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Universidade Federal do Rio Grande do Sul
Faculdade de Medicina
Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas: Psiquiatria
Tese de Doutorado
Aspectos Genéticos no Transtorno do Pânico
Carolina Blaya
Orientadora: Prof. Dra. Gisele Gus Manfro
Março/2008
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Universidade Federal do Rio Grande do Sul
Faculdade de Medicina
Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas: Psiquiatria
Tese de Doutorado
Aspectos Genéticos no Transtorno do Pânico
Carolina Blaya
Tese apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Ciências Médicas:
Psiquiatria da Universidade Federal do Rio
Grande do Sul como requisito parcial para
obtenção do título de doutor em
Psiquiatria.
Orientadora: Prof. Dra. Gisele Gus Manfro
Co-orientador: Sandra Leistner-Segal
Jordan W. Smoller
Porto Alegre, março de 2008.
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3
Catalogação-na-Publicação
B645 Blaya, Carolina
Aspectos genéticos no transtorno do pânico / Carolina Blaya. — 2008.
156 f.
Tese (doutorado) — Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas:
Psiquiatria, Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Rio Grande
do Sul, Porto Alegre, 2008.
Orientadora: Gisele Gus Manfro, co-orientadores: Sandra Leistner-
Segal, Jorge W. Smoller.
1. Transtorno de pânico 2. Transtornos da ansiedade 3. Genética
médica 4. Farmacogenética I. Manfro, Gisele Gus II. Leistner-Segal,
Sandra III. Smoller, Jorge W. IV. Título
NLM WM 172
(Bibliotecária responsável: Lenise Di Domenico Colpo – CRB-10/1757)
4
Ao meu esposo,
Rodrigo Dreher.
5
Agradecimentos
À minha orientadora, Prof. Dra. Gisele Gus Manfro, por ser o maior exemplo
de como combinar uma carreira acadêmica de muito sucesso com tanto afeto,
carinho, incentivo e amizade;
A minha co-orientadora, Sandra Leistner-Segal por ter disponibilizado
tempo e espaço para execução desse trabalho;
Ao meu co-orientador Jordan W. Smoller, por ter ampliado tanto a execução
desse projeto;
Ao Giovanni Salum Júnior, por ter trabalhado junto e contribuído muito em
todos os artigos dessa tese;
Aos colaboradores Elizeth Heldt, Priya Morjanni, Ana Carolina Seganfredo,
Maurício Silva de Lima, Leonardo Gonçalves, Jandira Acosta, Ana Paula Salgado,
Graziela Rodrigues, Jair Segal, Luciano Isolan, Cláudia Wachleski, Letícia Kipper,
Marina Dornelles, Andréia Tocchetto, Mariana Torres e Angela Paludo, pela
contribuição nas diversas etapas do trabalho;
Ao FIPE do Hospital de Clínicas de Porto Alegre, ao CAPES (Centro de
Aperfeiçoamento de Pessoal do Ensino Superior) e ao CNPq (Centro Nacional de
Apoio à Pesquisa), pelo apoio financeiro;
Aos meus pais, José (in memorian) e Liane, e aos meus irmãos, Patrícia e
Rodrigo, por constituírem essa família que é a mais sólida base da minha vida;
Ao meu esposo, Rodrigo Dreher, pelo companherismo, amor e por sempre
acreditar na minha capacidade.
6
Sumário
Lista de figuras ........................................................................................................ 8
Lista de tabelas ....................................................................................................... 9
Lista de abreviaturas ............................................................................................. 10
Apresentação Parcial dos Resultados .................................................................. 13
Resumo ................................................................................................................. 15
Summary ............................................................................................................... 18
Introdução ............................................................................................................. 21
Transtorno do Pânico ........................................................................................ 21
Etiologia ............................................................................................................. 22
Delineamentos de estudos em Genética Psiquiátrica ....................................... 26
A busca de genes candidatos ............................................................................ 32
Fenótipos intermediários ................................................................................... 45
Interação gene-ambiente ................................................................................... 50
Interação gene-gene .......................................................................................... 53
Farmacogenética ............................................................................................... 55
Justificativa do Estudo .......................................................................................... 57
Hipóteses .............................................................................................................. 58
Objetivos ............................................................................................................... 60
Considerações Éticas .......................................................................................... 61
Referências Bibliográficas ................................................................................... 62
Artigos .................................................................................................................. 63
7
Artigo 1 – Lack of association between the Serotonin Transporter Promoter
Polymorphism (5-HTTLPR) and Panic Disorder: a systematic review and meta-
analysis .............................................................................................................. 64
........................................................................................................................... 65
Artigo 2 – Panic disorder and serotoninergic genes (5-HTTLPR, HTR1A and
HTR2A): association and interaction with childhood trauma and parental
bonding .............................................................................................................. 75
Artigo 3 – Association between EFHC2 with Panic Disorder, Harm Avoidance
and Behavioral Inhibition ................................................................................... 95
Artigo 4 – CREB1 as a predictor of long term response to cognitive-behavior
therapy for pharmacotherapy-resistant panic disorder patients ...................... 102
Considerações finais ........................................................................................... 121
Anexo A: Termo de Consentimento Informado ................................................. 126
Adendo ao Termo de Consentimento Informado para Pacientes ......................... 127
Anexo B: Produção científica durante o período do doutorado ........................ 130
8
Lista de figuras
Figura Página
Figura 1. Modelo dimensional da nosologia genética 47
Figure 1. Flowchart – Stages of Systematic Review with Meta-
analysis
80
Figure 2. Forest plot with odds ratio of each study and pooled odds
ratio for the association between the s allele and risk of Panic
Disorder
81
Figure 1. Relative frequency of PD stratified for optimal father
parenting (low overprotection and high warmth) and rs6311 genotype
112
Figure 1. Flowchart of patients treated at CBGT that were included in
genetic analysis and their characteristics
140
Figure 2. Location of single nucleotide polymorphisms (SNPs) that
span CREB1 gene
143
9
Lista de tabelas
Tabela Página
Tabela 1. Estudos que avaliaram genes da serotonina no Transtorno
do Pânico
38
Table 1. Included Case-control Studies of 5-HTTLPR and Panic
Disorder
84
Table 2. Results of the overall studies and sub-group studies stratified
by ethnicity, quality of control group and comorbidity with Agoraphobia
85
Table 1. Set-based test for the association between Polymorphisms
(PMs) and Panic Disorder (PD n=107, Controls n=125)
110
Table 2. HTR1A single-marker association and haplotype association
with Panic Disorder (107 cases and 125 controls)
111
Table 1. Allelic Association between individual SNPs in EFHC2 with
Behavioral Inhibition and Harm Avoidance
119
Table 1. Set-based test for the association between Polymorphisms
(PMs) and Delta-CGI (Baseline CGI – 1-year CGI) at 1-year follow-up
(n=73)
141
Table 2. Association between individual SNP and Haplotype in CREB
gene and delta-CGI at 1-year follow-up (n=73)
142
10
Lista de abreviaturas
5-HTT – Gene transportador da serotonina ou Serotoninergic transporter gene
5-HTTLPR – Polimorfismo na região promotora do gene transportador da
serotonina ou Serotonin Transporter Promoter Polymorphism
AMPc – Adenosina monofosfato cíclico
BDNF – Fator neurotrófico neuronal
CBT – Cognitive Behavioral Therapy
CI – Comportamento inibido
CI95% – Confident Interval of 95%
CIDI – Composite International Diagnostic Interview
COMT – Gene Catechol O-Methyltransferase
CREB – AMPc responsive-element binding protein
CREB1 – AMPc responsive-element binding protein gene
CRH – Hormônio liberador de Corticotrofina
CRHR1 – Receptor 1 do Hormônio liberador de Corticotrofina
DL – Desequilíbrio de ligação
DNA – Ácido desoxirribonucléico
DSM – Manual diagnóstico e estatístico de transtorno mental ou Diagnostic and
Statistical Manual
EFHC2 – EF-hand domain containing 2
GWA – Genome-wide association
GxA – Interação Gene-Ambiente
11
HCPA – Hospital de Clínicas de Porto Alegre
HPA – Eixo Hipotálamo-hipófise-adrenal
HTR1A – Receptor de serotonina 1A
HTR1B – Receptor de serotonina 1B
HTR2A – Receptor de serotonina 2A
HTR2C – Receptor de serotonina 2C
HTR3A – Receptor de serotonina 3A
HWE – Equilíbrio de Hardy-Weinberg ou Hardy-Weinberg Equilibrium
ICD – International Classification of Diseases
ISRS – Inibidores seletivos de recaptação da serotonina
L – long
MAOA – Monoamino oxidase A
Met – Metionina
MGH – Massachusetts General Hospital
MINI – MINI International Neuropsychiatric Interview
MOOSE – Meta-analysis of Observational Studies in Epidemiology
OR – Odds ratio
PD – Panic Disorder
RFLP – Restriction fragment length polymorphism
RGS2 – Regulator of G-protein signaling 2
S – short
SLC6A4 – Solute Carrier Family 6 (Neurotransmitter transporter serotonin),
member 4
12
SNC – Sistema Nervoso Central
SNP – Single nucleotide polymorphism
SNPs – Single nucleotide polimorphisms
SSRIs – Serotonin Selective Reuptake Inhibitors
TCLE – Termo de Consentimento livre e esclarecido
TP – Transtorno do Pânico
TPH – Triptofano hidroxilase
UFRGS – Universidade Federal do Rio Grande do Sul
Val – Valina
VNTR – Número variável de repetições em tandem
13
Apresentação Parcial dos Resultados
• Blaya C, Paludo A, Torres M, Dornelles M, Seganfredo AC, Heldt E, Manfro
GG. Milnaciprano no Transtorno do Pânico: um ensaio aberto. XXIII
Jornada de Psiquiatria Psicodinâmica do CELG, Porto Alegre 2006.
• Blaya C, Paludo A, Torres M, Dornelles M, Seganfredo AC, Heldt E, Manfro
GG. Milnacipran in Panic Disorder: an open trial. 159
th
American Psychiatric
Association Annual Meeting, Toronto 2006.
• Muños V, Blaya C, Leister-Segal S, Manfro GG. Técnica de digestão com
MspI para identificação da variante “l” do 5-HTTLPR. 25ª Semana Científica
do HCPA, Porto Alegre 2006.
• Blaya C, Heldt E, Moorjani P, Salum Júnior G, Leistner-Segal S, Smoller J,
Manfro GG. Marcadores genéticos como preditores à Terapia Cognitiva
Comportamental para Transtorno do Pânico. XXV Congresso Brasileiro de
Psiquiatria, Porto Alegre, 2007.
• Blaya C, Moorjani P, Heldt E, Salum Júnior G, Leistner-Segal S, Perlis R,
Smoller J, Manfro GG. Genetic markers as a predictor to Cognitive
Behavioral Therapy (CBT) for Panic Disorder (PD). XVth World Congress in
Psychiatric Genetics, Nova Iorque, 2007.
• Salum Júnior G, Blaya C, Moorjani P, Seganfredo AC, Heldt E, Kipper L,
Smoller J, Manfro GG. Interação Gene-Ambiente (GxA): Moderação de um
polimorfismo no receptor da serotonina 1A (5-HTR1A) na relação com
14
Transtorno do Pânico e estressores precoces de vida. XIX Salão de
Iniciação Científica da UFRGS, Porto Alegre, 2007. Prêmio destaque.
• Acosta JR, Blaya C, Salum Júnior G, Manfro GG. Polimorfiosmo Val66Met
do Fator Neurotrófico Derivado do Cerébro (BDNF) e Transtorno do Pânico:
estudo de caso-controle. XIX Salão de Iniciação Científica da UFRGS,
Porto Alegre, 2007.
15
Resumo
A herdabilidade estimada do Transtorno do Pânico (TP) é de 28 a 43%,
embora ainda permaneça como questão de pesquisa quais os genes envolvidos
na sua etiologia. A busca dos genes candidatos para os estudos de associação
geralmente é baseada em moléculas envolvidas no tratamento farmacológico, nos
agentes que induzem ataques de pânico ou nos estudos de neuroimagem. Genes
relacionados ao sistema serotoninérgico, noradrenérgico, eixo hipotálamo-
hipófise-adrenal, entre outros, já foram investigados no TP. Os resultados são
ainda pouco conclusivos. Para ampliar o conhecimento nessa área, foram
realizados quatro estudos nessa tese.
O polimorfismo no promotor do gene transportador da serotonina (5-
HTTLPR) foi estudado por alguns autores no TP. Realizamos então o estudo 1,
que é composto pela revisão sistemática e meta-análise dos estudos de caso-
controle que avaliaram esse gene no TP. Foram revisados artigos publicados
entre janeiro de 1996 e abril de 2007 nas bases PubMed, PsychInfo, Lilacs e ISI.
Identificou-se 19 artigos potenciais, e foram incluídos na análise 10 estudos. Não
houve associação do gene 5-HTTLPR e o TP (OR=0,91, CI95% 0,80 to 1,03,
p=0,14). Três subanálises divididas de acordo com a etnia, qualidade do grupo
controle e comorbidade com Agorafobia também não encontraram qualquer
associação. Entretanto essa análise não possui poder para identificar associações
de menor magnitude, e mais estudos são necessários.
16
O estudo 2 foi realizado para avaliar a associação entre polimorfismos nos
genes 5-HTTLPR e receptores da serotonina 1A (HTR1A) e 2A (HTR2A) e o TP,
bem como a interação com dois fatores ambientais previamente associados ao
transtorno: trauma e parentagem na infância. Foram incluídos 107 pacientes e
125 controles. O gene HTR1A foi associado ao TP na análise de grupo corrigido
para o experimento (p
2
=0,027). Três SNPs desse gene foram associados ao TP.
Na análise de haplótipo pode-se identificar um haplótipo associado ao TP
(p=0,008), e outro protetor para o TP (p=0,004). Na análise de interação,
identificou-se que polimorfismos no gene HTR2A (rs6311 e rs6313), influenciado
por ótima parentagem paterna, conferia proteção ao TP. Essa interação
permaneceu significativa após a correção de Bonferroni. Não houve associação do
TP com o 5-HTTLPR mesmo considerando a interação com trauma na infância.
Esse estudo replica achados prévios de associação do TP com o HTR1A e
também reforça a evidência de interação gene-ambiente do HTR2A com
parentagem, que possivelmente influencia a capacidade dos sujeitos de usarem
as experiências familiares como suporte.
O estudo 3 avaliou o TP com o EF-hand domain containing 2 (EFHC2), um
gene previamente associado à percepção do medo. Nesse estudo foram incluídos
127 pacientes e 132 controles. Um dos 8 marcadores do EFHC2 (rs1562875) foi
associado ao TP, e também a dois outros fenótipos intermediários associados à
ansiedade: comportamento inibido e temperamento evitação de dano. Se for
replicado, esse achado pode colaborar para a elucidação do mecanismo
neurobiológico do medo.
17
O estudo 4 avaliou polimorfismos em 7 genes previamente envolvidos na
ansiedade (BDNF, CREB1, RGS2, CRHR1, 5-HTTLPR, HTR2A, HTR1A) com a
resposta à terapia cognitivo-comportamental (TCC) no TP. Foram incluídos 74
pacientes com TP resistentes a quatro meses de tratamento prévio com
antidepressivos que fizeram TCC em grupo. Na análise de grupo, houve
associação do CREB1 com melhora em 1 ano de seguimento (p= 0,016). Dois dos
5 marcadores do CREB1 estiveram associados a esse desfecho (rs7594560,
p=0,003 e rs2253206, p=0,021), mas não permaneceram associados após a
correção por permutação. Na análise de haplótipos, um dos dez haplótipos esteve
associado à melhor resposta nesse mesmo período. Apesar do limitado tamanho
amostral esse estudo promoveu evidências preliminares da associação do CREB1
na resposta à TCC.
Por fim, essa tese versa sobre alguns aspectos relacionados ao TP,
abrangendo revisão sistemática da literatura, estudos de associação, de interação
gene-ambiente e de resposta à TCC. Esses artigos estão de acordo com
propostas atuais de estudos em genética, incluindo a pesquisa de vários genes e
a análise de múltiplos marcadores que buscam aumentar o conhecimento dos
fatores genéticos associados ao TP.
18
Summary
The estimated herdability of PD is between 28 to 43%, however which
genes are involved in PD etiology still remains to be answered.. The search for
candidate genes are usually based on molecules associated to pharmacological
treatment, panic-inducing substance or neuroimage studies. Genes related to
serotoninergic, noradrenergic, hypothalamic-pituitary-adrenal axis and others have
been previously studied with inconclusive results. In order to improve this
knowledge, four studies were performed in this thesis.
The polymorphism in the promoter of serotonin transporter gene (5-
HTTLPR) has been studied in PD. The study 1 was designed in order to perform a
systematic review and meta-analysis of case-controls studies. Papers published
between January 1996 and April 2007 were eligible for this study. The electronic
databases searched included PubMed, PsychInfo, Lilacs and ISI. Nineteen
potential articles were identified, and 10 studies were included in this meta-
analysis. No statistically significant association between 5-HTTLPR and PD was
found, OR=0.91 (CI95% 0.80 to 1.03, p=0.14). Three sub-analyses divided
according to ethnicity, control group and comorbidity with agoraphobia also did not
find any association. However, more studies are needed in order to evaluate a
possible minor effect.
The study 2 was designed to evaluate the association between HTR1A,
HTR2A and 5-HTTLPR in PD patients and controls. Besides this, we ought to
evaluate the interaction between these genes and two environmental factors
19
previously associated with PD: childhood trauma and parental bonding. In this
case-control candidate gene study, 107 PD patients and 125 controls were
included. HTR1A was experiment-wide associated with PD in set-based test
(p
2
=0.027). Three SNPs of this gene were nominally significantly associated with
PD. Additionally, one haplotype was significantly associated with PD (p=0.008),
and one haplotype was significantly protective for PD (p=0.004). In the interaction
analysis with optimal father parenting, both interaction terms of SNPs of HTR2A
(rs6311 and rs6313) were nominally associated with PD and remained significant
after Bonferroni’s correction. No association was found with 5-HTTLPR even
considering interaction with childhood trauma. This study replicates previous
findings regarding the association between PD and HTR1A. We also reinforce
evidence of gene-environment interaction in HTR2A gene with parenting, maybe
influencing the capacity of subjects to use familiar experiences as environmental
support.
In the study 3 we evaluated the association between PD and EF-hand
domain containing 2 (EFHC2), a gene previously related to fear recognition. In this
study we included 127 patients and 132 controls. One of 8 EFHC2 markers
(rs1562875) was associated with PD and also with two intermediate phenotypes
related to anxiety: behavioral inhibition and harm avoidance. If replicated, this
finding may contribute to elucidate the neurobiological path of fear.
In the study 4 we evaluated 7 genes previously related to anxiety (BDNF,
CREB1, RGS2, CRHR1, 5-HTTLPR, HTR2A, HTR1A) with cognitive-behavioral
therapy (CBT) response. We included 74 patients resistant to 4 months of
20
antidepressant treatment that received add-on treatment with group CBT. In the
set-based test, CREB1 achieved gene-wide significant association with
improvement at 1-year follow-up (empirical p-value = 0.016). Out of the 5 CREB1
single markers SNPs, two showed nominally significant associations (rs7594560,
p-value 0.003 and rs2253206, p-value 0.021), that did not remain significant after
10,000 permutations. In the haplotype analysis, we identified one haplotype
significantly associated with 1-year response (p=0.0002). Although limited by small
sample size, these results provide preliminary evidence that variations in CREB1
may be related to long-term CBT response among pharmacological-resistant
patients with PD.
Finally, this thesis shows some aspects related to genetics in PD, including
a systematic search, association, gene-environment and CBT response studies.
Papers included are in accordance with what has been proposed for new studies in
genetic, including the analysis of different genes and markers in order to contribute
to the knowledge of genetic factors of PD.
21
Introdução
Transtorno do Pânico
O Transtorno do Pânico (TP) é caracterizado pela presença de ataques
súbitos de ansiedade, acompanhado de ansiedade antecipatória e evitação de
locais ou situações nas quais já ocorreu um ataque de pânico . O TP
freqüentemente é complicado pela presença de Agorafobia, que é a evitação
fóbica de locais nos quais é difícil de sair ou obter ajuda. Estudos recentes
estimam que o TP com ou sem Agorafobia afeta em torno de 4,8% da população
geral . O TP é duas ou três vezes mais comum em mulheres e geralmente inicia
no final da adolescência ou início da vida adulta .
O TP, em geral, tem um curso crônico. Alguns estudos evidenciaram que cerca
de 20 a 30% dos pacientes apresentavam sintomatologia igual ou pior após vários
anos de tratamento . Outros estudos de seguimento mostraram que o TP pode
apresentar um curso crônico em até 88% dos pacientes . Andersch et al. (2003)
seguiram pacientes com TP ao longo de 15 anos e evidenciaram que mais de 20%
da amostra seguia sintomática .
O diagnóstico do TP, como uma entidade nosológica individual, surgiu em
1980 a partir do DSM III (Manual Diagnóstico e Estatístico de Transtorno Mental).
No DSM IV , o TP caracteriza-se pela presença de ataques espontâneos e
recorrentes que atingem o pico máximo em até 10 minutos e são acompanhados
por uma sensação de medo iminente ou urgência para escapar. Após um dos
22
ataques, deve haver preocupação persistente com a possibilidade de ocorrer um
novo episódio, com suas implicações e consequências ou uma alteração
significativa no comportamento em função dos ataques por um período de pelo
menos um mês. No TP, os ataques de pânico não ocorrem como uma
conseqüência de efeitos fisiológicos diretos de alguma substância ou condição
médica, assim como não são sintomas de outro transtorno mental . O paciente
deve ter vivenciado ataques espontâneos ao menos uma vez, embora os ataques
possam passar a ser situacionais com o desenvolvimento da doença.
Etiologia
Diversos fatores vêm sendo atribuídos à gênese do Transtorno do Pânico, e
tanto fatores genéticos quanto psicológicos e ambientais parecem contribuir para
esse transtorno .
Fatores genéticos
Os Transtornos de Ansiedade geralmente se agregam em famílias .
Estudos de famílias com TP demonstraram um padrão familiar, no qual o risco de
TP em parentes de primeiro grau dos pacientes com esse transtorno é maior que
no grupo controle . Estudos com gêmeos também corroboram esses achados,
mostrando maior concordância do TP em gêmeos monozigóticos em comparação
aos dizigóticos .
23
Estudos realizados em gêmeos sugerem que fatores de risco genéticos
comuns provavelmente colaboram para as altas taxas de comorbidade presente
nos Transtornos de Ansiedade. Togerson encontrou uma concordância de 2:1 em
gêmeos monozigóticos:dizigóticos quando considerou todos os Transtornos de
Ansiedade, mas não encontrou essa relação quando considerou um mesmo
Transtorno de Ansiedade. Estudos mais recentes em uma ampla amostra de
gêmeos descreveram que tanto fatores genéticos quanto ambientais colaboram
para o desenvolvimento de Fobias, Depressão Maior, Transtorno de Ansiedade
Generalizada e Transtorno do Pânico .
Fatores Psicológicos
Vários estudos psicológicos sobre o TP seguem a teoria cognitivo-
comportamental. Segundo Clark , os ataques de pânico derivam de interpretações
catastróficas disfuncionais de certas manifestações corporais. A suposição é
centralizada no processamento inadequado de informações vindas de um estímulo
externo (ruído, luminosidade) ou interno (sensação de taquicardia, sudorese,
vertigem). A interpretação é de perigo iminente que dispara ou intensifica as
sensações corporais confirmando o “perigo”, gerando então mais interpretações
catastróficas e ansiedade em uma espiral crescente e rápida. O modelo de Barlow
amplia este conceito, no qual o ataque de pânico inicial é um “alarme falso”
quando ocorre um aumento momentâneo de estresse da vida em indivíduos com
vulnerabilidades biológicas e/ou psicologicas. Após o primeiro ataque, a pessoa
torna-se apreensiva em relação a ataques futuros. Para Barlow , o medo primário
24
no TP é o medo das sensações físicas, particularmente as associadas à ativação
autonômica. Esta teoria também salienta a influência dos fatores sócio-culturais
para o surgimento da Agorafobia, onde o medo estaria associado aos estímulos
ambientais.
Alguns autores dedicaram-se ao estudo dos fatores psicodinâmicos
associados ao início do TP ou a uma maior vulnerabilidade psicológica ao
transtorno . Pacientes com TP freqüentemente se descrevem como crianças
medrosas, nervosas e tímidas, e também referem desconforto com os sentimentos
agressivos, sentimentos crônicos de baixa auto-estima, frustração e ressentimento
que precediam o início do TP.
A qualidade da relação parental é um fator de risco para o TP . Por
exemplo, os pacientes com TP freqüentemente descrevem seus pais como
pessoas brabas, críticas, amedrontadoras e controladoras . O estudo da relação
parental na psicopatologia evoluiu muito com o surgimento de instrumentos que
avaliam esse constructo de forma estruturada, como o Parental Bonding Inventory
(PBI) . O PBI é um instrumento auto-aplicável de 25 questões que avalia
separadamente os cuidados do pai e da mãe durante os primeiros 16 anos de vida
em duas dimensões: a superproteção e o afeto. Uma análise fatorial recentemente
sugeriu uma estrutura de três fatores para o PBI, com a dimensão adicional do
fator de autoritarismo . Alguns estudos demostraram uma boa correlação entre os
cuidados reais e a medida parental avaliada pelo instrumento . Além disso, uma
coorte de 20 anos demostrou uma boa estabilidade do instrumento em longo
prazo . O PBI está disponível na versão traduzida e adaptada para o português
25
brasileiro . Estudos que avaliaram pacientes com TP quanto ao vínculo parental
com o PBI demontraram uma associação desse transtorno com pais com altos
níveis de superproteção e baixos níveis de afeto .
Fatores ambientais
Estudos prévios têm associado experiências traumáticas na infância ao
desenvolvimento do TP na idade adulta. Eventos estressantes na vida adulta
também estão relacionados ao desenvolvimento de Transtornos de Ansiedade e
ao TP . Scocco et al. descreveram que cerca de 90% dos pacientes com TP
experienciaram transição de papéis e 40% tiveram perdas no ano que antecedeu
o início do TP.
No entanto a aferição do trauma, principalmente do trauma infantil, é
algumas vezes pouco confiável, possivelmente devido ao medo, culpa e vergonha
relacionado ao evento. Alguns autores sugerem que a medida de trauma torna-se
mais confiável quando realizada através de uma medida contínua e auto-aplicável
. Um instrumento usado para avaliar trauma na infância é o Childhood Trauma
Questionnaire (CTQ), que foi traduzido e adaptado para a versão brasileira . O
CTQ é um instrumento auto-aplicável composto por 28 questões tipo Likert que
avalia cinco subescalas: abuso emocional, físico e sexual, e negligência física e
emocional. Os ítens são pontuados de 1 a 5, e o resultado de cada subescala
varia de 5 a 25. O CTQ fornece também um escore total de maus-tratos obtido
através da soma de todas as subescalas, variando de 25 a 125 pontos, sendo que
os escores maiores indicam maiores maus-tratos. Estudos prévios indicam boa
26
estabilidade do CTQ avaliado em crianças vítimas de trauma após 6 meses de
tratamento. As subescalas do CTQ apresentam boa consistência interna e
validade convergente com avaliação clínica .
Delineamentos de estudos em Genética Psiquiátrica
Durante muitos anos, os estudos em genética se restringiam aos estudos
de famílias através de análise de ligação de marcadores moleculares utilizando
um grande número de indivíduos afetados e não afetados dentro de uma mesma
família. No entanto, essa abordagem não contribuiu muito para identificar genes
de doenças complexas, como a doença coronariana, asma, diabetes e doenças
psiquiátricas . Os estudos mudaram então o foco do mapeamento genético para
estudos de associação.
Os estudos de associação buscam identificar se um padrão de
polimorfismos varia sistematicamente em um determinado fenótipo . Existem dois
desenhos fundamentais nos estudos de associação: os realizados em famílias
(trios) e os realizados em indivíduos não-relacionados (caso-controle). Em termos
de poder estatístico, os estudos de trios e caso-controle pouco se diferem . Já em
termos de coleta de dados, os estudos de trios geralmente exigem mais esforços
em comparação aos de caso-controle, exceto em crianças, pois o acesso aos pais
é mais fácil . Por outro lado, o delineamento de trios é mais robusto que o de caso-
controle na medida que permite determinar se o alelo de risco é de origem
materna ou paterna ; além disso, o estudo de trios possibilita a construção de um
27
modelo e teste de múltiplas hipóteses e reduz as chances de associação por
estratificação étnica .
Os estudos de trios baseiam-se no teste de desequilíbrio de transmissão,
que compara o número de alelos transmitidos para os sujeitos afetados com o que
seria esperado pela transmissão Mendeliana. Um excesso de determinado alelo
na prole afetada indica que aquele fenótipo está em desequilíbrio de ligação com o
marcador . Já os estudos de caso-controle comparam se um determinado
polimorfismo é mais freqüente em um determinado grupo .
Classificação dos estudos de associação
Existem mais de 30.000 genes no genoma humano, e a probabilidade a
priori de que algum gene selecionado ao acaso possa influenciar um determinado
fenótipo é muito baixa . Dessa forma, ou a seleção de SNPs (Single Nucleotides
Polimorphisms) deve englobar um número muito grande de marcadores, ou os
SNPs devem ser selecionados baseado em algum referencial teórico. Os estudos
de associação são então classificados de acordo com método de busca dos SNPs
estudados da seguinte forma:
a) Gene candidato, no qual cerca de 5-50 polimorfismos, ao redor de um
determinado gene, são avaliados. O gene pode ser determinado pela sua posição,
por ter estudos de ligação prévios, ou mesmo por ser um candidato funcional, ou
seja, ter a sua função já demonstrada em outras espécies;
b) Mapa fino, que são estudos conduzidos numa região candidata de cerca
de 1-10Mb e pode envolver centenas de genes;
28
c) Genome-wide Association (GWA), que busca identificar variações ao
longo do genoma, com cerca de 300.000 SNPs.
As vantagens dos estudos de gene candidato é que o custo é infinitamente
menor; no entanto, a escolha do gene deve ser feita de forma bastante criteriosa.
Já os estudos que envolvem múltiplos SNPs, como o GWA, apresentam um risco
elevado de encontrar associações espúrias devido às múltiplas associações,
portanto o valor p deve ser adequadamente corrigido .
Seleção de SNPs
Nos estudos de gene candidato, o processo de seleção dos SNPs no gene
deve ser feito de forma que os SNPs que retém maior variação genética sejam
escolhidos, e a esse processo se denomina Single Nucleotide Polymorphism
(SNP) Tagging. Dessa forma, dentre dois SNPs disponíveis que estão em forte
desequilíbrio de ligação (DL), será escolhido apenas um, preferencialmente aquele
com maior freqüência alélica . Existem programas que desempenham essa
função, como por exemplo, o Tagger program
(http://www.broad.mit.edu/mpg/tagger/).
Peculiaridades da análise estatística
Um dos problemas da análise estatística de estudos na área da genética é
que o grande número de polimorfismos possibilita encontrar associações
estatisticamente significativas ao acaso. Para evitar isso, algumas abordagens são
feitas no tratamento estatístico.
29
A primeira etapa é avaliar a qualidade do material genotipado. Indivíduos
que não foram genotipados na maioria dos polimorfismos devem-se,
provavelmente, ao comprometimento da qualidade do ácido desoxirribonucléico
(DNA), devendo então ser excluídos. Da mesma forma, SNPs que não forem
genotipados na maioria dos indivíduos provavelmente também não são de boa
qualidade . Testar para o equilíbrio de Hardy-Weinberg (HWE) também pode ser
útil, uma vez que desvio de HWE freqüentemente se deve a consangüinidade,
estratificação populacional, seleção ou erro no experimento . Portanto, alguns
autores preconizam que HWE deva também ser usado como controle de
qualidade, e descartar aqueles SNPs que desviarem em controles, por exemplo,
com um nível de significância alfa de 10
-3
ou 10
-4
.
O objetivo final dos estudos de associação é encontrar associação de
determinado gene com o fenótipo avaliado. No entanto, analisar os SNPs
individualmente pode negligenciar a informação conjunta . Uma das formas de
abordar a associação conjunta do gene é analisar através do teste baseado no
grupo (set-based test). Dessa forma, além do teste de associação individual de
cada SNP com o fenótipo, obtém-se também um teste de associação para o efeito
aditivo dos SNPs. Outra estratégia para avaliar um conjunto de SNPs é a análise
de haplótipos, que busca a correlação de SNPs em regiões de pouca
recombinação . Os achados da análise de haplótipo são mais consistentes quando
são incluídos SNPs com forte DL entre eles. No entanto essa abordagem oferece
pouca ou nenhuma vantagem sobre a análise de grupo, particularmente quando
30
se utiliza a estratégia de busca de SNPs através do método Tagging, pois esse
método não inclui SNPs que estão em forte DL .
Esses recursos não evitam, todavia, o grande problema dos estudos
genéticos: múltiplos testes. O genoma é muito grande, então qualquer SNP (ou
grupo de SNP) tem uma baixa probabilidade de estar realmente associado ao
fenótipo estudado. Uma estratégia para evitar falso-positivos é adotar a correção
de Bonferroni, mas para SNPs com forte DL essa correção é bastante
conservadora. Outra estratégia é adotar o procedimento de permutação. Dessa
forma os dados do genótipo são mantidos preservando a estrutura de DL, mas os
fenótipos são randomizados n vezes entre os indivíduos para gerar dados que
satisfaçam a hipótese nula de ausência de associação com o fenótipo . Nenhuma
associação biológica deve ser encontrada nos dados permutados, pois o fenótipo
foi modificado. Compara-se então o melhor resultado permutado, que representa
um achado ao acaso, aos dados reais obtidos . Como a permutação preserva o
esquema de correlação entre os SNPs, torna-se um método de correção menos
restrito que a correção de Bonferroni, que assume que todos os testes são
independentes .
Meta-análise
Existem três problemas freqüentes no delineamento de estudos com grande
poder em genética. O primeiro deles é a freqüência do fenótipo estudado, que
torna compreensível a razão pela qual existem estudos de maior poder na
Depressão Maior que no Transtorno do Pânico. A segunda grande limitação é a
31
freqüência do polimorfismo estudado. Por exemplo, para identificar uma
associação com uma razão de chances (RC) de 1,2 de um SNP cuja freqüência
nos controles é de 5%, seriam necessários mais de 12 mil sujeitos . E a terceira
limitação são os custos da genotipagem de genes em tantos indivíduos . Dessa
forma, os estudos são geralmente pequenos, incluindo de 100 a 300 sujeitos . Os
estudos pequenos possuem um papel fundamental ao gerar hipóteses, mas
devem ser replicados em uma segunda amostra, preferencialmente maior .
De acordo com Hirschhorn et al. , de um total de 166 estudos de associação
de variações genéticas com doenças, apenas 6 replicaram achados prévios.
Sabe-se que a RC de associação de um polimorfismo com uma doença é
geralmente baixa. Dentre os transtornos psiquiátricos, apenas a Doença de
Alzheimer foi associada a um gene com RC maior que 2 , enquanto que as demais
associações geralmente se situam numa RC entre 1,1 à 1,5 . Assim, a estratégia
estatística final é compilar os resultados de vários pequenos estudos para
averiguar o real impacto de determinada variação genética em um fenótipo,
através do recurso da meta-análise.
Estratificação Étnica
Outro problema freqüente nos estudos de associação de caso-controle são
os potenciais confundidores, como por exemplo, estratificação étnica. Como a
freqüência de muitos SNPs difere de acordo com a origem étnica, é possível que
uma determinada associação se deva a uma diferença de representação étnica
dos grupos. Uma estratégia pode ser restringir as análises a um determinado
32
grupo étnico, tornando a população mais homogênea possível . A desvantagem
desse método é que ele pode ser influenciado pela a definição cultural de uma
determinada ancestralidade . Por exemplo, no Brasil a ancestralidade africana é
freqüentemente omitida e alguns autores preconizam que a descrição fenotípica
não prediz a ancestralidade do brasileiro . No entanto, no Rio Grande do Sul o
percentual de mistura africana em indivíduos classificados fenotipicamente como
caucasianos é de cerca de 6% , sugerindo que a avaliação fenotípica é um bom
parâmetro de ancestralidade para essa região.
Outro recurso é utilizar alguns marcadores para avaliar o impacto da
ancestralidade da população na amostra. Uma forma descrita para controlar essa
variável é o controle genômico , no qual se utiliza de variação de marcadores
genéticos da amostra para inferir a subestrutura da população e corrigir a amostra
para a estratificação. Também pode ser usado o método de associação
estruturada, que parte do princípio de que uma população heterogênea é
composta por subpopulações homogêneas, então se utiliza de múltiplos lócus
para inferir a estrutura da população de forma detalhada . Os testes de associação
levam então em conta a estrutura inferida da população
A busca de genes candidatos
O TP é considerado um transtorno psiquiátrico de herança complexa, pois
não foi identificado nenhum padrão de herança Mendeliana . Provavelmente vários
genes contribuam com um pequeno efeito para a suscetibilidade ao TP. Desta
33
forma, a busca de genes candidatos tem sido feita baseada no conhecimento de
moléculas envolvidas no tratamento farmacológico, nos agentes que induzem
ataques de pânico ou nos estudos de neuroimagens. Por exemplo, a resposta
clínica que os pacientes com TP apresentam quando tratados com Inibidores
Seletivos de Recaptação da Serotonina (ISRS) e a piora quando usam agentes
serotoninérgicos colabora para a hipótese de disfunção serotoninérgica no TP .
Outros autores buscam genes candidatos baseado em modelos animais e
alterações neuroendócrinas encontradas nesses pacientes.
Sistema serotoninérgico
A disfunção do sistema serotoninérgico tem sido implicada em diversas
condições, como nos Transtornos de Ansiedade, enxaqueca, epilepsia e
Transtornos de Humor . No TP, tem sido descrito que tanto o excesso, quanto a
falta desse neurotransmissor em algumas regiões cerebrais estão envolvidos na
sua etiopatogenia . Existem duas hipóteses opostas que tentam explicar a
disfunção serotoninérgica no TP: excesso ou superatividade de serotonina , e
déficit ou subatividade da serotonina , e ambas as interpretações encontram
respaldo ao serem confrontadas com a resposta farmacológica. A teoria do
excesso de serotonina sugere que os pacientes com TP apresentam liberação
exagerada de serotonina na fenda sináptica ou hipersensibilidade dos receptores
pós-sinápticos. A piora clínica que os pacientes com TP apresentam quando
iniciam tratamento com ISRS corrobora a teoria de excesso, indicando que a
hipersensibilidade dos receptores pós-sinápticos piora as crises. Por outro lado, a
34
teoria do déficit propõe que em determinadas regiões cerebrais, como na
substância cinzenta periarquedutal, a serotonina previne o pânico, e o déficit
desse neurotransmissor propicia o ataque de pânico. A administração do
precursor da serotonina (5-hidroxi-triptofano) diminui os ataques de pânico e após
um tempo os ISRS são efetivos em diminuir as crises de ansiedade. Não se
espera que toda a complexidade do TP seja explicada de forma simplista por uma
disfunção em um sistema monoaminérgico. Entretanto, os modelos biológicos de
interpretação partem de bases simples com o intuito de explicar uma parte do
transtorno que pode estar relacionada à neurotransmissão específica de uma
determinada monoamina.
Existem vários genes envolvidos no sistema serotoninérgico, e um candidato
freqüentemente estudados nos transtornos ansiosos e de humor é o gene
transportador da serotonina (5-HTT). O 5-HTT está localizado no cromossomo
17q11.1-q12 e codifica uma proteína de membrana integral que tem um papel na
recaptação deste neurotransmissor na fenda sináptica. Existem dois polimorfismos
neste gene que têm sido pesquisados: um VNTR que corresponde a um número
variável de repetições em tandem no intron 2 e o polimorfismo de tamanho de
repetição (RFLP – restriction fragment length polymorphism) que corresponde a
uma inserção/ deleção de 44 pares de bases na região promotora deste gene (5 -
HTTLPR), que origina 2 alelos (l- long e s-short). O alelo l, constituído de 528
pares de base, vem sendo relacionado a uma transcrição do gene transportador
da serotonina duas a três vezes mais eficiente quando comparado ao alelo s de
35
484 pares de base . Isso significa que o alelo s seria menos ativo, resultando
numa captação em níveis menores da serotonina na fenda sináptica.
Lesch et al. relataram que o polimorfismo 5-HTTLPR é responsável por 3-
4% da variabilidade de neuroticismo. Indivíduos com genótipos s/s ou s/l teriam
mais características associadas ao neuroticismo do que pessoas com o genótipo
l/l. Osher et al. conseguiram reproduzir os achados de Lesch et al., encontrando
relação entre o alelo curto do 5-HTTLPR e medidas de personalidade relacionadas
à ansiedade. Entretanto, estudos subseqüentes não replicaram esses achados . A
associação do 5-HTTLPR com neuroticismo torna esse gene um bom candidato a
ser avaliado no TP. No entanto, alguns estudos não encontraram qualquer relação
entre esse gene e o TP , enquanto outro grupo encontrou associação com o alelo l
. Já os demais polimorfismos existentes nesse gene não foram associados ao TP
(tabela 1).
Alguns estudos pré-clínicos e clínicos apontam para a participação do
receptor de serotonina 1A (HTR1A) como envolvido no TP. Ratos modificados
para esse gene apresentam diversos comportamentos relacionados à ansiedade
em testes de conflito . O receptor HTR1A é expresso em duas populações de
neurônios: como auto-receptor pré-sináptico nos núcleos da Rafe e como
heteroreceptor pós-sináptico no córtex frontal, predominantemente no hipocampo,
septum e córtex . A ativação do receptor pré-sináptico do receptor HTR1A por um
agonista seletivo resulta numa supressão da síntese, turn-over e liberação de
serotonina nas áreas projetivas , resultando num efeito ansiolítico. Por outro lado,
a ativação dos receptores pós-sinápticos resulta num efeito ansiogênico . Nos
36
pacientes com TP existe uma redução da responsividade do receptor HTR1A ,
sugerindo que uma variação alélica no gene desse receptor possa predispor o
desenvolvimento desse transtorno . Recentemente foi descrito que um
polimorfismo (C1019G) no promotor do HTR1A possa contribuir para a
patogênese de Agorafobia no TP . O alelo G libera a repressão da expressão dos
auto-receptores HTR1A ao alterar o sítio de ligação de um fator inibitório da
transcrição, resultando então na redução da neurotransmissão serotonérgica . Um
estudo de neuroimagem descreveu uma associação entre o alelo G e a
diminuição da ativação do córtex cerebral quando expostos a estímulo
ansiogênico em pacientes com TP. O alelo G também foi associado à ansiedade e
temperamento de evitação de dano em voluntários saudáveis e ao TP com
Agorafobia . No entanto esse achado não foi replicado num estudo de duas
amostras independentes que avaliou o neuroticismo, um fenótipo intermediário da
ansiedade .
Drogas com ação no receptor de serotonina 2A (HTR2A) apresentam ação
ansiolítica . O gene do HTR2A consiste de dois introns e três éxons e está
localizado no cromossomo 13q14-q21. Alguns polimorfismos foram descritos
nesse gene , sendo que o polimorfismo T102C tem sido bastante estudado. O
alelo C expressa uma proteína do HTR2A menos ativo que alelo T, indicando um
papel funcional para esse polimorfismo . Alguns estudos demonstraram
associação entre variações no gene do HTR2A com comportamento suicida no
transtorno depressivo . No TP foi descrita associação de um polimorfismo (T102C)
em duas amostras independentes . No entanto esse achado não foi replicado em
37
duas outras amostras . Unschuld et al. recentemente descreveram associação do
HTR2A com temperamento dependente de gratificação em pacientes com TP.
A serotonina é metabolizada pele enzima monoamino oxidadese A (MAOA),
que é codificada pelo gene localizado no cromossomo X (Xp11.23-11.4) . Foi
descrito um polimorfismo na região promotora do gene que influencia a atividade
da enzima: os alelos longos possuem maior atividade enzimática em comparação
com os alelos curtos . Três estudos encontraram associação do alelo longo com
TP em mulheres, enquanto que um estudo não replicou esse achado .
A triptofano hidroxilase 1 (TPH1) é uma enzima que modula a síntese de
serotonina. Três polimorfismos não funcionais foram avaliados no TP, mas
nenhum dos quatro estudos encontrou associação com o TP. Recentemente
descobriu-se que a isoforma triptofano hidroxilase 2 (TPH2) é preferencialmente
expressa no tecido neuronal e é então responsável pela modulação da síntese da
serotonina no cérebro. Dois estudos avaliaram o TPH2 no TP e não encontraram
qualquer associação .
Os polimorfismos estudados nos demais receptores da serotonina não
mostraram resultados consistentes e replicáveis. A tabela 1 descreve os principais
achados encontrados nos genes da serotonina e o TP.
Tabela 1. Estudos que avaliaram genes da serotonina no Transtorno do Pânico
Gene
Candidato
Polimorfismo Referência Amostra Resultado principal
38
5-HTT 5-HTTLPR Hamilton et al. 1999
Deckert et al. 1997
Ishiguro et al. 1997
Maron et al. 2005
Matsushita et al. 1997
Kim et al.
45 famílias, 74
trios
158 pacientes
169 controles
66 pacientes
150 controles
158 pacientes
215 controles
86 pacientes
213 controles
244 pacientes
227 controles
Sem associação
Sem associação
Sem associação
Associação com alelo l
Sem associação
Sem associação
VNTR Maron et al. 2004 158 pacientes
215 controles
Sem associação
18784A-C
10647G-A
167G-C
Maron et al. 2004b 127 pacientes
146 controles
Sem associação
MAO-A VNTR Deckert et al. 1999
Hamilton et al. 2000
Maron et al. 2005
Samochowiec et al. 2004
209 pacientes
190 controles
70 famílias, 81
trios
158 pacientes
215 controles
101 pacientes
202 controles
Associação com o alelo
longo em mulheres
com TP
Sem associação
Associação alelo longo
em mulheres com TP e
Ago
Associação alelo longo
em mulheres com Ago
Fnu4HI Tadic et al. 2003 38 pacientes
276 controles
Sem associação
TPH 1 1095T-C Han et al. 1999 45 pacientes
142 controles
Sem associação
218A-C Fehr et al. 2001
Maron et al. 2004
Kim et al. 2006
35 pacientes
87 controles
158 pacientes
215 controles
244 pacientes
227 controles
Sem associação
Sem associação
Sem associação
779A-C Maron et al. 2004b 127 pacientes
146 controles
Sem associação
TPH2 19776C-T
79727C-T
844G-T
4002C-T
Maron et al.(2007)
Mössner et at.(2006)
213 pacientes
303 controles
134 pacientes
134 controles
Sem associação
Sem associação
39
HTR1A -1019C-G Rothe et al. 2004a
Maron et al. 2004b
Huang et al. 2004
133 pacientes
134 controles
127 pacientes
146 controles
87 pacientes
107 controles
Associação do
genótipo GG e alelo G
em mulheres com Ago
Associação do alelo C
em TP com TH
Associação do
genótipo GG e alelo G
no ataque de pânico
294G-A Inada et al. 2003 63 pacientes
100 controles
Sem associação
-480A-del Maron et al. 2004b 127 pacientes
146 controles
Sem associação
HTR1B 861G-C Fehr et al. 2000a
Maron et al. 2004
32 pacientes
74 controles
158 pacientes
215 controles
Sem associação
Sem associação
-1089T-C,
-700C-A, -511G-
T, -161A-T, 129
C-T, 276G-A,
371T-G, 705C-
T, 1180G-A
Maron et al. 2004b 127 pacientes
146 controles
Sem associação
HTR2A 102T-C Fehr et al. 2001
Inada et al. 2003
Rothe et al. 2004b
Maron et al. 2004b
35 pacientes
87 controles
63 pacientes
100 controles
94/86
pacientes
94/86
controles
127 pacientes
146 controles
Sem associação
Associação do alelo C
no TP com Ago
Sem associação
Associação do alelo C
no TP puro
-143A-G, 73C-A,
1354 C-T
Maron et al. 2004b 127 pacientes
146 controles
Sem associação
40
HTR2C Cys23Ser Fehr et al. 2000b
Inada et al. 2003
Maron et al. 2004b
35 pacientes
89 controles
63 pacientes
100 controles
127 pacientes
146 controles
Sem associação
Sem associação
Associação com TP
com ou sem
comorbidades
(12-18)G-T
(4-5)T-G
Deckert et al. 2000 87/124
pacientes
131/95
controles
Sem associação
2831T-G Maron et al. 2004b 127 pacientes
146 controles
Sem associação
HTR3A 1302T-C
1596G-A
Maron et al. 2004b 127 pacientes
146 controles
Sem associação
Abreviações. TP, Transtorno do Pânico; Ago, Agorafobia; TH, Transtorbo de Humor. 5-HTT, gene
transportador da serotonina. 5-HTTLPR, polimorfismo no promotor do gene transportador da serotonina;
MAO-A, enzima monoamino-oxidase A; TPH 1, triptofano hidroxilase 1; HTR1A, receptor da serotonina
1A; HTR1B, receptor da serotonina 1B; HTR2A, receptor da serotonina 2A; HTR2C, receptor da
serotonina 2C; HTR3A, receptor da serotonina 3A; VNTR, número variável de repetições em tandem.
Nota. Adaptado e atualizado de Maron et al. .
Sistema Noradrenérgico
Algumas evidências apontam para o papel da norepinefrina na patogênese
do TP: elevação do seu principal metabólito em urina de pacientes , uso de
agentes com ação noradrenérgica no tratamento farmacológico desse transtorno ,
e indução de ataques de pânico com o aumento da liberação da noradrenalina .
Além disso, o locus coeruleus, que contém a maior concentração de células
noradrenérgicas no cérebro, é conhecido por estar envolvido no medo e na
ansiedade .
Alguns autores mostraram dados consistentes relacionando o polimorfismo
Val158Met do gene Catechol O-Methyltransferase (COMT) com o TP . COMT é
uma enzima que inativa as catecolaminas, incluindo a noradrenalina, adrenalina e
41
dopamina. O gene que codifica a COMT está localizado no cromossomo 22q11.2.
Uma substituição de um único nucleotídeo (guanina por adenosina), na primeira
posição do códon 158 desse gene leva a uma mudança funcional do aminoácido
valina por metionina (rs4680). Essa transição de valina por metionina está
associada a um aumento de três a quatro vezes na termolabilidade. O alelo com
valina (Val) apresenta uma maior atividade da enzima COMT que o alelo com
metionina (Met) . O alelo Met foi associado ao Transtorno Obsessivo-Compulsivo ,
apesar de não ter sido replicado em outro estudo .
Alguns estudos demonstram uma relação entre o alelo de alta atividade (Val)
com o TP em caucasianos , no entanto em coreanos essa relação foi inversa .
Recentemente uma meta-análise avaliou seis estudos de associação e não
encontrou qualquer associação entre o polimorfismo Val158Met com o TP . No
entanto, foi identificada uma grande heterogeneidade nos estudos incluídos na
meta-análise. Nas análises estratificadas, identificou-se uma associação do alelo
valina em amostras caucasianas, enquanto que foi descrita uma associação com o
alelo metionina nas amostras asiáticas.
Hormônio liberador de Corticotrofina (CRH)
O CRH é um peptídeo que regula a função da hipófise e adrenal no eixo
hipotálamo-hipófise-adrenal (HPA) e é também um hormônio extra-hipotalâmico
relacionado a vários comportamentos, incluindo expressões de medo . Os corpos
celulares dos neurônios que contém CRH são largamente distribuídos no cérebro
e, além dos neurônios encontrados no núcleo para-ventricular do hipotálamo,
42
encontram-se no núcleo da estria terminal e núcleo central da amígdala. Com
base em uma série de dados proveniente de estudos com animais, sabe-se que a
administração central de CRH produz uma série de condutas análogas àquelas
vistas em Transtornos de Ansiedade e transtornos afetivos, incluindo: anorexia,
insônia, diminuição da libido, aumento da atividade locomotora, aumento da
freqüência cardíaca e pressão arterial, distúrbios gastrointestinais, aumento da
conduta de autolimpeza, redução da atividade exploratória e aumento da resposta
de sobressalto . Camundongos transgênicos com alterações no gene do CRH
mostraram excesso de produção do hormônio de liberação da corticotrofina. Esses
camundongos exibiam também anormalidades endócrinas, incluindo elevação do
hormônio adrenocorticotrófico e corticosterona, reforço da responsividade ao novo
e uma resposta semelhante à que é vista no labirinto em cruz elevado. Essas
manipulações genéticas reforçam a hipótese de que o CRH desempenha um
importante papel nas respostas comportamentais a estressores e na
psicopatologia humana . Há evidências de que o sistema de CRH do Sistema
Nervoso Central (SNC) comumente medeia a associação entre estresse precoce
na vida e o desenvolvimento de Transtornos de Humor e Ansiedade na vida adulta
. Um estudo recente demonstrou que variações no gene do CRH estão
associadas ao comportamento inibido em crianças, um temperamento que está
relacionado ao desenvolvimento de Transtorno de Ansiedade na vida adulta.
O receptor 1 do CRH (CRHR1) está envolvido na ação ansiogênica do CRH .
Modelos animais mostraram que ratos deficientes de CRHR1 apresentam menos
comportamento ansioso em comparação com ratos selvagens . Alguns estudos
43
demonstraram que antidepressivos de diferentes classes suprimem a expressão
do gene CRH em roedores , e que a atividade do eixo HPA está deprimida em
humanos saudáveis . Além disso, foi descrito que os ISRS exercem parte do seu
efeito através da redução da atividade dos neurônios do CRH . Liu et al.
recentemente encontraram um efeito moderado de polimorfismos do CRHR1 e
resposta em curto prazo à fluoxetina para Depressão Maior.
Neurotrofinas e mensageiros intermediários
O Fator neurotrófico neuronal (BDNF) é a mais abundante neurotrofina
cerebral e é uma molécula candidata a estar envolvida na fisiopatologia dos
Transtornos de Humor . O BDNF participa da plasticidade cerebral envolvendo
mecanismos como aprendizado e memória . O nível sérico do BDNF foi
relacionado à resposta à Terapia Cognitiva Comportamental de pacientes com TP
.
Um polimorfismo funcional Val66Met do gene BDNF foi relacionada à
atividade da secreção dessa neurotrofina . O modelo animal recentemente
mostrou que ratos Met/Met apresentam mais comportamento de ansiedade,
acompanhado de uma redução de secreção de BDNF atividade-dependente, mas
não no nível total . O comportamento ansioso dos ratos não foi modificado pelo
uso da fluoxetina, sugerindo a importância dessa neurotrofina como mediador do
efeito ansiolítico dos antidepressivos. Considerando o papel do BDNF na
sobrevivência, diferenciação e plasticidade neuronal, o polimorfismo Val66Met
passou a ser um grande candidato a ser avaliado nos transtornos psiquiátricos .
44
Entretanto a associação desse polimorfismo com ansiedade é bastante errática.
Por um lado, Lang et al. encontraram associação entre o genótipo Val/Val e
traços de ansiedade, enquanto o alelo Met estava associado a níveis mais
elevados de temperamento ansioso em outro estudo . No TP esse polimorfismo
somente foi avaliado em amostras orientais, e não houve associação entre esse
SNP e TP em japoneses e chineses .
Modelos animais demonstraram que a ansiedade está relacionada ao AMPc
responsive-element binding protein (CREB) . O CREB é expresso em todas as
células cerebrais e é uma proteína que age como fator de transcrição . Wallace et
al. demonstraram em um modelo animal que a expressão do CREB na amígdala
basolateral influencia os comportamentos de depressão, medo e ansiedade. O
aumento da expressão de CREB na amígdala de ratos tem um efeito semelhante
ao que é visto no treinamento massivo em campo aberto no desenvolvimento do
medo condicionado . Em humanos, o CREB está associado ao Transtorno de
Humor , suicídio , agressividade e resposta ao antidepressivo . O CREB também
está envolvido no circuito de recompensa e regula então a sensibilidade individual
ao estímulo emocional, contribuindo então para neuroadaptação ao estímulo .
Alguns estudos associaram também o CREB à memória em diversos organismos .
O propranolol, que é um tratamento experimental para o Transtorno do Estresse
Pós-Traumático, modifica a consolidação da memória ao atuar como antagonista
beta-adrenérgico, que inibe a fosforilação do AMPc . O TP está intimamente ligado
à interpretação catastrófica dos sintomas corporais e à memória dos ataques de
pânico, sendo essa a base da terapia cognitivo-comportamental .
45
O RGS2 (regulator of G-protein signaling 2) é uma proteína que reduz a
atividade da proteína G . Os neurotransmissores envolvidos na biologia da
ansiedade, como a serotonina e a noradrenalina, agem através da proteína G
acoplada ao receptor de signalina . Ratos RGS2 knockout mostraram-se mais
ansiosos que os ratos selvagens , e um estudo recente mostrou associação entre
4 SNPs do RGS2 com TP.
Fenótipos intermediários
Os estudos de genética em Transtornos de Ansiedade são bastante erráticos
, provavelmente devido à grande dificuldade em definir qual a real parte que é
herdável desse fenótipo. Alguns autores descreveram que o aspecto genético dos
Transtornos de Ansiedade se torna mais aparente quando a definição do estado
“afetado” é expandido, e inclui variações sub-sindrômicas . Sabe-se que os
Transtornos de Ansiedade são influenciados por fatores genéticos quando
considerados como um conjunto; no entanto, os estudos de gêmeos
demonstraram pouca concordância para um mesmo Transtorno de Ansiedade .
Além disso, existe uma grande sobreposição de Ansiedade e Depressão. Estudos
em família demonstraram uma maior suscetibilidade para o desenvolvimento de
Depressão em familiares de pacientes com TP . Parece que a nosologia genética
não segue os parâmetros diagnósticos propostos pelo DSM-IV .
Dentro desse contexto surge o conceito de fenótipos intermediários.
Propõem-se então que os fatores genéticos, modulados por experiências
46
ambientais, influenciam a expressão de “fenótipos mínimos” e o agrupamento
desses determina os “fenótipos intermediários”, como o comportamento inibido,
um temperamento que pode estar associado aos Transtornos de Ansiedade ou
Depressivos. Os fenótipos intermediários, por sua vez, caracterizam as síndromes
clínicas, como por exemplo, a síndrome ansiosa ou a síndrome depressiva,
configurando o temperamento ou o funcionamento pré-mórbido. As síndromes
passam então a ser consideradas transtornos quando levam a um prejuízo
funcional do indivíduo. O prejuízo funcional pode ocorrer devido ao tempo de
sofrimento, à desadaptação funcional, ao prejuízo na qualidade de vida ou mesmo
ao aumento dos custos sociais ou da morbi-mortalidade (Figura 1). Dentro desse
paradigma é possível compreender a grande sobreposição da comorbidade
Ansiedade e Depressão, uma vez que essas compartilham de endofenótipos
comuns.
47
Figura 1. Modelo dimensional da nosologia genética. Autor Salum Ga, 2008.
Alguns autores sugerem que existe um pequeno número de dimensões nas
quais os indivíduos diferem, e a psicopatologia representa então extremos de
dimensões que compõe a personalidade normal . Muitas dessas dimensões ou
DNA
RNA
m
TRADUÇÃO
Proteína
MODIFICAÇÕES PÓS-
TRANSCRICIONAIS
TRANCRIÇÃO
Ambiente
Relação
parental
Traumas
NEURO
TRANSMISSÃO
Memória
Aprendizado
RECEPTORES
NEUROTRANSMISSORES
Inato Adquirido
Mínima unidade
fenotípica
interpretável
F
F
F
F
F
F
F
F
F
Cultura
Sofrimento por tempo significativo
Desadaptação Funcional
Prejuízo na Qualidade de Vida
Aumento dos Custos Sociais
Aumento da Morbidade
Aumento da Mortalidade
Ansiedade Depressão
Co-morbidade
F
TRANSTORNOS
Endofenótipos
Temperamento
Funcionamento
Pré-mórbido
Síndromes
MODULAÇÃO
ALTERAÇÃO SINÁPTICA
48
temperamentos que contribuem para diferenças individuais na personalidade
estão diretamente relacionadas com a ansiedade .
O temperamento dos indivíduos é um fenótipo intermediário bastante
relacionado a variações herdáveis. Cloninger definiu três traços de personalidade
que ocorrem em resposta a estímulos específicos: os “procuradores por
novidade”, que é um padrão de atividade exploratória freqüente de intensa
excitação frente um novo estímulo; os “evitadores de dano”, que é uma tendência
herdada a responder de forma extremamente intensa a um estímulo aversivo,
aprendendo a evitar novidades; e os “dependentes de gratificação” que é uma
tendência a responder de forma intensa a reforços positivos. A integração dessas
dimensões neurobiológicas forma padrões de respostas diferentes a punição,
recompensa e novidades, e favorece a capacidade discriminatória de situações
seguras e perigosas. Existem evidências que a variação em cada dimensão está
fortemente associada com alterações específicas nas vias monoaminérgicas; por
exemplo, os “evitadores de dano” estão relacionados com alta atividade
serotoninérgica. Nos indivíduos com alta evitação de dano, a ansiedade crônica
caracteriza-se por preocupações antecipatórias freqüentes , um padrão
clinicamente semelhante ao encontrado em pacientes com Transtorno do Pânico.
Os pacientes com TP são descritos como possuírem predominantemente um
temperamento de evitadores de dano .
O comportamento inibido (CI) também é um fenótipo intermediário de
ansiedade que vem sendo estudado em estudos genéticos . CI na infância é
caracterizado pela presença de irritabilidade em bebês, timidez e medos
49
excessivos na criança pré-escolar e, na criança em idade escolar, introversão,
dificuldade e constrangimento ao enfrentar novas situações . O comportamento
inibido apresenta tanto componentes comportamentais, tais como o retraimento
social e timidez, quanto componentes fisiológicos, como aumento dos níveis de
cortisol salivar, dos níveis de catecolaminas urinárias, da freqüência cardíaca e
dilatação pupilar . Comportamento inibido é mais freqüente em crianças cujos pais
têm Agorafobia e Transtorno do Pânico , e Transtornos de Ansiedade são mais
freqüentes nas famílias de crianças com comportamento inibido . Crianças
identificadas como tendo comportamento inibido têm taxas mais altas de
Transtornos de Ansiedade na infância .
A percepção das emoções é outro fenótipo avaliado no TP em estudos de
neuroimagem . Kessler et al. descreveram que o reconhecimento das emoções
tende a ser pior nos pacientes com TP, que interpretam outras emoções como
raiva. Esse estudo levanta a hipótese de que os pacientes com TP tendem a
interpretar os estímulos sociais como sendo perigosos. A percepção do medo tem
sido estudada em diferentes transtornos , no qual a amígdala parece
desempenhar um papel crucial . Weiss et al. realizaram um mapeamento do
reconhecimento do medo em duas amostras independentes de pacientes com
Síndrome de Turner e encontraram associação com o EF-hand domain containing
2 (EFHC2), um gene localizado no cromossomo X.
50
Interação gene-ambiente
As associações entre marcadores genéticos com transtornos psiquiátricos
vêm sendo um tanto erráticas , provavelmente devido à desconsideração dos
fatores ambientais que interagem com fatores genéticos. Os transtornos
psiquiátricos, de uma forma geral, desenvolvem-se devido à interação entre uma
predisposição familiar e estressores biopsicossociais. Esse modelo é contemplado
pela teoria de diátese-estresse que prediz o desenvolvimento de Depressão , no
qual a sensibilidade a um evento estressor depende da sua genética. Mann et al.
sugerem a construção de um modelo que pode ser visto como um modelo gatilho-
limiar para explicar essa suscetibilidade e compreender esse fenômeno. A diátese
(vulnerabilidade) determina como um indivíduo reage a um evento estressor e
depende de fatores que moldam a sua personalidade como os fatores genéticos e
ambientais, experiências infantis entre outros. Baseado neste modelo, os fatores
de risco podem ser categorizados como pertencentes a um desses dois domínios
(gatilho ou limiar pessoal).
Essa tem sido a base dos estudos de interação gene-ambiente. Caspi et al.
ao seguir uma amostra por mais de duas décadas encontraram que a presença do
alelo curto no 5-HTTLPR influenciava a probabilidade de desenvolver um quadro
Depressivo Maior frente a uma situação estressora . A associação gene-ambiente
do 5-HTTLPR para Depressão foi demonstrada em muitos estudos , mas não em
todos . Surtees et al. , no maior estudo disponível de interação gene-ambiente
para Depressão, não encontrou relação entre o genótipo e experiências na
infância ou na vida adulta com o risco de Depressão maior. Por outro lado, foi
51
identificada uma interação somente com os homens, mas na direção oposta
àquela descrita por Caspi et al. .
A interação gene-ambiente do 5-HTTLPR com maus tratos na infância não
foi estudada exclusivamente na Depressão Maior. Kaufman et al. descreveram
em um estudo de seguimento de crianças vítimas de maus-tratos e controles uma
interação gene-ambiente também com o alelo s e uso precoce de álcool.
Nenhum estudo testou a interação gene-ambiente no TP, apenas com
fenótipos intermediários da ansiedade. Stein et al. avaliaram a interação do 5-
HTTLPR com trauma na infância e encontraram que os sujeitos com o alelo s
estavam associados à maior sensibilidade à ansiedade quando expostos a maior
abuso emocional, o que não ocorreu com os sujeitos ll. No entanto, não houve
interação gene-ambiente com o fenótipo neuroticismo pelo inventário de
personalidade NEO.
Outro gene candidato para interação gene-ambiente é o HTR1A. Ratos
com deleção de HTR1A, particularmente no córtex pré-frontal, apresentam um
fenótipo de ansiedade somente quando essa inativação ocorre no período pós-
natal, uma vez que a inativação do HTR1A na vida adulta não afeta a ansiedade .
Recentemente foi demonstrado que a expressão do HTR1A é menor em animais
sensíveis ao estresse . No entanto, Mandelli et al. não encontrou qualquer
associação entre o HTR1A e eventos estressantes no início da Depressão Maior.
Os estudos de interação não se restringem ao efeito deletério do ambiente,
mas também avaliam o efeito protetor. Jokela et al. avaliaram um coorte
prospectiva de 21 anos e encontraram que os sujeitos portadores do alelo T do
52
polimorfismo T102C do HTR2A eram mais responsivos ao aspecto protetor do
cuidado materno para o desenvolvimento de depressão. Esse estudo mostra que
variações genéticas podem influenciar na forma como o indivíduo utiliza os
suportes ambientais.
Os estudos de interação devem ser vistos com cuidado, pois
freqüentemente os achados se restringem a subanálises, o que resulta de um
maior número de testes estatísticos e então uma maior probabilidade de recair no
erro tipo I . Por exemplo, Grabe e Eley encontraram associação gene-ambiente
com o 5-HTTLPR apenas nas mulheres, enquanto que Surtees et al. encontraram
uma relação em homens com direção inversa . Já Stein et al. descreveu uma
interação do gene transportador da serotonina com uma escala de trauma na
infância e sensibilidade à ansiedade, enquanto que não há referência às demais
escalas, que refletem fatores de risco mais bem estabelecidos para ansiedade
como o abuso sexual. Sjoberg et al. descreveram interação entre 5-HTTLPR e
adversidades com Depressão, mas a interação foi observada em direções opostas
em homens e mulheres.
Outra limitação desses estudos é que a baixa freqüência de eventos no
grupo de comparação diminui o poder do estudo que provavelmente detectará
somente interações de grande efeito. Os estudos de interação geralmente
apresentam um poder pequeno, e os achados iniciais freqüentemente estão
superestimados, necessitando ser replicado em amostras maiores. Curiosamente,
os estudos de tamanho amostral pequeno geralmente descrevem uma associação
positiva, enquanto que apenas estudos grandes mostram resultados negativos.
53
Possivelmente, existe um viés de publicação e a interpretação do resultado passa
a ser ainda mais problemática . Ainda, a presença de interação estatística
encontrada nos estudos não significa necessariamente uma interação biológica
plausível .
Moffitt et al. propuseram sete etapas para conduzir um bom estudo de
interação, sendo que primeiramente deve-se buscar os modelos quantitativos de
genética comportamental. Os coeficientes de herdabilidade não indicam apenas a
contribuição de genes, mas também o efeito desses na interação com o ambiente.
No caso do TP, a herdabilidade é estimada em 28%, sendo que os fatores
ambientais contribuem em 70% . A segunda etapa é identificar o evento ambiental
candidato, e ter sua medida otimizada. Posteriormente, devem-se identificar os
genes candidatos, e então testar a interação. No passo seguinte, deve-se testar se
a interação permanece ao substituir um gene por outro ou mesmo um evento
ambiental por outro, para avaliar a especificidade da interação. Porém essa
relação somente é firmada quando o achado é replicado e concluído por meta-
análise .
Interação gene-gene
Diante do possível papel de múltiplos genes no desenvolvimento de
patologias psiquiátricas, alguns autores passaram a investigar a interação gene-
gene. O sucesso dessas interações depende muito de um tamanho amostral
adequado .
54
Freitag et al. avaliaram diversas interações possíveis para o
desenvolvimento do TP e encontraram uma interação entre o HTR1A (-1019C/G)
e o COMT (Val/Met). Os autores propõem que o alelo G do HTR1A levaria a um
aumento da expressão dos auto-receptores no núcleo da rafe, levando então a
uma diminuição da transmissão serotoninérgica. Nas células pós-sinápticas, por
outro lado, o alelo G levaria à diminuição da expressão dos receptores HTR1A
pós-sinápticos. Essa proposta está de acordo com estudos de neuroimagem nos
quais se identificou diminuição de ligação nos receptores no giro do cíngulo e nos
núcleos da rafe . A liberação de norepinefrina no locus coeruleus é modulada em
ratos pela ação inibitória do HTR1A nos neurônios glutamatérgicos , sugerindo-se,
então, que a redução da transmissão serotoninérgica causada pelo alelo G
conseqüentemente levaria a um aumento da liberação de norepinefrina. Já o alelo
G do COMT leva a uma inativação monoaminérigica mais rápida, e a redução
local de norepinefrina nos hetero-receptores alfa 1 nos neurônios serotoninérgicos
da rafe leva à diminuição da liberação de serotonina . Dessa forma, a redução da
neurotransmissão serotoninérgica poderia ocorrer pela elevação da atividade da
COMT ou pelo aumento dos auto-receptores ou diminuição dos hetero-receptores
HTR1A, ou mesmo pela interação desses fatores. No entanto, os autores
encontraram uma razão de chances (RC) para esse achado de 1,08 em uma
amostra de 230 sujeitos. Gauderman sugere que quando a RC esperada em um
estudo de interação for de 1,5, necessitar-se-iam mais de 2000 sujeitos, ou seja,
resultados vindos de amostras pequenas podem estar recaindo no erro tipo I.
55
Farmacogenética
A resposta a psicofármacos também parece ser influenciada por variações
genéticas. Ela é resultado da interação de múltiplas variações genômicas com
influências ambientais e depende da estrutura ou expressão funcional de produtos
gênicos (receptores, transportadores, enzimas), os quais são alvos diretos das
drogas ou modificam indiretamente o desenvolvimento e a plasticidade de
conexões neurais envolvidas em efeitos farmacológicos. Como o mecanismo de
ação detalhado dos antidepressivos continua sendo enigmático, os estudos
recentes modificaram o foco que vinha sendo depositado nos neurotransmissores,
ou seja, sua liberação, recaptura e metabolismo para modulação da expressão
gênica, plasticidade sináptica e neurogênese .
Os estudos de farmacogenética envolvendo antidepressivos geralmente se
concentram em pacientes com Depressão Maior. Serretti et al. trataram pacientes
com depressão unipolar e bipolar com fluvoxamina e encontraram uma pior
resposta ao fármaco para os pacientes bipolares com a variação G do
polimorfismo (-109C/G) no HTR1A. Lemonde et al. descreveram a resposta à
fluoxetina, à nefazodona e ao agonista do HTR1A fibanserina e também
encontraram uma pior resposta nos pacientes com o alelo G. Evidências indicam
uma associação entre o tempo de resposta e a resposta global dos ISRS e o 5-
HTTLPR em pacientes com Depressão .
Apenas um estudo examinou a influência de marcadores genéticos no TP.
Perna et al. testaram a hipótese de que a variação alélica do 5-HTTLPR poderia
estar relacionada com a eficácia da paroxetina no tratamento do TP. A presença
56
do alelo l em homozigose ou heterozigose foi associada com melhor resposta aos
ataques de pânico em mulheres .
Apesar dos avanços nas pesquisas de farmacogenética, nenhum estudo
avaliou a influência dos marcadores gênicos com a psicoterapia em nenhum
transtorno psiquiátrico.
57
Justificativa do Estudo
Estudos de caso e controle não têm encontrado qualquer associação entre
o polimorfismo do gene transportador da serotonina (5-HTTLPR) com o Transtorno
do Pânico (TP). No entanto, os estudos geralmente são realizados com amostras
que variam de 100 a 300 indivíduos, justificando o uso da meta-análise para
aumentar o poder do estudo.
Além disso, nenhum estudo avaliou o 5-HTTLPR na sua forma trialélica , e os
resultados de associação dos genes dos receptores de serotonina HTR1A e
HTR2A com o TP são bastante controversos. Não existe nenhum estudo
publicado em amostras brasileiras que avalie essas variações gênicas no TP.
Nenhum estudo avaliou também a interação dessas variações gênicas com
estressores associados ao TP.
O gene EFHC2 (EF-hand domain containing 2) esteve recentemente
relacionado à percepção do medo e ainda não foi avaliado no TP nem nos
fenótipos intermediários da ansiedade. Como medo é um sintoma central do TP, o
EFCH2 pode ser um gene candidato para o TP.
Por fim, apesar de alguns avanços na farmacogenética, nenhum estudo
avaliou a influência de marcadores gênicos à terapia cognitivo-comportamental.
Esses estudos possivelmente poderiam contribuir para elucidar o mecanismo
biológico envolvido no processo psicoterápico.
58
Hipóteses
Considerando que os estudos dos aspectos genéticos no TP ainda apresentam
resultados controversos, as hipóteses desse estudo são:
1. Uma vez que os estudos de associação com o 5-HTTLPR e o TP são
relativamente pequenos, nossa primeira hipótese é de que com o
recurso da meta-análise poderíamos encontrar uma associação. Devido
à associação do alelo s com traços de ansiedade em sujeitos saudáveis
, a hipótese é de que o alelo s também estaria associado ao TP.
2. Como estudos prévios associaram o TP com variações nos genes
HTR1A e HTR2A , nossa hipótese é de que replicaríamos esse achado
na amostra brasileira. Em relação aos estudos de interação gene-
ambiente, nossa hipótese é de que encontraríamos uma interação do 5-
HTTLPR com trauma na infância, e do HTR2A com vínculo parental no
TP.
3. Como o medo é um sintoma central do TP, nossa hipótese é de que o
gene EFHC2 estaria relacionado ao TP e aos seus 2 fenótipos
intermediários (comportamento inibido e temperamento de evitação de
danos).
4. Alguns estudos sugerem mecanismos semelhantes para a ação da
psicoterapia e de psicofármacos . Nossa hipótese é de que algum gene
previamente relacionado à ansiedade (BDNF, CREB, CRHR1,
RGS2, HTR1A, HTR2A) esteja associado à resposta à Terapia
Cognitivo-Comportamental.
59
60
Objetivos
Gerais:
• O objetivo desse estudo é pesquisar a influência do polimorfismo nos genes
dos receptores de serotonina HTR1A e HTR2A, 5-HTTLPR, CRHR1,
RGS2, BDNF, CREB e EFHC2 no TP. Como esse estudo envolve vários
genes, aumentando conseqüentemente a chance de erro tipo I, os genes
estudados com cada fenótipo foram estabelecidos a priori, resultando em
quatro objetivos específicos.
Específicos:
1. Revisão sistemática da literatura em busca da associação entre Transtorno
do Pânico e o gene transportador da serotonina.
2. Evidenciar associação entre o gene transportador da serotonina e os
receptores HTR1A e HTR2A com o diagnostico de TP na população
brasileira e a interação entre gene-ambiente com estressores e vínculo
parental na infância.
3. Evidenciar associação entre marcadores do EFHC2 com o TP e fenótipos
intermediários.
4. Evidenciar a influência dos marcadores gênicos do BDNF, CREB1,
CRHR1, RGS2, HTR1A, HTR2A e transportador da serotonina na resposta
à Terapia Cognitivo-Comportamental.
61
Considerações Éticas
Os sujeitos incluídos nos estudos assinaram o Termo de Consentimento
livre e esclarecido (TCLE) que está em anexo e um adendo explicando a parceria
internacional. O projeto está de acordo com a resolução CNS 347/05 e foi avaliado
pelo Comitê de Ética e Pesquisa da HCPA (04-272 e 05-056) e do Massachusetts
General Hospital (MGH 2007-P-000119). Os TCLE utilizados nos estudos estão no
anexo A.
62
Referências Bibliográficas
63
Artigos
Artigo 1 - Lack of association between the Serotonin Transporter Promoter
Polymorphism (5-HTTLPR) and Panic Disorder: a systematic review and
meta-analysis
Artigo 2 - Panic disorder and serotoninergic genes (5-HTTLPR, HTR1A and
HTR2A): association and interaction with childhood trauma and parental
bonding
Artigo 3 - Association between EFHC2 with Panic Disorder, Harm Avoidance
and Behavioral Inhibition
Artigo 4 - CREB1 as a predictor of long term response to cognitive-behavior
therapy for pharmacotherapy-resistant panic disorder patients
64
Artigo 1 – Lack of association between the Serotonin Transporter
Promoter Polymorphism (5-HTTLPR) and Panic Disorder: a
systematic review and meta-analysis
Carolina Blaya
1
, Giovanni A. Salum
1
, Maurício S. Lima
2
, Sandra Leistner-Segal
1
,
Gisele G. Manfro
1*
Publicado na Behavioral and Brain Functions
65
66
67
68
69
70
71
72
73
74
75
Artigo 2 – Panic disorder and serotoninergic genes (5-
HTTLPR, HTR1A and HTR2A): association and interaction with
childhood trauma and parental bonding
Carolina Blaya
1
, Giovanni Abrahão Salum
1
, Priya Moorjani
2
, Ana Carolina
Seganfredo
1
, Elizeth Heldt
1
, Sandra Leistner-Segal
1
, Jordan Smoller
2
, Gisele Gus
Manfro
1*
Preparado para enviar para submissão para Neuropsychopharmacology
76
Abstract
Background – Panic disorder (PD) has been related to both genetic and
environmental risk factors. However, no study has evaluated a gene-environment
interaction for this disorder. The aim of this study is to evaluate the association
between HTR1A, HTR2A and 5-HTTLPR in PD patients and controls. We also
evaluated the interaction between these genes and two environmental factors
previously associated with PD: childhood trauma and parental bonding.
Methods - This is a case-control candidate gene study (107 PD patients and 125
controls). Diagnoses were confirmed by M.I.N.I and clinical interview. Childhood
trauma was evaluated by the Childhood Trauma Questionnaire (CTQ) and Parental
Bonding Instrument (PBI) was used to evaluate parenting. Genes were screened
using a set-based test in PLINK followed by single marker association tests and
haplotype test for genes that reached experiment-wide significance. Logistic
regression was used to model the relationships between genotype in the dominant
model and trauma, optimal father parenting and optimal mother parenting,
independently in order to evaluate gene-environment interaction. We addressed
multiple comparisons at two levels of significance correction: gene-wide (p
1
) and
experiment-wide (p
2
).
Results – Only HTR1A was experiment-wide associated with PD in set-based test
(p
2
=0.027). Three SNPs of this gene were nominally significantly associated with
PD, but only one (rs6449693) remained significant after correction for multiple
testing. Additionally, one HTR1A haplotype was associated with PD (p=0.008), and
another haplotype was protective (p=0.004). In the interaction analysis with optimal
77
father parenting, both interaction terms of SNPs of HTR2A (rs6311 and rs6313)
were nominally associated with PD and rs6311 remained significant after
Bonferroni correction. Among subjects with TT/TC genotype in rs6311 the
protection effect of fathers with high care and low overprotection was higher than
the protection effect among subjects with CC genotype (β=0.134, t=-2.678,
p=0.007).
Conclusion – PD was associated with HTR1A, but not with 5-HTTLPR even
considering interaction with childhood trauma. We also reinforce evidence of gene-
environment interaction in HTR2A gene with parenting, maybe influencing the
capacity of subjects to use familiar experiences as environmental support.
78
Introduction
Twin studies have established that genes contribute to panic disorder (PD), ,
but efforts to identify the specific genes involved have had mixed results . Among
the most widely studied candidate genes have been those involved in serotonergic
neurotransmission , reflecting evidence of serotonergic dysfunction in PD and the
fact that medications modulating the serotonin system are first-line treatments .
The serotonin transporter (5-HTTLPR), serotonin receptor 1A (HTR1A) and
serotonin receptor 2A (HTR2A) polymorphisms have been associated with PD in
some studies but not in others . In addition, previous studies of the 5-HTTLPR
polymorphism have not examined a recently described functional SNP within the
insertion/deletion polymorphism .
On the other hand, environmental risk factors such as childhood
experiences have been systematically associated with psychopathology . For
instance, childhood sexual abuse elevates the risk for adult generalized anxiety
disorder and panic disorder, as well as other psychiatric and substance use
disorders . Some authors also suggest that relationship with the primary caregiver
is related to psychopathology . Studies have reported that PD is associated with
parental lower care and higher overprotection scores than healthy control .
Although childhood experiences seem to be strongly associated with PD,
not all people who had childhood trauma develop PD in adulthood. Diathesis-stress
theories of depression and anxiety suggest that individuals’ sensitivity to stressful
events depends on their genetic makeup . Besides this, heritability estimated for
anxiety symptoms were larger among individuals who had reported stressor life
79
events as compared to those without stressors, suggesting environmental
moderation of genetic effects . Association studies attempt to identify both
environmental and genetic risk factors as well as their interaction to test if a
specific genotype moderates the exposure to an environmental factor .
Serotoninergic genes have been implicated in a gene-environment interaction for
depression and for anxiety . However no study have accounted for gene-
environment interactions in PD.
The aim of this study is to evaluate the association between HTR1A,
HTR2A and 5-HTTLPR in PD patients and controls. In addition, we evaluated the
interaction between these genes and two environmental factors previously
associated with PD: childhood trauma and parental bonding.
Methods
This is a case-control candidate-gene study where PD patients were
recruited from the Anxiety Disorder Outpatient Clinic at the Hospital de Clínicas de
Porto Alegre. Controls were employees from HCPA that were recruited between
June 2006 and April 2007. The inclusion criteria were as follows: (1) PD with or
without agoraphobia for patients and absence of psychiatric disorder for controls;
(2) at least eighteen years old; (3) European-Brazilian ethnicity. Patients with
comorbidities common to PD were included in the study provided that the
symptoms were not clinically more relevant than the PD symptoms. Blood was
collected from participants for DNA extraction after written informed consent.
80
Institutional review board approval was obtained from the ethics committee of the
Hospital de Clínicas de Porto Alegre (Number 04-272).
Psychometric testing
Subjects were evaluated by a clinical interview and the Mini International
Neuropsychiatry Interview (MINI) - Brazilian version . A semi-structured interview
was used to assess sociodemographic data and clinical history.
Childhood trauma was evaluated by the Childhood Trauma Questionnaire
(CTQ) – Brazilian version , which evaluates five subscales: childhood emotional,
physical and sexual abuse and childhood physical and emotional neglect. CTQ is a
self-report questionnaire with 28 items with Likert-type questions (one to five
points). Each subscale score ranges from 5 to 25, with higher scores indicative of
greater maltreatment. A total score (ranging from 25 to 125) was calculated by
summing the values obtained on the five subscales. Previous studies indicates that
CTQ remained stable after 6-months of therapy for child abuse or neglect, and
subscales demonstrated good internal consistency and convergent validity with
trauma-specific measures of distress and therapist rating of abuse . Dill et al
showed that self-report instruments to evaluate childhood trauma are more likely to
elicit truthful responses than clinical interviews. Since all subscales were
associated with PD (Mann-Whitney U, p<0.01) and were intercorrelated (r>0.4),
CTQ was only assessed as the global index to avoid multiple comparison .
Parenting was assessed by the Parental Bonding Inventory (PBI) – Brazilian
Version . The original PBI was intended to measure the perceived parental rearing
styles of overprotection and warmth as remembered by the respondents during
81
their first 16 years of life. It consists of 25 items to be assessed separately for
mother and father. In a number of studies the PBI proved to be a reliable and valid
measure of actual and not merely perceived parenting . The long-term stability of
the PBI has been demonstrated by Wilhelm et al. in a 20-year cohort study.
Recently some studies have used confirmatory factor analyses to show the pre-
eminence of three-factor models of the PBI with the additional dimension of
authoritarianism . In a previous study we were able to confirm the three factor
structure in the Brazilian sample (unpublished data). Both low warmth and high
overprotection were associated with PD (Mann-Whitney U, p<0.01), but no
association was found with authoritarianism in neither father nor mother scales. In
order to avoid multiple comparisons, we generated a combined variable for father
and mother scales, respectively, creating an ideally parenting subtype named
“optimal father” and “optimal mother” characterized by high warmth and low
overprotection scores.
Genotyping
A total amount of 1μg of genomic DNA (diluted in 1X TE buffer at 50ng/μl)
from studied subjects was equally interleaved on 96-well master plates to ensure
technical uniformity during the laboratory process. DNA quality control metrics
were assessed prior to genotyping. Quantity of stranded DNA was assessed using
PicoGreen® (Molecular Probes, Oregon, USA).
Genotyping of HTR1A and HTR2A was performed with the methods
previously described with a few modifications . Primers were designed with
82
SpectroDESIGNER software (Sequenom, San Diego, California). Polymerase
chain reaction (PCR) was performed, followed by single base extension (SBE)
reaction. Samples were analyzed in automated mode by a MassARRAY RT mass
spectrometer (Sequenom) . The resulting spectra were analyzed by
SPECTROTYPER software (Sequenom) after baseline correction and peak
identification.
Genotyping was performed for HapMap single nucleotide polymorphisms
(SNPs) selected within each gene and 10kb flanking region. For 5-HTTLPR we
examined functional polymorphism including the embedded SNP (rs25531). The
Tagger program (http://www.broad.mit.edu/mpg/tagger/) was used to identify tag
SNPs with a minor allele frequency of greater than 5% and minimum r
2
of 0.8. A
total of 9 markers were thus selected for genotyping using mass spectrometry as
previously described .
Genotyping of the 5-HTTLPR was performed with the following protocol -
Genomic DNA (1.4 ng) was amplified in a 7 µl reaction using KlenTaq DNA
Polymerase (0.2 U), the proprietary KlenTaq Buffer (1X), dNTPs (200 µM each),
5% glycerol, Betaine (1 M) and the marker specific primers (0.2 µM). Amplification
was performed with thirteen cycles of denaturation for 30 seconds at 93ºC,
annealing for 30 seconds beginning at 61.5ºC and dropped 0.5º C every cycle and
primer extension at 72ºC for 30 second, followed by 37 cycles of denaturation for
30 seconds at 93ºC, annealing for 30 seconds at 55º C and primer extension at
72ºC for 30; 72ºC for 1 hour. The amplified product (1µl) was combined with size
standard (LIZ-250) before being analyzed on an ABI-3730. The long allele appears
83
as a product of about 412 while the short allele shows a band at about 370. The
genotype of the SNP embedded in the 5-HTTLPR (rs25531) was assayed by
digesting the PCR product with the restriction enzyme, MspI . This 10 µl reaction
contains 2 µl of the PCR product, 1 µl of 10X restriction buffer (New England
Biolabs), 1 µl of MspI enzyme and 6 µl of water. The reaction was incubated at
37ºC for 1 hour. The digested product (1µl) was then combined with size standard
(LIZ-250) before being analyzed on an ABI-3730. Post-digestion, the long allele
with the A SNP allele appears as a product of about 320, the G SNP allele is
indicated by the presence of a band at 148, while the short allele shows a band at
about 277. The final genotype was determined from the information from the
analysis of both the digested and undigested PCR product.
Markers were retained only if they met the following quality control criteria:
(1) >90% genotype call rate; (2) minor allele frequency (MAF) >5%; (3) Hardy
Weinberg equilibrium P > 0.001. Three duplicates were assessed in the
experiment with 100% concordance. After applying these quality control filters, 8
markers were retained for the association analysis. Four individuals with
genotyping call rates less than 90% were excluded resulting in 232 subjects
included in the analysis.
Statistical Analysis
PBI and CTQ Scales
Normal distribution and sphericity were assessed previously to any
statistical analysis with Kolmogorov-Smirnov test and Levene’s test. Since the
84
majority of CTQ and PBI scales are not normally distributed, the CTQ and PBI
scores were dichotomized using ROC curves to maximize the accuracy of the cut-
off to predict presence of PD in adulthood for risk factors, or predict absence of PD
in adulthood for protection factors. The Youden’s index J was used to define the
optimal cut-point for the continuous variables and Area Under the Curve (AUC)
was used to test significance. The best cut-points for CTQ Global Score was ≥41
(AUC=0.695; p<0.001). The best cut-points for PBI scales were: ≥6 for mother
overprotection (AUC=0.621; p=0.002) and ≥4 for father overprotection
(AUC=0.631; p=0.001) - defined in risk factors direction; and ≥16 for mother
warmth (AUC=0.615; p=0.003) and ≥13 for father warmth (AUC=0.600; p=0.001) -
defined in protection direction.
Genetic analysis plan
A. Association
For an initial analysis, we screened each gene using the set-based test in
PLINK (http://pngu.mgh.harvard.edu/purcell/plink/) followed by single marker
association for genes that reached experiment-wide significance. The set-based
test is based on calculating the average test statistic for the best three SNPs per
gene region, and evaluating the significance of these set-statistics by permutation
(10,000). Haplotype analysis was performed for genes that reached the
experiment-wide significance. The initial haplotype test is an omnibus test for any
joint effect of all haplotypes observed (minor allele frequencies [MAF] < .01).
Where the omnibus test was significant, we performed haplotype-specific tests of
each haplotype versus all others.
85
B. Interaction
Logistic regression techniques in Plink were used to model the relationships
between genotype in the dominant model and trauma, optimal father parenting and
optimal mother parenting, independently. Each model included: the SNP, one of
the three environmental factors and their interaction term (SNP*environment).
C. Level of significance and corrections for multiple testing
The overall level of significance adopted was α=0.05. Nominal p-values
(uncorrected) were named p
0
. We addressed multiple comparisons at two levels of
significance correction: gene-wide and experiment-wide. Gene-wide significant
accounts for the SNPs within the gene, (named p
1
) whereas experiment-wide
(named p
2
), the more restrict one, accounts for all the SNPs evaluated. For single
marker association, permutation was used to correct for multiple testing yielding
both gene-wise (p
1
) and experiment-wise (p
2
) p values. Haplotype analysis was
corrected for multiple testing using a Bonferroni correction for the number of
haplotypes. The interaction analysis was corrected with Bonferroni’s correction
accounting for the three environment covariates evaluated. Only the dominant
model was evaluated for the interaction analysis. All tests were two-tailed.
Results
The sample comprised 107 patients (76.6% woman, mean age 39.94, SD
10.17 years) and 125 controls (70.4% woman, mean age 36.93, SD 9.78 years).
The mean age of PD onset was 32 (SD=10.38) years, and mean of PD duration of
7.94 year (SD=8.45). PD comorbidities included agoraphobia (89.7%), major
86
depression (29%), generalized anxiety disorder (37.4%), social anxiety disorder
(17.8%), and dysthymia (15.9%).
Table 1 depicts the set-based test for PD and shows that only HTR1A
achieved experiment-wise significant association with PD. Table 2 shows single-
marker association and haplotype association with PD. Three SNPs included in the
analysis were nominally associated with PD, however only rs6449693 remained
significant at experiment-wide threshold. In the haplotype analysis, Hap2 was
significantly associated with PD (asymptotic p-value=0.008), whereas Hap4 was
significantly protective for PD (asymptotic p-value=0.004) and remained significant
after Bonferroni correction.
We could not find any significant interaction between all SNPs evaluated,
optimal mother parenting or trauma in childhood and PD in adulthood (data not
shown). However, optimal father parenting and rs6313 interaction term (β=0.176,
t= -2.403, p=0.016) and rs6311 (β=0.134, t=-2.678, p=0.007) was nominally
associated with PD, and both association remained significant after Bonferroni
correction. The genotypes in rs6311 and rs6313 moderate the effect of optimal
father parenting in childhood and PD in adulthood. Figure 1 illustrates this
association. Among subjects with TT/TC genotype in rs6311 the protection effect of
fathers with high warmth and low overprotection was higher than the protection
effect among subjects with CC genotype.
Discussion
87
As reported in previous studies , we observed significant association
between HTR1A and PD. Moreover we described specific haplotypes in HTR1A
related to this disorder. We also provide new data about gene-environment
interaction between childhood experiences, PD and HTR2A, a gene previously
associated with maternal nurturance and symptoms of major depression .
Preclinical and clinical studies have implicated HTR1A in the pathogenesis
of PD . Studies in HTR1A knockout mice demonstrated an increased anxiety-like
behavior in several tests . Besides this, PD has been associated with a reduction
on both pre-synaptic and post-synaptic HTR1A receptors as assessed by positron
emission tomography . However, association studies evaluating rs6295 and PD
have found controversial results. Rothe et al found an association with the G allele
for PD with agoraphobia and Huang et al found an association with panic attack,
while Maron et al. found an association between PD and the C allele. In our study,
rs6295, rs4521432 and rs6449693 were associated with PD, but only the last SNP
remained significant at experiment-wide levels. Additionally we could detect one
protective haplotype and another risk haplotype significantly associated with PD
even after correction.
Two independent studies have found association with HTR2A and PD ;
however this finding was not replicated in two additional studies . In our study, no
association was found between PD and HTR2A, but we found a gene-
environmental interaction with HTR2A and optimal father parenting in childhood
and PD in adulthood. This gene-environment interaction was also found with both
rs6311 and rs6313. Since rs6311 and rs6313 were in high linkage disequilibrium in
88
our sample, these two SNPs can bring redundant information to this interaction. A
recent study found that individuals carrying the TT/TC genotype of rs6313 HTR2A
were responsive to the protective aspects of nurturing mothering, so that in the
presence of high maternal nurturance they expressed low levels of depressive
symptoms . The authors hypothesize a path via the prefrontal cortex, since HTR2A
are involved in the functioning of the prefrontal cortex involved in cognitive control
and regulation of negative emotions . Anxiety and depression are frequently
comorbidities, and studies in families have shown a high susceptibility for
depression in families with PD , suggesting a common risk factors to these
disorders . In our study we were not able to find a significant association with
optimal mother parenting, although there was a trend in the interaction term in
rs6311 (p-nominal=0.081). Lack of statistical power could explain this result. In
spite of this, in the presence of father with high warmth and low overprotection,
individuals carrying the TT/TC genotype of rs6313 and rs6311 were more
responsive to optimal father parenting protection against PD.
The association between parenting and psychopathology seems to be
influenced by cultural aspects. For instance, a study that evaluated parental
bonding in six European countries found a different role to father/mother warmth
and protection. In France no aspects of parental bonding were associated with PD,
while in Belgium only father warmth and in Germany only mother overprotection
seems to be associated to PD . Maybe the HTR2A influences the ability of
individuals to use environmental support according to cultural aspects and could be
not linked to one parental figure itself.
89
Although 5-HTTLPR has been associated with anxiety traits in healthy
volunteers , no association was found with this polymorphism with PD in a recent
meta-analysis and our study corroborates this previous finding. This is the first
study that evaluated the triallelic form of 5-HTTLPR and PD and found no
association with this phenotype. Gene-environment interaction with 5-HTTLPR for
depression has been shown in many studies , but not in all of them . Besides,
some studies have contradictory results . In anxiety, Stein et al found an
interaction between emotional abuse and the short allele with anxiety sensitivity,
but not with neuroticism. In our study, we evaluate a combined trauma index
instead of the subscales to avoid multiple comparisons, and no gene-
environmental interaction was found with none of the SNPs evaluated in PD.
Our results should be interpreted in light of some limitations. Most
importantly, the small sample size means that our analyses may be subject to Type
II error. The possible confounding due to population stratification in Brazil was
addressed by restricting our analyses to Caucasian subjects , therefore these
findings are restricted to this population. The assessment of maltreatment
childhood and parental bonding was retrospective and at the same time as the
phenotypic evaluation. Although PBI has a long-term stability , biased recall could
not be ruled out . Genes selection was performed in a no-systematic search, and
some serotoninergic genes previously associated with PD were not evaluated .
The interaction with optimal father parenting should be interpreted carefully since
we corrected for multiple testing only considering the three phenotypes and not all
SNPs included. However as this finding is similar to what has been described for
90
depression and mother nurturance , the chance of spurious association by multiple
testing is reduced.
In sum, we were able to demonstrate an association between HTR1A and
PD, and a lack of association between 5-HTTLPR and PD even considering
childhood trauma or parental bonding. Besides, this study is the first analysis of
gene-environment interaction in PD. We observed that fathers with high warmth
and low overprotection interact with variants in HTR2A protecting for PD in
adulthood. Clearly, additional larger studies are needed to further define this
interaction effect.
91
References
92
Table 1 Set-based test for the association between Polymorphisms (PMs) and Panic
Disorder (PD n=107, Controls n=125)
Set
PMs in
the Set PMs T-value
Empirical
p-value 0
Empirical
p-value 1
Empirical
p-value 2
HTR1A P1 rs6449693 7.495 0.0159 0.0203 0.0555
P2 rs4521432 7.226 0.0103 0.0137 0.0383
P3 rs6295 7.059 0.0089 0.0111 0.0303
HTR2A P1 rs6311 0.335 0.6337 0.6493 0.9673
P2 rs6313 0.238 0.6415 0.6493 0.9677
5-HTTLPR P1 Biallelic 0.318 0.5975 0.5975 0.9597
SLC6A4 P1 Triallelic 0.225 0.6469 0.6469 0.9717
A multi-marker set-based test implemented in PLINK was used for the analysis of all
genes. Sets that have an experiment-wide association p-value (p<0.05) are shown in
bold. In each set, P1 is the best PMs associated with the outcome; P2 is the second
one and P3 is the third one. Maximum computed permutations were 10000.
Empirical p-value p 0: p-value for average chi-square without correction;
Empirical p-value p 1: p-value corrected for all tests within this set/ gene
Empirical p-value p 2: p-value corrected for all tests in all sets
Abbreviations: PMs, Polymorphisms; CGI, Clinical Global Impression; HTR2A,
Serotonin receptor 2A; HTR1A, Serotonin receptor 1A; 5-HTTLPR, Serotonin
transporter gene.
93
Table 2 HTR1A single-marker association and haplotype association with Panic Disorder (107 cases and 125 controls)
rs4521432 rs6449693 rs6295 rs13361335
Frequency
in PD
Frequency in
Controls
χ² (df=1)
Asymptotic
p-value
Corrected
p-value
Hap1 C A C G 0.12 0.11 0.11 0.736 >0.999
Hap2 T G G T 0.55 0.42 6.97 0.008 0.032
Hap3 C A G T 0.01 0.02 0.03 0.871 >0.99
Hap4 C A C T 0.32 0.45 8.29 0.004 0.016
Ominbus .032
Role
Downstream Downstream Promoter Promoter
HWE 0.695 0.794 0.794 >0.999
Allele change C/T A/G C/G G/T
Minor allele T G G G
Frequency in PD 0.55 0.55 0.56 0.12
Frequency in
Controls
0.42 0.42 0.44 0.11
χ² (df=1) 6.96 7.49 6.72 0.09
Asymptotic p-value 0.008 0.006 0.009 0.764
Empirical p-value 1 0.024 0.015 0.026 0.969
Empirical p-value 2 0.053 0.041 0.066 0.999
OR 1.64 1.67 1.62 1.09
Abbreviations: PD, Panic Disorder; HTR1A, Serotonin Receptor 1A; SNP, Single Nucleotide Polymorphism; HWE, Hardy Weinberg Equilibrium p value; OR,
Odds Ratio; χ² chi-square; df, degrees of freedom. Bold means p<0.05.
Asymptotic p-value: p-value for chi-square without correction;
Empirical p-value P 1: p-value corrected for all tests within this set/ gene
Empirical p-value P 2: p-value corrected for all tests in all sets
94
95
Artigo 3 – Association between EFHC2 with Panic
Disorder, Harm Avoidance and Behavioral Inhibition
Carolina Blaya
1
, Priya Moorjani
2
, Giovanni Abrahão Salum
1
, Leonardo
Gonçalves
1
, Lauren A. Weiss
2
, Sandra Leistner-Segal
1
, Gisele Gus Manfro
1*
,
Jordan Smoller
2
Submetido no International Journal of Neuropsychopharmacology
96
Anxiety-proneness is known to be influenced by genes . Recent evidence
suggests that anxiety traits and anxiety disorders are associated with altered
limbic reactivity to fearful stimuli . Previous studies have related the X-linked
genes to fear recognition in which amygdale, a key structure of the limbic system,
plays a critical role . Weiss et al performed a regression-based association
mapping in women with Turner syndrome and found an association between fear
recognition and EF-hand domain containing 2 (EFHC2). This finding makes this a
candidate gene for involvement in anxiety-proneness and perhaps disorder.
With this study we aim to examined whether EFHC2 also affects non-
syndromic anxiety-related traits that have been shown to reflect altered fear
recognition, e.g. harm avoidance (HA) and behavioral inhibition (BI) . We also
aim to find if EFHC2 is related to panic disorder (PD), a disorder in which
reactivity to fearful stimuli has also been implicated . Since the power of this
study is likely to be greater for the quantitative intermediate phenotypes, we run
HA and BI as a primary analyses and PD as a secondary analysis.
This is a case-control study where 127 Caucasian PD patients (75.5%
females, mean age 39.05 ± 10.12 years) were recruited from the Outpatient
Clinic and 132 Caucasian employees from HCPA (73.5% females mean age
36.93 ± 9.75 years) were recruited as controls. Blood was collected from
participants for DNA extraction after informed consent was signed. Institutional
review board approval was obtained from the ethics committee (Number 04-272).
The Mini International Neuropsychiatry Interview - Brazilian version was
used to confirm the psychiatric diagnoses. HA was assessed with the Cloninger’s
97
Temperament and Character Inventory . HA is described as a heritable tendency
to inhibit or stop behaviors in response to signals of aversive stimuli in order to
avoid punishment. The Self-Report Scale of Behavioral Inhibition - Retrospective
Version was used to assess childhood BI. BI is a strong predictor of anxiety
disorder and has an estimated heritability exceeding that of the anxiety disorders
themselves.
Single nuIcleotide polymorphisms (SNPs) were selected within the EFHC2
gene and 10KB flanking region. Genotyping of SNPs was performed according to
Weiss et al. with minor modifications. Markers were retained only if they met the
following quality control criteria: >90% genotype call rate, minor allele frequency
(MAF) >5%, Hardy-Weinberg Equilibrium (HWE) p > 0.001. One SNP was
excluded due to departure from HWE.
We used PLINK software to perform the basic single SNP association test
for alleles. For each SNP, we calculated empirical significant value based on a
Wald test and empirical significant value based on 10,000 permutations. SNPs
that achieve significance in permuted analysis are safer regarding false findings
due to multiple testing. Genotypic tests were performed when allelic tests show
significant in the permuted analysis. We considered an α=0.05 as significance
level.
Single marker tests of 8 EFHC2 SNPs and HA showed one nominally
significant association at rs1562875 and remained significant in the permuted
analysis (p=0.031). In the genotype analysis, rs1562875 was also nominally
associated with HA (Mean±SD: AA 23.6±5.8, AT 21.7±5.9 and TT 15.6±6.5,
98
nominal p-value=0.004; permuted p-value=0.033). In the BI analysis, rs1562875
and rs17146914 were associated with this phenotype, but did not remained
significant in the permuted analysis (p=0.137 and p=0.184, respectively) (table
1). In the PD analysis, the same SNP (rs1562875) was associated with this
disorder (10.7% cases vs. 4.3% controls; OR 2.64, CI95% 1.23-5.66, p=0.009).
However this association did not remain significant in the permuted analysis
(p=0.059). Multiple logistic regression could not be performed because of high
colinearity between the three phenotypes evaluated (tolerance values < 1 - r²).
This is the first study that evaluates EFHC2 and anxiety traits, a gene
previously associated with fear recognition . In our study, we found that
rs1562875 minor allele is nominally associated with higher scores in HA and BI
and is more frequent in PD than in controls. The strength of this study is the
congruent finding of these three highly associated phenotypes that could not be
isolated in regression analysis. Spurious association regarding PD and BI should
be considered due to multiple testing since only HA passed in permuted adjusted
analysis.
EFHC2 may be associated with anxiety by interfering in fear process
related to amygdale function. Pillay et al showed that PD patients produced
more activation of amygdale than controls in response to fearful faces using
fMRI. However, the SNP found in this association study was not the same and
neither it is in linkage disequilibrium (LOD<0.5) with the one that has been
reported to be associated with fear recognition in Turner Syndrome . EFHC2 is a
99
candidate to be involved in neural circuits; however its role in fear circuits has not
been properly understood.
Our results should be interpreted in light of some limitations. Most
importantly, the small sample size means that our analyses may be subject to
Type II error. Besides this, the possibility of spurious association must be
considered. Finally, p values were corrected only by permutation and not for the
three phenotypes evaluated with Bonferroni’s correction.
Regardless the small sample size and the unknown RNA expression
implications of polymorphisms in this gene, the association described between
EFHC2 and anxiety, if replicated, has potential implication in elucidating a
possible neurobiological path of fear.
100
References
Table 1. Allelic Association between individual SNPs in EFHC2 with Behavioral Inhibition and Harm Avoidance
SNP Characteristic Behavioral Inhibition
Harm Avoidance
SNP Role Allele
Change
MAF HWE
p
Β r² p-value
(asymptotic)
p-value
corrected
β r² p-value
(asymptotic)
p-value
corrected
rs287779 Intron A/G 0.24 0.54 -0.059 0.005 0.267 0.849 -0.237 <0.001 0.690 0.999
rs12557505 Intron A/T 0.10 0.70 0.066 0.002 0.410 0.961 0.888 0.004 0.309 0.894
rs12014680 Intron A/G 0.18 0.47 0.081 0.006 0.210 0.761 1.091 0.009 0.119 0.536
rs2208592 Exon G/T 0.12 0.53 0.151 0.015 0.055 0.301 1.154 0.007 0.178 0.698
rs7055196 Intron A/G 0.18 0.48 0.089 0.007 0.170 0.681 0.032 <0.001 0.964 1.000
rs17146914 Exon C/T 0.09 1 0.204 0.019 0.031* 0.184 1.232 0.005 0.236 0.800
rs1562875 Intron A/T 0.08 1 0.206 0.021 0.022* 0.137 2.798 0.031 0.005* 0.032*
rs5906930 Promoter C/G 0.40 0.54 0.011 <0.001 0.814 1.000 -0.206 <0.001 0.694 0.999
Abbreviations: SNP, Single Nucleotide Polymorphism; EFHC2, EF-hand domain containing 2; MAF, Minimal allele frequency; HWE, Hardy-Weinberg equilibrium; β,
regression coefficient; r² regression r-squared; p, Wald-test asymptomatic p-value.
Statistic tests: Wald test;
Note: Bold indicates minor allele. * indicates p<0.05.
102
Artigo 4 – CREB1 as a predictor of long term response to
cognitive-behavior therapy for pharmacotherapy-resistant panic
disorder patients
Carolina Blaya
1
, Priya Moorjani
2
, Elizeth Heldt
1
, Giovanni A. Salum
1
, Sandra
Leistner-Segal
1
, Roy H. Perlis
2
, Jordan W. Smoller
2
, Gisele G. Manfro
1*
Submetido no Genes, Brain and Behavior
103
Abstract
OBJECTIVES: While numerous studies have investigated the role of genetic
variation in predicting response to psychotropic medications, none have
examined whether genes influence response to Cognitive Behavior Therapy
(CBT). The aim of this study was to evaluate the role of variants in 7 genes
previously implicated in the etiology or treatment of anxiety: BDNF, CREB1,
RGS2, CRHR1, SLC6A4, HTR2A, HTR1A and response to CBT in
pharmacological-resistant panic disorder (PD) patients.
METHODS: Seventy-four Caucasian patients with PD resistant to antidepressant
treatment received group CBT for 4 months. Baseline illness severity was
assessed using the Clinical Global Impression (CGI) scale, and treatment
response was indexed by change in CGI at the end of treatment and at 1-year
follow-up. Additionally, the remission criteria (CGI≤2 and no panic attack) were
also evaluated. We examined single nucleotide polymorphisms (SNPs) using
either known functional variants or tag SNPs within each gene and 10 kb flanking
sequence which yielded a total of 47 SNPs. For SLC6A4, we examined the
5HTTLPR promoter variation including the embedded SNP (rs25531). Genes
were screened using a set-based test in PLINK followed by single marker
association tests for genes that reached gene-wide significance.
RESULTS: In the set-based test, CREB1 achieved gene-wide significant
association with improvement at 1-year follow-up (empirical p-value = 0.016). Out
of the 5 CREB1 single markers SNPs, two showed nominally significant
associations (rs7594560, p-value 0.003 and rs2253206, p-value 0.021), that did
104
not remain significant after 10,000 permutations. In the haplotype analysis, we
identified one haplotype significantly associated with 1-year response
(p=0.0002). We did not observe experiment-wide association between CBT
outcome and the remaining genes for either acute or 1-year response or
remission.
CONCLUSION: Although limited by small sample size, these results provide
preliminary evidence that variations in CREB1 may be related to long-term CBT
response among pharmacological-resistant patients with PD.
105
Introduction
Cognitive-behavioral therapy (CBT) has been established as an effective
treatment for panic disorder (PD), and may be superior to pharmacotherapy for
maintaining long-term treatment gains . Despite the consistent evidence for the
efficacy of CBT , many patients fail to respond to treatment. The nature of factors
that underlie these individual differences in treatment response are not well
understood .
The burgeoning field of pharmacogenetics has provided evidence that
specific genetic variants may explain differential response and toxicity to
medication treatment. Previous research has shown that individual response to
pharmacotherapy in major depression , schizophrenia , generalized social
anxiety disorder , and other psychiatric disorders may be related to genetic
variation. However, no study has evaluated the role of these genetic markers in
panic disorder patients and CBT response.
The biological mechanism by which CBT exerts its therapeutic effect is still
unknown. However, Linden proposed similarities in the biological mechanisms
of psycho- and pharmacotherapy. Neuroimage studies have shown regional
metabolic changes with psychotherapy that are similar to pharmacological
treatment in patients with major depression and anxiety disorders including
obsessive compulsive disorder and specific phobias . Hence, genes implicated
in etiology and pharmacological treatments of anxiety disorders are plausible
candidates to be evaluated in the CBT response for PD.
106
PD has been associated with polymorphisms in serotonin receptor 1A
(HTR1A) , serotonin receptor 2A (HTR2A) and regulator of G-protein signalling 2
(RGS2) in humans. Animal models have shown that anxiety is related to cAMP
responsive-element binding protein (CREB1) , corticotropin-releasing hormone
receptor (CRHR1) and brain derived neurotrophic factor (BDNF) . Regarding
response to pharmacological treatment, Perna et al. showed that paroxetine
treatment response in PD is related to the serotonin transporter gene (SLC6A4) .
The aim of this study was to evaluate the association between CBT response
in PD patients resistant to previous pharmacological treatment and variants in 7
genes previously implicated in the etiology or treatment of anxiety: BDNF, CREB1,
RGS2, CRHR1, SLC6A4, HTR2A, HTR1A.
Methods
We examined the role of these genes in a cohort of PD patients treated in
an open study of CBT with one year of naturalistic follow-up. Participants were
recruited from the Anxiety Outpatient Clinic at the Hospital de Clínicas de Porto
Alegre from 1998 to 2006. All participants were referred to be treated with
cognitive behavioral group therapy (CBGT) as an augmentation strategy after
resistant pharmacological treatment i.e. patients had to have residual symptoms
of PD such as panic attacks, anticipatory anxiety and phobic avoidance despite
being on stable dose of medication for at least 4 months. Patients were advised
not to change pharmacological treatment during CBT. CBGT was an adaptation
of the procedures manualized and sessions are described detailed elsewhere .
107
Patients were treated in one of the twelve groups (with a mean of 7 patients per
group) offering 12-sessions of treatment over 4 months. Blood was collected
from participants for DNA extraction during 2005 to 2006 after written informed
consent. Institutional review board approval was obtained from the ethics
committee (Number 04-272).
The inclusion criteria were as follows: (1) PD with or without agoraphobia,
according to DSM-IV diagnostic criteria ; (2) at least eighteen years old; (3)
Clinical GIobal Impressions (CGI) ≥ 3 despite being on a stable dose of
medications for at least 4 months (selective serotonin reuptake inhibitor, tricyclic
antidepressant or venlafaxine, with or without benzodiazepines). Patients with
mental retardation, dementia or other organic brain syndrome, psychotic
disorders and disabling chronic disease were excluded. Patients with
comorbidities common to PD were included in the study provided that the
symptoms were not clinically more prominent than the PD symptoms.
Of the 110 patients that entered the treatment protocol, DNA was collected
from 91 subjects. Only 82 Caucasians patients were included in order to
minimize confusion due to population stratification. Ethnicity was defined based
on phenotypic characteristics and ethnic background. Eight individuals with
genotyping call rates less than 90% were excluded resulting on 74 patients
included in the analysis. Figure 1 displays how the analytic sample was selected.
The sample was predominantly female (79.7%), with a mean age of 39.51
(SD=11.26) years, mean age of PD onset of 29.83 (SD=10.47) years, and
median PD duration of 8 year (P25=3 to P75=11). Patients included had been on
108
pharmacological treatment for a median of 2 years (p25=1 to p75=4) before
starting the CBGT. Five patients spontaneously stop their medication during the
acute treatment, and eighteen patients stop it during the follow-up period.
Thirteen patients (72%) that stop the medication were in remission in the 1-year
follow-up.
The Mini International Neuropsychiatry Interview (MINI) - Brazilian version
was used to confirm the PD diagnosis and establish comorbidity diagnoses. A
semi-structured interview was used to access sociodemographic data and clinical
history. Comorbidities included agoraphobia (90.54%), generalized anxiety
disorder (33.78%), major depression (25.68%), social anxiety disorder (18.92%),
and dysthymia (14.86%).
The Clinical Global Impressions scale (CGI) and Panic Inventory (PI)
were used to access severity at baseline, after the 12
th
session, and 1 year post
treatment. At study entry, ratings were completed by the clinicians running the
group blinded to genotype. Outcome ratings at the end of the treatment and at
follow-up evaluations were completed by trained clinicians who did not participate
in the group therapy or knew the results of the baseline ratings and the
genotyping.
Two end-points were evaluated in this study: acute treatment (at the end of
12-session therapy) and one-year follow-up. Treatment response was defined by
change in CGI score at each endpoint relative to baseline; and remission was
defined as the absence panic attacks and CGI ≤ 2. Since this sample is
composed by resistant patients, the 1-year endpoint could be a most adequate
109
moment to evaluate CBT outcome because some patients could need more time
to recover .
Genotyping was performed for HapMap single nucleotide polymorphisms
(SNPs) selected within each gene and 10kb flanking region. For the CREB1
gene, SNPs were selected based on previous studies . For SLC6A4 we
examined functional polymorphism including the embedded SNP (rs25531). For
BDNF we examined functional Val66Met polymorphism. The Tagger program
(http://www.broad.mit.edu/mpg/tagger/) was used to identify tag SNPs with a
minor allele frequency of greater than 5% and minimum r
2
of 0.8. A total of 47
SNPs were thus selected for genotyping using mass spectrometry as previously
described .
Genotyping of the polymorphism in the promoter of the serotonin
transporter (5-HTTLPR) was performed with the following protocol - Genomic
DNA (1.4 ng) was amplified in a of 7 µl reaction using KlenTaq DNA Polymerase
(0.2 U), the proprietary KlenTaq Buffer (1X), dNTPs (200 µM each), 5% glycerol,
Betaine (1 M) and the marker specific primers (0.2 µM). Amplification was
performed with thirteen cycles of denaturation for 30 seconds at 93ºC, annealing
for 30 seconds beginning at 61.5ºC and dropped 0.5º C every cycle and primer
extension at 72ºC for 30 second, followed by 37 cycles of denaturation for 30
seconds at 93ºC, annealing for 30 seconds at 55º C and primer extension at
72ºC for 30; 72ºC for 1 hour. The amplified product (1µl) was combined with size
standard (LIZ-250) before being analyzed on an ABI-3730. The long allele
appears as a product of about 412 while the short allele shows a band at about
110
370. The genotype of the SNP embedded in the 5-HTTLPR (rs25531) was
assayed by digesting the PCR product with the restriction enzyme, MspI . This
10 µl reaction contains 2 µl of the PCR product, 1 µl of 10X restriction buffer
(New England Biolabs), 1 µl of MspI enzyme and 6 µl of water. The reaction was
incubated at 37ºC for 1 hour. The digested product (1µl) was then combined with
size standard (LIZ-250) before being analyzed on an ABI-3730. Post-digestion,
the long allele with the A SNP allele appears as a product of about 320, the
presence of the G SNP allele is indicated by the presence of a band at 148, while
the short allele shows a band at about 277. The final genotype was determined
from the information from the analysis of both the digested and undigested PCR
product.
In addition, markers were retained only if they met the following quality
control criteria: (1) >90% genotype call rate; (2) minor allele frequency (MAF)
>5%; (3) Hardy Weinberg equilibrium P > 0.001. Three duplicates were assessed
in the experiment with 100% concordance. After applying these quality control
filters, 42 SNPs were retained for the association analysis.
For an initial analysis, we screened each gene using the set-based test in
PLINK (http://pngu.mgh.harvard.edu/purcell/plink/) followed by single marker
association tests for genes that reached gene-wide significance. The set-based
test is based on calculating the average test statistic for the best three SNPs per
gene region, and evaluating the significance of these set-statistics by
permutation (10,000). Gene-wide accounts for multiple comparison within the
gene, whereas experiment-wide significance accounts for multiple comparisons,
111
controlling for the 42 polymorphisms evaluated by permutation. Haplotype
analysis was performed for genes that reached the gene-wide significance.
Haplotype analysis was corrected for number of haplotypes observed (minor
allele frequencies [MAF] < .01) with Bonferroni’s correction. The overall level of
significance adopted was α=0.05.
Results
Patients who provided DNA were generally similar to the full sample
treated with CBGT. Since the DNA sample collection began after CBGT
longitudinal study initiation, those providing DNA samples were the ones in
follow-up. However, there were no differences between baseline characteristics,
outcome measures or co adjuvant treatments of patients included and those who
did not provide blood sample (n=19).
A set-based test was performed with delta CGI and remission at acute
treatment and 1-year follow-up. No association was found with the set-based test
in remission at both end-points and neither for delta-CGI after acute-treatment.
On the other hand, for the delta-CGI 1-year follow-up, a gene-wide association
was found in CREB1 (Table 1). Single marker tests of 5 CREB1 tag SNPs
(Figure 2) showed two nominally significant associations (Table 2), which did not
remain significant after 10,000 permutations. In light of previous studies
indicating sex-specific effects of CREB1 , we also tested for sex-related
heterogeneity. No interaction was found in the gene-by-sex analysis (data not
shown).
112
In the haplotype analysis, Hap4 was significantly associated with delta-
CGI evaluated at 1-year (p=0.0002) that remained significant after Bonferroni´s
correction, and two haplotypes were associated with worse response, but this
association did not remain significant after Bonferroni´s correction (Table 2).
Discussion
This is the first study that evaluates the role of genetic markers in CBT
response. Two SNPs in CREB1 were nominally associated with improvement at
1 year follow-up treatment. CREB1 is a nuclear transcription factor that mediates
the effects of cAMP on gene expression and has been previously related to
anger and antidepressant-emergent suicidal ideation in depressed patients .
By what mechanism might CREB1 influence response to CBT? One
possibility is that CREB1 mediate anger, a domain associated with impulsivity,
aggressive and goal-directed behaviors . Recently, Lara & Akiskal have
proposed a bidimensional model based on fear and anger traits which conceive
mood, behavior and personality concomitantly. Interestingly, Perlis et al. found
an association between a haplotype and anger that is similar to the one found to
be associated with PD improvement. Anger would be associated with
desinhibited exploration and low perception of cues of danger , and probably
facilitate exposition in CBT for PD. Moreover anxiety and stress is related to the
“flight or fight response” and PD patients who fight (anger) could have better
improvement as compared to those that flight (fear). Besides, CREB1 is also
related to memory – an important hallmark for CBT . The connection between
113
CREB1 and long-term memory was established in several organisms , however
the mechanisms that underlie the ability of CREB1 to facilitate memory are not
completely understood . CREB1 activity in the amygdale serves as a molecular
switch for the formation of long-term memory in fear conditioning in rats . The
association between CREB1 and CBT response might be mediated through
personal characteristics as well as through memory modulation that can interfere
in desensitization and exposure during the follow up treatment period.
The association with CREB1 was found only in 1-year follow-up. Although
outcomes cannot be attributed unequivocally to CBGT, the likelihood that our
results are due to non-specific factors or time are unlikely given the history of
chronicity of the illness (median duration of the disease was 8 years) and
inadequate response to open pharmacotherapy for this sample (median 2 years
of pharmacotherapy before starting CBT). Besides, it is also unlikely that this
association is due to modification in medication status, since almost 30% of
those who were in remission have spontaneously stopped their medication. It is
possible that due to patient´s severity, they need more time to perform the
exposure exercise and that is the reason why we found the association only in
follow-up period. Another possibility is CREB1 influence some characteristics
toward “fight response”, that could be related to anger. These personal
characteristics would become more important to patients’ recover in follow-up
period, when exercise depends on their own motivation and not on the therapist.
There was no significant association between the remaining genes
(BDNF, SLC6A4, RGS2, and CRHR1) and CBT response. We examined these
114
genes in light of prior evidence that they may contribute to anxiety-related or
treatment response phenotypes. For example, serum BDNF level has been
related to CBT response in a sample of PD . SLC6A4 and other genes in the
serotonin pathway have been implicated in PD, although results have been
inconclusive . A recent study reported association between four SNPs in RGS2
and PD. Finally, extrahypothalamic CRH systems mediate a broad range of
behavioral stress and anxiety responses and the CRH receptor 1 (CRHR1) is
implicated in anxiogenic CRH actions . We found no evidence that these loci are
associated with response to CBGT for PD, although the small sample size
examined here does not allow us to exclude a role for these genes.
Our results should be interpreted in light of some limitations. Most
importantly, the small sample size means that our analyses may be subject to
Type II error. Besides this, the association was found only in the follow-up period
with the empirical p value and not after 10,000 permutations. The possible
confounding due to population stratification in Brazilian was addressed by
restricting our analyses to Caucasian subjects , therefore these findings are
restricted to this population. Gene’s selection was performed in a no-systematic
search, and association previously related to PD was not evaluated . Additionally,
our finding could be restricted only to pharmacological resistant PD. Finally, the
CREB polymorphisms examined here were chosen to tag genetic variation
across the gene but are not known to have direct functional effects.
In sum, this study is the first analysis of genetic influences on response to
CBT. We observed preliminary evidence that variants in CREB1, a gene
115
implicated in the biological basis of anger, anxiety and memory, are associated
with CBT outcome at 1 year. Clearly, additional larger studies are needed to
further define the effect of CREB1, if any, on CBT response. However, if
replicated, these findings may have implications for elucidating the neurobiology
of CBT and identifying a potential subgroup of PD patients more likely to improve
with this treatment modality.
116
References
117
Genetic Markers Evaluation
EvaluationGenetic Analysis
Figure 1. Flowchart of patients treated at CBGT that were included in genetic analysis and their
characteristics.
Abbreviations: SSRI, Selective serotonin reuptake inhibitor; TCA, Tryciclic Antidepressant.
Table 1 Set-based test for the association between Polymorphisms (PMs) and Delta-
CGI (Baseline CGI – 1-year CGI) at 1-year follow-up (n=73)
Set
PMs in
the Set PMs T-value
Empirical
p-value 0
Empirical
p-value 1
Empirical
p-value 2
Baseline
Co-adjuvant treatment (n= 74)
SSRI (n=60)
TCA (n=13)
Baseline Evaluation
n = 124
Lost to endpoint follow-up (n= 14)
Endpoint (meeting 12)
n = 110
Lost to 1-year follow-up (n= 1)
Endpoint Evaluation for
GENETIC ANALYSIS
1-year Evaluation for
GENETIC ANALYSIS
Excluded from
GENETIC ANALYSIS (n= 36)
No blood/DNA (n= 19)
Low Genotyping (n= 8)
Excluded from analysis
Characteristics
Not Caucasian (n= 9)
Remission
(60.27%)
Included Patients
PD (DSM-IV);
Residual symptoms of PD after antidepressant treatment.
Remission
(39.18%)
118
BDNF P1 rs6265 0.006 1 1 1
CREB P1 rs7594560 9.961 0.013 0.020 0.111
P2 rs2253206 7.765 0.009 0.013 0.079
P3 rs1862952 5.839 0.011 0.016 0.098
CRHR1 P1 rs9892359 1.316 0.915 0.931 1
P2 rs17690314 1.13 0.917 0.932 1
P3 rs242944 0.867 0.941 0.953 1
HTR1A P1 rs6295 0.0381 0.995 0.996 1
P2 rs4521432 0.0238 0.995 0.995 1
P3 rs6449693 0.0159 0.995 0.995 1
HTR2A P1 rs6313 0.789 0.472 0.485 0.994
P2 rs6311 0.621 0.441 0.455 0.988
RGS2 P1 rs2746073 0.723 0.867 0.886 1
P2 rs3856223 0.720 0.827 0.850 1
P3 rs10921267 0.689 0.796 0.820 1
SLC6A4 P1 Biallelic 0.802 0.380 0.380 0.979
SLC6A4 P1 Triallelic 0.079 0.805 0.805 1
A multi-marker set-based test implemented in PLINK was used for the analysis of all
the genes. Sets that have gene-wide association p-value (p<0.05) are shown in bold.
In each set, P1 is the best PMs associated with the outcome; P2 is the second one
and P3 is the third one. Maximum computed permutations were 10000.
Empirical p-value P_0: p-value for average chi-square without correction.
Empirical p-value P_1: p-value corrected for all tests within this gene.
Empirical p-value P_2: p-value corrected for all tests within the experiment.
Abbreviations: PMs, Polymorphisms; CGI, Clinical Global Impression; BDNF, Brain
Derived Neurotrophic Factor; CREB, cAMP responsive-element binding protein;
RGS2, regulator of G-protein signalling g; CRHR1, corticotropin-releasing hormone
receptor; HTR2A, Serotonin receptor 2A; HTR1A, Serotonin receptor 1A; SLC6A4,
Serotonin transporter gene.
119
Table 2 Association between individual SNP and Haplotype in CREB gene and delta-CGI at 1-year follow-up (n=73)
SNP rs1862952 rs2253206 rs7569963 rs7594560 rs4675690 Frequency β R
2
Wald (t)
p-value
(asymptotic)
p-value
corrected
Hap1 A A A T T 0.01 0.798 0.006 0.681 0.498 >0.999
Hap2 T G G T T 0.02 -0.452 0.004 -0.550 0.584 >0.999
Hap3 A A G T T 0.09 -0.435 0.019 -1.176 0.244 >0.999
Hap4 A G G C T 0.09 1.111 0.171 3.832 0.0002 0.002
Hap5 A G G T T 0.18 -0.036 <0.001 -0.124 0.902
>0.999
Hap6 T A A T C 0.06 0.017 <0.001 0.042 0.967
>0.999
Hap7 A A A T C 0.19 -0.067 <0.001 -0.256 0.799 >0.999
Hap8 T A G T C 0.02 -1.985 0.086 -2.592 0.012 0.12
Hap9 A A G T C 0.04 -1.695 0.080 -2.484 0.015 0.15
Hap10 A G G T C 0.29 0.061 <0.001 0.240 0.811 >0.999
HWE 1 0.34 0.76 0.14 0.47
Allele change A/T A/G A/G C/T C/T
Minor allele T A A C T
MAF 0.11 0.43 0.26 0.10 0.40
β -0.439 -0.478 -0.016 0.873 0.282
SE 0.311 0.203 0.230 0.277 0.208
R
2
0.027 0.073 <0.001 0.123 0.025
Wald (t) -1.410 -2.360 -0.068 3.156 1.358
p-value (asymptotic) 0.163 0.021 0.946 0.002 0.179
p-value (empirical, corrected) >0.999 0.998 >0.999 0.929 >0.999
Abbreviations: CGI, Clinical Global Impression; CREB, cAMP responsive-element binding protein; SNP, Single Nucleotide Polymorphism; HWE- Hardy Weinberg Equilibrium p value; MAF,
Minimal Allele Frequency; β, regression coefficient; r² regression r-squared. Bold means p<0.05.
121
Considerações finais
Dentre os diversos fatores etiológicos envolvidos no TP, a vulnerabilidade
genética está bem estabelecida como um fator de risco, uma vez que a
herdabilidade para esse transtorno é de 28 a 43% . No entanto, os estudos
com genes candidatos não demostraram resultados muito consistentes.
O gene transportador da serotonina, que é um gene candidato natural
para ser investigado nos Transtornos de Ansiedade devido a sua associação
aos Transtornos de Humor e ao temperamento de evitação de danos , não foi
associado ao TP em diversos estudos prévios. Alguns autores freqüentemente
argumentam que a ausência de associação nos estudos em genética pode ser
por falta de poder dos estudos, pois se espera um efeito muito pequeno para um
único polimorfismo conferir risco a um transtorno. No entanto, no estudo 1 pode-
se constatar com a meta-análise a ausência de associação do polimorfismo 5-
HTTLPR com o Transtorno do Pânico (RC=0,91, IC95% 0,80 a 1,03, p=0,14).
Três subanálises foram realizadas nessa meta-análise divididas por etnia,
qualidade do grupo controle e comorbidade com Agorafobia, e também não foi
identificada nenhuma associação com esse gene. Entretanto, o tamanho
amostral incluído nesse estudo foi de cerca de 1000 pacientes com TP,
justificando então a realização de outros estudos para vir a identificar um
possível efeito do gene no TP com menor magnitude. Além disso, nenhum
estudo havia avaliado o 5-HTTLPR na sua forma trialélica no TP.
122
Realizamos então o estudo 2 com um dos objetivos de avaliar o 5-
HTTLPR na forma bialélica e trialélica no TP e, assim como na meta-análise,
não encontramos qualquer associação. O diferencial desse estudo foi que ele
contemplou a medida de interação do gene com traumas na infância. Ao
contrário do que ocorreu na depressão , não encontramos qualquer interação do
gene-ambiente. Esses resultados devem ser considerados com cautela, pois
esse é o primeiro estudo no TP que avaliou esse tipo de interação. Um estudo
prévio encontrou associação entre abuso emocional ou abuso físico e
sensibilidade à ansiedade , um fenótipo intermediário que está intimamente
ligado ao TP. Diante desses achados é possível levantar algumas hipóteses. A
primeira é de que nosso estudo não possui poder suficiente para identificar a
interação do 5-HTTLPR com trauma, uma vez que foram incluídos apenas 232
sujeitos. Curiosamente, o achado de Stein et al foi descrito em apenas 150
sujeitos, mas como o fenótipo avaliado era uma medida contínua, e não
dicotômica como no nosso estudo, é possível que esse tamanho amostral tenha
sido suficiente.
Outra hipótese é de que a interação gene-ambiente com o 5-HTTLPR
ocorre apenas para um aspecto ligado ao TP – a sensibilidade à ansiedade – e
não ao transtorno como um todo. Isso fundamenta a pesquisa de fenótipos
intermediários, que possivelmente são mais adequados para os estudos de
associação em comparação com a nosologia psiquiátrica proposta pelo DSM-IV
. No estudo 2 optou-se por não avaliar fenótipos intermediários, uma vez que o
número excessivo de testes implicaria uma correção ainda maior do valor p.
123
Determinamos uma única medida para cada covariável avaliada na interação
(pai protetor, mão protetora e trauma), mas como foram testados 8 marcadores,
o número de testes já nos pareceu excessivo para incluir também os fenótipos
intermediários. Nossa abordagem difere da adotada por Stein et al que foi
utilizar duas subescalas do CTQ, ao invés de avaliar uma medida mais global,
em dois fenótipos intermediários: neuroticismo e sensibilidade à ansiedade.
Apesar de realizar 12 testes (sensibilidade à ansiedade, escala de sintomas
físicos da sensibilidade à ansiedade e neuroticismo para a forma bialélica e
trialélica e duas covariáveis, abuso emocional e físico), os autores não fizeram
correção para múltiplos testes. Baseado nos achados dos estudos 1 e 2,
concluímos que o 5-HTTLPR não apresenta um papel maior na genética do TP
nem mesmo quando considerada sua forma trialélica ou a interação com trauma,
apesar de existir evidência de influenciar fenótipos intermediários associados à
ansiedade.
Outros genes foram também pesquisados, e naturalmente os receptores
da serotonina HTR1A e HTR2A são genes candidatos. Um polimorfismo do
HTR1A havia sido associado previamente ao TP, mas com resultados
contraditórios . No nosso achado replicamos a associação do alelo G do
polimorfismo localizado no promotor (rs6295) com TP e identificamos outros 2
SNPs do HTR1A associados ao TP. Os alelos de menor freqüência desses
polimorfismos constituem um haplótipo de risco para o TP, enquanto que os
alelos complementares conferem proteção ao transtorno. As associações
encontradas com o HTR1A não sofreram interação com nenhuma medida
124
ambiental avaliada no nosso estudo. Possivelmente, estudos de meta-análise
poderão avaliar qual a real contribuição desse gene.
Já o HTR2A havia sido associado ao TP em 2 estudos independentes ,
mas esse achado não foi replicado em 2 outros estudos . No nosso estudo não
identificamos associação entre esse gene e o TP. No entanto, quando
considerada a interação com pais pouco superprotetores e muito afetivos, a
presença de alelo T em dois polimorfismos do HTR2A conferiu proteção ao TP.
Esse achado replica parcialmente o que foi recentemente reportado para a
Depressão por Jokela et al . Ansiedade e Depressão são comorbidades
freqüentes, e alguns autores sugerem que ambas compartilham fatores de risco
comuns . Apesar de o achado prévio ter sido descrito com mães e o nosso com
pais, os achados nos parecem congruentes, pois existe uma contribuição
diferente para o cuidado materno e paterno dentro de cada cultura . Parece
também que variações no HTR2A influenciam o indivíduo a aproveitar o suporte
do ambiente familiar (podendo ser tanto o pai, quanto à mãe) para evitar o
desenvolvimento tanto de Ansiedade quanto Depressão.
Além de replicar associações com genes previamente associados ao TP,
essa tese sugere que o EFHC2 está associado ao TP e a dois fenótipos
intermediários associados à ansiedade (comportamento inibido e temperamento
evitador de dano). A força desse achado está na congruência da associação
com esses três fenótipos. O EFHC2 havia sido previamente associado à
percepção do medo , levando então ao desenvolvimento do nosso estudo 3.
125
Caso esse achado seja replicado, possivelmente poderá contribuir para a
compreensão do neurocircuito do medo.
Já o estudo 4 propõe pela primeira vez avaliar a influência de variações
gênicas na resposta à Terapia Cognitivo-Comportamental. Nesse estudo
avaliamos variações no 5-HTTLPR, HTR1A, HTR2A, BDNF, CREB1, RGS2 e
CRHR1 e encontramos que variações no CREB1 estavam associadas à melhor
resposta à TCC. O CREB1 havia sido previamente associado à raiva, e na
análise de haplótipos encontramos que o haplótipo associado à raiva foi também
associado com a melhor resposta à TCC. A ansiedade está associada à
resposta de “luta ou fuga”, e nosso estudo sugere que aqueles pacientes que
lutam (raiva) respondem melhor à TCC que os que fogem (medo).
Por fim, essa tese versa sobre alguns aspectos relacionados ao TP,
abrangendo desde a revisão sistemática da literatura, até estudos de
associação, de interação gene-ambiente e de resposta à TCC. Esses estudos
estão de acordo com a proposta de estudos para o século 21 , incluindo a
pesquisa de vários genes e análise de múltiplos lócus. Como perspectiva futura,
essa linha de pesquisa será ampliada, com o aumento do tamanho amostral, a
pesquisa de novos genes candidatos, a avaliação de outros fenótipos
intermediários e a análise de interação gene-ambiente e gene-gene na busca de
um melhor entendimento da genética do TP.
126
Anexo A: Termo de Consentimento Informado
Termo de Consentimento Informado para Pacientes
Estamos realizando uma pesquisa sobre a influência genética na evolução de pacientes
com Transtorno do Pânico. A causa do Transtorno do Pânico é multifatorial, ou seja, existem
alguns fatores genéticos e ambientais que predispõe à doença. O objetivo desse estudo é
verificar se existe alguma predisposição genética que influencie no modo como os indivíduos
lidam com os estressores ambientais.A avaliação constará de uma entrevista psiquiátrica e um
exame de sangue que identificará alguns genes que são associados a ansiedade. O tratamento
será escolhido de acordo com as indicações clínicas e desejo do paciente, podendo ser
farmacológico ou psicoterápico. Os pacientes serão reavaliados clinicamente anualmente e
inquiridos quanto a estressores ambientais no ano anterior à entrevista. A não participação do
estudo não acarretará em nenhum prejuízo no seu atendimento no HCPA.
Eu .......................................................................................... fui informado dos objetivos
acima descritos e da justificativa para qual estão sendo utilizadas as escalas de forma clara e
detalhada. Sei que poderei solicitar novos esclarecimentos e que, a qualquer momento, terei
liberdade de retirar meu consentimento da participação da pesquisa, sem prejudicar meu
atendimento no HCPA.
O (a) pesquisador(a) ........................................................... certificou-me de que as
informações por mim fornecidas terão caráter confidencial e no caso de divulgação serão sem
identificação e unicamente para fins de pesquisa.
Porto Alegre, ...... de ....................................... de .......... .
Assinatura do paciente ..................................................................................
Assinatura do pesquisador ............................................................................
Contato com pesquisadora: Carolina Blaya – Fone: 3316 82 72
Pesquisador Responsável: Gisele Gus Manfro
127
Adendo ao Termo de Consentimento Informado para Pacientes
Estamos realizando uma pesquisa sobre a influência genética na evolução de pacientes
com Transtorno do Pânico que você já está participando conforme Consentimento prévio.
Atualmente estamos desenvolvendo uma parceria com uma Universidade do exterior que dispõe
de maior tecnologia para o estudo desses fatores genéticos. Com essa parceria, iremos avaliar
um outro fator genético que vem sendo relacionado ao Transtorno do Pânico. Esses estudos
serão desenvolvidos em parceria entre o nosso grupo de pesquisa e essa instituição do Exterior.
Eu .......................................................................................... fui informado dos objetivos
acima descritos e da justificativa para qual minha amostra será enviada para o exterior e
concordo.
Como existem estudos novos na área da genética a cada ano, o seu sangue poderá ser
armazenado para futuras pesquisas. No entanto, a cada nova pesquisa, os pesquisadores
entrarão em contato com você para obter um novo consentimento informado.
Concordo com o armazenamento do material biológico ( ) sim
( ) não
O (a) pesquisador(a) ........................................................... certificou-me de que as
informações por mim fornecidas terão caráter confidencial e no caso de divulgação serão sem
identificação e unicamente para fins de pesquisa.
Porto Alegre, ...... de ....................................... de .......... .
Assinatura do paciente ................................................................................
Assinatura do pesquisador ..........................................................................
Contato com pesquisadora: Carolina Blaya – Fone: 2101 82 72
Pesquisador Responsável: Gisele Gus Manfro
128
Termo de Consentimento Informado para os Controles
Estamos realizando um banco de dados genéticos de indivíduos sem patologia
psiquiátrica. Sabe-se que a etiologia dos transtornos psiquiátricos é multifatorial, ou seja, existem
alguns fatores genéticos e ambientais que predispõe às doenças. O objetivo desse estudo é
estabelecer um banco de dados genéticos de indivíduos normais para que possa ser utilizado
como controle nas pesquisas psiquiátricas. A avaliação constará de uma entrevista psiquiátrica e
um exame de sangue que identificará alguns genes que estão sendo estudados nos transtornos
psiquiátricos. Se for identificado algum problema psiquiátrico, você será encaminhado para
tratamento. O anonimato dos dados será garantido através de um banco de códigos, ou seja, os
seus dados não serão identificados pelo seu nome, e sim por um número. A não participação do
estudo não acarretará em nenhum prejuízo no seu trabalho no HCPA.
Eu .......................................................................................... fui informado dos objetivos
acima descritos e da justificativa para qual serão utilizados os dados de forma clara e detalhada.
Sei que poderei solicitar novos esclarecimentos e que, a qualquer momento, terei liberdade de
retirar meu consentimento da participação da pesquisa, sem prejudicar meu trabalho no HCPA.
O (a) pesquisador(a) ........................................................... certificou-me de que as informações
por mim fornecidas terão caráter confidencial e no caso de divulgação serão sem identificação e
unicamente para fins de pesquisa.
Porto Alegre, ...... de ....................................... de .......... .
Assinatura do paciente .................................................................................
Assinatura do pesquisador ...........................................................................
Pesquisadora: Carolina Blaya – Fone: 2101 82 72 - 3333 40 78
Pesquisador Responsável: Gisele Gus Manfro
129
Adendo ao Termo de Consentimento Informado para Controles
Conforme consentimento informado prévio, você faz parte de um banco de controles de
patologia psiquiátrica. Estamos realizando uma pesquisa sobre a influencia genética no
Transtorno do Pânico, para verificar se os pacientes com esse transtorno possuem alguma
variação no material genético. Para isso, precisamos comparar os resultados dos pacientes com
um grupo controle.
Eu…………………………………………………………………..fui informado dos objetivos
acima descritos e concordo que avaliem marcadores genéticos na minha amostra do meu
material genético.
Como existem estudos novos na área de genética a cada ano, o seu material genético
poderá ser armazenado para futuras pesquisas. No entanto, a cada nova pesquisa, os
pesquisadores entrarão em contato com você para obter um novo consentimento informado.
Concordo com o armazenamento do material biológico ( ) sim
( ) não
O pesquisador(a) ………………………………………………………………….. certificou-me de que
as informações por mim fornecidas terão caráter confidencial e no caso de divulgação serão sem
a identificação e unicamente para fins de pesquisa.
Porto Alegre, ………. de ……………………………… de ………………….
Assinatura do paciente ……………………………………………………………..
Assinatura do pesquisador …………………………………………………………….
Contato com pesquisadora – Carolina Blaya – Fone 2101 82 72
Pesquisador Responsável – Gisele Gus Manfro
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Anexo B: Produção científica durante o período do doutorado
Com o objetivo de aumentar a amostra de pacientes com TP para os estudos
de associação em genética, foi desenvolvido um ensaio clínico aberto com
Milnaciprano. Esse estudo resultou em uma publicação em anexo nessa tese.
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