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UNIVERSIDADE FEDERAL DE ALFENAS
UNIFAL-MG
Maurette dos Reis Vieira Fernandes
Atividade biológica do extrato da fermentação do fungo endófito de
café Alternaria alternata.
Alfenas/MG
2008
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Maurette dos Reis Vieira Fernandes
Atividade biológica do extrato da fermentação do fungo endófito de
café Alternaria alternata.
Dissertação apresentada como parte dos requisitos
para a obtenção do título de mestre em Ciências
Farmacêuticas pela Universidade Federal de Alfenas.
Área de concentração: Obtenção de insumos
farmacêuticos e avaliação da atividade biológica.
Orientador: Prof. Dr. Masaharu Ikegaki.
Alfenas/MG
2008
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE ALFENAS – UNIFAL/MG
PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO
A banca examinadora, abaixo-assinada, aprova a dissertação "Atividade biológica do
extrato da fermentação do fungo endófito de café Alternaria alternata", elaborada
por Maurette dos Reis Vieira Fernandes, como requisito parcial para conclusão do Curso de
Mestrado em Ciências Farmacêuticas.
Área de concentração: Obtenção de insumos farmacêuticos e avaliação da atividade biológica.
Aprovada em:
____________________________________________________________
Prof. Masaharu Ikegaki - Orientador UNIFAL/MG
Prof. _________________________________________________________________
Instituição: Assinatura: __________________________
Prof. _________________________________________________________________
Instituição: Assinatura: __________________________
4
Agradeço a Deus que me deu forças nesta jornada difícil e de enorme valor.
5
AGRADECIMENTOS
À Universidade Federal de Alfenas pela oportunidade oferecida.
Ao prof. Dr. Masaharu Ikegaki pela orientação, conhecimentos transmitidos e
confiança depositada.
Ao amigo Tales Alexandre Costa e Silva pelo grande auxílio nos experimentos e por
contar sempre com sua amizade.
Ao Prof. Dr. Cláudio Miguel Costa-Neto e ao Prof. Dr. Severino M. Alencar pela
disponibilidade e pela oportunidade de parceria na execução de parte dos experimentos.
A todos os professores e técnicos dos laboratórios de Fitoquímica, Bioquímica Básica,
Microbiologia Básica e Controle de Qualidade, sem os quais muitos experimentos não seriam
possíveis de serem realizados.
Aos alunos orientados pelo professor Marcelo Henrique dos Santos, pelo trabalho em
conjunto. Eespecialmente à Kamila R. Dázio, sua cooperação foi valiosa.
À mestranda Priscilla Bento Matos Cruz Derogis pela amizade, companheirismo e
carinho em todos os momentos.
À mestranda Cristiani Bigatti pelo exemplo de fidelidade e sinceridade.
Ao bibliotecário Ronan Lázaro Gondim pelo auxílio imprescindível.
À professora e amiga Gisele Bastos Singi pelos ensinamentos e sobretudo pelo
carinho.
Ao meu marido Eduardo, essencial em minha vida, pelo importante apoio.
À coordenação do Curso de Pós-graduação pela política de incentivo à produção
acadêmica.
Ao órgão de incentivo à pesquisa e desenvolvimento Proapi-CAPES, pelos auxílios.
A todos, amigos e familiares, incentivadores e compreensivos nos momentos difíceis
ou de ausência.
6
RESUMO
A busca de novos princípios ativos de microrganismos é uma das áreas em que mais se
investe nos países desenvolvidos. Entre estes microrganismos, os fungos têm grande destaque
por sua produção de diversos metabólitos de interesse farmacológico. Endófitos são todos os
microrganismos, cultiváveis ou não, que habitam o interior dos tecidos vegetais, sem causar
danos ao hospedeiro e sem desenvolver estruturas externas, excluindo, dessa forma, bactérias
noduladoras e micorrizas. Considerando a importância da cultura do café no estado de Minas
Gerais, pesquisas com fungos endófitos de café, permitem a ampliação do conhecimento da
diversidade desses fungos. Neste estudo, um total de 22 fungos endófitos isolados de café
(Coffea arabica L.) foi cultivado in vitro. O screening foi conduzido usando o método de
difusão em agar contra bactérias Gram-positivas, Gram-negativas e leveduras. O isolado mais
efetivo contra todos os microrganismos testados foi a linhagem Alternaria alternata e
posteriormente, seu extrato bruto foi analisado. A concentração de fenólicos totais do extrato
bruto do endófito foi de 3,44 μgEAG/mg de extrato. Para os testes de atividade
antimicrobiana, a concentração inibitória mínima (CIM) e concentração bactericida e
fungicida mínima (CBFM) conta Staphylococcus aureus, Escherichia coli e Candida albicans
foram determinadas. Os valores de CIM variaram entre 50-100 μg/mL para S. aureus e
400-800 μg/mL para E. coli. O extrato não apresentou atividade nas concentrações testadas
para C. albicans. Além destes testes, foi avaliada a atividade antioxidante pela capacidade
sequestrante de radicais DPPH e pela oxidação do sistema β-caroteno/ácido linoleico, as quais
não apresentaram resultados significativos. A atividade antitumoral foi avaliada pelo teste do
MTT. À diluição de 400 μg/mL, o extrato apresentou atividade de aproximadamente 50%
sobre células HeLa in vitro. Esses resultados demonstram que fungos endófitos podem ser
uma promissora fonte de compostos antimicrobianos necessitando de estudos posteriores.
Palavras-chave: Atividade antioxidante. Atividade antimicrobiana. Fungos.
7
ABSTRACT
The search for new active components of microorganisms is one of the areas of greatest
investment in developed countries. Among these microorganisms, fungi are distinguished by
their ability to produce diverse metabolites for pharmacological purposes. Endophytes are all
microorganisms, cultivated or not, that live inside plant tissue, without causing harm to the
host and without developing external structures, excluding nodule bacteria and mycorrhiza.
Considering the importance of coffee production in the state of Minas Gerais, studies of
endophytic fungi in coffee allow for greater understanding of the diversity of these fungi. In
this study, a total of 22 endophytic fungi isolated from coffee (Coffea arabica L.) were
cultivated in vitro. The screening was conducted using the agar diffusion method against
Gram-positive and Gram-negative bacteria and yeast. The most effective isolated fungus
among all of the tested microorganisms was the lineage Alternaria alternata, and
subsequently, its extract was assayed. The total phenolic content was 3.44 μgGAE/mg of the
crude extract. For the antimicrobial activity assays, the minimum inhibitory concentration
(MIC) and minimum bactericidal and fungicidal concentration (MBFC) against
Staphylococcus aureus, Escherichia coli and Candida albicans were determined. The ranges
of MIC values were 50-100 μg/mL for S. aureus and 800-1000 μg/mL for E. coli. The crude
extract did not show activity in the tested concentrations for C. albicans. Through these tests,
the antioxidant activity of the fungus was assayed through its ability to scavenge DPPH
radicals and through β-carotene/linoleic acid system oxidation, both of which were not
significant. Antitumour activity was studied by the MTT assay. At a dilution of 400 μg/mL,
the extract displayed a cytotoxic activity of approximately 50% towards HeLa cells in vitro.
These results indicate that endophytic fungi could be a promising source of antimicrobial
compounds and are worthy of further study.
Keywords: Antioxidant activity. Antimicrobial activity. Fungi.
8
SUMÁRIO
1 REVISÃO DE LITERATURA................................................................ 9
1.1 FUNGOS ENDÓFITOS............................................................................. 10
1.2 FUNGOS ENDÓFITOS E SUAS POTENCIALIDADES......................... 13
1.2.1 Atividade antimicrobiana .......................................................................... 18
1.2.2 Atividade antioxidante .............................................................................. 21
1.2.3 Atividade citotóxica .................................................................................. 22
1.3 FUNGOS ENDÓFITOS DO CAFÉ........................................................... 24
1.4 FUNGO Alternaria alternata..................................................................... 26
1.4.1 Alternaria alternata como fungo endófito................................................. 27
2 APRESENTAÇÃO DO ARTIGO CIENTÍFICO.................................. 28
2.1 ARTIGO CIENTÍFICO ............................................................................ 29
3 CONCLUSÕES ....................................................................................... 48
REFERÊNCIAS........................................................................................ 49
9
1 REVISÃO DE LITERATURA
A necessidade de novos compostos úteis para o tratamento de doenças humanas é
crescente. A resistência aos fármacos em bactérias, o aparecimento de viroses que ameaçam a
vida, os recorrentes problemas de doenças em pessoas com órgãos transplantados e o grande
aumento na incidência de infecções fúngicas na população mundial salienta nossa
inadequação para lidar com estes problemas (STROBEL et al., 2004).
Acima de 50% de produtos químicos novos registrados pelo FDA entre 1981 e 2002,
como agentes anticâncer, antihipertensivos e para enxaqueca, foram produtos naturais (PNs)
ou derivados deles (NEWMAN et al., 2003).
Os PNs têm sido utilizados por centenas de anos e as plantas têm sido a principal fonte
de compostos usados pela medicina. O princípio ativo da aspirina, o medicamento mais
conhecido do mundo e universalmente usado, foi encontrado e isolado inicialmente em
espécies de Salix e Populus.
Quando Pasteur descobriu que a fermentação é causada por células vivas, começou-se
a investigar microrganismos como fonte de produtos naturais. Então, Fleming e Chaim, após
uma observação científica acidental, anunciaram a era do antibiótico com o descobrimento e a
produção da penicilina do fungo Penicillium notatum. Muitos outros exemplos ilustram a
importância dos produtos naturais de plantas e microrganismos na civilização moderna. O
paclitaxel (Taxol) é o mais recente exemplo de tais produtos com um enorme impacto na
medicina (STROBEL et al., 2004).
Entre todas as fontes naturais de pequenas moléculas, os microrganismos se destacam
na síntese de metabólitos biologicamente ativos que encontram aplicações como agentes
agroquímicos, antibióticos, imunossupessores, antiparasitários e antitumorais
(GUANATILAKA, 2006).
Uma das propriedades mais importantes dos microrganismos, especialmente dos
fungos, é a sua capacidade de produzir uma grande diversidade de micromoléculas bioativas.
Fungos são também responsáveis pela produção de substâncias altamente tóxicas,
denominadas micotoxinas, sendo que algumas são consideradas carcinogênicas potentes. Mas
também, fármacos importantes de uso clínico foram obtidos de fungos. Além dos
medicamentos de maior repercussão terapêutica para doenças infecciosas, os antibióticos
penicilinas e cefalosporinas, muitas substâncias com outras atividades farmacológicas foram
produzidas a partir de metabólitos de fungos. Tem-se ainda como exemplos a mevinolina, um
10
agente redutor de colesterol, asperlicina, antagonista dos receptores da colecistoquinina
(CCK) a qual é um hormônio gastrointestinal e também sintetizado por neurônios no sistema
nervoso central (SNC), papulacandinas como antifúngico, entre outras (PINTO et al., 2002).
1.1 FUNGOS ENDÓFITOS
Uma variedade de microrganismos, principalmente bactérias e fungos, habitam plantas
e, portanto, são conhecidos como endófitos. Desde o seu descobrimento na Alemanha, em
1904, os pesquisadores têm definido os endófitos de diferentes modos, dependendo de como
eles foram isolados e, subseqüentemente, examinados (STROBEL; DAISY, 2003).
Petrini et al. (1992) sugeriram uma definição mais abrangente do termo endófito, a
qual inclui todos os microrganismos que, durante pelo menos uma fase de seu ciclo de vida,
colonizam o interior dos tecidos vivos de seus hospedeiros sem causar sintomas de doenças.
Como podemos observar por esta definição, os endófitos não incluem apenas os fungos
filamentosos, mas também leveduras e, especialmente, bactérias endófitas, fato muitas vezes
negligenciado na literatura (CHANWAY, 1996).
Em 1990, a magnitude da diversidade fúngica foi estimada em 1,5 milhões de espécies
(HAWKSWORTH, 1991). Segundo Arnold et al. (2000), há uma grande diversidade de
fungos endófitos tropicais e o valor de 1,5 milhões de espécies descritas anteriormente
substima tal biodiversidade.
Segundo Strobel (2003), a relação entre os microrganismos endófitos e as plantas
provavelmente iniciou-se há aproximadamente 100 milhões de anos com o surgimento das
primeiras plantas na Terra. Durante a evolução das plantas, associações mutualísticas com
fungos endófitos ocorreram e promoveram várias adaptações. Entre elas, podemos relacionar
a capacidade de defesa da planta contra o ataque de insetos, microrganismos e animais
herbívoros, através da produção de uma variedade de compostos secundários como alcalóides,
terpenóides, esteróides e compostos aromáticos repelentes ou tóxicos a seus inimigos (LIU et
al., 2001). Assim, a simbiose entre planta e endófito pode ser observada pela proteção e
alimentação do fungo que, em contrapartida, produz substâncias bioativas (hormônios
reguladores de crescimento, antibióticos, inseticidas, etc) que aumentam o crescimento e
competitividade do hospedeiro na natureza (LU et al., 2000).
Há a hipótese de que a interação fungo endófito e planta hospedeira seja caracterizada
por um equilíbrio entre o poder de virulência do fungo e a defesa da planta. Se o balanço é
11
perturbado por ambos, uma diminuição da defesa da planta ou aumento do poder de
virulência do microrganismo, a doença pode se manifestar (SCHULZ et al., 2002; SCHULZ;
BOYLE, 2005). Apesar do antagonismo balanceado, não se exclui a possibilidade de que os
endófitos talvez possam promover benefícios ao hospedeiro, como por exemplo, através da
indução de metabólitos secundários contra patógenos, secreção de fitohormônios e aumento
da atividade metabólica da planta hospedeira (SCHULZ; BOYLE, 2005).
Endófitos ocorrem em tecidos aéreos de plantas e também em raízes, porém são
distintos das micorrizas por ocuparem exclusivamente o interior dos tecidos, sem formação de
hifas externas (SAIKKONEN et al., 1998).
O microrganismo endófito, especialmente bactéria, penetra o tecido da planta
principalmente pela raiz. Entretanto, partes aéreas como estômatos, flores e cotiledones,
também podem servir como entrada (KOBAYASHI; PALUMBO, 2000).
Insetos herbívoros são vetores conhecidos de fungos patógenos, mas também podem
dispersar esporos e hifas de fungos endófitos A maioria dos endófitos é, provavelmente,
transmitida horizontalmente por esporos de planta para planta. Também podem ser
transmitidos verticalmente através das sementes, e neste caso, a interação mutualística é
acentuada através do aumento da adaptação da planta hospedeira com o estágio de
germinação. Porém, a transmissão vertical pode reduzir a habilidade do fungo endófito em
infectar uma planta não infectada, tanto assexuadamente ou sexuadamente, via esporos. Nas
associações simbióticas o tamanho, o formato e estágio de maturidade sexual da planta
hospedeira obrigam o crescimento do fungo de acordo com o modelo do hospedeiro (Figura
1, Tabela 1) (SAIKKONEN et al., 1998; SAIKKONEN et al., 2004).
Figura 1- Ciclo de vida de endófito sistêmico de gramínea.
Fonte: SAIKKONEN et al. (2004).
A disseminação de fungos endófitos associados a arbustos, árvores e plantas herbáceas
ocorre horizontalmente via esporos, que penetram nos tecidos da planta através de aberturas
Tabela 1: Benefícios para os parceiros
Planta Fungo
Benefícios ↑Crescimento Proteção
↑Reprodução Nutrição
↑Resistência Transmissão
(↑: aumento)
Fonte: SAIKKONEN et al. (2004).
12
naturais, ou indiretamente, com o auxílio de um aparato enzimático. A colonização de plantas
lenhosas por fungos endófitos é usualmente localizada, específica para um tipo de órgão ou
tecido e pode ocupar uma pequena área do tecido infectado (Fischer; Petrini, 1992).
O interesse em estudar fungos endófitos vem aumentando nos últimos anos, com
destaque para três principais vertentes cujos objetivos de estudo são:
i) determinar a sua importância como segmento da diversidade biológica de fungos,
considerando sua elevada especialização frente ao ambiente em que vivem (ARNOLD et al.,
2000; CANNON; SIMMONS, 2002; RODRIGUES; PETRINI, 1996);
ii) esclarecer a sua função na saúde das plantas e o seu envolvimento em processos de
resistência a patógenos, pragas e estresses climáticos (ARNOLD et al., 2003; AZEVEDO et
al., 2000; REDMAN et al., 2001; RUBINI et al., 2005);
iii) avaliar o seu potencial como produtores de metabólitos biologicamente ativos, com
possível aproveitamento na agricultura e medicina (SCHULZ et al., 2002; STROBEL, 2002).
Fungos endófitos vivem internamente nos tecidos de plantas hospedeiras sem causar
sintomas aparentes de doença (CHANWAY, 1996); porém, isto não impede que eles se
tornem patogênicos caso o hospedeiro sofra estresse biótico ou abiótico (CARROL, 1988). A
distinção entre fungo patogênico e mutualista nem sempre é possível, pois a separação de
grupos ditos patogênicos, endófitos e oportunistas é meramente didática devido à distância
entre um estágio e outro ser muito pequena. Portanto, um microrganismo pode ser
considerado endófito, porém com a redução dos mecanismos de defesa da planta, pode se
comportar como um patógeno (PEIXOTO-NETO; AZEVEDO; ARAÚJO, 2002).
Dentre as espécies comumente encontradas como endofíticas destacam-se,
principalmente, membros do filo Ascomicota. Na literatura, os fungos endófitos são divididos
em dois grupos principais: balansiaceous e não-balansiaceous. Endófitos balansiaceous são
fungos ascomicetos pertencentes aos gêneros Epichloë e Balansia que se desenvolvem de
forma sistêmica e intercelular em todos os órgãos de gramíneas e são transmitidos
verticalmente através de sementes. Produzem uma série de metabólitos secundários, dentre os
quais, as peraminas e lolinas (alcalóides inseticidas) e as lolitrem B e ergovalinas (alcalóides
antivertebrados) (SCHULZ; BOYLE, 2005). A relação entre fungos balansiaceous e seus
hospedeiros é considerada mutualista, sendo que o fungo beneficia-se com o ganho
nutricional e proteção contra estresse abiótico enquanto a planta beneficia-se pela proteção
contra herbivoria através da produção de alcalóides tóxicos por parte do fungo (SAIKKONEN
et al., 1998; SAIKKONEN et al., 2004).
13
Endófitos não-balansiaceous significa um grupo diverso, representado, em sua
maioria, por espécies de diferentes famílias do filo Ascomicota e podem ser isoladas de todos
os órgãos de praticamente todas as plantas terrestres (BACON; WHITE, 2000). São
transmitidos horizontalmente (ARNOLD et al., 2003) e são cosmopolitas ocorrendo em
ambientes temperados e tropicais, sendo os gêneros: Acremonium, Alternaria, Cladosporium,
Epicoccum, Fusarium, Guignardia, Phyllosticta, Pestalotiopsis, Phomopsis, Phoma,
Pleospora, frequentemente isolados de um grande número de hospedeiros (ARNOLD et al.,
2000; SURYANARAYANAN; VENKATESAN; MURALI, 2003).
Segundo Strobel (2003), é muito provável que todas as plantas superiores sejam
hospedeiras de um ou mais microrganismo (fungos, bactérias e actinomicetos) endófito.
Associações biológicas mais estreitas podem ter sido desenvolvidas entre estes organismos e
seus respectivos hospedeiros, mais que os epífitos ou organismos relacionados ao solo. O
resultado desta interação pode ser a produção de um número maior e uma diversidade de
classes de biomoléculas, com atividades biológicas.
Neste contexto, Firáková, Sturdíková e Múcková (2007) verificaram que nos últimos
anos a pesquisa de microrganismos endófitos levou às novas perspectivas promissoras para
melhorar a produção de compostos de plantas medicinais como também de outras plantas.
1.2 FUNGOS ENDÓFITOS E SUAS POTENCIALIDADES
No que diz respeito aos fungos endófitos de gramíneas (balansiaceous), eles podem
conferir resistência à planta contra organismos herbívoros por meio de dois mecanismos
principais:
1) estímulo direto do vigor da planta
2) produção de metabólitos que aumentam a resistência à herbivoria (CLAY;
MARKS; CHEPLICK, 1993).
Rudgers e Swafford (2008) testaram a hipótese de que fungos endófitos em espécies
nativas de gramíneas, como Elymus virginicus (Figura 2), promoveriam tolerância do
hospedeiro à seca. Contudo, os benefícios dos endófitos foram mais acentuados sob irrigação
diária que sob a seca, sugerindo que o estresse da seca pode tanto afetar o endófito quanto a
planta hospedeira.
14
Fungos endófitos geram o crescimento vegetal pela síntese de fitormônios e fixação de
nitrogênio (PEIXOTO-NETO; AZEVEDO; ARAÚJO, 2002). Para White et al. (2002), os
fungos produtores de hormônios de crescimento vegetal o fazem para modificar a fisiologia e
estrutura da planta, visando à extração de nutrientes para si.
Fungos endófitos, que colonizam seus hospedeiros assintomaticamente, são fortes
candidatos ao controle biológico de fitopatógenos, por ocuparem o mesmo nicho ecológico
(BOYLE et al., 2001).
Alguns dados da literatura têm relatado a habilidade dos fungos endófitos em produzir,
in vitro, metabólitos secundários idênticos aos da planta hospedeira (STROBEL et al., 1996).
Aproximadamente 80% dos fungos endófitos produzem compostos biologicamente
ativos (antibacterianos, fungicidas e herbicidas), segundo Schulz e Boyle (2005). De acordo
com Strobel (2002), os metabólitos secundários bioativos de endófitos podem apresentar
aplicações na medicina, agricultura e indústria. Esses metabólitos pertencem a diversas
classes químicas, incluindo alcalóides, flavonóides, fenilpropanóides, lignanas, peptídeos,
esteróides, xantonas, compostos fenólicos, isocumarinas, quinonas, terpenóides, citocalasinas,
compostos alifáticos e clorados (Figura 3) (TAN; ZOU, 2001; SCHULZ; BOYLE, 2005).
Figura 2 - Fotografia de hifa do endófito Epicholoë em tecido
foliar de Elymus virginicus (S. F. Austin-400A). A seta indica o
endófito.
Fonte: RUDGERS; SWAFFORD (2008).
15
Phomopsichalasina Citocalasina Ácido indol-3-acetico R=COOH
Esteroides Diterpeno: Subglutinol A Diterpeno: Guanacastepene
Derivado isocumarinas: Quinona: Altersolanol A Flavonóide: Tricin R= H
(R)-Mellein R=H
Pentacetideo Fenóis e ácidos fenólicos
O termo composto fenólico abrange um amplo grupo de moléculas que possuem em
comum um anel aromático portando uma ou mais hidroxilas. Estão amplamente distribuídos
no reino vegetal e em microrganismos. Os animais são incapazes de sintetizar o anel
aromático e, neste caso, a síntese dos compostos fenólicos em pequena quantidade é feita
utilizando o anel benzênico de substâncias ingeridas na dieta. Os vegetais e a maioria dos
Figura 3 - Alguns exemplos da diversidade estrutural de metabólitos isolados de fungos endófitos.
Fonte: TAN; ZOU (2001).
16
microrganismos têm a capacidade de sintetizar o anel benzênico, e, a partir dele, produzir
diferentes tipos de compostos fenólicos, tais como, os floroglucinóis, os flavonóides, as
xantonas, entre outros. (MANN, 1994).
Do ponto de vista farmacológico possuem atividades anticâncer (CAI et al., 2004),
antimicrobiana, antiinflamatória e antioxidante (FIRÁKOVÁ; STURDÍKOVÁ; MÚCKOVÁ,
2007), portanto, é relevante a pesquisa destes compostos quando se trabalha com produtos
naturais.
Segundo Osbourn (2001), a produção de enzimas também é uma característica
expressa por fungos endófitos. Analisando uma planta colonizada por Cladosporium fulvum
constatou-se uma indução da defesa bioquímica através da produção de altos níveis de
peroxidases, H
2
O
2
, fenilalanina amônio liases (FAL), proantocianidinas e fenilpropanóides. A
produção de enzimas em resposta à colonização do endófito, pode ter um papel fundamental
na limitação do crescimento do endófito e/ou patógeno e da virulência dos mesmos
(ARNOLD et al., 2003; SHULZ; BOYLE, 2005).
Shulz et al. (2002), avaliaram fungos endófitos quanto à produção de enzimas in vitro
necessárias para penetrar e colonizar a planta hospedeira. O tipo das enzimas variou de
isolado para isolado, mas todos sintetizaram enzimas. Também foi observado que a
penetração, colonização e crescimento foram diferentes entre endófitos e patógenos.
Atualmente, enzimas amilolíticas termoestáveis produzidas por fungos endófitos são
investigadas para melhorar processos industriais de degradação do amido.
A mais nova aplicação de endófitos está na área de fitorremediação (auxílio na
remoção de xenobióticos do solo) (FIRÁKOVÁ; STURDÍKOVÁ; MÚCKOVÁ, 2007).
Segundo Li et al. (2005), metabólitos de fungos endófitos são tidos como um arsenal
versátil de agentes antimicrobianos, visto que alguns endófitos demonstraram possuir
capacidades biossintéticas superiores devido a sua provável recombinação genética com o
hospedeiro, enquanto residem e se reproduzem dentro dos tecidos de plantas saudáveis. Os
autores identificaram como Aspergillus sp. o fungo endófito mais ativo de um total de 32
fungos endófitos isolados da planta medicinal Cynodon dactylon (Poaceae) e examinados in
vitro para atividade anti- Helicobacter pylori. Como metabólitos secundários deste fungo,
foram isolados quatro compostos: o ácido helvólico, monometilsulocrina, ergosterol e 3β-
hidroxi-5α,8α-epidioxi-ergosta-6,22-diene, sendo que o metabólito mais ativo contra H.
pylori foi o ácido helvólico.
17
Wang et al. (2002) estudaram a substância brefeldina A, isolada do fungo endófito
Aspergillus clavatus, a qual apresentou atividade antifúngica, antiviral e uma maior
citotoxicidade frente a várias linhagens tumorais quando comparada ao taxol.
Um novo pentacetídeo isolado de Fusarium sp apresentou potente atividade
antifúngica contra Candida albicans (BRADY; CLARDY, 2000).
De acordo com um estudo feito com 81 espécies de plantas medicinais da Tailândia,
foram obtidos 582 isolados de fungos endófitos, sendo que seus extratos foram testados para
atividades biológicas e apresentaram atividades antimicrobiana, contra Mycobacterium
tuberculosis; antimalárica, contra Plasmodium falciparum; antiviral, contra o vírus tipo 1 do
Herpes simples e antitumoral, contra células de carcinoma epidermoide oral humano e células
de câncer de mama (WIYAKRUTTA et al., 2004).
Dando continuidade aos estudos de bioprospecção, Cafêu et al. (2005) selecionaram
várias espécies vegetais do Cerrado e Mata Atlântica brasileira para o isolamento e cultivo de
fungos endófitos. De Palicourea marcgravii, uma Rubiaceae de larga ocorrência no Cerrado,
vários fungos endófitos foram isolados, dentre os quais, Xylaria sp foi selecionado para
estudo devido ao seu extrato bruto ter apresentado atividade frente aos fungos fitopatogênicos
Cladosporium cladosporioides e Cladosporium sphaerospermum, indicando a produção de
metabólitos com atividade antifúngica em potencial.
Phongpaichit et al. (2007) avaliaram atividades biológicas de 65 extratos brutos de 51
fungos endófitos selecionados, isolados de espécies de Garcinia. Entre estes, 80% dos
extratos fúngicos dos caldos de fermentação e dos micélios demonstraram atividades:
antimicobacteriana (76,9%); antimalárica (14,1%); antiviral (16,7%); antioxidante (22,2%);
antiproliferação (11,1% contra células NCI-H187 e 12,7% contra células KB) e citotoxicidade
para células Vero (40,0%).
Foi relatado pela primeira vez por Kusari et al. (2008), a produção de hipericina por
um fungo endófito INFU/Hp/KF/34B, isolado de Hypericum perforatum L. proveniente de
Harwan, Jammu e Kashmir na India. A hipericina apresenta as atividades antidepressiva,
antimicrobiana, antioxidante, antiinflamatória e antiviral (HIV-1, HSV-1, HSV-2 e influenza
A). Vários estudos in vitro ainda têm revelado atividade citotóxica deste composto.
18
1.2.1 Atividade antimicrobiana
Ezra, Hess e Strobel (2004) estudaram o fungo Muscodor albus, um microrganismo
endófito primeiramente isolado de Cinnamomum zeylanicum, que produz uma mistura de
compostos orgânicos voláteis em cultura e têm um amplo espectro de atividade
antimicrobiana.
O extrato bruto de culturas de 13 cepas fúngicas identificadas como Phomopsis sp. e
isoladas como endófitos de folhas de Aspidosperma tomentosum e brotos de Spondias
mombin foram examinados quanto às suas atividades antifúngicas e antibacterianas. Três dos
13 extratos inibiram eficientemente o crescimento de todos os organismos testados, indicando
que eles podem representar um potencial para aplicações farmacêutica e/ou na agricultura e
são válidos para estudos posteriores (CORRADO; RODRIGUES, 2004).
No Brasil, um grupo de pesquisadores, relatou atividade antimicrobiana de fungos
endófitos de plantas tóxicas da Amazônia, os quais foram identificados por taxonomia
convencional como Aspergillus niger, Colletotrichum sp., Glomerella sp., Guignardia sp.,
Phomopsis sp., Trichoderma sp., e Xylaria sp. De uma amostra de 79 isolados fúngicos, 19
inibiram um ou mais microrganismos patogênicos e fitopatogênicos testados (SOUZA et al.,
2004).
No estudo de Li et al. (2005), também foram feitos testes do espectro antimicrobiano
do metabólito caracterizado mais ativo anti-Helicobacter pylori, o ácido helvólico, do extrato
do endófito Aspergillus sp. Este metabólito inibiu o crescimento de Sarcina lutea,
Staphylococcus aureus e Candida albicans.
Phongpaichit et al. (2006) selecionaram para estudo de atividade antimicrobiana,
fungos endófitos isolados de plantas de Garcinia encontradas no sul da Tailândia. Foi
verificada atividade antimicrobiana contra pelo menos um microrganismo testado, como S.
aureus, S. aureus resistente a meticilina e Cryptococcus neoformans em 18,6%, ou seja, 70
isolados dos 377 isolados fúngicos inicialmente testados.
Entre 67 fungos endófitos isolados de Quercus variabilis, 53,7% dos caldos de
fermentação inibiram o crescimento de pelo menos um microrganismo testado, tal como
fungos patogênicos (Trichophyton rubrum, Candida albicans, Aspergillus niger,
Epidermophyton floccosum e Microsporum canis) e bactérias (Escherichia coli, Bacillus
subtilis, Pseudomonas fluorescens), segundo Wang et al. (2007). Ainda neste estudo, a
amostra fúngica com mais atividade, I(R)9-2 Cladosporium sp. foi selecionada e do seu
19
extrato de fermentação foi isolado o metabólito secundário brefeldina A. Este é o primeiro
relato de antimicrobianos potenciais de fungos endófitos de Quercus variabilis.
No estudo de Lin et al. (2007), 174 fungos endófitos foram isolados da planta
medicinal, Camptotheca acuminata. Os testes de bioatividade contra Bacillus subtilis,
Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Candida albicans e Aspergillus niger mostraram
que 27,6% dos fungos endófitos inibiram o crescimento de mais de um microrganismo
testado.
Weber et al. (2007) isolaram e identificaram seis compostos bioativos dos extratos do
filtrado e do micélio de cinco espécies de fungos endófitos. A atividade antifúngica, contra
Candida albicans, de quatro compostos foi comparável à da anfotericina B, usada como
padrão.
Firáková, Sturdíková e Múcková (2007) apresentam uma visão geral dos metabólitos
secundários isolados de endófitos nos últimos cinco anos. Alguns exemplos: isopestacina
isolado do fungo endófito Pestalotiopsis microspora da planta Terminalia morobensis, com
atividade antimicrobiana (HARPER et al., 2003); kakadumicina A, do fungo Streptomyces
NRR1 30566 da planta Grevillea pteridifolia, com amplo espectro de atividade antibiótica,
especialmente contra bactérias Gram-positivas e acentuada atividade contra o parasito da
malária (CASTILHO et al., 2003); pomol do fungo endófito Phomopsis spp. da planta
Erythrina cristagalli, com atividade antifúngica e antibacteriana (WEBER et al., 2004);
coronamicina, do Streptomyces sp. da planta Monstera sp. com atividade contra fungos
patógenos humanos como o Cryptococcus neoformans e atividade contra Plasmodium
falciparum (EZRA; HESS; STROBEL , 2004); asperfumoide, do fungo endófito Aspergillus
fumigatus CY 018, da planta Cynodon dactylon, inibiu o crescimento de Candida albicans
(LIU et al., 2004); griseofulvina, do fungo Xylaria sp. F0010, da planta Abies holophylla, com
atividade antifúngica e antibiótica (PARK et al., 2005).
Na constante busca por novos compostos com atividade biológica, Chomcheon et al.
(2005) obtiveram extratos de isolados de fungos endófitos que exibiram atividade
antimicobacteriana. A análise química destes extratos levou à identificação do ácido 3-
Nitropropiônico (3-NPA) o qual demonstrou potente atividade antimicobacteriana com MIC
de 3,3 μM. Foram encontrados endófitos produtores de altos níveis de 3-NPA e, portanto este
composto acumulado em certas plantas pode ser produzido por endófitos associados.
De acordo com Silva et al. (2006), o fungo endófito Phomopsis cassiae foi
selecionado entre isolados obtidos da planta Cassia spectabilis para investigação biológica e
química. O extrato bruto do fungo apresentou significativa atividade antifúngica contra os
20
fungos fitopatogênicos Cladosporium sphaerospermum e Cladosporium cladosporioides
levando a estudos posteriores. O estudo do extrato bruto resultou em cinco novos
sesquiterpenos.
Guimarães et al. (2008) isolaram 39 fungos endófitos de Viguiera arenaria e de
Tithonia diversifolia, ambas coletadas no estado de São Paulo. Os extratos brutos de todos os
isolados foram avaliados em relação à atividade antimicrobiana. Dois extratos (5,1%) foram
ativos contra S. aureus, dez (25,6%) contra E. coli e 25 (64,1%) contra Candida albicans. A
proporção relativamente alta de extratos ativos contra Candida albicans indica que estes
fungos endófitos podem produzir potentes compostos antifúngicos.
No estudo de Liu et al. (2008), foi relatado pela primeira vez o metabólito 7-amino-4-
metilcoumarina (P3) isolado do extrato da cultura do fungo endófito Xylaria sp. Este fungo
foi isolado e caracterizado da planta Ginkgo biloba L. O composto mostrou significativas
atividades antibacteriana e antifúngica in vitro contra Staphylococcus aureus, Escherichia
coli, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Salmonella enteritidis, yersinia sp., Shigella
sp., Candida albicans, Penicillium expansum e Aspergillus niger. Os resultados fornecem
informações que mostram o potencial uso deste fungo endófito e seus componentes no
controle da deterioração de alimentos e de doenças provenientes de alimentos (intoxicações
alimentares).
Kusari et al. (2008) relataram pela primeira vez o isolamento de um fungo endófito de
plantas do gênero Hypericum. Tal endófito produziu os compostos emodim e hipericina por
meio da fermentação. Foi determinada a atividade antimicrobiana in vitro do extrato bruto do
endófito e dos compostos isolados contra a bactéria Gram-positiva Staphylococcus aureus
ssp. aureus (DSM 799) , contra as Gram-negativas Klebsiella pneumoniae ssp. azaenae
(DSM 681), Pseudomonas aeruginosa (DSM 1128), Salmonella enterica ssp. enterica (DSM
9898) e Escherichia coli (DSM 682) e também contra Candida albicans (DSM 1386) e
Aspergillus niger (DSM 1988). Todos os microrganismos foram consideravelmente
suscetíveis aos dois compostos, hipericina e emodin, demonstrando que este endófito possui
significante potencial industrial e científico para suprir a demanda farmacêutica por
hipericina.
21
1.2.2 Atividade antioxidante
Nos últimos anos, grande atenção tem sido dada para descoberta de novas moléculas
antioxidantes, devido às muitas condições patológicas, as quais estão associadas ao estresse
oxidativo (RODRIGUES et al., 2005).
O extrato da cultura do fungo endófito, Pestalotiopsis microspora, isolado da planta
Terminalia morobensis da Papua Nova Guine (STROBEL et al., 2002), apresentou tanto
atividade antifúngica como antioxidante devido aos seus metabólitos secundários, dos quais a
isopestacina foi isolada e caracterizada.
Segundo Harper et al. (2003), o composto chamado pestacina, também extraído do
fungo endófito, Pestalotiopsis microspora, tem moderada propriedade antifúngica e atividade
antioxidante onze vezes maior que a vitamina E.
De acordo com Song et al. (2005), a grafis-lactona A isolada do fungo endófito
Cephalosporium sp. IFB-E001, da planta Trachelospermum jasminoides, apresenta
propriedades antioxidantes.
Foi estabelecida a metodologia para isolamento, identificação e caracterização de um
novo endófito (Trametes hirsuta) que produz ligninas. Esses compostos produzidos por este
microrganismo são biologicamente ativos e exibem potentes propriedades antioxidantes,
anticâncer e radioprotetoras (PURI et al., 2006).
Segundo Liu et al. (2007), foi realizado um estudo pela primeira vez de um fungo
endófito Xylaria sp. (amostra YX-28) de Ginkgo biloba. O extrato metanólico da cultura do
fungo apresentou significativa atividade antioxidante nos dois métodos de análise, DPPH e
ácido linoléico-β-caroteno.
Huang et al. (2007) estudaram 1.160 isolados fúngicos endófitos obtidos de diferentes
tecidos de 29 plantas da medicina tradicional chinesa. O objetivo dos autores foi explorar
fungos endófitos que produzissem in vitro compostos bioativos com potente atividade
antioxidante. Foram investigados a capacidade antioxidante e o conteúdo de fenólicos totais
de 292 isolados fúngicos morfologicamente distintos. Observou-se uma correlação positiva
entre estes parâmetros, sugerindo que compostos fenólicos são os principais constituintes
antioxidantes de endófitos. Este estudo revelou que metabólitos produzidos por fungos
endófitos em cultura podem ser uma fonte potencial de antioxidantes naturais.
22
1.2.3 Atividade citotóxica
No campo dos agentes antineoplásicos, as descobertas da camptotecina (Figura 4) e do
taxol (Figura 5) têm muito mais em comum do que apenas seu uso terapêutico, pois ambos os
fármacos foram descobertos pelo mesmo grupo de pesquisa. Em 1966, Wall, Wani e
colaboradores relataram, pela primeira vez, o isolamento da camptotecina a partir de uma
árvore chinesa, Camptotheca acuminata. Mais recentemente, um grupo da Montana State
University (EUA) relatou a obtenção do taxol e da bagatina III (outro taxano de origem
natural) a partir de espécies de fungos endófitos, Taxomyces andreana, isolado das cascas de
T. brevifolia e Pestalotiopsis microspora (BARREIRO; VIEGAS; BOLZANI, 2006).
Figura 4 - Camptotecina.
Fonte: NEWMAN; CRAGG; SNADER (2000).
Figura 5 - Taxol.
Fonte: TAN; ZOU (2001).
23
O taxol é um importante fármaco anticâncer aprovado pelo FDA para tratamento de
câncer de ovário, mama e carcinoma de pulmão e se tornou o primeiro produto descrito que
estabilizou os microtúbulos evitando a replicação celular. Os microtúbulos estão envolvidos
em muitos aspectos da biologia celular como transporte intracelular de partículas,
deslocamento de cromossomas na mitose e manutenção da forma das células. Sendo assim,
representam um alvo importante de quimioterápicos anticâncer (SOUZA, 2004).
Segundo Huang et al. (2001), fungos endófitos podem ser uma fonte promissora para
agentes bioativos antifúngicos e antitumorais. Nesse estudo, os fungos endófitos foram
isolados de cascas internas de três tipos de plantas medicinais: Taxus mairei, Cephalataxus
fortunei e Torreya grandis, coletadas da província Fujian, China. Entre todos os fungos
endófitos isolados, o gênero Paecilomyces sp. demonstrou atividades antifúngica e
antitumoral mais acentuadas.
Puri et al. (2005) relataram, pela primeira vez, a produção do alcalóide camptotecina
por um fungo endófito isolado de Nothapodytes foetida da costa oeste da Índia. Este também
foi testado contra uma série de linhagens de células cancerígenas humanas. O isolamento de
um microrganismo produtor de camptotecina pode, no futuro, prover uma fonte mais
acessível para produção desta molécula precursora de fármaco anticâncer.
Teles et al. (2005) isolaram quatro benzopiranos de um fungo endófito Curvularia sp,
associado à planta brasileira Ocotea corymbosa. Um dos novos derivados foi indutor da
proliferação celular de células HeLa.
Wiyakrutta et al. (2004) coletaram 81 espécies de plantas medicinais de florestas da
Tailândia e estudaram os fungos endófitos com atividade biológica presentes nestas plantas.
Entre 582 isolados obtidos, 360 fungos distintos morfologicamente foram cultivados. Em
relação às células de carcinoma epidermoides orais humanas, 60 isolados foram ativos e 48
demonstraram atividade contra células de câncer de mama.
De acordo com Li et al. (2005), foram isolados e testados 130 fungos endófitos de 12
plantas da medicina tradicional chinesa, coletadas no sudoeste da China. Foram avaliadas
quanto à atividade antifúngica e anticancerígena em linhagens BGC-823 de células tumorais
gástricas humanas e quanto à inibição do crescimento contra sete fungos fitopatogênicos.
9,2% dos isolados demonstraram atividade antitumor e 30% exibiram atividade antifúngica.
Firáková, Sturdíková e Múcková (2007) relacionaram metabólitos de fungos endófitos
com atividade anticâncer. Como exemplos têm os compostos rubrofusarina B e aurasperone
A, isolados de Aspergillus niger IBF-E003 da planta Cynodon dactylon como fortes co-
inibidores da xantina oxidase, nas células de câncer de cólon (SONG et al., 2004); o composto
24
(+)- epiepoxidon, do fungo endófito Apiospora montagnei da planta Polysiphonia violacea
exibiu significante citotoxicidade contra linhagens de células de câncer humano (KLENKE et
al., 2004); compostos macrolídeos do endófito Streptomyces sp. Is 9131 da planta Maytenus
hookeri apresentaram atividade antineoplásica significante (ZHAO et al., 2005) e
podofilotoxina do fungo endófito Trametes hirsuta da planta Podophyllum hexandrum com
atividade anticâncer (PURI et al., 2006).
Segundo Prachya et al. (2007), no estudo de uma planta medicinal da Tailândia,
Hydnocarpus anthelminthicus, foi isolado o fungo endófito Phomopsis sp. e do extrato da sua
cultura foram isolados compostos com potente atividade citotóxica como o micoepoxidieno e
derivados, como também diacetil micoepoxidieno.
Lin et al. (2008), isolaram do córtex da planta Aegiceras corniculatum coletada na
China, o fungo endófito identificado como Penicillium sp. GQ-7. O extrato da fermentação
deste endófito mostrou citotoxicidade contra linhagens de células P388. Estudos dos
compostos ativos deste fungo levaram ao isolamento de seis novos derivados de ácidos
tetrâmicos denominados penicilenols A
1
, A
2,
B
1
, B
2
, C
1
e C
2
juntamente com citrinina, ácido
fenólico A, fenol A e dihidrocitrinina.
1.3 FUNGOS ENDÓFITOS DO CAFÉ
O desenvolvimento de pesquisas com fungos endófitos de café, uma das culturas mais
importantes para a economia do país e, em especial para o estado de Minas Gerais, permite a
ampliação do conhecimento da diversidade desses fungos como também a busca por novas
substâncias com potencial bioativo.
Até o presente momento, foram publicados poucos trabalhos referentes a fungos
endófitos de café. No trabalho de Almeida (2007), foram estudados fungos endófitos de café
(Coffea arabica L.) em sistema orgânico e convencional de cultivo e sobre as espécies de
Phoma associadas a este hospedeiro. O sistema orgânico apresentou uma taxa de colonização
de 53,9%, 993 UFCs e 38 espécies, enquanto o sistema convencional, 44,6%, 733 UFCs e 33
espécies, resultados que contribuem para o conhecimento da diversidade biológica de fungos
endófitos de café.
De acordo com Santamaría e Bayman (2005), as plantas contêm diversas comunidades
de fungos e outros microrganismos. Os autores compararam comunidades fúngicas epífitas e
25
endófitas associadas a folhas de café (Coffea arabica L.) em Porto Rico. Os autores
observaram que endófitos de café dominantes em algumas áreas, são frequentemente de
menor importância ou não encontrados em outras. Um total de 821 colônias foram isoladas e
agrupadas em 131 morfoespécies. Dos gêneros mais comuns, Pestalotia e Botryosphaeria
foram significativamente mais comuns como epífitos. Como endófitos, os mais comuns foram
Colletotrichum, Xylaria e Guignardia. Esta é a primeira comparação quantitativa de fungos
epífitos e endófitos em folhas de café.
Segundo Peterson e colaboradores (2005), Penicillium coffeae foi descoberto na
natureza como um endófito de café (Coffea arabica L.) no Hawai. Os autores estudaram a
relação filogenética entre o Penicillium coffeae e três isolados do mesmo gênero. Sugeriram,
ainda, que estudos químicos dos metabólitos ajudariam a esclarecer a relação entre os fungos
e a planta do café.
Vega et al. (2006) estudaram tecidos de várias partes (folhas, caules, grãos e raízes) de
plantas de café como Coffea arabica, C. congensis, C. deweyrei e C. liberica. Estas amostras
foram coletadas no Hawai e na Colômbia e foram analisadas quanto à presença de fungos
endófitos as quais revelaram 11 fungos conhecidos do gênero Penicillium entre eles P.
coffeae, P. brocae, P. citrinum e outros. Somente quatro isolados produziram ocratoxina A.
Os autores relatam que o papel que os fungos endófitos desempenham nas plantas de café
ainda é desconhecido.
Foram identificados como fungos endófitos de plantas de café brasileiro (Coffea
arabica e Coffea robusta), Aspergillus niger, Colletotrichum sp., Glomerella sp., Guignardia
sp., Phomopsis sp., Trichoderma sp., e Xylaria sp. Além destes, também outros fungos,
incluindo organismos não esporulados foram identificados. Os fungos foram investigados
quanto à sua atividade antimicrobiana contra bactérias patógenas humanas: Salmonella
choleraesuis , Staphylococcus aureus , Pseudomonas aeruginosa e contra quatro diferentes
sorotipos de Escherichia coli. Dezessete fungos inibiram pelo menos uma das bactérias
estudadas. Em função dos fungos endófitos de café caracterizados neste trabalho terem
mostrado potencial antibacteriano para patógenos humanos, estas amostras podem ser
consideradas importantes para estudos futuros a fim de se identificarem os compostos
responsáveis por tal atividade. (SETTE et al., 2006).
26
1.4 FUNGO Alternaria alternata
Alternaria é um gênero de fungos ascomicetos (Figura 6, Tabela 2). Algumas espécies
deste fungo são conhecidas como fitopatógenos. Eles são também alergenos comuns em
humanos, podendo causar febre do feno ou reações de hipersensibilidade que algumas vezes
levam à asma. Eles facilmente causam infecções oportunistas em pessoas
imunocomprometidas como pacientes com AIDS. Existem 44 espécies bem definidas, mas
extima-se que possam existir mais de 100. Eles são ubíquos no meio ambiente e estão também
presentes no processo de apodrecimento e decomposição de material orgânico. Espécies deste
fungo são produtoras de uma variedade de compostos tóxicos. Os efeitos destes compostos na
saúde animal e de plantas não são bem conhecidos. Os termos alternariosis e
alternariatoxicosis são usados para desordens em humanos e animais causadas por um fungo
deste gênero. Nem todas as espécies de Alternaria são patógenas, algumas têm se mostrado
promissoras como agentes de controle biológico contra espécies invasoras de plantas.
Classificação científica
Reino: Fungi
Filo: Ascomycota
Classe: Dothideomycetes
Ordem: Pleosporales
Família: Pleosporaceae
Gênero: Alternaria
Espécie: A. alternata
Tabela 2: Classificação de Alternaria alternata
Figura 6 – Alternaria sp.
Fonte: www.mycobank.org/mycotaxo.aspx
Fonte: www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy
27
1.4.1 Alternaria alternata como fungo endófito
Schulz et al. (2002) estudaram a síntese de exoenzimas de fungos endófitos in vitro e o
fungo Alternaria alternata produziu várias enzimas como amilase, fenoloxidase, lipase,
celulase e xilanase, importantes para penetração e colonização da planta hospedeira.
De acordo com Lin et al. (2007), no estudo com a planta medicinal Camptotheca
acuminata, foram isolados 174 fungos endófitos, dos quais 12,6% foram do gênero
Alternaria. Das 22 amostras de Alternaria testadas, três mostraram atividade antimicrobiana.
Recentemente, pesquisadores extraíram e purificaram um novo composto, o alternol,
do produto da fermentação do microrganismo Alternaria alternata var. monosporus. No
estudo de Liu et al. (2007), o composto alternol foi testado em células linfocíticas leucêmicas
L1210 de camundongos e foram constatadas a inibição da proliferação e indução da apoptose
das células. Além disso, a exposição das células ao alternol resultou em um significativo
aumento nas espécies reativas de oxigênio.
Micotoxinas produzidas por Alternaria e especificamente por Alternaria alternata são
numerosas. No estudo de Centeno e Calvo (2002), foi avaliada a produção de micotoxinas
pelo Alternaria e os autores constataram que o fungo produziu o éter monometil alternariol
(EMA), altenueno (ALT) e altertoxina I. Essas micotoxinas, além do ácido tenuazônico (AT)
e o alternariol (AOH), as quais não foram produzidas pelo fungo neste trabalho, são
amplamente estudadas.
28
2 APRESENTAÇÃO DO ARTIGO CIENTÍFICO
Segundo as normas do programa de pós-graduação em Ciências Farmacêuticas a
critério do orientador e do discente, a dissertação poderá ser apresentada sob a forma de 01
(um) volume contendo: uma revisão e discussão ampla da literatura, seguida de artigos
científicos referentes aos resultados obtidos no desenvolvimento da pesquisa. Sendo assim,
foi redigido um artigo o qual está em fase de submissão à Revista Brasileira de Ciências
Farmacêuticas, Qualis A Internacional (consultado no site:
www.qualis.capes.gov.br/webqualis/ConsultaPeriodicos.faces em 10 de junho de 2008).
29
Biological activities of the fermentation extract of the endophytic
fungus Alternaria alternata isolated from Coffea arabica L.
Maurette R. Vieira Fernandes
1
; Tales A. Costa e Silva
1
; Ludwig H. Pfenning
2
; Cláudio
Miguel Costa-Neto
3
; Tassiele A. Heinrich
3
; Severino M. Alencar
4
; Marisa A. Lima
1
;
Masaharu Ikegaki
1*
1
Universidade Federal de Alfenas / Unifal-MG; Departamento de Farmácia; Alfenas /MG;
2
Universidade
Federal de Lavras /UFLA; Departamento de Fitopatologia;Lavras / MG; 3 Universidade de São Paulo,
Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Departamento de Bioquímica e Imunologia;Ribeirão Preto/SP;
4 Esalq/USP; Departamento de Agroindústria, Alimentos e Nutrição; Piracicaba-SP
________________________________
*Correspondence:
Masaharu Ikegaki
Universidade Federal de Alfenas, Unifal-MG
Rua Gabriel Monteiro da Silva, 700 - centro
37130-000 Alfenas-MG
Tel: (0xx35) 3299-1102
E-mail address: [email protected]
30
ABSTRACT
A total of 22 endophytic fungi isolated from coffee (Coffea arabica L.) were cultivated in
vitro, and their crude extracts were tested. The screening was carried out using the agar
diffusion method against Gram-positive and Gram-negative bacteria and yeast. The most
effective isolated was Alternaria alternata (CML 867) and subsequently, its extract was
assayed. The total phenolic content was 3.44 μg GAE/mg of the crude extract. For the
antibacterial and antifungal activity assays, minimum inhibitory concentrations (MIC) and
minimum bactericidal and fungicidal concentrations (MBFC) against Staphylococcus aureus,
Escherichia coli and Candida albicans were determined. The ranges of MIC values were
50-100 μg/mL for S. aureus and 400-800 μg/mL for E. coli. The extract did not show activity
in the tested concentrations for C. albicans. The fungal crude extract was assayed for
antioxidant activities. Its ability to scavenge DPPH radicals and antioxidant activity by β-
carotene/linoleic acid system oxidation were not significant. In addition, antitumour activity
was studied by the MTT assay. At a diluition of 400 μg/mL, the extract displayed a cytotoxic
activity of approximately 50% towards HeLa cells in vitro. The results indicate that
endophytic fungi could be a promising source of bioactives compounds and are worthy of
further study.
Uniterms: Endophytic fungi; bioactive compounds; Alternaria alternata.
31
RESUMO
Um total de 22 fungos endofíticos isolados de café (Coffea arabica L.) foi cultivado in
vitro e seus extratos brutos testados. O screening foi conduzido pelo método de difusão em
agar contra bactérias Gram-positivas, Gram-negativas e leveduras. O isolado mais efetivo foi
Alternaria alternata (CML 867) e, subsequentemente, seu extrato foi analisado. O conteúdo
de fenólicos totais do extrato bruto foi de 3,44 μgEAG/mg de extrato. Para os testes de
atividades antibacteriana e antifúngica, a concentração inibitória mínima (CIM) e
concentração bactericida e fungicida mínima (CBFM) contra Staphylococcus aureus,
Escherichia coli e Candida albicans foram determinadas. Os valores da CIM variaram entre
50-100 μg/mL para S. aureus e 400-800 μg/mL para E. coli. O extrato bruto não apresentou
atividade nas concentrações testadas para C. albicans. Foram analisadas as atividades
antioxidante do extrato bruto. Sua habilidade para seqüestrar radicais DPPH e a atividade
antioxidante pela oxidação do sistema β-caroteno/ácido linoléico não foram significativas.
Além disso, a atividade antitumor foi estudada pelo teste do MTT. À diluição de 400 μg/mL,
o extrato apresentou uma atividade de aproximadamente 50% sobre as células HeLa in vitro.
Os resultados indicam que fungos endófitos podem ser uma fonte promissora de compostos
bioativos necessitando de estudos futuros.
Unitermos: Fungos endofíticos; compostos bioativos; Alternaria alternata.
32
INTRODUCTION
Natural products play a dominant role in the discovery of leads for the development of
drugs in the treatment of human diseases. Much of nature remains to be explored, particularly
marine and microbial environments (NEWMAN; CRAGG; SNADER, 2003).
Microorganisms have the ability to utilize various substrates as a consequence of the diversity
of their biological and biochemical evolution. The solid substrates they use include, among
others, live plants. Both bacteria and fungi are known to collaborate with many plants to form
mutually beneficial associations. Actinomycetes and fungi, of all microorganisms studied,
have been found to be the most prolific producers of secondary metabolites
(GUANATILAKA, 2006).
In 1990 the magnitude of fungal diversity was estimated at 1.5 million species
(HAWKSWORTH, 1991), however, Arnold et al. (2000) suggested that tropical fungal
endophytes might prove to be hyperdiverse, and therefore the 1.5 million figure
underestimates fungal biodiversity.
In the last few years, considerable amount of knowledge has been accumulated on the
biology of endophytic microorganisms (FIRÁKOVÁ; STURDÍKOVÁ; MÚCKOVÁ, 2007).
Petrini et al. (1992) has expanded the definition of endophytes to include all those
microorganisms that, during a more or less long period of life, colonize symptomlessly the
living internal tissue of their hosts.
Metabolites produced by endophytes are being recognized as a versatile arsenal of
antimicrobial agents, since some endophytes have been known to possess superior
biosynthetic capabilities, owing to their presumable gene recombination with the host, while
residing and reproducing inside the healthy plant tissues (LI et al., 2005). A high proportion
of endophytic fungi (80%) produce biologically active compounds in tests for antibacterial,
fungicidal and herbicidal activities (SCHULZ et al., 2002). The continued development of
new antimicrobial compounds is important to overcome the difficulties related to the
treatment of infections caused by resistant pathogens (PETERSEN et al., 2004), and
endophytic fungi have emerged as an alternative source for the production of new
antimicrobial agents.
Due to the importance of secondary metabolites production by endophytic fungi, a
study of these coffee fungi allows us a better understanding of its diversity.
33
The purpose of this study was to evaluate several isolated fungi from the Coffea
arabica L. plant and select an endophytic fungus for further evaluation of its antimicrobial,
antioxidant and cytotoxic activities.
MATERIALS AND METHODS
Isolation of the endophytic fungi
For isolation of the endophytic fungi, adult and healthy leaves were selected and
subjected to surface sterilization. They were first washed with running water and then
immersed in a aqueous ethanol (3:7) for 1 minute, then in a 3% aqueous sodium hypochlorite
solution for 4 minutes and finally in aqueous ethanol (0.2:9.8) for 0.5 minute, with further
drying in sterilized paper in a biosafety chamber (PETRINI et al., 1982).
The sterilized leaves were cut into 5 mm diameter pieces and placed in a Petri dish
containing 2% malt-extract agar (MEA 2%) augmented with 50 μg/mL of chloramphenicol
and 10 μg/mL of cyclosporin A with approximately 5 leaves cut in the shape of a discus on
each dish. The material was incubated at 25 ºC for 10 days. All strains were isolated by
culture in 2% malt-extract agar (MEA 2%) with no antibiotic. The fungi were identified by
Dr. Ludwig H. Pfenning and deposited in the fungal collection with the accession number
CML (Coleção Micológica de Lavras) at the UFLA (Universidade Federal de Lavras).
Fermentation
For initial screenings, the mycelium of different endophytes grown on MEA 2% plates
were inoculated into 250 mL Erlenmeyer flasks containing 10 g of wheat bran as the substrate
which was moistened with 10 mL of distilled water to get an initial moisture content of 100%
before autoclaving at 121 ºC for 20 minutes. These flasks were incubated at 25 ºC for 10 days
under appropriate experimental conditions. The biomass of each endophyte was extracted two
times with dichloromethane (100 mL) at room temperature and further concentrated using a
vacuum pump to give dried residues prior to biological assays. For the production of crude
extract on a large scale, the mycelium of fungus selected was inoculated into 1.000 mL
Erlenmeyer flasks containing 100 g of wheat bran as the substrate with 100 mL of distilled
water to get an initial moisture content of 100% before autoclaving at 121 ºC for 20 minutes.
These flasks were incubated at 25 ºC for 10 days. The biomass of endophyte was extracted
and concentrated at the same conditions.
34
Determination of total phenolic content
The phenolic compounds of both the crude extract and wheat bran were determined by
using the Folin-Ciocateau reagent solution (WOISKY; SALATINO, 1998). Briefly, the
appropriate dilutions of the sample (0.5 mL) were oxidized with 2.5 mL Folin-Ciocateau
reagent (1:10) for 3-8 minutes at room temperature. Then the reaction was neutralized with
4% saturated sodium carbonate. The absorbance of the resulting blue color was measured at
740 nm with the spectrophotometer after incubation for 2 hours at room temperature in
darkness. Gallic acid was employed as the standard. All tests were carried out in triplicate and
the results were expressed as gallic acid equivalents (µg GAE/ dry weight of the crude
extract).
Test microorganisms
The microorganisms used in this study were Staphylococcus aureus ATCC 6538,
Escherichia coli ATCC 25922 and yeast Candida albicans ATCC 69548. The cultures were
stored at 4-8ºC for bacteria and yeast in BHI agar (brain heart infusion agar). These
microorganisms were kindly donated by the Microbiology Laboratory of Unifal-MG.
Antimicrobial screening
The crude extracts were screened for their antimicrobial activity using the agar
diffusion method (Lorian, 1996) against potentially pathogenic bacteria and yeast. The
microorganisms were seeded by pour plate method. All test plates were incubated at 37 ºC for
24 hours for bacteria and at 25 ºC for 24-48 hours for yeast. The inhibition zones were
observed, measured and recorded. The procedure was repeated and confirmed. The culture of
the endophytic fungus Alternaria alternata (CML 867) afforded the most promising
antibacterial and antifungal activities and, subsequently, its extract was assayed.
Microbiological assay
The antimicrobial activity of the crude extract of fungus Alternaria alternata (CML
867) was assayed against bacteria and yeast. Test solution was prepared with known weight
of crude extract, dissolved in DMSO. The minimum inhibitory concentration (MIC) and
minimum bactericidal and fungicidal concentration (MBFC) were determined in accordance
with CLSI guidelines (M100-S15, 2005) and Duarte et al. (2003), with few modification.
35
Individual colonies isolated from 24 hour cultures of bacteria and yeast were
suspended in sterile NaCl solution 0.89%. The suspension was properly inoculated in Nutrient
broth for bacteria and Sabouraud broth for yeast, containing a twofold dilution series of the
crude extract (concentrations ranged from 50 to 800 μg/mL reaction) to achieve an assay
concentration of 10
5
CFU/mL or the control (DMSO). The tubes were incubated at 37 ºC, for
24 hours for bacteria, and 25 ºC, for 24 hours, for yeast. The test was performed on three
replicates for each concentration of the extract. The lowest concentration of extract that had
restricted growth to a level of absorbance < 0.05 at 660 nm (no visible growth) was recorded
as the MIC. To determinate the MBC, an aliquot (50 μL) of all incubated tubes with
concentrations higher than the MIC was subcultured on Nutrient agar for bacteria and
Sabouraud agar for yeast. The MBC was defined as the lowest concentration of the extract
that allowed no visible growth on the agar plate after the period of incubation (KOO et al.,
2000). Three replicates were made for each concentration of the extract.
Antioxidant assay
Reagents
All the chemicals and reagents used in this study were of analytical grade. 1,1-
diphenyl-2-picryl-hydrazyl radical (DPPH), butylated hydroxytoluene (BHT), ascorbic acid,
gallic acid (GA), Folin-Ciocateau reagent solution, sodium carbonate, α- tocopherol, β-
carotene, linoleic acid and Tween 40 were purchased from Sigma-Aldrich, Merck or Vetec.
Free radical-scavenging activity measurement
Four mL of dilutions of crude extract (100, 500 and 1000 μg/mL) were added to 1 mL
of 0.5 mM DPPH in 96% ethanol. The mixtures were vigorously shaken and left to stand at
room temperature for 30 minutes in the dark (YEN; CHANG; DUH, 2005, with few
modification). Absorbance at 517 nm was measured versus ethanol as blank. Standard
samples (BHT and ascorbic acid) were used in the same concentrations. A degradation of
DPPH was evaluated by comparison with a control (4 mL ethanol and 1 mL of DPPH
solution). The DPPH radical-scavenging capacity was calculated by the formula:
A negative control – A sample
A negative control
x 100
% CS =
36
Negative control: 4.0 mL ethanol and 1.0 mL of DPPH solution.
Where A = Absorbance
% CS = % scavenging capacity
Antioxidant activity on linoleic acid oxidation
This assay was performed as described by Ahn et al. (2004) with some modifications.
β-carotene (10 mg) was dissolved in 100 mL of chloroform. Then, an aliquot (3 mL) of Β-
carotene- chloroform solution was added to 40 mg of linoleic acid and 400 mg of Tween 40.
Chloroform was then removed under a stream of nitrogen gas. Distilled water (100 mL) was
added, and the solution was mixed well. Aliquots (3 mL) of the β-carotene/linoleic acid
emulsion were mixed with 50 μL of crude extract solution and incubated in a water bath at 50
ºC. Oxidation of the emulsion was monitored spectrometrically by measuring absorbance at
470 nm over a 120 minutes period, in intervals of 20 minutes. The control sample contained
50 μL of solvent in place of the extract. The antioxidant activity was expressed as a
percentage of inhibition relative to the control after 120 minutes of incubation using the
equation:
Where AA = antioxidant activity.
DR
C
is the degradation rate of the control (= A
C0
– A
C120
); A
C0
is the initial absorbance at time
0, and A
C120
is the absorbance at 120 minutes.
DR
S
is the degradation rate in the presence of the sample (=A
S0
– A
S120
); A
S0
is the initial
absorbance at time 0, and A
S120
is the absorbance at 120 minutes.
The crude extract and wheat bran samples were evaluated at concentrations of 500 and 1000
μg/mL, and α- tocopherol and BHT (200 μg/mL) were used as positive controls.
DR
C
– DR
S
DR
C
x 100
AA =
37
Cytotoxic assay
Cell culture and cytotoxic activity
The HeLa (Human Cervix Cancer) cells were cultured at 37 ºC in a humidified
atmosphere containing 5% of CO
2
, using a Dulbelcco’s modified Eagle’s medium (DMEM)
supplemented with 10% of fetal calf serum (FCS) at pH 7.4. Gentamicin (10 μg/mL) was
used as an antibiotic. Cell culture reagents were purchased from Invitrogen (Gaithersburg,
MD) and 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium salt (MTT) from Sigma.
On the first day, cells were detached and seeded in a 48-well plate (2.0 x 10
4
cells/well). After
24 hours the medium was exchanged. Solution of the crude extract and wheat bran extract
were prepared in DMSO (vehicle). The final concentrations (400, 300 and 200 μg/mL) were
achieved by direct dilution into the cell medium. The samples or the vehicle were added and
incubated for a period of 48 hours. After this interval, 50.0 μL of a MTT solution (5.0 mg/mL
in PBS) were added to each well and the cells were incubated for an additional 3 hours
(MOSMANN, 1983). Subsequently, the medium was removed, cells were washed two times
with PBS, and 300 μL of isopropanol–HCL (0.04 mol/L)
were added. Cell viability was
determined by absorbance measurements at 570 nm.
Statistical analysis
All of the data was expressed as a mean ± s.d. from at least three separated
experiments (repetitions) performed in triplicate. The ANOVA test for unpaired observation
between controls and experimental samples and Tukey´s test for multiple comparisons were
conducted to evaluate statistical differences; p values of 0.05 or less were considered
statistically significant.
RESULTS AND DISCUSSION
Isolation of endophytic fungi
22 strains of endophytic fungi were isolated and identified from coffee leaves (Coffea
arabica L.), as listed in Table I.
38
TABLE I: Endophytic fungi isolated from coffee (Coffea arabica L.)
Code Identification
CML 370 Colletotrichum gloeosporioides
CML 450 Hypoxilan sp.
CML 451 Phomopsis sp.
CML 452 Pestalotiopsis sp.
CML 453 Phoma herbarum
CML 455 Cladosporium cladosporioides
CML 456 Xylaria sp.
CML 457 Colletotrichum crassipes
CML 706 Phoma exigua var. exigua
CML 865 Pseudohalonectria lutea
CML 866 Staninwardia sp.
CML 867 Alternaria alternata
CML 868 Periconia sp.
CML 869 Paracyclothyrium sp.
CML 870 Libertella sp.
CML 871 Phomopsis stipata
CML 872 Myrothecium roridum
CML 873 Microascus sp.
CML 874 Leptosphaeria sp.
CML 875 Microsphaeropsis sp.
CML 876 Microsphaeropsis sp.
CML 877 Guignardia sp.
Sette et al. (2006) isolated and identified 37 endophytic filamentous fungi from coffee
plants (Coffea arabica and C. robusta), which were studied with respect to the production of
antimicrobial compounds against human pathogenic bacteria. The results revealed that, 36 of
the endophytic filamentous fungi isolates belong to the Ascomycetes group, including 14
different genera: Aspergillus, Bipolaris, Cladosporium, Clonostachys, Colletotrichum,
Epicoccum, Fusarium, Guignardia, Mycosphaerella, Phomopsis, Rosellinia, Talaromyces,
Trichoderma and Xylaria.
According to Santamaria and Bayman (2005), having studied endophytic and
epiphytic fungal communities associated with coffee leaves (Coffea arabica) in Puerto Rico,
determined that Colletotrichum, Xylaria and Guignardia are the most common types of
endophytes.
Antimicrobial screening
The screening was conducted by agar diffusion method against Gram-positive and Gram-
negative bacteria and yeast. All of the crude extracts of fungi isolates inhibited at least one of
the microorganisms studied (Table II). The most effective fungus was Alternaria alternata
(CML 867).
39
TABLE II: Antimicrobial activity of extracts from fungal fermentation and fungi isolated from Coffea arabica
host plants.
Microorganisms
Sa Ec Ca
Active extracts/total extracts tested (%) 18/22 (81.8) 13/22 (59.1) 8/22 (36.4)
Sa: Staphylococcus aureus ATCC 6538; Ec: Escherichia coli ATCC 25922; Ca: Candida albicans
ATCC 69548.
Species of Alternaria are common and prevalent in the mycoflora, infesting and often
parasitizing seeds of a wide variety of food crops (SCHROEDER; COLE, 1977).
The results obtained in this screening showed that endophytic fungi are a promising source of
bioactive natural products.
The crude extract of Alternaria alternata (CML 867) was assessed for several
bioactivities such as antimicrobial, antioxidant, and cytotoxic activities. The extract obtained
from the culture medium (blank) was tested in all of the assays and did not present significant
activity, showing that positive results were due to secondary metabolites produced by the
fungus.
Antimicrobial assay
The crude extract of Alternaria alternata (CML 867) was assessed for antimicrobial activity
against S. aureus, E. coli and C. albicans. The MIC and MBFC values of crude extract of
Alternaria alternata (CML 867) are shown in Table III.
TABLE III: The minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum bactericidal and fungicidal
concentration (MBFC) of crude extract of Alternaria alternata (CML 867).
Microorganisms
Staphylococcus aureus
ATCC 6538
Escherichia coli
ATCC 25922
Candida albicans
ATCC 69548
MIC
a
MBC
a
MIC MBC MIC MFC
Alternaria alternata crude
extract
b
50-100 >800 400-800 >800 >800 >800
Wheat bran crude extract
b
* * * * * *
DMSO * * * * * *
a
The MIC and MBC values are expressed in μg/mL. The concentrations of crude extracts ranged from 50 to 800
μg/mL
b
Three replicates were made for each concentration of the extracts for all assays.
* showed no activity.
Compounds isolated from endophytic fungi also displayed antimicrobial activity.
Altersin, a natural product isolated from two endophytic Alternaria species, showed potent
minimum inhibitory concentration against several pathogenic Gram-positive bacteria
40
(HELLWIG et al., 2002), suggesting that this compound could be present in the crude extract
of the fermentation of Alternaria alternata (CML 867), requiring subsequent confirmation.
In accordance with Lin et al. (2007), in the study of the medicinal plant Camptotheca
acuminata, 174 endophytic fungi were isolated. Of the 18 taxa obtained, Alternaria (12.6%)
was dominant, among others . Of the 22 Alternaria extracts tested, three showed antimicrobial
activity.
Of the 67 endophytic fungi isolated from Quercus variabilis, 19.4% (Aspergillus sp.,
Penicillium sp. and Alternaria sp.) showed significant antimicrobial activity (WANG et al.,
2007).
Phongpaichit et al. (2006) isolated 377 fungi and its fermentation broths were tested
for antimicrobial activity. The results revealed that 6-10% and 1% of the crude ethyl acetate
extracts inhibited both strains of S. aureus (MIC 32-512 μg/mL) and C. albicans (MIC
64-200 μg/mL), respectively.
Were tested 37 endophytic filamentous fungi isolated from coffee plants (Coffea
arabica and Coffea robusta) with respect to their production of antimicrobial compounds
against human pathogenic bacteria such as Salmonella choleraesuis, Staphylococcus aureus,
Pseudomonas aeruginosa and four different Escherichia coli serotypes. Seventeen fungi
inhibited at least one of the bacteria studied (SETTE et al., 2006).
Antioxidant assay
The crude extract of fungus Alternaria alternata (CML 867) was evaluated for its
antioxidant activity in the DPPH assay and by β-carotene/linoleic acid system oxidation as
shown in Figure 1 and Figure 2, respectively.
The radical DPPH scavenging activity model is a classic, simple and rapid method of
assessing antioxidant activity (GÜLÇIN; ALICI; CESUR, 2005). The extracts used and the
standards, butylated hydroxytoluene (BHT) and ascorbic acid, were assessed at a
concentration of 100 – 1000 μg/mL.
41
0
20
40
60
80
100
120
Wheat bran Crude extract BHT Ascorbic acid
DPPH scavenging activity (%)
100 μg/mL
500 μg/mL
1000 μg/mL
FIGURE 1 – DPPH scavenging activity of BHT, ascorbic acid, and the crude extracts from Alternaria alternata
(CML 867) and wheat bran at different concentrations.
In a concentration of 100 μg/mL, the crude extract of the endophyte showed less
significance (p < 0.05), in relation to the crude extract of wheat bran. In concentrations of
500 and 1.000 μg/mL, a significant difference between the fungus’ and wheat bran’s crude
extracts’ sequestering capability of DPPH radicals indicates the presence of antioxidant
compounds in the crude extract of Alternaria alternata (CML 867). This extract presented a
sequestering potential of approximately 8 times less than the standard BHT, with IC
50
of 86.7
and 687.2 μg/mL, respectively. The IC
50
values were obtained from the plot of absorbance
against concentration for each sample. The IC
50
is the sample concentration that lead 50% less
scavenging capacity.
In the β-carotene-linoleic acid assay, the linoleic acid free radical attacked the highly
unsaturated β-carotene models. The presence of different antioxidants can hinder the extent of
β-carotene bleaching by neutralizing the linoleate radicals formed in the system (SHON;
KIM; SUNG, 2003).
The negative control, ethanol control, showed the ineffectiveness of the vehicle used
in the inhibition of the oxidation of the system, observed by the reduction of the inhibition
rate (Figure 2). The standards effectively showed, over time, that they are able to maintain
the values of inhibition at 120 minutes at 84.7 ± 1.9 and 90.7 ± 2.2%.
The crude extract of Alternaria alternata (CML 867) presented a dose-dependent
response. There was no significant difference between the activity of the crude extract of
Alternaria alternata (CML 867) at 500 μg/mL and the crude extracts of wheat bran at 500 and
42
1.000 μg/mL (p> 0.05). At 1.000 μg/mL, the endophytic extract presented an inhibition rate
(56.4 ± 3.9 %, p<0.001) significant to that of the crude extract of wheat bran in the same
concentration, showing that the action of the crude extract of Alternaria alternata (CML 867)
is independent of the action of the wheat bran.
2 0
4 0
6 0
8 0
1 0 0
0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0 1 2 0
T im e (min)
(%) inhibition
E t h a n o l c o n t r o l a lf a - t o c o p h e r o l 2 0 0 u g / m L
B H T 2 0 0 u g / m L A lt e r n a r ia c r u d e e x t r a c t 5 0 0 u g / m L
A lt e r n a r ia c r u d e e x t r a c t 10 0 0 u g / m L W h e a t b r a n c r u d e e x t r a c t 5 0 0 u g / m L
W h e a t b r a n c r u d e e x t r a a c t 10 0 0 u g / m L
FIGURE 2 – Inhibition rate of oxidation of β-carotene-linoleic acid system by Alternaria alternata (CML 867)
crude extract at different concentrations in comparison with the wheat bran crude extract and the standards.
The data reinforces that the substrate used in the fermentation process interfered
significantly in the determination of antioxidant activity, as this substrate already possessed
this ability. According to Soares (2002), wheat bran extract was described as an important
antioxidant agent due to the presence of considerable quantities of phenolic acids, such as
protocatechuic, gentisic, caffeic, vanilic, chlorogenic and pherulic.
Phenolic compounds seem to have an important role in stabilizing lipid oxidation and
are associated with antioxidant activity, which is emphasized in several reports
(YANISHLIEVA-MASLAROVA, 2001). Therefore, in this work, we determined the total
phenolic content of the crude extract of Alternaria alternata (CML 867) and wheat bran,
obtaining values of 16.90 and 13.47 µg GAE/mg of dry crude extract, respectively.
The difference of phenolic content, which was 3.44 µg GAE/mg of dry crude extract,
can be related to the major activity of the endophyte crude extract with respect to the wheat
bran extract in the different models of antioxidant activity. However, the content of total
phenolics depends on the solvent used in the extraction. In the study of different extracts of
43
endophyte Xylaria sp, Liu et al. (2007) proved that extracts obtained from more polar solvents
present a higher amount of total phenolics. In our study, the crude extract of Alternaria
alternata (CML 867), obtained through the extraction with dicloromethane, presented a lower
amount of total phenolics, as did the chloroformic extract of Xylaria sp. (12.66 ± 0.92 µg
GAE/mg dry weight of the fruiting bodies) described by Liu et al. (2007). The analysis of 292
endophytes isolated from 29 traditional Chinese medicial plants evidenced that the
antioxidant capacities of endophytic fungal cultures were significantly correlated with their
total phenolic content (HUANG et al., 2007). This relationship was also observed in the
present study.
A comparison the antimicrobial activity and antioxidant activity in relation to the
amount of total phenolics of different propolis extracts, certified that a moderate correlation
exists between the amount of total phenolics and the biological activity. In one group of
extracts there was a strong linear relationship between total phenol contents and the measured
activities, while in the other group this relationship was weaker (SILVA et al., 2006). In this
context, the crude extract of the endophyte Alternaria alternata (CML 867) presented a
greater antimicrobial activity, a moderate antioxidant activity in the tested concentrations, and
overall, presented a lower total phenolic content.
Cytotoxic assay
The results of the cytotoxic activity of the crude extract of Alternaria alternata (CML 867)
are shown in Figure 3.
FIGURE 3 – Cytotoxic analysis of crude extract of wheat bran and Alternaria alternata (CML 867) for Hela
cells. The data represent averages of three independent experiments perfomed in triplicate.
44
The cytotoxic assays showed moderate activity of the crude extract of Alternaria
alternata (CML 867) on the viability of HeLa cells in vitro, when compared to the DMSO
treated cells. Three concentrations were tested varying between 200-400 μg/mL and it was
determined that, in the concentration of 400 μg/mL, the crude extract of the endophyte was
able to inhibit about 50% of cell proliferation in HeLa cells. In this test, the crude extract of
wheat bran showed no activity under the tested cells. The crude extract of Alternaria
alternata (CML 867) presented a dose-dependent response.
Several cytotoxic compounds have been isolated from endophytic fungi, showing the
potential of these fungi in the search for antitumoral agents (GUIMARÃES et al., 2008).
Liu et al. (2007) demonstrated for the first time that Alternol, a new compound purified from
the fermenting products of Alternaria alternata var. monosporus, from the bark of Yew, was
found to inhibit proliferation and induce apoptosis in mouse lymphocyte leukemia L1210
cells. Alternol induced the activation of caspase-3, caspase-9, but not caspase-8. Moreover,
there was a significant increase in reactive oxygen species (ROS) which might also play a role
in apoptosis. Based on this study, we can suggest that Alternaria alternata (CML 867) can
also be able to produce this compound with cytotoxic activity under HeLa cells.
Firáková, Sturdíková and Múcková (2007) presented the overview of bioactive
secondary metabolites with anticancer activity produced by endophytes, for example,
camptothecin of a fungal endophytic isolate, podophyllotoxin, aryltetralignans of Trametes
hirsuta, cytoskyrins of Curvularia lunata, macrolides of Streptomyces sp. Is9131 and
brefeldine A of Phoma medicaginis, among others.
Therefore, endophytic fungi play an important role in the search for antitumoral
compounds and might also represent an alternative source for the production of therapeutic
agents that are not easily obtained by chemical synthesis. The potential of these fungi is of
great interest and deserves further investigation.
ACKNOWLEDGMENTS
The authors would like to thank the Unifal-MG and Proapi-Capes for financial
support.
45
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3 CONCLUSÕES
Foram isolados 22 fungos endófitos de café (Coffea arabica L.) entre os quais foi
selecionado o fungo Alternaria alternata (CML 867) para dar prosseguimento ao trabalho.
O extrato bruto da fermentação apresentou valores de CIM variando entre 50-100 μg/mL
para Staphylococcus aureus, 400-800 μg/mL
para Escherichia coli e CIM > 800 μg/mL
para Candida albicans. A CBFM foi > 800 μg/mL
para todos os microrganismos testados.
Na avaliação da atividade antioxidante, o extrato apresentou uma atividade moderada nos dois
métodos de análise, quando utilizada a concentração de 500 μg/mL
no método do DPPH e de
1000 μg/mL
no método da oxidação do sistema β-caroteno/ácido linoléico .
O conteúdo de fenólicos totais do extrato bruto do endófito foi de 3,44 µg EAG/mg de extrato
bruto.
O ensaio de citotoxicidade mostrou uma atividade moderada do extrato bruto do Alternaria
alternata (CML 867) na viabilidade de células HeLa in vitro na concentração de 400 μg/mL
.
Esta inibição foi em torno de 50% da viabilidade celular.
Fungos endófitos são de grande interesse por produzirem uma diversidade de metabólitos
secundários com diferentes atividades biológicas. Estudos posteriores devem ser realizados
para se esclarecer quais compostos são responsáveis pelas atividades encontradas no extrato
da fermentação do endófito Alternaria alternata (CML 867).
49
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