiro-doce e adubos mais indicados para a produção de mudas
micorrizadas e a atividade microbiana. Em campo avaliou-se o efeito de fontes de inóculo e
tipos de adubo na produtividade e características dos frutos, atividade microbiana e produção
de glomalina. A aplicação de tampão Tris-HCl estimulou a produção de esporos de FMA e o
inóculo manteve-se infectivo após armazenamento por 120 dias a 4 ºC. Composto orgânico e
terra vegetal adicionados ao substrato para cultivo de FMA aumentaram a esporulação, mas
os benefícios foram dependentes do substrato diluente (solo ou areia) e do FMA, porém
quando o substrato foi adubado com esterco bovino houve redução na reprodução dos fungos.
A manutenção de inóculos produzidos em substrato com adubo orgânico por 120 dias, em
condições ambientais (28 ºC), não afeta a infectividade, embora as repostas sejam
dependentes do substrato diluente, da fonte de matéria orgânica e do FMA testado. Maior
germinação e crescimento micelial de G. albida ocorreram em solo adubado com composto
orgânico (53 % e 17,1 mm), seguido de terra vegetal (42,8 % e 13,9 mm) e esterco bovino
(23,7 % e 5,2 mm). A germinação de G. albida não foi afetada, mas o crescimento micelial
foi favorecido pela adição de 30 μg mL
-1
de glomalina no meio. Mudas de maracujazeiro-
doce associadas a G. albida (multiplicado em substrato com adubo orgânico), cultivadas em
solo + composto orgânico, apresentam maior crescimento, colonização micorrízica e redução
de 60 % no tempo de formação. Plantas de maracujazeiro-doce cultivadas em solo com
esterco bovino cresceram duas vezes mais do que as mantidas em substrato à base de palha de
coco, terra vegetal ou solo, com a micorrização favorecendo a formação de mudas mais
desenvolvidas e a atividade enzimática no solo. O uso de fertilizantes químicos e a inoculação
com G. albida produzido em solo + composto orgânico propiciaram a formação de maior
número de frutos (64.777 frutos ha
-1
) com reduzida acidez (0,75 % de ácido cítrico g
-1
polpa),
elevada ºBrix/acidez (24,32) e maior produtividade (11,08 t ha
-1
). Em condições de campo, a
produção de glomalina, a emissão de CO
2
e a atividade de hidrólise do diacetato de
XVIII
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
19
fluoresceína (FDA) foram favorecidas pelo uso de vermicomposto, com os benefícios sendo
modulados pela fonte de inóculo micorrízico empregada na fase de formação das mudas.
Adubos orgânicos podem estimular a atividade microbiana, a fase assimbiótica do FMA, a
produção de inóculo micorrízico infectivo e efetivo em promover o crescimento de mudas e a
produção de frutos de maracujazeiro-doce com qualidade.
Palavras-Chave: adubação orgânica; micorriza arbuscular, Passiflora alata.
XIX
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
20
ABSTRACT
Organic fertilizers have low cost and many of them constitute an alternative for production of
inoculum of arbuscular mycorrhizal fungi (AMF). However, it is necessary to verify the
effects of the organic fertilizers on the propagation of these fungi. The effect of organic
fertilizer on AMF and the effect of both on production of seedlings and productivity of sweet
passion fruit were investigated. The asymbiotic phase of Gigaspora albida in water agar
medium plus glomalin and in soil with organic fertilizer was evaluated in the laboratory.
Substrates for production of infective inoculum, mycorrhizal efficiency for production of
organic seedlings of sweet passion fruit and the amendment more feasible to increase
production of mycorrhizal seedlings and microbial activity were investigated in greenhouse
experiments. In the field, the effect of inoculum sources and fertilizer type on production and
characteristics of the fruits, and the microbial activity and production of glomalin were
determined. The utilization of Tris-HCl buffer stimulated AMF spores formation and the
inoculum was still infective after 120 days at 4 ºC. Organic compost and vegetal manure
added to the substrate for AMF cultivation increased sporulation, but the benefits were
dependent on the diluent substrate (sand or soil) and on the AMF species, however, when the
substrate received cattle manure, reproduction of the AMF was reduced. The maintenance of
the inocula produced in substrates with organic fertilizer for 120 days, under environmental
conditions (28 ºC), did not affect infectivity, although the responses depended on the diluent
substrate, source of organic matter and tested AMF. Higher germination rate and mycelial
growth of G. albida occurred in soil receiving organic compost (53% and 17.1 mm), followed
by vegetal manure (42.8% and 13.9 mm) and cattle manure (23.7% and 5.2 mm). Germination
of G. albida was not affected but the mycelial growth was benefited by the addition of 30 μg
mL
-1
of glomalin in the growth medium. Seedlings associated with G. albida (multiplied in
substrate with organic fertilizer), cultivated in soil + organic compost, presented higher
growth, higher mycorrhizal colonization and 60% reduction of the seedling formation period.
Growth of plants cultivated in soil with bovine manure was higher than that maintained in
substrate with coconut straw, vegetal manure or soil. The mycorrhization enhanced the
development of seedlings and soil enzymatic activity. Use of chemical fertilizers and the
inoculation with G. albida produced in soil + organic compost enhanced formation of fruits
(64,777 fruits ha
-1
) with low acidity (0,75 % of citric acid g
-1
pulp), high ºBrix/acidity (24.32)
and higher productivity (11, 08 t ha
-1
). Under field conditions, production of glomalin, CO
2
XX
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
21
evolution and (FDA) diacetate fluorescein hydrolysis activity were benefited by the
application of vermicompost, which was modulated by the source of mycorrhizal inoculum
used during seedling formation. Organic fertilizers can stimulate the microbial activity, the
AMF asymbiotic phase and the production of mycorrhizal inoculum infective and effective in
promoting plant growth and formation of high quality sweet passion fruits.
Key words: organic amendment; arbuscular mycorrhiza, Passiflora alata.
XXI
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
22
Introdução geral
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
23
INTRODUÇÃO GERAL
Fungos micorrízicos arbusculares (FMA) tem potencial para utilização
biotecnológica, pois maximizam o crescimento e a produtividade de culturas de interesse
econômico (Ilbas & Sahin 2005) por favorecer a absorção de nutrientes com baixa mobilidade
na solução do solo e aumentar a tolerância dos vegetais a estresses bióticos e abióticos (Smith
& Read 1997).
Apesar dos benefícios comprovados, a aplicação dos FMA na agricultura tem sido
dificultada devido ao caráter biotrófico obrigatório do micobionte (Jarstfer & Sylvia 1992),
sendo necessário o estabelecimento da simbiose para que ao final do ciclo do fungo ocorra
produção de propágulos que possam ser utilizados como inóculo. Várias metodologias têm
sido propostas visando a maximização da produção de inoculante micorrízico (Sieverding
1991), tais como a utilização de diferentes substratos (Gaur & Adholeya 2000),
multiplicações em sistemas hidropônicos (Hawkins & George 1997) e aeropônicos (Jarstfer &
Sylvia 1992), estabelecimento de cultivos in vitro com raízes transformadas (Pawlowska et al.
1999), e a utilização de substâncias estimuladoras do desenvolvimento dos FMA
(Karandashov et al. 2000). Algumas dessas metodologias, embora propiciando elevada
esporulação (St-Arnaud et al. 1996), apresentam alto custo de instalação e manutenção e
podendo resultar na produção de propágulos com reduzida viabilidade (Gryndler et al. 2003).
A incorporação de adubos orgânicos na composição de substratos é metodologia de baixo
custo que pode estimular a produção de inóculo de FMA (Gaur & Adholeya 2005; Douds et
al. 2005), constituindo oportunidade para pré condicionar os fungos para substratos com alta
fertilidade e para o manejo orgânico.
A manutenção da infectividade do inóculo é fator limitante da qualidade do inoculante
a ser comercializado e, nesse aspecto, o armazenamento adequado é fundamental.
Recomendações têm sido feitas para estocagem dos propágulos nas condições em que foram
produzidos (Louis & Lim 1988b) ou em baixas temperaturas (Juge et al. 2002; Kim et al.
2002). No entanto, poucos estudos foram desenvolvidos nesta área (Sylvia 1999),
especialmente com FMA multiplicados em substrato com adubo orgânico, sendo necessário
determinar, pontualmente, as condições de estocagem para cada inoculante de FMA.
A busca pela sustentabilidade nos sistemas agrícolas tem favorecido a utilização de
fontes orgânicas que maximizem a produção vegetal sem comprometer a qualidade edáfica.
Adubos orgânicos melhoram a agregação de partículas do solo (Díaz et al. 1994), a
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
24
capacidade tamponante e de troca catiônica (Wagner & Wolf 1988), o teor de nutrientes (Paul
& Clarck 1989), além de maximizar a atividade microbiana do solo (Fernandes et al. 2005).
No solo, os FMA constituem a maior parte da biomassa microbiana (Kennedy 1998) e
influenciam a atividade da microbiota edáfica (Duponnois et al. 2005), com os benefícios
dependentes da espécie de FMA empregada (Caravaca et al. 2004). No entanto, a
contribuição de fontes de inóculo de uma mesma espécie de FMA sobre tais processos não foi
determinada.
Em sistemas para formação de mudas ou em plantios, recomenda-se a aplicação de
adubos orgânicos (Caravaca et al. 2002b). Esses fertilizantes podem atuar de modo benéfico
sobre os FMA, pois favorecem o desenvolvimento dos fungos tanto no solo (Douds et al.
2005) quanto na raiz (Cavender et al. 2003). Entretanto, pouco se sabe sobre o efeito desses
materiais sobre a germinação e o crescimento micelial inicial de FMA. Essas etapas são
importantes para o estabelecimento da associação micorrízica arbuscular e a aplicação
inadvertida de doses ou fontes impróprias pode comprometer programas de inoculação de
plantas que passam por fase de viveiro, assim como o potencial germinativo de FMA em
campos manejados organicamente.
Para proporcionar efetivos benefícios em culturas de interesse econômico, faz-se
necessária prévia seleção de inóculo de FMA, visto que há diferentes graus de
compatibilidade hospedeiro-micobionte (Sylvia et al. 2003), em função, entre outros motivos,
dos isolados de uma mesma espécie apresentarem fisiologia diferenciada (Munkvold et al.
2004). Além disso, é desejável que o FMA utilizado em programas de inoculação seja
eficiente em aumentar o crescimento vegetal e o teor de nutrientes, produzindo elevada
biomassa no solo (Abbott et al. 1994).
O estabelecimento de sistemas orgânicos vem sendo incentivado, e os vegetais
produzidos apresentam elevado valor agregado (Bettiol & Ghini 2003). No entanto, a
fertilidade do solo (especialmente P) em tais sistemas pode comprometer a atuação de FMA
(Freitas et al. 2004); por isso, o emprego de fungos adaptados, eficientes e com habilidade em
esporular sob tais condições é desejável (Bagyaraj & Reddy 2005). Esses “edafotipos” podem
ser obtidos pela multiplicação dos fungos em substratos com adubos orgânicos, ricos em
fósforo. A aplicação desses materiais seleciona e mantém fungos mais eficientes para o
hospedeiro (Muthukumar & Udaiyan 2002).
Melhores respostas dos hospedeiros pela associação com isolados adaptados a vários
fatores do solo foram relatadas (Gonzalez-Chavez et al. 2002; Calvente et al. 2004;
Ananthakrisnan et al. 2004), porém os benefícios do uso de inóculo micorrízico produzido em
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
25
substratos com adubos orgânicos na produção orgânica vegetal são pouco conhecidos. No
entanto, a comunidade de FMA de áreas com manejo orgânico foi mais efetiva em promover
o crescimento vegetal, quando comparado ao emprego daquela oriunda de áreas com cultivo
convencional (Scullion et al. 1998; Eason et al. 1999).
Os FMA produzem no micélio externo uma glicoproteína específica, a glomalina
(Rillig et al. 2003b), envolvida na agregação do solo (Rillig et al. 2002a), favorecendo a
hidrofobicidade de partículas (Wright & Upadhyaya 1996) e aumentando a aeração do
substrato (Wright & Upadhyaya 1998), fatores que resultam na melhoria do crescimento do
hospedeiro (Piotrowski et al. 2004). Essa biomolécula pode ser utilizada na avaliação do
impacto de práticas agrícolas (Rillig 2004b). Mesmo considerada a maior fonte de carbono da
matéria orgânica, função anteriormente creditada aos ácidos húmicos (Wright & Nichols
2002), não se determinou a influência desta proteína sobre os processos assimbióticos de
FMA.
Apesar da ubiqüidade e da importância da glomalina em vários tipos de solo (Wright
& Upadhyaya 1996; Wright & Anderson 2000), a influência do aumento da fertilidade do
solo, decorrente da aplicação de adubos orgânicos, sobre a dinâmica de produção dessa
glicoproteina não está esclarecida. Recentemente Wuest et al. (2005) registraram que a
aplicação de 22,4 t ha
-1
ano
-1
de esterco não maturado favoreceu a produção de glomalina.
Além dos fatores do solo, a produção de glomalina é dependente da espécie de FMA
(Rillig et al. 2005), mas ainda não se determinou se há variação intraespecífica (entre
isolados). Este aspecto é importante na seleção de inoculantes micorrízicos para aplicação na
agricultura (Miller & Jastrow 2000), pois o uso de fungos com maior potencial para produção
desta proteína no solo é indicado por melhorar as condições edáficas e assim o crescimento do
hospedeiro (Rillig 2004b).
Passiflora alata Curtis, conhecida popularmente como maracujá-doce, é a segunda
espécie de Passiflora L. em importância econômica no Brasil (Vasconcellos et al. 2001a). Os
frutos, que apresentam polpa doce e levemente acidulada, possuem elevado valor agregado,
podendo alcançar US$1,00/fruto (Braga & Junqueira 2000), constituindo cultura alternativa e
rentável. Os principais mercados para exportação do maracujá-doce são os europeus, norte-
americanos e canadenses (Cançado Júnior et al. 2000). No entanto, devido à falta de
informações técnicas, essa passiflorácea ainda não é cultivada no Vale do Submédio São
Francisco, um dos principais pólos de exportação de frutas do nordeste brasileiro.
Um dos problemas para instalação, manutenção e renovação de maracujais é a
produção de mudas certificadas (Melleti 2001; Leonel & Pedroso 2005). Nesta fase, são
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
26
requeridos substratos ricos em nutrientes, que apresentam adubos orgânicos na composição
(Prado et al. 2004). Uma das maneiras de reduzir os custos de produção é a aplicação de FMA
selecionados, como registrado para Passiflora edulis Sims f. flavicarpa Deg. (Soares e
Martins, 2000; Cavalcante et al. 2001; 2002a) e Passiflora ligulares Juss (Rodríguez et al.
1995). O maracujazeiro-doce também é responsivo à inoculação com FMA selecionados
(Silva et al. 2004b), o que resulta em aumento de crescimento e redução do tempo de
formação das mudas (Silva et al. 2004b; Anjos et al. 2005). Porém, não está determinado se
os FMA podem contribuir para o crescimento de mudas de P. alata em substratos com adubo
orgânico.
Nesse contexto, a avaliação do impacto da adubação orgânica sobre as diferentes fases
da simbiose e de seus subprodutos (glomalina) poderá contribuir para o conhecimento e
compreensão da fisiologia de FMA na agricultura sustentável. Aliado a isto, é importante a
seleção de substratos de baixo custo que maximizem a produção de inóculo de FMA infectivo
e efetivo, em viveiro e em condições de campo, e que os fungos contribuam para melhoria da
qualidade do solo em sistemas orgânicos.
Diante disso, os objetivos deste trabalho foram: a) selecionar substratos orgânicos
eficientes para produção de inóculo de FMA; b) avaliar a infectividade do inóculo produzido,
após estocagem a 4 ºC e a 28 ºC; c) determinar o efeito de resíduos orgânicos e de glomalina
sobre a germinação e o crescimento micelial assimbiótico de FMA multiplicados em
substratos com ou sem aplicação de adubo orgânico; d) testar a eficiência dos inóculos
produzidos na formação de mudas orgânicas de maracujazeiro-doce; e) selecionar substratos
orgânicos para produção de mudas micorrizadas de maracujazeiro-doce; f) verificar o efeito
de FMA provindos da multiplicação em substratos com adubo orgânico, na produtividade do
maracujazeiro-doce, em cultivo químico e orgânico; g) avaliar o impacto da aplicação de
vermicomposto e de fontes de inóculo micorrízico sobre a atividade microbiana e a produção
de glomalina, em condições de campo.
Após extensiva revisão de literatura (Capítulo 1) foram selecionados substratos
promissores para produção de inóculo de FMA, utilizando painço como planta hospedeira
(Capítulos 2 e 3). A partir das combinações de substratos mais favoráveis à esporulação dos
fungos, avaliou-se a infectividade do inóculo pelo método da percentagem média de infecção,
em três ocasiões: logo após ter sido produzido e após armazenamento a 4 e 28 ºC por 120 dias
(Capítulos 2 e 3). Com a finalidade de averiguar se a multiplicação de FMA em substrato com
adubo orgânico favorece a germinação e o crescimento micelial assimbiótico em relação ao
inóculo produzido em solo, foram conduzidos experimentos de germinação in vitro, em meio
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
27
com glomalina (Capítulo 4) e em solo adubado com resíduos orgânicos (Capítulo 5). Inóculos
produzidos em substrato com adubo orgânico, selecionados no Capítulo 3, foram testados
quanto à eficiência em promover o crescimento de mudas de maracujazeiro-doce (Passiflora
alata) em solo adubado com composto orgânico (Capítulo 6). No capítulo 7, foram testados
resíduos orgânicos de baixo custo, visando confirmar se os benefícios da micorrização de P.
alata com Gigaspora albida Schenck & Smith multiplicado em substrato com adubo
orgânico, observados no capítulo anterior, eram evidenciados quando se empregava outra
fonte orgânica. Por fim, conduziu-se experimento em campo, para validar os dados obtidos
em casa de vegetação e confirmar se a utilização de FMA propagados em substrato com
adubo é mais eficiente do que o uso de fungos multiplicados em solo. Foi testado o efeito
desses FMA: na fase produtiva do maracujazeiro-doce (Capítulo 8) e na atividade microbiana,
avaliada pela emissão de CO
2
, atividade hidrolítica do diacetato de fluoresceína (FDA) e
produção de glomalina (Capítulo 9).
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
28
Revisão Geral
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
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1. Adubação orgânica na agricultura
A sociedade moderna tem se preocupado com a qualidade dos produtos de origem
agrícola consumidos (Bettiol & Ghini 2003), havendo interesse nos sistemas de produção que
devem fazer uso de práticas que permitam a elevada produtividade das culturas sem
comprometimento da sustentabilidade do solo (Mielniczuk 1999). Esses requisitos podem ser
atingidos quando os teores de matéria orgânica no solo estão adequados (Silva et al. 2004a).
Esta é considerada, desde a antiguidade, o principal fator de fertilidade do solo (Kiehl 1985),
sendo a sua aplicação uma prática clássica na agricultura. Nesse contexto, deve-se optar por
práticas de manejo e uso do solo que conservem os teores de matéria orgânica (Bayer &
Mielniczuk 1999).
Um dos expressivos problemas aliados ao desenvolvimento das grandes cidades é a
produção de resíduos sólidos oriundos de atividades urbanas, industriais e agrícolas (Sossai et
al. 2000). O processo de incorporação de resíduos orgânicos, por outro lado, é uma prática
agrícola antiga (Gouveia & Pereira Neto 2000), que atualmente vem sendo empregada para
conservação e melhoria da qualidade edáfica (Borie et al. 2002) e para disposição desses
resíduos (Jahnel et al. 1999). Além disso, com o aumento nos custos da fertilização mineral, o
uso de resíduos orgânicos visando aumentar a fertilidade do solo tem sido incentivado
(Tedesco et al. 1999).
No solo, a matéria orgânica é formada por resíduos vegetais e animais e produtos
resultantes da decomposição (Paul & Clarck 1989), apresentando carbono na forma de
polifenóis (50%), polissacarídeos (20%), complexos nitrogenados (20%) e por outras formas
(10%) (Wagner & Wolf 1998). Apenas bactérias autotróficas e plantas são capazes de
sintetizá-la a partir de elementos simples. Vários microrganismos atuam na decomposição,
resultando na mineralização dos nutrientes e formação de húmus (Feigl et al. 1998). Silva et
al. (2004a) mencionam que a matéria orgânica do solo é subdividida em: resíduos orgânicos,
fração “leve”, biomassa microbiana, substâncias não húmicas e húmicas.
A presença de substâncias húmicas nos adubos orgânicos é responsável por gerar
cargas negativas (Brady 1990), que adsorvem cátions nas micelas coloidais pelos
grupamentos carboxílicos (COOH), fenólicos e alcoólicos (OH) dos ácidos húmicos (Cerri et
al. 1992); com isso, a retenção eletrostática evita a perda de nutrientes pela água (Kiehl 1998).
As substâncias húmicas participam de várias reações, pois apresentam carga negativa variável
(dependente de pH) que interfere na ionização de grupamentos carboxílicos (Novotny &
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
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Martin-Neto 1999). Além disso, os ácidos húmicos podem favorecer o crescimento vegetal
via estímulo de microrganismos benéficos (Linderman & Davis 2001).
A incorporação de fontes orgânicas afeta a dinâmica física, química e biológica do
solo (Pavan & Chaves 1998). No âmbito físico, a adição de resíduos favorece a aeração, a
infiltração, a retenção de umidade (cerca de cinco vezes) e a agregação de partículas do solo
(Wagner & Wolf 1998; Tedesco et al. 1999; Celik et al. 2004). Com relação ao aspecto
químico, aumenta o pH, o poder tampão do substrato, além de contribuir para suprimento de
micronutrientes via formação de quelatos com ácidos orgânicos de baixo peso molecular, que
reduzem a precipitação como óxidos no solo (Arden-Clarke & Hodges 1988; Bayer &
Mielniczuk 1999). Físico-quimicamente, os resíduos aumentam a capacidade de troca
catiônica (CTC) e a saturação por bases (V%) (Abreu Jr. et al. 2001; Bulluck et al. 2002).
Esses benefícios são potencializados pela elevada superfície específica da matéria orgânica
(Silva et al. 2004a). Por fim, as fontes orgânicas favorecem os organismos do solo (Crecchio
et al. 2001), fornecendo substratos energéticos e condições adequadas para o desenvolvimento
da microbiota (Nsabimana et al. 2004; Gryndler et al. 2005).
A aplicação de adubos orgânicos pode ainda reduzir a população de fitopatógenos, por
aumentar a abundância de antagonistas (Bulluck et al. 2002). Aumentos de 30% e 50% na
diversidade e abundância de organismos, respectivamente, em sistemas que fazem uso de
adubos orgânicos em relação a sistemas de produção convencional têm sido apontados
(Bengtsson et al. 2005).
Apesar dos benefícios da incorporação de resíduos nos substratos para produção
vegetal, a presença de patógenos (Santos et al. 1998), bem como níveis tóxicos de metais
(Alves & Passioni 1997) e elementos orgânicos podem inviabilizar sua aplicação (Angel &
Heckman 1986). Pascual et al. (1999a) observaram que a qualidade do solo foi melhorada
pela adubação com resíduos frescos em relação aos compostados; todavia, o risco de
utilização de formas brutas é decorrente da instabilidade química, da presença de metais
pesados ou microrganismos patogênicos.
Existem vários tipos de resíduos orgânicos, de diferentes naturezas (vegetal, animal e
mista), consistências (sólida, líquida e semilíquida) e origens (industrial, urbana e agrícola),
que podem ser empregados na agricultura; no entanto, sua aplicação vai depender da
disponibilidade do produto (Kiehl 1985). Exemplos de resíduos comumente empregados
incluem: vinhaça, lodo de curtume e de estação de tratamento de efluentes, composto
orgânico, resíduos frigoríficos, tortas vegetais, entre outros (Tedesco et al. 1999). Esses
materiais podem ser incorporados ao solo “frescos”, sem prévio tratamento, ou após
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31
compostagem, que consiste na transformação microbiológica da matéria orgânica crua em
substrato estabilizado, sendo esta conversão bioquímica realizada por bactérias e fungos
(Kiehl 1985).
O processo de formação do composto orgânico é controlado, sendo afetado pela
temperatura, aeração e grupos de microrganismos presentes na matéria a ser compostada
(Pereira Neto 1996). Durante a compostagem, organismos patogênicos são eliminados
(Elorrieta et al. 2003), enquanto o volume do material a ser compostado é reduzido (Zibilske
1998).
De acordo com Kiehl (1998), a compostagem inclui três fases: uma rápida, de
fitotoxidade, com formação de ácidos orgânicos e toxinas, seguida da etapa de
bioestabilização do substrato e uma terceira fase, denominada de humificação, é acompanhada
da mineralização dos nutrientes (Jahnel et al. 1999). Nas fases iniciais do processo de
compostagem ocorre elevado consumo de O
2
e alta atividade enzimática, que são
gradativamente reduzidos com a maturação do composto; em contrapartida, geralmente ocorre
aumento na biomassa microbiana e na concentração de ácidos húmicos com a evolução do
processo de compostagem (Tiquia 2005).
A fase de maturação é importante na compostagem, pois possibilita a eliminação de
fitotóxicos durante a humificação do material. Testando a qualidade do composto orgânico em
leira de resíduos urbanos, Gouveia & Pereira Neto (2000) observaram que em leiras
maturadas, os teores de matéria orgânica estavam dentro do recomendado para se classificar
como fertilizante orgânico (27%). Similarmente, Jahnel et al. (1999) observaram que
parâmetros como pH, N, produção de CO
2
, temperatura, % de matéria orgânica e relação C/N,
podem ser indicadores de maturação do composto, sendo a temperatura e a relação C/N
indicadores isolados do grau de maturação, desde que sejam mantidas aeração e umidade
adequadas durante o processo. Recentemente, Tiquia (2005) sugeriu a atividade da
desidrogenase como indicador de maturação de composto orgânico.
Kiehl (1998) diferencia composto maturado daquele com qualidade agrícola; no
primeiro caso o material é resultante da degradação da matéria orgânica, originando o húmus;
no entanto, um composto maturado pode não apresentar características que o enquadram
como fertilizante orgânico com qualidade, tal como teores de carbono abaixo de 9,8 ou acima
de 13,4 % (Texeira & Mandelli 1991).
O composto orgânico pode ser utilizado na produção vegetal, tanto em horticultura,
floricultura e fruticultura (Alves & Passioni 1997), como na recuperação de áreas degradadas
(Leopoldino & Pereira Neto 2000), pois é um tipo de adubo estável (Palenzuela et al. 2002).
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A adubação provoca alterações físico-químicas no solo que proporcionam aumento na
estabilização e na agregação de partículas e na capacidade tamponante e de troca catiônica
(Pereira Neto 1996), além de reduzir a prática de calagem. Outra importante função é a
liberação de fósforo orgânico para mineralização por ação de fosfatases (Joner & Jakobsen
1994). A adição de materiais orgânicos compostados reduz a densidade aparente e aumenta a
porosidade do solo, melhorando o desenvolvimento das raízes (Caravaca et al. 2002a). Esses
benefícios são mais importantes em solos intemperizados e ácidos, como os tropicais e
subtropicais (Bayer & Mielniczuk 1999)
Outra fonte de adubo empregada na agricultura é o vermicomposto, resultado da ação
conjunta de minhocas (geralmente do gênero Eisenia Savigny 1826) e microrganismos sobre
a decomposição da matéria orgânica crua (Arancon et al. 2003a). O processo é denominado
vermicompostagem e o produto final, também conhecido como húmus de minhoca, é
amplamente utilizado (Atiyeh et al. 2002a). Vários vegetais podem ser beneficiados na fase
de viveiro (Arancon et al. 2003a) e em campo (Arancon et al. 2005) pelo uso de
vermicomposto como adubo, porém as doses empregadas (Atiyeh et al. 2002a) e o material
utilizado para a vermicompostagem podem interferir nas respostas obtidas (Arancon et al.
2003a; 2005). O fornecimento de nutrientes aliado ao efeito condicionante do solo e ao
favorecimento da atividade da microbiota edáfica são os principais benefícios do uso desses
fertilizantes (Atiyeh et al. 2000). Além disso, hormônios sintetizados durante a
vermicompostagem e a presença de ácidos húmicos favorecem o crecimento vegetal (Atiyeh
et al. 2002b). Os ácidos húmicos presentes em tais materiais podem atuar como hormônios,
promovendo o crecimento vegetal, ou servir como adsorventes para reguladores de
crescimento presentes neste tipo de adubo (Arancon et al. 2003b; 2004).
Geralmente se observa maior desenvolvimento de plantas cultivadas em solos com
resíduos orgânicos, em comparação com aquelas não adubadas ou recebendo adubos químicos
(Santos et al. 1998; 2001; Sossai et al. 2000; Perez-Murcia et al. 2006). Entretanto, em
algumas situações, o uso de fertilizantes químicos inicialmente proporciona maior
produtividade em relação ao emprego de adubos orgânicos. Esse tipo de resposta decorre da
existência de fase Lag para mineralização dos nutrientes presentes no adubo (Gleissman et al.
1996). Apesar disso, o mercado para exportação de vegetais produzidos sob manejo orgânico
está em franca expansão devido aos benefícios que proporciona (Bettiol & Ghini 2003),
alcançando preços elevados, quando comparado ao de vegetais cultivados em sistemas
convencionais (Gleissman et al. 1996).
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2. Atividade microbiana em solos com fertilizantes orgânicos
O solo deve ser preservado, pois representa a base para a sustentação da biota,
favorecendo trocas de energia por meio de reações bioquímicas e por processos biológicos
(Fillip 2002). A manutenção ou aumento na sua qualidade assegura a produção de alimentos e
subsídios para a sustentação da população humana (Ditzler & Tugel 2002), devido à ligação
com a qualidade da água e do ar (Doran et al. 2002) e por ser fator determinante na
sustentabilidade agrícola (Crecchio et al. 2001). No entanto, a utilização de práticas ou ações
antrópicas inadequadas tem comprometido a saúde do solo e, conseqüentemente, a
sustentabilidade dos ecossistemas naturais ou manejados.
Existem vários parâmetros físicos, químicos e biológicos que podem indicar alterações
na qualidade do solo. Entre eles, os índices microbiológicos e bioquímicos são recomendados
por serem mais sensíveis a variações na fertilidade e na qualidade edáfica (Pinzari et al. 1999;
Steinberg 1999; García et al. 2000a), em relação aos parâmetros físicos e químicos (Ros et al.
2003) e por serem correlacionados com o aumento no crescimento vegetal (Garcia et al.
1998). Exemplos de índices empregados são: atividade enzimática geral (Ghini et al. 1998;
Adam & Duncan 2001) ou específica (Caravaca et al. 2002d; Bending et al. 2002), biomassa
microbiana do solo (Chaoui et al. 2003), atividade respiratória (Grisi, 1978; Bettiol et al.
2002; Ros et al. 2003), e presença de polissacarídeos de origem microbiana (Frighetto 2000).
Metodologias mais refinadas, como a determinação da estrutura de comunidades microbianas,
pelo perfil de fosfolipídeos (PFLA), de ácidos nucléicos e da utilização de fontes de carbono
(Steinberg 1999; Hill et al. 2000) são também usadas.
O emprego de fertilizantes orgânicos pode aumentar os teores de P (García et al. 1992;
Sarangi et al. 2001), de matéria orgânica (Sarangi et al. 2001; Lee et al. 2004), o pH (Eghball
2002; Mäder et al. 2002), capacidade de troca catiônica (Antolín et al. 2005) e condutividade
elétrica (Sarangi et al. 2001) do solo, fatores que podem contribuir diretamente para maior
atividade da microbiota edáfica (Bayer & Mielniczuk 1999). A maior atividade microbiana
(respiração e atividade enzimática) em tais sistemas pode ser atribuída à maior exsudação
radicular dos vegetais (Pascual et al. 1999b). Em solos adubados com fertilizantes orgânicos
ocorre o melhor desenvolvimento do vegetal e conseqüente exsudação, que serve de fonte
energética para os microrganismos rizósféricos (Marinari et al. 2000; Izquierdo et al. 2005).
A presença de materiais com potencial de biodegradação serve como fonte de energia
adicional e de nutrientes, estimulando a microbiota autóctone do solo (Ros et al. 2003;
Fernandes et al. 2005), e é considerada um dos principais fatores que afetam a atividade
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
34
microbiana (Medina et al. 2004a). No entanto, os benefícios da aplicação de adubos são
dependentes do tipo e da dose empregada (Cervelli et al. 1978; Albiach et al. 2000; Pankhurst
et al. 2005).
Enzimas são catalisadores biológicos que aceleram reações. No solo, são produzidas
por plantas, animais e principalmente por microrganismos (Kiss et al. 1975; García et al.
2000a). Essas biomoléculas traduzem a funcionalidade do sistema, pois integram
propriedades físicas, químicas e biológicas (Aon & Colaneri 2001), além de participarem de
vários processos metabólicos (Nannipieri et al. 2002), como a mineralização de nutrientes
(Bandick & Dick 1999; Izquierdo et al. 2003), sendo consideradas indicadoras de fertilidade
atual ou potencial do solo (Canet et al. 2000).
A atividade enzimática do solo é devida a ação de enzimas intracelulares (biônticas),
constituindo parte da biomassa microbiana, ou extracelulares (abiônticas), que são liberadas
durante metabolismo e morte celular e que podem estar imobilizadas ou complexadas nos
colóides minerais e orgânicos do solo (Kiss et al. 1975; Burns 1982). Essa imobilização torna
as enzimas mais protegidas contra a desnaturação ou ao ataque de proteases (Burns 1978;
García et al. 1994; 2000a), reduzindo sua atividade (Alexander 1977). Mesmo fora da célula,
essas biomoléculas são importantes nos processos de mineralização de nutrientes (Marcote et
al. 2001), pois respondem rapidamente à presença de substratos, e os subprodutos dessa
degradação enzimática estimulam os microrganismos a secretarem mais enzimas, que dão
continuidade à catálise do substrato (Burns et al. 1982; Pascual et al. 2002). Por outro lado,
em solos arenosos e com reduzidos teores de matéria orgânica (< 1%), a atividade enzimática
é decorrente, principalmente, de enzimas intracelulares (Caravaca et al. 2002d).
De acordo com Burns (1986) as enzimas que catalisam reações no solo podem estar
associadas a células metabolicamente ativas ou não proliferantes, como esporos; além disso,
encontram-se ligadas a células mortas ou, ainda, formando complexos, principalmente por
forças de van der Waals; no entanto, pontes de hidrogênio podem estar envolvidas no
processo (Burns 1978; Cepeda et al. 2003).
O uso de enzimas é apontado como ferramenta útil no monitoramento da qualidade
edáfica (Nannipieri et al. 2002), pois podem ser alteradas por mudanças ambientais (Bandick
& Dick 1999), informando sobre processos bioquímicos que ocorrem no solo (Kizilkaya &
Bayrali 2005). A atividade enzimática pode ser alterada por vários fatores, como a presença e
o tipo de vegetal (Nsabimana et al. 2004; García et al. 2002; 2005; Izquierdo et al. 2005), a
profundidade do solo (Aon & Colaneri 2001b; Lalander et al. 2000; Fernandes et al. 2005), o
tipo de adubação (Bhattacharyya et al. 2001; Kaushik et al. 2005), práticas agrícolas (Balota
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
35
et al. 2004; Roldán et al. 2005) e as ações antrópicas, que comprometem a saúde do solo
(Brohon et al. 2001). Os principais grupos estudados na enzimologia do solo são as hidrolases
e as oxidorredutases, sendo também avaliadas as atividades de liases e transferases (García et
al. 2000a).
Entre os fatores que podem favorecer a atividade de enzimas no solo, destaca-se o
aumento nos teores de matéria orgânica, visto que este parâmetro é considerado indicador
chave da fertilidade (Roldán et al. 2003) e comumente solos com fertilizantes orgânicos têm a
atividade enzimática maximizada (García et al. 1998; Marschner et al. 2003; Antolín et al.
2005; Caravaca et al. 2005b; Fernandes et al. 2005; Kaushik et al. 2005). Este benefício é
geralmente atribuído ao fornecimento de substratos para a microbiota e à presença de
microrganismos e enzimas aderidas ao adubo aplicado (Pascual et al. 1998; Debosz et al.
2002; Izquierdo et al. 2005). A atividade de enzimas ligadas aos ciclos de nutrientes é
freqüentemente alterada. Essas mudanças podem também ser decorrentes de alterações dos
produtos de reação, bem como à presença de co-fatores e inibidores, decorrentes da adubação
(Albiach et al. 2000). O aumento nos teores de C (Balota et al. 2004; Bandick & Dick 1999;
Díaz-Raviña et al. 2005), de N (Frankenberger & Dick 1983; Böhme et al. 2005) e valores de
CTC (Frankenberger & Dick 1983), decorrente da aplicação de adubos orgânicos, é
positivamente correlacionado com a atividade de enzimas no solo.
A aplicação racional de fertilizantes orgânicos pode trazer benefícios a curto e em
longo prazo. Após dois anos, a aplicação de composto orgânico de resíduos urbanos no solo
foi suficiente para estimular a atividade da desidrogenase e da E-glicosidase (Crecchio et al.
2001). Por outro lado, a fertilização por 120 anos com esterco bovino (12 t ha
-1
ano
-1
)
aumentou a atividade da invertase e da xilanase (Poll et al. 2003) em relação ao solo não
fertilizado. Efeitos cumulativos benéficos da aplicação de 15 t ha
-1
ano
-1
de esterco bovino por
mais de 100 anos sobre a atividade microbiana também foram referidos por Böhme et al.
(2005).
Devido à heterogeneidade dos adubos orgânicos, a composição química do fertilizante
empregado pode modular a atividade de enzimas no solo (Marcote et al. 2001). Albiach et al.
(2000) evidenciaram máximo estímulo na atividade de enzimas (desidrogenase,
fosfodiesterase, fosfatase alcalina, arilsulfatase e urease) quando o solo foi fertilizado com
composto orgânico, em relação ao uso de resíduos de ovinos, lodo de esgoto, vermicomposto
ou solução de ácidos húmicos, como alternativas de fertilização. Benítez et al. (2000) também
registraram que o benefício da adubação orgânica no substrato de cultivo de Capsicum annum
L., sobre a atividade da urease, da fosfatase e da desidrogenase foi dependente do adubo
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
36
aplicado. De modo semelhante, Lee et al. (2004) evidenciaram que a atividade da fosfatase
(ácida e alcalina) e da desidrogenase foi maximizada com a aplicação de composto de
alimentos, em relação ao uso de composto orgânico comercial.
O estado de maturação da fonte orgânica aplicada também influencia a atividade
enzimática. Pascual et al. (2002) registraram que a persistência da atividade da urease e da
fosfatase ácida foi maior quando se empregou adubo compostado, em relação ao uso de
materiais frescos. O uso de materiais compostados na agricultura pode ser recomendado, visto
que há aumento na fertilidade (García et al. 1991) e na atividade microbiana do solo
(Carpenter-Boggs et al. 2000), além de resolver o problema da disposição de resíduos no
ambiente (García-Gil et al. 2000). Por outro lado, com emprego de materiais não
compostados, pode ocorrer rápido aumento na atividade microbiana, devido à presença de
materiais facilmente degradáveis (Masciandaro et al. 2000). Diante da diversidade de
respostas observada quando se emprega fertilizantes orgânicos, ensaios preliminares são
necessários antes da recomendação para o agricultor.
A dose de resíduo aplicado também pode interferir na atividade de microrganismos do
solo (Pascual et al. 1999b; Höflich et al. 2000). Lalander et al. (2000) observaram que a
quantidade de resíduo líquido de esterco suíno interferiu na atividade de fosfatase (ácida e
alcalina), urease, arilsulfatase e desidrogenase. García et al. (1994), por sua vez, também
verificaram que a aplicação de 195 e 260 t ha
-1
de resíduo sólido urbano, favoreceu a
atividade da urease, fostatase, e E-glicosidase, em relação ao solo não fertilizado e ao que
recebeu apenas 65 e 130 t ha
-1
do resíduo. Por outro lado, doses acima de 15 t ha
-1
de resíduo
orgânico reduziram a atividade de invertase, protease, amilase e desidrogenase (Sarangi et al.
2001).
A crescente utilização de fertilizantes minerais tem recebido atenção devido à
destruição de fontes renováveis e aos impactos que causam no solo (Calvo 1999), porém este
problema pode ser minimizado com o uso adequado de resíduos orgânicos que favorecem a
microbiota edáfica (Albiach et al. 2000; Roldán et al. 2003). Em geral o emprego desses
materiais estimula a atividade enzimática em relação ao uso de fertilizantes minerais
sintéticos (García-Gil et al. 2000; Lalander et al. 2000; Mäder et al. 2002; Lee et al. 2004;
Aracon et al. 2004; 2005). Böhme et al. (2005) observaram aumento da atividade da fosfatase
alcalina, E-glicosidase e urease em solo com esterco bovino, em relação à fertilização mineral.
De modo similar, Marcote et al. (2001) obtiveram mais benefícios do uso de composto
orgânico e esterco bovino sobre a atividade de enzimas do que o emprego de fertilizantes
químicos. Chakrabarti et al. (2000) também referiram que uso de esterco bovino favoreceu a
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
37
atividade da urease e da fosfatase ácida, quando comparado ao emprego de uréia +
superfosfato + muriato de potássio.
Por outro lado, a aplicação conjunta de fertilizantes minerais e orgânicos pode
favorecer a atividade enzimática edáfica, como evidenciado por Goyal et al. (1999), os quais
registraram aumento na atividade de desidrogenase, urease e fosfatase alcalina quando o solo
foi fertilizado com palha de trigo associada a fertilizantes minerais (uréia + superfosfato
simples).
2.1. Atividade de hidrólise do diacetato de fluoresceína (FDA)
Substâncias fluorogênicas sintéticas, como os ésteres de fluoresceína, que são
hidrolisados por enzimas, podem servir como indicativo do estádio metabólico celular
(Lundgren 1981).O subproduto liberado (fluoresceína) é positivamente correlacionado com a
atividade enzimática (Kramer & Guilbault 1963), a respiração microbiana (Södestrom 1977),
o conteúdo de ATP (Stubberfield & Shaw 1990) e a produção de biomassa fúngica (Swisher
& Carrol 1980). Entre os acetatos de bases fenólicas mais utilizados, destaca-se o FDA (3’- 6’
diacetato de fluoresceína), uma fluoresceína esterificada a dois radicais acetato (apolar e
incolor) que, após hidrólise enzimática, torna-se polar e fluorescente (Alef 1995a; Adam &
Duncan 2001). A reação pode ser mediada por enzimas produzidas por fungos, bactérias,
algas, protozoários e tecidos animais (Brunnius 1980; Schnürer & Rosswall 1982; Battin
1997; Monteiro 2000); por isso, fornece medida da atividade enzimática geral do solo
(Bandick & Dick 1999).
As enzimas que atuam no processo estão ligadas à parede de microrganismos
(Stubberfield & Shaw 1990) e envolvidas na decomposição da matéria orgânica do solo,
sendo proteases, lipases e esterases não específicas, intracelulares ou não, capazes de clivar o
FDA (Nannipieri et al. 2003). Vantagens da utilização do FDA como medida da atividade
enzimática geral do solo incluem a simplicidade, rapidez e sensibilidade do método (Schnürer
& Rosswall 1982). Porém, a possível adsorção da fluoresceína liberada nas partículas do solo
(Ghini et al. 1998) e a hidrólise abiótica do FDA, em extremos de pH e na presença de
algumas substâncias, constituem limitações para uso do método (Schnürer & Rosswall 1982;
Clarke et al. 2001).
A hidrólise de FDA tem sido empregada em vários sistemas. Battin (1997) considerou
que a metodologia é sensível para avaliação da atividade biológica e esterásica total em
biofilmes constituídos por algas, bactérias e fungos embebidos em matrix polissacarídica.
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
38
Outra aplicação é o monitoramento da formação de biofilmes bacterianos em tubulações de
água potável (de Rosa et al. 1998). Fontvielle et al. (1992) sugeriram que o método pode ser
empregado na avaliação da atividade microbiana em lodo ativado de sistemas aquáticos.
O impacto da aplicação de xenobióticos (Elsgaard et al. 2003) e herbicidas (Araújo et
al. 2003), da rotação de culturas (Larkin 2003), do tipo de vegetal (Bandick & Dick, 1999;
Nsabimana et al. 2004) e da aplicação de rejeito salino (Pereira et al. 2004) sobre a atividade
microbiana do solo também foi avaliado por essa metodologia.
A aplicação do método de hidrólise de FDA constitui alternativa para se averiguar o
impacto de práticas agrícolas na atividade enzimática geral (Aon et al. 2001; Taylor et al.
2002), porém as respostas podem ser dependentes da profundidade em que o solo foi coletado
e da fenologia do hospedeiro. Aon & Colaneri (2001) observaram correlações positivas entre
a hidrólise de FDA e os teores de C, N e a relação C/N apenas na fase de plantio da soja
[Glycine max (L.) Merr]; no período de floração e de pré-colheita a relação não se manteve.
A abundância de bactérias, assim como os teores de matéria orgânica, a capacidade de
troca catiônica, a biomassa microbiana e a atividade de várias enzimas (arilsulfatase,
desidrogenase, E-glicosidades e fosfatases ácida e alcalina) foram positivamente
correlacionadas com a atividade de hidrólise de FDA, tanto em solo argiloso quanto arenoso
(Taylor et al. 2002). Correlações positivas entre atividade de hidrólise de FDA e emissão de
CO
2
também foram referidas (Ghini et al. 1998; Araújo et al. 2003; Nasabimana et al. 2004).
A incorporação de adubos orgânicos pode favorecer a atividade microbiana no solo
(Graham et al. 2002) e teores de MO do solo têm sido positivamente relacionados à atividade
hidrolítica do FDA (Ghini et al. 1998; Bandick & Dick 1999; Nsabimana et al. 2004; Díaz-
Raviña et al. 2005). Pérez Sarmentero et al. (1994) verificaram que a aplicação de 20 t ha
-1
de
composto orgânico incrementou a atividade de hidrólise do FDA em relação ao controle sem
adubação ou à aplicação de adubos químicos, com o aumento positivamente relacionado aos
teores de matéria orgânica do solo. Com resultados semelhantes, Debosz et al. (2002)
verificaram que a aplicação de 4,2 t ha
-1
de lodo de esgoto ou 17 t ha
-1
de composto orgânico
estimulou a atividade enzimática geral do solo, sendo o benefício atribuído à presença de
microrganismos metabolicamente ativos nos resíduos aplicados.
Ghini et al. (2002) registraram aumento na atividade hidrolítica de FDA com o
emprego de adubos orgânicos, porém o benefício foi dependente do tipo de adubo aplicado.
Cama de frango favoreceu a atividade enzimática geral, o que não ocorreu quando lodo de
esgoto e casca de Pinus foram empregados como alternativa para adubação. De modo
semelhante, Pankhurst et al. (2005) verificaram que a aplicação de resíduos orgânicos no
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
39
cultivo de cana-de-açúcar favoreceu a atividade hidrolítica do FDA, com os benefícios
dependentes da fonte utilizada. Por outro lado, Bandick & Dick (1999) não verificaram
incrementos na hidrólise de FDA em solo adubado com 11,2 t ha
-1
ano
-1
de esterco, em
relação ao solo com fertilizantes minerais (90 kg N ha
-1
). Isso reforça a necessidade de
avaliação do impacto de fontes orgânicas ao substrato antes da recomendação de adubação,
tanto na fase de formação de mudas quanto na fase produtiva de vegetais.
2.2. Evolução de CO
2
Um dos métodos mais antigos e amplamente utilizados para se avaliar a atividade
microbiana do solo é a estimativa da taxa respiratória (Nsabamina et al. 2004), seja através da
liberação de dióxido de carbono (CO
2
) ou do consumo de oxigênio (O
2
). A produção de CO
2
é
parte final do metabolismo de organismos heterotróficos (Hernández & García 2003),
refletindo a atividade da microbiota aeróbica e anaeróbica (Gama-Rodrigues 1999). O CO
2
liberado pela microbiota edáfica pode ser quantificado por várias metodologias (Alef 1995b),
mas freqüentemente se utiliza solução básica (KOH ou NaOH) para “capturar” o CO
2
, que é
titulada com HCl (Grisi, 1978). Este é um dos métodos mais simples que fornece estimativas
de evolução de CO
2
(Van Cleve et al. 1979). Dessa forma, a respiração basal traduz a
capacidade metabólica da microbiota edáfica em degradar compostos orgânicos em condições
aeróbicas (Brohon et al. 2001; Nannipieri et al. 2003). Por outro lado, em solos com elevados
teores de carbonato pode haver liberação abiótica do CO
2
(Alef 1995b; Hernández & García
2003).
Solos com maior emissão de CO
2
são geralmente considerados com qualidade
superior, pois existe elevada atividade de microrganismos capazes de oxidar a matéria
orgânica (Abdelhamid et al. 2004). Esse parâmetro, portanto, é importante na avaliação do
emprego de adubos orgânicos visando aumento na fertilidade do solo (García et al. 2000b).
Por outro lado, maiores taxas de CO
2
evoluído podem significar redução nos estoques de
carbono, pois existe maior perda do carbono nativo do solo (Vasconcelos et al. 1998). Werner
(1997) considera que a maior perda de C via evolução de CO
2
, em cultivos orgânicos, é
compensada por maior entrada de C no sistema pela incorporação de resíduos orgânicos,
sendo as perdas comparativamente menores às observadas em sistemas convencionais.
Fatores como umidade, temperatura e disponibilidade de nutrientes afetam a atividade
respiratória da microbiota edáfica (Alef 1995b). A aplicação de materiais orgânicos também
pode interferir na atividade respiratória dos microrganismos do solo (Lundquist et al. 1999;
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
40
Bhattacharyya et al. 2001; Abdelhamid et al. 2004) devido, principalmente, aos teores de
carbono solúvel em água (Pascual et al. 1999b), pois o resíduo aplicado serve com fonte de
energia (Ros et al. 2003; Caravaca et al. 2005b), além de melhorar a aeração (disponibilidade
de oxigênio) do substrato (Chaoui et al. 2003). Esse comportamento pode ser constatado pelas
correlações positivas entre evolução de CO
2
e carbono orgânico (Nsabimana et al. 2004).
A adição de palha de milho favoreceu a emissão de CO
2
em solo sob diferentes tipos
de manejo (plantio direto ou adubação verde) (Vasconcelos et al. 1998). Palha de trigo,
associada à fertilização mineral, também estimulou a mineralização do C, em relação ao uso
de adubos químicos (Goyal et al. 1999). A aplicação de resíduos sólidos de origem urbana
também incrementou a respiração microbiana, e o aumento foi relacionado à liberação de
exsudados radiculares, gerados pelo melhor desenvolvimento do vegetal no solo fertilizado
com adubo orgânico (Pascual et al. 1999b). De modo semelhante, Debosz et al. (2002) e
Fernandes et al. (2005) registraram que a respiração basal também foi estimulada com a
aplicação de resíduos orgânicos ao solo.
Sistemas de cultivo orgânico, devido aos elevados teores de matéria orgânica, podem
apresentar duas vezes mais CO
2
evoluído do que sistemas convencionais (Bettiol et al. 2002).
Sarangi et al. (2001) registraram aumento de 143% nas emissões de CO
2
em solo fertilizado
com 17,5 t resíduo ha
-1
, quando comparado ao tratamento com adubos sintéticos (N:P:K
80:40:40 kg ha
-1
). Similarmente, a aplicação de composto orgânico, associado ou não a
preparações fermentadas (biodinâmicas), favoreceu a respiração microbiana, em relação ao
solo não adubado ou recebendo fertilizantes minerais (Carpenter-Boggs et al. 2000).
Composto orgânico também foi fonte eficaz em estimular a respiração de solo cultivado com
trigo (Triticum aestivum L.), quando comparado à aplicação de fertilizantes químicos (Chaoui
et al. 2003). Esses benefícios sobre a atividade microbiana podem ser atribuídos ao
suprimento de fosfato pelo adubo orgânico, que fornece maior balanço nutricional em relação
ao uso de adubos químicos (Marinari et al. 2000).
O carbono adicionado na forma de composto orgânico é liberado em duas fases: na
primeira ocorre degradação dos compostos mais simples e a segunda é caracterizada pela
mineralização mais lenta das substâncias resistentes à degradação (Caravaca et al. 2005b).
Com isso, o tempo decorrido da aplicação do adubo interfere na atividade respiratória dos
microrganismos do solo. García-Gil et al. (2004) verificaram que a aplicação de 40 t ha
-1
de
lodo de esgoto estimulou a emissão de CO
2
após nove meses da aplicação do adubo, benefício
que não foi registrado após 36 meses da adubação, possivelmente devido à exaustão de
substratos facilmente degradáveis. No entanto, aplicações sucessivas de resíduo podem
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
41
favorecer a respiração basal (Antolín et al. 2005). Geralmente, em sistemas orgânicos
observa-se correlações positivas entre a atividade de várias enzimas e a evolução de CO
2
(Antolín et al. 2005; García et al. 2005).
O uso de fertilizantes orgânicos não serve apenas para incrementar a produtividade e
melhoria da qualidade de solos agrícolas; no semi-árido da Espanha, a aplicação adequada
tem sido prática na recuperação de áreas desertificadas (Guerrero et al. 2000), com o emprego
desses fertilizantes aumentando os teores de M.O. do solo (Pascual et al. 1998) e favorecendo
a atividade respiratória e de enzimas (Caravaca et al. 2002a; Ros et al. 2003; Caravaca et al.
2004).
3. Simbiose Micorrízica Arbuscular
Através do sistema radicular as plantas estabelecem relações com fungos do solo. Em
algumas situações, a interação pode ser patogênica, em outras não produz qualquer impacto
evidente no vegetal, mas há muitos casos em que a relação é benéfica para os dois parceiros.
Um exemplo clássico dessa associação é a simbiose mutualística entre certos grupos de
fungos do solo e raízes da maioria das plantas, conhecida como micorriza (Newsham et al.
1995). Nesta interação, o fotobionte é favorecido pelo aumento na absorção de água e
nutrientes do solo, enquanto o micobionte recebe fotossintatos produzidos pelo vegetal (Smith
& Read 1997).
Com base na morfoanatomia do sistema radicular colonizado pelos fungos, as
micorrizas são agrupadas em três grandes grupos: ectomicorrizas, ectendomicorrizas e
endomicorrizas. Entre os tipos de endomicorrizas, a arbuscular, que é caracterizada pela
formação de arbúsculos no córtex radicular do hospedeiro, é cosmopolita ocorrendo tanto em
Briophytas e Pteridophytas, quanto em plantas vasculares (Smith & Read 1997). Este tipo de
simbiose é formado por cerca de 200 espécies de fungos micorrízicos arbusculares (FMA),
que constituem atualmente o Filo Glomeromycota (Schussler et al. 2001). Evidências de
reprodução sexuada não foram obtidas, mas os esporos de FMA apresentam núcleos
geneticamente distintos (Hijri & Sanders 2005), que conferem diversidade genética e
funcional a esse grupo de fungos.
A simbiose micorrízica arbuscular é antiga e os FMA parecem ter sido determinantes
no processo de colonização das plantas no ambiente terrestre. Registros fósseis indicam que
esses fungos surgiram há 460 milhões de anos (Ordoviciano), período em que a flora era
possivelmente representada por Briophytas (Redecker et al. 2000). A parceria entre os
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
42
simbiontes teve êxito e pode ser atualmente constatada nas diversas regiões do mundo (ártica,
temperada e tropical) (Mehrotra 2005). Além disso, os fungos micorrízicos potencialmente
determinam a estrutura de comunidades vegetais (van der Heidjen et al. 1998), enquanto as
plantas parecem controlar a diversidade de FMA nos ecossistemas (Johnson et al. 2005).
Após germinação e crescimento micelial assimbiótico, os FMA colonizam o córtex
radicular dos vegetais, com formação de estruturas inter e intracelulares (Smith & Read 1997)
que, após intensa dicotomização, originam os arbúsculos, considerados sítios de troca entre os
parceiros (Azcón-Aguilar & Barea 1997). Apesar da ocorrência generalizada no Reino
Vegetal, apenas dois tipos morfológicos de colonização têm sido evidenciados: o denominado
Arum, que se caracteriza por intensa colonização intercelular e formação de arbúsculos
altamente ramificados e o Paris, que é reconhecido pela formação de hifas enoveladas
intracelulares (Karandashov & Bucher 2005).
A formação da simbiose é regulada pela expressão de genes do fungo e da planta e
ativada pela percepção e transdução de sinais primários; no entanto, a origem (fúngica ou
vegetal) e a natureza desses sinais não são conhecidas (Karandashov & Bucher 2005).
Recentemente, Pamiske (2005) referiu que vegetais liberam estrigolactonas (grupo dos
sesquiterpenos lactona) como possíveis ativadores da ramificação de hifas de FMA no
processo de colonização radicular.
O custo da presença do fungo na raiz pode ser de 4-20% do conjunto de fotossintatos
(Morgan et al. 2005), que geralmente é revertido em maior aporte de nutrientes para o vegetal
(Bratek et al. 2002; Ilbas & Sahin 2005). Ao mesmo tempo em que ocorre a colonização
intraradicular, começa a produção de micélio extraradicular, responsável pela absorção de
nutrientes e formação de esporos no solo (Sylvia 1990). Adicionalmente, o micélio externo
pode formar estruturas ramificadas absortivas, conhecidas como ‘BAS’ (do inglês, branched
absorbing structure), que também estão envolvidas na aquisição de nutrientes, apresentando
alta atividade metabólica (Bago 2000).
Os FMA são considerados os principais componentes da microbiota do solo (Oehl et
al. 2003), sendo um dos principais benefícios da simbiose micorrízica arbuscular para o
hospedeiro o aumento na absorção de nutrientes com baixa mobilidade no solo, como o P
(Johnson et al. 2005). Entretanto, o papel dos FMA na absorção de elementos considerados
altamente móveis no solo, como o nitrogênio, também foi evidenciado (Newsham et al.
1995). Esses fungos são importantes no estabelecimento e manutenção de sistemas
sustentáveis, que visam a conservação da capacidade produtiva do solo, redução no uso de
insumos e energia e otimização da ciclagem de nutrientes (Bagyaraj & Reddy 2005).
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
43
Apesar da ocorrência generalizada e ausência de especificidade hospedeira (Allen et
al. 1995), pois os FMA podem se associar a cerca de 200.000 espécies vegetais (Johnson et
al. 2005), compatibilidade funcional entre os parceiros tem sido registrada (Sylvia et al.
2003). Mesmo assim, alguns vegetais não formam simbiose micorrízica arbuscular. Entre
esses, estão representantes das famílias Amaranthaceae, Brassicaceae, Chenopodiaceae,
Commellinaceae, Cyperaceae, Juncaceae, Poligonaceae e Proteaceae (Moreira & Siqueira
2002).
A importância da simbiose micorrízica arbuscular é conhecida tanto em sistemas
naturais como manejados, sendo atualmente considerada um dos principais componentes de
sistemas sustentáveis (Jeffries et al. 2003). No entanto, as dificuldades na comercialização de
inoculantes, associado à falta de conscientização dos agricultores sobre os benefícios do uso
de FMA têm sido empecilho à aplicação efetiva desses fungos na agricultura, devendo-se
determinar a viabilidade econômica da inoculação (Sieverding 1991).
3.1. Papel de FMA na atividade microbiana em solos com adubo
orgânico
No solo, os FMA constituem a maior parte da biomassa microbiana (Kennedy 1998),
desempenhando importante papel na agregação de partículas (Rillig 2004b) e no ciclo de
nutrientes, especialmente do P (Smith & Read 1997); porém, pouco se conhece sobre a
contribuição desses microrganismos na atividade microbiana do solo. Duponnois et al. (2005)
registraram alterações na atividade microbiana quando Acácia holoserica Cunn. Ex G. Dan
estava simbioticamente associada a Glomus intraradices Schenck & Smith. Por outro lado,
Wamberg et al. (2003) verificaram benefício da inoculação de G. intraradices na evolução de
CO
2
de solo cultivado com Pisum sativa L., apenas quando as plantas estavam no estádio
reprodutivo. O principal mecanismo micorrízico no aumento da atividade microbiana do solo
são as alterações na liberação de carboidratos pelas raízes de plantas micorrizadas, que
afetaria a atividade dos microrganismos rizosféricos (Wamberg et al. 2003; Rillig 2004a),
visto que tais compostos servem de fonte de nutrientes para a microbiota do solo (Izquierdo et
al. 2005). Contudo, não se pode descartar a influência direta da trama de hifas na melhoria da
qualidade do solo (Rillig 2004a).
A micorrização de Dorycnium pentaphyllum Scop com Glomus deserticola Trappe,
Bloss & Menge ou G. intraradices favoreceu a atividade de enzimas (desidrogenase, urease,
fosfatase ácida, e E-glicosidase) em solo adubado com resíduo de beterraba + Aspergillus
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
44
niger Tiegh + fosfato de rocha, em relação ao solo sem adubo, sendo os maiores valores
observados quando as plantas estavam associadas a G. deserticola, indicando que os
benefícios podem ser dependentes da espécie de FMA (Caravaca et al. 2004). No sistema
ectomicorrízico, Pinus halepelensis Mill e Pisolithus arhizus (Pers) Rauschert, em solo com
100 t ha
-1
de resíduo orgânico municipal, houve aumento na atividade de enzimas
(desidrogenase, catalase, urease, protease e fosfatase ácida) e na evolução de CO
2
(García et
al. 2000b). Com isso, observa-se a importância da aplicação conjunta de FMA e adubos
orgânicos na modificação das características biológicas do solo (Medina et al. 2004b).
Apesar dos FMA desempenharem importante papel na agricultura orgânica (Jeffries et
al. 2003) e contribuírem para aumentar a atividade microbiana, Caravaca et al. (2002a)
observaram que a aplicação de composto orgânico superou o efeito da micorrização (Olea
europaea L. e G. intraradices) em aumentar a atividade de enzimas (E-glicosidase, fosfatase
ácida e desidrogenase). De modo similar, Medina et al. (2004a) registraram que a aplicação
de resíduos foi o principal fator que alterou a atividade da E-glicosidade e da fosfatase ácida
na rizosfera de D. pentaphyllum, em relação à inoculação com FMA nativos.
3.2. Glomalina
Um dos benefícios relevantes da simbiose micorrízica arbuscular é o favorecimento da
formação de agregados do solo (Bethlenfalvay et al. 1999), importante para o bom
desenvolvimento do hospedeiro (Rillig et al. 2002a). Inicialmente, pensava-se que a
contribuição do FMA neste processo era devido apenas à trama de hifas presentes no solo
(Tisdall & Oades 1982). A possível ação de subprodutos atuando como agentes cimentantes
foi considerada (Tisdall 1994), visto que moléculas, como polissacarídeos de origem
microbiana, atuam no processo de agregação (Foster 1981); contudo, a natureza bioquímica
desse(es) componente(s) não era conhecida. Em meados da década de 1990, Wright &
Upadhyaya (1996) observaram a presença de uma proteína que era extraída do solo em
grandes quantidades (na ordem de miligramas) quando se utilizava citrato de sódio em
elevadas temperaturas (121 ºC). Testes imunoreativos indicaram que essa biomolécula é
produzida apenas por FMA (Wright et al. 1996) e por isso foi denominada glomalina, numa
referência à antiga ordem Glomales na qual os FMA estavam classificados (Morton & Benny
1990). Esta proteína contribui de modo similar às raízes e à cobertura vegetal, no processo de
agregação de partículas do solo, sendo o efeito neste processo mais efetivo do que a trama
micelial (Rillig et al. 2002b).
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
45
A glomalina é positivamente relacionada com a produção de micélio extraradicular
(Treseder et al. 2004); e as hifas externas são responsáveis pela síntese deste glicoconjugado,
que também é encontrado em esporos e raízes colonizadas (Wright et al. 1996).
Recentemente, Driver et al. (2005) sugeriram que a maior parte da glomalina no solo não
provém de liberação passiva ou de secreção hifálica, visto que 80% da proteína estava
fortemente ligada à parede de hifas e esporos de G. intraradices, não estando simplesmente
associada à superfície da hifa.
Bioquimicamente, a glomalina é uma glicoproteína, formada por 60% de carboidrato
(Wright & Upadhyaya, 1998) que se liga à porção protéica por ligações glicosídicas do tipo N
(resíduos de asparagina) (Voet et al. 2002; Wright et al. 1998), apresentando aminoácidos
alifáticos (valina, por exemplo) e aromáticos na cadeia polipeptídica (Rillig et al. 2001b). A
molécula é insolúvel, hidrofóbica (Wright & Upadhyaya 1996), com presença de resíduos
glicídicos tipo manose, glicose, N-acetil galactosamina e di/triacetil chitobiose (Wright et al.
1996) e elevada quantidade de ferro (0,8-8%) na sua estrutura química (Wright & Upadhyaya,
1998). Apresenta-se em gel SDS-PAGE com duas bandas (67 e 94 KD), devido à presença de
proteínas com diferentes graus de glicosilação nos extratos brutos, enquanto em gel para
proteínas nativas uma banda mostra focalização isoelétrica entre pH 7,3-7,5 e a outra em pH
6,9 (Wright et al. 1996). Igualmente a outras substâncias, como ácidos graxos e suberinas, a
glomalina constitui a fração humina da matéria orgânica (Hayes & Clapp 2001), sendo
considerada o maior componente da fase orgânica do solo (27%), função anteriormente
creditada aos ácidos húmicos, que representam apenas 8% (Wright & Nichols 2002). Rillig
(2005) sugere que a glomalina pode ser classificada como hidrofobina, pois está presente na
superfície de hifas e forma uma camada hidrofóbica na interface água-ar.
Tipicamente considera-se duas frações de glomalina: a facilmente extraível (GFE) e a
glomalina total (GT) (Wright & Upadhyaya 1996). Recentemente, Nichols (2003) sugeriu um
terceiro “pool” denominado “scum”, que é altamente hidrofóbico e observado quando potes
de cultivo de FMA em areia são submersos em água e ocorre a formação de uma camada
espumosa na superfície. Adicionalmente, Lovelock et al. (2004b) sugerem a presença de uma
fração denominada “residual”, que é extraída apenas quando bases fortes são empregadas. A
fração GFE é extraída em solução de citrato de sódio (20 mM; pH 7,0) após um ciclo em
autoclave (121 ºC) por 30 minutos. Ao sedimento deste extrato e com a adição de citrato de
sódio mais concentrato e alcalino (50 mM; pH 8,0), consegue-se extrair a fração GT, sendo
que este procedimento deve ser conduzido até os sobrenadantes não apresentarem coloração
marrom-avermelhada, característica da glomalina (Wright & Upadhyaya 1998).
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
46
Recentemente González-Chávez et al. (2004) fizeram uso de borato de sódio (100 mM; pH
9,0) como solução extratora. O processo de extração desse glicoconjugado do solo elimina
proteínas termossensíveis (Wright et al. 2000); com isso, a precipitação ácida, usando HCl ou
ácido tricloroacético (TCA), que é empregada para precipitar proteínas extracelulares
presentes no solo (Murase et al. 2003), seguida de diálise, em meio com ou sem tampões
orgânicos (borato de sódio ou Tris-HCl), fornece fração protéica com elevado grau de
purificação (González-Chávez et al. 2004). Utilizando espectroscopia de ressonância
magnética nuclear, Rillig et al. (2001b) observaram que, além da glomalina, os extratos
protéicos não apresentam outros peptídeos ou taninos, componentes comumente presentes em
extratos de solo.
Após extração, que pode ser realizada em simples “panela de pressão” (Wright &
Jawson 2001), a quantificação da glomalina é feita por métodos bioquímicos de rotina na
dosagem de proteínas (por ex. Bradford 1976) ou pode-se ainda fazer uso de técnicas
imunológicas, como o ELISA. Para isso é necessário o anticorpo monoclonal MAb32B11,
que foi utilizado inicialmente por Wright et al. (1996) para identificar a presença da glomalina
em hifas, esporos e raízes colonizadas por FMA. Esse anticorpo, que foi produzido a partir de
macerado de esporos de G. intraradices injetado em camundongo, reconhece epítopo da
glomalina apenas em FMA, não reagindo com outros fungos do solo. A reação com a
glomalina nos extratos de solo, superfície de hifas e esporos é verificada pela ligação do anti-
anticorpo conjugado ao isocianato de fluoresceína (FITC) (Wright 2000). As frações de
glomalina GFE e GT determinadas por este método são denominadas glomalina facilmente
extraível e glomalina total imunorreativas (GFEIR e GTIR, respectivamente), sendo esta
imunorreatividade indicativo da similaridade da glomalina extraída de solo com a protéina das
hifas de G. intraradices, utilizada para produção do MAb32B11 (Rillig 2004b).
Pouco se conhece sobre a caracterização química da glomalina e isto constitui
empecilho para melhor entendimento da contribuição desta biomolécula no ciclo do carbono
no solo (Zhu & Miller 2003). Aliado a isto, não se conhece o(s) gene(s) responsável (eis) pela
sua síntese. Diante dessa problemática, Rillig (2004b) propôs nova terminologia, sugerindo a
troca do termo “glomalina” por “proteína do solo relacionada a glomalina”; para as frações de
glomalina comumente extraídas de solo, o autor sugere a substituição do termo GT e GFE por
BRSP (proteína total do solo reativa ao método de Bradford) e EE-BRPS (proteína facilmente
extraível do solo reativa ao Bradford), respectivamente. Caso a fração utilizada seja a
imunorreativa, deve-se substituir “BR” por “IR”. Wander (2004) acrescenta que os
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
47
procedimentos de extração de glomalina devem ser otimizados, visando a separação de
“pools” com cinéticas e funções distintas.
Estimativas da produção de glomalina variam de 1-15 mg g
-1
solo (Wright &
Upadhyaya 1996; 1998). Em áreas agrícolas, os valores de glomalina facilmente extraível e
total estão em torno de 0,5 e 3 mg g
-1
solo, respectivamente (Rillig et al. 2003a); porém, em
regiões semi-áridas, os valores de produção são comparativamente baixos, não excedendo 0,3
e 0,6 mg g
-1
solo (Bird et al. 2002). Em áreas revegetadas com plantas micorrizadas a
produção pode chegar a 3,65 mg g
-1
solo (Caravaca et al. 2005a). Em solos de floresta, Rillig
et al. (2001b) conseguiram extrair > 60 mg glomalina g
-1
solo.
A glomalina representa 8 % da massa seca das hifas (González-Chávez et al. 2004) e é
considerada produto da atividade dos FMA. Algumas frações são potenciais indicadores do
impacto de práticas agrícolas (Rillig 2004b) e apontadas como biomarcadores para biomassa e
atividade desses fungos no solo (Millner & Wright 2002), especialmente ao nível de
ecossistema (Rillig & Allen 1999). A glomalina representa 4-5 % do carbono orgânico do
solo, enquanto a biomassa microbiana (estimada pelo método da fumigação e extração)
representa apenas 0,2 % (Rillig et al. 2001b). Estima-se que sua residência no solo seja longa
(6-42 anos) e com baixa taxa de degradação (25 %) em relação às hifas, que apresentam
elevada (60 %) decomposição e reduzida permanência (5-6 dias) no solo (Rillig et al. 2001a;
Staddon et al. 2003; Steinberg & Rillig 2003). O rápido “turnover” das hifas em relação à
glomalina pode justificar a ausência de correlação entre produção de micélio e proteína,
apontada por Rillig et al. (2001a). A relação linear da glomalina com a estabilidade de
agregados indica a influência deste subproduto da hifa no processo de estabilidade e
hidrofobicidade de partículas do solo (Wright & Anderson 2000). Porém, em solos com
elevados teores de carbonato de cálcio (71 %), a contribuição da glomalina no processo de
agregação de partículas é pequena, visto que nesses solos os principais agentes cimentantes
são carbonatos (Rillig et al. 2003a).
Presume-se que fatores do solo que afetam a simbiose micorrízica arbuscular também
regulem a produção de glomalina, visto que a presença (Rillig et al. 2002a) e o tipo de vegetal
(Wright & Anderson 2000; Bird et al. 2002) afetam a produção de proteína. Frações
imunorreativas de glomalina não foram afetadas pela aplicação de fogo em solos dos EUA,
fato possivelmente relacionado à estabilidade térmica desta proteína (Knorr et al. 2003). Em
contrapartida, Rillig et al. (2002b) registraram que as mesmas frações imunorreativas foram
reduzidas com o aquecimento do solo. Wuest et al. (2005) verificaram que a produção de
glomalina total também foi reduzida pela aplicação de fogo.
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
48
A glomalina pode servir como fonte de nutrientes (C e N), como sugerido por Harner
et al. (2005). Correlação positiva entre a emissão de CO
2
e concentração de glomalina indica
que a microbiota pode utilizar a porção glicídica desta glicoproteína nos processos oxidativos
(Rillig et al. 2003b).
O estado de agregação do solo influencia a produção de glomalina, como enfatizado
por Rillig & Steinberg (2002), os quais registraram que em solos com menor grau de
agregação, há maior produção de proteína e menor formação de hifas. Este comportamento
pode traduzir economia na produção de micélio extraradicular para que ocorra a síntese de
glomalina, que consiste em alto gasto energético para o micobionte (Driver et al. 2005).
Em algumas situações, solos fertéis podem favorecer a síntese de glomalina (Lovelock
et al. 2004a), devido à maior produção de hifas externas nesses solos. Entretanto, aumento
nos teores de Ca, P e K foram referidos por Lovelock et al. (2004b) como inibidores da
produção de GFE. Por outro lado, Rillig et al. (2003b) não encontraram relação entre os
teores de Ca, Mg, P e K e a produção de glomalina, enquanto o pH do solo foi negativamente
correlacionado com as frações GFE e GT. Correlações positivas entre as frações de glomalina
e o teor de carbono orgânico do solo têm sido registradas (Wright & Upadhyaya 1996;
Franzluebbers et al. 2000; Bird et al. 2002). Entretanto, mesmo esta proteína sendo
fortemente correlacionada com o carbono e o nitrogênio orgânicos do solo (Bird et al. 2002;
Wuest et al. 2005), pouco se conhece sobre a influência do aumento da fertilidade do solo,
decorrente da aplicação de adubos orgânicos, sobre a dinâmica da glomalina. Recentemente,
Wuest et al. (2005) registraram que a aplicação por 70 anos de 22,4 t ha
-1
ano
-1
de esterco não
maturado favoreceu a produção de glomalina; os autores atribuíram o efeito benéfico ao
aumento da retenção de umidade nos solos fertilizados.
Elevadas concentrações de dióxido de carbono na atmosfera afetam os FMA, que
podem funcionar indiretamente como dreno do excesso de carbono atmosférico (Staddon &
Fitter 1998), aumentando a produção de micélio extraradicular e de glomalina (Rillig et al.
2000), que favorece o estoque de carbono no solo (Rillig et al. 1999; Rillig et al. 2001b).
Quando incorporado na glomalina, o C apresenta-se estável no solo, visto que a sazonalidade
tem pouca influência na concentração desta proteína no meio (Lutgen et al. 2003).
Além dos fatores do solo, a produção de glomalina é dependente da espécie de FMA
(Wright et al.1996; Rillig et al. 2005), e este aspecto tem sido indicado como importante na
seleção de inoculantes para aplicação na agricultura (Miller & Jastrow 2000). O uso de fungos
com maior potencial para produção desta proteína no solo é indicado por melhorar as
condições edáficas e o crescimento do hospedeiro (Piotrowski et al. 2004; Rillig 2004b).
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
49
Nesse sentido, Wright & Upadhyaya (1999) registraram maior produção de glomalina por
Gigaspora rosea Nicolson & Schenck e Glomus caledonium (Nicolson & Gerdemann)
Trappe & Gerdemann em relação a Glomus intraradices, associados ao sorgo cultivado em
areia por cerca de três meses. Do mesmo modo, em condições de campo, Caravaca et al.
(2005a) verificaram maior produção de glomalina na rizosfera de Olea europaea quando
simbioticamente associada a Glomus claroideum Schenck & Smith em relação à inoculação
com fungos nativos. Porém, ainda não se determinou se há variação intraespecífica (entre
isolados) na produção de glomalina.
Apesar do conhecimento científico recente da glomalina, aspectos relacionados à
dinâmica desta glicoproteína em nível de ecossistema têm sido relatados. Rillig (2004b)
sugere a condução de ensaios em condições controladas para que haja melhor compreensão da
dinâmica desta proteína, visando posterior extrapolação dos padrões obtidos para o nível de
ecossistema. No panorama brasileiro, não se conhece a dinâmica e a ciclagem desta
biomolécula, tanto em ambientes naturais quanto manejados.
3.3. Germinação de FMA em substratos orgânicos
Antes de estabelecer simbiose com a raiz do hospedeiro, os FMA apresentam uma fase
denominada assimbiótica (ou pré-simbiótica), que consiste da germinação, com formação de
tubo germinativo, e produção limitada de micélio assimbiótico (Pawlowska & Charvat 2004).
Esses são os únicos estádios ativos dos FMA que podem ser estudados sem a presença do
vegetal (Brundrett & Juniper 1995).
O processo germinativo ocorre na ausência de hospedeiro, a partir das reservas
energéticas contidas no esporo (Giovannetti 2000). Contudo, o micélio formado, mesmo
absorvendo nutrientes do meio (Souza & Berbara 1999), não consegue se estender sem a
formação da micorriza (Becárd et al. 2004); ocorre senescência das hifas, caracterizada pela
formação de septos e retração citoplasmática a partir do ápice hifálico (Maia et al. 1994;
Parmiske 2005) e início de autólise (Hildebrant et al. 2002). Esse comportamento caracteriza
o biotrofismo obrigatório do fungo (Hepper 1983c), visto que apenas na presença de raízes o
ciclo se completa (Bécard & Piché 1989a). Becárd et al. (2004) sugeriram que na presença de
sinais radiculares ocorre indução na expressão de genes ligados à atividade mitocondrial,
resultando no aumento das taxas respiratórias e na atividade ATPase da bomba de prótons,
responsável pelo aumento na absorção de Pi e redução na acidez citoplasmática. Com isso, o
micélio se estende e se ramifica em direção ao hospedeiro (Sbrana & Giovannetti 2005).
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
50
Após hidratação e acepção de oxigênio pelos esporos, ocorre divisão nuclear com
formação de grande número de vesículas e movimentos citoplasmáticos; posteriormente,
segue-se o alargamento da camada interna e digestão da parede intermediária do esporo,
havendo, por fim, possível pressão física para emissão do tubo germinativo (Siqueira et al.
1985). Esses processos são decorrentes da ativação do metabolismo, que resulta na formação
de micélio; porém, mesmo após 15-20 dias da germinação, não há depleção total das reservas
do esporo (Giovannetti 2000). Os esporos apresentam 45-72% de lipídeos, dependendo do
estádio de desenvolvimento do processo assimbiótico (Beilkby & Kidby 1980) e durante o
processo germinativo ocorre redução nos triacilgliceróis de reserva e aumento nos
fosfolipídeos (Becárd et al. 2004). Processos bioquímicos tais como: conversão de lipídios em
trealose, absorção e utilização de glicose e frutose, síntese de aminoácidos, como arginina e
glutamina e fixação do CO
2
(Bago et al. 1999) concorrem para o anabolismo durante a fase
assimbiótica dos FMA.
A germinação de FMA pode ocorrer através da parede do esporo ou de estrutura
especializada (Mehrotra 2005) e modos diferenciados de emissão do tubo germinativo entre
os gêneros de FMA têm sido registrados (Giovannetti 2000). Em Gigaspora Gerdemann &
trappe emend. Walker & Sanders é formada uma “parede” germinativa; Acaulospora
Gerdemann & Trappe emend. Buch germina depois da formação de uma estrutura específica
denominada “orb”; em Glomus Tulasne & Tulasne ocorre re-crescimento da hifa de
sustentação; em Scutellospora Walker & Sanders forma-se uma placa germinativa. Múltipla
germinação tem sido registrada em espécies de Gigaspora, e parece constituir mecanismo
para aumentar as chances de colonização do hospedeiro (Koske 1981b; Maia et al. 1994).
Os esporos de FMA podem passar por período de dormência, caracterizado pela
ausência de germinação, mesmo em condições ideais ao processo (Tommerup 1987); a
duração dessa fase depende da espécie de FMA, com longos períodos comumente referidos
em representantes de Acaulospora (Tommerup 1983a). A presença deste fenômeno pode estar
relacionada à época do ano em que os esporos são formados (Gemma & Koske 1988). A
manutenção dos esporos em baixas temperaturas é uma das formas de quebrar a dormência
(Safir et al. 1990).
Fatores físicos, químicos e biológicos do solo afetam a germinação e o crescimento
micelial assimbiótico, devendo ser fornecidas condições edáficas ideais para garantir o
desenvolvimento desta etapa do ciclo de vida dos FMA. Espécies de FMA requerem faixas
diferenciadas de pH para seu desenvolvimento (Hepper 1984d; Mosse 1987); nesse aspecto,
Green et al. (1976) observaram que Scutellospora coraloidea (Trappe, Gerdemann & Ho)
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
51
Walker & Sanders e Scutellospora heterogama (Nicolson & Gerdemann) Walker & Sanders
germinaram mais em condições ácidas, enquanto Glomus mosseae (Nicolson & gerdemann)
Gerdemann & Trappe em meio alcalino. Siqueira et al. (1984) referiram que esporos de
Gigaspora margarita Becker & Hall apresentaram maior taxa de germinação e de
crescimento micelial em meio ácido, o que não ocorreu com G. mosseae.
Elevadas concentrações de nutrientes no meio de crescimento podem inibir a emissão
do tubo germinativo em esporos de FMA (Daniels & Graham 1976); porém, o efeito
prejudicial depende do nutriente (Siqueira et al. 1982). Bressan (2001) registrou que a adição
de N (5, 10 e 50 mg dm
-3
) em meio com 2 mg P dm
-3
inibiu a germinação de Glomus
etunicatum Becker & Gerdemann. Em contrapartida, com a adição de 20 mg P dm
-3
em meio
contendo 5 mg N dm
-3
houve estímulo no processo, indicando o efeito deletério do nitrogênio,
em relação ao fósforo, na fase assimbiótica. Similarmente, Daniels & Trappe (1980)
registraram elevadas taxas (60-80%) de germinação de Glomus epigaeus=Glomus versiforme
(Karsten) Buch em meio com 100 mg dm
-3
de fosfato monocálcico. Concentrações entre 5 -
500 mg P dm
-3
também não inibiram a germinação de Gigaspora gigantea (Nicolson &
Gerdemann) Gerdemann & Trappe (Koske 1981a). Hepper (1983a) considerou que a presença
de 4080 mg dm
-3
de fosfato de potássio em meio ágar-água reduziu a germinação de G.
mosseae e G. caledonium; no entanto, em solo com 982 mg P dm
-3
não houve inibição do
processo. Wilson et al. (1989) consideraram que o efeito negativo do P na germinação de G.
etunicatum e G. mosseae foi dependente da esterilização do solo, pois em solo não
esterilizado altas concentrações de P (60 mg dm
-3
) são necessárias para não haver competição
dos FMA com os demais microrganismos do solo por este nutriente.
O aumento na quantidade de sais no solo afeta negativamente a emissão do tubo
germinativo por reduzir o potencial osmótico do meio (Estaun 1989); porém, a presença do
cloro e do sódio também pode inibir o processo (Hirrel 1981; Vallini et al. 1993). Outro fator
edáfico que pode comprometer as etapas assimbióticas é a saturação por alumínio, sendo o
uso do índice germinativo ferramenta útil na seleção de FMA tolerantes em favorecer o
cultivo de vegetais em solos com elevados teores deste elemento (Bartolome-Esteban &
Schenck 1994).
Fatores físicos como temperatura e umidade controlam o curso da fase pré-simbiótica
(Nadarajah & Nawawi 1987; Siqueira et al. 1985). Como registrado por Daniels & Trappe
(1980), umidade próxima à capacidade de campo e temperatura entre 18-25 ºC são condições
ideais para germinação de esporos de G. versiforme. Koske (1981a) observou que
temperaturas acima de 35 ºC ou abaixo de 15º C são prejudiciais ao processo e que a umidade
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
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entre 5-28 % é ideal para o desenvolvimento assimbiótico de G. gigantea. Glomus
caledonium e Acaulospora laevis Gerdemann & Trappe não germinaram em solos mantidos a
5 ºC (Tommerup 1983b). Solos com elevada umidade (18%) inibiram a germinação de
Glomus clarum Nicolson & Schenck e Glomus macrocarpum Tulasne & Tulasne e G.
etunicatum, sendo o efeito atribuído à redução na aeração do substrato e ao hiperparasitismo
dos esporos (Sylvia & Schenck, 1983).
A luminosidade também pode afetar o crescimento micelial assimbiótico de FMA.
Varela-Castejón et al. (1998) registraram redução na germinação de G. macrocarpum quando
os esporos foram expostos à luz; em contrapartida, Nagahashi et al. (2000) verificaram que a
luz induziu a ramificação do tubo germinativo em Gigaspora rosea, o que aumenta as chances
de colonização do hospedeiro.
Na tentativa de cultivar os FMA na ausência de raízes, estudos visando selecionar
tipos e concentrações de biomoléculas que permitissem a propagação do fungo sem
hospedeiro foram conduzidos, mas sem sucesso. Vários tipos de carboidratos foram
adicionados ao meio de cultivo de FMA, visando a propagação axênica. Koske (1981a)
registrou redução no crescimento micelial de G. gigantea em meio com 5 g L
-1
de glicose.
Inibição do crescimento micelial também foi registrada quando esporos de G. gigantea foram
mantidos em meio ágar-água suplementado com trealose, porém a presença de frutose,
arabinose, manitol, amido e sacarose não afetou o processo, sendo sugerida a ausência de vias
de absorção e metabolização desses compostos (Silva & Siqueira 1991). Taxas reduzidas de
germinação de G. margarita com o aumento na concentração de sacarose foram registradas
por Siqueira et al. (1982); no entanto, os autores verificaram estímulo no crescimento micelial
quando concentrações menores que 4g L
-1
foram empregadas, sendo o efeito estimulatório da
sacarose evidenciado após 20 dias de incubação. Vilariño & Sainz (1997) observaram que a
exposição, por até 30 minutos, em solução de sacarose, estimulou a germinação de esporos de
G. mosseae. De modo semelhante aos carboidratos, a presença de aminoácidos no meio pode
estimular (histidina, cistina e leucina), inibir (metionina e fenilalanina) ou não afetar (glicina,
lisina, prolina, entre outros) os processos pré-simbióticos de G. gigantea (Freitas & Siqueira
1994).
Moléculas presentes no meio de crescimento para FMA podem modular a fase pré-
simbiótica (Koske 1982). Tampões orgânicos podem ser utilizados na composição do meio de
germinação (Fracchia et al. 2001), e na maioria dos casos estimulam o crescimento do micélio
assimbiótico de várias espécies de FMA, tais como: Glomus caledonium (Carr 1991) e G.
etunicatum (Pawlowska et al. 1999); porém, os benefícios são dependentes do tampão
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
53
utilizado. Hepper (1984b) registrou aumento no crescimento micelial de G. caledonium em
meio com diferentes sais de enxofre (tiosulfato, metabisulfito, sulfito e sulfato), indicando que
esses compostos podem alterar o potencial óxido-redutor do meio e assim favorecer o
processo pré-simbiótico. Bécard et al. (1989), por sua vez, enfatizaram o papel estimulatório
do CO
2
(0,5%) no crescimento micelial de G. margarita. Este efeito é potencializado na
presença de alguns tipos de flavonóides no meio (Becárd et al. 1992; Chabot et al. 1992;
Poulin et al. 1993).
Flavonóides são moléculas que atuam na ativação de genes de nodulação em rizóbio,
podendo também estimular o crescimento micelial de FMA (Gianinazzi-Pearson et al. 1989).
Ishii et al. (1997) verificaram que flavonóides com a presença de grupamento OH na posição
3 da molécula estimularam o crescimento micelial de Gigaspora ramisporophora Spain,
Sieverding & Schenck. Gigaspora gigantea também teve a fase assimbiótica favorecida pela
presença de flavonóides, porém os benefícios foram dependentes do tipo e concentração
utilizados (Romero & Siqueira 1996).
Em algumas situações, a presença de certas moléculas não interfere nos processos pré-
simbióticos. Sannazaro et al. (2004) registraram que não houve efeito da adição de inibidores
da síntese de poliaminas (di-fluoro metil arginina e di-fluoro metil ornitina) sobre a fase
assimbiótica de G. rosea. Similarmente, Kirk et al. (2005) verificaram que a aplicação de
derivados de petróleo ao solo não interferiu na fase assimbiótica de Glomus intraradices, na
ausência de raízes.
A presença de microrganismos pode maximizar os processos pré-simbióticos (Graham
1982), tanto pela utilização de inibidores da germinação pelos microrganismos, como pela
produção de substâncias voláteis ou altamente difusíveis (Azcón-Aguilar et al. 1986), que
favorecem o desenvolvimento desta etapa do ciclo de vida dos FMA. Carpenter-Boggs et al.
(1995) registraram aumento no índice germinativo de G. margarita na presença de
actinomicetos (Streptomyces orientalis (Pitenger & Brigham) Lechevalier, Prauser, Cabeda &
Ruan), sendo o benefício atribuído à presença de compostos voláteis (MIB-2 metil-
isoborneol). Protuberâncias nas hifas assimbióticas de G. versiforme foram observadas
quando se utilizou esporos desinfestados, o que não ocorreu quando bactérias estavam
associadas ao esporo, indicando que esses microrganismos podem interferir na morfologia do
micélio (Mayo et al. 1986).
O processo germinativo ocorre na ausência de vegetais, contudo o efeito estimulatório
de sinais do hospedeiro tem sido documentado (Becárd et al. 2004). Suspensão de células de
Pueraria phaseoloides Benth estimulou o crescimento micelial de G. margarita (Paula &
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
54
Siqueira 1990) e S. heterogama (Paula et al. 1991), sendo o efeito decorrente do acúmulo e
liberação de metabólitos no meio. De modo similar, Gianinazzi-Pearson et al. (1989)
registraram que exsudados radiculares de Trifolium pratense L. estimularam os processos pré-
simbióticos de G. margarita. Exsudados radiculares de Lycopersicom esculentum Mill e
Daucus carota L. também favoreceram a ramificação das hifas de G. gigantea, G. rosea e G.
intraradices (Nagahashi & Douds 2000). Em contrapartida, a presença de exsudados de
Medicago sativa L. não afetou a germinação de G. mosseae (El-Atrach et al. 1989).
A composição do meio de germinação pode afetar o crescimento do tubo germinativo
de FMA (Daniels & Graham 1976). Máxima germinação (100%) ocorreu em 7 dias de
incubação quando esporos de G. albida foram inoculados em meio ágar-água, situação não
observada quando o meio de germinação foi areia ou à base de extratos de Panicum
miliaceum L. (Maia & Yano-Melo 2001).
Meios com elevada capacidade de troca catiônica (CTC) podem favorecer o processo
germinativo por adsorverem ou imobilizarem substâncias que podem inibir as etapas pré-
simbióticas (Watrud et al. 1978; Daniels & Trappe 1980). Aumento na CTC do substrato
pode ser alcançado pelo uso de materiais orgânicos compostados. Calvet et al. (1992)
observaram que a presença de substratos orgânicos (composto de casca de árvore, composto
de oliveira e turfa) não afetou a germinação e o crescimento micelial. Entretanto, maior
produção de esporos vegetativos de G. mosseae foi obtida nos substratos compostados. Por
outro lado, os ácidos húmicos encontrados em adubos compostados reduziram linearmente o
crescimento micelial assimbiótico de G. mosseae (Vallini et al. 1993). É necessário, portanto,
selecionar doses e tipos de adubos para estabelecimento de sistemas agrícolas orgânicos,
visando não comprometer a fase assimbiótica dos FMA, importante para desenvolvimento da
simbiose em áreas com manejo orgânico.
3.4. Colonização intra e extraradicular por FMA em solos com adubo
orgânico
Como parte do ciclo de vida, os FMA colonizam o córtex radicular dos hospedeiros,
formando extensa rede de hifas (Smith & Read 1997); Estas podem apresentar morfologias
diferenciadas para desempenhar funções específicas, como é o caso dos arbúsculos que
participam da troca de nutrientes entre os simbiontes (Barker et al. 1998). Vesículas também
podem ser formadas, mas a presença destas estruturas é restrita a alguns gêneros (Bierman &
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
55
Linderman 1983) e relacionada ao estoque de nutrientes do fungo, sendo importante fonte de
propagação (Staddon & Fitter 2001).
A perspectiva do estabelecimento de sistemas agrícolas sustentáveis implica,
atualmente, na utilização de quantidades adequadas de resíduos orgânicos com qualidade
(Salami & Osonubi 2002), devendo-se considerar o componente micorrízico no sistema
(Celik et al. 2004), que pode ser beneficiado pela composição química e produtos da
decomposição dos adubos no solo (Baby & Manibhushanrao 1996; Gryndler et al. 2005). No
entanto, o uso indiscriminado de fontes, e doses inadequadas, pode comprometer a formação
da associação micorrízica em solos com resíduos orgânicos (Angel & Heckman 1986; Martín
et al. 2002), privando os vegetais dos benefícios da simbiose. Por outro lado, respostas
positivas da aplicação de resíduos sobre o desenvolvimento intraradicular de FMA têm sido
relatadas (Verma & Arya 1998; Murphy et al. 2000; Gaur & Adholeya 2002; Oehl et al.
2004). Em outros casos, a presença do adubo orgânico no solo não interfere na colonização
pelo fungo (Caravaca et al. 2003b). Assim, para adequado estabelecimento da simbiose, as
condições de fertilidade do substrato devem ser determinadas (Trindade et al. 2003).
Fatores como espécie vegetal (Zabir & Koide 2000; Gaur et al. 2000) e de FMA (Hart
& Reader 2002b), além de características físico-químicas do solo (Ryan & Graham 2002) e
práticas de manejo (Baltruschat & Dehne 1988), como o uso de fertilizantes orgânicos, afetam
o estabelecimento da simbiose micorrízica (Brechelt 1989).
Os mecanismos que beneficiam os FMA em solos submetidos à adubação orgânica
não são claros (Palenzuela et al. 2002). Todavia, Muthukumar & Udaiyan (2000) observaram
que a elevada concentração de carboidratos na raiz foi correlacionada com os elevados níveis
de colonização arbuscular em Vigna unguiculata (L.) Walp cultivada em solos com adubos
orgânicos. Gryndler et al. (2005) sugeriram a melhoria nas propriedades do solo e a presença
de substâncias produzidas durante a decomposição da matéria orgânica adicionada ao solo,
como possíveis mecanismos para melhorar o desenvolvimento de FMA em solos adubados
com resíduos orgânicos.
A aplicação de resíduos orgânicos pode favorecer o estabelecimento de FMA,
especialmente em solos pobres em nutrientes, como observado na simbiose Pistacia lentiscus
L. e G. intraradices, em solos do semi-árido adubados com composto orgânico (Caravaca et
al. 2002b). De modo semelhante, Muthukumar & Udaiyan (2002) observaram que melhor
estado nutricional de V. unguiculata, decorrente da aplicação de resíduos orgânicos de origem
vegetal ou animal, foi correlacionado com a colonização micorrízica. Em contrapartida,
alguns autores (Angel & Heckman 1986; Ryan & Ash 1999) sugerem que a aplicação de P,
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
56
oriundo da adubação, em solos com baixa fertilidade, reduz a colonização por FMA e que em
solos férteis não há efeito negativo da fertilização orgânica.
O teor de matéria orgânica do solo é importante para o estabelecimento do FMA na
raiz (Quintero-Ramos et al. 1993; Carrrenho et al. 2001). No entanto, a dose aplicada é
fundamental para resultados satisfatórios (Cavender et al. 2003), pois em quantidades
elevadas (50%), mesmo a aplicação de materiais compostados pode reduzir a taxa de
colonização a valores menores que 2% (Sainz et al. 1998). Este comportamento foi observado
por Noyd et al. (1996), que relataram aumento na infectividade de FMA em áreas sujeitas à
mineração quando doses moderadas de composto orgânico (22,4 t ha
-1
) foram aplicadas.
Entretanto, quantidades elevadas do adubo (44,8 t ha
-1
) trouxeram prejuízos na atividade dos
fungos. Similarmente, Avio & Giovannetti (1988) verificaram redução na colonização
micorrízica com aumento na concentração de celulose no substrato de cultivo de Medicago
sativa. Em experimento de longa duração (18 meses) Caravaca et al. (2004) observaram que
as raízes de D. pentaphyllum tiveram menor taxa de colonização por G. deserticola ou G.
intraradices em solo adubado com resíduo de beterraba, o que não ocorreu no solo sem
adubo. Com o uso de FMA adaptados às condições de alta fertilidade, maior estabelecimento
do fungo poderia ocorrer em solos com elevadas doses de fertilizantes orgânicos (Hayman
1982); no entanto, estudos são necessários para comprovar esta hipótese.
Apesar da preconização que o aumento nas doses de resíduos orgânicos reduz o
potencial infectivo e a reprodução dos FMA, Tanu et al. (2004) obtiveram respostas lineares
no potencial infectivo de fungos nativos associados a Cymbopogon winterianus Jowitt, com o
aumento nas doses de resíduos orgânicos. Soedarjo & Habte (1993) também observaram
correlação entre o teor de matéria orgânica, incrementado pela incorporação de folhas de
Leucaena leucocephala (Lam.) de Wit no substrato de cultivo dessa espécie e a taxa de
colonização por Glomus aggregatum Schench & Smith emend. Koske. Este tipo de resposta
pode ser atribuído à depleção do P em substratos com adubos orgânicos, como sugerido por
Schubert & Lubraco (2000), o que resulta em elevadas taxas de colonização radicular.
Respostas negativas do uso de fertilizantes orgânicos sobre os FMA são
freqüentemente atribuídas ao elevado teor de nutrientes no solo após aplicação do adubo
(Estaún et al. 1999). Porém, Schiavo & Martins (2002) não observaram inibição na
colonização de Psidium guajava L. por G. clarum em substrato constituído por bagaço de
cana-de-açúcar e torta de filtro (3:1 v/v) apresentando 73 mg P dm
-3
. Este substrato também
foi favorável à colonização de raízes de bananeiras micropropagadas por G. clarum (Leal et
al. 2005). Similarmente, Zambolim et al. (1992) registraram elevadas taxas (100%) de
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
57
colonização de G. etunicatum em raízes de sorgo [Sorghum bicolor L. (Moench)] cultivadas
em substrato à base de turfa, vermiculita e esterco de galinha (4,5: 4,5: 1 v/v) com 1080 mg P
dm
-3
. Isto indica que outros fatores, além dos teores de nutrientes, podem atuar negativamente
no estabelecimento da simbiose, como substâncias fitotóxicas (Martín et al. 2002),
composição do resíduo (Borie et al. 2002) e a presença de patógenos nos resíduos orgânicos
(Elorrieta et al. 2003).
A manipulação adequada dos fatores do solo pelo emprego de fontes orgânicas pode
favorecer os FMA. Miller & Jackson (1998) verificaram que elevados teores de matéria
orgânica no solo e alta relação C/N foram positivamente correlacionados com a colonização
micorrízica de Lactuca sativa L. Em contrapartida, o aumento na densidade aparente do
substrato e o pH na faixa alcalina, decorrentes da adubação orgânica, foram apontadas por
Trindade et al. (2003) como fatores que influenciaram negativamente o estabelecimento de G.
margarita em raízes de Musa spp.
A redução na colonização dos FMA pode estar relacionada ao tipo de resíduo
empregado. Boyle & Paul (1988) registraram que a fertilização por oito anos com resíduo
compostado não alterou a simbiose em raízes de cevada (Hordeum vulgare L.) em relação ao
controle não adubado, enquanto a aplicação de materiais não compostados reduziu cerca de
seis vezes a colonização radicular. Além disso, a presença de substâncias inibitórias em
resíduos orgânicos, como apontado por Roldán & Albaladejo (1993), pode contribuir para as
respostas negativas observadas. Trindade et al. (1996) consideraram que o bom estado de
maturação do composto de lixo utilizado no substrato de cultivo foi importante para o
estabelecimento de G. clarum nas raízes de Zea mays L. Esse aspecto é importante, pois
materiais compostados apresentam elevadas concentrações de substâncias húmicas (ácidos
húmicos e fúlvicos) que favorecem a produção de micélio intra e extraradicular (Gryndler et
al. 2005).
Na agricultura orgânica, a escolha por fontes disponíveis na propriedade agrícola é
desejável (Ryan et al. 1994), pois reduz os custos de produção. A seleção do tipo de resíduo
orgânico mais promissor para formação da simbiose é importante, pois a heterogeneidade dos
materiais utilizados pode comprometer o estabelecimento do fungo na raiz (Borie et al. 2002).
Selecionando substratos para produção de mudas de videira (Vitis L.) micorrizadas, Zenke et
al. (2003) concluíram que o substrato comercial Plantmax
, constituído por cascas de árvore,
turfa, vermiculita e calcário, reduziu a colonização por G. etunicatum, G. clarum e
Acaulospora sp., enquanto o uso de composto termofílico foi o mais favorável para os fungos,
no final do período de aclimatização das plantas.
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
58
Outro fator que modula a colonização micorrízica em solos com elevadas doses de
adubo é a espécie vegetal. Utilizando elevadas proporções (50 %) de composto orgânico,
Gaur & Adholeya (2000) observaram que a colonização de Allium cepa L. foi estimulada, a
de Allium sativum L. reduzida e a de Solanum tuberosum L. não alterada. De modo similar,
Caravaca et al. (2002c) verificaram que em raízes de O. europaea a taxa de colonização por
G. intraradices não afetada pela presença de composto orgânico no solo, enquanto a adubação
prejudicou o estabelecimento do fungo no córtex radicular de Rhammus lycioides L.
Respostas neutras da adubação orgânica sobre a fase intraradicular dos FMA também
já foram registradas (Ishac et al. 1986; Vassilev et al. 1998; Souza et al. 2005). O uso de 30%
de esterco de curral não afetou a colonização micorrízica de cafeeiros (Coffea arabica L.)
inoculados com G. margarita (Souza et al. 1991). Utilizando isolado dessa mesma espécie de
FMA, Lins et al. (2003) também não evidenciaram alterações na taxa de colonização de raízes
de bananeira (Musa L. var. Caipira) em substrato adubado com 5 % de esterco. O teor de
matéria orgânica do solo cultivado com Glycine max não afetou o estabelecimento da
simbiose com G. intraradices (Frey & Ellis 1997). Com respostas semelhantes e utilizando
isolado dessa mesma espécie de FMA, Caravaca et al. (2002a) verificaram que não houve
alteração na colonização de raízes de O. europaea em solo adubado com composto orgânico.
A adição de P orgânico ao solo não interferiu na interação Calamagrostis villosa (Chaix) J.F.
Gmel e G. etunicatum (Baláz & Vosátka 1997).
Sistemas de cultivo tradicionais, que utilizam elevadas doses de adubos químicos,
apresentam altos teores de P inorgânico e esta característica é freqüentemente apontada por
prejudicar a fase intraradicular da simbiose (Dann et al. 1996; Bressan 2002). Por outro lado,
áreas com manejo orgânico apresentam elevado potencial de infectividade como apontado por
Douds et al. (1993, 1995, 1997). Em tais sistemas, os vegetais geralmente têm o sistema
radicular mais colonizado por FMA, quando comparados com aqueles sob cultivo
convencional (Mäder et al. 2002; Bending et al. 2004). Comprovando este fato, Mäder et al.
(2000) observaram que a aplicação de fertilizantes orgânicos aumentou de 30-60% a taxa de
colonização micorrízica em relação a áreas submetidas à adubação mineral. De modo
semelhante, Ryan et al. (1994) constataram que trigo cultivado em sistema orgânico teve as
raízes três vezes mais colonizadas que o controle, mantido em sistema convencional.
Raízes de Secale cereale L. cultivadas em sistema orgânico tiveram taxa de
colonização micorrízica em torno de 77%, enquanto em solo sob manejo convencional os
valores não ultrapassaram 11% (Sattelmacher et al. 1991). Foi sugerido que o elevado teor de
P presente no solo foi o fator chave para as respostas observadas. Ryan et al. (2000) não
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
59
observaram relação negativa entre o P, presente no solo de áreas com manejo orgânico ou
convencional, e a colonização micorrízica de Trifolium repens L., Lolium perene L. e
Paspalum dilatatum Poir. Apesar das respostas divergentes, Joner (2000) sugere que o uso de
fertilizantes orgânicos tem efeito menos deletério que a aplicação de doses equivalentes de
adubos minerais NPK, visto que o P orgânico presente nos adubos orgânicos, mesmo em
elevadas concentrações, não inibe os FMA (Linderman & Davis 2001).
A conversão de sistemas agrícolas convencionais em áreas de produção sustentável
inclui o uso de resíduos orgânicos que favorecem a microbiota do solo (Ryan & Ash 1999),
especialmente os FMA (Galvez et al. 2001). Nesse sentido, Gleissman et al. (1990, 1996)
constataram maior colonização micorrízica em morangueiros (Fragaria ananassa Duch) por
FMA em áreas convertidas para manejo orgânico em relação às mantidas em sistema de
produção convencional. Do mesmo modo, Werner et al. (1990) registraram maiores taxas de
colonização micorrízica (14,4 %) em áreas com transição para cultivo orgânico do que em
ambientes com fertilizantes minerais (2%). Esses benefícios são geralmente atribuídos à
ausência de pesticidas e ao aumento no teor de matéria orgânica do solo nas áreas orgânicas
recém-convertidas (Kurle & Pfleger 1994).
A utilização de adubos orgânicos associados a fertilizantes minerais, prática
denominada adubação organomineral, pode trazer benefícios para o vegetal (Kiehl, 1998). No
entanto, essa combinação pode prejudicar o estabelecimento dos FMA (Harinikumar &
Bagyaraj 1989). Vejsadová (1992) relatou aumento na colonização de trevo vermelho em
substrato com esterco, mas quando houve aplicação conjugada de fertilizantes minerais e
orgânicos, os FMA nativos apresentaram redução na habilidade de colonizar. Do mesmo
modo, Trindade et al. (2000) constataram que a aplicação de 30% de esterco bovino associado
à fertilização mineral (superfosfato simples e cloreto de potássio) reduziu a colonização
micorrízica de FMA nativos em mudas de mamoeiro (Carica papaya L.).
Em algumas situações, o uso combinado de adubos químicos e orgânicos pode
favorecer a formação da micorriza, como assinalado por Gryndler et al. (1989), os quais
observaram que o uso, por oito anos, de adubo organomineral (esterco + N + K+ P +Ca),
favoreceu a colonização de plantas de milho (Z. mays), em relação à utilização do resíduo sem
suplementação mineral. De modo semelhante, Alloush et al. (2000) não registraram efeito
negativo na micorrização de Cicer areitinum L. por G. clarum, em substrato com superfosfato
(50 mg P dm
-3
) associado a esterco bovino (12,5 g dm
-3
).
Estudos sobre o efeito de resíduos orgânicos na fase intraradicular dos FMA
geralmente informam a taxa de colonização micorrízica total, existindo poucos relatos da
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
60
intensidade das diferentes estruturas (hifas, arbúsculos e vesículas) formadas por FMA nas
raízes. Neste aspecto, Muthukumar & Udaiyan (2000) registraram aumento na formação de
arbúsculos e vesículas em raízes de V. unguiculata, após 45 dias de associação com fungos
nativos, em solos com resíduos orgânicos de origem animal e vegetal. Boddington & Dodd
(2000) também evidenciaram maior formação de arbúsculos em raízes de Desmodium
ovalifolium Wall colonizadas por Gigaspora rosea, Glomus manihots Howeler, Sieverding &
Schenck e Acaulospora tuberculata Janos & Trappe, em solo adubado com matéria orgânica,
em relação à fertilização mineral.
Avaliando qualitativamente a colonização por G. mosseae, G. claroideum e Glomus
geosporum (Nicolson & Gerdemann) Walker nas raízes de Plantago lanceolata L., após 11
meses de simbiose, Gryndler et al. (2002) constataram estímulo na produção de arbúsculos
nas raízes cultivadas em substrato adubado com 2 g dm
-3
de celulose, o que não ocorreu
quando o substrato foi adubado com 2,5 g dm
-3
de quitina (Gryndler et al. 2003). Quitina
também não foi fonte orgânica favorável ao desenvolvimento de arbúsculos por G.
intraradices em raízes de Sorghum bicolor (Abdel-Fattah & Mohamedin 2000). De modo
similar, redução na formação de arbúsculos no córtex radicular de sorgo (S. bicolor) e soja
(Glycine max) foi evidenciada por Ellis et al. (1992) em solo adubado com 15,8 t ha
-1
ano
-1
de
esterco bovino. Loth & Hofner (1995) consideraram que os efeitos inibitórios da aplicação de
resíduos orgânicos são mais pronunciados na formação de vesículas, visto que tais estruturas
estão presentes com maior intensidade em solos sem adubo (Christie & Kilpatrick 1992).
Como observado, o emprego de fontes orgânicas pode favorecer a fase intraradicular,
mas fatores como dose e tipo de resíduo, além da espécie vegetal e de FMA devem ser
considerados para o sucesso do estabelecimento da simbiose em áreas com manejo orgânico.
Após estabelecimento do fungo no córtex radicular, ocorre formação de extensa rede
de hifas externas à raiz, que em conjunto formam o micélio extraradicular. No micélio externo
de Gigaspora e Scutellospora ocorre a formação de células auxiliares, cuja produção antecede
a esporulação (INVAM 1993), pois existe translocação do material armazenado para
formação dos esporos (Declerck et al. 2004).
O micélio extraradicular é responsável pela absorção de água e nutrientes, melhorando
o aporte hídrico e nutricional do hospedeiro (Sylvia 1988; 1994). Além da ligação com a
nutrição, transportando especialmente o fósforo do solo para o fotobionte (Joner & Jakobsen
1994), o micélio externo também participa no processo de agregação de partículas (Wright &
Upadhyaya 1998), representando ca. 2% da matéria orgânica do solo (Gryndler et al. 2002).
Outro benefício do micélio é a capacidade de adsorver rapidamente (< 30 minutos) metais
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
61
pesados, protegendo o vegetal contra os prejuízos destes elementos em elevadas
concentrações no solo (Joner et al. 2000).
Alguns fatores edáficos como pH (van Aarle et al. 2002) e fósforo (Nogueira &
Cardoso 2000), regulam diretamente a produção de micélio externo (Christie & Kilpatrick
1992); porém, a produção da biomassa micorrízica no solo também depende da espécie de
fungo (Hart & Reader 2002a,b), visto que os FMA formam micélio com dimensões e
morfologias diferenciadas (Dodd et al. 2000).
A matéria orgânica do solo tem relação com a produção de micélio externo de FMA
(Joner & Jakobsen 1992), visto que as hifas destes fungos estão preferencialmente associadas
a partículas orgânicas como observado por St. Jonh et al. (1983). Apesar do metabolismo
assimilatório de FMA estar ausente (Moreira & Siqueira 2002), a habilidade saprofítica desses
fungos foi registrada em vários relatos (Hepper & Warner 1983; Warner 1984) e, mesmo que
restrita, indica papel relevante da matéria orgânica no desenvolvimento do fungo. Hodge et al.
(2001) observaram que Glomus hoi Buch & Trappe apresentou habilidade em utilizar N
orgânico em substrato adubado com folhas e caule de L. perene. Tarafdar & Marschner
(1994) relataram utilização de P orgânico pelas hifas de Glomus mosseae. Posteriormente,
Koide & Kabir (2000) observaram que as hifas externas de Glomus intraradices também
foram capazes de hidrolisar P orgânico. Isso credita aos FMA a função de mineralizadores do
P orgânico presente no solo (Feng et al. 2003).
Apesar de observarem que plantas de Trifolium subterraneum L. associadas a Glomus
invermaium Hall foram mais eficientes na utilização de P proveniente da matéria orgânica,
Joner & Jakobsen (1995b) não atribuíram esse efeito à aquisição direta ou mineralização do P
pelas hifas.
De modo similar à colonização intraradicular, a fertilização orgânica pode aumentar o
comprimento do micélio externo de FMA, sendo as respostas moduladas pela qualidade da
matéria orgânica aplicada (Joner & Jakobsen 1995a). Nesse sentido, Gryndler et al. (2002)
observaram que em solo adubado com celulose (2g/ litro de substrato) houve incremento na
produção de hifas externas de G. mosseae, G. claroideum e G. geosporum em simbiose com
P. lanceolata. Com o mesmo sistema simbiótico, Gryndler et al. (2003) observaram
benefícios da utilização de quitina na fase extra-radicular dos fungos testados. Estudando a
influência de parâmetros físico-químicos do solo sobre a simbiose Glycine max e G.
intraradices, Frey & Ellis (1997) verificaram que a presença de 42 g dm
-3
de matéria orgânica
no substrato estimulou a produção de micélio externo em relação ao substrato com apenas 10
g dm
-3
. De modo semelhante, Palenzuela et al. (2002) observaram aumento na produção de
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
62
micélio externo de G. intraradices associado a O. europaea, em solo adubado com composto
orgânico.
Boddington & Dodd (2000) observaram que a utilização de fósforo orgânico
proveniente da aplicação de matéria orgânica tem efeito menos deletério sobre o micélio
externo do que a aplicação de doses equivalentes de fertilizante mineral, comprovando o
efeito benéfico da adubação orgânica sobre os FMA.
Em avaliações do micélio externo, a difícil distinção entre o formado por FMA e
aquele produzido por outros fungos do solo implica na utilização de controles sem inoculação,
visando eliminar possíveis superestimativas (Sylvia 1994). Isto restringe o conhecimento da
dinâmica da produção de micélio a ensaios em casa-de-vegetação, e justifica o menor número
de relatos da influência de fontes orgânicas sobre o micélio externo em relação à fase
intraradicular da simbiose. No entanto, a aplicação de resíduos orgânicos aumenta o potencial
infectivo de FMA (Tanu et al. 2004), cuja participação das hifas externas é reconhecida.
Diante disso, deve-se escolher práticas sustentáveis, como o uso adequado de adubos
orgânicos, que favoreçam a fertilidade e não comprometam o desenvolvimento do fungo
micorrízico no solo (Mäder et al. 2000).
3.5. Eficiência de FMA em solos com resíduos orgânicos
O estabelecimento do FMA nas raízes do hospedeiro pode favorecê-lo devido ao
aumento na absorção de nutrientes da solução do solo (Munyanziza et al. 1997) via formação
de microzonas de depleção (Werner et al. 1990). Este aspecto tem sido extensivamente citado,
especialmente em culturas de interesse agronômico (Barea 1991; Leal et al. 2005). A
melhoria na estruturação do solo pelos FMA, apesar de pouco estudada em relação aos
benefícios nutricionais (Ryan & Graham 2002), tem sido apontada como o segundo
mecanismo micorrízico para promoção do crescimento vegetal (Knorr et al. 2003).
Benefícios para a planta simbioticamente associada aos FMA incluem aumento na
produção de fitomassa (Kapoor et al. 2002) e produtividade (Mohammad et al. 2004; Ilbas &
Sahin 2005), redução no tempo de floração (Gaur et al. 2000), maior aporte nutricional
(Gupta et al. 2002), aumento na produção de óleos essenciais (Kapoor et al. 2004), tolerância
a estresses hídrico (Borkowska, 2002), salino (Yano-Melo et al. 2003) e antrópico (Malcová
et al. 2001), além da proteção contra patógenos radiculares (Pandey et al. 1999).
Benefícios da micorrização foram evidenciados em várias culturas de importância
econômica, como por exemplo, cafeeiro - Coffea arabica (Siqueira et al., 1998), mamoeiro -
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
63
Carica papaya (Trindade et al. 2000), bananeira - Musa spp. cv Pacovan (Yano-Melo et al.
1999), maracujazeiro amarelo - Passiflora edulis Sims f. flavicarpa Deg (Cavalcante et al.
2002a,b) e doce - Passiflora alata Curtis (Silva et al. 2004b), aceroleira - Malpighia
emarginata D.C. (Costa et al. 2001), mangabeira - Hancornia speciosa Gomes (Costa et al.
2003), gravioleira - Annona muricata L. (Chu et al. 2001), goiabeira - Psidium guajava
(Schiavo & Martins 2002), açaizeiro - Euterpe oleracea Mart (Chu 1999), cajueiro -
Anacardium occidentale L. (Ananthakrishnan et al. 2004), morangueiro - Fragaria ananassa
(Borkowska 2002), videira – Vitis sp. (Zenke et al. 2003), tomateiro - Lycopersicom
esculentum (Araújo et al. 1994) e macieira - Prunus prunifolia (Willd) Borkh (Locatelli &
Lovato 2002), entre outras.
O emprego de resíduos orgânicos é comum na agricultura, tanto na fase de muda,
quanto na formação e produtividade de pomares, e atualmente, os vegetais produzidos em
cultivo orgânico apresentam maior valor agregado no comércio em relação aos produzidos de
modo convencional (Gleissman et al. 1996). No entanto, para que a simbiose micorrízica,
importante componente de agrosistemas sustentáveis (Barea et al. 2002), possa atuar em solos
enriquecidos com adubo orgânico, a escolha do substrato é importante para se atingir máxima
resposta à micorrização (Vosatka et al. 1992). Nesse sentido, a qualidade (Martín et al. 2002)
e quantidade (Brechelt 1987) do resíduo aplicado são fundamentais.
O benefício da utilização de FMA na promoção do crescimento vegetal tem sido
demonstrado em solos com baixa fertilidade (Kahiluoto et al. 2001; Ilbas & Sahin 2005);
entretanto, em solos muito pobres o efeito da inoculação não é evidenciado (Caravaca et al.
2002a), sendo necessários níveis adequados de P e de outros nutrientes para se obter
resultados satisfatórios da micorrização (Mohammad et al. 2004). Nesse âmbito, Sainz et al.
(1998) não evidenciaram benefícios da micorrização de Trifolium pratense L. ou Cucumis
sativa L. em solo pobre em nutrientes, porém com a aplicação de 10% de vermicomposto,
maior crescimento vegetal foi obtido, sem inibição dos FMA. De modo similar, Ilbas & Sahin
(2005) verificaram que a aplicação de 100 mg KH
2
PO
4
dm
-3
associada à micorrização com
Glomus fasciculatum Gerdemann & Trappe favoreceu a produção de grãos de soja, o que não
ocorreu em solo não fertilizado.
A atuação do componente micorrízico em sistemas agrícolas requer condições edáficas
favoráveis ao estabelecimento da simbiose, sendo a utilização de adubos, em doses
adequadas, primordial para fornecer nutrientes de forma balanceada, sem prejudicar a
atividade do fungo no hospedeiro (Sainz et al. 1998). Contudo, em substratos ricos em
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
64
nutrientes, a simbiose pode se estabelecer, mas os benefícios da associação são mais evidentes
em estádios mais avançados da interação fungo-planta (Estaún et al. 1999).
Em alguns casos, o emprego de resíduos orgânicos pode favorecer o crescimento do
hospedeiro através do estímulo (Harinikumar & Bagyaraj 1989) ou mudança nas populações
nativas de FMA. A adubação orgânica pode selecionar e manter FMA mais eficientes, como
sugerido por Muthukumar & Udaiyan (2002) a partir de estudo com Vigna unguiculata
cultivada em solo adubado com fontes orgânicas de origem animal e vegetal, em condições de
campo.
Trabalhos visando a seleção de adubos e fungos mais promissores para o crescimento
vegetal em sistemas utilizando fontes orgânicas para adubação têm sido conduzidos. Lins et
al. (1999) relataram que a presença de 10% de esterco bovino estimulou o desenvolvimento
de mudas de Carica papaya associadas a fungos nativos isolados da rizosfera de mamoeiro.
Trabalhando com a mesma cultura, Trindade et al. (2000) verificaram que a simbiose com
Glomus etunicatum em solo com 5 ou 10% de esterco bovino favoreceu a formação de mudas
sadias. Por outro lado, o uso de 10% de esterco bovino inibiu a colonização micorrízica de
bananeiras (Musa sp.) micropropagadas, sendo a utilização de doses menores (5%) + turfa +
vermiculita, o substrato mais indicado para formação das mudas, sem comprometer os
benefícios da simbiose com G. margarita (Lins et al. 2003). Incrementos de ca. 300% no
crescimento de T. repens em simbiose com G. deserticola foram obtidos apenas quando o
solo recebeu resíduo aquoso de oliveiras (Vassilev et al. 1998).
Sinergismo positivo entre aplicação de composto de lixo urbano e a inoculação com G.
clarum sobre o crescimento do milho foi observado por Trindade et al. (1996), sendo
apontada a necessidade da presença do fungo para melhor aproveitamento do P encontrado no
resíduo. Do mesmo modo, em goiabeiras (P. guajava) cultivadas em substratos à base de
bagaço de cana-de-açúcar e torta de filtro (3:1 v/v), a inoculação com Glomus clarum
promoveu aumento na massa seca e nos teores de N e P das plantas, em relação ao controle
sem FMA (Schiavo & Martins 2002). Videiras micropropagadas, recebendo inóculo misto de
FMA (G. etunicatum, G. clarum e Acaulospora sp.) tiveram maior crescimento quando
cultivadas em substratos com adubos orgânicos do que em solo sem adubo; no entanto,
quando se utilizou o substrato comercial Plantmax
®
, o estabelecimento do fungo na raiz foi
prejudicado (Zemke et al. 2003).
Gaur & Adholeya (2000) observaram que em solo adubado com 50% de composto
orgânico de folhas, a inoculação com inóculo misto de FMA (Gigaspora, Scuellospora e
Glomus) incrementou em 52% e 46% a massa seca de plantas de cebola (Allium cepa) e batata
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
65
(Solanum tuberosum), respectivamente, em relação às plantas não associadas aos FMA.
Mudas micropropagadas de bambu [Dendrocalamus asper (Schultes) Backer ex Heyne]
também tiveram crescimento favorecido em solo adubado com ca. 17% de esterco de búfalo,
quando associadas a fungos micorrízicos nativos (Verma & Arya 1998). Estes também foram
importantes para a produção de óleos essenciais em Cymbopogon winterianus cultivado em
solo com 100 t ha
-1
de esterco de ave (Tanu et al. 2004).
O uso de resíduos humificados pode incrementar o crescimento vegetal pelo estímulo
de microrganismos benéficos como os FMA, como observado por Linderman & Davis (2001)
em solo adubado, com resíduos de videira compostados, para cultivo de cebola (A. cepa)
associada a G. intraradices. Brechelt (1989) também atribuíram aos microrganismos
benéficos, presentes no esterco bovino, utilizado para adubação do substrato, o aumento no
crescimento de Capsicum annum L. em associação com Acaulospora longula Spain &
Schenck.
A utilização conjunta de resíduos orgânicos e FMA também pode favorecer o
estabelecimento de vegetais em áreas semi-áridas (Caravaca et al. 2002a). Caravaca et al.
(2003b) registraram maior crescimento de Olea europaea formando simbiose com G.
intraradices em solo adubado com composto orgânico, após dois anos de experimentação.
Com respostas semelhantes, Caravaca et al. (2002b) verificaram maior altura de Pistacia
lentiscus L. em simbiose com G. intraradices apenas quando o solo foi adubado com
composto de lixo urbano. Esses benefícios são geralmente atribuídos ao aumento na
fertilidade do solo (Caravaca et al. 2004).
Baby & Manibhusharao (1996) verificaram que o emprego de resíduos orgânicos
favoreceu a população nativa de FMA e incrementou o desenvolvimento de plantas de arroz,
em relação ao tratamento sem adubação, sendo as respostas dependentes do tipo de resíduo
aplicado. No entanto, a necessidade da fase Lag na mineralização dos nutrientes em solo com
resíduos orgânicos pode retardar, inicialmente, os benefícios da adubação orgânica.
Gleissman et al. (1990) relataram que morangueiros cultivados em sistema de produção
convencional tiveram maior produção foliar e de frutos do que aqueles cultivados em sistema
orgânico. Por outro lado, o uso de 30 ou 60 t ha
-1
de esterco, além de possibilitar a formação
da micorriza, foi mais favorável ao crescimento de T. subterraneum do que a fertilização com
0,025 ou 0,044 t P ha
-1
(Joner 2000)
O uso de fertilizantes orgânicos pode não afetar o crescimento do hospedeiro
associado com FMA. Como observado por Alloush et al. (2000), a aplicação de 125 t ha
-1
de
esterco bovino não favoreceu o crescimento de Cicer areitinum em simbiose com Glomus
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
66
clarum. Com respostas similares, Palenzuela et al. (2002) não registraram aumento no
crescimento de Rhamnus lycioides L. associada a G. intraradices e cultivada em solo com 67 t
ha
-1
de composto orgânico. Abdel-Fattah & Mohamedin (2000) também verificaram que em
substrato com 1% de quitina, a aplicação de FMA é dispensável para incrementar o
crescimento do sorgo (Sorghum bicolor).
O uso de fertilizantes é importante para assegurar a produtividade de culturas. No
entanto, quando aplicado indevidamente pode comprometer os benefícios da simbiose
micorrízica como verificado em sorgo (S. bicolor) e soja (G. max ), que tiveram produtividade
favorecida quando cultivados em solo adubado com esterco bovino (15,8 t ha
-1
ano
-1
), mas a
colonização foi inibida nesta condição (Ellis et al.1992). Souza et al. (2005) também
registraram que o uso de 20% de composto de casca de acácia-negra no substrato para cultivo
de porta-enxertos de citrus [Poncirus trifoliolata (L.) Raf.] prejudicou a atuação de
Acaulospora scrobiculata Trappe e G. clarum, o que não ocorreu quando o substrato era
constituído por solo e areia.
4. Produção de inóculo de FMA
4.1. Considerações gerais
Como organismos benéficos aos vegetais, dentre estes vários de interesse agronômico,
os FMA devem ser produzidos em larga escala, visando sua aplicação e conseqüente redução
dos insumos agrícolas (Bagyaraj & Reddy 2005). No entanto, o caráter simbiotrófico do
fungo tem dificultado a produção de inóculo em larga escala visto que, diferentemente de
outros fungos de interesse biotecnológico, os FMA necessitam de um hospedeiro vegetal
compatível para completar o ciclo de vida e assim produzir propágulos que irão constituir o
inoculante desses fungos (Gianinazzi et al. 1988; Strullu et al. 1991). Mesmo com várias
pesquisas no campo de produção de inóculo de FMA, não se conseguiu propagar o fungo
axenicamente (Douds et al. 2005).
No Brasil, o campo de pesquisa para produção e comercialização de inóculo de FMA é
promissor e pouco estudado, visto que não existem inoculantes disponíveis no mercado, como
acontece no exterior (Siqueira & Klauberg Filho 2000). Além disso, o conhecimento limitado
da biologia dos FMA dificulta a comercialização, sendo necessários avanços nas tecnologias
de produção e armazenamento do inóculo (Azcón-Aguilar & Barea 1997). Transposto este
obstáculo, várias culturas poderão ser efetivamente beneficiadas pela simbiose micorrízica
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
67
arbuscular. No entanto, tentativas têm sido feitas para maximizar o processo e o emprego de
substâncias que estimulam o crescimento micelial dos FMA, como tampões orgânicos,
apontados como ferramentas na maximização da produção de propágulos de FMA (Millner &
Kitt 1992; Vilariño et al. 1997; Karandashov et al. 2000).
Fatores como tipo de hospedeiro, características físico-químicas do substrato de
cultivo (Sieverding 1991), e o método escolhido, devem ser levados em consideração na
produção de inóculo de FMA (Jarstfer & Sylvia 1992; Sylvia 1994).
O hospedeiro para multiplicação de FMA deve ser tolerante a alta intensidade
luminosa, ser propagado por sementes, produzir abundante sistema radicular e que este seja
extensivamente colonizado pelos fungos (Sylvia & Jarstfer 1994; INVAM, 1995). Vários
vegetais possuem esses requisitos, e podem ser utilizados como plantas multiplicadoras
(Tabela 1); todavia, a escolha vai depender da disponibilidade e da tolerância do vegetal à
temperatura local e ao ataque de pragas (Sieverding 1991).
Tabela 1. Exemplos de hospedeiros utilizados na produção de inóculo de fungos micorrízicos
arbusculares (FMA)
Hospedeiro Referência
Linum usitatissinum L. Dugassa et al. (1995); Hawkins & George (1997)
Paspalum notatum Flüggé Sylvia & Hubbel (1986); Wu et al. (1995)
Douds & Schenck (1990a); Struble & Skipper (1988)
INVAM (1995); Douds et al. (2005)
Ipomoea batatas L. Wu et al. (1995); Jarstfer et al. (1998)
Paiva et al. (2003)
Allium cepa
Jarstfer et al. (1998); Gaur & Adholeya (2000)
Manihot esculenta Crantz Potty (1985)
Sorghum bicolor
Zambolim et al. (1992); Raju et al. (1990)
Sorghum vulgare Piper Hitch Struble & Skipper (1988); Hetrick & Bloom (1986)
Gaur & Adholeya (2002)
Sorghum sudanense Staph Mohammad et al. (2000)
Glycine max
Struble & Skipper (1988); Luedders et al. (1979)
Bethlenfalvay et al. (1982)
Panicum maximum Jacq. Bagyaraj & Manjunath (1980)
Panicum miliaceum
Louis & Lim (1988a)
Tagetes erecta L. Hetrick & Bloom (1986)
Daucus carota
St-Arnaud et al. (1996); Douds (1997)
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
68
Bécard & Piché (1989a,b); Declerck et al. (1998)
Douds (2002)
Lycopersicom esculentum
Hetrick & Bloom (1986)
Zea mays
Simpson & Daft (1990); Huang & Tang (1988)
Elmes & Mosse (1984); Millner & Kitt (1992)
Gaur & Adholeya (2002)
Trifolium pratense
Chen et al. (2001)
Trifolium alexandrinum L. Gaur & Adholeya (2002)
Trifolium parviflorum Bunge ex Nyman Mac Donald (1981)
Phaseolus vulgaris L. Elmes & Mosse (1984)
Triticum aestivum
Thompson (1986); Simpson & Daft (1990)
Hawkins & George (1997); INVAM (1995)
Solanum tuberosum
Gaur & Adholeya (2000)
Pennisetum americanum L. Simpson & Daft (1990)
Allium sativum
Gaur & Adholeya (2000)
Pueraria phaseoloides
INVAM (1995)
Avena sativa L. Gaur & Adholeya (2002)
Cicer arietinum
Simpson & Daft (1990)
Polianthes tuberosa L. Gaur et al. (1998)
Medicago sativa
Gaur & Adholeya (2002)
Várias metodologias têm sido desenvolvidas para produção de inóculo de FMA
(Tabela 2) e todas demandam meses para produção de propágulos do fungo (Wood 1991).
Entretanto, na perspectiva da aplicação em larga escala, deve-se optar pelo método mais
econômico e prático, em termos de instalação e manutenção (Gianinazzi et al. 1988; Mehrotra
2005). A escolha vai depender da disponibilidade de material para estabelecimento do sistema
de produção, bem como da aplicação que se deseja fazer com o inóculo produzido (Saggin-
Júnior & Lovato 1999). Independente da técnica selecionada, o sucesso na multiplicação
dependerá de fatores como teores de nutrientes (Jarstfer et al. 1998), especialmente o P
(Douds et al. 2005; Bhadalung et al. 2005), pH (van Aarle et al. 2002) e temperatura do meio
(Raju et al. 1990; Gavito et al. 2005), os quais devem ser determinados para cada isolado de
FMA.
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
69
Tabela 2. Principais métodos para produção de inóculo de FMA
Métodos
FFMA multiplicado RReferência
Cultivo em solo
Gigaspora margarita Cardoso & Sanhueza (1985)
Struble & Skipper (1988)
Douds & Schenck (1990a)
Glomus fasciculatum Cardoso & Sanhueza (1985)
Glomus mosseae Struble & Skipper (1988)
Potty (1985)
Kuszala et al. (2001)
Glomus claroideum Struble & Skipper (1988)
Glomus clarum Paiva et al. (2003)
Glomus etunicatum Struble & Skipper (1988)
Paiva et al. (2003)
Glomus macrocarpum Struble & Skipper (1988)
Glomus manihots Siverding (1991)
Glomus intraradices Bagyaraj & Manjunath (1980)
Acaulospora laevis Gazey et al. (1992)
Acaulospora longula Luedders et al. (1979)
Acaulospora appendicula
Spain, Sieverding & Schenck
Sieverding (1991)
Entrophospora colombiana
Spain & Schenck
Sieverding (1991)
Cultivo em areia
Glomus sp. Jarstfer et al. (1998)
G. clarum Simpson & Daft (1990)
G. etunicatum Millner & Kitt (1992)
G. margarita
G. mosseae Millner & Kitt (1992)
Elmes & Mosse (1984)
Thompson (1986)
G. fasciculatum Elmes & Mosse (1984)
Thompson (1986)
Misturas específicas
Areia e solo G. mosseae Luedders et al. (1979)
G. fasciculatum Bagyaraj & Manjunath (1980)
Solo e argila expandida Glomus geosporum Kuszala et al. (2001)
G. fasciculatum Kuszala et al. (2001)
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
70
Argila expandida Gigaspora rosea Kuszala et al. (2001)
Fibra de vidro Glomus aggregatum Huang & Tang (1988)
Areia e “glass beads” G. mosseae Chen et al. (2001)
Turfa + solo + vermiculita + esterco G. etunicatum Zambolim et al. (1992)
Solo + composto de folhas Glomus sp.
Gigaspora sp.
Gaur & Adholeya (2002; 2005)
Scutellospora sp.
Solo + areia + celulose ou quitina G. claroideum
G. mosseae
G. geosporum
Gryndler et al. (2002, 2003)
Vermiculita + composto orgânico G. mosseae Douds et al. (2005)
G. etunicatum
G. geosporum
G. claroideum
G. intraradices
Gigaspora gigantea
Hidroponia
Glomus caledonium Mc Donald (1981)
G. mosseae Hawkins & George (1997)
G. intraradices Dugassa et al. (1995)
Aeroponia
E. colombiana Souza et al. (1996)
Entrophospora kentinensis Wu
& Liu
Wu et al. (1995)
G. clarum Paiva et al. (2003)
G. etunicatum Wang & Tschen (1994)
Paiva et al. (2003)
G. intraradices Dugassa et al. (1995)
Mohammad et al. (2000; 2004)
Sylvia & Hubbel (1986)
G. fasciculatum Wang & Tschen (1994)
G. mosseae Sylvia & Hubbel (1986)
Glomus sp. Jarstfer et al. (1998)
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
71
Cultivo in vitro
G. margarita Becárd & Piché (1989a,b)
Gadkar & Adholeya (2000)
Miller-Wideman & Watrud
(1984)
G. intraradices Chabot et al. (1992)
Declerck et al. (1998)
Diop et al. (1994a,b)
Douds (2002)
Juge et al. (2002)
St-Arnaud et al. (1996)
Gavito et al. (2005)
G. fasciculatum Declerck et al. (1998)
G. macrocarpum Declerck et al. (1998)
G. mosseae Douds (1997)
Glomus versiforme Diop et al. (1994a,b)
Declerck et al. (1996a,b; 1998)
Glomus cerebriforme McGee Gavito et al. (2005)
Glomus proliferum Dalpé et
Declerck
Gavito et al. (2005)
4.2. Uso de resíduos orgânicos para produção de inóculo de FMA
A reprodução dos FMA pode ser afetada pela presença da matéria orgânica do solo,
visto que tanto esporos quanto os demais propágulos do fungo estão geralmente aderidos às
partículas orgânicas (Gianinazzi-Pearson et al. 1984), havendo comumente estímulo na
esporulação quando fontes orgânicas são aplicadas ao solo (Baby & Manibhushanrao 1996;
Douds et al. 2005). Este benefício é decorrente da alteração na concentração de nutrientes
(Muthukumar & Udaiyan 2002) e aumento na aeração (Sieverding 1991) do solo pela
adubação, porém elevados teores de P podem inibir a reprodução de FMA (Mohammad et al.
2004).
Substratos com 2-4 % de matéria orgânica são indicados para cultivo de FMA
(Sieverding 1991), no entanto, o emprego de fontes orgânicas pode favorecer ou não a
abundância (Harinikumar & Bagyaraj 1989; Kurle & Pfleger 1994; Noyd et al. 1996) e a
diversidade (Oehl et al. 2003; 2004) de espécies de FMA. Focchi et al. (2004) não registraram
benefício da aplicação de adubos orgânicos sobre a abundância e diversidade de FMA em
citros. Glomus é o gênero de FMA mais referido em áreas orgânicas (Galvéz et al. 2001), pois
a produção de esporos neste grupo é favorecida pelo aumento nos teores de matéria orgânica
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
72
do solo (Carrenho et al. 2001). Por outro lado, espécies de Gigaspora e Scutellospora têm
sido referidas com baixa freqüência de ocorrência (Frank-Snyder et al. 2001; Oehl et al. 2003;
2004;). Enquanto espécies de Acaulospora e Entrophospora Ames & Schneider não tinham
sido registradas em áreas orgânicas (Douds et al. 1993; 1995; 1997; Galvéz et al. 2001;
Franke-Snyder et al. 2001). No entanto, recentemente, Oehl et al. (2003; 2004) encontraram
espécies de Acaulosporaceae em áreas com plantio orgânico, na Suíça.
Em algumas situações, o uso de resíduos pode comprometer a produção de esporos de
FMA, como observado por Ishac et al. (1986), os quais registraram redução na taxa de
reprodução de fungos nativos quando 5 g dm
-3
de composto de lixo foi adicionado ao solo
para cultivo do trigo (Triticum aestivum). Este tipo de resposta pode estar relacionada à
composição química (Roldán & Albaladejo 1993), à presença de metais pesados (Ortega-
Larrocea et al. 2001) e ao teor de P (Gaur & Adholeya 2000) presente no resíduo aplicado.
Entretanto, em algumas situações a concentração de P no substrato para cultivo de FMA não
inibe a propagação dos fungos. O uso de areia adubada com 111 mg P dm
-3
não inibiu a
esporulação de G. mosseae (Vestberg 1992) e a presença de 1800 mg P dm
-3
no compoto
orgânico favoreceu a produção de inóculo misto de FMA em condições de campo (Douds et
al. 2005).
O aumento nos teores de matéria orgânica do solo é positivamente correlacionado com
a produção de esporos de FMA (Mohammad et al. 2003), sendo alternativa de baixo custo na
otimização da produção de inóculo e favorecendo a adaptação dos fungos ao manejo
orgânico. No entanto, poucos ensaios visando selecionar fontes e proporções adequadas de
resíduos orgânicos para este fim têm sido conduzidos. Elevada esporulação (ca. 70 esporos g
-1
substrato) de G. etunicatum foi obtida por Zambolim et al. (1992), os quais utilizaram
substrato à base de solo, turfa e vermiculita enriquecido com esterco de galinha. Com
resultados semelhantes e em experimentos independentes, sucesso na esporulação de G.
claroideum, G. geosporum e G. mosseae foi obtido quando se incorporou 2 g quitina L
-1
(Gryndler et al. 2003) ou 2 g celulose L
-1
(Gryndler et al. 2002) no substrato de cultivo dos
fungos, em associação com Plantago lanceolata por 11 meses.
Para minimizar os custos de aquisição de inoculante micorrízico pode-se optar pela
propagação de FMA em campo, pois elevada esporulação (700 esporos g
-1
substrato) de
Glomus occultum (Paraglomus occultum Morton & Redecker) foi registrada por Sieverding
(1991) em condições de campo, na Colômbia. Porém, a solarização do solo deve ser
conduzida para reduzir a contaminação do inóculo produzido (Tarafdar 2005). O emprego de
fontes orgânicas que estimulem a propagação de FMA presentes no campo tem sido apontado
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
73
como alternativa para produção de FMA na propriedade agrícola (Gaur & Adholeya 2005).
Elevada esporulação (ca. 80 esporos g
-1
solo) de espécies de Gigaspora, Glomus e
Scutellospora foi obtida em solo adubado com cerca de 30% de composto de folhas e
utilizando-se Sorghum vulgare como hospedeiro (Gaur & Adholeya 2002). De modo similar,
Douds et al. (2005) registraram elevada produção de esporos (ca. 80 cm
-3
substrato) e de
propágulos infectivos de FMA (ca. 530 cm
-3
substrato) utilizando composto orgânico e
vermiculita (1:4 v/v) e Paspalum notatum como planta multiplicadora, em condições de
campo. No entanto, para o hospedeiro, os benefícios da aplicação de inoculantes produzidos
em substratos com resíduos ainda não foram determinados.
4.3. Infectividade e estocagem de inóculo
A infectividade do inóculo refere-se à capacidade dos propágulos em colonizar a raiz
de hospedeiro susceptível (Plenchette et al. 1989), sendo característica importante na seleção
de inoculantes para aplicação na agricultura (Abbott et al. 1994). Ensaios (Moorman &
Reeves 1979; Sieverding 1991; Feldman & Idzack 1994) para determinar a qualidade do
inóculo consistem na utilização de planta altamente micotrófica, geralmente o milho (Zea
mays), cultivada em substrato com proporções decrescentes do inóculo a ser testado; após 30
dias da emergência das plantas, as raízes são examinadas quanto à formação da micorriza,
podendo-se estimar a colonização (INVAM 2001) ou simplesmente assinalar a presença de
estruturas características da simbiose micorrízica arbuscular, para posterior determinação do
número mais provável de propágulos infectivos de FMA no inóculo. Fatores como tipo de
hospedeiro, substrato diluente e condições experimentais podem alterar os resultados obtidos
no ensaio (Wilson & Trinick 1982). Além dos bioensaios de infectividade, pode-se fazer uso
de corantes vitais, como o INT (iodonitrotetrazolium) para estimar a viabilidade de esporos de
FMA (Walley & Germida 1995).
Para validação comercial de inóculo de FMA, cultiva-se o milho em substrato com
10% de inoculante. Trinta dias após o início do experimento, o inóculo que produzir pelo
menos 25% de colonização nas raízes do hospedeiro é tido como viável para comercialização
(Sylvia 2001; INVAM 2001).
Após o inóculo ter sido produzido, é necessário mantê-lo viável para fins de pesquisa
ou aplicação na agricultura. Esse aspecto está relacionado à estocagem de inoculante de FMA,
que tem sido pouco documentada (Sylvia 1999), especialmente em sistemas para produção
desses fungos sem utilização de solo (INVAM 1994a).
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
74
Quando o inóculo é produzido de modo convencional, o solo ou a mistura específica
utilizada como substrato para cultivo do fungo servem como veículo para armazenamento
(INVAM 1994b). Após secagem, o substrato é comumente acondicionado em sacos de
polietileno (Bagyaraj 1994) e armazenadao a 8-10 ºC (Sieverding 1991). Para eleger o método
mais eficaz na preservação da viabilidade dos propágulos contidos no substrato, tanto para
fins comerciais quanto na manutenção de bancos de germoplasmas de FMA (Kuszala et al.
2001), a umidade do meio e a temperatura de estocagem devem ser levadas em consideração.
Por outro lado, o fungo multiplicado in vitro, com raízes transformadas, pode ser armazenado
a 4 ºC (Plenchette et al. 1996) ou encapsulado em matriz de alginato de sódio, sem perder a
capacidade de colonizar o hospedeiro (Declerck et al. 1996a; Jaizme-Veja et al. 2003).
Além dos fatores abióticos (temperatura e umidade do substrato) influenciarem na
preservação do potencial infectivo (Bendavid-Val et al. 1997), o estádio do ciclo de vida do
fungo pode afetar a infectividade do inóculo, visto que as hifas de alguns FMA são infectivas
se a esporulação não tiver sido iniciada, como observado em Acaulospora laevis (Jasper et al.
1993). A maturidade e o tamanho dos esporos presentes no inóculo também podem
influenciar a infectividade. Gazey et al. (1993) consideraram que esporos com maior diâmetro
apresentam retardo na germinação e maior produção de hifas germinativas do que aqueles
com dimensões menores, que germinam mais rápido, porém com menor comprimento
micelial. Estes comportamentos devem ser considerados na certificação comercial de
inoculantes.
O tipo de estrutura fúngica presente no inóculo de FMA influencia o potencial
infectivo. Staddon & Fitter (2001) registraram que hifas perderam a infectividade após
estocagem a 5 ºC por três semanas, enquanto a viabilidade das vesículas não foi alterada,
indicando que essas estruturas são responsáveis pela infectividade, quando se utiliza raízes
colonizadas e estocadas como fonte de inóculo.
Células auxiliares não são hábeis em colonizar o hospedeiro, não atuando como fonte
de propagação desses fungos (Bierman & Linderman 1983; Sieverding 1991). Servem, por
outro lado, como sítio temporário de estocagem de fontes de carbono (Mehrotra 2005), com o
pico de produção dessas estruturas antecedendo a esporulação (INVAM 1993). Declerck et al.
(2004) verificaram que houve recrescimento de hifas a partir de células auxiliares de
Scutellospora reticulata (Koske, Miller & Walker) Walker & Sanders; entretanto, o micélio
formado não foi hábil em colonizar raízes de alho (Allium porrum L.) e cenoura (Daucus
carota).
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
75
Esporos, além de serem a principal fonte de inóculo, são os propágulos com maior
durabilidade na ausência de hospedeiro (Gazey et al. 1993). Quando presentes e quiescentes,
garantem a infectividade do inóculo (Daft et al. 1987). Plenchette et al. (1996) verificaram
que raízes de D. carota colonizadas por G. versiforme in vitro apresentaram maior
infectividade em relação aos esporos.
A umidade do substrato no qual o inóculo foi produzido deve ser adequada para não
acentuar a perda da infectividade com a estocagem, como enfatizado por Ruiz-Lozano &
Azcón (1996), os quais registraram perda no potencial infectivo de inóculos de G. deserticola,
G. fasciculatum e G. mosseae em solo completamente seco após 6 meses de estocagem a 28-
32 ºC. Afek et al. (1994) observaram que não houve perda na infectividade de inóculos secos
e armazenados a 24 ºC, enquanto aqueles úmidos foram melhor preservados quando
armazenados a 9 ºC, temperatura que reduz a proliferação de microrganismos. Todavia,
Menge (1984) menciona que o inóculo deve estar seco, com umidade de 1-10 %, antes de ser
armazenado. Sieverding (1991) sugere que o armazenamento de inoculo úmido (5 % de
umidade) favorece a proliferação de microrganismos, mesmo em baixas temperaturas (4-8
ºC).
As condições de produção de FMA podem afetar a viabilidade do inóculo (Tommerup
1988) e recomendações para manutenção do fungo nas condições em que foi produzido têm
sido feitas (Daft et al. 1987; Nadarajah & Nawani 1987). Louis & Lim (1988b) observaram
que um isolado de G. clarum de região tropical manteve a infectividade quando armazenado
em temperaturas características de clima tropical (25-30 ºC).
A manutenção de inóculo de FMA em baixas temperaturas (4 ºC, por exemplo) é
prática comum nos laboratórios de pesquisa com FMA (Filion et al. 2001; Plenchette &
Strullu 2003; Mehrotra 2005). Esta recomendação tem sido feita devido à redução no
metabolismo (Tommerup 1983a), na mortalidade (Juge et al. 2002), aumento na
sincronização da germinação (Safir et al. 1990), quebra de dormência dos esporos
(Tommerup 1983b; Gemma & Koske 1988; Kim et al. 2002), assim como à ativação de
promotores ou inibição de bloqueadores da germinação dos esporos pelo frio (Tommerup
1987). Nemec (1987) registrou que o armazenamento por 175 dias, em baixas temperaturas
(1,1 ºC, 4 ºC e 10 ºC), preservou a viabilidade do inóculo de G. intraradices em relação à
estocagem a 16 ou 21 ºC. Por outro lado, Kuszala et al. (2001) observaram que inóculos de 20
espécies de FMA dos gêneros Acaulospora, Gigaspora, Glomus e Scutellospora mantiveram
a capacidade de colonizar o hospedeiro, independentemente da temperatura em que foram
armazenados (18-24 ºC, +4 ºC, -18 ºC, -80 ºC).
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
76
É desejável que o inóculo mantenha a infectividade por longos períodos (Nemec
1987), porém, estocagens prolongadas podem reduzir o potencial infectivo de FMA (Gould &
Liberta 1981; Warner 1983; Hardie 1984; Plenchette & Strullu 2003). Tommerup (1984)
mencionou que esporos germinados de A. laevis e Glomus caledonium podem manter a
infectividade por até quatro meses de armazenamento.
Além dos métodos tradicionais para manutenção da viabilidade de propágulos de
FMA, pode-se fazer uso da criopreservação. Hifas externas de FMA não associadas ao
hospedeiro podem manter a infectividade depois de submetidas ao congelamento (Addy et al.
1994), sendo este benefício mais pronunciado quando os propágulos passam por pré-
condicionamento ao frio antes de serem submetidos a temperaturas abaixo de -12 ºC (Addy et
al. 1998). Douds & Schenck (1990b) obtiveram resultados satisfatórios quando congelaram os
esporos de FMA no substrato em que foram propagados. Do mesmo modo, Nemec (1987) não
registrou prejuízo na formação de micorriza por G. intraradices após o inóculo ter sido
congelado por 62 h.
Tommerup (1988) mencionou que a utilização de “L-Drying”, que consiste na
dessecação à vácuo (1,3 × 10
-6
MPa), é eficiente na preservação do potencial germinativo de
A. laevis, G. caledonium, G. fasciculatum, Glomus monosporum Gerdemann & Trappe e
Scutellospora calospora Nicolson & Gerdemann (Walker & Sanders), por 8 anos, podendo
ser utilizada na estocagem de FMA em larga escala. Outras técnicas utilizadas são a
liofilização (Kuszala et al. 2001) e o encapsulamento em alginato (Strullu et al. 1991; Strullu
& Plenchette 1991).
Conhecimento sobre a estocagem de inóculo de FMA é restrito aos fungos cultivados
em solo (Douds & Schenck 1990a, por exemplo), em sistemas aeropônicos (Sylvia 1994) e in
vitro (Plenchette & Strullu 2003). Não foram determinadas as condições ideais de
armazenamento de FMA produzidos em substratos com resíduos orgânicos, que constitui
metodologia viável e de baixo custo na produção de inoculante desses fungos (Douds et al.
2005).
5. Seleção de inoculantes de FMA para aplicação na agricultura
Em programas de inoculação de FMA, a seleção de inóculo infectivo e efetivo é etapa
crítica para o sucesso da tecnologia micorrízica (Sylvia 1998; Calvente et al. 2004; Bagyaraj
& Reddy 2005). Nesse aspecto, apesar de não existir especificidade hospedeira na micorriza
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
77
arbuscular (Bagyaraj 1994), a compatibilidade funcional diferenciada entre os simbiontes
deve ser considerada (Bâ et al. 2000; Sylvia et al. 2003).
Para ser classificado como bom inoculante o FMA deve apresentar características
especiais, tais como: colonizar rapidamente o córtex radicular, produzir elevada biomassa no
solo e ser eficiente em aumentar o crescimento e o teor de nutrientes do hospedeiro (Abbott et
al. 1994).
De acordo com Wood (1991), vários fatores tais como: dependência micorrízica,
competição com FMA nativos e inibição da simbiose pelos elevados níveis de fertilidade do
solo podem afetar a eficiência do inóculo de FMA. Nesse sentido, Lambert et al. (1980)
mencionam que o emprego de FMA adaptados a fatores do solo pode trazer mais benefícios
para o hospedeiro, pois os fungos são mais competitivos.
Os FMA apresentam diferenças fisiológicas, inter e intraespecificas, que se revelam no
comportamento diferenciado na fase assimbiótica (Pawlowska & Charvat 2004) e na
promoção do crescimento vegetal (Sieverding 1991; Sieverding & Galvez 1988; Stürmer
2004; Munkvold et al. 2004). Isolados de G. intraradices, oriundos de áreas agrícolas na
Suíça, tiveram taxa diferenciada de produção de micélio e esporos (Koch et al. 2004).
Comprovando este fato, Giovannetti et al. (2003) verificaram que isolados de Glomus
mosseae, de regiões geográficas distintas, apresentaram incompatibilidade vegetativa de hifas
(ausência de anastomose), o que não ocorreu entre as hifas do mesmo isolado, indicando que a
propagação em condições edáficas distintas pode interferir na fisiologia dos FMA. Diante do
comportamento distinto de isolados de FMA, seleção prévia de inoculante deve ser feita antes
de recomendação para aplicação na agricultura.
O emprego de FMA nativos promove maior desenvolvimento (Quatrini et al. 2003) e
taxa de reprodução (Varshney et al. 2002) das plantas associadas em relação à inoculação
com fungos exóticos. Este comportamento é geralmente atribuído à adaptação genética e
fisiológica dos fungos (Caravaca et al. 2005a) e tem sido relatado tanto em condições de casa
de vegetação (Ananthakrishnan et al. 2004) como em campo (Sylvia et al. 1993). Medina et
al. (2004a) verificaram que o uso de fungos nativos favoreceu o crescimento de Dorycnium
pentaphyllum comparado com a aplicação de FMA exóticos. Similarmente, Calvente et al.
(2004) observaram maior crescimento de oliveiras (Olea europaea) quando fungos nativos
foram usados, em relação aos introduzidos. A utilização de inóculo de FMA nativo também
pode ser alternativa no estabelecimento de plantas em ambientes desertificados, como
registrado por Requena et al. (2001). Em contrapartida, Lesuer et al. (2001) observaram que o
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
78
local de origem dos FMA não afetou a concentração de P na parte aérea de Calliandra
calothyrsus Meissn.
Isolados fisiologicamente superiores em promover o crescimento vegetal podem ser
obtidos quando o fungo é multiplicado na condição edáfica que será usado (Graham et al.
1982). Devido a diferenças fisiológicas intraespecíficas observadas entre os FMA (Haas &
Krikum, 1985) e da capacidade de adaptação desses fungos às condições edáficas (Drew et al.
2003), Bethlenfalvay et al. (1989) sugerem a troca do termo “ecotipo” por “edafotipo”,
definindo-o como “variantes intraespecíficos de FMA que são de diferentes origens edáficas e
apresentam respostas fisiológicas diferenciadas em uma mesma planta cultivada em um
mesmo solo”. Nesse sentido, Clark et al. (1999a,b) registraram que FMA oriundos de solos
ácidos foram mais eficientes em promover o crescimento de Panicum virgatum L. em solo
ácido (pH
CaCl2
4,0), indicando que o pH do meio onde o FMA foi isolado pode interferir na
resposta do hospedeiro, devendo esse aspecto ser considerado em programas de inoculação.
Contudo, o comportamento diferenciado de isolados da mesma espécie pode ser dependente
da variável de crescimento estudada (Munkvold et al. 2004).
Em ambientes salinos, Pond et al. (1984) registraram que FMA provindos de áreas
salinizadas foram mais eficientes em promover o crescimento do tomateiro. De modo similar,
a temperatura em que o FMA é multiplicado pode afetar a eficiência simbiótica, como
ressaltado por Sieverding (1988) na simbiose Manihot esculenta e Entrophospora
colombiana.
Maximização dos benefícios do FMA para o hospedeiro, em solos contaminados por
metais, também já foi evidenciada quando os fungos foram multiplicados em substrato
contaminado (Gildon & Tinker 1981; del Val et al. 1999). Este comportamento foi registrado
para solos impactados por cobre (Gonzalez-Chavez et al. 2002), cádmio (Tulio et al. 2003;
Weissenhorn et al. 1993; Vivas et al. 2003a; 2003b), zinco (Weissenhorn et al. 1994; Joner et
al. 2000) e manganês (Malcová et al. 2003), sendo os isolados adaptados superiores em
promover o crescimento vegetal, em relação àqueles não condicionados ao impacto.
A tolerância ao estresse hídrico também pode ser maximizada pela aplicação de FMA
adaptados a esta condição, como apontado por Davies Jr. et al. (2002) na simbiose Capsicum
annuum e várias espécies de Glomus provindas de solo submetido a estresse hídrico. Com
resultados semelhantes, Bethlenfalvay et al. (1989) relataram que G. mosseae oriundo de
áreas áridas foi mais eficiente em promover o crescimento de Glycine max.
O fósforo é um dos nutrientes que controla o estabelecimento da simbiose micorrízica
arbuscular (Graham & Abbott 2000; Sharma et al. 2001). Os elevados teores
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
79
(> 45 mg P dm
-3
) deste macronutriente em solos cultiváveis e em meios para produção de
mudas, decorrentes da aplicação de fertilizantes, é um dos empecilhos para aplicação de FMA
na agricultura, pois o benefício da micorrização pode ser minimizado (Freitas et al. 2004).
Diante disso, é desejável o emprego de FMA adaptados e eficientes em solos férteis (Hayman
1982; Gianinazzi et al. 1988; Bagyaraj & Reddy 2005), e que sejam competitivos, infectivos e
com habilidade em esporular em tais condições (Davis et al. 1984). Esses isolados podem ser
obtidos pela multiplicação dos fungos em substratos ricos em P, visto que a fertilização pode
atuar na seleção de fungos que colonizam o vegetal em solos com elevado teor de P (Sylvia &
Neal 1990). Em contrapartida, FMA isolados de ambientes com 7,87 mg P dm
-3
podem não
trazer benefícios para o vegetal (Johnson 1993).
Henkel et al. (1989) verificaram que fungos nativos isolados de solos com 9,9 P mg
dm
-3
foram mais eficientes em favorecer a nutrição fosfatada de Agropyron smithii Rydb
cultivada em solo com 10 mg P dm
-3
, indicando a adaptação dos fungos nativos à condição de
baixa fertilidade. Similarmente, Louis & Lim (1988b) registraram que G. clarum isolado de
solos com 0,03 mg P dm
-3
) promoveu mais beneficios em soja (Glycine max) cultivada em
solo com baixos níveis de superfosfato triplo aplicado (0,83 g dm
-3
solo). Porém, Bohrer et al.
(2003) indicaram que comunidades de FMA oriundas de solo com baixos teores de P (2,15
mg dm
-3
) foram menos eficientes em promover o crescimento de Vangueria infausta Burch.
Johnson (1993) registrou que a comunidade de FMA provinda de áreas submetidas a
elevada fertilização (62,2 mg P dm
-3
) foi menos eficaz em promover o crescimento de
Andropogon gerardi Vitm, em relação aos fungos isolados de áreas com fertilização menos
intensa (26,5 mg P dm
-3
). Com isso, a autora sugeriu que a fertilização seleciona fungos
menos “mutualistas”. Em contrapartida, Stürmer (2004) registrou maior crescimento da soja
quando foram inoculados FMA provenientes de áreas com 24 mg P dm
-3
em relação a fungos
isolados de solos contendo 15 mg P dm
-3
.
Scullion et al. (1998) observaram que fungos de áreas com manejo orgânico
melhoraram a nutrição fosfatada de Allium amaloprasum L. e de Trifolium repens, em relação
aos FMA de áreas com manejo convencional, destacando o efeito benéfico da aplicação de
fertilizantes orgânicos na seleção e manutenção de FMA mais eficientes para o hospedeiro
(Muthukumar & Udaiyan 2002). Nesse aspecto, a multiplicação do fungo em substrato com
adubos orgânicos pode “adaptar” o fungo a essa condição e assim constituir alternativa no
beneficiamento de vegetais sob cultivo orgânico, visto que os benefícios de comunidades
adaptadas à fertilização são conhecidos (Eason et al. 1999). Todavia, para assegurar a
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
80
eficiência dos isolados adaptados é necessário manter o cultivo do fungo no substrato com
pressão de seleção (metal ou alto nível de nutrientes, por ex.) (González-Chávez et al. 2004).
Apesar de evidências de relação entre condição edáfica de origem do isolado de FMA
e expressão da eficiência em condição semelhante, Sanders (2004), mesmo sem suporte
experimental, sugere que o inóculo deve ser eficiente em várias condições ambientais.
Apesar dos benefícios comprovados da aplicação de FMA adaptados sobre o
crescimento do hospedeiro, não se conhece os mecanismos de como isolados de uma mesma
espécie podem produzir respostas diferenciadas no hospedeiro (Giovannetti & Gianinazzi-
Pearson 1994); no entanto, o local de adaptação pode explicar as variações intraespecíficas
(Monzón & Azcón 1996).
Fisiologicamente, os FMA quando são submetidos às condições edáficas em que
foram multiplicados ou isolados, apresentam reduzida fase Lag, trazendo mais benefícios aos
hospedeiros (Sainz & Arines 1988). Meharg & Cairney (2000) sugerem que em fungos
multiplicados em substratos com elevadas pressões de seleção (metais, salinidade, altos níveis
de P) ocorre expressão de genes ligados à tolerância, que são transferidos dentro da
população, conferindo ao fungo melhor atuação na planta. Por outro lado, Weissenhorn et al.
(1994) sugeriram que a plasticidade funcional, decorrente de núcleos geneticamente distintos
nos esporos de FMA contribui para a adaptação dos fungos a várias condições edáficas.
Possivelmente, a condição heterocariótica (Hijri & Sanders 2005) ou homocariótica com
variantes de um mesmo gene (Pawlowska & Taylor 2004) é responsável pela amplitude de
respostas fisiológicas obtidas quando FMA adaptados a determinado fator edáfico são
empregados.
Devido à plasticidade fenotípica dos FMA (Stahl & Christensen, 1991), em algumas
situações não se observa melhor atuação, sobre o hospedeiro, de fungos adaptados a
determinada condição edáfica em relação ao uso de isolados exóticos (Enkhtuya et al. 2000).
Tian et al. (2004) enfatizaram que o uso de G. mosseae isolado de áreas salinizadas aumentou
a absorção de NaCl em algodoeiro (Gossypium arboreum L.) cultivado em solo salinizado, o
que não ocorreu quando as plantas foram inoculadas com um isolado deste fungo não
adaptado ao estresse salino. Ruiz-Lozano & Azcón (2000) observaram que G. deserticola foi
mais eficiente em absorver nutrientes em condições salinas do que espécies autóctones de
Glomus de áreas salinizadas. Caravaca et al. (2003a) registraram melhor atuação do FMA
alóctone Glomus claroideum no estabelecimento de Retama sphaerocarpa (L.) Boissier, em
relação aos FMA nativos, em áreas do semi-árido da Espanha.
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
81
Assim, o uso de FMA adaptados pode, em alguns casos, não trazer benefícios
adicionais ao hospedeiro. Fidebilus et al. (2001) não observaram diferenças no crescimento e
uso da água por Citrus volkameriana Tan. & Pasq. em relação à micorrização com isolados de
Glomus oriundos de áreas mésicas, semi-áridas ou áridas. Van der Heidjen & Kuyper (2001)
também consideraram que a origem do fungo não teve influência no crescimento de Salix
repens L.
A amplitude de respostas fisiológicas geradas quando FMA adaptados são empregados
(Algualcil et al. 2003) sugere a prévia seleção de isolados, tanto em ensaios em casa de
vegetação quanto em campo, antes da recomendação em programas de inoculação. Em geral,
recomenda-se que o fungo introduzido em sistemas agrícolas seja compatível com as
condições de solo (Dodd & Thompson 1994). Estudos são necessários para elucidar se os
benefícios da micorriza formada por fungos adaptados é decorrente das maiores taxas de
germinação e crescimento micelial assimbiótico.
6. A cultura do maracujazeiro-doce
A América Tropical, que abrange a região Amazônica até o Paraguai, incluindo o
Nordeste da Argentina, é o principal centro de diversidade genética da família Passifloraceae
(Vasconcellos & Duarte-Filho 2000).
No Brasil, Passiflora edulis f. flavicarpa (maracujá-amarelo) e Passiflora alata
(maracujá-doce) são as principais espécies de Passiflora L. cultivadas (Lima & Borges 2002;
Donadio et al. 2002). Porém, o maracujá roxo (Passiflora edulis L.), cultivado principalmente
na Austrália, África e Sudeste Asiático, ocupa, juntamente com o maracujazeiro amarelo,
mais de 90% das áreas plantadas com maracujá no mundo (Braga & Junqueira 2000).
O maracujá amarelo é cultivado no Brasil em cerca de 35 mil hectares (IBGE 2005),
colocando o país como o maior produtor mundial (Ruggiero 2000). No panorama brasileiro, o
Nordeste apresenta maior área plantada e colhida (ca. 17 mil hectares), sendo considerada a
região com maior volume produzido (aproximadamente 214 mil toneladas) (IBGE 2005).
Passiflora alata é nativa e distribuída por todo o Brasil (Manica 2005). São Paulo,
Santa Catarina e o Distrito Federal são conhecidos por deterem as maiores produtividades
nacionais (Manica & Oliveira Jr. 2005). Passiflora alata é conhecida vulgarmente como
maracujá-doce, maracujá-de-refresco, maracujá-grande, maracujá-guaçu e ainda, maracujá-
de-comer, entre outras denominações. É apreciado pela polpa doce e levemente ácida,
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
82
podendo ser consumido in natura ou na forma de sucos; porém, devido ao elevado preço e
pequena oferta tem o consumo limitado às classes média e alta (Manica & Oliveira Jr. 2005).
Considerada a segunda espécie de maracujá mais cultivada no Brasil, o maracujá-doce
alcança valores mais expressivos no mercado de frutas frescas em relação ao maracujazeiro
amarelo (Bernacci et al. 2003). Porém, apesar do comércio em mercados nacionais do
maracujá-doce no Brasil ter sido iniciado na década de 1970 (Junqueira et al. 2005b), faltam
informações técnicas para o manejo adequado da cultura (Meletti et al. 2003). Além disso,
não se dispõe de dados referentes à produção e comercialização, visto que os órgãos de
levantamento estatístico não segregam as informações do maracujazeiro doce e do amarelo
(Vasconcellos et al. 2001a).
Os principais mercados para exportação do maracujá-doce são os europeus, norte-
americanos e canadenses (Cançado Júnior et al. 2000), constituindo cultura alternativa e
rentável, devido ao elevado valor agregado dos frutos, que podem alcançar preços entre US$
0,3 a US$ 1,00 por unidade (Braga & Junqueira 2000). Na Colômbia, outras espécies de
maracujazeiro [Passiflora ligulares Juss e Passiflora molissima (Kunta) Bailey] também são
exportadas para o mercado europeu (Ruggiero et al. 1996; Vasconcellos et al. 2001a).
Esta passiflorácea (P. alata) possui potencial ornamental, devido à beleza de sua flores
(Ruggiero et al. 1996; Braga & Junqueira 2000) e participação na indústria farmacêutica, pois
apresenta princípíos ativos como a passiflorina (Paris et al. 2002), que é encontrada em teores
próximos a 0,048% nas folhas (Cunha et al. 2002) e atua no tratamento da ansiedade e insônia
(Leonel et al. 2000). Nesse segmento, mais de 100 t ano
-1
de folhas secas são comercializadas
para laboratórios que produzem fármacos à base dos princípios ativos do maracujá (Silva &
Silva-Almeida 2000).
O maracujazeiro-doce é uma trepadeira com crescimento vigoroso, sistema radicular
fasciculado que se estende na profundidade e raio de 30 cm e 60 cm, respectivamente
(Maldonado et al. 1999). O caule tem secção quadrangular e as folhas são alternadas, com 1-2
pares de glândulas na base foliar (Cunha et al. 2002). As flores são hermafroditas, auto-
incompatíveis, com ântese por volta das 4-5h e fecham-se às 18:30-20h para não mais se
abrirem (Vasconcellos, 1991), sendo o mamangava (Xylocopa Latr.) principal agente
polinizador (Ruggiero et al. 1996), porém quando a eficiência da polinização natural não
atinge taxas próximas a 30%, recorre-se à polinização artificial, que resulta em aumento da
produtividade (Frutiséries 2002). Após fecundação, são necessários 75 dias para que ocorra
mudança na coloração verde para amarela na base dos frutos, estádio considerado ideal para a
colheita (Oliveira et al. 1980).
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
83
Devido à inexistência de cultivares de maracujazeiro-doce, a formação de mudas desta
frutífera é feita quase exclusivamente por via sexuada (Osipi & Nakagawa 2005b), gerando
desuniformidade dos pomares (Lima & Trindade 2002). Além disso, problemas na perda de
viabilidade das sementes têm sido identificados, sendo sugerida a semeadura logo após a
retirada das sementes do fruto (Lima et al. 1999) ou a manutenção das mesmas em baixas
temperaturas (10 ºC) (Osipi & Nakagawa 2005a). Outros métodos disponíveis são a enxertia,
a estaquia e a cultura de tecidos in vitro (Meletti & Nagai 1992; Ferreira 2000; Salomão et al.
2002), mas tais alternativas não são amplamente empregadas.
Um dos problemas para instalação, manutenção e renovação de maracujais é a
produção de mudas certificadas (Melleti 2001; Leonel & Pedroso 2005). Nesta fase, são
requeridos substratos ricos em nutrientes para produção das mudas, como sugerido por
Ruggiero et al. (1996): solo : esterco : bagaço de cana (2:2:1 v/v) + 1Kg de superfosfato
simples + 2Kg de calcário dolomítico por metro cúbico de amostra. Prado et al. (2004)
alertaram que o substrato deve apresentar saturação por bases em torno de 56% e
concentrações de Ca e Mg de 20 e 8 mmol
c
dm
-3
, respectivamente. Piza Jr. & Kavati (1995)
comentam que apenas a adubação do substrato não supre as necessidades do maracujazeiro na
formação de mudas, sendo necessária adubação de cobertura semanal com solução contendo
0,05% de sulfato de amônia, 0,05% de cloreto de potássio e 0,01% de superfosfato simples.
Para o maracujá-doce, Manica (2005) indicou 5,0 Kg de superfosfato simples e 0,5 Kg
de cloreto de potássio por metro cúbico de substrato à base de solo e esterco (3:1) como
padrão para produção de mudas. Entretanto, Lima et al. (1995) conseguiram produzir mudas
em substrato à base apenas de solo e esterco bovino, sem suplementação com fertilizantes
químicos. Leonel & Pedroso (2005) utilizaram substrato composto por solo, esterco e
vermiculita (1:1:1) e pulverizações com ácido giberélico para que as mudas fossem formadas
em 96 dias. Por sua vez, Borges et al. (1995) verificaram a necessidade de 25% de esterco e
104 dias de cultivo para obtenção de mudas com 6-8 folhas, 15-20 cm de altura e presença de
gavinhas, características consideradas ideais para o transplantio ao campo (Ruggiero et al.
1996).
Uma das maneiras de reduzir os custos de produção de mudas de maracujazeiro é a
aplicação de FMA selecionados, como registrado para P. edulis f. flavicarpa (Soraes e
Martins 2000; Cavalcante et al. 2001; 2002a) e P. ligulares (Rodríguez et al. 1995). Porém, a
micorrização com G. etunicatum, S. heterogama e Entrophospora colombiana não trouxe
benefícios adicionais no crescimento das mudas de maracujazeiro amarelo (Graça et al. 1991;
Lima et al. 1997). O maracujazeiro-doce também é responsivo à inoculação com FMA
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
84
selecionados (Silva et al. 2004b), o que resulta no aumento de crescimento e redução do
tempo de formação das mudas (Anjos et al. 2005).
Para o maracujazeiro-amarelo, as respostas benéficas da aplicação conjunta de FMA e
adubos orgânicos não são unânimes, visto que a composição do substrato pode afetar o
comportamento simbiótico. Silva et al. (2001) registraram beneficio da micorrização com G.
etunicatum em substrato com vermiculita, o que não ocorreu quando se utilizou Plantmax
®
.
Lima et al. (1997) não registraram benefícios da micorrização de mudas de P. edulis f.
flavicarpa por E. colombiana e G. etunicatum em substrato composto por 20% de esterco
bovino, enquanto sinergismo positivo da aplicação de Glomus sp. em solo com 10% de
esterco foi registrado por Silveira et al. (2003). Em maracujazeiro-doce, tem sido
recomendado o uso de fontes orgânicas na composição do substrato de formação de mudas
(Borges et al. 1995), porém não está determinado se os FMA podem contribuir para o
crescimento vegetal nesses susbstratos.
Na formação de pomares, geralmente se utiliza espaçamento variando de 3m x 5m a
5m x 6m, porém em sistemas mais adensados ocorre maior produtividade. Com isso, pode-se
instalar de 330 a 1000 plantas por hectare (Vasconcellos 2000). O local para o cultivo deve ter
temperturas médias entre 25-27ºC e fotoperíodo de 11 horas; além disso, deve-se optar por
solos profundos (60 cm), arenosos, bem drenados, com alto teor de matéria orgânica e com
pH entre 5-6 (Ruggiero et al. 1996; Luna 1998; Costa et al. 2000; Junqueira et al. 2002).
O maracujazeiro-doce produz o ano inteiro (Melleti, 2001), apresentando dois picos de
frutificação por safra, um mais expressivo em dezembro/janeiro e outro menor em junho/julho
(Vasconcellos et al. 2001a), com entressafra de três a quatro meses por ano (Salomão 2002).
As maiores produtividades são geralmente registradas no segundo (25-35 Kg/planta/ano) e
terceiro (20-25 kg/planta/ano) anos de cultivo, visto que apenas 15-20 Kg/planta/ano são
obtidos no primeiro ano do plantio (Junqueira et al. 2005b).
Disparidades na produtividade do maracujá-doce são decorrentes da ausência de
cultivares, da densidade de plantas na área, assim como das adubações empregadas, entre
outros fatores (Lima, 1999). Com isso, pode-se obter plantios com produtividade variando de
0,68 até 33,25 t ha
-1
(Martins et al. 2003); porém, estudos em campo apontam produtividade
geralmente oscilando entre 15-20 t ha
-1
. Silva et al. (2004c) registraram média de
produtividade em dois anos de cultivo em torno de 17 t ha
-1
. Vasconcellos et al. (2001b)
realizaram caracterização física e do teor de nutrientes em frutos de maracujazeiro-doce de
cultivo que apresentava produtividade de 15,70 t ha
-1
ao final do primeiro ano de produção.
Damatto Júnior et al. (2005) obtiveram cerca de 20 t ha
-1
de frutos no segundo ano de cultivo.
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
85
Na cultura do maracujazeiro são necessárias elevadas quantidades de fertilizantes
(Silva & Oliveira 2000) para garantir a produtividade, sendo as recomendações de adubação
para o cultivo do maracujazeiro-doce feitas com base nas indicações de fertilização para o
maracujazeiro-amarelo (Vasconcellos et al. 2001a). O uso de adubo orgânico é indicado e
pode-se utilizar várias fontes, como o esterco de galinha (9-18 litros), a torta de mamona (6-
13 litros) e o esterco de curral (20-30 litros), sendo este último o mais empregado (Borges
1999).
Na adubação de plantio, emprega-se 20-30 litros de esterco bovino e superfosfato
simples, cuja dose aplicada é baseada na quantidade de P disponível no solo; por outro lado,
na adubação de formação, que inclui o crescimento inicial do vegetal até o florescimento, que
ocorre 150-180 dias após o transplantio (Brancher 2005), faz-se as adubações nitrogenadas e
potássicas parceladas em três aplicações e a adubação de produção deve ser conduzida no
início do florescimento do maracujazeiro (Silva & Oliveira 2000).
Para o maracujá-doce, Sanzonowicz & Andrade (2005) recomendam no plantio a
aplicação por cova de 1Kg de superfosfato simples, 10-30 litros de esterco bovino, enquanto
na adubação de formação deve-se usar 135 g de N e 90 g de K
2
O; após aparecimento dos
frutos, são necessários 700 g de superfosfato simples + 100 g de sulfato de amônia + 100 g de
cloreto de potássio. Silva et al. (2004c) aplicaram 1Kg de Minercal + 190 g de superfosfato
simples e 60 g de K
2
O por planta e obtiveram produtividade média, em dois anos de cultivo,
de 17 t ha
-1
. Em sistema com uso de adubo orgânico, Damatto Júnior et al. (2005) observaram
que para se alcançar produtividade em torno de 20 t ha
-1
foram necessários 200 g de
termofosfato + 137 g de cloreto de potássio + 2,16 g de calcário e 5 Kg de esterco por planta.
Aguiar et al. (2005) estimaram que são necessários R$ 13.996,64 para a instalação do
sistema de produção de maracujá-doce, que inclui preparo da área e montagem dos sistemas
de condução e de irrigação; após o segundo ano de cultivo, pode-se obter fluxo líquido de
caixa em torno de R$ 10.000. Os autores obtiveram produção de cerca de 15.3, 31.10 e 24.75 t
ha
-1
no 1º, 2º e 3º anos de cultivo, respectivamente, empregando por cova 1Kg de superfosfato
simples + 4 litros de esterco de galinha + 50 g da mistura de micronutrientes FTE BR-12.
Os frutos comercializados apresentam elevada variação morfológica, devido à recente
exploração da cultura, sendo necessária a fixação de características importantes relacionadas à
qualidade dos frutos (Vasconcellos et al. 2001b). Oliveira et al. (1982) registraram frutos que
variaram de ovais a piriformes (6,85-10,13 cm de comprimento e 4,75-6,93 cm de largura),
com casca espessa (7,10-10,00 mm), peso médio entre 89 e 195g, rendimento em polpa de 14
e 21% e formação de 143-276 sementes/fruto. O suco apresenta pH na faixa ácida (3,48-3,56),
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
86
elevado teor de sólidos solúveis totais (SST) (15,28-24,70 ºBrix), porém possuem baixa
acidez total titulável (ATT) (Ruggiero et al. 1996), que pode variar 0,60-1,77 % de ácido
cítrico (Vasconcellos et al. 1993). Estudando as características de frutos obtidos por
polinização aberta, em cinco populações de P. alata, Martins et al. (2003) observaram frutos
com rendimento em polpa de 27,27 %, espessura da casca de 11,22 mm, com cavidade
ovariana longitudinal de 5,32 cm e transversal de 7,92 cm, comprimento e largura do fruto de
10,89 cm e 7,47 cm, respectivamente, e tempo decorrido da abertura da flor até a colheita
variando de 51-66 dias, entre outros caracteres estudados.
Em São Paulo, a comercialização do maracujá-doce é feita em caixetas que podem
variar de 3 até 3,7 Kg de fruto por embalagem (Meletti 2001). Porém, Junqueira et al. (2002)
comentam que a venda dos frutos pode ser feita também em embalagens individuais ou a
granel. Por ser consumido principalmente in natura, o aspecto externo é considerado tanto
pelos consumidores quanto pelos mercados importadores como parâmetro para se avaliar a
qualidade dos frutos (Souza et al. 2002).
Dentre as doenças que acometem o maracujá-doce estão a bacteriose, causada pela
Xanthomonas campestris pv. Passiflorae (Pereira) Dye e o vírus do endurecimento do fruto
(Passion fruit woodiness virus – PWV), transmitido por afídeos (Novaes et al. 2000;
Junqueira et al. 2005a); no entanto, a resistência do maracujazeiro-doce ao Fusarium Link
pode ser alternativa como porta-enxerto para o maracujazeiro amarelo (Meletti et al. 2003). O
parasitismo do fitonematóide das galhas [Meloidogyne (Goeldi 1892)] também pode acarretar
prejuízos na produção dessa fruteira (Ritzinger et al. 2002), sendo o uso de mudas pré-
inoculadas com FMA selecionados, alternativa para redução da população de nematóides
(Anjos 2004). Espécies de Passiflora servem como abrigo para diversos insetos e ácaros
(Fadini & Santa-Cecília, 2000), podendo algumas espécies constituir pragas e reduzir a
produtividade dos pomares. Como principais pragas do maracujazeiro-doce pode-se citar a
mosca-das-frutas, mosca-dos-botões-florais, percevejos e cupins (Vasconcellos 2000; Icuma
et al. 2005). Na fase pós-colheita, destaca-se a antracnose, causada por Colletotrichum
gloeosporioides (Penz.) Penz. & Saec, uma das principais doenças que comprometem a
comercialização dos frutos (Junqueira et al. 2005a).
O Vale do Submédio São Francisco é um dos maiores pólos de exportação de frutas
brasileiras, especialmente da uva e da manga. Atualmente, os produtores da região buscam
por culturas alternativas com valor agregado e potencial de exportação, como o
maracujazeiro-doce (Silva et al. 2004c). Isso resulta na diversificação de culturas,
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
87
constituindo fonte adicional de renda, especialmente na entressafra das culturas chave da
região.
Em condições irrigadas, o maracujazeiro-doce pode ser produzido no semi-árido
nordestino, pois em tais locais o fotoperíodo acima de 11 horas diárias permite a produção
durante todo o ano (Lima & Borges 2002); além disso, a condição climática da região
(elevada temperatura e baixa precipitação pluviométrica) reduz o tempo decorrido da
polinização à colheita dos frutos (Vasconcellos 1991). Tais condições podem favorecer a
produção de frutos com qualidade superior. Veras et al. (2000) observaram que frutos com
maior relação SST/ATT e menor ATT foram produzidos em condições de elevadas
temperaturas; no entanto, devido aos poucos estudos com a cultura (Vasconcellos et al.
2001a), são necessárias informações técnicas que possibilitem o cultivo mais produtivo desta
passiflorácea.
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Capítulo 2
Production and infectivity of inoculum of arbuscular mycorrhizal fungi multiplied
in a substrate supplemented with Tris-HCl buffer
Artigo enviado para publicação no periódico Mycorrhiza
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
144
Production and infectivity of inoculum of arbuscular mycorrhizal fungi multiplied in a
substrate supplemented with Tris-HCl buffer
Fábio Sérgio Barbosa da Silva, Adriana Mayumi Yano-Melo, Leonor Costa Maia
*
Universidade Federal de Pernambuco, Centro de Ciências Biológicas, Departamento de Micologia,
50670-420, Recife, PE, Brasil
*Corresponding author – Tel.: 55-81-21268865; Fax: 55-81-21268482; e-mail address:
. Proofs should be sent to: L.C.Maia, Depto. de Micologia, CCB,
UFPE, 50670-420 Recife, PE, Brasil.
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
145
Production and infectivity of inoculum of arbuscular mycorrhizal fungi supplemented
with Tris HCl buffer
Abstract
The organic buffers, by maintaining stable the hydrogenionic concentration, as well as by its
stimulatory capability, constitute an alternative for increasing the production of inoculum of
arbuscular mycorrhizal fungi (AMF). The effect of adding Tris-HCl buffer on production and
infectivity of AMF inoculum was investigated in a greenhouse experiment using separately 50
spores of Glomus etunicatum, Gigaspora albida, Scutellospora heterogama and Acaulospora
longula which were inoculated in containers with sand and vermiculite (1:1 v:v) and Panicum
miliaceum. The containers were irrigated with nutrient solution supplemented with 0, 10, 25,
50 and 75 mM of Tris-HCl (pH 6.5). After 85 days, production of spores was evaluated and
the increment compared with the initial inoculum. Infectivity of the inoculum that presented
higher production of spores was evaluated by the method of mean percentage of infection,
using corn as the host, on two occasions: a) soon after being produced; and b) after 120 days
of storage at 4
o
C and 28
o
C. Responses to buffer solutions differed: S. heterogama was not
benefited, while sporulation of G. etunicatum was improved in solution with 10 mM buffer.
Solution with 75 mM HCl buffer increased significantly sporulation of G. albida (65.10
spores g
-1
substrate), when comparing with that of the control (33.09 spores g
-1
substrate).
Maximum production of spores of A. longula was obtained in the treatments receiving 50 mM
(43.80 spores g
-1
substrate) and 75 mM (35 spores g
-1
substrate) of buffer. The infective
potential of G. albida was not affected by storage, while that of A. longula decreased when
the inoculum was maintained at 28 ºC. The infectivity of G. etunicatum increased after
storage, mainly at 4 ºC, what suggests that the inoculum of this species is benefited by storage
at low temperature.
Key words: mycorrhiza, organic buffer, storage, sporulation, viability.
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
146
Introduction
The mycorrhizal association favours growth of the host plant by improving its nutritional
status, being relevant for economically important crops and for the general maintenance of the
terrestrial ecosystems, contributing for the carbon and phosphorus cycles (Sanders et al.
1996).
Due to the obligate biotrophism, the production of inoculant is one of the obstacles for
application of arbuscular mycorrhizal fungi (AMF) to benefit plant crops of economic
importance. Among the methods for inoculum production, one is cultivation in sand and
vermiculite, supplemented with nutrient solutions containing organic buffers in its
formulation; this allows for high production of spores (Millner and Kitt 1992).
The presence of H
+
ions alters the enzymatic activity (Lowenstein 1993), and can reduce the
rhizospheric pH by about 0.5 units (Bagshaw et al. 1972) by the secretion or absorption of
cations in the growth medium (Griffin 1994), as well as by the reaction of CO
2
with water
(Taiz and Zeiger 1998). Organic buffers have the property of minimizing the alterations of the
H
+
ion concentration and are used for maintaining the pH of the growth media for AMF
(Gryndler et al. 1998; Pawlowska et al. 1999). The effect of a buffer on the growth of AMF
depends on its constitution (Carr 1991; Pawlowska et al. 1999) and concentration in the
growth medium (Masoro and Siegel 1979).
Research related with utilization of organic buffers for maintenance of pH and for stimulating
mycelial growth are restricted to a few species of AMF, mostly Glomus Tulasne & Tulasne
(Douds Jr. 1997; Pawlowska et al. 1999). Vilariño et al. (1997) related the efficiency of the
MES buffer with the presence of soil microorganisms that solubilize the sulfur present in the
structure of this buffer, favouring, in that way, the growth of the external mycelium of
Glomus intraradices Schenck & Smith. Low concentrations of the MES (0.9 mM) and Bis-
tris (1 mM) buffers allowed higher mycelial growth of Glomus fistulosum Skou & Jakobsen ,
cultivated together with corn transformed roots (Gryndler et al. 1998).
The AMF inoculum should be produced in high density, and maintain the infectivity and
effectivity for a long period of time. Although not much information regarding storage of
AMF is available (Sylvia 1999), it is recommended the maintenance of the inoculum in the
conditions under which it was produced (INVAM 2001). It has also been mentioned that
maintenance of AMF inoculum at low temperature stimulates germination and spore
development (Talukdar and Germida 2001; Wagner et al. 2001); however, the ideal
temperature for storage of each AMF isolate should be determined.
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
147
In this work the most suitable concentrations of Tris-HCl buffer for production of spores of
AMF and for maintenance of the infectivity of the inoculum, under different temperatures,
were investigated.
Material and methods
Experiment 1. Effect of addition of Tris-HCl buffer on production of spores of AMF.
Seeds of Panicum miliaceum L. (50 per pot) were desinfected with Sodium Hypochlorite
(0.5% / 10 min) and washed with distilled water before being planted. The substrate used was
washed river sand (pH
H2O
7.1) and vermiculite of medium granulation (1:1 v/v). Both were
autoclaved (30 min. / 1 atm / 120 ºC), in two consecutive days, and used 15 days after
sterilized. The experimental design was entirely at random in a factorial arrangement of 4
species of AMF × 5 concentrations of Tris-HCl buffer, with 5 replicates (100 experimental
units). Spores of Glomus etunicatum Becker and Gerd. (UFPE 06), Gigaspora albida Schenck
and Smith (UFPE 01), Scutellospora heterogama (Nicol. and Gerd.) Walker and Sanders
(UFPE19) and Acaulospora longula Spain and Schenck (UFPE 21) were inoculated as
suspensions (50 spores of each AMF), in plastic pots (400 mL) with 300 g of substrate, below
the host seeds. The pots were maintained in a greenhouse for 85 days; temperature (T
min.
22.81 ºC; T
max.
32.39 °C), humidity (RH
min.
45.62 %; RH
max.
81.13 %) and light were not
controlled. The pots were irrigated every other day with nutrient solution (Hoagland and
Arnon 1950 modified by Jarstfer and Sylvia 1992) suplemented with 0, 10, 25, 50 or 75 mM
of Tris – HCl buffer (pH 6.5), and every seven days received deionized water to avoid salt
accumulation. The experiment was evaluated 85 days after the inoculation, due to the
flowering time of the host plant. The AMF spores were extracted from the soil by wet sieving
(Gerdemann and Nicolson 1963) and sucrose centrifugation (Jenkins 1964), placed on Petri
dishes and quantified using a stereomicroscope.
Experiment 2. Evaluation of the infectivity of the AMF inoculum produced in a substrate
irrigated with nutrient solution supplemented with Tris-HCl buffer.
The infectivity potential of the inoculum produced in the first experiment was evaluated by
the MIP method – mean percentage of infection (http://invam.caf.wvu.edu/Myc-
info/Methods/Assays/Mip.htm 2001). The inocula with higher density of spores per gram of
substrate, were chosen for this assay (inoculum of G. albida produced in 75 mM, A. longula
in 50 mM and G. etunicatum in 10 mM of the Tris-HCl). The inoculum consisted of spores,
hypha and colonized roots. The experimental design was entirely at random in a factorial
arrangement of 3 sources of inoculum × 3 treatments of storage and 4 replicates (36
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
148
experimental units). The infectivity of each inoculum was estimated before and after storage
for 120 days, at 28 ºC (room temperature) and at 4 ºC (refrigerator). Samples of the material
produced in the first experiment were diluted (1:10 v/v) with sand, and cultivated with corn
(Zea mays L. cv Assum preto). After 30 days, roots were clarified and stained with Trypan
blue (0.05%) in lactoglycerol (Phillips and Hayman 1970); the percentage of colonization was
estimated by the intersect method (Giovannetti and Mosse 1980). The pots were maintained in
a greenhouse for 30 days after seedling emergence. The inoculum was considered viable,
from the commercial point of view, when roots of the host presented at least 25% of
mycorrhizal colonization (INVAM 2001; Sylvia 2001). For both experiments the data were
transformed (x + 0.5) for variance analysis and the means compared by Tukey (for
sporulation) and LSD at 5% probability (for infectivity), using the Statistica Program (Statsoft
1997).
Results
Experiment 1 - Different responses on sporulation of the AMF were found in relation to
buffer concentrations (Table 1), except for S. heterogama. The incorporation of >10 mM of
Tris-HCl to the substrate favoured the sporulation of G. etunicatum. Gigaspora albida
presented significant increase on sporulation when the substrate received concentrations
higher than 25 mM of buffer. Maximum production of spores of A. longula was obtained in
substrate receiving concentrations t50 mM of buffer.
Table 1. Production of spores (spores g
-1
substrate) of Acaulospora longula, Gigaspora
albida, Glomus etunicatum and Scutellospora heterogama after 85 days associated with
Panicum miliaceum, irrigated with nutrient solution (Hoagland and Arnon, 1950), modified
by Jarstfer and Sylvia (1992) and supplemented with Tris-HCl
AMF Concentrations de Tris-HCl (mM)
0 10255075
A. longula
11,72 bB 17,53 bB 14,23 cB 43,80 bA 35,00 bcAB
G. albida
33,09 bC 42,30 bBC 56,34 bAB 53,56 bAB 65,10 bA
G. etunicatum
104,73 aB 161,28 aA 198,44 aA 175,69 aA 292,01 aA
S. heterogama
4,62 bA 9,94 bA 10,80 cA 14,37 cA 15,05 cA
CV (%) 59,46
Means followed by the same small letter (column) and capital letter (line) do not differ (P< 0.05).
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
149
The sporulation of G. etunicatum increased in all treatments with Tris-HCl comparing with
the control (without buffer). Differently from the observed with A. longula, sporulation of G.
albida was positively correlated with the increase of buffer concentrations in the nutrient
solution (P< 0.05; r = 0.90). Higher production of spores was attained by G. etunicatum,
differing from those reached by the other species in all treatments, with and without buffer.
Conversely, S. heterogama did not multiply well, in comparison with the other fungi,
independently of presence of buffer in the growth medium.
Experiment 2 – In general, the storage at 4 ºC preserved the infective potential of the AMF
inocula in relation to the treatment maintained at 28 ºC (Table 2). The preservation of A.
longula under environmental conditions significantly reduced the infectivity in relation to the
treatment without storage. The infective potential of G. etunicatum increased when the
inoculum was stored at 4 ºC, while that of G. albida was not affected by the storage
treatments. Although G. albida produced less number of spores than G. etunicatum, the
infectivity of its inoculum was five times higher than that of the isolate of this fungus (Tables
1 and 2).
Table 2. Infectivity (%) of the inocula of AMF produced in a sand vermiculite substrate
irrigated with Hoagland and Arnon nutrient solution modified and supplemented with Tris-
HCl buffer, calculated at time 0 (without storage) and after maintenance for 120 days at 4 ºC
and at room temperature (28 ºC)
Treatments Inocula
GA
75 mM
AL
50 mM
GE
10 mM
Without storage
63,14a 23,24a 11,36b
4 ºC
61,82a 18,81ab 27,58a
28 ºC
63,35a 7,31b 14,61b
CV (%) 38,10
Discussion
The benefit of adding low concentrations of buffers in the medium, for sporulation of AMF
was mentioned for some Glomus species. Douds Jr. (1997) observed that 10 mM of Tris
favoured the germination and the mycelial growth of Glomus mosseae (Nicolson &
Gerdemann) Gerdemann & Trappe. Similarly, Karandashov et al. (2000) obtained high
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
150
production of extraradical mycelium and spores of Glomus caledonium (Nicolson &
Gerdemann) Trappe & Gerdemann by adding 10 mM of MES buffer in a medium with
transformed carrot roots. Using a concentration of 51 mM of the same buffer, Vilariño et al.
(1997) obtained high production of infective propagules of Glomus intraradices in relation to
the control treatment; however, the authors did not test other concentrations.
The production of spores of G. etunicatum using 10 mM of Tris-HCl buffer was higher than
that mentioned in other methods. Millner and Kitt (1992) obtained approximately 235 spores
g
-1
, using soil inoculum with 2000 spores and irrigating the culture with nutrient solution +
0.5 mM of MES. This treatment resulted in an increment of 17.05 x 10
3
%. In the present
work 161 spores g
-1
were obtained; however, the efficiency of the system was superior than
those obtained by the other authors, considering that the increment was up to 96.6 x 10
3
% in
relation to the initial inoculum. Although the concentration of the MES buffer applied in the
experiment of Millner and Kitt (1992) was lower than the concentration of the Tris-HCl
buffer in this experiment, the cost for spore production was higher, due to the price of MES
buffer relative to Tris-HCl.
The addition of Tris-HCl to the nutrient solution neither inhibit or stimulated the sporulation
of Scutellospora heterogama. On the other hand, a high amount of auxiliary cells was
observed in the pots irrigated with solution receiving buffer. The benefits of adding buffer
would probably be more evident with the continuity of the experiments, once that the values
of density of spores are numerically superior than that of the control and considering also that
the maximum production of auxiliary cells comes before sporulation (Morton 1993).
Species of Gigaspora Gerdemann & Trappe emend. Walker & Sanders form a high amount of
soil biomass, when compared to other AMF (Hart and Reader 2002). This may result in high
amounts of CO
2
(from respiration); the reaction of CO
2
with water reduce the pH of the
rhizosphere (Taiz and Zeiger 1998). This could justify the efficiency of the buffer in higher
concentrations, once that it would be needed high amounts of the buffer to make the pH
stable. Conversely, G. etunicatum develops hypha that are thinner than those of G. albida,
presenting lower respiration values; thus, the concentration of 10 mM would be sufficient to
stabilize the alterations on [H
+
].
Species of Gigaspora were not successfully cultivated in aeroponic systems. The supply of
nutrient solution with Tris-HCl may constitute an alternative for large scale production of this
fungus. Millner and Kitt (1992) obtained high production of spores of G. margarita using 0.5
mM of MES in the nutrient solution; in the same way, Silva et al. (2005 “in press”) observed
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
151
high sporulation of Gigaspora margarita Becker & Hall when adding 50 mM of Tris-HCl to
the nutrient solution.
The addition of high concentrations of the Tris-HCl buffer benefited sporulation of A.
longula. However, this effect cannot be attributed to the stabilizing capacity of the buffer,
considering that species of Acaulospora Gerdemann & Trappe emend. Buch usually “prefer”
acidic pH (Clarck 1997); A. longula was first described from a soil with pH 4.4 (Schenck et
al. 1984). The increase on sporulation of the A. longula isolate can be due to the stimulatory
capacity of the molecule, once that some buffers (Carr 1991), as well as some other
substances (Ishii et al. 1997), may stimulate the development of the AMF. It is possible that
the stimulatory effect had enhanced fast spore germination and root colonization, allowing
high sporulation of the fungus in the period of the experiment. Assays to study germination
and root colonization, under these conditions, are needed to prove this hypothesis.
There are recommendations for preservation of the inoculum in the conditions under which it
was produced (Louis and Lim 1988; Morton 1994). However, for inoculum produced in
tropical conditions, as in this work, the maintenance at 4 ºC was better for preserving the
infective potential of the tested AMF, in comparison with storage at environmental
temperature (28 ºC). This can be due to the uniformity of germination (Safir et al. 1990), as
well as to higher longevity of the structures at low temperatures, when metabolism is reduced.
The results obtained agree with those that recommend maintenance of AMF inoculum at low
temperatures (Gemma and Koske 1988; Talukdar and Germida 2001). Juge et al. (2002)
mentioned that low temperatures can reduce the mortality of spores.
The only infective unit of Gigasporaceae is the spore (Bierman and Linderman 1983), which
is more resistant than the hypha (Tommerup 1988; Staddon and Fitter 2001). This may
explain why spores of G. albida maintained its infectivity after storage. Decrease of
colonization by A. longula after 120 days at room temperature could be explained by loss of
hyphal viability as well as to the dormancy of the spores, a characteristic of the genus
Acaulospora (Tommerup 1983; Douds and Schenck 1991).
Wagner et al. (2001) observed increase in number of infective propagules of Glomus
claroideum Schenck & Smith when stored at 4 ºC in comparison with maintenance at room
temperature (24 ºC). In this work, the increase on infectivity of G. etunicatum maintained at 4
ºC might be related to inativation of inhibitors or activation of germination promoters as
suggested by Tommerup (1987) and Louis and Lim (1988).
The higher infectivity of G. albida may be related to the high number of germinative hypha
that are formed by its spores, as already observed (Maia et al. 1994). Another fact that could
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
152
be considered is the intrinsic infective potential of the isolate of G. etunicatum which can be
low in comparison with that of G. albida. The reason for the results obtained in this work
cannot be clearly defined considering the differences between the isolates, but it is possible to
suggest that G. etunicatum is investing more in spore production, in order to ensure the
dispersion of the species while G. albida, by forming bigger spores in lower number, is
investing mostly on germination and root colonization, to ensure survival of the species.
Similar results were mentioned by Gazey et al. (1992), comparing the sporulation of
Acaulospora species: Acaulospora laevis Gerdemann & Trappe, caracterized by its big
spores, produced lower number of spores than Acaulospora sp. (VUM18), which formed
smaller spores. Different life strategies among genera of AMF were observed by Hart and
Reader (2002), in studies of the intraradicular and extraradicular mycelium formed by species
of Acaulospora, Gigaspora and Glomus, that would be related with the success in the
propagation of each one of the species. Future research should be done in order to clarify
general aspects related to the biology of species of AMF.
Only G. albida and G. etunicatum attained the quality control patterns for production of
commercial inoculum, forming at least 25% of mycorrhizal colonization (INVAM 2001;
Sylvia 2001). Production in large scale of inoculum of these isolates can be obtained by using
the methods here described, which include addition of Tris-HCl buffer in the nutrient solution
and storage at 4 ºC.
Acknowledgements
Thanks are due to CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior),
for providing a PhD scholarship for the first author, and to CNPq (Conselho Nacional de
Desenvolvimento Científico e Tecnológico) for financial support, and research and DCR
grants to the 2
nd
and 3
th
authors, respectively). Special thanks to Dr. David Douds Jr. for
valuable suggestions in the content and corrections of the English text.
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Capítulo 3
Utilização de resíduos orgânicos na produção de inóculo e na infectividade de fungos
micorrízicos arbusculares após estocagem
Artigo a ser submetido para publicação no periódico Bioresource Technology
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
157
Utilização de resíduos orgânicos na produção de inóculo e na infectividade de fungos
micorrízicos arbusculares após estocagem
Fábio Sérgio Barbosa da Silva
1
; Adriana Mayumi Yano-Melo
1
; Uided Maaze Tiburcio
Cavalcante
1
; Maryluce Albuquerque da Silva
1
; Leonor Costa Maia
1*
1
Laboratório de Micorrizas, Depto. Micologia, CCB/UFPE, Av. Prof. Nelson Chaves, s/n,
Cidade Universitária, CEP 50670-420, Recife, PE, Brazil. [email protected]
.br;
; umaaze@hotmail.com; [email protected].br;
*Corresponding author: Leonor Costa Maia (Tel: +55-81-21268865; Fax: +55-81-21268482),
e-mail address: [email protected].br
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
158
Resumo
Foram conduzidos três experimentos (um para cada resíduo) com o objetivo de selecionar
substratos contendo resíduos orgânicos (composto orgânico, terra vegetal e esterco bovino
não maturado) para a produção de inóculo infectivo de fungos micorrízicos arbusculares
(FMA) utilizando painço como hospedeiro. O delineamento foi inteiramente casualizado, em
fatorial de 4 × 4 × 2: quatro proporções de resíduo (0, 10, 20 e 30 %), dois diluentes (solo e
areia previamente desinfestados), quatro isolados de FMA (50 esporos/planta em suspensão
de: Glomus etunicatum, Scutellospora heterogama, Acaulospora longula e Gigaspora
albida), com 5 repetições. Após 50 (composto orgânico e esterco bovino) e 70 (terra vegetal)
dias os esporos foram extraídos e quantificados. A infectividade dos inóculos de FMA que
apresentaram maior densidade de esporos foi avaliada em duas ocasiões: a) após produção
(sem estocagem); b) após estocagem por 120 dias a 4ºC e a 28 ºC. O resíduo composto
orgânico adicionado a solo e areia proporcionou aumento de 8392 % e 240 %, na esporulação
de G. etunicatum, respectivamente, enquanto S. heterogama e A. longula tiveram a
esporulação reduzida em solo e inalterada em areia. Com terra vegetal, a esporulação de A.
longula foi reduzida (em solo), a de G. albida ficou inalterada (solo e areia) e a de G.
etunicatum estimulada. Em areia com 10% de terra vegetal, S. heterogama e A. longula
tiveram aumento na esporulação de 8458 % e 4843 %, respectivamente, em relação ao
tratamento sem resíduo. Quando esterco bovino foi adicionado ao solo houve redução na
esporulação de todos os FMA; em areia isso ocorreu com G. albida e G. etunicatum. A
manutenção dos inóculos de FMA a 28 ºC não afeta a infectividade, embora as respostas
sejam dependentes do substrato diluente, da fonte de matéria orgânica e do FMA testado.
Palavras chave: esporulação; estocagem; Glomeromycota; adubação orgânica.
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
159
1. Introdução
Fungos micorrízicos arbusculares (FMA) tem potencial para utilização biotecnológica,
pois beneficiam o crescimento de culturas de interesse econômico por aumentar a absorção de
nutrientes com baixa mobilidade na solução do solo, especialmente o fósforo (Bolan, 1991), o
que resulta em vegetais mais tolerantes a entraves bióticos e abióticos (Azcón-Aguilar &
Barea, 1997).
Apesar dos benefícios comprovados, a aplicação dos FMA na agricultura tem sido
dificultada devido ao caráter biotrófico obrigatório do micobionte (Jarstfer & Sylvia, 1992),
sendo necessário o estabelecimento da simbiose para que ao final do ciclo possa ocorrer
elevada produção de propágulos que podem ser utilizados como fonte de inóculo. Várias
metodologias têm sido propostas visando a maximização da produção de inoculante
micorrízico tais como a utilização de diferentes substratos (Gaur & Adholeya, 2000),
multiplicações em sistemas hidropônicos (Hawkins & George, 1997) e aeropônicos (Jarstfer
& Sylvia, 1992), estabelecimento de cultivos in vitro com raízes transformadas (Pawlowska et
al. 1999), bem como a utilização de substâncias estimuladoras do desenvolvimento dos FMA
(Karandashov et al., 2000). Algumas dessas metodologias apresentam alto custo de instalação
e manutenção podendo, no entanto, propiciar elevada esporulação (St-Arnaud et al. 1996),
mas, com viabilidade reduzida dos propágulos (Gryndler et al. 2003).
A manutenção da infectividade do inóculo é fator limitante da qualidade do inoculante
a ser comercializado e nesse aspecto, o armazenamento adequado é fundamental.
Recomendações têm sido feitas para estocagem dos propágulos nas condições em que foram
produzidos (Louis & Lim, 1988) ou em baixas temperaturas (Juge et al. 2002), sendo
considerado viável, do ponto de vista comercial, o inóculo que produzir, nas raízes do
hospedeiro, pelo menos 25% de colonização micorrízica (INVAM, 2001; Sylvia, 2001). No
entanto, poucos estudos foram desenvolvidos nesta área, especialmente com FMA
multiplicados em substrato com adubo orgânico, sendo necessário determinar, pontualmente,
as condições de estocagem para cada inoculante de FMA.
Resíduos orgânicos são comumente empregados como adubo na horticultura e
fruticultura favorecendo o desenvolvimento vegetal pelo aumento na disponibilidade de
nutrientes, na capacidade tamponante e troca catiônica (Paul & Clark, 1989), bem como na
melhoria da estruturação do solo (Caravaca et al. 2002). A suplementação desses resíduos no
meio de propagação de inóculo de FMA aumenta a esporulação (Zambolim et al., 1992),
podendo favorecer a adaptação dos isolados à adubação orgânica, condição comumente
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
160
encontrada na produtividade vegetal. Adicionalmente, efeitos benéficos da adubação sobre a
infectividade (Palenzuela et al. 2002), colonização micorrízica (Mäder et al. 2000), produção
de micélio extraradicular (Joner & Jakobsen, 1992) e produção de propágulos em campo
(Douds Jr. et al. 1997; Gaur & Adholeya, 2005) foram registrados.
O emprego de fontes orgânicas para produção de inoculante de FMA vem sendo
sugerido (Gryndler et al. 2003), porém a infectividade e as condições ideais de estocagem dos
inóculos produzidos nestes sistemas não foram devidamente indicadas.
Este trabalho teve como objetivo determinar proporções e tipos de resíduos orgânicos
mais eficientes para produção de inóculo de FMA, bem como avaliar a infectividade do
inóculo produzido antes e após estocagem a 4 e 28 ºC.
2. Material e métodos
Foram conduzidos dois experimentos: no primeiro, selecionou-se tipos de resíduos
orgânicos e diluentes para produção de inóculo de FMA. No segundo, determinou-se a
infectividade dos inóculos que apresentaram maior densidade de esporos, antes e após
armazenamento a 4 e 28 ºC por 120 dias.
Os experimentos foram conduzidos em casa de vegetação, sendo utilizados dois
substratos diluentes: A = areia grossa de rio, lavada e esterilizada em autoclave (120 ºC, 1h)
por dois dias consecutivos; B = Solo Franco-argilo-arenoso, proveniente de Camaragibe-PE
desinfestado com Bromex
(Brometo de metila e 2% de cloropicrina) por 7 dias. Os
substratos foram utilizados 15 dias após a desinfestação.
Hospedeiro – utilizou-se sementes de painço (Panicum miliaceum L.), desinfestadas com
hipoclorito de sódio 0,5% por 15 min., antes de serem colocadas para germinar (Silva et al
2005, “in press”).
Isolados de FMA – esporos de Glomus etunicatum Becker & Gerdemann (UFPE 06),
Scutellospora heterogama (Nicol. & Gerd.) Walker & Sanders (UFPE 19), Acaulospora
longula Spain & Schenck (UFPE 21) e de Gigaspora albida Schenck & Smith (UFPE 01),
provenientes de potes de culturas mantidos em casa de vegetação, tendo como hospedeiro o
painço. Suspensões com 50 esporos dos FMA foram depositadas imediatamente abaixo das
sementes do hospedeiro, em potes mantidos sob luz natural, com temperatura de 32,9 e
23,2ºC e umidade relativa do ar de 80,3 e 45,5 % , máximas e mínimas, respectivamente.
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
161
Resíduos orgânicos – foram testados três tipos de resíduos (que constituíram experimentos
independentes), sendo adicionados aos substratos A ou B nas proporções de 0, 10, 20 e 30%
(v/v). Assim como o substrato diluente B, os resíduos foram desinfestados com brometo,
sendo utilizados após 30 dias.
O composto orgânico (CO) foi proveniente de leiras, montadas a partir de frutas e verduras
impróprias para comercialização e dispostas no pátio de compostagem da CEAGEPE/
Unidade CEASA de Pernambuco; a terra vegetal composta (TV) adquirida comercialmente
(Viva o Verde
); e o esterco bovino não maturado (EB) coletado em estábulo do
Departamento de Zootecnia, UFRPE.
Os resíduos foram passados em peneira (3 mm), desinfestados, diluídos nos substratos A e B.
Amostras foram encaminhadas à Embrapa Semi-Árido para análise química (Tabela 1). Após
mistura, os substratos foram deixados em repouso por 15 dias antes da utilização.
Tabela 1. Caracterização química e físico-química dos resíduos orgânicos e dos substratos
diluentes, utilizados na produção de inóculo de FMA
Resíduos orgânicos Substratos diluentes
Composto
orgânico
Terra
vegetal
Esterco
bovino
Areia Solo
P* (mg dm
-3
) 393,00 69,00 1026,00 88,00 4,00
Ca** (cmol
c
dm
-3
) 7,71 3,10 4,70 0,90 1,20
Mg** (cmol
c
dm
-3
) 3,40 2,20 5,10 0,60 0,40
C (g Kg
-1
) 43,10 33,40 222,60 2,00 13,30
N (g Kg
-1
) 3,80 1,20 13,10 0,30 1,20
C/N 11,34 27,86 16,99 6,66 11,08
CTC (cmol
c
dm
-3
) 12,67 13,88 12,05 3,37 1,69
pH (H
2
O -1:2,5) 6,20 5,40 7,60 5,50 4,60
CTC= capacidade de troca catiônica; *Mehlich I; ** KCl 1M.
Irrigação – com exceção do tratamento com substrato A e sem adubação, que a partir de
quinze dias após a germinação do painço foi irrigado com solução de Hoagland & Arnon,
modificada (Jarstfer & Sylvia, 1992), os demais tratamentos (substratos A e B) foram
irrigados, a cada dois dias, com água destilada.
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
162
Delineamento experimental – cada tipo de substrato constituiu um experimento independente,
com delineamento inteiramente casualizado, em fatorial: 4 × 4 × 2, sendo quatro proporções
de resíduo, quatro isolados de FMA, dois substratos diluentes (solo e areia) e cinco repetições,
totalizando 160 potes/experimento.
Avaliação – os experimentos foram avaliados 50 dias (composto orgânico e esterco bovino) e
70 dias (terra vegetal) após a inoculação, períodos correspondentes à floração do hospedeiro.
Esporos de FMA foram extraídos dos substratos por peneiramento úmido (Gerdemann &
Nicolson, 1963) e centrifugação em água e sacarose (Jenkins, 1964), colocados em placas
canaletadas e quantificados em estereomicroscópio Leica (40×).
Análise estatística – os dados de esporulação foram transformados em arcoseno × + 1 e as
médias comparadas pelo teste de Tukey (Pd 0,05); regressões polinomiais e lineares foram
determinadas para os dados de esporulação dos FMA em função das proporções de resíduo,
sendo ajustados modelos lineares e quadráticos utilizando-se o programa Sanest.
Avaliação da infectividade do inóculo – Do experimento anterior, utilizaram-se amostras dos
inóculos produzidos com a adição de composto orgânico e terra vegetal composta, que
apresentaram maior densidade de esporos, para avaliar a infectividade do inoculante. Com
exceção do inóculo produzido em esterco bovino, fonte orgânica que inibiu a esporulação dos
FMA, a infectividade dos inóculos de FMA foi avaliada, pelo método da percentagem média
de infecção (INVAM, 2001), em experimentos com delineamento inteiramente casualizado
em arranjo fatorial, com os seguintes tratamentos:
Composto orgânico:
fatorial de 4 × 3, sendo quatro fontes de inóculo [G. etunicatum, G.
albida e S. heterogama, multiplicados em solo + composto orgânico (10%) e G. etunicatum,
multiplicado em areia + composto orgânico (10%)], três tratamentos de estocagem (não
estocado e estocado por 120 dias em temperatura ambiente (28r2 ºC) e em refrigerador (4r1
ºC) e quatro repetições, totalizando 48 unidades experimentais.
Terra vegetal composta
: fatorial de 3 × 3, sendo três fontes de inóculo [G. etunicatum, S.
heterogama e A. longula multiplicados em areia + terra vegetal (10%)], três tratamentos de
estocagem (sem estocagem, estocado por 120 dias em temperatura ambiente (28r2 ºC) e em
refrigerador (4r1 ºC) e quatro repetições, totalizando 36 parcelas experimentais.
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
163
Amostras do inóculo, constituído por esporos, hifas e raízes colonizadas, foram
diluídas na proporção de 1:10 (v/v) com areia autoclavada (121ºC, 1 h), utilizando-se milho
(Zea mays L. cv. Assum Preto) como planta hospedeira. Após 30 dias foi avaliada a
percentagem de colonização, utilizando-se a técnica da interseção dos quadrantes (Giovannetti
& Mosse, 1980).
3. Resultados
Produção de inóculo em substratos com composto orgânico
A esporulação de G. albida apresentou modelo quadrático em relação às proporções
de composto orgânico no solo, enquanto a produção de esporos de S. heterogama e de A.
longula foi linearmente reduzida com a adição de resíduo no solo (Pd 0,01) (Figura 1). Por
outro lado, a adição do resíduo ao solo promoveu aumento significativo na produção de
esporos de G. etunicatum (ca. 81 vezes), observando-se comportamento quadrático em
relação às proporções de composto orgânico testadas, com ponto de máximo estimado em
17,01% de composto (Figura 1).
(Ga) y = -0,0147x
2
- 0,197x + 19,96; R
2
= 0,84**
(Ge) y = -0,0342x
2
+ 1,165x + 1,02; R
2
= 0,78**
(Sh) y = -0,5839x + 14,991; R
2
= 0,87**
(Al) y = -0,4627x + 10,998; R
2
= 0,64**
0
5
10
15
20
25
0102030
Proporções de composto orgânico (%)
Esporos/g
Ga Ge Sh Al
Figura 1. Produção de esporos de FMA, associados a Panicum miliaceum, em solo adubado
com composto orgânico, 50 dias após a inoculação.
** (Pd0,01). Ga= Gigaspora albida; Ge=
Glomus etunicatum; Sh= Scutellospora heterogama; Al= Acaulospora longula.
De modo geral a produção de inóculo foi prejudicada nos tratamentos em areia, com ou sem
adição de composto orgânico, exceto em G. etunicatum que teve esporulação estimulada (ca.
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
164
3 vezes) pela adição de 10% do composto e diminuída nas demais proporções (20 e 30%)
(Figura 2).
(Ge) y = -0,0313x
2
+ 0,6692x + 6,5225; R
2
= 0,52**
0
5
10
15
20
01020
Proporções de composto orgânico (%)
Esporos/g
30
Ga Ge Sh Al
(Ga) ns
(Sh) ns
(Al) ns
Figura 2. Produção de esporos de FMA, associados a Panicum miliaceum, em areia adubada
com composto orgânico, 50 dias após a inoculação.
** (Pd0,01); ns (ajuste não significativo);
Ga= Gigaspora albida; Ge= Glomus etunicatum; Sh= Scutellospora heterogama; Al= Acaulospora
longula.
Produção de inóculo em substrato com terra vegetal
A esporulação de G. etunicatum aumentou linearmente com as proporções de terra
vegetal no solo (Figura 3) e em areia (Figura 4) apresentou modelo quadrático com ponto de
máximo estimado em 19% de adubação. A produção de esporos de G. albida não foi alterada
pela adição de terra vegetal ao solo, e houve redução linear na esporulação de S. heterogama e
A. longula com o aumento das proporções de resíduo (Figura 3).
Nos tratamentos em areia, a adição de terra vegetal também não alterou a esporulação
de G. albida. Houve regressão quadrática para a esporulação de S. heterogama com ponto de
máxima em 19,47% de resíduo. Com exceção de G. albida a adição de apenas 10% de resíduo
propiciou aumento significativo na esporulação dos demais FMA utilizados, em relação ao
controle sem adição de matéria orgânica, resultando no aumento de cerca de 79, 49 e 4 vezes
para S. heterogama, A. longula e G. etunicatum, respectivamente (Figura 4).
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
165
(Al) y = -9,1087x + 276,91; R
2
= 0,87**
(Sh) y = -0,5099x + 19,919;R
2
= 0,64**
(Ge) y = 1,1595x + 7,3685; R
2
= 0,97**
0
50
100
150
200
250
300
350
0 10203
Proporções de terra vegetal (%)
Esporos/g
0
Ga Ge Sh Al
(Ga) ns
Figura 3. Produção de esporos de FMA, associados a Panicum miliaceum, em solo adubado
com terra vegetal composta, 70 dias após a inoculação.
** (Pd 0,01); ns (ajuste não significativo);
Ga= Gigaspora albida; Ge= Glomus etunicatum; Sh= Scutellospora heterogama; Al= Acaulospora
longula.
(Ge) y = -0,2081x
2
+ 7,9089x + 17,98; R
2
= 0,99**
(Sh) y = -0,0314x
2
+ 1,2209x + 0,389; R
2
= 0,98**
0
20
40
60
80
100
01020
Proporções de terra vegetal (%)
Esporos/g
30
Ga Ge Sh Al
(Al) ns
(Ga) ns
Figura 4. Produção de esporos de FMA, associados a Panicum miliaceum, em areia adubada
com terra vegetal composta, 70 dias após a inoculação.
** (Pd 0,01); ns (ajuste não significativo);
Ga= Gigaspora albida; Ge= Glomus etunicatum; Sh= Scutellospora heterogama; Al= Acaulospora
longula.
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
166
Produção de inóculo em substrato com esterco bovino não maturado
Quando o esterco bovino foi adicionado ao solo todos os FMA testados tiveram
esporulação linearmente reduzida. Em areia, G. albida e G. etunicatum apresentaram o
mesmo padrão, enquanto a esporulação de S. heterogama e A. longula não foi alterada pela
presença do esterco (Figuras 5 e 6).
(Al) y = -1,467x + 34,275; R2 = 0,60**
(Sh) y = -0,5131x + 12,139; R
2
= 0,59**
(Ge) y = -0,3923x + 9,292; R
2
= 0,60**
(Ga) y = -0,5317x + 12,498; R
2
= 0,60**
0
10
20
30
40
50
60
01020
Proporções de esterco bovino (%)
Esporos/g
30
Ga Ge Sh Al
Figura 5. Produção de esporos de FMA, associados a Panicum miliaceum, em solo adubado
com esterco bovino, 50 dias após a inoculação.
** (Pd0,01); Ga= Gigaspora albida; Ge= Glomus
etunicatum; Sh= Scutellospora heterogama; Al= Acaulospora longula.
(Ga) y = -0,1924x + 4,561; R
2
= 0,62**
(Ge) y = -0,4045x + 9,585; R
2
= 0,60**
0
2
4
6
8
10
12
14
16
01020
Proporções de esterco bovino (%)
Esporos/g
30
Ga Ge Sh Al
(Al) ns
(Sh) ns
Figura 6. Produção de esporos de FMA, associados a Panicum miliaceum, em areia adubada
com esterco bovino, 50 dias após a inoculação.
** (Pd0,01); ns (ajuste não significativo); Ga=
Gigaspora albida; Ge= Glomus etunicatum; Sh= Scutellospora heterogama; Al= Acaulospora
longula.
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
167
Ensaios de infectividade
Isolados de Gigasporaceae (G. albida e S. heterogama) multiplicados em solo com
adição de 10% de composto orgânico mantiveram o potencial infectivo após estocagem a 4 ºC
e a 28 ºC. Em contrapartida, G. etunicatum comportou-se de modo diferenciado em relação
aos tratamentos de estocagem e substrato onde foi produzido; quando este FMA foi
multiplicado em solo com 10% de composto orgânico a manutenção a 4 ºC promoveu
aumento no potencial infectivo em relação ao tratamento sem estocagem ou mantido em
temperatura ambiente. No entanto, quando multiplicado em areia, o condicionamento a 4 ºC
reduziu a infectividade em relação ao tratamento sem estocagem (Tabela 2).
Tabela 2. Infectividade de inóculo de FMA, em milho, após multiplicação em substrato com
10% de composto orgânico, em solo (S) ou em areia (A), tendo como hospedeiro o painço,
antes e após manutenção a 4 ºC e a 28 ºC, por 120 dias
Tratamentos Infectividade (% colonização micorrízica)
G. etunicatum
(A)
G. etunicatum
(S)
G. albida
(S)
S. heterogama
(S)
Sem estocagem 26,67 a 23,56 b 51,80 a 2,92 a
4 ºC 15,56 b 39,56 a 65,38 a 4,36 a
28 ºC 18,33 ab 18,35 b 63,03 a 1,73 a
CV (%) 13,35
Médias seguidas da mesma letra, na coluna, não diferem entre si pelo teste de Tukey (Pd0,05)
Independentemente dos tratamentos de estocagem houve manutenção da infectividade
do inóculo de G. etunicatum, S. heterogama e A. longula produzido em areia com 10% de
terra vegetal composta (Tabela 3).
O inóculo de G. albida produzido em solo com 10% de composto orgânico e A.
longula, S. heterogama e G. etunicatum em areia com 10% de terra vegetal não perde a
infectividade mesmo após estocagem por 4 meses a 28 ºC, dispensando o uso de câmaras frias
ou geladeiras para armazenamento de inoculante de FMA.
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
168
Tabela 3. Infectividade de inóculo de FMA, em milho, após multiplicado em substrato com
10% de terra vegetal em areia tendo como hospedeiro painço, antes e após manutenção a 4 ºC
e a 28 ºC, por 120 dias
Tratamentos Infectividade (% colonização micorrízica)
G. etunicatum
A. longula S. heterogama
Sem estocagem 11,86 a 27,14 a 2,80 a
4 ºC 21,77 a 18,00 a 0,49 a
28 ºC 14,42 a 34,36 a 0,70 a
C.V. (%) 31,43
Médias seguidas da mesma letra, na coluna, não diferem entre si pelo teste de Tukey (Pd0,05).
4. Discussão
A utilização de resíduos orgânicos não compostados pode favorecer a qualidade do
solo (Pascual et al. 1999), no entanto, neste estudo, o esterco bovino não compostado reduziu
a esporulação dos FMA testados. Este resultado pode ser atribuído à presença de substâncias
fitotóxicas, que poderiam ser eliminadas no processo de compostagem (Kiehl, 1998), tendo
em vista que, em geral, mesmo a menor proporção do esterco inibiu a esporulação dos FMA.
Martín et al. (2002) observaram redução na colonização produzida por Glomus mosseae
(Nicolson & Gerd.) Gerd. & Trappe e G. deserticola Trappe, Bloss & Menge em substrato
constituído por resíduos de oliveiras não compostados, tendo os autores atribuído os efeitos
negativos da adubação à presença de compostos fitotóxicos.
O caráter inibitório do esterco bovino sobre a esporulação dos FMA pode estar
relacionado ao elevado teor de nutrientes; entre estes, o fósforo (1026 mg dm
-3
), de
reconhecido efeito inibitório sobre a produção de esporos de FMA, quando em altas
concentrações no solo (Douds Jr. & Schenck, 1990). Do mesmo modo, o elevado teor de
nitrogênio (13,10 g Kg
-1
) encontrado no esterco pode ter prejudicado o desenvolvimento dos
fungos, considerando que este influencia o estabelecimento da simbiose, e conseqüente
reprodução do fungo (Bressan, 2002). É possível que a presença de elevados teores de Mg
(5,10 cmol
c
dm
-3
) no esterco também tenha contribuído para reduzir a esporulação dos FMA.
Jarstfer et al. (1998) observaram que altos níveis de magnésio reduziram a colonização
micorrízica e a esporulação de Glomus sp. Tulasne & Tulasne sendo este efeito mediado pela
redução do cálcio no tecido do hospedeiro.
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
169
Outro fator relevante no esterco é o caráter alcalino (pH 7,6) do resíduo, que pode ter
atuado de forma negativa sobre ambos, o fungo e o hospedeiro, e consequentemente sobre a
colonização e a produção de esporos, visto que o potencial hidrogeniônico afeta a associação
micorrízica arbuscular (van Aarle et al. 2002).
Membros de Gigasporaceae são referidos com baixa freqüência em solos submetidos à
adubação orgânica (Oehl et al. 2004); no entanto, neste estudo a aplicação de terra vegetal e
composto orgânico não afetou a esporulação de G. albida e estimulou a de S. heterogama
(10% de terra vegetal em areia), indicando que estes FMA podem ser multiplicados nessas
condições. Douds et al. (2005) verificaram que o uso de composto orgânico (1800 mg P dm
-3
)
e vermiculita (1:4 v/v) favoreceu a produção de inóculo de Gigaspora gigantea (Nicol. &
Gerd.) Gerdemann & Trappe.
Adubos orgânicos com elevados teores de nutrientes, especialmente P, atuam na
seleção e manutenção de FMA mais eficientes (Muthukumar & Udaiyan, 2002). Espécies de
Glomus podem apresentar elevada tolerância ao P (Carrenho et al. 2002), como observado
pelos resultados obtidos com composto orgânico que apresentava 393 mg P dm
-3
(Figuras 1 e
2).
Embora maiores médias na esporulação de Acaulospora longula tenham sido obtidas
em solo adubado com terra vegetal quando comparado ao obtido com areia, observa-se
redução linear na produção de esporos em solo com o aumento nas proporções de terra
vegetal (Figura 3), fato possivelmente relacionado à melhoria na retenção de água e ao
aumento nos teores de matéria orgânica nesse substrato. Esses resultados contrariam a
hipótese de Bhadalung et al. (2005), os quais consideraram que a esporulação de Acaulospora
Gerdemann & Trappe emend. Buch não é influenciada pela fertilização. Em areia, a adição de
terra vegetal favoreceu esporulação deste FMA, em relação ao controle (areia sem adubo)
(Figura 4); é possível que a matéria orgânica adicionada à areia estimule a propagação do
fungo como relatado por St. John et al. (1983). Além disso, o caráter ácido do resíduo (pH
5,4) pode ter favorecido a esporulação dessa espécie, pois segundo Clarck (1997) espécies de
Acaulospora têm elevada propagação em meio ácido e foram registradas por Oehl et al.
(2004) em áreas com manejo orgânico.
Os maiores benefícios da aplicação de terra vegetal ocorreram quando se utilizou areia
como diluente, confirmando a influência da composição e da granulometria do substrato na
produção de propágulos de FMA (Gaur & Adholeya, 2000); este comportamento pode ser
atribuído ao aumento do teor de nutrientes, em decorrência da adubação, visto que a areia é
considerada um meio inadequado para produção de inoculante (INVAM, 1994). Além disso, a
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
170
melhor aeração promovida pela areia (Morard & Silvestre, 1996), bem como o favorecimento
do crescimento micelial fornecido pela matéria orgânica do adubo (Joner & Jakobsen, 1992)
podem ter maximizado a esporulação de alguns dos FMA.
Gigaspora albida e S. heterogama apresentam apenas esporos como unidade infectiva
(INVAM, 1993) e estes são mais resistentes do que as hifas presentes no inóculo (Tommerup,
1988), favorecendo desta forma a manutenção do potencial infectivo observado nos
experimentos.
Espécies de Gigaspora Gerdemann & Trappe emend. Walker & Sanders são referidas
como sendo mais sensíveis que Scutellospora Walker & Sanders, perdendo rapidamente o
potencial infectivo após estocagem em geladeira (INVAM, 2004); no entanto, no presente
estudo, ambos os FMA testados mantiveram a infectividade, podendo o adubo orgânico ter
contribuído neste processo. Harinikumar & Bagyaraj (1989) observaram que a sobrevivência
dos FMA entre os períodos de plantio, em sistema de rotação de culturas, foi devida à
presença de esterco no substrato.
O meio de multiplicação influencia a viabilidade do inóculo de FMA (Tommerup,
1988). Quando G. etunicatum foi multiplicado em solo e estocado a 4 ºC houve aumento na
infectividade deste isolado; este comportamento pode ser atribuído à inativação de inibidores
ou à ativação de promotores da germinação (Tommerup, 1987), ao aumento da sincronização
do processo germinativo (Safir et al. 1990), bem como à redução na mortalidade dos esporos
(Juge et al. 2002).
Em geral, observa-se declínio no potencial infectivo de FMA quando os propágulos
são submetidos a longos períodos de estocagem (Ruiz-Lozano & Azcón, 1996). A redução da
infectividade de G. etunicatum multiplicado em areia com composto e estocado a 4 ºC, pode
ter ocorrido por perda da viabilidade das estruturas presentes no inóculo, conforme observado
também por Staddon & Fitter (2001).
Quando se utilizou areia e 10 % de terra vegetal, a esporulação foi incrementada e o
potencial infectivo dos FMA permaneceu inalterado após a estocagem, fazendo deste resíduo
substrato promissor para a produção de esporos. Kuszala et al. (2001) observaram que a
infectividade de inóculo (na forma de suspensão de esporos e micélio) de Glomus, Gigaspora
Gerdemann & Trappe emend. Walker & Sanders, Acaulospora Gerdemann & Trappe emend.
Walker e Scutellospora Walker & Sanders foi mantida por até 6 meses, independentemente da
temperatura de manutenção dos inóculos (18-28 ºC, +4 ºC, -18 ºC e -80 ºC).
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
171
Os inóculos de G. etunicatum, G. albida (produzidos em substrato com composto
orgânico) e de A. longula (multiplicado em meio com terra vegetal) por produzir > 25% de
colonização micorrízica, enquadram-se como viáveis para comercialização (Sylvia, 2001;
INVAM, 2001).
O estabelecimento de protocolo para produção de inóculo de FMA utilizando resíduos
orgânicos (10% de terra vegetal em areia e 10% de composto orgânico em solo) é alternativa
viável, pois incrementa a esporulação e favorece a manutenção da infectividade dos fungos,
podendo condicionar os isolados ao manejo orgânico, prática agrícola crescente que beneficia
a qualidade edáfica e a agricultura sustentável.
5. Agradecimentos
A Venézio Felipe dos Santos (IPA-PE), pelo auxílio nas análises estatísticas. À
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pela concessão das
bolsas de Doutorado (F.S.B. Silva) e Mestrado (M.A. Silva) e ao Conselho Nacional de
Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pelas bolsas de Produtividade (L.C. Maia)
e DCR (A.M. Yano-Melo).
6. Referências bibliográficas
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Capítulo 4
Partially purified extract of glomalin stimulates in vitro growth of
Gigaspora
albida mycelia
Artigo enviado para publicação no periódico Mycorrhiza
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
177
Partially purified extract of glomalin stimulates in vitro growth of
Gigaspora albida mycelia
Fábio Sérgio Barbosa da Silva
1
; Nicácio de Oliveira Freitas
1
; Adriana Mayumi Yano-Melo
1
;
Michele Dalvina Correia da Silva
2
; Maria Tereza dos Santos Correia
2
;
Leonor Costa Maia
1*
1
Universidade Federal de Pernambuco, Laboratório de Micorrizas, Depto. Micologia, CCB,
Cidade Universitária, CEP. 50670-420, Recife, PE, Brasil. [email protected];
[email protected], amymelo17@hotmail.com; [email protected].br
2
Universidade Federal de Pernambuco, Laboratório de Glicoproteínas, Depto. Bioquímica,
CCB, Cidade Universitária, CEP. 50670-420, Recife, PE, Brasil. [email protected],
.
*Corresponding author - Tel.: 55-81-21268865; Fax: 55-81 121268482.
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
178
Partially purified extract of glomalin stimulate in vitro growth of
Gigaspora albida mycelia
Abstract
Arbuscular mycorrhizal fungi produce a glycoprotein (glomalin) that has been related to soil
aggregation. Considering that the effect of glomalin on the asymbiotic phase of the AMF is
unknown, partially purified glomalin extracts were added to the medium and germination and
mycelial growth of Gigaspora albida Schenck and Smith was observed. An isolate of G.
albida, multiplied or not multiplied in a substrate with organic amendment, was used. Spores
were disinfected (0.05% NaOCl, 2 min) and placed on 1.3% water agar with 15, 30 or 45 Pg
of glomalin mL
-1
. After 7 and 14 days germination rate and hyphal growth were estimated.
Germination was not affected by the glycoprotein in the growth medium. Mycelial growth of
the fungus multiplied in organic residue was greater than that of the same fungus, multiplied
without organic substrate. Concentration of glomalin at 30 μg mL
-1
stimulated , but 45 μg mL
-
1
glomalin inhibited mycelial growth. The stimulatory effect of glomalin in the pre-symbiotic
phase might be related to utilization of both the carbohydrate and the protein portions of
glomalin. However, high amounts of this glycoprotein may inhibit fungal growth.
Key Words: Glomeromycota, glycoprotein, mycorrhiza.
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179
Introduction
Arbuscular mycorrhizal fungi (AMF) form a beneficial association with most plant species. In
this interaction the mycobiont increases the absorption of nutrients for the associated host and
enhances host tolerance to biotic and abiotic stresses (Smith and Read 1997).
The arbuscular mycorrhizae increase productivity of many economically important crops
(Azcón-Aguilar and Barea 1997), and are especially important in soils of tropical regions with
low phosphorus availability (Howeler et al. 1987).
Germination and early mycelial development are important for symbiosis establishment. Early
fungal development is affected by factors such as: temperature, humidity, pH and constitution
of the substrate or growth medium (Green et al. 1976; Daniels and Trappe 1980; Siqueira et
al. 1985; Maia and Yano-Melo 2001), as well as CO
2
tension and substances that may
stimulate the asymbiotic growth of the fungus (Bécard et al. 1992; Ishii et al. 1997; Siqueira
et al. 1999; Bécard et al. 2004). Conversely, high concentrations of certain nutrients, such as
phosphorus, may inhibit early fungal development (Louis and Lim 1988; Nagahashi et al.
1996).
Studies have shown the effect of amino acids and carbohydrates on germination and mycelial
growth of AMF (Silva and Siqueira 1991; Freitas and Siqueira 1994); however, there is little
information regarding the effect of glycoproteins on such biological processes. Glycoproteins
have been implicated in the recognition between the symbiont partners (Díaz et al. 1989).
The extraradical mycelium of the AMF produce a specific glycoprotein know as glomalin
(Rillig et al. 2003; Driver et al. 2005), that is involved in soil aggregation (Rillig at al. 2002).
By enhancing aggregate stability (Wright and Upadhyaya 1996; 1998) glomalin contributes to
storage of soil carbon (Rillig et al. 1999; Rillig et al. 2001a). This biomolecule is responsible
for 4-5% of soil C and N, while the microbial biomass (estimated by the traditional method of
fumigation-extraction) represents only 0.08 - 0.2% (Rillig et al. 2001b). Moreover, it has been
considered the highest source of carbon from the organic matter, a function earlier related to
the humic acids (Wright and Nichols 2002). Other function of this protein glycoconjugate is
related to the presence of iron in its structure. Iron potentially may impair growth of
pathogenic organisms, which need this element for development (Wright and Nichols 2002).
Although important and ubiquitous (Wright and Upadhyaya 1996; Wright and Anderson
2000) in nature, the effect of glomalin on germination and mycelial growth of AMF is still
unknown. The aim of this work was to evaluate how the presence of glomalin in the substrate
affects the asymbiotic phase of Gigaspora albida Schenck & Smith.
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
180
Material and methods
Glomalin. The glomalin was extracted from soil of an Atlantic Forest area, in the
municipality of Jaqueira, Pernambuco, Brazil (Usina Frei Caneca 08º42’37’’S and
35º50’01’’W), using the method described by Wright and Upadhyaya (1998). The Bradford
protein assay (Bradford 1976) was used to determine the glomalin concentration. The extract
of glomalin was partially purified as described by Wright et al. (1998): protein was
precipitated with an equal volume of 20% (w/v) TCA (4
o
C for 1 h). The pellet of protein was
washed twice with deionized water, dissolved in 100 mM Tris (hydroxymethyl aminometane,
pH 8.0) and dialyzed against 10 mM Tris (pH 8.0). Dialyzed samples were lyophilized and
incorporated to the medium.
Spores. Spores of Gigaspora albida (UFPE 01) were multiplied in two substrates (Table 1):
a) soil; b) soil + 10% compost of fruits and legumes. Panicum miliaceum L. (fodder millet)
was the host plant. After a multiplication cycle of 60 days, the substrates with the fungi
(spores and colonized roots) were maintained at 4 ºC for three months before being used (Kim
et al. 2002). The inoculum from substrate (a) was named number 1 and that from substrate (b)
was called number 2. In previous experiments (Silva et al. unpublished data) these isolates
showed the highest potential for increasing the growth of sweet passion fruit seedlings
(Passiflora alata Curtis). Spores multiplied in both substrates were extracted from soil by wet
sieving and sucrose centrifugation (Gerdemann and Nicolson 1963; Jenkins 1964) immersed
in sodium hypochlorite (0.05 % for 2 min.), and washed several times with sterilized distilled
water (Nutila et al. 1995).
Table 1. Chemical characterization of the substrates used for multiplication of Gigaspora
albida
Substrates pH P* C N CTC C/N
(H
2
O-1:2.5) (mg dm
-3
) (g kg
-1
) (cmol
c
dm
-3
)
Soil
4.6 4 13.3 1.2 1.69 11.08
Soil + 10% OC 5.6 53 26.1 2.0 9.89 13.05
OC= organic compost; CTC= cationic exchange capacity; *Mehlich I.
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
181
Experimental setup and design. Spores were transplanted to Petri dishes containing 7 mL
agar-water medium (1.3 %, autoclaved (121 ºC/ 20 min.) amended with 0, 15, 30 or 45 μg of
glomalin mL
-1
(each replicate was represented by a Petri dish with five spores). The plates
were incubated in the dark, under environmental conditions of temperature (28 r 2 ºC) and
relative air humidity (60-80 %). The final concentration of glomalin per plate was: 105, 210
and 315 Pg protein (respective pH: 7.00, 7.02 and 7.06). The experimental design was a
random factorial arrangement of: 4 glomalin concentrations × 2 G. albida inoculum sources
(number 1 and number 2) × 2 evaluation periods (7 and 14 days) and four replicates for a total
of 64 experimental parcels, with each bioassay being repeated twice.
Evaluations and measurements. Spore germination was rated as positive when the germ
tube was twice the size of its diameter. Mycelial growth was estimated in a stereomicroscope
(40 ×) by the Newman method (1966), after staining the hyphae with Trypan blue (0,05%).
Data were submitted to analysis of variance and the means were compared by the Tukey test
(P<0.05). Regression analysis was used to compare concentrations of glomalin and mycelial
growth (Statistica program, Statsoft, 1997).
Results
Spore germination of G. albida was not affected by presence of glomalin in the growth
medium (Figure 1), but mycelial growth of G. albida from both inoculum source (number 1
and number 2) (P<0.0001) was influenced by the glycoprotein. Spores multiplied in substrate
with organic residue had higher mycelial growth in comparison with those multiplied in soil
(P<0.0001). For G. albida number 1, the concentration of 30 Pg glomalin mL
-1
promoted
growth, while 45 Pg of this glycoprotein in the medium inhibited hyphal development (Figure
2) in both evaluation periods. On the other hand, the asymbiotic growth of G. albida number
2, multiplied in substrate without the organic amendment, was initially (at the 7
th
day) linear
(Y=3.3115+0.14552x; P<0.01; R
2
=0.99) and at the 14
th
day showed a square function;
however in this case the adjustment was not significant (P>0.05).
Discussion
Germination results from metabolization of spore reserves, after absorption of water
and in presence of oxygen, being regulated by some factors such as: pH, temperature and
nutrient concentration in the external medium. Because spore reserves are used for energy and
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
182
growth during germination, molecules present in the external environment, such as glomalin,
probably do not directly affect germination, as we observed.
0
20
40
60
80
100
120
Germ ination rate (%)
0
20
40
60
80
100
120
0 153045
Glomalin ( g mL
-1
)
Ge rmination rate (%)
I Isolate 2
a
b
P
solate 1
Number 2
Number 1
Figure 1. Germination rate of spores of Gigaspora albida multiplied (60 days) in soil with
(number 1) and without (number 2) addition of organic compound, in medium supplemented
with increasing concentrations of partially purified glomalin extract, at the 7
th
(a) and 14
th
(b)
days. Bar= standard error (Tukey test, P d 0.05).
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
183
0
5
10
15
20
25
0153045
Mycelial growth (mm)
Figure 2. Mycelial growth of Gigaspora albida multiplied (60 days) in soil with (number 1)
or without (number 2) addition of organic compound, in medium supplemented with
increasing concentrations of partially purified glomalin extract, at the 7
th
(a) and 14
th
(b) days
after inoculation. Bar= standard error (Tukey test, P d 0.05)
The increase in mycelial growth when the medium was supplied with extracted
glomalin may be due to the utilization, by the fungus, of the own molecule (as a nutrient) or
of the carbohydrate portion of glomalin. Bago et al. (1999) observed that glucose and fructose
were absorbed and used during the asymbiotic growth of Glomus mosseae (Nicolson and
Gerdemann) Gerdemann and Trappe. It is also possible that the protein portion of glomalin
Isolate 1 Isolate 2
Number 1 Number 2
A
a
a
0
20
40
60
80
100
120
0 153045
Glomalin mL
-1
)
Mycelial growth (mm)
( g
B
b
b
P
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
184
enhance mycelial growth by a stimulatory effect similar to the effect of amino acids reported
by Freitas and Siqueira (1994). Other possiblity is the stimulatory effect of the carbon present
in the chemical structure of glomalin. Others have reported enhancement of both the
symbiotic and asymbiotic phases of AMF by carbonaceous molecules (Becárd and Piché
1989; Silva and Siqueira 1991).
Even though the extraction of protein may eliminate thermosensible proteins, and
extracts probably contain little or no extraneous peptides or phenolic compounds, such as
tannins (Rillig et al. 2001b), one should not exclude the possibility of presence of other
substances stimulating the initial growth of the fungi. However, for González-Chávez et al.
(2004), acidic precipitation followed by dialysis (as used in our studies) gives an extract with
high purity degree. Also, native, insoluble glomalin may be different from the extracted
molecule.
The higher mycelial growth was observed in the G. albida multiplied in organic
amended substrate than the fungus multiplied in the substrate without amendment could be
related to the process of adaptation of the fungus to the presence of glomalin in the soil once
that this protein is the major source of carbon from organic matter in the soil (Wright and
Nichols 2002). AMF adapted to specific soil conditions regrow in similar soils better than
non-adapted AMF (Weissenhorn et al. 1993; Scullion et al. 1998; Enkhtuya et al. 2000).
The glomalin displayed a stimulatory effect on the asymbiotic growth of G. albida but
there was less growth when the concentration was high. This can be the result of presence of
Fe, which varies from 0.08 to 8%, in the glomalin structure (Wright and Upadhyaya 1998).
Thus, it would be possible that high concentrations of glomalin impaired normal mycelial
growth. In the same way, the humic acids earlier considered the major components of the
organic fraction of the soil (Hayes and Clapp 2002) linearly reduced mycelial growth of G.
mosseae (Vallinni et al. 1993) and this effect was related to presence of Na in its structure.
Glycoproteins are known to act on cellular recognition through the carbohydrates
portions (Powlson 1989). The enhancement of mycelial growth on medium with 30 μg mL
-1
of glomalin (Figure 2) may be related to the cellular recognition promoted by the glomalin to
stimulate the use of resources of the spore. Our results indicated that the presence of glomalin
enhanced growth in relation to the control. In other symbiotic systems (lichen and Rhizobium-
legume), glycoproteins are important for cellular recognition between the partners (Diáz et al.
1989; Mollina and Vicente 2000). Another possible explanation for the increase in mycelial
growth is the presence of sugars contributed by glomalin to the growth medium. In
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
185
ectomycorrhizal systems, the increase in concentration of monossacharides controls genetic
expression (Nehls et al. 2000).
Presence of glomalin has no effect on germination of G. albida, but mycelial growth is
stimulated by this protein, with the enhancement depending on the concentration in the
growth medium. Moreover, the conditions under which the spores of G. albida are multiplied
affect the asymbiotic growth of the fungus when in a substrate with glomalin.
Acknowledgements
Thanks are due to CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superios),
for providing a PhD scholarship for the first author, and to CNPq (Conselho Nacional de
Desenvolvimento Científico e Tecnológico) for financial support and research grant to L.C.
Maia. Special thanks to Dr. Sara Wright for valuable suggestions in the content and
corrections of the English text.
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Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
189
Capítulo 5
Influência de resíduos orgânicos sobre a fase assimbiótica de Gigaspora albida
Schenck & Smith (Glomeromycota)
Artigo a ser submetido para publicação no periódico Mycorrhiza
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
190
Influência de resíduos orgânicos sobre a fase assimbiótica de
Gigaspora albida Schenck & Smith (Glomeromycota)
Fábio Sérgio Barbosa da Silva
1
; Adriana Mayumi Yano-Melo
1
; Nicácio de Oliveira Freitas
1
;
Danielle Karla Alves da Silva & Leonor Costa Maia
1
*
1
Universidade Federal de Pernambuco, Laboratório de Micorrizas, Depto. Micologia, CCB,
Cidade Universitária, CEP. 50670-420, Recife, PE, Brasil. [email protected];
[email protected]; nicacio.freitas@bol.com.br
*Corresponding author: Leonor Costa Maia, Tel.: 55-81-21268865; Fax: 55-81 21268482,
e-mail address: leonorcm[email protected]
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
191
Resumo
Fungos micorrízicos arbusculares (FMA) desempenham importante papel na agricultura
(orgânica); no entanto, o efeito da aplicação de resíduos orgânicos na fase assimbiótica desses
fungos é pouco conhecido. Foi avaliado o efeito de doses e tipos de adubos orgânicos sobre a
germinação e o crescimento micelial de G. albida multiplicado em solo adubado (número 1)
ou não (número 2) com composto orgânico. Cinco esporos foram desinfestados
(NaOCl/0,05%/2min), colocados entre membranas filtrantes e transferidos para solo adubado
com 0, 10, 20 e 30% (v/v) de composto orgânico, proveniente da compostagem de frutas e
verduras, terra vegetal ou esterco bovino não maturado, em experimentos independentes.
Avaliações do índice germinativo e do crescimento micelial foram conduzidas aos 7 e 14 dias
da inoculação. Cada experimento foi inteiramente casualisado em fatorial: 2 isolados de G.
albida × 4 proporções de resíduo × 2 épocas de avaliação e 4 repetições. A germinação e o
crescimento micelial inicial dos isolados de G. albida foram afetados pelo resíduo orgânico
testado. Maior germinação e crescimento micelial de G. albida ocorreram em solo adubado
com composto orgânico (53 % e 17,1 mm), seguido de terra vegetal (42,8 % e 13,9 mm) e
esterco bovino (23,7 % e 5,2 mm). Em solo adubado com composto orgânico, G. albida
(número 2) apresentou maior índice germinativo (57 %) que o multiplicado em condições
orgânicas (50 %). Comportamento inverso ocorreu em substrato adubado com terra vegetal,
com registro de maior germinação em G. albida (número 1). No experimento com esterco
bovino, a condição de multiplicação não interferiu nas respostas assimbióticas. Em geral, a
germinação e o crescimento micelial de G. albida foram beneficiados apenas em solo com
composto orgânico e terra vegetal o que não ocorreu no experimento com esterco bovino,
especialmente nas maiores proporções utilizadas. Seleção criteriosa dos tipos e proporções de
resíduo utilizados na agricultura deve ser feita, considerando que aplicações inadequadas
podem afetar o estabelecimento da associação micorrízica, pelo comprometimento da fase
pré-simbiótica.
Palavras-chave: crescimento assimbiótico; adubação orgânica; FMA.
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
192
Introdução
A crescente preocupação com a qualidade ambiental tem impulsionado a utilização de
fontes que favoreçam a qualidade edáfica e a agricultura sustentável (Mielniczuk 1999; Carter
2002). Entre esses materiais estão os resíduos orgânicos que, sendo devidamente aplicados
melhoram a estruturação do solo (Caravaca et al. 2002a), fornecem nutrientes (Paul & Clarck
1989), aumentam a capacidade tampão e de troca catiônica (Wagner & Wolf 1988) e
beneficiam a microbiota com aumento na atividade microbiana (Fernandes et al. 2005). No
entanto, as respostas positivas são dependentes da dose e do tipo de resíduo utilizado (Tanu et
al. 2004).
Para o estabelecimento da associação micorrízica arbuscular são necessárias condições
ideais para o desenvolvimento da fase pré-simbiótica, que envolve a germinação e a formação
de micélio assimbiótico (Giovannetti 2000). Fatores como pH (Green et al. 1976),
temperatura (Daniels & Trappe 1980), umidade (Sylvia & Schenck 1983), luminosidade
(Varela-Castejón et al. 1998), nutrientes (Bressan 2001), tensões de CO
2
(Bécard et al. 1989),
assim como vários compostos (Ishii et al. 1997; Bécard et al. 2004) e interações bióticas
(Carpenter-Boggs et al. 1995) são relatados como moduladores do processo (Siqueira et al.
1985).
Em sistemas para formação de mudas ou em plantios, recomenda-se a aplicação de
adubos orgânicos (Caravaca et al. 2002b), que podem atuar de modo diferenciado e particular
sobre a interação dos fungos micorrízicos arbusculares (FMA) com as plantas (Jeffries et al.
2003); entretanto, pouco se sabe sobre o efeito desses insumos sobre a germinação e o
crescimento micelial inicial de FMA, apesar da habilidade saprofítica de FMA em substratos
com matéria orgânica ter sido sugerida (Hepper & Warner 1983; Warner 1984). Estudando o
efeito da aplicação de resíduos orgânicos sobre a fase assimbiótica de FMA, Calvet et al.
(1992) observaram que o comportamento germinativo de Glomus mosseae (Nicol. & Gerd)
Gerdemann & Trappe foi independente da presença de adubo no substrato.
Maior eficiência simbiótica tem sido obtida com a utilização de FMA adaptados às
condições edafoclimáticas alvo (Algualcil et al. 2003), podendo esses benefícios serem
decorrentes da maior taxa de germinação e de crescimento micelial desses fungos; porém,
essa hipótese ainda não foi testada, especialmente com FMA condicionados à adubação
orgânica.
As etapas assimbióticas são importantes para o estabelecimento da associação
micorrízica arbuscular e a aplicação inadvertida de doses ou fontes impróprias de adubação
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
193
pode comprometer programas de inoculação de plantas que passam por fase de viveiro, assim
como o potencial germinativo de FMA em campos manejados organicamente. O objetivo
deste trabalho foi avaliar o impacto da presença de resíduos orgânicos, no substrato, sobre a
germinação e o crescimento micelial de Gigaspora albida Schenck & Smith multiplicado em
solo adubado ou não com resíduo orgânico.
Material e métodos
Foram utilizados esporos de Gigaspora albida (UFPE 01) provenientes de um ciclo de
multiplicação (60 dias) em solo adubado (número 1) ou não (número 2) com 10% de
composto orgânico (Tabela 1), tendo como hospedeiro o painço (Panicum miliaceum L.).
Após a multiplicação o solo-inóculo (esporos e raízes colonizadas), contendo 20 esporos g
-1
substrato, foi seco e armazenado (4ºC por três meses) antes de ser utilizado (Kim et al. 2002).
Em experimentos anteriores (Silva et al. dados não publicados), esses isolados foram os mais
promissores em aumentar o crescimento de mudas de Passiflora alata Curtis.
Tabela 1. Caracterização química dos substratos utilizados para multiplicação de Gigaspora
albida
Substratos pH P* C N CTC C/N
(H
2
O-1:2,5) (mg dm
-3
) (g Kg
-1
) (cmol
c
dm
-3
)
Solo
4,6 4 13,3 1,2 1,69 11,08
Solo e 10% CO 5,6 53 26,1 2,0 9,89 13,05
CO= composto orgânico; CTC= capacidade de troca catiônica; *Mehlich I
Foram testados três resíduos orgânicos (Tabela 2), que constituíram experimentos
independentes: a)Composto orgânico – proveniente da compostagem de frutas e verduras
impróprias para comercialização e fornecido pela CEAGEPE/unidade CEASA/ Recife;
b)Terra Vegetal – adquirida comercialmente (Viva o Verde Ltda.); c)Esterco Bovino não
maturado – coletado no estábulo do Departamento de Zootecnia / UFRPE.
Todos os resíduos foram peneirados (3 mm), desinfestados com Bromex (Brometo
de metila – 98% e cloropicrina – 2%) por 5 dias e mantidos em repouso por 30 dias.
Como substrato foi utilizado o solo tipo franco-argilo-arenoso, proveniente do
município de Aldeia, Camaragibe-PE (pH 5,4 e 3 mg P dm
-3
) esterilizado em autoclave
(121ºC/30 min/2 dias consecutivos) que recebeu os resíduos orgânicos nas proporções de 0,
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
194
10, 20 e 30 % (v/v), correspondente à aplicação de 0, 200, 400 ou 600 t ha
-1
. Após preparo, o
substrato foi deixado em repouso por 15 dias e umedecido com água destilada esterilizada
(40% do volume total dos poros) antes de ser utilizado.
Tabela 2. Caracterização química dos resíduos orgânicos utilizados nos experimentos
Resíduos orgânicos
Composto orgânico Terra vegetal Esterco bovino
P* (mg dm
-3
) 393,00 69,00 1026,00
Ca** (cmol
c
dm
-3
) 7,71 3,10 4,70
Mg** (cmol
c
dm
-3
) 3,40 2,20 5,10
C (g Kg
-1
) 43,10 33,40 222,60
N (g Kg
-1
) 3,80 1,20 13,10
C/N 11,34 27,86 16,99
CTC (cmol
c
dm
-3
) 12,67 13,88 12,05
pH (H
2
O -1:2,5) 6,20 5,40 7,60
CTC= capacidade de troca catiônica; *Mehlich I; ** KCl 1M.
Para inoculação, esporos foram extraídos por peneiramento úmido, seguido de
centrifugação em sacarose (Gerdemann & Nicolson 1963; Jenkins 1964), desinfestados com
NaOCl (0,05%/2 min) e lavados quatro vezes em H
2
O destilada e esterilizada (Nutila et al.
1995). Quatro grupos de cinco esporos foram colocados entre membranas filtrantes (Gelmann
Sciences Inc., Amm Arbor Michigan), que foram depositadas a 2,5 cm da superfície em
recipientes (Nalgene
, 42 × 13 × 5,5 cm e capacidade para 2000 mL) contendo 1500 mL dos
substratos testados. Cada conjunto de esporos entre membranas foi considerado uma
repetição. Os recipientes foram acondicionados no escuro, em temperatura ambiente (28 r
2ºC).
Avaliações foram conduzidas aos 7 e 14 dias da inoculação. Foram considerados
germinados os esporos que apresentaram comprimento da hifa germinativa maior que o
diâmetro do esporo (Bartolome – Esteban & Schenck 1994). As hifas foram coradas com
solução aquosa de azul de Trypan (0,05%) e o crescimento micelial determinado pelo método
de Newman (1966), em estereomicroscópio (40×).
O delineamento experimental foi do tipo inteiramente casualizado em arranjo fatorial:
2 fontes de inóculo de Gigaspora albida (número 1 e número 2) × 4 proporções do resíduo
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
195
orgânico × 2 épocas de avaliação e 4 repetições, totalizando 64 parcelas experimentais para
cada resíduo testado. Os dados foram transformados (x + 0,5), submetidos à ANOVA e as
médias comparadas pelo teste de Tukey (0,05%), utilizando-se o programa Sanest (Zonta et
al. 1984). Análises conjuntas dos experimentos foram realizadas para determinação do resíduo
mais favorável aos processos pré-simbióticos do fungo, utilizando-se o programa NTIA
(Embrapa 1996). Análises de regressão foram feitas para os parâmetros que apresentaram
interação com as proporções de resíduo.
Resultados
No experimento com composto orgânico, houve interação entre os fatores estudados
(fonte de inóculo de G. albida, proporções de adubo e época de avaliação) para o crescimento
micelial, porém para o índice germinativo, a interação foi significativa entre os fatores fonte
de inóculo e proporções de adubo, independente da época de avaliação (P<0,01). No ensaio
com terra vegetal, a germinação foi influenciada pela fonte de inóculo, sem haver interação
com os outros fatores, enquanto para o crescimento micelial, a interação entre fonte de
inóculo e proporções de terra vegetal no substrato foi significativa, independentemente da
época de avaliação (P<0,01). Em solo adubado com esterco bovino, as proporções de adubo
influenciaram significativamente a germinação e o crescimento micelial, independentemente
da época de avaliação e da fonte de inóculo testada (P<0,05).
Em meio com composto orgânico, G. albida (número 2), produzido apenas em solo,
apresentou maior índice germinativo que o multiplicado em condições orgânicas.
Comportamento inverso ocorreu em substrato adubado com terra vegetal, onde se observou
maior germinação e crescimento micelial de G. albida (número 1). No experimento com
esterco bovino, a condição de multiplicação do fungo não interferiu nas respostas
assimbióticas (Figura 1).
A adubação do solo com 20 % de composto orgânico estimulou a germinação de G.
albida produzido em substrato com adubo orgânico, mas o aumento da dose foi prejudicial
independentemente da época de avaliação. Em contrapartida, a adição de apenas 10 % foi
suficiente para aumentar o percentual germinativo dos esporos multiplicados em solo, que se
manteve elevado mesmo nos tratamentos com mais adubo (Figura 2), tanto aos 7 quanto aos
14 dias de avaliação.
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
196
0
10
20
30
40
50
60
a
a
a
a
b
b
Índice germinativo (%)
Isolado1
Isolado2
1Número
Núme
r
o2
A
CO TV EB
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
b
a
a
a
a
a
Crescimento micelial (mm)
Resíduos orgânicos
B
Figura 1. Índice germinativo (A) e crescimento micelial (B) de Gigaspora albida,
multiplicado em substrato com (Número 1) ou sem (Número 2) adição de composto orgânico,
em solo adubado com composto orgânico (CO), terra vegetal (TV) ou esterco bovino (EB).
Médias seguidas da mesma letra dentro de cada resíduo orgânico não diferem estatisticamente entre si
pelo teste de Tukey (P<0,05).
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
197
0 102030
0
10
20
30
40
50
60
70
80
B b
B b
A a
A a
A a
A a
A b
A b
Índice germinativo (%)
Proporções de composto orgânico (%)
Isolado 1
Isolado 2
Número 1
Número 2
Figura 2. Índice germinativo de isolados de Gigaspora albida, produzidos em substrato com
(número 1) ou sem (número 2) adubo orgânico, mantido em solo com proporções crescentes
de composto orgânico, independentemente da época de avaliação.
Médias seguidas da mesma
letra minúscula, entre as proporções e dentro de cada fonte de inóculo de FMA e maiúsculas entre as
fontes de inóculo na mesma proporção do resíduo, não diferem estatisticamente pelo teste de Tukey
(P<0,05).
Na primeira avaliação (7 dias), o crescimento micelial de G. albida (número 1) foi
favorecido pela presença de 20 % de composto orgânico; porém, com o passar do tempo (14
dias) o tratamento controle atingiu crescimento micelial similar (Figura 3).
A aplicação de 10 e 20 % de composto também favoreceu o crescimento micelial de
G. albida (número 2) até os sete dias, porém, do mesmo modo que ocorreu com o outro
isolado, aos 14 dias o crescimento alcançado nesses tratamentos também foi acompanhado
pelo controle (Figura 3). Diferenças entre as fontes de inóculo, aos 7 dias, ocorreram apenas
no tratamento com 10 % de adubo com G. albida (número 2) apresentando maior crescimento
micelial que G. albida (número 1). Aos 14 dias houve diferença entre os isolados apenas no
tratamento com 20 % de adubação e dessa vez G. albida (número 1) apresentou maior
crescimento micelial do que G. albida (número 2) (Figura 3).
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
198
0
10
20
30
40
50
Crescimento micelial (mm)
A a
A a
A a
B b
A b
A b
A b
A b
Número 1
Número 2
7 dias
0102030
0
10
20
30
40
50
Crescimento micelial (mm)
A b
B a
A a
A a
A a
A a
A a
A ab
Proporções de composto orgânico (%)
14 dias
Figura 3. Crescimento micelial de isolados de Gigaspora albida, produzidos em substrato
com (Número 1) ou sem (Número 2) adubo orgânico, em solo com proporções crescentes de
composto orgânico, aos 7 e 14 dias de inoculação.
Médias seguidas da mesma letra minúscula,
entre as proporções e dentro de cada fonte de inóculo de FMA e maiúscula, entre as fontes de inóculo
na mesma proporção do resíduo, não diferem estatisticamente pelo teste de Tukey (P<0,05).
Em solo com terra vegetal, nas duas épocas de avaliação, os esporos de G. albida
provindos de condição orgânica produziram maior quantidade de micélio assimbiótico na
menor dose testada (10%) (Figura 4). Em contrapartida, o crescimento micelial do isolado
mantido em solo não foi afetado pela presença da terra vegetal no meio de crescimento
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
199
(Figura 4). Em geral, G. albida (número 1) desenvolveu melhor do que G. albida (número 2)
nessa condição de solo (Figura 4).
Figura 4. Crescimento micelial de isolados de Gigaspora albida, produzidos em substrato
com (Número 1) ou sem (Número 2) adubo orgânico, mantidos em solo com proporções
crescentes de terra vegetal, independentemente da época de avaliação.
Médias seguidas da
mesma letra minúscula, entre as proporções e dentro de cada fonte de inóculo de FMA e maiúscula
entre as fontes de inóculo na mesma proporção do resíduo não diferem estatisticamente pelo teste de
Tukey (P<0,05).
A adição de esterco bovino não maturado reduziu linearmente tanto a germinação
quanto o crescimento micelial de ambos os isolados de G. albida, nas duas épocas de
avaliação (Figura 5).
0 102030
0
5
10
15
20
25
B a
B a
A a
A a
A a
A b
A b
A b
Crescimento micelial (mm)
Isolado 1
Proproções de terra vegetal (%)
Isolado 2
Número
Número 1
Número
Número 2
Proporções de terra vegetal (%)
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
200
0102030
0
2
4
6
8
10
12
14
Proporções de Esterco Bovino (%)
Crescimento micelial (mm)
Crescimento micelial
0
10
20
30
40
y= 42.5 - 1.25x; R
2
=0.98**
y= 12.181 - 0.4634x; R
2
=0.95*
Índice germinativo (%)
Índice germinativo
Figura 5. Índice germinativo e crescimento micelial de Gigaspora albida em solo adubado
com proporções crescentes de esterco bovino, independentemente da fonte de inóculo e da
época de avaliação. * (P< 0.05); ** (P< 0.01).
A partir da análise conjunta dos experimentos, verificou-se que a germinação e o
crescimento micelial inicial de G. albida foram afetados pelo resíduo orgânico testado, sendo
observado melhor desenvolvimento em meio com composto orgânico, seguido da terra
vegetal, enquanto a adição de esterco bovino não maturado não favoreceu a fase assimbiótica
do fungo (P< 0,01) (Tabela 3).
Tabela 3. Índice germinativo e crescimento micelial de esporos de Gigaspora albida em solo
adubado com composto orgânico (CO), terra vegetal (TV) ou esterco bovino não maturado
(EB), independentemente da época de avaliação e das proporções dos resíduos.
Variável Resíduos orgânicos
Composto orgânico Terra vegetal Esterco bovino
Índice germinativo (%) 53,0a 42,8b 23,7c
Crescimento micelial (mm) 17,1a 13,9b 5,2c
Médias seguidas da mesma letra na linha não diferem entre si pelo teste de Tukey (P<0.05).
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
201
O isolado de Gigaspora albida multiplicado em meio com adubo orgânico formou, em
todos os tratamentos (épocas, doses e tipos de resíduos), células auxiliares com morfologia
diferenciada (Figura 6), o que não ocorreu no isolado produzido em solo sem adubo.
a
100 Pm
c
b
mP
mP
20
20
Figura 6. Células auxiliares produzidas no micélio assimbiótico de Gigaspora albida (número 1)
multiplicado em solo com composto orgânico: (a) hifas e células auxiliares (seta); (b, c) detalhe das
células auxiliares alteradas pela ausência de ornamentações.
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
202
Discussão
A composição do substrato de crescimento afeta a germinação e a fase pré-simbiótica
de FMA (Maia & Yano-Melo 2001). No presente estudo, respostas diferenciadas nas fases
assimbióticas foram obtidas em relação ao tipo de substrato orgânico testado (Tabela 3).
A aplicação de materiais orgânicos no solo pode aumentar a colonização micorrízica
(Mäder et al. 2000), o número de propágulos infectivos (Palenzuela et al. 2002), bem como a
produção de esporos de FMA (Gryndler et al. 2003). O estímulo no crescimento micelial de
G. albida em decorrência da presença do composto orgânico ou terra vegetal no solo pode ser
atribuído à presença de carbono, oriundo da adubação, visto que o efeito benéfico de
compostos com C na estrutura química já foi relatado (Bécard et al. 1989; Silva & Siqueira
1991), porém o tipo de adubo empregado pode modular as respostas obtidas. Maior produção
de hifas também foi observada por St. John et al. (1983) em substratos com elevada
quantidade de material orgânico particulado.
Resíduos orgânicos compostados favorecem a qualidade do solo (Caravaca et al.
2002a) e estes benefícios são decorrentes da maior estabilidade do material, assim como da
eliminação de substâncias fitotóxicas durante o processo de compostagem (Kiehl 1998). Essas
características podem ter contribuído para o maior crescimento micelial de G. albida em solo
enriquecido com composto orgânico, em relação às demais fontes testadas (Figura 3). Com
resultados semelhantes, Calvet et al. (1992) observaram elevada produção de esporos
vegetativos no micélio assimbiótico de Glomus mosseae desenvolvido em resíduos
compostados, em relação ao tratamento em turfa não compostada. A baixa relação C/N do
composto orgânico estudado é relatada como benéfica para FMA (Douds et al. 1997) e pode
ter favorecido o processo.
O caráter alcalino do esterco bovino (Tabela 2) pode ter afetado negativamente o
desenvolvimento dos FMA, visto que a concentração hidrogeniônica afeta o processo pré-
simbiótico (Green et al. 1976). Trindade et al. (2000) observaram redução na colonização
micorrízica em mudas de mamoeiro com o aumento da proporção de esterco bovino maturado
no substrato. O comprometimento do processo pré-simbiótico em meio com esterco pode
estar relacionado ao teor de N presente no resíduo (Tabela 2), visto que elevados teores deste
macronutriente foram referidos como inibidores da simbiose (Bressan 2002). Outra provável
explicação é a presença de substâncias fitotóxicas que são comumente encontradas em
materiais não compostados (Kiehl 1998), como o esterco utilizado no presente estudo.
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
203
Em condições desfavoráveis, G. albida emite vários tubos germinativos (Maia et al.
1994), o que aumenta as chances do fungo encontrar e colonizar o hospedeiro (Giovannetti
2000). Essa estratégia poderia ter sido utilizada pelo fungo produzido apenas em solo, quando
mantido nos tratamentos com composto orgânico, mas o comportamento pré-simbiótico
similar entre os isolados não indica que isso tenha ocorrido.
A utilização de FMA adaptados às condições edafoclimáticas em que serão aplicados
tem sido recomendadas (Azcón-Aguilar & Barea 1997) e respostas positivas de FMA
adaptados a diversos fatores do solo foram descritas (Enkthuya et al. 2000; Weissenhorn et al.
1993; Malcová et al. 2003). No presente estudo, os benefícios da adaptação do isolado à
condição orgânica variaram em função do tipo de material orgânico empregado no ensaio de
germinação. Apesar do maior desenvolvimento assimbiótico ser esperado para o fungo
multiplicado em condição orgânica, o propagado apenas em solo, também se mostrou
adaptado à presença de composto orgânico no solo (Figuras 2 e 3). Este comportamento
traduz possível plasticidade fenotípica, decorrente talvez da elevada quantidade de núcleos no
esporo (Weissenhorn et al. 1994). Por outro lado, Meharg & Cairney (2000) sugerem que em
substratos com maiores pressões seletivas, tal como o elevado teor de P (53 mg dm
-3
) no
substrato com composto orgânico utilizado para multiplicação de G. albida, genes
codificadores da tolerância são expressos em elevadas taxas e transferidos dentro da
população de FMA, conferindo melhores respostas em relação a isolados multiplicados em
meio sem pressão de seleção. No presente trabalho, esta hipótese é suportada apenas em
substrato adubado com terra vegetal, onde maiores taxas de germinação e de crescimento
micelial foram obtidas a partir de esporos produzidos em condição orgânica (Figura 1).
Apesar de ser considerado que os FMA adaptados às condições edafoclimáticas são
fisiologicamente superiores aos não adaptados, verifica-se que as respostas são também
mediadas pela composição do meio de crescimento.
Conforme ressaltado por Giovannetti (2000), respostas diferenciadas no crescimento
assimbiótico são observadas em relação aos nutrientes do meio. Elevadas proporções do
composto orgânico reduziram o crescimento micelial do isolado multiplicado em substrato
adubado (Figura 3). A elevada concentração de P no substrato pode não ter sido a responsável
por essa resposta, uma vez que este macronutriente tem efeitos deletérios mais pronunciados
na fase simbiótica (Bressan 2002) do que na fase assimbiótica (Koske 1981). Por outro lado, a
presença de elevados teores de N no tratamento com maior nível de adubação (30 %) pode ter
comprometido o desenvolvimento micelial inicial, tal como observado por Bressan (2001).
Outra provável explicação para a inibição do crescimento micelial é a elevada quantidade de
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
204
húmus em materiais compostados (Kiehl 1998). Vallini et al. (1993) observaram que o
aumento na concentração de ácidos húmicos no meio de crescimento reduziu o comprimento
da hifa germinativa de Glomus mosseae.
Representantes de Gigaspora Gerdemann & Trappe emend. Walker & Sanders
formam células auxiliares no solo (Schenck & Pérez 1990). Supõe-se que essas estruturas
extra-radiculares estão mais relacionadas às características intrínsecas do esporo do que
associadas à composição do meio de crescimento (Silva & Siqueira 1991). As alterações
morfológicas observadas em G. albida (número 1) (Figura 6), podem ser decorrentes da sua
multiplicação em substrato com adubo, o que se traduziu pela formação de células auxiliares
com morfologia diferenciada daquela característica do gênero, que apresenta células com
ornamentações espinhosas (Schenck & Smith 1982). Relatos de modificações na morfologia
do micélio assimbiótico também foram registrados por Mayo et al. (1986), os quais
observaram que a eliminação de bactérias associadas aos esporos de Glomus versiforme
(Karsten) Buch favoreceu a formação de micélio com protuberâncias, o que não ocorreu no
micélio originado de esporos sem desinfestação. Entretanto, avaliações de esporos
provenientes de vários ciclos consecutivos de multiplicação em substrato adubado são
necessárias para comprovar se esta alteração seria decorrente de adaptação ou mutação.
Não é claro se a perda das espinescências, registrada nas células auxiliares produzidas
por G. albida multiplicado em substrato com adubo, aumentaria as chances de emissão de
hifas por essa estrutura ou se reduziria o gasto metabólico para a produção dessas
ornamentações. Contudo, os ganhos não iriam se traduzir em garantia de colonização do
hospedeiro, dada a incapacidade dessas estruturas funcionarem como fonte de inóculo
micorrízico (Bierman & Linderman 1983). A emissão de hifas a partir de células auxiliares de
Scutellospora reticulata (Koske, Miller & Walker) Walker & Sanders foi recentemente
constatada por Declerck et al. (2004), entretanto, o micélio formado não foi hábil em
colonizar as raízes de Allium porrum L. e de Daucus carota L.
Os dados obtidos sugerem que deve ser feita seleção criteriosa da quantidade e tipo de
resíduo empregado em sistemas agrícolas orgânicos, visto que adubações inadequadas podem
afetar os benefícios da simbiose micorrízica arbuscular pelo comprometimento da fase
assimbiótica dos fungos que formam essa associação.
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
205
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Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
210
Capítulo 6
Fungos micorrízicos arbusculares multiplicados em substrato com adubo orgânico
favorecendo a formação de mudas orgânicas de Passiflora alata Curtis:
uma questão de adaptação?
Artigo a ser submetido para publicação no
periódico Pesquisa Agropecuária Brasileira
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
211
Fungos micorrízicos arbusculares multiplicados em substrato com adubo orgânico
favorecendo a formação de mudas orgânicas de Passiflora alata Curtis:
uma questão de adaptação?
Fábio Sérgio Barbosa da Silva
1,4
; Adriana Mayumi Yano-Melo
2,4
;
Uided Maaze Tiburcio Cavalcante
2,4
; Maryluce Albuquerque da Silva
1,4
&
Leonor Costa Maia
3,4
*
1
Biólogo, doutorando em Biologia de Fungos ([email protected];
)
2
Bióloga, Dr. em Ciências Biológicas(amym[email protected]; [email protected])
3
Bióloga, PhD em Fitopatologia *([email protected].br)
4
Laboratório de Micorrizas, Departamento de Micologia, Centro de Ciências Biológicas,
Universidade Federal de Pernambuco, 50670-420, PE, Brasil
*autor para correspondência
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
212
Resumo – (Fungos micorrízicos arbusculares multiplicados em substrato com adubo orgânico
favorecendo a formação de mudas orgânicas de Passiflora alata Curtis: uma questão de
adaptação?) Avaliou-se a aplicação de composto orgânico na produção de mudas de
maracujazeiro-doce associadas a fungos micorrízicos arbusculares (Glomus etunicatum,
Acaulospora longula, Gigaspora albida e Scutellospora heterogama) multiplicados em solo
ou substrato + 10 % de resíduos orgânicos. O experimento foi conduzido em delineamento
inteiramente casualizado em fatorial de 9 × 2: quatro FMA multiplicados em solo, quatro em
substrato + adubo orgânico e um controle × dois substratos (com ou sem composto orgânico),
4 repetições. Após 42 dias avaliou-se: altura; produção foliar; massa seca da parte aérea; área
foliar; produção de esporos e de glomalina; colonização radicular. A adubação associada a
micorrização proporcionou maior crescimento, sendo os maiores benefícios com G. albida
produzido em substrato + adubo orgânico, resultando em incrementos de 90 % e 92 % para
massa seca da parte aérea e área foliar, respectivamente, em relação ao controle. G.
etunicatum favoreceu o crescimento das mudas, apenas quando multiplicado em solo sem
adubo; os resultados com A. longula não foram afetados pela condição de multiplicação. A
glomalina e a esporulação não foram influenciadas pela adubação. Mudas associadas a G.
albida (multiplicado em substrato com resíduo orgânico), produzidas em solo + composto
orgânico, apresentam maior crescimento, colonização micorrízica e redução de 60 % do
tempo de formação, indicando que a micorrização, condicionada à adubação orgânica,
constitui ferramenta eficaz na produção orgânica de mudas desta fruteira.
Termos para indexação: maracujazeiro-doce, composto orgânico, micorriza arbuscular
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
213
Introdução
Entre as alternativas biotecnológicas que podem aumentar a produtividade de culturas
economicamente importantes está a aplicação de fungos micorrízicos arbusculares (FMA).
Para proporcionar efetivos benefícios em culturas agrícolas, é necessária a prévia seleção de
inóculo de FMA, visto que há diferentes graus de compatibilidade entre o hospedeiro e o
micobionte (Costa et al., 2001; Sylvia et al., 2003). Nesse aspecto, é recomendada a utilização
de FMA adaptados às condições edafo-climáticas onde serão aplicados (Azcón-Aguilar &
Barea, 1997), devido à melhor eficiência desses fungos nessa situação (Gonzalez-Chavez et
al., 2002). Entretanto, pouco se conhece sobre o potencial de FMA adaptados à adubação
orgânica na produtividade vegetal em sistemas orgânicos.
A busca pela sustentabilidade e redução nos custos de produção em sistemas agrícolas
tem favorecido a utilização de fontes orgânicas que maximizem a produção vegetal sem
comprometer a qualidade edáfica. Adubos orgânicos melhoram a agregação das partículas do
solo, a capacidade tamponante e de troca catiônica, o teor de nutrientes (Paul & Clarck, 1989),
além de beneficiar a atividade microbiana do solo (Caravaca et al., 2004). Em sistemas
micorrízicos, a suplementação do solo com fontes orgânicas pode favorecer o
desenvolvimento de FMA tanto no solo (Frey & Ellis, 1997) quanto na raiz (Murphy et al.,
2000).
O maracujazeiro-doce (Passiflora alata Curtis) é a segunda espécie de Passifloraceae
em importância econômica no Brasil (Vasconcelos et al., 2001). Da mesma forma que o
maracujazeiro-amarelo (Passiflora edulis Sims. f. flavicarpa Deg.) depende da associação
micorrízica arbuscular para pleno desenvolvimento (Cavalcante et al., 2002), especialmente
em solo com baixo teor de fósforo; Anjos (2004) e Silva et al. (2004) constataram que a
mesma condição ocorre em maracujazeiro-doce.
Apesar do efeito sinérgico positivo da aplicação conjunta de adubos orgânicos e da
inoculação com FMA no crescimento vegetal (Caravaca et al., 2003), não se conhece este
efeito na formação de mudas de maracujazeiro-doce. Dessa forma, objetivou-se neste trabalho
selecionar FMA eficiente em promover o crescimento de maracujazeiro-doce em solo
adubado com composto orgânico, e verificar se a eficiência do fungo era influenciada pelo
substrato de produção do inóculo.
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
214
Material e métodos
Sementes de maracujazeiro-doce (P. alata) foram desinfestadas com NaOCl-20% (2%
cloro ativo) por 2 minutos, lavadas em água destilada e colocadas para germinar em solo e
areia (2:1 v/v), previamente desinfestado.
Os tratamentos de inoculação com FMA e condições de propagação dos fungos são
apresentados na Tabela 1; em todos os potes de cultura usou-se o painço (Panicum miliaceum
L.) como hospedeiro. Após multiplicação, o solo-inóculo (esporos e raízes colonizadas) foi
seco e mantido a 4 ºC por três meses, antes de ser utilizado (Kim et al., 2002). Em
experimentos anteriores (Silva et al., dados não publicados), esses substratos foram os mais
promissores para produção de inóculo dos FMA testados. Os FMA multiplicados em solo
foram utilizados como controle.
Tabela 1. Condições da produção e densidade dos inóculos de FMA
Inóculo
FMA
Espécie (acesso) Substrato de
multiplicação
Densidade
do inóculo*
Ga-Org Gigaspora albida Schenck & Smith (UFPE 01) Solo + CO (10% v/v) 20,66
Ga-S
Gigaspora albida
Solo 18,58
Ge-Org Glomus etunicatum Becker & Gerd. (UFPE 06) Areia + TV (10% v/v) 92,24
Ge-S Glomus etunicatum (UFPE 06) Solo 101,03
Sh-Org Scutellospora heterogama (Nicol. & Gerd.)
Walker & Sanders (UFPE 19)
Areia + TV (10% v/v) 10,27
Sh-S Scutellospora heterogama (UFPE 19) Solo 18,00
Al-Org Acaulospora longula Spain & Schenck
(UFPE 21)
Areia + TV (10% v/v) 103,12
Al-S Acaulospora longula (UFPE 21) Solo 100,17
*esporos g
-1
; CO= comporto orgânico; TV= terra vegetal.
Como substrato para o experimento foi usado solo franco argilo arenoso desinfestado
com Bromex
(98% de brometo de metila e 2% de cloropicrina) por 5 dias. Parte do substrato
foi adubado (10% v/v) com composto orgânico (Tabela 2), proveniente da compostagem de
frutas e verduras impróprias para comercialização na CEAGEPE/Unidade CEASA/Recife.
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
215
Tabela 2. Caracterização química dos substratos utilizados para multiplicação dos FMA e
para cultivo do maracujazeiro-doce
pH P* C N CTC C/N
Substratos
(H
2
O-1:2,5) (mg dm
-3
) (g Kg
-1
) (cmol
c
dm
-3
)
Multiplicação de FMA
Solo
4,6 4 13,3 1,2 1,69 11,08
Solo+10% CO 5,6 53 26,1 2,0 9,89 13,05
Areia+10% TV 6,1 65 4,0 0,3 3,38 13,33
Cultivo do maracujazeiro
Solo
4,7 4 38,5 1,16 11,35 33,19
Solo+10% CO 5,0 42 44,4 2,03 13,25 21,87
CO=composto orgânico; TV=terra vegetal; CTC=capacidade de troca catiônica; *Mehlich I.
Plântulas de maracujá com duas folhas definitivas foram transferidas para potes com
capacidade para 200 g de substrato e nessa ocasião inoculadas na região das raízes com solo-
inóculo fornecendo 200 esporos de FMA/pote, de acordo com o tratamento. Após 15 dias,
foram transplantadas para vasos de 1 Kg com o mesmo substrato. Nos tratamentos controle
foram adicionados 2 mL de filtrado (45 Pm), oriundo do peneiramento de todos os inóculos
testados (20 g dos inóculos em 200 mL de H
2
O destilada), visando equilibrar a microbiota do
solo, exceto FMA. O experimento foi mantido em telado, sob condições ambientais de
luminosidade, temperatura (T
max
: 37,04 ºC; T
mín
: 26,69 ºC) e umidade (UR
máx
: 38,86%;
UR
mín
: 80,45%).
O delineamento experimental foi do tipo inteiramente casualizado em arranjo fatorial
de 9 (Controle não inoculado, Ga-Org, Ga-S, Ge-Org, Ge-S, Sh-Org, Sh-S, Al-Org e Al-S) ×
2 tipos de substrato de cultivo das mudas (com ou sem adição de composto orgânico) em 4
repetições, totalizando 72 unidades experimentais.
O experimento foi colhido 42 dias após a inoculação, ocasião em que houve emissão
de gavinhas, sendo avaliados: altura, número de folhas, diâmetro do caule a 3 cm do solo,
massa seca da parte aérea, área foliar, incremento no crescimento; produção de esporos
(Gerdemann & Nicolson, 1963; Jenkins, 1964) e de glomalina no solo (Wright & Upadhyaya,
1998). Após diafanização das raízes em KOH (10 % p/v) e coloração com azul de Trypan
(0,05%) em lactoglicerol (Phillips & Hayman, 1970), foram avaliadas a percentagem de
colonização micorrízica total, arbuscular, hifálica e vesicular (Mc Gonigle et al., 1990). A
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
216
massa seca foi obtida após secagem em estufa de circulação de ar até peso constante, e a área
foliar avaliada usando o Programa Sigma Pró Scan 5. Para determinar o incremento produzido
pela presença do FMA utilizou-se a fórmula de Edington et al. (1971) adaptada: I(%)= [(Tr-
T)/Tr]×100, onde I(%)= incremento da variável; Tr= valor médio para o tratamento
micorrizado e T= valor médio do controle não inoculado.
Para análise, os dados de densidade de esporos foram transformados em log (x + 1),
colonização micorrízica total, arbuscular e hifálica em arco seno (x/100) e colonização
vesicular em x+0,5. Os dados foram submetidos à análise de variância e as médias
comparadas pelo teste de Tukey (P d 0,05), utilizando o programa Sanest.
Resultados
Houve efeito significativo (P<0,001) da interação entre inoculação de FMA e
adubação do substrato para diâmetro do caule, altura, massa seca aérea, área foliar e
colonização micorrízica total, arbuscular, hifálica e vesicular das mudas de maracujazeiro-
doce. Para a densidade de esporos houve efeito apenas dos tratamentos de inoculação,
enquanto a produção de glomalina não foi afetada pelos fatores testados (P>0,05).
Em geral, a aplicação de adubo orgânico oriundo da compostagem, juntamente com a
inoculação com FMA, favoreceu o crescimento das mudas em comparação com o controle
não inoculado (Tabela 3). As mudas associadas a S. heterogama multiplicado em solo, não
foram beneficiadas pela micorrização exceto em relação à área foliar, no tratamento usando
solo + composto orgânico. Por outro lado, nos tratamentos com S. heterogama multiplicado
em terra vegetal, houve respostas positivas de crescimento nos demais parâmetros quando se
usou solo + 10 % composto orgânico como substrato de cultivo das mudas.
Em solo adubado, apenas as mudas inoculadas com o isolado de G. albida
multiplicado em substrato com adubo orgânico emitiram gavinhas; nestas condições, este
isolado proporcionou melhores respostas do maracujazeiro-doce em todos os parâmetros
estudados, o que foi traduzido por incrementos de 90 % e 92 %, para massa seca da parte
aérea e área foliar, respectivamente, em relação ao controle não inoculado. No solo com
adubo, com exceção da altura, as mudas associadas a G. albida multiplicado em solo com
resíduo orgânico e G. etunicatum oriundo de solo sem adubação apresentaram o mesmo
padrão de crescimento (Tabela 3).
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
217
Tabela 3. Diâmetro do caule, altura, massa seca da parte aérea e área foliar de mudas de maracujazeiro-
doce, inoculadas com FMA multiplicados em substrato com adubo orgânico e cultivadas em solo com ou
sem composto orgânico, 42 dias após a inoculação
Inoculação Diâmetro do caule Altura Massa seca aérea Área foliar
solo solo+CO solo solo+CO solo solo+CO solo solo+CO
NI 1,60 bA 1,57 cA 4,25 aA 4,20 eA 0,06 bA 0,17 fA 16,32 cA 39,48 eA
Ga-Org 2,31 aB 3,20 aA 7,50 aB 20,85 aA 0,57 aB 1,69 aA 200,50 aB 478,50 aA
Ga-S 2,33 aB 2,72 bA 7,07 aB 11,35 bcA 0,41 abB 1,14 bcA 133,40 abB 315,90 bcA
Ge-Org 1,60 bB 2,62 bA 5,27 aB 8,87 cdA 0,14 bB 0,69 deA 46,23 bcB 215,90 cdA
Ge-S 1,70 bB 3,20 aA 5,40 aB 15,00 bA 0,22 bB 1,41 abA 64,69 bcB 377,50 abA
Sh-Org 1,96 abB 2,55 bA 6,57 aB 9,17 cdA 0,29 abB 0,84 cdA 44,98 bcA 98,40 eA
Sh-S 1,70 bA 1,92 cA 5,52 aA 6,47 deA 0,16 bA 0,37 efA 87,90 bcB 276,10 bcdA
Al-Org 1,65 bB 2,65 bA 5,52 aB 10,32 cA 0,18 bB 0,96 cdA 53,48 bcB 268,90 cdA
Al-S 1,67 bB 2,52 bA 5,60 aB 8,47 cdA 0,07 bB 0,71 deA 31,54 bcB 202,90 dA
CO= composto orgânico; Ga= Gigaspora albida; Ge= Glomus etunicatum; Sh= Scutellospora heterogama; Al=
Acaulospora longula; C= não inoculado (controle); S=FMA multiplicado em solo; Org=FMA multiplicado em
substrato com adubo orgânico. Médias seguidas pela mesma letra, minúscula na coluna e maiúscula na linha, não
diferem estatisticamente (p<0,05).
Em solo suplementado com composto orgânico, G. albida e S. heterogama
multiplicados em substrato com adubo promoveram as melhores respostas no crescimento das
mudas do que os isolados oriundos de multiplicação em solo. O inverso ocorreu com G.
etunicatum; neste caso, melhores respostas foram obtidas com o isolado multiplicado em solo
sem adubo. Por outro lado, a condição de multiplicação de A. longula não afetou as variáveis
testadas (Tabela 3).
De modo geral, não se evidenciou efeito da condição de multiplicação dos FMA, no
crescimento das mudas cultivadas em solo não adubado. Nesta condição, melhores respostas
de crescimento de P. alata foram registradas com a inoculação de G. albida (Tabela 3) com
incrementos de 90 % e 92 % para massa seca da parte aérea e área foliar, respectivamente, em
relação ao controle não inoculado.
Na ausência de adubação, maior colonização micorrízica total foi observada em
plantas inoculadas com G. albida multiplicado em solo ou em solo + adubo orgânico e com S.
heterogama oriundo da multiplicação em solo + adubo, diferindo estatisticamente da
colonização produzida pelos demais fungos (Tabela 4). Maior desenvolvimento de hifas foi
observado em raízes inoculadas com S. heterogama multiplicado em substrato com adubo,
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
218
enquanto maior colonização arbuscular tenha sido registrada em raízes associadas com G.
albida (Tabela 4).
A colonização por hifas foi beneficiada pela presença do composto orgânico no meio
de cultivo. Neste substrato, o isolado de G. albida multiplicado em condição orgânica
produziu maior colonização hifálica do que aquele oriundo de multiplicação em solo. Por
outro lado, a condição de multiplicação não influenciou a formação de arbúsculos (Tabela 4).
A produção de glomalina não diferiu entre os FMA e não foi afetada pela presença de
adubo no meio de crescimento (Tabela 4).
Tabela 4. Percentual de colonização micorrízica total (CT), por hifas (CH) e arbúsculos (CA) e produção
de glomalina em mudas de maracujazeiro-doce, inoculadas com isolados de FMA multiplicados em
substrato com adubo orgânico e cultivadas em solo com ou sem composto orgânico, 42 dias após a
inoculação, em casa de vegetação
Inoculação CT (%) CH (%) CA (%) Glomalina*
(mg g agregado
-1
)
Solo Solo+CO Solo Solo+CO Solo Solo+CO Solo Solo+CO
C 0,0 dA 0,7 eA 0,0 dA 0,7 eA 0,0 dA 0,0 dA 9,9 aA 9,7 aA
Ga-Org 79,6 aA 85,1 aA 11,8 bcB 30,1 abcA 67,8 aA 55,0 aB 10,2 aA 10,8 aA
Ga-S 71,2 aA 71,0 abA 19,3 bA 7,0 deB 52,0 aA 64,0 aA 11,4 aA 10,7 aA
Ge-Org 2,9 cdB 40,1 cdA 1,4 cdB 23,2 bcdA 1,5 cdB 16,9 bA 10,6 aA 10,3 aA
Ge-S 23,3 bA 16,2 dA 7,8 bcA 11,0 cdeA 15,5 bA 5,9 bcB 10,6 aA 10,7 aA
Sh-Org 55,4 aA 52,4 bcA 49,9 aA 49,1 aA 5,5 bcA 3,2 cdA 10,1 aA 11,5 aA
Sh-S 11,4 bcdB 50,6 bcA 9,5 bcdB 47,6 abA 1,9 cdA 2,9 cdA 10,8 aA 8,9 aA
Al-Org 10,4 bcB 42,7 bcdA 6,1 bcdB 26,6 abcA 3,9 cdA 0,5 cdA 10,8 aA 10,5 aA
Al-S 6,6 bcdB 36,9 cdA 3,8 bcdB 22,1 cdA 1,0 cdA 2,0 cdA 11,0 aA 10,9 aA
*1-2mm diâmetro; CO= composto orgânico; Ga= Gigaspora albida; Ge= Glomus etunicatum; Sh= Scutellospora
heterogama; Al= Acaulospora longula; C= não inoculado (controle); S=FMA multiplicado em solo; Org=FMA
multiplicado em substrato com adubo orgânico.
Médias seguidas pela mesma letra, minúscula na coluna e maiúscula na linha, não diferem estatisticamente (P<0,05).
Não foram observadas vesículas nas raízes associadas a G. etunicatum, enquanto
naquelas em simbiose com A. longula a adubação favoreceu a formação dessas estruturas
(Tabela 5).
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
219
Tabela 5. Percentual de colonização vesicular por Acaulospora longula, multiplicado em
substrato com (Org) ou sem (S) adubo orgânico, nas raízes de maracujazeiro-doce cultivado em
solo com ou sem composto orgânico, 42 dias após a inoculação, em casa de vegetação
Inoculação Substratos
Solo Solo + 10 % CO
Al-S 0,34 aB 1,83 aA
Al-Org 10,54 aB 12,77 aA
Médias seguidas pela mesma letra, minúscula na coluna e maiúscula na linha, não diferem
estatisticamente (P<0,05).
Não houve diferenças significativas na esporulação dos FMA considerando o substrato
onde as mudas foram cultivadas. No entanto, G. albida multiplicado em solo com adubo
produziu maior quantidade de esporos que os demais fungos (Tabela 6).
Tabela 6. Número de esporos de FMA na rizosfera de mudas de maracujazeiro-doce
inoculadas com isolados multiplicados em solo e em substrato com adubo orgânico,
independentemente do tipo de substrato de cultivo, 42 dias após a inoculação
FMA / origem do inóculo
G. albida A. longula G. etunicatum S. heterogama
Org S Org S Org S Org S
Nº esporos. g
-1
solo
2,15a 1,34b 0,83bc 0,69cd 0,10e 0,17de 0,05e 0,05e
Ga= Gigaspora albida; Ge= Glomus etunicatum; Sh= Scutellospora heterogama; Al= Acaulospora
longula; C= não inoculado (controle); S=FMA multiplicado em solo; Org=FMA multiplicado em
substrato com adubo orgânico.
Médias seguidas da mesma letra não diferem entre si pelo teste de Tukey (P<0,05).
Discussão
O isolado de G. albida, que maximizou o crescimento das mudas de P. alata em solo
com ou sem composto orgânico, usado neste trabalho, promoveu o crescimento do
maracujazeiro-amarelo (Cavalcante et al., 2002) e do maracujazeiro-doce (Silva et al., 2004).
A incorporação de resíduos orgânicos favorece o crescimento vegetal devido à
melhoria das condições físico-químicas e biológicas do solo. No entanto, no presente estudo, os
benefícios da adubação orgânica não foram evidenciados em plantas não micorrizadas, mesmo
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
220
com o substrato adubado apresentando 42 mg P dm
-3
(Tabela 2), o que confirma o
micotrofismo de P. alata, constatado por Anjos (2004).
A micorrização, segundo Johnson (1998), pode ser favorecida pela presença de matéria
orgânica em solos pobres, considerando que há aumento no teor de nutrientes no solo adubado,
especialmente em relação aos teores de N e P como observado no experimento (Tabela 1),
sendo este aspecto verificado na resposta da interação entre FMA e adubação orgânica para o
crescimento de maracujazeiro-doce. Similarmente, Caravaca et al. (2003) relataram o efeito
sinérgico positivo da aplicação de resíduos orgânicos e de FMA no crescimento vegetal.
Os benefícios da inoculação com FMA e adição de composto orgânico registrados no
presente estudo podem ser atribuídos à melhor utilização, pelas hifas, de P e N orgânicos
(Hodge et al., 2001) e à melhoria da estruturação do solo, decorrente da adubação.
Adicionalmente tem sido observado que maior produção de hifas em meio com matéria
orgânica (Frey & Ellis, 1997) pode favorecer a formação de extensa rede micelial que propicia
aumento no crescimento de mudas devido à maior absorção de nutrientes.
Mesmo em substrato adubado, os isolados de S. heterogama e de A. longula
multiplicados em solo sem adubo não foram capazes de incrementar o crescimento das mudas.
No tratamento com S. heterogama a ineficiência simbiótica pode estar relacionada às respostas
tardias do isolado multiplicado em solo, comportamento observado em mudas de
maracujazeiro-amarelo associadas a esse isolado (Cavalcante et al., 2002). Entretanto, quando
multiplicado em meio com adubo, o isolado de S. heterogama mostrou-se eficiente em
promover o crescimento do maracujazeiro-doce, evidenciando que a condição de multiplicação
influencia a atuação do fungo micorrízico.
Comportamento diferenciado com relação à estratégia de colonização de FMA
pertencentes a famílias distintas foi observado por Hart & Reader (2002). No presente estudo,
foi constatado que o benefício da micorrização variou de acordo com a espécie de FMA. Os
isolados de G. albida e S. heterogama, multiplicados em substrato com adubo orgânico,
promoveram maiores benefícios ao hospedeiro do que os isolados multiplicados apenas em
solo, ocorrendo o inverso com o isolado de G. etunicatum, enquanto com A. longula o
substrato de multiplicação não influenciou os benefícios decorrentes da simbiose. Este
comportamento sugere que o substrato para multiplicação pode aumentar a eficiência de
isolados de Gigasporaceae, indicando certo grau de adaptação à condição de cultivo. Nesse
aspecto, Muthukumar & Udaiyan (2002) consideram que a multiplicação de FMA em meio
com resíduo orgânico constitui alternativa para manter e selecionar isolados mais eficientes.
Scullion et al. (1998) observaram que FMA isolados de áreas com manejo orgânico foram mais
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
221
efetivos em promover o crescimento de Trifolium repens L. do que fungos oriundos de áreas
com sistema de cultivo convencional, onde foram aplicados fertilizantes químicos. Além disso,
há relatos sobre o efeito benéfico de FMA adaptados a diversas condições edáficas (Gonzalez-
Chavez et al., 2002).
A melhor atuação dos FMA multiplicados em substrato suplementado com adubo
orgânico, e testados também em condição orgânica, tal como observado no presente estudo,
pode ser atribuída à tolerância dos isolados, principalmente ao P, adquirida durante a
multiplicação, visto que em substratos com elevadas pressões seletivas, ocorre alta taxa de
expressão de genes ligados à tolerância, que são transferidos dentro da população de FMA,
conferindo melhores respostas simbióticas (Meharg & Cairney, 2000). Entretanto, o fraco
desempenho do isolado de G. etunicatum multiplicado em substrato com terra vegetal em
relação ao produzido apenas em solo, pode estar relacionado à plasticidade funcional desta
espécie (Weissenhorn et al., 1994). Esse comportamento está de acordo com a hipótese
proposta por Johnson (1993) de que a fertilização seleciona FMA menos eficientes em
promover o crescimento do hospedeiro. Neste experimento, quando G. etunicatum foi
multiplicado em substrato adubado que apresentava elevado teor de P (Tabela 2) foi menos
efetivo em promover o crescimento do maracujazeiro-doce do que o inóculo oriundo da
multiplicação em solo sem adubo. Fraco desempenho de espécies de Glomus Tulasne &
Tulasne adaptadas a diversos fatores do solo, como salinidade (Tian et al., 2004), sobre o
crescimento do hospedeiro tem sido registrado em relação a isolados não adaptados.
O meio de multiplicação não interferiu na eficiência de A. longula considerando que os
dois isolados apresentaram comportamento simbiótico similar. O mesmo foi observado por
Graham & Abbott (2000) com isolados de Acaulospora laevis Gerd. & Trappe que
apresentavam diferentes graus de infectividade.
Elevada esporulação pode ser obtida com a aplicação adequada de fontes orgânicas
(Gryndler et al., 2002); entretanto, a duração do experimento (42 dias) pode não ter sido
suficiente para possibilitar a formação de grande número de esporos dos FMA testados.
Gigaspora albida multiplicado em substrato com adubo orgânico foi o único FMA que teve
destacada esporulação, independentemente do substrato de cultivo de P. alata, sendo essa
característica importante na seleção de inoculantes, pois se busca isolados que além de
beneficiar o hospedeiro produzam elevadas quantidades de propágulos no solo (Abbott et al.,
1994).
Aumentos na taxa de colonização radicular foram referidos em diversos sistemas
quando fontes orgânicas foram adicionadas ao substrato (Murphy et al., 2000). Entretanto,
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
222
apesar das melhores respostas de crescimento do maracujazeiro-doce terem sido obtidas com o
isolado de G. albida produzido em condição orgânica isso não foi traduzido por maior
produção de estruturas micorrízicas, em relação a G. albida multiplicado em solo. Os
arbúsculos participam ativamente da transferência de nutrientes (Barker et al., 1998) entre os
parceiros e influenciam a funcionalidade da simbiose, porém praticamente não houve diferença
na colonização promovida por G. albida multiplicado em condições diferentes. Provavelmente,
outras técnicas para avaliação da simbiose micorrízica, como a eficiência na aquisição de P
entre os isolados (Munkvold et al., 2004) e a quantificação de micélio externo (Hart & Reader,
2002) possam detectar diferenças intraespecíficas.
Entre os FMA testados que formam vesículas, apenas A. longula produziu tais
estruturas no córtex radicular de P. alata, sendo registrada maior quantidade em solo com
adubo orgânico. Tal produção possivelmente foi relacionada à maior disponibilidade de
nutrientes no meio suplementado com composto orgânico, visto que vesículas são estruturas de
armazenamento (Smith & Read, 1997). A colonização extensiva do córtex radicular por
espécies de Acaulosporaceae é tardia (Hart & Reader, 2002) o que pode ter contribuído para o
efeito pouco destacado da simbiose formada por A. longula.
A adubação orgânica, na maioria das vezes, favorece a produção de micélio externo
(Frey & Ellis, 1997) o qual é responsável pela síntese de glomalina (Wright & Upadhyaya,
1998). Entretanto, a produção de glomalina não diferiu entre os tratamentos, o que pode ser
atribuído à curta duração do experimento, visto que boa parte da energia do fungo pode ter sido
destinada à formação de colonização intraradicular e absorção de nutrientes do solo, não
estando disponível para o metabolismo secundário e conseqüente formação da glicoproteína.
Em experimento de longa duração (24 meses), Caravaca et al. (2005) registraram aumento na
produção de glomalina na rizosfera de Olea europaea L., Pistacia lentiscus L., Rentama
sphaerocarpa L. e Rhamnus lycioides L. associadas a Glomus claroideum Schenck & Smith,
em relação às plantas controle sem inoculação.
A aplicação de FMA em mudas de fruteiras tem reduzido o tempo para transplantio ao
campo, tal como mencionado para maracujazeiro amarelo (Cavalcante et al., 2002). Para
maracujazeiro-doce são necessários 104 dias e aplicação de 25 % de esterco para formação de
mudas com altura de 19 cm e presença de gavinhas, condições ideais para transplantio ao
campo (Borges et al., 1995). A utilização de 10 % de composto orgânico associado à
inoculação com G. albida, multiplicado em meio com composto orgânico, permitiu a formação
de mudas com essas características em apenas 42 dias após a inoculação. A adoção desse
sistema (FMA + adubo orgânico) reduziu tanto o tempo de formação da muda (ca. 60
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
223
%) quanto a dose adubo (ca. 60 %) necessária para promover o crescimento, em comparação
com a dose recomendada de esterco (25 %) (Borges et al., 1995), constituindo alternativa de
baixo custo na produção de mudas dessa frutífera.
Conclusões
1. O uso de adubo, obtido da compostagem de frutas e verduras, associado à
micorrização estimula o crescimento de mudas de maracujazeiro-doce.
2. Mudas associadas a G. albida cujo inóculo foi multiplicado em substrato com resíduo
orgânico têm o crescimento maximizado, com redução de 60 % no tempo necessário para o
transplantio ao campo.
3. A eficiência do fungo é favorecida pela multiplicação de inóculo em substrato com
adubo orgânico, sendo as respostas dependentes do isolado de FMA.
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Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
227
Capítulo 7
Substratos orgânicos na produção de mudas micorrizadas de maracujazeiro-doce e
na atividade microbiana do solo
Artigo a ser submetido para publicação no periódico
Pesquisa Agropecuária Brasileira
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
228
Substratos orgânicos na produção de mudas micorrizadas de maracujazeiro-doce e na
atividade microbiana do solo
Fábio Sérgio Barbosa da Silva
1
; Adriana Mayumi Yano-Melo
1
; Danielle K. Alves da Silva
1
;
Sônia Valéria Pereira
2
& Leonor Costa Maia
1
*
1
Laboratório de Micorrizas, Departamento de Micologia, Centro de Ciências Biológicas,
Universidade Federal de Pernambuco, 50670-420, PE, Brasil.
2
Instituto de Tecnologia de Pernambuco, Av. Prof. Luiz Freire, 700, Cidade Universitária,
CEP 50740-540, Recife, PE, Brasil.
* autor para correspondência: [email protected]
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
229
RESUMO
(Substratos orgânicos na produção de mudas micorrizadas de maracujazeiro-doce e na
atividade microbiana do solo). Foi conduzido experimento visando selecionar substratos
orgânicos que favoreçam a atuação do fungo micorrízico arbuscular (FMA) na produção de
mudas de maracujazeiro-doce e a atividade microbiana do solo. Plântulas de Passiflora alata
foram inoculadas ou não com Gigaspora albida e cultivadas em 4 substratos: (a) solo, (b) solo
e esterco bovino maturado, (c) solo e palha de coco e (d) solo e terra vegetal, os três últimos
na proporção 9:1 (v/v). O delineamento experimental foi em fatorial: 2 tratamentos de
inoculação × 4 tipos de substratos, 4 repetições. Após 46 dias foram avaliados: crescimento
das mudas, colonização micorrízica total, hifálica e arbuscular, evolução de CO
2
e atividade
de hidrólise do diacetato de fluoresceína. As mudas cultivadas em solo com esterco bovino
cresceram duas vezes mais do que as mantidas nos demais substratos, com a micorrização
favorecendo a formação de plantas mais desenvolvidas, resultando em incrementos de 157 %
e 175 % para a área foliar e massa seca da parte aérea, respectivamente, em relação ao
controle. Apenas a adição de palha de coco maximizou a colonização micorrízica total,
enquanto a formação de arbúsculos foi estimulada por todas as fontes empregadas. A
colonização por hifas não foi influenciada pelos substratos. Maior emissão de CO
2
ocorreu em
solo com esterco bovino ou palha de coco, com o FMA contribuindo no processo. A
micorrização favoreceu a atividade enzimática do solo apenas na presença de adubo. Entre os
substratos o que inclui esterco bovino pode ser indicado para formação de mudas
micorrizadas de maracujazeiro-doce, pois aumenta o crescimento das plantas e a atividade
microbiana do solo.
Termos para indexação
Evolução de CO
2
; FDA; micorriza arbuscular; Passiflora alata
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
230
Introdução
O maracujazeiro-doce (Passiflora alata Curtis) é a segunda espécie de Passifloraceae
mais cultivada no Brasil, produzindo frutos que são consumidos principalmente in natura,
devido às qualidades gustativas da polpa que é doce e acidulada (Manica & Oliveira Jr.,
2005). As folhas são utilizadas na indústria farmacêutica para extração de princípios ativos
como a passiflorina (Paris et al., 2002). O cultivo desta frutífera tem se intensificado nos
últimos anos, pois os frutos apresentam elevado valor agregado (Braga & Junqueira, 2000) e
potencial para exportação (Cançado Júnior et al., 2000). Contudo, um dos problemas atuais da
cultura é a renovação de pomares com mudas certificadas e de qualidade (Melleti, 2001).
Uma das maneiras de reduzir os custos da adubação na fase de muda é a aplicação de
fungos micorrízicos arbusculares (FMA) (Ilbas & Sahin, 2005). Quando em simbiose, as
plantas associadas apresentam maior aporte nutricional, o que contribui para aumento da
tolerância a estresses bióticos e abióticos. Esses benefícios têm sido evidenciados em espécies
de Passiflora L. (Rodriguez et al., 1995; Cavalcante et al., 2002); em P. alata (maracujazeiro-
doce) a micorrização favoreceu o crescimento e reduziu o tempo de formação das mudas para
transplantio ao campo (Silva et al., 2004; Anjos et al., 2005).
A composição do substrato é importante para formação de mudas sadias. Nesse
sentido, são recomendados para o maracujazeiro-doce, formulações à base de solo e
fertilizantes químicos, podendo-se fazer uso de adubos orgânicos (Ruggiero et al., 1996;
Leonel & Pedroso, 2005). Porém, para garantir os benefícios da micorrização, a escolha do
substrato é fundamental (Silveira et al., 2003).
A redução na quantidade de adubos aplicados pode minimizar os custos de produção
do viveirista. Nesse aspecto, Silva et al. (dados não publicados) obtiveram mudas de
maracujazeiro-doce associadas a Gigaspora albida Schenck & Smith, em solo com apenas
10 % de composto orgânico, supostamente com economia de 60 % na dose de adubo aplicado
e dispensando o uso de fertilizantes químicos no substrato de cultivo. Para obtenção de
resultados similares, a seleção prévia de substratos é necessária, considerando que os
benefícios da adubação podem variar de acordo com a fonte orgânica utilizada (Trindade et
al., 2003).
A necessidade de sistemas agrícolas sustentáveis gera preocupação com a qualidade
do solo desde a fase de produção de mudas. Uma das maneiras de aumentar a qualidade
edáfica é o emprego de fontes orgânicas em doses adequadas, visto que tais materiais, quando
devidamente utilizados, melhoram as condições físicas, químicas e biológicas do solo
(Abdelhamid et al., 2004). Maior atividade microbiana, estimada pela evolução de CO
2
e
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
231
atividade de enzimas do solo, é freqüentemente observada em solo com fertilizantes orgânicos
do que naqueles sem ou com adubo químico (García-Gil et al., 2004). Por outro lado, os FMA
favorecem o crescimento de vegetais em substratos com adubo orgânico, mas pouco se
conhece sobre o papel que desempenham na atividade microbiana do solo (Wamberg et al.,
2003), que pode ser alterada pela presença desses fungos (Duponois et al., 2005).
O objetivo deste trabalho foi selecionar substratos que favoreçam a atuação do fungo
micorrízico sobre a produção de mudas de maracujazeiro-doce e a atividade microbiana do
solo.
Material e métodos
Sementes de maracujazeiro-doce foram desinfestadas com NaOCl-20% (2% cloro
ativo) por 2 minutos, lavadas em água destilada e colocadas para germinar em solo
previamente desinfestado. Plântulas de maracujá com duas folhas definitivas foram
transferidas para potes com capacidade para 180 g de substrato (Tabela 1) e inoculadas na
região das raízes com solo-inóculo fornecendo 200 esporos/pote de Gigaspora albida (UFPE
01), multiplicado em solo + composto orgânico (9:1 v/v), utilizando-se painço como
hospedeiro; o inóculo foi seco e mantido a 4 ºC por seis meses, antes de ser utilizado (Kim et
al., 2002)
Tabela 1. Caracterização química dos substratos utilizados para produção de mudas de
maracujazeiro-doce
Substratos
Solo Solo:TV (9:1 v/v) Solo:EB (9:1 v/v) Solo:PC (9:1 v/v)
MO (g kg
-1
)
38,17 40,96 40,03 39,10
pH (H
2
O-1:2,5)
5,40 5,40 5,50 5,50
P* (mg dm
-3
)
5,00 12,00 33,00 5,00
Ca** (cmol
c
dm
-3
)
3,20 3,20 3,30 2,90
Mg** (cmol
c
dm
-3
)
0,90 0,90 1,50 0,60
CTC (cmol
c
dm
-3
)
8,40 8,36 8,97 7,06
V (%)
51,00 53,00 63,00 53,00
MO= matéria orgânica; CTC= capacidade de troca catiônica; V= saturação de bases; TV= terra
vegetal; EB= esterco bovino; PC= palha de coco; *Mehlich I; ** KCl 1M.
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
232
Após 15 dias, foi feito o transplantio para sacos pretos de polietileno contendo 1 Kg do
respectivo substrato. Nos tratamentos controle foram adicionados 2 mL de filtrado (45 Pm),
oriundo do peneiramento do inóculo de G. albida, visando restaurar a microbiota do solo,
com exceção dos FMA. O experimento foi mantido em telado, sob condições ambientais de
luminosidade, temperatura (T
max
: 36,15 ºC; T
mín
: 27,84 ºC) e umidade (UR
máx
: 80,40 %;
UR
mín
: 38,90 %).
O delineamento experimental foi do tipo inteiramente casualizado em arranjo fatorial
de 4 × 2, sendo 4 tipos de substrato (Tabela 1): (a) solo (controle); (b) solo e esterco bovino
maturado; (c) solo e terra vegetal; (d) solo e palha de coco (material fibroso, oriundo da
trituração do mesocarpo do coco e usado como condicionador de solo), os três últimos na
proporção 9:1 (v/v) × 2 tratamentos de inoculação (inoculado ou não com G. albida) em 4
repetições, totalizando 32 parcelas experimentais. Após mistura, os substratos foram deixados
em repouso por 15 dias antes de serem utilizados.
O experimento foi colhido 46 dias após a inoculação, ocasião em que houve emissão
de gavinhas, caracterizando a muda como apta para transplantio, sendo avaliados: altura, nº de
folhas, área foliar, diâmetro do caule a 3 cm do solo, massa seca da parte aérea, colonização
micorrízica total, hifálica e arbuscular (McGonigle et al., 1990), respiração microbiana (Grisi,
1978) e atividade de hidrólise do diacetato de fluoresceína (enzimática geral do solo) (Swisher
& Carrol, 1980). A colonização micorrízica foi estimada após diafanização das raízes em
KOH (10 % p/v) e coloração com Chlorazol black-E (Brundrett et al., 1984). A massa seca foi
obtida após secagem em estufa de circulação de ar (60 ºC) até peso constante.
Para análise, os dados de colonização arbuscular e hifálica foram transformados em
arco seno (x/100) e colonização total em x. Os dados foram submetidos à análise de
variância e as médias comparadas pelo teste de Tukey (P d 0,05), utilizando o programa
Sanest.
Resultados
Houve efeito significativo (P<0,05), mas sem interação, do tipo de substrato e da
inoculação para massa seca da parte aérea, área foliar, diâmetro do caule, evolução de CO
2
.
Para os demais parâmetros avaliados (altura, produção foliar, colonização micorrízica total,
hifálica e arbuscular e atividade de hidrólise do diacetato de fluoresceína) foi registrada
interação significativa entre os dois fatores (tipos de substrato e inoculação) (Tabela 2). As
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
233
mudas cultivadas em solo adubado com esterco bovino apresentaram maior área foliar,
diâmetro do caule e massa seca da parte aérea do que as dos demais tratamentos (Tabela 3).
A micorrização favoreceu a formação de mudas mais desenvolvidas (Tabelas 4 e 5).
Formação de gavinhas foi constatada apenas nas plantas associadas a G. albida e cultivadas
em solo adubado com esterco bovino.
Tabela 2. Níveis de significância para adubação, fungos e interação entre as variáveis
avaliadas
Parâmetro Substratos (1) Inoculação (2) 1 × 2
Massa seca da parte aérea ** ** ns
Área foliar ** ** ns
Diâmetro do caule ** ** ns
Nº de folhas ** ** **
Altura ** ** *
Colonização micorrízica total ** ** **
Colonização micorrízica hifálica ** ** *
Colonização micorrízica arbuscular ** ** **
Atividade enzimática geral ** ** **
Respiração microbiana ** * ns
** (P < 0,01); * (P < 0,05); ns (não significativo).
Tabela 3. Influência da composição do substrato na área foliar (AF), massa seca da parte aérea
(MSPA), diâmetro do caule (DC) e respiração microbiana (RM), em mudas de maracujazeiro-
doce independentemente da micorrização com Gigaspora albida, 46 dias após inoculação, em
casa-de-vegetação
Tratamentos Parâmetros
AF (cm
2
) MSPA (g) DC (mm) RM*
Solo 146,98 B 0,44 B 0,18 B 3,30 B
Solo:TV (9:1 v/v) 151,14 B 0,45 B 0,20 B 4,12 B
Solo:EB (9:1 v/v) 378,04 A 1,21 A 0,25 A 8,00 A
Solo:PC (9:1 v/v) 194,62 B 0,56 B 0,18 B 7,80 A
CV % 29,20 38,07 12,61 14,58
TV= terra vegetal; EB= esterco bovino; PC= palha de coco. *μg C-CO
2
g solo seco dia
-1
Médias seguidas da mesma letra, na coluna, não diferem entre si pelo teste de Tukey (P<0,05).
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
234
Tabela 4. Influência da micorrização com Gigaspora albida na área foliar (AF), massa seca
da parte aérea (MSPA), diâmetro do caule (DC) e respiração microbiana (RM), em mudas de
maracujazeiro-doce 46 dias após inoculação, em casa-de-vegetação
Tratamentos Parâmetros
AF (cm
2
) MSPA (g) DC (mm) RM*
Controle 115,50 B 0,31 B 0,16 B 5,31 B
319,92 A 1,02 A 0,24 A 6,30 A
CV % 29,20 38,07 12,61 14,58
Médias seguidas da mesma letra na coluna não diferem entre si pelo teste de Tukey (P<0,05).
*μg C-CO
2
g solo seco dia
-1
Com exceção do tratamento com palha de coco, a incorporação das demais fontes
orgânicas não resultou em diferenças significativas na colonização micorrízica total nas raízes
do maracujazeiro, quando comparado ao substrato solo (Figura 1). A adubação favoreceu a
formação de arbúsculos no córtex radicular, com a produção de tais estruturas variando em
função do substrato empregado (Figura 1). A colonização por hifas (Figura 1) não foi afetada
pela incorporação de fontes orgânicas ao substrato de cultivo das mudas.
0
20
40
60
80
100
Solo S+TV S+EB S+PC
Substratos
Colonização micorrízica (%)
Total Arbusculos Hifas
A
AB
AB
A
B
B
B
C
A
A
A
A
Figura 1. Colonização micorrízica total, arbuscular e hifálica de Gigaspora albida nas raízes
de Passiflora alata cultivada em solo, solo e terra vegetal (S+TV), solo e esterco bovino
(S+EB) e solo e palha de coco (S+PC), 46 dias após inoculação.
Barras seguidas da mesma letra,
entre os tipos de substrato, não diferem entre si pelo teste de Tukey (P < 0,05).
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
235
A evolução de CO
2
foi estimulada (>150 %) pela adição de esterco e palha de coco
(Tabela 3), com o FMA contribuindo no processo (Tabela 4).
A micorrização em geral interferiu na atividade enzimática geral do solo, estimada
pela hidrólise do FDA, que foi estimulada pela incorporação de matéria orgânica, com
maiores valores obtidos em solo com palha de coco, seguido pelos substratos à base de
esterco bovino e com terra vegetal, que não diferiram entre si (Tabela 5). Apenas quando o
substrato foi constituído por adubo orgânico houve aumento da atividade de hidrólise do FDA
em função da presença do FMA (Tabela 5).
Tabela 5. Influência da composição do substrato de cultivo e da micorrização com Gigaspora
albida na atividade enzimática geral do solo, altura e produção foliar de mudas de
maracujazeiro-doce, 46 dias após inoculação, em casa-de-vegetação
Tratamentos
de inoculação
Substratos
Solo
Solo:TV
(9:1 v/v)
Solo:EB
(9:1 v/v)
Solo:PC
(9:1 v/v)
Altura (cm)
Controle 4,25 bB 5,40 bB 7,95 aB 6,02 abB
G.albida
8,60 bA 7,80 bA 13,75 aA 8,77 bA
CV % 15,01
Produção foliar
Controle 3,75 cB 4,25 cB 8,50 aA 6,00 bB
G.albida
8,25 aA 9,00aA 9,50 aA 8,50 aA
CV % 13,76
Atividade enzimática geral (Pg FDA hidrolisado g
-1
solo seco h
-1
)
Controle 5,95 cA 13,24 bB 15,03 bB 22,34 aB
G.albida
4,18 cA 19,56 bA 23,84 bA 29,02 aA
CV % 13,76
TV= terra vegetal; EB= esterco bovino; PC= palha de coco.
Médias seguidas da mesma letra, maiúscula na coluna e minúscula na linha, não diferem entre si pelo
teste de Tukey (P<0,05).
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
236
Discussão
O emprego de FMA selecionados pode favorecer o desenvolvimento de mudas de
maracujazeiro-doce (Silva et al., 2004), como também observado no presente ensaio. Mudas
dessa fruteira apresentam características para transplantio ao campo em 104 dias, quando
cultivadas em sacos de polietileno com 1 L de substrato (Borges et al., 1995), porém, o
presente trabalho mostrou que o uso combinado de FMA e substrato à base de esterco bovino
pode formar mudas prontas aos 46 dias. Esse sistema mostrou-se mais eficiente do que o
utilizado por Anjos et al. (2005), combinando FMA e fertilizante fosfatado quando foram
necessários 65 dias para formação de mudas de maracujazeiro-doce, cultivadas em sacos de
polietileno com 1,7 kg de solo.
Resíduos orgânicos são comumente empregados na formação de mudas de
maracujazeiro-doce (Leonel & Pedroso, 2005; Manica, 2005), sendo importante a escolha do
substrato para se atingir resposta máxima à micorrização (Vosátka et al., 1992). Isso foi
confirmado no presente estudo, com o esterco bovino apresentando-se como o adubo mais
promissor para desenvolvimento das mudas. Zenke et al. (2003) mencionaram que o
desenvolvimento de videiras micropropagadas e micorrizadas foi dependente do tipo de fonte
orgânica empregada na composição do substrato de aclimatização das mudas. Silva et al.
(2001) também observaram que o benefício da micorrização para o maracujazeiro-amarelo era
relacionado à composição do substrato.
A adição de 10 % de esterco ao solo constitui alternativa promissora na formação de
mudas de maracujazeiro-doce micorrizadas, reduzindo em 60 % a dose de adubo orgânico
recomendada nesta fase (Lima et al., 1995). Além disso, poderia dispensar a aplicação de
superfosfato simples e de cloreto de potássio, comumente recomendados na composição do
substrato (Manica, 2005).
Sinergismo positivo do uso combinado de FMA e adubos orgânicos no crescimento
vegetal tem sido registrado (Caravaca et al., 2002). Há relatos de efeito sinérgico do uso de
10 % de esterco bovino e inoculação de Glomus Tulasne & Tulasne para formação de mudas
de maracujazeiro-amarelo (Silveira et al. 2003). Mesmo não havendo interação significativa
dos fatores estudados (adubação e FMA) (Tabela 2), as mudas cultivadas em substrato à base
de esterco bovino só apresentaram maior desenvolvimento e características ideais para
transplantio ao campo, quando associadas a G. albida. É possível que as hifas externas do
FMA tenham propiciado maior aproveitamento do fósforo, presente em elevada concentração
nesse resíduo (Tabela 1), tal como sugerido por Caravaca et al. (2003) em situação
semelhante.
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
237
Em geral, elevados teores de P em substratos orgânicos minimizam os benefícios da
simbiose micorrízica arbuscular (Estaún et al., 1999), mas isso não ocorreu em relação ao
substrato com esterco bovino, que foi o mais favorável à formação das mudas, embora
apresentasse 33 mg P dm
-3
, teor comparativamente maior em relação ao demais substratos
testados (Tabela 1). Esse resíduo orgânico também não inibiu a atuação de FMA sobre o
crescimento de outras culturas como o mamoeiro (Trindade et al., 2000) e a bananeira (Lins et
al., 2003), em substratos com 10 e 5 % de esterco, respectivamente.
Teores de 2 e 0,8 cmol
c
dm
-3
de Ca e Mg, respectivamente, associado a 56% de
saturação por bases (V), foram considerados como ideais para o cultivo do maracujazeiro-
doce (Prado et al., 2004); com valores mais elevados (Tabela 1), o substrato com esterco
bovino favoreceu a formação de mudas sadias.
O estabelecimento da fase intraradicular e a formação de arbúsculos dos FMA pode
ser favorecida pela utilização de fontes orgânicas (Muthukumar & Udaiyan, 2000; Cavender
et al., 2002), mas, a heterogeneidade dos materiais empregados pode interferir no
estabelecimento do fungo na raiz (Borie et al., 2002) (Figura 1). Entre os resíduos testados,
apenas a palha de coco estimulou a colonização micorrízica total. A maior produção de
arbúsculos, registrada no tratamento com este substrato, não foi relacionada ao aumento no
crescimento do maracujazeiro-doce, embora tais estruturas sejam relacionadas à
funcionalidade e à eficiência da simbiose (Smith & Read, 1997). Baby & Manibhushanrao
(1996) também verificaram que o uso de resíduo de coco no substrato para cultivo de arroz
favoreceu a colonização arbuscular por fungos nativos. A incorporação de celulose ao
substrato também estimulou a produção de arbúsculos em raízes de Plantago lanceolata L.
(Gryndler et al., 2002). A produção de hifas intraradiculares nas raízes estudadas não foi
afetada pela adubação, que em alguns casos parece não ter efeito sobre a micorrização
(Caravaca et al., 2002)
Aumento na evolução de CO
2
, nos substratos testados, ocorreu nos tratamentos com
esterco bovino e palha de coco. É possível que a matéria orgânica tenha sido melhor utilizada
como fonte de energia para os processos oxidativos, que resultam em elevadas taxas de CO
2
emitido (Marinari et al., 2000; Vasconcelos et al., 1998). A respiração microbiana, empregada
em estudos sobre a qualidade do solo (Hernández & Garcia, 2003) aumenta com a fertilização
orgânica (Abdelhamid et al., 2004), dependendo da fonte aplicada (Ghini et al., 2002). Por
outro lado, os exsudados radiculares, produzidos em função do melhor desenvolvimento
vegetal em solo com adubo orgânico, podem contribuir para aumentar as taxas de respiração
microbiana (Pascual et al., 1999). Também há registro do aumento da taxa de respiração com
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
238
a introdução de FMA. Wamberg et al. (2003) mencionaram que a inoculação com Glomus
intraradices Schenck & Smith favoreceu a atividade microbiana na rizosfera de Pisum
sativum L., quando as plantas estavam no estádio de floração. No caso do maracujazeiro-doce,
a inoculação com G. albida aumentou a atividade respiratória na fase vegetativa, em todos os
substratos usados para cultivo das mudas. Essa contribuição dos FMA provavelmente se deve
à respiração das hifas presentes no solo e ao aumento do metabolismo com a utilização, pelo
fungo, de N e P orgânicos do substrato (Hodge et al. 2001; Feng et al., 2003), resultando em
maior emissão de CO
2
. Em sistemas ectomicorrízicos, Garcia et al. (2000) também
verificaram a contribuição do fungo no aumento da respiração basal em solo cultivado com
Pinus halepensis Miller.
Os resíduos orgânicos contribuem para aumentar o metabolismo microbiano e a
produção de enzimas (García-Gil et al., 2004), favorecendo também a atividade hidrolítica do
solo (Ghini et al., 2002), como observado no presente trabalho, porém os benefícios variaram
com a fonte orgânica empregada, tal como evidenciado por Pankhurst et al. (2005). A maior
atividade enzimática registrada nos tratamentos com adubo, pode ser decorrente da presença
de microrganismos e do acúmulo de enzimas extracelulares complexadas aos colóides da
matéria orgânica utilizada como adubo (Pascual et al., 1998).
A contribuição do fungo micorrízico no aumento da atividade enzimática, foi
dependente da fertilização do solo, que provavelmente atuou no estímulo da produção de
micélio (Frey e Ellis, 1997) e/ou na secreção de enzimas pelas hifas. Caravaca et al. (2004)
relataram que a inoculação com Glomus deserticola Trappe, Bloss & Menge aumentou a
atividade da E-glicosidade, desidrogenase e urease, em solo adubado com resíduo de
beterraba utilizado para o cultivo de Dorycnium pentaphyllum L.
Conclusão
O substrato composto por solo e esterco bovino (9:1 v/v) pode ser indicado para
formação de mudas micorrizadas de maracujazeiro-doce, favorecendo o seu crescimento e
aumentando a atividade respiratória e enzimática do solo.
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Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
244
Capítulo 8
Produtividade e qualidade de frutos de maracujazeiro-doce em cultivo associado
com fungos micorrízicos arbusculares, no Vale do Submédio São Francisco-PE
Artigo enviado para publicação no periódico Pesquisa Agropecuária Brasileira
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
245
Produtividade e qualidade de frutos de maracujazeiro-doce em cultivo associado com
fungos micorrízicos arbusculares, no Vale do Submédio São Francisco-PE
Fábio Sérgio Barbosa da Silva
1
; Adriana Mayumi Yano-Melo
1
; Natoniel Franklin de Melo
2
;
Geraldo Milanez de Resende
2
; Maryluce Albuquerque da Silva
1
& Leonor Costa Maia
1
*
1
Laboratório de Micorrizas, Depto. Micologia, UFPE, Cidade Universitária, CEP. 50670-420,
Recife, PE, Brasil. ([email protected]
), ([email protected]),
), ([email protected]).
2
Embrapa Semi-Árido, C.P. 23, CEP. 56302-970, Petrolina, PE, Brasil.
), ([email protected]).
*autor para correspondência
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
246
Resumo - (Produtividade e qualidade de frutos de maracujazeiro-doce em cultivo associado
com fungos micorrízicos arbusculares, no Vale do Submédio São Francisco-PE). Foi
conduzido experimento em campo visando determinar se a condição de multiplicação do
inóculo micorrízico (Gigaspora albida) afeta a produtividade e a qualidade de frutos do
maracujazeiro-doce, em cultivo químico e orgânico. Mudas recebendo inóculo multiplicado
em solo ou em solo + 10% de composto orgânico foram transplantadas para covas adubadas
com vermicomposto ou com fertilizantes químicos. O delineamento experimental foi em
blocos casualizados em fatorial 2 (tratamentos de inoculação) × 2 (tipos de adubação) e cinco
repetições. Dez meses após a instalação do cultivo avaliou-se produtividade e características
dos frutos. Em solo com fertilizantes químicos, maior número de frutos (64.777 frutos ha
-1
)
com reduzida acidez (0,75 % de ácido cítrico g
-1
polpa), elevada ºBrix/acidez (24,32) e maior
produtividade (11,08 t ha
-1
) foram registrados em plantas com inóculo produzido em solo +
composto orgânico. Nos tratamentos com vermicomposto, maior produtividade (3.83 t ha
-1
) e
ºBrix (21,58) dos frutos ocorreram em plantas recebendo inóculo multiplicado em solo. O
cultivo do maracujazeiro-doce associado a G. albida (multiplicado em solo + composto
orgânico) em solo com fertilizantes químicos é alternativa para aumento do número de frutos
com reduzida acidez e elevada ºBrix/acidez, no semi-árido brasileiro.
Termos para indexação
Passiflora alata; Gigaspora albida; Glomeromycota; adubação orgânica, semi-árido.
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
247
Abstract- A field experiment was performed to determine if multiplication condition of the
mycorrhizal inoculum (Gigaspora albida) affects yield and quality of sweet passion fruits
receiving organic and mineral fertilizers. Seedlings with inoculum multiplied in soil or in soil
+ 10% organic compost were transplanted to plots receiving vermicompost or mineral
fertilizer. The experimental design was in blocks at random, in factorial 2 (inoculation
treatments) × 2 (fertilizer treatments), and five replicates. Ten months after crop installation,
yield and fruit characteristics were evaluated. In soil with mineral fertilizers, higher number of
fruits (64,777 ha
-1
) with low acidity (0,75 % citric acid g
-1
pulp), high ºBrix/acidity (24,32)
and higher productivity (11.08 t ha
-1
) were obtained in plants with inoculum produced in soil
+ organic compost. In treatments with vermicompost, higher productivity (3,83 t ha
-1
) e ºBrix
(21,58) were obtained in plants receiving inoculum multiplied in soil. Cultivation of sweet
passion fruit associated to G. albida (multiplied in soil + organic compost) in mineral
fertilized soil, constitute an alternative to increase production of high quality fruits (reduced
acidity and high ºBrix/acidity) in the brazilian semiarid.
Index terms
Passiflora alata; Gigaspora albida; Glomeromycota; organic amendment; semiarid.
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
248
Introdução
Microrganismos do solo podem atuar como promotores do crescimento de vegetais de
interesse agronômico; entre esses, os fungos micorrízicos arbusculares (FMA) podem
melhorar o aporte nutricional do hospedeiro, que resulta na maior tolerância a estresses de
natureza biótica ou abiótica. Na simbiose micorrízica não há especificidade hospedeira, mas
diferenças na eficiência dos FMA podem ser intra ou interespecíficas (Munkvold et al., 2004).
Assim, a seleção prévia de inoculantes para aplicação na agricultura é recomendada (Abbott
et al., 1994).
Segundo Graham et al. (1982), FMA fisiologicamente superiores em promover o
crescimento vegetal são obtidos quando o fungo é multiplicado na condição edáfica em que
será utilizado, sendo o desempenho diferenciado decorrente da adaptação fisiológica e
genética do fungo (Caravaca et al., 2005). Nesse aspecto, melhores respostas de FMA
previamente adaptados a certas condições edáficas têm sido registradas (Gonzaléz-Chavez et
al., 2002).
O componente micorrízico deve ser considerado na geração de tecnologia em
agrossistemas sustentáveis, o que inclui o uso de adubos orgânicos de qualidade e em
quantidades adequadas (Salami & Osonubi, 2002). Nesse contexto, o emprego de fungos
condicionados à adubação orgânica pode constituir alternativa para incrementar o crescimento
e a produtividade de vegetais sob cultivo orgânico, devendo ser selecionados FMA que
promovam benefícios ao hospedeiro mesmo em condições de elevada fertilidade (Gianinazzi
et al., 1988). Considerando que a atuação de FMA em campo tem sido comprometida pela
aplicação de elevadas doses de fertilizantes, a utilização de fungos adaptados a tais condições
é necessária para o sucesso em programas de inoculação com FMA (Wood, 1991). O emprego
de resíduos orgânicos é uma das práticas agrícolas que seleciona e mantém FMA mais
eficientes em promover benefícios ao vegetal (Muthukumar & Udaiyan, 2002). Scullion et al.
(1998), por exemplo, verificaram que a comunidade de FMA proveniente de áreas manejadas
organicamente foi mais efetiva em promover o crescimento de Allium amelloprasium L. e
Trifolium repens L. em relação a fungos proveniente de áreas com manejo convencional.
O maracujazeiro-doce (Passiflora alata Curtis) destaca-se pela aceitação no mercado
europeu, norte-americano e canadense (Cançado Júnior et al., 2000) e pelo elevado valor
agregado dos frutos (Braga & Junqueira, 2000). Esta espécie é a segunda Passifloraceae
economicamente importante no Brasil, sendo beneficiada pelo uso de FMA na fase de muda
(Anjos et al., 2005). Ensaios anteriores indicaram que a aplicação de Gigaspora albida
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
249
Schenck & Smith, multiplicado em substrato com composto orgânico, favoreceu o
crescimento de mudas de P. alata cultivadas em solo + 10% de composto orgânico, mais do
que o isolado multiplicado em solo. Todavia, para indicação desse isolado na formação de
pomares de maracujazeiro-doce, estudos em campo são necessários para comprovar se este
comportamento se mantém até a fase de produção de frutos.
O Vale do Submédio São Francisco é um dos maiores pólos de exportação de frutas
brasileiras, especialmente uva e manga. Atualmente os produtores da região buscam culturas
alternativas com valor agregado e potencial de exportação, como o maracujazeiro-doce (Silva
et al., 2004). Isso resulta na diversificação de culturas, constituindo fonte adicional de renda,
especialmente na entressafra das culturas chave da região. Em condições irrigadas, essa
passiflorácea pode ser produzida no semi-árido nordestino; o fotoperíodo acima de 11 horas
diárias permite a produção durante todo o ano (Lima & Borges, 2002). Além disso, a
condição climática da região (elevada temperatura e baixa precipitação pluviométrica) reduz o
tempo decorrido entre a polinização à colheita dos frutos (Vasconcellos, 1991) e favorece a
formação de frutos com maior relação SST/ATT (sólidos solúveis totais/acidez total titulável)
e a reduzida ATT (Veras et al., 2000). Devido à escassez de estudos com maracujazeiro-doce
(Vasconcelos et al., 2001a), é necessária a geração de informações técnicas, como
recomendações de adubação, que possibilitem a instalação de cultivo desta passiflorácea no
semi-árido pernambucano.
Desta forma, testou-se a hipótese de que FMA multiplicados em substrato com adubo
orgânico (alta fertilidade) teriam melhor atuação na produtividade do hospedeiro, quando este
é cultivado em solo com fertilizantes orgânicos. Foi avaliada, portanto, a influência da
condição de multiplicação do inóculo micorrízico na produtividade e qualidade de frutos do
maracujazeiro-doce, sob cultivo orgânico e químico.
Material & métodos
Área experimental
O experimento foi conduzido no Campo Experimental de Bebedouro (Embrapa Semi-
árido, Petrolina-PE), no período de 15-12-2003 a 15-10-2004, sendo avaliado o primeiro pico
da produção anual do maracujazeiro-doce. O clima da região é classificado, segundo
Köeppen, como tipo Bswh [Clima Semi-Árido, com temperaturas altas (> 22ºC) e chuvas
escassas no inverno (< 250 mm)]. Durante o experimento, o índice pluviométrico foi 801,1
mm e a temperatura média 18,1 ºC (mínima) e 32,1 ºC (máxima). O solo da área experimental
é do tipo Argissolo-Amarelo-Eutrófico (Embrapa, 1999).
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
250
FMA
Foi escolhido o FMA Gigaspora albida (UFPE 01), pelo fato deste fungo ter sido o
mais eficiente, na produção de mudas de maracujazeiro-doce (Silva et al., dados não
publicados). Foi utilizado inóculo de G. albida proveniente de um ciclo de multiplicação (60
dias) em dois substratos: a) solo (S) e b) solo + 10% composto orgânico (Org) (Tabela 1).
Como hospedeiro para multiplicação do fungo foi utilizado o painço (Panicum miliaceum L.)
e o solo-inóculo (esporos e raízes colonizadas) foi seco e estocado a 4 ºC, por três meses,
antes de ser utilizado (Kim et al., 2002).
Tabela 1. Caracterização química dos substratos utilizados para: a) multiplicação de
Gigaspora albida; b) preparo das mudas de Passiflora alata; c) do vermicomposto utilizado
na adubação orgânica para cultivo do maracujazeiro-doce
pH P* C N CTC C/N
Substratos
(H
2
O-1:2,5) (mg dm
-3
) (g Kg
-1
) (cmol
c
dm
-3
)
FMA
Solo
4,6 4 13,3 1,2 1,69 11,08
Solo+10% CO 5,6 53 26,1 2,0 9,89 13,05
Preparo das mudas
Solo+10% VC 7,1 74 15,56 1,41 6,08 11,03
Adubação orgânica
Vermicomposto 7,0 1450 124,41 11,31 12,00 11,00
CO=composto orgânico;VC=vermicomposto; CTC=capacidade de troca catiônica;*Mehlich I.
Pré-inoculação das mudas de Passiflora alata
Sementes de maracujazeiro-doce (P. alata), obtidas de frutos maduros adquiridos
comercialmente, foram desinfestadas com NaOCl-20% (2% cloro ativo) por 2 minutos,
lavadas em água destilada e colocadas para germinar em bandejas de células contendo areia e
vermiculita previamente esterilizadas (121 ºC/1 atm/30 min.). Plântulas com duas folhas
definitivas foram inoculadas, separadamente, com solo-inóculo contendo 200 esporos de G.
albida, multiplicado em solo (S) ou em solo + 10% composto orgânico (Org); após
inoculação, as plântulas foram transferidas para sacos contendo 1 kg de solo (Argissolo-
Amarelo-Eutrófico) + 10% de vermicomposto (Tabela 1). Aos 46 dias da inoculação, mudas
com oito folhas definitivas foram transplantadas ao campo. Nesse momento, raízes de 10
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
251
mudas, selecionadas ao acaso, de cada tratamento de inoculação (S e Org), foram clarificadas
e coradas com Clorazol Black-E (Brundrett et al., 1984) para estimativa da percentagem de
colonização micorrízica. Nos dois tratamentos, registrou-se 70% de colonização nas raízes.
Adubação
Foram testados dois tipos de adubação: a) Química: antes do transplantio foram
aplicados por cova 50 g de superfosfato simples; após 90 dias fez-se a adubação com 45g de
uréia + 21g de cloreto de potássio, sendo este procedimento repetido no início (180 dias após
transplantio) e 60 dias após a floração; b) Orgânica: foram aplicados 20 litros de
vermicomposto/cova (Tabela 1) fracionados em quatro aplicações: na fundação, 90, 180 e 240
dias após o transplantio.
Preparo da área experimental
Foram retiradas 20 amostras de solo, na profundidade de 0-20 e 20-40 cm, que
constituíram duas amostras compostas, uma para cada profundidade; ambas foram enviadas
para caracterização química e física (Embrapa, 1979) e recomendação para adubação da
cultura. Antes do transplantio das mudas, a área foi arada, gradada, sendo preparadas covas
(40×40×40 cm) que receberam os fertilizantes recomendados para adubação. Foram aplicados
700 kg ha
-1
de calcário dolomítico, para elevar o pH do solo, além dos teores de cálcio e
magnésio, conforme análise do solo. Após aplicação dos adubos e corretivos, a área foi
irrigada por 15 dias por gotejamento.
Condução do experimento
Foi utilizado espaçamento de 5 m entre plantas × 3 m na fileira (densidade de 660
plantas ha
-1
), sendo adotado sistema de condução em espaldeira com dois fios (nº 12), um a
1,6 m e outro a 2,0 m do solo. A irrigação foi feita por gotejamento semi-automático (dois
gotejadores espaçados 20 cm entre si), por 6 horas, em dias alternados (8,4 L H
2
O planta
-1
h
-
1
). Podas de formação foram feitas quando a planta atingiu o fio superior e repetidas
semanalmente após seis meses da instalação do cultivo. Nesse período, a floração foi iniciada
e diariamente as plantas eram polinizadas artificialmente e marcadas, para se determinar o
tempo decorrido entre a abertura da flor e a frutificação.
Delineamento experimental
O delineamento experimental foi de blocos ao acaso, em arranjo fatorial de 2×2,
compreendendo dois tratamentos de inoculação (plantas pré-inoculadas com G. albida
multiplicado em solo e em solo + 10% composto orgânico) × dois tipos de adubação (química
e orgânica) com cinco repetições. Cada parcela experimental foi constituída por quatro
plantas.
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
252
Parâmetros avaliados e análise dos dados
Dez meses após a instalação do plantio, foram avaliadas: produtividade (t ha
-1
),
número de frutos por hectare e características do fruto como comprimento longitudinal e
transversal do fruto (cm) e da cavidade ovariana, espessura da casca (mm), comprimento
longitudinal e transversal da cavidade ovariana (cm), peso do fruto (g), peso da polpa (g),
rendimento em polpa (%), número de sementes/fruto, sólidos solúveis totais-SST (ºBrix),
acidez total titulável-ATT (% ácido cítrico g
-1
polpa), pH do suco e relação SST/ATT. Para se
avaliar essas características, foram selecionados dez frutos por planta, em estádio ideal para a
colheita (base amarelada) (Vasconcellos, 2000). As características físicas do fruto foram
avaliadas com paquímetro digital; os SST foram determinados com auxílio de refratômetro de
bolso e expressos em ºBrix; o pH em potenciômetro, após diluição de 1mL de suco em 50 mL
de H
2
O destilada e a ATT foi determinada por titulometria, utilizando-se a fenolftaleína como
indicador de pH, e expressa em % ácido cítrico g
-1
polpa (Instituto Adolf Lutz, 1985). Os
dados de contagem foram transformados (x + 0,5) para satisfazer a homogeneidade de
variância e posteriormente submetidos à ANOVA e as médias comparadas pelo teste de
Tukey (5 %), utilizando-se o programa Sanest.
Resultados e Discussão
O maior número de frutos por hectare (64.777) e produtividade (11,08 t ha
-1
) do
maracujazeiro-doce ocorreu em solo adubado com fertilizantes químicos (Figura 1). O
emprego de fontes orgânicas favorece a dinâmica física, química e biológica do solo
(Caravaca et al., 2004); entretanto, no presente ensaio, a possível melhoria nas condições do
solo não se traduziu por incrementos em produção. Morangueiros cultivados em sistema de
produção convencional (com uso de fertilizantes químicos) tiveram maior produção foliar e
de frutos do que àqueles cultivados em sistema orgânico (Gleissman et al., 1990). Como
sugerido pelos autores, existe necessidade de fase (Lag) para mineralização dos nutrientes
presentes no resíduo. Isso possivelmente retarda o efeito da adubação orgânica. Mäder et al.
(2002) consideraram que o uso de sistemas orgânicos pode reduzir em até 20% a
produtividade em relação ao cultivo em sistemas convencionais.
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
253
0
20.000
40.000
60.000
80.000
Q uímica O rgânica
Adubação
Produção (nº frutos/ha)
S Org
0
5
10
15
Q uímica O rgânica
Adubação
Produtividade (ton/ha)
S Org
0
5
10
15
20
25
Q uímica O rgânica
Adubação
SST (º Brix)
S Org
0
0,4
0,8
1,2
1,6
Q uímica O rgânica
Adubação
ATT (% ácido cítrico/g de
polpa)
S Org
0
5
10
15
20
25
30
Q uímica O rgânica
Adubação
SST/ATT
S Or
aA
Figura 1. Número de frutos por hectare, produtividade, sólidos solúveis totais (SST), acidez
total titulável (ATT) e relação SST/ATT de frutos de maracujazeiro-doce, pré-inoculados com
Gigaspora albida provindo da multiplicação em solo com (Org) ou sem (S) composto
orgânico e cultivado em solo com adubo químico ou orgânico.
Médias seguidas da mesma letra,
minúscula entre os tratamentos de inoculação dentro de cada tipo de adubação e maiúsculas entre os
tratamentos de adubação dentro de cada tratamento de inoculação, não diferem pelo teste de Tukey (P
< 0,05).
g
bA
aA
bB
bA
aA
aA
bB
aB
aA
aA
bA
bA
aA
aA
bB
aA
bB
aA
aA
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
254
A ausência de cultivares comerciais, de densidades diferenciadas de plantas por
hectare e de práticas distintas de adubação resultam em plantios de maracujazeiros com
produtividades não uniformes (Martins et al., 2003), que mesmo assim podem alcançar de 15-
20 t ha
-1
(Vasconcellos et al., 2001b). A combinação G. albida (inóculo Org) + adubação
química proporcionou a produção de 11,08 t ha
-1
de frutos (Figura 1). Esse sistema é eficiente,
pois o valor é referente apenas ao primeiro pico da produção anual. A produtividade de 17 t
ha
-1
e 20 t ha
-1
, obtida, respectivamente, por Silva et al. (2004) e Damatto Jr. et al. (2005), foi
calculada a partir dos dois picos de produção anual da cultura. Além disso, reflete valores
médios do 1º e do 2º ano de produção, quando se observa maior produção de frutos (Junqueira
et al., 2005). Portanto, comparativamente, o sistema testado também se mostrou eficiente.
Em geral, no primeiro ano de cultivo, obtém-se rendimento na produção de frutos em
torno de 15-20 kg planta
-1
ano
-1
(Junqueira et al., 2005). Quando as plantas estavam
associadas ao FMA proveniente de multiplicação em adubo orgânico e foram cultivadas em
solo com adubo químico foi registrada produção de 98 kg planta
-1
. Foram obtidos cerca de
quatro vezes mais frutos que o esperado para o primeiro ano de produção da cultura, o que
mostra a eficácia do sistema adotado para produção do maracujá-doce.
No tratamento mais promissor, nesse estudo, foram aplicados apenas 50g de
superfosfato simples + 63 g de cloreto de potássio + 135 g de uréia, o que traduz economia de
cerca de 20 vezes na adubação fosfatada recomendada no plantio (Sanzarowicz & Andrade,
2005), sendo dispensável o uso de esterco bovino. Adicionalmente, não foi necessária
aplicação de superfosfato simples na adubação para produção, como sugerido por
Sanzarowicz & Andrade (2005). A redução na quantidade de adubo aplicado minimizou os
custos de produção e favoreceu a atuação do fungo micorrízico, conhecido por aumentar o
crescimento vegetal em solos com baixa fertilidade (Kahiluoto et al., 2001).
A maior produtividade registrada no experimento foi obtida nas plantas associadas ao
FMA provindo da multiplicação em substrato com adubo orgânico que apresentava elevada
fertilidade (Tabela 1), mostrando que esse tipo de substrato pode selecionar e manter fungos
mais eficientes (Muthukumar & Udaiyan, 2002). Esses dados contrariam a hipótese de
Johnson (1993), o qual sugere que a fertilização seleciona fungos menos eficientes, e
concordam com os obtidos por Scullion et al. (1998), os quais registraram que fungos de
áreas com manejo orgânico foram mais eficientes em melhorar a nutrição fosfatada de Allium
amaloprasum e de Trifolium repens, quando comparado ao efeito produzido por fungos de
áreas sem aplicação de fertilizantes orgânicos. Stürmer (2004) também mencionou que FMA
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
255
provindos de áreas com 24 mg P dm
-3
promoveram mais benefícios em soja (Glycine max L.)
do que aqueles oriundos de solos com 15 mg P dm
-3
.
O tipo de adubação aplicada (química ou orgânica) no cultivo afetou o desempenho do
FMA. Em solo submetido à fertilização química, plantas associadas a G. albida multiplicado
em solo + composto orgânico produziram duas vezes mais frutos, em relação às micorrizadas
com o outro isolado de FMA (S) (Figura 1). Por outro lado, quando as plantas foram mantidas
em cultivo orgânico, maior produtividade foi alcançada com o FMA multiplicado em solo
(Figura 1). Esse resultado não suporta a hipótese inicial do trabalho e contraria dados obtidos
em casa-de-vegetação, que indicaram que FMA adaptados têm melhor desempenho quando
submetidos à condição edáfica em que foi propagado (Gonzalez-Chavez et al., 2002); Os
isolados usados nesse estudo haviam sido testados na formação de mudas do maracujazeiro-
doce em casa de vegetação, mas as respostas obtidas não se repetiram em campo. Por outro
lado, em condições de campo, a inoculação com FMA nativos favoreceu o crescimento e
nutrição mineral de Olea europaea L., Rethama sphaerocarpa (L.) Boissier e Rhamnus
lycioides L. mais do que a aplicação do FMA alóctone Glomus claroideum Schenck & Smith
(Caravaca et al., 2005). Melhor atuação desses FMA nativos (adaptados) foi sobre parâmetros
de crescimento do vegetal (biomassa e conteúdo nutricional) (Caravaca et al., 2005). No
presente trabalho, o melhor desempenho de G. albida, foi verificado em termos de produção
de frutos. Confirma-se a necessidade de ensaios em campo para validação de dados
observados na fase de muda, pois em condições de campo, outros fatores, tal como a
população nativa de FMA na área, podem interferir nas respostas do hospedeiro.
A duração do experimento (10 meses) pode não ter sido suficiente para se confirmar a
hipótese inicial do trabalho (G. albida multiplicado em substrato orgânico com melhor
desempenho em solo com adubo orgânico), pois Requena et al. (2001) só observaram que
FMA nativos (adaptados) foram mais eficientes no estabelecimento de Anthyllis cytisoides L.
em áreas desertificadas em relação ao FMA não adaptado Glomus intraradices Schenck &
Smith após três anos de transplantio.
Quando multiplicado em solo com elevados teores de P (42 mg dm
-3
) G. albida foi
mais eficiente em solo com adubo químico e com baixa quantidade de P (4,35g P planta
-1
).
Em contrapartida, maior eficiência do outro isolado (S), produzido em solo com baixo teor de
P (4 mg dm
-3
), foi registrada no solo adubado com vermicomposto (31,9 g P planta
-1
). Este
resultado indica que G. albida teve melhor atuação em condição de solo diferente daquela em
que foi propagado. A plasticidade funcional nos FMA, decorrente da presença de núcleos
distintos, evidenciada em espécies de Glomus Tulasne & Tulasne (Weissenhorn et al., 1994),
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
256
poderia explicar o melhor desempenho de G. albida em condições diferentes daquelas em que
foi multiplicado.
Nos frutos de maracujazeiro-doce, os sólidos solúveis totais (SST) variam entre 15,3-
24,7 ºBrix (Veras et al., 2000) e a acidez total titulável entre 0,6-1,8% de ácido cítrico
(Vasconcellos et al., 1993). Todos os tratamentos utilizados produziram frutos com teores
entre esses limites (Figura 1), porém o uso de vermicomposto favoreceu a formação de frutos
com teores mais elevados de SST e ATT (P < 0,01). Resultados similares foram obtidos por
Damatto Jr. et al., (2005), os quais evidenciaram que o uso de vermicomposto favoreceu a
formação de frutos com elevados SST (24 ºBrix) e ATT (2,21 g ácido cítrico 100 g polpa
-1
),
sendo os efeitos atribuídos a maior disponibilidade de nutrientes no substrato.
No cultivo orgânico, o uso de G. albida multiplicado em solo favoreceu a produção de
frutos com elevado SST, quando comparado ao tratamento com o outro isolado (Figura 1). É
possível que o referido isolado mesmo provindo de solo com baixo P (Tabela 1), tivesse
habilidade diferenciada para absorver fósforo, requerido em elevadas concentrações na via de
formação de açúcares, considerando que em maracujá, os SST são constituídos
principalmente por carboidratos (Folegatti & Matsuura, 2002). Na biossíntese de outros
compostos que necessitam de elevadas concentrações de P nas vias metabólicas, como por
exemplo, óleos essenciais, o papel do FMA no processo é conhecido (Kapoor et al., 2002); no
entanto, devido à elevada acidez encontrada nos frutos, os elevados valores de SST
encontrados não se traduziram em aumento na relação SST/ATT (Figura 1).
No tratamento com fertilizantes químicos a origem do FMA não afetou os SST (Figura
1), mas, o emprego do isolado provindo da multiplicação em solo + 10% de composto
orgânico favoreceu a produção de frutos com melhor qualidade (reduzida acidez e maior
relação SST/ATT). Kapoor et al. (2004) também evidenciaram que o uso combinado de
fertilizantes químicos (20 kg KH
2
PO
4
ha
-1
) e Glomus fasciculatum (Thaxter) Gerdemann &
Trappe emend. Walker & Schenck melhorou a qualidade dos óleos essenciais em Foeniculum
vulgare Mill. Mesmo que a combinação (adubo orgânico + FMA multiplicado em solo) tenha
promovido a formação de frutos com elevados teores de SST, o tratamento de adubação
química + FMA multiplicado em adubo orgânico favoreceu a produção de frutos com elevada
relação SST/ATT (Figura 1). Esta é uma característica desejável, indicando que os frutos são
mais doces e menos ácidos, sendo, portanto mais apreciados.
Algumas características dos frutos são determinadas pelo genótipo do vegetal, não
sendo influenciadas pela presença do fungo micorrízico na raiz, que teria maior atuação na
fisiologia do hospedeiro. Talvez por isso não tenham sido detectadas diferenças nos demais
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
257
parâmetros observados (tamanho do fruto e da cavidade ovariana, espessura da casca, peso do
fruto e da polpa, rendimento em polpa, nº sementes/fruto, pH do suco e tempo de abertura da
flor até o ponto de colheita) (Tabela 2).
Tabela 2. Níveis de significância para adubação e fungos e interação dos parâmetros avaliados
na produtividade do maracujazeiro-doce no Vale de São Francisco, Petrolina, PE
Parâmetro Adubação (1) FMA (2) 1 × 2 CV(%)
CLF (cm) ns ns ns 4,11
CTF (cm) ns ns ns 6,58
CLCO (cm) ns ns ns 6,78
CTCO (cm) ns ns ns 9,47
Espessura da casca (mm) ns ns ns 13,46
Peso médio dos frutos (g) ns ns ns 12,69
Peso médio da polpa (g) ns ns ns 24,44
Rendimento em polpa (%) ns ns ns 10,94
TAF (dias) ns ns ns 5,58
Nº de sementes/fruto ns ns ns 14,23
pH do suco ns ns ns 2,99
Produção (nº frutos ha
-1
) ** ** ** 9,36
Produtividade (ton ha
-1
) ** ** ** 14,15
SST (ºBrix) ** ** ** 4,26
ATT (% ácido cítrico g
-1
polpa) ** ** ** 5,16
Relação SST/ATT ** * ** 13,91
CLF= comprimento longitudinal dos frutos; CTF= comprimento transversal dos frutos; CLCO=
comprimento longitudinal da cavidade ovariana; CTCO= comprimento transversal da cavidade
ovariana; SST= sólidos solúveis totais; ATT= acidez total titulável; TAF= tempo decorrido da abertura
da flor até o ponto de colheita. ns= não significativo; * (P<0,05); ** (P< 0,01).
Os frutos de maracujazeiro-doce atualmente comercializados apresentam elevada
variação morfológica (Vasconcellos et al., 2001b), devido à recente exploração da cultura e à
propagação quase exclusivamente por semente (Osipi & Nakagawa, 2005), o que gera
desuniformidade nos pomares. No entanto, os dados de peso médio, comprimento, nº de
sementes/fruto e de pH do suco estão de acordo com o padrão (Oliveira et al., 1982); embora
tenha sido registrado maior rendimento em polpa. O tempo decorrido da abertura entre a flor e
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
258
a colheita dos frutos foi similar ao registrado por Martins et al. (2003); entretanto, os autores
encontraram frutos com cavidade ovariana longitudinal e transversal, menor e maior,
respectivamente, do que o evidenciado no presente estudo (Tabela 3). Observa-se, portanto,
que de modo geral, no Vale do Submédio São Francisco podem ser produzidos frutos que se
enquadram dentro dos valores referenciados para outras regiões brasileiras onde também se
cultiva o maracujazeiro-doce (Martins et al., 2003).
Tabela 3. Valores médios para as características de frutos de maracujazeiro-doce, micorrizado
com Gigaspora albida (produzido em solo com (Org) ou sem (S) 10% de composto orgânico)
e cultivado em solo adubado com fertilizantes químicos ou orgânicos
Parâmetros
Tratamentos
Adubação química Adubação orgânica
S Org S Org
CLF (cm) 9,63 9,74 9,73 9,79
CTF (cm) 6,75 6,68 6,32 6,80
CLCO (cm) 6,97 6,52 7,10 6,98
CTCO (cm) 5,26 4,91 4,81 5,16
Espessura da casca (cm) 0,77 0,88 0,77 0,79
Peso médio dos frutos (g) 164,87 171,05 151,91 153,90
Peso médio da polpa (g) 33,71 35,27 33,47 38,78
Rendimento em polpa (%) 23,43 22,96 23,67 27,44
TAF (dias) 57 60 58 55
Nº de sementes/fruto 149 151 141 199
pH do suco 3,56 3,67 3,51 3,57
CLF= comprimento longitudinal dos frutos; CTF= comprimento transversal dos frutos; CLCO=
comprimento longitudinal da cavidade ovariana; CTCO= comprimento transversal da cavidade
ovariana; TAF= tempo decorrido da abertura da flor até o ponto de colheita.
O maracujazeiro-doce iniciou a floração em junho/julho (seis meses após o
transplantio) com pico de produção de frutos em agosto/setembro. Assim, a produção no Vale
do Submédio São Francisco nos meses de agosto/setembro constitui mercado adicional e
competitivo para a comercialização desta fruteira. Em São Paulo, Estado que detém a maior
produtividade nacional (Manica & Oliveira Jr., 2005), os picos de produção são em
dezembro/janeiro e em junho/julho (Vasconcellos et al., 2001a).
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
259
Conclusões
A condição de multiplicação do inóculo micorrízico interfere na produção e na
qualidade de frutos do maracujazeiro-doce, com as respostas moduladas pelo tipo de
adubação empregada.
Em condições de campo, o efeito da micorrização pode ser observado na fase
produtiva do hospedeiro, mesmo se o FMA inoculado é oriundo de substrato com diferentes
condições de fertilidade.
O cultivo em solo com fertilizantes químicos de maracujazeiros-doce micorrizados
com isolado de G. albida multiplicado em solo + 10% de composto orgânico pode constituir
alternativa para maior produção de frutos com reduzida acidez e elevada SST/ATT, no Vale
do Submédio São Francisco.
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Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
264
Capítulo 9
Produção de glomalina e atividade microbiana na rizosfera de maracujazeiros-doce
em função do uso de vermicomposto e fontes de inóculo micorrízico
Artigo a ser submetido para publicação no periódico Biology and Fertility of Soils
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
265
Produção de glomalina e atividade microbiana na rizosfera de maracujazeiros-doce em função
do uso de vermicomposto e fontes de inóculo micorrízico
Fábio Sérgio Barbosa da Silva
1
· Adriana Mayumi Yano-Melo
1
· Natoniel Franklin de Melo
2
·
Geraldo Milanez de Resende
2
· Leonor Costa Maia
1
*
1
Laboratório de Micorrizas, Depto. Micologia, UFPE, Cidade Universitária, CEP. 50670-420,
Recife, PE, Brasil.
; amymelo17@hotmail.com; [email protected]).
2
Embrapa Semi-Árido, C.P. 23, CEP. 56302-970, Petrolina, PE, Brasil.
*autor para correspondência (Tel: +55-81-2126 8865; Fax: +55-81-2126 8482).
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
266
Resumo
O uso de adubos orgânicos na agricultura favorece as características e os microrganismos do
solo, entre esses, os fungos micorrízicos arbusculares (FMA), que produzem uma
glicoproteína (glomalina) relacionada à qualidade edáfica. Contudo, não se determinou se a
produção de glomalina é afetada pela fertilização orgânica e pelo isolado de FMA. Mudas de
maracujazeiro-doce foram pré-inoculadas com Gigaspora albida multiplicado em solo (S) ou
em solo + 10% de composto orgânico (Org) e transplantadas para covas adubadas com
vermicomposto (20 L planta
–1
) ou com fertilizantes químicos (50 g superfosfato simples +
135 g de uréia + 63 g de cloreto de potássio por planta). O delineamento experimental foi em
5 blocos casualizados em fatorial: 2 tratamentos de inoculação (S e Org) × 2 tipos de
adubação (química e orgânica), com cada parcela experimental constituída por 4 plantas. Dez
meses após a instalação do cultivo, avaliou-se: teores de P, de matéria orgânica (MO), pH e
capacidade de troca catiônica (CTC) do solo, produção de glomalina total (GT) e facilmente
extraível (GFE) em agregados de 1-2mm e < 1mm, evolução de CO
2
, atividade enzimática
geral do solo, esporulação de FMA e colonização micorrízica. Maiores valores para as
variáveis estudadas foram obtidos com o uso do vermicomposto, em relação ao uso de
fertilizantes químicos; por outro lado, interação entre fertilização e fonte de FMA afetou
apenas a produção de glomalina (GFE), a evolução de CO
2
e a colonização micorrízica. As
frações de glomalina foram positivamente correlacionadas com os teores de P (r= 0,87) e MO
(r= 0,87), valores de CTC (r= 087), com a densidade de esporos (r= 0,55) e evolução de CO
2
(r= 0,72). Conclui-se que a produção de glomalina e a atividade microbiana do solo são
favorecidas pelo uso de vermicomposto, mas os benefícios podem ser modulados pela fonte
de inóculo micorrízico empregada na fase de formação de mudas de maracujazeiro-doce.
Palavras-chave - Adubação orgânica; glicoproteína; hidrólise de FDA; evolução de CO
2
;
Glomeromycota, Passiflora alata.
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
267
Introdução
A necessidade de sistemas agrícolas sustentáveis tem impulsionado a busca por
práticas que favoreçam a produtividade de culturas, sem comprometer a qualidade do solo;
nesse sentido, o uso de adubos orgânicos de qualidade e em doses adequadas é uma
alternativa de baixo custo que melhora as características físicas, químicas, físico-químicas e
microbiológicas do solo (Antolín et al. 2005).
A simbiose micorrizica arbuscular é influenciada por várias práticas agrícolas, entre
elas a aplicação de adubos orgânicos, que podem favorecer os fungos micorrízicos
arbusculares (FMA), aumentando a taxa de colonização intra e extraradicular (Bending et al.
2004), a reprodução (Gaur & Adholeya 2005) e a eficiência simbiótica do fungo (Lins et al.
2003).
No micélio externo dos FMA uma glicoproteína é produzida, denominada glomalina,
que juntamente com a trama de hifas no solo aumenta a agregação de partículas (Nichols
2003) e o estoque de carbono (Rillig et al. 2003), contribuindo para melhoria da qualidade
edáfica. Fatores como fertilidade do solo (Lovelock et al. 2004a), práticas de manejo (Knorr
et al. 2003) e espécie vegetal (Bird et al. 2002) interferem na deposição deste composto.
Apesar da estreita relação com os teores de carbono (Wright & Upadhyaya 1998), pouco se
conhece sobre o impacto do uso de adubos orgânicos, sobre a produção de glomalina no solo.
Recentemente, Wuest et al. (2005) sugeriram que a aplicação de 22,4 t ha
-1
ano
-1
de esterco
favoreceu a produção dessa glicoproteína.
Rillig et al. (2005) registraram que espécies de FMA contribuem de modo
diferenciado para a produção de glomalina, confirmando sugestões prévias de Wright et al.
(1996). Porém, mesmo considerando que existem diferenças intraespecíficas entre FMA, na
promoção do crescimento vegetal (Vivas et al. 2003), não se determinou se diferentes
isolados de uma mesma espécie contribuem de modo distinto para a síntese de glomalina no
solo. Esse conhecimento é importante na indicação de fungos eficientes em promover a
agregação do substrato e conseqüente melhoria na qualidade do solo (Rillig 2004).
O emprego de fontes orgânicas na agricultura favorece a atividade dos
microrganismos do solo, sendo freqüentemente registradas maiores taxas de respiração
microbiana e atividade de enzimas em tais sistemas (Fernandes et al. 2005). Esses benefícios
podem ser maximizados pelo emprego de materiais compostados, como apontado por Pascual
et al. (2002).
O papel dos FMA na melhoria da qualidade edáfica também é conhecido (Duponois et
al. 2005). Esses fungos podem afetar os demais microrganismos através da rede micelial e
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
268
seus subprodutos, bem como pela modificação nos rizodepósitos (Wamberg et al. 2003). A
micorrização de Dorycnium pentaphyllum L. com Glomus deserticola Trappe, Bloss &
Menge ou Glomus.intraradices Schenck & Smith favoreceu a atividade de enzimas
(desidrogenase, urease, fosfatase ácida e E-glucosidase) em solo adubado com resíduo de
beterraba + Aspergillus niger Tiegh + fosfato de rocha, em relação ao solo sem adubo, sendo
os maiores valores observados quando as plantas estavam associadas a G. deserticola,
indicando que os benefícios podem ser dependentes da espécie de FMA (Caravaca et al.
2004). Todavia, o impacto do uso de fontes distintas de inóculo da mesma espécie de FMA
sobre tais processos não é conhecido.
Foi testada a hipótese de que a aplicação de adubo orgânico e a fonte de inóculo de
FMA empregada na formação de mudas de maracujazeiro-doce (Passiflora alata Curtis)
interferem na produção de glomalina e na atividade microbiana do solo.
Material & métodos
Área experimental
O experimento foi conduzido no Campo Experimental de Bebedouro (Embrapa Semi-
árido, Petrolina-PE), no período de dezembro-2003 a outubro-2004. O clima da região é do
tipo Bswh [Clima Semi-Árido, com temperaturas altas (> 22ºC) e chuvas escassas no inverno
(< 250 mm)], segundo Köeppen. Durante o experimento o índice pluviométrico foi de 801,1
mm e a temperatura atingiu médias mínimas e máximas de 18,11 ºC e 32,10 ºC,
respectivamente. O solo da área é do tipo Argissolo-Amarelo-Eutrófico (Embrapa 1999).
Antes do transplantio das mudas, a área foi arada e gradeada e foram confeccionadas covas
(40×40×40 cm) que receberam os fertilizantes mediante recomendação de adubação. Foram
aplicados 700 kg ha
-1
de calcário dolomítico, visando elevar o pH do solo e os teores de cálcio
e magnésio. Após aplicação dos adubos e corretivos, a irrigação foi mantida por 15 dias.
Material
Plântulas com duas folhas definitivas de maracujazeiro-doce (Passiflora alata Curtis)
foram inoculadas, separadamente, com solo-inóculo fornecendo 200 esporos de Gigaspora
albida Schenck & Smith, multiplicado em solo (S) ou em solo + 10% composto orgânico
(Org) e acondicionadas em potes com capacidade de 200 g de substrato (solo do experimento
de campo e 10% de vermicomposto). Após 15 dias, as plântulas foram transferidas para sacos
contendo 1 Kg do mesmo substrato (Tabela 1). Aos 46 dias da inoculação, mudas com oito
folhas definitivas foram transplantadas ao campo. Foram testados dois tipos de adubação:
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
269
química e orgânica. Na primeira, foram aplicados 50 g de superfosfato simples antes do
transplantio; após 90 dias fez-se a adubação com 45 g de uréia + 21 g de cloreto de potássio,
sendo este procedimento repetido no início (180 dias após o transplantio) e 60 dias após a
floração. Na adubação orgânica foram aplicados 20 L de vermicomposto/cova (Tabela 1)
fracionados em quatro aplicações iguais: na fundação, e aos 90, 180 e 240 dias após o
transplantio.
Tabela 1. Caracterização química dos substratos utilizados para multiplicação de Gigaspora
albida, preparo das mudas de Passiflora alata e como adubação orgânica para cultivo do
maracujazeiro-doce
pH P* C N CTC C/N
Substratos
(H
2
O-1:2,5) (mg dm
-3
) (g Kg
-1
) (cmol
c
dm
-3
)
Multiplicação de FMA
Solo
4,6 4 13,3 1,2 1,69 11,08
Solo+10% CO 5,6 53 26,1 2,0 9,89 13,05
Preparo das mudas
Solo+10% VC 7,1 74 15,56 1,41 6,08 11,03
Adubação orgânica
Vermicomposto 7,0 1450 124,41 11,31 12,00 11,00
CO=composto orgânico;VC=vermicomposto; CTC=capacidade de troca catiônica.* Mehlich I
Delineamento experimental
Foram testados dois fatores: adubação e fontes de inóculo micorrízico. O delineamento
experimental foi de blocos ao acaso em arranjo fatorial de 2 × 2, constituindo de dois
tratamentos de inoculação (plantas pré-inoculadas com G. albida multiplicado em solo ou em
solo + 10 % de composto orgânico) × dois tipos de adubação (química e orgânica), e cinco
repetições. Cada parcela experimental foi constituída por 4 plantas.
Condução do experimento
Foi utilizado o espaçamento de 5 × 3 m, sendo adotado sistema de condução em
espaldeira com dois fios (nº 12), um a 40 cm e outro a 2 m do solo. A irrigação foi feita por
gotejamento semi-automático (dois gotejadores espaçados 20 cm entre si) por 6 horas em dias
alternados (8,4 L H
2
O planta
-1
h
-1
). Podas de formação foram feitas quando a planta atingiu o
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
270
fio superior, e após seis meses da instalação do cultivo o procedimento foi realizado
semanalmente.
Amostragem e parâmetros avaliados
Dez meses após a instalação do plantio foram retiradas amostras de solo (0-20 cm de
profundidade) a 15 cm do caule, em quatro pontos eqüidistantes, para cada uma das quatro
plantas da parcela experimental. As 16 amostras (quatro por planta) de cada parcela
constituíram amostra composta. Parte foi enviada à Embrapa Semi-Árido para determinação
do pH, da capacidade de troca catiônica (CTC) e dos teores de fósforo (P) e matéria orgânica
(MO) (Embrapa 1979) e outra destinada à avaliação dos parâmetros bioquímicos e
microbiológicos do solo. A atividade enzimática do solo foi estimada pela hidrólise do
diacetato de fluoresceína (FDA) (Swisher & Carroll 1980); a respiração microbiana foi
determinada por evolução de CO
2
(Grisi 1978); as frações de glomalina facilmente extraível
(GFE) e total (GT) foram extraídas de duas classes de agregados: < 1 e 1-2 mm de diâmetro,
sendo utilizada a metodologia de Wright & Upadhyaya (1998), contudo, para extração da
fração GT foram necessários dois ciclos de extração em autoclave (121 ºC/ 1 h), utilizando
citrato de sódio (50mM; pH 8,0); para a dosagem protéica utilizou-se o método de Bradford
(1976). A colonização micorrízica foi determinada pela técnica da interseção de quadrantes
(Giovannetti & Mosse 1980), após diafanização das raízes (KOH 10%) e coloração com
Clorazol Black 0,03% (Brundrett et al. 1984). Os esporos de FMA foram extraídos
(Gerdemann & Nicolson 1963; Jenkins 1964) e quantificados em estereomicroscópio (40 ×).
Análise dos dados
Foram realizadas análises de correlação simples de Pearson (r) entre as variáveis
estudadas. Os dados de densidade de esporos foram transformados em x+0,5 e os de
colonização micorrízica em arcoseno x+0,5 para satisfazer a homogeneidade de variância, e
posteriormente submetidos à ANOVA e as médias comparadas pelo teste de Tukey (5 %),
utilizando-se o programa Sanest.
Resultados e Discussão
Houve efeito da adubação para as características de fertilidade do solo (pH, CTC, P e
MO), bem como para as frações de glomalina total, densidade de esporos e atividade
enzimática geral do solo, porém não foi observado efeito dos tratamentos de micorrização
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
271
nem da interação com a adubação (Tabela 2). Por outro lado, para os demais parâmetros
avaliados a interação entre adubação e micorrização foi significativa (Tabela 2).
Aumento no pH, na CTC e nos teores de P e MO foram evidenciados quando se utilizou
vermicomposto como alternativa de adubação (Tabela 3). Essa melhoria nas propriedades do
solo é freqüentemente registrada quando se adiciona fertilizantes orgânicos ao solo (Mäder et
al. 2002; Antolín et al. 2005).
Tabela 2. Níveis de significância para adubação, fungos e interação entre as variáveis
estudadas, em cultivo do maracujazeiro-doce no Vale de São Francisco, Petrolina, PE
Parâmetro
Adubação (1)
FMA (2)
1 × 2
CV (%)
pH ** ns ns 2,18
P ** ns ns 20,40
Matéria orgânica ** ns ns 15,57
CTC ** ns ns 10,17
FDA ** ns ns 53,91
Emissão de CO
2
** ns ** 8,22
GFE (< 1 mm) ** ns ** 7,65
GFE (1-2 mm) ns ** * 11,26
GT (< 1 mm) ** ns ns 10,11
GT (1-2 mm) ** ns ns 17,26
% colonização micorrízica ** ** ** 6,04
Densidade esporos ** ns ns 6,96
CTC= capacidade de troca catiônica; GFE= glomalina facilmente extraível; GT= glomalina total. ns= não
significativo; * (P<0,05); ** (P<0,01).
Quando o solo recebeu adubo orgânico foram registrados incrementos de cerca de 150 %
na atividade de hidrólise do FDA (enzimática geral do solo), em relação ao tratamento com
fertilizantes químicos (Tabela 4). Com resultados semelhantes, Pérez Sarmentero et al. (1994)
verificaram que a aplicação de 20 t ha
-1
de composto orgânico incrementou a atividade de
hidrólise do FDA em relação ao controle sem adubação, ou à aplicação de adubos químicos.
Pankhurst et al. (2005) também observaram que a aplicação de resíduos orgânicos no cultivo
de cana-de-açúcar favoreceu a atividade hidrolítica do FDA. Este benefício pode ser atribuído
ao fornecimento de substratos para atividade microbiana e à presença de microrganismos
metabolicamente ativos e enzimas aderidas ao vermicomposto aplicado (Caravaca et al. 2005;
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
272
Izquierdo et al. 2005). Além disso, em solos adubados com fertilizantes orgânicos, ocorre
redução na densidade aparente, que resulta em aumento na porosidade, contribuindo para o
melhor desenvolvimento do vegetal e conseqüente exsudação, que serve de fonte energética
para os microrganismos rizósféricos (Marinari et al. 2000; Izquierdo et al. 2005).
Tabela 3. Influência da fertilização química e orgânica nas características químicas do solo
após cultivo durante dez meses do maracujazeiro-doce associado a Gigaspora albida
Adubação
Características químicas
pH (1:2,5 H
2
O) P* (mg dm
-3
) MO (g kg
-1
) CTC (cmol
c
dm
-3
)
Química 6,98 b 13,40 b 6,08 b 2,40 b
Orgânica 7,18 a 36,00 a 10,51 a 3,46 a
Médias seguidas da mesma letra, na coluna, não diferem entre si pelo teste de Tukey P<0,05.
*Mehlich
A produção de esporos de FMA na rizosfera de P. alata foi beneficiada pela presença de
vermicomposto (Tabela 4). O aumento na reprodução dos fungos pode ser relacionado ao
estímulo na esporulação, quando fontes orgânicas são aplicadas ao solo (Gaur & Adholeya
2005). Isso decorre da alteração na concentração dos nutrientes do solo, pela adubação
(Muthukumar & Udaiyan 2002).
No solo adubado com vermicomposto houve incremento de 80 e 90% na produção de
glomalina total, em relação ao tratamento com fertilizantes químicos (Tabela 4).
Tabela 4. Influência da fertilização química e orgânica na concentração de glomalina total
(GT) em duas classes de agregados (<1 e 1-2 mm), na densidade de esporos de FMA (DE) e
na atividade enzimática geral (AEG) de solo após cultivo do maracujazeiro-doce associado a
Gigaspora albida durante dez meses
Adubação Parâmetros
GT DE AEG
(mg g agregado
-1
)
(< 1mm) (1-2 mm)
(esporos 100 g
-1
)
(Pg FDA hidrolisado
g
-1
solo seco h
-1
)
Química 0,73 b 0,99 b 211 b 6,43 b
Orgânica 1,34 a 1,89 a 278 a 12,25 a
Médias seguidas da mesma letra, na coluna, não diferem entre si pelo teste de Tukey (P<0,05).
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
273
A glomalina no solo é positivamente relacionada com a produção de hifas (Treseder et al.
2004), que é estimulada pela adubação orgânica do substrato (Gryndler et al. 2002). Assim, é
possível que a síntese desta proteína tenha sido estimulada pelo aumento na fertilidade do
solo, como apontado por Lovelock et al. (2004b). Nessas condições ocorre maior produção de
micélio externo, que apresenta glomalina como componente de parede (Driver et al. 2005).
Além disso, a glomalina presente em esporos de FMA (Wright et al. 1996), que foram
produzidos em maior quantidade no solo com vermicomposto (Tabela 4), pode ter contribuído
para as maiores estimativas obtidas no tratamento com adubo orgânico.
A aplicação de vermicomposto favoreceu a colonização micorrízica, em relação ao uso
de fertilizantes químicos (Figura 1), situação que tem sido relatada em outros sistemas (Mader
et al. 2002; Bending et al. 2004). Ryan et al. (1994) constataram que trigo cultivado em
sistema orgânico teve as raízes três vezes mais colonizadas que aquele mantido em sistema
convencional, fato que Kurle & Pfleger (1994) atribuem ao aumento nos teores de matéria
orgânica do solo em áreas orgânicas.
Química Orgânica
0
5
10
15
20
25
30
35
aA
bA
aB
bB
Colonização micorrízica (%)
Adubação
S
Org
Figura 1. Colonização micorrízica por Gigaspora albida multiplicado em solo com (Org) ou
sem (S) composto orgânico, em raízes de Passiflora alata cultivada em solo adubado com
fertilizantes químicos e orgânicos, no Vale do Submédio São Francisco, Petrolina, PE.
Barras com letras iguais, maiúsculas entre os tratamentos de adubação dentro de cada tipo de inóculo e
minúsculas entre os tratamentos de inoculação
dentro de cada tipo de adubação, não diferem entre si
pelo teste de Tukey (P<0,05).
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
274
Apesar dos elevados teores de P prejudicarem a fase intra-radicular da simbiose (Dann et
al. 1996), esse não foi o fator principal para redução na formação de micorriza no cultivo
químico do maracujeiro-doce, em relação a aplicação de adubo orgânico (Figura 1), visto que
os maiores teores de P foram registrados nos solos com vermicomposto (Tabela 3). Joner
(2000) sugeriu que o uso de fertilizantes orgânicos tem efeito menos deletério que a aplicação
de doses equivalentes de adubos minerais (NPK), visto que o P orgânico presente nos adubos
orgânicos, mesmo em elevadas concentrações, não inibe o desenvolvimento de FMA
(Linderman & Davis 2001).
A forma de produção do inóculo de G. albida interferiu na extensão da colonização
radicular de P. alata: nos dois tratamentos de adubação, as plantas previamente inoculadas
com o fungo produzido em substrato com adubo orgânico (Org), tiveram maiores taxas de
colonização micorrízica, em relação a associação com o outro isolado de G. albida
(multiplicado em solo) (Figura 1). Com resultados semelhantes, Scullion et al. (1998)
verificaram que fungos provindos de áreas com manejo orgânico produziram mais estruturas
no córtex radicular de Trifolium repens L. e Allium ameloprasum L., em relação àqueles de
áreas com manejo convencional. Além disso, a adubação orgânica tem sido apontada por
selecionar e manter FMA mais eficientes em promover o crescimento vegetal (Muthukumar
& Udaiyan 2002). No presente estudo, foi verificado que a adoção desta prática, na fase de
produção do inóculo micorrízico, permitiu a propagação de fungos com elevada capacidade
de colonização do hospedeiro.
O estímulo da aplicação de vermicomposto e a contribuição diferenciada das fontes de
inóculo foram verificados nas duas classes de agregados avaliadas (Figuras 2 e 3), indicando
que além da fração comumente utilizada para extração (1-2 mm) desta proteína (Rillig 2004),
agregados menores (< 1mm) também podem ser empregados, sem comprometimento das
respostas obtidas.
Os maiores depósitos protéicos na rizosfera do maracujazeiro-doce cultivado em solo
com vermicomposto ocorreram quando a muda foi previamente micorrizada com G. albida
(Org), cujo inóculo foi produzido em substrato com adubo orgânico (Figura 3). É provável
que a multiplicação em substrato adubado e com elevados teores de fósforo (42 mg P dm
-3
)
tenha permitido ao fungo se adaptar a condição de alta fertilidade, fornecida pela aplicação de
vermicomposto, que resultou em maior produção de glomalina em relação ao tratamento
usando inóculo de G. albida produzido em solo (4 mg P dm
-3
). Em outras situações, o uso de
FMA multiplicados na condição edáfica alvo foram mais eficazes que o emprego de fungos
não adaptados (Stürmer 2004).
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
275
Química Orgânica
0.0
0.5
1.0
1.5
aA
bA
aB
aB
GFE(mg glomalina g
-1
agregados <1mm)
Adubação
S
Org
Figura 2. Glomalina facilmente extraível (GFE) de agregados (<1 mm) de solo adubado com
fertilizantes químicos ou orgânicos, após cultivo por dez meses com maracujazeiro-doce
associado a Gigaspora albida, multiplicado em solo com (Org) ou sem (S) composto
orgânico, no Vale do Submédio São Francisco, Petrolina, PE.
Barras com letras iguais, maiúsculas entre os tratamentos de adubação dentro de cada tipo de inóculo e
minúsculas entre os tratamentos de inoculação dentro de cada tipo de adubação, não diferem entre si pelo teste
de Tukey (P<0,05).
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
OrgânicaQuímica
aA
bA
aB
aB
GFE(mg glomalina g
-1
agregado 1-2 mm)
Adubação
S
Org
Figura 3. Glomalina facilmente extraível (GFE) de agregados (1-2 mm) de solo adubado com
fertilizantes químicos ou orgânicos, após cultivo durante dez meses com maracujazeiro-doce
associado a Gigaspora albida, multiplicado em solo com (Org) ou sem (S) composto
orgânico, no Vale do Submédio São Francisco, Petrolina, PE.
Barras com letras iguais, maiúsculas entre os tratamentos de adubação dentro de cada tipo de inóculo e
minúsculas entre os tratamentos de inoculação dentro de cada tipo de adubação, não diferem entre si pelo teste
de Tukey (P<0,05).
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
276
A produção de glomalina facilmente extraível (GFE) foi favorecida pelo uso de
vermicomposto, sendo que neste tratamento se observaram diferenças entre os inóculos de
FMA utilizados. A contribuição diferenciada de espécies de FMA na produção de glomalina é
conhecida (Rillig et al. 2005). Neste estudo, verificou-se que embora o isolado de FMA fosse
o mesmo, a forma de produção do inóculo foi diferenciada e interferiu na síntese dessa
proteína. Este aspecto é importante na seleção de inoculantes micorrízicos para aplicação na
agricultura (Miller & Jastrow 2000), visto que o uso de fungos com maior potencial para
produção de glomalina é indicado por melhorar as condições edáficas e o crescimento do
hospedeiro (Rillig 2004).
Nos dois tratamentos de micorrização a adubação com vermicomposto promoveu maior
evolução de CO
2
em relação ao solo com fertilizantes químicos (Figura 4). Sistemas de
cultivo orgânico, geralmente favorecem a atividade respiratória dos microrganismos do solo,
quando comparado aos sistemas convencionais com adubos químicos (Chaoui et al. 2003).
Tal aumento na evolução de CO
2
é decorrente da entrada de substâncias degradáveis pela
adubação orgânica, que servem como fonte de energia para a microbiota edáfica (Caravaca et
al. 2005). Esses benefícios sobre a atividade microbiana também podem ser atribuídos ao
suprimento de fosfato, que fornece maior balanço nutricional em relação aos fertilizantes
químicos (Marinari et al. 2000). Adicionalmente, o aumento na liberação de exsudados
radiculares gerados pelo melhor desenvolvimento do vegetal, no solo fertilizado com
vermicomposto, pode ter contribuído para a maior atividade respiratória obtida (Pascual et al.
1999).
A fonte de inóculo micorrízico influenciou a respiração microbiana apenas em solo
adubado com vermicomposto, considerando que maiores taxas de emissão de CO
2
foram
registradas em solo cultivado com o maracujazeiro-doce pré-inoculado com G. albida
produzido em solo (S) (Figura 4). Com isso, observa-se que isolados da mesma espécie
alteram de modo diferenciado esse processo. Nesse caso, os inóculos de G. albida testados
podem ter contribuído para alterar a exsudação radicular do maracujazeiro-doce, pois o fungo
influencia a liberação de carboidratos pelas raízes micorrizadas, afetando a atividade dos
microrganismos rizosféricos (Wamberg et al. 2003), visto que os rizodepósitos servem de
fonte de nutrientes para a microbiota do solo (Izquierdo et al. 2005). Esse é o principal
mecanismo micorrízico para o aumento da atividade respiratória.
As frações de glomalina foram positivamente correlacionadas com os teores de P e MO
e valores de CTC (Tabela 5). Teores de matéria orgânica também têm sido positivamente
relacionados com a produção de glomalina em outras pesquisas (Lovelock et al. 2004a;
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
277
Wuest et al. 2005). Por outro lado, a relação linear positiva entre a produção de glomalina e o
teor de P no solo (Tabela 5) contraria os resultados obtidos por Rillig et al. (2003) e Lovelock
et al. (2004a), os quais registraram, respectivamente, relação nula ou negativa entre essas
variáveis.
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Orgânica
Química
aA
aB
bA
aB
P
g C-CO
2
g solo seco
-1
dia
-1
Adubação
S
Org
Figura 4. Evolução de CO
2
em solo adubado com fertilizantes químicos ou orgânicos e após
cultivo durante dez meses com maracujazeiro-doce associado a Gigaspora albida,
multiplicado em solo com (Org) ou sem (S) composto orgânico, no Vale do Submédio São
Francisco, Petrolina, PE.
Barras com letras iguais, maiúsculas entre os tratamentos de adubação
dentro de cada tipo de inóculo e minúsculas entre os tratamentos de inoculação dentro de cada tipo de
adubação, não diferem entre si pelo teste de Tukey (P<0,05).
A produção de glomalina foi positivamente correlacionada com a densidade de esporos
de FMA no solo (Tabela 5) e possivelmente a proteína presente na parede dos esporos foi
também extraída. Wright et al. (1996) constataram a presença de glomalina na parede de
esporos de FMA.
A evolução de CO
2
foi positivamente correlacionada com as frações de glomalina
estudadas, indicando que a microbiota heterotrófica aeróbica foi hábil em utilizar a porção
glicídica desta glicoproteína (Harner et al. 2005) nos processos oxidativos, como ressaltado
por Rillig et al. (2003).
Em áreas agrícolas, estimativas de produção de glomalina facilmente extraível e total
estão em torno de 0,5 e 3 mg g
-1
solo, respectivamente (Rillig et al. 2003), porém em regiões
semi-áridas, os valores de produção são comparativamente baixos, não excedendo 0,3 e 0,6
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
278
mg g
-1
solo (Bird et al. 2002). No presente estudo, valores acima de 0,8 e 1 mg g
-1
de
agregados foram obtidos quando o solo recebeu vermicomposto, indicando que a prática da
adubação orgânica pode incrementar indiretamente a produção de glomalina.
Em sistemas orgânicos, correlações positivas entre a atividade de várias enzimas e a
evolução de CO
2
geralmente são observadas (Antolín et al. 2005). No presente estudo, a
atividade hidrolítica do FDA do solo e a respiração microbiana também foram positivamente
correlacionadas (Tabela 5), tal como referido também por Araújo et al. (2003). Esses
parâmetros foram positivamente correlacionados com as características químicas do solo
(Tabela 5). Similarmente, foram mencionadas relações positivas com os teores de matéria
orgânica (Perez Sarmentero et al. 1994) e com os teores de C e N do solo (Aon & Colaneri
2001). De modo geral, o aumento nos teores de MO (Fernandes et al. 2005) e nos valores de
CTC (Frankenberger & Dick 1983), decorrente da aplicação de adubos orgânicos é
positivamente correlacionado com a atividade enzimática no solo.
Tabela 5. Coeficientes de correlação simples (r) entre as variáveis estudadas (P<0,05).
Variáveis MO P CTC AEG RM DE GT (1-
2)
GT (<1) GFE (1-
2)
GFE (<1)
MO - 0,86 0,93 0,76 0,83 0,56 0,89 0,94 0,87 0,89
P - 0,84 0,56 0,78 0,53 0,84 0,86 0,84 0,89
CTC - 0,71 0,82 0,47 0,86 0,90 0,84 0,87
AEG - 0,73 0,51 0,47 0,71 0,51 0,56
RM - 0,68 0,76 0,89 0,73 0,82
DE - 0,54 0,60 0,55 0,68
GT (1-2) - 0,91 0,97 0,92
GT (<1) - 0,92 0,94
GFE (1-2) - 0,91
GFE (<1) -
MO= matéria orgânica; P= fósforo; CTC= capacidade de troca catiônica; AEG=atividade
emzimática geral do solo (hidrólise de FDA); RM= respiração microbiana (emissão de CO
2
);
GT= glomalina total; GFE= glomalina facilmente extraível; (1-2)= agregados de 1-2 mm;
(<1)= agregados menores que 1 mm; DE= densidade de esporos
Conclui-se que a produção de glomalina e a atividade microbiana do solo são
favorecidas pelo uso de vermicomposto como alternativa de adubação para o maracujazeiro-
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
279
doce, melhorando a qualidade do solo; no entanto, os benefícios são dependentes da fonte de
inóculo micorrízico empregada na fase de formação das mudas.
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Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
284
Conclusões Gerais
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
285
CONCLUSÕES GERAIS
Nas condições experimentais utilizadas, conclui-se que:
A incorporação de tampão Tris-HCl e resíduos orgânicos (terra vegetal e composto
orgânico) no substrato de cultivo é alternativa viável para produção de inóculo de FMA, pois
incrementa a esporulação e favorece a manutenção da infectividade dos fungos após
armazenamento;
A presença de glomalina no meio não afeta a germinação de G. albida, mas estimula o
crescimento micelial, com as respostas variando em função da concentração e da fonte de
inóculo testados;
A fonte do inóculo de G. albida, bem como o tipo e a dose de adubo orgânico no
substrato afetam o desenvolvimento da fase pré-simbiótica, não sendo recomendada a
adubação com esterco bovino não maturado, pois prejudica essa fase de desenvolvimento;
O uso de composto orgânico favorece a formação de mudas de maracujazeiro-doce
apenas quando associado a micorrização, sendo o máximo benefício obtido quando as plantas
estão associadas a G. albida, cujo inóculo foi multiplicado em substrato com resíduo
orgânico, havendo redução em 60% no tempo necessário para o transplantio ao campo;
A utilização de substrato à base de esterco bovino maturado favorece o crescimento de
mudas micorrizadas de P. alata e a atividade microbiana do solo;
A condição de multiplicação de inóculo micorrízico interfere na produção e na
qualidade de frutos do maracujazeiro-doce, com as respostas moduladas pelo tipo de
adubação empregada;
O uso de G. albida, multiplicado em solo + 10% de composto orgânico, na formação
de mudas de maracujazeiros-doce, associado ao cultivo químico, pode constituir alternativa
para produção de frutos com qualidade, no Vale do Submédio São Francisco;
A produção de glomalina e a atividade microbiana do solo são favorecidas pelo uso
de vermicomposto como alternativa de adubação para o maracujazeiro-doce, melhorando a
qualidade do solo; no entanto, os benefícios são dependentes da fonte de inóculo micorrízico
empregada na fase de formação das mudas.
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
286
Considerações Finais
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
287
CONSIDERAÇÕES FINAIS
A aplicação de fungos micorrízicos arbusculares visando o aumento no crescimento e
na produtividade de culturas não constitui tecnologia inovadora, pois esse efeito é bastante
relatado em trabalhos científicos. No entanto, a tecnologia micorrízica não é utilizada como
deveria, sendo a produção de inoculante em larga escala um dos empecilhos para a efetiva
aplicação desses fungos. Portanto, a otimização nos processos de produção, armazenamento e
comercialização do inóculo constitui um dos principais desafios da micorrizologia. Esse
problema tem bastante relevância no Brasil, visto que não se dispõe de inoculantes
micorrízicos comerciais.
Os FMA podem ser propagados em potes de cultura em solo, e o inóculo produzido
pode ser utilizado na micorrização de plantas de interesse agrícola e florestal. Porém, a
manipulação da composição dos substratos para propagação dos fungos, pela incorporação de
adubos orgânicos, pode interferir na fisiologia do fungo e da planta simbioticamente
associada, como registrado neste trabalho.
A tecnologia gerada (uso de adubos orgânicos na composição do substrato para
produção de inoculante micorrízico) é de baixo custo e, mesmo simples, incrementa a taxa de
reprodução dos fungos, que mantêm a infectividade após armazenamento. Além disso, a
multiplicação em tal condição interferiu no desenvolvimento da fase assimbiótica de
Gigaspora albida, que em algumas situações teve maior taxa de germinação e produziu maior
quantidade de micélio do que o fungo mantido apenas em solo. Por fim, a aplicação de
inóculo produzido em condições orgânicas interferiu na fisiologia do hospedeiro (nesse caso o
maracujazeiro-doce), resultando na redução no tempo de formação de mudas (60%) e na
elevada produção de frutos com características mais apreciáveis (reduzida acidez e elevada
SST/ATT). Essa metodologia constitui, ainda, oportunidade para propagação de espécies de
Gigaspora, que geralmente não estão presentes em formulações de inoculantes comerciais.
Os resultados obtidos nesse trabalho indicam que a micorrização de mudas de
maracujazeiro-doce com G. albida produzido em solo suplementado com apenas 10% de
resíduo orgânico incrementa a produtividade em mais de 200%, em relação ao uso do fungo
multiplicado de modo convencional (em solo). Por se tratar de uma fruta que apresenta
elevado valor agregado (US$ 1,00/fruto), o emprego dessa tecnologia é viável, pois o valor
bruto da produtividade por hectare, utilizando mudas inoculadas com o fungo produzido em
solo adubado é US$ 64.777, enquanto, com o uso da outra fonte de inóculo o valor é
comparativamente menor (US$ 23.277), o que resulta em aumento de lucratividade da ordem
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
288
de US$ 41.500. Isso indica que o emprego de tecnologias simples pode maximizar os
benefícios da micorrização, tornando o uso de FMA mais atrativo para os agricultores. Além
disso, a instalação de cultivo de maracujazeiros-doce micorrizados com esta fonte de inóculo,
no Vale do Submédio São Francisco, pode constituir fonte adicional de renda para os
produtores, especialmente na entressafra de culturas chaves da região.
O uso dessa metodologia (solo + 10% de composto orgânico) permite a produção de
20 esporos g
-1
solo de G. albida, sendo necessários 10g para inoculação de uma muda de
maracujá-doce (200 esporos). Cerca de sete quilos de inóculo são suficientes para a
inoculação de mudas em um hectare (densidade 666 plantas ha
-1
). O custo adicional para
produção do inóculo (sem considerar instalações, como telado, solo e sementes de painço) é
devido à aquisição do adubo orgânico (25 kg de composto orgânico custam R$ 4,00). Como o
substrato é constituído por 10% de composto orgânico, será necessário menos de 1 kg de
adubo orgânico para produzir inóculo necessário para micorrização das mudas em um hectare,
ou seja, o custo adicional é da ordem de R$ 0,16/ha. Isso indica que se o agricultor optar por
essa tecnologia, a produção de mudas aptas para transplantio ao campo será antecipada e a
produtividade incrementada, com custo adicional de apenas 0,20 centavos de real por hectare,
o que no final torna-se de menor monta, considerando a economia gerada pela antecipação na
produção de mudas.
Além dos benefícios para o hospedeiro, o emprego do “edafotipo” propagado em
substrato com adubo orgânico, melhorou a qualidade edáfica via maior deposição de
glomalina, favorecendo a agregação do solo.
Em síntese, o uso de adubos orgânicos favorece a produção de inóculo de FMA, que
tem a infectividade mantida após estocagem. Os fungos produzidos podem apresentar elevada
taxa de germinação e crescimento micelial assimbiótico, trazem mais benefícios para o
hospedeiro e produzem mais glomalina, quando comparados aos multiplicados em meio sem
fertilizantes orgânicos.
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
289
Perspectivas para trabalhos futuros
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
290
PERSPECTIVAS PARA TRABALHOS FUTUROS
A formulação de substratos para cultivo de FMA usando adubos orgânicos mostrou-se
alternativa promissora para produção de inoculante de FMA. No entanto, deve-se testar outros
meios (por exemplo, argila expandida + adubos orgânicos), visando reduzir a densidade do
veículo utilizado para propagação dos fungos. Como forma de reduzir os custos na aquisição
de inóculo micorrízico, incentiva-se a produção de inóculo na propriedade agrícola, sendo
sugerido o emprego de fertilizantes orgânicos para estimular a reprodução dos fungos.
Ensaios devem ser conduzidos para recomendação do uso de adubos orgânicos para produção
de inoculante em campo.
Buscam-se meios de propagação que favoreçam a reprodução e a manutenção da
infectividade dos FMA. No presente estudo, o uso de resíduos orgânicos favoreceu a
produção de inóculo, que se manteve infectivo após armazenamento por 120 dias; no entanto,
é necessário determinar se o potencial infectivo é alterado após longos períodos de
armazenamento (por exemplo, 24 meses).
O prejuízo do uso de alguns adubos orgânicos sobre a fase assimbiótica de Gigaspora
albida foi verificado, confirmando a necessidade de se determinar o efeito dessa prática
agrícola sobre as etapas assimbióticas de outras espécies de FMA. Do mesmo modo, a
influência da glomalina sobre a fase pré-simbiótica de G. albida, que foi estudada in vitro,
deve ser avaliada em outros FMA e em condições mais próximas daquelas em que os FMA
ocorrem.
Os esporos de G. albida, multiplicados em solo + 10% de composto orgânico,
formaram micélio com células auxiliares com morfologia diferenciada daquelas característica
do gênero. É necessário aprofundar os estudos para definir se as alterações observadas são
decorrentes de retardo no desenvolvimento dessas estruturas, ocasionado pela condição de
multiplicação ou se o meio de propagação além de interferir na fisiologia, afeta a morfologia
do micélio dessa espécie de FMA. Nesse caso, são necessárias avaliações do desenvolvimento
da fase assimbiótica de G. albida a partir de inóculo multiplicado sucessivamente em
substrato adubado.
O cultivo de FMA em substrato com adubos orgânicos permitiu a propagação de
fungos com fisiologia diferenciada daquele multiplicado apenas em solo. Entretanto, trata-se
do mesmo fungo cultivado em condições diferentes, sendo necessários ensaios de
compatibilidade vegetativa para definir se a propagação do fungo em condições edáficas
específicas permite a produção de isolados distintos.
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
291
A propagação de FMA em substratos com adubos orgânicos maximizou a eficiência
do fungo em promover o crescimento de mudas orgânicas de maracujazeiro-doce. Estudos da
eficiência desse inóculo na produção orgânica de outras fruteiras devem ser delineados. Além
disso, deve-se averiguar se a eficiência de FMA multiplicados em substrato adubado é
alterada quando os mesmos voltam a ser propagados em solo.
O uso de G. albida, produzido em substrato com adubo orgânico, na formação de
mudas de maracujazeiro-doce aumentou a produtividade e a qualidade de frutos no primeiro
ano da cultura (safrinha), sendo importante constatar se o benefício desse “edafotipo” é
mantido no 2º e 3º anos de produção desta fruteira.
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
292
Anexos
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
293
Silva, Fábio Sérgio Barbosa da
Fase assimbiótica, produção, infectividade e
efetividade de fungos micorrízicos arbusculares (FMA)
em substratos com adubos orgânicos / Fábio Sérgio
Barbosa da Silva. – Recife : O Autor, 2006.
291 folhas : il., fig., tab.
Tese (doutorado) – Universidade Federal de
Pernambuco. CCB. Ciências Biológicas. Biologia de
Fungos, 2006.
Inclui bibliografia e anexos.
1. Biologia de fungos – Micorrizas. 2. Micorriza
arbuscular – Adubação orgânica – Produção de
inóculo. 3. Qualidade do solo – Glomalina – Enzimas
do solo. 4. Maracujazeiro-doce – Eficiência
micorrízica – Produtividade. 5. FMA (Fungos
micorrízicos arbusculares) – Infectividade e
estocagem de inóculo – Germinação. I. Título.
582.281.2 CDU (2.ed.) UFPE
579.53 CDD (22.ed.) BC2006-583
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
294
ISSN 0102-3306 printed version
ISSN 1677-941X online version
INSTRUCTIONS TO AUTHORS
x Scope
x
Instructions to authors of papers to be submitted to
the Acta Botanica Brasilica
Scope
Acta Botanica Brasilica publishes original articles dealing
with all areas of basic and applied Botany, in Portuguese,
Spanish or English. The research should contemplate
theoretical aspects of the subject in question, and be based
on a central query that indicates originality and potential
interest, keeping in mind the broad spectrum of readers in
Brazil and elsewhere.
Instructions to authors of papers to be submitted to the Acta Botanica Brasilica
1. Acta Botanica Brasilica publishes original articles dealing
with all areas of basic and applied Botany, in Portuguese,
Spanish or English. The research should contemplate
theoretical aspects of the subject in question, and be based
on a central query that indicates originality and potential
interest, keeping in mind the broad spectrum of readers in
Brazil and elsewhere.
2. The articles should be concise with at the most 25 typed
pages (equivalent to 15 printed pages) including illustrations
and tables. Four copies of the paper should also be included
with the a 3.5’’ diskette, for revision by the Editorial board.
The format must be in Times New Roman, size 12, 1.5
spacing between lines on A4 sized paper, with all margins 1.5
cm, using the Word processing package Microsoft Word for
Windows, version 6 or above. All pages should be numbered
consecutively. Longer papers might be accepted but the
extra-cost should be sponsored by the authors.
3. Latin or Greek words in the title or text, such us in vivo, in
vitro, in loco, et al., should be in italics.
4. The title should be centralized and written with only the
first letter capitalized.
5. The names of the authors should have only the first letter
capitalized, below the title, and justified to the right.
References to footnotes should be in Arabic numerals, after
the authors’ names, indicating the complete address and data
and information about the work (part of a thesis etc.), where
necessary, after the title. The footnote should be separated
from the main text
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
295
by a horizontal line.
6. The manuscript format should contain:
- RESUMO and ABSTRACT: Use capitalized letters and bold
for these subtitles). It should occupy a single paragraph with
about 200 words, followed by up to five keywords besides the
title. It should be a concise summary in Portuguese, of the
objectives, material and methods, results and conclusions.
The same rules apply to the abstract, written in English and
followed by the keywords. The English abstract is obligatory
and should follow the same rules.
- Introduction: It should have only the first letter
capitalized, in bold, justified to the left and give a clear and
concise view of: a) revision of studies relevant to the
objective of the work; b) issues that lead the author to
conduct the research; c) objectives.
- Material and methods: Only the first letter in bold
justified to the left and should contain a brief description of
the work, enough to permit the research to be repeated, and
any techniques published should be cited and not described.
- Results and discussion: It should have the first letter only
capitalized, in bold, justified to the left and could contain
tables and figures (charts, photographs, drawings, maps and
illustrations) only when essentially needed to understand the
text. Depending on the work, results and discussion can be
joined or presented separately. Tables and Figures should be
numbered in independent series, in Arabic numerals placed at
the bottom right and should be presented on separate sheets
(one for each Table or Figure) at the end of the text (original
plus three copies). The Figures should be no more than twice
the size that in press. The area available for them, including
the legend is 17.5 cm wide and 23.5 cm high, with a scale
placed at the left side of the figure.
Numbers and letters should be sufficiently large to be easily
legible when reduced. Letters should be placed below and to
the right of the drawing.
Photographs should be on glossy black and white paper.
Color photos can be accepted by the Editorial Board but
the authors should sponsor the costs.
Tables and Figures must be referred to in the text in
abbreviated form (singular) with the initial letter in capital
(Fig., Tab.).
Abbreviations and symbols, when used for the first time,
should be proceeded by their meaning in full. E.g.:
Universidade Federal de Penambuco (UFPE); Microscopia
Eletrônica de Varredura (MEV). Measures should be
abbreviated and a space separates it from the number (eg.:
11 cm; 2,4 µm), except for percentage (e.g. 90%).
For taxonomic and flora work only the botanical vouchers
examined which are representative of the taxon in question
should be cited in the following order:
COUNTRY (capitalized and bold). State (bold): Municipality,
date (the month in roman numerals), phenology (where
possible), collector’s name and number (italics), and the
herbarium code. Eg: BRASIL. São
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
296
Paulo: Santo André, 3/XI/1997, fl. fr., Milanez 435 (SP).
In case of more than 3 collectors, cite the first followed by
et al. E.g.: Silva et al.
Character keys should be indented and the author’s name of
the taxa should not appear. The taxa in the keys when cited
in the text, should be numbered in alphabetic order. Example:
1. Terrestrial plants
2. Orbicular leaves, more than 10 cm diam.
………………………….……2. S. orbicularis
2. Sagittal leaves, less than 8 cm diam.
………………………………………..4. S. sagittalis
1. Aquatic plants
3. White flowers ………………………………………………………………1.
S. albincans
3. Red flowers…………………………………………………………………3. S.
purpurea
The taxonomic treatment should use italics and bold together
only for valid names. Basonymes and synonymes should be in
italics only. Authors of scientific names should be
abbreviated, according to the current taxonomic list of the
group (eg. Brummit & Powell 1992, for plant names).
1. Sepulveda albicans L., Sp. pl. 2: 25. 1753.
Pertencia albicans Sw., FI. bras. 4: 37, t. 23, f. 5. 1870.
Fig. 1-12
Subtitles within Materials and methods and Results should be
written with the initial letter in capital, followed by a dash and
the text in the same line. Eg. Study area - localized ....
Results and discussion should include the conclusions.
- Acknowledgements (with the initial letter in capital, bold,
and left justified): should be brief, with complete names.
- Bibliographic references
- Within the text: first author, then the date. eg. Silva (1997),
Silva & Santos (1997), Silva et al. (1997) or Silva (1993;
1995), Santos (1995; 1997) or (Silva 1975; Santos 1996;
Oliveira 1997).
- At the end of the article: the initial letter in capitals, and left
justified; in alphabetical and chronological order of the
authors; the names of journals and book titles should be
written in bold and in full. Examples:
Santos, J. 1995. Estudos anatômicos em Juncaceae. Pp. 5-22.
In: Anais do XXVIII Congresso Nacional de Botânica.
Aracaju 1992. São Paulo, HUCITEC Ed. v.I.
Santos, J.; Silva, A. & Oliveira, B. 1995. Notas palinológicas.
Amaranthaceae. Hoehnea 33(2): 38-45.
Silva, A. & Santos, J. 1997. Rubiaceae. Pp. 27-55. In: F.C.
Hoehne (ed.). Flora Brasilica. São Paulo, Secretaria da
Agricultura do Estado de São Paulo.
For more details consult the most recent issues of the
Silva, Fábio S. B. Fase assimbiótica, produção, infectividade...
297
journal or the internet link: www.botanica.org.br. and also
the on line articles in www.scielo.br/abb.
Abstracts of scientific meetings will not be accepted as
bibliographic references. Citations of dissertations and theses
should be avoided; when needed, they should be included in
the text. E.g. J. Santos, data not published or J. Santos,
personal communication.
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