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GISELLE GUIMARÃES GOMES
C
ARACTERIZAÇÃO DO LÓCUS
T
C
RRM/T
CP
28
DE
T
RYPANOSOMA
CRUZI
TESE SUBMETIDA À UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO
DE JANEIRO VISANDO A OBTENÇÃO DO GRAU DE
DOUTOR EM CIÊNCIAS
Universidade Federal do Rio de Janeiro
Centro de Ciências da Saúde
Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho
2 0 0 8
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ii
Gomes, Giselle G.
Caracterização do Lócus TcRRM/Tcp28 de Trypanosoma cruzi
Giselle Guimarães Gomes. Rio de Janeir
o: UFRJ/ Instituto de Biofísica Carlos Chagas
Filho, 2008.
xiii, 100p. il.
Tese de Doutorado -
Universidade Federal do Rio de Janeiro, Instituto de Biofísica
Carlos Chagas Filho, Programa de Biologia Molecular e Estrutural.
1 - RNABP. 2 - Trypanosoma cruzi. 3 - Tese (Dout. - UFRJ/IBCCF)
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iii
Este trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Metabolismo Macromolecular
Firmino Torres de Castro, sob a orientação de Rosane Silva e com apoio
financeiro da FAPERJ, CAPES, CNPq, PRONEX e FUJB.
iv
“Ciência é muito mais uma maneira de pensar do que um corpo de
conhecimento”.
Carl Sagan
v
A
GRADECIMENTOS
À minha orientadora, Rosane, por todo apoio e incentivo. Ao Edson e ao
Turán pela co-orientação constante. Ao Bill e ao César pelo auxílio na bancada.
A todos os membros do Laboratório de Metabolismo Macromolecular pelo
clima constantemente agradável, pelas discussões e pelos vários ombros amigos.
À Bia e à Cinthia, um agradecimento especial pela grande ajuda.
Aos companheiros dos outros laboratórios, ao Celso, ao Camacho, ao
Dione, ao Zé, ao Paulo, à Emile, à Tereza, à Renata, à Michele, à Scheila e a
todos os outros pelos tantos galhos quebrados nestes anos todos.
À professora Tecia, à professora Thaís e ao professor Peralta pela
contribuição, sem a qual a realização deste trabalho não teria sido possível.
Ao meu maridinho, que após 13 anos ainda está ao meu lado na alegria e
na tristeza, na saúde e na doença, na riqueza e na pobreza e sempre me dando
força, nem que isso signifique ir ao Fundão no fim de semana só para me fazer
companhia.
Aos meus amigos do INPI, de Campo Grande, da Fiocruz, ex e atuais
lemêmês, todos que sempre me deram força e nunca me deixaram desistir.
À minha família, e aqui eu repito o que disse no mestrado, que tem o maior
orgulho de mim, mesmo sem fazer a menor idéia do que eu faço!
À Elisa, pelo apoio profissional, sem a menor sombra de dúvida,
fundamental.
vi
A
BREVIATURAS
µCu – microcurie
µg – micrograma
µl – microlitro
µM - micromolar
Abs - Absorbância
APS – persulfato de amônio
ARE – elemento rico em adenina e uridina
ARM – motivo rico em arginina
ATP - adenosina trifosfato
BSA – albumina de soro bovino
cDNA – DNA complementar;
cm - centímetros
CPM – contagem por minuto
DEPC - dietilenopirocarbonato
DNA – ácido desoxirribonucléico
dNTP – deoxirribonucleotídeos trifosfatos
DsRBM – motivo de ligação a RNA fita dupla
DTT – ditiotreitol
EDTA – ácido etilenodiaminotetracético
EST – marcadores de seqüências expressas
g – grama
g – gravidade
GRE – elemento rico em guanina
GST – glutationa peptidil S-transferase
HRP – Horseradish Peroxidase
HSP - Proteínas de choque térmico
IgG – Imunoglobulina G
IPTG – isopropil-1-tio-(β-D-galactopiranosídeo)
vii
Kb - quilobases
kDa – quilodaltons
kDNA – DNA de cinetoplasto
KH – domínio de homologia K
M – molar
mA – mili-ampéres
mg – miligrama
mL – mililitro
mM – milimolar
MOPS – ácido 3-(N-morfolino) propanosulfônico
mRNA – RNA mensageiro
mt-DNA – DNA mitocondrial
N - normal
ng - nanograma
nM - nanomolar
NMR - ressonância nuclear magnética
nt - nucleotídeos
ºC – graus Celsius
ORF – fase aberta de leitura
PAGE – Eletroforese em gel de poliacrilamida
PBS – tampão salina-fosfato
PCR – reação em cadeia da polimerase
pH - potencial hidrogeniônico
RAPD – DNA polimórfico amplificado aleatoriamente
RBP – proteínas de ligação a RNA
rDNA – DNA ribossomal
RGG – domínio rico em glicina
RNA – ácido ribonucléico
RNAbp – proteínas de ligação a RNA
RNP - ribonucleoproteína
rpm – rotações por minuto
viii
RRM – motivo de reconhecimento do RNA
rRNA – RNA ribossomal
RT-PCR – PCR com transcriptase reversa
SDS – dodecil sulfato de sódio
SL – RNA – RNA spliced leader
SSC – salina-citrato de sódio
ssDNA – DNA fita simples
TBE – tris-borato EDTA
TEMED – N,N,N’,N’- tetrametiletilenodiamina
TNE – tris-NaCl EDTA
Tris – tris (hidroximetil) aminometano
U - Unidades
UTR – região não traduzida
V – volts
W - watts
ix
R
ESUMO
Os tripanossomas são um grupo de organismos eucarióticos com muitas
características peculiares em sua biologia molecular. A identificação e a
caracterização de proteínas de ligação a RNA em T.cruzi é particularmente
relevante uma vez que elas representam papéis chave nos mecanismos de
regulação da expressão gênica. Durante o mestrado, foi possível identificar duas
proteínas, TcRRM1 e 2, cada uma apresentando dois domínios de ligação a RNA.
Ambas são muito semelhantes a duas proteínas de T. brucei, p34 e p37, e a uma
ORF anotada no genoma de Leishmania major. Os genes RRM de T. cruzi são
organizados em um tandem alternando com cópias do gene Tcp28, de função
desconhecida. Todavia, o acúmulo de transcritos de TcRRM é maior nas formas
amastigotas enquanto que para Tcp28, o acúmulo é maior nas formas
tripomastigotas. Ambas as proteínas codificadas por estes genes podem ser
identificadas em extratos celulares através de ensaios de Western blot. Estes
ensaios indicam que a regulação da expressão diferencial ao longo do ciclo para
ambos os genes se mantém no nível protéico. As regiões não-traduzidas de
ambos os genes foram mapeadas de modo a identificar no futuro possíveis
elementos em cis envolvidos nesta regulação gênica. Ensaios de
imunofluorescência indicam que tanto as proteínas TcRRM como a proteína Tcp28
se localizam no citoplasma. Para TcRRM, parece haver localização diferencial nos
tipos celulares. Nas formas epimastigotas, a localização parece ser perinuclear,
enquanto que nas formas amastigotas, a localização parece ser abaixo da
membrana. Ensaios de ligação preliminares sugerem uma possível capacidade de
ligação da proteína TcRRM1 a polirribonucleotídeos.
x
A
BSTRACT
Trypanosomes are a group of eukaryotic organisms with many peculiarities
in their molecular biology. The identification and characterization of RNA binding
proteins in T.cruzi is particularly relevant once they play key roles in the gene
expression regulation mechanisms. In a previous work, it was possible to identify
two proteins, TcRRM1 and 2, each presenting two RNA binding domains. Both are
very similar to two T. brucei proteins, p34 e p37 and to an annotated ORF in
Leishmania major. The TcRRM genes are organized in an tandem with alternating
copies of Tcp28, of unknown function. However, TcRRM transcript accumulation is
higher in amastigotes while for Tcp28 transcripts, accumulation is higher in
trypomastigotes. Both proteins can be identified in total cell extracts through
Western blot assays. These assays indicate that the differential express regulation
found in the RNA level along the biologic cycle can still be found in the protein
level. The unstranslated regions of both genes were mapped in order to identify, in
the future, possible cis elements involved in this gene regulation.
Immunofluorescense assays indicate that both TcRRM and Tcp28 proteins are
cytoplastic. TcRRM may have a different localization on the different cell types. In
the epimastigotes, the localization may be perinuclear, while for the amastigotes,
the localization may be under the membrane. Preliminary binding assays suggest a
possible binding capacity of TcRRM1 to polirribonucleotides.
xi
Í
NDICE
AGRADECIMENTOS V
ABREVIATURAS VI
RESUMO IX
ABSTRACT X
ÍNDICE XI
INTRODUÇÃO 1
A
DOENÇA DE
C
HAGAS
1
A
BIOLOGIA DO
T
RYPANOSOMA CRUZI
2
Taxonomia 2
Ciclo de vida 3
Organização gênica e controle da expressão gênica em tripanossomatídeos 5
A
ESTRUTURA DAS PROTEÍNAS DE LIGAÇÃO A
RNA 10
O
PAPEL DAS PROTEÍNAS DE LIGAÇÃO A
RNA
NO CONTROLE DA EXPRESSÃO GÊNICA EM
TRIPANOSSOMATÍDEOS
13
OBJETIVOS 18
MATERIAIS E MÉTODOS 19
M
ICRORGANISMOS
19
Cepas de Escherichia coli 19
Clones de T. cruzi 19
L
INHAGENS
C
ELULARES
19
O
LIGONUCLEOTÍDEOS
19
P
LASMÍDEOS
U
TILIZADOS
20
S
ONDAS
21
M
EIOS DE CULTURA
21
S
OLUÇÕES
: 22
xii
C
ULTURA DE
T
RYPANOSOMA CRUZI
25
Cultura axênica das formas epimastigotas 25
Cultura das formas tripomastigotas e amastigotas em células de mamíferos 25
E
XTRAÇÃO DE
Á
CIDOS
N
UCLÉICOS
26
Extração de DNA de Trypanosoma cruzi 26
Extração de RNA total de Trypanosoma cruzi 27
O
BTENÇÃO DE
E
XTRATOS
C
ELULARES DE TRIPANOSSOMATÍDEOS
27
C
LONAGEM DE FRAGMENTOS DE
DNA
EM VETORES BACTERIANOS
27
Indução de competência em E. coli 27
Transformação bacteriana 28
Extração de DNA plasmidial em pequena escala 28
E
LETROFORESE
29
Eletroforese de DNA em gel de agarose 29
Eletroforese desnaturante de RNA em gel de agarose 29
Eletroforese em gel de poliacrilamida com SDS (SDS – PAGE) 30
Eletroforese em gel de poliacrilamida 31
T
RANSFERÊNCIA DE MACROMOLÉCULAS PARA MEMBRANAS
31
Transferência de RNA para membranas de nylon – northern blot 31
Transferência de proteínas para membranas de nitrocelulose – western blot 32
H
IBRIDIZAÇÃO A SONDAS MOLECULARES
32
Marcação de sondas de DNA por iniciação randômica 32
Marcação de sondas de DNA por end-labeling 33
Marcação de sondas de RNA por transcrição in vitro 33
Reação de hibridização à sonda homóloga 33
I
MUNOBLOT
34
C
ONSTRUÇÃO DE VETORES RECOMBINANTES
35
Reação em Cadeia da Polimerase 35
Purificação de fragmento de DNA de gel de agarose 35
Reação de ligação do vetor ao produto de PCR 35
S
EQUENCIAMENTO DE
DNA 36
P
RODUÇÃO DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES
36
I
MUNOFLUORESCÊNCIA
37
A
VALIAÇÃO DE
M
EIA VIDA DE M
RNA 38
R
EAÇÃO DE LIGAÇÃO PROTEÍNA
-
RNA
38
F
ILTRAGEM EM MEMBRANA DE NITROCELULOSE
38
P
RODUÇÃO DE
A
NTICORPO ANTI
-
PROTEÍNAS RECOMBINANTES
39
RESULTADOS 40
M
APEAMENTO DAS
R
EGIÕES
N
ÃO
T
RADUZIDAS
(UTR
S
)
DOS
G
ENES
T
C
RRM 40
xiii
A
LINHAMENTO DAS
S
EQUÊNCIAS DE
A
MINOÁCIDOS
P
REDITAS
P
ARA AS
P
ROTEÍNAS DE
L
IGAÇÃO A
RNA
DE
T.
CRUZI
,
T.
BRUCEI E
L.
MAJOR
. 42
M
EIA VIDA DOS
RNA
S CODIFICANTES DAS PROTEÍNAS
T
C
RRM 45
P
ROTEÍNAS
T
C
RRM
NAS DIFERENTES FORMAS EVOLUTIVAS DO
T.
CRUZI
45
L
OCALIZAÇÃO
C
ELULAR DAS
P
ROTEÍNAS
T
C
RRM
EM
T.
CRUZI
. 48
C
APACIDADE DE
L
IGAÇÃO DA
P
ROTEÍNA
T
C
RRM1
E
T
C
RRM2
A
H
OMORRIBOPOLÍMEROS
48
A
VALIAÇÃO DA CAPACIDADE DE
L
IGAÇÃO DA
P
ROTEÍNA
T
C
RRM1
A
O
LIGORIBONUCLEOTÍDEOS
52
A
CÚMULO DE M
RNA
DE
T
CP
28
NAS
3
D
IFERENTES
F
ORMAS
E
VOLUTIVAS DE
T.
CRUZI
. 56
M
APEAMENTO DAS
R
EGIÕES
N
ÃO
T
RADUZIDAS
(3´
E
5´UTR)
DO
G
ENE
T
CP
28 56
A
LINHAMENTO DAS
S
EQUÊNCIAS DE
A
MINOÁCIDOS
P
REDITAS
P
ARA AS
P
ROTEÍNAS DE
T
CP
28
DE
T.
CRUZI
,
T.
BRUCEI E
L.
MAJOR
58
A
LINHAMENTO DAS
S
EQUÊNCIAS DE
A
MINOÁCIDOS
P
REDITAS
P
ARA AS
P
ROTEÍNAS DE
T
CP
28
DE
T.
CRUZI
,
T.
BRUCEI E
L.
MAJOR
59
A
LINHAMENTO DAS
S
EQUÊNCIAS DE
A
MINOÁCIDOS
P
REDITAS
P
ARA AS
P
ROTEÍNAS DE
T
CP
28
DE
T.
CRUZI
,
T.
BRUCEI E
L.
MAJOR
60
M
EIA VIDA DO
RNA
CODIFICANTE DA PROTEÍNA
T
CP
28 60
P
RODUÇÃO DE
A
NTICORPOS
C
ONTRA A
P
ROTEÍNA
R
ECOMBINANTE
T
CP
28 60
P
RESENÇA DE
T
CP
28
NOS
3
DIFERENTES FORMAS EVOLUTIVAS DE
T.
CRUZI
63
L
OCALIZAÇÃO
C
ELULAR DA
P
ROTEÍNA
T
CP
28
EM
T.
CRUZI
63
DISCUSSÃO 67
BIBLIOGRAFIA 75
ANEXO 1 85
R
ESULTADOS
A
NTERIORES
O
BTIDOS NO
M
ESTRADO
85
ANEXO 2 92
G
OMES
,
G.G.;
Ü
RMÉNYI
,
T.P.;
R
ONDINELLI
,
E.;
W
ILLIAMS
,
N.;
S
ILVA
,
R.
(2004)
T
C
RRM
S AND
T
CP
28
GENES ARE INTERCALATED AND DIFFERENTIALLY EXPRESSED IN
T
RYPANOSOMA CRUZI LIFE CYCLE
.
BBRC
322:
985-992 92
Introdução
1
I
NTRODUÇÃO
A
DOENÇA DE
C
HAGAS
A doença de Chagas, identificada em 1909 por Carlos Chagas, é causada
pelo protozoário flagelado Trypanosoma cruzi. (Chagas, 1909). Em sua fase
aguda a doença pode ser letal, entretanto a infecção geralmente evolui para o
estágio crônico. A doença de Chagas é uma antropozoonose geralmente
circunscrita à América Latina e é a principal causa de cardiomiopatia crônica no
continente (Benchimol-Barbosa, 2006). A imunidade protetora adquirida após a
infecção natural não ocorre e não existem vacinas disponíveis para a doença de
Chagas (Barret, et.al., 2003). A estimativa mais recente do Disease Control
Priorities Project, financiado pelo NIH e pelo Banco Mundial, indica uma
prevalência total de 9,8 milhões de pessoas em todo o mundo (Schofield, et.al.,
2006).
A transmissão clássica da doença de Chagas se dá por insetos da
subfamília Triatominae, da família Reduviidae (Ordem: Hemíptera). Os vetores
mais importantes são o Triatoma infestans, o Rhodnius prolixus e o
Pangstrongylus megistus (Figura 1). Em 9 de junho de 2006, a Intergovernment
Commission of the Southern Cone Initiative Against Chagas Disease declarou
formalmente o Brasil como sendo livre de transmissão pelo Triatoma infestans.
Todavia, ainda é prematuro acreditar que a doença de Chagas tenha sido
conquistada por três principais motivos: primeiramente, as técnicas disponíveis
nem sempre eliminam completamente os insetos que habitam o ambiente
peridoméstico. Em segundo, as populações selvagens de triatomíneos são
amplamente difundidas pelas Américas. Deste modo, mesmo uma eliminação total
das populações domésticas pode não ser suficiente contra a reinfestação por
populações peridomésticas e selvagens (Schofield, et.al., 2006). Em terceiro,
ainda que a transmissão clássica da doença de Chagas através do inseto barbeiro
tenha sido controlada com sucesso, a transmissão oral tem sido responsável por
registros regionais de episódios epidêmicos da doença em sua forma aguda
(Benchimol-Barbosa, 2006). Nestas situações questiona-se o controle do vetor
Introdução
2
como solução quando comparado com o pronto diagnóstico e o tratamento
específico.
A
BIOLOGIA DO
T
RYPANOSOMA CRUZI
Taxonomia
O Trypanosoma cruzi é classificado no grupo taxonômico Kinetoplastidae.
Este grupo é definido por apresentar o cinetoplasto, uma rede de mtDNA em
círculos concatenados localizada no interior da mitocôndria única e que está
associada à base flagelar. Além do T. cruzi, neste táxon também se incluem
outras espécies do gênero Trypanosoma, como o Trypanosoma brucei causador
da doença do sono na África, além de espécies do gênero Leishmania causadoras
de leishmaniose, todos na família Trypanosomatidae. Assim, este grupo
taxonômico possui alta relevância médica e econômica (de Souza, 2002).
O T. cruzi é considerado uma espécie única, ainda que apresente alta
diversidade genética e fenotípica entre os seus diferentes isolados. Acredita-se,
inclusive, que as variações clínicas apresentadas pelos pacientes portadores da
doença de Chagas tenham correlação não só com a variabilidade genética do
hospedeiro, mas também com as variações apresentadas pelo parasito (Campbell,
et.al., 2004).
O táxon T. cruzi contém dois grupos definidos: T. cruzi I, associado ao ciclo
de transmissão selvagem e à infecção em marsupiais e T.cruzi II, que consiste de
cinco subgrupos relacionados, denominados IIa, IIb, IIc, IId e IIe associado ao ciclo
de transmissão doméstico e à infecção em mamíferos placentários.
O consórcio de Iniciativa Genômica de T. cruzi elegeu como linhagem
referência o clone CL Brener, derivado da linhagem CL e membro do subgrupo IIe
(The Trypanosoma cruzi Genome Consortium, 1997). Mais tarde, mostrou-se que
este clone é um híbrido cuja linhagem ancestral é representada pelos subgrupos
IIb e IIc ( Westenberger, et.al., 2005).
Introdução
3
Ciclo de vida
O T. cruzi apresenta ao longo do seu ciclo biológico diferentes formas
celulares definidas pelo aspecto geral da célula, a posição do cinetoplasto em
relação ao núcleo e a região de emersão do flagelo. As formas amastigotas
possuem formato arredondado e um pequeno flagelo não visível em microscopia
óptica convencional; as formas epimastigotas possuem o corpo celular alongado e
são capazes de divisão, assim como os amastigotas, possuindo o cinetoplasto
localizado anterior ao núcleo. As formas tripomastigotas metacíclicos e
sangüícolas têm o cinetoplasto localizado posteriormente ao núcleo sendo estas
formas incapazes de divisão (Figura 1) (revisto por de Souza, 2002).
A transmissão da doença de Chagas pelos insetos se dá após os
mesmos ingerirem sangue de um indivíduo infectado. Durante esta ingestão, os
insetos defecam e eliminam estágios infectivos do parasito perto da ferida (Figura
1). As formas tripomastigotas metacíclicas eliminadas nas fezes são capazes de
penetrar nas células do hospedeiro através da ferida, onde se transformam em
amastigotas. A multiplicação inicial nos macrófagos no sítio de picada do inseto
origina uma reação inflamatória característica, o chagoma. Os macrófagos
possuem um papel importante na infecção inicial e no carreamento dos parasitas
para outros sítios dentro do corpo. No citoplasma das células do hospedeiro
vertebrado, as formas amastigotas se dividem por fissão binária e se transformam
em tripomastigotas sangüícolas que, após a ruptura da célula são liberados na
corrente sangüínea onde poderão penetrar em novas células do mesmo
hospedeiro ou poderão infestar outros insetos. A superfície do parasito é coberta
por glicoproteínas tipo mucinas que se ligam à membrana por âncoras de
glicosilfosfatidilinositol (GPI). Estas âncoras podem ativar os macrófagos
hospedeiros (revisto por de Souza, 2002).
No estômago do inseto, o ciclo continua, quando as formas tripomastigotas
sangüícolas ingeridas se diferenciam em epimastigotas que se dividem por fissão
binária no intestino e se transformam em tripomastigotas metacíclicos no reto,
onde poderão reiniciar o ciclo infectando novo hospedeiro (revisto por Vickerman,
Introdução
4
Esquema 1 – (1) O vetor triatomíneo ingere sangue de um indíviduo liberando
formas tripomastigotas em suas fezes próximo ao local da ferida. (2) Os
tripomastigotas penetram nas células do hospedeiro onde se transformam em
(3) amastigotas, que se multiplicam por fissão binária e (4) são liberados na
corrente sangúinea como formas tripomastigotas sanguícolas que podem
reinfectar novas células (3) ou ser ingerido por um outro vetor (5). No intestino
do inseto, as formas tripomastigotas se transformam em formas epimastigotas
(6), que são capazes de divisão por fissão binária (7) diferenciando-se em
tripomastigotas metacíclicos (8) que serão liberados nas fezes podendo reiniciar
o ciclo. Fonte: Center for Disease Control and Prevention – USA Government.
Estágios no Inseto Triatomínio Estágios em Humanos
Estágio Infectivo
Estágio Diagnóstico
Estágios no Inseto Triatomínio Estágios em Humanos
Estágio Infectivo
Estágio Diagnóstico
Introdução
5
1985; Burleigh e Andrews, 1995; Kollien e Schaub, 2000; Tyler e Engman, 2001 e
De Souza, 2002).
Organização gênica e controle da expressão gênica em tripanossomatídeos
Os tripanossomatídeos divergiram muito inicialmente na linhagem evolutiva
eucariótica, evoluindo separadamente por muito tempo. Assim, puderam acumular
diversas características exclusivas em sua biologia que são bastante peculiares
quando comparadas às encontradas nos eucariotos superiores. Estas
características os tornam bastante interessantes como modelo de estudo na
biologia celular e molecular. Além do ciclo de vida complexo com diferentes
formas celulares adaptadas ao hospedeiro invertebrado e ao hospedeiro
mamífero, podemos ressaltar diversas peculiaridades no nível molecular.
Os genes codificantes de proteínas estão arranjados em longos clusters de
dezenas a centenas de genes na mesma fita de DNA (El-Sayed, et.al., 2005a).
Estes genes são transcritos em unidades policistrônicas, separados por pequenas
regiões intergênicas. As unidades policistrônicas podem conter cópias de um
mesmo gene, como é o caso dos genes da família mucina TcMUC e TcSMUG ( Di
Noia, et al., 1998 e 2000) e os genes da proteína de choque térmico HSP70
(Requena et al., 1988), ou ainda genes de funções e padrão de expressão
distintos como o tandem contendo os genes Amastina/Tuzina (Teixeira et al.,
1995); o tandem contendo os genes metaciclogenina/Trypanredoxina
Peroxidase/Gene Associado (Mtc/TryP/AG) (Ávila et al., 2001) e o tandem
contendo os genes de α- e β-tubulina (Soares et al.; 1989). Assim, alguns autores
chegam a afirmar que o arranjo gênico em tripanossomatídeos seria
remanescente dos operons bacterianos (Clayton, 2002; D´Orso, et.al., 2003).
Todavia, cabe ressaltar que, ao contrário dos operons bacterianos, o arranjo
genômico de tripanossomatídeos não inclui um promotor definido, nem engloba
genes cujos produtos protéicos exerçam uma função metabólica singular. No
entanto, há uma semelhança forte com os operons especialmente porque os
genes codificantes de proteína não contêm íntrons; a única exceção encontrada
Introdução
6
Esquema 2 – Comparação entre os mecanismos de processamento de RNA
em (a) células de mamíferos e de levedura e em (b) tripanossomas. As etapas
gerais do processo de maturação dos mRNAs são mostrados nas caixas azuis.
O círculo cinza no núcleo dos tripanossomas indica a presença da maquinaria
de trans-splicing e de poliadenilação. ARE – Elemento rico em Adenina; PARP –
Proteína ligadora da cauda poliA; DCP – Proteína decapeadora; NPC –
Complexo do poro nuclear.; HuR – Hu antígeno R; eIF4G e eIF4E – elementos
de alongamento 4G e 4F; hnRNP – Ribonucleoproteínas heterogêneas; PARN –
PoliA ribonuclease; EJC – complexo de junção de exon; AUBP – Proteína
ligadora de Adenina e Uridina; CBP - Proteína ligadora do terminal C. Fonte:
Adaptado de D´Orso, 2003.
Células de mamíferos e leveduras
Tripanossomas
Tradução Tradução
Exossomo Exossomo
Estabilização do mRNA Estabilização do mRNADesestabilização do mRNA Desestabilização do mRNA
Controle da meia-
vida do mRNA
Citoplasma Citoplasma
NúcleoNúcleo
Exportação do mRNA
Exportação do mRNA
Transcrição acoplada ao cis-
splicing e à poliadenilação
Trans-splicing
acoplado à
poliadenilação
Complexo transcricional
para a RNA pol II
Pré-mRNA
policistrônico
Pré-mRNA
monocistrônico
Introdução
7
até agora foi no gene que codifica a poli (A) polimerase (PAP) de T. brucei (Mair,
et al., 2000). O gene PAP possui um único íntron que obedece à regra GU/AG dos
íntrons de cis-splicing (Mair, et.al., 2000). Do ponto de vista filogenético, a
descoberta de cis-splicing em tripanosomas unifica o tema de que todos os
organismos que possuem trans-splicing também possuem cis-splicing.
Devido à transcrição policistrônica, a maturação do mRNA em
tripanossomas difere do processo que ocorre na maioria dos eucariotos (Figura 2)
(revisto por Liang, et.al., 2003). As unidades policistrônicas transcritas são
posteriormente individualizadas pelos mecanismos de poliadenilação e de trans-
splicing. Este último foi identificado por Boothroyd e Cross em 1982 quando
descobriu-se que o mRNA das proteínas VSG de T. brucei carregavam uma
seqüência de 39-nucleotídeos comum que foi chamada de seqüência spliced
leader (SL) ou mini-exon. Mais tarde foi verificado que todos os mRNAs contém
esta seqüência. A estrutura secundária do SL RNA é similar em todos os
organismos que apresentam splicing, sendo composta por três stem-loops, todavia
a seqüência não é conservada entre as diferentes espécies. (Liang, et.al., 2003).
O mecanismo de trans-splicing envolve a junção de dois exons de dois
RNAs transcritos separadamente, e sua função primordial em tripanossomatídeos
é a maturação da porção final 5´ dos RNAs mensageiros codificados nas unidades
policistrônicas (revisto por Clayton, 2002). A adição do mini-exon atende a dois
propósitos: funciona em conjunto com a poliadenilação na liberação dos
transcritos policistrônios e fornece o cap aos mRNAs (Agabian, 1990).
Ainda que inicialmente descoberto em tripanossomas, o processo de trans-
splicing foi mais tarde encontrado nos protozoários do filo Euglenozoa (Tessier et
al., 1991) e nos metazoários dos filos Nematoda (Krause e Hirsh,1987) e
Platyhelminthes (Rajkovic, et al.,1990), além de cordados (Vandenberghe, et.al.,
2001).
Os sítios de inserção de trans-splicing, como os sítios de cis-splicing de
outros eucariotos, são precedidos por tratos de polipirimidina (Benz, et.al., 2005)
Mutações no trato polipirimidínico podem levar à escolha de sítios aberrantes de
poliadenilação (Hug, et.al., 1993). Nos tripanossomas, a adição da cauda poliA é
Introdução
8
acoplada ao processo de trans-splicing do gene à jusante (LeBowitz, et.al., 1993).
Todavia, recentemente Jägger et.al., (2007) demonstraram que o processamento
do RNA policistrônico acoplado à transcrição não é uma regra e alguns destes
sítios podem ser ignorados de modo a gerarem longos transcritos estáveis de
mRNA contendo mais de uma região codificante e apenas uma sequência mini-
exon em sua porção 5´ final. Os autores sugeriram que estes RNAs intermediários
funcionariam como um “estado de latência traducional” que poderia ser estocado
para processamento completo futuro em um transcrito maduro, quando requerido
pela célula.
Ao longo do ciclo de vida, o parasita se vê obrigado a multiplicar-se e a
adaptar-se a diferentes meios, com diferentes temperaturas, nutrientes e defesas,
o que requer uma alteração em seu padrão protéico e significa que a expressão
em tripanossomatídeos precisa responder a estes estímulos (Giambiagi-deMarval,
et.al., 1996). Em geral, as células dos metazoários não necessitam responder de
forma tão rápida às mudanças externas quanto as células dos eucariotos
inferiores, pois se encontram em um microambiente mantido relativamente
constante. Neste caso, e ainda assim, a regulação sobre o início da transcrição é
a forma de controle da expressão gênica mais utilizada, onde elementos presentes
no DNA, em conjunto com proteínas de ligação a DNA, endereçam genes para a
transcrição pela RNA polimerase II (Taatjes, et.al., 2004). Contudo, nos
tripanossomatídeos nenhum promotor para a RNA polimerase II foi identificado, à
exceção do promotor do gene spliced leader (SL) (Gillinger e Bellofatto, 2001)
além do fato de que vários fatores de transcrição basais parecem estar ausentes
do genoma, como por exemplo, a proteína ligadora de TATA (Kelly, et.al., 2005). A
proteína TATA, uma proteína conservada em eucariotos, é responsável pela
transcrição basal da RNA polimerase II. O promotor do gene SL RNA não possui
seqüência TATA, tampouco seqüência de reconhecimento do elemento B,
assemelhando-se ao promotor do gene snRNA U1 (Gunzl, et.al., 2002).
Entretanto, recentemente, identificou-se em T. brucei uma forma divergente do
fator de transcrição TFIIB que é essencial para a transcrição a partir do promotor
do gene SL RNA (Palenchar e Bellofatto 2006).
Introdução
9
A transcrição policistrônica nos tripanossomatídeos, em conjunto à
ausência de promotores clássicos, indica que a iniciação da transcrição não é um
fator limitante na produção do mRNA. Ao contrário, o que parece ocorrer é a
transcrição constitutiva de todos os genes (Clayton, 2002). Esta falta de controle
da iniciação da transcrição nos parasitas kinetoplastídeos demonstra a
importância da regulação durante processos pós-transcricionais específicos, como
o trans splicing e a estabilidade do mRNA (D´Orso, et.al., 2003). O controle pós-
transcricional em organismos eucarióticos é um mecanismo de regulação gênica
bastante conservado e inclui a inibição da tradução, a desestabilização de
mRNAs, o splicing alternativo e o sequestro de mRNAs a corpos subcelulares bem
definidos. Em tripanossomas, a regulação parece ser alcançada principalmente
pela mudança rápida na meia-vida do RNAm e pelo controle traducional, ao invés
da ocorrência de ativação pós-transcricional (D´Orso, et.al., 2003). A estabilidade
do mRNA é dependente das regiões não traduzidas e credita-se este tipo de
atividade regulatória a fatores que agem em trans reconhecendo elementos em cis
presentes nas regiões não-traduzidas 3´ e 5´ (Clayton, 2002 e D´Orso, et.al.,
2003).
Vários elementos reguladores em cis alteram a meia-vida dos RNAs
mensageiros maduros, a maioria localizada na região 3´UTR (Di Noia et al., 2000;
Coughlin et al., 2000; Dallagiovanna et al., 2001). Este processo é essencialmente
alcançado através de proteínas ligadoras de RNA que formam, em conjunto ao
mRNA, complexos ribonucleoprotéicos. É a composição do complexo que
determina se o mRNA será transportado ao citoplasma para tradução, degradação
ou outro evento de processamento. Proteínas capazes de interagir em trans com
estes elementos foram identificadas por D´Orso e Frasch (2001b; 2002), mas o
mecanismo pelo qual elas agem nos tripanossomatídeos permanece ainda
indefinido.
Recentemente, identificou-se em Trypanossoma cruzi corpos subcelulares
semelhantes a corpos P. Estes são sítios onde o mRNA pode ser decapeado e
degradado 5´- 3´ ou estocado para o retorno subseqüente aos polissomos (Holetz
et.al., 2007). Cassola et.al., (2007) logo em seguida, demonstraram grânulos
Introdução
10
contendo mRNAs que compartilham componentes com corpos P e com grânulos
de estresse, inclusive com o recrutamento da proteína TcUBP-1. Estes novos
estudos sugerem que não se pode descartar outros mecanismos que envolvam,
por exemplo, a acessibilidade de mRNAs à maquinaria de tradução.
Em leveduras e em células de mamíferos, os mecanismos pós-
transcricionais também representam papéis importantes na regulação da
expressão gênica. Os transcritos presentes em complexos ribonucleoprotéicos se
encaminham aos polissomos para tradução, enquanto outros são endereçados
para decaimento ou têm a sua tradução reprimida e são estocados, sendo
degradados posteriormente. A primeira etapa na degradação do mRNA é
deadenilação, deixando a porção 3´ susceptível à clivagem pelo exossomo (Parker
e Song, 2004). Alternativamente, a perda da cauda poliA disponibiliza a porção 5´
para o decapeamento pelo complexo Dcp1/2 deixando o RNA susceptível à
degradação pela exoribonuclease XRN1, ambas co-localizadas nos corpos-P
(Eulalio et.al., 2007).
Outra alteração pós-transcricional descrita em tripanossomatídeos é a
edição dos transcritos mitocondriais descoberta em 1986 (Benne, et.al.,1986). O
processo de editoração dos RNAs envolve a inserção e/ou a deleção de resíduos
de uridina de acordo com seqüências contidas em RNAs guias, transcritos de
minicírculos de DNA de cinetoplasto na mitocôndria (kDNA). (revisto por Adler e
Hadjuk, 1994; Alfonso, et al., 1997; Estévez e Simpson, 1999)
A
ESTRUTURA DAS PROTEÍNAS DE LIGAÇÃO A
RNA
O RNA possui considerável importância na perpetuação e manifestação de
informação contida no genoma. RNAs participam nos processos de replicação,
transcrição, processamento, transporte e tradução. No contexto de controle da
expressão gênica, os RNAs reguladores participam na modulação da cromatina e
na determinação da meia-vida e da tradução de mRNAs.
A molécula de RNA raramente encontra-se isolada na célula. Durante a
formação dos transcritos, ribonucleoproteínas (RNPs) se agregam co-
Introdução
11
transcricionalmente a este transcrito nascente e participam nas etapas de
processamento, exportação do núcleo, transporte e localização do RNA (Dreyfuss,
et.al., 2002).
A diversidade de funções das proteínas ligadoras de RNA sugere uma
diversidade corrrespondente de motivos responsáveis pelo reconhecimento da
molécula de RNA. Todavia, a maioria destas proteínas é modular e a ampla
diversidade estrutural de substratos ocorre em decorrência de múltiplas cópias de
domínios de ligação a RNA. É a combinação destes domínios em vários arranjos
estruturais que gera proteínas que podem reconhecer o RNA com a afinidade e a
especificidade necessárias para encontrar os RNAs cognatos no meio celular
enquanto retêm a versatilidade requerida para a função complexa de atuar no
processamento do RNA (revisto por Lunde, et.al., 2007).
Vários domínios já foram identificados e são utilizados inclusive na
caracterização de RNAbps (RNA Binding Proteins) (Pérez-Cañadillas e Varani,
2001). O domínio de ligação a RNA do tipo RRM (RNA Recognition Motif) é
composto de 80-90 aminoácidos Mais de 10.000 RRMs já foram identificados
sendo de longe o mais comum e melhor caracterizado dos módulos de ligação a
RNA. As proteínas RRM funcionam, em sua maioria, em processos de regulação
pós-transcricional da expressão gênica (Lunde, et.al., 2007).
A estrutura terciária do domínio RRM da proteína A do complexo
ribonucleoprotéico U1, que está envolvido em splicing foi determinada por Nagai et
al. em 1990. Esta consiste em quatro folhas β-pregueadas antiparalelas
agrupadas contra duas α-hélices orientadas perpendicularmente (Figura 3). Os
dois submotivos ficam justapostos nas duas folhas β centrais onde fazem contato
direto com a molécula de RNA (revisto por Lunde, et.al., 2007). A ligação é
mediada na maioria dos casos por três resíduos conservados: um resíduo Arg ou
Lys que forma uma ponte de sal com o esqueleto fosfodiéster e dois resíduos
aromáticos que fazem interações stacking com as nucleobases. Estes três
resíduos se situam nos dois motivos altamente conservados RNP1 e RNP2 que se
localizam nas duas folhas beta centrais. (Figura 3) (Lunde, et.al.,2007, Outbridge,
et.al., 1994).
Introdução
12
Esquema 3 – O domínio de ligação a RNA do tipo RRM. Acima, a estrutura
do domínio RRM da protéina U1A humana ligada à molécula de RNA (laranja).
As bases de fita simples são especificamente reconhecidas pela folha β-
pregueada e através de duas alças que conectam os elementos da estrutura
secundária. Abaixo, vários módulos se combinam para exercerem múltiplas
funções. Em (a), os múltiplos módulos aumentam a especificidade de
reconhecimento; em (b), eles se organizam para reconhecerem mais de uma
molécula; em (c), ele funcionam como espaçadores para o posicionamento de
outros módulos e em (d), eles se combinam com domínios enzimáticos. Fonte:
Lunde, 2007
Introdução
13
Grande parte da capacidade destas proteínas de reconhecerem o RNA depende
especificamente das seqüências presentes entre os domínios, chamadas de
linkers. Seqüências linkers longas (> 50-60 resíduos) são geralmente
desorganizadas e permitem que os dois domínios reconheçam uma gama ampla
de alvos. Enquanto que linkers curtos predispõem os domínios a se ligarem a um
strech contíguo de ácidos nucléicos. Quando isto acontece, o linker forma uma α-
hélice curta em resposta à ligação ao RNA que posiciona os dois domínios
relativos um ao outro e algumas vezes contactam o RNA diretamente. Nestas
situações, as seqüências linkers são tão conservadas quanto, ou melhor que, os
próprios domínios. Porque o posicionamento preciso dos domínios facilita a sua
função (Lunde, et.al., 2007), conforme o linker se encurta, a afinidade pelo RNA
aumenta entre 10 e 1000 vezes, quando comparada com a afinidade de dois
domínios RRMs somados (revisto por Lunde, et.al., 2007).
O
PAPEL DAS PROTEÍNAS DE LIGAÇÃO A
RNA
NO CONTROLE DA EXPRESSÃO
GÊNICA EM TRIPANOSSOMATÍDEOS
Uma vez que os tripanossomatídeos apresentam características de biologia
celular e molecular bastante peculiares, como o ciclo de vida digenético e a
regulação da expressão gênica basicamente pós-transcricional, a família
Trypanosomatidae constitui um grupo bastante interessante para o estudo de
proteínas de ligação a RNA. As proteínas RNAbp são essenciais na regulação da
expressão de proteínas específicas às diferentes formas celulares do parasita, e
portanto na sua adaptação aos diferentes ambientes encontrados ao longo do seu
ciclo biológico. Diversas RNAbps já foram isoladas e caracterizadas em
trypanossomatídeos, dada a sua importância na biologia molecular desses
organismos.
Em 1998, Manger e Boothroyd identificaram em T. brucei a RRM1, uma
proteína nuclear essencial, cujo gene apresenta três domínios RRM arranjados em
tandem (Manger and Boothroyd, 1998) e cuja função ainda é desconhecida
(Manger e Boothroyd, 2001). Em 2001, Xu et al. identificaram a proteína XB1 em
T. cruzi através do sistema de três híbridos em levedura, que selecionou proteínas
Introdução
14
que interagiam ao RNA mini-exon (Xu et al., 2001). Em 2001, D´Orso e Frasch
descreveram a proteína TcUBP-1, que apresenta o domínio RRM e é regulada ao
longo do ciclo. TcUBP-1 forma um complexo ribonucleoprotéico com TcUBP-2 e
TcPABP e pode ligar regiões ricas em adenosina e uridina (ARE),
conseqüentemente diminuindo a meia vida do mRNA de TcSMUG (D´Orso e
Frasch, 2002). Mais tarde, De Gaudenzi et al. descreveram que as proteínas
TcUBP 1 e 2 formam uma família, com pelo menos 6 membros, de proteínas
ligadoras de RNA que apresentam um único domínio de RRM (De Gaudenzi,
et.al., 2005)
As proteínas de ligação à cauda poli (A) dos mRNAs, altamente
conservadas em eucariotos, também foram identificadas em T. cruzi (Batista et al.,
1994), e em T. brucei (Pitula et al., 1998). Zhang e Williams identificaram três
proteínas de ligação a RNA em T. brucei através de afinidade por ssDNA (Zhang
and Williams,1997). Uma delas é ortóloga a PABP (Pitula et al., 1998) enquanto as
outras duas, Tbp34 e Tbp37, foram capazes de se ligar ao rRNA 5S (Pitula et al.,
2002a). As proteínas Tbp34 e Tbp37 são bastante similares, com exceção de uma
inserção de 18 aminoácidos em Tbp37 no terminal amino. Elas apresentam três
domínios distintos: um domínio APK N-terminal rico nos resíduos alanina, prolina e
lisina; dois domínios RRM internos e uma região C-terminal KKDX (Zhang e
Williams, 1997). A expressão destas proteínas é estágio-específica, sendo Tbp34
presente predominantemente na forma procíclica, sugerindo um controle tanto
traducional quanto pós-transcricional (Li, et.al., 2003). A interação específica das
proteinas Tbp34 e Tbp37 com o RNA ribosomal 5S sugere um papel na via de
importação e exportação nuclear durante a biogênese do ribossomo. Esta
hipótese foi reforçada com a verificação de que Tbp34 e Tbp37 se associam a
duas proteínas de ligação ao RNA fosforiladas em tirosina, NOPP44/46, que se
localizam primariamente no nucléolo (Pitula et al, 2002b). Recentemente,
Hellmanm, et. al., (2007a) sugeriram que Tbp34 e Tbp37 têm um importante papel
na estabilização do rRNA 5S. Através da técnica de interferência de RNA, eles
demonstraram que a perda da função destas proteínas se correlaciona com uma
diminuição nos níveis de rRNA 5S, assim como uma diminuição na atividade
Introdução
15
ribossômica e alteração da biogênese ribossomal. Experimentos de captura
seqüencial demonstraram ainda que Tbp34, Tbp37 e NOPP44/46 se associam
com o fator de exportação nuclear, exportina 1, formando um complexo, mas
ainda não se sabe se o rRNA 5S faz parte deste complexo nem se a interação
com o rRNA 5S e NOPP44/46 reflete um papel comum ou dois papéis distintos
destas proteínas (Hellman, et.al., 2007b).
De Gaudenzi et.al. analisaram em 2005 as proteínas contendo domínios de
ligação a RNA do tipo RRM presentes nos três genomas tripanossomatídeos, T.
cruzi, T, brucei e L. Major, seqüenciados e um total de 77 ortólogos diferentes
foram identificados (Figura 4) num resultado consistente com a publicação da
comparação dos três genomas de tripanossomatídeos, T. cruzi, T. brucei e L.
major, que inclui a conservação da ordem dos genes e o agrupamento de
homólogos em repetições em tandem (De Gaudenzi, et.al., 2005) (Figura 4).
O trabalho aqui apresentado é uma continuação do trabalho anterior do
nosso grupo, relatado em minha tese de mestrado e resumido no anexo 1. Segue-
se uma breve descrição dos resultados obtidos. Durante a elaboração da minha
dissertação de mestrado, foi possível identificar duas proteínas, nomeadas
TcRRM1 e 2 através da análise dos bancos de dados gerados pela iniciativa
genômica do T. cruzi. Estas proteínas são bastante semelhantes entre si e
apresentam cada uma dois domínios de ligação a RNA do tipo RRM, além de um
domínio N-terminal rico nos aminoácidos alanina, prolina e lisina (APK-Rich)
sendo a principal distinção a presença ou a ausência de 18 nucleotídeos na
porção 5´da região codificante (Anexo 1 – Figura 1).
Os genes TcRRM estão arranjados em um tandem no genoma de T. cruzi
contendo pelo menos oito cópias e o seqüenciamento da região intergênica
revelou uma fase aberta de leitura que apresentou alta homologia a um EST. A
sua seqüência predisse uma proteína de aproximadamente 28kDa e o gene
intercalante foi então nomeado Tcp28 (Anexo 1 – Figura 2).
A procura por seqüências semelhantes em bancos de dados mostrou que
os genes RRM de T.cruzi (TcRRM) são bastante semelhantes a dois genes já
descritos em Trypanosoma brucei: Tbp34 e Tbp37. Um gene semelhante também
Introdução
16
Esquema 4 – Árvore Filogenética das proteínas com domínios de ligação a
RNA de T. cruzi. O círculo vermelho aponta para a posição das proteínas
TcRRM1 e 2, que aqui tiveram seu nome alterado para TcNRBD 1 e 2. Fonte:
De Gaudenzi, 2005.
Introdução
17
foi encontrado no genoma de Leishmania major. Anticorpos gerados contra as
proteínas de T. brucei capazes de reconhecer proteínas em diferentes clones e
cepas de T. cruzi, além de proteínas de Crithidia fasciculata e de Leishmania
braziliensis (Anexo 1 – Figura 3).
Analisamos o acúmulo de RNA mensageiro dos genes TcRRM nas três
diferentes formas celulares do T. cruzi através de northern blot. Não foi possível a
distinção entre os mRNAs de TcRRM 1 e TcRRM 2, mas o acúmulo é claramente
maior nas formas amastigotas (Anexo 1 – Figura 4).
Como as proteínas Tbp34 e Tbp37 de T. brucei se localizam no núcleo e
apresentam sinal de localização nuclear, realizamos ensaios de
imunofluorescência com células de T. cruzi. Este ensaio preliminar com os
anticorpos contra as proteínas de T. brucei mostrou localização citoplasmática
para as proteínas RRM em T. cruzi (Anexo 1 – Figura 5).
As regiões codificantes de TcRRM 1 e TcRRM 2 foram clonadas em
vetores para expressão em E. coli e posterior purificação das proteínas
recombinantes. Estas proteínas também são reconhecidas pelos anticorpos anti-
p34/p37 (Anexo 1 – Figura 6).
Objetivos
18
O
BJETIVOS
Em face da importância das proteínas de ligação a RNA na biologia do
Trypanosoma cruzi e dos dados anteriores obtidos durante a dissertação de
mestrado na caracterização da estrutura gênica das proteínas TcRRM 1 e TcRRM
2 de T. cruzi, o objetivo geral desta tese é a expansão do conhecimento a respeito
destas proteínas no que tange à sua função e à sua importância para T. cruzi.
Constitui também um objetivo geral desta tese a caracterização da proteína
codificada pelo gene Tcp28, localizado intercalado aos genes TcRRM no genoma
de T. cruzi. Assim sendo, nossos objetivos específicos são:
1. Caracterizar funcionalmente TcRRM 1 e TcRRM 2;
1.1. Determinar o padrão de expressão de TcRRM1 e TcRRM2 ao longo do
ciclo de vida do T.cruzi;
1.1.1. Determinar as regiões não traduzidas (UTRs) dos genes TcRRMs
1.1.2. Verificar a meia vida dos RNAs codificantes das proteínas TcRRMs;
1.1.3. Verificar a presença das proteínas TcRMMs nos diferentes tipos
celulares;
1.2. Determinar a localização das proteínas TcRRM nas células do T.cruzi;
1.3. Caracterizar a propriedade de ligação a ácidos nucléicos das proteínas
TcRRMs testando sua capacidade de ligação ao rRNA5s e a
homorribopolímeros;
2. Caracterizar o gene Tcp28 que intercala os genes TcRRM1 e 2;
2.1. Determinar o padrão de expressão de Tcp28;
2.1.1. Verificar a presença de Tcp28 nos 3 diferentes tipos celulares;
2.1.2. Determinar as regiões não traduzidas do gene Tcp28;
2.2. Determinar a localização da proteína Tcp28
Materiais e Métodos
19
M
ATERIAIS E
M
ÉTODOS
M
ICRORGANISMOS
Cepas de Escherichia coli
• DH5αF´IQ (Hanahan, 1983)
supE44 ∆lac U169 (∅80lacZ∆15) hsdR17 recA1 endA1 gyrA96 thi-1 relA1
• BL-21 (Studier e Moffatt, 1986)
hsdS gal (cIts857 ind San&nin5) lac UV5
-
T7 gene 1
Clones de T. cruzi
• CL Brener (Cano et.al., 1995)
• Dm28c (Contreras, et.al., 1988)
L
INHAGENS
C
ELULARES
• LLCMK2 (Hull, et.al., 1962) Macaca mulatta (macaco, Rhesus, rim) –
Epitelial – ATCC #: CCL-7
O
LIGONUCLEOTÍDEOS
Primers Sequências (5’-3’) Enzimas
TcRNAbp
NH
2
Bam
CGCGGATCCGGCAGACTTGGCGGGCAT
BamH1
COOHbp
RACE
CAUCAUCAUCAUAAGAACCACACGAAGTAA ____
TcRNAbp
COOH Eco
CCGGAATTCAAGAACCACACGAAGTAA
EcoR1
Tcp28- NH
2
GACGCGGATCCATGGGCCTGAAAAGGC
BamH1
Materiais e Métodos
20
Bam
Teng NH
2
Bam
CGCGCGGATCCGATACAATCGCCGTACAT
BamH1
Teng RACE CAUCAUCAUCAUATGTACGGCGATTGT ____
Tcp28
COOH Bam
GACGCGGATCCGAGGCAGTGTTGATG
BamH1
ME- Cruzi
GGATGGAATTCAGTTTCTGTACTATATTG
EcoR1
Obs. As sequências em negrito correspondem aos sítios de restrição indicados à
direita.
P
LASMÍDEOS
U
TILIZADOS
Nome
Origem- Nº Acesso
GenBank
Tamanho
aproximado
do inserto
Vetor
40
o
22
Porcel, B. et al,
2000a
AW329912 1Kb pT7T3
18h2
Porcel, B. et al,
2000a
AW324803 1Kb pT7T3
InterRBPs Gomes et.al.,
2004
- 1,3Kb pBluescript II KS
ME/Tcp28 Gomes et.al.,
2004
- 600pb pBluescript II KS
RRM1/GST Gomes,
Dissertação de
Mestrado
- 800pb pGEX 4T1
RRM2/GST Gomes,
Dissertação de
Mestrado
- 800pb pGEX 4T1
Tcp28/GST Neste trabalho - 800pb pGEX 4T1
UBP1/GST Neste trabalho - 800pb pGEX 4T1
Materiais e Métodos
21
S
ONDAS
Desenho indicando o lócus contendo os genes TcRRM (caixa listrada) e Tcp28 (caixa
branca) com a posição das sondas TcRRM (retângulo listrado) e Me-Tcp28 (retângulo
branco) e a posição dos iniciadores.
M
EIOS DE CULTURA
Meio LIT (Infusão de fígado-
tripticase)
NaCl 75mM
KCl 5,4mM
Na
2
HPO
4
(12H
2
O) 62mM
Glicose 0,2%
Bacto-triptona 0,5%
Infusão de fígado 0,5%
pH ajustado a 7,2 com NaOH 1N
Meio LB (Luria Bertani) Bacto-triptona 1%
Extrato de levedura 0,5%
NaCl 85mM
pH ajustado a 7 com NaOH 5N
Meio LB-agar Meio LB
Agar 1,5%p
Meio 2xYT-G Bacto-triptona 1,6%
TcRRM TcRRMTcp28 Tcp28
COOHBP-RACE TENG-RACE
TcRNABP-NH2 Bam
TcRNAbp COOH
Tcp28 NH2 Bam
Tcp28 Bam
Materiais e Métodos
22
Extrato de Levedura 1%
NaCl 86mM
Glicose 2%
pH ajustado a 7 com NaOH 5N
RPMI RPMI Medium1640 Gibco
NaHCO
3
2,0g/L
pH ajustado a 7,4 com NaOH 5N
Todos os meios de cultura eram autoclavados a 120ºC por 20 minutos, à exceção
do meio RPMI que era filtrado (Millipore, 0,22µm).
S
OLUÇÕES
:
Acri-bis 30%
Acrilamida 29,2% (w/v)
Bisacrilamida 0,8% (w/v)
GET
Tris-HCl pH8,0 25mM
EDTA 10mM
Glicose 50mM
MOPS 10x
MOPS 20mM
Acetato de sódio 5mM
EDTA1mM
pH ajustado a 7,5
PBS
NaCl 140mM
KCl 2,7mM
Na
2
HPO
4
8mM
KH
2
PO
4
1,5mM
Glicose 5,5mM
pH ajustado a 7,5
PBS-T
PBS 1x
Tween 0,05% (v/v)
Solução de Azul de Coomassie
Metanol 45% (v/v)
Ácido acético 10% (v/v)
Materiais e Métodos
23
Azul de coomassie R250 0,2% (w/v)
Solução de bloqueio
PBS-T
0,05% leite em pó Molico
Solução de Denhardt 5x
Ficol 400 1% 50x
Polivinilpirrolidona 1%
BSA 1%
Solução de desnaturação
NaOH 0,5M
NaCl 1,5M
Solução de extração de RNA 1
Solução de hidrocloreto de guanidina
99,92% (V/V)
2-mercaptoetanol 0,08% (V/V)
Solução de extração de RNA 2
Solução de Isotiocianato de guanidina
92% (V/V)
2-mercaptoetanol 8% (V/V)
Solução de hidrocloreto de
guanidina
Hidrocloreto de guanidina 6M pH 7,5
EDTA 25mM
Solução de isotiocianato de
guanidina
Tris-HCl 50mM pH 7,5
Isotiocianato de guanidina 4M
EDTA 25mM
Solução de lavagem 1
SSC 1% (v/v)
SDS 0,1% (v/v)
Solução de lavagem 2
SSC 0,1% (v/v)
SDS 0,1% (v/v)
Solução de neutralização
Tris-HCl pH 8,0 0,5M
NaCl 1,5M
Solução de pré-hibridização
Formamida 50% (v/v)
DNA de esperma de salmão 100ng/mL
Tampão fosfato 50mM
SSC 5x
Denhardt 5x
Solução de revelação por
fosfatase alcalina
NBT 1% (v/v)
BCIP 1% (v/v)
Tampão de Susbtrato 98% (v/v)
Materiais e Métodos
24
Solução de ressuspensão
Tris-HCl 50mM pH 7,5
EDTA 2mM
NaCl 0,1M
Solução de transferência
Glicina 190mM
Metanol 20%(v/v)
Tris 25mM
Solução de vermelho de
Ponceau
Vermelho de Ponceau 0,025% (w/v)
Ácido Tricloroacético 3%
Solução descorante para SDS-
PAGE
Metanol 5% (v/v)
Ácido acético 7%(v/v)
Solução encolhedora para SDS-
PAGE
Metanol 65%(v/v)
Glicerol 0,5%(v/v)
SSC 10x
NaCl 3M
Citrato de Sódio 0,3M
Tampão de Amostra para gel de
agarose 6x
Azul de bromofenol 0,025%(w/v)
Xileno-cianol 0,025%(w/v)
Glicerol 30%(v/v)
Tampão de amostra de RNA
Formamida deionizada 50%(v/v)
Formaldeído 6%(v/v)
tampão MOPS 1x
Tampão de amostra de proteína
6x
SDS 2%(v/v)
DTT10mM
Azul de bromofenol 0,02%(w/v)
Glicerol 10%(v/v)
Tampão Fosfato 10x
Na
2
HPO
4
0,3mM
Na H
2
PO
4
5mM
NaCl 72,6mM
Tampão de Substrato
Tris-HCl 1,2% (p/v)
MgCl
2
0,1M
azida sódica 0,01%
Tampão Tris-Glicina
Tris-HCl 0,1M
Glicina 0,7%(p/v)
Materiais e Métodos
25
TBE
Tris-borato 90mM
EDTA 1mM pH8,0
pH ajustado a 7,5
TE-4
Tris-HCl 10mM pH 8,0
EDTA 0,1mM
TE
Tris-HCl 10mM pH8,0
EDTA 1mM
TNE
Tris-HCl 1M pH 7,6
NaCl 5M
EDTA 0,5M pH8,0
C
ULTURA DE
T
RYPANOSOMA CRUZI
Cultura axênica das formas epimastigotas
Utilizamos células de Trypanosoma cruzi das cepas CL e Y e os clones de
T. cruzi CL Brenner (Cano et al., 1995) e Dm28c (Contreras et al., 1988). Formas
epimastigotas eram mantidas em cultura axênica em meio LIT (Camargo, 1964) a
29ºC, com repiques semanais para a densidade populacional de 1 x 10
7
células/mL.
Cultura das formas tripomastigotas e amastigotas em células de
mamíferos
As formas tripomastigotas e amastigotas foram produzidas in vitro em
colaboração com a Professora Thaís Souto-Padrón do Instituto de Microbiologia
aqui da UFRJ. Utilizamos células LLCMK2 (Hull, et.al., 1962) cultivadas em meio
RPMI a 37ºC com 5% de CO
2
em estufa Nuaire IR Autoflow CO
2
Water-Jacketed
incubator com troca de meio a cada 2-3 dias. A infecção com formas
tripomastigotas de T. cruzi ocorria com inóculo de aproximadamente 10
6
células
por garrafa de cultura por 24 horas.
Materiais e Métodos
26
Após o rompimento das células LLCMK2, o que ocorria em torno de 7-15
dias, o sobrenadante era submetido a uma centrifugação inicial de 1000rpm em
centrífuga clínica (180g) por 5 minutos para sedimentação dos debris celulares.
Este sobrenadante era filtrado em papel de filtro e transferido para outro tubo e
novamente centrifugado, desta vez a 3000 rpm (2250g) por 10 minutos para
sedimentação das células de T. cruzi. O tubo era colocado a 37ºC por 2 horas
sem agitação quando as formas amastigotas e tripomastigotas eram então
separadas, baseado no fato de que as formas tripomastigostas escapavam do
sedimentado para a superfície devido à sua maior mobilidade enquanto as formas
amastigotas permaneciam no fundo do tubo.
E
XTRAÇÃO DE
Á
CIDOS
N
UCLÉICOS
Extração de DNA de Trypanosoma cruzi
A extração do DNA dos microrganismos era realizada a partir de 25mL de
cultura em fase estacionária (Sambrook et al. 2001 com modificações). As células
eram sedimentadas por centrifugação por 10 minutos a 2000 rpm em centrífuga
clínica e lavadas com 30mL de tampão PBS pelo menos 3 vezes. A seguir, as
células eram ressuspensas em 420µL de tampão TNE. Adicionava-se então SDS
para uma concentração final de 1% e 400µg de proteinase K incubando-se a 37ºC
por 18 horas. Extraía-se o DNA adicionando-se ao lisado de células igual volume
de fenol-clorofórmio e centrifugando-se por 1 minuto em microcentrífuga a 12.000
rpm; a fase aquosa era transferida para outro tubo e estes passos eram repetidos
até o desaparecimento da interface protéica. Precipitava-se o DNA presente na
solução aquosa adicionando-se 1/10 do volume de acetato de sódio 3M pH 4,8 e
2,5 volumes de etanol absoluto. O DNA precipitado na mistura era sedimentado
por centrifugação por 15 minutos em microcentrífuga a 12.000 rpm. O sedimento
era lavado com etanol 70% e posteriormente ressuspenso na concentração de
2µg/mL em TE.
Materiais e Métodos
27
Extração de RNA total de Trypanosoma cruzi
Para a extração de RNA, utilizava-se uma cultura em fase exponencial
contendo geralmente 5 x 10
9
células. As células eram sedimentadas por
centrifugação por 10 minutos a 2000 rpm em centrífuga clínica e lavadas com
10mL de PBS pelo menos 2 vezes. O sedimento de células era coberto com 25mL
de solução de extração de RNA 1 e imediatamente vortexado até que a solução
ficasse translúcida, quando então, adicionava-se 0,3 volume de etanol absoluto
para a precipitação diferencial das moléculas de RNA. Centrifugava-se por 5
minutos a 16.000g a 4ºC e descartava-se o sobrenadante. Ressuspendia-se o
precipitado de RNA em 1mL de solução de extração de RNA 2, adicionando-se
depois, 0,05 volume de ácido acético 1M e 0,5 volume de etanol absoluto. Após 10
minutos a –20ºC, a solução era submetida à centrifugação por 10 minutos a 7000g
a 4ºC. O precipitado de RNA era ressuspenso em 1 a 3mL de H
2
O e novamente
precipitado como descrito para DNA (Chomczynski e Sacchi, 1987).
O
BTENÇÃO DE
E
XTRATOS
C
ELULARES DE TRIPANOSSOMATÍDEOS
As células eram primeiramente contadas em câmara de Newbauer. Em
seguida, as mesmas eram sedimentadas através de centrifugação por 1 minuto a
12.000 rpm. O sedimentado era lavado com PBS e as células ressuspensas em
tampão de amostra de proteína 1x para uma concentração de 10
5
a 10
6
células/µL. Os extratos celulares totais eram imediatamente utilizados para evitar a
ação de proteases (Sambrook et al., 2001).
C
LONAGEM DE FRAGMENTOS DE
DNA
EM VETORES BACTERIANOS
Indução de competência em E. coli
A cultura bacteriana era inoculada, com alça de platina ou ponteira estéril,
diretamente do estoque congelado em 3mL de meio LB e cultivada por 18 horas
Materiais e Métodos
28
sob agitação a 37ºC. Em seguida, a cultura era repicada retirando-se 1mL e
inoculando-se em 50mL de meio LB. A cultura era cultivada até que atingisse
Abs
600nm
0,5, quando as células eram sedimentadas por centrifugação a 2800 rpm
a 4ºC por 10 minutos. O sedimentado de células era ressuspenso em 25mL de
solução de CaCl
2
50mM e mantido no gelo por pelo menos 30 minutos tomando-se
o devido cuidado no manuseio das células bacterianas a fim de se evitar lise
celular. Após a incubação, as células eram novamente centrifugadas sob as
mesmas condições já citadas, no entanto ressuspensas desta vez em 5mL de
CaCl
2
50mM. Após nova incubação em gelo por 60 minutos, adicionava-se glicerol
para uma concentração final de 20% e aliquotava-se em tubos que posteriormente
eram armazenados a –70ºC (Sambrook et al. 2001., com modificações)
Transformação bacteriana
A transformação era induzida, adicionando-se de 50 a 100ng do DNA
plasmidial de interesse em volume de 1-15µL, às células competentes e
incubando-se em gelo por 15 minutos. Um choque térmico de 90 segundos era
feito colocando-se a mistura em banho-maria a 42ºC e retornando-as ao gelo por
2 minutos. As células eram recuperadas adicionando-se 800µL de meio LB e
mantendo-se a cultura a 37ºC por 30 minutos. A seleção dos transformantes se
dava plaqueando-se 100µL da cultura em placas contendo LB-ágar e 100µg/mL
de ampicilina. Otimizava-se a obtenção de transformantes, sedimentando-se as
células restantes na cultura através de centrifugação por 1 minuto em
microcentrífuga a 12.000 rpm. Retirava-se 800µL do meio e ressuspendia-se as
células nos 100µL restantes para posterior plaqueamento (Sambrook et al. 2001.,
com modificações).
Extração de DNA plasmidial em pequena escala
As bactérias transformadas com os plasmídeos de interesse eram
cultivadas em 2mL de meio LB com ampicilina a 50µg/mL por toda a noite sob
Materiais e Métodos
29
agitação a 37ºC. As células eram posteriormente sedimentadas por centrifugação
a 12.000 rpm por 1 minuto em microcentrífuga. Ressuspendia-se o precipitado em
100µL da solução GET. Preparava-se imediatamente antes de usar uma solução
contendo NaOH 0,2N e SDS 1%. Adicionava-se 150µL desta solução à suspensão
de células e misturava-se por inversão. Adicionava-se 150µL de acetato de
potássio 3M pH4,8 e em seguida 150µL de clorofórmio. O material era então
centrifugado por 3 minutos a 12.000 rpm e a fase aquosa transferida para um tubo
novo. O DNA plasmidial era precipitado adicionando-se 2 volumes de etanol
absoluto e incubando-se à temperatura ambiente por 2 minutos. O material
precipitado era sedimentado por 15 minutos na microcentrífuga a 12.000 rpm e
ressuspenso em 20 a 30 µL de TE (Sambrook et al. 2001., com modificações).
E
LETROFORESE
Eletroforese de DNA em gel de agarose
Agarose suficiente para concentração final de 0,8 a 1,5% era dissolvida em
tampão TBE. A solução era vertida ainda morna em fôrma apropriada para
eletroforese horizontal e após gelificação, o gel era coberto com tampão TBE. As
amostras de DNA eram diluídas em tampão de amostra para gel de agarose 6x
para uma concentração final de 1x e aplicadas nos poços formados no gel no pólo
negativo. A corrida eletroforética se dava entre 70 e 100V. Após a corrida
eletroforética, os géis eram corados em solução de brometo de etídeo 5µg/mL e
visualizados sob luz ultravioleta (Sambrook et al. 2001, com modificações).
Eletroforese desnaturante de RNA em gel de agarose
Adicionava-se 1,2g de agarose e 10mL de tampão MOPS 10x pH 7,5 10x a
73mL de H
2
O até a completa dissolução da agarose. Após o esfriamento da
solução adicionava-se formaldeído para uma concentração final de 6%. O material
Materiais e Métodos
30
era vertido em cuba apropriada devidamente nivelada. A gelificação se dava em
aproximadamente 30 minutos quando o gel era coberto com tampão MOPS 1x. As
amostras eram preparadas adicionando-se 5µg de RNA total em 9,7µL de tampão
de amostra de RNA, aquecendo-se por 10 minutos a 65ºC e incubando-se em
gelo. Antes da aplicação adicionava-se tampão de amostra para gel de agarose
para uma concentração final de 1x. A corrida se dava a 100V constantes até que o
corante azul de bromofenol chegasse a aproximadamente 3 cm do final do gel. O
gel era então corado com solução de brometo de etídeo 5µg/mL e visualizado em
transiluminador de ultravioleta (Sambrook et al. 2001, com modificações).
Eletroforese em gel de poliacrilamida com SDS (SDS – PAGE)
Para a montagem do gel de separação, preparava-se uma solução contendo
acrilamida-bisacrilamida 12-16%, onde a relação acrilamida-biscarilamida era de
29:1, além de Tris-HCl pH 8,8 0,375M, SDS 0,1%, APS 0,05% e TEMED 0,1% e
vertia-se em aparato apropriado para eletroforese vertical. Cobria-se o gel com
1mL de butanol e deixava-se polimerizando por 30 minutos. Após a polimerização,
retirava-se a butanol, lavava-se com H
2
O destilada e retirava-se a água com o
auxílio de uma folha de papel de filtro. Cobria-se o gel de separação com a
solução para o gel de empacotamento que continha acrilamida-bisacrilamida 4%,
Tris HCl pH6,8 0,125M, SDS 0,1%, APS 0,05% e TEMED 0,1%. Colocava-se o
pente e deixava-se polimerizando por 30 minutos.
As amostras de extrato protéico eram preparadas adicionando-se tampão
de amostra de proteína para concentração de 1x, aquecendo-as a 95ºC por 5
minutos e incubando-as em gelo.
Durante a separação das amostras no gel de empacotamento, a corrida
eletroforética se dava a 25mA constantes; quando as amostras passavam para o
gel de separação, aumentava-se a corrente para 35mA.
Após a corrida eletroforética, os géis eram corados e fixados mergulhando-
os em solução de Azul de Comassie por 1 a 18 horas. Posteriormente, os géis
Materiais e Métodos
31
eram mergulhados na solução descorante até que o fundo do gel clareasse e as
bandas pudessem ser visualizadas com nitidez. Para a secagem do gel, este era
mergulhado em solução encolhedora por 1 hora e posteriormente colocado entre
duas folhas de papel celofane presas a grampos por aproximadamente 48hs
(Weber e Osborne, 1969).
Eletroforese em gel de poliacrilamida
Os géis de poliacrilamida eram produzidos através da mistura de uma
solução contendo acrilamida/bisacrilamida (38:2) com tampão TAE 1x ou TBE
0,5X, além de APS 0,1 % e TEMED 0,1%. Para os géis desnaturantes
acrescentava-se ainda uréia a 6%. Estes eram corridos a 40W constantes a uma
temperatura controlada de 50ºC. Os géis não desnaturantes (para gel shift) eram
corridos a 4ºC a 100-200V constantes. Após a corrida, os géis eram transferidos
para papel de filtro e secos em secador de gel por 1hora a 80ºC. Após a secagem,
os mesmos eram expostos a filme de raio X ou à tela intensificadora do aparato de
exposição Phosphor Screen General Purpose (Molecular Dynamics).
T
RANSFERÊNCIA DE MACROMOLÉCULAS PARA MEMBRANAS
Transferência de RNA para membranas de nylon – northern blot
Os géis de agarose de RNA para transferência eram sempre feitos em
duplicata. Uma cópia era corada com brometo de etídeo e a outra usada para
transferência sem tratamento prévio. Para a transferência, uma cuba de
transferência era devidamente preenchida com SSC 2X e o gel era colocado
invertido sobre a cuba seguido pela membrana de nylon previamente mergulhada
em SSC 2X por 10 minutos e devidamente marcada para orientação posterior. A
membrana era coberta com um volume de 5 cm de papel de filtro e guarnecida
com um peso de papel. Toda a cuba era coberta com um filme plástico e a
transferência se dava por 18 horas à temperatura ambiente. Após a transferência,
Materiais e Métodos
32
a membrana era exposta à luz de transiluminador ultravioleta por 1 minuto e
deixada em forno a 80°C por 1 hora e 30 minutos (Sambrook, et.al., 2001)
Transferência de proteínas para membranas de nitrocelulose – western blot
Os géis de poliacrilamida com SDS eram feitos em duplicata. Uma das
cópias era corada com comassie blue e a outra submetida à transferência.
A transferência se dava em aparato apropriado para eletrotransferência. O
gel e a membrana de nitrocelulose eram posicionados entre duas folhas de papel
de filtro e este conjunto era fixado em grades especiais. Alternativamente,
utilizava-se a membrana Hybond-P de acordo com as instruções do fabricante
(Amershan-Pharmacia). O aparato era mergulhado em solução de transferência
de forma que o gel ficasse no pólo negativo e a membrana no pólo positivo. A
transferência das proteínas para a membrana acontecia a 50mA constantes por 16
horas a 4ºC ou, alternativamente, por 300mA constantes por 1hora em gelo.
A membrana era armazenada a 4ºC até a sua utilização. A verificação da
transferência era feita através da coloração da membrana com solução de
vermelho de Ponceau. A membrana era mergulhada nesta solução por 5 minutos
e o excesso de corante retirado com PBS até a visualização das bandas
(Sambrook et al., 2001).
H
IBRIDIZAÇÃO A SONDAS MOLECULARES
Marcação de sondas de DNA por iniciação randômica
Os vetores utilizados como sonda eram previamente digeridos com enzimas
de restrição para a liberação do inserto. Após a digestão, o inserto era purificado
através de eletroforese em gel de agarose de onde a banda de interesse era
excisada e purificada com o kit QiaxII da Qiagen
.
Materiais e Métodos
33
O material eluído era posteriormente dosado em espectrofotômetro a
260nm.
A marcação radioativa do inserto purificado de DNA era feita em 25ng do
mesmo com 50µCu do isótopo [α-
32
P]dCTP ou [α-
32
P]dATP de acordo com o
protocolo do kit RadPrime DNA Labeling System, da GibcoBRL
(Sambrook et al.,
2001., com modificações).
Marcação de sondas de DNA por end-labeling
5pmoles de sonda eram incubados juntamente com exchange buffer 1X
(Gibco
) e 10 unidades da enzima T4 quinase, além de 10 unidades de inibidor de
RNAse e 50 µCu do isótopo [γ-
32
P]dATP em água DEPC num volume final de
reação de 20µL. Após incubação por 1 hora a 37ºC, a sonda era purificada em
coluna de sefarose G50 ou precipitada com cloreto de amônio e contada em
cintilador.
Marcação de sondas de RNA por transcrição in vitro
400ng de DNA molde previamente linearizado eram incubados com 500nM
de ribonucleotídeos, 10mM de DTT, tampão de transcrição 1x (Gibco
), 0,005%
de BSA, 50µCu do isótopo [α-
32
P]UTP, 10 unidades de inibidor de RNAse e 10
unidades de T7 RNA polimerase por 1 hora a 37ºC. Após a incubação inicial, o
DNA molde era digerido com 10 unidades da enzima DNAse RNAse free por 1
hora a 37ºC. A reação era purificada com fenol-clorofórmio e coluna de sefarose
G50. A marcação obtida era contada no cintilador.
Reação de hibridização à sonda homóloga
A membrana contendo os ácidos nucléicos transferidos do gel, era colocada
em saco plástico com a solução de pré-hibridização por no mínimo 1 hora a 42ºC.
Após a pré-hibridização, adicionava-se à solução SDS para uma concentração
Materiais e Métodos
34
final de 0,1% e a sonda marcada, previamente aquecida a 95ºC por 5 minutos. A
reação de hibridização ocorria por 18 horas a 42ºC.
Após a incubação, a membrana era lavada com a solução de lavagem 1 por
15 minutos a 42ºC duas vezes e posteriormente duas vezes com a solução de
lavagem 2 também a 42ºC por 15 minutos.
A membrana era acomodada em cassete apropriado, coberta com filme de
raios X e com tela intensificadora (lightning Plus, Du Pont
). A exposição ocorria a
–70ºC em tempos variados (Sambrook et al., 2000, com modificações).
I
MUNOBLOT
Com Anticorpo conjugado à Peroxidase
A membrana contendo as proteínas transferidas do gel de poliacrilamida
com SDS era mergulhada em solução de bloqueio e mantida sob agitação por 1
hora à temperatura ambiente. Em seguida, retirava-se a solução de bloqueio inicial
e adicionava-se nova solução de bloqueio contendo o anticorpo primário, na
diluição ideal de cada anticorpo. A incubação se dava à temperatura ambiente sob
agitação por 1 hora quando a membrana era então lavada por duas vezes com
PBS-T por 5 minutos à temperatura ambiente, sob agitação. À membrana, então,
adicionava-se nova solução de bloqueio, desta vez contendo o anticorpo
secundário, anti –IgG de coelho ou camundongo conjugado a HRP (Horseradish
Peroxidase). A incubação e a lavagem ocorriam da mesma forma que com o
anticorpo primário.
A revelação era feita com o kit de ECL da Santa Cruz Biotechnology
, de
acordo com o protocolo do fabricante.
Com Anticorpo conjugado à Fosfatase Alcalina
Alternativamente à revelação por peroxidase, utilizava-se protocolo para
revelação com a fosfatase alcalina. Neste caso, as soluções de bloqueio e
lavagem não continham fosfato e sim o sal Tris para evitar reação cruzada. A
Materiais e Métodos
35
revelação era feita incubando-se a membrana em Solução de Revelação até o
aparecimento das bandas protéicas de interesse.
C
ONSTRUÇÃO DE VETORES RECOMBINANTES
Reação em Cadeia da Polimerase
Para a reação de PCR utilizava-se 100ng de DNA genômico, 1µM de cada
oligonucleotídio, 200µM de cada um dos dNTPs, 1,5mM de MgCl
2
, tampão de
PCR GibcoBRL
para concentração de 1x e 1,5U de Taq DNA polimerase
GibcoBRL
em um volume de reação de 25µL. A reação ocorria em termociclador
modelo Mastercycler gradient, da Eppendorff
, programado para desnaturação
inicial de 94ºC por 5 minutos, 25 ciclos de 94ºC por 30 segundos, 55ºC por 30
segundos, 72ºC por 30 segundos e uma extensão final de 10 minutos a 72ºC, a
exceção de quando especificado no texto.
Purificação de fragmento de DNA de gel de agarose
O fragmento de DNA era purificado do gel pelo Kit Consert Gel Extraction
System da GibcoBRL
ou com o kit QiaexII da Qiagen
de acordo com as
instruções do fabricante.
Reação de ligação do vetor ao produto de PCR
6µL do produto de PCR digerido e purificado do gel de agarose eram
ligados a 6µL do vetor pKS também digerido e purificado do gel utilizando-se 1U
da enzima T4 DNA ligase (Gibco
) num volume de reação de 15µL A reação de
ligação ocorria a 14ºC por 15 horas de acordo com recomendações do fabricante.
6µL desta reação de ligação eram utilizados para transformação de células E.coli
DH5αF´IQ.
Materiais e Métodos
36
S
EQUENCIAMENTO DE
DNA
1µg do DNA plasmidial era seqüenciado em Seqüenciador Capilar
MegaBace 1000 (Molecular Dinamics e Amersham Biosciences
), um sistema de
análise de DNA de 96 capilares. As reações de seqüenciamento são realizadas de
acordo com o protocolo para o MegaBACE 1000, utilizando o APBiotech
DYEnamic ET Dye Terminator Cycle Sequencing Kit (com Thermo Sequenase™ II
DNA Polimerase). As seqüências são analisadas pelo software Sequence
Analyser utilizando o Base Caller Cimarron 3.
P
RODUÇÃO DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES
As proteínas recombinantes eram purificadas de acordo com as
recomendações do fabricante com algumas modificações (Bulk GST Purification
Modules – Amershan Pharmacia
). Os clones recombinantes de E. coli eram
inoculados em 4mL de meio 2xYT-G contendo 100µg/mL de ampicilina e
cultivados por 18 horas sob agitação a 37ºC. Posteriormente, o volume era
elevado adicionando-se 36mL de meio 2xYTG – Ampicilina e a cultura era
crescida sob as mesmas condições até que atingisse Abs
600nm
1-2 quando então
era adicionado IPTG para uma concentração final de 0,1µg/mL. A indução da
expressão da proteína de fusão se dava por 3 horas e 30 minutos. A cultura era,
então, centrifugada a 5000rpm em rotor SS-34 (Sorvall
) por 10 minutos e o
sedimentado de bactérias era ressuspenssa em 3mL de solução de ressupensão.
Adicionava-se lisozima para uma concentração final de 10µg/mL e deixava-se sob
agitação a 30ºC por 15 minutos. Adicionava-se então triton X-100 para
concentração final de 1% e incubava-se em gelo por 30 minutos. Centrifugava-se
por 10 minutos a 12.000 rpm para retirada dos debris celulares e transferia-se o
sobrenadante para outro tubo. Ao sobrenadante adicionava-se a matriz glutationa
sefarose preparada de acordo com o kit Bulk GST purification module, da
Amersham Pharmacia
®
e deixava-se sob agitação por 20 minutos. A retirada da
Materiais e Métodos
37
proteína recombinante se dava por uma das duas formas: ou a proteína de fusão
era eluída 3 vezes com tampão de eluição acrescido de NaCl 0,2N por 10 minutos,
ou adicionava-se 90µL de tampão PBS à matriz juntamente com 10U de trombina
e deixava-se sob agitação por 2 horas à temperatura ambiente.
I
MUNOFLUORESCÊNCIA
As células de T. cruzi eram contadas em câmara de Newbauer, lavadas
com PBS e ressuspensas em solução contendo paraformaldeído 4% e
glutaraldeído 0,32%. A fixação se dava por 30 minutos à temperatura ambiente,
quando um volume contendo 10
6
células era colocado sobre lamínulas novas e
secas previamente tratadas. O tratamento das lamínulas consistia em lavagem
com acetona, e tratamento com poli-L-lisina por 30 minutos à temperatura
ambiente. As lamínulas eram posteriormente lavadas com PBS e secas em estufa
a 37ºC. A adesão das células às lamínulas se dava à temperatura ambiente por no
mínimo 30 minutos.
Para a permeabilização das células, as lamínulas contendo as células
aderidas eram mergulhadas em acetona gelada, mantidas a 4ºC por 10 minutos e
posteriormente lavadas com PBS, quando eram tratadas com Cloreto de amônio
150mM por 20 minutos. Após lavagem das lamínulas com PBS, estas eram
tratadas com solução contendo PBS e BSA 3% por 16 horas a 4ºC. RNAse A para
concentração de 20µg/mL era adicionada à solução de PBS/BSA e as lamínulas
mantidas em estufa a 37ºC por 1 hora. Após retirada da solução PBS/BSA/RNAse,
com a solução PBS/BSA, adicionava-se a solução contendo o anticorpo
antip34p37 diluído 100x em PBS. A reação de ligação antígeno-anticorpo se dava
à temperatura ambiente por 1 hora. As lamínulas eram lavadas com PBS e
tratadas com anticorpo secundário anti-coelho conjungado à fluoresceína diluído
500x e com iodeto de propídio 10µg/mL por 1 hora à temperatura ambiente sob
iluminação indireta. As lâminas eram montadas colocando-se sobre elas 1 gota de
N-propil galacto e posteriormente a lamínula era selada com esmalte. As lâminas
prontas eram congeladas a –20ºC protegidas da luz. A análise das lâminas foi
Materiais e Métodos
38
feita em microscópio confocal de fluorescência no modo fluorescência
convencional em colaboração com o Laboratório de Ultraestrutura Celular Hertha
Meyer/IBCCF. Como controle negativo, utilizou-se soro pré-imune, quando
presente.
A
VALIAÇÃO DE
M
EIA VIDA DE M
RNA
Realizamos este ensaio de modo a estimar o tempo de degradação do RNA
mensageiro de interesse. Para isso, utilizamos o inibidor da transcrição
actinomicina D. Partimos de 200mL de cultura axênica de formas epimastigotas
em fase exponencial (em torno de 2 x 10
7
células/mL). Aplicamos actinomicina D
para uma concentração final de 10µg/mL. Uma alíquota de 12mL era retirada
imediatamente após a adição do inibidor para o ponto 0 minutos e alíquotas eram
retiradas após 30 minutos, 60 minutos, 90 minutos, 120 minutos, 150 minutos e
180 minutos. Em cada ponto, as células eram sedimentadas e o RNA extraído. As
amostras de RNA total extraído em cada ponto era separada em gel de agarose
com formamida e transferidas para membrana Hybond-N. As membranas eram
hibridizadas com a sonda de interesse, marcada com o isótopo [α-
32
P]dCTP.
R
EAÇÃO DE LIGAÇÃO PROTEÍNA
-
RNA
A reação de ligação proteína-RNA ocorria colocando-se em contato entre 0
e 800ng de proteína com 40.000 cpm de cada sonda em Tris-HCl 10mM, glicerol
5%, KCl 100mM, MgCl2 5mM, BSA 1µg/mL e tRNA 50ng/µL por 10 minutos a
37ºC. A ligação poderia ser visualizada em gel de poliacrilamida não desnaturante
(EMSA) ou filtrada em membranas de nitrocelulose.
F
ILTRAGEM EM MEMBRANA DE NITROCELULOSE
A reação de ligação proteína-RNA era aplicada diretamente sobre a
membrana (Schleicher & Schuel
) montada sobre um quitasato. Com a ajuda de
uma bomba de vácuo, pressão negativa era aplicada no interior do quitasato. A
membrana era lavada com 100x o volume da reação de ligação com solução de
Materiais e Métodos
39
binding. As membranas eram secas em forno a 80ºC por 1 hora e contadas em
cintilador.
P
RODUÇÃO DE
A
NTICORPO ANTI
-
PROTEÍNAS RECOMBINANTES
Os anticorpos foram produzidos com o auxílio do Professor José Mauro
Peralta do Instituto de Microbiologia Prof Paulo de Góes, da UFRJ. Brevemente, 3
injeções de 30µg da proteína recombinante foram realizadas em camundongos
Balb-c com intervalos de 10 dias e uso de adjuvante de Freud. Dois camundongos
foram utilizados para cada proteína. Após os trinta dias, os camundongos foram
sacrificados e os soros foram obtidos. Os soros são mantidos aliquotados e
congelados a –20ºC.
Resultados
40
R
ESULTADOS
M
APEAMENTO DAS
R
EGIÕES
N
ÃO
T
RADUZIDAS
(UTR
S
)
DOS
G
ENES
T
C
RRM
Resultados anteriores mostraram que os genes TcRRM se arranjam em
tandem intercalado a cópias do gene Tcp28 (Anexo 1 – Figura 1). É bem sabido
que as regiões não traduzidas exercem um papel fundamental no controle da
expressão gênica agindo em cis com fatores que podem regular a estabilidade e
tradução de um dado RNA. Daí a importância de se mapear os sítios de
processamento e de se delimitar as regiões não traduzidas durante a
caracterização de um determinado gene. A região 3´UTR dos RNAs mensageiros
de TcRRM foi mapeada através da técnica de 3´RACE. Brevemente, esta técnica
consiste na síntese de DNA através da técnica de RT-PCR onde se utiliza um
oligonucleotídeo iniciador composto por uma seqüência poli(t) ligada a uma
seqüência específica rica GC. Posteriormente amplifica-se o produto obtido com
oligonucleotídeos que pareiem a esta seqüência específica e à seqüência
codificante do gene de interesse. O produto amplificado é então clonado em vetor
plasmidial e posteriormente seqüenciado. Neste caso utilizamos o
oligonucleotídeo COOHbp-RACE para a amplificação da região 3´UTR dos genes
TcRRM. Este procedimento foi realizado a partir de RNA total das 3 formas
celulares do parasito (Figura 1 A) e 10 clones de cada foram selecionados para
seqüenciamento. As seqüências obtidas puderam ser separadas em dois grupos
diferentes e foram nomeadas 3´UTR I e 3´UTR II (Figura 1B). Para a seqüência 3´
UTR I, 5 diferentes sítios de poliadenilação foram encontrados enquanto que para
a seqüência 3´UTR II apenas 1. Não encontramos associação entre a presença de
uma destas seqüências de UTR e um determinado estágio celular. Inclusive, a
proporção de 7 para 3 de 3´UTR I para 3´UTR II é mantida aproximadamente nas
três formas celulares, conforme mostra o gráfico (Figura 1C). Portanto, não há
associação entre a presença dos diferentes sítios de poliadenilação do 3´UTR I e
as diferentes formas do parasito, indicando que não há acúmulo preferencial de
uma das formas de 3´UTR do gene TcRRM nos diferentes estágios.
Resultados
41
100pb
400pb
300pb
200pb
Amastigota
Tripomastigota
Epimastigota
Brometo de Etídio
100pb
400pb
300pb
200pb
Amastigota
Tripomastigota
Epimastigota
Amastigota
Tripomastigota
Epimastigota
Brometo de Etídio
A
B
3´UTR I
3´UTR II
CATCATCATCATAAGAACCACACGAAGTAAGAGAGGAGTGCTGTTTTAATCGTTTGTAAA
TTTTTTTATTCTTTTTAATCTTAAAAAAAAA
Número de clones
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Amastigota
T
r
ipom
as
tigota
Epimastigota
Número de clones
C
Figura 1 –Mapeamento da Região 3´ Não Traduzida (3´UTRs) dos Genes
TcRRM – Em A, produtos de amplificação da região 3´UTR dos genes
TcRRM dos diferentes tipos celulares de T. cruzi pela técnica de 3´RACE;
Os padrões de peso molecular encontram-se indicados á direita. Em B,
seqüências de DNA encontradas nas três formas celulares. Dois tipos de
seqüências foram determinados. Em azul, os diferentes sítios de
poliadenilação mapeados; em verde, o primer utilizado; em vermelho, o
sítio de terminação; Em C, o gráfico mostra o número de clones de cada
tipo de seqüência 3´UTR encontrados em cada forma celular.
CATCATCATCATAAGAACCACACGAAGTAATGCTATTTTTTGCAATGTGCAGCTTCACTTT
ATTATTTCTTATTTTTTGTTGTTTTTTTTAGGCATGCAAAAAAAAA
Resultados
42
A região 5´UTR de TcRRM foi obtida através da amplificação de RNA das três
formas celulares por transcrição reversa utilizando-se iniciadores para a região do
mini-exon em conjunto com oligonucleotídeos para a região codificante de TcRRM
(
TcRNAbp NH
2
Bam).
O cDNA obtido foi submetido a PCR e os produtos clonados
em vetores plasmidiais e 10 clones de cada foram seqüenciados. Devido à
presença da inserção ou deleção dos 18 nucleotídeos na porção 5´da região
codificante (Anexo I – Figura 1B), pudemos distinguir entre os genes TcRRM 1 e
2. Uma única seqüência foi obtida para cada gene. Interessantemente, esta
seqüência é bastante similar à região 5´UTR dos genes de T. brucei,
apresentando inclusive uma deleção comum a Tbp34 e a TcRRM1 (Figura 2).
A
LINHAMENTO DAS
S
EQUÊNCIAS DE
A
MINOÁCIDOS
P
REDITAS
P
ARA AS
P
ROTEÍNAS DE
L
IGAÇÃO A
RNA
DE
T.
CRUZI
,
T.
BRUCEI E
L.
MAJOR
.
Conforme determinado durante o mestrado (Anexo 1 – Figura 3), a
seqüência predita das proteínas TcRRM é bastante similar a duas proteínas de T.
brucei, Tbp34 e Tbp37. Com a liberação das seqüências do projeto genoma de L.
major, apenas 1 gene havia sido descrito, ao contrário dos dois que haviam sido
descritos nas duas espécies do gênero Trypanosoma. A fim de verificarmos se isto
ocorria devido a erros inerentes ao processo de empilhamento de seqüências com
alta semelhança que é utilizado durante a montagem de um genoma, ou se esta
espécie apresentava realmente uma única proteína, realizamos um experimento
de Western blot com anticorpos gerados contra as proteínas Tbp34/Tbp37 (Figura
3). A figura mostra que o anticorpo é capaz de reconhecer as duas proteínas de T.
brucei, Tbp34 e Tbp37, bem como as duas proteínas de T. cruzi, TcRRM1 e
TcRRM2. Na raia contendo extrato total de L. braziliensis, apenas 1 única banda é
reconhecida pelo anticorpo. Esta é compatível com o tamanho esperado a partir
da seqüência predita sugerindo que se trata realmente de um único gene.
Resultados
43
Figura 2 –Mapeamento da Região 5´ Não Traduzida (5´UTRs) dos Genes
TcRRMs – Em A, produtos de amplificação da região 5´UTR dos genes
TcRRM das diferentes tipos celulares de T. cruzi utilizando-se
oligonucleotídeo iniciador para a região do mini-exon. Os padrões de peso
molecular encontram-se indicados á direita. Em B, sequências encontradas
nas três formas celulares de T. cruzi e comparação com seqüências dos
genes Tbp34 e Tbp37 de T. brucei. Dois tipos de seqüências foram
determinados. No caso do T. cruzi, TcRRM 1 e 2. Em verde, seqüência de
mini-exon; em azul, os nucleotídeos idênticos, em vermelho, o sítio de
iniciação.
Amastigota
Tripomastigota
Epimastigota
100pb
400pb
300pb
200pb
Brometo de Etídio
Amastigota
Tripomastigota
Epimastigota
100pb
400pb
300pb
200pb
Brometo de Etídio
Amastigota
Tripomastigota
Epimastigota
100pb
400pb
300pb
200pb
Amastigota
Tripomastigota
Epimastigota
Amastigota
Tripomastigota
Epimastigota
100pb
400pb
300pb
200pb
Brometo de Etídio
Tbp37
Tbp34
TcRRM1
TcRRM2
Mini-exonMini-exon
Iniciação
5´UTR
------CAGTTTCT-GTACTATATTGCAAGTAAGCAAAACACTTTCACCTCGGACATCGAGTAATAAAAAGCAAAGGAAAGA----ATG
------CAGTTTCT-GTACTATATTG-------------CACTTTTACCTCGGACATCGAGTCATAAAAAGTTAAGGAAAAAAGGAATG
----------------TACTATATTG--------------ACTTTGACCTCGAACTTCGAGTAATAAAA--TCAAGGAA-GC----ATG
GCACGAGGGTTTCTTGTACTATATTGCAATTTAGCAAT--ACTTCGACCTCGAACTTCGAGTAATAAAA--TCAAGGAA-GC----ATG
A
B
Resultados
44
Figura 3 – Detecção de proteínas de ligação a RNA de T. cruzi, T. brucei e
L. braziliensis por Western blot a partir de extratos celulares usando os
anticorpos gerados contra as proteínas Tbp34/Tbp37 de T. brucei. Gel de
Poliacrilamida com SDS 12%.
T. cruzi – epimastigotas
L. braziliensis – promastigotas
T. brucei - sanguícolas
Resultados
45
M
EIA VIDA DOS
RNA
S CODIFICANTES DAS PROTEÍNAS
T
C
RRM
Uma das formas de controle da expressão gênica utilizada pelos
tripanossomatídeos com freqüência é a regulação da estabilidade do RNA
mensageiro. Assim, de modo a estimar o tempo de degradação do RNA
mensageiro de TcRRM, nós utilizamos o inibidor da transcrição actinomicina D.
Este foi adicionado na fase exponencial de uma cultura de epimastigotas de
T.cruzi. Dadas as dificuldades de manutenção das culturas de tripomastigotas e
de amastigotas, realizamos este ensaio apenas com as formas epimastigotas.
Alíquotas das culturas foram retiradas em diferentes tempos após a adição da
droga, a saber, 10, 20, 30, 60 e 120 minutos. O RNA total foi extraído de cada
alíquota e separado por gel de agarose com formamida e posteriormente foi
transferido para membrana. A membrana foi hibridizada com uma sonda
correspondente a região codificante de RRM (Figura 4A). Podemos observar que,
mesmo após 120 minutos, a abundância do mRNA não se reduziu à 50%, o que
leva a crer que este mRNA é bastante estável.
P
ROTEÍNAS
T
C
RRM
NAS DIFERENTES FORMAS EVOLUTIVAS DO
T.
CRUZI
Ensaios de northern blot realizados durante o mestrado (Anexo I – Figura 4)
sugeriam um acúmulo diferencial de RNAs mensageiros nas três diferentes formas
celulares de T. cruzi, com um acúmulo maior na forma amastigota. Todavia, a
sonda RRM não é capaz de distinguir entre os transcritos de TcRRM1 e 2 dada a
semelhança na seqüência de nucleotídeos e a mínima diferença no peso
molecular entre os mRNAs. Os extratos protéicos das três formas celulares do T.
cruzi, amastigotas, tripomastigotas e epimastigotas foram separados em géis de
poliacrilamida com SDS realizados em duplicata. Uma das cópias do gel foi
corada, e a outra foi transferida para membrana e incubada com o anticorpo anti-
p34/p37, produzido contra as proteínas de T. brucei (Figura 5). Este procedimento
nos permitiu identificar duas proteínas nas formas epimastigotas de T. cruzi.
Apenas a proteína TcRRM 1, de maior peso molecular, pode ser identificada nas
Resultados
46
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
0 20 40 60 80 100 120 140
Tem po (min)
[R]t/[R]0
Figura 4 – Meia vida dos RNAs codificantes das proteínas TcRRMs. RNA
total foi extraído em diferentes tempos após a adição de actinomicina D à
cultura de formas epimastigotas de T.cruzi. (A) RNA separado por
eletroforese em gel de agarose-formamida. O gel foi transferido para
membrana e a membrana foi hibridizada à sonda TcRRM, que
compreende toda a região codificante. Os pesos moleculares relativos aos
RNAs ribossomais estão delimitados à esquerda. B, Diminuição da
densidade do sinal obtido após o tempo de exposição à actinomicina D.
sonda TcRRMBrometo de Etídeo
2,4Kb
2,02Kb
1,59Kb
10 20 60 1203010 20 6030 120
Tempo (minutos) Tempo (minutos)
A
B
Intensidade de sinal
Resultados
47
Figura 5 – Verificação da Presença das Proteínas TcRMM nos diferentes
tipos celulares de T. cruzi – Extrato Protéico obtido a partir de 10
6
células
foi separado em gel de poliacrilamida 12% e transferido para membrana de
nitrocelulose. A membrana foi incubada com anticorpo específico para as
proteínas Tbp34/Tbp37 de T. brucei. Os pesos moleculares estão
indicados à esquerda.
Anti-p34/p37
Epimastigotas
Tripomastigotas
Amastigotas
TcRBP2
TcRBP1
SDS-PAGE Imunoblot
34kDa
32kDa
Commassie Blue
Epimastigotas
Tripomastigotas
Amastigotas
Figura 5 – Verificação da Presença das Proteínas TcRMM nos diferentes
tipos celulares de T. cruzi – Extrato Protéico obtido a partir de 10
6
células
foi separado em gel de poliacrilamida 12% e transferido para membrana de
nitrocelulose. A membrana foi incubada com anticorpo específico para as
proteínas Tbp34/Tbp37 de T. brucei. Os pesos moleculares estão
indicados à esquerda.
Anti-p34/p37
Epimastigotas
Tripomastigotas
Amastigotas
TcRBP2
TcRBP1
SDS-PAGE Imunoblot
34kDa
32kDa
Commassie Blue
Epimastigotas
Tripomastigotas
Amastigotas
Anti-p34/p37
Epimastigotas
Tripomastigotas
Amastigotas
TcRBP2
TcRBP1
SDS-PAGE Imunoblot
34kDa
32kDa
34kDa
32kDa
34kDa
32kDa
Commassie Blue
Epimastigotas
Tripomastigotas
Amastigotas
Resultados
48
formas amastigotas. Nenhuma proteína foi identificada nas formas tripomastigotas.
Este experimento sugere que as proteínas TcRRM sejam reguladas ao longo do
ciclo de vida do T cruzi.
L
OCALIZAÇÃO
C
ELULAR DAS
P
ROTEÍNAS
T
C
RRM
EM
T.
CRUZI
.
Experimentos realizados durante o mestrado (Anexo I – Figura 5), sugeriam
que as proteínas TcRRM se localizavam no citoplasma das formas epimastigotas
de T. cruzi, ao contrário das ortólogas de T. brucei. Continuamos então a
avaliação da localização das proteínas de T, cruzi utilizando os anticorpos anti-
Tbp34/Tbp37 de T. brucei reconhecidos por anticorpo secundário conjugado à
fluoresceína, em um experimento de imunofluorescência. Neste caso, utilizamos
não só as formas epimastigotas previamente estudadas (Figura 6 A-C) como
também as formas amastigotas (Figura 6 D-E) e tripomastigotas (Figura 6 F-I).
Nas formas epimastigotas, (Figura 6 A-C) o sinal emitido se concentra na
região perinuclear, região rica em retículo endoplasmático, local de síntese
protéica. Esta localização, que parece ser diferente das protéinas ortólogas de
T.brucei pode sugerir que as mesmas talvez apresentem funções fisiológicas
distintas. Neste experimento, pudemos detectar as proteínas TcRRM no
citoplasma das formas amastigotas, possivelmente na região abaixo da membrana
(Figura 6 D-E).
No caso das formas tripomastigotas, a localização foi variável, ora
apresentando uma localização semelhante àquela apresentada pelos amastigotas
(6F), ora apresentando uma localização mais difusa no citoplasma, ora não
apresentando marcação nenhuma (Figura 6G-I). Este resultado variável foi
encontrado em todas as vezes que esse experimento foi repetido.
C
APACIDADE DE
L
IGAÇÃO DA
P
ROTEÍNA
T
C
RRM1
E
T
C
RRM2
A
H
OMORRIBOPOLÍMEROS
Uma vez que as proteínas TcRRM apresentam domínios conservados de
ligação a RNA e com o intuito de avaliar se estas proteínas reconheceriam e se
Resultados
49
10µm10µm
10µm10µm
10µm10µm
A
B
C
Resultados
50
10µm10µm
10µm10µm
10µm10µm
D
E
F
Resultados
51
Figura 6 – Determinação da sub-localização celular das proteínas TcRRMs
por imunofluorescência nas células de T. cruzi. À direita, microscopia
de contraste diferencial interferencial, à esquerda, filtro para fluoresceína
indicando as proteínas TcRRMs; A-C, formas epimastigotas; D-E; formas
amastigotas; F-H, formas tripomastigotas; I, forma tripomastigota e forma
amastigota; A barra indica 10µm.
G
H
I
10µm10µm
10µm10µm
10µm10µm
Resultados
52
ligariam a seqüências homogêneas de RNA, incubamos as mesmas então com
polirribonucleotídeos: poliadenina (A), policitosina (C), poliguanina (G) e poliuridina
(U). A reação de ligação proteína-RNA ocorreu incubando-se entre 0 e 800ng de
proteína com as sondas de RNA marcadas com 40.000 cpm de cada sonda. Ao
final da incubação, o material foi filtrado em membranas de nitrocelulose. A
radioatividade nelas fixada, relativa ao complexo proteína-RNA, foi contada em
cintilador. Os experimentos foram feitos em duplicata e obteve-se a média das
contagens. Observou-se uma capacidade de ligação crescente de TcRRM1 na
presença dos polirribonucleotídeos poliA e poliC conforme aumentava-se a
quantidade de proteína, diferentemente do que ocorre com o polirribonucleotideos
poliG e poliU (Figura 7A). No caso da proteína TcRRM2, esta ligação dependente
da concentração de proteína ocorreu com o polirribonucleotídeo poliC. (Figura 7B).
A
VALIAÇÃO DA CAPACIDADE DE
L
IGAÇÃO DA
P
ROTEÍNA
T
C
RRM1
A
O
LIGORIBONUCLEOTÍDEOS
As proteínas ortólogas Tcp34 e Tcp37 de T. brucei foram caracterizadas
como sendo capazes de se ligarem ao rRNA 5S. Como as proteínas TcRRM
apresentam localização diferente, prosseguimos os ensaios de ligação a RNA
testando não apenas o rRNA 5S, como também oligoribonucleotídeos sintéticos.
Estes foram desenhados conforme DiNoia et.al. (2001a) e apresentam seqüências
ricas em adenina e em uridina (sonda S1) comumente encontradas em elementos
cis de regiões não traduzidas ou seqüências onde algumas adeninas foram
substituídas por guaninas (sonda S2). Como controle negativo, escolhemos a
molécula de ssDNA SP6. Todas as sondas foram marcadas radioativamente, ou
através de marcação terminal no caso das sondas S1 e S2 e SP6, ou, no caso do
rRNA 5S, durante a transcrição in vitro. Neste experimento, a proteína TcRRM1
reconheceu a sonda S1 (Figura 8). Essa ligação não ocorreu com as sondas S2
nem com a sonda de rRNA 5S e nem com a molécula de ssDNA SP6, à exceção
de sua concentração de 800ng. Entretanto, este experimento não pode ser
validado já que em nenhuma das vezes em que tentamos repeti-lo, obtivemos este
mesmo resultado. Diversos testes foram feitos, com diferentes condições de gel e
Resultados
53
A
poliA
-5
0
5
10
15
20
25
0 200 400 800
Quantidade de Proteínas (microgramas)
cpm
PoliC
-100
-50
0
50
100
150
200
250
300
1 2 3 4
Quantidade de Proteínas (microgram as)
cpm
PoliG
-200
-150
-100
-50
0
50
100
150
0 200 400 800
Quantidade de Proteínas (microgramas)
cpm
PoliU
-450
-400
-350
-300
-250
-200
-150
-100
-50
0
50
100
0 200 400 800
Quantidade de Proteínas (microgramas)
cpm
Resultados
54
Figura 7 – Ligação das Proteínas TcRRM a Homorribopolímeros – Em A,
TcRRM1 e em B, TcRRM2. As proteínas de fusão TCRRM foram
incubadas com poliribonucleotídeos, poliadenina, policitosina, poliguanina
e poliuridina. A reação de ligação proteína-RNA ocorreu utilizando-se entre
0 e 800ng de proteína com 40.000 cpm de cada sonda em Tris-HCl 10mM;
glicerol 5%, KCl 100mM; MgCl2 5mM, BSA 1? g/mL e tRNA 50ng/µL por
10 minutos a 37ºC. Ao final da incubação, a reação era aplicada em
membranas de nitrocelulose mantidas sob pressão negativa,
posteriormente secas e contadas em cintilador.
PoliG
-2000
-1500
-1000
-500
0
500
0 200 400 800
Quantidade de Proteínas (microgramas)
cpm
PoliU
-400
-200
0
200
400
600
800
0 200 400 800
Quantidade de Proteínas (microgramas)
cpm
PoliA
-90
-80
-70
-60
-50
-40
-30
-20
-10
0
10
20
0 200 400 800
Quantidade de Proteínas (microgramas)
cpm
PoliC
-200
-100
0
100
200
300
400
500
600
700
800
0 200 400 800
Quantidade de Proteínas (microgramas)
cpm
B
Resultados
55
TcRRM 1:.GST
S
1
S
2
5S rRNA SP6
S1 – AUU UAU UUU UAU UUA
S2 - AUG GUG UUG GUG UUG
5SrRNA – AAGGGTTGTGGCCGCTTAACTTCACAAATCGGACGGGATGTGGTG
CACTCGGCCAAGTATGGTCGTACCC
SP6 - ATTTAGGTGACACTATAG
Figura 8 – Teste de Ligação das Proteínas TcRRM a Oligorribopolímeros –
A proteína de fusão TcRRM 1 foram incubadas com os
oligoribonucleotídeos: S1, S2, 5S rRNA e SP6. A reação de ligação
proteína-RNA foi aplicada em gel de poliacrilamida não-desnaturante para
separação da sonda livre e do complexo proteína-sonda. O gel foi
transferido para papel, seco e exposto a filme de raio X.
Resultados
56
de reação de ligação e esse resultado não pode ser repetido para a proteína
TcRRM1. No caso da proteína TcRRM2, não observamos em nenhuma condição
ligação a qualquer dos oligoribonucleotídeos testados.
A
CÚMULO DE M
RNA
DE
T
CP
28
NAS
3
D
IFERENTES
F
ORMAS
E
VOLUTIVAS DE
T.
CRUZI
.
O gene Tcp28 foi identificado durante a elaboração da dissertação de
mestrado (Anexo 1 – Figura 2) quando o mesmo foi caracterizado como estando
intercalado no arranjo in tandem composto por cópias dos genes TcRRM. Este
gene codifica uma proteína putativa de 28kDa. Aqui, nós avaliamos se este gene
estava sendo transcrito através do acúmulo de RNAs mensageiros nos três
diferentes tipos celulares do T. cruzi. A sonda específica para o gene Tcp28
(Sonda Me-Tcp28) foi capaz de reconhecer um RNA, em torno de 1,2Kb, nas três
formas (Figura 9). Todavia, comparando-se a intensidade do sinal, vemos que o
acúmulo é maior nas formas tripomastigotas. Este resultado é diferente do
resultado encontrado para TcRRM (Anexo 1 – Figura 4) que tem um maior
acúmulo nas formas amastigotas, sugerindo uma regulação diferencial para os
genes contidos no tandem.
M
APEAMENTO DAS
R
EGIÕES
N
ÃO
T
RADUZIDAS
(3´
E
5´UTR)
DO
G
ENE
T
CP
28
A fim de caracterizarmos o gene Tcp28, com as suas regiões não
traduzidas e seus sítios de processamento, utilizamos as mesmas técnicas já
descritas para os genes TcRRM. Assim, amplificamos, clonamos e seqüenciamos.
Neste caso, utilizamos apenas as formas epimastigotas de T. cruzi e os
oligonucleotídeos iniciadores (Teng NH2 Bam e Tcp28 COOH Bam). Uma única
seqüência e um único sítio foram mapeados nos 10 clones seqüenciados para a
região 3´UTR (Figura 10).
O mesmo também se pode dizer para a porção 5´UTR. A seqüência obtida
apresenta um único sítio de trans splicing (Figuras 11 A-B).
Resultados
57
Figura 9 – Acúmulo de mRNA de Tcp28 nos 3 diferentes tipos celulares de
T. cruzi. RNA total foi separado por eletroforese em gel de agarose-
formamida, transferido para membrana e hibridizado com a sonda Me-
Tcp28. Os pesos moleculares dos RNAs ribossomais estão indicados à
esquerda. Abaixo, as quantidades equivalentes de rRNA nas 3 formas de
T. cruzi, usadas como controle de carregamento no gel.
~ 1,2kb
Me-Tcp28
2,44Kb
2,02Kb
1,59Kb
2,44kb
2,02kb
1,59kb
Spheromastigotes
Trypomastigotes
Epimastigotes
~ 1,2kb
Me-Tcp28
2,44Kb
2,02Kb
1,59Kb
2,44kb
2,02kb
1,59kb
Spheromastigotes
Trypomastigotes
Epimastigotes
Amastigotas
Tripomastigotas
Epimastigotas
Resultados
58
A
B
600pb
c
D
N
A
e
p
i
m
a
s
t
i
g
o
t
a
C
o
n
t
r
o
l
e
n
e
g
a
t
i
v
o
3´UTR
Figura 10 – Determinação da região não traduzida (3´UTRs) do gene Tcp28
– Em A, produto de amplificação da região 3´UTR da forma epimastigota
de T. cruzi pela técnica de 3´RACE; Em B, a sequência obtida. Em
vermelho, o sítio de término da tradução e em azul o único sítio de
poliadenilação mapeado.
ATCGTGGGCCTATCGCGATGTTTCCCGAGCGTTTTGAAGCACACATCGTGGGAAGTGGACGCGAGG
CACTGCATTCTGCTGGTCTCCATTCGAAACTTTTTGTCACTTTTTGTCCGCAAGTTGTGCGGCTGC
CATCCGGGGAGCAGAGACCGTTTGTGATAATTGTGGCTGCTTGCCCTAATTTTCATCAACACTGCC
TCTGATCTGCATTTATTTCGTGCTTTTGCTGCTATCGCCACATCTTTGTTTGATGATACTGTTGCT
TGATTGGTTGGTGAGAGCCGAAAACAAAAAAAAAAA
ATCGTGGGCCTATCGCGATGTTTCCCGAGCGTTTTGAAGCACACATCGTGGGAAGTGGACGCGAGG
CACTGCATTCTGCTGGTCTCCATTCGAAACTTTTTGTCACTTTTTGTCCGCAAGTTGTGCGGCTGC
CATCCGGGGAGCAGAGACCGTTTGTGATAATTGTGGCTGCTTGCCCTAATTTTCATCAACACTGCC
TCTGATCTGCATTTATTTCGTGCTTTTGCTGCTATCGCCACATCTTTGTTTGATGATACTGTTGCT
TGATTGGTTGGTGAGAGCCGAAAACAAAAAAAAAAA
Resultados
59
Figura 11 – Determinação da região não traduzida (5´UTRs) do gene Tcp28
– Em A, produto de amplificação da região 5´UTR da forma epimastigota
de T. cruzi com o uso do oligonucleotídeo iniciador mini-exon; Em B, a
sequência obtida. Em verde a sequência do mini-exon; em vermelho, o
sítio de trans-splicing, em amarelo, o sítio de iniciação e em azul, a
sequência codificante.
A
500pb
450pb
B
c
D
N
A
e
p
i
m
a
s
t
i
g
o
t
a
C
o
n
t
r
o
l
e
n
e
g
a
t
i
v
o
gtactatattgagtatgtataatatatatacatatatatgtatatatatgtgagtgttttgcatt
gtcatctttttattggggctctttgaatttacattgtgacgctgcacacggctgtgatgagcctg
aaaaggcttagcattttctgtggagaagcttctggtgtagagggtttcttggcttttgcaccggt
ttcgactgatcgta
Resultados
60
A
LINHAMENTO DAS
S
EQUÊNCIAS DE
A
MINOÁCIDOS
P
REDITAS
P
ARA AS
P
ROTEÍNAS DE
T
CP
28
DE
T.
CRUZI
,
T.
BRUCEI E
L.
MAJOR
Assim como TcRRM, Tcp28 também pode ser identificada nos genomas de
T. brucei e de L. major. Este gene não havia sido ainda identificado em nenhum
destes organismos, tampouco pudemos encontrar ortólogos em outros organismos
baseados nas seqüências depositadas no GenBank. A figura 12 mostra o
alinhamento entre as seqüências preditas. Pode-se perceber que a proteína de L.
major é maior (135 aminoácidos a mais) e menos conservada que Tcp28 de T.
cruzi. O arranjo gênico também é conservado nestes organismos com este gene
se localizando intercalante ao gene TcRRM precedido pelo gene da fucose
sintase.
M
EIA VIDA DO
RNA
CODIFICANTE DA PROTEÍNA
T
CP
28
Os resultados de northern blot da figura 9 sugeriram que o mRNA de Tcp28
acumulava de forma diferencial ao longo do ciclo de vida do T.cruzi. De maneira a
avaliarmos a estabilidade do RNA mensageiro, realizamos um experimento sob as
mesmas condições já explicadas antes para os mRNAs de TcRRM na figura 4
(Figura 13A). Conforme podemos observar no gráfico (Figura 13B), neste caso
também não foi possível determinar a queda de 50% na intensidade com os
tempos utilizados, indicando que o RNA mensageiro codificante para Tcp28
parece ser bastante estável com uma meia-vida superior a 2 horas.
P
RODUÇÃO DE
A
NTICORPOS
C
ONTRA A
P
ROTEÍNA
R
ECOMBINANTE
T
CP
28
Com o intuito de dar prosseguimento aos estudos de função e localização
desta proteína, clonamos a região codificante com o auxílio dos oligonucloetídeos
inciadores TcHO-NH
2
e Teng-Sal no vetor de expressão pGEX4T1 e produzimos
a proteína recombinante em grande escala, partindo-se de 4L de cultura
bacteriana.
Resultados
61
Tcp28 ---------------------MGLKRLSICCGEASGVEGFLAFAPVSTDRIP-------S 32
Tbp28 ---------------------MLLKKLPVFVGTEFLTDAHLAIMTSGGVSIP-------L 32
Lmp28 MPGASDRGTAYVSCRIHCLPACFSRAVVAVCKLTSPAPGIPPLVSLCRYGLPGYSAQEGE 60
: : . . .: . :*
Tcp28 ELRKRVEALHVNHQMPYVLSRVAASAALSLSLK------------APFLFVGSREEARKY 80
Tbp28 EMESRCKELHPNHRVPYVLSRLAASSALSTVLG------------KPITFSGSRHDAEQY 80
Lmp28 AFSAAASGLHPRHQLPFVLSRVAASKAIASLSPDKRAACPGEEDGPAVVFTDRREAAPTL 120
: . ** .*::*:****:*** *:: .. * . *. *
Tcp28 G-ANLSLSHEDAVGGAVAWCDN-----------------------------------VPF 104
Tbp28 D-ANLSLSHEDFVGAAVAWRKG-----------------------------------TSN 104
Lmp28 HGCCLSIAHEDSAAASVAWSVPSPDSSSFKDYHAAPERLYMEAQLVCSHSTLPDATATSF 180
. **::*** ...:*** ..
Tcp28 VFGIDVVDVKQLARVRRRFPHFAARCMPCCQPSMLD---AVELLKVQTMYDDCIDPS--- 158
Tbp28 AIGIDVVDVQQLERVVKRFPQFAARFMPRCDLSALS---SVDACNIERTFRGHADQV--- 158
Lmp28 AYAIDVVNVAEVHRVRSRFPHFGQRWMPQCTTTASADDVGRALTCVQKQHQECVAAVGAP 240
. .****:* :: ** ***:*. * ** * : . :: .
Tcp28 -------------------------------------DVVLAQHWGLRECCVKLVGILGR 181
Tbp28 -------------------------------------TVTLSQHWGLRECCVKLVGVEGR 181
Lmp28 GGSHGGEGVSACQAACRRDEWWKHLVTPYVTEADAYAAVVLAQHWGVRECAVKLVGIPGR 300
*.*:****:***.*****: **
Tcp28 SFPFDCFRGP-----------------IAMFPERFEAHIVGSGREALHSAGLHSKLFVTF 224
Tbp28 TFPFECFRGP-----------------RAYFPDRFKAQVVEEGSDALRAAGLNSSLFVST 224
Lmp28 SFAYECVRALPPRGGAVVTESTPFTASFLMSHTLYSAEVHGAEAATLAQQRLHPLLYLYT 360
:*.::*.*. :.*.: :* *:. *::
Tcp28 CPQVVQLPSGEQRPFVIIVAACPKLHQHCL 254
Tbp28 WPELLKLPSGDVKPYIVVVAACPRKSAV-- 252
Lmp28 WTEWVPLNSTVDLPYVVVLACAPCRSDAR- 389
.: : * * *:::::*..*
Figura 12 – Alinhamento das seqüências de aminoácidos preditas para a
proteína Tcp28 de T. cruzi, T. brucei e L. major. Os asteriscos indicam
os aminoácidos idênticos; os pontos, diferenças em um único nucleotídeo
e os dois pontos, dois aminoácidos.
Resultados
62
Figura 13 – Verificação da meia vida do RNA codificante da proteína
Tcp28. RNA total foi extraído em diferentes tempos após a adição de
actinomicina D à cultura de formas epimastigotas de T.cruzi e foi separado
por eletroforese em gel de agarose-formamida. Os pesos moleculares
relativos aos RNAs ribossomais estão delimitados à esquerda. O gel foi
transferido por northern blot. A membrana foi hibridizada à sonda Me-
Tcp28 e posteriormente exposta. As bandas obtidas foram analisadas pelo
programa ImageQuant 5.2.
Me-Tcp28
Brometo de Etídeo
2,4Kb
2,02Kb
1,59Kb
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
0 20 40 60 80 100 120 140
Tempo (min)
[R]t/[R]0
10 20 603010 20 6030 120
Tempo (minutos) Tempo (minutos)
120
Intensidade de sinal
Resultados
63
Estas proteínas recombinantes foram então utilizadas para produção de
anticorpos em camundongos.
Os anticorpos produzidos reconheceram a proteína Tcp28, tanto fusionada
à GST quando após a digestão com a enzima trombina que libera a proteína de
fusão. O anticorpo não reconheceu a proteína GST, sugerindo especificidade
(Figura 14A). Os soros obtidos foram então testados com extratos celulares totais
das formas epimastigotas de T. cruzi. O soro imune foi capaz de reconhecer uma
proteína com em torno de 30kDa, não identificada pelo soro pré-imune,
corroborando o tamanho esperado decorrente da seqüência predita de
aminoácidos (Figura 14B).
P
RESENÇA DE
T
CP
28
NOS
3
DIFERENTES FORMAS EVOLUTIVAS DE
T.
CRUZI
O acúmulo diferencial dos RNAs de Tcp28 nas diferentes formas evolutivas
de T. cruzi nos sugere um controle ao longo do desenvolvimento. Assim,
avaliamos a presença da proteína Tcp28 nos 3 diferentes estágios do parasita. A
figura 15 mostra a presença de bandas em torno de 30kDa identificadas não só
em epimastigotas como também em amastigotas e em tripomastigotas. Todavia,
parece haver o reconhecimento de uma banda dupla.
L
OCALIZAÇÃO
C
ELULAR DA
P
ROTEÍNA
T
CP
28
EM
T.
CRUZI
A proteína predita Tcp28 não possui domínio conservado para que
pudéssemos inferir sua função ou localização. Sua expressão foi definida por
detecção por northern blot e por western blot. Como sua localização poderia
informar sobre sua atividade na célula, avaliamos a capacidade dos anticorpos
produzidos localizarem a proteína Tcp28 pela técnica de imunofluorescência. Em
dois ensaios diferentes, observamos um sinal intenso e difuso no citoplasma das
células epimastigotas de T. cruzi (Figura 16).
Resultados
64
Figura 14 – Reação de anticorpos contra a proteína recombinante Tcp28.
Camundongos foram imunizados com a proteína recombinante Tcp28. (A)
soro pré-imune e soro imune incubados com extrato total da formas
epimastigotas; (B) soro incubado com a proteína recombinante de fusão
purificada, com a GST purificada e com a proteína recombinante digerida
com a enzima trombina.
14,3KDa
20,1KDa
30 KDa
45 KDa
66 KDa
97 KDa
Commassie Blue
Anti-Tcp28
66KDa
45 KDa
30KDa
Pré-imune Imune 1:200
T
c
p
2
8
:
.
G
S
T
GST
T
c
p
2
8
T
c
p
2
8
:
.
G
S
T
GST
T
c
p
2
8
20,1KDa
14,3KDa
B
A
Resultados
65
Figura 15 – Verificação da presença de Tcp28 nos 3 diferentes tipos
celulares de T. cruzi. Extrato protéico contendo 10
6
células separado
através de eletroforese em gel de poliacrilamida e transferido para
membrana. A membrana foi incubada com o anticorpo contra Tcp28
recombinante. Os pesos moleculares estão indicados à esquerda.
66KDa
45 KDa
30KDa
Commassie Blue Anti-Tcp28
A
m
a
s
t
i
g
o
t
a
T
r
i
p
o
m
a
s
t
i
g
o
t
a
E
p
i
m
a
s
t
i
g
o
t
a
A
m
a
s
t
i
g
o
t
a
T
r
i
p
o
m
a
s
t
i
g
o
t
a
E
p
i
m
a
s
t
i
g
o
t
a
Resultados
66
Figura 16
–
Determinação da sub-localização celular da proteína Tcp28 por
imunofluorescência em
T.cruzi.
À direita, microscopia de
contraste diferencial interferencial, à esquerda, filtro para fluoresceína
indicando as proteínas TcRRMs; A-B, formas epimastigotas;
A
B
10
µ
m10
µ
m
Figura 16
–
Determinação da sub-localização celular da proteína Tcp28 por
imunofluorescência em
T.cruzi.
À direita, microscopia de
contraste diferencial interferencial, à esquerda, filtro para fluoresceína
indicando as proteínas TcRRMs; A-B, formas epimastigotas;
A
B
10
µ
m10
µ
m10
µ
m10
µ
m
Figura 16 – Determinação da sub-localização celular da proteína Tcp28 por
imunofluorescência em T. cruzi. À esquerda, microscopia de contraste
diferencial interferencial, à direita, filtro para fluoresceína indicando as
proteínas TcRRM. A e B - Formas epimastigotas.
Discussão
67
D
ISCUSSÃO
O controle da expressão gênica em tripanossomatídeos é bastante
complexo. Apesar de as três classes de RNA polimerase já terem sido
identificadas com base na sua resistência à α-amanitina e na identificação dos
respectivos genes, apenas poucos promotores foram caracterizados, sendo a
transcrição de genes que codificam proteínas basicamente policistrônica. A
regulação transcricional já foi descrita, mas apenas para os genes com
promotores característicos da RNA polimerase I, como os genes VSG (Variant
Surface Glycoprotein) (Vanhamme e Pays, 1995). Assim, a regulação pós-
transcricional é essencial, sendo a expressão da maioria dos genes que codificam
proteína controlada durante o processamento e tradução do RNA e não na
iniciação da transcrição. As regiões intergênicas e não-traduzidas são
responsáveis pelo controle da meia vida e estabilidade do mRNA, pois
apresentam seqüências que são reconhecidas por proteínas de ligação a RNA,
como já descrito por diversos autores (Nozaki e Cross, 1995; Di Noia et al., 2000;
Coughlin et al., 2000; Dallagiovanna et al., 2001) Daí a importância da
identificação de novas proteínas de ligação a RNA que possam controlar a
estabilidade e assim, a meia-vida destas moléculas.
Durante a elaboração da dissertação de mestrado, nós identificamos os
genes TcRRM1 e TcRRM2 através da análise das seqüências expressas
disponibilizadas nos bancos de dados pelo Projeto Genoma de T. cruzi, lançado
em 1994. Este projeto tinha como objetivo principal permitir o acesso global às
seqüências do parasita para a identificação de novos genes (The Trypanosoma
cruzi Genome Consortium, 1997) através da análise de seqüências-alvo de
expressão (ESTs - Expressed Sequence Tags) (Verdun et al., 1998). A
identificação dos genes PDZ-5 (Coelho et al., 2003) e TcRABT (Ramos, et al.,
2005) em nosso laboratório e dos genes que codificam para a subunidade F da
Discussão
68
ATP sintase e a protease prenil CAAX identificados em 2000 por Porcel et al.
exemplificam esta abordagem.
A análise das proteínas codificadas pelos genes TcRRM1 e 2 mostrou que
as mesmas são bastante semelhantes entre si apresentando a estrutura modular
comumente encontrada em proteínas de ligação a RNA. Níveis variáveis de
diversidade de seqüência entre membros desta família de genes podem refletir a
divisão atual entre as linhagens I e II de T.cruzi (Cerqueira, et.al., 2008). Cada
uma apresenta dois domínios de ligação a RNA do tipo RRM (RNA recognition
motif). O domínio RRM é comumente visto em proteínas envolvidas em diversos
processos celulares como splicing, tradução e estabilidade dos RNAs (Burd &
Dreyfuss, 1994). De Gaudenzi et.al., descreveram em 2003 uma família de
proteínas RRM em T. cruzi em que cada membro apresentava um domínio RRM
(De Gaudenzi, et.al., 2003). A presença de mais de um domínio RRM já foi
descrita em diversas proteínas, como a PABP que apresenta 4 destes (Burd &
Dreyfuss, 1994). A presença de mais de um domínio pode elevar a afinidade da
proteína pela molécula de RNA ou pode estar envolvida em interações com outras
proteínas (Lunde, et.al., 2007). Além dos módulos RRM, estas proteínas
apresentam um domínio N-terminal rico nos aminoácidos alanina, prolina e lisina
(APK-Rich). Esta região básica pode interagir com regiões ácidas de outras
moléculas.
Os genes TcRRM estão arranjados em um tandem no genoma de T. cruzi
contendo pelo menos oito cópias e a amplificação da região intergênica revelou
um fragmento de 1,3Kb cuja seqüência apresentou uma fase aberta de leitura.
Esta apresentou alta homologia a um EST: TENG 0695. A sua seqüência prediz
uma proteína de aproximadamente 28kDa e o gene intercalante foi então,
nomeado Tcp28. Bem como os genes TcRRM, o gene Tcp28 também parece ser
exclusivo de tripanossomatídeos, sendo encontrado somente nos genomas dos
três parasitos já disponibilizados, T. cruzi, T. brucei e L. major. Além da
conservação da seqüência também parece haver conservação do arranjo gênico.
A alternância de genes com função e padrão de expresões distintos é bastante
comum em tripanossomatídeos (Soares, et.al. 1989; Teixeira, et.al., 1995, Di Noia,
Discussão
69
et.al., 1998, Ávila, et.al., 2001). Foi proposto, inclusive, que todos os genes seriam
transcritos em grandes unidades policistrônicas, como para o cromossomo 1 de L.
major (Myler, et.al., 1999).
As regiões não traduzidas exercem um papel fundamental no controle da
expressão gênica agindo em cis com fatores que podem regular a estabilidade e
tradução de um dado RNA. Elementos em cis já foram identificados em diversos
genes de tripanossomatídeos tanto na região 5´UTR (Teixeira et al., 1999; Pasion
et al., 1996) quanto na região 3´UTR (Wilson et al., 1999; Di Noia et al., 2000 e
D´Orso e Frasch, 2001a). Deriva daí a importância de se mapear os sítios de
processamento e de se delimitar as regiões não traduzidas durante a
caracterização de um determinado gene. Diversos genes que são regulados pós-
transcricionalmente apresentam a região ARE no 3´UTR, por exemplo, os genes
da família de mucinas TcSMUG (D´Orso e Frash, 2001a). Esta região está
implicada na desestabilização dos RNAs mensageiros em eucariotos superiores e
recentemente foi observado que a proteína TcUBP1 é capaz de reconhecer esta
região em T. cruzi, participando, assim, do controle da meia-vida do RNA
mensageiro (D´Orso e Frasch, 2001b). É possível que a expressão dos genes
RRM também seja controlada desta forma. Para TcRRM, pudemos identificar dois
diferentes 3´UTR que foram nomeadas 3´UTR A e 3´UTR B, todavia, não foi
possível a associação entre a presença de uma destas seqüências de UTR e um
determinado estágio celular, tampouco nos foi possível detectar associação entre
a presença dos diferentes sítios de poliadenilação do 3´UTR A e as diferentes
formas do parasito. Para o gene Tcp28, uma única seqüência 3´UTR foi obtida
entre as diferentes formas do parasito.
Devido à presença da inserção ou deleção dos 18 nucleotídeos na porção
5´da região codificante, pudemos distinguir entre os genes TcRRM 1 e 2 ao
analisarmos a sua região 5´UTR. Uma única seqüência foi obtida para cada gene.
Interessantemente, esta seqüência é bastante similar à região 5´UTR dos genes
Tbp34 e Tbp37 de T. brucei, apresentando inclusive uma deleção comum a Tbp34
e a TcRRM1. Uma única seqüência foi obtida para a 5´UTR de Tcp28. Todavia,
Discussão
70
como os ortólogos de T.brucei e L. major não foram caracterizados, não é possível
a comparação.
Comparando as seqüências de aminoácidos de TcRRM1 e 2, a principal
diferença apresentada é a presença ou a ausência de 18 nucleotídeos na porção
5´da região codificante. A procura por seqüências semelhantes em bancos de
dados mostrou que os genes RRM de T. cruzi (TcRRM) são bastante semelhantes
a dois genes já descritos em Trypanosoma brucei: Tbp34 e Tbp37. A semelhança
foi tal que anticorpos gerados contra as proteínas de T. brucei são capazes de
reconhecer proteínas em diferentes clones e cepas de T. cruzi. Um gene
semelhante também foi encontrado no genoma de Leishmania major. TcRRM1
também é semelhante a um antígeno previamente descrito em amastigotas de T.
cruzi, TcAG18, através de rastreamento de uma biblioteca de expressão de cDNA
de amastigotas com soro chagásico humano (Da Rocha, et.al., 2002). O projeto de
L. major sugeria a presença de apenas 1 único gene constrastando com os dois
genes descritos para as duas espécies do gênero Trypanosoma. Neste trabalho,
um experimento de Western blot mostrou a presença de 1 única banda protéica
compatível com o tamanho esperado sugerindo ser este o caso em L. braziliensis.
Ainda assim, o arranjo gênico parece ser mantido, com a presença de um ortólogo
de Tcp28 localizado imediatamente adjacente às ortólogas de TcRRM, tanto em L.
major quanto em T. brucei. Este resultado é compatível com a noção de grandes
agrupamentos de genes policistrônicos nos protozoários tripanossomatídeos (El
Sayed, et.al., 2005b).
Foi demonstrado durante o mestrado que os genes RRM apresentam níveis
de RNA mensageiro detectáveis nos três diferentes estágios do ciclo do T. cruzi,
sendo o teor menor na forma infectante, maior nas formas replicativas, e maior
ainda na forma esferomastigota. Este resultado significa que há regulação da
expressão destas proteínas no nível do RNA mensageiro. No caso de Tcp28, o
mesmo experimento de Northern blot apenas havia sido realizado com extratos
celulares de epimastigotas. No presente trabalho, a análise do acúmulo de
mRNAs nos três diferentes tipos celulares de T. cruzi mostrou que a intensidade
do sinal emitido pela sonda específica é maior nas formas tripomastigotas. Estes
Discussão
71
resultados sugerem que estes genes, arranjados intercalados no mesmo lócus,
são expressos diferentemente em relação um ao outro. Padrões semelhantes de
expressão diferencial de RNA já haviam sido observados em T. cruzi para os
genes amastina/tuzina (Teixeira, et.al., 1995) e podem envolver regulação pós
transcricional.
Ainda nesta linha, um ensaio de Western blot utilizando-se as três
diferentes formas celulares do T.cruzi nos permitiu identificar que a regulação pós
transcricional se mantém no nível protéico. Os anticorpos antip34/p37 foram
capazes de identificar duas proteínas nas formas epimastigotas, além de uma
única proteína na forma amastigota, sugerindo uma provável regulação ao longo
do ciclo de vida do T.cruzi para as proteínas TcRRM.
Para a proteína Tcp28, o anticorpo produzido contra Tcp28 recombinante
foi capaz de identificar proteínas com o tamanho esperado nas três diferentes
formas celulares. Todavia, parece haver o reconhecimento de uma banda dupla
nas formas amastigotas e tripomastigotas. Outros experimentos seriam
necessários a fim de se afirmar se isto se deve a algum tipo de modificação pós-
traducional. Este mesmo anticorpo também reconhece bandas de alto peso
molecular, com um sinal bastante intenso especialmente nos extratos celulares
das formas epimastigotas. É possível que Tcp28 interaja com outras proteínas,
formando complexos protéicos, que não tenham sido rompidos pela técnica
utilizada. Seria interessante verificar a capacidade destas proteínas de interagirem
com outras proteínas. Este resultado não confere com o que seria esperado pelo
resultado do experimento de northern blot, onde o acúmulo de mRNA foi muito
mais intenso nas formas tripomastigotas, uma vez que o sinal detectado pelo
anticorpo no western blot foi muito mais intenso nas formas epimastigotas. A
comparação não seria recomendável entre as raias deste western blot, pois se
utilizou contagem de células (10
7
células/raia) como normatização, e os diferentes
tipos celulares de T. cruzi possuem tamanhos diferentes e conjuntos protéicos
muito diversos como pode ser verificado pela coloração dos extratos com
Commassie blue. Esta dificuldade poderia ser superada com o uso de uma
proteína sabidamente sem variação ao longo do ciclo como padrão ou ainda com
Discussão
72
aplicação nas raias do gel de quantidades protéicas uniformes. Caso esta variação
se mantenha, poderia ser explicada pela presença de controles pós-transcricionais
como, por exemplo, a estocagem de RNAs mensageiros em corpos P
recentemente descrita por Holetz et.al. (2007). Estes corpos poderiam estocar
mRNAs transcritos em uma fase do ciclo para tradução pelos polissomos na fase
seguinte.
A regulação da expressão gênica em tripanossomatídeos é basicamente
pós-transcricional e, neste sentido, com freqüência é utilizada a regulação da
estabilidade do RNA mensageiro. Um ensaio da avaliação da meia-vida do mRNA
dos genes TcRRM mostrou que, mesmo após 120 minutos, a abundância de
mRNA não se reduziu a 50%. O mesmo também foi observado para Tcp28. Para
ambos os casos, seria interessante repetir o experimento utilizando-se tempos
mais longos a fim de se determinar com clareza a meia-vida. RNAs mensageiros
com meia vida superior a duas horas são considerados estáveis em
tripanossomatídeos (Dallagiovana, et.al., 2008).
Uma vez que as proteínas RRM não apresentam sinal de localização
nuclear e apresentam acúmulo diferencial de mRNA e de proteínas ao longo do
ciclo, realizamos experimentos de localização celular. Dados preliminares do
mestrado sugeriram localização citoplasmática para as proteínas RRM. Ao
contrário das ortólogas de T. brucei, que apresentam localização nuclear (Zhang,
et.al., 1998), os experimentos de imunofluorescência ora apresentados indicam
que, em epimastigotas de T. cruzi, as proteínas se localizam no citoplasma, em
uma região ao redor do núcleo, corroborando o dado recente para o antígeno
TcAG48 que mostra esta mesma localização para este antígeno utilizando-se a
proteína fusionada à GFP (Pais et.al, 2008). Esta localização pode coincidir com
uma região rica em retículo endoplasmático e um experimento de
imunocitoquímica com ouro coloidal em conjunto a marcadores específicos de
retículo poderia responder a esta questão. Esta localização poderia sugerir um
papel na síntese protéica e aqui cabe ressaltar que as proteínas ortólogas de T.
brucei, Tbp34 e Tbp37, são capazes de se ligar ao rRNA5S (Pitula et.al., 2002b).
Seria interessante realizar um estudo mais aprofundado de localização com as
Discussão
73
proteínas de T. brucei a fim de se verificar possíveis variações em sua localização,
pois apenas um único ensaio foi realizado (Zhang, et.al., 1998).
A localização das proteínas TcRRM encontrada nas formas epimastigotas
não se mantém nas outras formas celulares. Em amastigotas, a localização,
apesar de citoplasmática, é mais concentrada numa região abaixo da membrana.
Em tripanossomatídeos, na região abaixo da membrana, se localizam os
microtúbulos subpeliculares responsáveis por transporte no interior da célula.
Seria interessante verificar a co-marcação com anticorpos anti-tubulina. Esta
localização pode ter alguma relação com o fato de que apenas uma proteína é
encontrada nas formas amastigotas de acordo com os experimentos de Western
blot.
Em tripomastigotas, a localização variou nas diferentes células de uma
mesma amostra. Algumas células apresentavam um padrão de localização
semelhante ao apresentado pelas formas amastigotas, outras não apresentavam
marcação alguma, este último corroborando os resultados do Western blot, onde
nenhuma proteína era detectada. À primeira vista, poderia se tratar de diferenças
na permeabilidade das células aos anticorpos, mas o mesmo resultado variável foi
encontrado em todas as vezes em que este experimento foi repetido e em que
utilizou-se técnicas de permeabilização. Uma especulação provável é a de que
com a incapacidade de se sincronizar as células do T. cruzi, a amostra dita
tripomastigota poderia conter células em diferentes etapas da fase tripomastigota.
A presença de domínios conservados de ligação a RNA sugere que as
proteínas TcRRM apresentem capacidade de ligação a moléculas de RNA. A
incubação de TcRRM1 com os polirribonucleotídeos, poliadenina (poliA),
policitosina (poliC), poliguanina (poliG) e poliuridina (poliU), mostrou uma
capacidade de ligação crescente conforme a maior quantidade de proteína para
poliA e poliC, diferentemente da ligação de TcRRM2, que ocorreu com poliC.
De acordo com Pitula et.al., (2002b), as proteínas ortólogas de T.brucei,
Tbp34 e Tbp37, são capazes de se ligar ao rRNA5S. Hellman, et.al., (2007a)
nocautearam a expressão destas proteínas com o uso de RNAi e mostraram que
estas proteínas são essenciais para a sobrevivência celular, agindo possivelmente
Discussão
74
na estabilização do rRNA5S e direcionando-o à subunidade 60S. Hellman, et.al.,
(2007b) demonstraram ainda a forte interação com as proteínas NOPP44/46.
Como as proteínas RRM parecem ser exclusivas de tripanossomatídeos, é
possível que elas apresentem a mesma função metabólica em todas as espécies
em que são expressas. Neste sentido, realizamos experimentos de alteração da
mobilidade eletroforética utilizando o rRNA 5S. Todavia, não nos foi possível
determinar tal capacidade de ligação para as proteínas TcRRM de T.cruzi,
tampouco nos foi possível determinar a capacidade de ligação desta proteína a
oligoribonucleotídeos sintéticos. Um controle positivo com uma proteína
sabidamente ligadora a RNA seria bastante útil na validação deste experimento. E
neste sentido, a proteína TcUBP1 foi clonada em vetor plasmidial e produzida de
forma recombinante. Outros experimentos que utilizassem extratos protéicos ao
invés de proteínas recombinantes também seriam úteis em eliminar a
probabilidade de erros nas proteínas recombinantes ou até de modificações pós-
traducionais essenciais.
Contudo, dado a abundância de expressão destas proteínas, também é
possível que ela estejam envolvidas em múltiplos processos e possuam muitas
funções ao longo do ciclo de vida do parasito. E para verificar esta última hipótese,
seria interessante avaliar a interação destas proteínas com chips de microarrays
contendo o pool de RNAs de T.cruzi a fim de determinar os possíveis alvos destas
proteínas.
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82. Teixeira, S.M.R.; Kirchhoff, L.K.; Donelson, J.E. Trypanosoma cruzi:
Supression of Tuzin Gene Expression by its 5´UTR and Spliced Leader
Addition Site. (1999)Exp. Parasitol. 93:143-151;
83. Tessier, LH.; Keller, M.; Chan, R.L.; Fournier, R.; Well, J.H.; Imbault, P.;
Short-Leader Sequences May Be Transferred From Small Rnas To Pre-
Mature Mrnas By Trans-Splicing In Euglena. (1991) EMBO J. 10:2621-2625;
84. The Trypanosoma cruzi Genome Consortium. The Trypanosoma cruzi
Genome Initiative (1997) Parasitol. Today 13(1):16-22;
Bibliografia
84
85. Tyler, K.M.; Engman, D.M. The Life Cycle Of Trypanosoma cruzi Revisited
(2001) Int. J. Parasitol. 31:472-481;
86. Vandenberger, ª E.; Meedel, T. H. Hasting, K. E. mRNA 5´leader trans
splicing in the chordates. (2001) Genes Dev. 15:294:303;
87. Vanhamme,L.; Pays,E. Control Of Gene Expression In Trypanosomes
(1995) Microbiol. Rev. 59(2):223-240;
88. Verdun, R. E.; Di Paolo, N.; Urmenyi, T. P.; Rondinelli, E.; Frasch, A. C.;
Sanchez, D. O.; Gene discovery through expressed sequence Tag
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89. Vickerman, K. Developmental Cycles And Biology Of Pathogenesis
Trypanosomes. (1985) Br. Med. Bull 41(2):105-114;
90. Weber K, Osborn M. The reliability of molecular weight determinations by
dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis. J Biol Chem. (1969)
244(16):4406–4412.
91. Westenberger, S.; Barnabé, C.; Campbell, D.A.; Sturm, N.R. Two
Hibridization Events Define the Population Structure of Trypanosoma cruzi
(2005) Genetics 171: 527-543;
92. Wilson, K.; Uyetake, l.; Boothroyd, J. Trypanosoma brucei: Cis-Acting
Sequences Involved in the Developmental Regulation of PARP Expression.
(1999) Exp. Parasitol. 91:222-230;
93. Xu, P.; Wen, L.; Benegal, G.;Wang, X.;Buck, G.A. Identification Of A Spliced
Leader RNA Binding Protein From Trypanosoma cruzi (2001) Mol.
Biochem.Parasitol 112:39-49
94. Zhang, J.; Williams, N. Purification, Cloning, And Expression Of Two Closely
Related Trypanosoma brucei Nucleic Acid Binding Proteins (1997) Mol.
Biochem. Parasit. 87: 145-158;
95. Zhang, J.; Ruyechan, W.; Williams, N. Developmental Regulation Of Two
Nuclear RNA Binding Proteins, P34 And P37, From Trypanosoma brucei
(1998) Mol. Biochem. Parasitol. 92:79-88
Anexos
85
A
NEXO
1
R
ESULTADOS
A
NTERIORES
O
BTIDOS NO
M
ESTRADO
Anexos
86
A
NEXO
1
A
– (A) Seqüência de nucleotídeos e de aminoácidos de TcRRM1 e TcRRM2. Os
traços indicam deleção e os pontos indicam o mesmo nucleotídeo ou aminoácido. Os sítios
de restrição para BamH1 e SalI estão destacados. Os primers RRM-NH2 e RRM-COOH
estão sublinhados e indicados. A região dos domínios de ligação a RNA estão indicadas
(sublinhados). (B) Esquema mostrando a posição dos diferentes domínios presentes nos
genes TcRRM. As regiões ricas em APK e dos domínios de ligação a RNA estão indicadas.
A caixa preta marca as diferenças na região carboxi-terminal e a seta aponta para a inserção
de 6 aminoácidos na região N- terminal.
Anexos
87
A
NEXO
1
B – Arranjo estrutural do lócus RRM em T. cruzi. (A) Southern blot de DNA
genômico de T. cruzi digerido com diferentes enzimas utilizando TcRRM1 como sonda. A
seta indica o fragmento de 2,1Kb comum às digestões com BamH1 e SalI. Os números à
esquerda dos painéis (A., B e C) indicam os marcadores de peso molecular. (B) Southern
blot de DNA genômico de T. cruzi digerido com concentrações crescentes de SalI
utilizando TcRRM1 como sonda. As setas indicam os fragmentos com tamanhos múltiplos
de 2,1kb. (C) Southern blot de DNA genômico de T. cruzi digerido com concentrações
crescentes de ClaI utilizando ME-Tcp28 como sonda. (D) Mapa físico do lócus TcRRM. I,
esquema indicando o lócus contendo os genes TcRRM (caixa cinza) e Tcp28 (caixa branca).
II, posição das sondas TCRRMI (retângulo cinza) e Me-Tcp28 (retângulo branco). III,
posição dos primers utilizados. IV – posição dos sítios de restrição BamHI, SalI e ClaI.
Anexos
88
Tbp37 MAPKSAAKPAASGKNAPAPKSAPAAKSAPATKASAPKND----PKKNAPKAA------AP 50
Tbp34 MAPKSAAK------------------SAPPAKASAPKND----PKKNAPKAA------AP 32
Lmrbp MPAKAAAKP-----------------VKPAAKA-APKPA----NKAPAPKAA------AA 32
TcRRM1 MPAKSANKP------------ASKPANKPAPK-PAAKPAAKPAAKAPAPKAEKKGAAKAP 47
TcRRM2 MPAKSANKP------------ASKPAAKPAAKAPAPKAEKKGAAKAPAPKAA------AP 42
*..*:* * *..* *.* * **** *.
Tbp37 KP-AATAPKAAAAKEAKARPAAGTHNGVYVKNWGQGSVTDATRIFSAAGKVVSAQIRRRR 109
Tbp34 KP-AATAPKAAAAKEAKARPAAGTHNGVYVKNWGQGSVTDATRIFSAAGKVVSAQIRRRR 91
Lmrbp KP-VAKAAPKAAA--PAARPASGSSNGVYVKNWGTGSVADAANVFSAAGKVVKVQLRRQR 89
TcRRM1 APKAAAAAPKPAVRDAKQRSDAANHNGLYVKNWGQVFCGRRQALFGTAGKVVGVRVRRRR 107
TcRRM2 APKAAAAAPKPAVRDAKQRSDAANHNGLYVKNWGQGSVDDARALFGTAGKVVGVRVRRRR 102
* .* *. .*. . *. :.. **:****** :*.:***** .::**:*
Tbp37 YAIIFFENAAAVRKAIDLFNEKEVLGAKVTVSPAKTSPKPDPHEGSSVVFLSPIFRMSTT 169
Tbp34 YAIIFFENAAAVRKAIDLFNEKEVLGAKVTVSPAKTSPKPDPHEGSSVVFLSPIFRTSTT 151
Lmrbp YAIVFFENSAAVKKAIDLFNEKEVLGKTVLVVPAKTSPKPDAHENSSCVFVSPIFRPSTT 149
TcRRM1 YAIIFFENAAAVKKAIDFLNGKEFMGNVLSVVPAKTTPKPDPHANSSVVFVSPIFRASTT 167
TcRRM2 YAIIFFENAAAVKKAIDLFNGKEFMGNVLSVVPAKTTPKPDPHANSSVVFVSPIFRASTT 162
***:****:***:****::* **.:* : * ****:****.* .** **:***** ***
Tbp37 NGQIRELFTGMRVLRIRTYRQNYAYVYLDSAAAAQKFVKEKNGTEFRGKKLRVALSTRSL 229
Tbp34 NGQIRELFTGMRVLRIRTYRQNYAYVYLDSAAAAQKFVKEKNGTEFRGKKLRVALSTRSL 211
Lmrbp KAQVMELFAGVKVQRLRMYRQNFAYAYLDSPAAAKKFVEEKNGTEFRGHTLRVALSARSL 209
TcRRM1 KKQILELFSGMKVLRLRTYRNNYAYVYLDTPAAAQRAVKEKNGAEFRGKQLRVALSTRSL 227
TcRRM2 KKQILELFSGMKVLRLRTYRNNYAYVYLDTPAAAQRAVKEKNGAEFRGKQLRVALSTRSL 222
: *: ***:*::* *:* **:*:**.***:.***:: *:****:****: ******:***
Tbp37 QKEKDRAERANLLSDAHNFKKDAKKDIKRDDKKDPKKDSRRNEKKDAKRK- 279
Tbp34 QKEKDRAERANLLSDAHNFKKDAKKDIKRDDKKDPKKDSRRNEKKDAKRKQ 262
Lmrbp EKLRARQEAANVVIAAHRHYKTHERQ------------------------- 235
TcRRM1 AKDRARAERARLLMAAQSSTEKEPHEVREECCFNRL--------------- 263
TcRRM2 AKDKARAERADFLMAAQSLTRERTTRSKRGVLF------------------ 255
* : * * * .: *: .
A
NEXO
1 C – Alinhamento das seqüências de aminoácidos de TcRRM de T. cruzi, T.
brucei e L. major. Os asteriscos indicam os aminoácidos idênticos, os pontos indicam
diferenças em um único aminoácido; os dois pontos indicam diferença em dois
aminoácidos.
Anexos
89
A
NEXO
1
D
–
Acúmulo de RNAs mensageiros dos genes RBP nas diferentes formas
celulares de T. cruzi – Northern blot mostrando os níveis de RNA detectados. À esquerda,
gel de agarose-formaldeído 2% com 5µg de RNA total corado com brometo de etídio; à
direita, autoradiografia do filtro hibridizado com a sonda TcRBP1; S – esferomastigotas; M
– tripomastigotas metacíclicos; E – epimastigotas. A seta aponta o RNA reconhecido pela
sonda TcRBP1.
2,44Kb
2,02Kb
1,59Kb
S
p
h
e
r
o
m
a
s
t
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g
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T
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E
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e
2,44Kb
2,02Kb
1,59Kb
S
p
h
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T
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S
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T
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m
a
s
t
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g
o
t
e
E
p
i
m
a
s
t
i
g
o
t
e
Anexos
90
A
NEXO
1
E – Localização subcelular das proteínas RBP nas formas epimastigotas e
tripomastigotas metacíclicas de T.cruzi por imunofluorescência e microscopia confocal – À
esquerda, micrografia de contraste de fase; no centro, micrografia confocal de fluorescência
com o filtro para a fluoresceína indicando RBP; à direita, sobreposição das micrografias de
fluorescência com os filtros para a fluoresceìna (verde) e para o iodeto de propídeo
revelando DNA (vermelho). A seta branca aponta para uma célula tripomastigota; a seta
vermelha para formas epimastigotas.
Antip34/p37
Anexos
91
A
NEXO
1
F – Produção de TcRRM 1 e TcRRM 2 recombinantes em E. coli– Em A,
esquema de clonagem das proteínas recombinantes TcRBP1 e TcRBP2. As setas
laranjas e verdes representam os oligonucleotídeos RBP-Eco e RBP-Not respectivamente.
Em B, expressão das proteínas RBP recombinantes - À esquerda, SDS-PAGE 12%
corado com comassie blue. A seta vermelha indica as proteínas de fusão; a seta azul indica
as proteínas RBP recombinantes isoladas. PM: padrão de peso molecular (200KD,
116,25KD, 97,4KD., 66,2 KD, 45KD, 31KD, 21,5KD, 14,4KD). À direita, imunoblot
revelado com os anticorpos heterólogos anti-Tbp34/Tbp37, produzidos contra as proteínas
de T. brucei.
TcRBP2
TcRBP1
PCR
Clonagem
TcRBP1
TcRBP2
PM
TcRBP1:.GST
TcRBP2:.GST
GST
TcRBP1
TcRBP2
TcRBP1:.GST
TcRBP2:.GST
GST
SDS-PAGE C. blue Imunoblot
A
B
Anexos
92
A
NEXO
2
G
OMES
,
G.G.;
Ü
RMÉNYI
,
T.P.;
R
ONDINELLI
,
E.;
W
ILLIAMS
,
N.;
S
ILVA
,
R.
(2004)
T
C
RRM
S AND
T
CP
28
GENES ARE INTERCALATED AND
DIFFERENTIALLY EXPRESSED IN
T
RYPANOSOMA CRUZI LIFE CYCLE
.
BBRC
322:
985-992
Anexos
93
Anexos
94
Anexos
95
Anexos
96
Anexos
97
Anexos
98
Anexos
99
Anexos
100
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