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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
FACULDADE DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA
Estudos pré-clínicos do efeito gastroprotetor da mangiferina,
uma glicosilxantona isolada de Mangifera indica L., em
modelos experimentais de lesão gástrica aguda
ANA CARLA DA SILVA CARVALHO
FORTALEZA-CE
2008
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Ana Carla da Silva Carvalho
Estudos pré-clínicos do efeito gastroprotetor da mangiferina,
uma glicosilxantona isolada de Mangifera indica L., em
modelos experimentais de lesão gástrica aguda
Dissertação apresentada ao Programa
de Pós-Graduação em Farmacologia da
Universidade Federal do Ceará como
requisito parcial para obtenção do título
de Mestre em Farmacologia.
Orientador:
Prof. Dr. Vietla Satyanarayana Rao
2008
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Ana Carla da Silva Carvalho
Estudos pré-clínicos do efeito gastroprotetor da mangiferina,
uma glicosilxantona isolada de Mangifera indica L., em
modelos experimentais de lesão gástrica aguda
Esta dissertação foi submetida como
parte dos requisitos necessários à
obtenção do grau de Mestre em
Farmacologia, outorgado pela
Universidade Federal do Ceará, e
encontra-se à disposição dos
interessados na Biblioteca setorial da
referida Universidade.
A citação de qualquer trecho desta
dissertação é permitida, desde que
realizada de acordo com as normas
da ética científica.
Data da aprovação: 30 de janeiro de 2008
BANCA EXAMINADORA
______________________________________________
Prof. Dr. Vietla Satyanarayana Rao (Orientador)
Universidade Federal do Ceará
______________________________________________
Prof. Dr. Aldo Ângelo Moreira Lima
Universidade Federal do Ceará
______________________________________________
Profa. Drª. Maria Teresa Salles Trevisan
Universidade Federal do Ceará
A Deus, pela proteção e bênçãos
concedidas
À minha mãe Maria do Carmo,
meus irmãos Júnior e Ricardo, ao
meu amore Thiago Costa, e à
minha princesa Ana Carollina,
pelo amor e apoio incondicional.
AGRADECIMENTOS
Ao Prof. Dr. Vietla Satyanarayana Rao pela confiança em mim
depositada, pela orientação, incentivo e amizade durante a realização deste
trabalho. Meu muito obrigada.
Às Profas. Dras. Maria Tereza Trevisan e Antonia Lúcia pelo
fornecimento da mangiferina, a base de realização deste trabalho.
À Profa. Dra. Flávia Almeida Santos pela colaboração em muitos
momentos.
A todos os professores do departamento de Fisiologia e Farmacologia
da Faculdade de Medicina da UFC, pelos ensinamentos transmitidos.
Aos meus amigos da Pós-graduação Alana Fonteles, Cinthya Iamille,
Caroline Mourão, Deive Campos, Iana Bantim, Danilo Gonçalves, Tiago Olinda,
Otacílio Deocleciano, em especial a Marjorie Guedes e Silvéria Lira pela
amizade e parceria durante os experimentos.
Aos bolsistas do Laboratório de Produtos Naturais Daniel, Patrícia,
Rafaela, Rhandell, Sâmia, Saulo e Tiago pelo auxílio e amizade demonstrados
nestes meses de convívio saudável e proveitoso.
Ao amigo Roberto César pela amizade e inestimável ajuda no início do
curso.
A minha querida professora e amiga Drª Rosilene Moretti Marçal (UFS),
que mesmo distante não deixou de me incentivar.
Aos funcionários do Departamento de Fisiologia e Farmacologia, Aura,
Chiquinho, Edmílson, Fernando, Íris e Joana.
Ao CNPq, pelo apoio financeiro;
Enfim, a todos que direta ou indiretamente contribuíram para a
realização desse trabalho.
"Não deixe que a saudade sufoque, que a
rotina acomode, que o medo impeça de
tentar. Desconfie do destino e acredite em
você. Gaste mais horas realizando que
sonhando, fazendo que planejando, vivendo
que esperando porque, embora quem
quase morre esteja vivo, quem quase vive
já morreu.”
(Luís Fernando Veríssimo)
SUMÁRIO
Lista de Abreviaturas
Lista de Tabelas
Lista de Figuras
RESUMO
ABSTRACT
1.INTRODUÇÃO 21
1.1. Plantas Medicinais 21
1.1.1. Plantas Medicinais e Gastroproteção 22
1.2. Xantonas 34
1.3. Mangifera indica Linn.
36
1.4. Mangiferina 39
1.5. Fisiologia Gastrintestinal 23
1.5.1. Fisiologia da Secreção Gástrica 24
1.5.2. Mecanismos de Defesa da Mucosa Gástrica 25
1.6. Doença Ulcerosa Péptica 29
2. JUSTIFICATIVA E OBJETIVOS 42
2.1. Justificativa 42
2.2. Objetivos 44
3. MATERIAL 46
3.1. Material Botânico 46
3.2. Animais Experimentais 46
3.3. Drogas e Reagentes 47
3.4. Equipamentos 48
4. MÉTODOS 49
4.1. Obtenção da mangiferina 49
4.2. Lesão gástrica induzida por etanol 51
4.2.1. Estudo do envolvimento dos neurônios aferentes primários sensíveis
à capsaicina
51
4.2.2. Estudo do envolvimento do óxido nítrico 52
4.2.3. Estudo do envolvimento das prostaglandinas 53
4.2.4. Estudo do envolvimento dos canais de potássio ATP-dependentes
53
4.2.5. Estudo da ação sobre os grupos sulfidrilas não protéicos (NP-SH) 54
4.2.6 Avaliação da peroxidação lipídica: dosagem de malonildealdeído
(MDA)
55
4.3. Lesão gástrica induzida por etanol acidificado 56
4.4. Lesão gástrica induzida por indometacina 57
4.5. Lesão gástrica induzida pelo composto 48/80 58
4.6. Atividade antisecretória gástrica 59
4.7. Esvaziamento gástrico 59
4.8. Análise estatística 60
5. RESULTADOS 61
5.1. Obtenção da mangiferina 61
5.2. Efeito protetor da mangiferina na lesão gástrica induzida por etanol 61
em camundongos
5.2.1. Efeito gastroprotetor da mangiferina na lesão gástrica induzida por
etanol: papel dos neurônios aferentes primários sensíveis à capsaicina
65
5.2.2. Efeito gastroprotetor da mangiferina na lesão gástrica induzida por
etanol: papel do óxido nítrico
68
5.2.3. Efeito gastroprotetor da mangiferina na lesão gástrica induzida por
etanol: participação das prostaglandinas
68
5.2.4. Efeito gastroprotetor da mangiferina na lesão gástrica induzida por
etanol: papel dos canais de potássio ATP - dependentes
73
5.2.5. Efeito gastroprotetor da mangiferina na lesão gástrica induzida por
etanol: papel dos grupos sulfidrilas não protéicos (NP-SH) gástricos
73
5.2.6 Efeito gastroprotetor da mangiferina na lesão gástrica induzida por
etanol: ação sobre a peroxidação lipídica
78
5.3. Efeito da mangiferina na úlcera gástrica induzida por etanol acidificado
em camundongos
81
5.4. Efeito da mangiferina sobre as úlceras gástricas induzidas por
indometacina em camundongos
84
5.5. Efeito da mangiferina sobre a lesão gástrica induzida pelo composto
48/80 em camundongos
87
5.6. Efeito da mangiferina sobre a secreção gástrica no modelo de ligação
do piloro em ratos
90
5.7. Efeito da mangiferina sobre o esvaziamento gástrico em ratos 94
6. DISCUSSÃO 97
7. CONCLUSÕES 109
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 111
9. ANEXO – ARTIGO PUBLICADO 131
LISTA DE ABREVIATURAS
% Percentagem
± Mais ou menos
® Marca registrada
µg Micrograma
5-HT Serotonina
5-HT4 Receptores serotoninérgicos do tipo 4
AINES Antiinflamatórios não-esteroidais
AMPc Adenosina Monofosfato cíclico
ANOVA Análise de variância
ATP Adenosina trifosfato
Ca
2+
Íon cálcio
CEPA Comitê de Ética em Pesquisa Animal
CGRP Peptídio Relacionado ao Gene da Calcitonina
CLAE Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
cNOS Óxido nítrico sintase constitutiva
COX Ciclooxigenases
COX-1 Ciclooxigenase tipo 1
COX-2 Ciclooxigenase tipo 2
COX-3 Ciclooxigenase tipo 3
Da Daltons
DL
50
Dose letal 50%
DMSO Dimetilfulfóxido
DNA Ácido desoxiribonucleico
E.P.M. Erro padrão da média
EDTA Ácido Etilenodiaminotetraacético sal dissódico
eNOS Óxido nítrico sintase endotelial
EP3 Receptor prostanóide tipo 3
ERO Espécies reativas de oxigênio
et al. ...e colaboradores
g Grama
G
i
Proteína G inibitória
GSH Glutationa reduzida
h Hora
H
+
, K
+
-ATPase Bomba de prótons
HCl Ácido clorídrico
i.p. Intraperitoneal
IgE Imunoglobulina E
iNOS Óxido nítrico sintase induzível
IV Infravermelho
K
ATP
Canais de potássio sensíveis a ATP
KCl Cloreto de potássio
kg Quilograma
L Litros
L-NAME
N
G
-nitro-L-arginina-metilester
M Molar
M
3
Receptor muscarínico tipo 3
MDA Malonildealdeído
MeOH Metanol
mg Miligrama
min. Minuto
mL Mililitro
mm
2
Milímetros quadrados
NAC N-acetilcisteína
NaOH Hidróxido de sódio
NK
2
Receptor taquicininas tipo 2
nm Nanômetros
nmoles Nanomoles
nNOS Óxido nítrico sintase neuronal
NO Óxido nítrico
NOS Óxido nítrico sintase
NP-SH Grupos sulfidrílicos não-protéicos
o
C Grau centígrado
p Nível de significância
P.A. Para análise
PGE
2
Prostaglandina E
2
PGI
2
Prostaciclina
PGs Prostaglandinas
PKA Proteína Kinase A
PKC Proteína Kinase C
RMN Ressonância Magnética Nuclear
rpm Rotações por minuto
s.c. Sub-cutâneo
SNC Sistema Nervoso Central
SNE Sistema Nervoso Entérico
SST Somatostatina
TBA Ácido tiobarbitúrico
TCA Ácido tricloroacético
TGI Trato gastrintestinal
TNB Ácido trinitrobenzeno sulfônico
TRPV1 Canal de potencial transiente tipo vanilóide subtipo 1
U.S.A. United States of America
UV Ultravioleta
v.o. Via oral
vs Versus
α Alfa
β Beta
δ Delta
µL Microlitro
µM Micromolar
LISTA DE TABELAS
TABELA PÁGINA
TABELA 1. Efeito da mangiferina e N-acetilcisteína (NAC) no
modelo de úlcera gástrica induzida por etanol em
camundongos.
63
TABELA 2. Efeito da capsazepina na proteção gástrica da
mangiferina no modelo de úlcera gástrica induzida
por etanol em camundongos.
66
TABELA 3. Efeito do L-NAME na gastroproteção da mangiferina
no modelo de úlcera gástrica induzida por etanol em
camundongos.
69
TABELA 4. Efeito da indometacina na gastroproteção da
mangiferina no modelo de úlcera gástrica induzida
por etanol em camundongos.
71
TABELA 5. Efeito da glibenclamida na gastroproteção da
mangiferina no modelo de úlcera gástrica induzida
por etanol em camundongos.
74
TABELA 6. Efeito da mangiferina e N-acetilcisteína (NAC) sobre
os níveis de grupos sulfidrilas não protéicos (NP-SH)
no modelo de úlcera gástrica induzida por etanol em
camundongos.
76
TABELA 7. Efeito da mangiferina e N-acetilcisteína (NAC) sobre
os níveis de malonildealdeído no modelo de úlcera
gástrica induzida por etanol em camundongos.
79
TABELA 8. Efeito da mangiferina e lansoprazol no modelo de 82
úlcera gástrica induzida por etanol acidificado em
camundongos.
TABELA 9. Efeito da mangiferina e lansoprazol no modelo de
úlcera gástrica induzida por indometacina em
camundongos.
85
TABELA 10. Efeito da mangiferina e ciproheptadina no modelo de
lesão gástrica induzida pelo composto 48/80 em
camundongos.
88
TABELA 11. Efeito da mangiferina e cimetidina sobre o volume
secretório gástrico e acidez gástrica total em ratos
com piloro ligado.
91
TABELA 12. Efeito da mangiferina e atropina sobre o
esvaziamento gástrico em ratos.
95
LISTA DE FIGURAS
FIGURA PÁGINA
FIGURA 1. Estrutura básica das xantonas. 24
FIGURA 2.
Mangifera indica L.
27
FIGURA 3. Estrutura química da mangiferina. 29
FIGURA 4. Mecanismos de defesa e injúria da mucosa gástrica. 38
FIGURA 5. Efeito da mangiferina e N-acetilcisteína (NAC) nas
lesões gástricas induzidas por etanol em
camundongos.
64
FIGURA 6. Efeito da capsazepina na gastroproteção da
mangiferina à lesão gástrica induzida por etanol
absoluto em camundongos.
67
FIGURA 7. Efeito do L-NAME na proteção gástrica da
mangiferina à lesão gástrica induzida por álcool em
camundongos.
70
FIGURA 8. Efeito da indometacina na gastroproteção da
mangiferina à lesão gástrica induzida por etanol
absoluto em camundongos.
72
FIGURA 9. Efeito do tratamento com glibenclamida na proteção
da mangiferina frente às lesões gástricas induzidas
por etanol absoluto em camundongos.
75
FIGURA 10.
Efeito da mangiferina e N-acetilcisteína (NAC) sobre
os níveis de grupos sulfidrilas não protéicos nas
lesões gástricas induzidas por etanol em
camundongos.
77
FIGURA 11.
Efeito da mangiferina e N-acetilcisteína (NAC) sobre
os níveis de malonildealdeído nas lesões gástricas
induzidas por etanol em camundongos.
80
FIGURA 12.
Efeito da mangiferina e lansoprazol nas lesões
gástricas induzidas por etanol acidificado em
camundongos.
83
FIGURA 13.
Efeito da mangiferina e lansoprazol sobre a úlcera
gástrica induzida por indometacina em
camundongos.
86
FIGURA 14.
Efeito da mangiferina e ciproheptadina sobre a lesão
gástrica induzida pelo composto 48/80 em
camundongos.
89
FIGURA 15.
Efeito da administração intraduodenal mangiferina e
cimetidina no volume secretório gástrico em ratos.
92
FIGURA 16.
Efeito da administração intraduodenal da mangiferina
e cimetidina na acidez total gástrica em ratos.
93
FIGURA 17.
Efeito da mangiferina e atropina sobre o
esvaziamento gástrico em ratos.
96
RESUMO
Estudos pré-clínicos do efeito gastroprotetor da mangiferina, uma
glicosilxantona isolada de Mangifera indica L., em modelos experimentais
de lesão gástrica aguda. Autora: Ana Carla da Silva Carvalho. Orientador:
Prof. Dr. Vietla Satyanarayana Rao. Dissertação de Mestrado. Programa de
Pós-Graduação em Farmacologia. Departamento de Fisiologia e Farmacologia.
Universidade Federal do Ceará, 2008.
Mangiferina, uma glicosilxantona isolada da árvore frutífera Mangifera
indica L. (Anacardiaceae), foi avaliada em modelos experimentais de lesão
gástrica aguda. Mangiferina (3, 10 e 30 mg/kg, v.o.) atenuou significativamente
(p<0,001) as lesões gástricas induzidas por etanol (30, 35 e 63% de redução),
etanol acidificado (27, 44 e 78% de inibição), indometacina (22, 23 e 57% de
redução) e composto 48/80. Esta xantona (30 mg/kg) foi capaz de diminuir de
forma significativa (p<0,01) a depleção dos grupos sulfidrilas não-proteicos e o
aumento nos níveis de malonildealdeído, associados à administração de
etanol. O pré-tratamento com o antagonista dos receptoes TRPV1 capsazepina
(5 mg/kg, i.p.) não foi capaz de reverter (p>0,05) o efeito gastroprotetor da
mangiferina (30 mg/kg) frente às lesões induzidas por etanol. Adicionalmente, o
efeito da mangiferina foi significativamente reduzido (p<0,01) em camundongos
pré-tratados com indometacina, L-NAME e glibenclamida. Mangiferina (30
mg/kg) causou diminuição significativa (p<0,001) do volume secretório e da
acidez total gástrica e aumentou significativamente (p<0,001) o esvazimento
gástrico em ratos. Os resultados do presente estudo indicam uma ação
citoprotetora da mangiferina conferindo efeito gastroprotetor contra injúria
gástrica induzida por diversos agentes, que pode ser atribuído, ao menos em
parte, às prostaglandinas endógenas, liberação de óxido nítrico, abertura de
canais de potássio sensíveis a ATP e ação antioxidante.
Palavras-chave: Anacardiaceae, Mangifera indica, Xantonas, Úlcera Gástrica.
ABSTRACT
Pre-clinical study of gastroprotective effect of mangiferin, a
glucosylxanthone from Mangifera indica L., in experimental models of
acute gastric mucosal injury. Author: Ana Carla da Silva Carvalho. Advisor:
Prof. Dr. Vietla Satyanarayana Rao. Master’s thesis. Post-Graduate Program in
Pharmacology. Department of Physiology and Pharmacology, UFC, 2008.
Mangiferin, a glucosylxanthone from the fruiting tree Mangifera indica Linn.
(Anacardiaceae), was evaluated for the first time in acute models of gastric
injury. Mangiferin (3, 10 and 30 mg/kg, p.o.) significantly attenuated (p<0,001)
the gastric damage induced by ethanol (30, 35 and 63% of reduction), acidified
ethanol (27, 44 and 78% of inhibition), indomethacin (22, 23 and 57% of
reduction) and compound 48/80. This xanthonoid (30 mg/kg) markedly
attenuated (p<0,01) the depletion of gastric mucosal non-protein sulfhydryl and
the increase of malonyldialdehyde levels ethanol associated. While
pretreatment with TRPV1 antagonist capsazepine (5 mg/kg, i.p.) failed to block
effectively (p>0,05) the gastroprotective effect of mangiferin (30 mg/kg) against
ethanol damage. Furthermore, the mangiferin effect was significantly (p<0,01)
reduced in mice pretreated with indomethacin, L-NAME and glibenclamide.
Mangiferin (30 mg/kg) caused significant diminutions (p<0,001) in gastric
secretory volume and total acidity and significantly enhanced (p<0,001) gastric
emptying in rats. Taken together, the results of this study strongly indicate a
cytoprotective role for mangiferin affording gastroprotection against gastric
damage induced by various ulcerogens, which is possibly mediated, in part, by
endogenous prostaglandins, nitric oxide release, K
+
ATP
channel opening and
antioxidant action.
Key words: Anacardiaceae, Mangifera indica, Xantonas, Úlcera Gástrica.
21
1. INTRODUÇÃO
1.1. PLANTAS MEDICINAIS
O uso de plantas medicinais é milenar e difundido por todo o mundo,
seja no uso em rituais místicos/religiosos ou como medicamento. O emprego
empírico de produtos naturais era e continua sendo, uma das formas usuais de
se buscar cura e alívio para as doenças que acometem o homem (LI &
OHIZUMI, 2004; FIRENZOULI et al., 2005).
Plantas e seus derivados são as maiores fontes de drogas,
movimentando cerca de 30% do mercado farmacêutico mundial
(KIRKPATRICK, 2002). Entre os anos de 1981 e 2002, de 877 novas moléculas
introduzidas no mercado, em torno de 49% eram substâncias isoladas de
produtos naturais, semi-sintéticos ou moléculas sintetizadas tomando como
modelo estruturas de origem natural (NEWMAN et al., 2003). Em termos
históricos, a pesquisa com plantas medicinais tomou impulso após o
isolamento da morfina no século XIX. As plantas possibilitaram a descoberta
de vários medicamentos, podemos citar os alcalóides bisindólicos vimblastina e
vincristina isolados de Catharanthus roseus G., a atropina, obtida a partir de
Atropa belladona e também a lactona sesquiterpênica artemisina isolada de
Artemisia Annua L., utilizada como antimalárico. Apesar do enorme
desenvolvimento da síntese química, atualmente 25% das drogas prescritas no
mundo são de origem vegetal (BALUNAS et al., 2005).
De acordo com a Organização Mundial de Saúde, 80% da população
mundial utiliza plantas medicinais, em sua maioria nos países em
22
desenvolvimento (GURIB-FAKIM, 2006). No Brasil, 20% da população são
responsáveis por 63% do consumo de medicamentos alopáticos; os 80%
restantes encontram nos produtos de origem natural, especialmente as plantas
medicinais, a única fonte de recursos terapêuticos (FOGLIO et al., 2006).
Apesar do uso de plantas medicinais e seus derivados ser bastante
difundido, muitas espécies são usadas empiricamente, sem respaldo científico
quanto à eficácia e segurança. Em todo o mundo, apenas 17% das plantas
foram estudadas de alguma maneira quanto ao seu emprego medicinal e, na
maioria dos casos, sem grande aprofundamento nos aspectos fitoquímicos e
farmacológicos (FOGLIO et al., 2006).
O Brasil possui uma enorme biodiversidade, detendo aproximadamente
um terço da flora mundial. Este fato aliado à escassez de estudos
farmacológicos para a maioria das espécies vegetais demonstra o enorme
potencial do estudo de plantas para a descoberta de novas moléculas
terapeuticamente úteis (YUNES et al., 2001).
1.1.2. PLANTAS MEDICINAIS E GASTROPROTEÇÃO
Em recentes publicações têm sido evidenciada a ação gastroprotetora
de diversas plantas medicinais e de substâncias isoladas a partir delas
(BRZOZOWSKI et al., 2005; NAVARRETE et al., 2005; NARAYAN et al., 2005;
ANDREO et al., 2006; DA ROCHA LAPA et al., 2007). Os compostos obtidos a
partir de plantas medicinais com atividade antiulcerogênica apresentam
estruturas químicas diversas e distintos mecanismos de ação (SCHMEDA-
HIRSCHMANN & YESILADA, 2005).
23
O extrato obtido a partir das folhas e frutos de Sapindus saponaria L.,
rico em triterpenos pentacíclicos, apresentou atividade antiulcerogênica e
antisecretória gástrica, diminuindo a concentração de ácido clorídrico e o pH
gástrico (MEYER et al., 2002). Lactonas sesquiterpênicas com atividade
antiulcerogênica foram isoladas de Artemisia douglasiana (GUARDIÃ et al.,
1994). Dihidro-epideoxiartenuína b, isolada de Artemisia annua, apresentam
ação antiulcerogênica, estimulando a produção de muco através do aumento
dos níveis gástricos de prostaglandinas (FOGLIO et al., 2002; DIAS, 2004).
Estudos realizados no Laboratório de Produtos Naturais da Universidade
Federal do Ceará evidenciaram a ação gastroprotetora de uma variedade de
plantas medicinais e de seus princípios ativos, dentre eles podemos citar a
ação gastroprotetora do guaraná (Paullinia cupana Mart.) (CAMPOS et al.,
2003), do 1,8-cineol (SANTOS et al., 2001), da resina bruta e da mistura
contendo α- e β-amirina isolada de Protium heptaphyllum (OLIVEIRA et al.,
2004a; OLIVEIRA et al., 2004b), dentre outros.
Nesse contexto, as plantas medicinais e os compostos isolados a partir
delas (como os terpenos e as xantonas), apresentam importância como
agentes terapêuticos, visto sua ampla utilização na medicina popular, no
tratamento de desordens gástricas tais como úlceras gástricas e gastrites
(SCHMEDA-HIRSCHMANN & YESILADA, 2005).
1.2. XANTONAS
Xantonas são compostos polifenólicos naturais presentes em plantas
superiores, fungos e liquens (VIEIRA et al., 2005). Elas são metabólitos
24
secundários derivados da dibenzo-γ-pirona. Seu nome é proveniente do grego
xanthos que significa amarelo, decorrente de sua coloração característica
(KUSTER et al., 2003). Podem ser classificadas em cinco grandes grupos: (a)
xantonas simples oxigenadas, (b) xantonas glicosiladas, (c) xantonas
preniladas e seus derivados, (d) xantonolignoides, e (e) xantonas variadas
(JIANG et al., 2004).
As xantonas são formadas pela combinação das vias do chiquimato e do
acetato e possuem a mesma estrutura básica (Figura 2). Neste esqueleto
básico das xantonas podemos observer os carbonos numerados de 1-4,
derivados do anel acetato A, e os carbonos 5-8 derivados do chiquimato. Hoje
em dia as xantonas e seus derivados são isolados das plantas ou sintetizados
quimicamente (KUSTER et al., 2003).
Figura1. Estrutura básica das xantonas (KUSTER et al., 2003).
As xantonas são quimicamente diferentes dos flavonóides, porém são
muito similares em suas reações de coloração e em sua mobilidade
cromatográfica. Sua presença pode ser detectada por cromatografia em
camada delgada por sua coloração sob luz UV. Para seu isolamento são
utilizadas frequentemente técnicas cromatográficas. Diversas técnicas
espectroscópicas podem ser utilizadas para determinação estrutural das
25
xantonas. Os espectros obtidos na região do infravermelho, assim como
aqueles de RMN-
1
H e RMN-
13
C apresentam sinais característicos para essas
substâncias (KUSTER et al., 2003).
De 2000 a 2004 foram identificadas 278 novas xantonas naturais
oriundas de 20 famílias de plantas superiores (122 espécies e 44 gêneros), de
19 espécies de fungos e de 3 espécies de liquens (VIEIRA et al., 2005). No
total foram descritas em torno de 1.000 diferentes xantonas com substituintes
em diferentes posições, o que promove uma grande variedade de atividades
biológicas e farmacológicas a esses compostos (JIANG et al., 2004; SOUSA et
al., 2005).
O estudo de xantonas é interessante não só pela investigação
quimiossistemática, mas também devido à sua importância farmacológica. Um
número substancial de estudos demonstra que as xantonas e seus derivados
apresentam diversas atividades farmacológicas tais como antiinflamatória, anti-
hepatotóxica, antialérgica, anticonvulsivante, anti-diabética, gastroprotetora,
entre outras (MARONA, 1998; WANG et al., 2002; JIANG et al., 2004).
Diversos trabalhos têm apresentado as xantonas como potenciais
substâncias para o tratamento de diversos tipos de câncer, como o de pulmão,
fígado e estômago (PACHUTA et al., 1986; LIOU et al., 1993; PERMANA et al.,
1994; LIN et al., 1996; ASANO et al. 1996; MATSUMOTO et al., 2004;
PATTANAPRATEEB et al., 2005). Algumas xantonas (naturais e sintéticas)
apresentaram, ainda, ação antimicrobiana, inclusive contra Mycobacterium
tuberculosis (GHOSAL et al., 1978) e ação antifúngica (WANG et al., 2005).
Xantonas também são excelentes antioxidantes, atuando através da
eliminação de radicais livres, inibindo a peroxidação lipídica e quelando metais
26
(CASTANHEIRO et al., 2007). Os antioxidantes naturais, como as xantonas,
protegem o corpo humano dos radicais livres e retardam a progressão de
muitas doenças crônicas, além de desempenhar papel importante na
patogênese de várias doenças degenerativas (MONTILLA et al., 2003). Neste
sentido, o uso das xantonas naturais como agentes antioxidantes em
patologias que envolvem estresse oxidativo, como a úlcera gástrica, tem se
mostrado promissor.
1.3. Mangifera indica Linn.
Mangifera indica L. (mangueira) é uma espécie pertencente à família
Anacardiaceae, gênero Mangifera, que se disseminou por uma ampla região do
globo terrestre, climaticamente favorável ao seu desenvolvimento (CUNHA et
al.,2002). A mangueira (Figura 3) é uma planta nativa do sul e do sudeste
asiático, desde o leste da Índia até as Filipinas, e vem sendo cultivada há mais
de quatro mil anos. Seu fruto, a manga, é o segundo fruto tropical mais
importante cultivado no mundo (RIBEIRO, 2006). O cultivo da mangueira está
presente em vários países do mundo, constituindo uma importante atividade
econômica em muitos deles (Índia, China, Tailândia, México, Paquistão,
Indonésia, Filipinas, Brasil e Nigéria) (RIBEIRO, 2006).
As mangueiras são grandes árvores, atingindo até 35-40 m de altura,
com um raio de sua copa próximo de 10 m. Suas folhas são perenes, com 15-
35 cm de comprimento e 6-16 cm de largura; quando jovens estas folhas são
rosa-alaranjadas. As flores são diminutas, em inflorescências paniculadas nas
extremidades dos ramos e com perfume agradável. (LONDON FRUIT, 2002).
27
Figura 2. Mangifera indica L. (à direita detalhe das flores e dos frutos)
(modificado de http://www.vilamada.com.br/conteudo/vila_viva/arvores_praca.
htm – acesso: 09/10/2007)
A utilização das cascas de M. indica em diversos países para o
tratamento de menorragia, diarréia, sífilis, diabetes, escabiose, infecções
cutâneas, anemia etc. sob a forma de extrato aquoso, obtido por decocção,
está descrito no Napralert Database (NÚÑEZ-SELLÉS et al., 2007).
Nos últimos anos, estudos realizados em Cuba com o extrato aquoso
das cascas de uma variedade selecionada de M. indica resultaram em uma
formulação farmacêutica com nome fantasia de Vimang
®
. O principal
componente deste extrato é a xantona glicosilada mangiferina. Porém, além
desta substância, o extrato contém também uma mistura de componentes
28
terpenóides, esteróides, ácidos graxos e microelementos (CORREIA et al.,
2006).
Encontra-se descrito na literatura que Vimang
®
apresenta atividades
imunoestimulante (MAKARE et al., 2001), antiiflamatória (GARRIDO et al.,
2004), antioxidante (SANCHEZ et al., 2000; MURUGANANDAN et al., 2002;
SELLES et al., 2002), citotóxica e antineoplásica (BELTRÁN et al., 2004).
Estudos realizados com o extrato aquoso das cascas de M. indica
demonstraram que ele é um poderoso seqüestrador de radicais hidroxil e ácido
hipocloroso, exercendo efeito inibitório sobre a peroxidação de fosfolipídios em
cérebro de ratos e inibição de danos ao DNA. Além destes, apresenta
propriedades de proteção contra a produção de espécies reativas de oxigênio,
sendo mais ativo que as vitaminas C e E, mangiferina e β-caroteno. Vimang
®
mostrou proteção dos tecidos hepático e cerebral de camundongos contra o
estresse oxidativo induzido (SÁNCHEZ et al., 2000).
O extrato de M. indica também demonstrou efeito inibitório sobre a
produção de radicais livres em macrófagos de ratos, mostrando-se interessante
para o tratamento de doenças de origem imunopatológica, especificamente em
certas desordens auto-imunes (GARCÍA et al., 2002).
Recentemente foi descrita a ação antiulcerogênica do extrato aquoso
das flores de M. indica. Ele mostrou-se eficaz em inibir as lesões gástricas
induzidas por etanol, etanol acidificado, estresse e piroxican. O extrato também
reduziu a acidez total gástrica em ratos com piloro ligado e acelerou o processo
de cicatrização num modelo subagudo de úlcera induzida por ácido acético. O
efeito gastroprotetor deste extrato parece envolver a participação de grupos
sulfidrilas não-proteicos endógenos (LIMA et al., 2006). A contribuição da
29
mangiferina no efeito gastroprotetor do extrato aquoso das flores de M. indica
ainda não foi elucidado.
1.4. MANGIFERINA
Mangiferina (1,3,6,7-tetrahidroxixantona-C2-beta-D-glicose; Figura 4) é
uma glicosilxantona presente em várias plantas, incluindo Mangifera indica L.
(CHOPRA et al., 1956).
Figura 3. Estrutura química da mangiferina (CORREIA et al., 2006).
Encontra-se descrito na literatura que a biogênese da mangiferina
assemelha-se a dos flavonóides. Isto pode ser explicado com base no fato da
mangiferina ocorrer em algumas plantas na presença de flavonas C-
glicosiladas e não de outras xantonas. Além disso, o núcleo da mangiferina é
formado a partir de um precursor flavonóide do tipo C6C3 (p-hidroxicinamato)
conjugado a dois malonatos. Aparentemente o ácido benzóico não está
envolvido na rota biossintética da mangiferina, diferentemente do que é
observado para as demais xantonas. Dessa forma a rota biossintética da
30
mangiferina assemelha-se mais à descrita para as flavonas do que para as
outras xantonas (JENSEN et al., 2002).
Diversas atividades farmacológicas da mangiferina têm sido descritas na
literatura (CORREIA et al., 2006). Mangiferina apresentou ação antidiabética
em camundongos KK/Ay, um modelo genético de diabetes mellitus não
insulino-dependente com hiperinsulinemia (MIURA et al., 2001). Mangiferina
exibiu também potente atividade antidiabética, antihiperlipidêmica e
antiaterogênica em ratos com diabetes mellitus induzida por estreptozotocina,
mostrando-se uma droga promissora para o tratamento de diabetes melittus e
distúrbios lipidêmicos associados (MURUGANANDAN et al., 2005).
As ações imunomodulatória, analgésica e antiinflamatória da mangiferina
também foram demonstradas. Estudos sobre a atividade imunomodulatória da
mangiferina evidenciaram que esta xantona modula a expressão de vários
genes críticos para a regulação da apoptose, replicação viral, tumorigênese,
inflamação e doenças auto-imunes, o que traz a possibilidade do seu uso no
tratamento de doenças inflamatórias e/ou de câncer (LEIRO et al., 2004; DAR
et al., 2005). Mangiferina protegeu linfócitos humanos de lesões ao DNA
quando expostos à radiação gama, apontando para a possibilidade de seu uso
em pacientes submetidos à radioterapia ou indivíduos expostos
ocupacionalmente às radiações (JAGETIA & BAIGA, 2005; JAGETIA &
VENKATESHA, 2006).
Muruganandan et al. (2002) mostraram que a mangiferina exerce
proteção dos tecidos cardíaco e renal de ratos contra o estresse oxidativo
induzido. O efeito inibitório da mangiferina na carcinogênese intestinal em ratos
também foi demonstrado (YOSHIMI et al., 2001).
31
Outra atividade farmacológica descrita para a mangiferina é sua ação
antialérgica, que ocorre através de uma inibição dose-dependente da produção
de IgE e reação anafilática em roedores, redução da permeabilidade vascular
induzida pela histamina e sua liberação estimulada pelo composto 48/80 em
mastócitos de ratos (RIVERA et al., 2006).
A mangiferina apresenta potente atividade antioxidante, eliminando o
radical superóxido (testes in vitro), sendo que 100 µM de mangiferina mostrou-
se equivalente à atividade de 1 U/mL de superóxido dismutase (LEIRO et al.,
2003). Mangiferina também mostrou-se capaz de inibir a lipoperoxidação
experimentalmente induzida por ferro-citrato em mitocôndria isolada de fígado
de rato (PARDO-ANDREU et al., 2005; ANDREU et al., 2005).
1.5. FISIOLOGIA GASTRINTESTINAL
O trato gastrintestinal (TGI) é um dos sistemas do organismo de
importância fundamental, considerando sua função de provê-lo de água,
eletrólitos e alimentos (GUYTON & HALL, 2006).
As suas funções dependem de propriedades inerentes à musculatura
lisa intestinal, reflexos de neurônios intrínsecos no intestino e no sistema
nervoso central (SNC), efeitos parácrinos de mediadores químicos e hormônios
gastrintestinais. Porém, a maioria de suas funções é autônoma e controlada
predominantemente pelo sistema nervoso entérico (SNE) através de dois
plexos intramurais principais no trato - o plexo mioentérico (plexo de Auerbach)
e o plexo de Meissner (RANG et al., 2003; HOOGERWERF & PASRICHA,
2006). Os neurônios no interior dos plexos secretam acetilcolina, noradrenalina,
32
e também serotonina (5-HT), purinas, óxido nítrico e uma variedade de
peptídios farmacologicamente ativos. O plexo entérico contém neurônios
sensoriais que respondem a estímulos mecânicos e químicos (RANG et al.,
2003).
Os hormônios do trato gastrintestinal incluem tanto secreções
endócrinas quanto parácrinas. As secreções endócrinas (substâncias liberadas
na corrente sangüínea) são principalmente peptídios sintetizados por células
endócrinas existentes na mucosa, sendo o mais importante a gastrina. As
secreções parácrinas, ou hormônios locais, muitas das quais consistem em
peptídios reguladores, são liberadas por células especializadas, que se
distribuem por toda a parede do trato gastrintestinal. Esses hormônios atuam
sobre as células vizinhas e, no estômago, o mais importante deles é a
histamina. Algumas dessas secreções parácrinas também atuam como
neurotransmissores (RANG et al., 2003; HOOGERWERF & PASRICHA, 2006).
1.5.1. FISIOLOGIA DA SECREÇÃO GÁSTRICA
A secreção de ácido gástrico é um processo contínuo e complexo, em
que múltiplos fatores centrais e periféricos contribuem para uma meta comum:
a secreção de H
+
pelas células parietais. Os fatores neuronais (acetilcolina),
parácrinos (histamina) e endócrinos (gastrina) regulam a secreção de ácido.
Seus receptores específicos (M
3
, H
2
e CCK
2
, respectivamente) localizam-se na
membrana basolateral das células parietais no corpo e fundo gástricos. Nessas
células o AMP cíclico e as vias dependentes de Ca
2+
ativam a H
+
, K
+
-ATPase
(a bomba de prótons), que efetua a troca de íons hidrogênio e potássio através
33
da membrana celular parietal. Essa bomba gera o maior gradiente iônico
conhecido nos vertebrados, com um pH intracelular de cerca de 7,3 e um pH
intracanalicular de cerca de 0,8 (HOOGERWERF & PASRICHA, 2006).
A gastrina, que é produzida pelas células G do antro, é o indutor mais
potente da secreção de ácido. A liberação de gastrina é estimulada por
múltiplas vias, incluindo ativação do SNC, distenção local e componentes
químicos do conteúdo gástrico. A gastrina estimula a secreção ácida
indiretamente ao induzir a liberação de histamina pelas células
enterocromafins; um efeito direto sobre as células parietais também
desempenha um papel menos importante (HOOGERWERF & PASRICHA,
2006).
A somatostatina (SST), que é produzida pelas células D do antro, inibe a
secreção de ácido gástrico. A acidificação do pH luminal gástrico para valores
menores que três estimula a liberação de SST que, por sua vez, suprime a
produção de gastrina em uma alça de retroalimentação negativa. As células
produtoras de SST estão diminuídas em pacientes com infecção por
Helicobacter pylori, e a conseqüente redução do efeito inibitório da SST pode
contribuir para produção excessiva de gastrina (SCHUBERT, 2007).
1.5.2. MECANISMOS DE DEFESA DA MUCOSA GÁSTRICA
A concentração extremamente elevada de H
+
no lúmen gástrico requer
mecanismos vigorosos de defesa para proteger o esôfago e o estômago. A
principal defesa do esôfago é proporcionada pelo esfíncter esofágico inferior,
que impede o refluxo do conteúdo gástrico ácido para dentro do esôfago. A
34
secreção de uma camada de muco constitui importante defesa na proteção das
células epiteliais gástricas. O muco gástrico é formado por 95% de água e 5%
de glicoproteínas (REPETTO, 2002), é solúvel quando secretado, porém forma
rapidamente um gel insolúvel que reveste toda a superfície mucosa do
estômago, retarda a difusão de íons e impede a lesão da mucosa por
macromoléculas, como a pepsina (HOOGERWERF & PASRICHA, 2006).
A secreção de bicarbonato pelas células epiteliais gástricas é um dos
mecanismos de defesa da mucosa contra os efeitos nocivos do ácido. Ela é
regulada por diversos fatores tais como prostaglandinas, óxido nítrico,
neurônios aferentes sensíveis a capsaicina, peptídeos e fatores neuronais
(AIHARA et al., 2007).
As prostaglandinas endógenas têm um importante papel mediando
muitos aspectos da defesa da mucosa gastrintestinal (MAITY et al., 2003). As
prostaglandinas são sintetizadas a partir do ácido araquidônico, através das
enzimas ciclooxigenases (COX). Há duas formas de ciclooxigenase, a COX-1 e
a COX-2. Já foram descritas variantes de remontagem da COX-1 que retém a
atividade enzimática, uma das quais foi chamada de “COX-3” (HOOGERWERF
& PASRICHA, 2006). Enquanto a isoforma COX-1 (constitutiva) produz a maior
parte das prostaglandinas na mucosa gástrica normal, a COX-2 (induzida) atua
como um fator importante na cicatrização das úlceras. Inicialmente acreditou-se
que a COX-2 contribuía para a cicatrização das úlceras unicamente através da
produção de prostaglandinas. Entretanto, estudos sugerem que a inibição da
COX-2 aumenta o tempo de cicatrização das úlceras tanto por via dependente
quanto independente de prostaglandinas (PERINI et al., 2003).
35
A prostaglandina E
2
(PGE
2
) e a prostaciclina (PGI
2
) constituem as
principais prostaglandinas sintetizadas pela mucosa gástrica. Atuam sobre o
receptor prostanóide EP3 nas células parietais e estimulam a via G inibitória
(G
i
), diminuindo, assim, o AMP cíclico intracelular e a secreção de ácido
gástrico. A PGE
2
também pode evitar a lesão gástrica através de efeitos
citoprotetores, que incluem a estimulação da secreção de muco e bicarbonato
e o aumento do fluxo sanguíneo da mucosa (HOOGERWERF & PASRICHA,
2006; AIHARA et al., 2007).
O estômago protege a si próprio da lesão ácida por diversos
mecanismos que exigem um fluxo sanguíneo adequado, devido à elevada
atividade metabólica e necessidade de oxigênio da mucosa gástrica. A
elevação do fluxo sangüíneo é importante quando a barreira protetora mucosa
do estômago é rompida e ocorre retrodifusão de íons H
+
para as células da
mucosa (MAITY et al., 2003). Atribui-se o controle do fluxo sanguíneo gástrico
principalmente às prostaglandinas endógenas (FUNATSU et al., 2007).
O óxido nítrico (NO) tem sido reconhecido recentemente como um
mediador fundamental nos mecanismos de defesa gástrica, devido a sua
habilidade de aumentar o fluxo sangüíneo da mucosa e a produção de muco,
além de inibir a aderência de neutrófilos às células endoteliais (CORUZZI et al.,
2000). O NO é sintetizado pela NO sintase (NOS) a partir do oxigênio
molecular (O
2
) e L-arginina. Existem três isoformas conhecidas da NOS: uma
forma induzida - iNOS (expressa em macrófagos, células de Kupffer,
neutrófilos, fibroblastos, músculo liso vascular e células endoteliais em resposta
a estímulos patológicos como microrganismos invasores) e duas dita
36
constitutivas (cNOS), que estão presentes em condições fisiológicas no
endotélio (eNOS) e nos neurônios (nNOS) (CHO, 2001; UCHIDA et al., 2001).
Embora a produção de NO pela cNOS seja importante na manutenção
da integridade da mucosa gástrica, recentes estudos demonstram que o NO
atua de maneira bifásica na resposta ulcerogênica da mucosa gastrointestinal
dependendo da isoforma da NOS, ou seja, o NO produzido pela cNOS
apresentaria em efeito protetor, e o NO originário da iNOS teria um efeito pró-
ulcerogênico (NISHIO et al., 2006). O NO também é importante no controle da
secreção ácida e alcalina, no fluxo sangüíneo da mucosa gástrica e na
secreção de muco gástrico (BAYIR et al., 2006).
A geração de espécies reativas de oxigênio (ERO) ocorre durante o
metabolismo celular normal e está relacionada com a patogênese de diversas
doenças (AGNIHOTRI et al., 2007). As ERO causam inflamação e morte
celular através da modulação das vias de transdução de sinal, por afetar as
enzimas redox-sensíveis e fatores de transcrição, por auxiliar a atividade de
proteases e por estimular a expressão de mediadores inflamatórios e
moléculas de adesão (UZUN et al., 2005).
Os compostos sulfidrílicos estão envolvidos na manutenção da
integridade gástrica, principalmente quando as ERO estão envolvidas na
patofisiologia da lesão tecidual. A glutationa reduzida (GSH) participa em
muitos aspectos do metabolismo oxidativo, incluindo remoção de
hidroperóxidos, proteção contra radiação ionizada, manutenção do padrão
fisiológico de proteínas sulfidrílicas e condensação com xenobióticos ou
compostos reativos endógenos, para ajudar na sua detoxificação e excreção. A
GSH atua como um varredor de radicais livres e substâncias tóxicas ingeridas
37
na alimentação e/ou produzidas diretamente no TGI, desta forma a
manutenção dos níveis de GSH contribui para integridade da mucosa gástrica
(SHIRIN et al., 2001).
Outro componente da defesa gástrica são os fatores de crescimento que
estimulam importantes elementos celulares de cicatrização da úlcera como a
angiogênese, formação de tecido de granulação e reepitelização, mas sua
especificidade e potência variam (SZABO & VINCZE, 2000; TÉTREAULT et al.,
2007).
1.6. DOENÇA ULCEROSA PÉPTICA
A úlcera péptica é uma lesão profunda da mucosa, onde tanto os
componentes dos tecidos epitelial e conectivo, incluindo miofibroblastos
subepiteliais, como células do músculo liso, vasos e nervos, podem ser
destruídos (MILANI & CALABRÒ, 2001).
As úlceras ocorrem freqüentemente no duodeno (úlcera duodenal), onde
mais de 95% estão localizadas na sua primeira porção, e 90% próximo à
junção do piloro com a mucosa duodenal. No estômago (úlcera gástrica), as
úlceras se localizam mais comumente no antro (60%) e na junção do antro com
o corpo, na pequena curvatura (25%). A incidência de úlceras gástricas parece
ser ligeiramente maior em homens em relação às mulheres (1,3: 1), sendo que
a faixa etária de maior ocorrência das úlceras duodenais é de 30-55 anos, e
das úlceras gástricas é de 50-70 anos (ABITBOL, 2007).
A úlcera duodenal é mais freqüente nas populações ocidentais, e as
úlceras gástricas são mais comuns nos países orientais, particularmente o
38
Japão. Embora menos prevalente do que a úlcera duodenal, a úlcera gástrica
(0,1% da população em países desenvolvidos) apresenta maior grau de
mortalidade e morbidade associados, resultantes de hemorragias, perfurações
e obstruções (SIVRI, 2004).
A patogenia da doença ulcerosa péptica é mais bem representada como
um complexo cenário envolvendo o desequilíbrio entre os fatores de defesa da
mucosa (bicarbonato, muco, prostaglandinas, fluxo sanguíneo, óxido nítrico,
fatores de crescimento, etc.) e fatores agressivos que compreendem os
agentes químicos, que podem ser endógenos (HCl, pepsina) ou exógenos
(etanol, anti-inflamatórios não esteroidais), e agentes biológicos (Helicobacter
pylori) (Figura 1) (NATALE et al., 2004).
Figura 4. Mecanismos de defesa e injúria da mucosa gástrica (Adaptado de
ROBBINS & COTRAN, 2005).
39
Nos últimos anos, a infecção H. pylori e as drogas antiinflamatórias não-
esteroidais (AINES) foram identificadas como as duas principais causas de
úlcera péptica. Diversos estudos mostram que mais de 90% dos pacientes com
úlcera duodenal e 70% daqueles que apresentam úlcera gástrica estão
infectados por H. pylori (SIVRI, 2004). Essa infecção pode resultar em
comprometimento na produção de somatostatina pelas células D e, com o
decorrer do tempo, em redução da inibição da produção de gastrina, resultando
em aumento da produção de ácido e redução da produção duodenal de
bicarbonato (HOOGERWERF & PASRICHA, 2006).
Os AINES também estão freqüentemente associados a úlceras pépticas
(em até 60% dos pacientes, particularmente naqueles com complicações, como
sangramento). A lesão tópica causada pela presença do fármaco no lúmen
parece desempenhar um papel menos importante na patogenia dessas úlceras,
conforme evidenciado pelo fato de que podem ocorrer úlceras com doses muito
baixas de ácido acetilsalicílico (10 mg) ou com administração parenteral de
AINES. Os efeitos desses fármacos são, em vez disso, mediados por via
sistêmica; o elemento crítico consiste na supressão da forma constitutiva da
ciclooxigenase (COX-1) na mucosa e na produção diminuída das
prostaglandinas citoprotetoras, a PGE
2
e a PGI
2
(GANOC, 2003;
HOOGERWERF & PASRICHA, 2006).
O uso crônico de AINES pode aumentar de 2 a 4% o risco de
desenvolver uma úlcera sintomática, sangramento gastrintestinal ou até mesmo
perfuração. A conduta ideal consiste em suspender os AINES em pacientes
com úlcera, se possível. Se houver necessidade de terapia contínua, pode-se
considerar o uso de inibidores da COX-2 seletivos, embora isso não elimine o
40
risco de formação subseqüente de úlcera (HOOGERWERF & PASRICHA,
2006).
A cicatrização das úlceras apesar do uso contínuo de AINES é possível
com a administração de agentes supressores da secreção ácida, habitualmente
em doses mais elevadas e por um período consideravelmente mais longo do
que os esquemas padrões (p. ex., 8 semanas ou mais). Nessa situação os
inibidores da bomba de prótons são superiores aos antagonistas dos
receptores H
2
e aos análogos das prostaglandinas (misoprostol) na promoção
da cicatrização das úlceras ativas (taxas de cicatrização de 80 a 90% para os
inibidores da bomba de prótons versus 60 a 75% para os antagonistas dos
receptores H
2
) e na prevenção da recidiva das úlceras gástricas e duodenais
em caso de administração contínua de AINES (LANZA, 1998; HOOGERWERF
& PASRICHA, 2006).
O pantoprazol, ou o lansoprazol, por via intravenosa constituem
claramente a terapia preferida para pacientes com úlceras hemorrágicas
agudas. O benefício teórico da supressão máxima da secreção de ácido nesse
contexto consiste na aceleração da cicatrização da úlcera subjacente. Além
disso, um pH gástrico mais elevado aumenta a formação de coágulo e retarda
a sua dissolução (HOOGERWERF & PASRICHA, 2006). Atualmente, estes
agentes anti-secretórios representam uma das melhores opções na terapia
contra úlcera péptica (GISBERT, 2005), entretanto seu uso prolongado tem
sido associado à incidência de fraturas e câncer (YANG et al., 2006; LEEDHAM
et al., 2007).
O emprego de inibidores seletivos da COX-2, como alternativa para
evitar os efeitos pró-ulcerogênicos dos demais AINES, tem sido largamente
41
reduzido em virtude da possível associação desses fármacos a eventos
cardiovasculares adversos. Adicionalmente, diversos autores têm especulado
acerca da contribuição da COX-2 nos mecanismos de defesa da mucosa
gástrica e de cicatrização de úlceras (JUGDUTT, 2007).
Dispepsia não-ulcerosa, ou dispepsia funcional, é um termo que se
refere a uma desordem gastrintestinal cujos sintomas são semelhantes aos da
úlcera em pacientes que não apresentam ulceração gastroduodenal franca.
Isso pode ocorrer em associação com gastrite (com ou sem infecção por H.
pylori) ou com o uso de AINES, porém a patogenia dessa síndrome permanece
controvertida, no entanto, três importantes fatores parecem estar envolvidos: a)
anormalidades da motilidade gastrointestinal, b) aumento da sensibilidade a
estímulos provenientes do lúmen do tubo digestivo e c) anormalidades da
esfera psicoemocional. Estas alterações podem resultar em retardo do
esvaziamento gástrico, que ocorre em cerca de metade dos casos de dispepsia
funcional (TRONCON, 2001).
Embora o tratamento empírico da dispepsia funcional com agentes
supressores da secreção ácida seja utilizado rotineiramente em pacientes com
dispepsia não-ulcerosa, não há evidências convincentes de seu benefício em
estudos clínicos controlados (HOOGERWERF & PASRICHA, 2006).
42
2. JUSTIFICATIVA E OBJETIVOS
2.1. JUSTIFICATIVA
A doença ulcerosa péptica e as gastropatias associadas às drogas
antiinflamatórias não-esteroidais representam alguns dos principais problemas
que afetam negativamente a qualidade de vida. Atualmente, os fármacos com
ação antisecretória gástrica, como os inibidores da bomba de prótons,
representam uma das principais opções na terapia destas patologias
(GISBERT et al., 2005), porém o uso prolongado destes agentes está
associado à uma alta incidência de fraturas e câncer (YANG et al., 2006;
LEEDHAM et al., 2007).
Gastropatias associadas à AINES continuam sendo um grave problema
clínico que não foi solucionado com a introdução dos inibidores seletivos da
ciclooxigenase-2. A indicação do tratamento com esses fármacos está em
declínio devido aos efeitos colaterais cardíacos de certos inibidores da COX-2
(JUGDUTT et al., 2007).
Dessa forma, ainda existe um vasto campo para pesquisa de novos
agentes farmacológicos úteis no combate à doença ulcerosa péptica e às
gastropatias associadas aos AINES.
A utilização das plantas como medicamento para o tratamento das
enfermidades que acometem a espécie humana, remonta à idade antiga.
(CALIXTO, 2001). São inúmeros os exemplos de medicamentos que foram
desenvolvidos, direta ou indiretamente, a partir de fontes naturais,
43
especialmente de plantas (FARNSWORTH & BINGEL, 1997; CALIXTO, 2001;
NEWMAN et al., 2003; BOLDI, 2004).
Muitas substâncias presentes em plantas como terpenos, taninos,
xantonas, flavonóides, cumarinas e alcalóides apresentam atividade
gastroprotetora (COE et al., 1996; OLIVEIRA et al., 2004; ZAYACHKIVSKA et
al., 2004). Mangiferina é uma xantona glicosilada presente em Mangifera
indica L. (Anacardiaceae) que apresenta diversas ações farmacológicas
descritas na literatura como antioxidante, analgésica, imunomodulatória, dentre
outras (DAR et al., 2005; PINTO et al., 2005; RIVERA et al., 2006).
Recentemente foi demonstrada a ação antiulcerogênica do extrato aquoso das
flores de M. indica (LIMA et al., 2006), porém a contribuição da mangiferina
neste efeito permanece desconhecida, visto que no extrato estão presentes
diversas outras substâncias não determinadas como taninos, flavonóides,
esteróides e triterpenos.
Evidências clínicas e experimentais sugerem que o estresse oxidativo
apresenta um papel fundamental na etiologia da úlcera gástrica e compostos
antioxidantes podem oferecer citoproteção gástrica (REPETTO et al., 2002).
Dessa maneira, a importância deste estudo, se justifica na investigação
da ação gastroprotetora da mangiferina, tendo como base suas diversas
atividades farmacológicas descritas na literatura, em modelos animais de
úlcera gástrica aguda, bem como os possíveis mecanismos de ação
envolvidos.
44
2.2. OBJETIVOS
GERAL
Investigar a ação gastroprotetora da mangiferina em modelos agudos de
lesão gástrica em animais.
ESPECÍFICOS
Estudar a atividade gastroprotetora da mangiferina nos modelos agudos
de lesão gástrica induzida por etanol, etanol acidificado, indometacina e
composto 48/80 em camundongos;
Avaliar a participação do receptor da capsaicina (TRPV1), óxido nítrico,
prostaglandinas e canais de potássio ATP-dependentes no mecanismo
gastroprotetor da mangiferina no modelo de úlcera induzida por etanol;
Verificar a ação da mangiferina sobre a produção dos grupos sulfidrílicos
não-protéicos (NP-SH) gástricos em camundongos;
Avaliar a ação da mangiferina sobre o nível de peroxidação lipídica,
através da dosagem de malonildealdeído na mucosa gástrica no modelo
de lesão gástrica induzida por etanol;
45
Estudar o efeito da mangiferina sobre a secreção gástrica, utilizando o
modelo de ligadura do piloro em ratos;
Averiguar a ação da mangiferina sobre o esvaziamento gástrico em
ratos.
46
3. MATERIAL
3.1. MATERIAL BOTÂNICO
As cascas de Mangifera indica L. (Anacardiaceae) foram coletadas em
agosto de 2003, em uma plantação pertencente ao Departamento de
Agronomia, no Campus do Pici, Universidade Federal do Ceará. A espécie
vegetal foi autenticada pelo Dr. Francisco Edson de Paula, e uma excicata foi
registrada sob o Nº. 32628 no Herbário Prisco Bezerra da mesma universidade.
3.2. ANIMAIS EXPERIMENTAIS
Foram utilizados camundongos albinos (Mus musculus), variedade
Swiss Webster, adultos, machos, pesando entre 25-30 g e ratos albinos (Rattus
norvegicus), variedade Wistar, adultos, machos, pesando entre 180-200 g,
provenientes do Biotério do Departamento de Fisiologia e Farmacologia da
Universidade Federal do Ceará. Os animais foram acondicionados em caixas
de polipropileno, à temperatura ambiente de 22-24
o
C, com ciclos de
claro/escuro de 12 em 12 h, recebendo ração padrão (Purina Chow) e água “ad
libitum”. Os animais foram colocados em jejum de sólidos 18 h antes da
realização dos experimentos.
Os protocolos utilizados neste trabalho possuem aprovação do Comitê
de Ética em Pesquisa Animal (CEPA) do Departamento de Fisiologia e
Farmacologia da Faculdade de Medicina da Universidade Federal do Ceará
(Protocolo nº088/07).
47
3.3. DROGAS E REAGENTES
PRODUTO ORIGEM
Ácido clorídrico P.A. Merck, Brasil
Ácido Etilenodiaminotetraacético sal dissódico (EDTA) Proanalysi, Brasil
Ácido tricloroacético P.A. Sigma, USA
Ácido trinitrobenzeno sulfônico - TNB Sigma, USA
Álcool etílico absoluto P.A. Synth, Brasil
Capsaicina Sigma, USA
Capsazepina Sigma, USA
Carboximetilcelulose Merck, Brasil
Carvão Ativado pó Reagen, Brasil
Cimetidina (Tagamet
®
) SmithKline Beecham, Brasil
Ciproeptadina (Periatin
®
) Prodome, Brasil
Cloreto de sódio Vetec, Brasil
Composto 48/80 Sigma, USA
Diazóxido Sigma, USA
Dimetilfulfóxido (DMSO) Reagen, Brasil
Ester metil NG nitro-L-arginina (L-NAME) Sigma, USA
Éter etílico Labsynth, Brasil
Fenolftaleína Reagen, Brasil
Formaldeído P.A. Sigma, USA
Glibenclamida Sigma, USA
Glicose Vetec, Brasil
48
Glutation reduzido Sigma, USA
Goma Arábica Sigma, USA
Hidróxido de sódio Reagen, Brasil
Indometacina (Indocid
®
) Merck, Brasil
Lansoprazol (Prazol
®
) Medley, Brasil
L-arginina Sigma, Brasil
N-Acetilcisteína (Fluimucil
®
) Zambon, Brasil
Sulfato de atropina Sigma, Brasil
Sulfato de Morfina (Dimorf
®
) Cristália, Brasil
Tween 80 Sigma, USA
Vermelho de fenol Reagen, Brasil
3.4. EQUIPAMENTOS
EQUIPAMENTO ORIGEM
Balança para animais (mod. MF-6) Filizola, Brasil
Balança analítica (mod. AX-200) Shimadzu, Japão
Centrifuga refrigerada, modelo CT 5500 DR CIENTEC
®
, Brasil
Freezer –75ºC Legaci System
®
Lavadora ultrasônica, modelo USC 700 UNIQUE
®
Material cirúrgico ---
Pipetas automáticas Jencons
®
Seringas plásticas B-D-Plastipak
Vidrarias Pirex, U.S.A.
49
4. MÉTODOS
4.1. OBTENÇÃO DA MANGIFERINA
O material vegetal seco (2,03 kg de cascas de M. indica L.) foi extraído
duas vezes com etanol (13L). O extrato etanólico bruto teve seu solvente
removido em evaporador rotatório, sob pressão reduzida. O resíduo sólido foi
redissolvido em metanol, resultando na formação de um precipitado amorfo,
que foi separado logo em seguida por filtração simples. Após repetidas
recristalizações em acetato de etila, foram obtidos cristais amarelados de
mangiferina (40 g). A estrutura e pureza da mangiferina foram confirmadas
utilizando-se técnicas espectroscópicas (RMN de
1
H e
13
C, infravermelho) e
cromatografia líquida alta eficiência (CLAE).
A metodologia de extração e caracterização da mangiferina foi realizada
pela Prof
a
. Dr
a
. Maria Teresa Salles Trevisan e Prof
a
. Dr
a
. Antonia Lúcia de
Souza do Departamento de Química Orgânica e Inorgânica da Universidade
Federal do Ceará.
50
Cascas secas
(2,03 kg)
Extrato
etanólico fluido
Extrato
etanólico seco
Precipitado
amorfo
Mangiferina
(40 g)
Extração em etanol (13 L)
Filtração e evaporação do
solvente em rotavapor
Dissolução em metanol
seguida de filtração simples
Recristalização em acetato de etila
Análise (RMN
1
H e
13
C, IV, CLAE e dados na literatura)
51
4.2. LESÃO GÁSTRICA INDUZIDA POR ETANOL
A atividade antiulcerogênica da mangiferina foi primeiramente avaliada
no modelo de úlcera gástrica induzida por etanol em camundongos (ROBERT
et al., 1979).
Camundongos, em jejum de sólidos de 18h, foram divididos em grupos
de 8 animais, tratados com veículo (3% de Tween 80 em água destilada, 10
mL/kg, v.o.), mangiferina (3, 10 e 30 mg/kg; v.o.) ou N-acetilcisteína (NAC - 750
mg/kg, i.p.). Uma hora após os tratamentos com veículo e mangiferina, e 30
minutos após o tratamento com N-acetilcisteína, os animais receberam 0,2 mL
de etanol 96% via oral.
Decorridos 30 minutos, os animais foram sacrificados; os estômagos
retirados, abertos pela grande curvatura, lavados com solução salina 0,9 % e
comprimidos entre dois vidros de relógio para uma melhor visualização. A área
de lesão gástrica glandular foi determinada com o auxílio de um programa de
planimetria computadorizada (ImageJ). Os dados foram expressos em termos
de porcentagem de área lesada em relação à área total do corpo gástrico.
4.2.1. ESTUDO DO ENVOLVIMENTO DOS NEURÔNIOS AFERENTES
PRIMÁRIOS SENSÍVEIS À CAPSAICINA
Camundongos divididos em grupos de 8 animais foram tratados com
veículo (3% de Tween 80 em água destilada, 10 mL/kg, v.o.), mangiferina (30
mg/kg; v.o.) 1h antes ou capsaicina (5 mg/kg; i.p.) 30 minutos antes de
receberem etanol 96% (0,2 mL/animal; v.o.).
52
A participação dos neurônios sensoriais sensíveis à capsaicina foi
investigado segundo MATSUDA et al. (1999) através da administração de
capsazepina (5 mg/kg; i.p.) 30 min antes da mangiferina (30 mg/kg; v.o.) ou
capsaicina (5 mg/kg; i.p.). Após 30 min da administração da capsaicina e 1 h
após a administração da mangiferina os animais receberam etanol 96% (0,2
mL/animal; v.o.).
Os animais foram sacrificados 30 minutos após a administração do
etanol, e a área de lesão gástrica glandular determinada pelo método descrito
anteriormente.
4.2.2. ESTUDO DO ENVOLVIMENTO DO ÓXIDO NÍTRICO
Camundongos foram divididos em grupos de 8 animais e tratados com
veículo (3% de Tween 80 em água destilada, 10 mL/kg, v.o.), mangiferina (30
mg/kg; v.o.) 1 h antes ou L-arginina (450 mg/kg; i.p.) 30 minutos antes de
receberem etanol 96% (0,2 mL/animal; v.o.).
O envolvimento do óxido nítrico foi avaliado pela administração de L-
NAME (20 mg/kg; i.p.) 30 min antes da mangiferina (30 mg/kg; v.o.) ou L-
arginina (450 mg/kg; i.p.). Após 30 min da administração da L-arginina e 1 h
após a administração da mangiferina os animais receberam etanol 96% (0,2
mL/animal; v.o.) (MATSUDA et al., 1999).
Decorridos 30 minutos da administração do etanol, os animais foram
sacrificados; os estômagos foram retirados e a área de lesão gástrica
determinada como descrito anteriormente.
53
4.2.3. ESTUDO DO ENVOLVIMENTO DAS PROSTAGLANDINAS
Camundongos divididos em grupos de 8 animais foram tratados com
veículo (3% de Tween 80 em água destilada, 10 mL/kg, v.o.), mangiferina (30
mg/kg; v.o.) ou misoprostol (0,016 mg/kg, v.o.) 1h antes de receberem etanol
96% (0,2 mL/animal; v.o.).
A participação das prostaglandinas foi investigada através da
administração de indometacina (10 mg/kg; v.o.) 2 horas antes da mangiferina
(30 mg/kg; v.o.) ou misoprostol (0,016 mg/kg, v.o.). Após 1 h da administração
da mangiferina ou misoprostol os animais receberam etanol 96% (0,2
mL/animal; v.o.) (MATSUDA et al., 1999).
Os animais foram sacrificados 30 minutos após a administração do
etanol, e a área de lesão gástrica glandular determinada de acordo com o
método descrito previamente.
4.2.4. ESTUDO DO ENVOLVIMENTO DOS CANAIS DE POTÁSSIO ATP-
DEPENDENTES
Camundongos foram divididos em grupos de 8 animais e tratados com
veículo (3% de Tween 80 em água destilada, 10 mL/kg, v.o.), mangiferina (30
mg/kg; v.o.) 1h antes ou diazóxido (3 mg/kg; i.p.) 30 minutos antes de
receberem etanol 96% (0,2 mL/animal; v.o.).
O papel dos canais de K
+
ATP-dependentes foi investigado pela
administração de glibenclamida (5 mg/kg; i.p.) 30 min antes da mangiferina (30
mg/kg; v.o.) ou diazóxido (3 mg/kg; i.p.). Após 30 min da administração do
54
diazóxido e 1 h após a administração da mangiferina os animais receberam
etanol 96% (0,2 mL/animal; v.o.) (RAHGOZAR et al., 2001)
Após 30 minutos da administração do etanol, os animais foram
sacrificados e a área de lesão gástrica glandular determinada através do
método descrito anteriormente.
4.2.5. ESTUDO DA AÇÃO SOBRE OS GRUPOS SULFIDRILAS NÃO
PROTÉICOS (NP-SH)
Grupos de 8 camundongos cada, em jejum de sólidos de 18 horas,
foram tratados com mangiferina (30mg/kg, v.o.), N-acetilsisteína (750 mg/kg,
i.p.) ou veículo (3% de Tween 80 em salina 0,9%, 10 mL/kg). Uma hora após
os tratamentos com veículo e mangiferina, e 30 minutos após o tratamento com
N-acetilcisteína, os animais receberam 0,2 mL de etanol 96% por via oral. Um
grupo controle normal, que recebeu apenas solução salina, e não etanol, foi
incluído.
Trinta minutos após a administração do etanol, os animais foram
sacrificados e um segmento glandular de cada estômago foi retirado, pesado e
homogeneizado em EDTA gelado (0.02 M, pH 8.9), obtendo-se um
homogenato a 10%. Uma alíquota de 4 mL de cada amostra foi retirada e
adicionado 3,2 mL de água destilada e 0,8 mL de ácido tricloroacético - TCA
50% em solução aquosa. Em seguida, os tubos de ensaio contendo a mistura
foram centrifugados a 3000 rpm por 15 minutos. Um volume de 2 mL foi
retirado do sobrenadante e adicionado 4 mL de Tris (0,4M, pH 8,9) e 0,1 mL de
DTNB (0,01M).
55
A absorbância foi medida dentro de 5 minutos a 412 nm. A concentração
de NP-SH foi calculada através de uma curva de calibração de glutationa
reduzida (GSH) e os resultados expressos em µg de NP-SH/g de tecido
(SEDLACK & LINDSAY, 1968).
4.2.6 AVALIAÇÃO DA PEROXIDAÇÃO LIPÍDICA: DOSAGEM DE
MALONILDEALDEÍDO (MDA)
A atividade antioxidante foi medida pela dosagem das substâncias
reativas com o ácido Tiobarbitúrico (TBA), um indicador de peroxidação lipídica
(AGAR et al.,1999). Nesta reação, duas moléculas de TBA reagem
estequiometricamente com uma molécula de MDA para formar uma solução de
cor rosa, que tem absorbância máxima em pH ácido de 532 a 535 nm.
Grupos de 8 camundongos cada, em jejum de sólidos de 18 horas,
foram tratados com mangiferina (30mg/kg, v.o.), N-acetilsisteína (750 mg/kg,
i.p.) ou veículo (3% de Tween 80 em salina 0,9%, 10 mL/kg). Uma hora após
os tratamentos com veículo e mangiferina, e 30 minutos após o tratamento com
N-acetilcisteína, os animais receberam 0,2 mL de etanol 96% por via oral. Um
grupo controle normal, que recebeu apenas solução salina, e não etanol, foi
incluído.
Trinta minutos após a administração do etanol, os animais foram
sacrificados e um segmento glandular de cada estômago foi retirado, pesado e
homogeneizado em tampão KCl 10% (pH 7.4) numa concentração de 1 g de
peso molhado do estômago para 60 mL de tampão. 250 µl do homogenato
foram introduzidos em tubos de ensaio e incubados em banho de água a
56
temperatura de 37ºC por 60 minutos. Após a incubação, 400 µl de ácido
perclórico 35% foi adicionado, a fim de parar a peroxidação, os tubos foram
agitados e centrifugados a 14000 rpm por 10 minutos. Em seguida 600µl do
sobrenadante foram adicionados a 200µl de ácido tiobarbitúrico 1,2%. A
mistura foi levada ao banho de água por 30 minutos a uma temperatura
variável de 95 - 100ºC. Em seguida a solução foi retirada e colocada para
esfriar à temperatura ambiente. A leitura da absorbância foi realizada a 532nm.
A absorbância das amostras foi realizada a um comprimento de onda de 532
nm. A curva padrão foi obtida por diluições em série (1; 0,5; 0,25; 0,12; 0,06;
0,03 mM) utilizando uma solução de MDA. A concentração de MDA foi
expressa em nmoles/g de tecido (AGAR et al., 1999).
4.3. LESÃO GÁSTRICA INDUZIDA POR ETANOL ACIDIFICADO
Os camundongos foram divididos em grupos de 8 animais cada, em
jejum de sólidos de 18h, e foram tratados, via oral, com veículo (3% de Tween
80 em água destilada, 10 mL/kg), mangiferina (3, 10 e 30 mg/kg) ou
lanzoprazol (30 mg/kg). Uma hora após os tratamentos os animais receberam
0,2 mL de uma solução 0,3M de HCl em etanol 60% e após 1h foram
sacrificados (MIZUI et al., 1987). Os estômagos foram retirados e a área de
lesão gástrica glandular determinada por planimetria e os dados expressos em
termos de percentagem.
57
4.4. LESÃO GÁSTRICA INDUZIDA POR INDOMETACINA
Os camundongos, em jejum de sólidos de 18 h, divididos em grupos de
8 animais, foram tratados, via oral, com veículo (3% de Tween 80 em salina
0,9%, 10 mL/kg), mangiferina (3, 10 e 30mg/kg) ou lansoprazol (30 mg/kg,
v.o.). Após uma hora, os animais foram tratados por via oral com indometacina
(30 mg/kg, preparada com 0,5 % de carboximetilcelulose). Oito horas após este
tratamento, os animais foram sacrificados por deslocamento cervical, os
estômagos retirados e instilados com formalina a 5 % por 15 minutos
(BHARGAVA, 1973). Em seguida foram abertos ao longo da grande curvatura,
lavados em salina e inspecionados para atribuições de escores de acordo com
SZABO et al. (1985) abaixo descrito, onde n corresponde ao número de úlceras
encontradas.
1. Perda de pregas da mucosa......................................................
2. Descoloração da mucosa...........................................................
3. Edema........................................................................................
4. Hemorragias...............................................................................
5. Número de petéquias
- até 10...........................................................................................
- mais de 10...................................................................................
6. Intensidade da ulceração
- úlceras ou erosão de até 1 mm...................................................
- úlceras ou erosão maiores que 1 mm..........................................
- úlceras perfuradas.......................................................................
1 ponto
1 ponto
1 ponto
1 ponto
2 pontos
3 pontos
n x 2 pontos
n x 3 pontos
n x 4 pontos
58
4.5. LESÃO GÁSTRICA INDUZIDA PELO COMPOSTO 48/80
O efeito da mangiferina na lesão gástrica induzida pelo composto 48/80,
um conhecido degranulador de mastócitos, foi avaliado utilizando-se
camundongos em jejum de sólidos de 18h, divididos em grupos de 8 animais.
Estes foram pré-tratados com veículo (3% de Tween 80 em água destilada, 10
mL/kg, v.o.), mangiferina (3, 10 e 30 mg/kg; v.o.) ou ciproeptadina (10 mg/kg,
v.o.). Meia hora após os tratamentos, os animais receberam uma injeção
intraperitonial do composto 48/80 (0,75 mg/kg). Após três horas da
administração do composto 48/80, os animais foram sacrificados; os
estômagos retirados, inflados com solução salina 0,9%, e colocados em uma
solução de formalina 5% por 10 min. Em seguida os estômagos foram abertos
ao longo da grande curvatura e a porção glandular examinada. A intensidade
da lesão da mucosa foi estimada de acordo com Ohta et al. (2004), utilizando a
escala abaixo descrita:
grau 0, ausência de lesão(normal);
grau I, somente edema;
grau II, área lesada de 1–10 mm
2
;
grau III, área lesada de 11–20 mm
2
;
grau IV, área lesada de 21–30 mm
2
;
grau V, área lesada de 31–40 mm
2
;
grau VI, área lesada de 41–50 mm
2
;
grau VII, área lesada>51 mm
2
.
59
4.6. ATIVIDADE ANTISECRETÓRIA GÁSTRICA
Ratos em jejum de 16 horas, com livre acesso à solução de glicose 5 %,
foram anestesiados com éter, fixados em decúbito dorsal e realizada a
tricotomia da parede abdominal. Através de uma incisão de 2 cm na região
epigástrica, o estômago foi localizado e o piloro amarrado. Administrou-se o
tratamento, mangiferina (30 mg/kg), cimetidina (100 mg/kg) ou veículo (3% de
Tween 80 em salina 0,9%), todos por via intraduodenal, em um volume de 2,5
mL/kg, imediatamente após a ligadura do piloro. Foram suturadas a parede do
abdômen e a pele. Transcorridas 4 horas da cirurgia, os animais foram
sacrificados por anestesia etérea profunda, a cárdia foi amarrada para evitar
perda do material secretado e o estômago foi removido. Os estômagos foram
lavados com água destilada, secos com papel de filtro e mantidos em béquer
sobre placa de gelo. Seccionou-se o estômago ao longo da grande curvatura, e
o suco gástrico foi recolhido em tubos de ensaio imersos em gelo. Os tubos
foram centrifugados a 3500 rpm / 30 min. O sobrenadante do suco gástrico foi
transferido para uma proveta e o volume foi verificado. A acidez total foi
determinada através de titulação com NaOH 0,1 N utilizado fenolftaleína 2%
como indicador ácido-básico (REITMAN et al., 1970).
4.7. ESVAZIAMENTO GÁSTRICO
Grupos de 6 ratos cada, em jejum de sólidos de 18 horas, foram pré-
tratados com veículo (3% de Tween 80 em água destilada, 10 mL/kg, v.o.),
mangiferina (3, 10 e 30 mg/kg, v.o.) ou atropina (3 mg/kg, v.o.). Decorridos 45
60
minutos dos tratamentos os animais receberam vermelho de fenol (0,5 mg/kg).
Após 15 minutos da administração do vermelho de fenol os animais
foram sacrificados, o piloro e a cárdia amarrados e os estômagos removidos,
lavados externamente, abertos ao longo da grande curvatura e o conteúdo
gástrico coletado. A superfície interna do estômago foi lavada utilizando 7 mL
de água destilada. Em seguida, o volume obtido foi centrifugado a 1500 rpm
por 15 minutos. A 1 mL do sobrenadante foi adicionado 1 mL de NaOH 1N. As
amostras foram levadas ao espectrofotômetro e as absorbâncias medidas a
560 nm.
Os resultados foram interpolados com uma curva padrão de vermelho de
fenol (25; 12,5; 6,25; 3,215 µg/mL em NaOH 1N) para calcular a concentração
do corante retido no estômago (GUPTA & BRANS, 1978). Os resultados foram
expressos em µg de vermelho de fenol retidos no estômago.
4.8. ANÁLISE ESTATÍSTICA
A análise estatística foi realizada com auxílio do programa Graph Pad
Prism 4.0 (USA). Os resultados foram expressos como a média ± erro padrão
da média (E.P.M.). A comparação entre as médias foi realizada utilizando-se
análise de variância (ANOVA) seguida pelo teste de Student Newman Keul,
para dados paramétricos, e teste de Kruskall-Wallis seguido do teste de
Dunnett, para dados não paramétricos (escores das lesões gástricas induzidas
por indometacina e composto 48/80). As diferenças foram consideradas
estatisticamente significativas quando p<0,05.
61
5. RESULTADOS
5.1. OBTENÇÃO DA MANGIFERINA
A extração da mangiferina a partir das cascas de Mangifera indica L.
apresentou um rendimento de aproximadamente 1,97%.
O estudo dos espectros de
1
H e
13
C permitiram a identificação da
estrutura da mangiferina como sendo 1,3,6,7-tetrahidroxixantona-C
2
-β-D-
glucosideo (Figura 3), por comparação com a literatura (GÓMEZ-ZALETA et
al., 2006). A mangiferina isolada apresentou um grau de pureza de 95%
(confirmada por CLAE) (BARRETO et al., 2007), peso molecular de 422,5 Da e
ponto de fusão de 271°C.
5.2. EFEITO PROTETOR DA MANGIFERINA NA LESÃO GÁSTRICA
INDUZIDA POR ETANOL EM CAMUNDONGOS
Os efeitos da mangiferina e da N-acetilcisteína sobre as lesões gástricas
induzidas por etanol estão demonstrados na Tabela 1 e Figura 5.
O etanol promoveu intensos danos à mucosa gástrica sob a forma de
erosões hemorrágicas no grupo de animais que recebeu apenas o veículo. A
área lesionada (mm
2
), expressa como percentual em relação à área total do
corpo gástrico, no grupo controle foi de 26,03 ± 1,67%.
Nas doses testadas, mangiferina (3, 10 e 30 mg/kg) atenuou
significativamente (p<0,001) a lesão gástrica induzida pelo etanol (18,21 ± 2,00;
17,05 ± 2,22 e 9,66 ± 1,80%, respectivamente), o que corresponde a uma
62
inibição de 30, 35 e 63%. Este efeito apresentou dose dependência nas doses
de 10 e 30 mg/kg.
N-acetilcisteína (NAC – 750 mg/kg), fármaco de referência, também
inibiu significativamente (p<0,01) as lesões gástricas (12,9 ± 1,39%) quando
comparada ao controle em 50%.
63
TABELA 1. Efeito da mangiferina e N-acetilcisteína (NAC) no modelo de
úlcera gástrica induzida por etanol em camundongos.
GRUPOS
DOSE
(mg/kg)
ÁREA DE LESÃO GÁSTRICA
(mm
2
)
% INIBIÇÃO
Controle (veículo)
-
26,03 ± 1,67
-
3 18,21 ± 2,00** 30,04
10 17,05 ± 2,22** 34,50
Mangiferina
30 9,66 ± 1,80*** 62,88
NAC 750 12,9 ± 1,39** 50,44
Os resultados são expressos como média ± erro padrão da média (E.P.M.) para 8
animais/grupo. Veículo (3% de Tween 80 em salina 0,9%, 10 mL/kg) e mangiferina
(3, 10 e 30 mg/kg) foram administrados por via oral e N-acetilcisteína (NAC - 750
mg/kg) por via intraperitoneal, 1 hora antes da administração de etanol absoluto
(0,2 mL/animal v.o.). Os animais foram sacrificados 30 minutos após a
administração do etanol. **p<0,01; ***p<0,001 vs controle veículo (ANOVA e Teste
de Student Newman Keul, como teste post hoc).
64
FIGURA 5. Efeito da mangiferina e N-acetilcisteína (NAC) nas lesões
gástricas induzidas por etanol em camundongos. Os valores representam a
média ± erro padrão da média (E.P.M.) para 8 animais/grupo. Os animais foram
tratados com veículo (3% de Tween 80, v.o.), mangiferina (3, 10 e 30 mg/kg,
v.o.) e NAC (750 mg/kg, i.p.) 1 hora antes da administração de etanol absoluto
(0,2 mL/animal, v.o.). Os animais foram sacrificados 30 minutos após a
administração do etanol. **p<0,01; ***p<0,001 vs controle veículo (ANOVA e
Teste de Student Newman Keul, como teste post hoc).
65
Visto que a dose de 30 mg/kg da mangiferina apresentou maior proteção
no modelo de lesão gástrica induzida por etanol, esta dose foi selecionada para
o estudo dos possíveis mecanismos de ação envolvidos na gastroproteção da
mangiferina.
5.2.1. EFEITO GASTROPROTETOR DA MANGIFERINA NA LESÃO
GÁSTRICA INDUZIDA POR ETANOL: PAPEL DOS NEURÔNIOS
AFERENTES PRIMÁRIOS SENSÍVEIS À CAPSAICINA
Os grupos tratados com capsaicina (5 mg/kg, i.p.) ou com mangiferina
(30 mg/kg, v.o.) apresentaram uma diminuição significativa (p<0,01) na injúria
gástrica provocada pelo etanol (10,53 ± 1,87%; 14,01 ± 2,56%,
respectivamente) quando comparados ao grupo controle veículo (38,30 ±
1,90%). O tratamento com capsazepina (5 mg/kg, i.p.) promoveu uma reversão
significativa (p<0,01) na gastroproteção da capsaicina (31,68 ± 2,56%). Já a
mangiferina não teve seu efeito protetor (16,95 ± 1,66%) significativamente
alterado (p>0,05) pelo pré-tratamento com capsazepina (Tabela 2 e Figura 6).
66
TABELA 2. Efeito da capsazepina na proteção gástrica da mangiferina no
modelo de úlcera gástrica induzida por etanol em camundongos.
GRUPOS
DOSE
(mg/kg)
ÁREA DE LESÃO GÁSTRICA
(mm
2
)
Controle (veículo)
-
38,30 ± 1,90
Capsaicina 5 10,53 ± 1,87
a
Mangiferina 30 14,01 ± 2,56
a
Capsaicina + Capsazepina 3 + 5 31,68 ± 2,56
b
Mangiferina + Capsazepina 30 + 5 16,95 ± 1,66
a,c
Os valores representam a média ± erro padrão da média (E.P.M.) para 8
animais/grupo. Os animais foram tratados com veículo (3% de Tween 80, v.o.),
mangiferina (30 mg/kg, v.o.) ou capsaicina (5 mg/kg, i.p.). Capsazepina (5 mg/kg,
i.p.) foi administrada 30 minutos antes dos tratamentos com mangiferina ou
capsaicina. Etanol absoluto (0,2 mL/animal, v.o.) foi administrado 1 hora ou 30
minutos após os tratamentos com mangiferina ou capsaicina, respectivamente.
a
p<0,01 vs Controle;
b
p<0,01 vs Capsaicina;
c
p>0,05 vs Mangiferina (ANOVA e
Teste de Student Newman Keul, como teste post hoc).
67
FIGURA 6. Efeito da capsazepina na gastroproteção da mangiferina à
lesão gástrica induzida por etanol absoluto em camundongos. Os valores
representam a média ± erro padrão da média (E.P.M.) para 8 animais/grupo.
Os animais foram tratados com veículo (3% de Tween 80, v.o.), mangiferina
(30 mg/kg, v.o.) ou capsaicina (5 mg/kg, i.p.). Capsazepina (5 mg/kg, i.p.) foi
administrada 30 minutos antes dos tratamentos com mangiferina ou capsaicina.
Etanol absoluto (0,2 mL/animal, v.o.) foi administrado 1 hora ou 30 minutos
após os tratamentos com mangiferina ou capsaicina, respectivamente.
a
p<0,01
vs Controle;
b
p<0,01 vs Capsaicina;
c
p>0,05 vs Mangiferina (ANOVA e Teste
de Student Newman Keul, como teste post hoc).
68
5.2.2. EFEITO GASTROPROTETOR DA MANGIFERINA NA LESÃO
GÁSTRICA INDUZIDA POR ETANOL: PAPEL DO ÓXIDO NÍTRICO
O tratamento dos animais com L-Arginina (450 mg/Kg, i.p.) ou com
mangiferina (30 mg/kg, v.o.) promoveu uma inibição significativa (p<0,01) do
percentual de área lesionada (15,13 ± 2,56%; 19,46 ± 2,30%,
respectivamente), quando comparado ao grupo controle veículo (41,37 ±
2,15%. O pré-tratamento com L-NAME (20 mg/kg, i.p.) atenuou
significativamente (p<0,01) a inibição da lesão gástrica promovida pela
mangiferina (48,61 ± 6,95%) e pela L-arginina (50,23 ± 3,50%) (Tabela 3 e
Figura 7).
5.2.3. EFEITO GASTROPROTETOR DA MANGIFERINA NA LESÃO
GÁSTRICA INDUZIDA POR ETANOL: PARTICIPAÇÃO DAS
PROSTAGLANDINAS
Os grupos tratados com misoprostol (0,016 mg/kg, v.o.) ou com
mangiferina (30 mg/kg, v.o.) apresentaram uma diminuição significativa
(p<0,001) na injúria gástrica provocada pelo etanol (11,34 ± 1,39%; 11,40 ±
2,55%, respectivamente) quando comparados ao grupo controle veículo (30,90
± 2,15%). O pré-tratamento com indometacina (10 mg/kg, v.o.) promoveu uma
reversão significativa (p<0,01) na gastroproteção do misoprostol (23,93 ±
1,83%) e também da mangiferina (27,72 ± 2,95%) (Tabela 4 e Figura 8).
69
TABELA 3. Efeito do L-NAME na gastroproteção da mangiferina no modelo
de úlcera gástrica induzida por etanol em camundongos.
GRUPOS
DOSE
(mg/kg)
ÁREA DE LESÃO GÁSTRICA
(mm
2
)
Controle (veículo)
-
41,37 ± 2,15
L-Arginina 450 19,46 ± 2,30
a
Mangiferina 30 15,13 ± 2,56
a
L-Arginina + L-NAME 450 + 20 50,23 ± 3,50
b
Mangiferina + L-NAME 30 + 20 48,61 ± 6,95
c
Os valores representam a média ± erro padrão da média (E.P.M.) para 8
animais/grupo. Os animais foram tratados com veículo (3% de Tween 80, v.o.),
mangiferina (30 mg/kg, v.o.) ou L-Arginina (450 mg/kg, i.p.). L-NAME (20 mg/kg,
i.p.) foi administrado 30 minutos antes dos tratamentos com mangiferina ou L-
Arginina. Etanol absoluto (0,2 mL/animal, v.o.) foi administrado 1 hora ou 30
minutos após os tratamentos com mangiferina ou L-Arginina, respectivamente.
a
p<0,01 vs Controle;
b
p<0,01 vs L-Arginina;
c
p<0,01 vs Mangiferina (ANOVA e
Teste de Student Newman Keul, como teste post hoc).
70
FIGURA 7. Efeito do L-NAME na proteção gástrica da mangiferina à lesão
gástrica induzida por álcool em camundongos. Os valores representam a
média ± erro padrão da média (E.P.M.) para 8 animais/grupo. Os animais foram
tratados com veículo (3% de Tween 80, v.o.), mangiferina (30 mg/kg, v.o.) ou L-
Arginina (450 mg/kg, i.p.). L-NAME (20 mg/kg, i.p.) foi administrado 30 minutos
antes dos tratamentos com mangiferina ou L-Arginina. Etanol absoluto (0,2
mL/animal, v.o.) foi administrado 1 hora ou 30 minutos após os tratamentos com
mangiferina ou L-Arginina, respectivamente.
a
p<0,01 vs Controle;
b
p<0,01 vs L-
Arginina;
c
p<0,01 vs Mangiferina (ANOVA e Teste de Student Newman Keul,
como teste post hoc).
71
TABELA 4. Efeito da indometacina na gastroproteção da mangiferina no
modelo de úlcera gástrica induzida por etanol em camundongos.
GRUPOS
DOSE
(mg/kg)
ÁREA DE LESÃO GÁSTRICA
(mm
2
)
Controle (veículo)
-
30,90 ± 2,15
Misoprostol 0,016 11,34 ± 1,39
a
Mangiferina 30 11,40 ± 2,55
a
Misoprostol + Indometacina 0,016 + 10 23,93 ± 1,83
b
Mangiferina + Indometacina 30 + 10 27,72 ± 2,95
c
Os valores representam a média ± erro padrão da média (E.P.M.) para 8
animais/grupo. Os animais foram tratados com veículo (3% de Tween 80, v.o.),
mangiferina (30 mg/kg, v.o.) ou misoprostol (0,016 mg/kg, v.o.). Indometacina (10
mg/kg, i.p.) foi administrada 2 horas antes dos tratamentos com mangiferina ou
misoprostol. Etanol absoluto (0,2 mL/animal, v.o.) foi administrado 1 hora após os
tratamentos com mangiferina ou misoprostol.
a
p<0,001 vs Controle;
b
p<0,01 vs
Misoprostol;
c
p<0,01 vs Mangiferina (ANOVA e Teste de Student Newman Keul,
como teste post hoc).
72
FIGURA 8. Efeito da indometacina na gastroproteção da mangiferina à
lesão gástrica induzida por etanol absoluto em camundongos. Os valores
representam a média ± erro padrão da média (E.P.M.) para 8 animais/grupo.
Os animais foram tratados com veículo (3% de Tween 80, v.o.), mangiferina
(30 mg/kg, v.o.) ou misoprostol (0,016 mg/kg, v.o.). Indometacina (10 mg/kg,
i.p.) foi administrada 60 minutos antes dos tratamentos com mangiferina ou
capsaicina. Etanol absoluto (0,2 mL/animal, v.o.) foi administrado 1 hora após
os tratamentos com mangiferina ou misoprostol.
a
p<0,001 vs Controle;
b
p<0,01 vs Misoprostol;
c
p<0,01 vs Mangiferina (ANOVA e Teste de Student
Newman Keul, como teste post hoc).
73
5.2.4. EFEITO GASTROPROTETOR DA MANGIFERINA NA LESÃO
GÁSTRICA INDUZIDA POR ETANOL: PAPEL DOS CANAIS DE POTÁSSIO
ATP - DEPENDENTES
O tratamento dos animais com diazóxido (3 mg/kg, i.p.) ou com
mangiferina (30 mg/kg, v.o.) promoveu uma redução significativa (p<0,01) da
lesão gástrica induzida pelo etanol (15,11 ± 2,85%; 18,50 ± 1,50%,
respectivamente), quando comparado ao grupo controle veículo (40,40 ±
2,07%). O pré-tratamento com glibenclamida (5 mg/kg, i.p.) reverteu
significativamente (p<0,01) a gastroproteção da mangiferina (32,25 ± 7,74) e do
diazóxido (19,38 ± 6,32) (Tabela 5 e Figura 9).
5.2.5. EFEITO GASTROPROTETOR DA MANGIFERINA NA LESÃO
GÁSTRICA INDUZIDA POR ETANOL: PAPEL DOS GRUPOS SULFIDRILAS
NÃO PROTÉICOS (NP-SH) GÁSTRICOS
Os animais que receberam etanol mostraram significativa redução
(p<0,001) nos níveis de NP-SH (180,5 ± 12,47 µg/g de tecido) quando
comparado ao controle que recebeu apenas o veículo. Mangiferina (30 mg/kg)
foi capaz de atenuar a depleção dos grupos sulfidrilas produzida pelo etanol
(276,1 ± 11,40 µg/g de tecido) de forma significativa (p<0,01). A N-acetilcisteína
(750 mg/kg) inibiu significativamente (p<0,001) a depleção dos grupos
sulfidrilas (318,1 ± 18,93 µg/g de tecido) produzida pelo etanol (Tabela 6 e
Figura 10).
74
TABELA 5. Efeito da glibenclamida na gastroproteção da mangiferina no
modelo de úlcera gástrica induzida por etanol em camundongos.
GRUPOS
DOSE
(mg/kg)
ÁREA DE LESÃO GÁSTRICA
(mm
2
)
Controle (veículo)
-
40,40 ± 2,07
Diazóxido 3 18,50 ± 1,50
a
Mangiferina 30 15,11 ± 2,85
a
Diazóxido + Glibenclamida 3 + 5 44,71 ± 4,02
b
Mangiferina + Glibenclamida 30 + 5 38,52 ± 1,35
c
Os valores representam a média ± erro padrão da média (E.P.M.) para 8
animais/grupo. Os animais foram tratados com veículo (3% de Tween 80, v.o.),
mangiferina (30 mg/kg, v.o.) ou diazóxido (3 mg/kg, i.p.). Glibenclamida (5 mg/kg,
i.p.) foi administrada 30 minutos antes dos tratamentos com mangiferina ou
diazóxido. Etanol absoluto (0,2 mL/animal, v.o.) foi administrado 1 hora ou 30
minutos após os tratamentos com mangiferina ou diazóxido, respectivamente.
a
p<0,01 vs Controle;
b
p<0,01 vs Diazóxido;
c
p<0,01 vs Mangiferina (ANOVA e Teste
de Student Newman Keul, como teste post hoc).
75
FIGURA 9. Efeito do tratamento com glibenclamida na proteção da
mangiferina frente às lesões gástricas induzidas por etanol absoluto em
camundongos. Os valores representam a média ± erro padrão da média
(E.P.M.) para 8 animais/grupo. Os animais foram tratados com veículo (3% de
Tween 80, v.o.), mangiferina (30 mg/kg, v.o.) ou diazóxido (3 mg/kg, i.p.).
Glibenclamida (5 mg/kg, i.p.) foi administrada 30 minutos antes dos tratamentos
com mangiferina ou diazóxido. Etanol absoluto (0,2 mL/animal, v.o.) foi
administrado 1 hora ou 30 minutos após os tratamentos com mangiferina ou
diazóxido, respectivamente.
a
p<0,01 vs Controle;
b
p<0,01 vs Diazóxido;
c
p<0,01 vs Mangiferina (ANOVA e Teste de Student Newman Keul, como teste
post hoc).
76
TABELA 6. Efeito da mangiferina e N-acetilcisteína (NAC) sobre os
níveis de grupos sulfidrilas não protéicos (NP-SH) no modelo de
úlcera gástrica induzida por etanol em camundongos.
GRUPOS
DOSE
(mg/kg)
NP-SH
(µg/g tecido)
Controle (veículo)
-
435,6 ± 16,79
Controle (etanol) - 180,5 ± 12,47
a
Mangiferina 30 276,1 ± 11,40
b
NAC 750 318,1 ± 18,93
c
Os resultados são expressos como média ± erro padrão da média (E.P.M.)
para os níveis gástricos de glutationa (NP-SH) de 8 animais/grupo. Os níveis
foram analisados 30 minutos após a administração oral de etanol. Veículo
(3% de Tween 80 em salina 0,9%, 10 mL/kg) e mangiferina (30 mg/kg) foram
administrados por via oral e N-acetilcisteína (NAC - 750 mg/kg) por via
intraperitoneal, 1 hora antes da administração de etanol absoluto (0,2
mL/animal v.o.).
a
p<0,001 vs controle veículo;
b
p<0,01 vs controle etanol;
c
p<0,001 vs controle etanol (ANOVA e Teste de Student Newman Keul, como
teste post hoc).
77
FIGURA 10. Efeito da mangiferina e N-acetilcisteína (NAC) sobre os níveis
de grupos sulfidrilas não protéicos nas lesões gástricas induzidas por
etanol em camundongos. Os valores representam a média ± erro padrão da
média (E.P.M.) para 8 animais/grupo. Os níveis de glutationa foram analisados
30 minutos após a administração oral de etanol. Os animais foram tratados
com veículo (3% de Tween 80, v.o.), mangiferina (30 mg/kg, v.o.) ou NAC (750
mg/kg, i.p.) 1 hora antes da administração de etanol absoluto (0,2 mL/animal).
a
p<0,001 vs controle veículo;
b
p<0,01 vs controle etanol;
c
p<0,001 vs controle
etanol (ANOVA e Teste de Student Newman Keul, como teste post hoc).
78
5.2.6 EFEITO GASTROPROTETOR DA MANGIFERINA NA LESÃO
GÁSTRICA INDUZIDA POR ETANOL: AÇÃO SOBRE A PEROXIDAÇÃO
LIPÍDICA
Os animais que receberam etanol mostraram significativo aumento
(p<0,001) nos níveis de malonildealdeído (86,44 ± 9,47 nmol/g de tecido)
quando comparado ao controle que recebeu apenas o veículo (54,53 ± 6,22
nmol/g de tecido). Mangiferina (30 mg/kg) foi capaz de atenuar a produção de
malonildealdeído produzida pelo etanol (54,0 ± 7,43 nmol/g de tecido) de forma
significativa (p<0,01). A N-acetilcisteína (750 mg/kg) inibiu significativamente
(p<0,001) o aumento nos níveis de malonildealdeído (31,73 ± 4,65 nmol/g de
tecido) produzida pelo etanol (Tabela 7 e Figura 11).
79
TABELA 7. Efeito da mangiferina e N-acetilcisteína (NAC) sobre os
níveis de malonildealdeído no modelo de úlcera gástrica induzida por
etanol em camundongos.
GRUPOS
DOSE
(mg/kg)
MALONILDEALDEÍDO
(nmol/g tecido)
Controle (veículo)
-
54,53 ± 6,22
Controle (etanol) - 86,44 ± 9,47
Mangiferina 30 54,0 ± 7,43
a, b
NAC 750 31,73 ± 4,65
a, c
Os resultados são expressos como média ± erro padrão da média (E.P.M.)
para os níveis gástricos de malonildealdeído de 8 animais/grupo. Os níveis
foram analisados 30 minutos após a administração oral de etanol. Veículo
(3% de Tween 80 em salina 0,9%, 10 mL/kg) e mangiferina (30 mg/kg) foram
administrados por via oral e N-acetilcisteína (NAC - 750 mg/kg) por via
intraperitoneal, 1 hora antes da administração de etanol absoluto (0,2
mL/animal v.o.).
a
p<0,001 vs controle etanol;
b
p>0,05 vs controle veículo;
c
p<0,05 vs controle veículo (ANOVA e Teste de Student Newman Keul, como
teste post hoc).
80
Controle Controle 30 750
0
20
40
60
80
100
120
(veículo) (Etanol)
Mangiferina
NAC
mg/kg
a, b
a, c
nmol/g de tecido
FIGURA 11. Efeito da mangiferina e N-acetilcisteína (NAC) sobre os
níveis de malonildealdeído nas lesões gástricas induzidas por etanol
em camundongos. Os valores representam a média ± erro padrão da média
(E.P.M.) para 8 animais/grupo. Os níveis de malonildealdeído foram
analisados 30 minutos após a administração oral de etanol. Os animais foram
tratados com veículo (3% de Tween 80, v.o.), mangiferina (30 mg/kg, v.o.) ou
NAC (750 mg/kg, i.p.) 1 hora antes da administração de etanol absoluto (0,2
mL/animal).
a
p<0,001 vs controle etanol;
b
p>0,05 vs controle veículo;
c
p<0,05
vs controle veículo (ANOVA e Teste de Student Newman Keul, como teste
post hoc).
81
5.3. EFEITO DA MANGIFERINA NA ÚLCERA GÁSTRICA INDUZIDA POR
ETANOL ACIDIFICADO EM CAMUNDONGOS
Os efeitos da mangiferina e do lansoprazol sobre as lesões gástricas
induzidas por etanol acidificado estão demonstrados na Tabela 8 e Figura 12.
A administração de etanol acidificado promoveu grandes lesões
hemorrágicas na mucosa gástrica no grupo controle que recebeu apenas
veículo (33,50 ± 2,17 %).
Mangiferina, em todas as doses testadas (3, 10 e 30 mg/kg), foi capaz
de atenuar significativamente (p<0,001) o dano à mucosa gástrica induzida
pelo etanol acidificado (24,38 ± 1,32; 18,54 ± 2,18 e 7,09 ± 2,18%;
respectivamente), inibindo em 27, 44 e 78% as lesões. Este efeito foi dose
dependente nas doses de 10 e 30 mg/kg.
Da mesma forma lansoprazol (30 mg/kg), fármaco de referência, reduziu
significativamente (23,94 ± 2,40%) as lesões gástricas (p<0,01) induzidas pelo
etanol acidificado em 28,53%.
82
TABELA 8. Efeito da mangiferina e lansoprazol no modelo de úlcera gástrica
induzida por etanol acidificado em camundongos.
GRUPOS
DOSE
(mg/kg)
ÁREA DE LESÃO GÁSTRICA
(mm
2
)
% INIBIÇÃO
Controle (veículo)
-
33,50 ± 2,17
-
3 24,38 ± 1,32** 27,22
10 18,54 ± 2,18*** 44,65
Mangiferina
30 7,09 ± 2,18*** 78,83
Lansoprazol 30 23,94 ± 2,40** 28,53
Os resultados são expressos como média ± erro padrão da média (E.P.M.) para 8
animais/grupo. Veículo (3% de Tween 80 em salina 0,9%, 10 mL/kg), mangiferina
(3, 10 e 30 mg/kg) e N-acetilcisteína (NAC - 750 mg/kg) foram administrados por
via oral, 1 hora antes da administração de uma solução de 0,3M de HCl em etanol
60% (0,2 mL/animal v.o.). Os animais foram sacrificados 1 hora após a
administração do etanol acidificado. **p<0,01; ***p<0,001 vs controle veículo
(ANOVA e Teste de Student Newman Keul, como teste post hoc).
83
FIGURA 12. Efeito da mangiferina e lansoprazol nas lesões gástricas
induzidas por etanol acidificado em camundongos. Os valores representam
a média ± erro padrão da média (E.P.M.) para 8 animais/grupo. Os animais
foram tratados com veículo (3% de Tween 80, v.o.), mangiferina (3, 10 e 30
mg/kg, v.o.) e lansoprazol (30 mg/kg, v.o.) 1 hora antes da administração de
uma solução de 0,3M de HCl em etanol 60% (0,2 mL/animal, v.o.). Os animais
foram sacrificados 1 hora após a administração do etanol acidificado. **p<0,01;
***p<0,001 vs controle veículo (ANOVA e Teste de Student Newman Keul,
como teste post hoc).
84
5.4. EFEITO DA MANGIFERINA SOBRE AS ÚLCERAS GÁSTRICAS
INDUZIDAS POR INDOMETACINA EM CAMUNDONGOS
A Tabela 9 e Figura 13 mostram os efeitos da mangiferina e do
lansoprazol nas lesões gástricas induzidas por indometacina.
A administração oral de indometacina (30 mg/kg) produziu lesões
gástricas com uma média de escores de 15,54 ± 1,46. O pré-tratamento dos
animais com mangiferina, nas doses testadas (3, 10 e 30 mg/kg), reduziu
significativamente (p<0,001) a média de escores das lesões (12,07 ± 1,03;
11,69 ± 1,28 e 6,60 ± 1,70, respectivamente), representando uma inibição de
22, 24 e 57%. Este efeito apresentou dose dependência nas doses de 10 e 30
mg/kg.
De forma semelhante, os animais pré-tratados com lansoprazol (30
mg/kg) apresentaram uma redução significativa (p<0,001) dos escores de lesão
gástrica (3,66 ± 1,39) correspondendo a uma inibição de 76,44%.
85
TABELA 9. Efeito da mangiferina e lansoprazol no modelo de úlcera gástrica
induzida por indometacina em camundongos.
GRUPOS
DOSE
(mg/kg)
LESÃO GÁSTRICA
(escores)
% INIBIÇÃO
Controle (veículo)
-
15,54 ± 1,46
-
3
12,07 ± 1,03*
22,32
10
11,69 ± 1,28*
24,27 Mangiferina
30
6,60 ± 1,70***
57,52
Lansoprazol 30
3,66 ± 1,39***
76,44
Os resultados são expressos como média ± erro padrão da média (E.P.M.) para 8
animais. Veículo (3% de Tween 80 em salina 0,9%, 10 mL/kg), mangiferina (3, 10 e
30 mg/kg) e lansoprazol (30 mg/kg) foram administrados por via oral, 1 hora antes da
administração de indometacina (30 mg/kg, v.o.). Os animais foram sacrificados 8
horas após a administração da indometacina. *p<0,05; ***p<0,001 vs controle veículo
(ANOVA e Teste de Kruskal Wallis - Dunnett).
86
FIGURA 13. Efeito da mangiferina e lansoprazol sobre a úlcera gástrica induzida
por indometacina em camundongos. Os resultados são expressos como média ±
erro padrão da média (E.P.M.) para 8 animais. Veículo (3% de Tween 80 em salina
0,9%, 10 mL/kg), mangiferina (3, 10 e 30 mg/kg) e lansoprazol (30 mg/kg) foram
administrados por via oral, 1 hora antes da administração de indometacina (30 mg/kg,
v.o.). Os animais foram sacrificados 8 horas após a administração da indometacina.
*p<0,05; ***p<0,001 vs controle veículo (ANOVA e Teste de Kruskal Wallis - Dunnett).
87
5.5. EFEITO DA MANGIFERINA SOBRE A LESÃO GÁSTRICA INDUZIDA
PELO COMPOSTO 48/80 EM CAMUNDONGOS
Os efeitos da mangiferina e da ciproheptadina sobre as lesões gástricas
induzidas pelo composto 48/80 estão demonstradas na Tabela 10 e Figura 14.
A administração intraperitonial do composto 48/80 (0,75 mg/kg) produziu
lesões gástricas no grupo controle com uma média de escores de 6,30 ± 0,26.
Os grupos tratados com mangiferina (3, 10 e 30 mg/kg) apresentaram
significativa redução (p<0,05) dos escores apenas nas doses de 10 e 30 mg/kg
(3,90 ± 0,31 e 1,80 ± 0,21 respectivamente), de forma dose dependente.
Ciproheptadina (10 mg/kg), um conhecido antialérgico, reduziu
significativamente (p<0,01) os escores de lesão (3,30 ± 0,36) quando
comparado ao grupo controle.
88
TABELA 10. Efeito da mangiferina e ciproheptadina no modelo de lesão
gástrica induzida pelo composto 48/80 em camundongos.
GRUPOS
DOSE
(mg/kg)
LESÃO GÁSTRICA
(escores)
Controle (veículo)
-
6,30 ± 0,26
3 4,40 ± 0,22
10 3,90 ± 0,31* Mangiferina
30 1,80 ± 0,21***
Ciproheptadina 10 3,30 ± 0,36**
Os resultados são expressos como média ± erro padrão da média (E.P.M.)
para 8 animais/grupo. Veículo (3% de Tween 80 em salina 0,9%, 10 mL/kg),
mangiferina (3, 10 e 30 mg/kg) e ciproheptadina (10 mg/kg) foram
administrados por via oral, 30 minutos após a injeção intraperitonial do
composto 48/80 (0,75 mg/kg). Os animais foram sacrificados 3 horas após o
tratamento com o composto 48/80. *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001 vs controle
veículo (ANOVA e Teste de Kruskal Wallis – Dunnett).
89
FIGURA 14. Efeito da mangiferina e ciproheptadina sobre a lesão gástrica
induzida pelo composto 48/80 em camundongos. Os resultados são
expressos como média ± erro padrão da média (E.P.M.) para 8 animais/grupo.
Veículo (3% de Tween 80 em salina 0,9%, 10 mL/kg), mangiferina (3, 10 e 30
mg/kg) e ciproheptadina (10 mg/kg) foram administrados por via oral, 30
minutos após a injeção intraperitonial do composto 48/80 (0,75 mg/kg). Os
animais foram sacrificados 3 horas após o tratamento com o composto 48/80.
*p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001 vs controle veículo (ANOVA e Teste de Kruskal
Wallis - Dunnett).
90
5.6. EFEITO DA MANGIFERINA SOBRE A SECREÇÃO GÁSTRICA NO
MODELO DE LIGAÇÃO DO PILORO EM RATOS
A administração intraduodenal da mangiferina (30 mg/kg), em ratos com
piloro ligado por 4 horas, diminuiu significativamente (p<0,05) o volume
secretório gástrico (3,20 ± 0,21 mL), quando comparado ao controle (4,72 ±
0,39 mL).
Mangiferina também foi capaz de inibir, significativamente (p<0,001), a
acidez total gástrica (61,67 ± 5,90 µEq/h) em relação ao grupo controle (128,9
± 9,38 µEq/h). Cimetidina (100 mg/kg), um conhecido antagonista H
2
, não
alterou o volume secretório gástrico em comparação com o controle. Já a
acidez total gástrica foi significativamente reduzida também pela cimetidina
(27,32 ± 3,71 µEq/h), quando comparada ao controle (Tabela 11 e Figuras 15 e
16).
91
TABELA 11. Efeito da mangiferina e cimetidina sobre o volume secretório
gástrico e acidez gástrica total em ratos com piloro ligado.
GRUPOS
DOSE
(mg/kg)
Volume Secretório
Gástrico (mL)
Acidez Total Gástrica
(µEq/h)
Controle (veículo)
-
4,72 ± 0,39
128,9 ± 9,38
Mangiferina 30 3,20 ± 0,21* 61,67 ± 5,90***
Cimetidina 100 4,11 ± 0,43 27,32 ± 3,71***
Os resultados são expressos como média ± erro padrão da média (E.P.M.) para 6
animais do volume secretório gástrico (mL) e da acidez gástrica total (µEq/h). Veículo
(3% de Tween 80 em salina 0,9%), mangiferina (30 mg/kg) e cimetidina (100 mg/kg)
foram administrados por via intraduodenal, imediatamente após a ligação do piloro.
Os animais foram sacrificados 4 horas após a ligação do piloro. *p<0,05 vs controle
normal; ***p<0,001 vs controle normal (ANOVA e Teste de Student Newman Keul,
como teste post hoc).
92
FIGURA 15. Efeito da administração intraduodenal mangiferina e
cimetidina no volume secretório gástrico em ratos. Os valores
representam a média ± erro padrão da média (E.P.M.) para 6
animais/grupo. Veículo (3% de Tween 80 em salina 0,9%), mangiferina
(30 mg/kg) e cimetidina (100 mg/kg) foram administrados por via
intraduodenal, imediatamente após a ligação do piloro. Os animais foram
sacrificados 4 horas após a ligação do piloro. *p<0,05 vs controle normal
(ANOVA e Teste de Student Newman Keul, como teste post hoc).
93
FIGURA 16. Efeito da administração intraduodenal da mangiferina e
cimetidina na acidez total gástrica em ratos. Os valores representam a
média ± erro padrão da média (E.P.M.) para 6 animais/grupo. Veículo (3% de
Tween 80 em salina 0,9%), mangiferina (30 mg/kg) e cimetidina (100 mg/kg)
foram administrados por via intraduodenal, imediatamente após a ligação do
piloro. Os animais foram sacrificados 4 horas após a ligação do piloro.
***p<0,001 vs controle normal (ANOVA e Teste de Student Newman Keul,
como teste post hoc).
94
5.7. EFEITO DA MANGIFERINA SOBRE O ESVAZIAMENTO GÁSTRICO EM
RATOS
Os efeitos da mangiferina e atropina sobre o esvaziamento gástrico em
ratos estão demonstrados na Tabela 12 e Figura 17.
Os animais que receberam vermelho de fenol (0,5 mg/kg) e foram
tratados apenas com veículo, apresentaram uma média de 29,62 ± 2,33 µg/mL
de corante por estômago. Apenas o grupo tratado com mangiferina na dose de
30 mg/kg reduziu significativamente (p<0,001) a quantidade média de corante
(8,65 ± 2,58 µg/mL) em comparação com o grupo controle, aumentando o
esvaziamento gástrico. O antagonista dos receptores muscarínicos, atropina (3
mg/kg) diminuiu o esvaziamento gástrico, aumentando de forma significativa
(p<0,01) a concentração média de corante por estômago (46,31 ± 3,24 µg/mL).
95
TABELA 12. Efeito da mangiferina e atropina sobre o
esvaziamento gástrico em ratos.
GRUPOS
DOSE
(mg/kg)
VERMELHO DE FENOL
(µg/mL)
Controle (veículo)
-
29,62 ± 2,33
3 29,63 ± 1,55
10 29,73 ± 1,69 Mangiferina
30 8,65 ± 2,58
a
Atropina 3 46,31 ± 3,24
b
Os resultados são expressos como média ± erro padrão da
média (E.P.M.) do conteúdo gástrico de vermelho de fenol
(µg/mL) para 6 animais/grupo. Veículo (3% de Tween 80 em
salina 0,9%), mangiferina (3, 10 e 30 mg/kg) e atropina (3 mg/kg)
foram administrados por via oral 45 minutos antes do vermelho
de fenol. Os animais foram sacrificados 15 minutos após a
administração do vermelho de fenol.
a
p<0,001;
b
p<0,01 vs
Controle (veículo) (ANOVA e Teste de Student Newman Keul,
como teste post hoc).
96
FIGURA 17. Efeito da mangiferina e atropina sobre o esvaziamento
gástrico em ratos. Os resultados são expressos como média ± erro padrão
da média (E.P.M.) do conteúdo gástrico de vermelho de fenol (µg/mL) para 6
animais/grupo. Veículo (3% de Tween 80 em salina 0,9%), mangiferina (3, 10
e 30 mg/kg) e atropina (3 mg/kg) foram administrados por via oral 45 minutos
antes do vermelho de fenol. Os animais foram sacrificados 15 minutos após a
administração do vermelho de fenol.
a
p<0,001;
b
p<0,01 vs Controle (veículo)
(ANOVA e Teste de Student Newman Keul, como teste post hoc).
97
6. DISCUSSÃO
Embora existam muitos produtos disponíveis no mercado para o
tratamento de desordens gastrintestinais, incluindo antiácidos, inibidores da
bomba de prótons, anticolinérgicos e antagonistas histaminérgicos, a maioria
destas drogas produzem severas reações adversas, como ginecomastia,
alterações hematopoiéticas, nefrite intestinal aguda (RA & TOBE, 2004),
trombocitopenia (ZLABEK & ANDERSON, 2002), reações anafiláticas
(GONZALEZ et al., 2002), nefrotoxidade e hepatotoxidade (FISHER & LE
COUTEUR, 2001). Além disso, em países de terceiro mundo como o Brasil, o
tratamento para patologias que acometem o sistema gastrintestinal é muito
caro, o que impede o acesso da maioria da população a terapia. Assim, existe
a necessidade do desenvolvimento de agentes efetivos, seguros e de baixo
custo para o combate de doenças como úlcera péptica e dispepsia.
As plantas medicinais estão entre as mais atrativas fontes de novas
drogas, e foi demonstrado que elas apresentam resultados promissores no
tratamento de gastropatias (BORRELLI & IZZO, 2000). No Brasil, um grande
número de preparações a partir de plantas é utilizado na medicina popular para
o tratamento de vários tipos de desordens gástricas (GRACIOSO et al., 2002;
TOMA et al., 2002; ALMEIDA et al., 2003). Este fato, aliado a grande
biodiversidade existente no Brasil, impulsiona a pesquisa por novas drogas
gastroprotetoras a partir de produtos naturais.
Frutas e vegetais contém constituintes químicos bioativos, incluindo
flavonóides, terpenos, xantonas, saponinas, alcalóides e taninos, capazes de
oferecer gastroproteção (RAO et al., 1997; SANTOS & RAO, 2001; BAGGIO et
98
al., 2005; MORIKAWA et al., 2006). Mangiferina é uma glicosilxantona isolada
da mangueira (Mangifera indica L.) para qual se encontram descritas na
literatura diversas ações farmacológicas, dentre elas ação antioxidante (LEIRO
et al., 2003; NÚÑEZ-SELLÉS et al., 2007), imunomodulatória (DAR et al.,
2005), antialérgica (RIVERA et al., 2006) e cardioprotetora (YOSHIMI et al.,
2001). Evidências clínicas e experimentais sugerem que o estresse oxidativo
está estreitamente relacionado à etiopatologia da doença ulcerosa péptica, e
que substâncias antioxidantes, como a mangiferina, podem desempenhar ação
gastroprotetora (REPETTO et al., 2002; THOMPSON et al., 2006).
Os modelos animais desempenham um papel importante na busca de
novas drogas com propriedades gastroprotetoras. Considerando que a etiologia
da úlcera é multifatorial, as lesões na mucosa gástrica podem ser induzidas por
diferentes modelos experimentais, utilizando diversos mecanismos
(SAMONINA et al., 2004). Alguns dos modelos agudos mais utilizados para
avaliação de substâncias antiulcerogênicas em animais são os de lesão
gástrica induzida por etanol e por indometacina (PANDIAN et al., 2002). No
presente trabalho, além de utilizar esses modelos, nós também avaliamos o
efeito da mangiferina em outros modelos como os de ulceração gástrica
induzida por etanol acidificado e pelo composto 48/80 em camundongos.
A úlcera gástrica induzida por etanol ocorre predominantemente na
porção glandular do estômago, sendo resultante de uma ação necrotizante
direta além da redução dos fatores de defesa como secreção de bicarbonato e
muco além de aumento do estresse oxidativo (RUJJANAWATE et al., 2005).
Mangiferina (3, 10 e 30 mg/kg), foi capaz de prevenir as lesões gástricas
induzidas pela administração de etanol e etanol acidificado, demonstrando
99
ação gastroprotetora e eficácia por via oral. As doses utilizadas neste estudo
podem ser consideradas não tóxicas com base nos dados da literatura que
descrevem uma DL
50
de 400 mg/kg para mangiferina em camundongos
(JAGETIA et al., 2005).
Os radicais livres são lesivos através de uma variedade de mecanismos,
dentre eles a peroxidação dos ácidos graxos das membranas celulares. As
mudanças conformacionais nos ácidos graxos resultantes da peroxidação
lipídica alteram a permeabilidade e fluidez da membrana, prejudicando as
funções dos receptores, canais iônicos e outras proteínas que fazem parte da
membrana (FREEMAN & CRAPO, 1982). Compostos sulfidrilas desempenham
um importante papel no reparo de danos celulares quando agentes oxidantes
estão envolvidos no processo de injúria (SZABO et al., 1981). O tratamento
agudo com etanol promove estresse oxidativo com conseqüente aumento da
peroxidação lipídica, aumentando os níveis de malonildealdeído, e depleção
dos níveis dos grupos sulfidrilas não-proteicos (REPETTO et al., 2002).
No presente estudo, mangiferina foi capaz de diminuir significativamente
os níveis de malonildealdeído formados pela administração de etanol.
Semelhante ao observado para N-acetilcistéina, um doador de sulfidrilas,
mangiferina atenuou a depleção dos níveis de grupos sulfidrilas não protéicos
nas lesões gástricas induzidas por etanol. Dessa forma, torna-se plausível
sugerir que a ação gastroprotetora da mangiferina se deva, ao menos em
parte, a suas propriedades antioxidantes.
Baseado nos resultados obtidos, que demonstraram o efeito gastroprotetor
da mangiferina frente às lesões gástricas induzidas por etanol, decidimos
investigar os possíveis mecanismos envolvidos nessa atividade. Dentre os
100
vários fatores envolvidos na manutenção da integridade na mucosa gástrica e
proteção contra injúria provocada pelo etanol, dedicamos nossa atenção à
contribuição das fibras aferentes sensíveis à capsaicina, óxido nítrico
endógeno, prostaglnadinas (PGs) e canais de potássio sensíveis a ATP (K
ATP
)
(ZAYACHKIVSKA et al., 2004; BRZOZOWSKI et al., 2005) na atividade
gastroprotetora da mangiferina. Seguindo este propósito, investigamos se o
efeito protetor da mangiferina nas lesões induzidas por etanol é sensível ao
bloqueio das prostaglandinas, capsaicina, síntese de óxido nítrico ou da
ativação dos canais de K
ATP
pela indometacina, capsazepina, L-NAME ou
glibenclamida, respectivamente.
A inervação da mucosa apresenta importante papel na proteção
gástrica, em particular, as fibras aferentes sensíveis a capsaicina têm sido
implicadas diretamente na resposta aguda à agressão na mucosa, promovendo
a dilatação das arteríolas da submucosa e aumentando rapidamente a
circulação sangüínea local. Seu efeito estaria envolvido com a ativação dos
receptores TRPV1 (canal de potencial transiente tipo vanilóide subtipo 1) e com
a liberação de taquicininas e de peptídio relacionado ao gene da calcitonina
(CGRP), visto que a eliminação deste efeito foi observada com vagotomia,
administração de capsazepina, um antagonista TRPV1 (SCHUBERT, 2004),
antagonistas NK
2
de taquicininas e antagonistas dos receptores CGRP
(MINOWA et al., 2004). A ativação dos neurônios sensoriais por compostos
como a capsaicina promove também um aumento na produção de óxido nítrico
através da ativação da cNOS, com conseqüente aumento no fluxo sanguíneo
da mucosa o que reduz a susceptibilidade do estômago à danos
(EVANGELISTA, 2006).
101
Assim, a ativação das terminações destes neurônios aferentes protegeria
a mucosa gástrica da formação das lesões (HOLZER, 1998; HOLZER, 1991).
Este fato foi comprovado por estudos como os de Park e colaboradores (2000)
e Kagawa e colaboradores (2003), onde demonstrou-se que a capsaicina inibe
significativamente as lesões hemorrágicas induzidas por etanol em ratos, além
de inibir a peroxidação lipídica, a atividade da mieloperoxidase e aumentar a
secreção de bicarbonato.
A fim de verificar a participação dos neurônios aferentes sensíveis à
capsaicina na gastroproteção oferecida pela mangiferina os animais foram
tratados com o antagonista seletivo dos receptores TPPV1 capsazepina. Os
resultados obtidos revelaram que a gastroproteção proporcionada pela
mangiferina é resistente à capsazepina, sugerindo que os neurônios aferentes
sensíveis à capsaicina não participam da sua ação gastroprotetora.
O óxido nítrico é outro fator relevante na prevenção e reparo de injúrias
no TGI, participando no controle da produção de muco e secreção de
bicarbonato, na regulação do fluxo sanguíneo capilar da parede gastrintestinal,
além de atuar como agente citoprotetor, antiinflamatório e como complemento
aos efeitos protetores das prostaglandinas no estômago (WALLACE &
GRANJIER, 1996; MUSCARA & WALLACE, 1999). O NO reduz efetivamente a
injúria na mucosa gástrica provocada por agentes químicos, além de facilitar a
cicatrização do tecido lesado e a inibição da sua síntese aumenta a
susceptibilidade do estômago à injúria provocada por agentes químicos como o
etanol (MASUDA et al., 1995; KAWANO & TSUJI, 2000). A presença de NO em
baixas concentrações está associada aos efeitos benéficos no TGI, enquanto o
102
NO em altas concentrações pode induzir a formação de radicais derivados do
nitrogênio, que são altamente citotóxicos (WALLACE & MILLER et al., 2000).
O nosso estudo demonstra que o efeito gastroprotetor da mangiferina
contra a lesão gástrica induzida por etanol em camundongos é revertido pelo
tratamento com L-NAME (um inibidor não específico das enzimas NO
sintases). Assim, nossos resultados sugerem que o efeito da mangiferina
depende da presença de NO, pois a inibição da produção de NO endógeno
reverteu seu efeito gastroprotetor.
É conhecido que a prostaglandina E
2
possui uma ação protetora contra a
lesão gástrica provocada pelo etanol (GLAVIN et al., 1996). As PGs mantêm a
integridade da mucosa gástrica pela inibição da secreção ácida, estimulação da
secreção de muco e bicarbonato, inibição da ativação de mastócitos,
diminuição da aderência leucocitária ao endotélio vascular, inibição da
apoptose, aumento e manutenção do fluxo sangüíneo da mucosa (BATISTA et
al., 2004). As prostaglandinas apresentam particular importância na integridade
da mucosa gástrica quando mecanismos de defesa neuronal estão danificados
(PESKAR, 2001). No presente trabalho, a gastroproteção promovida pela
mangiferina é resistente à capsazepina havendo, portanto, a possibilidade da
participação das prostaglandinas endógenas neste mecanismo protetor.
A inibição da síntese de prostaglandinas endógenas mediada pela
administração de indometacina aos animais foi capaz de reverter o efeito
gastroprotetor da mangiferina frente às lesões gástricas induzidas por etanol, o
que nos leva a inferir que a produção de prostaglandinas está envolvida no
mecanismo protetor desta xantona.
103
Estudos demonstram que o efeito lesivo direto da indometacina na
mucosa gástrica de rato pode ser agravado pelo uso da glibenclamida.
Entretanto esse efeito pode ser inibido com o uso de cromokalim e diazóxido
(GOMES et al., 2006). Peskar e colaboradores (2002) demonstraram que a
gastroproteção por vários agentes é inibida não somente pela indometacina,
mas também pelo bloqueador dos canais de K
ATP
, glibenclamida. Estes dados
sugerem que o mecanismo de ação das prostaglandinas endógenas e
exógenas envolve a ativação dos canais de K
ATP
(PESKAR et al., 2002). Assim,
todos esses trabalhos sugerem que a regulação da abertura e fechamento dos
canais de K
ATP
no estômago pode ser um mecanismo de defesa da mucosa
gástrica agressões externas.
Nossos estudos evidenciaram que a glibenclamida reverteu o efeito
protetor da mangiferina. Visto que esta proteção é adicionalmente sensível à
indometacina, podemos sugerir que, nestas condições, as prostaglandinas
endógenas ativam os canais de K
ATP
, e este mecanismo é responsável, ao
menos em parte, pela ação gastroprotetora da mangiferina. Dessa forma, uma
explicação possível para o nosso resultado é que a mangiferina poderia
aumentar a síntese de prostaglandinas, ativando consequentemente os canais
de K
ATP
.
Sabe-se que a administração de drogas antiinflamatórias não-
esteroidais, como a indometacina, leva à alta incidência de inflamação e
úlceras no aparelho digestivo, especialmente no estômago. Além disso, o
tratamento com AINES é suspenso em 5% a 15% dos pacientes com artrite
reumatóide por causa de distúrbios gastrintestinais. Portanto, drogas capazes
de prevenir as lesões na mucosa gástrica são de suma importância na melhoria
104
da qualidade de vida dos pacientes em uso crônico de AINES (FUNATSU et
al., 2007).
Indometacina é um agente ulcerogênico conhecido, especialmente no
estômago vazio, sendo as úlceras induzidas por este AINE presentes
predominantemente na porção glandular do estômago (NWAFOR et al., 2007).
No modelo de lesões gástricas induzidas por indometacina, mangiferina
mostrou-se eficaz em prevenir o dano à mucosa, semelhante ao observado
para o inibidor da bomba de prótons lanzoprazol.
Garrido e colaboradores (2004) relatam o efeito antiinflamatório da
mangiferina, e apesar desta ação é interessante que no presente estudo
mangiferina demonstrou ação antiulcerogênica contra lesões gástricas
induzidas por etanol e indometacina, sugerindo um provável envolvimento das
prostaglandinas endógenas na sua ação protetora. No entanto, se mangiferina
promove ou não a liberação de prostaglandinas e, assim, promove uma melhor
microcirculação e uma conseqüente gastroproteção, ainda necessita de
estudos para confirmação.
A acidez da mucosa não representa um fator importante no modelo de
úlcera gástrica induzida por etanol (TARNAWSKI, et al., 1985), porém tem
enorme relevância no efeito ulcerogênico do etanol acidificado e da
indometacina (FUNATSU et al., 2007). Dessa forma a redução do volume e da
acidez total gástrica promovido pela mangiferina no teste em animais com
piloro ligado por 4 horas, nos leva a sugerir que este efeito pode estar
envolvido no seu mecanismo gastroprotetor.
Além de reduzir a secreção total ácida, verificamos que a mangiferina
(30 mg/kg) é capaz de aumentar o esvaziamento gástrico de forma
105
significativa. Sabe-se que a modulação farmacológica do esvaziamento
gástrico e da mistura ácido-base representa um mecanismo de defesa gástrica
importante na dispepsia funcional. Os mecanismos que participam da origem
dos sintomas na dispepsia funcional não são perfeitamente conhecidos e as
anormalidades da motilidade antro-piloro-duodenal constituem, provavelmente,
o grupo de fatores etiopatogênicos que tem sido demonstrado há mais tempo e
com maior freqüência (TRONCON, 2001).
O conceito de que pacientes com dispepsia funcional podem apresentar
diminuição anormal da contratilidade antral e retardo do esvaziamento gástrico,
fundamenta o uso racional de drogas pró-cinéticas, como a metoclopramida, a
cisaprida, a bromoprida e a domperidona. Estas drogas pró-cinéticas
aumentam tanto a amplitude, como a freqüência das contrações antrais pós-
prandiais e aceleram o esvaziamento gástrico. Estes efeitos são conseqüentes
à estimulação de receptores serotoninérgicos do tipo 4 (5-HT4) que, por sua
vez, aumentam a liberação de acetilcolina de terminações nervosas do plexo
mioentérico (TRONCON, 2001). Dessa forma podemos inferir uma possível
participação dos receptores 5-HT4 na ação pró-cinética da mangiferina, porém
estudos mais detalhados são necessários para confirmação desta hipótese.
Fármacos que inibem a secreção gástrica de ácido também são utilizados
rotineiramente no tratamento desta patologia (HOOGERWERF & PASRICHA,
2006). Diante do exposto torna-se plausível afirmar que a mangiferina
apresenta-se como droga potencialmente últil no tratamento da dispepsia
funcional principalmente devido à sua ação sobre a secreção ácida e o
esvaziamento gástrico.
106
RIVERA e colaboradores (2006) demonstraram que a mangiferina é
capaz de inibir a liberação de histamina estimulada pelo composto 48/80 em
mastócitos isolados de rato. O composto 48/80 é um conhecido degranulador
de mastócitos, e a estimulação dos mastócitos por esta substância parece
envolver uma trilha de sinais de transdução, culminando com a secreção de
serotonina e histamina. A infecção por H. pylori promove inflamação e redução
do fluxo sanguíneo da mucosa gástrica através da degranulação de mastócitos
(OHTA et al., 2004).
Estudos demonstram que animais tratados com composto 48/80
desenvolvem lesões gástricas que ocorrem com diminuição dos níveis de
glutationa peroxidase e aumento da peroxidação lipídica. Além disso, foi
demonstrado em ratos tratados com composto 48/80, que a liberação aguda de
serotonina contribui para a lesão da mucosa gástrica, enquanto a liberação de
histamina contribui principalmente com a progressão da lesão (OHTA et al.,
2006). Os resultados do presente estudo mostram que a administração oral de
mangiferina (30 mg/kg) previne efetivamente a progressão da lesão gástrica
induzida pelo composto 48/80.
Podemos inferir que a proteção exercida pela mangiferina neste modelo
agudo de lesão gástrica pode ser atribuída a sua ação antioxidante, prevenindo
a depleção de enzimas antioxidantes como a glutationa peroxidase e reduzindo
os níveis de peroxidação lipídica, além de sua capacidade inibitória sobre a
liberação de histamina pelos mastócitos. Novos testes se fazem necessários
para confirmação deste possível mecanismo.
O conjunto de nossos resultados atesta a ação gastroprotetora da
mangiferina, e mostra que esta ação envolve as prostaglandinas endógenas, a
107
produção de óxido nítrico, ativação dos canais de K
ATP
, diminuição da secreção
ácida e efeito antioxidante. No entanto, maiores esclarecimentos se fazem
necessários sobre os mecanismos moleculares que envolvem estes efeitos. O
presente estudo nos permite afirmar que a xantona glicosilada mangiferina
apresenta enorme potencial terapêutico para desenvolvimento de um fármaco
adjuvante no tratamento de patologias gastrintestinais como a úlcera gástrica e
dispepsia funcional promovida por AINES e quimioterápicos. Neste contexto, é
importante relembrar que as drogas inibidoras seletivas da COX-2, conhecidas
como coxibs (celecoxib e rofecoxib), as quais têm sido enfatizadas pelos
poucos efeitos colaterais gastrintestinais, foram responsáveis por um
importante evento no ano de 2004: o rofecoxib foi retirado do mercado devido
aos seus graves efeitos cardiovasculares, colocando consequentemente os
outros coxibs sob a suspeita de apresentar esta reação adversa, ainda que em
grau variável (RAINSFORD, 2007). Além disso, dados clínicos disponíveis na
literatura revelam que antiácidos, sais de bismuto e sucralfato não são mais
eficientes que placebo no tratamento da dispepsia funcional (SAAD & CHEY,
2006).
Em suma, nós demostramos pela primeira vez que a glicosilxantona isolada
da árvore frutífera Mangifera indica L. oferece gastroproteção contra lesão
gástrica aguda induzida por etanol absoluto, etanol acidificado, indometaccina
e composto 48/80 em camundongos. Os resultados deste estudo indicam uma
ação citoprotetora da mangiferina conferindo efeito gastroprotetor contra injúria
gástrica induzida por esses agentes, o qual pode ser devido, ao menos
parcialmente, às prostaglandinas endógenas, liberação de óxido nítrico e
abertura de canais de potássio sensíveis a ATP, e torna a mangiferina uma
108
substância promissora para o desenvolvimento de novas terapias para o
combate de gastropatias associadas à AINES e doença ulcerosa péptica.
109
7. CONCLUSÕES
Mangiferina apresentou atividade gastroprotetora em modelos
experimentais de lesão gástrica aguda (etanol, etanol acidificado,
indometacina e composto 48/80), de forma dose dependente,
demonstrando eficácia por via oral.
Mangiferina atenuou a depleção dos grupos sulfridrilas não-proteicos, e
reduziu a formação de malonildealdeído no modelo de lesão gástrica
induzida por etanol, indicando uma ação antioxidante como parte do seu
mecanismo de ação gastroprotetora;
O estudo do mecanismo citoprotetor da mangiferina indica um
envolvimento, em parte, das prostaglandinas endógenas, óxido nítrico e
abertura de canais de potássio sensíveis a ATP.
A investigação do envolvimento do receptor TRPV1 revelou que as fibras
aferentes sensíveis à capsaicina não estão envolvidas no mecanismo
gastroprotetor da mangiferina.
O mecanismo gastroprotetor da mangiferina também envolve a diminuição
da secreção ácida, demonstrada no teste em animais com piloro ligado por
4 horas, além de uma ação pró-cinética aumentando o esvaziamento
gástrico
110
Esse estudo demonstra a ação gastroprotetora da mangiferina e fornece
evidências de que esta xantona é uma substância promissora para o
desenvolvimento de novas terapias no combate a gastropatias associadas à
AINES e doença ulcerosa péptica.
111
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9. ANEXO - ARTIGO PUBLICADO
Artigo publicado: Gastroprotective Effect of Mangiferin, a Xanthonoid from
Mangifera indica, against Gastric Injury Induced by Ethanol and Indomethacin in
Rodents.
Revista: Planta Medica, vol. 73(13), pág. 1372-1376, Outubro, 2007.
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