( PDF ) Caracterização molecular de espécies de Candida isoladas de portadores de AIDS e de portadores de Câncer atendidos em Hospitais-Escola de Maceió, Alagoas

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MARIA ANILDA DOS SANTOS ARAÚJO

CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE ESPÉCIES DE

CANDIDA ISOLADAS DE PORTADORES DE AIDS E DE

PORTADORES DE CÂNCER ATENDIDOS EM

HOSPITAIS-ESCOLA DE MACEIÓ-ALAGOAS, BRASIL

RECIFE – PE

2006

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MARIA ANILDA DOS SANTOS ARAÚJO

CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE ESPÉCIES DE CANDIDA

ISOLADAS DE PORTADORES DE AIDS E DE PORTADORES DE

CÂNCER ATENDIDOS EM HOSPITAIS-ESCOLA DE MACEIÓ-

ALAGOAS, BRASIL

Tese de doutorado apresentada ao Programa

de Pós-Graduação em Biologia de Fungos do

Departamento de Micologia da Universidade

Federal de Pernambuco, como parte dos

requisitos para obtenção do título de Doutor.

ORIENTADORA:

Profª. Dra. Lusinete Aciole de Queiroz

Departamento de Micologia – CCB/UFPE

CO-ORIENTADOR:

Profº. Dr. Eurípedes Alves da Silva Filho

Setor de Genética, Biologia Celular e

Molecular do Instituto de Ciência Biológicas e

da Saúde – ICBS/UFAL

RECIFE – PE

2006

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Araújo, Maria Anilda dos Santos

Caracterização molecular de espécies de Candida isoladas

de portadores de AIDS e de portadores de Câncer atendidos

em Hospitais-Escola de Maceió, Alagoas / Maria Anilda dos

Santos Araújo. – Recife: O Autor, 2006.

115folhas: il., fig., tab.

Tese (Doutorado) - Universidade Federal de Pernambuco. CCB.

Pós-Graduação em Biologia de Fungos, 2006.

Inclui Bibliografia e anexos

1. Biologia de fungos – Micologia médica. 2. Leveduras -

Candida spp. – Isolamento e identificação. 3. Caracterização

molecular – Marcadores moleculares, ITS (Internal Space

Transcribe), Calb 1 e Calb 2, (GTG)

. 4. Pacientes portadores

de AIDS e de Câncer – Investigação de Candida spp. –

Secreção de orofaringe, sangue e urina. I. Título.

582.282. CDU (2.ed.) UFPE

579.562 CDD (22.ed.) BC2006-467

“Tudo que você pensa e acredita é realizável. Tudo o que uma pessoa pode

desejar, pode conseguir. Os seus pensamentos, portanto, fazem a sua vida”.

Lauro Trevisan

OFEREÇO

A Deus por ter me dado força e

coragem para não desanimar

diante dos obstáculos.

Aos meus pais, Conceição e

Anísio, por me incentivarem, por me

ajudarem nos momentos mais

difíceis, por serem exemplos na minha

vida, pela força, coragem e apoio

constantes.

O meu muito obrigada!

Amo vocês

DEDICO

Ao meu filho Maharishy, por não ter me esquecido quando precisei me

ausentar, pois a cada retorno demonstrava através de um sorriso, beijo e

abraço que estávamos cada dia mais juntinhos. Também ao meu esposo

Samarone por ter assumido as responsabilidades durante minha ausência,

por ter sido pai e mãe para nosso filho, por estarmos juntos em mais uma

caminhada, fortalecendo ainda mais nossa união.

AMO demais VOCÊS

AGRADECIMENTOS

À Universidade Federal de Pernambuco, através de Centro

Ciências Biológicas-CCB pela oportunidade de cursar esta Pós-Graduação e

aumentar meus conhecimentos;

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e

Tecnológico (CNPq), pela concessão de bolsa de estudo durante a realização

do Doutorado em Biologia de Fungos;

À Profª. Dra. Leonor Costa Maia por seu grande desempenho na

Coordenação da Pós-graduação em Biologia de Fungos e por seu apoio

durante todo o curso;

À Profª. Dra. Luzinete Aciole de Queiroz pela orientação,

ensinamentos e por ter acreditado em mim, pela amizade e carinho

demonstrados nos momentos mais difíceis;

Ao Prof. Dr. Euripedes Alves da Silva Filho pela co-orientação,

pela ajuda e incentivo de mudança do projeto, dando o suporte necessário para

concluir o trabalho e por ser um amigo imprescindível durante este percurso;

Ao Hospital Universitário Prof. Alberto Antunes e Hospital Escola

Dr. Hélvio Auto pelo acesso e colaboração de pessoal qualificado para

realização das coletas de amostras clínicas nos pacientes, como também a

todos os funcionários que auxiliaram de forma direta ou indireta para realização

deste trabalho;

Aos pacientes portadores de AIDS e portadores de Câncer que se

dispuseram em colaborar com esta pesquisa, permitindo que fossem coletadas

as amostras clinicas;

À Profª. Dra. Norma Suely Sobral da Silveira pela amizade,

incentivo constante, exemplo de profissionalismo e pela transmissão de

conhecimentos;

A professora Élica Amara Cecília Guedes por ter sido a pessoa

certa encontrada na hora certa, pela amizade desde quando eu era aluna de

Graduação do Curso de Biologia da UFAL e pela ajuda constante durante toda

a realização deste curso;

À Universidade Federal de Alagoas, Instituto de Ciências

Biológicas e da Saúde e Departamento de Botânica por ter cedido espaço

físico e alguns materiais para desenvolvimento deste trabalho de tese;

Às estagiarias Kátia Simone dos Santos, Geone Pimentel, Leide

Daiana P. Paiva, Paola Zucoli e Aryanna Kelly P. Souza pela ajuda durante a

realização das coletas;

À minha amiga Elvira Maria Bezerra de Alencar por sua sincera

amizade, garra, força, companheirismo e por seus conselhos valiosos;

À Bereneuza Valente Brasileiro pela grande ajuda durante a

realização deste trabalho, pela força e incentivo constantes;

Às Professoras Rejane Pereira Neves e Oliane Magalhães por

seu incentivo e ensinamentos;

Ao Prof. Dr. Marcos Morais pela permissão ao acesso no

Laboratório de Genética para realização de algumas atividades relacionadas a

tese;

Aos estagiários do Laboratório de genética: Alecsandra, Meiriana

e Rafael pela amizade, apoio e ajuda durante a realização das atividades de

biologia molecular;

Aos meus irmãos Anilson, Adjane e Adenilson pelo carinho e

sincera amizade;

A todos os professores do Departamento de Micologia pelos

ensinamentos;

E a todos que direta e indiretamente contribuíram para realização

deste trabalho o meu muito obrigado.

RESUMO

Foi realizada a caracterização molecular de espécies de Candida

isoladas de espécimens clínicos de pacientes portadores de AIDS e de

portadores de Câncer atendidos em Hospitais-Escola de Maceió-Alagoas;

também foi verificada a diversidade genética em níveis específicos e

intraespecífico das leveduras isoladas. Foram coletadas amostras de sangue,

secreção da orofaringe e urina de pacientes portadores de AIDS atendidos no

setor de Infectologia do Hospital Dia – HUPAA/UFAL e no Hospital Escola Dr.

Hélvio Auto, como também de pacientes portadores de câncer atendidos no

Setor de Oncologia do Hospital Universitário Prof. Alberto Antunes/UFAL,

sendo analisado 405 amostras clínicas. Após isolamento, as leveduras foram

purificadas e identificadas. Entre 135 pacientes analisados foi observada uma

ocorrência de 35% de isolados de leveduras, sendo a secreção de orofaringe o

espécimen clínico do qual houve prevalência (78%), seguido de urina (22%).

Entre as espécies de maior ocorrência está Candida albicans (63%), seguida

de C. glabrata (22%), C. guilliermondii (18%), C. parapsilosis (14%) e C.

tropicalis (8%). Posteriormente, foi realizada a caracterização molecular das

espécies de leveduras, pela análise dos produtos de PCR amplificados com

iniciador para a região ITS do rDNA, de ISSR (GTG)

e com iniciadores

espécie-espécificos CALB1 e CALB2 para C. albicans. Os marcadores

moleculares utilizados mostraram-se eficientes, reprodutíveis e auxiliaram na

identificação convencional constituindo-se em ferramentas apropriadas para

caracterização genética entre espécies de Candida.

Palavras chave: Candida spp, AIDS, Câncer, Caracterização molecular.

ABSTRACT

It was accomplished the molecular characterization of species of

Candida isolated from clinical specimens of patients bearers of AIDS and

Cancer assisted in School Hospitals of Maceió-Alagoas, It was also verified the

genetic diversity in specific and intraspecific levels of the isolated yeasts. It was

collected samples of blood, oropharygeal secretion and urine from patients

bearers of AIDS assisted in the infectology section of the Hospital Dia -

HUPAA/UFAL and in the Hospital Escola Dr. Hélvio Auto, as well as from

patients bearers of cancer assisted in the section of oncology of the Hospital

Universitário Dr. Alberto Antunes/UFAL, being analyzed 405 clinical samples.

After isolation, the yeasts were purified and identified. Among 135 patients

analyzed, it was observed an occurrence of 35% of isolated of yeasts, being the

oropharygeal secretion the clinical specimen which presented prevalence

(78%), followed by urine (22%). The Candida albicans is among the species of

larger occurrence (63%), followed by C. glabrata (22%), C. guilliermondii (18%),

C. parapsilosis (14%) and C. tropicalis (8%). Later, it was accomplished the

molecular characterization of the species, by the analysis of the products of

PCR amplified with initiator for the ITS area of the rDNA, of ISSR (GTG)5 and

with specific-species initiator CALB1 and CALB2 for C. albicans. The used

molecular markers were efficient, reproductive and they helped in the

conventional identification being constituted in appropriate tools for genetic

characterization among species of Candida.

Key Words: Candida spp, AIDS, Cancer, Molecular Characterization

SUMÁRIO

AGRADECIMENTOS

RESUMO

ABSTRACT

PÁGINAS

1. INTRODUÇÃO GERAL....................................................................... 13

1.1 Pacientes Imunocomprometidos........................................................

1.2 AIDS...................................................................................................

1.3 Câncer……………………………………………………………………..

1.4 Leveduras..........................................................................................

1.5 Identificação de Leveduras................................................................

1.6 Caracterização molecular..................................................................

2. MATERIAL E MÉTODOS.................................................................... 26

2.1. Pacientes..........................................................................................

2.2. Coleta de Espécimens Clínicos........................................................

2.3. Processamento das Amostras Clínicas............................................

2.3.1. Exame Direto.................................................................................

2.3.2. Obtenção de Cultura......................................................................

2.3.3. Purificação e Identificação.............................................................

2.4. Análise Molecular das Amostras de Leveduras................................

2.4.1. Obtenção de Massa Celular...........................................................

2.4.2. Extração do DNA Nuclear..............................................................

2.4.3. Quantificação do DNA....................................................................

2.4.4. Amplificação do DNA ....................................................................

2.4.5. Região ITS do DNA Ribossomal....................................................

2.4.6. ISSR - Inter Simple Sequence Repeats.........................................

2.4.7. Amplificação com Iniciadores CALB 1 e CALB 2...........................

2.4.8. Análise Estatística..........................................................................

3. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................... 32

4. ARTIGO............................................................................................... 41

4.1 CANDIDA SPP ISOLADAS DE SECREÇÃO DA OROFARINGE

DE PACIENTES PORTADORES DE AIDS ANTENDIDOS EM

HOSPITAIS-ESCOLA DE MACEIÓ, ALAGOAS, BRASIL.....................

4.2 ESPÉCIES DE CANDIDA ISOLADAS DE PACIENTES

PORTADORES DE CÂNCER ATENDIDOS NO HOSPITAL

UNIVERSITÁRIO DE MACEIÓ, ALAGOAS, BRASIL............................

4.3 IDENTIFICAÇÃO POR PCR DE ESPÉCIES DE CANDIDA

ISOLADAS DE PORTADORES DE AIDS E DE PORTADORES DE

CÂNCER ATENDIDOS EM HOSPITAIS-ESCOLA DE MACEIÓ,

ALAGOAS, BRASIL................................................................................

5. CONCLUSÕES GERAIS..................................................................... 105

6. ANEXOS.............................................................................................. 106

6.1. Ficha do Paciente.............................................................................

106

6.2. Termo de Consentimento Livre e Esclarecido..................................

108

6.3. Registro no Comitê de Ética.............................................................

110

6.4. Instruções para Redação de Artigos.................................................

111

ARAÚJO, M. A. S. Caracterização molecular de espécies de Candida... 2006

1. INTRODUÇÃO GERAL

1.1 Pacientes Imunocomprometidos

Pacientes imunocomprometidos são susceptíveis a diversas

infecções; entretanto, os fungos causadores de micoses, raramente provocam

infecções sistêmicas em indivíduos imunocompetentes. A detecção de

estruturas fúngicas em qualquer parte do organismo revela grande potencial

patológico, uma vez que a colonização pode preceder à micose invasiva

(LACAZ; MACHADO, 2000).

As infecções fúngicas tornam-se cada vez mais freqüentes e

surgem como um problema particularmente significativo em pacientes

imunocomprometidos. Diversos fungos, presentes no meio ambiente ou

integrante da microbiota própria do homem, podem em determinadas

oportunidades passar de sapróbios a patogênicos, provocando quadros clínicos

variáveis, desde processos febris benignos, a fungemias, algumas vezes fatais,

se não forem diagnosticadas e tratadas precocemente (LACAZ et al., 2002).

Entre as principais infecções fúngicas oportunistas que ocorrem

em pacientes imunocomprometidos estão incluídas candidíase, criptococose,

histoplasmose, aspergilose, paracoccidioimicose, entre outras (LACAZ;

MACHADO, 2000; PORRO; YOSHIOKA, 2000). O principal motivo pelo qual os

fungos invadem os tecidos humanos está na incapacidade imunológica do

hospedeiro em vencer a invasão do fungo (BRANCHINI, 2002; AZULAY et al.,

1989).

Na determinação de fatores predisponentes que indiquem a

instalação de doenças fúngicas em pacientes imunocomprometidos, são

considerados fatores importantes à terapia das doenças adjacentes resultando

na disfunção do sistema imunológico desses indivíduos (RAJENDRAN et al.,

1992; SIDRIM; ROCHA, 2004). A administração de antibióticos de amplo

espectro, a utilização de cateteres intravenosos, o uso de nutrição parenteral, a

neutropenia, a permanência em unidades de terapia intensiva e as

intervenções cirúrgicas são outros fatores predisponentes que freqüentemente

se associam a um processo infeccioso (OLIVEIRA, 1997; HOOVER et al.,

1997).

ARAÚJO, M. A. S. Caracterização molecular de espécies de Candida... 2006

1.2 AIDS

O Vírus da Imunodeficiência Adquirida - HIV é um retrovírus com

genoma de RNA, da família Retroviridae (retrovírus) e subfamília Lentivirinae.

Pertence ao grupo dos vírus citopáticos e não-oncogênicos que se

caracterizam por possuir uma enzima denominada transcriptase reversa,

responsável pela transcrição do RNA viral para uma cópia de DNA, que

poderá, então integrar-se ao genoma do hospedeiro (TORTORA et al., 2005).

Este vírus é caracterizado por produzir alterações nos

mecanismos de defesa da imunidade (DOLANDE et al., 2002), que no estágio

avançado da infecção leva a Síndrome de Imunodeficiência Adquirida (AIDS);

porém o paciente HIV-positivo só é considerado acometido por AIDS quando

apresenta contagem CD4+ abaixo de 350céls/mm

(EYESSON et al., 2002),

quando a carga viral apresenta-se acima de 10.000 cópias de RNA viral/mL

(MATTOS et al. 2004) e se estiverem classificados no grupo IV, segundo a

classificação do Center Disease Control – CDC, ou se somarem 10 pontos no

critério de pontuação da Organização Panamericana de Saúde – OPAS e da

Organização Mundial de Saúde (BRASIL, 2004).

A AIDS no Brasil foi identificada em 1980, a qual se manteve

restrita em São Paulo e Rio de Janeiro. Em 1985, observaram-se casos por

todo país, sendo que até junho de 2005 foram notificados 371.827 casos de

AIDS, destes 251.851 homens e 118.842 mulheres. Na região Nordeste foi

registrado 38.837 casos para o total de casos de AIDS no Brasil desde o início

da epidemia; no estado de Alagoas em 2005 foram notificados 64 novos casos,

totalizando 1.968 casos no Estado (BRASIL, 2005).

A síndrome da imunodeficiência adquirida - AIDS apresenta-se

como uma das principais causas de morte prematura, constituindo desta forma

um importante problema de saúde pública. A mortalidade de pacientes com

AIDS está em grande parte relacionada a infecções oportunistas graves

(SANTO et al., 2000).

Em relação às doenças associadas a AIDS que demonstram

condições marcadoras da progressão clínica, podemos destacar: 1. Sarcoma

de Kaposi; 2. Tuberculose; 3. Candidíase; 4. Herpes zoster ou simples; 5.

ARAÚJO, M. A. S. Caracterização molecular de espécies de Candida... 2006

Criptococose extra-pulmonar; 6. Pneumonia por Pneumocystis carinii; 7.

Toxoplasmose cerebral; 8. Infecções por Criptosporidium (GUIMARÃES, 2000).

Associação entre candidíase bucal e AIDS tem sido considerada

como um dos sinais iniciais da infecção pelo vírus HIV. Na infecção por este

vírus ocorrem alterações em glândulas salivares, no número de proteínas

antimicrobianas e de determinados eletrólitos na saliva. Infecções severas por

Candida foram correlacionadas com deficiências do sistema imune,

particularmente das células T, observadas na infecção pelo HIV (WRAY et al.,

1990; PHILIP et al., 1991).

A terapia de doenças causadas pelo vírus da imunodeficiência

adquirida é principalmente direcionada para a inibição específica da replicação

desses microorganismos retardando a progressão da imunodeficiência e/ou

restaurando a imunidade, melhorando a qualidade e aumentando o tempo de

vida dos infectados. A introdução da terapia anti-retoviral potente, é composta

por três ou mais drogas combinadas, em substituição à monoterapia, constitui

um grande avanço na luta contra a infecção pelo HIV (MATTOS et al., 2004).

1.3 Câncer

Câncer é o nome dado a um conjunto de mais de 100 doenças

que têm em comum o crescimento desordenado (maligno) de células que

invadem os tecidos e órgãos, podendo causar metástase para outras regiões

do corpo. Dividindo-se rapidamente, estas células tendem a ser muito

agressivas e incontroláveis, determinando a formação de tumores (acúmulo de

células cancerosas) ou neoplasias malignas (BRASIL, 2005).

Indubitavelmente o câncer é um problema de saúde pública no

Brasil, constituindo a segunda causa de morte por doença no país. Nas últimas

décadas, o registro de câncer no Brasil, tem mostrado crescentes os casos

desta patologia, ressaltando a importância da doença e seu impacto social e

econômico (BITTENCOURT et al., 2004).

Em relação a ocorrência de infecções fúngicas em portadores de

câncer, podemos destacar os pacientes que apresentam leucemia, linfomas e

tumores sólidos, sendo a candidíase e aspergilose as micoses mais

comumente diagnosticadas (BODEY et al., 1992). Outro fator importante em

ARAÚJO, M. A. S. Caracterização molecular de espécies de Candida... 2006

pacientes leucêmicos, é a deficiência na integridade de barreira anatômica da

pele e de membranas mucosas, na imunidade celular específica dos linfócitos

T e inespecífica dos fagócitos que predispõem de maneira significante estes

pacientes (LACAZ; MACHADO, 2000).

A granulocitopenia severa e prolongada é o fator mais importante

para o desenvolvimento de infecção fúngica disseminada em pacientes com

neoplasias malignas. Adicionalmente, a emergência dessas infecções tem sido

associada à utilização de novos regimes de antibióticos empíricos, durante

episódio de prolongada granulocitopenia, secundariamente ao tratamento

quimioterápico mais intensivo (NUCCI et al., 1995; NUCCI et al., 1998). Os

fungos mais comumente relacionados com infecção em pacientes com câncer

pertencem aos gêneros Candida, Aspergillus, Mucor, Cryptococcus e,

ocasionalmente, Histoplasma, Trichosporon, Fusarium e Pneumocystis

(OLIVEIRA, 1997).

Alterações como líquen plano, leucoplasias e hiperqueratoses

podem favorecer o estabelecimento de Candida. Isto se dá principalmente pela

retenção prolongada de células epiteliais, alterações moleculares e aumento da

quantidade de queratina (KROGH, 1987; OKSALA, 1990; FOTOS et al., 1992).

As infecções por Candida estão associadas a displasias epiteliais moderadas,

glossite romboidal mediana e papilomas. Espécies do gênero Candida parecem

ter a capacidade de induzir displasias em hiperplasias benignas, de agravar a

severidade de displasias epiteliais, e mesmo promover alterações malignas em

casos de displasias epiteliais (BARRET et al., 1998). Existem relatos do

desenvolvimento de carcinomas “in situ” e carcinomas invasivos em sítios de

infecção crônica por Candida (PEDERSEN et al., 1989).

1.4 Leveduras

Cerca de 56 gêneros e de 500 espécies de Candida já foram

isoladas e um crescente número vem sendo relatado. Na cavidade bucal já

foram isolados 25 gêneros e 167 espécies, no entanto são considerados

patogênicos ao homem 10 gêneros e 40 espécies (STENDERUP, 1990;

LYNCH, 1994). As leveduras mais comuns na cavidade bucal e em outras

superfícies mucosas são espécies do gênero Candida, que compreende cerca

ARAÚJO, M. A. S. Caracterização molecular de espécies de Candida... 2006

de 200 espécies distribuídas na natureza, todas assexuadas e dimórficas, das

quais algumas espécies podem viver como sapróbios comensais ou parasitas

no homem (KREGER-van RIJ, 1984; FOTOS et al., 1991; BARNETT et al.,

2002).

A candidíase é a mais freqüente infecção fúngica oportunista.

Durante muito tempo, acreditava-se que apenas a Candida albicans era capaz

de causar doença no homem. Atualmente, sabe-se que, diferentes espécies

de Candida são capazes em condições especiais do hospedeiro, de causar

diversos tipos de quadro clínicos (SIDRIM; ROCHA, 2004; VIDOTTO, 2004).

Diversas são as espécies de Candida que podem viver como

sapróbias comensais ou parasitas patogênicos nos seres humanos. Entre elas

podemos destacar C. albicans, C. catenulada, C. dattila, C. famata, C. glabrata,

C. guilliermondii, C. inconspicua, C. kefyr, C. krusei, C. lusitanae, C.

parapsilosis, C. pulcherrima, C. stelatoidea, C. viswanathii, C. tropicalis e C.

zeylanoides (LACAZ et al. 2002; HOOG et al. 2000; VIDOTO, 2004).

Espécies do gênero Candida têm sido isoladas de vários sítios do

corpo humano, como boca, pele, vagina e ânus (VIDOTTO, 2004). Podendo

ser encontradas em todos os tecidos, à exceção dos cabelos, e especialmente

no trato gastrointestinal, e são eliminadas através das fezes, urina e secreções

brônquicas (BERGENDAL et al., 1979; LYNCH, 1994). Na cavidade bucal são

encontradas principalmente no dorso da língua, onde as papilas filiformes e

reentrâncias, como o forame cego e fissura mediana, servem de sítios que

fornecem proteção e meio ambiente favorável para o desenvolvimento de

infecção. Além do dorso da língua, Candida pode ser encontrada em outros

sítios da cavidade bucal, como palato duro e mucosa jugal (ARENDORF;

WALKER, 1980).

C. albicans é a espécie mais comum constituindo 60 a 90% dos

isolados da cavidade bucal, sendo isolada de crianças e adultos saudáveis e

dos portadores de candidíase, incluindo usuários de próteses dentárias,

indivíduos HIV positivos, pacientes submetidos a radioterapia e portadores de

doenças que afetam as glândulas salivares, como a síndrome de Sjögren

(KOGA-ITO, 1997; KINDELAN et al., 1998).

A virulência da C. albicans está associada principalmente com

sua capacidade de aderência às células epiteliais. Isto se dá principalmente

ARAÚJO, M. A. S. Caracterização molecular de espécies de Candida... 2006

pela interação das adesinas dos microrganismos e receptores das células

epiteliais. A aderência é necessária para a colonização inicial e contribui para a

persistência da levedura no hospedeiro. Sem adesão, a taxa de crescimento do

fungo é insuficiente para mantê-lo na boca ou trato gastrointestinal. Esta

aderência pode ser mediada e facilitada por xerostomia, carboidratos,

receptores epiteliais, fibronectinas, tipos específicos de queratina ou mesmo

bactérias (FOTOS et al., 1991; JORGE et al., 1993).

C. albicans possui maior capacidade de aderência às células

epiteliais e a outras superfícies, o que pode estar relacionado com sua maior

patogenicidade, quando comparada as outras espécies de Candida (PIRES et

al. 2001). Outro fator associado a maior capacidade de causar infecção pode

ser sua alta diversidade genética (SANGEORZAN et al., 1994). Esta espécie

pode formar tubo germinativo o que lhe propicia o aumento da capacidade

invasiva as células do hospedeiro (KIMURA; PEARSAL, 1980). Esta espécie é

produtora de numerosas enzimas, entre elas fosfolipase, lipase,

fosfomonoesterase, hexosaminidases e pelo menos três proteinases aspárticas

(KWON-CHUNG; BENNETT, 1992). Estas enzimas favorecem sua implantação

no tecido e amostras com atividade fosfolipásica aumentada aderem-se mais

fortemente às células epiteliais bucais, aumentando sua patogenicidade

(BARRET-BEE et al., 1985).

A espécie C. tropicalis possui considerável potencial biológico

como agente oportunista principalmente quando o hospedeiro encontra-se

neutropênico, diante da supressão da microbiota bacteriana pelo uso de

antibióticos ou quando ocorrem danos na mucosa gastrointestinal. Esta espécie

tem sido relatada como o segundo ou terceiro agente etiológico mais comum

de candidíase em pacientes com neoplasias, sendo sua freqüência maior em

pacientes com leucemias e menor em pacientes com tumores sólidos. As

espécies C. glabrata e C. parapsilosis surgem como importantes patógenos

hospitalares constituem-se na segunda ou terceira espécie mais comum na

maioria das candidíases relatadas. Maior ocorrência de C. glabrata tem sido

observada em pacientes idosos, enquanto C. parapsilosis é mais freqüente em

crianças e recém nascidos prematuros. As infecções invasivas por C.

guilliermondii são raras; esta espécie é considerada agente emergente e as

ARAÚJO, M. A. S. Caracterização molecular de espécies de Candida... 2006

infecções, na maioria dos casos, são descritas em pacientes com câncer

(COLOMBO; GUIMARÃES, 2003).

A imunidade contra Candida é dada pela imunidade secretora nas

mucosas caracterizada pelas imunoglobulinas secretadas na saliva, associada

a imunidade celular quando o microrganismo invade o tecido, através da

possível ação das células de Langerhans, células T supressoras, macrófagos e

neutrófilos (CHALLACOMBE, 1994).

A transformação de espécies de Candida do estado comensal

para o estado parasitário deve-se a fatores microbianos, ambientais e

individuais. Algumas condições e fatores têm sido relacionados à passagem da

forma comensal para quadros de candidíase, no entanto mesmo altas

contagens de Candida não indicam necessariamente sinais clínicos de

candidíase (STENDERUP, 1990).

Quanto aos fatores relacionados ao hospedeiro que predispõem o

desenvolvimento de candidíases, podemos destacar quadros de

imunossupressão, desordens endócrinas, períodos de convalescência e

hospitalização, deficiências nutricionais de ferro e vitaminas, terapia com

drogas imunossupressoras, doenças malignas, caquexia, alterações hormonais

como gravidez e menopausa, uso de anticoncepcionais, disfunções

leucocitárias e doenças mieloproliferativas (SARAMANAYAKE et al., 1986;

HEIMDAHL; NORD, 1990; OKSALA, 1990; WAHLIN, 1991; UMAZUME et al.,

1995; WILSON, 1998). Desordens endócrinas como diabetes mellitus,

hipoadrenalismo, hiperparatireoidismo, hipotireoidismo e hipoadrenocorticismo

parecem estar associadas com o aumento da candidíase (DOROCKA-

BOBKOWSKA et al., 1996; SPOLIDORIO et al., 2001).

Quadros de imunossupressão quer sejam relacionados a

desordens sistêmicas como AIDS e doenças mieloproliferativas, ou em

respostas à quimioterapia, têm sido relacionadas a maior susceptibilidade à

candidíase e infecções por espécies usualmente não encontradas em

pacientes saudáveis (FRANKER et al., 1990; BUNETEL; BONNAURE-

MALLET, 1996; TEANPAISAN; NITTAYANANTA, 1998). A prevalência de

lesões por leveduras em pacientes HIV-positivos varia de 50 a 90% e o número

de portadores de Candida chega a 94% (GREENSPAN, 1994; TEANPAISAN;

NITTAYANANTA, 1998). O diagnóstico da candidíase bucal depende das

ARAÚJO, M. A. S. Caracterização molecular de espécies de Candida... 2006

características clínicas e da evolução, associados à evidenciação das

leveduras ou pseudohifas em esfregaços, citologia e cortes histológicos

corados com ácido periódico-Schiff (PAS), Grocott, Gram, imunofluorescência,

cultura de Candida a partir de amostras de saliva, impressão da mucosa,

titulação de anticorpos anti-Candida salivares, hibridização “in situ” e sondas de

DNA (BUDTZ-JÖRGENSEN, 1990; OLSEN; STENDERUP, 1990; REICHL,

1990; AGUIRRE et al., 1996).

O tratamento da candidíase depende de fatores como: tipo de

candidíase, condições gerais do paciente, fatores predisponentes envolvidos e

severidade das manifestações clínicas, sendo escolhido de acordo com o

agente, forma de administração e a duração da terapia (EPSTEIN, 1990;

ZEGARELLI, 1993; GREENSPAN, 1994).

1.5 Identificação de Leveduras

Leveduras são fungos unicelulares usualmente arredondados que

se reproduzem por brotamento, originando blastosporos. Algumas leveduras

transformam-se em um estágio micelial sob certas condições ambientais,

enquanto outras permanecem sempre unicelulares. As leveduras perfeitas são

incluídas na classe Hemiascomycetes, ordem Endomycetales, e as leveduras

imperfeitas na classe Blastomycetes, família Cryptococcaceae, sendo algumas

destas patogênicas ao homem (LODDER, 1970; LACAZ et al. 2002).

A propriedade de assimilar vários açúcares tem sido usada para

diferenciar espécies. Essa característica está estreitamente relacionada com a

fermentação de açúcares, tendo em vista que todos os açúcares fermentáveis

são também assimilados, porém, o inverso não ocorre (KREGER-van RIJ,

1984).

As leveduras podem utilizar vários carboidratos nas provas de

fermentação. Os compostos mais comumente usados são: glicose, galactose,

sacarose, maltose, lactose, rafinose, trealose, melicitose, arabinose, frutose,

xilose, melibiose, amido, inulina, dextrina e glicogênio (HOOG et al, 2000;

LACAZ et al., 2002).

A formação de clamidosporo, usualmente é uma das

características utilizadas na identificação de espécie, sendo o primeiro relato

ARAÚJO, M. A. S. Caracterização molecular de espécies de Candida... 2006

desta estrutura realizado por Benham (1931) utilizando ágar “corn meal”. A

distribuição das espécies de Candida é muito ampla, tanto no meio ambiente,

quanto fazendo parte da microbiota normal do homem (VIDOTTO, 2004). O

gênero Candida apresenta células variando quanto a forma, em globosa,

ovóide, cilíndrica a alongada; reproduzem-se por brotamento multilateral, o

pseudomicélio pode ser bem desenvolvido, rudimentar ou ausente; o micélio

verdadeiro e os clamidosporos podem estar presentes em algumas espécies

(LODDER, 1970; KREGER-van RIJ, 1984; BARNETT et al., 1990).

NAZZAL et al. (2005) destacam a importância da PCR como uma

ferramenta para identificação de espécies de Candida direto da amostra clínica,

por se tratar de um método rápido usando seqüências de oligonucleotideos

espécie-específicos.

1.6 Caracterização molecular

Os métodos tradicionalmente utilizados na identificação de

leveduras baseiam-se em critérios morfológicos, reprodutivos, fisiológicos e

bioquímicos adequados à identificação em nível de espécie, entretanto estão

sendo utilizadas técnicas moleculares para auxiliar à identificação tradicional e

para estudar a filogenia de muitos fungos. Entre essas técnicas, a de

amplificação das regiões ITS (Espaço Interno Transcrito) do rDNA, permite a

análise de variação de diferentes níveis taxonômicos, possibilitando discriminar

espécies ou variedades de uma mesma espécie. O polimorfismo destas

regiões mostrou ser uma excelente ferramenta de discriminação intraespecífica

para leveduras (FUNGARO, 1995; GRATTAPAGLIA; FERREIRA, 1995;

BRASILEIRO, 2003; SILVA-FILHO, 2003; SILVEIRA, 2004).

A reação em cadeia da DNA polimerase (PCR) é uma técnica que

resulta na amplificação seletiva in vitro de uma determinada seqüência da

molécula de DNA, a partir da utilização da enzima DNA polimerase termo

resistente e componentes como desoxirribonucleotídeos trifosfatados (dNTPs)

e oligonucleotídeos iniciadores. Estes iniciadores hibridizam com a região

complementar do DNA alvo para produzir bilhões de cópias dessa seqüência

em poucas horas. A desnaturação da dupla hélice do DNA, o emparelhamento

dos iniciadores com a seqüência alvo pela redução da temperatura da mistura,

ARAÚJO, M. A. S. Caracterização molecular de espécies de Candida... 2006

e a extensão dos iniciadores pela DNA polimerase, se processam

automaticamente em um equipamento chamado termociclador (NEWTON;

GRAHAN, 1997).

A técnica de PCR pode ser aplicada a qualquer situação que

necessite da amplificação de regiões de DNA, e tem sido largamente

empregada no melhoramento vegetal e animal, tipagens de microrganismos de

interesse médico e industrial, diagnóstico de vários tipos de cânceres, e em

estudos de genética forense (SAIKI et al.,1998).

Devido à sua especificidade e sensibilidade, a PCR é um método

importante para a identificação de fungos. Existem vários exemplos de testes

baseados em PCR desenvolvidos para a detecção de fungos em patologia

médica, em plantas e em alimentos. A PCR pode ser utilizada para detectar

grupos de linhagens, patótipos, espécies ou taxa superiores. Esta técnica

fornece uma rápida, simples e confiável alternativa aos métodos de

identificação convencional de fungos isolados da amostra clínica, o que

permitirá o diagnóstico das infecções micóticas (GOTTFREDSSON et al, 1998;

MITCHELL et al, 1994; REISS et al, 1998; SULLIVAN et al, 1996; WALSH;

CLANOCK, 1998).

Na espécie C. albicans, como na maioria dos eucariontes, três

diferentes genes do rDNA (5.8S, 18S e 26S) aparecem agrupados em blocos

repetidos em dezenas de cópias do genoma. Estes genes são separados por

regiões não codificantes denominadas ITS1 e ITS2, as quais são transcritas e

removidas após o processamento do transcrito primário para dar origem ao

RNA ribossômico maduro. O fato de este agrupamento gênico apresentar

algumas regiões altamente conservadas e outras variáveis tem permitido a

análise de variação de diferentes níveis taxonômicos (Figura 1) (WHITE et al.,

1990).

ARAÚJO, M. A. S. Caracterização molecular de espécies de Candida... 2006

18S 5.8S 26S 5S 18S

ITS1 ITS2 IGS1 IGS2

ITS5

ITS4

JV52

JV51

18S

5.8S

26S

18S

ITS1 ITS2 IGS1 IGS2

VARIAÇÃO INTERESPECÍFICA VARIAÇÃO INTRAESPECÍFICA

DNA RIBOSSOMALDNA RIBOSSOMAL

ITS4

JV52

JV51

FIGURA 1. Agrupamento gênico do DNA ribossomal com a representação da

região ITS (ITS1-5.8S-ITS2) flanqueada pelos iniciadores universais ITS4 e

ITS5 (FUNGARO, 2000).

A região 18S, por exemplo, é a mais conservada e por isso é

utilizada apenas para comparação de organismos distantemente relacionados.

Porções do gene 26S são bastante variáveis e, portanto, apropriadas para

comparação de diferentes gêneros ou, em alguns casos de diferentes

espécies. Já as regiões ITS evoluem rapidamente e, então, são apropriadas

para discriminar espécies relacionadas ou até mesmo variedades de uma

mesma espécie. O fato das regiões ITS serem flanqueadas por segmentos

conservados e relativamente curtos entre 400 à 1000pb, e ainda por

aparecerem em grande número de cópias no genoma, permitem que sejam

amplificadas e seqüenciadas com facilidade. Como conseqüência, é grande o

número de seqüências ITS de diferentes fungos que estão atualmente

disponíveis nos bancos de dados de seqüência de nucleotídeos (ESTEVE –

ZARZOSO et al., 1999).

As seqüências de DNA que são polimórficas, ou seja,

freqüentemente variáveis entre espécies de fungos, tais como as seqüências

ITS, são selecionadas para detecção de uma espécie e exclusão de todas as

demais. Por exemplo, diferenças na região ITS têm sido usadas para

desenvolver testes baseados em PCR, para a identificação de fungos

causadores de micoses na espécie humana, toxinas em amostras de

ARAÚJO, M. A. S. Caracterização molecular de espécies de Candida... 2006

alimentos, bem como patógenos de plantas, sem o prévio isolamento do fungo.

Devido as seqüências de rDNA estarem presentes em grande número de

cópias no genoma, pode-se obter uma alta sensibilidade no diagnóstico via

PCR (CHEN et al., 2001).

Baseando–se no princípio da PCR, WILLIAMS et al. (1990) e

WELSH e MC CLELLAND (1990) descreveram uma classe de marcadores

moleculares, que amplificam regiões anônimas dispersas pelo genoma. Esta

variação da técnica da PCR foi chamada de análise do Polimorfismo de DNA

amplificado ao acaso (Random Amplified Polymorphic - RAPD). Nesta técnica,

não se escolhe a priori a região a ser amplificada. Ao contrário disso, utilizam-

se iniciadores de seqüências arbitrárias de bases e analisam-se os produtos

amplificados. A amplificação ocorrerá quando a seqüência do iniciador

reconhecer um sítio de homologia em uma das fitas e também reconhecer o

mesmo sítio, porém com orientação invertida, na outra fita da molécula de

DNA, dentro do intervalo limite da PCR. Os iniciadores são utilizados, um a um,

para detectar diferenças entre os genótipos. A concentração de DNA genômico

é a variável mais importante a ser padronizada, pois o excesso de DNA pode

reduzir ou inibir significativamente a atividade de polimerização da enzima taq

DNA polimerase devido a altas concentrações de impurezas, resultando na

ausência de amplificações. Por outro lado, o DNA em concentração muito baixa

pode dar origem a padrões de amplificação não reprodutíveis, podendo ocorrer

acréscimo ou diminuição de fragmentos amplificados, mesmo entre repetições.

Em fungos, cada iniciador de RAPD gera em média 10 segmentos amplificados

com peso molecular variando de 300 a 2500 pb. Ao serem totalizados os

fragmentos obtidos com os diferentes iniciadores, tem-se desta forma um

grande número de locos a serem analisados. A presença de um fragmento

amplificado em alguns dos genótipos comparando com a ausência desse

mesmo fragmento em outros genótipos caracteriza o que se denomina de

polimorfismo de RAPD (FUNGARO, 2000).

Microssatélites são seqüências curtas de até seis nucleotídeos

repetidas em bloco encontradas no genoma de vários organismos. Estudos têm

demonstrado que estas seqüências são relativamente instáveis, sofrendo

deleções e adições de unidade de repetição em Saccharomyces cerevisiae,

ARAÚJO, M. A. S. Caracterização molecular de espécies de Candida... 2006

Escherichia coli e em mamíferos (FIELD; WILLS, 1998). Este marcador

molecular pode ser utilizado na própria seqüência microssatélite como iniciador

de amplificação do DNA, sendo este método denominado de amplificação de

seqüências simples entre repetições de DNA (Inter Simple Sequence Repeats -

ISSR). O polimorfismo destas regiões entre repetições mostrou ser uma

excelente ferramenta de discriminação intraespecífica, tanto para isolados de

Cryptococcus neoformans (MEYER; MITCHELL, 1995), como para isolados de

S. cerevisiae industriais usando o trinucleotiídeo (GTG)

(SILVA-FILHO et al.

2005).

A utilização de microssatélites em espécies de Candida para

estudos epidemiológicos, tem demonstrado que estes marcadores funcionam

como excelentes ferramentas para determinação intraespecífica e

interespecífica, principalmente permitindo identificar diferentes padrões dentro

da mesma espécie (FIELD et al. 1996; DALLE et al. 2000; BOTTEREL et al.

2001; SHEMER et al. 2001).

As leveduras constituem um grupo numeroso, diversificado de

grande importância econômica. A identificação destes microrganismos é

baseada em características fenotípicas, incluindo morfologia de células e

provas bioquímicas. Entretanto, a reprodutividade dessas técnicas são

afetadas por fatores ambientais que influenciam nas características fisiológicas

destes organismos impossibilitando a discriminação intraespecifica. Diversas

técnicas moleculares baseadas na análise dos fragmentos das moléculas dos

ácidos nucléicos estão sendo cada vez mais utilizadas, como método

alternativo para auxiliar e resolver problemas de identificação destes

microrganismos. Estas técnicas moleculares têm proporcionado para a

micologia um grande potencial de riqueza de caracteres, pois elas analisam o

genoma independentemente do estado fisiológico da célula e são sensíveis

para distinguir espécies estritamente relacionadas, além de possibilitar uma

análise da variabilidade individual e/ou populacional destes fungos,

contribuindo desta forma no estudo sistemático e epidemiológico de

distribuição de variantes em diferentes regiões geográficas (FUNGARO, 2000;

BRASILEIRO et al., 2004).

ARAÚJO, M. A. S. Caracterização molecular de espécies de Candida... 2006

2. MATERIAL E MÉTODOS

2.1 PACIENTES

Foram analisados espécimens clínicos de 135 pacientes

atendidos em ambulatório. Entre 100 pacientes portadores de AIDS, 50 foram

atendidos no Setor de Infectologia do Hospital Dia – Hospital Universitário Prof.

Alberto Antunes - HUPAA/UFAL e 50 no ambulatório de Hospital-Escola Dr.

Hélvio Auto/UNCISAL; 35 pacientes portadores de Câncer foram atendidos no

Setor de Oncologia do Hospital Universitário Dr. Alberto Antunes - HUPAA

/UFAL, entre estes pacientes haviam portadores de câncer de mama,

melanoma e útero, ambos em Maceió, Alagoas.

2.2 COLETA DE ESPÉCIMENS CLÍNICOS

De cada paciente foi coletada uma amostra de secreção da

orofaringe, sangue e urina, totalizando 405 amostras clínicas. Para a coleta de

secreção de orofaringe foram utilizados swabs esterilizados, os quais foram

umedecidos em água destilada esterilizada adicionada de cloranfenicol na

concentração de 50mg/L e em seguida acondicionados no mesmo tubo

contendo água mais antibiótico. Com o auxílio de seringa descartável foram

coletados 5mL de sangue e transferidos para tubos tipo Vacuntanier contendo

EDTA como anticoagulante. Após as instruções devidas a urina foi coletada

pelo próprio paciente. Os recipientes contendo as amostras clínicas foram

encaminhados ao Laboratório de Micologia do Instituto de Ciências Biológicas

e da Saúde-ICBS/UFAL para realização de exame direto e cultura.

2.3 PROCESSAMENTO DAS AMOSTRAS CLÍNICAS

2.3.1 Exame Direto

Para detecção de estruturas fúngicas através do exame direto as

amostras dos diferentes espécimens clínicos foram processadas a fresco e

clarificadas com solução aquosa a 30% de hidróxido de potássio.

ARAÚJO, M. A. S. Caracterização molecular de espécies de Candida... 2006

2.3.2 Obtenção de Cultura

Para isolamento de leveduras foi utilizado o meio infusão de

cérebro-coração (BHI) adicionado de 0,5% de extrato de levedura (YE) contido

em tubos e ágar BHI adicionado de 50mg/L de cloranfenicol contido em placas.

Para enriquecimento, 1mL de sangue foi semeado em BHI-YE e mantido a

37ºC durante 72 horas. Decorrido o período de incubação, 0,5mL da cultura foi

semeado no sentido radial na superfície de ágar BHI com antibiótico. Do

precipitado da urina foi retirado 0,5mL e semeado por espalhamento radial na

superfície de ágar BHI com antibiótico. A secreção de orofaringe foi semeada

com o auxílio de swab por meio de espalhamento radial na superfície do ágar

BHI com antibiótico. Todos os espécimens clínicos foram semeados em

duplicata para manutenção à temperatura ambiente (28°C ± 1°C) e a 37°C, por

um período de 48 horas até 30 dias.

2.3.3 Purificação e Identificação

Para purificação das leveduras foram preparadas suspensões em

água destilada esterilizada com cloranfenicol (50mg/L). Com alça em anel uma

alíquota da suspensão foi semeada por esgotamento na superfície do meio

ágar Sabouraud adicionado de 50mg/L de cloranfenicol contido em placa. As

colônias OBTIDAS foram repicadas para ágar Sabouraud com extrato de

levedura contido em tubos, que foram mantidas à temperatura ambiente (28°C

± 1°C). Para identificação das leveduras foram adotados os critérios contidos

em Barnett et al.

, Hoog et al.

, Kreger-van Rij

e Loder

REGISTRO NO COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA – CEP – Nº 007471/2003-41

2.4 ANÁLISE MOLECULAR DAS AMOSTRAS DE LEVEDURAS

2.4.1 Obtenção de Massa Celular

Foram obtidos 50 isolados de espécies de Candida de pacientes

portadores de AIDS e de portadores Câncer; também foram analisadas 9

amostras de leveduras cedidas pela Coleção de Culturas – URM/UFPE: C.

albicans URM – 4126, URM– 4968, URM – 4385; C. guilliermondii URM –

4975, URM – 4819; C. parapsilosis URM – 4261, URM – 4984; C. tropicalis

ARAÚJO, M. A. S. Caracterização molecular de espécies de Candida... 2006

URM – 4977, URM – 4262. As amostras de levedura foram inoculadas em meio

liquido YPD (extrato de levedura, peptona e dextrose) e incubadas a 30°C por

16 horas a 150rpm, em mesa agitadora termostatizada.

2.4.2 Extração do DNA Nuclear

Após o período de incubação foi retirado 1,0mL da amostra e

transferido para microtubos esterilizados de 1,5mL e centrifugado por três

minutos a 5.900g. O sobrenadante foi descartado e ao sedimento foram

adicionados 600μL de solução de lise, mantidos a 65°C em banho-maria por 30

minutos com agitação por inversão a cada cinco minutos. Posteriormente

foram adicionados fenol/clorofórmio (1:1) e após breve agitação as suspensões

foram centrifugadas a 15.400g por 10 minutos. Foram transferidos 500μL da

fase superior para novos microtubos 1,5mL esterilizados e adicionados 500μL

de clorofórmio/álcool isoamílico (24:1). As amostras foram centrifugadas mais

uma vez por igual período e rotação, e 400μL da fase superior foram

transferidos para novos microtubos de 1,5mL esterilizados. A estes tubos foram

adicionados 800μL de etanol absoluto gelado, permanecendo por duas horas a

-20°C para precipitação do DNA. Após a precipitação, por centrifugação a

15.400g por 10 minutos o DNA foi retirado, o sobrenadante foi descartado e o

DNA lavado em etanol a 70% por duas vezes, secado em estufa a 37°C por 30

minutos e em seguida ressuspenso em tampão TE pH 8,0 (TRIS 10mM/EDTA

1mM) e mantido a -20°C.

2.4.3 Quantificação de DNA

Após descongelamento, as amostra de DNA forma diluídas com

água miliq a 1:200μL; em seguida a quantificação foi realizada por

espectrofotometria utilizando-se comprimento de onda de 260nm. Para o

cálculo da concentração de DNA foi utilizada a relação 1 DO = 50μg/mL

(SAMBROOK et al., 1989).

2.4.4 Amplificação do DNA Nuclear

As amostras de DNA foram amplificadas por PCR utilizando os

iniciadores descritos na Tabela 1.

ARAÚJO, M. A. S. Caracterização molecular de espécies de Candida... 2006

TABELA 1. Iniciadores usados para amplificar segmentos de DNA de espécies

de Candida.

INICIADOR

SEQUÊNCIA

MARCADOR

MOLECULAR

REFERÊNCIA

(GTG)

GTGGTGGTGGTGGTG ISSR Lieckfeldt et al. 1970

ITS4 TCCTCCGCTTATTGATATGC rDNA White et al. 1990

ITS5 GGAAGTAAAAGTCGTAACAA rDNA White et al. 1990

CALB 1 TTTATCAACTTGTCACACCA rDNA Luo & Mitchell 2002

CALB 2 ATCCCGCCTTACCACTACCG rDNA Luo & Mitchell 2002

2.4.5 Região ITS do DNA Ribossomal

A reação de amplificação da região ITS do DNA ribossomal por

PCR foi realizada em 25μL de volume final utilizando os iniciadores ITS4 e

ITS5, em termociclador HIBAID de acordo com o protocolo da Tabela 2. A

amplificação foi programada para um ciclo de desnaturação inicial de seis

minutos a 94°C, seguido de 35 ciclos para desnaturação a 94°C por 20

segundos, anelamento a 55°C por 20 segundos, extensão a 72°C por 60

segundos, com extensão final a 72°C por cinco minutos. Os produtos de

amplificação foram separados por eletroforese e fotografados nas mesmas

condições do item anterior.

2.4.6 ISSR (Inter Simple Sequence Repeats)

A reação de amplificação de seqüências simples entre repetições

(ISSR) por PCR com o iniciador (GTG)

foi realizada em 25µL de volume final

utilizando-se um termociclador HIBAID, de acordo com protocolo da Tabela 3.

A amplificação com o iniciador (GTG)

foi programada para um ciclo de

desnaturação de cinco minutos a 94°C seguido de 40 ciclos de desnaturação a

94°C por 15 segundos, anelamento a 55°C por 45 segundos, extensão a 72°C

por 90 segundos, e extensão final a 72°C por seis minutos. Os produtos de

amplificação foram separados por eletroforese em gel de agarose 1,3%

submetidos a 7,5 volts/cm entre os eletrodos por 150 minutos em tampão TBE

ARAÚJO, M. A. S. Caracterização molecular de espécies de Candida... 2006

0,5X, corados em brometo de etídeo, visualizados em transiluminador de luz

ultravioleta e fotografados em sistema de fotodocumentação (DOC Print Vilber

Loumart).

TABELA 2. Protocolo de reação para amplificação da região ITS do rDNA com

os iniciadores ITS4 e ITS5.

COPONENTES CONCENTRAÇÃO

ESTOQUE

VOLUME NA

REAÇÃO (μL)

CONCENTRAÇÃO

FINAL

Água destilada esterilizada 13,35

Tampão PCR 10X 2,5 1X

BSA (soro albumina bovina)

0,25μg/μL

2,5

0,025μg/μL

Mistura de dNTPs 2,0mM 2,5 0,2mM

Iniciador ITS4

12,5pmoles/μL

1,0

0,5pmoles/μL

Iniciador ITS5

12,5pmoles/μL

1,0

0,5pmoles/μL

MgCl

50mM 1,50

3,0mmoles/μL

Taq Polimerase

5U/μL

0,40

0,05U/μL

DNA

50,0ng/μL

1,0

2,0ng/μL

TABELA 3. Protocolo de reação para amplificação de ISSR por PCR com o

iniciador (GTG)5.

COPONENTES

CONCENTRAÇÃO

ESTOQUE

VOLUME NA

REAÇÃO (μL)

CONCENTRAÇÃO

FINAL

Água destilada esterilizada 9,75

Tampão PCR 10X 2,50 1X

BSA (soro albumina bovina)

0,25μg/μL

2,50

0,025μg/μL

Mistura de dNTP 2,0mM 2,50 0,2mM

Iniciador

1,0pmol/μL

5,00

0,2pmoles/μL

MgCl

50mM 1,50 3,0mM

Taq Polimerase

5U/μL

0,25

0,05U/μL

DNA

50,0ng/μL

1,00

2,0ng/μL

ARAÚJO, M. A. S. Caracterização molecular de espécies de Candida... 2006

2.4.7 Amplificação com iniciadores CALB1 e CALB2

A reação de amplificação por PCR com os iniciadores espécie-

específicos CALB1 e CALB2 foi realizada em 20μL de volume final utilizando-

se um termociclador HIBAID de acordo com o protocolo da Tabela 4. A

amplificação foi programada para um ciclo de desnaturação inicial de cinco

minutos a 96ºC, seguido de 40 ciclos para desnaturação a 94ºC por 30

segundos, pareamento a 58ºC por 30 segundos, extensão a 72ºC por 30

segundos, com extensão final a 72ºC por 15 minutos. Os produtos de

amplificação foram separados por eletroforese visualizados em condições

iguais às descritas para o iniciador ITS.

TABELA 4. Protocolo de reação para amplificação com iniciadores espécie-

específicos CALB1 e CALB2.

2.4.8 Análise Estatística

Os dados obtidos das amplificações com marcadores (GTG)

foram analisadas pelo programa Numerical Taxonomy System of Multivariate

Programs – NTSYS – PC 2.1 (BUSSAD et al., 1990; CRUZ; REGAZZI, 1994;

ROHLF, 2002). Os dados foram introduzidos na forma de variáveis binárias,

COMPONENTES CONCENTRAÇÃO

ESTOQUE

VOLUME NA

REAÇÃO (μL)

CONCENTRAÇÃO

FINAL

Água destilada esterilizada 8,15

Tampão PCR 10X 2,50 1X

BSA (Albumina de soro Bovino) 0,25μg/μL 2,50

0,025μg/μL

Mistura de dNTPs* 2.0mM 2,50 0,2mM

Iniciador CALB1 12,5pmol 1,25

0,5pmoles/μL

Iniciador CALB2 12,5pmol 1,25

0,5pmoles/μL

MgCl2 50mM 1,50

3,0mmoles/μL

Taq polimerase 5U/μL 0,10

0,05U/μL

DNA 50,0ng/μL 1,00

2,0ng/μL

ARAÚJO, M. A. S. Caracterização molecular de espécies de Candida... 2006

nas quais o número 1 (um) significa a presença da banda e o número 0 (zero) a

ausência da banda. A partir das bandas no gel, o programa constrói uma matriz

de similaridade utilizando o coeficiente similaridade Simple Matching (SM)

calculado de acordo com a fórmula:

SM = (a + d)

(a+b+c+d)

Onde: SM = coeficiente de similaridade Simple Matching

a = número coincidências positivas

b e c = número de não-coincidências

d = número coincidências negativas

A partir da matriz de similaridade foi gerado um dendrograma pelo

método de agrupamento UPGMA (Unweighted Pair Group Method With

Arithmetical Average).

3. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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ARAÚJO, M. A. S. Caracterização molecular de espécies de Candida... 2006

4. ARTIGOS

4.1 CANDIDA SPP ISOLADAS DE SECREÇÃO DE OROFARINGE

DE PACIENTES PORTADORES DE AIDS ATENDIDOS EM

HOSPITAIS-ESCOLA DE MACEIÓ, ALAGOAS, BRASIL

ARTIGO SUBMETIDO A:

BRAZILIAN JOURNAL OF MICROBIOLOGY

SÃO PAULO/BRASIL

ARAÚJO, M. A. S. Caracterização molecular de espécies de Candida... 2006

CANDIDA SPP ISOLADAS DE SECREÇÃO DE OROFARINGE DE

PACIENTES PORTADORES DE AIDS ATENDIDOS EM

HOSPITAIS-ESCOLA DE MACEIÓ, ALAGOAS, BRASIL

*Maria Anilda dos Santos Araújo

1, 2

; Elvira Maria Bezerra de

Alencar

; Kátia Simone dos Santos

; Aryanna Kelly Pinheiro Souza

;

Euripedes Alves da Silva Filho

; Lusinete Aciole de Queiroz

1. Pós-Graduação em Biologia de Fungos, Universidade Federal de Pernambuco,

Centro de Ciências Biológicas, Departamento de Micologia

2. Universidade Federal de Alagoas, Instituto de Centro de Ciências Biológicas e da

Saúde, Setor de Botânica

3. Universidade Federal de Alagoas, Instituto de Centro de Ciências Biológicas e da

Saúde, Setor de Biologia

*Autor para correspondência: Rua: Conselheiro Francisco Vieira, 23, Prado, Maceió-

AL, CEP 57010-230. Fone: (82) 3376-9236. Email: [email protected]

ARAÚJO, M. A. S. Caracterização molecular de espécies de Candida... 2006

CANDIDA SPP ISOLADAS DA SECREÇÃO DE OROFARINGE

DE PACIENTES PORTADORES DE AIDS ATENDIDOS EM

HOSPITAIS-ESCOLA DE MACEIÓ, ALAGOAS, BRASIL

RESUMO

Foi realizada a detecção de espécies de Candida na secreção de

orofaringe de pacientes portadores de AIDS atendidos em Hospitais-Escola de

Maceió-Alagoas, Brasil. De pacientes atendidos no Hospital Universitário Prof.

Alberto Antunes/HUPAAUFAL e Hospital-Escola Dr. Hélvio Auto, foram

coletadas amostras de secreção da orofaringe, as quais foram processadas

para exame direto e cultura. Após isolamento, as leveduras foram purificadas e

identificadas. Entre 100 pacientes analisados, foram isolados leveduras de

29%, dos quais 16 (55%) foram de pacientes atendidos no Setor de Infectologia

do Hospital Dia-HUPAA/UFAL e 13 (45%) de pacientes atendidos no Hospital-

Escola Dr. Hélvio Auto/UNCISAL. Em relação à ocorrência de espécies de

Candida, verificou-se maior expressão de C. albicans, representando 31% dos

casos, seguida de C. guilliermondii (27,5%), C. glabrata e C. parapsilosis

(17,3%), e C. tropicalis (6,9%).

Palavras chave: Candida spp, secreção de orofaringe e AIDS.

ARAÚJO, M. A. S. Caracterização molecular de espécies de Candida... 2006

CANDIDA SPP ISOLATED FROM THE OROPHARYGEAL

SECRETION OF PATIENT BEARERS OF AIDS ASSISTED IN

SCHOOL HOSPITALS OF MACEIÓ, ALAGOAS, BRAZIL.

ABSTRACT

It was accomplished the detection of species of Candida in the

oropharygeal secretion of patient bearers of AIDS assisted in school hospitals

of Maceió-Alagoas, Brazil. From patients assisted in the Hospital Universitário

Prof. Dr. Alberto Antunes/HUPAAUFAL and Hospital-Escola Dr. Hélvio Auto,

samples of secretion from the oropharygeal were collected which were

processed for direct exam and culture. After isolation, the yeasts were purified

and identified. Among 100 analyzed patients, yeasts were isolated of 29%, of

which 16 (55%) were obtained from patients assisted in the infectology section

of the Hospital DIA-HUPAA/UFAL and 13 (45%) from patients assisted in the

Hospital-Escola Dr. Hélvio Auto/UNCISAL. Related to the occurrence of isolated

Candida's species, it was verified larger expression of Candida albicans,

representing 31% of the cases, followed by C. guilliermondii (27,5%), C.

glabrata and C. parapsilosis (17,3%), and C. tropicalis (6,9%).

key words: Candida spp, Oropharygeal Secretion, AIDS.

ARAÚJO, M. A. S. Caracterização molecular de espécies de Candida... 2006

INTRODUÇÃO

Entre as infecções oportunistas, as causadas por fungos, estão

entre as principais doenças observadas em pacientes com AIDS, as mais

comuns são candidíase, criptococose, histoplasmose, aspergilose,

paracoccidioimicose, entre outras

14, 23, 25, 29

Candidíases são as infecções micóticas mais freqüentes e podem

acometer qualquer tecido, órgão ou sistema. Esta infecção pode ser

considerada como um indicador da AIDS, e como um importante componente

para o diagnóstico precoce e análise da progressão da infecção pelo HIV

1, 3, 4,

8, 17, 18

De acordo com Fridkin e Jarvis

, Jarvis

, Wingard

o registro de

infecções causadas por Candida albicans tem diminuído relativamente devido a

incidência de infecções causadas por outras espécies incluindo C. glabrata,

C.parapsilosis, C. tropicalis, C. Krusei, C. lusitaneae, C. dublinienis, C. famata.

C. guilliermondii, C. kefyr, C. inconspicua, C. novergensis, C. rugosa, C.utilis e

C. zelanoides também tem sido mencionadas

5, 28

A recorrência de candidíase oral está relacionada ao tratamento

periódico que se faz necessário nos pacientes imunocomprometidos, porém o

uso prolongado de antibióticos e drogas antifúngicas tanto no tratamento

quanto na profilaxia tem resultado na resistência de C. albicans, assim como no

surgimento de outras espécies de Candida

6, 21

Este estudo teve como objetivo detectar a ocorrência de espécies

de Candida da secreção de orofaringe de pacientes portadores de AIDS

atendidos em Hospitais-Escola de Maceió, Alagoas, Brasil.

ARAÚJO, M. A. S. Caracterização molecular de espécies de Candida... 2006

MATERIAL E MÉTODOS

PACIENTES

Foram analisados espécimens clínicos de 100 pacientes

atendidos em ambulatório, sendo 50 atendidos no Setor de Infectologia do

Hospital Dia – Hospital Universitário Prof. Dr. Alberto Antunes - HUPAA/UFAL e

50 no ambulatório de Hospital-Escola Dr. Hélvio Auto/UNCISAL, Maceió,

Alagoas, Brasil.

COLETA DE ESPÉCIMENS CLÍNICOS

De cada paciente foi coletada uma amostra de secreção da

orofaringe, com o auxilio de swabs esterilizados umedecidos em 2mL de água

destilada esterilizada adicionada de 50mg/L de cloranfenicol contida em tubo.

Os recipientes com as amostras clínicas foram encaminhados ao Laboratório

de Micologia do Instituto de Ciências Biológicas e da Saúde-ICBS/UFAL para

realização de exame direto e cultura.

PROCESSAMENTO DA AMOSTRA

Exame Direto

Para detecção de estruturas fúngicas através do exame direto as

amostras dos diferentes espécimens clínicos foram processadas a fresco e

clarificadas com solução aquosa a 30% de hidróxido de potássio.

Obtenção de Cultura

As amostras de secreção da orofaringe foram semeadas com o

auxílio de swab por espalhamento radial na superfície do meio ágar infusão de

cérebro-coração (BHI) contido em placa, adicionado de 50mg/L de

ARAÚJO, M. A. S. Caracterização molecular de espécies de Candida... 2006

cloranfenicol. Foram semeadas em duplicata e mantidas a temperatura

ambiente (28°C ± 1°C) e a 37°C, por um período de 48 horas até 7 dias.

Purificação e Identificação

Para purificação das leveduras foram preparadas suspensões em

água destilada esterilizada com cloranfenicol (50mg/L). Com alça em anel uma

alíquota da suspensão foi semeada por esgotamento na superfície do meio

ágar Sabouraud adicionado de 50mg/L de cloranfenicol contido em placa. As

colônias isoladas foram repicadas para ágar Sabouraud com extrato de

levedura contido em tubos e foram mantidas à temperatura ambiente (28°C ±

1°C). Para identificação das leveduras foram adotados os critérios de Barnett et

al.

, Hoog et al.

, Kreger-van Rij

e Lodder

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Entre os 100 pacientes portadores de AIDS analisados, em 29%

foi observada a ocorrência de leveduras. Os pacientes apresentavam carga

viral e nível de CD4 controlados, por estarem sendo submetidos a tratamentos

com antiretrovirais e drogas antifúngicas Segundo Mattos et al.

que

verificaram a prevalência de lesões de mucosa bucal em 22% dos pacientes

HIV-positivos e associaram essas lesões a candidíase pseudomembranosa,

sendo a mais freqüente acometendo 6,3% dos pacientes. Os autores ressaltam

que no curso da infecção pelo HIV, a imunossupressão resultante da infecção

crônica pelo vírus, culmina com o surgimento de infecções oportunistas e

algumas neoplasias.

Em relação aos pacientes atendidos nos dois hospitais, verificou-

se a presença de espécies de Candida na secreção de orofaringe de 16 (55%)

dos pacientes atendidos no Setor de Infectologia do Hospital Dia-HUPAA/UFAL

ARAÚJO, M. A. S. Caracterização molecular de espécies de Candida... 2006

e de 13 (45%) dos pacientes atendidos no Hospital-Escola Dr. Hélvio

Auto/UNCISAL. Foi positivo o exame direto da secreção de orofaringe de todos

os pacientes com manifestações clínicas características de candidíase. Neves

et al.

observaram a ocorrência de 95,8% das amostras de secreção de

orofaringe de pacientes com AIDS. Lima et al.

destacam a secreção de

orofaringe como o espécimen clínico que se detecta o isolamento de leveduras,

principalmente espécies de Candida.

Em relação a prevalência de espécies de Candida nos portadores

de AIDS nos dois hospitais, verificou-se que nos pacientes atendidos do

Hospital Universitário Prof. Alberto Antunes as espécies de maior ocorrência

foram C. albicans e C. parapsilosis com 5 isolados de cada espécie, seguida de

3 amostras C. guilliermondii, 2 de C. glabrata e 1 de C. tropicalis. Nos

pacientes do Hospital-Escola Dr. Hélvio Auto, C. albicans também foi a espécie

de maior ocorrência com 4 isolados, seguida de 5 amostras deC. guilliermondii,

3 de C. glabrata e 1 C. tropicalis. C. parapsilosis não foi isolada de pacientes

deste hospital (Tabela 1). Segundo Gomides et al.

, Hernández-Hernández et

al.

, Lacaz et al.

, Saballs et al.

, Sidrim e Rocha

, Vidotto

estas espécies

são as mais encontradas na secreção de orofaringe de pacientes

imunocomprometidos.

Candida albicans foi a espécie de maior ocorrência na secreção

de orofaringe, representando 31% dos casos positivos, seguida de 27,5% de C.

guilliermondii, 17,3% de C. glabrata e C. parapsilosis, e C. tropicalis com 6,9%

(Figura 1). Resultados semelhantes foram encontrados por Lacaz et al.

Sidrim e Rocha

, Silva et al.

, Vidotto

, com relação a maior ocorrência de C.

albicans da secreção de orofaringe. C. tropicalis, C. parapsilosis e C. glabrata

ARAÚJO, M. A. S. Caracterização molecular de espécies de Candida... 2006

também foram assinaladas pelos autores causando infecções fúngicas em

pacientes com AIDS.

O surgimento de outras leveduras em espécimens clínicos

diferentes, bem como de espécies Candida tem sido demonstrados por alguns

autores. Neves et al.

na secreção de orofaringe isolaram C. albicans (86,1%),

seguida de C. tropicalis (5,5%), C. glabrata e C. parapsilosis (2,7%), C. krusei e

Trichosporon pupullans (1,4%). Matsumoto et al.

isolaram em sangue e

cateter, as espécies C. parapsilosis (35%), seguido de C. albicans (20%), C.

tropicalis e C. guilliermondii (8,75%) e Oliveira et al.

isolaram da urina, as

espécies C. tropicalis (53%), seguida de C. albicans (36%)

Considerando a literatura especializada de identificação de

leveduras, foram observadas variações nas características macro e

microscópicas de alguns isolados de C. albicans, C. parapsilosis, C. glabrata,

C. guilliermondii e C. tropicalis (Figura 2, 3, 4, 5, 6)

2, 11, 12, 16

ARAÚJO, M. A. S. Caracterização molecular de espécies de Candida... 2006

TABELA 1. Espécies de Candida isoladas de secreção da orofaringe de

pacientes portadores de AIDS atendidos em dois Hospitais-Escola de Maceió,

Alagoas, Brasil.

SECREÇÃO DE OROFARINGE/ PACIENTES COM AIDS

ESPÉCIES

HOSPITAL UNIVERSITÁRIO

Prof. ALBERTO ANTUNES

HOSPITAL-ESCOLA Dr.

HÉLVIO AUTO

TOTAL

C. albicans

5 4

C. guilhermondii

3 5

C. glabrata

2 3

C. parapsilosis

5 0

C. tropicalis

1 1

TOTAL

16 13 29

ARAÚJO, M. A. S. Caracterização molecular de espécies de Candida... 2006

10%

15%

20%

25%

30%

35%

C. albicans C. guilliermondii C. glabrata C.parapsilosis C.tropicalis

FIGURA 1. Ocorrência de espécies de Candida isoladas da secreção de

orofaringe de pacientes portadores de AIDS atendidos em Hospitais-Escola de

Maceió, Alagoas.

Ocorrência (%)

ARAÚJO, M. A. S. Caracterização molecular de espécies de Candida... 2006

FIGURA 2. Candida albicans: A, aspectos macroscópicos; B, aspectos

microscópicos (400X).

Clamidósporo

ARAÚJO, M. A. S. Caracterização molecular de espécies de Candida... 2006

FIGURA 3. Candida glabrata: A, aspectos macroscópicos; B, aspectos

microscópicos (400X).

ARAÚJO, M. A. S. Caracterização molecular de espécies de Candida... 2006

FIGURA 4. Candida guilliermondii: A, aspectos macroscópicos; B, aspectos

microscópicos (400X).

ARAÚJO, M. A. S. Caracterização molecular de espécies de Candida... 2006

FIGURA 5. Candida parapsilosis: A, aspectos macroscópicos; B, aspectos

microscópicos (400X).

ARAÚJO, M. A. S. Caracterização molecular de espécies de Candida... 2006

FIGURA 6. Candida tropicalis: A, aspectos macroscópicos; B, aspectos

microscópicos (400X).

ARAÚJO, M. A. S. Caracterização molecular de espécies de Candida... 2006

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ARAÚJO, M. A. S. Caracterização molecular de espécies de Candida... 2006

3.2 ESPÉCIES DE CANDIDA ISOLADAS DE PACIENTES

PORTADORES DE CÂNCER ATENDIDOS NO HOSPITAL

UNIVERSITÁRIO DE MACEIÓ, ALAGOAS, BRASIL

ARTIGO SUBMETIDO A:

BRAZILIAN JOURNAL OF MICROBIOLOGY

SÃO PAULO/BRASIL

ARAÚJO, M. A. S. Caracterização molecular de espécies de Candida... 2006

ESPÉCIES DE CANDIDA ISOLADAS DE PACIENTES

PORTADORES DE CÂNCER ATENDIDOS NO HOSPITAL

UNIVERSITÁRIO DE MACEIÓ, ALAGOAS, BRASIL

*Maria Anilda dos Santos Araújo

1, 2

; Elvira Maria Bezerra de

Alencar

; Kátia Simone dos Santos

; Aryanna Kelly Pinheiro Souza

;

Euripedes Alves da Silva Filho

; Lusinete Aciole de Queiroz

1. Pós-Graduação em Biologia de Fungos, Universidade Federal de Pernambuco,

Centro de Ciências Biológicas, Departamento de Micologia

2. Universidade Federal de Alagoas, Instituto de Centro de Ciências Biológicas e da

Saúde, Setor de Botânica

3. Universidade Federal de Alagoas, Instituto de Centro de Ciências Biológicas e da

Saúde, Setor de Biologia

*Autor para correspondência: Rua: Conselheiro Francisco Vieira, 23, Prado, Maceió-

AL, CEP 57010-230. Fone: (82) 3376-9236. Email: [email protected]

ARAÚJO, M. A. S. Caracterização molecular de espécies de Candida... 2006

ESPÉCIES DE CANDIDA ISOLADAS DE PACIENTES

PORTADORES DE CÂNCER ATENDIDOS NO HOSPITAL

UNIVERSITÁRIO DE MACEIÓ, ALAGOAS, BRASIL

RESUMO

O presente trabalho teve como objetivo detectar a ocorrência de

leveduras nos espécimens clínicos sangue, secreção da orofaringe e urina de

pacientes portadores de câncer atendidos no Hospital Universitário Prof.

Alberto Antunes - HUPAA de Maceió-Alagoas. Haviam entre os pacientes,

portadores de câncer de mama, melanoma e útero. Depois de coletadas,

amostras dos espécimens clínicos foram processadas para exame direto e

cultura. Após purificação as leveduras foram identificadas. Dos 35 pacientes

analisados, 12 (34,3%) apresentaram infecções por leveduras, sendo

observada uma ocorrência de 84,6% na secreção da orofaringe e de 15,4% na

urina; no sangue não foram detectadas leveduras. As espécies isoladas foram

C. albicans (53,8%), C. glabrata (38,5%) e C. tropicalis (7,7%). Os pacientes

analisados pertenciam ao sexo feminino, sendo predominante o câncer de

mama.

Palavras chave: Candida spp, Câncer, Espécimens clínicos.

ARAÚJO, M. A. S. Caracterização molecular de espécies de Candida... 2006

SPECIES OF ISOLATED CANDIDA OF PATIENTS BEARERS OF

CANCER ASSISTED IN THE HOSPITAL UNIVERSITÁRIO DE

MACEIÓ, ALAGOAS, BRAZIL

ABSTRACT

The objective of the present work was to detect the occurrence of

yeasts in the clinical specimen blood, secretion oropharygeal and urine of

patient bearers of cancer assisted in the Hospital Universitário Prof. Dr. Alberto

Antunes - HUPAA of Maceió-Alagoas. There were among the patients, bearers

of breast cancer, melanoma and uterine cancer. After they were collected,

samples of the clinic specimens were processed for direct exam and culture.

After purification, the yeasts were identified. From the 35 analyzed patients, 12

(34,3%) presented fungic by yeasts, being observed an occurrence of 84,6% in

the oropharygeal secretion and 15,4% in the urine; it wasn´t identified yeasts in

the blood. The isolated species were C. albicans (53,8%), C. glabrata (38,5%)

and C. tropicalis (7,7%). The analyzed patients were of the feminine sex and

the breast cancer was predominant.

key words: Candida spp, Cancer, Clinic Specimens.

ARAÚJO, M. A. S. Caracterização molecular de espécies de Candida... 2006

INTRODUÇÃO

Câncer é o nome dado a um conjunto doenças que têm como

característica o crescimento desordenado e maligno de células que invadem

tecidos e órgãos, podendo causar metástase em diferentes regiões do corpo

Em relação a ocorrência de infecções fúngicas em pacientes com

câncer, como os portadores de leucemia, linfomas e tumores sólidos,

candidíases e aspergiloses está entre as micoses mais comumente

diagnosticadas

4, 11

A granulocitopenia severa e prolongada é o fator mais importante

para o desenvolvimento de infecção fúngica disseminada em pacientes com

neoplasias malignas. Adicionalmente, a emergência dessas infecções tem sido

associada à utilização de novos regimes de antibióticos, durante episódio de

prolongada granulocitopenia, secundariamente ao tratamento quimioterápico

mais intensivo

16, 17

. As espécies mais comumente relacionados com infecção

em pacientes com câncer, pertencem aos gêneros Candida, Aspergillus,

Mucor, Cryptococcus e, ocasionalmente, Histoplasma, Trichosporon, Fusarium

e também a Pneumocystis carrini

O presente trabalho teve como objetivo detectar a ocorrência de

leveduras em espécimens clínicos de pacientes portadores de Câncer

atendidos no Hospital Universitário Prof. Alberto Antunes.

ARAÚJO, M. A. S. Caracterização molecular de espécies de Candida... 2006

MATERIAL E MÉTODOS

PACIENTES

Foram analisadas amostras clínicas de 35 pacientes portadores

de Câncer, sendo 9 com câncer de mama, 2 com câncer de útero e 2 com

melanoma. Os pacientes foram atendidos previamente no ambulatório do Setor

de Oncologia do Hospital Universitário Dr. Alberto Antunes - HUPAA /UFAL e

encaminhados ao laboratório do referido hospital, onde foi procedida a coleta

dos espécimens clínicos.

REGISTRO NO COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA – CEP – Nº 007471/2003-41

COLETA DE ESPÉCIMENS CLÍNICOS

De cada paciente foi coletada uma amostra de secreção da

orofaringe, sangue e urina, totalizando 105 amostras clínicas. Para coleta de

secreção da orofaringe foram utilizados swabs esterilizados, os quais foram

umedecidos em água destilada esterilizada adicionada de cloranfenicol na

concentração de 50mg/L contida em tubos; em seguida os swabs foram

colocados no mesmo tubo. Com o auxílio de seringa descartável foram

coletados 5mL de sangue e transferidos para tubos tipo Vacuntanier contendo

EDTA como anticoagulante. Após as instruções devidas a urina foi coletada

pelo próprio paciente. Os recipientes contendo as amostras clínicas foram

encaminhados ao Laboratório de Micologia do Instituto de Ciências Biológicas

e da Saúde-ICBS/UFAL para realização de exame direto e cultura.

PROCESSAMENTO DOS ESPÉCIMENS CLÍNICOS

Exame Direto

Para detecção de estruturas fúngicas através do exame direto as

ARAÚJO, M. A. S. Caracterização molecular de espécies de Candida... 2006

amostras dos diferentes espécimens clínicos foram processadas a fresco e

clarificadas com solução aquosa a 20% de hidróxido de potássio.

Obtenção de Cultura

Para isolamento de leveduras foram utilizados os meios infusão

de cérebro-coração (BHI) adicionado de 0,5% de extrato de levedura (YE)

contidos em tubo e ágar BHI adicionados de 50mg/L de cloranfenicol contido

em placa. Para enriquecimento 1mL do sangue foi semeado em BHI-YE e

mantido a 37ºC durante 72 horas. Decorrido o período de incubação, 0,5mL da

cultura foi semeada no sentido radial na superfície de ágar BHI. Do precipitado

da urina foi retirado 0,5mL e semeado por espalhamento radial na superfície de

ágar BHI contendo 50mg/L de cloranfenicol. A secreção de orofaringe foi

semeada com o auxílio de swab por meio de espalhamento radial na superfície

do meio. Todos os espécimens clínicos foram semeados em duplicata para

manutenção a temperatura ambiente (28°C ± 1°C) e 37°C, por um período de

48 horas até 30 dias.

Purificação e Identificação

Para purificação das leveduras foram preparadas suspensões em

água destilada esterilizada com 50mg/L cloranfenicol. Com alça em anel uma

alíquota da suspensão foi semeada por esgotamento na superfície do meio

ágar Sabouraud adicionado de 50mg/L de cloranfenicol contido em placa. As

colônias isoladas foram repicadas para meio ágar Sabouraud mais extrato de

levedura contido em tubos e foram mantidas à temperatura ambiente (28°C ±

1°C). Para identificação das leveduras foram adotados os critérios de Barnett et

al.

, Hoog et al.

, Kreger-van Rij

e Lodder

ARAÚJO, M. A. S. Caracterização molecular de espécies de Candida... 2006

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Nos 35 pacientes portadores de câncer, observou-se uma

ocorrência de 12 (34,3%) de casos positivos para o isolamento de leveduras.

Segundo Lacaz e Machado

as infecções fúngicas causam uma diversidade

enorme de síndromes clínicas, tornando-se a hipótese de etiologia micótica

suspeita em qualquer quadro infeccioso relacionado a pacientes

imunocomprometidos e que se tratam de infecções que quando são

diagnosticadas tardiamente estão associadas a alta letalidade. O índice de

infecções fúngicas tem aumentado em pacientes imunocomprometidos,

principalmente quando são isolados fungos não considerados patógenos

primários a partir de espécimens que contêm uma microbiota diversa e

abundante, representando um problema na interpretação do papel patogênico,

devido a necessidade de se estabelecer e reunir parâmetros para definir sua

participação na enfermidade.

A Tabela 1 mostra a ocorrência dos tipos de câncer em relação

aos espécimens clínicos e espécies de Candida isoladas de pacientes

portadores de câncer atendidos no Hospital Universitário Prof. Alberto Antunes.

Entre os pacientes analisados o câncer de mama foi o de maior ocorrência,

sendo observado em 9 (75%) pacientes, seguido de câncer de útero com 2

(16,7%) casos e melanoma apenas 1 (8,3%) caso. Bittencourt et al.

observaram que o câncer de mama é o mais freqüente atingindo o percentual

de 24% de todos os tumores em tratamento oncológico, com maior incidência

na vida adulta e no sexo feminino, seguido pelo câncer de colo uterino. De

acordo com os dados do Ministério da saúde a taxa de mortalidade por câncer

de mama tem aumentado, passando de 5,7/100.000 para 9,7/100.000

ARAÚJO, M. A. S. Caracterização molecular de espécies de Candida... 2006

mulheres nos últimos 20 anos, continuando a ser a primeira causa de morte

nas mulheres brasileiras

. Vale salientar, que as pacientes portadoras de

câncer de útero tinham sido esterectomizadas.

A secreção da orofaringe foi o espécimen clínico de maior

ocorrência, sendo observado 11 (84,6%) casos de leveduras, seguida da urina

com 2 (15,4%) casos; do sangue não foi isolada levedura (Tabela 1). Segundo

Neves et al.

a secreção da orofaringe é o espécimen clínico onde mais

ocorrem isolamento de leveduras, principalmente espécies de Candida.

Entretanto, Barret et al.

e Spolidorio et al.

também citam a presença deste

gênero em biópsias de lesões da mucosa bucal. A microbiota oral é

representada por vários tipos de microrganismos, porém em pacientes

imunocomprometidos, tanto a microbiota normal como a oportunista pode

causar infecções severas, inclusive, atingindo a corrente sanguínea causando

infecções generalizadas

As espécies isoladas foram C. albicans com 7 (53,8%) casos,

sendo 6 isolados obtidos da secreção da orofaringe e 1 da urina, dos quais 5

foram isolados de câncer de mama, 1 de melanoma e 1 de câncer de útero;

seguida de C. glabrata com 5 (38,5%), sendo 4 isolados obtidos da secreção

da orofaringe de pacientes portadores de câncer de mama e 1 da urina de

portador de câncer de útero; C. tropicalis 1 (7,7%) obtido da secreção da

orofaringe de paciente portador de câncer de mama (Tabela 1). Estes dados

estão de acordo com os observados por Lacaz et al.

, Sidrim e Rocha

, Silva

et al

, onde C. albicans é a espécie mais isolada da secreção da orofaringe e

nos pacientes portadores de câncer de mama segundo Lacaz e Machado

Colombo et al.

e Nucci e Colombo

destacaram o surgimento de outras

ARAÚJO, M. A. S. Caracterização molecular de espécies de Candida... 2006

espécies causando infecções está relacionado ao tratamento periódico que se

faz necessário e também ao uso prolongado de medicamentos utilizados na

profilaxia da candidíase oral, resultando na resistência da levedura.

Nos espécimens clínicos urina e secreção da orofaringe de um

mesmo paciente portador de câncer de mama, foi obtido isolamento apenas de

C. albicans. Por se tratarem de leveduras que são encontradas no trato

gastrointestinal em 20 a 80% da população adulta saudável, podem se tornar

patogênicas caso ocorram alterações nos mecanismos de defesa do

hospedeiro, tais como neoplasias

ARAÚJO, M. A. S. Caracterização molecular de espécies de Candida... 2006

TABELA 1. Ocorrência dos tipos de câncer em relação aos espécimens

clínicos e espécies de Candida isoladas de pacientes portadores de câncer

atendidos no Hospital Universitário Prof. Alberto Antunes.

ESPÉCIMEN CLÍNICO

PACIENTE

TIPO DE

CÂNCER

SANGUE URINA SECREÇÃO DE

OROFARINGE

ESPÉCIE

1 Mama +

C. albicans

2 Mama + +

C. albicans

3 Mama +

C. glabrata

4 Útero +

C. albicans

5 Mama +

C. glabrata

6 Mama +

C. albicans

7 Útero +

C. glabrata

8 Mama +

C. glabrata

9 Mama +

C. tropicalis

10 Mama +

C. albicans

11 Mama +

C. glabrata

12 Melanoma +

C. albicans

ARAÚJO, M. A. S. Caracterização molecular de espécies de Candida... 2006

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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ARAÚJO, M. A. S. Caracterização molecular de espécies de Candida... 2006

4.3 IDENTIFICAÇÃO POR PCR DE ESPÉCIES DE CANDIDA

ISOLADAS DE PACIENTES PORTADORES DE AIDS E DE

PORTADORES DE CÂNCER ATENDIDOS EM HOSPITAIS-

ESCOLA DE MACEIÓ, ALAGOAS, BRASIL

ARTIGO SUBMETIDO A:

BRAZILIAN JOURNAL OF MICROBIOLOGY

SÃO PAULO/BRASIL

ARAÚJO, M. A. S. Caracterização molecular de espécies de Candida... 2006

IDENTIFICAÇÃO POR PCR DE ESPÉCIES DE CANDIDA

ISOLADAS DE PACIENTES PORTADORES DE AIDS E DE

PORTADORES DECÂNCER ANTENDIDOS EM HOSPITAIS-

ESCOLA DE MACEIÓ, ALAGOAS, BRASIL

*Maria Anilda dos Santos Araújo

; Euripedes Alves da Silva

Filho

; Bereneuza T. R. V. Brasileiro

; Kátia Simone dos Santos

;

Lusinete Aciole de Queiroz

; Elvira Maria Bezerra de Alencar

1. Pós-Graduação em Biologia de Fungos, Universidade Federal de Pernambuco,

Centro de Ciências Biológicas, Departamento de Micologia; 2. Universidade Federal

de Alagoas, Instituto de Ciências Biológicas e da Saúde, Setor de Biologia; 3.

Universidade Federal de Pernambuco, Departamento de Genética; 4. Universidade

Federal de Alagoas, Instituto de Ciências Biológicas e da Saúde, Setor de Botânica.

*Autor para correspondência: Rua: Conselheiro Francisco Vieira, 23, Prado, Maceió-

AL, CEP 57010-230. Fone: (82) 3376-9236. E-mail: [email protected]

ARAÚJO, M. A. S. Caracterização molecular de espécies de Candida... 2006

IDENTIFICAÇÃO POR PCR DE ESPÉCIES DE CANDIDA

ISOLADAS DE PACIENTES PORTADORES DE AIDS E DE

PORTADORES DE CÂNCER ANTENDIDOS EM HOSPITAIS-

ESCOLA DE MACEIÓ, ALAGOAS, BRASIL

RESUMO

O presente trabalho teve como objetivo verificar a diversidade

genética em nível específico e intraespecífico os isolados de Candida obtidos

de pacientes portadores de AIDS e de portadores de Câncer, utilizando como

marcadores moleculares o DNA ribossomal, ISSR (GTG)

e os iniciadores

espécie-específicos CALB1 e CALB2. Entre os 50 isolados obtidos 19 foram

identificadas pelo método convencional como Candida albicans, 11 C. glabrata,

9 C. guilliermondii, 7 C. parapsilosis e 4 C. tropicalis. Em relação ao fragmento

da região ITS (ITS1-5.8S-ITS2) do rDNA verificou-se que os isolados das

espécies C. albicans, C. glabrata, C. guilliermondii e C. tropicalis amplificaram

um fragmento de 550pb, enquanto C. parapsilosis amplificou um fragmento de

520pb. Os resultados obtidos com a utilização do iniciador para ISSR (GTG)

demonstraram grande variabilidade intraespecífica, permitindo detectar

linhagens dentro da mesma espécie. Com a utilização dos iniciadores espécie-

específicos CALB1 e 2, verificou-se que os isolados identificados como C.

albicans, amplificaram um fragmento de 273pb confirmando a espécie. Todos

os marcadores moleculares mostraram-se eficientes, reprodutíveis e auxiliam

na identificação convencional, constituindo-se em ferramentas apropriadas

para caracterização genética entre espécies de Candida.

Palavras chave: Candida spp, PCR, AIDS, Câncer.

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IDENTIFICATION BY PCR OF SPECIES OF ISOLATED CANDIDA

OF PATIENTS BEARERS OF AIDS AND CANCER ASSISTED IN

SCHOOL HOSPITALS OF MACEIÓ, ALAGOAS

ABSTRACT

The objective of the present work was to verify the genetic

diversity to the specific and intraspecific levels of the isolated of Candida

obtained from patients bearers of AIDS and Cancer assisted in the School

Hospitals of Maceió-Alagoas, using as molecular markers the DNA ribossomal,

ISSR (GTG)

and the specific-species initiator CALB1 and CALB2. From the 50

isolateds identified by the conventional method, 19 were Candida albicans, 11

C. glabrata, 9 C. guilliermondii, 7 C. parapsilosis and 4 C. tropicalis. In relation

to the fragment of the area ITS (ITS1-5.8S-ITS2) of the rDNA, it was verified

that the isolated of the species C. albicans, C. glabrata, C. guilliermondii and C.

tropicalis amplified a fragment of 550pb, while C. parapsilosis amplified a

fragment of 520pb. The results obtained with the use of the initiator for ISSR

(GTG)

demonstrated great intraspecific variability, allowing the detection of

lineages in the same species. By the use of the specific-species initiator

CALB1 and 2, it was verified that the isolated identified as C. albicans amplified

a fragment of 273pb confirming the species. All of the molecular markers were

efficient, reproductive and they helped in the conventional identification, being

appropriate tools for genetic characterization among species of Candida.

key words: Candida spp, PCR, AIDS, Câncer.

ARAÚJO, M. A. S. Caracterização molecular de espécies de Candida... 2006

INTRODUÇÃO

A candidíase é a mais freqüente infecção fúngica oportunista em

humanos

. Os aspectos clínicos da candidíase variam desde manifestações

da colonização de mucosas, até quadros sistêmicos com a invasão de vários

órgãos

. As espécies C. albicans, C. tropicalis, C. parapsilosis, C. glabrata e C.

krusei são mais comumente implicadas em quadros clínicos e C. lusitaniae, C.

rugosa, C. pseudotropicalis, C. guillermondii são leveduras menos

freqüentemente isoladas

19, 30

Os métodos tradicionalmente utilizados na identificação de

leveduras baseiam-se em critérios morfológicos e fisiológicos para nível de

espécie

14, 16, 21

, entretanto estão sendo utilizadas técnicas moleculares as

quais visam a análise de DNA e auxiliam na taxonomia dos microrganismos

possibilitando um estudo da variabilidade individual e/ou populacional

10, 11

A técnica de reação em cadeia de DNA polimerase (PCR –

Polymerase Chain Reaction) com os iniciadores espécie-específicos é

atualmente a mais utilizada para amplificação de fragmentos de interesse e

destaca-se na identificação de fungos patogênicos ao homem a partir do

espécimen clínico ou de culturas, uma vez que o diagnóstico através de testes

convencionais podem ser concluídos em apenas em quinze dias, dificultando o

tratamento e melhor resposta terapêutica

9, 12, 15

O presente trabalho teve como objetivo verificar a diversidade

genética em níveis específico e intraespecífico dos isolados de Candida obtidos

de pacientes portadores de AIDS e de portadores de Câncer atendidos em

Hospitais Escola de Maceió, Alagoas, utilizando como marcadores moleculares

o rDNA, o ISSR (GTG)

e iniciadores espécie-específicos CALB 1 e 2.

ARAÚJO, M. A. S. Caracterização molecular de espécies de Candida... 2006

MATERIAL E MÉTODOS

Amostras

Os isolados de leveduras foram obtidos de pacientes portadores

de AIDS e de portadores de Câncer atendidos no Setor de Infectologia do

Hospital Dia e Setor de Oncologia do Hospital Universitário Profº. Alberto

Antunes-HUPAA/UFAL e do Hospital-Escola Dr. Hélvio Auto; as leveduras de

referência foram obtidas Coleção de Culturas da Micoteca URM-UFPE (Tabela

1).

Obtenção de Massa Celular e Extração do DNA Nuclear

Os isolados foram inoculados em meio líquido extrato de levedura

peptona e dextrose-YPD e incubados a 30°C por 16 horas a 150rpm, em mesa

agitadora termostatizada. Após período de incubação foi retirado 1,0mL da

amostra e transferidos para microtubos esterilizados de 1,5mL e centrifugado

por três minutos a 5.900g. O sobrenadante foi descartado e adicionados 600μL

de solução de lise, mantidos a 65°C em banho-maria por 30 minutos com

agitação por inversão a cada cinco minutos. Posteriormente, foram

adicionados fenol/clorofórmio (1:1) e após breve agitação as suspensões foram

centrifugadas a 15.400g por 10 minutos. Foram transferidos 500μL da fase

superior para novos microtubos esterilizados de 1,5mL e adicionados 500μL de

clorofórmio/álcool isoamílico (24:1). As amostras foram centrifugadas mais uma

vez por igual período e rotações, e 400μL da fase superior foram transferidos

para microtubos de 1,5mL novos e esterilizados. A estes tubos foram

adicionados 800μL de etanol absoluto gelado, permanecendo por duas horas a

-20°C para precipitação do DNA. Após a precipitação, o DNA foi coletado por

ARAÚJO, M. A. S. Caracterização molecular de espécies de Candida... 2006

centrifugação a 15.400g por 10 minutos, lavado com etanol a 70% por duas

vezes, secado em estufa a 37°C por 30 minutos e em seguida ressuspendido

com tampão TE pH 8,0 (TRIS 10mM/EDTA 1mM) e mantido a -20°C. A

quantificação foi realizada por espectrofotometria utilizando-se comprimento de

onda de 260nm após diluição das amostras de 1:200. Para o cálculo da

concentração de DNA foi utilizada a relação 1 DO = 50μg/mL

Amplificação do DNA Nuclear

As amostras de DNA foram amplificadas por PCR utilizando os

iniciadores descritos na Tabela 2, em termociclador HIBAID. A reação das

ISSR (Inter Simple Sequence Repeats) por PCR com o iniciador (GTG)

foi

realizada no volume final 25µL nas seguintes condições: tampão (Tris-HCl

20mM pH 8,4; KCl 50mM), BSA (soro albumina bovina) 0,025μg/μL, dNTP

0,2mM, iniciador (GTG)

0,2pmoles/μL, MgCl

3,0mM, Taq polimerase

0,05U/μL e 2,0ng/μL de DNA. Os ciclos de amplificação foram programados

para um ciclo de desnaturação de 5 minutos a 94°C seguido de 40 ciclos de

desnaturação a 94°C por 15 segundos, anelamento a 55°C por 45 segundos,

extensão a 72°C por 90 segundos, e extensão final a 72°C por seis minutos. Os

produtos de amplificação do lócus ITS1-5.8S-ITS2 dor rDNA foram separados

por eletroforese em gel de agarose 1,3% submetidos a 7,5 volts/cm entre os

eletrodos por 150 minutos em tampão TBE 0,5X, utilizando-se o marcador de

peso molecular de 100pb (Invitrogen Life Technologies) corados em brometo

de etídeo, visualizados em transiluminador de luz ultravioleta e fotografados

com sistema de fotodocumentação (DOC Print Vilber Loumart, França).

ARAÚJO, M. A. S. Caracterização molecular de espécies de Candida... 2006

TABELA 1. Espécies de Candida obtidas de pacientes portadores de AIDS e Câncer

atendidos em Hospitais-Escola de Maceió, Alagoas e da Micoteca URM/UFPE.

ESPÉCIE ISOLADO SUBSTRATO GRUPO DE PACIENTE PROCEDÊNCIA

CALB – 5

ORO AIDS HUPAA

CALB – 6

URINA AIDS HUPAA

CALB – 7

URINA AIDS HUPAA

CALB – 10

ORO AIDS HUPAA

CALB – 11

ORO AIDS HUPAA

CALB – 12

ORO AIDS HUPAA

CALB – 13

ORO AIDS HUPAA

CALB – 22

ORO CÂNCER HUPAA

CALB – 26

ORO CÂNCER HUPAA

CALB – 27

ORO CÂNCER HUPAA

CALB – 28

ORO CÂNCER HUPAA

CALB – 29

ORO CÂNCER HUPAA

CALB – 33

URINA CÂNCER HUPAA

CALB – 36

URINA CÂNCER HUPAA

CALB – 38

URINA CÂNCER UNCISAL

CALB – 55

ORO AIDS UNCISAL

CALB – 57

ORO AIDS UNCISAL

CALB – 58

ORO AIDS UNCISAL

CALB – 60

ORO AIDS UNCISAL

URM - 4126

- - MICOTECA -UFPE

URM - 4126

- - MICOTECA -UFPE

C. albicans

URM - 4126

- - MICOTECA -UFPE

CGLA – 20

URINA AIDS HUPAA

CGLA – 21

URINA AIDS HUPAA

CGLA – 23

URINA CÂNCER HUPAA

CGLA – 32

ORO AIDS HUPAA

CGLA – 34

URINA AIDS HUPAA

CGLA – 35

URINA AIDS HUPAA

CGLA – 37

ORO CÂNCER HUPAA

CGLA – 41

ORO CÂNCER HUPAA

CGLA – 54

ORO AIDS UNCISAL

CGLA – 56

ORO AIDS UNCISAL

C. glabrata

CGLA – 59

ORO AIDS UNCISAL

CGUI – 02

ORO AIDS HUPAA

CGUI – 03

ORO AIDS HUPAA

CGUI – 04

ORO AIDS HUPAA

CGUI – 17

ORO AIDS HUPAA

CGUI – 30

ORO AIDS UNCISAL

CGUI – 31

ORO AIDS UNCISAL

CGUI – 39

ORO AIDS UNCISAL

CGUI – 40

ORO AIDS UNCISAL

CGUI – 42

ORO AIDS UNCISAL

URM - 4975

- - MICOTECA -UFPE

C. guilliermondii

URM - 4819

- - MICOTECA -UFPE

CPAR – 08

ORO AIDS HUPAA

CPAR – 09

ORO AIDS HUPAA

CPAR – 14

ORO AIDS HUPAA

CPAR – 15

ORO AIDS HUPAA

CPAR – 16

ORO AIDS HUPAA

CPAR – 18

URINA AIDS HUPAA

CPAR – 19

URINA AIDS UNCISAL

URM - 4261

- - MICOTECA -UFPE

C. parapsilosis

URM - 4984

- - MICOTECA -UFPE

CTRO – 01

ORO AIDS HUPAA

CTRO – 24

ORO AIDS UNCISAL

CTRO – 25

URINA AIDS UNCISAL

CTRO – 53

ORO CÂNCER HUPAA

URM - 4977

- - MICOTECA -UFPE

C. tropicalis

URM - 4262

- - MICOTECA -UFPE

CALB – C. albicans; CGLA – C. glabrata; CGUI – C. guilliermondii; CPAR – C. parapsilosis;

CTRO – C. tropicalis; HU – Hospital Universitário Prof. Alberto Antunes-HUPAA; UNCISAL -

Universidade de Ciências da Saúde de Alagoas; ORO – Secreção de orofaringe.

ARAÚJO, M. A. S. Caracterização molecular de espécies de Candida... 2006

TABELA 2. Iniciadores usados para amplificar segmentos de DNA de espécies

de Candida.

INICIADOR

SEQUÊNCIA

MARCADOR

MOLECULAR

REFERÊNCIA

(GTG)

GTGGTGGTGGTGGTG ISSR Lieckfeldt et al.

ITS4 TCCTCCGCTTATTGATATGC rDNA White et al.

ITS5 GGAAGTAAAAGTCGTAACAA rDNA White et al.

CALB 1 TTTATCAACTTGTCACACCA rDNA Luo & Mitchell

CALB 2 ATCCCGCCTTACCACTACCG rDNA Luo & Mitchell

A reação de amplificação da região ITS do DNA ribossomal por

PCR foi realizada em 25µL de volume final utilizando os iniciadores ITS4 e

ITS5, em termociclador HIBAID, nas seguintes condições: tampão (Tris-HCl

20mM pH 8,4; KCl 50mM), BSA (soro albumina bovina) 0,025μg/μL, dNTP

0,2mM, iniciador ITS

0,5pmoles/μL, iniciador ITS

0,5pmoles/μL, MgCl

3,0mM, Taq polimerase 0,05U/μL e 2,0ng/μL de DNA. Os ciclos de

amplificação foram programados para um ciclo de desnaturação inicial de 6

minutos a 94°C, seguido de 35 ciclos para desnaturação a 94°C por 20

segundos, anelamento a 55°C por 20 segundos, extensão a 72°C por 60

segundos, com extensão final a 72°C por cinco minutos. Os produtos de

amplificação foram separados por eletroforese e fotografados, nas mesmas

condições do item anterior.

Amplificação com Iniciadores CALB1 e CALB2

A reação de amplificação por PCR com os iniciadores espécie-

específicos CALB1 e CALB2

foi realizada em 20μL de volume final em

ARAÚJO, M. A. S. Caracterização molecular de espécies de Candida... 2006

termociclador HIBAID, nas seguintes condições: tampão (Tris-HCl 20mM pH

8,4; KCl 50mM), BSA (soro albumina bovina) 0,025μg/μL, dNTP 0,2mM,

iniciador CALB1 0,5pmoles/μL, iniciador CALB 2 0,5pmoles/μL, MgCl

3,0mM,

Taq polimerase 0,05U/μL e 2,0ng/μL de DNA. Os ciclos de amplificação foram

programados para um ciclo de desnaturação inicial de 5 minutos a 96ºC,

seguidos de 40 ciclos para desnaturação a 94ºC por 30 segundos, pareamento

a 58ºC por 30 segundos, extensão a 72ºC por 30 segundos, com extensão final

a 72ºC por 15 minutos. Os produtos de amplificação foram separados por

eletroforese e fotografados em condições iguais às descritas para o iniciador

(GTG)

Análises Estatísticas

Os dados obtidos com as amplificações com o marcador (GTG)

foram analisadas pelo programa Numerical Taxonomy System of Multivariate

Programs – NTSYS – PC 2.1

3, 8, 24

. Os dados foram introduzidos na forma de

variáveis binárias, nas quais o número 1 (um) significa a presença do

fragmento e o número 0 (zero) a ausência. A partir desta análise, o programa

constrói uma matriz de similaridade utilizando o coeficiente similaridade Simple

Matching (SM). A partir da matriz de similaridade foi gerado um dendrograma

pelo método de agrupamento UPGMA (Unweighted Pair Group Method With

Arithmetical Average).

RESULTADOS E DISCUSSÃO

A amplificação do locus ITS1-5.8S-ITS2 do DNA ribossomal

utilizando os iniciadores ITS4 e ITS5 gerou um fragmento de 550pb para todos

isolados de C. albicans, C. glabrata, C. guilliermondii e C. tropicalis. Enquanto a

espécie C. parapsilosis amplificou um fragmento de aproximadamente 520pb,

ARAÚJO, M. A. S. Caracterização molecular de espécies de Candida... 2006

como mostra a Figura 1. Estes dados são semelhantes aos observados por

Guillamón et al.

e Chen et al.

que identificaram espécies de leveduras

baseadas na análise de RFLP da região ITS do DNA ribossomal, sendo

observado que os produtos obtidos através da PCR desta região

demonstraram grande variação específica.

A espécie C. glabrata amplificou um fragmento de 550pb da

região ITS do rDNA, sendo que o tamanho do fragmento amplificado foi

diferente do observado por Cirak et al.

quando utilizaram métodos

moleculares na identificação de espécies de Candida obtendo um fragmento de

800pb para esta espécie.

As espécies C. albicans e C. tropicalis apresentaram o mesmo

tamanho de fragmento para a região ITS do DNA ribossomal. Guillamón et al.

e Chen et al.

comprovaram que estas espécies apresentam o mesmo tamanho

do fragmento ITS, mas são espécies diferentes, através da utilização de

enzimas de restrição, que funcionam como uma ferramenta para diferenciar

espécies com mesmo tamanho de fragmento ITS, uma vez que apresentam

sítios diferentes para as mesmas enzimas de restrição (CfoI, HaeIII, HinfI,

BsaHI, HineII) resultando em padrões específicos.

O tamanho do fragmento de C. guilliermondii para região ITS do

rDNA foi de aproximadamente 550pb, sendo que para esta espécie Williams et

obteve um fragmento amplificado de 600pb quando identificaram espécies

de Candida através de PCR e análises de polimorfismo de fragmentos de

restrição da região ITS do DNA ribossomal. HSU et al.

identificaram fungos

de interresse médico através de iniciadores para seqüências específicas de C.

albicans (CALB1 e CALB2), C. glabrata (CGL1 e CGL2), C. guilliermondii

ARAÚJO, M. A. S. Caracterização molecular de espécies de Candida... 2006

(CGU1 e CGU2), C. parapsilosis (CPA1 e CPA2), C. tropicalis (CTR1 e

CTRO2), C. krusei (CKRU1 e CKRU2) e Cryptococcus neorformans (CN5 e

CN4) e obtiveram apenas produtos de PCR amplificados de suas respectivas

espécies.

Das leveduras de referência provenientes da Coleção de Culturas

Micoteca-URM foram obtidos produtos de PCR da região ITS do DNA

ribossomal, sendo amplificado um fragmento de aproximadamente 550bp para

as espécies: C. albicans (URM-4986 e URM-4385), C. tropicalis (URM-4262 e

URM-4817), C. guilliermondii (URM-4819), C. parapsilosis (URM-4261 e URM-

4984) e de 450bp para o isolado URM-4975 de C. guilliermondii (Figura 2). Os

resultados obtidos são semelhantes aos observados por Guillamón et al.

Chen et al.

para espécies C. albicans, C. tropicalis e C. parapsilosis, mas

diferem para C. guilliermondii, que segundo os autores apresenta um

fragmento de 600pb. Vale salientar que não foi obtida amostra de referência de

C. glabrata.

As espécies identificadas pelo método convencional como C.

albicans, C. glabrata, C. guilliermondii, C. parapsilosis e C. tropicalis foram

identificadas através da biologia molecular utilizando-se os iniciadores espécie-

específico CALB1 e CALB2, sendo incluídas as amostras de referencia (Tabela

1). Com a utilização destes marcadores, verificou-se que todos os isolados

identificados como C. albicans, amplificaram um fragmento de 273pb com os

iniciadores específicos para C. albicans confirmando a espécie. Entre os

isolados desta espécie verificou-se grande variação morfológica em relação

aos aspectos macroscópicos, no entanto com relação aos aspectos

microscópicos observou-se características marcantes, como a formação de

ARAÚJO, M. A. S. Caracterização molecular de espécies de Candida... 2006

pseudomicélio e de clamidósporos formados em microcultivos utilizando-se os

meios agar-fubá, agar-arroz e bile de boi, que características da espécie

segundo Barnett et al.

e Kreger-van Rij

. Os resultados obtidos são

semelhantes aos descritos por Luo e Mitchell

que identificaram fungos

patogênicos de culturas utilizando reações de PCR em multiplex e obtiveram

100% de sensibilidade e especificidade para iniciadores espécie-específico da

região ITS do rDNA.

Os resultados obtidos com as espécies de C. glabrata e C.

guilliermondii são diferentes dos encontrados na literatura com a utilização dos

iniciadores CALB e ITS. HSU et al.

e Chavasco et al.

utilizaram iniciadores

espécie-específicos para confirmação dessas espécies e demonstraram que a

técnica de PCR é útil, prática e mais precisa.

Em relação a C. parapsilosis todos os isolados identificados pelo

método convencional coincidiram com a identificação molecular utilizando-se

os iniciadores ITS sendo observado um fragmento de 520pb e com os

iniciadores CALB1 e CALB2, verificando-se que os isolados identificados como

C. glabrata não amplificaram, sendo considerados espécies diferentes de

C.albicans. Hsu et al.

, Luo e Mitchell

e Nazzal et al.

utilizaram

iniciadores específicos para identificação de diferentes espécies de leveduras e

obtiveram produtos de PCR apenas para as espécies que apresentam

seqüências homólogas aos iniciadores mencionados.

Nos isolados de C.albicans foram encontrados perfis que

variaram entre 3 a 20 fragmentos, em C. glabrata entre 1 a 19 fragmentos, em

C. guilliermondii entre 2 a 21 fragmentos, em C. parapsilosis entre 9 a 22

fragmentos e em C. tropicalis entre 1 a 18 fragmentos (Figura 3).

ARAÚJO, M. A. S. Caracterização molecular de espécies de Candida... 2006

Os perfis gerados pela amplificação com o iniciador (GTG)

para

C. albicans, C. glabrata, C. guilliermondii, C. parapsilosis e C. tropicalis (Figura

4, 5, 6, 7, 8). Os isolados de C. albicans geraram perfis que foram reunidos em

três grupos, um com 73% de similaridade (A e C) e outro com 65% de

similaridade (B). Os isolados URM-4126 e CALB-12, URM-4385 e CALB-55,

CALB-57 e CALB-60, CALB-28 e CALB-29 apresentaram 100% de

similaridade. Dos 6 isolados do grupo A, 5 foram obtidos de pacientes

portadores de AIDS e 1 de portador de câncer, sendo observado 4 padrões

diferentes. No grupo B observou-se que dos 4 isolados, 3 foram obtidos de

pacientes com câncer apresentando 3 padrões distintos e 1isolado de paciente

com AIDS. O grupo C apresentou 8 isolados, sendo 5 isolados obtidos de

pacientes portadores de AIDS todos com padrões distintos e 3 isolados de

portadores de câncer com 2 padrões diferentes. Entre os 18 isolados de

C.albicans obtidas de pacientes portadores de AIDS e de portadores de câncer,

foram discriminados 17 padrões. Os resultados obtidos mostram que houve

grande variabilidade intraespecífica entre os isolados de C. albicans,

demonstrando que a utilização deste marcador pode ser uma importante

ferramenta para distinguir linhagens dentro da mesma espécie. Estes dados

são semelhantes ao observados por Thanos et al.

que identificaram espécies

de Candida com ISSR, sendo que os produtos amplificados de 26 espécies de

Candida apresentaram maior variabilidade interespecifica do que

intraespecifica.

O dendrograma gerado para C. glabrata apresentou 5 grupos,

sendo que os isolados do grupo A apresentaram 80% de similaridade, mas os

isolados CGLA – 20 e CGLA – 21 apresentaram 100% de similaridade. O grupo

ARAÚJO, M. A. S. Caracterização molecular de espécies de Candida... 2006

B apresentou 4 isolados com 90% de similaridade. O grupo C está formado

pelos isolados CGLA – 34 e CGLA – 35 e apresentaram 100% de similaridade

entre eles e com cerca de 62% de fragmentos comuns com os grupos A e B.

Os isolados CGLA – 37 contidos no grupo D e CGLA – 23 no grupo E, foram os

mais distintos, com 59 e 53%, respectivamente, em relação aos demais grupos

através da análise da distância genética. Em relação ao grupo de pacientes

observou-se que dos 11 isolados 8 foram obtidos de pacientes portadores de

AIDS e 3 de pacientes de portadores de câncer, sendo observados 9 padrões

distintos. No grupo A foram discriminados 2 padrões, no grupo B 3 padrões dos

quais os isolados CGLA – 41 de paciente com câncer e CGLA – 54 de paciente

com AIDS apresentaram o mesmo padrão, no grupo C 2 isolados com 1

padrão, o grupo D e E com os isolados CGLA – 37 e CGLA – 23,

respectivamente com padrões diferentes. Os resultados obtidos com este

marcador molecular demonstram que a presença ou ausência de um fragmento

detecta polimorfismo entre os isolados caracterizando linhagens. Silva-Filho et

al.

determinaram o padrão de Saccharomyces cerevisiae após análise

molecular baseada em PCR através do iniciador (GTG)

, fragmentos

polimórficos identificados entre as linhagens de S. cerevisiae, permitindo a

discriminação de 17 linhagens nativas desta espécie, as quais foram

confirmadas pelo método convencional de identificação. Brasileiro

também fez

uso deste marcador molecular em isolados de Fusarium solani e verificou que

esta ferramenta foi mais eficiente para caracterizar a variabilidade genética

intraespecífica.

Os isolados de C. guilliermondii geraram 4 perfis, sendo que o

grupo A apresentou 75% de similaridade de tamanho de fragmento, o grupo B

ARAÚJO, M. A. S. Caracterização molecular de espécies de Candida... 2006

com 83%, o grupo C com 72% e o grupo D com 95%. Os isolados CGUI – 03,

CGUI - 30 e CGUI – 31, pertencentes ao grupo B apresentaram 100% de

similaridade. Os nove isolados foram obtidos de pacientes portadores de

AIDS, sendo observados 5 isolados no grupo B com 3 padrões diferentes dos

quais os isolados CGUI – 03, CGUI – 30 e CGUI – 31 apresentaram o mesmo

padrão. O grupo C e D com 2 isolados cada um apresentando um padrão

distinto.

Dos 9 isolados de C. parapsilosis 8 foram discriminados com

84%, sendo os perfis gerados agrupados em três grupos, o grupo A com 73%

de similaridade, o grupo B com 55% e o grupo C com 49% de similaridade,

sendo que os isolados deste grupo, CPAR – 18 e CPAR – 19 apresentaram

100% de similaridade. Os grupos A e B de C. parapsilosis se relacionam a

aproximadamente 55% de similaridade. Entre os isolados desta espécie 7

foram obtidos de pacientes portadores de AIDS, sendo observado 5 isolados

no grupo B com 3 padrões distintos e 2 isolados no grupo C com um padrão.

Os perfis gerados pelos isolados de C. tropicalis foram agrupados

em 3 grupos, sendo que os isolados do grupo A apresentaram 73% de

similaridade. Os isolados CTRO – 53 e CTRO – 51 se relacionam com 82% de

similaridade, o grupo B com apenas um isolado apresentou 62% de

similaridade com o grupo A. O grupo C se relaciona com o grupo A com 55%

de similaridade. Dos 5 isolados desta espécie foram obtidos 4 padrões

distintos, sendo o grupo A com 3 isolados e 2 padrões diferentes, o grupo B e

C com 1 isolado cada um apresentando padrões distintos.

Em relação ao grau de similaridade, observou-se que as

diferentes espécies apresentam percentuais bem diversificados, verificando-se

ARAÚJO, M. A. S. Caracterização molecular de espécies de Candida... 2006

que a PCR utilizando-se o iniciador (GTG)

funciona como uma importante

ferramenta para detectar a diversidade genética de leveduras. Segundo Couto

et al.

que realizaram acompanhamento de leveduras presentes na cadeia

produtiva da indústria de maionese e saladas, verificaram que das 127

leveduras isoladas foram identificadas espécies de Zygosaccharomyces,

Candida, Pichia e Cryptococcus pelo “kit” API ID 32. Os autores utilizaram

também o marcador molecular (GTG)

e obtiveram 28 perfis para as espécies

identificadas pelo “kit” API, sendo que o iniciador (GTG)

foi capaz de

discriminar seis isolados que não foram identificados pelo sistema API.

ARAÚJO, M. A. S. Caracterização molecular de espécies de Candida... 2006

TABELA 1. Comparação entre a identificação convencional e a identificação

molecular utilizando os iniciadores espécie-específicos CALB1 e CALB2.

ISOLADO INICIADORES CALB1 E 2 IDENTIFICAÇÃO PELO MÉTODO

CONVENCIONAL

IDENTIFICAÇÃO POR PCR

CALB – 5

C. albicans C. albicans

CALB – 6

C. albicans C. albicans

CALB – 7

C. albicans C. albicans

CALB – 10

C. albicans C. albicans

CALB – 11

C. albicans C. albicans

CALB – 12

C. albicans C. albicans

CALB – 13

C. albicans C. albicans

CALB – 22

C. albicans C. albicans

CALB – 26

C. albicans C. albicans

CALB – 27

C. albicans C. albicans

CALB – 28

C. albicans C. albicans

CALB – 29

C. albicans C. albicans

CALB – 33

C. albicans C. albicans

CALB – 36

C. albicans C. albicans

CALB – 38

C. albicans C. albicans

CALB – 55

C. albicans C. albicans

CALB – 57

C. albicans C. albicans

CALB – 58

C. albicans C. albicans

CALB – 60

C. albicans C. albicans

URM - 4126

C. albicans C. albicans

URM - 4126

C. albicans C. albicans

URM - 4126

C. albicans C. albicans

CGLA – 20

C. glabrata

Não albicans

CGLA – 21

C. glabrata

Não albicans

CGLA – 23

C. glabrata

Não albicans

CGLA – 32

C. glabrata C. albicans

CGLA – 34

C. glabrata C. albicans

CGLA – 35

C. glabrata C. albicans

CGLA – 37

C. glabrata C. albicans

CGLA – 41

C. glabrata C. albicans

CGLA – 54

C. glabrata

Não albicans

CGLA – 56

C. glabrata

Não albicans

CGLA – 59

C. glabrata

Não albicans

CGUI – 02

C. guilliermondii

Não albicans

CGUI – 03

C. guilliermondii

Não albicans

CGUI – 04

C. guilliermondii

Não albicans

CGUI – 17

C. guilliermondii

Não albicans

CGUI – 30

C. guilliermondii

Não albicans

CGUI – 31

C. guilliermondii C. albicans

CGUI – 39

C. guilliermondii C. albicans

CGUI – 40

C. guilliermondii C. albicans

CGUI – 42

C. guilliermondii

Não albicans

URM - 4975

C. guilliermondii C. albicans

URM - 4819

C. guilliermondii

Não albicans

CPAR – 08

C. parapsilosis

Não albicans

CPAR – 09

C. parapsilosis

Não albicans

CPAR – 14

C. parapsilosis

Não albicans

CPAR – 15

C. parapsilosis

Não albicans

CPAR – 16

C. parapsilosis

Não albicans

CPAR – 18

C. parapsilosis

Não albicans

CPAR – 19

C. parapsilosis

Não albicans

URM - 4261

C. parapsilosis

Não albicans

URM - 4984

C. parapsilosis

Não albicans

CTRO – 01

C. tropicalis

Não albicans

CTRO – 24

C. tropicalis

Não albicans

CTRO – 25

C. tropicalis

Não albicans

CTRO – 53

C. tropicalis

Não albicans

URM - 4977

C. tropicalis

Não albicans

URM - 4262

C. tropicalis C. albicans

ARAÚJO, M. A. S. Caracterização molecular de espécies de Candida... 2006

FIGURA 1. Amplificação da região ITS do rDNA de isolados de C. albicans

(A), C. glabrata (B), C. tropicalis (C) obtidas de pacientes portadores de

AIDS e de portadores de Câncer; C. guilliermondii (D) e C. parapsilosis (E)

obtidas de portadores de AIDS atendidos em Hospitais-Escola de Maceió,

Alagoas; URM – amostras da coleção de cultura micoteca; M - marcador

molecular de 100 pb.

URM

4986 05 07 10 11 M 12 13 22 26 27

2072

1500

600

100

550

2072

1500

600

100

550

URM

4986 06 28 29 33 36 M 38 55 57 58 60

20 21 23 32 34 35 M 37 41 54 56 59

URM

M 4975 02 03 04 17 30 31 39 40 42

URM

M 4984 08 09 14 15 16 18 19

URM

M 01 24 25 4977 53

2072

1500

600

100

550

2072

1500

600

100

550

2072

1500

600

100

550

2072

1500

600

100

550

ARAÚJO, M. A. S. Caracterização molecular de espécies de Candida... 2006

FIGURA 2. Amplificação da região ITS do rDNA de espécies de

Candida obtidas da Micoteca URM-UFPE. C. albicans (4986 e 4385); C.

tropicalis (4262 e 4817); C. guilliermondii (4975 e 4819); C. parapsilosis

(4261 e 4984); M – marcador molecular de 100 pb.

2072

1500

600

100

550

400

4986

262

817

819

261

4984

385

URM

4126

ARAÚJO, M. A. S. Caracterização molecular de espécies de Candida... 2006

FIGURA 3. Perfis de amplificação ISSR com o iniciador (GTG)

de isolados de

C. albicans (A), C. glabrata (B), C. tropicalis (C) obtidas de pacientes

portadores de AIDS e de portadores de Câncer; C. guilliermondii (D) e C.

parapsilosis (E) obtidas de portadores de AIDS atendidos em Hospitais-Escola

de Maceió, Alagoas; URM – amostras da coleção de cultura micoteca; M –

Saccharomyces cerevisiae utilizada como marcador de peso molecular.

3100

2500

2200

650

750

URM URM

4986 28 29 33 36 38 M 55 57 58 60 4385

20 21 23 32 34 35 M 37 41 54 56 59

URM

4984 08 09 14 M 15 16 18 19

URM URM

4977 01 24 M 25 53 4262

URM URM

4975 02 03 04 17 M 30 31 39 40 42 4819

URM

4986 05 06 07 M 10 11 12 13 22 26

3100

2500

2200

650

750

3100

2500

2200

650

750

3100

2500

2200

650

750

3100

2500

2200

650

750

3100

2500

2200

650

750

A A

B C

D E

ARAÚJO, M. A. S. Caracterização molecular de espécies de Candida... 2006

FIGURA 4. Dendrograma dos perfis obtidos da amplificação de ISSR com o

iniciador (GTG)

de isolados de C. albicans obtidas de pacientes portadores

de AIDS(*) e de portadores de Câncer (**) atendidos em Hospitais-Escola de

Maceió, Alagoas, através do método de agrupamento UPGMA, utilizando o

coeficiente de similaridade Simple Matching (SM).

ARAÚJO, M. A. S. Caracterização molecular de espécies de Candida... 2006

FIGURA 5. Dendrograma dos perfis obtidos da amplificação de ISSR com o

iniciador (GTG)

de isolados de C. glabrata obtidas de pacientes portadores de

AIDS (*) e de portadores de Câncer (**) atendidos em Hospitais-Escola de

Maceió, Alagoas, através do método de agrupamento UPGMA, utilizando o

coeficiente de similaridade Simple Matching (SM).

ARAÚJO, M. A. S. Caracterização molecular de espécies de Candida... 2006

FIGURA 6. Dendrograma dos perfis obtidos da amplificação de ISSR com o

iniciador (GTG)

de isolados de C. guilliermondii obtidas de pacientes

portadores de AIDS atendidos em Hospitais-Escola de Maceió, Alagoas,

através do método de agrupamento UPGMA, utilizando o coeficiente de

similaridade Simple Matching (SM).

ARAÚJO, M. A. S. Caracterização molecular de espécies de Candida... 2006

FIGURA 7. Dendrograma dos perfis obtidos da amplificação de ISSR com o

iniciador (GTG)

de isolados de C. parapsilosis obtidas de pacientes

portadores de AIDS atendidos em Hospitais-Escola de Maceió, Alagoas,

através do método de agrupamento UPGMA, utilizando o coeficiente de

similaridade Simple Matching (SM).

ARAÚJO, M. A. S. Caracterização molecular de espécies de Candida... 2006

100

FIGURA 8. Dendrograma dos perfis obtidos da amplificação de ISSR com o

iniciador (GTG)

de isolados de C. tropicalis obtidas de pacientes portadores

de AIDS (*) e de portadores de Câncer (* *) atendidos em Hospitais-Escola de

Maceió, Alagoas, através do método de agrupamento UPGMA, utilizando o

coeficiente de similaridade Simple Matching (SM).

ARAÚJO, M. A. S. Caracterização molecular de espécies de Candida... 2006

101

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ARAÚJO, M. A. S. Caracterização molecular de espécies de Candida... 2006

105

5. CONCLUSÕES GERAIS

Com base nos resultados obtidos podemos concluir que:

1. Pacientes portadores de AIDS e Câncer apresentam grande

predisposição ao isolamento de leveduras por se tratar de um grupo

imunodeprimido e que a presença de qualquer microrganismo pode

causar infecções graves se não forem diagnósticas precocemente;

2. O espécimen clínico de maior ocorrência para isolamento de leveduras

foi a secreção de orofaringe tanto nos pacientes portadores de AIDS

como de Câncer;

3. A Candida albicans foi a espécie de maior ocorrência nos dois grupos de

pacientes seguida de C. glabrata, C. guilhermondii, C. parapsilosis, C.

tropicalis;

4. Em pacientes portadores de Câncer não foram isoladas C. guilhermondii

e C. parapsilosis;

5. Todos os marcadores moleculares mostraram-se eficientes,

reprodutíveis e auxiliam na identificação convencional, constituindo-se

em ferramentas apropriadas para caracterização genética entre

espécies de Candida.

ARAÚJO, M. A. S. Caracterização molecular de espécies de Candida... 2006

106

6. ANEXOS

6. 1 FICHA DO PACIENTE

FICHA DO PACIENTE

N.° do Prontuário N.° Pesquisa

DADOS PESSOAIS

Endereço

DADOS RELACIONADOS COM A DOENÇA

Lesões preexistentes Sim Não N.º de lesões

Protocolo

DIAGNÓSTICO MICOLÓGICO SANGUE

Nome

Sexo

Masculino Feminino

Ocupação

Idade

Estado Civil

Doença de

AIDS CÂNCER

Tipo de

Câ

Início da

Tratamento

Qual?

Local

Sintomas

Grupo de

Teste de Elisa

Exame Direto

Cultura

ARAÚJO, M. A. S. Caracterização molecular de espécies de Candida... 2006

107

DIAGNÓSTICO MICOLÓGICO URINA

DIAGNÓSTICO MICOLÓGICO OROFARINGE

Agente Etiológico

Conclusão

Exame Direto

Cultura

Conclusão

Agente Etiológico

Exame Direto

Cultura

Conclusão

Agente Etiológico

CONCLUSÃO GERAL

ARAÚJO, M. A. S. Caracterização molecular de espécies de Candida... 2006

108

6.2 TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO

TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO

Eu, _________________________________________, paciente matriculado

no __________________________________ com registro _______________, tendo

sido convidado(a) a participar como voluntário(a) do estudo intitulado “Fungos em

pacientes portadores de HIV/AIDS atendidos no Hospital escola Dr. Helvio

Auto/ECMAL de Maceió-Alagoas, Brasil”, recebi da estudante de doutorado da Pós-

Graduação em Biologia de Fungos da Universidade Federal de Pernambuco Maria

Anilda dos Santos Araújo professora substituta da Universidade Federal de Alagoas,

responsável pela execução da mesma os seguintes esclarecimentos que me

permitiram compreender sem dificuldade e perfeitamente os seguintes aspectos:

1. Que o estudo se propõe a coletar amostras clínicas de secreção da orofaringe,

sangue e urina, como também se necessário realizar a raspagem da pele;

2. Que a importância deste estudo é a de diagnosticar doenças causadas por fungos

nas diferentes amostras clínicas coletadas;

3. Que os resultados que se desejam alcançar são os seguintes: identificar as

espécies de fungos isoladas

4. Que esse estudo começará em janeiro de 2005 e terminará em dezembro de 2005;

5. Que o estudo será realizado da seguinte maneira: coleta de amostras clínicas,

identificação das espécies, emissão dos resultados dos exames, encaminhamentos

dos resultados aos hospitais e analisar geneticamente as diferentes espécies isoladas

e identificadas;

6. Que eu participarei das seguintes etapas: coleta de amostras clínicas e recebimento

do resultado do exame;

7. Que as alternativas conhecidas para se obter os mesmos resultados são as

seguintes: não existe outro método para o isolamento e identificação de fungos

causadores de micoses;

8. Que os desconfortos que poderei sentir durante a minha participação são os

seguintes: não haverá desconforto para a coleta de amostras clínicas;

9. Que não existe riscos à minha saúde física e mental, pois todo material utilizado na

coleta de amostras estão esterilizados e que será realizado por profissionais

qualificados;

10. Que continuarei sendo atendido no referido hospital e dispondo de toda a atenção,

independente de minha participação na pesquisa;

11. Que os benefícios que deverei esperar com minha participação, são: a detecção

da doença causada por fungos e um tratamento especifico para determinada micose

que deverá ser efetuado pela equipe de médicos do hospital.

12. Que a minha participação na pesquisa será acompanhada pelos médicos dos

hospitais, desde a coleta de amostras clínicas, encaminhamento dos resultados dos

exames e tratamento;

ARAÚJO, M. A. S. Caracterização molecular de espécies de Candida... 2006

109

13. Que, sempre que desejar, me foram dados esclarecimentos sobre cada uma das

etapas do estudo;

14. Que eu poderei, a qualquer momento, recusar-me a continuar participando do

estudo e também a retirar este meu consentimento, sem que isso me traga qualquer

penalidade ou prejuízo;

15. Que as informações conseguidas através da minha participação no estudo não

permitirão a identificação da minha pessoa, exceto pelos responsáveis, e que a

divulgação das mencionadas informações ficará restrita ao âmbito técnico ou

científico;

16. Que eu deverei ser indenizado por qualquer despesa que venha a sofrer pela

minha participação nesse estudo e, também, por quaisquer danos que venha a sofrer

pela mesma razão, sendo que, para essas despesas, foi-me assegurada à existência

de recursos específicos;

Finalmente, tendo eu compreendido perfeitamente tudo o que me foi

informado sobre a minha participação no mencionado estudo e estando consciente

dos meus direitos, das minhas responsabilidades, dos riscos e dos benefícios que

minha participação implicarão, concordo em dele participar e para isso eu DOU O

MEU CONSENTIMENTO SEM QUE QUALQUER CONSTRANGIMENTOS OU

IMPOSIÇÃO me obriguem a isso.

Endereço do participante-voluntário(a):

Domicílio:_____________________________________________________Nº______

Complemento:___________________________________ Bairro:________________

CEP:_______________ Cidade:________________________ UF:________________

Telefone:___________________ Ponto de referência:__________________________

Contato de Urgência:____________________________________________________

Endereço dos responsáveis pela pesquisa:

Instituição: Universidade Federal de Alagoas - Centro

de Ciências Biológicas

Endereço: Praça Afrânio Jorge s/n, Prado

CEP:57010-000

Cidade:Maceió UF:Alagoas

Telefones para contato: (82) 223-5613/376-

9236/9341-7177

Endereço do Comitê de Ética em Pesquisa:

Instituição: Universidade Federal de Alagoas –

Reitoria, 1º Andar, sala do COC

Endereço: Campus A. C. Simões, BR 104 – Norte, Km

97, Tabuleiro dos Martins

CEP: 57072-970 Cidade: Maceió UF:Alagoas

Telefones para contato: (82) 214-1053

FAX (82) 214-1600

Maceió, _____ de _________________ de _______

Assinatura ou impressão datiloscópica do voluntário

ou responsável legal

Assinatura do responsável pelo estudo

ARAÚJO, M. A. S. Caracterização molecular de espécies de Candida... 2006

110

6. 3 REGISTRO NO COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA

ARAÚJO, M. A. S. Caracterização molecular de espécies de Candida... 2006

111

6.4. NORMAS PARA ELABORAÇÃO DOS ARTIGOS

INSTRUÇÕES AOS AUTORES

ISSN 1517-8382 versão

impressa

ISSN 1678-4405 versão online

• Objetivo e política editorial

• Preparação de originais

Objetivo e política editorial

A Brazilian Journal of Microbiology destina-se à publicação de trabalhos de

pesquisa originais, notas breves e, ocasionalmente, revisões, envolvendo todos os

aspectos da microbiologia. Os textos submetidos à publicação devem ser redigidos

em inglês, e conter Título, Resumo e Palavras-chave também em português. A

Brazilian Journal of Microbiology tem uma política muito severa de avaliação

dos trabalhos submetidos à publicação, sendo cada manuscrito avaliado por pelo

menos dois revisores criteriosamente selecionados.

Enviando originais para publicação

Ser membro da Sociedade Brasileira de Microbiologia não é um pré-requisito para

a aceitação de um manuscrito para publicação. Trabalhos de pesquisadores do

Brasil e de outros países, não membros da SBM, são igualmente considerados

para publicação.

Quando um manuscrito é submetido à publicação, entende-se que todos os

autores e suas instituições estão de acordo com a publicação. Manuscritos

submetidos à publicação na Brazilian Journal of Microbiology não podem ter

sido publicados anteriormente (exceto na forma de resumo), nem ter sido

sumbetidos à publicação em outro periódico.

Brazilian Journal of Microbiology não assume qualquer responsabilidade por

erros cometidos pelos autores. Além disso, a Brazilian Journal of Microbiology

não assume qualquer responsabilidade pelas conclusões dos autores.

Todos os manuscritos devem ser submetidos em triplicata aos Editores

, e

enviados ao endereço abaixo (por e-mail ou por fax não são aceitos).

Publicação de um manuscrito

Manuscritos são aceitos para publicação somente após criticamente revisados. Os

trabalhos são avaliados por revisores indicados pelo Editores. Após a revisão, os

manuscritos são devolvidos para o autor indicado, para as correções sugeridas

pelos revisores, quando necessárias. Os autores devem retornar o novo texto

para os Editores. O autor indicado recebe uma notificação sobre o recebimento, a

aceitação ou a recusa de um trabalho submetido à publicação.

Quando um manuscrito é aceito, o autor indicado é avisado sobre a necessidade

ARAÚJO, M. A. S. Caracterização molecular de espécies de Candida... 2006

112

de envio de um disquete de computador contendo o texto. O autor indicado

receberá provas tipográficas para correção, que deverão ser cuidadosamente

revisadas de acordo com as instruções enviadas e devolvidas no prazo de 5 dias.

Preparação de originais

Tipos de trabalhos

Os seguintes tipos de trabalho podem ser publicados na Brazilian Journal of

Microbiology:

Trabalho de pesquisa relata os resultados de pesquisa original ainda não

publicada. O texto deve ter de 12 a 15 páginas impressas, em espaço duplo,

além das referências bibliográficas, tabelas e figuras pertinentes. Um Resumo

com Título e Palavras-chave em português também devem ser incluídos.

Nota breve é um relato conciso de novas e importantes descobertas. A Nota

Breve deve ser redigida de acordo com as instruções para a preparação de

Trabalho de Pesquisa, mas sem as divisões em tópicos. Os Resumos em

português e em inglês devem conter no máximo 50 palavras. Tabelas e Figuras

devem limitar-se a duas tabelas ou duas figuras, ou uma tabela e uma figura. A

designação short communication aparecerá no topo do trabalho. O autor deve

indicar que o manuscrito é uma nota breve, permitindo que o texto seja avaliado

de maneira apropriada.

Mini-revisão - Artigos de revisão serão sobre temas de interesse geral na área

de microbiologia, escritos por especialistas convidados. Além dos resumos em

inglês e em português, o texto poderá ter também um índice.

Preparação do texto

Geral

1. Todos os manuscritos devem ser datilografados em espaço duplo, com amplas

margens, com as páginas numeradas em seqüência. Trabalhos de pesquisa

devem ter no máximo 15 páginas impressas, incluindo figuras e tabelas. Notas

breves devem ter no máximo 6 páginas.

2. Todos os manuscritos devem ser redigidos em inglês. Os Editores

recomendam que, antes de ser submetido, o texto seja cuidadosamente revisado

por alguém fluente em inglês. Manuscritos em inglês precário não serão aceitos.

3. O texto deve ser organizado em tópicos, conforme descrito no próximo

parágrafo. O nome dos tópicos deve ser digitado em letras maiúsculas

(ABSTRACT, INTRODUCTION etc.). A citação de tabelas e de figuras deve iniciar

com maiúsculas (as shown in Table 1..., as presented in Fig. 2..., etc.).

4. A abreviação de palavras e de símbolos deve seguir as recomendações da

IUPAC-IUB Commission. O Sistema Métrico deve ser adotado em todo o texto.

5. Como regra, as referências devem ser citadas por seus números.

Excepcionalmente, quando autores são mencionados no texto, a menção deve

ser feita de acordo com os seguintes exemplos: Bergdoll (número) reported

that..., Bailey and Cox (número) observed that..., ou Smith et al. (número)

ARAÚJO, M. A. S. Caracterização molecular de espécies de Candida... 2006

113

mentioned that... Não utilizar letras maiúsculas.

6. Aos autores dos trabalhos aceitos para publicação será solicitado o envio de

um disquete de 3 1/2" contendo o trabalho digitado em um processador de texto

adequado para PC. Esse material pode ser enviado também por correio

eletrônico.

Organização

Página de título: Uma página separada deve conter o título do trabalho, o

nome completo (inclusive o primeiro nome e as iniciais intermediárias) e a

afiliação de cada autor. Um asterisco deve indicar o autor para correspondência.

Os números de telefone e fax e o endereço eletrônico, quando disponível, devem

ser assinalados no pé da página. A página de título não deve ter nenhum texto.

O título deve ser o mais conciso possível e indicar claramente o objetivo do

trabalho, não devendo conter abreviações. Expressões do tipo "Effects of...",

"Influence of...", "Study on..." etc. devem ser evitadas. O título deve ser

preparado com muito cuidado pois ele é utilizado nos sistemas de busca.

Abstract: Deve ser apresentado em uma página separada, limitando-se a no

máximo 250 palavras. Ele deve resumir o conteúdo básico do trabalho, devendo

ser compreensível mesmo sem a consulta do texto completo. Um abstract não

deve conter referências, tabelas ou abreviações incomuns. Abstracts devem ser

preparados com muito cuidado pois são publicados em textos de referência e

lidos por pessoas que não têm acesso ao trabalho completo. Três a cinco

keywords também devem ser apresentados.

Resumo: Resumo é o abstract redigido em português. Sua preparação deve

seguir as recomendações para a preparação do abstract em inglês. O resumo

deve ter também um título em português. As regras para o título em português

são as mesmas para o título em inglês (ver acima). Três a cinco palavras-chave

também devem ser apresentadas. O resumo e o título em português também

devem ser apresentados em página separada.

Introdução: Deve iniciar em página nova e fornecer ao leitor informações

suficientes para que os resultados relatados no trabalho possam ser avaliados

sem consulta à literatura. Entretanto, a introduction não deve ser uma extensa

revisão de literatura. Deve também dar subsídios para a compreensão dos

objetivos do trabalho que está sendo apresentado.

Materiais e Métodos: Esse tópico deve fornecer informações suficientes para a

repetição do trabalho. Descrição repetida de detalhes de técnicas anteriormente

publicadas deve ser evitada. Quando um método publicado é modificado pelos

autores, essas modificações devem constar do texto. A origem de reagentes,

meios de cultura e equipamentos (companhia, cidade, estado, país) deve ser

mencionada. Nomes comerciais e marcas registradas também devem ser

indicados. A utilização de subtópicos geralmente facilita a leitura e a

compreensão desse item.

Resultados: Esse tópico deve, através de texto, tabelas ou figuras, fornecer os

resultados experimentais. Caso um tópico relativo à Discussion

seja incluído,

evitar a excessiva interpretação dos resultados, que deverá ser feita na

Discussion. Caso Results e Discussion sejam combinados em um único tópico, os

resultados devem ser discutidos no texto quando adequado. Tabelas devem ser

numeradas independentemente das figuras, devendo-se utilizar números

arábicos. Todas as tabelas e figuras devem ser mencionadas no texto. A

ARAÚJO, M. A. S. Caracterização molecular de espécies de Candida... 2006

114

localização mais adequada das tabelas e figuras deve ser assinalada.

Discussão: Deve fornecer a interpretação dos resultados em função das

informações disponíveis.

Agradecimentos: Esse tópico é opcional e deve vir após a discussão. Destina-

se a agradecimentos por apoio financeiro e pessoal.

Referências: A lista de referências bibliográficas deve ser apresentada em

ordem alfabética, de acordo com o sobrenome do primeiro autor. Todos os

autores devem ser mencionados. As referências devem ser numeradas em

ordem crescente. Cada referência deve ser citada no texto por seu número. Os

nomes das revistas devem ser abreviados de acordo com o sistema utilizado

pelo Biological Abstracts ou Chemical Abstracts. Todas as referências

mencionadas na lista devem ser citadas no texto, assim como todas as

referências citadas no texto devem constar da lista. Seguir os seguintes

exemplos:

a. Artigo em revista

Campos, L.C.; Whittam, T.S.; Gomes, T.A.T.; Andrade, J.R.C.; Trabulsi,

L.R. Escherichia coli serogroup 0111 includes several clones of

diarrhaegenic strains with different virulence properties. Infect. Immun. ,

62:3282-3288, 1994.

b. Trabalho ou capítulo em livro

Nelson, E.B. Current limits to biological control of fungal phytopathogens.

In: Arora, D.K.; Rai, B.; Mukerji, K.G.; Knudsen, G. (eds). Handbook of

applied mycology: soils and plants. Marcel Dekker, New York, 1991,

p.327-355.

c. Livro pelos autores

Salyers, A.A.; Whitt, D.D. Bacterial pathogenesis. A molecular approach.

ASM, Washington, 1994, 418p.

d. Patente

Hussong, R.V.; Marth, E.H.; Vakaleris, D.G. Manufacture of cottage

cheese. U.S. Pat. 3,117,870. Jan.14, 1964.

e. Tese

Calzada, C.T. Campylobacter jejuni e Campylobacter coli – caracterização

em sorogrupos e biotipos das cepas isoladas no município de São Paulo

no período de 1983-1989. São Paulo, 1991, 131p. (Ph.D. Thesis. Instituto

de Ciências Biomédicas. USP).

f. Publicação com autor ou editor desconhecido

Anonymous. The economy of by-products. Álcool Alcoolquim., 2: 33-40,

1985.

ARAÚJO, M. A. S. Caracterização molecular de espécies de Candida... 2006

115

g. Communicações em eventos (Simpósios, Conferências etc.)

Simões, G.S.; Silva, J.; Toledo, A.S.; Gontijo Filho, P.P. Micobactérias não

tuberculosas isoladas de pacientes com sindrome da imunodeficiência adquirida.

XVII Congresso Brasileiro de Microbiologia, Santos, 1993, p.41.

Referências como personal communication ou unpublished data devem ser

evitadas, embora algumas vezes elas sejam necessárias. Nesses casos, elas

devem ser citadas no texto e não na lista de referências bibliográficas.

Referências a respeito de trabalhos accepted for publication ou in press podem

ser utilizadas. No entanto, referências de trabalhos submitted ou in preparation

não devem ser utilizadas.

Tabelas

As tabelas não devem estar no meio do texto. Cada tabela deve ser apresentada

em uma página separada e numerada em seqüência empregando números

arábicos. O título da tabela deve aparecer no topo, e descrever de maneira clara

as informações apresentadas. Títulos e subtítulos devem ser concisos,

apresentando os dados em colunas e linhas, cuidadosamente arranjadas.

Figuras

As figuras devem ser identificadas com números arábicos. Dados apresentados

em tabelas não devem ser repetidos nas figuras. A legenda deve vir no pé da

figura.

Fotografias e desenhos

Apenas fotografias extremamente necessárias para a compreensão do trabalho

devem ser apresentadas. Sua qualidade deve ser suficiente para garantir boa

reprodução. As fotografias devem ser numeradas no verso e identificadas com o

nome do autor. No caso de desenhos, os detalhes devem ter qualidade suficiente

para permitir redução. Desenhos e figuras devem ser desenhados ou impressos

em preto e devem ser preparados como indicado para as fotografias. Ilustrações

coloridas não são aceitas.

Cópias

O autor indicado receberá gratuitamente quinze cópias do trabalho. Cópias

adicionais, pagas, devem ser requisitadas no retorno da prova gráfica corrigida.

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Departamento de Microbiologia - ICB II - USP

Av. Prof. Lineu Prestes, 1374 - Sala 214

Cidade Universitária

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Tel. / Fax: +55 11 3813-9647

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