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Universidade de São Paulo
Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”
Atributos fenológicos, agronômicos e expressão gênica durante a
frutificação do cafeeiro
Cristiana de Gaspari-Pezzopane
Tese apresentada para obtenção do título de Doutor
em Agronomia. Área de concentração: Fitotecnia
Piracicaba
2007
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Cristiana Gaspari-Pezzopane
Engenheira Agrônoma
Atributos fenológicos, agronômicos e expressão gênica durante frutificação do
cafeeiro
Orientador:
Prof. Dr. JOSÉ LAÉRCIO FAVARIN
Tese apresentada para obtenção do título de
Doutor em Agronomia. Área de concentração:
Fitotecnia
Piracicaba
2007
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Dados
Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)
DIVISÃO DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - ESALQ/USP
Gaspari-Pezzopane, Cristiana de
Atributos fenológicos, agronômicos e expressão gênica durante frutificação do
cafeeiro / Cristiana de Gaspari-Pezzopane. - - Piracicaba, 2007.
105 p. : il.
Tese (Doutorado) - - Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, 2007.
Bibliografia.
1. Café 2. Expressão gênica 3. Fenologia 4. Fruto – Desenvolvimento 5.
Influência climática 6. Marcador molecular I. Título
CDD 633.73
“Permitida a cópia total ou parcial deste documento, desde que citada a fonte – O autor”
3
Ao meu marido RICARDO,
com muito amor
DEDICO
Aos meus pais e irmãos
OFEREÇO
4
AGRADECIMENTOS
A DEUS, por tornar tudo possível.
À Universidade de São Paulo, Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”,
pela oportunidade de realização do curso.
Ao Centro de Café “Alcides Carvalho” do Instituto Agronômico de Campinas por
permitir a realização do projeto em seus campos experimentais e laboratórios.
Ao CNPq, pela concessão da bolsa de estudos.
Ao Dr. José Laércio Favarin e à Dra. Mirian Perez Maluf pela orientação,
dedicação e valiosa amizade.
Ao Dr. Oliveiro Guerreiro Filho pelo apoio na condução e avaliação dos
experimentos e pela amizade.
Aos demais professores da ESALQ e pesquisadores do Centro de Café “Alcides
Carvalho”, pelo apoio e ajuda, em especial à D. Ivone e Dr. Luiz Carlos Fazuoli que
contribuíram para que este estudo se concretizasse.
Aos professores, funcionários e alunos do programa de Pós Graduação em
Fitotecnia, pelo apoio e ajuda durante todo o curso, em especial à Luciane Aparecida
Lopes Toledo.
Aos colegas de curso pela divertida e saudável convivência.
Aos colegas de laboratório, pela convivência e palavras de incentivo.
Aos amigos Paula, Roberta, Thais, Marcos, Milene, Valéria, Ne, Michelle, Carla e
Gisa pela ajuda na concretização deste e, principalmente, pelos grandes momentos que
passamos juntos durante esta etapa.
Aos meus irmãos, cunhados, sobrinhos, amigos e familiares que sempre me
apoiaram e incentivaram.
Ao meu marido Ricardo, por sua contribuição na condução e avaliação do
trabalho, por seu amor e apoio incondicional nessa etapa da minha vida.
A todos que de algum modo contribuíram para a realização desse trabalho.
5
SUMÁRIO
RESUMO..........................................................................................................................7
ABSTRACT ......................................................................................................................8
LISTA DE FIGURAS ........................................................................................................9
LISTA DE ABREVIATURAS...........................................................................................17
1 INTRODUÇÃO ............................................................................................................18
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA........................................................................................20
2.1 Importância econômica do café no Brasil.................................................................20
2.2 O cafeeiro: origem, classificação botânica e biologia da reprodução.......................20
2.3 Cultivares de Coffea arabica ....................................................................................21
2.4 Fenologia do cafeeiro...............................................................................................23
2.5 Desenvolvimento dos frutos do cafeeiro...................................................................26
2.6 Expressão gênica diferencial no desenvolvimento dos frutos de café .....................28
2.7 Melhoramento do cafeeiro e o genoma do café .......................................................30
3 MATERIAL E MÉTODOS............................................................................................32
3.1 Avaliações fenológicas e agronômicas ....................................................................32
3.1.1 Avaliações fenológicas..........................................................................................32
3.1.1.1 Desenvolvimento fenológico...............................................................................33
3.1.1.2 Porcentagem de frutos maduros na colheita......................................................33
3.1.2 Avaliações agronômicas........................................................................................34
3.1.2.1 Produção e rendimento ......................................................................................34
3.1.2.2 Tipos de sementes .............................................................................................35
3.1.2.3 Tamanho dos grãos............................................................................................35
3.1.3 Análise estatística .................................................................................................36
3.2 Expressão gênica.....................................................................................................36
3.2.1 Busca de ESTs em banco de dados de café.........................................................36
3.2.2 Coleta de material vegetal e isolamento de RNA total ..........................................37
3.2.3 Síntese de cDNA...................................................................................................38
3.2.4. Amplificação por PCR e eletroforese....................................................................38
3.2.5 Clonagem e sequenciamento................................................................................39
6
3.2.6 Quantificação da expressão gênica por PCR em tempo real................................40
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO...................................................................................42
4.1 Avaliações Fenológicas e Agronômicas...................................................................42
4.2 Expressão gênica.....................................................................................................48
4.2.1 Data-mining...........................................................................................................49
4.2.2 Análise da expressão gênica por RT-PCR e PCR em tempo real.........................52
4.2.2.1 Grupo de genes relacionados com o desenvolvimento do embrião...................52
4.2.2.2 Grupo de genes relacionados com os componentes químicos dos frutos..........60
4.3 Considerações Gerais..............................................................................................87
CONCLUSÕES ..............................................................................................................92
REFERENCIAS..............................................................................................................93
ANEXO.........................................................................................................................104
7
RESUMO
Atributos fenológicos, agronômicos e expressão gênica durante a frutificação do
cafeeiro
As características relacionadas à frutificação do cafeeiro são altamente
influenciadas pelo ambiente. Portanto, a associação de análises agronômicas,
fenológicas e genômicas são necessárias para o entendimento desse processo. Esses
estudos fazem parte do programa de melhoramento genético do café, com o objetivo de
obter plantas com maior uniformidade de maturação, duração de ciclo e bebidas
específicas. Nesse contexto, os objetivos desse trabalho foram estabelecer padrões
agronômicos e fenológicos comparativos entre diferentes cultivares e safras de café,
caracterizar genes diferencialmente expressos durante o desenvolvimento dos frutos de
cafeeiro arábica e correlacionar genes diferencialmente expressos com atributos
fenológicos e agronômicos. Os estudos foram realizados no Centro de Café do IAC em
Campinas, SP. As cultivares de Coffea arabica utilizadas foram: Mundo Novo, Catuaí
Vermelho, Icatu Vermelho, Obatã e Icatu Precoce, nas safras de 2004/2005 e
2005/2006. Os atributos fenológicos foram avaliados com base no desenvolvimento do
ciclo fenológico e na porcentagem de frutos maduros na colheita. As avaliações
agronômicas foram avaliadas baseadas nas características tecnológicas do produto
como, produção e rendimento, tipos de sementes e tamanho dos grãos. A expressão
gênica diferencial foi avaliada por método semi-quantitativo e quantitativo RT-PCR em
todos os estádios de desenvolvimento dos frutos. Seqüências de genes específicos
foram identificadas por buscas em bancos de dados do Programa Genoma Café e no
Genbank, possibilitando a construção de oligonucleotídeos específicos para cada gene.
Em geral, os resultados das análises confirmaram a influência ambiental no
desenvolvimento dos frutos do cafeeiro, especialmente as variações hídricas e de
temperatura. Diferenças significativas foram identificadas entre as cultivares, em
relação aos atributos fenológicos e agronômicos, principalmente na safra 2005/2006
quando foi possível discriminar as cultivares quanto à duração do ciclo fenológico. A
expressão gênica durante o desenvolvimento dos frutos, seguiu padrão similar entre as
cultivares, mesmo comparando diferentes anos agrícolas. Conseqüentemente, essas
análises permitiram a identificação de genes candidatos a serem usados como
marcadores genéticos das fases de frutificação de C. arabica, como: crescimento (PAL,
CHS e manB), transição do crescimento para o início da maturação (csp1, GLA e ER5),
maturação e amadurecimento (CS, AAT, ACS, ACO, ETR e ICL) e transição da
maturação para o amadurecimento (PAL). Esses genes marcadores em associação
com atributos agronômicos e fenológicos, podem ser utilizados como parâmetros
moleculares para a definição de estádios adequados à colheita, assegurando
composição final específica dos frutos e da qualidade da bebida.
Palavras-chave: Coffea arabica L.; Fases do desenvolvimento dos frutos; Fenologia;
Genes expressos; Influência climática; Marcadores moleculares
8
ABSTRACT
Phenological and agronomic attributes and gene expression during the fruit
development of the coffee tree
Coffee fruit development and ripening are biological processes largely influenced
by environmental conditions. Therefore, the association of agronomic, phenologic and
genomic analyses is necessary for a broad comprehension of these processes. This
type of approach is already part of coffee breeding programs, which aimed the
development of coffee cultivars bearing maturation uniformity, controlled life cycle and
specific cup qualities. In this context, the main objectives of this dissertation are to
establish comparative patterns of fruit ripening among different coffee cultivars, to
characterize gene expression during fruit development, and to correlate possible
differential gene expression with agronomic and phenologic traits. All investigations
were performed at the experimental field of the Coffee Center/IAC, Campinas, SP. The
Coffea arabica cultivars Mundo Novo, Catuaí Vermelho, Icatu Vermelho, Obatã and
Icatu Precoce, years 2004/2005 and 2005/2006, were evaluated regarding phenologic
cycle and percentage of cherry fruits at harvesting time. Agronomic traits evaluated
included productivity and outturn, type of seeds and grain size. Differential gene
expression was evaluated through semi-quantitative and quantitative RT-PCR, in all
stages of fruit development. Sequences of selected genes were identified through blast
searches in the database of the Coffee Genome EST Project and the Genbank, and
used to design gene-specific primers. In general, analyzed results confirmed the
environmental influence over fruit development, especially temperature variations during
evaluated seasons. Significant differences were identified among cultivars regarding
phenologic and agronomic traits, especially in the year 2005/2006 where life cycle
duration allowed cultivar discrimination. Gene expression during fruit development
followed a similar pattern among evaluated cultivars, even when comparing different
harvesting years. Therefore, these patterns allowed the identification of candidate genes
for use as genetic markers of C. arabica fruit development phases, such as growing
(PAL, CHS and manB), transition from growing to maturation (csp1, GLA, ER),
maturation and ripening (CS, AAT, ACS, ACO, ETR, ICL) and transition from maturation
to ripening (PAL). These gene-markers, in association with agronomic and phenological
traits, may be used as molecular parameters for the definition of best colleting stage,
ensuring specific final coffee fruit composition and cup quality.
Keywords: Coffea arabica L.; Fruit development stages; Phenology; Gene expression;
Ripening; Climate influence; Molecular markers
9
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Esquematização das seis fases fenológicas do cafeeiro arábica, durante
24 meses, nas condições climáticas tropicais do Brasil, extraído de
Camargo e Camargo (2001)......................................................................
23
Figura 2 - Escala de notas para o desenvolvimento fenológico do cafeeiro,
extraído de Pezzopane et al. (2003) .........................................................
25
Figura 3 - Fases de maturação de frutos de café identificadas na colheita: verde,
verde-cana, cereja, passa e seco..............................................................
34
Figura 4 - Fases de desenvolvimento dos frutos de cafeeiro coletados para
caracterização gênica: ovário fecundado (ov), fruto chumbinho (ch),
fruto em expansão (ex), fruto verde (v), frutos verde-cana (vc), fruto
cereja (c) e endosperma maduro (en).......................................................
37
Figura 5 - Épocas de ocorrência de estádios fenológicos em cafeeiro (0-gema
dormente; 1-gema entumecida; 2-abotoado; 3-florada; 4-pós-florada; 5-
chumbinho; 6-expansão dos frutos; 7-fruto verde; 8-fruto verde-cana; 9-
fruto cereja; 10-fruto passa; 11-fruto seco), para a florada principal, nos
anos agrícolas de 2004/05 (A) e 2005/06 (B), para o município de
Campinas, SP............................................................................................
44
Figura 6 - Balanço hídrico e temperatura para o período de julho de 2004 a junho
de 2006, para o município de Campinas, SP…………...…..................…..
45
Figura 7 – Análise de componentes principais das variáveis fenológicas
associadas às cultivares Obatã (OB), Catuaí Vermelho (CV), Icatu
Vermelho (IV), Mundo Novo (MN) e Icatu Precoce (IP) nas safras
2004/05 e 2005/06. Representadas no plano 1-2......................................
46
Figura 8 - Análise de componentes principais das variáveis agronômicas
associadas às cultivares Obatã (OB), Catuaí Vermelho (CV), Icatu
Vermelho (IV), Mundo Novo (MN) e Icatu Precoce (IP), nas safras
2004/05 e 2005/06. Representadas no plano 1-3......................................
47
10
Figura 9 - Amplificação por RT-PCR de transcritos do gene GN pareado ao gene
controle Actina, nas cultivares Mundo Novo (MN), Catuaí Vermelho
(CV), Icatu Vermelho (IV), Obatã (OB) e Icatu Precoce (IP), nas fases
de desenvolvimento dos frutos (ovário-ov; chumbinho-ch; expansão-ex;
verde-v; verde cana-vc; cereja-c e endosperma-en). Peso molecular
(PM) de 100 pb. Fragmento com intensidade visual igual
(=)...............................................................................................................
53
Figura 10 - Amplificação por RT-PCR de transcritos do gene SCR pareado ao gene
controle Actina, nas cultivares Mundo Novo (MN), Catuaí Vermelho
(CV), Icatu Vermelho (IV), Obatã (OB) e Icatu Precoce (IP), nas fases
de desenvolvimento dos frutos (ovário-ov; chumbinho-ch; expansão-ex;
verde-v; verde cana-vc; cereja-c e endosperma-en). Peso molecular
(PM) de 100 pb. Fragmento com intensidade visual igual
(=)..............................................................................................................
54
Figura 11 - Amplificação por RT-PCR de transcritos do gene STM pareado ao gene
controle Actina, nas cultivares Mundo Novo (MN), Catuaí Vermelho
(CV), Icatu Vermelho (IV), Obatã (OB) e Icatu Precoce (IP), nas fases
de desenvolvimento dos frutos (ovário-ov; chumbinho-ch; expansão-ex;
verde-v; verde cana-vc; cereja-c e endosperma-en). Peso molecular
(PM) de 100 pb. Fragmento com intensidade visual igual (=)...................
55
Figura 12 – Quantificação da expressão do gene STM nos frutos de cafeeiro em
expansão, verde e cereja na cultivar Mundo Novo (A) e na fase cereja
para as cultivares Mundo Novo, Catuaí, Icatu Vermelho, Obatã e Icatu
Precoce (B)................................................................................................
55
Figura 13 - Amplificação por RT-PCR de transcritos do gene ARF pareado ao gene
controle Actina, nas cultivares Mundo Novo (MN), Catuaí Vermelho
(CV), Icatu Vermelho (IV), Obatã (OB) e Icatu Precoce, nas fases de
desenvolvimento dos frutos (ovário-ov; chumbinho-ch; expansão-ex;
verde-v; verde cana-vc; cereja-c e endosperma-en). Peso molecular
(PM) de 100 pb. Fragmento com intensidade visual igual (=) e maior (+).
56
11
Figura 14 - Amplificação por RT-PCR de transcritos do gene ASN1 pareado ao
gene controle Actina, nas cultivares Mundo Novo (MN), Catuaí
Vermelho (CV), Icatu Vermelho (IV), Obatã (OB) e Icatu Precoce (IP),
nas fases de desenvolvimento dos frutos (ovário-ov; chumbinho-ch;
expansão-ex; verde-v; verde cana-vc; cereja-c e endosperma-en). Peso
molecular (PM) de 100 pb. Fragmento com intensidade visual igual (=) e
maior (+).....................................................................................................
57
Figura 15 - Amplificação por RT-PCR de transcritos do gene ABA3/FLACCA
pareado ao gene controle Actina, nas cultivares Mundo Novo (MN),
Catuaí Vermelho (CV), Icatu Vermelho (IV), Obatã (OB) e Icatu Precoce
(IP), nas fases de desenvolvimento dos frutos (ovário-ov; chumbinho-
ch; expansão-ex; verde-v; verde cana-vc; cereja-c e endosperma-en).
Peso molecular (PM) de 100 pb. Fragmento com intensidade visual
igual (=)......................................................................................................
59
Figura 16 - Amplificação por RT-PCR de transcritos do gene cat pareado ao gene
controle Actina, nas cultivares Mundo Novo (MN), Catuaí Vermelho
(CV), Icatu Vermelho (IV), Obatã (OB) e Icatu Precoce (IP), nas fases
de desenvolvimento dos frutos (ovário-ov; chumbinho-ch; expansão-ex;
verde-v; verde cana-vc; cereja-c e endosperma-en). Peso molecular
(PM) de 100 pb. Fragmento com intensidade visual igual
(=)..............................................................................................................
60
Figura 17 - Amplificação por RT-PCR de transcritos do gene MS pareado ao gene
controle Actina, nas cultivares Mundo Novo (MN), Catuaí Vermelho
(CV), Icatu Vermelho (IV), Obatã (OB) e Icatu Precoce (IP), nas fases
de desenvolvimento dos frutos (ovário-ov; chumbinho-ch; expansão-ex;
verde-v; verde cana-vc; cereja-c e endosperma-en). Peso molecular
(PM) de 100 pb. Fragmento com intensidade visual igual (=)...................
61
12
Figura 18 - Amplificação por RT-PCR de transcritos do gene TS pareado ao gene
controle Actina, nas cultivares Mundo Novo (MN), Catuaí Vermelho
(CV), Icatu Vermelho (IV), Obatã (OB) e Icatu Precoce (IP), nas fases
de desenvolvimento dos frutos (ovário-ov; chumbinho-ch; expansão-ex;
verde-v; verde cana-vc; cereja-c e endosperma-en). Peso molecular
(PM) de 100 pb. Fragmento com intensidade visual igual (=)...................
62
Figura 19 - Amplificação por RT-PCR de transcritos do gene CS pareado ao gene
controle Actina, nas cultivares Mundo Novo (MN), Catuaí Vermelho
(CV), Icatu Vermelho (IV), Obatã (OB) e Icatu Precoce (IP), nas fases
de desenvolvimento dos frutos (ovário-ov; chumbinho-ch; expansão-ex;
verde-v; verde cana-vc; cereja-c e endosperma-en). Peso molecular
(PM) de 100 pb. Fragmento com intensidade visual igual (=) e menor (-).
63
Figura 20 – Quantificação da expressão do gene CS nos frutos do cafeeiro em
expansão, verde e cereja na cultivar Mundo Novo (A) e na fase cereja
para as cultivares Mundo Novo, Catuaí, Icatu Vermelho, Obatã e Icatu
Precoce (B)................................................................................................
63
Figura 21 - Amplificação por RT-PCR de transcritos do gene 4cl pareado ao gene
controle Actina, nas cultivares Mundo Novo (MN), Catuaí Vermelho
(CV), Icatu Vermelho (IV), Obatã (OB) e Icatu Precoce (IP), nas fases
de desenvolvimento dos frutos (ovário-ov; chumbinho-ch; expansão-ex;
verde-v; verde cana-vc; cereja-c e endosperma-en). Peso molecular
(PM) de 100 pb. Fragmento com intensidade visual igual (=)...................
64
Figura 22 - Amplificação por RT-PCR de transcritos do gene CCoAOMT1 pareado
ao gene controle Actina, nas cultivares Mundo Novo (MN), Catuaí
Vermelho (CV), Icatu Vermelho (IV), Obatã (OB) e Icatu Precoce (IP),
nas fases de desenvolvimento dos frutos (ovário-ov; chumbinho-ch;
expansão-ex; verde-v; verde cana-vc; cereja-c e endosperma-en). Peso
molecular (PM) de 100 pb. Fragmento com intensidade visual igual (=)...
65
13
Figura 23 - Amplificação por RT-PCR de transcritos do gene PAL pareado ao gene
controle Actina, nas cultivares Mundo Novo (MN), Catuaí Vermelho
(CV), Icatu Vermelho (IV), Obatã (OB) e Icatu Precoce (IP), nas fases
de desenvolvimento dos frutos (ovário-ov; chumbinho-ch; expansão-ex;
verde-v; verde cana-vc; cereja-c e endosperma-en). Peso molecular
(PM) de 100 pb. Fragmento com intensidade visual igual (=)...................
67
Figura 24 – Quantificação da expressão do gene PAL nos frutos do cafeeiro em
expansão, verde e cereja na cultivar Mundo Novo (A) e na fase cereja
para as cultivares Mundo Novo, Catuaí, Icatu Vermelho, Obatã e Icatu
Precoce (B)................................................................................................
67
Figura 25 - Amplificação por RT-PCR de transcritos do gene CHS pareado ao gene
controle Actina, nas cultivares Mundo Novo (MN), Catuaí Vermelho
(CV), Icatu Vermelho (IV), Obatã (OB) e Icatu Precoce (IP), nas fases
de desenvolvimento dos frutos (ovário-ov; chumbinho-ch; expansão-ex;
verde-v; verde cana-vc; cereja-c e endosperma-en). Peso molecular
(PM) de 100 pb. Fragmento com intensidade visual igual (=) e maior (+).
69
Figura 26 - Amplificação por RT-PCR de transcritos do gene IFS pareado ao gene
controle Actina, nas cultivares Mundo Novo (MN), Catuaí Vermelho
(CV), Icatu Vermelho (IV), Obatã (OB) e Icatu Precoce (IP), nas fases
de desenvolvimento dos frutos (ovário-ov; chumbinho-ch; expansão-ex;
verde-v; verde cana-vc; cereja-c e endosperma-en). Peso molecular
(PM) de 100 pb. Fragmento com intensidade visual igual (=)...................
70
Figura 27 - Amplificação por RT-PCR de transcritos do gene AAT pareado ao gene
controle Actina, nas cultivares Mundo Novo (MN), Catuaí Vermelho
(CV), Icatu Vermelho (IV), Obatã (OB) e Icatu Precoce (IP), nas fases
de desenvolvimento dos frutos (ovário-ov; chumbinho-ch; expansão-ex;
verde-v; verde cana-vc; cereja-c e endosperma-en). Peso molecular
(PM) de 100 pb. Fragmento com intensidade visual igual (=) e menor (-).
71
14
Figura 28 - Amplificação por RT-PCR de transcritos do gene GLA pareado ao gene
controle Actina, nas cultivares Mundo Novo (MN), Catuaí Vermelho
(CV), Icatu Vermelho (IV), Obatã (OB) e Icatu Precoce (IP), nas fases
de desenvolvimento dos frutos (ovário-ov; chumbinho-ch; expansão-ex;
verde-v; verde cana-vc; cereja-c e endosperma-en). Peso molecular
(PM) de 100 pb. Fragmento com intensidade visual igual (=) e menor (-).
72
Figura 29 – Quantificação da expressão do gene GLA nos frutos do cafeeiro em
expansão, verde e cereja na cultivar Mundo Novo (A) e na fase cereja
para as cultivares Mundo Novo, Catuaí, Icatu Vermelho, Obatã e Icatu
Precoce (B)................................................................................................
73
Figura 30 - Amplificação por RT-PCR de transcritos do gene manB pareado ao
gene controle Actina, nas cultivares Mundo Novo (MN), Catuaí
Vermelho (CV), Icatu Vermelho (IV), Obatã (OB) e Icatu Precoce (IP),
nas fases de desenvolvimento dos frutos (ovário-ov; chumbinho-ch;
expansão-ex; verde-v; verde cana-vc; cereja-c e endosperma-en). Peso
molecular (PM) de 100 pb. Fragmento com intensidade visual igual (=) e
maior (+)....................................................................................................
74
Figura 31 - Amplificação por RT-PCR de transcritos do gene ACS pareado ao gene
controle Actina, nas cultivares Mundo Novo (MN), Catuaí Vermelho
(CV), Icatu Vermelho (IV), Obatã (OB) e Icatu Precoce (IP), nas fases
de desenvolvimento dos frutos (ovário-ov; chumbinho-ch; expansão-ex;
verde-v; verde cana-vc; cereja-c e endosperma-en). Peso molecular
(PM) de 100 pb. Fragmento com intensidade visual igual (=)...................
76
Figura 32 - Amplificação por RT-PCR de transcritos do gene ACO pareado ao gene
controle Actina, nas cultivares Mundo Novo (MN), Catuaí Vermelho
(CV), Icatu Vermelho (IV), Obatã (OB) e Icatu Precoce (IP), nas fases
de desenvolvimento dos frutos (ovário-ov; chumbinho-ch; expansão-ex;
verde-v; verde cana-vc; cereja-c e endosperma-en). Peso molecular
(PM) de 100 pb. Fragmento com intensidade visual igual (=)...................
77
15
Figura 33 - Amplificação por RT-PCR de transcritos do gene ERF pareado ao gene
controle Actina, nas cultivares Mundo Novo (MN), Catuaí Vermelho
(CV), Icatu Vermelho (IV), Obatã (OB) e Icatu Precoce (IP), nas fases
de desenvolvimento dos frutos (ovário-ov; chumbinho-ch; expansão-ex;
verde-v; verde cana-vc; cereja-c e endosperma-en). Peso molecular
(PM) de 100 pb. Fragmento com intensidade visual igual (=) e maior (+).
78
Figura 34 - Amplificação por RT-PCR de transcritos do gene ETR pareado ao gene
controle Actina, nas cultivares Mundo Novo (MN), Catuaí Vermelho
(CV), Icatu Vermelho (IV), Obatã (OB) e Icatu Precoce (IP), nas fases
de desenvolvimento dos frutos (ovário-ov; chumbinho-ch; expansão-ex;
verde-v; verde cana-vc; cereja-c e endosperma-en). Peso molecular
(PM) de 100 pb. Fragmento com intensidade visual igual (=)...................
79
Figura 35 – Quantificação da expressão do gene ETR nos frutos do cafeeiro em
expansão, verde e cereja na cultivar Mundo Novo (A) e na fase cereja
para as cultivares Mundo Novo, Catuaí, Icatu Vermelho, Obatã e Icatu
Precoce (B)................................................................................................
80
Figura 36 - Amplificação por RT-PCR de transcritos do gene GR pareado ao gene
controle Actina, nas cultivares Mundo Novo (MN), Catuaí Vermelho
(CV), Icatu Vermelho (IV), Obatã (OB) e Icatu Precoce (IP), nas fases
de desenvolvimento dos frutos (ovário-ov; chumbinho-ch; expansão-ex;
verde-v; verde cana-vc; cereja-c e endosperma-en). Peso molecular
(PM) de 100 pb. Fragmento com intensidade visual igual (=)...................
81
Figura 37 - Amplificação por RT-PCR de transcritos do gene DH pareado ao gene
controle Actina, nas cultivares Mundo Novo (MN), Catuaí Vermelho
(CV), Icatu Vermelho (IV), Obatã (OB) e Icatu Precoce (IP), nas fases
de desenvolvimento dos frutos (ovário-ov; chumbinho-ch; expansão-ex;
verde-v; verde cana-vc; cereja-c e endosperma-en). Peso molecular
(PM) de 100 pb. Fragmento com intensidade visual igual (=)...................
82
16
Figura 38 - Amplificação por RT-PCR de transcritos do gene ER5 pareado ao gene
controle Actina, nas cultivares Mundo Novo (MN), Catuaí Vermelho
(CV), Icatu Vermelho (IV), Obatã (OB) e Icatu Precoce (IP), nas fases
de desenvolvimento dos frutos (ovário-ov; chumbinho-ch; expansão-ex;
verde-v; verde cana-vc; cereja-c e endosperma-en). Peso molecular
(PM) de 100 pb. Fragmento com intensidade visual igual (=)...................
83
Figura 39 - Amplificação por RT-PCR de transcritos do gene csp1 pareado ao gene
controle Actina, nas cultivares Mundo Novo (MN), Catuaí Vermelho
(CV), Icatu Vermelho (IV), Obatã (OB) e Icatu Precoce (IP), nas fases
de desenvolvimento dos frutos (ovário-ov; chumbinho-ch; expansão-ex;
verde-v; verde cana-vc; cereja-c e endosperma-en). Peso molecular
(PM) de 100 pb. Fragmento com intensidade visual igual (=) e menor (-)
84
Figura 40 - Amplificação por RT-PCR de transcritos do gene ICL pareado ao gene
controle Actina, nas cultivares Mundo Novo (MN), Catuaí Vermelho
(CV), Icatu Vermelho (IV), Obatã (OB) e Icatu Precoce (IP), nas fases
de desenvolvimento dos frutos (ovário-ov; chumbinho-ch; expansão-ex;
verde-v; verde cana-vc; cereja-c e endosperma-en). Peso molecular
(PM) de 100 pb. Fragmento com intensidade visual igual (=) e maior (+).
86
Figura 41 – Quantificação da expressão do gene ICL nos frutos do cafeeiro em
expansão, verde e cereja na cultivar Mundo Novo (A) e na fase cereja
para as cultivares Mundo Novo, Catuaí, Icatu Vermelho, Obatã e Icatu
Precoce (B)................................................................................................
87
17
LISTA DE ABREVIATURAS
cDNA DNA complementar
CTAB Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide
DEPC dietil pirocarbonato
dNTP dioxiribonucleotídeo trifosfato
EDTA etilenodiamina tetra acetato dissódico
EST seqüências expressas (“Expressed Sequence Tag”)
HCl hidróxido de cloro
IPTG Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside
KCl cloreto de potássio
LB Luria-Bertani
LiCl cloreto de lítio
MgCl
2
cloreto de magnésio
MOPS ácido 3-morfolino-propanossulfônico
PCR reação de polimerase em cadeia
PVP polivinilpirrolidona
Tris Tris(hidroximetil)aminometano
RT-PCR Transcriptase reversa por reação de polimerase em cadeia
X–Gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-Dgalactoside
18
1 INTRODUÇÃO
O gênero Coffea L. possui aproximadamente 100 espécies, cujo centro de
origem é o Continente Africano. Apenas as espécies Coffea arabica L. (café arábica) e
Coffea canephora Pierre (café robusta ou conilon) são cultivadas comercialmente. As
demais espécies são importantes em programas de melhoramento genético vegetal, por
serem fontes de variabilidade genética, principalmente para resistência aos fatores
bióticos e abióticos.
Os frutos da espécie C. arabica são os mais consumidos, devido as suas
características organolépticas que são preferidas pelos consumidores do que da
espécie C. canephora. Dessa maneira, aproximadamente 70% dos grãos de café
comercializados são do tipo arábica e 30% restantes de café robusta.
O Brasil é o maior produtor mundial de café, com uma produção anual (safra
2006/2007) da ordem de 40,6 milhões de sacas. Minas Gerais é o principal Estado
produtor de cafeeiro arábica e o Espírito Santo o maior produtor de café robusta. O
Estado de São Paulo ocupa a terceira posição 10% da produção nacional.
As plantas da espécie C. arabica são alotetraplóides (2n = 44 cromossomos),
autofértil e se reproduzem por autofecundação. Essa espécie possui grande número de
cultivares disponíveis no mercado, apesar da diversidade genética ser relativamente
pequena. Isso se deve ao fato de serem plantas autógamas e, também, por terem sido
introduzidos poucos representantes da espécie no Brasil.
O ciclo fenológico do cafeeiro é composto pelas fases vegetativa e reprodutiva. A
fase reprodutiva se caracteriza por apresentar várias floradas uma principal, seguida de
outras, cujo número varia de um ano para outro, de acordo com a variação climática, da
variabilidade genética e de questões relacionadas ao manejo. Esse comportamento do
cafeeiro provoca a desuniformidade da maturação, o que ocorre também dentro de uma
mesma florada. A diferença de maturação traz inconvenientes à colheita, além de
prejudicar a qualidade final da bebida.
Dessa maneira, o conhecimento do comportamento de cultivares em relação ao
seu ciclo e a uniformidade de maturação é essencial para fornecer subsídios aos estudos
de melhoramento genético para características agronômicas como a uniformidade de
19
maturação dos frutos e a duração do ciclo (precoce, média e tardia). Para isso, devem
ser estudas safras consecutivas, submetidas a condições climáticas distintas, bem
como os genes envolvidos no crescimento e maturação dos frutos de café. Entretanto, são
poucos os trabalhos que identificam os genes expressos nos diferentes estádios de
desenvolvimento dos frutos do cafeeiro, o que já acontece com outras culturas.
As características relacionadas á frutificação do cafeeiro são altamente
influenciadas pelo ambiente dessa maneira, torna-se necessária à associação de
estudos genéticos e comportamentais da planta. Portanto, as análises genômicas
associadas com as análises agronômicas e fenológicas para a caracterização do
padrão genético de crescimento e maturação dos frutos do cafeeiro, servirão como
base para o delineamento de programas de melhoramento, com vistas à obtenção de
plantas com maior uniformidade de maturação e características de bebidas específicas.
Essa pesquisa foi realizada com os seguintes objetivos: (i) estabelecer padrões
agronômicos e fenológicos comparativos do desenvolvimento de frutos do cafeeiro
entre diferentes cultivares e safras, (ii) identificar genes com expressão diferencial
durante o desenvolvimento dos frutos entre as cultivares e as safras; (iii) quantificar a
expressão de genes-chave durante as fases fenológicas do cafeeiro, (iv) correlacionar
genes diferencialmente expressos durante o crescimento e a maturação dos frutos com
as características fenológicas e agronômicas e (v) identificar genes para servir como
marcadores de fases de desenvolvimento dos frutos do cafeeiro arábica.
20
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 Importância econômica do café no Brasil
O Brasil domina o mercado internacional de café, com produção anual (safra
2005/2006) da ordem de 40,6 milhões de sacas, das quais 31,0 milhões são de cafeeiro
arábica (76,4%) e 9,6 milhões, de robusta (23,6%). A área cultivada com café no Brasil
é de 2,30 milhões de hectares, dos quais 2,1 milhões estão em produção e 165,8 mil
hectares em formação (CONAB, 2007). O setor responde por, aproximadamente, 2
milhões de empregos diretos, o que justifica sua importância sócio-econômica.
Os principais Estados produtores são: Minas Gerais com 49,5% da produção do
País, das quais 99,9% são grãos de cafeeiro arábica e o Espírito Santo em segundo
lugar (21,3%), em que somente 2,2 milhões são grãos de arábica (quarto lugar entre
estados produtores) e 6,5 milhões de grãos robusta (primeiro lugar entre os Estados
produtores) e, em terceiro lugar aparece São Paulo, que produz apenas café arábica,
com 10,8% da produção nacional (CONAB, 2007).
A expansão cafeeira no país foi possível graças às condições de solo e clima,
bem como à diversificação de materiais genéticos pela seleção de cultivares altamente
produtivas e adaptadas às diversas condições. O Brasil possui hoje 103 cultivares de C.
arabica e 10 cultivares de C. canephora registradas no Ministério da Agricultura e do
Abastecimento, único país no mundo a cultivar duas espécies em escala comercial.
2.2 O cafeeiro: origem, classificação botânica e biologia da reprodução
O cafeeiro pertence à família Rubiaceae, tribo Coffeeae e gênero Coffea, o qual
possui 103 espécies cujo Centro de Origem é na África, assim distribuídas: África
Continental (41 espécies), Ilha de Madagascar (59 espécies) e Ilha de Mascarenhas (3
espécies) (BRIDSON; VERDCOURT, 1988; DAVIS et al., 2006). Recentes estudos
moleculares e morfológicos identificaram 10 gêneros da tribo Coffeeae além do gênero
Coffea: Argocoffeopsis, Belonophora, Calycosiphonia, Diplospora, Discospermum,
Nostolachma, Psilanthus, Tricalysia, Sericanthe e Xantonnea Pierre ex Pit. (DAVIS et
al., 2006)
21
A espécie Coffea arabica é originária da Etiópia, Sudão e Quênia, e a espécie
Coffea canephora oriunda de regiões tropicais e subtropicais da África (CHEVALIER,
1947; CHARRIER, 1978; DAVIS et al., 2006). As demais espécies são provenientes das
Ilhas de Madagascar e Mascarenhas (BRIDSON, 1982; BRIDSON, 1987; BRIDSON,
1994; BRIDSON; VERDCOURT, 1988; DAVIS et al., 2006). Dentre essas espécies,
apenas C. arabica L. e C. canephora Pierre são utilizadas comercialmente, enquanto as
demais são importantes em programas de melhoramento, por serem fontes de
variabilidade genética, principalmente para a tolerância a fatores bióticos e abióticos.
A espécie C. canephora é diplóide com 2n = 22 cromossomos, possui auto-
incompatibilidade do tipo gametofítica (CONAGIN; MENDES, 1961), o que a torna
alógama, reproduzindo-se por fecundação cruzada. A espécie C. arabica é a única
tetraplóide (2n = 44 cromossomos) e multiplica-se, predominantemente, por
autofecundação, em que a fecundação cruzada varia a uma taxa média da ordem de
10% (CARVALHO; MÔNACO, 1962), em razão das condições climáticas e da ação de
polinizadores.
Estudos recentes sugerem que C. arabica seja um alotetraplóide formado pela
hibridação entre C. eugenioides e C. canephora, ambas diplóides e que sofreram
duplicação após o cruzamento (LASHERMES et al., 1999). Isso explicaria a baixa
divergência genética encontrada entre C. arabica e as espécies de origem.
No Brasil, encontra-se um dos principais bancos de germoplasma ativos de
Coffea, localizado no Centro de Café “Alcides Carvalho” do Instituto Agronômico na
cidade de Campinas, possuindo 16 espécies, centenas de híbridos intra e
interespecíficos, introduções da Etiópia, mutantes e variedades comerciais, e ainda três
espécies do gênero Psilanthus (EIRA et al., 2007).
2.3 Cultivares de Coffea arabica
A diversificação dos materiais genéticos aconteceu em resposta às diferenças
das condições edafoclimáticas das regiões produtoras. Dessa maneira, o Instituto
Agronômico (IAC), na cidade de Campinas, iniciou em 1932, um programa de
melhoramento do cafeeiro, responsável pelo lançamento de muitas variedades
cultivadas (CARVALHO; FAZUOLI, 1993).
22
No início, o objetivo era selecionar progênies de maior produtividade, depois
direcionou para redução de custos de produção, a partir da obtenção de plantas de
porte baixo e ou tolerantes a doenças, pragas e nematóides. Atualmente, os objetivos
do melhoramento do cafeeiro, além dos citados anteriormente são: qualidade do
produto, uniformidade de maturação, agregação de valor por meio de materiais com
baixo teor de cafeína, bem como tolerância a fatores abióticos como, por exemplo, ao
estresse hídrico (CARVALHO; FAZUOLI, 1993).
Das 103 cultivares de C. arabica, registradas no Ministério da Agricultura e
Abastecimento, 90% foram desenvolvidas pelo IAC, com destaque para as cultivares:
Mundo Novo, Catuaí, Icatu e Obatã.
A cultivar Mundo Novo é uma das mais plantadas no Brasil, devido à sua
rusticidade, elevada produção e boa qualidade de bebida. Essa cultivar é oriunda de
cruzamento natural, provavelmente, entre as cultivares Sumatra e Bourbon Vermelho,
ambas as espécies de C. arabica. As plantas selecionadas passaram por seleções para
solucionar alguns defeitos, como: plantas muito alta e pouco produtiva e frutos
desprovidos de uma ou das duas sementes (CARVALHO; FAZUOLI, 1993).
As cultivares Catuaí Vermelho e Catuaí Amarelo foram obtidas pela hibridação
entre cultivares de C. arabica, Caturra Amarelo e Mundo Novo, selecionadas por serem
plantas vigorosas e com boa produtividade. Os cruzamentos deram origem às plantas
de frutos amarelos e vermelhos, bastante produtivas, vigorosas e de porte baixo, o que
torna a colheita bem mais econômica (CARVALHO; FAZUOLI, 1993).
A cultivar Icatu é derivada do cruzamento interespecífico entre uma planta
tetraplóide da cultivar Robusta (C. canephora) e uma de Bourbon Vermelho (C.
arabica). Objetivou transferir as características de tolerância à ferrugem, produtividade e
pericarpo menos espesso, da cultivar de C. canephora, para cultivar de C. arabica.
Após o cruzamento, vários retrocruzamentos foram feitos com Mundo Novo, para que
as características da espécie C. arabica fossem restauradas, originando a cultivar Icatu
Vermelho. Outros retrocruzamentos foram feitos com a cultivar Bourbon Amarelo, cujo
resultado foi a seleção do Icatu Amarelo e Icatu Precoce (CARVALHO; FAZUOLI,
1993).
23
Uma das últimas cultivares lançadas pelo programa de melhoramento do IAC foi
a Obatã, derivada do cruzamento de Vila Sarchi (C. arabica) com o Híbrido de Timor
(cruzamento natural entre C. arabica cv. Típica e C. canephora) e, posterior,
cruzamento natural com Catuaí Vermelho. Essa cultivar apresenta elevada resistência à
ferrugem, porte baixo, internódios curtos, folhas largas, frutos grandes e vermelhos com
maturação tardia e boa qualidade de bebida (FAZUOLI et al., 2002).
2.4 Fenologia do cafeeiro
A fenologia compreende o estudo de eventos periódicos da vida da planta em
função da sua reação às condições do ambiente, como por exemplo, manejo cultural,
temperatura, precipitação e fertilidade do solo.
O ciclo fenológico do cafeeiro apresenta duas fases, as quais ocorrem
simultaneamente: vegetativa e reprodutiva. Em razão disso, as plantas demora dois
anos para completar o ciclo, o que não ocorre com a maioria das plantas, que florescem
e frutificam no mesmo ano fenológico. Esse acontecimento é chamado de bienalidade,
que Camargo e Camargo (2001) descrevem como a sucessão dessas fases (vegetativa
e reprodutiva) em cafeeiros arábica, nas condições climáticas do Brasil (Figura 1).
Figura 1 – Esquematização das seis fases fenológicas do cafeeiro arábica, durante 24
meses, nas condições climáticas tropicais do Brasil, extraído de Camargo e
Camargo (2001)
24
O ciclo fenológico foi subdividido em seis fases distintas: (1) vegetação e
formação das gemas foliares; (2) indução e maturação das gemas florais; (3) florada;
(4) granação dos frutos; (5) maturação dos frutos e (6) repouso e senescência dos
ramos terciários e quaternários.
No primeiro ano são formados os ramos vegetativos, com gemas axilares nos
nós, que depois são induzidas e se transformam em gemas reprodutivas (GOUVEIA,
1984). Esse processo é determinado por condições ambientais como a interação entre
a redução do fotoperíodo e temperaturas amenas (CAMARGO, 1985; CAMARGO;
CAMARGO, 2001; CAMAYO-VELEZ et al., 2003; RENA; MAESTRI, 1987).
Após a indução, a gema floral amadurece, entram em dormência e se torna apta
à antese, que ocorre, principalmente, após chuva ou irrigação (RENA; MAESTRI, 1987).
O segundo ano fenológico inicia-se com a florada, seguida pela formação dos
frutos, compreendida pelas fases de crescimento: chumbinhos, expansão e granação,
seguida pela fase de maturação. O estresse hídrico durante as fases de crescimento
dos frutos afeta a granação e resulta em frutos pequenos (peneira baixa), bem como
poderá formar frutos chochos (frutos desprovidos de uma ou das duas sementes). Na
maturação dos frutos, a ocorrência de deficiências hídricas moderadas poderá
beneficiar a qualidade da bebida (CAMARGO; CAMARGO, 2001).
A fase reprodutiva é detalhada por Pezzopane et al. (2003) em que utiliza escala
para a avaliação fenológica do cafeeiro arábica, por meio de imagens das fases que
variam de 0 a 11, como: gema floral dormente (0); gema floral entumecida (1); botão
floral abotoada (2); florada ou antese (3); pós-florada com queda de pétalas (4); fruto
”chumbinho”, no início do crescimento após a fecundação (5); frutos em expansão (6);
grão verde, com formação do endosperma e granação dos frutos (7); grão verde cana,
corresponde ao início da maturação devido à mudança de cor (8); fruto cereja
completou a maturação (9); fruto passa - início da senescência (10); e fruto seco (11)
(Figura 2).
25
Figura 2 - Escala de notas para o desenvolvimento fenológico do cafeeiro, extraído de
Pezzopane et al. (2003)
26
Durante a fase reprodutiva, as etapas podem ocorrer mais de uma vez, ou seja, o
cafeeiro arabica, além da florada principal, apresenta sucessivas floradas em razão da
variação climática, da variabilidade genética (RENA; MAESTRI, 1987) e, em razão do
manejo, como: a irrigação (RIBEIRO et al., 2004; MATIELLO; GARCIA, 2006) e
arborização (LUNZ, 2006). Esse acontecimento faz com que a maturação seja desigual
inclusive dentro da mesma florada. A diferença de maturação entre e dentro das floradas
dificulta a colheita, tornando-a onerosa e prejudicial à qualidade da bebida, pois se não
houver a separação dos frutos, com diferentes estádios de maturação, antes da secagem,
o produto final apresentará defeitos.
2.5 Desenvolvimento dos frutos do cafeeiro
O desenvolvimento de um fruto compreende uma série de eventos desde o início
do crescimento até a sua morte, cujas fases são: crescimento, maturação,
amadurecimento e senescência. O crescimento é responsável pelo aumento de
tamanho do fruto. A maturação resulta na maturidade fisiológica, quando o fruto
continua seu desenvolvimento mesmo que separado da planta. Durante o
amadurecimento ocorre uma série de processos que resultam em características
estéticas e de qualidade, evidenciadas por mudanças na composição, coloração,
textura, sabor e aroma. A senescência se caracteriza por uma série de eventos que
provoca a morte celular (CASTRO et al., 2005; NATCHTIGAL et al., 1997).
O fruto do cafeeiro é uma drupa com duas lojas de polinização independente as
quais originam duas sementes. Os frutos maduros são formados pelo exocarpo (casca),
responsável pela expressão da coloração do fruto do café durante o desenvolvimento;
mesocarpo (polpa ou mucilagem), rico em açúcar e água. Durante a maturação o açúcar
diminui, provavelmente, devido a modificações da pectina; endocarpo (pergaminho),
tecido duro e lignificado; película prateada (testa ou resto de tegumento) e o endosperma
(tecido triplóide que contém as reservas para consumo do embrião). O embrião encontra-
se inserido no endosperma. (ANTUNES FILHO; CARVALHO, 1954; COSTE, 1959; DE
CASTRO; MARRACCINI, 2006). Juntos, o exocarpo, mesocarpo e endocarpo constituem
o pericarpo.
27
O desenvolvimento dos frutos de café é um processo longo, que pode variar de 6
a 8 meses para as cultivares de C. arabica e 9 a 11 meses para as cultivares C.
canephora. Após a fecundação ocorre o desenvolvimento do perisperma (fase
maternal), caracterizado pela divisão e elongação das suas células (perisperma) e pelo
início da divisão das células do endosperma. Essas fases correspondem aos frutos
chumbinho e em expansão, e na seqüência há o desenvolvimento do endosperma, com
a elongação das células deste tecido (endosperma). Nessa fase, chamada de grão
verde, o perisperma desaparece gradualmente, substituído pelo endosperma.
Finalmente, ocorre a fase de maturação do pericarpo (fases verde-cana e cereja), em
que se verifica o endurecimento do endosperma e a alteração da cor do pericarpo, pelo
acúmulo gradual de proteínas de reserva, sacarose e polissacarídeos complexos, as
quais são as principais reservas da semente, além da degradação da clorofila e
produção de pigmentos (DE CASTRO; MARRACCINI, 2006; PEZZOPANE et al., 2003).
Em relação à fisiologia da maturação dos frutos de cafeeiro, Pereira et al. (2005)
observaram que nos frutos verde-cana há um rápido crescimento na produção de
etileno, que decresce nos frutos cereja, o que indica serem os frutos climatéricos. Tais
frutos são aqueles em que a maturação é acompanhada por um aumento na respiração
e na produção de etileno (CASTRO et al., 2005; TAIZ; ZEIGER, 2004).
As modificações bioquímicas que levam à maturação de frutos climatéricos
incluem o aumento na atividade de enzimas responsáveis pela biossíntese de etileno,
SAM sintase (S-Adenosil-mationina), ACC sintase (ácido 1-carboxílico 1-amino
ciclopropano) e ACC oxidase, assim como a degradação da parede celular, o acúmulo
de pigmentos, a formação de aroma e de metabólicos secundários (CASTRO et al.,
2005).
A giberelina, o ácido abscísico, a auxina e a citocinina também estão
relacionadas com o processo de maturação. Durante esse processo há diminuição da
concentração de giberelina e aumento de ácido abscísico e a presença de auxina
retarda a maturação, enquanto que o aumento de citocinina antecipa o processo
(CASTRO et al., 2005; TAIZ; ZEIGER, 2004).
28
2.6 Expressão gênica diferencial no desenvolvimento dos frutos de café
Durante o processo de crescimento, maturação e amadurecimento dos frutos de
cafeeiro, vários genes são ativados como aqueles relacionados com a síntese de fenóis,
oligossacarídeos, lipídeos, trigonelina, ácidos clorogênicos, ácidos alifáticos, cafeína,
polissacarídeos, aminoácidos, proteínas e ácidos húmicos (CLARKE; MACRAE, 1985). O
conhecimento sobre a expressão desses genes é essencial como subsídio aos estudos de
melhoramento de características agronômicas importantes, tais como: uniformidade de
maturação e duração do ciclo fenológico. Entretanto, ainda faltam estudos que identifiquem
e caracterizem esses genes diferencialmente expressos, a exemplo da cultura de tomate.
O crescimento, maturação e amadurecimento de frutos são influenciados por fatores
internos e externos, que incluem regulação da expressão gênica, hormônios, luz e
temperatura. Os estudos de expressão gênica estão contribuindo para muitas descobertas
e esclarecimento de inúmeras dúvidas.
Em tomateiro (Lycopersicum esculentum), muitos trabalhos foram realizados
durante o desenvolvimento dos frutos, o que possibilitou caracterizar a expressão
diferencial dos genes relacionados a esse processo. Os principais genes estudados
relacionam ao etileno, incluindo os da via biossintética, os precursores e os fatores de
transcrição relacionados a esse hormônio (MOORE et al., 2002; FEI et al., 2004; ADAMS-
PHILLIPS et al., 2004; ALBA et al., 2005).
Utilizando-se microarranjos de cDNA foram identificados 869 genes com expressão
diferencial durante o desenvolvimento dos frutos de tomateiro. Esses genes são
dependentes do etileno e incluem receptores, fatores de transcrição, pigmentos, proteínas
de reserva, açúcares, ácidos orgânicos, antioxidantes, compostos voláteis, entre outros
(ALBA et al., 2005). Estudando-se mutantes pelas técnicas de Northern-blot e
microarranjos, Moore et al. (2002) identificaram cDNAs diferenciais para 10 estádios de
maturação.
Em cafeeiro, algumas pesquisas foram feitas como, por exemplo, a
caracterização da expressão dos genes de maturação (PEREIRA et al., 2005). No
entanto, ainda são poucos, e predomina trabalhos relacionados com genes envolvidos
na via biossintética da cafeína e dos ácidos clorogênicos.
29
A cafeína sintase, a teobromina sintase e a metilxantosina sintase são as
enzimas da via biossintética da cafeína e os estudos dos genes correspondentes
evidenciaram que os mesmos são expressos em diferentes tecidos da planta como:
folhas, flores e, principalmente, nos frutos, mesmo quando imaturos (ASHIHARA;
CROZIER, 1999; MIZUNO et al., 2003). Lin et al. (2005), utilizando as técnicas RT-PCR
e Northern-blot também realizaram estudos que evidenciaram a participação dos genes
da via biossintética da cafeína em diferentes tecidos das plantas como endosperma e
folhas jovens. Os genes da teobromina sintase e da cafeína sintase expressam em
frutos imaturos e, a teobromina sintase também apresentou transcritos em frutos
verdes. Os pesquisadores observaram que não houve expressão de metilxantosina,
teobromina e cafeína sintase em frutos maduros.
A via biossintética dos ácidos clorogênicos em café envolve as seguintes
enzimas: PAL (phenilalanina amônia liase); C4H (cinamato 4-hidroxilase); C3H
(coumarato 3-hidroxilase); 4CL (hidroxicinamoil-CoA ligase) e CQT (hidroxicinamoil-
CoA:D-quinato hidroxicinamoil transferase) (CLARKE; MACRAE, 1985). Em estudos de
análise de expressão por RT-PCR realizados por Melo (2005), o autor observou que a
expressão dessas enzimas reduzia à medida que o tecido do fruto envelhecia. No
endosperma foi verificado um decréscimo acentuado de expressão no final da
maturação dos frutos. Os ácidos clorogênicos estão envolvidos nos processos de
maturação dos frutos, qualidade do produto e na defesa das plantas contra os
patógenos (CLARKE; MACRAE, 1985).
As enzimas
α
-galactosidase e
β
-mannanase, precursoras de açúcares, são
abundantes nos grãos de frutos de café maduro, por esse motivo são muito estudadas.
Marraccini et al. (2001) utilizando a técnica de Northern-blot, identificou que o gene
responsável pela síntese de
α
-galactosidase é mais expresso no endosperma, e o gene
que codifica a
β
-mannanase é expresso, principalmente, durante a germinação dos
grãos. Ainda nesse estudo, os autores identificaram que o gene csp1, que codifica a
proteína de reserva 11S, é abundante no endosperma, principalmente durante a
maturação.
A sucrose sintase (SUS) é considerada precursora da qualidade da bebida do
café e o gene responsável pela síntese desse açúcar também é bastante estudado.
30
Utilizando-se análises de quantificação da expressão gênica (Northern-blot) e frutos de
cafeeiro em diferentes estádios de desenvolvimento, foi observado que a máxima
expressão do gene SUS ocorre nas fases finais de desenvolvimento do endosperma
(GEROMEL et al., 2006), o que comprova sua importância na maturação dos frutos.
O etileno é o principal hormônio produzido na maturação, cujos precursores são
as enzimas ACC oxidase e ACC sintase. Pereira et al. (2005) observaram pela técnica
de Northern-blot que os frutos verdes de café apresentavam menor acúmulo de
transcritos de ACC oxidase, com aumento a partir dos frutos verde-cana e mantendo-se
em frutos no estádio cereja. Essa observação indica que o cafeeiro é uma planta
climatérica, devido ao aumento da produção de etileno no início da maturação.
A expressão do gene que codifica a proteína isocitrato liase foi estudada em
sementes de cafeeiro frescas e durante a secagem, utilizando-se a técnica RT-PCR
com oligonucleotídeos específicos (SELMAR et al., 2001). Esses autores observaram
uma quantidade maior de transcritos em sementes de cafeeiro durante a secagem e
baixa expressão em sementes frescas. Tal constatação sugere que essa enzima é
indicadora de germinação e também está relacionada à qualidade da bebida, pois
quando há maior expressão observou bebida superior.
Análises in silico mostram que o genoma do café apresenta grande similaridade
com o genoma do tomateiro, mesmo sendo o cafeeiro da família Rubiaceae e o
tomateiro da família Solanaceae (LIN et al., 2005). Esses resultados evidenciam a
possibilidade de usar genes já identificados nessa planta, como modelo de estudo para
cafeeiro, uma vez que as pesquisas em tomateiro estão mais avançadas
comparativamente.
2.7 Melhoramento do cafeeiro e o genoma do café
Por se tratar de uma cultura perene e de período juvenil longo, o melhoramento
genético do cafeeiro é muito demorado, o que demanda a implementação de técnicas que
facilitem e acelerem a obtenção, seleção e avaliação de novos materiais (FAZUOLI et al.,
1999). Entre estas técnicas, as mais promissoras são as metodologias da Biologia
Molecular e da Engenharia Genética. A aplicação dessas técnicas, no entanto, só foi
possível após o programa Genoma do Café, que proporcionou melhor conhecimento
31
molecular dos genes do cafeeiro (VIEIRA et al., 2006). Com isso, pode se incluir a
engenharia genética como estratégia de melhoramento (CAIXETA et al., 2003).
No projeto Genoma do Café foram seqüenciados genes transcritos, os ESTs
(expressed sequence tags) das espécies C. arabica, C. canephora e C. racemosa, de
onde foram obtidos diversos tecidos sadios em diferentes estádios de desenvolvimento
(calos, folhas, raízes, flores e frutos) e submetidos a estresse biótico e abiótico (pragas,
doenças, frio, calor e seca) (CAIXETA et al., 2003; VIEIRA et al., 2006). No total, foram
seqüenciados 214.964 clones de 37 bibliotecas de cDNA. Os ESTs foram agrupados
em 17.982 contigs e 32.155 singletons, resultando na identificação de cerca de 33.000
unigenes diferentes (VIEIRA et al., 2006).
O projeto genoma do café gerou informações com o objetivo de que as mesmas
fossem utilizadas na: (i) obtenção de cultivar melhorada por meio de novos marcadores
moleculares, desenvolvidos a partir de seqüências obtidas; (ii) de plantas selecionadas,
com características agronômicas desejáveis, com menor custo e tempo; (iii) para
identificar genes relacionados com tolerância às adversidades ambientais; (iv) identificar
genes envolvidos com o crescimento e desenvolvimento, como: florescimento e a
tolerância a insetos-praga, doenças e nematóides; (v) identificar e estudar a interação
de genes e proteínas envolvidas na produção de cafeína, ácidos clorogênicos,
carboidratos, aroma e sabor, uma vez que estas (aroma e sabor) são qualidades
organolépticas relacionadas à qualidade da bebida; (vi) estudar a evolução e a
diversidade de genomas do gênero Coffea; (vii) estudar a fisiologia e a genética da
multiplicação de cultivares híbridos melhorados e (viii) desenvolver mapas físicos e
genéticos do cafeeiro (CAIXETA et al., 2003).
32
3 MATERIAL E MÉTODOS
O trabalho experimental foi realizado em duas safras consecutivas, 2004/2005 e
2005/2006, no Centro de Café “Alcides Carvalho” do Instituto Agronômico (IAC), situado
no Centro Experimental da Fazenda Santa Elisa, município de Campinas, Estado de
São Paulo. A área experimental está localizada a 22° 54'S de latitude, 47°05'W de
longitude e 674 m de altitude, com clima tipo Cwa (clima subtropical, com inverno seco
e verão úmido e quente), conforme classificação de Köppen (SETZER, 1966).
Esta pesquisa foi realizada num campo de cultivares de cafeeiro arábica,
implantado em 2000 com espaçamento de 3,5 m x 0,8 m e 3.570 plantas por hectare. A
área experimental é formada por 20 cultivares (10 cv. porte baixo e 10 cv. porte alto),
em que cada cultivar é representada por duas linhas de plantas com 40 cafeeiros por
linha.
Na safra 2004/2005 foram utilizadas, na pesquisa, as seguintes cultivares:
Mundo Novo IAC 388-17 (MN), Catuaí Vermelho IAC 144 (CV), Icatu Vermelho IAC
4045 (IV) e Obatã IAC 1669-20 (OB); e no ano agrícola 2005/2006, além daquelas da
safra anterior acrescentou a cultivar Icatu Precoce IAC 3282 (IP).
As atividades experimentais compreenderam os estudos de avaliações de
atributos fenológicos, agronômicos e expressão gênica das cultivares de cafeeiro
arábica, em relação ao desenvolvimento dos frutos.
3.1 Avaliações fenológicas e agronômicas
As avaliações fenológicas e agronômicas foram realizadas nas plantas de cada
parcela constituída por quatro cafeeiros e quatro repetições.
3.1.1 Avaliações fenológicas
O desenvolvimento fenológico do cafeeiro envolve as fases vegetativa e reprodutiva,
em que, além da florada principal ocorre, com freqüência, outras floradas, em razão do
ambiente, da constituição genética da planta e do manejo da lavoura.
33
3.1.1.1 Desenvolvimento fenológico
Durante o período de junho de 2004 a junho de 2006 foram realizadas avaliações do
desenvolvimento fenológico das diferentes cultivares de cafeeiro utilizadas no estudo.
As avaliações foram feitas utilizando uma escala fenológica proposta por
Pezzopane et al. (2003), em que identifica 12 estádios fenológicos, principalmente para
o período reprodutivo (após o repouso das gemas), pela atribuição de valores: (0) gema
dormente; (1) gema entumecida; (2) abotoado; (3) Florada; (4) pós-florada (5) frutos
chumbinho; (6) frutos em expansão; (7) fruto verde; (8) fruto verde-cana; (9) fruto
cereja; (10) fruto passa; (11) fruto seco (Figura 2).
Nas plantas de cada cultivar foi marcado um ramo com orientação norte, no terço
médio superior da planta, para cada uma das principais floradas que ocorreram no ano.
Nos ramos marcados foram retiradas as flores das floradas subseqüentes e os
frutos chumbinho de floradas anteriores. Na seqüência, atribuiu-se notas relativas ao
desenvolvimento fenológico em todos os ramos marcados, com intervalos de 7 a 10
dias, admitindo o estádio atual de desenvolvimento àquele com freqüência superior a
50% no ramo.
3.1.1.2 Porcentagem de frutos maduros na colheita
Para todas as cultivares de cada parcela e ano agrícola, no momento da colheita,
obteve-se a massa de frutos verde, verde cana, cereja, passa e seco em amostra de,
aproximadamente, 500 gramas (Figura 3). O resultado final foi expresso em
porcentagem, obtida pela relação entre a massa de frutos de cada fase de maturação e
a amostra total de frutos.
34
Figura 3 - Fases de maturação de frutos de café identificadas na colheita: verde, verde-
cana, cereja, passa e seco
3.1.2 Avaliações agronômicas
No final das safras 2004/2005 e 2005/2006 foram feitas avaliações de índices de
produção, como: (i) produção, (ii) rendimento, (iii) tipos de sementes e (iv) tamanho de
grãos nas parcelas experimentais das cultivares de cafeeiro.
3.1.2.1 Produção e rendimento
Ao final de cada safra, quando as plantas apresentaram a maior parte dos frutos
no estádio cereja, foi realizada a colheita das parcelas experimentais.
Após a colheita por derriça obteve-se a produção de “café da roça” (mistura de
frutos com diferentes níveis de maturação, sem nenhuma separação), utilizando uma
balança de precisão.
De cada repetição foram separadas amostras de 3 kg e acondicionadas em
sacos de nylon, permanecendo sob secagem natural em terreiro até a umidade de 110
g kg
-1
de frutos e, posteriormente, obteve-se a produção de café em coco.
As amostras de café em coco foram processadas em máquinas de
beneficiamento, obtendo-se a massa de café beneficiado. A partir desses dados foi
determinado o rendimento por meio da relação entre a massa dos grãos beneficiados e
a massa da produção em coco e expresso em porcentagem.
35
3.1.2.2 Tipos de sementes
O fruto do cafeeiro é uma drupa com duas lojas de polinização independente, as
quais originam duas sementes (grão comercial). Quando as duas sementes se
desenvolvem normalmente, a semente é classificada como tipo chato ou normal, com
uma face plana e outra convexa. Se uma única semente se desenvolve no fruto, a
mesma apresenta a forma arredondada e se denomina tipo moca. No caso de mais de
um óvulo se desenvolver dentro da loja do ovário, as sementes resultantes ficam
embricadas umas às outras, e assumem formas irregulares, as quais são denominadas
de concha e grãos quebrados (FAZUOLI, 1977).
Para a determinação dos vários tipos de sementes foi utilizada uma amostra de
café beneficiado de 0,4 kg por repetição, utilizada para a determinação de rendimento.
Os três tipos de sementes (chato, moca e concha) foram separados manualmente para
a obtenção da massa com balança de precisão. As porcentagens foram calculadas em
relação à massa total de café beneficiado.
3.1.2.3 Tamanho dos grãos
O tamanho dos grãos de café é uma característica de grande importância na
qualidade final da bebida, pois grãos separados em função do tamanho possibilitam
uma torra bem mais uniforme.
Para a determinação do tamanho dos grãos, apenas as sementes do tipo “chato”
foram submetidas a um conjunto de 15 peneiras com orifícios circulares variando de
12/64 a 26/64 polegadas. Posteriormente, foi obtida a massa dos grãos
correspondentes a cada peneira para a determinação da peneira média. Para tanto,
multiplica-se o número da peneira pelas respectivas massas de sementes efetuando a
somatória dos produtos, a qual será dividida pela massa total dos grãos e o quociente
obtido representa o valor da peneira média (FAZUOLI, 1991).
36
3.1.3 Análise estatística
Os dados das avaliações agronômicas e fenológicas foram analisados
individualmente pelo teste t, intervalo de confiança e comparação de médias, utilizando-
se o programa GENES (CRUZ, 2007). Essas análises foram feitas para que o
comportamento das cultivares em relação às variáveis estudadas fosse conhecido.
Posteriormente, os dados foram submetidos à análise multivariada de
componentes principais, análise, que se baseia em avaliações de agrupamento para
determinar as divergências genéticas (CRUZ, 2006). Essas análises foram feitas com o
software STATISTICA.
3.2 Expressão gênica
3.2.1 Busca de ESTs em banco de dados de café
Os genes responsáveis pelo processo de crescimento e maturação dos frutos de
café são ainda pouco conhecidos, por isso as buscas de seqüências de ESTs foram
feitas com seqüências de Coffea já identificadas, bem como a partir de outras espécies
depositadas no banco NCBI (Nacional Center for Biotechnology Information).
Os genes foram selecionados com base na relação dos mesmos com os
seguintes processos: (i) desenvolvimento do embrião, (ii) composição química da
semente e (iii) maturação dos frutos.
Com as seqüências identificadas, buscou-se no banco de seqüências de ESTs,
oriundos do Projeto Genoma Café, homólogos dessas seqüências de genes
específicos. Para isso, utilizou-se o algoritmo BLAST (ALTSCHUL et al., 1990) e outras
ferramentas desenvolvidas pela equipe de Bioinformática do Projeto Genoma Café.
As seqüências identificadas em café serviram como base para a construção de
oligonucleotídeos específicos para os locos de ESTs que seriam avaliados.
Os oligonucleotídeos foram construídos com aproximadamente 20 nucleotídeos
cada par, temperatura de anelamento máxima de 55° C, ao menos a extremidade 5’
iniciando pelos nucleotídeos citocinina ou guanidina e, com produto da amplificação de
300 a 400 pares de bases.
37
ov ch ex ve vc ce ce en
3.2.2 Coleta de material vegetal e isolamento de RNA total
O desenvolvimento dos frutos de café pode variar de acordo com a espécie,
cultivar, região de cultivo e tratos culturais. Em Campinas, o florescimento dos cafeeiros
da espécie C. arabica ocorre, em geral, de setembro a outubro e o amadurecimento se
dá entre os meses de abril a junho (LEVY et al., 1989). Portanto, os frutos foram
coletados nas diferentes fases de crescimento, maturação e amadurecimento, baseada
na escala fenológica proposta por Pezzopane et al. (2003). Na safra 2004/2005
coletaram-se frutos nas fases: verde, verde-cana, cereja, enquanto na safra 2005/2006
amostrou-se ovário fecundado, frutos chumbinho, expansão, verde, verde-cana, cereja
e endosperma maduro (Figura 4).
Figura 4 - Fases de desenvolvimento dos frutos de cafeeiro coletados para
caracterização gênica: ovário fecundado (ov), fruto chumbinho (ch), fruto
em expansão (ex), fruto verde (v), frutos verde-cana (vc), fruto cereja (c)
e endosperma maduro (en)
Os frutos foram coletados e em seguida congelados em nitrogênio liquido e
armazenadas em biofreezer a -80
o
C. O tecido congelado foi utilizado para a extração
do RNA total.
Antes do início da manipulação dos tecidos para a extração do RNA, todo o
material e solução foram tratados com DEPC 0,1%, com exceção do Tris-HCl e dos
solventes orgânicos, preparados com água livre de DNAse e RNAse.
O RNA total foi isolado de cada fase de desenvolvimento dos frutos de café,
utilizando-se cerca de 2,0 gramas de tecido macerado em nitrogênio líquido até a
obtenção de um pó fino, ao qual se adicionou 20mL de tampão de extração contendo
CTAB 2%, PVP 2%, Tris-HCl 100mM pH 8, EDTA 25 mM, NaCl 2M e β-
mercaptoethanol 50mM. Depois, foram feitas extrações com clorofórmio até não haver
38
precipitados na interface entre a fase aquosa e a fase orgânica. O RNA foi precipitado
com uma solução de LiCl 12M até a concentração final de 2,5M e, posteriormente,
lavado com outra solução de LiCl 2,5M e ressuspendido em aproximadamente 100μL
de água tratada com DEPC. Depois que o RNA foi isolado, armazenou-o em biofreezer
a -80° C.
O RNA total foi quantificado por espectrofotometria, medindo-se a absorbância a
220, 240, 260, 270 e 280nm. Na absorbância de 260nm determina-se a concentração
de ácidos nucléicos, na relação 270 por 280 a quantidade de fenol e na relação 260 por
270 a pureza, ou seja, a quantidade de proteínas.
A qualidade do RNA também foi verificada em gel desnaturante, feito com
agarose 1,5%, MOPS 5X e formaldeído.
3.2.3 Síntese de cDNA
Inicialmente o RNA total foi tratado com a enzima DNAse (Invitrogen)
adicionando-se ao 400ng de RNA total tampão da reação 10X, enzima DNAse I 1,0
UμL
-1
e água ultra-pura e após 15 minutos à temperatura ambiente, a DNAse foi
inativada com EDTA 25mM.
Com o RNA livre de DNAse iniciou-se a síntese do cDNA (DNA complementar)
que foi feita pela técnica de transcrição reversa, por meio do uso da enzima Super
Script III (Invitrogen). A síntese consiste em adicionar aos 400 ng de RNA tratado primer
oligo dT 50μM, tampão de anelamento, mistura 2X (MgCl
2
10mM e dNTP 1mM) e
enzima Super Script III, cuja reação será incubada por 50 minutos a 50° C e 5 minutos
a 85° C. O cDNA foi armazenado a -20° C.
3.2.4. Amplificação por PCR e eletroforese
As reações de amplificação foram conduzidas em volume final de 25μL,
contendo 40ng de cDNA, tampão 10X (100mM Tris-HCl, pH 8,4 e 500 mM KCl), 2 mM
de dNTP, 25 mM de MgCl
2
, 10 pmol de cada oligonucleotídeo específico (foward e
reverse) e 5 U.μl
-1
da enzima Taq DNA polimerase (Invitrogen). As condições de
39
amplificação estabelecidas foram: 95° C (5 minutos), 30 ciclos de 95° C (1 minuto), 52°
C (30 segundos) e 72° C (30 segundos), seguidos de 72° C (10 minutos).
Os produtos da amplificação foram separados por eletroforese em gel de
agarose 1,0% e corado com brometo de etídeo. A revelação foi feita em
fotodocumentador com luz ultravioleta. Os fragmentos correspondentes aos transcritos
gênicos foram avaliados em relação à presença, ausência e intensidade visual dos
fragmentos amplificados.
Para cada par de oligonucleotídeo e cada conjunto de amostras foi feita duas
repetições da reação RT-PCR, com o objetivo de comprovar os resultados.
3.2.5 Clonagem e sequenciamento
Após a análise das reações por PCR, os produtos correspondentes aos genes
que se mostraram com expressão diferencial e ainda não haviam sido descritos para
café, foram selecionados para clonagem e sequenciamento (ANEXO A).
Dessa maneira, as bandas correspondentes aos genes selecionados foram
cortadas e purificadas com kit de purificação (Invitrogen - Purelink Quick Gel Extration).
Na reação de ligação foram usadas 3 partes do inserto para 1 parte do vetor 2.1
(Invitrogen), adicionando-se tampão de ligação 10x, enzima T4 DNA ligase e água. A
reação foi incubada 14° C durante a noite.
Para a transformação bacteriana, 5μL da reação de ligação foi misturada a
100μL de células competentes (E. coli linhagem D45α). Essa mistura foi incubada em
gelo por 30 minutos, depois por 40 s a 42° C e novamente em gelo por 2 minutos.
Posteriormente, adicionou-se 950μL de meio SOB e as bactérias cresceram por 1 hora
a 37° C, com agitação de 200 a 250 rpm.
As bactérias foram plaqueadas em meio LB sólido contendo 100μg.mL
-1
de
ampicilina, 50mg.mL
-1
de X–Gal e IPTG 100mM. As placas foram incubadas a 37° C
durante a noite. Das placas, somente as colônias brancas foram inoculadas em meio
LB líquido contendo ampicilina (100 μg.mL
-1
). A cultura permanente das colônias
selecionadas foi feita acrescentando-se 150μL de glicerol em 850μL de bactéria e
conservadas a -80° C.
40
A purificação dos plasmídeos foi feita utilizando-se o kit Spin miniprep (Qiagen),
o qual consiste em isolar apenas o vetor contendo o inserto de interesse, para que
possa ser realizado o sequenciamento. O sequenciamento foi feito no Centro de
Citricultura “Silvio Moreira” do Instituto Agronômico (IAC), município de Cordeirópolis,
Estado de São Paulo, utilizando-se o seqüenciador 3730 (Applied Biosystems).
As análises dos resultados do sequenciamento foram feitas primeiramente
deixando as seqüências no formato GenBank pelo programa Sewer
(www.bioinformatics.org/sewer
) e, posteriormente, utilizou-se o programa Vecscreen
(www.ncbi.nlm.nih.gov/vecscreen). Os nucleotídeos correspondentes ao vetor foram
retirados, restando apenas os nucleotídeos do inserto. Essas seqüências de
nucleotídeos foram comparadas às seqüências disponíveis em bancos de dados pela
utilização do programa BLASTX (www.ncbi.nlm.nih.gov/blast). O programa BLASTX
deduz a seqüência de aminoácidos a partir da seqüência nucleotídica e compara com
seqüências de aminoácidos disponíveis em bancos de dados.
3.2.6 Quantificação da expressão gênica por PCR em tempo real
Para o PCR quantitativo foram desenhados oligonucleotídeos para genes
representativos dos processos de desenvolvimento do embrião, composição química da
semente e maturação dos frutos. A normalização da expressão desses genes foi feita a
partir da expressão do gene da gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (gapdh) de café,
chamado gene controle. Cada amostra foi repetida três vezes.
Cada gene selecionado foi analisado na cultivar Mundo Novo no estádio de fruto
em expansão, verde e cereja e também, em todas as cultivares estudada no estádio
cereja, somente na safra 2005/2006.
O PCR quantitativo é baseado no monitoramento da fluorescência da
amplificação do DNA ciclo a ciclo. O número de cópias dos genes foi identificado
utilizando-se Platinum SYBR Green qPCR Super Mix UDG (Invitrogen) que consiste em
um corante fluorescente intercalante de DNA. A fluorescência é captada pelo
termociclador a cada ciclo da reação de PCR, permitindo a criação de uma curva de
amplificação.
41
As reações de amplificação foram conduzidas em volume final da amostra de
15μL contendo: 50 ng de cDNA, 1X Platinum SYBR Green qPCR Super Mix UDG
(Invitrogen), 3 mM de MgCl
2
e 200 mM de cada um dos oligonucleotídeos dos genes
estudados. As condições de amplificação estabelecidas foram: 50 °C por 2 minutos,
95°C por 2 minutos e 40 ciclos de 95° C por 15 segundos e 60° C por 30 segundos.
Todas as reações foram realizadas em termociclador ABI Prism 7700 Sequence
Detection System (Perkin-Elmer Applied Biosystem), em triplicata com a presença de
controle branco e do gene controle.
Os resultados foram analisados utilizando-se a quantificação relativa, calculada a
partir do valor de 2
-ΔΔCt
. Primeiramente calculou-se o valor de ΔCt (Ct
gene alvo
– Ct
gene
controle
), em seguida o valor do ΔΔCt (ΔCt
gene alvo
- ΔCt
calibrador
) e, finalmente o valor da
quantificação relativa. Ct é o ciclo definido como "treshold", ou seja, onde a
fluorescência é detectável e é inversamente proporcional ao logaritmo do número inicial
de cópias (TYAGI et al., 1998).
O calibrador utilizado para as análises em Mundo Novo foram amostras de frutos
em expansão e para as análises das cultivares na fase cereja o calibrador foi uma
amostra de Mundo Novo.
Os métodos de quantificação de expressão dos genes são recentes e por esse
motivo, ainda estão sendo estudados gene a gene para se obter qual a quantificação
relevante para cada um deles. Dessa maneira, para esse estudo, a significância da
quantificação da expressão diferencial foi definida caso a caso, dependendo da
categoria do gene, definida de acordo com seu produto e função na planta.
42
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Avaliações Fenológicas e Agronômicas
As avaliações fenológicas foram realizadas com o objetivo de caracterizar as
cultivares em relação à duração do ciclo de desenvolvimento dos frutos do cafeeiro
arábica, enquanto os aspectos agronômicos com a finalidade de estudar, em condições
de campo, a produção do cafeeiro.
Na Figura 5 estão apresentado o desenvolvimento fenológico das cultivares de
cafeeiro arábica, desde o estádio gema dormente até fruto seco, nos anos agrícolas
2004/05 e 2005/06.
Na safra 2004/2005 houve apenas uma florada significativa, ocorrida no final do
mês de setembro, após chuvas acentuadas, interrompendo um período de deficiências
hídricas e seguidas por queda da temperatura média (Figura 6). A deficiência hídrica
acentuada no período de repouso das gemas proporcionou uma florada principal bem
definida (CAMARGO; CAMARGO, 2001).
O desenvolvimento dos frutos entre a antese e a fase chumbinho foi semelhante
entre as cultivares. Na fase de frutos em expansão dos grãos (6) a cultivar Obatã
apresentou desenvolvimento tardio em relação às demais cultivares, as quais não
evidenciaram diferença expressiva entre si (Figura 5).
No ano agrícola 2005/2006, nos meses de setembro e outubro, as chuvas foram
escassas e irregulares, com ocorrência de diversas floradas, com duas precipitações
mais significativas. Uma das floradas ocorreu no começo de setembro e a outra, menos
intensa, no início de outubro (Figura 6). Nessa safra, a partir do estádio de frutos
chumbinho (5), as cultivares diferiram em relação ao ciclo fenológico, em razão da
maturação (9) ter ocorrido em diferentes períodos (Figura 5). Fato semelhante foi
observado por Pezzopane et al (2003), no ano agrícola 2001/02.
Durante o primeiro ciclo fenológico (safra 2004/05), a temperatura média foi
superior em relação à safra seguinte (Figura 6). No período de fevereiro a abril,
correspondente a maturação dos frutos, esses valores foram, aproximadamente, 4°C
acima da média do mesmo período da safra 2005/06. Segundo Camargo (1985), a
43
ocorrência de temperaturas elevadas nesse período acelera o desenvolvimento e a
maturação dos frutos, o que provocaria a perda de qualidade da bebida.
Esse fato prejudicou a classificação das cultivares quanto à duração do ciclo
reprodutivo, pois somente a cultivar Obatã se diferenciou das demais, com ciclo tardio
ou 243 dias após a florada. As outras cultivares, Catuaí, Icatu Vermelho e Mundo Novo
apresentaram ciclos médios e iguais a 229, 233 e 231 dias após a antese, nessa ordem
(Figura 5).
Verificou-se que o ciclo reprodutivo no ano agrícola 2005/06 variou entre as
cultivares, com desenvolvimento dos frutos entre a florada e a presença de cerejas aos
276 dias na cultivar Obatã, 270 dias na cultivar Icatu Vermelho, seguida da cultivar
Catuaí Vermelho com 266 dias e Mundo Novo 255 dias. A cultivar Icatu Precoce
apresentou o menor ciclo, 235 dias da floração até estádio cereja. Observou redução no
tempo de duração de cada fase da frutificação da cultivar (Icatu Precoce) (Figura 5),
que antecipou até 41 dias a sua maturação (cereja – 9) em relação a cultivar mais
tardia (Obatã).
Esses dados corroboram os encontrados na descrição das cultivares feitas por
Guerreiro Filho et al. (2007). A classificação das cultivares quanto à duração dos ciclos
pode ser determinada como muito tardia para Obatã, tardia no Icatu Vermelho, média a
tardia no Catuaí Vermelho, média para Mundo Novo e precoce no material de mesmo
nome - Icatu Precoce.
Por meio da comparação da duração dos ciclos fenológicos estudados, verifica-
se que a cultivar Obatã reduziu o ciclo em 33 dias entre a safra 2004/2005 e 2005/2006.
Para as cultivares Catuaí e Icatu Vermelho essa redução foi da ordem de 37 dias,
enquanto para Mundo Novo, reduziu 24 dias. Esses dados evidenciam o efeito das
condições climáticas sobre o desenvolvimento dos frutos do cafeeiro, como constatado
por diversos autores (KUMAR, 1979; CAMARGO; CAMARGO, 2001; PEZZOPANE,
2004).
Na Figura 7 são apresentados os resultados da análise multivariada em
componentes principais dos atributos fenológicos, levando em consideração a duração
do ciclo de desenvolvimento dos frutos e a porcentagem de frutos nos estádios verde,
44
Mundo Novo
Icatu
Catuaí
Obatã
Icatu
Mundo Novo
Icatu
Catuaí
Obatã
Jul Ago Set Out Nov Dez Jan Fev Mar Abr Mai Jun Jul
Jul Ago Set Out Nov Dez Jan Fev Mar Abr Mai Jun Jul
Mês
0 1 2 34 5 6 7 8 9 10 11
0 1 2 34 5 6 7 8 9 10 11
0 1 2 34 5 6 7 8 9 10 11
0 1 2 34 5 6 7 8 9 10 11
0 1 2 34 5 6 7 8 9 10 11
0 1 23 4 5 6 7 8 9 10 11
0 1 23 4 5 6 7 8 9 10 11
0 1 23 4 5 6 7 8 9 10 11
0 1 23 45 6 7 8 9 10 11
(A)
(B)
Vermelho
Vermelho
Precoce
verde-cana, cereja, passa e seco, na ocasião da colheita dos dois anos agrícolas
(2004/05 e 2005/06).
Os resultados apresentados pela análise indicam que o fator 1 é caracterizado
pela variável duração de ciclo e o fator 2 pela freqüência de frutos secos e passa.
Figura 5 - Épocas de ocorrência de estádios fenológicos em cafeeiro (0-gema
dormente; 1-gema entumecida; 2-abotoado; 3-florada; 4-pós-florada; 5-
chumbinho; 6-expansão dos frutos; 7-fruto verde; 8-fruto verde-cana; 9-
fruto cereja; 10-fruto passa; 11-fruto seco), para a florada principal, nos
anos agrícolas de 2004/05 (A) e 2005/06 (B), para o município de
Campinas, SP
Observa-se efeito ambiental bastante evidente, como indica a separação das
cultivares nos anos agrícolas 2004/05 e 2005/06. As cultivares apresentaram maior
quantidade de frutos no estádio cereja na safra 2004/05, enquanto na safra seguinte
ocorreu maior porcentagem de frutos verde e verde-cana (Figura 7). As diversas
45
-40
-20
0
20
40
60
80
100
JA SONDJ FMAMJ JA SONDJ FMAMJ
Deficiência Excedente (mm)
9
12
15
18
21
24
27
30
Temperatura, ºC
Temperatura
2004 2005 2006
floradas no ano agrícola 2005/06 podem ter ocasionado grande porcentagem de frutos
imaturos na colheita.
Figura 6 - Balanço hídrico e temperatura para o período de julho de 2004 a junho de
2006, para o município de Campinas, SP
Por meio da análise comparativa das cultivares em componentes principais para
atributos fenológicos no ano 2004/05, nota-se uma estrutura de subgrupos (Figura 7). A
cultivar Obatã diferenciou das demais (Catuaí, Icatu Vermelho e Mundo Novo) por
apresentar menor porcentagem de frutos cereja e maior proporção de frutos verde e
verde-cana. Esses resultados confirmam a sua característica de maturação tardia
(Obatã) em relação às demais cultivares.
Na safra 2005/2006, com base na mesma análise, observa-se que a cultivar
Icatu Precoce apresentou maior porcentagem de frutos seco e fruto passa o que explica
sua precocidade (IP) em relação aos demais materiais genéticos. A cultivar Mundo
Novo ocupou uma posição intermediária entre a cv. Icatu Precoce e as cultivares
Catuaí, Icatu Vermelho e Obatã. A cv. Mundo Novo apresentou maturação média,
enquanto os ciclos fenológicos das demais variam de médio a tardio (Figura 7).
A análise da duração do desenvolvimento dos frutos (Figura 5) e a análise em
componentes principais das variáveis fenológicas (Figura 7) indicam comportamentos
46
distintos entre os anos agrícolas, influenciados pelas diferenças climáticas. Contudo, foi
possível diferenciar as cultivares quanto à precocidade de maturação.
Figura 7 – Análise de componentes principais das variáveis fenológicas associadas às
cultivares Obatã (OB), Catuaí Vermelho (CV), Icatu Vermelho (IV), Mundo
Novo (MN) e Icatu Precoce (IP) nas safras 2004/05 e 2005/06.
Representadas no plano 1-2
A análise em componentes principais das variáveis agronômicas como, produção
de grãos, rendimento, tamanho de grãos (peneira) e o tipo de sementes (chato, moca e
concha) está apresentada na Figura 8. Estes atributos influenciam a qualidade
tecnológica do produto – a bebida do café. Da mesma maneira que ocorreu com as
análises fenológicas, estas variáveis (atributos agronômicos) se comportaram
distintamente entre as safras agrícolas (Figura 8).
Na Figura 8 o fator 1 evidencia o efeito ambiental, o que caracteriza os anos
agrícolas como distintos. Em 2005/06 obteve maior produção, elevada freqüência de
sementes do tipo chato, grãos de peneira graúda e menor freqüência de sementes
OB
OB
OB
OB
OB
OB
OB
OB
IV
IV
IV
IV
IV
IV
IV
IV
MN
MN
MN
MN
MN
MN
MN
MN
IP
IP
IP
Seco
Ciclo
CV
CV
CV
CV
CV
CV
CV
CV
IP
Verde
Verde-cana
Cereja
Passa
Fator 1 (45,96%)
Fator 2 (32,58%)
safra 2004/2005
safra 2005/2006
47
OB
OB
OB
OB
OB
OB
OBOB
CV
CV
CV
CV
CV
CV
CV
CV
IV
IV
IV
IV
IV
IV
IV
IV
MN
MN
MN
MN
MN
MN
MN
MN
IP
IP
IP
IP
Concha
Pene ira
Chato
Moca
Re ndim e nt o
Produção
Fator 1 (51,34%)
Fator 2 (18,86%)
moca. O contrário observou-se na safra 2004/05, cuja produção foi baixa, grãos de
peneira inferior, menor quantidade de semente do tipo chato e elevada porcentagem de
sementes moca. Esses resultados refletem, também, o fenômeno da bienalidade de
produção do cafeeiro (RENA; MAESTRI, 1987; CAMARGO; CAMARGO, 2001), por
serem características indicativas de qualidade tecnológica e influenciada pelas
variações ambientais. Os atributos agronômicos representados pelo eixo 1 não diferem
marcantemente entre as cultivares (Figura 8).
Figura 8 – Análise de componentes principais das variáveis agronômicas associadas às
cultivares Obatã (OB), Catuaí Vermelho (CV), Icatu Vermelho (IV), Mundo
Novo (MN) e Icatu Precoce (IP), nas safras 2004/05 e 2005/06.
Representadas no plano 1-3
A grande quantidade de sementes do tipo moca na safra 2004/05 pode ser
explicada pela ocorrência de temperatura elevada por ocasião da florada (Figura 6).
Mendes et al. (1954), Mônaco (1960) e Pezzopane (2004) também verificaram alta
porcentagem desse tipo (moca) associado à ocorrência de fatores ambientais adversos
na florada e no inicio da frutificação.
safra 2005/2006
safra 2004/2005
48
O fator 2 relaciona especialmente o efeito genético, porque esta bastante
correlacionada com a porcentagem de sementes do tipo concha, uma característica
varietal definida geneticamente (CARVALHO; KRUG, 1949), com herdabilidade de 59%.
Esta observação permite formular a hipótese de que se trata de característica pouco
influenciada pelo ambiente (SEVERINO et al., 2000).
As sementes do tipo concha, também chamada de falsa poliembrionia, consistem
na presença de mais de uma semente na mesma loja, as quais são envolvidas pelo
mesmo pergaminho, resultante do desenvolvimento simultâneo de dois ou mais óvulos
fertilizados na mesma loja do ovário (ANTUNES FILHO; CARVALHO, 1954; ALVES,
1955).
No ano agrícola 2005/06 as cultivares puderam ser agrupadas em função dessa
característica, com maior porcentagem de sementes do tipo concha em Catuaí
Vermelho e menor porcentagem na cultivar Icatu Precoce. As demais cultivares do
estudo apresentaram quantidades intermediárias (Figura 8). Na safra anterior essa
observação não aconteceu, pois as cultivares não diferiram para essa característica.
4.2 Expressão gênica
A realização dessa pesquisa fundamentou nos seguintes objetivos: (i)
identificação de genes com expressão diferencial durante o desenvolvimento dos frutos
entre as cultivares e as safras; (ii) quantificar a expressão de genes-chave durante as
fases fenológicas do cafeeiro; (iii) correlação entre genes diferencialmente expressos
durante o crescimento e maturação dos frutos com características fenológicas e
agronômicas e (iv) identificação de genes que sirvam como marcadores das fases de
frutificação do cafeeiro arábica. Somente os resultados das análises de RT-PCR da
safra 2005/06 foram apresentados, devido à ausência de diferenças significativas na
safra anterior (2004/05). A cultivar Mundo Novo foi utilizada como padrão de expressão
e comportamento fenológico para comparar as cultivares nas análises de amplificação.
As análises de PCR quantitativo (em tempo real) foram feitas na cv. Mundo Novo nas
fases de fruto em expansão, verde e cereja, enquanto nas demais cultivares somente
no estádio cereja. Nas análises de Mundo Novo utilizou como calibrador a amostra de
49
frutos em expansão, enquanto nas outras cultivares usou frutos cereja e a cv. Mundo
Novo como calibrador.
Essas análises foram realizadas com genes representantes de cada etapa do
desenvolvimento dos frutos de cafeeiro, com o objetivo de validar a estratégia
experimental adotada. No caso das duas técnicas de PCR apresentarem resultados
com o mesmo padrão de expressão, os mesmos serão aplicados para os demais
genes.
4.2.1 Data-mining
A partir das análises in silico realizadas no banco de genes NCBI e no banco de
dados do Projeto Genoma Café foram identificados 28 genes relacionados ao processo
de desenvolvimento de frutos (Tabela 1). Desses genes, somente alguns tinham sido
descritos para o cafeeiro, por isso utilizou genes identificados de espécies próximas
geneticamente, como Lycopersicon esculentum ou de espécies modelo como, por
exemplo, Arabidopsis thaliana. Na ausência de seqüências de boa qualidade ou
completas, adotaram-se seqüências de outras espécies, preferencialmente daquelas
com maturação climatérica, característica do cafeeiro.
Os genes identificados foram divididos em três grupos de acordo com seu
produto e função: (i) desenvolvimento do embrião, (ii) componentes químicos dos frutos
e (iii) maturação e amadurecimento dos frutos (Tabela 2).
No grupo de genes ligados ao desenvolvimento do embrião, estão àqueles
envolvidos à formação, maturação e germinação do embrião, além de genes resistentes
à dessecação. No grupo de genes relativos aos componentes químicos importantes dos
frutos, estão à cafeína, ácidos clorogênicos, açúcares e àqueles relacionados com
aroma e sabor. Sobre a maturação dos frutos, os genes envolvidos na via biossintética
do etileno e com fatores de transcrição e receptores.
50
Tabela 1 – Análise in silico para identificação de transcritos correspondentes aos
genes envolvidos no desenvolvimento de frutos do cafeeiro arábica
Homologia Tamanho (pb)
Genes
organismo acesso
Nº EST
café
esperado observado
ABA3/FLACCA
Arabidopsis
thaliana/Lycopersicon
esculentum
NM101519/
AY074788
6 317 300
ACO L. esculentum AB013101 31 237 250
ACS L. esculentum AB013100 2 324 310
AAT L. esculentum AY534531 6 341 320
ARF A. thaliana AF042196 2 262 250
ASN1 A. thaliana NM180333 7 344 340
CS C. arabica AB086414 66 292 300
CCoAOMT1 C. canephora EF153933 28 309 300
cat L. esculentum AF112368 155 329 300
CHS L. esculentum X55194 111 348 340
4cl C. arabica AM117807 7 308 300
csp1 C. arabica Y16976 43 350 350
Dehydrin C. canephora DQ333960 22 235 230
EMB3 Picea glauca L47601 20 337 330
manB C. arabica AJ278996 13 352 340
ER5 L. esculentum U77719 9 345 330
ERF L. esculentum AY192367 15 320 300
ETR L. esculentum U38666 1 371 370
GLA C. arabica L27992 6 202 200
GR Pisum sativum X98274 9 363 350
GN A. thaliana NM101264 3 198 200
ICL L. esculentum U18678 4 310 300
IFS Glycine max AF195799 4 349 340
MS C. arabica AB048793 36 299 300
PAL C. canephora AF460203 15 193 280
SCR A. thaliana BT002580 4 325 300
STM A. thaliana NM104916 9 327 300
TS C. arabica AB048794 60 332 320
51
Tabela 2 – Grupos de genes relacionados ao desenvolvimento de frutos do cafeeiro
definidos de acordo com o produto do gene
Grupo Gene Produto
ABA3/FLACCA cofator molibdênio sulforase
ARF fator resposta a auxina (fator transcrição)
ASN1 asparagina sintase
GN GNOM (fator transcrição)
SCR SCARECROW (fator transcrição)
Desenvolvimento
do embrião
STM SHOOT MERISTEMLESS (fator transcrição)
AAT álcool acyl transferase
CHS Chalcone sintase
CS cafeína sintase
CCoAOMT1 Caffeoyl-CoA metiltransferase
4cl 4-coumarato CoA ligase
GLA
α-galactosidase
IFS Isoflavona sintase
manB
Endo β-mannanase
MS Metilxantosina sintase
PAL fenilalanina amônia liase
Componentes
químicos dos frutos
TS Teobromina sintase
ACO ACC oxidase
ACS ACC sintase
Cat Catalase
csp1 proteína de reserva 11S
DH dehydrin
EMB3 proteína família LEA durante a embriogenese
ER5 proteína família LEA em resposta ao etileno
ERF resposta ao etileno (fator transcrição)
ETR receptor de etileno
GR Glutationa redutase
Maturação e
amadurecimento
dos frutos
ICL Isocitrato liase
52
4.2.2 Análise da expressão gênica por RT-PCR e PCR em tempo real
4.2.2.1 Grupo de genes relacionados com o desenvolvimento do embrião
A formação do embrião, desde a gênese até o desenvolvimento na germinação
(embriogênese), requer expressão gênica específica. Em Arabidopsis, pela seleção de
mutantes, foram identificados genes de fatores de transcrição envolvidos nesse
processo, tais como: GNOM, SCARECROW, SHOOTMERISTEMLESS, HOBBIT,
MONOPTEROS e SHOOT ROOT (TAIZ; ZEIGER, 2004).
Na presente pesquisa estudou os três primeiros genes, GNOM, SCARECROW e
SHOOTMERISTEMLESS. O gene GNOM (GN) é responsável pelo padrão axial, ou
seja, garante a polaridade axial, pois está envolvido com a sinalização da auxina. Seu
mutante em Arabidopsis não apresenta raízes e cotilédones, razão por que não
desenvolve polaridade axial (MAYER et al., 1993). O gene SCARECROW (SCR) atua
no desenvolvimento do tecido fundamental, fundamental para a diferenciação do tecido
e das células do embrião e das raízes primárias, secundárias e também do hipocótilo.
Em Arabidopsis o mutante para esse gene produz raízes com uma única camada de
tecido fundamental, o que leva à sua desestruturação (TAIZ; ZEIGER, 2004; DI
LAURENZIO et al., 1996). O SHOOT MERISTEMLESS (STM) é um gene que faz parte
da família de homeobox (KNOX) e se expressa, especificamente, em células que se
diferenciam em meristema apical da parte aérea e na manutenção da identidade do
referido meristema na planta adulta (TAIZ; ZEIGER, 2004). O mutante desse gene em
Arabidopsis, resulta em indivíduos sem o meristema apical (LINCOLN et al., 1994).
O meristema apical é determinado antes de ser reconhecido morfológicamente,
por isso a presença de transcritos desses genes devem ocorrer na fase embrionária,
após a fecundação da oosfera, quando se forma o zigoto, com o pólo proximal (pólo
radial) e o pólo distal (pólo caulinar) definidos, e estende até o último estádio de
desenvolvimento do fruto (CASTRO et al., 2005).
Nessa pesquisa foram observados transcritos amplificados dos genes GN, SCR
e STM em todas as fases de desenvolvimento dos frutos de cafeeiro arábica (Figura 9,
10 e 11). Os genes GN e SCR não apresentaram diferença significativa entre as fases
fenológicas e tampouco entre as cultivares. No entanto, para o gene STM foram
53
amplificados transcritos com menor intensidade em frutos nas fases chumbinho,
expansão, verde e endosperma maduro (Figura 11). Esses resultados corroboram os
obtidos na análise de quantificação da expressão do gene STM, em que se observou
pequena diferença de expressão entre as fases expansão, verde e cereja na cv. Mundo
Novo e também entre as demais cultivares no estádio cereja (Figura 12). A
quantificação da expressão relativa desse gene variou entre 0,5 a 1,0 entre as amostras
estudadas e, por se tratar de um fator de transcrição, essas pequenas alterações de
expressão são consideradas significativas.
A diferença de expressão desse gene (STM) em relação aos outros (GN e SCR)
justifica-se pela sua função na diferenciação de células do meristema apical, menos
requerida nas fases intermediárias de desenvolvimento da semente.
Figura 9 - Amplificação por RT-PCR de transcritos do gene GN pareado ao gene
controle Actina, nas cultivares Mundo Novo (MN), Catuaí Vermelho (CV),
Icatu Vermelho (IV), Obatã (OB) e Icatu Precoce (IP), nas fases de
desenvolvimento dos frutos: ovário-ov; chumbinho-ch; expansão-ex; verde-
v; verde cana-vc; cereja-c e endosperma-en. Peso molecular (PM) de 100
pb. Fragmento com intensidade visual igual (=)
MN
CV
= = = = = = =
PM ov ch ex v vc c en
IV
= = = = = = =
OB
= = = = = = =
IP
= = = = = = =
PM ov ch ex v vc c en
54
Figura 10 - Amplificação por RT-PCR de transcritos do gene SCR pareado ao gene
controle Actina, nas cultivares Mundo Novo (MN), Catuaí Vermelho (CV),
Icatu Vermelho (IV), Obatã (OB) e Icatu Precoce (IP), nas fases de
desenvolvimento dos frutos: ovário-ov; chumbinho-ch; expansão-ex; verde-
v; verde cana-vc; cereja-c e endosperma-en. Peso molecular (PM) de 100
pb. Fragmento com intensidade visual igual (=)
Nas análises de RT-PCR o gene STM apresentou transcritos com dois
fragmentos distintos em todas as cultivares e fases de desenvolvimento dos frutos, em
que o menor tamanho é mais intenso do que aquele com mais pares de bases (pb).
Esses resultados podem ser decorrentes da amplificação de dois alelos distintos, pois a
espécie C. arabica é alotetraplóide, o que aumenta a sua probabilidade.
MN
CV
= = = = = = =
PM ov ch ex v vc c en
IV
= = = = = = =
OB
= = = = = = =
IP
= = = = = = =
PM ov ch ex v vc c en
55
0
0,5
1
1,5
2
2,5
Mundo Novo Catuaí Icatu Obatã Icatu Precoce
Expressão Relativa
0
0,5
1
1,5
2
2,5
expansão verde cereja
Expressão Relativa
A
B
Figura 11 - Amplificação por RT-PCR de transcritos do gene STM pareado ao gene
controle Actina, nas cultivares Mundo Novo (MN), Catuaí Vermelho (CV),
Icatu Vermelho (IV), Obatã (OB) e Icatu Precoce (IP), nas fases de
desenvolvimento dos frutos: ovário-ov; chumbinho-ch; expansão-ex; verde-
v; verde cana-vc; cereja-c e endosperma-en. Peso molecular (PM) de 100
pb. Fragmento com intensidade visual igual (=)
Figura 12 – Quantificação da expressão do gene STM nos frutos de cafeeiro em
expansão, verde e cereja na cultivar Mundo Novo (A) e na fase cereja
para as cultivares Mundo Novo, Catuaí, Icatu Vermelho, Obatã e Icatu
Precoce (B)
A auxina é um hormônio vegetal e seus efeitos fisiológicos influenciam desde a
germinação até a senescência, como a elongação celular, fototropismo, geotropismo,
dominância apical, iniciação e elongação radicular, abscisão de folhas e frutos, efeito
MN
CV
= = = = = = =
PM ov ch ex v vc c en
IV
= = = = = = =
OB
= = = = = = =
IP
= = = = = = =
PM ov ch ex v vc c en
56
herbicida, partenocarpia, partição de assimilados, produção de etileno e crescimento de
frutos. Em altas concentrações, esse hormônio estimula a produção de etileno em
partes de plantas intactas e separadas e, por estarem envolvidas na expansão celular,
determinam padrões de crescimento em frutos (CASTRO et al., 2005).
A maior expressão do gene ARF (AUXIN RESPONSE FACTOR), uma família de
fatores de transcrição, ocorre na antese e reduz após a fertilização do óvulo (GOETZ,
2006).
Como a auxina está relacionada com a formação de frutos e estímulo à produção
de etileno, observou nas análises do presente estudo maior amplificação de transcritos
nas fases iniciais de crescimento, com diminuição na fase de grão verde. No fruto verde
cana (início da maturação) a expressão aumentou novamente, e decresceu nas fases
seguintes (Figura 13).
As cultivares Icatu Vermelho, Obatã e Icatu Precoce, apresentaram aumento de
intensidade dos fragmentos, amplificados nas fases expansão e verde cana, porém,
como o controle também apresenta essa variação, elas não são significativas.
Figura 13 - Amplificação por RT-PCR de transcritos do gene ARF pareado ao gene
controle Actina, nas cultivares Mundo Novo (MN), Catuaí Vermelho (CV),
Icatu Vermelho (IV), Obatã (OB) e Icatu Precoce, nas fases de
desenvolvimento dos frutos: ovário-ov; chumbinho-ch; expansão-ex; verde-
v; verde cana-vc; cereja-c e endosperma-en. Peso molecular (PM) de 100
pb. Fragmento com intensidade visual igual (=) e maior (+)
MN
CV
= = = = = = =
PM ov ch ex v vc c en
IV
= + = = = = =
OB
= + = = = = =
IP
= + = = = = =
PM ov ch ex v vc c en
57
Outro gene desse grupo é o ASN1, codificador para a enzima asparagina
sintase, muito importante em processos como a germinação e assimilação de nitrogênio
(LAM et al., 2003; TAIZ; ZEIGER, 2004). O nitrogênio é requerido em todas as fases de
desenvolvimento de frutos, por isso é provável a presença de transcritos
correspondentes a esse gene em todas as amostras.
Na Figura 14 são apresentados transcritos amplificados nas fases de frutificação
do cafeeiro. Apenas a cultivar Mundo Novo apresentou ausência de transcritos no fruto
verde, cujo padrão foi observado em todas as repetições. A ausência de fragmentos em
grãos verde de Mundo Novo pode estar associada à mudança entre a fase final de
crescimento e o início da maturação (DE CASTRO; MARRACCINI, 2006). Essa
mudança pode alterar alguns processos metabólicos e, como a cultivar Mundo Novo é a
mais antiga entre as cultivares utilizadas no presente estudo, o referido processo foi
mais evidente.
Figura 14 - Amplificação por RT-PCR de transcritos do gene ASN1 pareado ao gene
controle Actina, nas cultivares Mundo Novo (MN), Catuaí Vermelho (CV),
Icatu Vermelho (IV), Obatã (OB) e Icatu Precoce (IP), nas fases de
desenvolvimento dos frutos: ovário-ov; chumbinho-ch; expansão-ex; verde-
v; verde cana-vc; cereja-c e endosperma-en. Peso molecular (PM) de 100
pb. Fragmento com intensidade visual igual (=) e maior (+)
MN
CV
= = = + = = =
PM ov ch ex v vc c en
IV
= = = + = = =
OB
= = = + = = =
IP
= = = + = = =
PM ov ch ex v vc c en
58
Um importante regulador de resposta de plantas ao estresse abiótico é o ácido
abscísico (ABA) (TAIZ; ZEIGER, 2004). Esse hormônio está envolvido, principalmente,
em respostas aos estresses abióticos como baixas temperaturas, déficit hídrico e
salinidade, bem como na germinação das sementes. Além disso, pode afetar outros
aspectos do desenvolvimento da planta, pois interage com a auxina, citocinina,
giberelina, etileno e brassinosterídeos com influencia no fechamento estomático,
dormência das gemas, atraso de crescimento, estímulo à senescência, abscisão de
folhas e frutos, embriogênese e acúmulo de reservas nas sementes (CASTRO et al.,
2005; TAIZ; ZEIGER, 2004).
Em condições de frio, deficiência hídrica e estresse salino as plantas acumulam
ABA, o que induz a expressão de muitos genes de resposta ao estresse. A indicação de
estresse é diminuída em plantas mutantes para a biossíntese de ABA. Análises
genéticas baseadas no efeito inibidor de ABA na germinação de sementes
evidenciaram redução na biossíntese e ou alteração na resposta de ABA. Esses
mutantes em Arabidopsis são ABA1, ABA2 E ABA3 (XIONG et al., 2001) e em
tomateiro FLACCA e SITIENS (SAGI et al., 1999).
Como quantificado por Da Silva et al. (2005), em embriões de cafeeiro ocorre
aumento de ABA no início da maturação e decréscimo quando termina o processo, os
quais verificaram máximo acúmulo por volta de 180 dias após a florada em C. arabica e
210 dias na espécie C. canephora. A amplificação de transcritos referentes ao gene que
codifica o fator de transcrição ABA3 (cofator molibidênio sulforase – aldeído oxidase)
em todas as fases de desenvolvimento dos frutos, da fecundação até a fase final da
maturação está apresentada na Figura 15.
O aumento de intensidade de transcritos ocorreu devido ao estresse hídrico
pelos quais passaram os frutos. Esse fenômeno aconteceu, principalmente, após a
florada e nas fases finais de desenvolvimento, nos meses de setembro e outubro, maio
e junho, respectivamente (Figura 6). Observa-se maior intensidade do fragmento na
fase ovário, quando houve déficit de 10 mm, bem como na fase cereja com déficit de 20
mm (Figuras 6 e 15).
59
Figura 15 - Amplificação por RT-PCR de transcritos do gene ABA3/FLACCA pareado ao
gene controle Actina, nas cultivares Mundo Novo (MN), Catuaí Vermelho
(CV), Icatu Vermelho (IV), Obatã (OB) e Icatu Precoce (IP), nas fases de
desenvolvimento dos frutos: ovário-ov; chumbinho-ch; expansão-ex; verde-
v; verde cana-vc; cereja-c e endosperma-en. Peso molecular (PM) de 100
pb. Fragmento com intensidade visual igual (=)
A catalase (cat) é uma enzima oxidativa presente nos peroxissomos e, durante o
ciclo fotossintético, participa da degradação do peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
). Também
está relacionada com a germinação de sementes e redução dos efeitos prejudiciais de
estresses biótico e abiótico (DRORY; WOODSON, 1992; DE ROBERTIS; HIB, 1998).
Em razão da sua função nas plantas pode-se explicar a amplificação de
transcritos em todas as amostras, não havendo diferença entre as fases, nem entre as
cultivares (Figura 16).
MN
CV
= = = = = = =
PM ov ch ex v vc c en
IV
= = = = = = =
OB
= = = = = = =
IP
= = = = = = =
PM ov ch ex v vc c en
60
Figura 16 - Amplificação por RT-PCR de transcritos do gene cat pareado ao gene
controle Actina, nas cultivares Mundo Novo (MN), Catuaí Vermelho (CV),
Icatu Vermelho (IV), Obatã (OB) e Icatu Precoce (IP), nas fases de
desenvolvimento dos frutos (ovário-ov; chumbinho-ch; expansão-ex; verde-
v; verde cana-vc; cereja-c e endosperma-en). Peso molecular (PM) de 100
pb. Fragmento com intensidade visual igual (=)
4.2.2.2 Grupo de genes relacionados com os componentes químicos dos frutos
A cafeína é um alcalóide presente em todas as partes da planta de café,
principalmente nos frutos. Na biossíntese participam três enzimas: (i) metilxantosina
sintase (MS), que converte xantosina em 7-metilxantosina, (ii) teobromina sintase (TS),
que originará a 7-metilxantina e depois a 3,7-dimetilxantina (teobromina) e (iii) a cafeína
sintase (CS) (MIZZUNO et al., 2003).
A teobromina sintase, em estudos realizados com o tomateiro revelou-se como
uma das enzimas que influenciam a biossíntese do etileno, hormônio comum na
maturação (ALBA et al., 2005).
Com a utilização da técnica RT-PCR, Oliveira (2007) observou que a expressão
dos genes da biossíntese da cafeína, na cultivar. Mundo Novo diminuiu a partir da fase
de maturação dos frutos. Constatou ainda, que o gene codificador da teobromina
sintase apresentou menor variação dos fragmentos amplificados. Koshiro et al. (2006)
MN
CV
= = = = = = =
PM ov ch ex v vc c en
IV
= = = = = = =
OB
= = = = = = =
IP
= = = = = = =
PM ov ch ex v vc c en
61
sugeriram que, devido ao padrão de expressão semelhante desses genes, as enzimas
apresentam mecanismos comuns de regulação da expressão gênica.
Os resultados do presente estudo, para todos os genes que codificam as
enzimas da biossíntese da cafeína (MS, TS e CS), corroboram os dados de Oliveira
(2007). Nas Figuras 17, 18 e 19 observa-se transcritos amplificados nas fases de
desenvolvimento dos frutos, com diminuição de intensidade nas fases verde cana,
cereja e endosperma. A redução da intensidade de fragmentos amplificados é menos
marcante para o gene codificador da TS. Na cultivar Icatu Precoce, os fragmentos
amplificados do gene que codifica a CS apresentaram menor intensidade no fruto
cereja em relação as demais cultivares, o que pode ser explicado pela precocidade no
ciclo de desenvolvimento dos frutos dessa cultivar (IP).
Figura 17 - Amplificação por RT-PCR de transcritos do gene MS pareado ao gene
controle Actina, nas cultivares Mundo Novo (MN), Catuaí Vermelho (CV),
Icatu Vermelho (IV), Obatã (OB) e Icatu Precoce (IP), nas fases de
desenvolvimento dos frutos (ovário-ov; chumbinho-ch; expansão-ex;
verde-v; verde cana-vc; cereja-c e endosperma-en). Peso molecular (PM)
de 100 pb. Fragmento com intensidade visual igual (=)
Nas análises PCR quantitativo, o padrão de expressão do gene da síntese da
cafeína (CS) apresentou comportamento semelhante àquele observado em PCR semi-
quantitativo (RT-PCR) nas diferentes fases de desenvolvimento dos frutos de café na
cv. Mundo Novo, como na fase cereja nas demais cultivares (Figura 20).
MN
CV
= = = = = = =
PM ov ch ex v vc c en
IV
= = = = = = =
OB
= = = = = = =
IP
= = = = = = =
PM ov ch ex v vc c en
62
Figura 18 - Amplificação por RT-PCR de transcritos do gene TS pareado ao gene
controle Actina, nas cultivares Mundo Novo (MN), Catuaí Vermelho (CV),
Icatu Vermelho (IV), Obatã (OB) e Icatu Precoce (IP), nas fases de
desenvolvimento dos frutos (ovário-ov; chumbinho-ch; expansão-ex;
verde-v; verde cana-vc; cereja-c e endosperma-en). Peso molecular (PM)
de 100 pb. Fragmento com intensidade visual igual (=)
Os ácidos clorogênicos (CGA) são compostos fenólicos, cuja função principal
consiste na ação como antioxidante. No cafeeiro, os ácidos clorogênicos fazem parte
dos principais componentes dos frutos com teor entre 5 a 8% em C. arabica e 7 a 11%
em C. canephora. Esse composto encontra-se em todas as fases de desenvolvimento
dos frutos (CLIFFORD, 1985), considerado um dos componentes responsáveis pela
qualidade da bebida.
MN
CV
= = = = = = =
PM ov ch ex v vc c en
IV
= = = = = = =
OB
= = = = = = =
IP
= = = = = = =
PM ov ch ex v vc c en
63
0
0,5
1
1,5
2
2,5
expansão verde cereja
Expressão Relativa
0
0,5
1
1,5
2
2,5
Mundo Novo Catuaí Icatu Obatã Icatu Precoce
Expressão Relativa
A B
Figura 19 - Amplificação por RT-PCR de transcritos do gene CS pareado ao gene
controle Actina, nas cultivares Mundo Novo (MN), Catuaí Vermelho (CV),
Icatu Vermelho (IV), Obatã (OB) e Icatu Precoce (IP), nas fases de
desenvolvimento dos frutos (ovário-ov; chumbinho-ch; expansão-ex; verde-
v; verde cana-vc; cereja-c e endosperma-en). Peso molecular (PM) de 100
pb. Fragmento com intensidade visual igual (=) e menor (-)
Figura 20 – Quantificação da expressão do gene CS nos frutos do cafeeiro em
expansão, verde e cereja na cultivar Mundo Novo (A) e na fase cereja
para as cultivares Mundo Novo, Catuaí, Icatu Vermelho, Obatã e Icatu
Precoce (B)
MN
CV
= = = = = = =
PM ov ch ex v vc c en
IV
= = = = = = =
OB
= = = = = = =
IP
= = = = = - =
PM ov ch ex v vc c en
64
Dentre as principais enzimas que participam de sua síntese (CGA) estão a
fenilalanina liase (PAL), 4-coumarato CoA ligase (4cl), hidroxicinamoil-CoA ligase e
caffeoyl-CoA metiltransferase (CCoAOMT1) (CLARKE; MACRAE, 1985).
A amplificação de transcritos referentes aos genes que codificam para as
enzimas 4cl e CCoAOMT1 em todas as fases de desenvolvimento dos frutos de café,
pode ser observada nas Figuras 21 e 22. Os fragmentos amplificados do gene
codificador da enzima 4cl apresentaram significativa redução de intensidade em frutos
em maturação (verde cana e cereja) (Figura 21). Essa redução foi intensificada no
endosperma maduro - desprovido do perisperma, provavelmente porque a casca de
frutos maduros deve ser rica em CGA, com maior concentração do que o endosperma.
Esses resultados corroboram os dados de Melo (2005) e Oliveira (2007), os quais
observaram por meio da análise RT-PCR, redução de transcritos do gene 4cl em frutos
cereja na cultivar Mundo Novo.
Figura 21 - Amplificação por RT-PCR de transcritos do gene 4cl pareado ao gene
controle Actina, nas cultivares Mundo Novo (MN), Catuaí Vermelho (CV),
Icatu Vermelho (IV), Obatã (OB) e Icatu Precoce (IP), nas fases de
desenvolvimento dos frutos (ovário-ov; chumbinho-ch; expansão-ex; verde-
v; verde cana-vc; cereja-c e endosperma-en). Peso molecular (PM) de 100
pb. Fragmento com intensidade visual igual (=)
MN
CV
= = = = = = =
PM ov ch ex v vc c en
IV
= = = = = = =
OB
= = = = = = =
IP
= = = = = = =
PM ov ch ex v vc c en
65
Os resultados de amplificação do gene CCoAOMT1 (Figura 22) evidenciaram
aumento na intensidade dos fragmentos nas amostras de frutos verde e verde cana,
que diminui em grãos que completaram a maturação, como: grãos cereja e endosperma
maduro sem perisperma. Resultados semelhantes foram obtidos por Lepelley et al.
(2007) pela técnica PCR quantitativo em grãos de C. canephora, em diferentes estádios
de maturação. A expressão do gene CCoAOMT1 foi baixa em frutos pequenos, com
aumento significativo nos frutos verde e verde-amarelado. No entanto, sua expressão
reduz novamente nos frutos cereja.
Figura 22 - Amplificação por RT-PCR de transcritos do gene CCoAOMT1 pareado ao
gene controle Actina, nas cultivares Mundo Novo (MN), Catuaí Vermelho
(CV), Icatu Vermelho (IV), Obatã (OB) e Icatu Precoce (IP), nas fases de
desenvolvimento dos frutos (ovário-ov; chumbinho-ch; expansão-ex; verde-
v; verde cana-vc; cereja-c e endosperma-en). Peso molecular (PM) de 100
pb. Fragmento com intensidade visual igual (=)
A fenilalanina é um dos compostos fenólicos secundário mais abundante das
plantas. Pela eliminação de uma molécula de amônia do ácido cinâmico origina esta
substância. O ácido cinâmico é precursor do ácido cumárico, chalconas, flavonas e
isoflavonas. A reação que origina a fenilalanina é catalisada pela enzima fenilalanina
amonialiase (PAL), cuja atividade PAL pode ser aumentada por fatores ambientais
como: baixa fertilidade, luz e infecção por fungos (TAIZ; ZEIGER, 2004).
MN
CV
= = = = = = =
PM ov ch ex v vc c en
IV
= = = = = = =
OB
= = = = = = =
IP
= = = = = = =
PM ov ch ex v vc c en
66
A regulação da PAL pode ser complexa pela existência, em alguns vegetais, de
múltiplos genes codificadores da enzima (TAIZ; ZEIGER, 2004). Para minimizar esse
problema, no presente estudo foram selecionados ESTs da PAL que existem em
bibliotecas de frutos, o que aumenta a chance de avaliações de genes PAL associados
à maturação.
Os resultados da análise de amplificação por PCR semi-quantitativo do gene
PAL (Figura 23) evidenciaram diferença de amplificação de transcritos entre as fases de
desenvolvimento dos frutos. A maior intensidade dos fragmentos foi observada nas
fases ovário, expansão, verde cana e cereja, enquanto a menor intensidade ocorreu no
fruto verde.
As fases em que a amplificação de transcritos apresentou maior intensidade (ov,
ex, vc e c), corresponderam aos períodos de menor precipitação e queda de
temperatura (Figura 6). A deficiência hídrica e a baixa temperatura tornam as plantas
mais sensíveis, devido ao gasto energético, o que possibilita a incidência de pragas e
doenças, ou mesmo, alterações fisiológicas desfavoráveis (RENA; MAESTRI, 1987;
TAIZ; ZEIGER, 2004).
Nas análises para quantificação da expressão do gene PAL, os resultados foram
semelhantes aos obtidos pela análise semi-quantitativa (Figura 24), com variação de
expressão do gene codificador da PAL nas cultivares em fruto cereja. Esse resultado
indica comportamento diferenciado das cultivares em razão da influência de fatores
ambientais. As cultivares Mundo Novo e Icatu Precoce apresentaram expressões
baixas, seguidas das cultivares Catuaí Vermelho, Icatu Vermelho e Obatã. As duas
últimas cultivares, são oriundas de cruzamento interespecífico, ainda com pouca
estabilidade genética, o que pode ter proporcionado o aumento da expressão desse
gene (PAL) em relação à Mundo Novo, material genético mais estável utilizado no
presente estudo.
A síntese de compostos fenólicos como, antocianinas, taninos condensados,
flavonas, isoflavonas e flavonóides dependem da atividade da enzima chalcona sintase
(CHS) (TAIZ; ZEIGER, 2004). Os compostos fenólicos protegem as plantas contra raio
ultravioleta (UV), insetos, fungos e bactérias (CASTRO et al., 2005).
67
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
expansão verde cereja
Expressão Relativa
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
Mundo Novo Catuaí Icatu Obatã Icatu Precoce
Expressão Relativa
A
B
Figura 23 - Amplificação por RT-PCR de transcritos do gene PAL pareado ao gene
controle Actina, nas cultivares Mundo Novo (MN), Catuaí Vermelho (CV),
Icatu Vermelho (IV), Obatã (OB) e Icatu Precoce (IP), nas fases de
desenvolvimento dos frutos (ovário-ov; chumbinho-ch; expansão-ex; verde-
v; verde cana-vc; cereja-c e endosperma-en). Peso molecular (PM) de 100
pb. Fragmento com intensidade visual igual (=)
Figura 24 – Quantificação da expressão do gene PAL nos frutos do cafeeiro em
expansão, verde e cereja na cultivar Mundo Novo (A) e na fase cereja
para as cultivares Mundo Novo, Catuaí, Icatu Vermelho, Obatã e Icatu
Precoce (B)
Em macieira, a enzima CHS apresenta atividade elevada e constante durante o
amadurecimento dos frutos, a qual aumenta quando a fruta é exposta à luminosidade,
conforme dados apresentados por Ju et al. (1995). A Arabidopsis thaliana também
MN
CV
= = = = = = =
PM ov ch ex v vc c en
IV
= = = = = = =
OB
= = = = = = =
IP
= = = = = = =
PM ov ch ex v vc c en
68
responde a intensidade luminosa, com aumento de expressão desse gene (FEINBAUM;
AUSUBEL, 1988).
Em tomateiro é a enzima chave na biossíntese de antocianina, cuja expressão foi
identificada nos cotilédones, hipocótilo e em folhas de mudas dessa planta (O’NEILL et
al., 1990). Ubi et al. (2006) mostraram que a luz UV e a baixa temperatura são fatores
importantes para a acumulação de antocianina na casca da maçã, o que induz a
expressão dos genes relacionados com sua biossíntese, especialmente os que
codificadores das enzimas chalcona sintase, antocianina sintase e UFGluT.
Durante o desenvolvimento dos frutos do cafeeiro observou maior intensidade de
fragmentos amplificada correspondentes ao gene que codifica a CHS no início da
maturação (verde cana) (Figura 25). Nessa fase, o exocarpo começa a apresentar a
coloração vermelha, o que sugere aumento na produção de antocianina.
Nos frutos verdes e no endosperma maduro diminuiu a intensidade de
transcritos. O endosperma é a semente madura desprovida do pericarpo, local da
pigmentação, a qual pode ser vermelha ou amarela, e que explicaria a diminuição da
intensidade dos fragmentos nas respectivas fases (verde e endosperma). O estádio
fruto verde caracteriza-se pelo máximo tamanho, com endosperma sólido e apto a
iniciar a maturação, por isso menos suscetível a influências de fatores externos (bióticos
ou abióticos).
A cultivar Icatu Precoce apresentou menor redução de intensidade do fragmento
amplificado correspondente a grão verde em relação às demais cultivares. Esse
resultado pode ser devido ao fato da mesma (IP) apresentar grãos de coloração
amarela, além de ciclo reduzido (Figura 5). Dessa maneira, a mudança de fase é mais
rápida, com ausência de síntese dessa enzima por menos tempo, comparativamente ao
que ocorre nas demais cultivares.
69
Figura 25 - Amplificação por RT-PCR de transcritos do gene CHS pareado ao gene
controle Actina, nas cultivares Mundo Novo (MN), Catuaí Vermelho (CV),
Icatu Vermelho (IV), Obatã (OB) e Icatu Precoce (IP), nas fases de
desenvolvimento dos frutos (ovário-ov; chumbinho-ch; expansão-ex; verde-
v; verde cana-vc; cereja-c e endosperma-en). Peso molecular (PM) de 100
pb. Fragmento com intensidade visual igual (=) e maior (+)
A enzima isoflavona sintase (IFS) é precursora do composto fenólico - isoflavona
(ou isoflavonóide), o qual possui ação sobre os patógenos. As fitoalexinas relacionadas
com a defesa vegetal mais estudada em plantas são os isoflavonóides (TAIZ; ZEIGER,
2004).
A soja possui grande quantidade dessa proteína, por isso tem sido bastante
estudada em relação a esta característica. O gene que codifica para isoflavona sintase
apresenta maior expressão em embriões com 30 a 70 dias após a polinização e se
mantém durante todo o desenvolvimento da semente, não observando mudanças
significativas na expressão (DHAUBHADEL et al., 2007).
A enzima IFS, por estar relacionada à resposta de defesa, é influenciada pelo
ambiente, sofrendo alterações durante o desenvolvimento dos frutos de café. Na Figura
26, observa-se que a maior intensidade dos fragmentos amplificados corresponde ao
ovário em frutos verde cana, com redução de transcritos no endosperma maduro
desprovido do perisperma (en). Essa constatação permite supor que seja pela ausência
MN
CV
= = = = = = =
PM ov ch ex v vc c en
IV
= = = = = = =
OB
= = = = = = =
IP
= = = + = = =
PM ov ch ex v vc c en
70
do exocarpo, parte do fruto que possui pigmentação (casca) e que, também, atua como
barreira protetora da semente, da mesma maneira que ocorre com os genes PAL e
CHS.
Figura 26 - Amplificação por RT-PCR de transcritos do gene IFS pareado ao gene
controle Actina, nas cultivares Mundo Novo (MN), Catuaí Vermelho (CV),
Icatu Vermelho (IV), Obatã (OB) e Icatu Precoce (IP), nas fases de
desenvolvimento dos frutos (ovário-ov; chumbinho-ch; expansão-ex; verde-
v; verde cana-vc; cereja-c e endosperma-en). Peso molecular (PM) de 100
pb. Fragmento com intensidade visual igual (=)
O gene codificador da enzima álcool acyl transferase (AAT) é altamente
expresso no amadurecimento de frutos, pois a enzima está relacionada ao
desenvolvimento do aroma dos frutos (BEEKWILDER, et al., 2004; FEI, et al., 2004).
Dessa forma, a maior expressão desse gene deve acontecer no final da maturação, em
fase de colheita, e a semente apta para germinar.
Pela análise PCR semi-quantitativo todas as cultivares estudadas
apresentaram aumento de intensidade dos fragmentos amplificados nas fases de
maturação (verde cana, cereja e endosperma). No entanto, em Mundo Novo e Obatã a
intensidade dos fragmentos foi maior já na fase de frutos verde, quando o mesmo
atinge o tamanho máximo (Figura 27). Esse resultado pode indicar que o início da
MN
CV
= = = = = = =
PM ov ch ex v vc c en
IV
= = = = = = =
OB
= = = = = = =
IP
= = = = = = =
PM ov ch ex v vc c en
71
formação do aroma é precoce nessas cultivares (Mundo Novo IAC 388-17 e Obatá IAC
1669-20), hipótese que depende de pesquisas complementares, como a quantificação
química desse composto associado à análise sensorial.
Figura 27 - Amplificação por RT-PCR de transcritos do gene AAT pareado ao gene
controle Actina, nas cultivares Mundo Novo (MN), Catuaí Vermelho (CV),
Icatu Vermelho (IV), Obatã (OB) e Icatu Precoce (IP), nas fases de
desenvolvimento dos frutos (ovário-ov; chumbinho-ch; expansão-ex; verde-
v; verde cana-vc; cereja-c e endosperma-en). Peso molecular (PM) de 100
pb. Fragmento com intensidade visual igual (=) e menor (-)
A α-galactosidase, β-mannosidase e endo-β-mannanase são as principais
enzimas envolvidas na modificação ou degradação da parede celular. A enzima α-
galactosidase também está relacionada com a síntese de carboidratos em frutos,
por isso aparece durante o processo de desenvolvimento e maturação. A endo-β-
mannanase faz parte de um dos principais passos no metabolismo da parede
celular de mananos (grupo de carboidratos) durante a germinação do fruto do café
(ZHU; GOLDSTEIN, 1994; MARRACCINI et al., 2001).
Nas análises RT-PCR da presente pesquisa, verifica-se a partir dos
resultados para o gene codificador da α-galactosidase (GLA) (Figura 28), que há
acúmulo de transcritos a partir de fruto verde, cuja intensidade dos fragmentos
amplificados diminuiu em frutos cereja e endosperma maduro. A maior intensidade
MN
CV
= = = - = = =
PM ov ch ex v vc c en
IV
= = = - = = =
OB
= = = = = = =
IP
= = = - = = =
PM ov ch ex v vc c en
72
de fragmentos amplificados no grão verde se deve, provavelmente, ao acúmulo de
açúcares que ocorre nessa fase.
Na cultivar Icatu Vermelho o aumento de intensidade dos fragmentos
amplificados foi tardio e ocorreu a partir de fruto verde cana. O padrão observado
para essa cultivar pode indicar síntese tardia de carboidratos nos grãos, pois, todas
as repetições da análise apresentaram resultados semelhantes. Nas análises de
quantificação da expressão desse gene, observou o no fruto verde em Mundo Novo,
assim como na análise semi-quantitativa. Na fase de grão cereja não houve
diferença entre as cultivares (Figura 29).
Figura 28 - Amplificação por RT-PCR de transcritos do gene GLA pareado ao gene
controle Actina, nas cultivares Mundo Novo (MN), Catuaí Vermelho (CV),
Icatu Vermelho (IV), Obatã (OB) e Icatu Precoce (IP), nas fases de
desenvolvimento dos frutos (ovário-ov; chumbinho-ch; expansão-ex; verde-
v; verde cana-vc; cereja-c e endosperma-en). Peso molecular (PM) de 100
pb. Fragmento com intensidade visual igual (=) e menor (-)
Em frutos de C. arabica variedade Caturra, Marraccini et al. (2001)
observaram atividade máxima e grande acúmulo de transcritos da enzima α-
galactosidase em fruto verde cana, enquanto nos frutos maduros não detectaram
expressão desse gene (GLA). No entanto, Gaspari-Pezzopane et al. (2005)
avaliaram α-galactosidase em Mundo Novo e observaram maior amplificação de
MN
CV
= = = = = = =
PM ov ch ex v vc c en
IV
= = = - = = =
OB
= = = = = = =
IP
= = = = = = =
PM ov ch ex v vc c en
73
0
5
10
15
20
25
30
35
40
expansão verde cereja
Expressão Relativa
0
0,5
1
1,5
2
Mundo Novo Catuaí Icatu Obatã Icatu Precoce
Expressão Relativa
A
B
transcritos a partir de frutos em expansão, que se manteve presente até fruto
cereja, com pequena redução de intensidade.
Figura 29 – Quantificação da expressão do gene GLA nos frutos do cafeeiro em
expansão, verde e cereja na cultivar Mundo Novo (A) e na fase cereja
para as cultivares Mundo Novo, Catuaí, Icatu Vermelho, Obatã e Icatu
Precoce (B)
O gene que codifica a enzima endo-β-mannanase (manB) apresentou
amplificação de transcritos ao longo do desenvolvimento do fruto, com acentuado
decréscimo no fruto verde (Figura 30). Essa diminuição de fragmentos amplificados
seria porque o fruto verde corresponde ao final da fase de crescimento e início da
maturação. Nessa fase, também completa o preenchimento do perisperma, redução
da clorofila e inicia o acúmulo de açúcares e antocianina (DE CASTRO;
MARRACCINI, 2006).
Na cultivar Mundo Novo, a fase chumbinho apresentou menor intensidade
dos fragmentos amplificados do que as demais cultivares estudadas. Esse
resultado, provavelmente se deve a erro experimental, pois foi observada redução
semelhante na amostra controle.
Na pesquisa desenvolvida por Marraccini et al. (2001), os autores
observaram em frutos de C. arabica variedade Caturra a presença do gene que
codifica a endo-β-mannanase somente em sementes germinando. Entretanto, os
resultados apresentados no presente trabalho corroboram os obtidos por Gaspari-
Pezzopane et al. (2004) e Oliveira (2007) por meio da análise de RT-PCR, na
74
cultivar Mundo Novo. É, provavelmente, que a discrepância em relação a esses
pesquisadores se deve a outro alelo presente na cultivar Caturra. E ainda, a
possibilidade dos genótipos apresentarem diferentes padrões de acúmulo de
açúcares no desenvolvimento do fruto, para GLA e manB, pode ser outra provável
explicação da diferença em relação ao trabalho de Marracini et al. (2001).
Figura 30 - Amplificação por RT-PCR de transcritos do gene manB pareado ao gene
controle Actina, nas cultivares Mundo Novo (MN), Catuaí Vermelho (CV),
Icatu Vermelho (IV), Obatã (OB) e Icatu Precoce (IP), nas fases de
desenvolvimento dos frutos (ovário-ov; chumbinho-ch; expansão-ex; verde-
v; verde cana-vc; cereja-c e endosperma-en). Peso molecular (PM) de 100
pb. Fragmento com intensidade visual igual (=) e maior (+)
4.2.2.3 Grupo de genes relacionados com a maturação e amadurecimento frutos
O etileno é um hormônio vegetal gasoso, de ocorrência natural, presente em
todas as partes das plantas e, com efeito, no crescimento e diferenciação dos tecidos.
Os principais efeitos do etileno são: germinação e crescimento de gemas;
amadurecimento de frutos; abscisão de folhas e frutos; epinastia ou a inclinação das
folhas para baixo sob alta concentração de auxinas ou baixa concentração de etileno;
floração; senescência; crescimento de plântulas e geotropismo transversal. A produção
de etileno aumenta em resposta as condições de estresse, tais como: deficiência
MN
CV
= + = = = = =
PM ov ch ex v vc c en
IV
= + = = = = =
OB
= + = = = = =
IP
= + = = = = =
PM ov ch ex v vc c en
75
hídrica, encharcamento, resfriamento, exposição ao ozônio ou ferimento mecânico
(CASTRO et al., 2005; TAIZ; ZEIGER, 2004).
A biossíntese do etileno é composta pelas enzimas SAM (S-Adenosil-metionina),
ACC sintase (ACS) e ACC oxidase (ACO). Em tomateiro os receptores de etileno são
os ETRs e Nr e os fatores de transcrição relacionados à via de sinalização do etileno
são MBF1, CAF, TFIIE, bZIP1, bZIP61, AOBP, TDR4, ERFs e EREBPs (ALBA et al.,
2005).
O etileno é considerado o hormônio do amadurecimento, pois a sua síntese
aumenta com a maturação dos frutos, acompanhando a elevação da respiração (frutos
climatéricos), o que não ocorre em frutos não climatéricos (CASTRO et al., 2005).
A necessidade do etileno para as plantas, foi comprovada por meio do bloqueio
da biossíntese desse hormônio pela expressão da fita anti-sense da enzima ACC
sintase ou da ACC oxidase, em experimentos com plantas transgênicas de tomateiro,
obtendo frutos que não amadurecem (OELLER et al., 1991). Outro experimento que
comprovou a necessidade de etileno foi feito com o mutante never ripe de tomateiro,
cujos frutos não amadurecem pela falta de receptor do etileno (mutação), por impedir a
ligação do hormônio (WILKINSON et al., 1995).
O produto ACC formado pela enzima ACC sintase, além de precursor do etileno,
também é utilizado na síntese de uma “nova” metionina, por via modificada do ciclo de
obtenção desse aminoácido. Essa via alternativa ou Ciclo de Yang tem a função de
manter alta a taxa biossintética do etileno. De acordo com Castro et al. (2005) a enzima
ACC sintase é constitutiva e limitante à biossíntese de etileno (CASTRO et al., 2005).
Em razão dessa ação, na análise PCR semi-quantitativa da presente pesquisa,
foram amplificados transcritos do gene que codifica a ACS em todas as fases de
desenvolvimento dos frutos de cafeeiro, com aumento significativo em frutos em
maturação (vc) e maduro (c) (Figura 31). Esses dados corroboram àqueles obtidos por
Nakatsuka et al. (1998) e Alba et al. (2005), os quais verificaram expressão máxima do
gene ACS após o início da maturação, quando também deve ocorrer a maior síntese de
etileno, conseqüentemente.
76
Figura 31 - Amplificação por RT-PCR de transcritos do gene ACS pareado ao gene
controle Actina, nas cultivares Mundo Novo (MN), Catuaí Vermelho (CV),
Icatu Vermelho (IV), Obatã (OB) e Icatu Precoce (IP), nas fases de
desenvolvimento dos frutos (ovário-ov; chumbinho-ch; expansão-ex; verde-
v; verde cana-vc; cereja-c e endosperma-en). Peso molecular (PM) de 100
pb. Fragmento com intensidade visual igual (=)
A atividade da enzima ACO aumenta nas fases de maturação de alguns frutos e
em condições de estresse ambiental, quando há necessidade de etileno. No entanto,
devido a produção de etileno pela ativação da enzima ACO ocorre, conseqüentemente,
maior atividade da ACS (CASTRO et al., 2005).
Nas análises do presente estudo, o gene ACO apresentou amplificação de
transcritos nas fases de crescimento do fruto (ovário, chumbinho, expansão) e reduziu
no fruto verde. Na seqüência, houve grande aumento nas fases de maturação (vc) e de
frutos maduros (c), independentemente da cultivar (Figura 32). Esses resultados
corroboram os dados de Pereira et al. (2005), Alba et al. (2005) e Budzinski et al.
(2005), para os quais os transcritos apresentaram acúmulo gradual a partir do início da
maturação.
MN
CV
= = = = = = =
PM ov ch ex v vc c en
IV
= = = = = = =
OB
= = = = = = =
IP
= = = = = = =
PM ov ch ex v vc c en
77
Figura 32 - Amplificação por RT-PCR de transcritos do gene ACO pareado ao gene
controle Actina, nas cultivares Mundo Novo (MN), Catuaí Vermelho (CV),
Icatu Vermelho (IV), Obatã (OB) e Icatu Precoce (IP), nas fases de
desenvolvimento dos frutos (ovário-ov; chumbinho-ch; expansão-ex;
verde-v; verde cana-vc; cereja-c e endosperma-en). Peso molecular (PM)
de 100 pb. Fragmento com intensidade visual igual (=)
O fator de transcrição da família ERF faz parte da via de transdução de sinal do
etileno, razão porque a expressão desse gene é rapidamente induzida pela sua
aplicação na planta (CHAVES; MELLO-FARIAS, 2006).
O padrão de amplificação de transcritos correspondentes a esse gene (ERF) foi
semelhante àquele dos genes ACS e ACO, presentes em todas as fases de
desenvolvimento dos frutos. Observou-se aumento de intensidade dos transcritos nas
fases de maturação, após decréscimo ocorrido nos frutos verde (Figura 33).
Os receptores de etileno estão ligados à membrana do retículo endoplasmático e
quando ativados, iniciam uma ou mais rotas de transdução de sinal (TAIZ; ZEIGER,
2004), com os receptores da família ETR requeridos, principalmente, nas fases de
maturação dos frutos (WILKINSON, 1995; CHAVES; MELLO-FARIAS, 2006).
MN
CV
= = = = = = =
PM ov ch ex v vc c en
IV
= = = = = = =
OB
= = = = = = =
IP
= = = = = = =
PM ov ch ex v vc c en
78
Figura 33 - Amplificação por RT-PCR de transcritos do gene ERF pareado ao gene
controle Actina, nas cultivares Mundo Novo (MN), Catuaí Vermelho (CV),
Icatu Vermelho (IV), Obatã (OB) e Icatu Precoce (IP), nas fases de
desenvolvimento dos frutos (ovário-ov; chumbinho-ch; expansão-ex;
verde-v; verde cana-vc; cereja-c e endosperma-en). Peso molecular (PM)
de 100 pb. Fragmento com intensidade visual igual (=) e maior (+)
Durante a maturação dos frutos do cafeeiro arábica verificou-se maior
intensidade de amplificação de transcritos correspondentes ao gene do receptor ETR
(Figura 34). Essa constatação se deve à maturação climatérica, em que há aumenta
síntese de etileno na maturação. Esses resultados apresentaram o mesmo padrão
daqueles que foram observados para os genes ACS, ACO e ERF.
As análises de quantificação da expressão desse gene (ETR) evidenciaram que
a fase de fruto cereja apresenta 7 vezes mais transcritos do que as fases expansão e
grão verde (Figura 35). Na fase cereja, não há diferença entre as cultivares de cafeeiro
utilizadas na presente pesquisa (Figura 35).
Na pesquisa desenvolvida por Bustamante-Porras et al. (2007), os autores
estudaram o gene ETR1 em diferentes espécies de cafeeiro, e verificaram que se trata
de um gene de cópia simples para todas as espécies, exceto em C. arabica, uma
espécie tetraplóide. No mesmo estudo, mediante análise semi-quantitativa RT-PCR, os
pesquisadores observaram a presença desse gene em todos os estádios de
MN
CV
= = = = = = =
PM ov ch ex v vc c en
IV
= = = = = = =
OB
= = = + = = =
IP
= = = + = = =
PM ov ch ex v vc c en
79
desenvolvimento dos frutos de C. canephora e C. pseudozanguebariae, sem diferenças
significativas na sua expressão.
Por ser uma família de genes, o padrão de expressão de cada um dos membros
pode ser distinto, assim como a expressão em diferentes espécies. Nas análises da
presente pesquisa, utilizou-se um membro não identificado da família ETR e a espécie
C. arabica, enquanto Bustamante-Porras et al. (2007) utilizaram as espécies C.
canephora e C. pseudozanguebariae e o membro ETR1. A utilização de espécies
diferentes e membros distintos da família ETR, podem explicar a diferença observada
no padrão de expressão entre a presente pesquisa e dos autores citados acima.
Figura 34 - Amplificação por RT-PCR de transcritos do gene ETR pareado ao gene
controle Actina, nas cultivares Mundo Novo (MN), Catuaí Vermelho (CV),
Icatu Vermelho (IV), Obatã (OB) e Icatu Precoce (IP), nas fases de
desenvolvimento dos frutos (ovário-ov; chumbinho-ch; expansão-ex;
verde-v; verde cana-vc; cereja-c e endosperma-en). Peso molecular (PM)
de 100 pb. Fragmento com intensidade visual igual (=)
A glutationa protege as plantas contra estresses como: poluição do ar, calor, frio,
déficit hídrico e metais pesados. Além disso, protege as sementes da desidratação e
possui ação antioxidante. Essas funções são efetivas quando a glutationa está reduzida
e, para tanto, depende da reação catalisada pela glutationa redutase (GR) (YOUNG;
CONN, 1956; TAIZ; ZEIGER, 2004).
MN
CV
= = = = = = =
PM ov ch ex v vc c en
IV
= = = = = = =
OB
= = = = = = =
IP
= = = = = = =
PM ov ch ex v vc c en
80
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
expansão verde cereja
Expressão Relativa
0
0,5
1
1,5
Mundo Novo Catuaí Icatu Obatã Icatu Precoce
Expressão Relativa
A
B
Figura 35 – Quantificação da expressão do gene ETR nos frutos do cafeeiro em
expansão, verde e cereja na cultivar Mundo Novo (A) e na fase cereja
para as cultivares Mundo Novo, Catuaí, Icatu Vermelho, Obatã e Icatu
Precoce (B)
Em Arabidopsis, com a análise HPLC e PCR observou a presença da GR
durante todas as fases de desenvolvimento da semente, principalmente na maturação
do embrião (CAIRNS et al., 2006). O arbusto Amelanchier alnifolia, de maturação
climatérica, também apresentou as enzimas glutationa transferase e glutationa redutase
nas fases de desenvolvimento dos frutos, com substancial aumento nas etapas finais
de amadurecimento (ROGIERS et al., 1998).
Em citros, fruto não climatérico, a enzima GR está presente em todas as fases
de desenvolvimento dos frutos, inclusive no final da maturação, quando não apresenta
alteração significativa na concentração (HUANG et al., 2007).
Na presente pesquisa, todas as fases de desenvolvimento dos frutos do cafeeiro
arábico apresentaram amplificação de transcritos referentes ao gene codificador da GR,
com aumento de intensidade dos fragmentos na fase de frutos em expansão (ex), em
maturação (vc) e maduros (c) (Figura 36). A expansão dos frutos é uma fase exigente
em fotoassimilados e água. O balanço hídrico apresentado na Figura 6 evidencia que a
referida fase coincidiu com período em havia uma pequena deficiência hídrica,
aproximadamente, 20 mm. A GR relaciona com a proteção da planta à desidratação, o
que explicaria o aumento de intensidade de transcritos referentes ao gene que codifica
essa enzima na fase de expansão.
81
Figura 36 - Amplificação por RT-PCR de transcritos do gene GR pareado ao gene
controle Actina, nas cultivares Mundo Novo (MN), Catuaí Vermelho (CV),
Icatu Vermelho (IV), Obatã (OB) e Icatu Precoce (IP), nas fases de
desenvolvimento dos frutos (ovário-ov; chumbinho-ch; expansão-ex; verde-
v; verde cana-vc; cereja-c e endosperma-en). Peso molecular (PM) de 100
pb. Fragmento com intensidade visual igual (=)
Os genes que codificam para as proteínas LEA (late embryogenesis-
abundant), constituem uma família importante na maturação de frutos, pois são
proteínas que se acumulam nas últimas fases do desenvolvimento das sementes e
são componentes importantes dos grãos. Esses genes também estão relacionados
com a proteção à dessecação, por isso são induzidos por estresse hídrico,
osmótico, salino e baixas temperaturas (ZEGZOUTI et al., 1997; TAIZ; ZEIGER,
2004).
A proteína dehydrin (DH) é um subgrupo da família LEA e sua expressão
associa à proteção do embrião e tecidos da semente ao estresse osmótico,
causado por dessecação, salinidade ou baixas temperaturas (ROBERTS et al.,
1993). Nos estudos feitos por Hinniger et al. (2006), com a cultivar Caturra, por meio
da técnica RT-PCR, os autores observaram que nos grãos há presença de
transcritos do gene codificadores da proteína DH nas fases de grão verde pequeno
até quando estão maduros, enquanto no perisperma a expressão aumenta com a
MN
CV
= = = = = = =
PM ov ch ex v vc c en
IV
= = = = = = =
OB
= = = = = = =
IP
= = = = = = =
PM ov ch ex v vc c en
82
proximidade da maturação. Esses pesquisadores observaram, também, que
cafeeiro da espécie C. canephora apresenta expressão para o gene DH somente a
partir da fase de grão verde grande.
Os resultados observados nas análises do presente estudo corroboram os
dados de Hinniger et al. (2006) (Figura 37). Transcritos amplificados
correspondentes ao gene DH estão presentes em todas as fases de
desenvolvimento dos frutos e não há diferença significativa entre as fases da
frutificação, bem como entre as cultivares utilizadas neste estudo (Figura 37).
Figura 37 - Amplificação por RT-PCR de transcritos do gene DH pareado ao gene
controle Actina, nas cultivares Mundo Novo (MN), Catuaí Vermelho (CV),
Icatu Vermelho (IV), Obatã (OB) e Icatu Precoce (IP), nas fases de
desenvolvimento dos frutos (ovário-ov; chumbinho-ch; expansão-ex;
verde-v; verde cana-vc; cereja-c e endosperma-en). Peso molecular (PM)
de 100 pb. Fragmento com intensidade visual igual (=)
O gene EMB3, membro da família LEA, está associado à embriogênese e ao
estímulo à formação de ABA (DONG; DUNSTAN, 1996). De acordo com os
resultados da presente pesquisa houve amplificação de transcritos em todas as
fases da frutificação, sem diferença visual na intensidade dos fragmentos. Esses
dados são semelhantes àqueles apresentados para o gene DH (Figura 38).
MN
CV
= = = = = = =
PM ov ch ex v vc c en
IV
= = = = = = =
OB
= = = = = = =
IP
= = = = = = =
PM ov ch ex v vc c en
83
Figura 38 - Amplificação por RT-PCR de transcritos do gene ER5 pareado ao gene
controle Actina, nas cultivares Mundo Novo (MN), Catuaí Vermelho (CV),
Icatu Vermelho (IV), Obatã (OB) e Icatu Precoce (IP), nas fases de
desenvolvimento dos frutos (ovário-ov; chumbinho-ch; expansão-ex; verde-
v; verde cana-vc; cereja-c e endosperma-en). Peso molecular (PM) de 100
pb. Fragmento com intensidade visual igual (=)
Outro gene da família LEA é o ER5, relacionado à resposta ao etileno, por isso é
muito requerido na maturação. Frutos imaturos de tomateiro apresentam expressão do
gene apenas com a aplicação exógena de etileno (ZEGZOUTI et al., 1997, 1999).
No trabalho feito por Oliveira (2007), em que estudou o desenvolvimento de
frutos de C. arabica, o autor observou maior intensidade de transcritos desse gene
(ER5) da família LEA a partir das fases finais de desenvolvimento.
No presente estudo, durante o desenvolvimento dos frutos de cafeeiro, observou
a presença de fragmentos de ER5, mais intensamente em frutos verde, exceto na
cultivar Icatu Vermelho, em que a maior intensidade se deu em frutos verde cana
(Figura 38). Os resultados apresentados nessa figura evidenciam a amplificação de
outro transcrito de menor intensidade e maior tamanho. Esse fragmento reduz quase
totalmente, a partir de fase verde. A amplificação do referido fragmento pode ter
resultado da presença de um alelo diferente, de expressão reduzida. Tal suposição se
MN
CV
= = = = = = =
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IV
= = = = = = =
OB
= = = = = = =
IP
= = = = = = =
PM ov ch ex v vc c en
84
deve ao fato da espécie C. arabica ser alotetraplóide, o que aumenta a probabilidade de
mais de um alelo expresso, ou ainda de processamento alternativo.
Figura 39 - Amplificação por RT-PCR de transcritos do gene csp1 pareado ao gene
controle Actina, nas cultivares Mundo Novo (MN), Catuaí Vermelho (CV),
Icatu Vermelho (IV), Obatã (OB) e Icatu Precoce (IP), nas fases de
desenvolvimento dos frutos (ovário-ov; chumbinho-ch; expansão-ex; verde-
v; verde cana-vc; cereja-c e endosperma-en). Peso molecular (PM) de 100
pb. Fragmento com intensidade visual igual (=) e menor (-).
Em frutos de café, a proteína de reserva 11S acumula-se a partir da décima
oitava semana após a florada e atinge máxima expressão 27 semanas depois da
antese (MARRACCINI et al., 1999). Por meio da técnica RT-PCR os autores
observaram que na espécie C. arabica havia transcritos amplificados do gene csp1,
codificador dessa proteína (11S), em endosperma maduro e ausente no perisperma.
Esses resultados foram confirmados por Lin et al. (2005) em análise in silico de ESTs
homólogos na biblioteca de cDNA de cafeeiro arábica.
Na presente pesquisa obteve resultados semelhantes nas análises do gene
csp1. Foram amplificados transcritos com pequena intensidade nas fases iniciais de
desenvolvimento dos frutos, a qual aumenta a partir de fruto verde (Figura 39). Os
frutos verdes já estão formados, com o endosperma na forma sólida e apta para o início
da maturação.
MN
CV
= = = = = = =
PM ov ch ex v vc c en
IV
= = = - = = =
OB
= = = = = = =
IP
= = = = = = =
PM ov ch ex v vc c en
85
Figura 39 - Amplificação por RT-PCR de transcritos do gene csp1 pareado ao gene
controle Actina, nas cultivares Mundo Novo (MN), Catuaí Vermelho (CV),
Icatu Vermelho (IV), Obatã (OB) e Icatu Precoce (IP), nas fases de
desenvolvimento dos frutos (ovário-ov; chumbinho-ch; expansão-ex; verde-
v; verde cana-vc; cereja-c e endosperma-en). Peso molecular (PM) de 100
pb. Fragmento com intensidade visual igual (=)
A enzima isocitrato liase (ICL) é específica para a germinação, pois é a chave no
ciclo do glioxilato, onde são transformados ácidos graxos em hidratos de carbono (TAIZ;
ZEIGER, 2004; DE ROBERTIS; HIB, 1998).
Em estudos de Selmar et al. (2004), os autores sugerem que a isocitrato liase
pode ser indicativa da qualidade da bebida de café, em que a superioridade da bebida
correlaciona com a maior quantidade da enzima. Seus resultados mostram ausência de
transcritos em sementes frescas e presentes em sementes preparadas por via úmida
desde o primeiro dia de secagem e por via seca a partir do terceiro dia de secagem.
A análise PCR semi-quantitativa da presente pesquisa revelou presença de
fragmentos correspondentes ao gene codificador dessa enzima (ICL) nas fases finais
do processo, época que as sementes estão formadas e aptas à germinação (Figura 40).
Em Mundo Novo e Icatu Vermelho, a amplificação de transcritos do gene foi mais tardia,
observada em fruto verde cana. Nas demais cultivares ocorreram fragmentos na fase
MN
CV
= = = = = = =
PM ov ch ex v vc c en
IV
= = = = = = =
OB
= = = = = = =
IP
= = = = = = =
PM ov ch ex v vc c en
86
verde. Esses resultados indicam diferença na constituição genética das cultivares, mas
não definem ciclos de maturação, haja vista que a cv. Mundo Novo tem maturação
média e média a tardia na cv. Icatu Vermelho, como também ocorre na cv. Catuaí
Vermelho.
Nas análises de quantificação da expressão do gene ICL para as amostras de
frutos em expansão, verde e cereja na cultivar Mundo Novo, observou que esse gene
foi, aproximadamente, 800 vezes mais expresso na fase cereja, em relação às fases
expansão e verde. Entre as cultivares na fase cereja, a diferença de expressão do gene
ICL foi pouco relevante (Figura 41). Esses resultados confirmam os dados obtidos pela
análise semi-quantitativa RT-PCR.
Figura 40 - Amplificação por RT-PCR de transcritos do gene ICL pareado ao gene
controle Actina, nas cultivares Mundo Novo (MN), Catuaí Vermelho (CV),
Icatu Vermelho (IV), Obatã (OB) e Icatu Precoce (IP), nas fases de
desenvolvimento dos frutos (ovário-ov; chumbinho-ch; expansão-ex;
verde-v; verde cana-vc; cereja-c e endosperma-en). Peso molecular (PM)
de 100 pb. Fragmento com intensidade visual igual (=) e maior (+)
MN
CV
= = = + = = =
PM ov ch ex v vc c en
IV
= = = = = = =
OB
= = = + = = =
IP
= = = + = = =
PM ov ch ex v vc c en
87
0
100
200
300
400
500
600
700
expansão verde cereja
Expressão Relativa
0
0,5
1
1,5
Mundo Novo Catuaí Icatu Obatã Icatu Precoce
Expressão Relativa
A
4.3 Considerações Gerais
Os resultados apresentados discutidos indicam que a estratégia experimental
adotada para avaliar os atributos fenológicos foi eficiente, pois mesmo com grande
influência ambiental pôde se diferenciar as cultivares quanto ao ciclo de
desenvolvimento dos frutos.
Os atributos agronômicos evidenciam diferença entre as safras, o que indica que
o fenômeno da bienalidade de produção do cafeeiro é influenciado pelas variações
ambientais.
Nas análises genéticas, os genes relacionados ao desenvolvimento do embrião
podem ser divididos em: (i) formação (GN, SCR, STM, ARF e ASN1) e (ii) germinação
(ABA3/FLACCA e cat). Os resultados das análises evidenciaram que os genes desse
grupo apresentaram amplificação de transcritos em todas as fases de desenvolvimento
dos frutos, hipótese que era esperada e foi comprovada na presente pesquisa.
Os genes relacionados com os componentes químicos dos frutos podem ser
reunidos na biossíntese da cafeína (MS, TS e CS), dos ácidos clorogênicos
(CCoAOMT1 e 4cl), de metabólitos secundários (PAL, CHS e IFS), da síntese de aroma
(AAT) e de açúcares (GLA e manB). Aqueles relacionados com a síntese da cafeína e
dos ácidos clorogênicos diminuíram a intensidade dos fragmentos com a proximidade
da maturação, enquanto os demais genes, desse grupo, intensificaram nas fases finais
Figura 41 – Quantificação da expressão do gene ICL nos frutos do cafeeiro em
expansão, verde e cereja na cultivar Mundo Novo (A) e na fase cereja
para as cultivares Mundo Novo, Catuaí, Icatu Vermelho, Obatã e Icatu
Precoce (B)
88
de desenvolvimento.
No processo de maturação e amadurecimento dos frutos os genes estudaram-se
àqueles relacionados com a síntese de etileno (ACO, ACS, ERF e ETR), bem como
GR, DH, ER5 e ICL. A maioria desses genes aumentou a intensidade dos fragmentos
nas fases finais de desenvolvimento dos frutos, exceto os genes DH e EMB3, os quais
mantiveram a mesma expressão em todos os estádios de desenvolvimento do fruto.
Os resultados das análises genéticas apresentados pelos grupos de
componentes químicos e maturação e amadurecimento dos frutos corroboram os dados
revisados na literatura para as espécies de maturação climatérica (TAIZ; ZEIGER,
2004; CASTRO et al., 2005). Durante o climatério aumenta a síntese de etileno e,
conseqüentemente, há, também, aumento da expressão dos genes relacionados ao
hormônio.
As variações de intensidade de fragmentos entre as cultivares sugerem que a
composição química e a maturação podem diferir ao longo do desenvolvimento dos
frutos. Porém, essa diferença não indica duração do ciclo, em razão de não estarem
relacionadas à precocidade.
Os resultados das análises genéticas sugerem que para a identificação da
duração do ciclo de desenvolvimento dos frutos, as amostras deveriam ser coletadas
utilizando, como referência, dias após a florada. Esse procedimento permitiria observar
a mudança de expressão dos genes desde o início. As análises indicaram também que
a partir de frutos em expansão até o final da maturação (grão cereja) seria a principal
fase dos frutos para estudos dessa natureza. Nesse período, ocorreram as principais
variações de expressão gênica.
Entre as cultivares, pode-se ainda observar que as cultivares Obatã e Icatu
Vermelho apresentaram maior variação na expressão dos genes, ns frutificação, o que
sugere serem cultivares ainda instáveis para essa característica, possivelmente porque
são oriundas de cruzamento interespecífico e, portanto, trata-se de material em
segregação.
As análises RT-PCR forneceram subsídios para a observação do perfil de
expressão dos genes estudados. Nos resultados não se verificou a ocorrência de
polimorfismo de expressão e de polimorfismo gênico (tamanho de fragmentos).
89
Verificou somente polimorfismo temporal entre as fases de desenvolvimento dos frutos
e entre as cultivares, o que foi confirmado nas análises de quantificação da expressão
gênica. A possibilidade da existência de polimorfismo gênico e de expressão não é
descartada, pois a região amplificada do gene foi pequena, e pode não ter abrangido a
região polimórfica.
Os resultados do polimorfismo temporal possibilitaram a identificação de alguns
genes candidatos a marcadores genéticos das fases de desenvolvimento dos frutos de
cafeeiro arábica (Tabela 3). Esses genes marcadores em associação com atributos
fenológicos e agronômicos, podem ser utilizados como parâmetros moleculares para a
definição dos estádios para a colheita, assegurando composição final específica dos
frutos e a qualidade da bebida.
A fase de crescimento, compreendida entre a fase de ovário fecundado até grão
verde, foi marcada pelo padrão de expressão dos genes PAL, CHS e manB. Como
observado nas análises por RT-PCR e PCR quantitativo, o gene PAL apresentou
aumento de expressão em frutos em expansão e redução no grão verde - fruto com
tamanho máximo. O gene PAL sintetiza compostos fenólicos secundários e sua
expressão é altamente influenciada pelo ambiente, por estar relacionada à proteção das
plantas.
O gene CHS está relacionado, também, com a síntese de compostos
importantes à proteção das plantas, principalmente contra raios UV. Nas análises desse
estudo foi observada presença constante de fragmentos amplificados em todas as
fases de desenvolvimento dos frutos, exceto em fruto verde, na fase de transição entre
crescimento e maturação. O gene manB, que sintetiza a enzima endo-β-mannanase,
está presente em maior quantidade quando os frutos estão aptos à germinação, o que
acontece em grão verde, época que os fragmentos são visualmente menos intensos.
A transição do crescimento para o início da maturação foi marcada pelos genes
csp1, GLA e ER5. O gene csp1, que codifica a proteína de reserva 11S, apresentou
transcritos intensos a partir de fruto verde – com endosperma formado. A enzima α-
galactosidase, envolvida na síntese de carboidratos e o gene codificador da enzima,
aumenta substancialmente a expressão em grão verde com decréscimo na fase cereja,
comprovado pelos resultados da presente pesquisa.
90
ER5 é um gene da família LEA, relacionado à resposta ao etileno. Esse gene
apresenta significativo aumento na intensidade dos fragmentos na fase verde, assim
como para os demais genes que marcam a referida fase.
Os genes indicativos da maturação e amadurecimento dos frutos de cafeeiro
arábica foram: CS, AAT, ACS, ACO, ETR e ICL. O gene CS, respondeu pela síntese da
cafeína sintase, cuja expressão reduziu marcantemente a partir de fruto verde cana,
devido ao início da maturação. O gene AAT sintetiza a enzima relacionada ao
desenvolvimento do aroma em frutos de cafeeiro, e se manifesta desde o início da
maturação, quando a amplificação de transcritos é intensa.
ACC sintase e ACC oxidase são enzimas da biossíntese do etileno, codificadas
pelos genes ACS e ACO, respectivamente. Nesse estudo, análise semi-quantitativa
para expressão desses genes evidenciaram aumento da intensidade de transcritos
amplificados em frutos verde cana e cereja, fases com intensa síntese de etileno. O
gene para receptor de etileno (ETR) apresentou o mesmo padrão de expressão que os
da biossíntese do etileno. A enzima ICL presente durante a germinação das sementes e
o gene codificador, avaliado nesta pesquisa, apresentou aumento de expressão a partir
da fase verde cana, com maior intensidade na fase cereja.
A transição da maturação para amadurecimento também é marcada pelo gene
PAL. Aumentou a expressão do gene no início da maturação (vc) até a fase cereja (c).
Devido aos genes PAL e CHS serem influenciados pelo ambiente, as fases de
crescimento e transição entre maturação e amadurecimento, marcada pela expressão
diferencial do gene PAL, e a fase de transição entre crescimento e maturação, marcada
pelo gene CHS, serão definidas pelas condições ambientais como: temperatura e
disponibilidade hídrica. As condições ambientais podem antecipar ou retardar a
expressão desses genes, o que influenciaria a duração do ciclo da frutificação.
Assim, como observado nas Figuras 5, 6 e 7, altas temperaturas reduzem o
desenvolvimento dos frutos, atingindo o ponto de colheita antecipadamente. Além do
que influencia nas características tecnológicas do produto, como: produção, grãos
normais e tamanhos dos grãos (Figura 8). A deficiência hídrica afeta, principalmente, as
características comerciais do produto e a produção, em razão do aborto de flores
quando submetidas a longos períodos de estiagem.
Tabela 3 – Fases fenológicas dos frutos de cafeeiro arábica e respectivos marcadores gênicos, em que o sinal (–) indica
ausência de transcritos, (+/-) baixa expressão, (+) expressão normal e (++) alta expressão de transcritos
Desenvolvimento frutos crescimento maturação amadurecimento
Fator
ambiental
ov
ch
ex
v
vc
c
en
Fases fenológicas
SET/OUT/NOV/DEZ JAN/FEV/MAR ABR/MAI/JUN
PAL, CHS, manB CS, AAT, ACS, ACO, ETR, ICL
água, luz,
temperatura
csp1, GLA, ER5
PAL
temperatura e
água
Genes marcadores
PAL +/- +/- ++ - +/- + -
CHS + + + - + + -
manB + + + - + + +
csp1 - - - + + + +
GLA - - - ++ + + +
ER5 - - - + + + +
CS +/- +/- + + - - -
AAT - - - - + + +
ACS +/- +/- +/- +/- ++ + +
ACO +/- +/- +/- +/- ++ ++ +
ETR +/- +/- +/- +/- ++ ++ ++
Padrão de
expressão
de genes
marcadores
ICL - - - + ++ ++ ++
91
92
5 CONCLUSÕES
1. Os atributos fenológicos (duração do ciclo, fases de frutificação e maturação) e
agronômicos (produção, rendimento, tipos de sementes e de peneira) variam com o ano
agrícola e a duração do ciclo fenológico diferenciou as cultivares.
2. Não há diferença no padrão de expressão gênica entre as safras e as
cultivares avaliadas apresenta padrão similar de comportamento.
3. As condições ambientais influenciam o padrão de expressão dos genes ABA,
CHS, PAL e GR nas cultivares avaliadas.
4. O polimorfismo temporal observado nas cultivares permite identificar genes
marcadores do desenvolvimento de frutos do cafeeiro arábica.
5. Os genes marcadores identificados na fase de crescimento dos frutos foram:
PAL, CHS e manB; na transição entre crescimento e início da maturação (csp1, GLA e
ER5); na maturação e amadurecimento (CS, AAT, ACS, ACO, ETR e ICL) e na
transição entre maturação e amadurecimento o gene PAL.
6. A expressão dos genes apresentou padrão de espécie com maturação
climatérica.
93
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104
ANEXO
105
ANEXO A – Resultados obtidos com o sequenciamento dos cDNAs
Homologia
Genes
Organismo Produto
E value
Similaridade
(%)
Identidade
(%)
ABA3/FLACCA L.esculentum
cofator
molibdênio
sulforase
2e-18 75 55
ARF Ipomoea nil
fator de
resposta à
auxina
8e-47 96 93
ASN1 L.esculentum
asparagina
sintase
9e-72 100 94
DH
C.
canephora
dehydryn 3e-18 100 100
EMB3 A. thaliana
proteína da
família LEA
1e-49 93 85
ER5
Brassica
napus
proteína da
família LEA
3e-09 96 88
ERF1
Gossypium
hirsutum
fator de
resposta ao
etileno
3e-22 74 55
ETR1
Solanum
tuberosum
receptor de
etileno
2e-49 92 84
GN A. thaliana GNOM 1e-30 90 84
LEC1 S. tuberosum
fator de
transcrição
1e-17 100 92
SC A. thaliana SCARECROW 1e-44 89 70
STM
Prunus
persica
proteína
homeobox
6e-59 96 92
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