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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
“JÚLIO DE MESQUITA FILHO”
FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
CÂMPUS DE ARARAQUARA
LUCILA HABIB BOURGUIGNON OLIVEIRA
AVALIAÇÃO DO PERFIL DE EXPRESSÃO GÊNICA DE
CÉLULAS CD34+ E CÉLULAS CD133+ ISOLADAS DE MEDULA
ÓSSEA E DE SANGUE DE CORDÃO UMBILICAL
ARARAQUARA – SP
2008
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LUCILA HABIB BOURGUIGNON OLIVEIRA
AVALIAÇÃO DO PERFIL DE EXPRESSÃO GÊNICA DE
CÉLULAS CD34+ E CÉLULAS CD133+ ISOLADAS DE MEDULA
ÓSSEA E DE SANGUE DE CORDÃO UMBILICAL
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Análises Clínicas da
Faculdade de Ciências Farmacêuticas da
Universidade Estadual Paulista “Júlio de
Mesquita Filho”, para obtenção do título de
Mestre em Análises Clínicas.
Área de concentração: Análises Clínicas
Orientador: Prof. Dr. Dimas Tadeu Covas
ARARAQUARA – SP
2008
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AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO,
POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA FINS DE ESTUDO OU
DE PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.
FICHA CATALOGRÁFICA
Oliveira, Lucila Habib Bourguignon
Avaliação do perfil de expressão gênica de células CD34+ e células
CD133+ isoladas de medula óssea e de sangue de cordão umbilical.
Araraquara, 2008.
p. 111.
Dissertação de Mestrado, apresentada à Faculdade de Ciências
Farmacêuticas/UNESP
Área de concentração: Análises Clínicas.
Orientador: Covas, Dimas Tadeu
1. Células-tronco hematopoéticas. 2. Células CD34+. 3. Células CD133+.
4. Sangue de cordão umbilical. 5 medula óssea. 6 Composição celular.
7. Perfil de expressão gênica. 8. rede de regulação transcricional.
FOLHA DE APROVAÇÃO
Lucila Habib Bourguignon Oliveira
Avaliação do perfil de expressão gênica de células CD34+ e células CD133+ isoladas
de medula óssea e de sangue de cordão umbilical.
Dissertação apresentada a Faculdade de
Ciências Farmacêuticas da Universidade
Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”
para a obtenção do título de Mestre.
Área de concentração: Análises Clínicas.
Aprovado em:
Banca examinadora:
Prof. Dr.
___________________________________________________________________
Instituição:
___________________________________________________________________
Assinatura:
___________________________________________________________________
Prof. Dr.
___________________________________________________________________
Instituição:
___________________________________________________________________
Assinatura:
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Prof. Dr.
___________________________________________________________________
Instituição:
___________________________________________________________________
Assinatura:
___________________________________________________________________
Dedico este trabalho aos meus pais
Ewerton e Maria Inês e à minha avó
Ignês (in memorian), uma
professora excepcional e um
exemplo de mulher.
Agradecimentos
Em primeiro lugar a Deus, pelo dom da vida, pela saúde e
capacidade concedidas a mim e por me cercar de pessoas tão
queridas e fundamentais em minha vida.
Aos meus pais, Ewerton e Maria Inês, pelo amor e apoio
incondicionais que sempre recebi e por serem os grandes
incentivadores das minhas conquistas. Obrigada por
compreenderem minhas dificuldades e me fortalerecerem nos
momentos difíceis. Saibam que cada conquista minha é um triunfo de
vocês.
Aos meus amados irmãos, Larissa e Gil pelo carinho, compreensão e
força.
Aos meus avós, Auxiliadora e Messias por serem pessoas incríveis
que eu amo tanto. Aos meus avós Ignês (in memorian) e José Luis (in
memorian) pelo exemplo de vida, honestidade e altruísmo. Às minhas
tias Lena e Jane e à Neide pelas palavras de carinho e incentivo.
Ao
Prof. Dr. Dimas Tadeu Covas pela orientação, confiança e
oportunidade.
Ao
Prof. Dr. Marco Antonio Zago pela oportunidade de trabalhar
com sua equipe.
Ao CNPQ, pela bolsa concedida e à FAPESP e à FINEP pelo auxílio
financeiro.
Agradeço ao “nosso lab”, o Laboratório de Terapia Celular . Em especial à Maristela
Orellana Delgado, por sua grande ajuda desde o início e durante a execução deste
trabalho, além da amizade, compreensão e disponibilidade. Às “meninas” do
laboratório, Karina Rosa Solano, Sâmia Rigotto Caruso, Thaísa Fernandes e Aline
Garcia pelo companheirismo, incentivo, momentos de discontração e boa convivência
durante esses 2 anos e meio. Á Ane Rose pela paciência e pela ajuda inicial e aos
demais integrantes do laboratório.
Ao Laboratório de Citometria de Fluxo. À Patrícia Vianna Bonini de Palma e Camila
C.B.O. Menezes pela contribuição fundamental neste trabalho.
Ao Laboratório de Biologia Molecular. À Prof. Dra. Simone Kashima Haddad e à
todos do laboratório pela troca de idéias, solicitude e amizade.
Ao Laboratório de Transferência Gênica. À Prof. Dra. Aparecida Maria Fontes e à
todos do laboratório pela amizade e contribuições durante o desenvolvimento do
projeto.
Ao laboratório de Hematologia do HCFMRP-USP pela oportunidade e por me
acolherem nos últimos meses do trabalho.
À Dalila Zanette, Rita de Cassia Viu Carrara, Viviane C Oliveira e Amélia Goes
Araujo, pelas participações fundamentais no trabalho e ao Dr. Vergílio Colturato do
Hospital Amaral Carvalho (Jaú) pela colaboração.
Aos funcionários da Fundação Hemocentro que sempre tiveram dispostos a me
ajudar, seja por ações ou mesmo um simples sorriso... Especialmente ao Miro,
Bernadete, Dalvinha, Sandra Navarro, Cíntia Santos, Rodrigo Gomes e Marco Antônio
Martins.
Aos voluntários que cederam as amostras de medula óssea e sangue de cordão
umbilical. Sem vocês nada disso seria possível...
Em especial aos amigos...
Ana Valéria Gouveia de Andrade e Mariana Carolina Sobral por cada dia que vivemos,
que rimos, que sofremos e que aprendemos juntas. Agradeço por toda a força e carinho
que sempre me deram, me ajudando a superar obstáculos e a prosseguir em frente na
luta. Obrigada de coração meninas!!
Rodrigo Alexandre Panepucci por ter contribuído substancialmente neste estudo, desde
a doação das amostras até as discussões, trocas de idéias e incentivo. Por ter
participado ativamente na minha evolução e com quem compartilho os méritos
concedidos por esse trabalho. Pela compreensão, carinho, e, principalmente por ter
acreditado em mim! Obrigada pela parceria e, acima de tudo, pela amizade. Valeu
Querido!!!
Bruno Marcos Verbeno pela amizade fiel, pelo esforço em conjunto e por nossos
“rabiscos” em papel, sempre grande fonte de inspiração.Obrigada, Bruninho, por
tudo!!
Paula Barbugli, Aline Ferreira, Fernanda Trigo, Alessandra de Paula Sousa e Luís
Garcia, o “teacher”, pela amizade, companheirismo, carinho, conselhos, e, claro, pelas
muitas risadas proporcionadas!!
Mara Nogueira Martins, Karina Magalhães e a todas as “Marias” que eu guardo
sempre no meu coração por todo o carinho e amizades sinceras.
Aos meus anjinhos da guarda Lívia Paschoal e Átila Soares, por cada palavra de
carinho e incentivo. À Neuza Fiori por todas as conversas imprescindíveis para a
conclusão desta etapa.
Agradeço finalmente á Cláudia, Laura e Sônia da Seção de Pós-Graduação pela
paciência, ajuda e solicitude. E também a todos os amigos e familiares que mesmo
longe torceram por mim!!!
“O segredo não é correr atrás das borboletas.
É cuidar do jardim para que elas venham até você.”
Mário Quintana
Resumo
A maior expressão de alvos transcricionais e componentes da via NFkB é uma
característica distintiva das células-tronco hematopoéticas (CTH) CD34+ de
sangue de cordão umbilical (SCU) comparadas às CTH CD34+ de medula
óssea (MO) e pode estar relacionada com o estado mais primitivo das CTH dos
neonatos. No entanto, as células CD34+ são um grupo heterogêneo de células-
tronco (CT) e progenitoras em diferentes estágios de maturação e diferenças
na composição celular entre MO e SCU poderiam contribuir para os resultados
mencionados. Estudos recentes têm identificado o marcador de superfície
CD133, como um marcador de CT mais primitivas, expresso em uma
subpopulação de células CD34
bright
, com um sugestivo potencial de
hemangioblasto. Com o objetivo de caracterizar a composição celular de MO e
SCU e identificar mecanismos moleculares envolvidos com a maior
primitividade das células CD133+, propusemos avaliar o perfis imunofenotípico
(quanto à expressão de CD34 e CD133) por citometria de fluxo e de expressão
gênica de células CD34+ e células CD133+ selecionadas
imunomagneticamente, de ambas as fontes, pelas técnicas de microarray e
PCR em tempo real. Nossos resultados revelaram que enquanto a maioria das
células CD133+ são CD34+, independente da fonte, as células CD34+ de SCU
possuem uma porcentagem significativamente maior de células CD133+ do
que às células CD34+ de MO. A análise de clusterização revelou que as
células CD133+ de MO se agrupam com as células de SCU (CD34+ e
CD133+), enquanto as CD34+ de MO aparecem como um grupo distinto. A
comparação dos perfis de expressão gênica entre as células CD133+ e as
células CD34+, revelou a hiper-expressão de 47 fatores de transcrição (FT) nas
células CD133+, dentre eles, diversos relacionados à regulação da
hematopoese embrionária e à auto-renovação nas CTH, como RUNX1,
GATA3, USF1, TAL1, HOXA9 e HOXB4. A análise de promotores destes FT
revelou uma frequência de sítios de ligação significativamente maior que o
esperado, para fatores da via NFB, incluindo como potenciais alvos RUNX1,
GATA3 e USF1. A avaliação dos FT selecionados bem como de NFB2, RELB
e NOTCH1 por PCR em tempo real revelou que, enquanto a maioria dos
transcritos apresentaram níveis de expressão significativamente maior nas
células CD133+ de MO, comparados com as células CD34+ de MO, somente
USF1, HOXB4 e HOXA9 seguiram o mesmo padrão nas células de SCU. Por
sua vez, as células de SCU apresentaram níveis mais elevados de NOTCH1,
RELB, RUNX1, TAL1 e HOXB4 comparadas às células de MO para ambas as
células, CD34+ e CD133+, indicando que, mesmo a subpopulação de CTH
mais primitivas CD133+, apresentam diferenças moleculares intrínsecas
relacionadas à fonte de origem. Finalmente, a correlação positiva significante
entre todos os FT avaliados evidenciou uma potencial co-regulação entre os
mesmos nas CTH. Em suma nossos resultados sugerem a existência de uma
rede de regulação transcricional altamente interconectada, caracterizada pela
expressão coordenada de NOTCH, NFB e outros importantes FT que poderia
ser parcialmente responsável pela manutenção de um estado mais primitivo
das CTH.
Palavras-chave: Células-tronco hematopoéticas, células CD34+, células
CD133+, sangue de cordão umbilical, medula óssea, composição celular, perfil
de expressão gênica, rede de regulação transcricional.
Abstract
A higher expression of transcription targets and components of the NF-kB
pathway is a distinctive feature of umbilical cord blood (UCB) CD34+
hematopoietic stem cells (HSC) when compared to bone marrow (BM) CD34+
HSC and this could be related to the more primitive state of the newborn’s HSC.
However, CD34+ cells represent a heterogeneous group of cells composed by
stem and progenitors cells in different developmental stages, and differences in
cellular composition between both sources could contribute for these finding.
The surface marker CD133 has been identified as a very primitive marker,
expressed in a subpopulation of CD34
bright
, with a proposal hemangioblast
potential. Thus, in attempt to better characterize the cellular composition of UCB
and BM and to identify molecular mechanisms related to the more primitive
characteristics of CD133+ cells, we proposed to evaluate the
immunophenotypic profile (expression of CD34 and CD133) by flow-cytometry
and the gene expression profiles of immunomagnetically selected CD34+ and
CD133+ cells, from both sources, by microarray and Real time PCR. Our results
highlighted that, while almost all CD133+ cells are CD34+ independently of the
evaluated source, the UCB CD34+ cells showed a significantly higher
proportion of CD133 expression, compared to BM CD34+ cells. After obtaining
the expression profiles from distinct HSC pooled samples generated by
microarrays, cluster analysis showed that BM CD133+ cells preferentially
grouped with UCB cells (CD34+ and CD133+) instead of BM CD34+ cells,
which appeared as a very distinct profile The comparison between CD133+ and
CD34+ samples revealed the over-expression of 47 transcriptional factors (TF)
in CD133+ cells, many of them well-known and related to the regulation of
embryonic hematopoiesis and self-renewal of HSC such as RUNX1, GATA3,
USF1, TAL1, HOXA9 and HOXB4. Promoter analysis of selected TF revealed a
significantly higher frequency of NF-kB binding sites on these genes, than
expected by chance, and included potentially novel NF-kB targets such as
RUNX1, GATA3 and USF1. The evaluation of transcriptional levels of selected
TF, as well as NFB2, RELB and NOTCH1 by Real Time PCR, revealed that,
while almost transcripts showed a significantly higher levels on BM CD133+
cells compared to BM CD34+ cells, only USF1, HOXB4 and HOXA9 showed
the same pattern in the comparison between UCB cells. Nevertheless, the UCB
cells revealed a significantly higher expression of NOTCH1, RELB, RUNX1
TAL1 and HOXB4 when compared to BM (for both cell populations, CD133+
and CD34+), which indicates that, even the more primitive CD133+
subpopulation cells display intrinsic molecular differences related to the source.
Finally, significant positive correlation analysis between all the transcripts
evaluated suggest a potential co-regulation of these TF in HSC. Taken together,
our results corroborate the existence of a highly interconnected transcriptional
network characterized by the coordinated expression of NOTCH, NF-kB and
other important TF, that could be, in part, responsible for the maintenance of the
more primitive state of HSC cells.
Keywords: Hematopoietic stem cells, CD34+ cells, CD133+ cells, umbilical
cord blood, bone marrow, cellular composition, gene expression profile,
transcription network.
Lista de Ilustrações
Página
Figura 1: Estratégia adotada para a determinação da expressão dos
marcadores CD133 e CD34 em citometria de fluxo..........................................40
Figura 2: Desenho experimental utilizado no estudo .......................................43
Figura 3: Abordagem experimental da técnica de microarray..........................45
Figura 4: Avaliação da pureza e porcentagem de células CD34+ nas células
CD133+ selecionadas.......................................................................................53
Figura 5: Porcentagem de células CD133+ nas células CD34+ presente na
fração mononuclear ..........................................................................................54
Figura 6: Enriquecimento da subpopulação celular CD34+CD133+ após a
seleção imunomagnética de células CD34+ .....................................................55
Figura 7: Agrupamento obtido após análise de clusterização hierárquica .......61
Figura 8: Fatores de transcrição hiper-expressos nas células CD133+
comparadas às células CD34+ .........................................................................64
Figura 9: Sítios de ligação para NFB e os potenciais alvos transcricionais
encontrados hiper-expressos nas células CD133+...........................................66
Figura 10: Validação das diferenças encontradas nas análises de microarrays
por PCR em tempo real ....................................................................................67
Figura 11: Níveis de expressão gênica avaliados por PCR em tempo real .....68
Figura 12: Análise de correlação entre os transcritos NOTCH1, RUNX1,
GATA3 e HOXA9 ..............................................................................................70
Página
Figura 13: Análise de correlação entre os transcritos NOTCH1, GATA3,
RELB ..........................................................................................................71
Figura 14: Análise de correlação entre os transcritos HOXB4 e HOXA9 e entre
os transcritos NFB2 e RELB...........................................................................71
Figura 15: Rede de regulação gênica interconectando diferentes fatores de
transcrição relacionados à primitividade das CTH ............................................90
Lista de Tabelas
Página
Tabela 1: Amostras utilizadas para confecção dos pools de células CD133+ de
sangue de cordão umbilical ..............................................................................56
Tabela 2: Amostras utilizadas para confecção das dos pools de células
CD133+ de medula óssea.................................................................................57
Tabela 3: Amostras utilizadas para confecção dos pools de células CD34+ de
sangue de cordão umbilical ..............................................................................58
Tabela 4: Amostras de células CD133+ utilizadas para os estudos de
expressão gênica por PCR em Tempo Real.....................................................59
Tabela 5: Coeficientes de correlação entre os transcritos avaliados................69
Lista de Abreviaturas e Siglas
µg = micrograma
µL = microlitro
µm =micrometro
ACD = do inglês “Acid Citrate Dextrose”
Am = Amostras
Anti-CD133 = referente ao anticorpo contra o antígeno CD133
Anti-CD34 = referente ao anticorpo contra o antígeno CD34
Arrays = referente aos microarranjos, do inglês “microarrays”
BM= do inglês “Bone Marrow”
BS = do inglês “Binding Sites”
CD = do inglês “Cluster of Differentiation”
CD133+ = referente às células que expressam o marcador CD133
CD34+ = referente às células que expressam o marcador CD34
CD38-= referente às células com ausência do marcador CD38
cDNA = do inglês “Complementary Desoxiribonucleic Acid”
CMN = Células Mononucleares
CPD = do inglês “Citrate Phosphate Dextrose”
CPE = Células Progenitoras Endoteliais
cRNA = do inglês “Complementary Ribonucleic Acid
CTH = Células-Tronco Hematopoéticas
CTM = Células-Tronco Mesenquimais
Cy5 = do inglês “Cyanin 5
DECH = Doença do Enxerto Contra o Hospedeiro”
DEPC = Dietilpirocarbonato
DNA = do inglês “Desoxiribonucleic Acid”
dNTP = Desoxi-Nucleotídeo Trifosfato
EB = do inglês “Embryoid Bodies”
FACS = do inglês "Fluorescence-Activated Cell Sorter”
FDR = do inglês “False Discovery Rate”
FITC = do inglês “Fluorescein Isothiocyanate”
FSC = do inglês “Forward Scatter”
FT = Fator de Transcrição
GVHD = do ingles “Graft Versus Host Disease”
HCRP = Hospital das Clínicas de Ribeirão Preto
HLA = do ingles “Human Leukocyte Antigen”
IgG1 = Imunoglobulina Gama Isotipo 1
IgG2A = Imunoglobulina Gama Isotipo 2A
kD = kilodalton
KDR = do inglês “kinase insert domain receptor”
Log = logaritmo
LTC-IC = do inglês “Long-Term Culture-Initiating Cells”
mL=mililitro
MO = medula óssea
NFκB = do inglês “Nuclear Factor kappa B”
ng = nanograma
nm = nanometro
NOD/SCID= do inglês“Nonobese Diabetic/Severe Combined
Immunodeficient”
pb = pares de base
PBS = do inglês “Phosphate Buffered Saline”
PCR = do inglês "Polymerase Chain Reaction"
PE = do inglês “Phycoeritrin”
Pop= População
R1 = Região 1 (representa a população celular delimitada)
RNA = do inglês “Ribonucleic Acid”
rpm = rotações por minuto
SAM = do inglês “Significance Analysis of Microarrays”
SCU = Sangue de Cordão Umbilical
SSC= do inglês “Side Scatter”
TA = Temperatura Ambiente
TELIS = do inglês “Transcription Element Listening System”
TMO = Transplante de Medula Óssea
UCB= do inglês “Umbilical Cord Blood”
USP = Universidade de São Paulo
UTP = do inglês “uridine-5'-triphosphate”
VEGFR2 = do inglês “Vascular Endothelial Grow Factor”
Nota sobre a nomenclatura de genes
Devido à sua natureza, o presente trabalho inclui grande número de
nomes de genes, cujos nomes serão mantidos em inglês, seguindo a
nomenclatura do HUGO (Human Genome Organization), como por exemplo
NFB2 (nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cells 2),
RUNX1 (runt-related transcription factor 1) e USF1 (upstream transcription
factor 1).
Sumário
Página
1.Introdução.................................................................................................... 22
1.1 Células-tronco hematopoéticas – CTH e hematopoese fetal e adulta.... 23
1.2 Caracterização das CTH ........................................................................ 24
1.3 O uso das CTH em transplantes ............................................................ 25
1.4 O sangue de cordão umbilical como fonte alternativa ............................ 26
1.5 Diferenças na expressão gênica entre células CD34+ de SCU e MO.... 27
1.6 As células CD133+................................................................................. 29
1.7 Delineamento do estudo......................................................................... 30
2. Objetivos..................................................................................................... 32
2.1 Objetivo geral ......................................................................................... 33
2.2 Objetivos específicos.............................................................................. 33
3. Material e Métodos..................................................................................... 34
3.1 Aspectos éticos ...................................................................................... 35
3.2 Coleta de sangue de cordão umbilical.................................................... 35
3.3 Coleta da medula óssea......................................................................... 35
3.4 Isolamento das células mononucleares.................................................. 36
3.5 Seleção imunomagnética de células CD133+ e
células CD34+ ............. 37
3.6 Citometria de fluxo.................................................................................. 38
3.7 Extração do RNA.................................................................................... 40
3.8 Quantificação e análise da qualidade do RNA ....................................... 41
3.9 Microarrays de oligonucleotídeos ........................................................... 42
3.9.1 Formação dos pools de RNA ........................................................... 42
3.9.2 A técnica de microarray ................................................................... 44
3.9.3 Obtenção e análise das imagens..................................................... 46
3.10 Análises Bioinformáticas....................................................................... 47
3.10.1 Clusterização hierárquica............................................................... 47
3.10.2 Seleção de genes diferencialmente expressos.............................. 47
3.10.3 Análise de Promotores................................................................... 48
3.11 PCR em tempo real .............................................................................. 49
4. Resultados.................................................................................................. 52
4.1 Caracterização por citometria de fluxo ................................................... 53
4.1.1 Pureza e co-expressão de CD34 nas células CD133+ .................... 53
4.1.2 Co-expressão de CD133 nas células CD34+................................... 54
4.2 Seleção das amostras para os experimentos de microarrays ................ 56
4.2.1 Células CD133+ de sangue de cordão umbilical................................. 56
4.2.2 Células CD133+ de medula óssea................................................... 57
4.2.3 Células CD34+ de sangue de cordão umbilical ............................... 58
4.2.4 Células CD34+ de medula óssea..................................................... 58
4.3 Amostras utilizadas no PCR em tempo real ........................................... 59
4.3.1 Amostras CD133+ de SCU .............................................................. 60
4.3.2 Amostras CD133+ de MO................................................................ 60
4.3.3 Amostras CD34+ de MO e SCU ...................................................... 60
4.4 Perfis de expressão gênica .................................................................... 61
4.4.1 Análise de Clusterização ..................................................................... 61
4.4.2 Genes diferencialmente expressos entre as células CD34+ e as
células CD133+ e seleção dos fatores de transcrição .............................. 62
4.5 Análise de promotores............................................................................ 65
4.6 PCR em tempo real ................................................................................ 67
4.6.1 Análise de Correlação entre os transcritos.......................................... 69
5. Discussão ................................................................................................... 72
5.1 Diferenças na composição celular entre as CTH de MO e SCU ............ 73
5.2 Similaridade entre as células CD133+ de MO e as células de SCU....... 74
5.3 Enriquecimento de CD133 nas células CD34+ após seleção
imunomagnética ........................................................................................... 75
5.4 Fatores de transcrição hiper-expressos nas células CD133+ ................ 76
5.4.1 TAL1 ................................................................................................ 77
5.4.2 RUNX1............................................................................................. 78
5.4.3 Genes HOX...................................................................................... 79
5.4.4 USF1................................................................................................ 83
5.4.5 GATA-3............................................................................................ 83
5.5 Análise de promotores e a participação da via NFκB ............................. 84
5.6 Avaliação dos transcritos por PCR em tempo real e análise de
correlação................................................................................................85
5.7 Evidências de uma potencial rede de regualação transcricional nas
CTH .........................................................................................................89
6. Conclusões................................................................................................. 91
Referências..................................................................................................... 94
Apêndices..................................................................................................... 108
APÊNDICE A: Fatores de transcrição hiper-expressos nas células CD133+
quando comparadas às células CD34+...................................................... 109
APÊNDICE B: P valores obtidos da análise estatística entre os diferentes
grupos. ....................................................................................................... 111
1. Introdução
Introdução
23
Nos últimos anos, as células-tronco têm recebido grande destaque devido à
sua potencial utilização terapêutica em diversas doenças. Enquanto a maioria
dessas aplicações ainda se encontram em um campo experimental, alguns
procedimentos já estão incorporados na clínica médica e utilizados com
sucesso na terapêutica, como por exemplo, o transplante de células-tronco
hematopoéticas (CTH), mais conhecido como transplante de medula óssea.
1.1 Células-tronco hematopoéticas – CTH e hematopoese fetal
e adulta
As células-tronco hematopoéticas (CTH) são um grupo de células
sanguíneas imaturas capazes de se diferenciar em todos os tipos celulares
encontrados no sangue periférico como os granulócitos, linfócitos e eritrócitos.
Como propriedades fundamentais das células-tronco, as CTH possuem a
capacidade de diferenciação, ou seja, são capazes de se diferenciar em
progenitores que dão origem a células especializadas ,bem como a capacidade
de sofrer auto-renovação, dando origem a células idênticas, permitindo a
manutenção do pool de células indiferenciadas no compartimento
hematopoético (MAYANI & LANSDORP, 1998).
A hematopoese constitui o processo de produção contínua de elementos
figurados no sangue e tem início precoce no embrião, podendo ser classificada
como primitiva ou definitiva. A hematopoese primitiva é caracterizada pelo
surgimento das primeiras células sanguíneas, cerca do 20
o
dia após a
fertilização, localizada no saco vitelínico (extra-embrionário) e a hematopoese
definitiva tem início pouco depois, em uma região chamada aorta gônado-
Introdução
24
mesonefros (AGM) (DZIERZAK, 1999). Enquanto a primeira é transitória,
gerando apenas células da linhagem eritróide, a segunda é capaz de originar
todas os tipos celulares sanguíneos encontrados no indivíduo adulto (PALIS &
YODER, 2001).
Durante o desenvolvimento embrionário, as CTH definitivas são
encontradas predominantemente em órgãos como o fígado e o baço. Ao se
aproximar a época do nascimento, essas células migram pela corrente
sanguínea, desses órgãos primários, para a medula óssea (MO) onde se fixará
a hematopoese definitiva no adulto. Na MO, as CTH encontram um micro-
ambiente capaz de sustentar a constante renovação do tecido sanguíneo,
através da interação com as células-tronco mesenquimais (CTM). Estas células
têm o potencial de se diferenciarem em adipócitos, condrócitos, osteócitos e
células estromais formando a micro-arquitetura da MO e fornecem sinais às
CTH, por meio de fatores secretados, que auxiliam hematopoese (DEANS &
MOSELEY, 2000; GRONTHOS et al., 1994; PITTENGER et al., 1999).
Também durante o desenvolvimento, as CTH migram para órgãos linfóides
como o timo onde se inicia a produção de linfócitos T (SPITS, 2002).
1.2 Caracterização das CTH
Do ponto de vista morfológico, as CTH não podem ser diretamente
identificadas. No entanto, é possível caracterizá-las através da presença de
determinados marcadores (ou antígenos) na superfície celular, bem como pela
ausência de expressão de outros marcadores. A ligação desses antígenos com
Introdução
25
anticorpos conjugados a moléculas de fluorocromos, e posterior análise em
citometria de fluxo permite, assim, a caracterização dessas células.
A ausência de marcadores específicos dificulta a identificação da
“verdadeira” CTH, embora saiba-se que elas fazem parte das células
mononucleares (CMN) do tecido hematopoético (medula óssea), e estão
enriquecidas em uma sub-população de células caracterizadas
imunofenotipicamente como células CD34+ (CIVIN et al., 1984; SUTHERLAND
& KEATING, 1992).
O antígeno CD34 é uma glicoproteína integral de membrana com 385
aminoácidos e cerca de 116 kD. O domínio N-terminal extracelular possui os
epítopos que interagem com os anticorpos utilizados na identificação e/ou
purificação das células CD34+. Acredita-se que esta proteína tenha a função
de adesão celular, controlando a localização destas células por interações com
proteínas de membrana de outras células (HEALY et al., 1995; SUTHERLAND
et al., 1992). Diversos estudos clínicos utilizando as células CD34+, revelaram
a importância desse antígeno que foi, durante muito tempo, o principal
marcador utilizado na definição dos progenitores hematopoéticos (KRAUSE et
al., 1996). De fato, as CTH CD34+ possuem uma capacidade 100 vezes maior
de reconstituir a hematopoese em camundongos NOD/SCID do que células
CD34-, em transplantes intravenosos (GAO et al., 2001).
1.3 O uso das CTH em transplantes
A utilização das CTH em transplantes para fins terapêuticos existe a
mais de 40 anos. Os primeiros transplantes foram realizados com CTH de MO
Introdução
26
visando a reconstituição do sistema hematopoético de indivíduos submetidos a
regimes de quimioterapia no tratamento de doenças neoplásicas,
hematológicas ou não (THOMAS et al., 1957; THOMAS et al., 1959). Desde
então as células de MO vêm sendo utilizadas no tratamento de diversas
doenças e sem dúvida é hoje uma importante fonte para obtenção de CTH. No
entanto, o sucesso dos transplantes com células de MO depende, entre outros
fatores, da compatibilidade entre doador e receptor e, muitas vezes, a demora
em encontrar um doador compatível, quando possível, torna-se um processo
de grande sofrimento, levando à busca de outras fontes de CTH para os
transplantes.
1.4 O sangue de cordão umbilical como fonte alternativa
Recentemente, o sangue de cordão umbilical (SCU) passou a ser
considerado uma fonte alternativa válida, tanto para adultos como para
crianças (ROCHA et al., 2004). O primeiro transplante de células
hematopoéticas de SCU foi realizado em 1989 para a reconstituição do sistema
hematopoético de uma criança com anemia de Fanconi (GLUCKMAN et al.,
1989). Desde então, o SCU tem sido alvo de importantes estudos,
apresentando algumas vantagens em relação à MO como, por exemplo, a fácil
coleta (procedimento não invasivo e indolor ao doador) e a possibilidade da
criação de bancos de sangue de cordão umbilical e placentário, aumentando as
chances de se encontrar material HLA-compatível quando surge o paciente que
necessita do transplante (WAGNER et al., 1992).
No entanto, os resultados pós transplante com células do SCU diferem
daqueles realizados com células de MO, com uma menor incidência da doença
Introdução
27
do enxerto contra o hospedeiro (DECH ou GVHD-graft versus host disease)
mas com uma demora no enxertamento e restabelecimento de células do
sistema imune, mais especificamente de neutrófilos, nos pacientes
transplantados com as células do SCU (ROCHA et al., 2004). Também os
transplantes realizados com as CTH dos neonatos proporcionam uma melhor
reconstituição dos progenitores hematopoéticos mais primitivos e
comprometidos em comparação com os realizados com CTH de MO, indicando
que CTH de SCU privilegiariam a auto-renovação às custas de diferenciação e
maturação (FRASSONI et al., 2003).
1.5 Diferenças na expressão gênica entre células CD34+ de
SCU e MO
Com o intuito de esclarecer as bases moleculares das diferenças funcionais
entre as CTH de MO e de SCU, foi realizado um amplo estudo em nossos
laboratórios, no qual foram analisados em uma escala global, os genes
diferencialmente expressos entre as células CD34+ de MO e SCU. Os
resultados obtidos permitiram destacar uma acentuada sinalização constitutiva
da via nuclear factor kappa B (NF-kB), com uma maior expressão de
componentes centrais e alvos transcricionais, como uma característica
distintiva das células CD34+ de SCU quando comparadas às células CD34+ da
MO (PANEPUCCI et al., 2007).
Conhecida por desempenhar papéis importantes na biologia das células do
sistema imune (BEINKE & LEY, 2004) e na sobrevivência das CTH (PYATT et
al., 1999), a sinalização de NFB atua por duas vias: a clássica ou canônica
Introdução
28
(mediada pelas subunidades proteicas RELA e NFB1), e a não-canônica ou
constitutiva (mediada por RELB e NFB2). Enquanto a ultima é responsável
pela ativação continuada de NF-kB, a primeira pode influenciar a duração e
amplitude desta ativação (BEINKE et al., 2004).
Além dos componentes centrais da via NFB no conjunto de genes hiper-
expressos nas células CD34+ de SCU, também foram encontrados ativadores
dessa via como, por exemplo o NOTCH1, que apresenta um papel central no
controle da timopoese, favorecendo a diferenciação de progenitores linfóides
em células T (DE SMEDT et al., 2002). Adicionalmente, a ativação da via Notch
está relacionada com o aumento da capacidade de auto-renovação das CTH
em ensaios de repopulação in vivo por longos períodos após transplante
(STIER et al., 2002).
O aumento na expressão de NFB1 em populações de CTH mais primitivas
já havia sido observado por Shojaei e col, em linha com os resultados relatados
por Panepucci e col. que destacou, ainda, a possível relação da via constitutiva
(não canônica) NF-kB, mediada por altos níveis de NFB2 e RELB, com o
estado mais primitivo das CTH CD34+ encontradas no SCU (PANEPUCCI et
al., 2007; SHOJAEI et al., 2004).
No entanto, as células caracterizadas pelo marcador CD34, constituem um
grupo heterogêneo de células-tronco e progenitoras em diferentes estágios de
maturação (BURT, 1999; MAYANI & LANSDORP, 1998). Diferenças na
composição das subpopulações de células CD34+ de MO e SCU, com uma
maior proporção de células mais primitivas no SCU poderiam, assim, explicar
parte dos resultados encontrados.
Introdução
29
1.6 As células CD133+
Com o objetivo de identificar células progenitoras mais primitivas, muitos
grupos definiram subpopulações de células CD34+ com base na expressão de
outros antígenos de superfície. Assim, subpopulações mais primitivas de CTH
foram posteriormente definidas pela ausência (ou baixa expressão) de
marcadores como CD38 (TERSTAPPEN et al., 1991) ou pela presença de
marcadores como KDR (ZIEGLER et al., 1999) ou CD133 (YIN et al., 1997).
Embora ainda de função desconhecida, a molécula CD133 (também
conhecida como AC133) é uma glicoproteína transmembrana de 865
aminoácidos, encontrada em uma subpopulação das células CD34
bright
(com
alta expressão de CD34) de fígado fetal, medula óssea, sangue de cordão
umbilical e sangue periférico mobilizado (YIN et al., 1997; SHMELKOV et al.,
2005). Caracterizadas como uma sub-população de células-tronco mais
primitivas, as células CD34+CD133+ demonstram ter maior capacidade de
gerar progenitores em cultura de células por longo período (LTC-IC, long-term
culture-initiating cells) do que as células CD34+CD133-. Também possuem
capacidade de recuperação da hematopoese em camundongos NOD/SCID
letalmente irradiados, após transplante intra-venoso (DE WYNTER et al.,
1998). Adicionalmente, o potencial de repopulação das células CD34+CD133+
por longos períodos foi demonstrado em modelos de transplante de medula em
fetos de ovelhas (YIN et al., 1997). Em ambos os estudos, não foi demonstrado
a presença de células CD133+ que não expressasse o marcador CD34,
embora células CD133+CD34- que, apesar de raras, são capazes de se
diferenciar em células CD133+CD34+ (BHATIA, 2001).
Introdução
30
Além da identificação de CTH, a molécula CD133 é utilizada como
marcador de células progenitoras endoteliais (CPE). Presente na superfície de
progenitores endoteliais VEGFR2+ (ou KDR+), o CD133 tem sua expressão
diminuída conforme a maturação dessas células (PEICHEV et al., 2000). No
mesmo ano, Gehling e col., demonstraram que células CD133+ eram capazes
de se diferenciarem em células endoteliais in vitro e in vivo (GEHLING, 2006), e
em 2002, Grant e col. demonstraram que o transplante de uma única célula da
MO era capaz de promover a reconstituição da MO e a neovascularização
retiniana (GRANT et al., 2002).
Em resumo, esses estudos indicam a existência de uma célula-tronco do
adulto mais primitiva, caracterizada pelo marcador CD133, com capacidade de
regenerar a hematopoese bem como de promover ao mesmo tempo a
vasculogênese, razão pela qual tem sido proposto denominá-las, a exemplo do
que ocorre com células com esta mesma característica no embrião, de
hemangioblastos (BAILEY et al., 2004; GEHLING, 2006).
1.7 Delineamento do estudo
A exata proporção dos diferentes subtipos de CTH, caracterizadas pela
expressão de CD34 e CD133 na medula óssea e no sangue de cordão
umbilical não é conhecida. Da mesma forma, não se sabe se eventuais
diferenças nesta proporção se reflete na expressão diferencial de genes que
poderiam explicar o comportamento distinto observado clinicamente nos
transplantes realizados com CTH derivadas da MO ou do SCU.
Introdução
31
O nosso objetivo neste estudo foi caracterizar as populações de CTH
presentes na MO e SCU com relação à expressão de CD34 e CD133 e ao
perfil de expressão gênica em larga escala, este último com o intuito de
identificar os mecanismos moleculares relacionados à maior primitividade das
células CD133+.
2. Objetivos
Objetivos
33
2.1 Objetivo geral
Isolar, caracterizar e avaliar o perfil de expressão gênica em larga escala
de células CD34+ e CD133+ derivadas de medula óssea e de sangue de
cordão umbilical.
2.2 Objetivos específicos
Isolar as CTH de medula óssea e de sangue de cordão umbilical.
Caracterizar a composição celular de ambas as fontes, quanto à
expressão dos marcadores CD34 e CD133.
Avaliar o perfil de expressão gênica das células CD34+ e CD133+ de
medula óssea e de sangue de cordão umbilical pela técnica de
microarray.
Identificar os genes diferencialmente expressos entre as células CD34+
e CD133+ de ambas as fontes.
Identificar possíveis mecanismos de regulação envolvidos nas
diferenças observadas.
Validar as diferenças observadas por PCR quantitativo em tempo real.
3. Material e Métodos
Material e Métodos
35
3.1 Aspectos éticos
As amostras de sangue de cordão umbilical e de medula óssea foram
obtidas com consentimento após total esclarecimento dos doadores, de acordo
com os procedimentos aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa do
Hospital das Clínicas da USP de Ribeirão Preto sob os processos HCRP n
o
2146/2008, n
o
6775/2002 e n
o
4727/2001.
3.2 Coleta de sangue de cordão umbilical-SCU
As coletas de SCU foram realizadas pela equipe de obstetrícia do
hospital MATER em Ribeirão Preto. O sangue foi coletado utilizando-se
técnicas de assepsia imediatamente após o parto e secção do cordão umbilical
e posteriormente à dequitação da placenta. Foi feita a punção da veia umbilical
com uma agulha acoplada à uma bolsa de coleta (JP indústria farmacêutica,
Ribeirão Preto, SP, Brasil) devidamente identificada, contendo 25 mL de
solução anticoagulante CPD (citrate phosphate dextrose). As bolsas foram
mantidas a 4
o
C e processadas num período de até 6 horas após a coleta.
3.3 Coleta da medula óssea-MO
As amostras de MO foram obtidas de doadores normais, com idade
mínima de 18 anos e máxima de 60 anos, recrutados dentre os doadores de
medula óssea para transplante de medula (TMO) alogênico.
As coletas foram feitas através da punção aspirativa da crista ilíaca
posterior ou anterior, após anti-sepsia e anestesia local. Do volume total
Material e Métodos
36
aspirado, uma alíquota de 20 a 40 mL era separada e acondicionada em tubos
com anticoagulante heparina (Becton Dickinson, Franklin Lakes, New Jersey,
USA) para a realização dos experimentos propostos. Os procedimentos de
coleta foram realizados no hospital Amaral de Carvalho (Jaú-SP), no serviço de
transplante de medula óssea e no Hospital das Clínicas da Faculdade de
Medicina da USP de Ribeirão Preto. Em geral, as amostras foram processadas
num período de até 6 horas após a coleta.
3.4 Isolamento das células mononucleares
As células mononucleares (CMN) de SCU e de MO foram isoladas pelo
gradiente de densidade Ficoll-Hypaque (Amershan Biosciences, Piscataway,
New Jersey, USA). Considerando a necessidade de amostras com alta pureza
para análise de expressão gênica, o protocolo de Ficoll padrão foi modificado a
fim de elevar a pureza final e otimizar os resultados obtidos. Neste sentido,
primeiramente era realizada uma pré-centrifugação a 300g por 10 minutos, com
o intuito de retirar parte das plaquetas contidas no aspirado de MO e
principalmente no plasma do SCU. Em seguida as amostras eram então
diluídas na proporção 1:2 em tampão fosfato salina, PBS (phosphate buffered
saline) + 0,6% ACD (acid citrate dextrose) e após homogeneização, era feito a
adição de 13 mL de Ficoll na parte inferior de cada tubo, de maneira vagarosa,
com a consequente formação de duas fases: uma fase orgânica (inferior),
composta pela solução de Ficoll e uma fase aquosa (superior), composta pela
amostra (suspensão celular diluída). Em seguida, as amostras eram
submetidas à centrifugação a 800g por 30 minutos à temperatura ambiente
Material e Métodos
37
(TA) de modo que ao final, podia-se observar a formação de um anel, entre as
fases, composto por CMN, bem como um pellet celular no fundo do tubo,
composto pelas demais células (polimorfonucleares e células da linhagem
eritróide).
As CMN presentes na interface Ficoll-fase aquosa eram então
cuidadosamente coletadas, transferidas para novos tubos e lavadas duas
vezes com PBS + 0,6% ACD. Considerando o elevado número de eritroblastos
presentes no sangue de cordão umbilical, como segundo passo adicional, era
feito a lise das hemáceas, no qual o pellet proveniente da última lavagem era
ressuspenso em solução de cloreto de amônio (NH
4
Cl) e incubado em banho
de gelo por um período de 10 a 15 minutos. Em seguida era adicionado 30 mL
de solução de PBS + 5% de albumina humana e realizadas mais duas
lavagens com essa solução. Após as lavagens, as células eram ressuspensas
em tampão de coluna contendo PBS + 0,6% de ACD + 0,5% albumina e
contadas em câmara de Newbauer.
3.5 Seleção imunomagnética de células CD133+ e
células
CD34+
As células CD133+ e CD34+ foram selecionadas (ou purificadas)
imunomagneticamente utilizando o kit MACS para seleção positiva (Miltenyi
Biotec, Bergish Gladbach, Alemanha). Resumidamente as células
mononucleares eram incubadas com anticorpos monoclonais anti-AC133 ou
anti-CD34 acoplados a partículas magnéticas (beads). As células eram então
passadas em uma coluna de separação magnética LS (MACS
®
Miltenyi Biotec)
Material e Métodos
38
sob o campo magnético de um potente ímã SuperMACS (Miltenyi Biotec,
Bergish Gladbach, Alemanha), levando à retenção das células CD133+ ou
CD34+ marcadas magneticamente. A coluna ainda sob o campo magnético era
lavada eliminando as células não marcadas, sendo então retirada do campo
para eluição das células CD133+ ou CD34+. Ao final do procedimento, as
células eram novamente contadas em câmara de Newbauer e cerca de 2x10
5
células eram separadas para análise em citometria de fluxo. As demais células
eram utilizadas para a extração do RNA.
3.6 Citometria de fluxo
A avaliação da pureza final e a caracterização da composição celular
das CTH de MO e SCU, a fim de definir qual a extensão da co-expressão de
CD133 e CD34 nas populações definidas por estes marcadores, foram
realizadas por citometria de fluxo. A aquisição e análise dos eventos foi feita
com o citômetro FACSCalibur (Becton Dickinson, San Jose, CA, EUA)
utilizando o software específico CellQuest (Becton Dickinson, San Jose, CA,
EUA). Em resumo, como protocolo de marcação, cerca de 2x10
5
células totais
mononucleares ou imunomagneticamente selecionadas (CD34+ ou CD133+)
eram ressuspensas em 200µl de PBS, divididas em duas alíquotas de 100µl e
incubadas separadamente em dois tubos, um controle e um teste. Ao tubo
teste eram adicionados 3µl do anticorpo anti-AC133 conjugado ao fluorocromo
PE (phycoerythrin) (Miltenyi Biotec, Bergish Gladbach, Alemanha) seguida da
adição de 3µl do anticorpo anti-CD34 conjugado ao FITC (fluorescein
isothiocyanate) (Becton Dickinson, San Jose, CA, EUA) e ao tubo controle era
Material e Métodos
39
adicionado 3µl da solução de anticorpos controles inespecificos γ1 conjugado a
FITC (isotipo IgG1) e γ2 conjugado a PE (isotipo IgG2
A
) (Becton Dickinson, San
Jose, CA, EUA).
Como as células haviam sido selecionadas imunomagneticamente
utilizando anticorpos anti-AC133 (AC133-1) ou anti-CD34 (clone QBEND/10)
foram utilizados anticorpos monoclonais anti-AC133 (AC133-2) e anti-CD34
(clone 8G12) diferentes, que reconhecem epitopos distintos.
Os tubos eram então incubados sob a proteção de luz por 20 minutos e,
logo após, eram adicionados 2 ml de PBS e centrifugados a 1800 rpm por 5
minutos. O sobrenadante era descartado e o pellet de células era ressuspenso
em 200 µl de PBS seguida da aquisição das células em citômetro
(FACSCalibur, Becton Dickinson, San Jose, CA, EUA) ou adição de 200 µl de
PBS + formol, para posterior análise. Cerca de 10.000 a 50.000 eventos eram
adquiridos e plotados em função dos parâmetros de FSC (forward scatter), que
corresponde ao tamanho da célula e SSC (side scatter), que corresponde à
granularidade. De acordo com esses parâmetros, os eventos correspondentes
às células com perfil linfocitário típico de células progenitoras, já estabelecido
em nossos laboratórios, eram selecionados, constituindo a gate R1, enquanto
os eventos não selecionados corresponderiam a artefatos ou debris (Figura
1A). As células selecionadas em R1 eram então plotadas em um dot plot onde
o sinal das células marcadas com γ1 e γ2 era utilizado para a calibração do
aparelho (Figura 1B). Por fim, as células marcadas com os anticorpos CD34-
FITC e AC133-PE eram lidas em um novo dot plot para a quantificação do sinal
de fluorescência (Figura 1C).
Material e Métodos
40
A B C
Figura 1: Estratégia adotada para a determinação da expressão dos marcadores CD133 e
CD34 em citometria de fluxo. Durante a aquisição das células, foi desenhada uma gate na
população de progenitores linfocitários (R1), estabelecida com base nos parâmetros de
tamanho (FSC) por granularidade (SSC) (A). Os dot plots revelam a marcação dos eventos
selecionados por R1, para os isotipos controles IgG1/IgG2a (B) e para o sinal de CD34-FITC e
CD133-PE (C).
3.7 Extração do RNA
A extração do RNA foi realizada pelo método do Trizol, o qual é
constituído de uma solução monofásica de fenol e isotiocianato de guanidina
que rompe a célula mantendo a integridade do RNA total. Depois de
selecionadas, as células CD133+ ou CD34+ eram centrifugadas e
ressuspensas em 250 µl de PBS previamente tratado com DEPC
(Dietilpirocarbonato; Sigma-Aldrich, Steinhein, Alemanha) + 750µl da solução
de Trizol
LS (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). A mistura era completamente
homogeneizada com uma pipeta, transferida para um tubo de microcentrifuga e
em seguida armazenada em freezer a -80
o
C. No momento da extração, as
amostras eram descongeladas e a cada tubo eram adicionados 10µL de
glicogênio (10 µg/µL) seguido de 200 µL de clorofórmio puro. O tubo era então
incubado por 15 minutos a TA e após esse período era feita uma agitação
Material e Métodos
41
vigorosa em vórtex por 10 segundos. Na seqüência, o tubo era centrifugado a
14.000 g por 15 minutos a 4°C e a fase aquosa (fase superior) que se formava
era transferida para um novo tubo, evitando-se a coleta da interface entre fase
aquosa/fase orgânica, composta por proteínas. Em seguida era adicionado 500
µL de álcool isopropílico gelado para a precipitação do RNA. A mistura era
então homogeneizada e incubada à temperatura -20°C por cerca 12 horas (ou
overnight). Após esse período, o tubo era centrifugado a 14.000 g por 15
minutos a 4°C descartando-se o sobrenadante. O RNA era então lavado com a
adição de 1 mL de etanol 75% para a retirada de sais. Em seguida o tubo era
agitado e centrifugado a 14.000 g por 15 minutos a 4
o
C e o sobrenadante
descartado. Ao final, o pellet de RNA obtido era deixado secar, para a
evaporação do etanol e logo em seguida era ressuspenso em água (tratada
com DEPC) e armazenado em freezer a -80
o
C até ser utilizado.
3.8 Quantificação e análise da qualidade do RNA
O RNA total obtido das amostras foi quantificado através de leitura em
espectrofotômetro no comprimento de onda () de 260 nm, utilizando uma
equivalência de 40 µg/mL para 1 unidade de Absorbância. O grau de pureza da
amostra foi verificado através da análise da relação entre 260 e 280nm, sendo
considerada uma boa extração aquela que apresentou valores entre 1,6 a 1,8.
Finalmente, a integridade do RNA foi verificada em gel de agarose 1% e corado
com brometo de etídio para a visualização das bandas de RNA ribossomal 18S
e 28S.
Material e Métodos
42
3.9 Microarrays de oligonucleotídeos
O microarray é uma técnica de biologia molecular que permite a análise
da expressão gênica em larga escala (milhares de genes simultâneos) e
possibilita a comparação direta do perfil transcricional gerado entre diferentes
amostras. Neste sentido, as análises do perfil de expressão gênica das células
CD133+ e CD34+ selecionadas foram realizadas utilizando a plataforma
comercial de microarray Amersham CodeLink UniSet Human I BioArrays (GE
Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA), contendo cerca de 10.000
genes.
3.9.1 Formação dos pools de RNA
Com exceção das amostras CD34+ de MO, cujos resultados foram
obtidos de um estudo realizado anteriormente em nossos laboratórios (dados
não publicados), o RNA total das células CD34+ de SCU e das células CD133+
de MO e de SCU foi agrupado de modo a obter-se pools contendo RNA de
diferentes amostras de acordo com a Figura 2.
Material e Métodos
43
Figura 2: Desenho experimental utilizado no estudo. Cada lâmina corresponde a um pool
de amostras (1=pool 1 e 2=pool 2), com exceções das lâminas 1A/B e 2A/B, que correspondem
a amostras únicas em duplicata experimental (A e B) de CD34+ de MO, cujos resultados foram
obtidos de um estudo prévio.
A opção em se trabalhar com pools teve como objetivo permitir a
obtenção de uma quantia adequada de RNA para os experimentos de
microarrays e, ao mesmo tempo, reduzir o impacto da variação biológica, já
que com a utilização de um número maior de amostras por array, os níveis de
expressão obtidos para os diferentes genes correspondem a uma média da
expressão gênica das diferentes amostras. Assim, apesar do número reduzido
de arrays por tipo celular, as diferenças observadas representam, de maneira
mais aproximada, o que se observaria em um número maior de amostras.
Neste sentido, o número total de amostras utilizadas para cada um dos pools
de CD133+ de MO, CD133+ de SCU e CD34+ de SCU foram 5, 4 e 3,
respectivamente.
As amostras de cada pool foram selecionadas de forma que a pureza
final do mesmo estivesse acima de 90%. Para o cálculo da pureza do pool,
MO
1A
1B
2A
2B
SCU MO
1
2
1
2
1
2
CD34
SCU
CD133
Material e Métodos
44
utilizamos a média ponderada, levando em consideração o número de células
de cada amostra, de acordo com a fórmula a seguir:
MP = (n˚ de celsAm1 x %)+( n˚ de celsAm2 x %)+...(n˚. de celsAmn x %)
∑ n
˚
. de cels Am
Após a formação dos pools, o RNA foi purificado com o kit RNeasy
(Qiagen, Valencia, CA, USA) e a qualidade do RNA total foi adicionalmente
verificada por eletroforese em gel de agarose 1%, para a detecção de ambas
as bandas 18S e 28S, indicando a integridade do RNA do pool seguido de nova
quantificação em espectofotômetro (260 nm).
3.9.2 A técnica de microarray
Um total de 1,5 µg de cada pool de amostras foi utilizado para gerar o
RNA complementar (cRNA) biotinilado, utilizando o kit CodeLink Expression
Assay Reagent (GE Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA), seguindo
as instruções do fabricante. O esquema da abordagem experimental da técnica
de microarray é ilustrado na Figura 3.
Material e Métodos
45
Figura 3: Abordagem experimental da técnica de microarray. As etapas de 1 a 6 são
detalhadas no texto a seguir.
Inicialmente cada pool de amostras foi adicionado com uma quantidade
pré-determinada de RNA bacteriano utilizado como controle interno da
hibridização (1), e submetido então, à transcrição reversa utilizando primers
oligo(dT) contendo a seqüência promotora da RNA T7 polimerase (2). Após a
síntese da segunda fita, o cDNA gerado foi purificado em colunas QIAquick
(Qiagen, Valencia, CA, USA). O cDNA de cada amostra foi utilizado em
reações de transcrição de RNA in vitro utilizando a enzima RNA polimerase T7
e nucleotideos (biotin-11-UTP) marcados com biotina (Perkin Elmer, Boston,
MA, USA) (3). Este passo amplifica a amostra de RNA linearmente, mantendo
a representatividade original da amostra, e gerando um RNA complementar
RNA total
(1) RNA bacteriano
(controle)
(2) Transcrição reversa
Síntese da segunda
fita de cDNA
(5) Fragmentação e
Hibridização
Matriz em gel
Sondas
cRN
A
Biotina
(6)Detecção
Biotina
Conjugado
Estreptavidina
(
3
)
T7 RNA
p
olimerase
UTPs biotinilados
TTTTT - T7
A
AAA
TTTTT -
TTTTT
(
4
)
cRN
A
Material e Métodos
46
(cRNA) biotinilado (4). O cRNA de cada amostra foi purificado com o kit
RNeasy e quantificado por espectrofotometria. Para a hibridização, 10µg de
cRNA de cada pool foram fragmentados por aquecimento a 94
o
C por 20
minutos, em uma solução tampão adequada contendo magnésio. O cRNA
fragmentado foi então injetado nas microcâmaras das lâminas de microarrays
(5), e depois de seladas, as lâminas foram incubadas por 18 horas a 37
o
C sob
agitação intensa (300 rpm) em um shaker adaptado especificamente para
manter as lâminas fixas na horizontal. Após este período de hibridização, as
microcâmaras foram removidas das lâminas, e estas foram incubadas com um
conjugado cianina 5-estreptavidina (Cy5-Streptavidin conjugate; Amersham
Biosciences, Piscataway, NJ, USA), para a detecção da fluorescência (6),
sendo lavadas e, logo após, secadas para finalmente serem escaneada e
analisadas.
3.9.3 Obtenção e análise das imagens
Após a lavagem e a secagem das lâminas, estas foram escaneadas
utilizando o software GenePix Pro 6.0 e um scanner GenePix 4000B (Axon
Instruments, Foster City, CA, USA). As lâminas foram escaneadas a 650nm
(fluorescência do Cy5) utilizando uma resolução de 10µm. Para a determinação
da intensidade do sinal de fluorescência dos diferentes spots da lâmina, as
imagens obtidas foram analisadas com o programa CodeLink Expression
Analysis Software (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA). Em suma,
este software reconhece os spots presentes na lâmina e quantifica a
intensidade de fluorescência de cada spot. Os valores de fluorescência obtidos
são então normalizados pela mediana dos valores de todos os spots da lâmina,
Material e Métodos
47
de forma que diferentes lâminas (amostras) possam ser comparadas e os
resultados exportados para planilhas do software Microsoft Excel.
3.10 Análises Bioinformáticas
3.10.1 Clusterização hierárquica
Cerca de 10.000 genes foram utilizados para agrupar os arrays de
acordo com a similaridade nos perfis de expressão gênica. O software Cluster
3.0 foi utilizado para a clusterização hierárquica pelo método de Average
Linkage utilizando a métrica baseada no coeficiente de correlação de
Spearman Rank. O dendograma foi gerado utilizando o software Java
TreeView.
3.10.2 Seleção de genes diferencialmente expressos
Os valores de expressão finais de cada gene foram utilizados numa
análise de significância estatística utilizando o programa SAM V3.00
(Significance Analysis of Microarrays) (TUSHER et al., 2001). O programa SAM
se baseia na realização de testes estatísticos repetidas vezes sobre o mesmo
conjunto de dados, realizando permutações entre os grupos sendo
comparados. Desta forma, pode-se estimar a chance de erro na seleção de
genes resultante, ou FDR (False Discovery Rate), assim como um Score (d)
utilizado no ranqueamento dos genes selecionados. O número de genes
selecionados pelo programa depende de um parâmetro interno do programa
chamado Delta, cujo valor é estipulado pelo usuário. Ao contrário dos métodos
Material e Métodos
48
estatísticos usuais, onde um valor de P é obtido, e um limiar considerado
aceitável (usualmente P<0.05) define o conjunto de genes diferencialmente
expressos; o método SAM deixa a critério do usuário, a seleção do número de
genes, associando a este conjunto, um FDR. O ordenamento dos genes pelo
Score, permite saber quais genes apresentam diferenças estatisticamente mais
significativas.
Após a seleção dos genes diferencialmente expressos, nós fizemos uma
busca de todos os genes com atividade de fatores de transcrição (FT)
presentes no conjunto dos genes hiper-expressos nas células CD133+,
utilizando a ferramenta de bioinformática PathwayStudio (Ariadne Genomics,
Inc. Rockville, MD, USA).
3.10.3 Análise de Promotores
Para realizar a análise de promotores, nós utilizamos uma ferramenta de
bioinformática on-line chamada TELIS - Transcription Element Listening
System (http://www.telis.ucla.edu/TELiS.htm) para determinar a freqüência de
sítios de ligação de fatores de transcrição, entre os promotores dos genes
selecionados (COLE et al., 2005). Neste sentido, o trecho genômico de 600pb
acima do inicio da transcrição destes genes foram definidos como regiões
promotoras. Adicionalmente, as matrizes da base TRANSFAC (WINGENDER
et al., 2001) foram utilizadas para busca e determinação dos sítios de ligação
utilizando como parâmetro de estringência um valor de 0.95 (máxima
estringência) utilizando o algoritmo MatInspector (QUANDT et al., 1995).
Finalmente, o conjunto total de promotores humanos foi definindo como
parâmetro para determinação da freqüência (número de sítios por promotor),
Material e Métodos
49
bem como da incidência (porcentagem de promotores contendo o sítio)
esperada dos diferentes sítios de ligação de fatores de transcrição entre os
promotores. Uma vez definidos o tamanho do promotor e a estringência, a
freqüência e incidência calculada para os diferentes sítios de ligação, presentes
no conjunto de promotores sendo avaliado, são comparadas às freqüências e
incidência, calculadas para o conjunto de promotores de referência utilizado
(QUANDT et al., 1995). Desta forma, os fatores de transcrição potencialmente
envolvidos no controle da expressão dos genes diferencialmente expressos
foram definidos.
3.11 PCR em tempo real
Para a realização dos estudos de PCR quantitativo em tempo real (Real
time PCR), 500 ng de RNA total de cada amostra foi utilizado para a
transcrição reversa e síntese de 25µl de cDNA, usando o High Capacity cDNA
Archive Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). O cDNA resultante foi
então diluído 5 vezes para uso nas reações.
Realizamos a quantificação relativa dos genes NFB2, RELB, NOTCH1,
GATA3, RUNX1, USF1, TAL1, HOXA9 e HOXB4 em um total de 29 amostras
de CD34+ (18 de MO+ e 11 de SCU) e 25 amostras de CD133+ (11 de MO e
14 de SCU). Todas as amostras de CD34+ de MO e de SCU, exceto aquelas
utilizadas também para os experimentos de microarrays, foram derivadas de
um estudo anterior (PANEPUCCI et al., 2005). As reações foram realizadas em
duplicata utilizando mix de sonda e primers TaqMan (“Assay on demand”) em
conjunto com o reagente MasterMix (Applied Biosystems, Foster City, CA,
USA). A amplificação foi realizada em um volume final de 10µl, utilizando 5µl
Material e Métodos
50
do reagente específico TaqMan Master Mix, 0,5 µl do mix especifico de sonda e
primers TaqMan, 2,5µl de H
2
O, e 2µl de cDNA diluído. As condições de
termociclagem compreenderam uma incubação a 50ºC por 2 minutos, 95ºC por
10 minutos (para ativação da DNA polimerase), seguidos por 40 ciclos de 95ºC
por 15 segundos (desnaturação) e 60ºC por 1 minuto (anelamento e extensão
simultâneos). Um aparelho de detecção de PCR em tempo real 7300 Real
Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) foi utilizado
juntamente com o software Sequence Detection System V1.3 para obtenção
dos valores de CT. Ao final das corridas os dados foram então exportados para
planilhas do software Excel para cálculo dos valores de CT.
O gene endógeno (ou housekeeping) GAPDH (Applied Biosystems, Foster
City, CA, USA) foi utilizado para a normalização interna das amostras e a
fórmula 2
-∆∆Ct
, (PFAFFL, 2001) foi utilizada para o cálculo da expressão
relativa, de modo a obtermos, ao final, valores de expressão relativos à
amostra central de CD34+ de MO. Neste sentido, para cada gene avaliado, as
reações de PCR foram realizadas inicialmente com as amostras de MO
(CD34+ e CD133+) e as duas amostras CD34+ de MO imediatamente anterior
e posterior à mediana dos valores de CT das mesmas, foram utilizadas como
calibradores durante a avaliação das amostras de SCU (CD34+ e CD133+),
permitindo a posterior comparação entre todas as amostras.
O software GraphPad Prism V4.03 (GraphPad Software, Inc., San Diego,
CA) foi utilizado para gerar os gráficos e para calcular a significância
estatística, aplicando o teste não-paramétrico de Mann-Whitney com uma
cauda.
Material e Métodos
51
Adicionalmente fizemos uma análise de correlação entre os genes
avaliados, utilizando os níveis de expressão obtidos por PCR em tempo real e
o teste Spearman não paramétrico para testar a significância estatística entre
as correlações.
4. Resultados
Resultados
53
4.1 Caracterização por citometria de fluxo
4.1.1 Pureza e co-expressão do CD34 nas células CD133+
A pureza final das células CD133+ obtidas após a seleção
imunomagnética e a co-expressão do marcador CD34 nessas células, foram
avaliadas por citometria de fluxo (Figura 4). Inicialmente, observamos que a
maioria das células CD133+ expressam também o marcador CD34, de modo
que uma média de 99,6 % das células CD133+ de SCU são CD34+ enquanto
na MO essa porcentagem é de 99,4%. As purezas finais das amostras de
CD133+ de SCU e MO estão detalhadas nas tabelas 1 e 2 e serão mostradas
posteriormente.
Figura 4: Avaliação da pureza e porcentagem de células CD34+ nas células CD133+
selecionadas. SCU=sangue de cordão umbilical. MO=medula óssea. A=%CD34-/CD133+ e
B=%CD34+/CD133+. A pureza de cada amostra é determinada pela porcentagem de células
CD133+ totais (A+B), com médias de 93,1% para as amostras CD133+ de SCU (n=7) e 91,7%
para as amostras CD133+ de MO (n=7). A avaliação da co-expressão do marcador CD34, ou
seja, a porcentagem de células CD34+ nas células CD133+ selecionadas, por sua vez, é
determinada pela porcentagem de células CD34+/CD133+ (duplo positivas) presente na
população total de células CD133+, através da fórmula B*100/A+B, com médias igual a 99,6%
para as amostras de SCU e 99,4% para as de MO.
SCU
92,7%
0,4%
91,2% 0,5%
MO
A
A
B
B
Resultados
54
4.1.2 Co-expressão de CD133 nas células CD34+
Vimos que a grande maioria das células CD133+ co-expressam o
marcador CD34 independente da fonte. Com o intuito de melhor caracterizar as
células CD34+, nós analisamos a expressão do marcador CD133 nas células
CD34+ presentes na fração de células mononucleares de SCU e de MO.
Nossos resultados revelaram uma diferença significante na porcentagem de
células CD133+ entre as células CD34+ de ambas as fontes, sendo que no
SCU, cerca 70% das células CD34+ co-expressam o marcador CD133,
enquanto na MO, cerca de 40% das células CD34+ o fazem (Figura 5).
UCB BM
0
20
40
60
80
100
CD133 em células CD34+(%)
Figura 5: Porcentagem de células CD133+ nas células CD34+ presentes na fração
mononuclear. UCB=sangue de cordão umbilical (SCU); BM=medula óssea. (MO). As células
CD34+ de SCU (n=9) apresentaram uma porcentagem significativamente maior (P=0.0010) de
células CD133+ comparadas às células CD34+ de MO (n=5).
Resultados
55
Posteriormente, com o objetivo de avaliar a influência do procedimento
de seleção imunomagnética sobre a composição celular, nós avaliamos a
expressão do marcador CD133 nas células CD34+ antes (na fração de células
mononucleares) e após a seleção imunomagnética; onde pudemos observar
um aumento das células CD133+ após o procedimento de seleção das células
CD34+ tanto em MO como em SCU (Figura 6).
Figura 6: Enriquecimento das subpopulação celular CD34+CD133+ após a seleção
imunomagnética de células CD34+. Os valores correspondem às médias das porcentagens
de células CD34+CD133+ (duplo positivas) na população de células CD34+ antes e após a
seleção em coluna magnética, variando de 37% para 46% na MO (n=2) e de 66% para 80% no
SCU (n=7). MO=medula óssea; SCU=sangue de cordão umbilical. CMN=células
mononucleares.
CMN
MO
SCU
66%
80%
46%
37%
Pós-coluna CD34
Resultados
56
4.2 Seleção das amostras para os experimentos de microarrays
4.2.1 Células CD133+ de sangue de cordão umbilical
Foram selecionadas oito amostras de células CD133+ de SCU para a
confecção dos pools e realização dos experimentos de microarrays (Tabela 1).
Destas, obtivemos uma média de 1,5 x 10
6
células CD133+, variando de 0,7 a
4 x 10
6
por amostra e correspondendo a um total de 13,4 x 10
6
células. A
pureza das amostras variou entre 88 e 96%. Quinhentos nanogamas de RNA
de cada amostra foram separados com o intuito de validarmos os resultados
encontrados nas análises de microarrays por um método independente. O RNA
restante de cada amostra, variando entre 2 a 6 µg por amostra, foi agrupado
em dois pools: 1 e 2 com um total 13,5µg e 14,0µg de RNA, respectivamente. A
pureza final foi de 91% para o pool 1 de 94% para o pool 2 (Tabela 1).
Tabela 1. Amostras utilizadas para confecção dos pools de células CD133+ de sangue de
cordão umbilical.
Amostra Tipo
Celular
Pool N
o
células(10
6
) Pureza Pureza
Pool
RNA
Pool(µg)
Total
(µg)
1 1,9 91% 2,0
2 0,7 94% 4,5
3 2,3 88% 4,0
4
1
0,9 96%
91%
3,0
13,5
5 0,9 89% 2,5
6 1,0 95% 3,5
7 1,7 94% 2,0
8
SCU
CD133+
2
4,0 94%
94%
6,0
14,0
SCU=sangue de cordão umbilical.
Resultados
57
4.2.2 Células CD133+ de medula óssea
Para a confecção dos pools e realização dos experimentos de
microarrays das amostras CD133+ de MO, 10 amostras foram selecionadas,
com uma média de 1,0 x 10
6
células por amostra, correspondendo a um total
de 9,7 x 10
6
células totais. O número de células selecionadas por amostra
variou de 0,4 a 3,0 x 10
6
. A pureza das amostras variou entre 87 e 99% (Tabela
2). Da mesma forma que para o SCU, 500 ng de cada amostra foi separado
para posterior validação e o RNA restante, com uma variação entre 2,5 a 5,0
µg por amostra, foi agrupado em dois pools. O total de RNA foi de 17,0 µg e
15,5 µg, para o pool 1 e para o pool 2, respectivamente. Em relação à pureza,
o resultado foi de 90% para o pool 1 de 94% para o pool 2 (Tabela 2).
Tabela 2. Amostras utilizadas para confecção das dos pools de células CD133+ de
medula óssea.
Amostra Tipo
Celular
Pool N
o
células(10
6
) Pureza Pureza
Pool
RNA
Pool(µg)
Total
(µg)
1 1,0 93% 3,0
2 0,7 91% 3,0
3 0,4 93% 3,0
4 0,4 99% 3,0
5
1
3,0 87%
90%
5,0
17,0
6 0,6 91% 2,5
7 0,6 92% 3,0
8 0,7 95% 3,0
9 1,0 92% 4,0
10
MO
CD133+
2
1,3 97%
94%
3,0
15,5
MO=medula óssea
Resultados
58
4.2.3 Células CD34+ de sangue de cordão umbilical
Em relação às células CD34+ de SCU, foram utilizadas 6 amostras para
a confecção dos pools e realização dos experimentos de microarrays.
Obtivemos uma média de 2,9 x10
6
células CD34+, com variação entre 0,6 a 4,8
x10
6
por amostra, correspondendo a um total de 16,3x10
6
células. A pureza das
amostras variou entre 77 e 99% (Tabela 3). Da mesma forma que para as
amostras de células CD133+, 500 ng de cada amostra CD34+ de SCU foi
inicialmente separado para posterior validação. O restante também foi
agrupado em dois pools, os quais tiveram amostras variando entre 3 a 10,5 µg.
O total de RNA para o pool 1 foi de 17 µg e para o pool 2 de 23,5µg . Já a
pureza para o pool 1 e para o pool 2 foi de 92% e 91%, respectivamente
(Tabela 3).
Tabela 3. Amostras utilizadas para confecção dos pools de células CD34+ de sangue de
cordão umbilical.
Amostra Tipo
Celular
Pool N
o
células(10
6
) Pureza Pureza
Pool
RNA
Pool (µg)
Total
(µg)
1 3,2 99% 3,0
2 3,1 85% 9,0
3
1
0,6 96%
92%
5,0
17,0
4 4,9 90% 10,0
5 4,8 96% 10,5
6
SCU
CD34
2
1,0 77%
91%
3,0
23,5
SCU=sangue de cordão umbilical.
4.2.4 Células CD34+ de medula óssea
Como citado anteriormente, os resultados das análises dos microarrays
das células CD34+ de MO foram obtidos de um estudo anterior no qual foram
Resultados
59
utilizadas duas amostras distintas, ambas com 97% de pureza final, para a
confecção das lâminas (realizadas em duplicatas).
4.3 Amostras utilizadas no PCR em tempo real
Um total de 29 amostras CD34+ (18 de MO+ e 11 de SCU) e 25
amostras CD133+ (11 de MO e 14 de SCU) foram avaliadas por PCR em
tempo real a fim de validar os genes selecionados nos experimentos de
microarrays bem como avaliar a expressão de genes relacionados aos
mesmos. Os valores das purezas das amostras CD133+ de SCU e de MO
utilizadas nos experimentos de PCR em tempo real estão dispostos na Tabela
4.
Tabela 4. Amostras de células CD133+ utilizadas para os estudos de expressão gênica
por PCR em Tempo Real.
ID Nota * Pureza ID Nota * Pureza
SCU-1
Pool 1 microarray 91%
SCU-14
80%
SCU-2
Pool 1 microarray 94%
MO-1
Pool 1’ microarray 93%
SCU-3
81%
MO-2
80,%
SCU-4
79%
MO-3
85%
SCU-5
Pool 1 microarray 88%
MO-4
Pool 1’ microarray 91%
SCU-6
Pool 2 microarray 89%
MO-5
Pool 1’ microarray 93%
SCU-7
87%
MO-6
Pool 1’ microarray 98%
SCU-8
Pool 1 microarray 96%
MO-7
Pool 1’ microarray 87%
SCU-9
Pool 2 microarray 95%
MO-8
Pool 2’ microarray 91%
SCU-10
51%
MO-10
Pool 2’ microarray
95%
SCU-11
43%
MO-11
Pool 2’ microarray
92%
SCU-12
Pool 2 microarray 94%
MO-12
Pool 2’ microarray
97%
SCU-13
Pool 2 microarray 94%
MO=medula óssea, SCU=sangue de cordão umbilical.
* Ver descrição no texto a seguir.
Resultados
60
4.3.1 Amostras CD133+ de SCU
As amostras SCU-1, SCU-2, SCU-5 e SCU-8 correspondem às amostras
1 a 4, utilizadas na confecção do pool 1 de células CD133+ de SCU, enquanto
as amostras SCU-6, SCU-9, SCU-12 e SCU-13, correspondem às amostras 5 a
8, utilizadas na confecção do pool 2 de células CD133+ de SCU (Tabela 1).
4.3.2 Amostras CD133+ de MO
As amostras MO-1 e MO-4 a MO-7 correspondem às amostras 1 a 5, utilizadas
na confecção do primeiro pool de células CD133+ de MO. Já as amostras MO-
8 e MO-11 a MO-13 correspondem às amostras 6 e 8 a 10, respectivamente,
utilizadas na confecção do segundo pool de células CD133+ de MO. (Tabela
2).
A amostra MO-9 correspondente a amostra 7 que havia sido utilizada
para confecção do pool 2 de CD133+ de MO foi excluída dos cálculos de
expressão gênica por PCR em tempo real uma vez que apresentou alteração
na expressão do gene endógeno indicando uma possível degradação do
cDNA.
4.3.3 Amostras CD34+ de MO e SCU
Como citado anteriormente todas as amostras de CD34+ de MO e de
SCU, exceto aquelas utilizadas também para os experimentos de microarrays,
foram derivadas de um estudo anterior com pureza variando entre 55% a 97%
(PANEPUCCI et al., 2007).
Resultados
61
4.4 Perfis de expressão gênica
4.4.1 Análise de Clusterização
Um total de 9925 genes foram utilizados para a geração dos perfis de
expressão gênica das diferentes amostras (sob a forma pools) pela técnica de
microarray. Após a normalização dos valores de expressão, estes foram
utilizados em uma análise de clusterização hierárquica, a qual permite agrupar
os perfis de expressão distintos de acordo com a similaridade entre os mesmos
(Figura 7).
Figura 7: Agrupamento obtido após análise de clusterização hierárquica . As amostras
foram agrupadas de acordo com a similaridade entre os perfis de expressão gênica.
MO=medula óssea; SCU=sangue de cordão umbilical; 1=pool1; 2=pool 2; A (1e 2)e B (1 e
2)=amostras individuais realizadas em duplicatas experimentais.
CD133-SCU (1)
CD133-SCU (2)
CD34- SCU (1)
CD34- SCU (2)
CD133-MO (1)
CD133- MO (2)
CD34- MO (A1)
CD34- MO (A2)
CD34- MO (B1)
CD34- MO
(
B2
)
Resultados
62
Como podemos observar no dendograma apresentado (Figura 7), há em
primeiro lugar um agrupamento direto entre as replicatas experimentais das
amostras CD34+ de MO. Em seguida, os perfis de transcrição são agrupados
de maneira independente, de acordo com o tipo (CD34 ou CD133) e a fonte
(MO ou SCU). Ao ampliarmos a análise, verificamos que as amostras CD34+
de SCU e as CD133+ de SCU aparecem agrupadas juntas, enquanto as
amostras CD34+ de MO e CD133+ de MO, não. Ao contrário, as amostras
CD133+ de MO aparecem preferencialmente agrupadas com as amostras de
SCU (CD34+ e CD133+). Assim, ao final temos, de uma maneira mais
abragente, a presença de dois grandes grupos ou clusters distintos. O primeiro,
composto pelas amostras de SCU (CD133+ e CD34+) e pelas amostras
CD133+ de MO e o segundo, composto pelas amostras CD34+ de MO, o qual
aparece como um grupo distinto.
4.4.2 Genes diferencialmente expressos entre as células CD34+ e as
células CD133+ e seleção dos fatores de transcrição
A comparação entre os perfis de expressão gênica das amostras CD34+
e das amostras CD133+ por SAM, revelou em um total de 1266 genes
diferencialmente expressos, com uma média de false discovery rate (FDR) de
4,53% (delta=1.009). Destes, 891 estavam hiper-expressos nas células
CD133+, enquanto 375 estavam hiper-expressos nas células CD34+.
Revelado os genes diferencialmente expressos, nós optamos por
selecionar os genes com atividade de fator de transcrição (FT), devido ao papel
fundamental que estes exercem no controle da regulação gênica, uma vez que
são essenciais para a ativação do complexo transcricional no núcleo, e
Resultados
63
consequentemente nas características biológicas das células. Assim, com o
intuito de identificar os mecanismos moleculares potencialmente envolvidos
com a maior primitividade das células CD133+, nós realizamos uma busca por
todos os FT presentes no conjunto de genes hiper-expressos nessas células
(891). Um total de 47 FT foram encontrados, dentre eles muitos fatores
conhecidos, relacionados à manutenção da primitividade (aumento da auto-
renovação e expansão das CTH) e ao potencial de hemangioblasto, como o
RUNX1/AML1, USF1, TAL1/SCL, HOXA9 e HOXB4 bem como com
desenvolvimento e comprometimento com a linhagem T linfocítica, como o
GATA3. (Figura 8). A lista completa com o nome, a descrição e a média dos
valores de expressão desses genes está disponível em Apêndice (Apêndice A).
Resultados
64
Figura 8: Fatores de transcrição hiper-expressos nas células CD133+ comparadas às
células CD34+. Os genes encontram-se dispostos em ordem decrescente de fold (razão
CD133+/CD34+) de acordo com o heatmap, onde os quadrados mais escuros correspondem
aos maiores níveis de expressão enquanto os mais claro correspondem aos menores níveis.
CD133=células CD133+. CD34=células CD34+. BM=medula óssea (MO), UCB=sangue de
cordão umbilical (SCU).
Resultados
65
4.5 Análise de promotores
Com o objetivo de avaliar os mecanismos de regulação envolvidos com
os FT que apareceram em maiores níveis nas células CD133+ e identificar a
existência de um possível FT chave, que poderia ser responsável pela hiper-
expressão dos mesmos, nós realizamos uma análise de promotores em 44 dos
47 genes selecionados. Após identificar os sítios de ligação para diferentes FT
nos promotores desses genes, foi realizada uma análise para identificar entre
estes quais eram estatisticamente mais freqüentes em relação ao esperado,
com base nas freqüências determinadas para o conjunto total de promotores
humanos. A análise revelou que três sítios de ligação de fatores da via NF-kB
estavam entre os sítios mais significativamente representados, distribuídos
entre os promotores de 9 dos 44 genes avaliados, dentre eles GATA3, USF1 e
RUNX1 (Figura 9)
Resultados
66
A B
Figura 9: Sítios de ligação para NFκB e os potenciais alvos transcricionais encontrados
hiper-expressos nas células CD133+. (A) A análise de promotores revelou três sítios de
ligação, com frequência e incidência acima do esperado para fatores da via NF-kB, sendo eles:
NFKAPPAB_01 (equivalente ao complexo NFB1/RELA), NFKAPPAB65_01 (equivalente ao
RELA) e CREL.(B) Heatmap ilustrando o número de ocorrências dos três sítios de ligação para
NF-KB, sendo nenhum (branco), um (cinza) e dois (preto). A direita tem-se os potenciais alvos
transcricionais de NFB incluindo GATA3, USF1 e RUNX1. AM=amostras; Pop=população
(amostragem definida por um amplo conjunto de promotores de mamíferos).
Incidência
% dos
promotores
contendo ao
menos um
sítio de li
g
a
ç
ão
Frequência
Número de sítios de
ligação por
promotor
n = 4/44 p = 0.0097
Média Am =9.09%
Média Pop=1.90%
Razão = 4.8
z = 4.37 p = 1.25E-5
Média Am = 0.114
Média Pop = 0.020
Razão = 5.8
1.
V$
NFKAPPAB
0
1
n = 5/44 p = 0.0025
Média Am = 11.36%
Média Pop = 2.15%
Razão = 5.3
z = 4.10 p = 4.10E-5
Média Am = 0.114
Média Pop = 0.022
Razão = 5.2
2.
V$
NFKAPPAB
65 0
1
n = 7/44 p = 0.0149
Média Am = 15.91%
Média Pop = 5.98%
Razão = 2.7
z = 3.07 p = 0.0022
Média Am = 0.182
Média Pop = 0.063
Razão = 2.9
3
.
V$C
REL
0
1
Resultados
67
4.6 PCR em tempo real
As diferenças de expressão dos genes RUNX1, GATA3, USF1, TAL1,
HOXA9 e HOXB4, entre as células CD133+ e as células CD34+, observadas
nas análises de microarrays foram validadas por PCR em tempo real (Figura
10).
Vimos que a análise de promotores revelou uma potencial regulação de
diversos FT hiper-expressos nas células CD133+ por fatores da via NFB, o
que nos levou a avaliação adicional dos níveis expressão dos transcritos de
NFB2, RELB e também de NOTCH1 por PCR em tempo real. Os resultados
obtidos para os 6 genes selecionados nos microarrays, bem como para os
genes NOTCH1, RELB e NFB2 são apresentados na Figura 11.
0 1 2 3 4
GATA3
RUNX1
USF1
TAL1
HOXA9
HOXB4
PCR em tempo real
Microarray
Fold
Figura 10: Validação das diferenças encontradas nas análises de microarrays por PCR
em tempo real. A razão CD133+/CD34+ (fold), foi calculada utilizando a média dos valores
expressão dos transcritos das amostras CD133+ (MO e SCU) e das amostras CD34+ (MO e
SCU). Enquanto as barras em cinza representam os valores de fold obtidos nos microarrays,
as barras em preto representam os valores obtidos por PCR em tempo real. Nota-se que
embora os valores não sejam iguais entre as técnicas avaliadas; eles são equivalentes uma
vez que todos são positivos, ou seja, estão de fato mais expressos nas células CD133+
comparadas às células CD34+.
Resultados
68
Figura 11: Níveis de expressão gênica avaliados por PCR em tempo real. O PCR em tempo real foi realizado em amostras CD34+ de MO (n=18),
CD133+ de MO (n=11), CD34+ de SCU (n=11) e CD133+ de SCU (n=14). A expressão gênica é mostrada como a razão (Fold) relativa à expressão gênica
mediana das amostras de CD34+ de MO (em log de base 2). A análise de significância estatística (representada em asterisco para p<0.05) revelou que,
exceto USF1, todos os transcritos estavam em maiores níveis nas células CD34+ de SCU do que nas células CD34+ de MO. Esses resultados também
foram verdadeiros para a subpopulação de células CD133+, exceto para HOXA9 e GATA3, e NFB2 em adição ao USF1. A comparação entre as células
CD34+ de MO com as células CD133+ de MO, confirmou os resultados encontrados pelos microarrays, exceto para TAL1. Em contraste, exceto para USF1,
HOXB4 e HOXA9, não havia diferença significante entre as células CD34+ de SCU e CD133+ de SCU. Todos os p valores estão disponíveis em Apêndice
(Apêndice B). BM=medula óssea (MO); UCB=sangue de cordão umbilical (SCU).
Resultados
69
4.6.1 Análise de Correlação entre os transcritos
Finalmente, com o intuito de identificar potenciais inter-relações entre os
fatores de transcrição, nós realizamos uma análise de correlação com os
valores de expressão obtidos por PCR em tempo real onde pudemos observar
uma correlação positiva estatisticamente significante entre todos os transcritos
avaliados (Tabela 5).
Tabela 5: Coeficientes de correlação entre os transcritos avaliados.
NOTCH1 RELB NFΚB2 GATA3 RUNX1 HOXA9 HOXB4 USF1 TAL1
NOTCH1
RELB 0.80
NFΚB2 0.71 0.88
GATA3 0.83 0.71
0.62
RUNX1 0.79
0.63 0.54
0.80
HOXA9 0.72
0.51 0.40
0.80
0.70
HOXB4
0.65 0.47 0.29 0.67
0.75 0.87
USF1
0.53 0.46 0.42 0.60 0.40 0.69 0.53
TAL1
0.41 0.42 0.26 0.47 0.61 0.55
0.71
0.44
Valores dos coeficientes de correlação de Spearman (r) apresentados a cada comparação
entre os transcritos avaliados. Os valores acima de 0.7 estão destacados em negrito revelando
as correlações mais expressivas.
De acordo com a Tabela 5, NOTCH1, RUNX1, GATA3 e HOXA9 são
todos relacionados entre si, com elevados coeficientes de correlação (r>0.7 e
P<0.0001) (Figura 12). Da mesma maneira, NOTCH1, RELB e GATA3 são
também correlacionados com altos coeficientes (r>0.7 e P<0.0001) (Figura 13).
Resultados
70
0,83 (P<0.0001)
0.5 1 2 4 8 16 32 64
0.5
1
2
4
8
16
32
64
128
NOTCH1
GATA3
0,79 (P<0.0001)
0.5 1 2 4 8 16 32 64
0.5
1
2
4
8
NOTCH1
RUNX1
0,72 (P<0.0001)
0.5 1 2 4 8 16 32 64
0.5
1
2
4
8
16
32
NOTCH1
HOXA9
0,70 (P<0.0001)
0.5 1 2 4 8
0.5
1
2
4
8
16
32
RUNX1
HOXA9
0,80 (P<0.0001)
0.5 1 2 4 8
0.5
1
2
4
8
16
32
64
128
RUNX1
GATA3
0,80 (P<0.0001)
0.5 1 2 4 8 16 32 64 128
0.5
1
2
4
8
16
32
GATA3
HOXA9
Figura 12: Análise de correlação entre os transcritos NOTCH1, RUNX1, GATA3 e HOXA9.
Os níveis de expressão obtidos por PCR em tempo real para NOTCH1, RUNX1, GATA3 e
HOXA9 foram plotados nos gráficos para destacar a potencial corregulação dos transcritos
avaliados. Os valores de fold foram calculados em relação à amostra que apresentou menor
nível de expressão da série, permitindo a direta avaliação entre as mudanças apresentadas
para cada transcrito. Os coeficientes de correlação e os p valores estão dispostos sobre os
gráficos.
Resultados
71
Adicionalmente, podemos verificar altos níveis de correlações para os
transcritos de HOXB4 e HOXA9(r=0.87), pertencentes à mesma família de FT,
bem como para RELB e NFB2 (r=0.88), que atuam em forma de dímeros na
via de sinalização de NFB não canônica. (Figura 14).
0,80 (P<0.0001)
0.5 1 2 4 8 16 32 64
0.5
1
2
4
8
16
32
64
128
256
NOTCH1
RELB
0,83 (P<0.0001)
0.5 1 2 4 8 16 32 64
0.5
1
2
4
8
16
32
64
128
NOTCH1
GATA3
0,70 (P<0.0001)
0.5 1 2 4 8 16 32 64 128 256
0.5
1
2
4
8
16
32
64
128
RELB
GATA3
Figura 13: Análise de correlação entre os transcritos NOTCH1, GATA3, RELB. Os Níveis
de expressão obtidos por PCR em tempo real para NOTCH1, GATA3 e RELB foram plotados
nos gráficos para destacar a potencial corregulação dos transcritos avaliados. Os valores de
fold foram calculados em relação à amostra que apresentou menor nível de expressão da
série, permitindo a direta avaliação entre as mudanças proporcionais apresentada para cada
transcrito. Os coeficientes de correlação e os p valores estão dispostos sobre os gráficos.
0,87 (P<0.0001)
0.5 1 2 4 8 16 32
0.5
1
2
4
8
16
32
HOXA9
HOXB4
0,88 (P<0.0001)
0.5 1 2 4 8 16 32 64 128 256
0.5
1
2
4
8
16
32
64
128
RELB
NFKB2
Figura 14: Análise de correlação entre os transcritos HOXB4 e HOXA9 e entre os
transcritos NFΚB2 e RELB. Os Níveis de expressão obtidos por PCR em tempo real para
HOXB4 e HOXA9 bem como para NFB2 e RELB. Os valores de fold foram calculados em
relação à amostra que apresentou menor nível de expressão da série, permitindo a direta
avaliação entre as mudanças proporcionais apresentada para cada transcrito. Os coeficientes
de correlação e os p valores estão dispostos sobre os gráficos.
5. Discussão
Discussão
73
5.1 Diferenças na composição celular entre as CTH de MO e de
SCU
Quando avaliamos o perfil imunofenotípico das células, quanto à
expressão dos marcadores CD34 e CD133, vimos que enquanto todas as
células CD133+ expressam o CD34 independente da fonte avaliada (Figura 4),
as células CD34+ presentes na fração mononuclear de MO e SCU, revelaram
uma diferença significante na porcentagem de células que co-expressam o
marcador CD133, com um maior número de células CD133+ entre as CD34+
de SCU (Figura 5). Essas diferenças corroboram o estudo de Wynter e col, que
observou a expressão do marcador CD133 em 35% das células CD34+ de MO,
enquanto no SCU, essa porcentagem foi de 50% (DE WYNTER et al., 1998).
A presença de subpopulações de células-tronco no compartimento
hematopoético, aliada às diferenças na composição celular desse
compartimento, podem contribuir para a diversidade de comportamento das
CTH em diferentes fontes (SIEBURG et al., 2006), como a maior atividade
proliferativa das CTH de fígado fetal comparada as CTH de MO (REBEL et al.,
1996) ou o maior potencial de homing das células CD34+ de SCU comparado
às células CD34+ de MO em ensaios de transmigração (VOERMANS et al.,
1999). Da mesma maneira, diferenças nos resultados de pacientes após o
transplante de CTH de SCU ou de MO, como uma menor incidência da doença
do enxerto contra o hospedeiro (DECH) e uma demora no enxertamento e
restabelecimento de células do sistema imune nos pacientes transplantados
com as CTH dos neonatos (ROCHA et al., 2004), também podem ser
parcialmente explicadas por diferenças na composição celular dos enxertos. No
entanto, a fim de explicar as diferenças funcionais entre as CTH de fontes
Discussão
74
distintas, além da composição celular, devemos considerar as características
moleculares intrínsecas da fonte, como discutiremos mais a frente.
De maneira geral, nossas análises imunofenotípicas, somadas à outros
estudos, refletem uma grande heterogeneidade das células CD34+ de MO,
enquanto as células de SCU apresentam, uma composição celular mais
homogênea, com características mais primitivas (elevada expressão de
CD133).
5.2 Similaridade entre as células CD133+ de MO e as células de
SCU
Após a obtenção dos perfis de expressão gênica das amostras distintas
gerados pelos microarrays, nós realizamos, inicialmente, uma análise de
clusterização a fim de determinar as similaridades e características específicas
entre os grupos propostos (Figura 7). A qualidade das análises dos microarrays
foi verificada pelo estreito agrupamento entre as replicatas experimentais das
amostras CD34+ de MO, refletindo a reprodutibilidade experimental da
plataforma utilizada. Ainda, o agrupamento independente dos perfis de
transcrição de acordo com o marcador (CD34 ou CD133) e fonte (MO ou SCU),
indicou que a estratégia de pools adotada por nós foi capaz de refletir, de modo
geral, as similaridades e diferenças entre as células analisadas.
Uma vez constatada a qualidade e o potencial da técnica de análise
global, nossos resultados revelaram que o estreito agrupamento entre as
amostras CD34+ de SCU e CD133+ de SCU, seguido pelas amostras CD133+
de MO e finalmente pelas CD34+ de MO, pôde indicar que o marcador CD133,
define, de fato, uma subpopulação mais primitiva dentro da população de
Discussão
75
células CD34+ de MO, com características moleculares mais próximas às
células de SCU, ontologicamente mais primitivas.
Enquanto a diferença significante na porcentagem de células CD133+
entre as células CD34+ de ambas as fontes, determinada por nossas análises
imunofenotípicas, explica o agrupamento a parte das amostras CD34+ de MO
(mais heterogênea), o agrupamento preferencial entre as células CD133+ de
SCU com as células CD34+ de SCU, ao invés das próprias células CD133+ de
MO, não é tão óbvio.
5.3 Enriquecimento de células CD133+ após seleção
imunomagnética de células CD34+
Uma vez que a maior parte das células CD133+ são CD34
bright
,
apresentando elevada expressão de CD34, e as células CD34
dim
(que
apresentam baixa expressão de CD34) são CD133 negativas (GALLACHER et
al., 2000; JAATINEN et al., 2006), em tese, o procedimento de seleção
imunomagnética de células CD34+ poderia resultar em um aumento da
porcentagem de células duplo positivas (que expressam ambos os
marcadores), já que as células com um maior número de epítopos CD34
(CD34
bright
) seriam preferencialmente selecionadas. Assim, decidimos avaliar a
expressão do marcador CD133 antes e após o procedimento de seleção
imunomagnética das células CD34+ e vimos que, de fato, o procedimento de
seleção positiva proporcionou um aumento na porcentagem de células CD133+
nas células CD34+ selecionadas tanto de SCU como de MO (Figura 6).
O enriquecimento de células CD133+ após seleção das células CD34+
de SCU observado por nós (de cerca de 66% para de 80%), explica a elevada
Discussão
76
porcentagem relatada em outros estudos (POMYJE et al., 2003; HE et al.,
2005; OKAMOTO et al., 2007) e determina que, apesar do uso de diferentes
marcadores na seleção das células de SCU, as populações obtidas são muito
similares. Assim, essa semelhança imunofenotípica explicaria parcialmente o
agrupamento obtido por nossa análise de clusterização, mais especificamente,
a proximidade entre as amostras CD133+ de SCU e CD34+ de SCU.
Adicionalmente, a separação entre os perfis de expressão de células
CD133+ de MO e SCU, obtidos de amostras altamente homogêneas, indica
que mesmo esta subpopulação de células difere em função da origem. Uma
conclusão em linha com os estudos realizados com células CD34+CD38-,
também definida como uma subpopulação de células mais primitivas (WEEKX
et al., 1998). Mesmo essa subpopulação, possui propriedades distintas
dependendo da idade ontológica (SHOJAEI et al., 2004). Embora outras
subpopulações presentes nas células CD133+ (ou mesmo CD38-) possam ser
responsabilizadas pelas diferenças observadas, o fenótipo de uma determinada
população não é uma característica estática, mas sim, o resultado de uma
sinalização continua entre essas células e seu ambiente, e portanto, fortemente
interconectados e de difícil distinção.
5.4 Fatores de transcrição hiper-expressos nas células CD133+
Com o intuito de identificar mecanismos moleculares relacionados à
maior primitividade das células CD133+, comparamos os perfis de expressão
gênica entre as células CD133+ e as células CD34+ e selecionamos dentre os
genes diferencialmente expressos, todos os fatores de transcrição
Discussão
77
apresentando maior expressão nas células CD133+. Um total de 47 FT foram
encontrados, muitos deles, com papéis bem conhecidos, no surgimento da
hematopoese no embrião e, portanto, relacionados com o proposto potencial
de hemangioblasto destas células. A seguir, apresentamos uma breve
descrição de alguns destes importantes fatores, selecionados e avaliados neste
trabalho.
5.4.1 TAL1
O TAL1, também denominado SCL é membro da família helix-loop-helix
de fatores de transcrição (BEGLEY et al., 1989) e identificado como um dos
principais reguladores da hematopoese nos estágios precoces do
desenvolvimento. A ausência de TAL1 em camundongos ocasionou a morte de
embriões entre os dias E9-10.5 por anemia (SHIVDASANI & MAYER ; ORKIN,
1995) e a diferenciação in vitro de células embrionárias deficientes desse gene
demonstrou o completo bloqueio da hematopoese definitiva revelando que o
gene TAL1 é essencial para o desenvolvimento de todas as linhagens
sanguíneas (PORCHER et al., 1996).
Além da hematopoese definitiva, o TAL1 pode atuar no estabelecimento
da hematopoese primitiva (BEGLEY & GREEN, 1999). Durante a
embriogênese de camundongos, sua expressão precede ou ocorre
paralelamente ao estabelecimento dos sítios hematopoéticos, podendo ser
detectada na mesoderme extra e intra-embrionária no dia E7.5 , nas ilhas de
sangue no saco vitelínico no dia E8.5 e em tecidos hematopoéticos adultos
(KALLIANPUR; JORDAN ; BRANDT, 1994). Em células CD34+ de SCU a
hiperexpressão de TAL1 foi capaz de promover a auto-renovação e aumentar o
Discussão
78
potencial de reconstituição da hematopoese em camundongos irradiados.
Adicionalmente esses resultados mostraram ser dependente da atividade de
ligação desse fator ao DNA (REYNAUD et al., 2005).
Enquanto células originárias do saco vitelínico de embriões deficientes
de TAL1 apresentaram capacidade de originar células hematopoéticas
primitivas ou definitivas, não foram capazes de desenvolver uma rede vascular
primária, indicando o papel principal desse fator de transcrição no
comprometimento hematopoético mas não nos estágios iniciais de
vasculogênese . (BEGLEY et al., 1989; ROBB et al., 1995; SHIVDASANI et al.,
1995) Apesar de não ser essencial para o estabelecimento da linhagem
endotelial, o TAL1 é requerido para a angiogênese embrionária, caracterizada
pela proliferação e remodelamento das células endoteliais pré-existentes no
plexo vascular primário (rede de capilares no saco vitelínico) em um complexo
vascular maduro (VISVADER; FUJIWARA ; ORKIN, 1998). Dessa maneira,
parece atuar na interface entre o desenvolvimento de células hematopoéticas e
vascular com um papel dual tanto na regulação da hematopoese como no
remodelamento e maturação vascular no embrião, conferindo uma possível
função do TAL1 em células com potencial de hemangioblasto (PATTERSON et
al., 2007; JAFFREDO et al., 2005).
5.4.2 RUNX1
Também conhecido como AML1, o RUNX1 possui um papel importante
no estabelecimento da hematopoese definitiva, mas não na primitiva, uma vez
que embriões deficientes de RUNX1 desenvolvem normalmente as ilhas de
sangue no saco vitelínico, mas morrem entre os dias E11 e E12.5. Antes da
Discussão
79
morte, o fígado rudimentar apresenta eritrócitos nucleares primitivos, mas
ausência de células eritróides, mielóides, megacarióides, indicando o bloqueio
da hematopoese definitiva no embrião (OKUDA; VAN; HIEBERT; GROSVELD ;
DOWNING, 1996; WANG et al., 1996).
Apesar da maioria dos trabalhos definirem o papel de RUNX1 no
estabelecimento e expansão do programa hematopoético definitivo, alguns
estudos de expressão gênica sugerem que ele possa atuar em estágios
anteriores do desenvolvimento. Neste sentido, North e col demonstraram a
expressão de RUNX1 em subpopulações de células endoteliais no saco
vitelínico, artérias vitelínica e umbilical e na parede ventral da aorta dorsal
(NORTH et al., 1999). Adicionalmente a expressão desse gene foi detectada
em eritrócitos primitivos emergentes no saco vitelínico. A presença de
transcritos de RUNX1 nesses eritrócitos e em subpopulações de células
endoteliais sugere, assim, a atuação desse gene em estágios precoces do
desenvolvimento. Em linha com essa idéia, Lacaud e col, demonstraram a
funcionalidade do gene RUNX1 em corpos embrióides (EB- embryoid bodies),
células equivalentes ao hemangioblasto in vitro, bem como o papel essencial
do mesmo no comprometimento hematopoético durante a ontogenia (LACAUD
et al., 2002).
5.4.3 Genes HOX
Os genes Hox (homeobox genes) constituem uma família de fatores de
transcrição altamente conservados durante a evolução e são organizados em 4
grupos ou clusters genômicos (A-D) (ARGIROPOULOS& HUMPHRIES, 2007).
Estudos de expressão gênica em amostras de MO, tanto de humanos como de
Discussão
80
camundongos, revelaram que a maioria dos genes HOX dos grupos A, B e C
são expressos em células hematopoéticas, preferencialmente em
subpopulações enriquecidas com CTH mais primitivas, enquanto são
negativamente regulados durante o processo de diferenciação e maturação
(GIAMPAOLO et al., 1994; GIAMPAOLO et al., 1995; MORETTI et al., 1994;
SAUVAGEAU et al., 1994; KAWAGOE; HUMPHRIES; BLAIR; SUTHERLAND ;
HOGGE, 1999; PINEAULT; HELGASON; LAWRENCE ; HUMPHRIES, 2002).
Essas observações levaram à hipótese de que os genes Hox poderiam ter
funções cruciais em CTH mais primitivas, e que a expressão desregulada dos
mesmos poderiam ter impacto em transformações leucêmicas.
No entanto, enquanto inúmeros estudos demonstram o envolvimento
dos genes HOX na regulação da hematopoese, as funções precisas e os
mecanismos regulatórios envolvidos com esses fatores não são tão evidentes
(ARGIROPOULOS & HUMPHRIES, 2007). A fim de elucidar esses
mecanismos, diversos estudos de modificação gênica envolvendo o knockout
(ausência) ou a expressão forçada dos genes Hox em CTH foram
desenvolvidos; de modo que a maioria deles têm destacado o importante papel
desses genes na auto-renovação e expansão das CTH. Entre os principais
envolvidos com essas propriedades, estão os genes Hox encontrados em
nossos estudos: HOXB4 e HOXA9 (ARGIROPOULOS& HUMPHRIES, 2007).
5.4.3.1 HOXB4
A expressão de HOXB4 em células hematopoéticas humanas e murinas
foi detectada em diversos estudos (SAUVAGEAU et al., 1994; PINEAULT;
HELGASON; LAWRENCE; HUMPHRIES, 2002) e a hiperexpressão do mesmo
Discussão
81
ou a distribuição de sua proteína, demonstrou ser suficiente para estimular a
expansão de CTH in vivo e ex vivo sem, no entanto, promover transformação
leucêmica (SAUVAGEAU et al., 1995; ANTONCHUK; SAUVAGEAU ;
HUMPHRIES, 2001; ANTONCHUK; SAUVAGEAU ; HUMPHRIES, 2002;
AMSELLEM et al., 2003; SCHIEDLMEIER et al., 2007.
A expansão das CTH pela expressão constitutiva de HOXB4 pode
ocorrer devido ao aumento da auto-renovação da população de células-tronco
ou pelo aumento da sobrevivência do pool dessas células e pode estar
relacionada à transcrição de alvos específicos, a fim de permitir a manutenção
das características primitivas das CTH (BESLU et al., 2004). De maneira
interessante, a expressão ectópica de HOXB4 confere a células
hematopoéticas primitivas, derivadas do saco vitelínico de camundongos, a
habilidade em reconstituir ambas as linhagens mielóide e linfóide em
recipientes letalmente irradiados, conferindo a esses progenitores um potencial
de CTH definitiva (KYBA; PERLINGEIRO ; DALEY, 2002). No entanto, esses
resultados são controversos, uma vez que a elevada expressão de HOXB4 em
células CD34+ de SCU, levou a uma redução dos progenitores eritróides,
mielóides e linfócitos B in vitro embora tenha promovido, in vivo, um aumento
na capacidade de enxertamento em ensaios de competição (SCHIEDLMEIER
et al., 2003).
5.4.3.2 HOXA9
Considerado o mais expresso dentre os genes HOX no compartimento
hematopoético, o fator de transcrição HOXA9 pode ser o principal determinante
da auto-renovação em CTH (ARGIROPOULOS& HUMPHRIES, 2007). Assim
Discussão
82
como o HOXB4, o HOXA9 é preferencialmente expresso em progenitores
hematopoéticos primitivos e tem sua expressão diminuída durante a
diferenciação dessas células, sugerindo ter um papel funcional importante nos
estágios precoces da hematopoese (SAUVAGEAU et al., 1994; PINEAULT et
al., 2002). De fato, camundongos deficientes de HOXA9 exibem falhas no
desenvolvimento de múltiplas linhagens (LAWRENCE et al., 1997; IZON et al.,
1998) e ensaios de repopulação competitivos, in vivo, revelaram que o principal
defeito apresentado por esses camundongos foi uma diminuição na capacidade
de repopulação após o transplante de CTH de MO. (LAWRENCE et al., 2005).
Por outro lado, a capacidade de reconstituição da hematopoese e o
potencial de expansão das CTH sob elevada expressão de HOXA9, foi
demonstrada em modelo de transplante de MO em camundongos
(THORSTEINSDOTTIR et al., 2002). Esses resultados, somados à expressão
preferencial de HOXA9 em células hematopoéticas primitivas (SAUVAGEAU et
al., 1994) e à redução do número de CTH na ausência de HOXB9
(LAWRENCE et al., 1997), indicam que esse FT possa ser um dos principais
reguladores de CTH mais primitivas (THORSTEINSDOTTIR et al., 2002).
De maneira geral, os genes HOXB4 e HOXA9 têm demonstrado um
importante efeito na expansão das CTH e um possível papel no programa de
transição da hematopoese primitiva para a definitiva. No entanto, os
mecanismos moleculares pelos quais esses genes iniciam ou intensificam o
processo de auto-renovação bem como os potenciais genes alvos envolvidos
ainda necessitam de uma maior elucidação (ARGIROPOULOS& HUMPHRIES,
2007).
Discussão
83
5.4.4 USF1
Os fatores de transcrição USF têm sido considerados reguladores-chave
de um gama de programas de regulação gênica, incluindo resposta imune e ao
estresse, ciclo celular e controle da proliferação (CORRE & GALIBERT, 2005).
De maneira interessante, o USF1 é identificado como um fator de transcrição
estimulador que se liga ao promotor do gene HOXB4 em situações envolvendo
auto-renovação nas CTH (GIANNOLA et al., 2000; ZHU et al., 2003).
5.4.5 GATA-3
Membro da família GATA de fatores de transcrição (WEISS; ORKIN,
1995) e junto com GATA-1 e GATA-2, são predominantemente expressos em
células hematopoéticas. Considerado um fator de transcrição específico de
células Th2, tem uma função primária no controle da diferenciação da
subpopulação linfocitária Th no sistema imune (SZABO; SULLIVAN; PENG;
GLIMCHER, 2003; MOWEN; GLIMCHER, 2004; SAKAGUCHI et al., 2006;
WEAVER; HARRINGTON; MANGAN; GAVRIELI ; MURPHY, 2006). Além de
ser crucial para a diferenciação e função das células Th2, o GATA-3 apresenta
importantes funções regulatórias durante o comprometimento de progenitores
linfóides na linhagem T e em etapas específicas do desenvolvimento tímico
(HENDRIKS et al., 1999; HATTORI; KAWAMOTO; FUJIMOTO; KUNO ;
KATSURA, 1996; TING; OLSON; BARTON ; LEIDEN, 1996). Adicionalmente
tem se atribuído ao GATA-3 um papel na sobrevivência de linfócitos CD4+,
embora esse mecanismo ainda não seja completamente elucidado (HO & PAI,
2007).
Discussão
84
Além do sistema hematopoético, é também expresso em tecidos e
órgãos não hematopoéticos, como o sistema nervoso central, pele, glândulas
mamárias e fígado, durante a embriogênese (OOSTERWEGEL; TIMMERMAN;
LEIDEN ; CLEVERS, 1992; GEORGE et al., 1994; LABASTIE; CATALA;
GREGOIRE ; PEAULT, 1995; DEBACKER; CATALA ; LABASTIE, 1999;
RIVOLTA ; HOLLEY, 1998), cujo papel na ontogenia é enfatizado pela morte
de camundongos deficientes de GATA3 no dia E11.5 (PANDOLFI et al., 1995).
No entanto, o completo mecanismo de ação e os alvos transcricionais,
(que não as citocinas do padrão Th2, tais como IL-5 e IL13) de GATA-3, cujas
funções parece ir além do controle da diferenciação de linfócitos Th2, ainda
permanecem elusivos (KISHIKAWA; SUN; CHOi; MIAW ; HO, 2001; LAVENU-
BOMBLED; TRAINOR; MAKEH; ROMEO ; MAX-AUDIT, 2002; YAMASHITA et
al., 2002;HO & PAI, 2007).
Dessa maneira, enquanto o enriquecimento de todos esses fatores de
transcrição nas células CD133+ per se define mecanismos regulatórios
biologicamente significantes, algumas relações entre eles, descritas na
literatura ou exploradas por nós, contribuem para a melhor compreensão do
controle genético envolvido na manutenção de um estado mais primitivo das
CTH.
5.5 Análise de promotores e a participação da via NFκB
Com o objetivo de compreender os mecanismos regulatórios envolvidos
no controle dos fatores de transcrição encontrados hiper-expressos nas células
CD133+, realizamos uma busca por sítios de ligação (binding sites, BS) para
Discussão
85
FT nos promotores desse conjunto de genes. O resultado dessa análise
revelou uma frequência e incidência de BS, significantemente maior do que o
esperado, para os fatores da via NF-kB,.incluindo como potenciais alvos de
NFB os fatores RUNX1, GATA3 e USF1.
A participação da via de sinalização NFB, especialmente a maior
ativação da via não canônica (mediada pelas subunidades NFB2 e RELB) nas
células CD34+ de SCU, quando comparadas às células CD34+ de MO, já havia
sido anteriormente descrita por Panepucci e col, que destacou a possível
relação da mesma com os estados mais primitivos das CTH dos neonatos.
(PANEPUCCI et al., 2007). Em linha com o trabalho anterior, no presente
estudo, a via NFB aparece com um potencial papel regulatório na transcrição
de importantes FT encontrados em níveis elevados nas células CD133+.
5.6 Avaliação dos transcritos por PCR em tempo real e análise
de correlação
A avaliação dos níveis de expressão de RUNX1, GATA3, USF1, TAL1,
HOXA9 e HOXB4 por PCR em tempo real nas amostras utilizadas para a
confecção dos pools e em amostras adicionais, permitiu a validação dos
resultados obtidos pela técnica de microarray.
Consistente com o proposto papel de NFB no envolvimento com um
estado mais primitivo das CTH (PANEPUCCI et al., 2007), as amostras
CD133+ de MO apresentaram maiores níveis de NFB2 e RELB do que as
amostras CD34+ de MO. Ainda, as amostras de SCU apresentaram níveis
significativamente maiores desses transcritos quando comparadas com as de
Discussão
86
MO, para ambas populações (CD34+ e CD133+), exceto para NFB2 quando
comparado entre as células CD133+ de MO e SCU (p=0.0992). Assim, mesmo
as subpopulações CD133+ consideradas mais homogêneas e primitivas,
revelaram uma influência do microambiente do SCU em seu padrão de
expressão gênica.
Fortes evidências sugerem que maiores níveis de NOTCH1 em CTH
mais primitivas, podem estar relacionado à via de sinalização NF-kB. Por
exemplo, NOTCH1 facilita a retenção nuclear dos complexos de NF-kB (SHIN
et al., 2006) e uma grande quantidade de estudos indicam uma ativação
coordenada da sinalização de NOTCH e NFB em processos patológicos e
normais (RAMDASS et al., 2007; WANG; ZHANG; BANERJEE; LI; SARKAR,
2006; WANG et al., 2006. Esses achados nos levaram a investigar os níveis
de NOTCH1 nos grupos de células estudados.
A quantificação de todos os transcritos dos fatores de transcrição
mencionados, por PCR em tempo real, em um grande número de amostras
independentes, nos permitiu avaliar a significância estatística da correlação
entre os mesmos e, posteriormente, explorar potenciais mecanismos
regulatórios envolvidos no programa genético das CTH.
Desde que NFB2 e RELB agem em conjunto (sob a forma de
dímeros) para regular a transcrição de seus alvos, dentre eles o próprio
RELB, a sua elevada correlação (r=0.88) era esperada (BREN et al., 2001).
No entanto, dentre todos os fatores de transcrição, NOTCH1 foi o transcrito
mais correlacionado com os demais, incluindo GATA3 (r=0.83), RELB
(r=0.8) e NFB2 (r=0.71), sugerindo ter uma participação importante na
regulação transcricional desses genes. A estatística significante (P<0.0001)
Discussão
87
e o alto coeficiente de correlação (r>0.7) encontrado entre os transcritos de
NOTCH1, RELB e NFB2 pode refletir a up-regulação dos transcritos das
subunidades de NF-kB por NOTCH1 (CHENG et al., 2001) bem como o
mecanismo de de-repressão do promotor de NFB2 mediado por NOTCH1
(NAKAZAWA et al., 2001; OSWALD et al., 1998). Interessantemente,
trabalhos publicados durante o curso do presente estudo, descreveram a
direta regulação de GATA3 por NOTCH1, o que pode contar para a forte
correlação entre esses fatores encontradas por nós. (AMSEN et al., 2007;
FANG et al., 2007; KUBO, 2007).
Apesar da conhecida regulação de GATA3 por NOTCH1, nossa análise
de promotores revelou a existência de BS para fatores da via NFB no
promotor de GATA3, bem como de RUNX1 e USF1, os quais poderiam ser
novos alvos transcricionais de NFB. A avaliação de RUNX1, GATA3 e USF1
por PCR em tempo real confirmaram os níveis mais elevados desses
transcritos nas células CD133+ de MO, comparadas ás células CD34+ de SCU
(seguindo o mesmo padrão de NFB2 e RELB).
De maneira interessante, NOTCH1 e RUNX1 também apresentaram
altamente correlacionados entre si (r=0.79), em linha com a proposta regulação
de RUNX1 por NOTCH1 (BURNS; TRAVER; MAYHALL; SHEPARD ; ZON,
2005; KUMANO et al., 2003).
Adicionalmente, a elevada correlação dos transcritos de RUNX1 com
GATA3 (0.80) e também de RUNX1 com TAL1 (r = 0.60) observada por nós,
corrobora a recente descrição da regulação de RUNX1 por TAL1 e por
membros da família GATA (NOTTINGHAM et al., 2007; LANDRY et al.,
2008).
Discussão
88
As células de SCU apresentaram uma expressão dos transcritos de
TAL1 e RUNX1 significativamente maior, quando comparadas às células de
MO, para ambas as populações, CD133+ e CD34+. No entanto, os
transcritos de TAL1 não apresentarem diferenças entre as amostras de
CD34+ de MO e CD133+ de MO, embora os elevados níveis de TAL1 nas
células CD133+ de SCU tenham contribuído para as diferenças encontradas
nos microarrays na comparação entre as amostras CD133+ e as amostras
de CD34+ (figura 10).
Enquanto a maioria dos transcritos apresentaram níveis de expressão
significativamente maior nas células CD133+ de MO, comparados às células
CD34+ de MO, somente USF1, HOXB4 e HOXA9 seguiram o mesmo padrão
nas células de SCU, ou seja, apresentaram-se significativamente mais
elevados nas células CD133+ de SCU quando comparadas às células CD34+
de SCU. Assim, apesar das populações celulares selecionadas por ambos os
marcadores (CD34 e CD133) no SCU serem muito semelhantes, os fatores
USF1, HOXB4 e HOXA9 assumem um padrão de expressão distinto,
determinado pelo fenótipo celular.
Nossos resultados corroboram outros estudos que demonstram a
regulação de HOXB4 por USF1 (GIANNOLA et al., 2000; ZHU et al., 2003) e
acrescenta que, considerando a maior correlação entre USF1 com HOXA9
do que entre USF1 e HOXB4 (r = 0.69 e 0.53, respectivamente), bem como
entre ambos os genes HOX com RUNX1, GATA3 e NOTCH1 e, finalmente,
entre HOXB4 e TAL1 (0.71), outros fatores, além do USF1, poderiam tem
importantes papéis na regulação de HOXB4 nas CTH. No entanto, é
importante ressaltar que a correlação entre os transcritos pode evidenciar
Discussão
89
tanto a regulação de um fator de transcrição pelo outro, ou vice-versa, como
de ambos por um terceiro fator que estaria acima (ou up-stream) dos
mesmos.
5.7 Evidências de uma potencial rede de regulação
transcricional nas CTH
A revelação de elevadas correlações entre todos os FT avaliados,
aliadas às recentes descrições da regulação entre alguns desses fatores
apresentados pela literatura, somam evidências para a existência de uma rede
de regulação transcricional interconectando importantes FT relacionados às
características mais primitivas das CTH. As corregulações entre esses fatores
poderiam ser parcialmente responsáveis pela manutenção de um estado mais
primitivo das células CD133+ e das células de SCU em geral (Figura 15).
Discussão
90
Figura 15: Rede de regulação gênica interconectando diferentes fatores de transcrição
relacionados à primitividade das CTH. As ligações entre os fatores de transcrição propostas
é baseada na análise de correlação entre os níveis de expressão dos transcritos avaliados.
Desse modo, as setas em violeta e com único sentido, representam as regulações que
corroboram a literatura, enquanto as setas em cinza, de mão dupla, representam as co-
regulações evidenciadas por nossos resultados, de modo que o sentido da regulação, bem
como a possibilidade de ambos os fatores ligados, serem regulados por um terceiro fator,
necessitam de maior investigação.
6. Conclusões
Conclusões
92
Em nosso trabalho, comparamos subpopulações distintas de CTH
definidas pela expressão dos marcadores de superfície clássicos: CD34 e
CD133. A caracterização da composição celular das CTH de SCU e MO,
baseadas na expressão desses marcadores, revelou uma maior
heterogeneidade das células CD34+ de MO quando comparadas às células
CD34+ de SCU, as quais apresentam uma composição mais homogênea e
primitiva, como um todo (maior porcentagem de células CD133+).
O marcador CD133, foi capaz de definir uma subpopulação de células
mais primitivas na MO, com características moleculares mais próximas às
células de SCU. No entanto, mesmo essa população de células mais primitivas
(CD133+) apresentaram diferenças no perfil transcricional entre MO e SCU,
refletindo, assim, características moleculares intrínsecas relacionadas à fonte
de origem. Essas características estariam intimamente ligadas ao fenótipo da
população, sendo este o resultado de uma sinalização contínua entre as
células e o seu ambiente (MO ou SCU).
A comparação dos perfis de expressão gênica entre as células CD133+
e as células CD34+, revelou elevados níveis de importantes fatores de
transcrição relacionados à primitividade das CTH nas células CD133+, dentre
os quais, potenciais alvos da via NFB. Nossos resultados confirmam a
importância de NFB na primitividade das CTH, uma vez que seus níveis se
encontraram elevados não apenas em células ontogeneticamente mais
primitivas (como as do cordão umbilical), mas também, em células adultas mais
primitivas, com base em seu fenótipo (CD133+). A correlação positiva
significante entre NFB, NOTCH1 e os demais fatores de transcrição avaliados,
evidenciam uma potencial co-regulação entre os mesmos nas CTH. Assim, a
Conclusões
93
maior porcentagem de células primitivas no SCU, e consequentemente, a
maior primitividade deste, seriam, o resultado de mecanismos regulatórios
coordenados por níveis mais elevados de diferentes fatores transcricionais,
entre eles, os destacados neste trabalho.
Em suma nossos resultados inferem a existência de uma rede
transcricional altamente interconectada, caracterizada pela expressão
coordenada de NOTCH, NFB e outros importantes fatores de transcrição. O
potencial mecanismo regulatório proposto no presente estudo contribui, assim,
com os esforços atuais para a compreensão dos programas genéticos
responsáveis pela manutenção da primitividade das CTH e serve como base
para futuros estudos funcionais, a fim de validar os mecanismos de regulação e
os alvos transcricionais específicos de cada um dos fatores apresentados.
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Apêndices
Apêndices
109
APÊNDICE A: Fatores de transcrição hiper-expressos nas
células CD133+ quando comparadas às células CD34+
gene UniGene Descrição CD34+ CD133+ *Fold
LHX2 Hs.445265 LIM homeobox 2 0,03 0,10 3,84
KLF2 Hs.107740 Kruppel-like factor 2 (lung) 1,95 7,36 3,77
GATA3 Hs.524134 GATA binding protein 3 0,87 3,19 3,65
LZTS1 Hs.521432 leucine zipper, putative tumor
suppressor 1
0,04 0,13 3,53
CTNNA2 Hs.167368 catenin (cadherin-associated
protein), alpha 2
0,03 0,11 3,53
MXI1 Hs.501023 MAX interactor 1 0,34 1,20 3,48
SALL1 Hs.135787 sal-like 1 (Drosophila) 0,04 0,14 3,39
PRRX2 Hs.555950 paired related homeobox 2 0,05 0,16 3,17
E4F1 Hs.513268 E4F transcription factor 1 0,04 0,13 3,14
HSF1 Hs.530227 heat shock transcription factor 1 0,05 0,13 2,75
JUND Hs.2780 jun D proto-oncogene 0,35 0,94 2,65
USF1 Hs.414880 upstream transcription factor 1 1,12 2,90 2,59
CBFA2T3 Hs.513811 core-binding factor, runt domain,
alpha subunit 2; translocated to, 3
0,83 2,12 2,55
ZNF217 Hs.518805 zinc finger protein 217 0,63 1,60 2,54
HMGA1 Hs.518805 high mobility group AT-hook 1 0,40 1,02 2,53
ID4 Hs.519601 inhibitor of DNA binding 4,
dominant negative helix-loop-
helix protein
0,37 0,85 2,31
MEF2D Hs.314327 MADS box transcription enhancer
factor 2, polypeptide D (myocyte
enhancer factor 2D)
0,54 1,21 2,26
DLX2 Hs.419 distal-less homeo box 2 0,12 0,28 2,24
ZHX3 Hs.380133 zinc fingers and homeoboxes 3 0,37 0,79 2,13
JUP Hs.514174 junction plakoglobin 15,99 33,80 2,11
TEAD1 Hs.546308 TEA domain family member 1
(SV40 transcriptional enhancer
factor)
0,77 1,56 2,03
ZFP36 Hs.534052 zinc finger protein 36, C3H type,
homolog (mouse)
36,46 73,67 2,02
FOXG1B Hs.525266 forkhead box G1B 0,16 0,31 2,00
PAX5 Hs.126365 paired box gene 5 (B-cell lineage
specific activator)
2,16 4,23 1,96
EP300 Hs.517517 E1A binding protein p300 3,19 5,92 1,86
MSRB Hs.461420 methionine sulfoxide reductase B 7,75 14,31 1,85
ZNF148 Hs.380334 zinc finger protein 148 (pHZ-52) 0,62 1,12 1,81
TIEG2 Hs.12229 TGFB inducible early growth
response 2
1,91 3,35 1,76
HOXB4 Hs.532669 homeo box B4 1,43 2,43 1,70
GLI3 Hs.199338 GLI-Kruppel family member GLI3 0,24 0,40 1,68
DDIT3 Hs.505777 DNA-damage inducible transcript
3
3,72 6,16 1,66
SALL2 Hs.416358 sal-like 2 (Drosophila) 0,53 0,86 1,62
SRF Hs.520140 serum response factor 0,40 0,64 1,59
RUNX1 Hs.149261 runt-related transcription factor 1 2,31 3,64 1,58
Apêndices
110
(acute myeloid leukemia 1; aml1
oncogene)
HOXC6 Hs.820 homeo box C6 0,74 1,16 1,56
SNFT Hs.62919 Jun dimerization protein
p21SNFT
0,41 0,63 1,53
CSDA Hs.221889 cold shock domain protein A 3,33 5,10 1,53
POU3F1 Hs.1837 POU domain, class 3,
transcription factor 1
7,86 11,98 1,53
PRDM1 Hs.436023 PR domain containing 1, with
ZNF domain
1,47 2,22 1,51
HOXA9 Hs.127428 homeo box A9 0,52 0,78 1,49
ATF6 Hs.492740 activating transcription factor 6 10,97 16,27 1,48
WBSCR14 Hs.520446 Williams Beuren syndrome
chromosome region 14
2,33 3,40 1,46
PML Hs.526464 promyelocytic leukemia 0,56 0,81 1,44
TAL1 Hs.73828 T-cell acute lymphocytic leukemia
1
3,17 4,24 1,34
PAX6 Hs.591993
paired box gene 6 (aniridia,
keratitis)
0,81 1,08 1,33
ZNF278 Hs.517557 zinc finger protein 278 1,40 1,85 1,32
PBX2 Hs.509545 pre-B-cell leukemia transcription
factor 2
10,53 13,57 1,29
Os valores correspondem á média dos valores de expressão obtidos nos microarrays de
cada tipo celular e estão ordenados em ordem decrescente de Fold.
*Fold=razão CD133+/CD34+.
Apêndices
111
APÊNDICE B: P valores obtidos da análise estatística entre os diferentes grupos.
NOTCH1 RELB NFΚB2 GATA3 RUNX1 USF1 TAL1 HOXA9 HOXB4
CD34+BM Vs CD133+BM
p<0.0001 p=0.0103 p=0.0092 p<0.0001 p=0.024 p=0.0033 Ns p=0.0004 p=0.0379
CD34+BM Vs CD34+UCB
p<0.0001 p<0.0001 p<0.0001 p<0.0001 p<0.0001 Ns p=0.0438 p=0.0004 p=0.0012
CD34+BM Vs CD133+UCB
p<0.0001 p<0.0001 p<0.0001 p<0.0001 p<0.0001 p=0.0003 p=0.0276 p<0.0001 p<0.0001
CD133+BM Vs CD34+UCB
Ns p=0.0013 p=0.0076 Ns p=0.0128 p=0.0108 Ns Ns Ns
CD133+BM Vs CD133+UCB
p=0.0024 p<0.0001 Ns Ns p=0.0423 Ns p=0.0295 Ns p=0.01
CD34+UCB Vs CD133+UCB
Ns Ns Ns Ns Ns p=0.0012 Ns p=0.0143 p=0.0133
Valores obtidos de teste não-paramétrico de Mann-Whitney com uma cauda.
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