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Universidade Federal do Rio de Janeiro
Michelle Oliveira de Castro
Rio de Janeiro
2008
Papel de polissacarídeos
sulfatados na fertilização de
ouriços-do-mar
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2
Michelle Oliveira de Castro
Papel de polissacarídeos sulfatados na fertilização
de ouriços-do-mar
Tese de Doutorado submetida ao Instituto
de Bioquímica Médica da UFRJ visando à
obtenção do grau de Doutor em Química
Biológica
Orientador: Paulo Antônio de Souza Mourão
Professor Titular – UFRJ
Co-orientadora: Ana Cristina Espirito Santo
Vilela-Silva
Professora Adjunta – UFRJ
Anexo 1: Carbohydrate-based species
recognition in sea urchin fertilization: another
avenue for speciation? Evolution & Development,
6:5, 353–361 (2004).
Anexo 2:
Expression of two different sulfated
fucans by females of Lytechinus variegatus may
regulate the seasonal variation in the fertilization of
the sea urchin. Glycobiology vol. 17 no. 8 pp. 877–
885, 2007.
Universidade Federal do Rio de Janeiro
2008
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3
Castro, Michelle Oliveira de. Papel de
polissacarídeos sulfatados na fertilização de ouriços-do-
mar/ Michelle Oliveira de Castro. Rio de Janeiro, 2008.
xvii, 127 f.: il.
Tese (Doutorado em Química Biológica) –
Universidade Federal do Rio de Janeiro, Instituto
Instituto de Bioquímica Médica, 2008.
Orientador: Paulo Antônio de Souza Mourão
Co-orientadora: Ana Cristina Espirito Santo Vilela Silva
1. Fertilização. 2. Polissacarídeos sulfatados 3.Ouriços-do-mar
I.Mourão, Paulo Antônio de Souza (Orient.). II.
Universidade Federal do Rio de Janeiro. Instituto
de Bioquímica Médica. III. Papel de polissacarídeos sulfatados
na fertilização de ouriços-do-mar.
4
Folha de aprovação
Papel de polissacarídeos sulfatados na fertilização de ouriços-do-mar
Orientador: Paulo Antônio de Souza Mourão, Prof.Titular, Instituto de
Bioquímica Médica, UFRJ
Co-orientadora: Ana Cristina Espirito Santo de Vilela Silva, Prof. Adjunta,
Instituto de Ciências Biológicas, UFRJ
Banca Examinadora
Prof. Ana Maria Landeira-Fernandez
Prof. Adjunta do Instituto de Bioquímica Médica da UFRJ
Prof. Maria Teresa Villela Romanos, Professora Adjunta do Instituto de
Microbiologia Paulo de Goés da UFRJ
Prof. Adriane Regina Todeschini, Professora Adjunta do Instituto de Biofísica da
UFRJ
Suplente interno:
Prof. Andrea Thompson Da Poian, Professora Adjunta do Instituto de Bioquímica
Médica da UFRJ
Suplente externo:
Prof. Silvana Allodi, Prof. Adjunta do Departamento de Histologia e
Embriologia do Instituto de Ciências Biomédicas da UFRJ
5
AGRADECIMENTOS
Essa tese começou a ser desenvolvida em 2002, no início do meu Mestrado.
Foram 6 anos de muito trabalho, mas também de muita ajuda.
A primeira pessoa que quero agradecer é meu orientador, Paulo Antônio de
Souza Mourão. Pela oportunidade, paciência, dedicação e entusiasmo com cada
experimento que dava certo.
A minha co-orientadora, Ana Cristina Vilela-Silva, que me acompanhou em
cada passo desde 1999, quando ela era uma aluna de Mestrado. Foi a Ana quem me
ensinou a fazer cada experimento, a acreditar que ia dar certo, a não me deixar
desistir nos momentos difíceis. A Ana passou de orientadora a amiga, sempre me
escutando, mesmo quando eu não estava certa, com a maior paciência do mundo. E
ela teve muita paciência comigo, nossa. Ana, muito obrigada, por ter me orientado da
maneira como você me orientou, ter me ajudado tanto, e por me ajudar até hoje.
Professora Mariana, como não agradecer a você; Me ajudou muito em tudo
que pedi, absolutamente tudo, mesmo quando estava atolada de trabalho até o
pescoço. Uma das poucas pessoas que a gente pode dizer o que pensa, (e vice
versa), portanto com a melhor opinião sobre tudo.
Professora Ana Tovar, presença indispensável no laboratório, sempre tirando
dúvidas, ajudando em qualquer coisa. A Ana é dessas pessoas que você pergunta
alguma coisa e ela para tudo pra te responder.
Aos demais professores do lab, Mauro e Luís Cláudio, também sempre
solícitos.
A todos meus amigos do lab, Robertino, Bolo, Fabinho, Lizandra, Marianinha,
Vítor, Bruno, Miúdo, Nelson, Celso, Cíntia, Eliene, Xalalá, obrigada a toda ajuda.
Adriana, enquanto foi secretária do lab, quebrou vários galhos, me ajudou
muito, super obrigada.
6
São muitas pessoas, não dá pra falar individualmente de cada uma, mas
algumas são fundamentais:
À Livia, meu braço direito e esquerdo. Entrou no lab pra ser minha estagiária,
comprou todas as brigas comigo, eu sei que é só falar que ela me defende. Esteve
do meu lado em cada experimento, gastou olhos tanto como eu no microscópio, em
cada gráfico tem as mãos dela também. Juntas conseguimos algo inédito, fomos a
um congresso maravilhoso (poderia até ter sido melhor não fosse o pudim de café;
Mas tudo bem, ele estava bom mesmo!). Nos tornamos Amigas, e vamos ser pra
sempre. Livia, torço muito por você, você não tem idéia de quanto. Obrigada mesmo,
por tudo. Não fosse você, essa tese não seria assim.
Clarice, e como eu tive sorte com estagiárias. Dedicada, pontual, despencava
de São Gonçalo de ônibus e chegava mais cedo que eu...Obrigada por todas as
vezes que você esteve ali, por tudo que você fez. Assim como a Livia, suas mãos
estão em muitos experimentos, sua dedicação, seu empenho. E como estou
orgulhosa de vocês duas agora!
Rafa, a você eu tenho muito que agradecer. Tantas coletas, tantas vezes que
você me ouviu, me ajudou, torceu por mim, esteve do meu lado. Melhor amigo eu
não poderia ter, nunca. Eu sei que sempre vou poder contar com você, e você
comigo. Foram muitos experimentos,aulas, RMNs, nossa, quanta coisa aconteceu.
Obrigada por tudo, mais ainda por ser meu amigo.
Bibi, o melhor ouvido, horas e horas ao telefone, nós duas falando muito e
escutando muito. Obrigada por toda sua ajuda sempre, todas caronas, sugestões
conselhos....Obrigada por ter se tornado uma amiga tão especial.
7
A todos aqueles que muitas vezes me ajudaram até sem saber, quando usei o
fluorímetro, ou o microscópio. E eu usei muitos, então muito obrigada a todos.
A pessoas muito especiais na minha vida;
Meu pai, obrigada por tudo, pelo apoio, pelo orgulho que sente de mim, por
me ouvir. Por me ajudar sempre que pôde, por tentar sempre. Amo você pai.
Minha mãe, por sua dedicação sem fim, seu orgulho, por nunca achar que vai
dar errado, por me incentivar sempre. A pessoa mais positiva desse mundo, a que
não me deixou desistir nunca. Amo você
Meu namorado, que do nada foi levado para esse meio, e hoje entende do que
eu faço. Obrigada por estar aqui pra mim, por me fazer sentir segura, por ter orgulho,
por ter escutado tantas e tantas vezes. Por me ajudar em tudo, por cuidar de mim,
por fazer tudo que estava ao seu alcance para me ajudar.
Meus irmãos, que eu sei que posso contar sempre. Meu irmão, a pessoa mais
prestativa desse mundo; Minha irmãzinha, que tantas vezes cuidou de mim, fez
comida quando eu estava estudando, me deu chocolate, abaixou o som...Ali do lado
todo dia, aí que a gente vê quando alguém é importante.
Obrigada a todos que, de alguma forma, me ajudaram a realizar esse trabalho.
8
ÍNDICE
Lista de abreviaturas
XIII
Resumo
XIV
Abstract
XVI
Introdução
18
1. Polissacarídeos sulfatados
18
1.1 Polissacarídeos sulfatados em invertebrados
19
1.2 Atividades biológicas de fucanas sulfatadas de algas e
invertebrados marinhos
20
2) Ouriço-do-mar
23
2.1 Estrutura dos gametas
24
3) Fertilização
25
3.1) Fertilização em ouriços-do-mar
26
3.1.1) Mobilidade e quimiotaxia dos espermatozóides
28
3.1.2 Reação acrossômica
29
3.1.3 Espécie-especificidade na fertilização dos ouriços-do-mar
33
3.1.4 Interação entre bindina e seu receptor na superfície do óvulo
37
Objetivos
40
Materiais e Métodos
41
Resultados e Discussão
51
Capítulo 1) A espécie-especificidade da fertilização nos ouriços-
do-mar é assegurada pela estrutura de polissacarídeos sulfatados
51
1) A importância da sulfatação e da ligação glicosídica no
reconhecimento entre gametas
52
1.1) As fucanas sulfatadas induzem a captação de cálcio
pelos ouriços-do-mar
62
1.1.2 Ensaios com espermatozóides de A. lixula
64
1.1.3) Ensaios com espermatozóides de E. lucunter
68
1.1.4) Ensaios com espermatozóides de L. variegatus
71
1.2) Ensaios de fertilização
74
Conclusões capítulo 1
76
Capítulo 2) Uma fucana sulfatada inativa de L. variegatus com
expressão sazonal
80
Purificação e caracterização estrutural da fucana sulfatada
80
2.1) Qual o significado fisiológico da fucana sulfatada II de L.
variegatus?
86
Conclusões capítulo 2
90
Capítulo 3) O ouriço-do-mar Glyptocidaris crenularis contém uma
β-galactana sulfatada
92
Purificação e caracterização estrutural de uma galactana sulfatada
de G. crenularis
93
9
3.1) Conformações distintas das α- e β galactanas sulfatadas
101
3.1.2) Conformação de α- e β-galactanas sulfatadas
102
3.2) Estrutura x atividade biológica
104
Conclusões capítulo 3
107
Conclusões Finais
109
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
111
Anexo 1
124
Anexo 2
134
10
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1)
Estruturas químicas dos polissacarídeos sulfatados de
ouriços-do-mar.
22
Figura 2) Modelo esquemático da estrutura de um ouriço-do-mar. 24
Figura 3) Fertilização em ouriços-do-mar. 27
Figura 4)
Estruturas químicas dos polissacarídeos sulfatados de
ouriços-do-mar.
54
Figura 5) Sucesso na fertilização entre es
permatozóides do gênero
Strongylocentrotus.
55
Figura 6) Imagens confocais de espermatozóides. 56
Figura 7) Indução da reação acrossômica por diferentes fucanas
sulfatadas em espermatozóides de S. droebachiensis, S. pallidus,
S. purpuratus e S. franciscanus.
60
Figura 8)
Indução da reação acrossômica em espermatozóides de
S. droebachiensis
coletados nos Oceanos Pacífico e Atlântico e em
espermatozóides de S. purpuratus e S. franciscanus
pela fucanas
de S. droebachiensis ( fucana sulfatada I) e A. lixula.
61
Figura 9
) Estruturas químicas dos polissacarídeos sulfatados de
ouriços-do-mar.
63
Figura 10) Captação de cálcio em espermatozóides da espécie
A.
lixula.
66
Figura 11)
Reação acrossômica observada em espermatozóides da
espécie A. lixula.
68
Figura 12)
Captação de canais de cálcio em espermatozóides da
espécie E. lucunter.
70
Figura 13)
Reação acrossômica observada em espermatozóides
da espécie E. lucunter.
71
Figura 14) Captação de cálcio em espermatozóides de
L.
variegatus.
72
Figura 15) A- Reaçã
o acrossômica observada em
espermatozóides da espécie L. variegatus e B
: foto do
espermatozóide reagido e não reagido, duplamente marcado para
rodamina-faloidina e DAPI.
73
Figura 16)
% de óvulos fertilizados por espermatozóides
homólogos e heterólogos de três espécies de ouriços-do-mar.
75
Figura 17) Purificação das fucanas sulfatadas da matriz gelatinosa
de óvulos de ouriço-do-mar da espécie L. variegatus .
82
Figura 18)
Estrutura da fucana sulfatada I (P1) habitualmente
encontrada na matriz gelatinosa de L. variegatus.
83
Figura 19)
Espectro unidimensional de 1H a 600 MHz da fucana
sulfatada I e da fucana sulfatada II.
84
11
Figura 20)
Estrutura da fucana sulfatada II (P2) encontrada na
matriz gelatinosa de L. variegatus.
86
Figura 21) Indução da reaç
ão acrossômica em espermatozóides
da espécie L. variegatus.
87
Figura 22)
Purificação dos polissacarídeos sulfatados obtidos de
fêmeas individuais da L. variegatus
coletadas durante o inverno e
no verão.
88
Figura 23) Análise do peso seco da matriz gelatinosa e dos
polissacarídeos totais obtidos de fêmeas individuais de L.
variegatus coletadas ao longo de um ano.
89
Figura 24)
Purificação dos polissacarídeos sulfatados da matriz
gelatinosa de óvulos de ouriço-do-mar da espécie G. crenularis.
94
Figura 25) Espectro unidimensional de
1
H-
RMN a 400 MHz da
galactana sulfatada intacta do ouriço-do-mar G. crenularis
e a
mesma galactana dessulfatada quimicamente.
95
FIGURA 26)
Tiras das regiões anoméricas (expansões entre ~ 4.5
a ~ 5.1 ppm) de COSY, TOCSY e NOE
SY de espectros da
galactana sulfatada de G. crenularis intacta
e dessulfatada
quimicamente.
97
Figura 27) Espectro de
1
H/
13
C HSQC da galactana sulfatada
intacta de G. crenularis e dessulfatada quimicamente.
98
Figura 28) Estrutura da galactana sulfatada de G. crenularis.
99
Figura 29) Descrição conformacional de galactanas.
103
Figura 30) Reação acrossômica em espermatozóides de E.
lucunter e captação de cálcio em espermatozóides de E. lucunter.
106
12
ÍNDICE DE TABELAS
Tabela 1) Deslocamento químico de prótons em resíduos de α-
fucose dos polissacarídeos sulfatados de L. variegatus e em
compostos padrão.
85
Tabela 2) Deslocamento químico de carbonos para resíduos de α-
fucose da fucana sulfatada II de L. variegatus e em compostos
padrão.
85
Tabela III) Deslocamentos químicos de
1
H and
13
C (ppm),
3
J
H-H
e
1
J
C-H
do espectro de RMN da α-L-galactana sulfatada de E.
lucunter e da β-galactana sulfatada de G. crenularis
100
13
LISTA DE ABREVIATURAS
AgNO
3
Nitrato de prata
AMPc
Adenosina monofosfato cíclico
ATP
Adenosina trifosfato
BaCl
2
Cloreto de bário
Ca
+
Cálcio
CaCl
2
Cloreto de cálcio
CETAVLON
Brometo de cetilmetilamônio
CO
2
Dióxido de carbono
D
2
O Água deionizada
DAPI 4',6-diamino-2-phenylindole,
diidroclorido
DMB Dimetil azul de metileno
DMSO Dimetilsulfóxido
EDTA Ácido etildiaminotetracético
FURA-2 AM Marcador fluorescente para cálcio
intracelular permeável à membrana
GMPc
Guanosina monofosfato cíclica
K
+
Potássio
kDa
Quilo dálton
KCl Cloreto de potássio
Na
+
Sódio
NaOH Hidróxido de sódio
NaCl Cloreto de sódio
MgSO
4
.7H
2
O Sulfato de magnésio heptahidratado
p-DAB Para-dimetilaminobenzaldeído
PBS TAMPÃO SALINA FOSFATO
TFA Ácido trifluoroacético
NH
4
OH Hidróxido de amônio
NaSO
4
anidro Sulfato de sódio anidro
14
RESUMO
CASTRO, Michelle Oliveira de. Papel de polissacarídeos sulfatados na
fertilização de ouriços-do-mar. Rio de Janeiro, 2008. Tese de Doutorado, Instituto de
Bioquímica Médica, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2008.
Os óvulos de ouriços-do-mar são envolvidos por uma matriz gelatinosa
composta, predominantemente, por polissacarídeos sulfatados. Esta matriz é
especializada na interação dos gametas, sendo o polissacarídeo sulfatado
responsável pela indução da reação acrossômica de maneira espécie-específica em
espermatozóides. Essa reação acrossômica é um evento que acontece logo após o
contato inicial entre óvulo e espermatozóide, mais precisamente entre polissacarídeo
sulfatado da matriz gelatinosa e seu receptor na membrana plasmática do
espermatozóide, e se caracteriza pela emissão de um prolongamento de actina
polimerizada. Na ponta desse processo acrossomal fica a bindina, proteína
responsável pela interação com o óvulo. Em sua grande maioria, esses
polissacarídeos sulfatados são formados por resíduos de fucose, sendo então
chamados de fucanas sulfatadas.
Neste trabalho, foi investigada a relação entre estrutura do polissacarídeo
sulfatado versus atividade fisiológica na indução da reação acrossômica em
espermatozóides do gênero Strongylocentrotus (provenientes do oceano Pacífico), e
em espermatozóides de três espécies presentes no litoral do Rio de Janeiro: Arbacia
lixula, Lytechinus variegatus e Echinometra lucunter. Foi visto que as espécies do
gênero Strongylocentrotus mantém sua espécie-especificidade mais restrita a
interação entre bindina e receptor na superfície do óvulo, enquanto os
espermatozóides das espécies do Rio de Janeiro foram mais restritivos:
15
espermatozóides de L. variegatus e A. lixula somente reconheceram polissacarídeos
sulfatados com estrutura idêntica ao presente em sua própria matriz gelatinosa,
enquanto espermatozóides de E. lucunter reconheceram, além do polissacarídeo
sulfatado presente em sua própria matriz gelatinosa, um segundo polissacarídeo
sulfatado com estrutura similar a sua.
Foi estudado o período de reprodução de L. varigatus, devido a observação de
que um segundo polissacarídeo sulfatado é secretado em sua matriz gelatinosa em
certas épocas do ano somente. A estrutura deste polissacarídeo foi elucidada e,
como o primeiro, trata-se de uma fucana sulfatada. Porém, possui alterações na
estrutura: enquanto a primeira possui unidades tetrassacarídicas repetitivas, unidas
por ligação glicosídica 1→3, e com a posição do sulfato variando entre as posições 2
e 4, a segunda é formada por unidades monossacarídicas repetitivas, também
unidas por ligação glicosídica 1→3, porém com sulfato na posição 4 somente.
Por fim, um estudo complementar permitiu demonstrar a estrutura do
polissacarídeo sulfatado presente na matriz gelatinosa do ouriço-do-mar
Glyptocidaris crenularis, uma espécie proveniente do Japão. Trata-se de um
polissacarídeo sulfatado formado por unidades de galactose, sendo a segunda
espécie já descrita com essa característica. Também tentamos fazer experimentos
de fertilização com essa espécie, o que não foi possível devido ao pequeno tamanho
do espermatozóide. Entretanto, determinamos a estrutura da galactana sulfatada
presente na matriz gelatinosa, e é a seguinte: [→3)-β-Galp-2(SO
4
)-(1→3)-β-Galp-
(1→]
n
.
16
ABSTRACT
CASTRO, Michelle Oliveira de. Papel de polissacarídeos sulfatados na
fertilização de ouriços-do-mar. Rio de Janeiro, 2008. Tese de Doutorado, Instituto de
Bioquímica Médica, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2008.
The egg jelly coat which surrounds the sea urchins eggs is mostly composed
of sulfated polysaccharides. This jelly coat is related with gamete interaction, since its
sulfated polysaccharide is responsible for inducing the acrosome reaction in sperm in
a specie specific manner. This acrosome reaction
is an event that happens
immediately after the initial contact between egg and sperm, more precisely between
the sulfated polyssacharide present in the egg jelly and its receptor in the plasma
membrane of the sperm. It envolves the exocytosis of the acrosomal vesicle and the
polimerizaton of actin to form the acrosomal process. In the tip of this acrosomal
process there is a protein named bindin, that is responsible for the interaction
between sperm and egg. In the vast majority these sulfated polysaccharides are
formed by residues of fucose, and then are called sulfated fucans.
In this work was investigated the relationship between structure of the sulfated
polyssacharide versus physiological activity in the induction of the acrosome reaction
in sperm from the gender Strongylocentrotus (from the Pacific Ocean), and in sperm
of three species present on the coast of Rio de Janeiro: Arbacia lixula, Lytechinus
variegatus and Echinometra lucunter.
It was seen that the species from the genus Strongylocentrotus keep their specie-
specific interaction between the bindin protein and its receptor in the surface of the
egg, while the sperm of species from Rio de Janeiro were more restrictive: sperm of
L. variegatus and A. lixula only recognized the sulfated polysaccharides with identical
structure to the one present in its own egg jelly, while sperm from E. lucunter
17
recognized, in addition to it´s own sulfated polysaccharide, a second one witch
structure is similar to its own.
It was also studied the period of reproduction of L. variegatus, because wue observed
that a second sulfated polysaccharide is secreted in its egg jelly durin certain times of
the year only. This second sulfated polysaccharide had its structure elucidated, and,
as the first one, is a sulfated fucan. But it has some changes in the structure: While
the former has tetrasaccharides repeating units, with glicosidic linkage 1→3, and the
position of the sulfate ranging between 2 and 4, the second one contains a
homopolymer of 4-sulfated, 3-linked α-L-
fucan.
Finally, an additional study has shown the structure of the sulfated
polysaccharide from the egg jelly of the sea urchin Glyptocidaris crenularis, a species
from Japan. This is a sulfated polysaccharide formed by units of galactan, and it is
the second species already described with that characteristic. We already performed
studies involving the fertilization of this specie, but we were not able to see anything,
since the sperm of G. crenularis is very small. However, we determined the structure
of the sulfated galactan present in the egg jelly, and it is as follow: [→3)-β-Galp-
2(SO
4
)-(1→3)-β-Galp-(1→]
n
.
18
INTRODUÇÃO
1) Polissacarídeos sulfatados
Os polissacarídeos sulfatados são um grupo de macromoléculas complexas
com grande variedade estrutural, que se caracterizam por apresentar alta densidade
de cargas negativas. O caráter aniônico desses polímeros provém da presença de
ésteres de sulfato, e, em alguns casos, de um grupamento carboxila.
Essas moléculas são amplamente distribuídas entre os seres vivos, ocorrendo
em invertebrados marinhos como polissacarídeos simples, de estrutura linear e
repetitiva (ALVES et al, 1997), e em algas marinhas, como estruturas complexas e
ramificadas (MULLOY et al, 1994). Em vertebrados, esses polímeros formam
compostos conhecidos como glicosaminoglicanos, que são heteropolissacarídeos
lineares de natureza ácida, com unidades dissacarídicas repetitivas constituídas por
uma hexosamina (glucosamina ou galactosamina) e um açúcar não nitrogenado
(ácido D-glucurônico ou ácido L-idurônico), ou um açúcar neutro (D-galactose).
Estes estão covalentemente ligados a uma cadeia protéica, constituindo os
proteoglicanos. A única exceção é o ácido hialurônico, que não está ligado a
proteína. Os tipos de glicosaminoglicanos encontrados em vertebrados são:
condroitim sulfato, dermatam sulfato, heparam sulfato, heparina, ácido hialurônico e
queratam sulfato. Eles podem se localizar tanto no interior das células, como
grânulos citoplasmáticos, na matriz extracelular, ou como componentes da
membrana celular. Devido a sua ampla distribuição, e ao fato de serem capazes de
19
interagir com várias moléculas, os proteoglicanos participam de diferentes processos
celulares, sendo assim de grande importância fisiológica.
1.1 Polissacarídeos sulfatados em invertebrados
Os polissacarídeos sulfatados de invertebrados podem ser divididos em dois
grupos: os homopolissacarídeos, constituídos pelas galactanas e fucanas
sulfatadas, e os heteropolissacarídeos, que são aqueles que apresentam uma
estrutura semelhante aos glicosaminoglicanos de vertebrados, mas com um padrão
distinto de sulfatação, ou ramificações com outros açúcares ligados à cadeia
principal.
Os ouriços-do-mar são uma grande fonte desses polissacarídeos
sulfatados, que são encontrados principalmente na matriz gelatinosa que recobre
seus óvulos (ALVES et al., 1997; ALVES et al., 1998; VACQUIER & MOY, 1997;
VILELA-SILVA et al.,, 1999), e no seu embrião (VILELA-SILVA et al.,, 2001). Esses
polissacarídeos sulfatados da matriz gelatinosa apresentam uma estrutura regular,
composta de unidades oligossacarídicas repetitivas, que variam no seu padrão de
sulfatação, tipo de ligação glicosídica e/ou unidade de açúcar constituinte (MULLOY
et al., 1994).
Em nosso laboratório já foi caracterizado estruturalmente diferentes
polissacarídeos sulfatados da matriz gelatinosa de várias espécies de ouriços-do-
mar, e constatamos a grande diversidade estrutural dentre as espécies. Por
exemplo, a espécie Lytechinus variegatus possui na sua matriz gelatinosa uma
fucana sulfatada constituída por uma cadeia linear de α-L-fucopiranose, com
sulfatação nas posições 2 e 4 na mesma unidade ou alternadas unidas por ligações
1→3 com unidades tetrassacarídicas repetitivas (Figura 1A). A espécie Arbacia lixula
20
também possui uma fucana linear, formada por unidades tetrassacarídicas
repetitivas de α-L-fucopiranosil, mas unidas por ligações 1→4, com sulfatação na
posição 2 dos dois primeiros resíduos somente (Figura 1B). Echinometra lucunter
possui, ao contrário das demais espécies, uma α-L-galactana sulfatada, unida por
ligações 1→3 e sulfatada na posição 2 (Figura 1C) (ALVES et al., 1997). Essas três
espécies co-habitam no litoral do Rio de Janeiro. Por outro lado, uma espécie
proveniente do Atlântico Norte, Strongylocentrotus purpuratus, apresenta dois
isotipos de fucanas sulfatadas estruturalmente distintos (Fig 1D e 1E).
1.2 Atividades biológicas de fucanas sulfatadas de algas e invertebrados
marinhos
Fucanas e galactanas sulfatadas da matriz gelatinosa dos óvulos de ouriços-
do-mar possuem um importante papel fisiológico: são indutores da reação
acrossômica em espermatozóides de maneira espécie-específica (SEGALL &
LENNARZ, 1979; ALVES et al., 1997). A reação acrossômica é uma etapa
fundamental do processo de fertilização, que será abordada em detalhes
posteriormente. A espécie-especificidade deste fenômeno é assegurada pela grande
divergência estrutural entre os polissacarídeos sulfatados responsáveis pela sua
indução. Essa diversidade é assegurada pelo tipo de açúcar constituinte, pelo
padrão de sulfatação e pela posição da ligação glicosídica (ALVES et al., 1997;
ALVES et al., 1998; VACQUIER & MOY, 1997; VILELA-SILVA et al., 1999).
Outro ponto que tem sido muito estudado é o potencial efeito terapêutico de
polissacarídeos sulfatados. Alguns polissacarídeos sulfatados, originados de
equinodermas e de algas marrons, exibem potentes atividades biológicas em
21
mamíferos. Algumas de suas ações podem ser atribuídas a interferências nos
mecanismos de interação célula - célula tais como a inibição da invasão de células
por retrovírus, em especial o vírus da imunodeficiência humana (MCCLURE et al.,
1992), herpes e citomegalovírus (BABA et al., 1988), e o vírus causador da febre
africana (GARCIA-VILLALON & GIL-FERNANDEZ, 1991).
Além disso, os polissacarídeos sulfatados originados de algas marinhas
inibem a invasão de eritrócitos por merozoítas de Plasmodium falciparum e a
citoaderência de eritrócitos parasitados às células endoteliais (XIAO et al.,1996).
Também exercem uma função anti-angiogênica (HAHNENBERGER & JAKOBSON,
1991), bloqueiam a ligação espermatozóide-óvulo em várias espécies de
vertebrados (BOLWELL et al., 1979; AHUJA, 1982), têm propriedade antiproliferativa
e antitumoral (Riou, 1996) e inibem a proliferação de fibroblastos (FERRAO &
MASON, 1993).
Dentre as atividades biológicas mais estudadas dos polissacarídeos
sulfatados de algas marinhas destacam-se as ações antitrombótica e anticoagulante
(CHURCH et al., 1989; COLLIEC et al., 1991; NARDELLA et al., 1996; FARIAS et
al., 2000). Um estudo recente, realizado em nosso laboratório, comparou a
atividade anticoagulante de fucanas sulfatadas de equinodermas, que apresentam
estruturas mais simples e bem definidas, com fucanas de algas marrons, que são
mais complexas e heterogêneas. O resultado demonstra que, não apenas a potência
anticoagulante é diferente, mas também varia o mecanismo como é exercida essa
atividade. Alguns polissacarídeos exercem sua ação majoritariamente via
antitrombina e outros via cofator II de heparina. Também podem apresentar
diferenças quanto à protease alvo (heparina ou fator Xa).
22
Figura 1
– Estruturas químicas dos polissacarídeos sulfatados de diferentes espécies de
ouriços
-
do
-
mar.
23
Em 2002, Pereira e colaboradores compararam a atividade anticoagulante da
fucana sulfatada de S. franciscanus (Figura 1F) e da galactana sulfatada de E.
lucunter (Figura 1C). Esses dois polissacarídeos possuem estrutura similar, ambos
com sulfatação na posição 2 e ligações glicosídicas1→3. A única diferença reside no
tipo de açúcar constituinte: S. franciscanus possui L-fucose, enquanto E. lucunter,
possui uma L-galactose. A galactana sulfatada possui atividade anticoagulante
através da inibição da trombina e do fator Xa via antitrombina ou cofator II da
heparina, o que não foi observado para a fucana sulfatada. Logo, a atividade
biológica do polissacarídeo sulfatado não se dá exclusivamente por causa de sua
carga negativa, mas também depende da estrutura química do polímero.
2) Ouriço-do-mar
Os ouriços-do-mar são invertebrados marinhos bentônicos, pertencentes ao
filo Echinodermata. São animais de movimentos livres, possuindo corpo esférico,
coberto de espinhos de tamanhos variáveis de acordo com a espécie, e com
simetria radial. Constituem a classe Echinoidea, com cerca de 950 espécies
descritas, sendo que elas variam em cor e tamanho, a maioria possuindo de 6 a 12
cm de diâmetro. Os ouriços-do-mar têm distribuição mundial, sendo divididos em
vários gêneros diferentes. São dióicos, mas em geral não apresentam dimorfismo
sexual, sendo sua identificação (macho ou fêmea) feita através da coloração dos
gametas. Um equinóideo regular apresenta 5 gônadas, suspensas ao longo dos
24
interambulacros (Figura 2). Um pequeno gonoduto estende-se a partir de cada
gônada, abrindo-se através de um gonóporo. Cada gônada é recoberta por um
peritôneo celomático e revestida internamente por um epitélio germinativo. Entre
essas camadas encontram-se tecido conjuntivo e células musculares. Os
espermatozóides e os óvulos são eliminados por contração da camada muscular, na
água do mar, onde ocorre a fertilização. Um macho é capaz de produzir 1 trilhão de
espermatozóides, enquanto a fêmea, cerca de milhões de óvulos (BARNES,1996).
2.1 Estrutura dos gametas
Assim como os mamíferos, os ouriços-do-mar possuem espermatozóides e
óvulos. Os espermatozóides são compostos da: “cabeça”, onde fica o núcleo, que
contém material genético, e o acrossoma. “Pescoço”, que é uma parte média
mitocondrial e “cauda” ou flagelo estrutura responsável pela mobilidade do
espermatozóide. Todas as estruturas são recobertas pela membrana plasmática. No
acrossoma estão presentes as enzimas que vão digerir a matriz gelatinosa do óvulo
Figura 2
– Modelo esquemático da estrutura de um ouriço-do-mar. As gônadas estão
sinalizadas com a seta.
Fonte: http://www.dkimages.com
25
para permitir a fertilização. A função da mitocôndria é a de produzir ATP para que o
espermatozóide se movimente (BIERMANN, 2002).
Os óvulos também possuem uma estrutura simples, sendo recobertos por
uma linha vitelínica e pela matriz gelatinosa. É nessa matriz gelatinosa que se
encontra o polissacarídeo sulfatado, responsável pela indução da reação
acrossômica (ALVES et al., 1997; ALVES et al., 1998; VACQUIER & MOY, 1997;
VILELA-SILVA et al., 1999). Em um grande número de espécies, esse
polissacarídeo consiste de resíduos de α-L-fucose sulfatada, e mais raramente de
resíduos de α-L-galactose (ALVES et al., 1997). Além do polissacarídeo sulfatado,
também se encontra nessa camada um glicoconjugado rico em ácido siálico que,
entre outras funções, ativa os espermatozóides (SUZUKI et al., 1990).
Recentemente, foi descoberto que esse glicoconjugado rico em ácido siálico é capaz
de potencializar o efeito do polissacarídeo sulfatado, ao induzir o aumento do pH
intracelular dos espermatozóides. Esse evento é fundamental para iniciar a reação
acrossômica (ver adiante) (HIROHASHI & VACQUIER, 2002b).
3) Fertilização
Para que ocorra uma fertilização com sucesso, o espermatozóide precisa
encontrar o óvulo e estar apto a se fundir com sua membrana plasmática. Em muitas
espécies, tanto vertebrados como invertebrados, essas ações requerem, entre
outras, a mobilidade do espermatozóide e também a reação acrossômica. A
mobilidade do espermatozóide, seu movimento progressivo e sua velocidade são
dependentes da atividade de um simples flagelo (GIBBONS, 1981). Em muitos
26
invertebrados a quimiotaxia ocorre em resposta a fatores associados à matriz
gelatinosa, que são liberados quando os gametas são liberados na água do mar
(MILLER, 1985). Mesmo em vertebrados, sabe-se que a progesterona, liberada pelo
trato genital feminino, atua “guiando” os espermatozóides (HUNTER, 2008)
.
Em muitas espécies, o mecanismo utilizado para o reconhecimento
espermatozóide-óvulo envolve interações entre proteínas e carboidratos. Isso inclui
tanto os glicoconjugados complexos encontrados nos tratos reprodutivos, quanto
proteínas ligadoras de carboidratos na superfície do espermatozóide. Vários
glicoconjugados são utilizados nas etapas de capacitação do espermatozóide
(mamíferos), ligação deste à matriz extracelular ou linha vitelínica e indução da
reação acrossômica (MILLER & ROY, 1989).
3.1) Fertilização em ouriços-do-mar
O modelo de fertilização dos ouriços-do-mar é muito estudado, especialmente
devido à quantidade disponível de material e sua acessibilidade (ALBERTS, 1989).
Espécies que liberam seus gametas na água do mar, como os ouriços-do-mar,
requerem uma série de eventos para que ocorra uma fertilização bem sucedida, tais
como:
1º) Sincronia na liberação dos gametas por machos e fêmeas (TYLER &
TYLER, 1966);
2º) Mecanismos que estimulam o encontro dos gametas: Depois de liberados,
os espermatozóides precisam ganhar mobilidade para encontrarem os óvulos, e
também precisam ser estimulados e quimicamente atraídos para o óvulo da própria
espécie. Presume-se que a mobilidade dos espermatozóides seja estimulada por
27
pequenos peptídeos produzidos pelos óvulos (GARBERS, 1989 e SUZUKI, 1990).
Esses compostos se ligam à superfície dos espermatozóides, aumentam a sua
produção de GMPc, o que estimula sua mobilidade;
3º) Reação acrossômica: Quando o espermatozóide entra em contato com o
óvulo deve ocorrer a indução da reação acrossômica, que foi descrita em detalhes
por DAN (1952, 1954a e 1964). O óvulo está recoberto pela matriz gelatinosa que,
de fato, estará mediando este primeiro contato entre os gametas. Durante o
processo de reação acrossômica o espermatozóide entra em um processo exocítico,
liberando proteases e a bindina. Esses compostos estão presentes na vesícula
acrossomal na “cabeça” do espermatozóide. Ao mesmo tempo, a actina, que está
em uma região subacrossomal, se polimeriza formando um filamento. Na ponta
desse filamento é exposta a proteína bindina com função de adesão entre os
gametas (BIERMANN et al., 2004) A superfície do óvulo possui receptores espécie-
específicos para a bindina. A interação da bindina com seu receptor específico
permite estabilizar a interação óvulo-espermatozóide. A fertilização culmina com a
fusão da membrana plasmática do óvulo com a membrana do espermatozóide
(FOLTZ & LENNARZ, 1993) (Figura 3).
Figura 3
– Fertilização em ouriços-do-mar. 1)Espermatozóides se tornam ativos quando em
contato com água do mar. 2)A ativação se dá por pequenos peptídeos liberados da matriz
gelatinosa. 3) Indução da reação acrossômica – a) fluxo de íons, b) exocitose da vesícula acrosomal,
c) polimerização da actina e d)processo de fusão das membranas mediado pela bindina.
Fonte: NEILL & VACQUIER, 2004.
28
3.1.1) Mobilidade e quimiotaxia dos espermatozóides
A ativação da mobilidade dos espermatozóides é um evento extremamente
importante para o sucesso da fertilização. Os espermatozóides produzidos e
estocados nas gônadas são imóveis, e só adquirem mobilidade quando liberados na
água do mar, devido às mudanças iônicas que ocorrem no interior da célula. Nas
gônadas, os espermatozóides estão sob alta tensão de CO
2,
o que
mantém seu pH
intracelular em 7,2 (JOHNSON et al., 1983). Nesse pH, a enzima dineína ATPase,
responsável pelo batimento flagelar, encontra-se inativa, bem como a respiração
celular (CHRISTEN et al., 1982, LEE et al., 1983). Quando os espermatozóides são
liberados na água do mar a tensão de CO
2
diminui, prótons são liberados, e o pH
aumenta para 7,5-7,6. Esse aumento no pHi (pH intracelular) ativa a dineína
ATPase, dando início à mobilidade do espermatozóide (CHRISTEN et al., 1982).
Além da diminuição na tensão do CO
2
, há uma saída de K
+
, que causa
hiperpolarização da membrana plasmática do espermatozóide. Se essa etapa não
acontecer, há um bloqueio na ativação dos espermatozóides (DARSZON et al.,
1999).
Já a quimiotaxia é dada por pequenos peptídeos ativadores, os SAPs (small
activating peptides), isolados da matriz gelatinosa dos óvulos de ouriços-do-mar.
Quando são liberados na água do mar, são reconhecidos por espermatozóides da
própria espécie, onde interagem com receptores específicos, causando uma
ativação celular. Este é o primeiro nível de reconhecimento entre os gametas. Já
foram descritos aproximadamente 75 SAPs de 15 diferentes espécies de ouriços-do-
mar (SUZUKI et al., 1995).
29
A primeira espécie a ter o SAP isolado e estudado foi S. purpuratus, que
recebeu o nome de “speract”. Nos espermatozóides de S. purpuratus existe um
receptor protéico de 77 kDa, específico para o speract (DANGOTT & GARBERS,
1984; DANGOTT, 1989). Após interagir com o receptor, há a ativação de uma
guanilil ciclase acoplada à membrana, que eleva os níveis de GMPc. O aumento nos
níveis de GMPc, por sua vez, abre um canal de K
+
, que leva à hiperpolarização da
membrana (BABCOCK et al., 1992; GALINDO et al., 2000). O bloqueio dessa
hiperpolarização abole os efeitos iniciais do SAP (HARUMI et al., 1992). Outra
molécula que também é ativada é a adenil ciclase (AC), que leva a um aumento de
AMPc (BELTRAM et al., 1996). Esse aumento de AMPc leva à abertura de um canal
de cálcio, que aumenta a concentração de Ca
++
intracelular. Como conseqüência
ocorre despolarização da membrana plasmática, que se segue à hiperpolarização
devido à saída de K
+
.
Outra espécie que teve seu SAP estudado foi Arbacia punctulata, e recebeu o
nome de resact (WARD et al., 1985b). Porém, diferentemente do speract, o resact se
liga diretamente à guanilil ciclase ao invés de ativá-la (SHINOMURA et al., 1986).
Também acontece um aumento na concentração de Ca
++
intracelular, que é bifásico.
Sua maior parte é devido ao aumento na concentração de GMPc, e em menor
proporção, pelo aumento na concentração de AMPc (KAUPP et al., 2003).
3.1.2 Reação acrossômica
A indução da reação acrossômica é a segunda etapa de reconhecimento do
espermatozóide pelo óvulo durante o processo de fertilização. A terceira etapa
30
envolve o reconhecimento da bindina, exposta na superfície do espermatozóide,
pelo seu receptor específico na membrana do óvulo.
Os primeiros estudos que observaram o processo de indução da reação
acrossômica foram feitos por Jean Dan (1952, 1954 a, b). Essa autora observou que
a região acrossomal de espermatozóides de ouriços-do-mar e de estrelas-do-mar se
modificava quando exposta a uma mistura de água do mar + óvulos, emitindo um
filamento. Depois foi demonstrado que esse filamento era actina polimerizada, o
primeiro passo necessário para o sucesso na fertilização (TILNEY et al., 1973,
1978).
A reação acrossômica envolve uma série de eventos: Inicialmente a enzima
acrosina, é secretada pelos espermatozóides, e quando entra em contato com os
óvulos, digere parcialmente a matriz gelatinosa (LEVINE et al., 1978). Assim que o
espermatozóide tem contato com o polissacarídeo sulfatado presente na matriz
gelatinosa do óvulo, há uma rápida hiperpolarização de sua membrana, devido à
entrada de Ca
++
e Na
+
, (DAN, 1954; SCHACKMANN et al., 1978), seguido de uma
despolarização causada pela saída de K
+
e H
+
. (SCHACKMANN et al., 1978, 1981).
Em 1974, Yanagimachi & Usui postularam que o influxo de cálcio representa o
primeiro sinal de indução da reação acrossômica, uma vez que leva a uma posterior
saída de H
+
, aumentando o pH intracelular no espermatozóide em cerca de 0,25
unidades (LEE et al., 1983). Este evento ocasiona a polimerização da actina,
formando filamentos que vão constituir o processo acrossomal, e expondo a bindina
para se ligar ao óvulo (TILNEY et al.,1978).
Mesmo após a reação acrossômica estar completa, o Ca
++
continua a se
acumular no espermatozóide e esse perde sua capacidade de fertilização.
(VACQUIER, 1979).
31
Foram observadas outras mudanças fisiológicas nos espermatozóides
durante a reação acrossômica: Em particular um aumento de dez vezes na
concentração de inositol trifosfato (IP
3
) (DOMINO & GARBERS, 1988), ativação de
AC dependente de cálcio (WATKINS et al., 1978), que leva à um aumento de AMPc
(GARBERS & KOPF, 1980), aumento da atividade de proteína quinase A (GARCIA-
SOTO et al., 1991) e da óxido nítrico sintase (KUO et al., 2000). Os mesmos efeitos
foram observados durante a ativação da motilidade e quimiotaxia, porém com uma
separação temporal e espacial bem diferente (NEILL & VACQUIER, 2004).
Enquanto a reação acrossômica está ocorrendo, proteases que digerem a
matriz gelatinosa continuam sendo liberadas, permitindo que o espermatozóide a
atravesse e possa fazer contato com a superfície do óvulo. Essa superfície consiste
de uma membrana, com componentes específicos, denominada linha vitelínica,
onde a bindina vai se ligar a um receptor próprio (GACHE et al., 1983; NIMAN et al.,
1984).
Em 1984, Podell & Vacquier encontraram uma glicoproteína de 210 - kDa nos
espermatozóides do ouriço-do-mar S. purpuratus, que se ligava ao componente
ativo da matriz gelatinosa. Várias evidências obtidas por esses autores indicaram
que esta glicoproteína é o provável receptor da fucana sulfatada. Anticorpos contra
essa proteína bloqueiam a entrada de cálcio e conseqüentemente a reação
acrossômica. Porém, foi somente em 1996 que Moy e colaboradores identificaram
essa glicoproteína numa preparação de membranas de espermatozóides,
caracterizando-a como uma proteína ligante de carboidratos, localizada em todo o
flagelo e na região acrossomal. Esta proteína foi denominada como suREJ1 (“sea
urchin receptor for egg jelly”). A utilização de anticorpos monoclonais para a suREJ1
induziram a reação acrossômica em espermatozóides, e esse efeito foi inibido pelo
32
suREJ1 na forma solúvel.
No momento que o polissacarídeo sulfatado liga-se ao seu
receptor protéico na membrana plasmática dos espermatozóides, é induzida a
abertura de dois canais de cálcio seqüenciais. O primeiro tem abertura transiente
(GUERRERO & DARSZON, 1989), e o segundo, que se abre 5 s após o primeiro,
mantém a concentração de cálcio intracelular elevada (GONZALES-MARTINEZ et
al., 2001).
Em 2002, Mengerink & Vacquier isolaram um receptor, denominado como
suREJ3, presente somente na superfície da vesícula acrossomal, sugerindo seu
envolvimento com a regulação da exocitose durante a reação acrossômica. É uma
proteína com peso molecular elevado, possui 11 domínios transmembrana e sua
localização indica função na reação acrossômica. Outra proteína, chamada de
suREJ2, foi encontrada em espermatozóides de ouriços-do-mar por Galindo et al.,
em 2004, mas não tem ligação com a reação acrossômica.
A abertura dos dois canais de cálcio induzida pelo polissacarídeo sulfatado é
de extrema importância para o sucesso da fertilização (DARSZON et al., 1999,
HIROHASHI & VACQUIER, 2003). O segundo canal sozinho pode ser aberto por
uma forma hidrolisada e de menor peso molecular do polissacarídeo sulfatado, mas
a reação acrossômica não acontece (HIROHASHI & VACQUIER, 2002b). Esse
polissacarídeo sulfatado com o peso molecular reduzido não induz o aumento no
pHi, que é o sinal para a abertura do segundo canal de cálcio (NEILL & VACQUIER,
2004). Existem evidências de que o segundo canal é do tipo “SOC” (store operated
channels), ou seja, funciona a partir da mobilização de estoques internos de cálcio
(HIROHASHI & VACQUIER, 2003). Por exemplo, o aumento na concentração de IP3
(DOMINO & GARBERS, 1988), em resposta ao polissacarídeo sulfatado, leva a uma
liberação de cálcio de estoques internos. A abertura desse canal sozinho pode levar
33
à exocitose do processo acrossomal, mas não à reação acrossômica completa
(HIROHASHI & VACQUIER, 2003).
Um glicoconjugado rico em ácido siálico, também um componente presente
na matriz gelatinosa, potencializa a reação acrossômica: Sozinho esse composto
não induz a reação acrossômica, mas pode potencializá-la junto com o
polissacarídeo sulfatado, através da elevação do pHi, mas sem aumentar a
concentração de Ca
++.
O aumento apenas do pHi não leva à reação acrossômica
completa. Ainda não se identificou um receptor no espermatozóide capaz de ligar ao
glicoconjugado rico em ácido siálico (HIROHASHI & VACQUIER, 2002c).
Resumindo, a reação acrossômica em espermatozóides de ouriços-do-mar é
induzida pelo polissacarídeo sulfatado presente na matriz gelatinosa do óvulo
(ALVES et al., 1997; ALVES et al.,1998; VACQUIER & MOY,1997; VILELA-SILVA et
al.,1999; VACQUIER et al., 1997) e é acompanhada pela mudança da
permeabilidade da membrana a íons. Todas essas mudanças, assim como a reação
acrossômica, podem ser inibidas por antagonistas do canal de cálcio, como D-600,
verapamil e diidropiridinas (DIXON et al., 1986; NATHANS & HOGNESS 1984) e por
bloqueadores do canal de potássio (KRIKOS et al., 1985).
3.1.3 Espécie-especificidade na fertilização dos ouriços-do-mar
Diferentes espécies de ouriços-do-mar vivem no mesmo habitat. Como são
animais que lançam seus gametas ao mar, a possibilidade de ocorrer uma
fertilização cruzada, com formação de embriões híbridos, seria muito grande. Isso
não ocorre, ou ocorre muito raramente, devido aos mecanismos específicos de
interação entre as moléculas dos gametas, que regulam esse reconhecimento.
34
Um nível importante de reconhecimento entre as moléculas desses gametas é
a indução da reação acrossômica, que é o primeiro contato efetivo entre os
gametas. Nessa etapa, a molécula responsável pela espécie-especificidade na
fertilização é o polissacarídeo sulfatado, presente na matriz gelatinosa que recobre
os óvulos (MULLOY et al., 1994; ALVES et al., 1997, 1998; VACQUIER & MOY,
1997; VILELA-SILVA et al., 1999).
Em nosso laboratório foram realizados importantes trabalhos sobre a espécie-
especificidade na fertilização de ouriços-do-mar. Nos estudos iniciais (ALVES et al.,
1997) foi determinada a estrutura dos polissacarídeos sulfatados de três espécies
distintas de ouriços-do-mar, e observado que esse polímero induzia a reação
acrossômica de maneira espécie-específica. Em todos os ensaios realizados só foi
observada a indução da reação acrossômica em espermatozóides com o
polissacarídeo homólogo e nunca com o heterólogo.
Em 1998, nosso grupo relatou a existência de duas fucanas sulfatadas,
estruturalmente distintas, na matriz gelatinosa da espécie Strongylocentrotus
purpuratus. Ao serem testadas como indutores da reação acrossômica verificamos
que ambas possuíam potência semelhante em induzir a reação acrossômica em
espermatozóides homólogos. Porém, o fato de existirem dois polissacarídeos
sulfatados aumenta o nível de complexidade no processo de reconhecimento celular
entre os gametas de diferentes espécies de ouriços-do-mar (VACQUIER, 1997).
Outra espécie do gênero Strongylocentrotus também teve seu polissacarídeo
caracterizado. Trata-se da fucana sulfatada do Strongylocentrotus franciscanus, que
também é composta por resíduos de fucose, totalmente sulfatados na posição 2,
unidos por ligações 1→3, sendo a estrutura mais simples já descrita (Fig. 1F)
(VILELA-SILVA et al., 1999).
35
As fucanas sulfatadas dessas três espécies - S. purpuratus, S. franciscanus e
L. variegatus tiveram sua capacidade em induzir a reação acrossômica testada,
tanto em espermatozóides homólogos quanto em heterólogos. Também para essas
espécies foi verificada a espécie-especificidade da reação acrossômica, uma vez
que não houve reação significativa em cruzamentos heterólogos. Essas
observações comprovam que os polissacarídeos sulfatados realmente agem como
uma barreira para evitar os cruzamentos heteroespecíficos (VILELA-SILVA et al.,
1999).
Posteriormente foram caracterizadas as fucanas sulfatadas das espécies de
ouriços-do-mar Strongylocentrotus droebachiensis e Strongylocentrotus pallidus
(VILELA-SILVA et al., 2002).
A fucana sulfatada de S. pallidus é composta por
unidades tetrassacarídicas repetitivas de fucose sulfatada, unidas por ligação
glicosídica 1→3, sulfatada na posição 2 dos dois primeiros resíduos e na posição 4
dos dois resíduos seguintes (Fig 1G). Já a espécie S. droebachiensis possui dois
isotipos de fucanas sulfatadas, estruturalmente distintos. Um deles é composto por
unidades monossacarídicas repetitivas, sulfatada na posição 2 e unidas por ligação
glicosídica do tipo 1→4 (fucana sulfatada II) (Fig. 1G). A outra é formada por
unidades tetrassacarídicas repetitivas de fucose sulfatada, unidas por ligação
glicosídica 1→4 e sulfatada na posição 2 dos dois primeiros resíduos (fucana
sulfatada I) (Fig. 1B). As fêmeas de S. droebachiensis foram analisadas
individualmente, e cada uma possui apenas um dos dois isotipos observados.
Notamos dois fatos muito interessantes nessa espécie. As fêmeas de ouriços-
do-mar provenientes do Oceano Atlântico possuem apenas um dentre os dois
isotipos observados (fucana sulfatada I), enquanto aquelas do Oceano Pacífico
podem apresentar os dois isotipos. A fucana sulfatada I de S. droebachiensis é
36
estruturalmente idêntica à fucana sulfatada encontrada na espécie A. lixula (ALVES
et al.,1997). Contudo, essas espécies não vivem nas mesmas regiões e ainda são
distantes milhões de anos na escala evolutiva.
Para uma análise mais detalhada do mecanismo específico de
reconhecimento espermatozóide-óvulo, foram feitos experimentos observando a
indução da reação acrossômica entre espécies de diferentes gêneros que possuem
fucanas sulfatadas com cadeias sacarídicas unidas por ligação 1→3, e apresentam
diferenças pouco expressivas no padrão de sulfatação (VILELA-SILVA et al., 1999).
Uma das espécies utilizada foi S. franciscanus, cuja fucana é constituída por
unidades totalmente sulfatada na posição 2 e unidas por ligações 1→3, Nos testes
de indução da reação acrossômica em espermatozóides de S. franciscanus, usando
a fucana sulfatada homóloga ou heterólogas, observou-se uma especificidade
variável de acordo com a extensão de sulfatação na posição 2 (VILELA-SILVA et al.,
1999). Quando se utilizava espermatozóides de S. purpuratus, notou-se uma
especificidade bem mais restrita, dependente do grau de sulfatação na posição 4.
Assim, a potência em induzir a reação acrossômica depende claramente da
extensão de sulfatação nas posições 2 e 4 dos resíduos de fucose.
Portanto, a estrutura do polissacarídeo sulfatado, incluindo a posição da
ligação glicosídica, o sítio de sulfatação e o tipo de açúcar constituinte são requisitos
importantes para o reconhecimento entre os gametas. As variações nessas
estruturas caracterizam uma barreira que limita os cruzamentos inter-específicos.
Porém, não podemos excluir que outras moléculas também estejam envolvidas no
processo de fertilização e contribuam para a espécie-especificidade da fertilização
nesses invertebrados.
37
3.1.4 Interação entre bindina e seu receptor na superfície do óvulo
A bindina é uma proteína de aproximadamente 30,5 kDa localizada nos
grânulos acrossomais dos espermatozóides de ouriços-do-mar. Foi isolada
inicialmente de espermatozóides de S.purpuratus (VACQUIER & MOY,1977). Essa
proteína têm muitas funções na fertilização, especialmente promovendo a ligação do
espermatozóide ao óvulo através de um receptor transmembrana. Na forma solúvel,
a bindina induz a fosforilação de resíduos de tirosina da porção citoplasmática do
receptor, e medeia a fusão entre os gametas (GLABE, 1985 a, 1985 b; METZ et al.,
1994). A clonagem e o seqüenciamento da bindina de diferentes espécies
mostraram que ela possui um domínio central conservado, circundada por domínios
carboxi-terminal e amino-terminal, que são altamente divergentes entre as diferentes
espécies (HOFMAN & GLABE, 1994). Uma região de 18 aminoácidos desse core
(denominada como B18) consegue fundir vesículas lipídicas in vitro, sugerindo que
essa região deve ser a responsável pela fusão das membranas (ULRICH et al.,
1999). A bindina só foi encontrada em equinóides. Nenhuma molécula homóloga foi
identificada em outro organismo (VACQUIER, 1998). Em contraste com o core, o
restante da molécula é bem variável entre as espécies, inclusive no tamanho da
molécula
. O ouriço-do-mar Diadema antillarum possui a bindina com maior peso
molecular, constituído por 418 aminoácidos. A espécie Encope stokesii
(popularmente conhecido como bolacha do mar), possui a bindina com o peso
molecular mais reduzido, constituído por 193 aminoácidos (ZIGLER & LESSIOS,
2003). Acredita-se que essa variação na estrutura da bindina é resultante da seleção
natural e da diversidade entre as espécies. A bindina existe há 250 milhões de anos
(ZIGLER & LESSIOS, 2003).
38
Após a indução da reação acrossômica, essa proteína é exposta na superfície
do espermatozóide e se liga a um receptor presente na superfície do óvulo. Alguns
trabalhos mostraram que a bindina se liga também a polissacarídeos sulfatados de
uma forma espécie-inespecífica. Essa proteína interage igualmente com fucanas
sulfatadas e com glicosaminoglicanos, tais como heparina e condroitim sulfato
(GLABE et al.,, 1982), além de interagir com um polímero sintético de polivinil
sulfato, que não apresenta estrutura de carboidrato (ROBERTS et al., 1986).
Portanto, esses resultados indicam que a presença de éster sulfato é fundamental
para a interação da bindina com polissacarídeos sulfatados, mas sem requisitos
estruturais específicos.
Muitos estudos já foram realizados na tentativa de determinar a estrutura do
receptor para a bindina. Por exemplo, em 1977, Vacquier & Moy isolaram uma
glicoproteína da superfície dos óvulos de S. purpuratus, que se ligava à bindina,
inibindo a fertilização. Posteriormente observou-se que esse “receptor” era de fato
um glicoconjugado de alto peso molecular, com propriedades semelhantes a um
proteoglicano (ROSSIGNOL et al., 1981, 1984b). A purificação dessa molécula era
difícil devido a sua baixa solubilidade. A solução foi remover alguns componentes,
reduzindo os glicoconjugados de alto peso molecular a glicopeptídeos. Os
fragmentos obtidos se ligavam aos espermatozóides de diferentes espécies que
haviam sofrido reação acrossômica (ROSSIGNOL et al., 1984b). Os autores
concluíram que o teor de carboidratos presente nesse receptor age como elemento
adesivo, enquanto a cadeia polipeptídica confere a espécie-especificidade de fato
(RUIZ BRAVO & LENNARZ, 1986,1989).
Em 1995, Ohlendieck & Lennarz caracterizaram um receptor para
espermatozóides nos óvulos de S. purpuratus. Essa molécula contém um pequeno
39
domínio citoplasmático carboxi-terminal, um ou mais domínio transmembrana, e um
domínio extracelular relativamente grande, onde se localiza a região de ligação à
bindina (FOLTZ & LENNARZ, 1993). A glicoproteína intacta é composta de
aproximadamente 70% de carboidratos, consistindo de galactosamina, galactose,
glucosamina, manose e fucose (OHLENDIECK et al., 1993). As cadeias
oligossacarídicas são sulfatadas, algumas N- ligadas e outras O- ligadas à cadeia
protéica.
Provavelmente, a interação entre a bindina dos espermatozóides e seu
receptor na superfície do óvulo envolva duas etapas. Inicialmente, ocorre uma
interação eletrostática da bindina com seu receptor, mediada pelas cadeias
oligossacarídicas sulfatadas, seguida por uma interação altamente específica,
envolvendo a cadeia polipeptídica (OHLENDIECK & LENNARZ, 1995). A ligação
estável dessas moléculas requer a manutenção de altos níveis internos de ATP no
espermatozóide (HIROHASHI & LENNARZ, 1998). Isso explica a perda da
capacidade de fertilizar do gameta logo após a indução da reação acrossômica.
Em 1996, Ohlendieck & Lennarz observaram que, logo após a ligação do
espermatozóide ao óvulo, o receptor da bindina era rapidamente degradado.
Simultaneamente uma isoforma solúvel era liberada no espaço perivitelínico durante
a reação cortical, sendo subseqüentemente degradada. Assim, logo após uma
fertilização bem sucedida, o rápido decréscimo do receptor pode complementar o
bloqueio da poliespermia, iniciado pela despolarização da membrana. A ligação do
excesso de espermatozóides ao receptor na forma solúvel, no espaço perivitelínico,
previne a interação entre os gametas na membrana plasmática do óvulo, abolindo
assim a poliespermia.
40
Objetivos
O enfoque dessa tese está no estudo dos polissacarídeos sulfatados de
ouriços-do-mar. Assim, pretendemos:
1) Analisar o efeito das fucanas e das galactanas sulfatadas, presentes na
matriz gelatinosa que envolve os óvulos de ouriços-do-mar, como indutores da
reação acrossômica. Pretendemos estabelecer os requisitos estruturais que
influenciam o reconhecimento entre os gametas.
2) Caracterizar estruturalmente um novo polissacarídeo sulfatado sazonal da
matriz gelatinosa de L. variegatus.
3) Caracterizar o polissacarídeo sulfatado presente na matriz gelatinosa da
espécie Glyptocidaris crenularis, proveniente de Noheji Bay, Japão. Trata-se de uma
espécie distinta de ouriço-do-mar, que habita águas profundas.
41
MATERIAIS E MÉTODOS
Materiais
Os ouriços-do-mar das espécies E. lucunter, L. variegatus e A. lixula foram
coletados na Praia Vermelha, situada na Urca, Rio de Janeiro, Brasil.
As espécies S. droebachiensis, S. pallidus, S. purpuratus e S. franciscanus
foram coletadas em Friday Harbor, W.A., U.S.A, através de colaboração com a Dra
Christiane Biermann de Friday Harbor Laboratories, University of Washington. Os
experimentos de fertilização envolvendo espermatozóides dessas espécies foram
realizados pela Dra Christiane H. Biermann. A espécie G. crenularis foi coletada em
Noheji Bay, Japão, através de colaboração com o Dr. Noritaka Hirohashi.
Os seguintes materiais foram utilizados:
Agarose, acetato de sódio, ácido sulfúrico, ácido acético, AgNO
3
, albumina
sérica bovina, azida sódica, azul de toluidina, BaCl
2,
borohidreto de sódio,
butanol,
CaCl
2,
cisteína, CETAVLON, D
2
O, DAPI (SIGMA), DEAE-celulose, Dimetil azul de
metileno (DMB), DMSO, Dowex 50W, EDTA, etanol absoluto, faloidina (Alexa 488
Molecular Probes), fenol, FURA-2 AM (Molecular Probes), gliceraldeído, glicina,
Hepes, inibidor de tripsina de soja, KCl, membrana de diálise, L-galactose e D-
galactose (SIGMA), metanol, NaOH, NaCl, MgSO
4
.7H
2
O, NH
4
OH , papaína, p-DAB,
papel de cromatografia 1mm DE-52 da Whatman, paraformaldeído, PBS (SIGMA),
piridina, 1,3 diaminopropano, rodamina (R415 Molecular Probes), TFA, Tris,
vermelho de cresol.
42
Métodos
1) Extração da matriz gelatinosa dos óvulos de ouriços-do-mar
Os ouriços-do-mar foram coletados e colocados sobre placas de Petri, com a
porção ventral voltada para cima. Em cada invertebrado foram injetados 0,5-1 mL de
KCl 0,5 M para induzir a liberação dos gametas. Os machos e as fêmeas
identificados através da coloração dos gametas liberados. Os óvulos foram então
recolhidos, e tiveram sua matriz gelatinosa - o "egg jelly" - separados através de um
choque de pH e liofilizados (VACQUIER & MOY,1997). Os espermatozóides eram
coletados e mantidos em tubos de vidro em gelo,
sem diluição até o momento de
serem usados.
2) Extração dos polissacarídeos da matriz gelatinosa dos óvulos dos
ouriços-do-mar
A matriz gelatinosa liofilizada de cada espécie de invertebrado foi hidratada
com tampão de digestão (acetato de sódio 100 mM, 5 mM cisteína, 5 mM EDTA pH
5,0), durante 24 h a 4°C. Logo após, adicionou-se papaína (Merck), na proporção de
10% do peso seco inicial, incubando a mistura por 24 h a 60°C, em um recipiente
vedado. Esse material foi então centrifugado por 10 min a 3500 rpm; o sobrenadante
foi recolhido e o precipitado ressuspendido em água destilada para nova
centrifugação nas mesmas condições. Esse novo sobrenadante foi adicionado ao
primeiro. Logo após, os polissacarídeos presentes nos sobrenadantes foram
precipitados com 3 volumes de etanol, mantendo-se o material a - 20°C por 24 h. O
43
precipitado foi recolhido por centrifugação, e seco a vácuo por 24 h (ALBANO &
MOURÃO, 1986). Esse material foi denominado como “polissacarídeos totais”.
3) Purificação dos polissacarídeos sulfatados
Cerca de 50 mg dos polissacarídeos totais, extraídos da matriz gelatinosa de
cada espécie de ouriço-do-mar, foram solubilizados em acetato de sódio 0,05 M pH
5,0, e aplicados numa coluna DEAE celulose, e eluídos através de um gradiente
linear de NaCl, variando entre 0-3,0 M e 0-4M de NaCl, dependendo da espécie.
Foram coletadas frações de 2,5 mL, sendo todas monitoradas por metacromasia
com DMB, que permite determinar a presença de polissacarídeo sulfatado, e pela
reação para ácido siálico (KABAT & MAYER, 1971). A concentração de NaCl foi
estimada por condutividade.
Também usamos outra coluna de troca iônica, uma Mono-Q acoplada a um
sistema de FPLC (HR5/5) equilibrada em tampão Tris-HCl 20mM, pH 8.0. Foram
coletadas frações de 0,5 mL, e analisadas por metacromasia com DMB, reação de
Erlich para ácido siálico (Kabat & Mayer, 1971) e dosagem de hexoses totais pelo
método do fenol/ácido sulfúrico (Dubois, 1956).
A concentração de NaCl foi estimada
por condutividade. A preferência por uma coluna ou outra se deve às vantagens de
cada uma. A Mono-Q permite um resultado mais analítico, enquanto a DEAE-
celulose permite a purificação de uma quantidade maior de polissacarídeos
sulfatados.
4) Hidrólise ácida forte
44
Os polissacarídeos sulfatados (1 mg) foram solubilizados em 200 µL de água
destilada e então misturados com o mesmo volume de TFA, para obter uma
concentração final de 6 M. Os tubos vedados foram colocados a 100°C por 5 h.
Terminada a reação, o material foi lavado três vezes com 400 µL de água destilada,
no evaporador rotativo, e seco em dessecador a vácuo.
5) Eletroforese em gel de agarose
As amostras de polissacarídeos sulfatados foram analisadas por eletroforese
em gel de agarose. Para esta metodologia, os polissacarídeos sulfatados purificados
foram diluídos em água destilada (5 mg/mL) e amostras de 5 µL foram aplicadas em
gel de agarose 0,5% , preparado em 1,3-propilenodiamino-acetato 0,5 M (pH 9,0)
(Vieira,1991; Alves,1997). Após a eletroforese por 1 h a 100 V numa cuba horizontal,
os polissacarídeos no gel foram precipitados com uma solução a 0,5 % de
CETAVLON em água. O gel foi então seco e corado com azul de toluidina 0,1 % em
ácido acético: etanol: água (0,1:5:5, v/v).
6) Cromatografia de açúcares em papel
As amostras obtidas da hidrólise ácida (cerca de 10 µg de açúcar) foram
aplicadas em uma folha de papel Whatman 1MM, juntamente com padrões de
fucose, glucose, galactose e manose. O cromatograma foi colocado em uma cuba
descendente, com 200 mL de butanol: piridina: água (3:2:1,5 v/v ) como solvente.
Após 48 h, o cromatograma foi seco, em capela ventilada por 24 h, e revelado com
AgNO
3
.
45
7) Detecção dos isômeros de açúcares (D e L)
Foram utlizados cerca de 1 mg de cada açúcar analisado para configuração D
ou L, que foram: padrão de D galactose, padrão de L galactose e o polissacarídeo
sulfatado purificado de G. crenularis. Cada amostra foi dissolvida em uma gota de
TFA e 0,5 ml de octanol, sendo então colocados em banho quente a 130° C por 24
h. Após esse tempo as amostras foram evaporadas em evaporador rotatório e
acetiladas.
Acetilação de açúcares reduzidos para análise em cromatografia líquida em
fase gasosa
Cerca de 100 µg de monossacarídeos derivados do polissacarídeo sulfatado
foram misturados com 2 ml de NH
4
OH 0,5 M e 10mg de borohidreto de sódio, por 1
h à temperatira ambiente. Foi adicionado ácido acético glacial à reação e então o
material foi seco e lavado três vezes com 1 ml de metanol e mantido por 30 min. em
dessecador. Em seguida, foram adicionados 0,5 ml de anidrido acético: piridina (1:1,
v/v), mantendo a 100°C por 1 h. A reação foi interrompida com a adição de 2 ml de
clorofórmio e lavado três vezes com 2 ml de águas destilada. O extrato desse
material foi passado em coluna de NaSO
4
anidro, com aproximadamente 8 cm de
altura. O material foi seco e mantido a vácuo por 24 h para análise por cromatografia
em fase gasosa (T
injetor
= 230°C; T
detector
= 250°C; T
0
= 110°C; T
f
=250°C; V =
2°C/min
8) Dessulfatação
46
O polissacarídeo sulfatado obtido de G. crenularis foi submetido ao processo
de dessulfatação, como descrito por Nagasawa (1979). A primeira etapa do
procedimento consta da preparação do sal piridinum. A amostra foi dissolvida em
água destilada. A esta solução foi adicionado DOWEX 50 W X 8 (H=, 50-100 mesh)
a 4°C, até atingir o pH 1,0. Após a decantação da resina, o sobrenadante foi
neutralizado com piridina e liofilizado, originando o sal piridinum. Esse sal foi
dissolvido em 3 mL de DMSO, contendo 10% de metanol, e a solução mantida a
80°C por 5 h. Em seguida, os tubos foram colocados em banho de gelo, diluídos
com 3 mL de água destilada e o pH ajustado para 9,0-9,5 por adição de NaOH 1N. A
mistura foi dialisada contra água destilada por aproximadamente 20 h e depois
liofilizada.
9) Ressonância Magnética Nuclear
Os espectros foram obtidos em um espectrômetro Bruker DRX 600 MHz,
utilizando um probe de ressonância tripla de 5 mm. Utilizou-se de 1,5 a 10 mg de
amostra de polissacarídeos dissolvidos em 0,5 a 0,7 mL de D
2
O 99,9%. Os
experimentos foram realizados a 60° C, com supressão de HDO por pré-saturação.
Os experimentos realizados foram o espectro unidimensional (detecção direta de
1
H
ou
13
C), espectro bidimensional HMQC (“Heteronuclear Multiple Quantum
Coherence”) editado para 13 C, 1H/1H TOCSY (“Total Correlation Spectroscopy”),
COSY (“Correlation Spectroscopy”) e NOESY (“Nuclear Overhauser Enhacements
Spectroscopy”).
47
10) Ensaios de Fertilização
Os ensaios de fertilização usando as espécies S. droebachiensis, S. pallidus e
S. purpuratus foram realizados em colaboração com a Dra Christiane Biermann, de
Friday Harbor Laboratories. Os ouriços-do-mar foram induzidos a liberar seus
gametas através de injeção intra-celômica de KCl 0,55 M. O esperma foi coletado,
sem diluição, e guardado em banho de gelo. Os óvulos foram guardados em água
do mar filtrada, à temperatura ambiente. Para obter a matriz gelatinosa, os óvulos
foram colocados em um filtro Nitex, e lavados diversas vezes. Esse procedimento
separa a matriz gelatinosa, que fica precipitada. A diluição inicial dos
espermatozóides foi de 1:10000, sendo então subseqüentemente diluídos na
proporção de 1:4 por mais 4 vezes. Depois da diluição, os espermatozóides foram
adicionados a uma solução contendo água do mar e a matriz gelatinosa (volume
final 500 µL). O sucesso da fertilização foi determinado através da contagem de
óvulos que estavam clivando, ou através da visualização do aumento do envelope
vitelínico. Para cada análise foram observados de 200 - 300 óvulos.
Os ensaios de fertilização usando as espécies E. lucunter, A. lixula e L.
variegatus foram realizados com espermatozóides das três espécies e óvulos de
cada uma das três espécies. Os ouriços-do-mar eram induzidos a liberar os gametas
(ver item 1 métodos), e estes eram coletados sem diluição. Ambos eram guardados
em tubos de ensaio de vidro, no gelo, e utilizados poucos minutos após a liberação.
Para cada ensaio eram usados 400 µL da suspensão de óvulos + 100 µL de
espermatozóides + 3,0 mL de água do mar artificial, pH 8,0. A mistura era deixada
no gelo, sendo agitada em vórtex a cada 2 min. Após 8 min., retirava-se 30 µL da
solução espermatozóides+óvulos que era aplicada em lâmina de microscopia,
48
fechada com lamínula. Procedia-se então a observação por microscópia óptico com
aumento de 20X. Em cada lâmina eram contados entre 200-300 óvulos.
11) Ensaios de reação acrossômica
Os espermatozóides das espécies do gênero Strongylocentrotus foram
diluídos 1:10 em tampão HEPES 10 mM, pH 7,9, a 9°C. 50 µL da solução de
espermatozóides eram adicionados a 100 µL de solução teste (matriz gelatinosa ou
fucana sulfatada purificada). A reação era interrompida após 5 min. com a adição de
750 µL de paraformaldeído. Após 30 minutos os espermatozóides eram lavados com
500 µL de PBS (Sigma) e mantido sob agitação por pelo menos 30 minutos com 1
unidade de faloidina (Alexa 488, Molecular Probes). Depois eram adicionados 20 µL
da solução de anticorpo anti-bindina, obtido de coelho (fornecido pelo Dr. Victor
Vacquier). Os espermatozóides eram então lavados por duas vezes, tendo seu
precipitado final ressuspendido em 20-50 µL de PBS, e montados em lâminas de
vidro, cobertas por lamínula. A observação das lâminas foi realizada em um
microscópio confocal (Nikon 60x PlanApo 1.4 NA), utilizando simultaneamente
canais de luz verde (faloidina) e vermelho (anti-bindina).
Para os espermatozóides das espécies A. lixula, E. lucunter e L. variegatus
foram feitas algumas alterações do método anterior. Os espermatozóides foram
coletados e guardados no gelo, sem diluição. No momento do experimento eram
diluídos 1:5 em tampão HEPES (10 mM, pH 7,9) preparado em água do mar
artificial. 25 µL da suspensão de espermatozóides eram adicionados a 50 µL de
solução contendo matriz gelatinosa, fucanas ou galactanas sulfatadas, cujo teor de
hexose havia sido determinado previamente pelo ensaio de fenol-ácido sulfúrico
49
(Dubois, 1956). Após 5 min. no gelo, os espermatozóides eram fixados com 350 µL
de paraformaldeído 3,7% preparado em água do mar artificial. Após 30 min, os
espermatozóides eram lavados duas vezes seguido de centrifugação a 5000 g por 5
min. com PBS. Posteriormente os espermatozóides foram marcados com 1U
rodamina (Molecular Probes R415, Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA) por duas
horas, em uma solução 0,1 M de glicina, 1mg/mL albumina sérica bovina, azida
sódica, 0,02% pH 7,4. As células eram então lavadas duas vezes com 500 µL de
PBS, incubados por 6 min com 30 µL de DAPI 0,5%, lavados mais duas vezes com
500 µL de PBS e ressuspendidos em uma solução 30% de gliceraldeído 70% em
PBS. As lâminas eram montadas, e cobertas por lamínula. Os espermatozóides
foram contados usando um microscópio
Zeiss Axioskop 2 plus fluorescente. As fotos
foram adquiridas com um microscópio confocal Zeiss LSM 510 Meta (Jeha,
Alemanha). Foram observados simultaneamente os canais vermelho (faloidina) e
azul (DAPI).
12) Medida da captação de cálcio
Os ouriços-do-mar foram coletados e induzidos a liberar seus gametas
através da injeção intra-celômica de KCl 0,55 M, como descrito no item 1 dessa
seção. Os espermatozóides foram recolhidos sem diluição, e lavados por duas
vezes com água do mar artificial. Logo após foram diluídos 5x com água do mar
artificial + inibidor de tripsina de soja + FURA-2 AM (Molecular Probes) a uma
concentração final de 12 µM. A solução foi incubada por 4 h, no escuro e a 4°C.
Após a incubação, os espermatozóides foram novamente lavados 2x com água
do mar artificial. Esses procedimentos nos permitiram obter amostras de
50
espermatozóides de ouriços-do-mar preenchidos com o “probe” FURA-2 AM.
Essas amostras (50 µL) foram diluídas com 1,5 mL de água do mar artificial, e
foram analisadas em um fluorímetro, da seguinte maneira: 50 µl da solução final
de espermatozóides + 1,5 ml de água do mar. Alguns segundos após o início da
leitura de fluorescência da solução de espermatozóides marcados, a solução
teste era adicionada (concentração final de hexose 100 µg/mL para todos os
polissacarídeos sulfatados testados), e observava-se a alteração do sinal de
fluorescência. O aumento é indicativo da entrada de cálcio no espermatozóide,
portanto indica o reconhecimento do espermatozóide pelo polissacarídeo
sulfatado. As espécies A. lixula e E.lucunter foram analisadas em um fluorímetro
FP-6300
da Jasco, enquanto L. variegatus foi analisado em um fluorímetro F-4500
Hitachi. Essa diferença se deu somente por questões técnicas. O método usado
foi ligeiramente modificado de Hirohashi &Vacquier, 2002a.
A metodologia usada permite monitorar o aumento da concentração interna
de cálcio que ocorre nos espermatozóides antes da reação acrossômica induzida
pelos polissacarídeos sulfatados. A leitura era feita com excitação em 340 nm e
emissão em 500 nm.
51
Resultados e Discussão
Capítulo 1) A espécie-especificidade da fertilização nos ouriços-do-mar é
assegurada pela estrutura de polissacarídeos sulfatados
52
1) A importância da sulfatação e da ligação glicosídica
no reconhecimento entre gametas
Em trabalho prévio realizado pelo nosso grupo (VILELA-SILVA et al., 2002),
caracterizamos as estruturas das fucanas sulfatadas presentes na matriz gelatinosa
dos óvulos das espécies de ouriços-do-mar S. droebachiensis e S. pallidus.
Na espécie S. droebachiensis observamos a presença de dois
polissacarídeos estruturalmente distintos. Ambos são formados por resíduos de
fucose sulfatada, unidos por ligação glicosídica 1→4, sendo que um deles é formado
por unidades tetrassacarídicas repetitivas, com sulfato na posição 2 dos dois
primeiros resíduos (fucana sulfatada I, Fig. 4); o outro é formado por unidades
monossacarídicas repetitivas, unidas por ligação 1→4 e sulfatadas na posição 2
(fucana sulfatada II), (Fig. 4). Analisando a matriz gelatinosa das fêmeas coletadas
no Oceano Pacífico verificamos que cada uma delas possui um dos dois isotipos
descritos, enquanto na população proveniente do Oceano Atlântico só observamos
um deles.
A espécie S. pallidus também possui um polissacarídeo formado por resíduos
de fucose sulfatada, contendo unidades tetrassacarídicas repetitivas, formadas por
ligações do tipo 1→3, com sulfato na posição 2 dos dois primeiros resíduos e na
posição 4 dos dois seguintes (Fig. 4).
Como já foi mencionado na Introdução dessa tese, o polissacarídeo sulfatado
presente na matriz gelatinosa do óvulo dos ouriços-do-mar é o responsável pela
indução da reação acrossômica, evento fundamental para que o espermatozóide se
ligue e possa se fundir ao óvulo. Como são animais que liberam seus gametas na
53
água do mar e diferentes espécies coabitam o mesmo ambiente, é fundamental que
haja um mecanismo que impeça o cruzamento heterólogo. Já foi demonstrado que a
estrutura desses polissacarídeos sulfatados é fundamental para a espécie-
especificidade da fertilização (ALVES et al., 1997; ALVES et al.,1998; VACQUIER &
MOY, 1997; VILELA-SILVA et al., 1999). Contudo ainda não foi estabelecido qual o
principal componente estrutural da molécula que é responsável pela regulação da
indução da reação acrossômica. Seria o padrão de sulfatação, o tipo de ligação
glicosídica ou o açúcar constituinte?
Para avaliar essa questão estudamos a fertilização entre três espécies
correlacionadas, S. droebachiensis, S. pallidus e S. purpuratus. Nos cruzamentos
homólogos foi observado um alto índice de fertilização, como era esperado. Nos
cruzamentos heterólogos notamos alta espécie-especificidade (Fig. 5A).
Os espermatozóides das três espécies foram posteriormente incubados com
a matriz gelatinosa homóloga, e então colocados em contato com óvulos
heterólogos (Fig. 5B). Com isto, os espermatozóides encontram-se previamente
reagidos, ultrapassando a etapa de reconhecimento da reação acrossômica.
Surpreendentemente, houve fertilização cruzada entre as espécies S.
droebachiensis e S. pallidus, mas não com S. purpuratus. O que podemos concluir
desse experimento é que a reação acrossômica induzida pela matriz gelatinosa das
espécies S. droebachiensis e S. pallidus é fundamental para a espécie-
especificidade entre estas duas espécies, mas não para S. purpuratus. Neste caso,
mesmo quando os espermatozóides foram pré-reagidos com a própria matriz
gelatinosa, não conseguiram fecundar óvulos heterólogos. Provavelmente essa
especificidade deve estar relacionada com a interação bindina-óvulo.
54
Figura 4 – Estruturas químicas dos polissacarídeos sulfatados de ouriços-do-mar.
55
Com o objetivo de confirmarmos esses resultados, incubamos os
espermatozóides dessas espécies com a matriz gelatinosa homóloga e heteróloga, e
usamos microscopia de fluorescência para observar a ocorrência de reação
acrossômica. Esse experimento foi possível usando a dupla marcação com
anticorpos anti-actina e anti-bindina, duas proteínas expostas após a indução da
reação acrossômica. Como só observamos dupla marcação dos espermatozóides
quando incubados com a própria matriz gelatinosa, podemos concluir que o evento
de indução da reação acrossômica é realmente espécie-específica e limita a
fertilização heteróloga (Fig. 6).
Figura 5
– Sucesso na fertilização entre espermatozóides do gênero Strongylocentrotus
antes (A) e após (B) a indução da reação acrossômica pela matriz gelatinosa homóloga.
56
Foram então realizados experimentos semelhantes com as fucanas
sulfatadas purificadas da matriz gelatinosa que envolve o óvulo de ouriços-do-mar
do gênero Strongylocentrotus e espermatozóides de quatro diferentes espécies: S.
droebachiensis, S. pallidus, S. franciscanus e S. purpuratus. Esses polissacarídeos
sulfatados diferem no padrão de sulfatação e no tipo de ligação glicosídica. Por
exemplo, as fucanas sulfatadas de S. franciscanus e S. pallidus, ambas com ligação
glicosídica 1→3, diferem no padrão de sulfatação: S. franciscanus é composta por
unidades monossacarídicas repetitivas sulfatadas na posição 2 (Fig. 4), enquanto S.
pallidus é formada por unidades tetrassacarídicas repetitivas sulfatadas na posição 2
dos dois primeiros resíduos e na posição 4 dos dois resíduos seguintes (Fig. 4). A
Figura 6)
Imagens confocais de espermatozóides de S. droebachiensis (A e B) e de S.
pallidus (C e D), após incubação com a matriz gelatinosa de S. droebachiensis ( A e C) e com a de
S. pallidus (B e D). A reação positiva, indicativo de que o espermatozóide apresentou a reação
acrossômica, é assegurada pela dupla marcação com o anticorpo anti-actina (em verde) e anti-
bindina (em vermelho).
57
fucana II de S. droebachiensis é similar à de S. franciscanus, porém suas unidades
são unidas por ligações 1→4, enquanto a de S. franciscanus é 1→3 (Fig. 4). S.
purpuratus também possui dois isotipos de fucanas sulfatadas, ambas com ligação
glicosídica 1→3, porém com padrão de sulfatação distinto. Um dos isotipos é
constituído por unidades monossacarídicas totalmente 2-sulfatadas, mas com sulfato
variável na posição 4. Outro isotipo é formado por unidades trissacarídicas com
padrão regular de sulfatação (Fig. 4).
O uso dessas fucanas sulfatadas nos permite testar a importância dos
diversos componentes estruturais na regulação da reação acrossômica. Assim,
espermatozóides de S. droebachiensis, S. pallidus e S. purpuratus foram incubados
com diferentes fucanas sulfatadas purificadas, e a indução da reação acrossômica
foi avaliada pela metodologia descrita na Fig 6.
A reação acrossômica é induzida nos espermatozóides de S. pallidus pelo
polissacarídeo homólogo e também pela fucana sulfatada de S. purpuratus. Porém
essa reação não ocorre quando os espermatozóides são incubados com a fucana
sulfatada de S. droebachiensis, que possui polissacarídeos com ligação glicosídica
1→4. Da mesma forma que observado para os espermatozóides de S. franciscanus,
a reação acrossômica é induzida pelo polissacarídeo homólogo e pela fucana
sulfatada de S. pallidus, ambas com ligação glicosídica 1→3, mas não com a fucana
sulfatada de S. droebachiensis. Em contraste, os espermatozóides de S.
droebachiensis reagem exclusivamente com a fucana sulfatada homóloga (Fig. 7).
Esses resultados demonstram que a posição da ligação glicosídica das
fucanas sulfatadas é o fator determinante para a indução da reação acrossômica
nos espermatozóides de ouriços-do-mar dessas espécies do gênero
Strongylocentrotus. Através desses experimentos podemos determinar uma relação
58
direta entre a estrutura de um carboidrato com um importante evento fisiológico, que
é a indução da reação acrossômica em espermatozóides e seu conseqüente efeito
na fertilização dos ouriços-do-mar. Os nossos resultados indicam a importância da
ligação glicosídica das fucanas sulfatadas, quando essas foram testadas em altas
concentrações. Em um trabalho anterior, Vilela-Silva e colaboradores (1999)
testaram diferentes concentrações das fucanas sulfatadas na indução da reação
acrossômica em espermatozóides de diferentes espécies, e notaram que em
concentrações mais baixas a diferença no padrão de sulfatação (2- e 4-sulfatações)
é importante para o reconhecimento espécie-específico entre as espécies
analisadas. Podemos, então, concluir que os dois aspectos estruturais do
carboidrato - padrão de sulfatação e a posição da ligação glicosídica – garantem
espécie-especificidade na fertilização de ouriços-do-mar.
Os nossos resultados também indicam que as espécies distantes de ouriços-
do-mar usam diferentes mecanismos para assegurar a sua espécie-especificidade
da fertilização. As espécies S. droebachiensis e S. pallidus possuem um mecanismo
preponderante de regulação através da posição da ligação glicosídica das fucanas
sulfatadas. Porém, é interessante notar que espermatozóides de S. pallidus e S.
purpuratus reagem equivalentemente frente aos polissacarídeos sulfatados
homólogos (Fig.7). Contudo, como mostrado nos ensaios da Figura 5, a fertilização
não se efetiva.
Assim, a espécie S. purpuratus assegura a espécie-especificidade da
fertilização por um mecanismo distinto, provavelmente dependente do
reconhecimento da bindina pelo seu receptor na superfície do óvulo. Mesmo quando
os espermatozóides de S. droebachiensis e S pallidus foram incubados com a
própria matriz gelatinosa, e, portanto sofreram a reação acrossômica, não foram
59
capazes de fertilizar os óvulos de S. purpuratus. Não há seleção divergente no gene
para bindina entre S. pallidus e S. droebachiensis, mas há para S. purpuratus
(BIERMANN, 1998).
Outra observação interessante foi a descoberta de uma fucana sulfatada em
S. droebachiensis (fucana sulfatada I) (VILELA-SILVA et al., 2002) com estrutura
idêntica àquela na espécie A. lixula (ALVES et al., 1997). Essas espécies são
isoladas geograficamente, ocorrendo em águas com diferentes temperaturas, e
divergiram evolutivamente entre 150-200 milhões de anos atrás (LITTLEWOOD &
SMITH, 1995).
Testamos a indução da reação acrossômica em espermatozóides de S.
droebachiensis usando a fucana sulfatada homóloga e aquela purificada a partir da
espécie A. lixula. Verificamos que os dois polissacarídeos induzem a reação
acrossômica de maneira equivalente (Fig. 8). Os experimentos também foram
realizados usando espermatozóides da espécie S. droebachiensis, coletados nos
dois Oceanos. Não observamos diferenças significativas na indução da reação
acrossômica pela fucana sulfatada coletadas dessa espécie de ouriço-do-mar em
dois oceanos distantes. Essas observações sugerem que a evolução dos genes que
codificam a biossíntese dessas fucanas sulfatadas ocorrem através de seleção
natural, uma vez que ainda não foram encontrados ouriços-do-mar que coabitam e
que possuam o mesmo isotipo de polissacarídeo sulfatado como indutor da reação
acrossômica.
60
Figura 7)
Indução da reação acrossômica por diferentes fucanas sulfatadas em
espermatozóides de S. droebachiensis, S. pallidus, S. purpuratus e S. franciscanus.
61
62
1.1) As fucanas sulfatadas induzem a captação de cálcio pelos
ouriços-do-mar.
Após os resultados obtidos com os ouriços-do-mar do gênero
Strongylocentrotus, estendemos nossos experimentos de espécie-especificidade na
indução da reação acrossômica para três espécies que vivem juntas no litoral do Rio
de Janeiro: L. variegatus, E. lucunter e A. lixula. Na realidade, nosso grupo já havia
verificado que a indução da reação acrossômica entre essas espécies acontecia de
forma espécie-específica (ALVES et al., 1997). Mas agora estendemos esses
estudos testando os espermatozóides dessas espécies frente aos polissacarídeos
sulfatados de Strongylocentrotus. Assim, pretendemos aprofundar os estudos sobre
os requisitos estruturais envolvidos na determinação do reconhecimento espécie-
específico na indução da reação acrossômica. Nesses experimentos,
acompanhamos a indução da reação acrossômica pela alteração morfológica do
espermatozóide e, em paralelo, avaliamos a etapa inicial desse processo, que
envolve a captação de cálcio pelos espermatozóides.
A estrutura dos polissacarídeos sulfatados presentes na matriz gelatinosa que
recobre os óvulos dessas espécies é bem diferente. Tanto L. variegatus quanto A.
lixula possuem fucanas sulfatadas. Porém a fucana sulfatada de L. variegatus possui
ligação glicosídica 1→3, e sulfatação nas posições 2,4,2/4 e 2 (Fig. 9A). Em
contraste a fucana sulfatada de A. lixula possui ligação glicosídica 1→4, e 2-
sulfatação apenas nas duas primeiras unidades tetrassacarídicas repetitivas(Fig.
9B). Os dois polissacarídeos são formados por unidades tetrassacarídicas
repetitivas. O ouriço-do-mar E. lucunter possui uma galactana sulfatada, composta
63
por unidades monossacarídicas repetitivas, unidas por ligação glicosídica 1→3 e
sulfato na posição -2 (Fig. 9C).
Nos ensaios para testar o efeito biológico desses polissacarídeos sulfatados
usamos uma sonda fluorescente FURA-2, um marcador de cálcio intracelular. Os
espermatozóides foram inicialmente incubados com FURA-2. Na presença da
fucana sulfatada ocorre a indução da abertura de canais de cálcio na membrana
plasmática do espermatozóide (DARSZON et al., 1999). Ao entrar na célula, o cálcio
se conjuga com o FURA-2 intracelular, emitindo fluorescência.
Figura 9– Estruturas químicas dos polissacarídeos sulfatados de ouriços-do-mar.
64
Outra metodologia utilizada consiste em observar o prolongamento de actina
polimerizada, que é exposto após a reação acrossômica. Uma suspensão de
espermatozóides é colocada em contato com soluções de polissacarídeos
sulfatados. Após 30 min são fixados, e posteriormente, incubados com
faloidina/rodamina (corante para actina polimerizada), e DAPI (corante fluorescente
para o núcleo) (HIROHASHI & VACQUIER, 2002a). O prolongamento fica marcado
em vermelho fluorescente.
1.1.2 Ensaios com espermatozóides de A. lixula
Iniciamos esses experimentos com espermatozóides da espécie A. lixula.
Temos um interesse especial por esse ouriço-do-mar porque sua fucana sulfatada é
estruturalmente idêntica à fucana sulfatada I de S. droebachiensis (VILELA-SILVA et
al., 2002). Anteriormente relatamos que os espermatozóides de S. droebachiensis
reconhecem os dois tipos de fucanas sulfatadas encontradas na matriz gelatinosa de
seus óvulos de maneira similar. Os espermatozóides de S. droebachiensis também
reconhecem a fucana sulfatada de A. lixula (Biermann, 2004; HIROHASHI et al.,
2002d). Agora realizamos os experimentos de polissacarídeos sulfatados de S.
droebachiensis como indutores da reação acrossômica por espermatozóides de A.
lixula
O primeiro ensaio realizado foi a determinação da captação de cálcio pelos
espermatozóides de A. lixula utilizando o FURA-2, e a mesma concentração para
todos os polissacarídeos sulfatados testados, que foi de 100 µg / mL. O tempo de
reação variou entre 100 e 180 segundos. Vimos que a adição da matriz gelatinosa
não purificada da própria espécie (Fig. 10 A) e da fucana sulfatada purificada (Fig.
65
10B) induzem a captação de cálcio. A adição de fucana sulfatada I de S.
droebachiensis, com estrutura semelhante ao polissacarídeo homólogo de A. lixula,
também induz a captação de cálcio (Fig. 10C). Curiosamente a fucana sulfatada II
de S. droebachiensis não induz a captação de cálcio pelos espermatozóides de A.
lixula (Fig. 10D), assim como a fucana sulfatada de L. variegatus (Fig. 10E) e a
galactana sulfatada de E. lucunter (Fig. 10F). Em contraste, os espermatozóides de
S. droebachiensis reagem de forma semelhante às suas duas fucanas, I e II e ao
polissacarídeo de A. lixula (HIROHASHI et al., 2003). Esses resultados indicam que
na divergência evolutiva dessas duas espécies não ocorreram modificações nos
polissacarídeos sulfatados secretados na matriz gelatinosa, mas diferenciação no
receptor para estes constituintes presentes na superfície dos espermatozóides.
Os animais que liberam seus gametas na água do mar têm apresentam
alterações rápidas nas proteínas relacionadas à sua fertilização, o que é necessário
para o estabelecimento de barreiras e manutenção das espécies. Geralmente, os
gametas femininos mudam primeiro, e os masculinos se adaptam aos femininos
(VACQUIER, 1998). Nesse caso, podemos supor que o receptor para a fucana
sulfatada de S. droebachiensis se adaptou às duas fucanas presentes na espécie.
Porém, o receptor presente no espermatozóide de A. lixula se adaptou à somente à
fucana sulfatada expressa pela sua espécie. Como já foi dito, essas espécies não
coabitam, e são distantes evolutivamente entre 150 a 200 milhões de anos.
66
Figura 10)
Captação de cálcio em espermatozóides da espécie A. lixula. Os espermatozóides
de A. lixula foram incubados com FURA -2 e posteriormente analisados na indução da captação de
cálcio através da adição de polissacarídedos sulfatados. As setas simples indicam o momento da
adição do polissacarídeo sulfatado e as setas duplas indicam a variação na intensidade da
fluorescência.
A) Matriz gelatinosa de A. lixula. B) Fucana sulfatada de A. lixula. C) Fucana sulfatada I de S.
droebachiensis. D) Fucana sulfatada II de S. droebachiensis. E) Fucana sulfatada de L.variegatus. F)
Galactana sulfatada de E. lucunter. G) Água do mar artificial.
Inset: intensidade de fluorescência.
67
Possivelmente, o receptor da fucana sulfatada nos espermatozóides de A.
lixula necessita da seqüencia tetrassacarídica completa do polissacarídeo para o
seu reconhecimento incluindo ligações glicosídicas 1→4 e 2- sulfatação nos dois
primeiros resíduos, seguidos de duas unidades não sulfatadas.
Em seguida, a reação dos espermatozóides de A. lixula aos diferentes
polissacarídeos sulfatados foi analisada pela formação do processo acrossomal por
microscopia (Fig. 11). Nesse experimento, os espermatozóides foram corados com
rodamina-faloidina (marcador para actina polimerizada) e DAPI (marcador para
núcleo). Claramente, foi possível, usando essa metodologia diferenciar os
espermatozóides reativos e não reativos (Fig. 11 B). A matriz gelatinosa da própria
espécie é o indutor mais potente da reação acrossômica, atingindo cerca de 60%
dos espermatozóides. Em seguida, observamos que a fucana sulfatada homóloga e
a fucana sulfatada I de S. droebachiensis também induzem a reação acrossômica
nesses espermatozóides, mas com uma potência mais reduzida (aproximadamente
25%). Claramente os espermatozóides de A. lixula são muito pouco responsivos à
fucana sulfatada II de S. droebachiensis (Fig. 11 A).
Em síntese, os resultados obtidos com as duas metodologias – captação de
cálcio e quantificação da reação acrossômica – indicam que os espermatozóides de
A. lixula respondem à fucana sulfatada homóloga e à fucana sulfatada I de S.
droebachiensis. Entretanto, apresentam uma resposta muito diferente à fucana
sulfatada II de S. droebachensis. Portanto, esses espermatozóides requerem um
polissacarídeo com unidade tetrassacarídica repetitiva para indução da reação
acrossômica.
68
1.1.3) Ensaios com espermatozóides de E. lucunter
Os mesmos ensaios descritos para A. lixula foram estendidos para os
espermatozóides de E. lucunter. Quando a captação de cálcio foi observada, os
resultados mostraram que esses espermatozóides respondem à própria matriz
gelatinosa e à própria galactana sulfatada purificada (Fig. 12 A e B, experimento de
captação de cálcio e figura 13, ensaio de reação acrossômica), mas não à fucana
sulfatada de L. variegatus e de A. lixula, como está mostrado no experimento de
captação de cálcio (Fig. 12 D e E), tendo isso também sido observado nos
experimentos de reação acrossômica (não mostrado). Por outro lado, em relação à
indução da reação acrossômica, curiosamente, os espermatozóides de E. lucunter
também reagiram à fucana sulfatada de S. franciscanus (Fig. 13), mas o mesmo não
Figura 11)
A- Reação acrossômica observada em espermatozóides da espécie A. lixula
e B: foto do espermatozóide reagido (R) e não reagido (NR), duplamente marcado para
rodamina-faloidina e DAPI (aumento de 100X) Para ambos experimentos a concentração final
de hexose dos polissacarídeos sulfatados testados foi de 500 µg/mL.
69
foi visto no experimento de incorporação de cálcio (Fig. 12 C). Esses dois
polissacarídeos são 2-sulfatados e possuem o mesmo tipo de ligação glicosídica.
Portanto, esses espermatozóides não distinguem L-galactose e L-fucose. De
maneira semelhante, os espermatozóides de S. franciscanus também respondem de
maneira equivalente à esses dois polissacarídeos sulfatados (Hirohashi et al.,
2002d).
70
Figura 12)
Captação de cálcio pelos canais presentes na membrana plasmática de
espermatozóides da espécie E. lucunter. Os espermatozóides de E. lucunter foram incubados com
FURA -2 e posteriormente analisados na indução da captação de cálcio através da adição de
polissacarídedos sulfatados. As setas simples indicam o momento da adição do polissacarídeo
sulfatado e as setas duplas indicam a variação na intensidade da fluorescência.
A) Matriz gelatinosa de E. lucunter. B) Galactana sulfatada de E. lucunter. C) Fucana sulfatada
de S. franciscanus. D) Fucana sulfatada de L.variegatus. E) Fucana sulfatada de A. lixula. F) Água do
mar artificial.
Inset: IF, intensidade de fluorescência
71
1.1.4) Ensaios com espermatozóides de L. variegatus
Os espermatozóides de L. variegatus foram muito específicos em resposta à
incubação com os diferentes polissacarídeos sulfatados de ouriços-do-mar nos
experimentos de incorporação de cálcio (Fig. 14) e na indução da reação
acrossômica (Fig. 15). Responderam exclusivamente a sua própria matriz gelatinosa
e a sua própria fucana sulfatada purificada (Fig. 14 A e B) e figura 15. Mesmo uma
fucana sulfatada com ligação glicosídica 1→3, como a de S. pallidus não induziu a
captação de cálcio em espermatozóides de L. variegatus (Fig. 14 F). Também não
responderam à fucana sulfatada com alto teor de 4-sulfato, como o polissacarídeo
de S. pallidus (Fig. 14 F). Ainda mais surpreendente, não responderam a uma
fucana sulfatada da própria espécie, sintetizada em períodos específicos do ano e
constituída por unidades 4-sulfato, unidas por ligação 1→3. Essa fucana sulfatada
será detalhada no capítulo 2.
Figura 13)
A- Reação acrossômica induzida pelos polissacarídeos sulfatados purufucados
observada em espermatozóides da espécie E. lucunter e B: foto do espermatozóide reagido e não
reagido, duplamente marcado para rodamina-faloidina e DAPI.
72
Portanto, os espermatozóides de L. variegatus são muito restritos e
respondem apenas a sua fucana sulfatada homóloga.
Figura 14)
Abertura dos canais de cálcio em espermatozóides da espécie L. variegatus.
A
, matriz
gelatinosa de L. variegatus, B, fucana sulfatada I de L. variegatus, C, fucana sulfatada II de L. variegatus, D,
galactana sulfatada de E. lucunter, E, fucana sulfatada de A. lixula, F, fucana sulfatada de S. pallidus, G,
água do mar. Inset: IF, intensidade de fluorescência. As setas simples indicam o momento da adição do
polissacarídeo sulfatado, e as setas duplas mostram a variação na intensidade de fluorescência
73
Como pudemos observar nas figuras 11, 13 e 15, em todas as espécies
testadas a porcentagem de indução da reação acrossômica pelo polissacarídeo
purificado não ultrapassa 50%. No caso de A.lixula, a matriz gelatinosa não
purificada é significativamente mais potente na indução da reação acrossômica do
que a fucana homóloga purificada. Essas observações sugerem que outro
componente da matriz gelatinosa, como o glico conjugado rico em ácido siálico, atua
de forma sinérgica com o polissacarídeo sulfatado, potencializando a indução da
reação acrossômica.
Figura 15)
A
- Reação acrossômica observada em espermatozóides da espécie L. variegatus e
B: foto do espermatozóide reagido e não reagido, duplamente marcado para rodamina-faloidina e
DAPI.
74
1.2) Ensaios de fertilização
Os experimentos que relatamos no item 1.2 mostram os efeitos dos
polissacarídeos sulfatados da matriz gelatinosa como indutores da reação
acrossômica, seja através da alteração morfológica ou pela captação de cálcio pelo
gameta. Entretanto o fenômeno biológico final é a fertilização. Portanto, resta
esclarecer se as três espécies de ouriços-do-mar que co-habitam o litoral do Rio de
Janeiro realmente não fazem cruzamentos intra específicos.
Com esse objetivo realizamos ensaios de fertilização incubando os óvulos das
três espécies – L. variegatus, A. lixula e E. lucunter com espermatozóides
homólogos e heterólogos. Após 8 minutos de incubação observamos por
microscopia a formação do envelope de fertilização. Observamos alta porcentagem
de fertilização nos cruzamentos homólogos – 80% para E. lucunter e 60% para L.
variegatus e A. lixula. Esses valores corroboram nossos dados de indução da reação
acrossômica (ALVES et al., 1997)
75
Figura 16) % de óvulos fertilizados por espermatozóides homólogos e heterólogos de três
espéciesde ouriços-do-mar A- espermatozóides de E. lucunter B: espermatozóides de L. variegatus e
C: espermatozóides de A. lixula.
76
Conclusões capítulo 1
A fertilização é um evento que já foi amplamente estudado em muitas
espécies. Os estudos iniciais foram realizados com invertebrados marinhos,
especialmente ouriços-do-mar e estrelas-do-mar. Nas últimas décadas, esses
estudos foram estendidos para diversas espécies de vertebrados, como
camundongos (BLEIL & WASSARMAN, 1988, WASSARMAN, 1999), sapos (TIAN
et al., 1997) e mesmo o homem. Esses estudos tiveram um grande avanço com as
técnicas de fertilização in vitro desenvolvidas por Steptoe & Edwards (1978). O
mecanismo de fertilização animal é similar nas diferentes espécies, e pode ser
esquematizado em quatro passos: 1) o espermatozóide é atraído ao óvulo através
de quimioatraentes liberados pelo óvulo. 2) Dependendo da espécie, o
espermatozóide se liga ao envelope vitelínico antes ou depois da exocitose do
conteúdo acrosomal 3) Após a exocitose, o espermatozóide “abre caminho” para
chegar ao óvulo. 4) Após a ligação espermatozóide-óvulo, as células se fundem e o
núcleo do espermatozóide é incorporado ao núcleo do óvulo (VACQUIER, 1998).
Nesse 1° capítulo, mostramos que diferentes espécies de ouriços-do-mar do
gênero Strongylocentrotus desenvolveram mecanismos distintos para o
reconhecimento entre os gametas. A indução da reação acrossômica, mediada
pela estrutura dos polissacarídeos sulfatados da matriz gelatinosa, é fundamental
para a diferenciação entre S. droebachiensis e S. pallidus. Nessas duas espécies a
posição da ligação glicosídica - 1→ 4 para S. droebachiensis e 1→3 para S.
pallidus - é um fator preponderante para reconhecimento entre espermatozóide e
óvulo.
77
Para a diferenciação entre essas duas espécies e S. purpuratus, o evento
essencial é provavelmente a interação entre a bindina e o seu receptor na
superfície do óvulo. As espécies encontradas no litoral do Rio de Janeiro se
mostraram muito restritas na sua fertilização. Essa conclusão é corroborada
através dos ensaios diretos de fertilização, observação da reação acrossômica e
medida da captação de cálcio pelos espermatozóides. Em especial, os
espermatozóides de L. variegatus se mostraram muito restritivos. À semelhança
das espécies do gênero Strongylocentrotus, esperávamos que os espermatozóides
de L. variegatus reconhecessem a fucana sulfatada de S. pallidus, por ter o mesmo
tipo de ligação glicosídica da fucana sulfatada homóloga, e unidade e também alto
teor de 4-sulfatação. Contudo, isso não ocorreu. Provavelmente os
espermatozóides de L. variegatus requerem uma fucana sulfatada com a unidade
tetrassacarídica específica para a indução da reação acrossômica.
Os espermatozóides de A. lixula reconheceram a fucana sulfatada I de S.
droebachiensis, cuja estrutura é idêntica à sua fucana homóloga. Porém, não
reagiram com a fucana sulfatada II, constituída integralmente por unidades 2-
sulfatadas.
E. lucunter foi a única espécie que reconheceu um polissacarídeo sulfatado
heterólogo. Os espermatozóides dessa espécie reagiram de maneira equivalente à
sua galactana sulfatada e à fucana sulfatada de S. franciscanus. Esses dois
polissacarídeos são constituídos por ligações glicosídicas do tipo α(1→3) e
sulfatadas na posição 2. A diferença entre eles reside no tipo de açúcar
constituinte, α-galactose em E. lucunter e α-fucose em S. franciscanus. Para os
espermatozóides dessa espécie o importante é o sítio de sulfatação e o tipo de
ligação glicosídica.
78
As espécies do gênero Strongylocentrotus estão amplamente
distribuídas nos oceanos Atlântico e Pacífico, mas não coabitam com as três
espécies estudadas do litoral do Rio de Janeiro. Assim, o mecanismo que dirigiu a
evolução do sistema de reconhecimento entre os gametas das espécies
encontradas no litoral do Rio de Janeiro pode ser bem diferente. Sabe-se que esse
sistema tem uma divergência evolutiva rápida e extensa, que está ligado aos
processos de especificidade (SWANSON & VACQUIER, 2002).
Evolutivamente, S. franciscanus é a espécie mais distante do gênero
Strongylocentrotus, seguida de S. purpuratus e S. droebachiensis e S. pallidus. As
duas últimas espécies são bem próximas. Isso pode explicar o fato do mecanismo
de reconhecimento entre S. droebachiensis e S. pallidus ser similar. L. variegatus
é uma espécie que divergiu há cerca de 30-40 milhões de anos, bem mais que S.
franciscanus, que divergiu entre 2.5-20 milhões de anos (MINOR et al., 1991).
Ainda mais distante é A. lixula, que divergiu a cerca de 200 milhões de anos,
enquanto E. lucunter é considerada uma espécie nova, que divergiu de seu
ancestral há 1,62 milhões de anos (McCartney et al., 2000). O fato dessas três
espécies co-habitarem a mesma região e com épocas de reprodução próximas,
pode explicar as barreiras para os cruzamentos intra-específicos que existem entre
elas. Necessariamente essas espécies necessitam diferenciar as moléculas que
estão envolvidas nas suas fertilizações.
Os experimentos de captação de cálcio pelos espermatozóides
corroboram os dados da literatura mostrando que os polissacarídeos sulfatados da
matriz gelatinosa estimulam a abertura dos canais de cálcio, um evento
fundamental para disparo da reação acrossômica (HIROHASHI & VACQUIER,
2002 a,b,c,d). Há necessidade da abertura seqüecial dos dois canais, e na ordem
79
correta. Esse fato é crucial para o sucesso da reação acrossômica. O primeiro
canal leva a um aumento rápido na concentação interna de Ca
++
, enquanto o
segundo, que parece ser regulado pela abertura do primeiro, possui características
de canais de cálcio que funcionam a partir de estoques internos de cálcio. O
polissacarídeo sulfatado provavelmente se liga ao seu receptor no espermatozóide
(REJ1), e leva a abertura do primeiro canal de cálcio, e logo depois o segundo
canal se abre também. O perfil de incorporação de cálcio que nós observamos é
típico da abertura dos dois canais; quando somente o primeiro canal se abre, há
uma subida na incorporação de cálcio, e rapidamente acontece uma queda na
intensidade de fluorescência, voltando ao mesmo nível que antes da adição do
polissacarídeo sulfatado. Outros fatores também levam a abertura de um canal ou
outro, mas sem capacidade de assegurarem a reação acrossômica. Os
mecanismos completos desse sistema ainda não são conhecidos.
80
Capítulo 2) Uma fucana sulfatada inativa de L. variegatus com expressão
sazonal*
*Esses dados também estão apresentados e discutidos no anexo II:
Expression of two different sulfated fucans by females of Lytechinus variegatus may
regulate the seasonal variation in the fertilization of the sea urchin. Glycobiology vol.
17 no. 8 pp. 877–885, 2007.
81
2) Purificação e caracterização estrutural de uma
segunda fucana sulfatada em L. variegatus
Durante os experimentos com gametas da espécie L. variegatus, os óvulos
eram sempre recolhidos para serem aproveitados para a extração de
polissacarídeos sulfatados. Estas coletas foram realizadas ao longo de todo o ano.
Sabe-se que muitas espécies de ouriços-do-mar possuem épocas de reprodução
específicas, quando os gametas são liberados fisiologicamente, para que ocorra a
reprodução (BROOKBANK, 1968). Mas, como nós induzíamos a liberação dos
gametas com KCl, muitas vezes eram liberados espermatozóides e óvulos que ainda
não estavam maduros. Com isso, muitos dos experimentos com espermatozóides
tornavam-se inviáveis. Contudo, os óvulos coletados eram submetidos a extração da
matriz gelatinosa, e pudemos perceber que, no período ao redor do inverno,
aparecia um segundo polissacarídeo sulfatado. Fomos então estudar sua estrutura,
e analisar as condições de expressão desse segundo polissacarídeo.
Inicialmente extraímos os polissacarídeos totais da matriz gelatinosa dos
óvulos de L. variegatus, que foram liberados no inverno. Esses polissacarídeos
foram aplicados em uma coluna DEAE celulose, eluídos com um gradiente linear de
0 a 3M de NaCl, e monitorados por metacromasia com DMB e pela reação de
Erlich, que evidencia ácido siálico (KABAT & MAYER, 1971) (Fig 17 A). A coluna
revelou 3 frações: A primeira é positiva para ácido siálico (Fig. 17 A, SG, círculos
fechados). A segunda e a terceira são positivas para polissacarídeos sulfatados,
indicado pela metacromasia, em círculos abertos. A segunda fração, denominada
como P1, é eluída com cerca de 1,2 M de NaCl,o que é característico da fucana
82
sulfatada que descrevemos anteriormente na matriz gelatinosa de L. variegatus
(MULLOY et al., 1994). Já a terceira fração, denominada como P2, foi uma surpresa.
A migração eletroforética sugeriu que esses dois polissacarídeos têm uma estrutura
química diferente (Fig 17B), A fração P2 aparece apenas ao redor do inverno,
indicando um polissacarídeo sulfatado de expressão sazonal. Análises por
cromatografia em papel (não mostrado) comprovaram que esse segundo
polissacarídeo sulfatado (Fig. 17 A, P2), assim como P1, também é composto
somente por resíduos de fucose sulfatada.
A próxima etapa foi determinar a estrutura química dessa segunda fucana
sulfatada. Esses experimentos foram feitos por Ressonância Magnética Nuclear
(RMN). O espectro unidimensional da fucana sulfatada I (P1) confere com o
polissacarídeo descrito anteriormente nessa espécie (MULLOY et al., 1994), cuja
estrutura é composta da unidade tetrassacarídica repetitiva [3-α-L-Fucp-2(OSO
3
)-
Figura 17
– Purificação das fucanas sulfatadas da matriz gelatinosa de óvulos de ouriço-do-
mar da espécie L. variegatus
Perfil de eluição da cromatografia de DEAE-celulose. SG: sialo glicoconjugado. P1: fucana
sulfatada 1. P2: fucana sulfatada 2. (○) Metacromasia (525 nm) (●) Reação de Erlich.
Eletroforese em gel de agarose das amostras obtidas da cromatografia anterior, de fêmeas
analisadas no verão e no inverno.
83
1→3-α-L-Fucp-4(OSO
3
)-1→3-α-LFucp-2,4(OSO
3
)-1→3-α-L-Fucp-2(OSO
3
)-1]n (Fig.
18 e 19). O espectro da segunda fucana sulfatada (P2) mostrou apenas um sinal
anomérico em 5,1 ppm (em contraste com os quatro sinais observados na fucana
sulfatada 1), e um sinal de metil em 1,25 ppm (Fig. 19). Esses dados são indicativos
de que a fucana sulfatada II é composta por unidades monossacarídicas repetitivas,
enquanto a fucana sulfatada I possui unidades tetrassacarídicas repetitivas.
Figura 18
– Estrutura da fucana sulfatada I (P1) habitualmente encontrada na matriz
gelatinosa de L. variegatus.
84
Os prótons da fucana sulfatada P2 foram assinalados através do
1
H-COSY
(espectroscopia de correlação, anexo II) e TOCSY (espectroscopia de correlação
total). Os “cross peaks” mostraram a correlação entre o sistema de spin e os
deslocamentos de
1
H estão mostrados na Tabela I.
O espectro
1
H/
13
C HMQC mostrou seis picos majoritários e foi interpretado
usando a informação obtida através dos espectros de TOCSY e COSY. Essa análise
permitiu a determinação dos deslocamentos químicos de
13
C, mostrados na Tabela
II. A posição de sulfato foi claramente deduzida pelo intenso deslocamento para
campo baixo do H4 (0,7 ppm), em comparação com unidades não sulfatadas nessa
posição. A ligação glicosídica foi deduzida pelo deslocamento para campo baixo de
C3, como pode ser visto na tabela II, indicando unidades unidas por ligação 1→3.
Figura 19
– Espectro unidimensional de 1H a 600 MHz da fucana sulfatada I (P1 – A) e da
fucana sulfatada II (P2 – B)
85
Esses dados indicam que a fucana sulfatada II (P2) de L. variegatus possui a
seguinte estrutura: [3-α-L-Fucp-4(OSO
3
)-1]n (Fig. 20).
Tabela 1) Deslocamento químico de prótons em resíduos de α-fucose dos polissacarídeos
sulfatados de L. variegatus e em compostos padrão.
Espécies
Tipo de unidade
Isotipo de
fucana
sulfatada
Deslocamento químico (ppm)
a
H1 H2 H3 H4 H5 H6
L. variegatus
3-α-L-Fucp-(4SO
3
-
)-1-
P2 5,10 3,86 4,02
4,72
4,45 1,25
L. variegatus
3-α-L-Fucp-(2SO
3
-
)-1-
b
P1 (a)
c
5,40
4,51
4,25 4,05 4,32 1,23
L.
variegatus
3-α-L-Fucp-(2,4SO
3
-
)-1-
b
P1 (b)
c
3,38
4,54
4,22
4,77
4,51 1,25
L. variegatus
3-α-L-Fucp-(2SO
3
-
)-1-
b
P1 (c)
c
5,31
4,54
4,12 4,06 4,44 1,24
L. variegatus
3-α-L-Fucp-(4SO
3
-
)-1-
b
P1 (d)
c
5,08 3,87 3,98
4,78
4,45 1,27
A. lixula
4-α-L-Fucp-(2SO
3
-
)-1-
d
5,25
4,51
4,16 4,01 4,56 1,38
S. purpuratus
3-α-L-Fucp-(4SO
3
-
)-1-
e
5,14 3,90 4,07
4,76
4,55 1,32
Valores em negrito indicam a posição de sulfato. b, Mulloy (1994), c, figura 18, d Alves (1997) e e,
Alves (1998).
Tabela 2) Deslocamento químico de carbonos para resíduos de α-fucose da fucana sulfatada
II de L. variegatus e em compostos padrão.
Espécies
Tipo de unidade Deslocamento químico (ppm)
a
C1 C2 C3 C4 C5 C6
L. variegatus
3-α-L-Fucp-(4SO
3
-
)-1-
98,5 68,8
76,6
79,9 67,0 15,8
S. franciscanus
b
3-α-L-Fucp-(2SO
3
-
)-1-
96,77 75,52
75,94
74,16 69,00 18,00
S. pallidus
c
3-α-L-Fucp-(4SO
3
-
)-1-
97,20 70,05
78,55
81,80 69,13 15,00
S. pallidus
c
3-α-L-Fucp-(4SO
3
-
)-1-
95,70 70,05
78,55
81,80 69,13 15,00
S. droebachiensis
c
4-α-L-Fucp-(2SO
3
-
)-1-
101,97 77,90 70,97
83,40
69,96 13,00
S. droebachiensis
c
4-α-L-Fucp-(2SO
3
-
)-1-
101,60 77,90 71,40
83,40
69,96 13,00
Valores em negrito indicam a posição da ligação glicosídica. a, deslocamentos químicos relativos ao
metanol. b, Vilela-Silva (1999) e e, Vilela-Silva (2002).
86
2.1) Qual o significado fisiológico da fucana sulfatada II de L.
variegatus?
Algumas espécies de ouriços-do-mar também possuem duas isoformas de
fucanas sulfatadas na sua matriz gelatinosa. Já descrevemos essa observação em
S. droebachiensis (VILELA-SILVA et al., 2002) e S. purpuratus (ALVES et al., 1998).
Porém, nessas espécies, as duas isoformas de fucanas sulfatadas induzem a
reação acrossômica nos espermatozóides homólogos com potência semelhante. Em
contraste com essas observações anteriores, a fucana sulfatada II de L. variegatus
não induz a reação acrossômica em espermatozóides homólogos. Tanto nos
ensaios de observação direta da reação acrossômica (Fig. 21 A), quanto nos
ensaios de captação de cálcio pelos espermatozóides (Fig. 21B), a fucana sulfatada
II não foi ativa. O máximo de indução da reação acrossômica pela fucana sulfatada II
é de 10%, equiparável à água do mar, que é o controle negativo.
Figura 20
– Estrutura da fucana sulfatada II (P2) encontrada na matriz gelatinosa de L.
variegatus.
87
Nossa sugestão é a de que como a fucana sulfatada II é sintetizada
majoritariamente ao redor do inverno, sua ocorrência na matriz gelatinosa preveniria
a indução da reação acrossômica e a conseqüente fertilização. Dessa forma
preveniria formação de embriões em um período pouco propício ao seu
desenvolvimento.
Para esclarecer o período de ocorrência da fucana sulfatada II e se uma
mesma fêmea sintetizaria os dois isotipos ou apenas um deles, coletamos a matriz
gelatinosa de fêmeas individualizadas no decorrer do período de um ano. A matriz
gelatinosa de cerca de 70 fêmeas no período do verão só apresentavam a fucana
sulfatada I, e o glicoconjugado rico em ácido siálico. Durante o outono/inverno,
analisamos 45 fêmeas com matriz gelatinosa em quantidade suficiente para a
identificação das fucanas sulfatadas. Dessas, 28 apresentavam somente a fucana
Figura 21
–
A
– Indução da reação acrossômica em espermatozóides da espécie L.
variegatus B – indução da captação de cálcio por espermatozóides da espécie L. variegatus. As setas
indicam o momento da adição da fucana sulfatada.
88
sulfatada II e 17 apresentavam somente a fucana sulfatada I, além do
glicoconjugado rico em ácido siálico. Exemplos das cromatografias de troca iônica
das matrizes gelatinosas coletadas no verão e no inverno são mostradas na Figura
22 (A, B, C e D).
A quantidade total de matriz gelatinosa produzida pelas fêmeas durante os
meses do outono e da primavera diminui substancialmente em comparação com a
quantidade extraída das fêmeas nos meses do verão (Fig. 23, círculos abertos). A
quantidade de polissacarídeos sulfatados extraídos da matriz gelatinosa (também
em peso seco) (Fig. 23 círculos fechados) acompanha a mesma variação observada
para a matriz gelatinosa. Observamos dois períodos de alta produção, e dois
Figura 22
– Purificação dos polissacarídeos sulfatados obtidos de fêmeas individuais da L.
variegatus coletadas durante o inverno (A – C) e no verão (D). Os gametas foram coletados e
analisados individualmente, e purificados por cromatografia de troca iônica em uma coluna MONO-Q
acoplada a um sistema de FPLC. As frações foram analisadas de acordo com sua metacromasia (■) e
concentração de NaCl (---). SG: glicoconjugado rico em ácido siálico. P1: Fucana sulfatada 1 e P2
fucana sulfatada 2.
89
períodos de baixa produção da matriz gelatinosa e dos polissacarídeos sulfatados.
Variação semelhante foi observada para espécimes de L. variegatus que ocorrem na
Flórida (MCCARTHY & YOUNG, 2002).
Não foi possível correlacionar os dois períodos de variação na produção da
matriz gelatinosa e dos polissacarídeos sulfatados com fatores ambientais, tais
como pH da água do mar, densidade, salinidade e concentração de oxigênio na
água. Claramente observamos que a produção da fucana sulfatada II (ou P2, como
mostrado nos gráficos) ocorre nos meses mais frios do ano no hemisfério sul (entre
junho e agosto). Portanto correlacionamos a presença da fucana sulfatada II com a
temperatura mais baixa da água do mar. Porém, mais experimentos precisam ser
feitos para confirmar definitivamente essa possibilidade.
Outra hipótese é a de que a fucana sulfatada II também seria produzida nos
meses do verão, porém não sendo detectada na presença de altas concentrações
da fucana sulfatada I. Para verificarmos essa possibilidade, realizamos uma
Figura 23
– Análise do peso seco da matriz gelatinosa (○) e dos polissacarídeos totais (●)
obtidos de fêmeas individuais de L. variegatus coletadas ao longo de um ano
90
cromatografia de troca iônica utilizando quantidades elevadas de polissacarídeos
totais extraídos da matriz gelatinosa de fêmeas coletadas no verão. Coletamos as
frações eluídas da região da cromatografia com a concentração de NaCl que remove
a fucana sulfatada II. Mesmo sem reação positiva por metacromasia com DMB,
agrupamos e dialisamos contra água destilada. Em seguida fomos analisar por
eletroforese em gel de agarose e RMN (não mostrado). Claramente não detectamos
fucana sulfatada II nessas amostras. Concluímos que as fêmeas de L. variegatus
não sintetizam o isotipo II da fucana sulfatada durante o período do verão.
Conclusões capítulo 2
A matriz gelatinosa dos óvulos do ouriço-do-mar L. variegatus possui duas
fucanas sulfatadas: Uma delas é encontrada durante todo o ano. Sua estrutura é
regular, formada por unidades tetrassacarídicas repetitivas (MULLOY et al., 1994). A
outra fucana é formada por unidades monossacarídicas repetitivas, e só aparece
nos meses mais frios do ano.
Essa segunda isoforma da fucana sulfatada foi testada em experimentos de
fertilização com espermatozóides de L. variegatus. Testamos seu efeito como
indutora da reação acrossômica e da captação de cálcio pelos espermatozóides.
Não observamos resposta positiva nas duas metodologias. Nossa sugestão é a de
que a ocorrência da fucana sulfatada II na matriz gelatinosa previne a baixa
reprodução dos ouriços-do-mar e a fertilização dos óvulos, já que não há indução da
reação acrossômica nos espermatozóides.
91
Naturalmente, nas épocas de temperaturas mais baixas, mesmo que ocorra a
fertilização, a possibilidade dos embriões se desenvolverem é muito baixa
(FUJISAWA et al., 1989).
92
Capítulo 3) O ouriço-do-mar Glyptocidaris crenularis contém uma β-
galactana sulfatada
93
3) Purificação e caracterização estrutural de uma
galactana sulfatada de G. crenularis
A terceira e última etapa da tese envolveu a caracterização estrutural do
polissacarídeo sulfatado presente na matriz gelatinosa que envolve os óvulos da
espécie Glyptocidaris crenularis. Essa espécie é encontrada na baía de Noheji, no
Japão, e sua matriz gelatinosa nos foi enviada liofilizada pelo Dr Noritaka Hirohashi.
Essa espécie de ouriço-do-mar vive em grandes profundidades (mais de 30 metros)
(http://www.echinoids.nl/), enquanto E. lucunter, A. lixula e L. variegatus, as espécies
encontradas no litoral do Brasil, vivem em cerca de 3 metros de profundidade.
A primeira etapa do trabalho consistiu na extração dos polissacarídeos
sulfatados da matriz gelatinosa, e a sua subseqüente purificação através de
cromatografia de troca iônica em coluna Mono Q, acoplada a um sistema de FPLC.
O sistema foi eluído com um gradiente linear de 0 a 3 M de NaCl, e as frações
monitoradas por metacromasia (quadrados fechados), reação de Dubois (triângulos
fechados) e reação de Erlich (círculos fechados) (Fig. 24 A). Para nossa surpresa, só
identificamos uma fração, sem evidência de ocorrência do glicoconjugado rico em
ácido siálico encontrado em todas as outras espécies já analisadas anteriormente.
Dividimos essa fração em dois componentes denominados como P1 e P2 (Fig. 24
A). Esses polissacarídeos foram dialisados contra água destilada e liofilizados. O
único açúcar encontrado em P1 e P2 foi galactose. Portanto esse polissacarídeo é
uma galactana sulfatada. Até hoje, galactana sulfatada foi encontrada apenas na
espécie de ouriço-do-mar E. lucunter (ALVES et al., 1997).
94
A eletroforese em gel de agarose de P1 e P2 (Fig. 24 B) mostrou que não há
diferença significativa na migração dessas subfrações. Também mostram uma
migração distinta da galactana sulfatada de E. lucunter, sugerindo uma possível
diferença estrutural entre elas. Essa diferença será confirmada por Ressonância
Magnética Nuclear. Análises em cromatografia gasosa (não mostrado) com a
galactana sulfatada purificada mostraram que esta contém resíduos de D-galactose.
Os experimentos de RMN foram feitos com a galactana sulfatada nativa e o
derivado dessulfatado quimicamente (ver Materiais e Métodos). Isso permite
reconhecer o sítio de sulfatação e a posição da ligação glicosídica.
As subfrações P1 e P2 têm espectros unidimensionais de prótons idênticos
(não mostrado), mostrando que se trata de um único polissacarídeo sulfatado.
Figura 24
- Purificação dos polissacarídeos sulfatados da matriz gelatinosa de óvulos de ouriço-
do-mar da espécie G. crenularis.
A, Perfil de eluição da cromatografia de troca iônica Mono-Q acoplada a um sistema de FPLC.
A coluna foi monitorada através de (■) metacromasia (525 nm) (●) reação de Erlich, dosagem de hexose
(▲) e condutividade (--).
B, Eletroforese em gel de agarose das amostras obtidas da cromatografia anterior. PT:
Polissacarídeos totais.P1: Primeira parte do pico metacromático, que foi dividido em dois. P2: Segunda
parte do pico metacromático. EL: Galactana sulfatada de E. lucunter.
95
O espectro unidimensional de
1
H da galactana sulfatada (Fig. 25 A) mostrou
dois sinais, que correspondem a prótons β anoméricos, o que foi confirmado pelo
espectro de
1
H/
13
C-HSQC (Fig. 27 A). Os dois sinais anoméricos foram
denominados como A1 e B1, com deslocamentos químicos de prótons de 4,94 e
4,73 ppm, respectivamente, equivalentes a resíduos de β-galactopiranose sulfatado
e não sulfatado (Tabela III).
Figura 25
– Espectro unidimensional de
1
H-RMN a 400 MHz da galactana sulfatada intacta
(A) do ouriço-do-mar G. crenularis e a mesma galactana dessulfatada quimicamente (B). Os sinais
A1 e B1 correspondem aos sinais de prótons anoméricos H1- de resíduos de β-galactopiranose 2-
sulfatado e não sulfatado. * contaminante.
96
O espectro unidimensional de
1
H da galactana dessulfatada (Fig. 25 B)
mostrou um único sinal de próton anomérico, semelhante ao resíduo não sulfatado
da molécula nativa. Esse resultado sugere que a galactana sulfatada de G.
crenularis é constituída por quantidades equimolares de resíduos sulfatados e não
sulfatados. Com o objetivo de assinalar os resíduos desses dois tipos de unidades
foram realizados espectros bidimensionais (Figs 26 e 27). A identificação dos cross-
peaks nos espectros de COSY (Figs 26 A e D) e TOCSY (Fig 26 B e E) permitiu
assinalar os prótons dos dois sistemas de spins, como indicado na tabela III. Com os
deslocamentos químicos dos prótons foi possível assinalar a correlação
1
H e
13
C nos
espectros de HSQC (Fig. 27), e assim obtivemos os valores dos deslocamentos
químicos de
13
C, indicados na tabela III.
A comparação entre os deslocamentos químicos da galactana dessulfatada
de G. crenularis com valores da literatura indica claramente que esse polissacarídeo
é constituído por unidades de β-galactopiranose, unidos por ligações 1→3. A
posição da ligação glicosídica é indicada claramente pelo deslocamento a
aproximadamente 10 ppm do C-3 para campo baixo.
Os deslocamentos químicos de 1H e 13C das unidades da galactana
dessulfatada são semelhantes àqueles do resíduo B da galactana nativa de G.
crenularis. O resíduo A mostra claramente um deslocamento de aproximadamente
0,8 ppm de H2 e de aproximadamente 0,2 de H1 para campo baixo, indicando
claramente a ocorrência de unidades 2-sulfatadas.
97
FIGURA 26)
Tiras das regiões anoméricas (expansões entre ~ 4.5 a ~ 5.1 ppm) de COSY (
A
e
D
), TOCSY (
B
e
E
) e NOESY (
C
). Espectros da
galactana sulfatada (A-C) de G. crenularis e dessulfatada quimicamente (D e E). Cerca de 5 mg foram dissolvidos em 0.5 mL de D
2
O e os espectros 2D
RMN foram realizados a 50
o
C em 400 MHz. Os deslocamentos químicos são relativas ácido trimetilsulfonilpropiônico em 0 ppm para
1
H. Os sistemas de spin
foram chamados de A e B para unidades de β-galactopiranosídeor 2-sulfatado e não sulfatado respectivamente. * contaminante.
98
Figura 27
– Espectro de
1
H/
13
C HSQC da galactana sulfatada intacta de G. crenularis (
A
)
e dessulfatada quimicamente (B). Os sistemas de spin foram marcados como A e B para unidades
de β-galactopiranose - 2-sulfatada e não-sulfatada, respectivamente.
99
Uma vez esclarecido que a galactana sulfatada de G. crenularis é
constituída por quantidades equimolares de unidades de β-galactose não
sulfatada (unidade B) e 2-sulfatada (unidade A) restou determinar se esses
resíduos estão intercalados ou distribuídos de maneira randômica. Esse
aspecto foi esclarecido com o espectro de NOESY (Fig. 26 C). Claramente,
identificamos NOES inter-resíduos entre o H1 do resíduo A e o H3 do resíduo B
(A1-B3) e entre o H1 do resíduo B e o H3 do resíduo A (B1-A3), além de
diversos NOESs inter-resíduos (A1-A3, A1-A5, B1-B3 e B1-B5).
Este último resultado indica claramente que as unidades A e B estão
intercaladas ao longo do polímero, sugerindo um padrão de distribuição
homogêneo para a molécula. Assim, a β galactana sulfatada de G. crenularis é
formada por unidades dissacarídicas repetitivas, da seguinte maneira: [→3)-β-
Galp-2(SO
4
)-(1→3)-β-Galp-(1→]
n,
como é mostrado na figura 28.
Figura 28: Estrutura da unidade dissacarídica da galactana sulfatada de G. crenularis
100
Tabela III) Deslocamentos químicos de
1
H and
13
C (ppm),
3
J
H-H
e
1
J
C-H
do espectro de
RMN da α-L-galactana sulfatada de E. lucunter e da β-galactana sulfatada de G. crenularis
Polissacarídeo de ouriço
-
do
-
mar
Deslocamento químico
1
H e
13
C
H
-
1
C-1
H
-
2
C-2
H
-
3
C-3
H
-
4
C-4
H
-
5
C-5
H
-
6
C-6
β
ββ
β-D-galactana sulfatada (A) resíduo
2-sulfatado
4.94
104.1
4.52
80.2
4.11
81.8
4.37
70.5
4.02
74.3
3.82
62.5
β
ββ
β
-D-galactana sulfatada (B) resíduo
não sulfatado
4.73
107.2
3.87
72.0
3.90
83.5
4.24
69.1
3.75
77.0
3.82
62.5
α
αα
α-L-galactana sulfatada
a
5.47
97.2
4.66
76.2
4.23
75.9
4.33
72.5
4.35
69.5
3.82
63.8
3
J
H-H
(Hz)
H-1, H-2 H-2, H-3 H-3, H-4 H-4, H-5 H-5, H-6
β
ββ
β
-D-galactana sulfatada
4.4 7.9 2.7 ND ND
α
αα
α
-L-galactana sulfatada
3.0 10.5 ND
c
ND 4.5
C-1,H-1 C-2,H-2 C-3,H-3 C-4,H-4 C-5,H-5
C-5,H-5
β
ββ
β-D-galactana sulfatada (A) resíduo
2-sulfatado
164.7 156.8 143.4 151.4 143.0 143.9
β
ββ
β
-D-galactana sulfatada (B) resíduo
não sulfatado
163.5 141.2 143.1 150.5 139.9 143.9
α
αα
α-L-galactana sulfatada
177.5 151.3 146.2 146.5 146.8 143.3
a
Dados de Pereira, 2002.
Valores em itálicos são referentes à ligação glicosídica
101
3.1) Conformações distintas das α- e β galactanas sulfatadas
Os sinais de prótons anoméricos da β-galactana sulfatada de G.
crenularis mostram “dublets” bem definidos (Fig. 25 A e B) com valores de J
H1-
H2
de aproximadamente 7.4 Hz (Tabela III). Esse padrão de “multiplets” é
evidente nos espectros homonucleares bidimensionais (TOCSY e NOESY, fig.
26B-E). Esse padrão de multiplets também foi observado em β-galactanas
sulfatadas de outros organismos (AMORNRUT et al., 1999), mas não em α-
galactanas sulfatadas (Alves, 1997, Pereira, 2002) (Tabela III).
As diferenças nos valores de J entre α- e β-galactanas sulfatadas
possivelmente refletem diferentes conformações moleculares entre essas duas
galactanas. Provavelmente, a β-galactana sulfatada é um polímero mais
flexível do que a α-galactana sulfatada. Essa diferença se reflete nos valores
distintosde
3
J
H-H
e de
1
J
C-H
da β-galactana sulfatada de G. crenularis e da α-L
galactana sulfatada de E. lucunter. As duas unidades constituintes da β-
galactana sulfatada de G. crenularis possuem os mesmos valores de
3
J
H-H,
apenas com uma discreta diferença nos valores de
1
J
C-H
(Tabela III). Isso
significa que a presença ou não de sulfato não influencia nas constantes de
acoplamento. Essa observação indica que os estereoisômeros α and β
contribuem significativamente para a conformação dos polímeros de galactose
sulfatada. Para confirmar essa hipótese, empregamos técnicas de modelagem
molecular para arranjos de dissacarídeos sulfatados e não-sulfatados dessas
duas galactanas sulfatadas de ouriços-do-mar com o intuito de avaliar as
possíveis diferenças na conformação dos polissacarídeos.
102
3.1.2) Conformação de α- e β-galactanas sulfatadas
Os dados espectroscópicos sugerem que α- e β-galactanas sulfatadas
diferem nas suas conformações em solução.
Estudos de Becker et al. (2007) indicaram que a sulfatação de
galactanas aumenta a rigidez da cadeia polissacarídica, como indicado pelos
estudos conformacionais. Em especial nota-se uma diminuição da região de
energia mínima nos plots de contorno e nos ângulos diedráis ψ e Φ nessas
formas aniônicas (Fig. 29 A e B). Para cadeias compostas por unidades de β-
galactose, também é observado um aumento nas regiões de alta energia nos
mapas dos compostos sulfatados (Fig. 29 C, D e E). Porém, o perfil
conformacional da β-galactana sulfatada mostra maior variedade de estruturas
do que das α-galactanas. Cadeias de α-L-galactose contém única
conformação, presente com um mínimo de energia. Por outro lado, ß-D-
galactana apresenta muitas regiões de energia mínima nos plots de contorno,
com 2 a 3 conformações para cada ângulo diedral, resultando em 6 a 9
possíveis conformações para cada unidade dissacarídica. Esses dados
mostram claramente que a ß-galactana sulfatada possui maior flexibilidade e
pode assumir uma maior variedade de conformações do que a α-galactana
sulfatada.
103
Figura 29)
Descrição conformacional de galactanas compostas das seguintes unidades :
A) α-D-Galp(1→3)α-D-Galp
B) α-D-Galp2S(1→3) α-D-Galp2S
C) β-D-Galp(1→3)β-D-Galp
D) β-D-Galp2S(1→3)β-D-Galp
E) β-D-Galp(1→3)β-D-Galp2S
Os “plots” de contorno são mostrados entre 10kJ.mol
-1
a 10/50kJ.mol
-1
, (*) indicam a quantidade de
energia mínima necessária para obter as conformações e refinamentos de MD.A flutuação e distribuição dos
ângulos Φ e ψ estão mostradas.
104
3.2) Estrutura x atividade biológica
Os estudos estruturais revelaram uma β-galactana sulfatada, com
estrutura única e bem distinta daquelas que havíamos descrito
anteriormente.Tentativas de testar essa β-galactana sulfatada como indutora
da reação acrossômica em espermatozóides homólogos foram infrutíferas
porque os gametas de G. crenularis são muito pequenos e é impossível
identificar a reação acrossômica por análise microscópica. Outra dificuldade é
que G. crenularis é uma espécie de difícil coleta, que ocorre em alta
profundidade e baixa temperatura, com um curto período de reprodução (final
de fevereiro a abril, no Japão. HIRAI, 1963).
Porém, essa β-galactana sulfatada é importante para estabelecer a
relação entre estrutura versus atividade de indução da reação acrossômica em
espermatozóides de E. lucunter. Essa espécie de ouriço-do-mar possui na sua
matriz gelatinosa, como indutor natural da reação acrossômica, uma α-L-
galactana sulfatada com resíduos unidos por a ligação glicosídica 1→3 e
sulfatados na posição 2.
Metade das unidades constituintes da galactana sulfatada de G.
crenularis é semelhante ao polissacarídeo de E. lucunter (glicosilação na
posição 3 e sulfatação na posição 2), porém esses dois componentes diferem
na configuração anomérica da ligação glicosídica α em E. lucunter, β em G.
crenularis. Observamos que a β-galactana sulfatada de G. crenularis não induz
a reação acrossômica nem a captação de cálcio nos espermatozóides de E.
lucunter (Fig. 30 A e B), mostrando que a configuração anomérica α é um
requisito estrutural importante para a indução da reação acrossômica. Em
105
contraste, a fucana α-sulfatada de S. franciscanus, semelhante ao
polissacarídeo homólogo de E. lucunter é capaz de induzir a reação
acrossômica em espermatozóides de E. lucunter.
Os estudos de modelagem molecular (Fig. 29) mostraram que β-
galactanas sulfatadas têm conformação mais flexível do que α-galactana
sulfatada. Porém, a conformação preponderante da α-galactana sulfatada e
que supomos que seja fundamental para a indução da reação acrossômica em
espermatozóides de E. lucunter está ausente no mapa conformacional da β-
galactana sulfatada. Portanto, a β-galactana sulfatada, apesar de sua grande
flexibilidade conformacional, não é capaz de assumir a estrutura necessária
para induzir a reação acrossômica nos espermatozóides de E. lucunter.
106
Conclusões capítulo 3
Figura 30)
A: Reação acrossômica em espermatozóides de E. lucunter.
B: Captação de cálcio em espermatozóides de E. lucunter.
1: espermatozóides de E. lucunter + galactana sulfatada de E. lucunter
2: espermatozóides de E. lucunter + galactana sulfatada de G. crenularis
3: espermatozóides de E. lucunter + água do mar artificial
107
Nossa primeira observação intrigante nos estudos com G.
crenularis foi a ausência do glicoconjugado rico em ácido siálico na matriz
gelatinosa dessa espécie. Todas as outras sete espécies de ouriços-do-mar já
analisadas possuem este composto, que participa da fertilização,
potencializando a reação acrossômica. Esse glicoconjugado rico em ácido
siálico aumenta o pHi do espermatozóide, sem alterar a concentração de cálcio
intracelular. Esse aumento não é bloqueado por nifedipina ou altas
concentrações de K
+
, como acontece com o aumento de pHi induzidos pelos
polissacarídeos sulfatados. Essas observações sugerem a presença de um
receptor para o glicoconjugado (HIROHASHI &VACQUIER, 2002b). Fizemos
experimentos exaustivos para encontrar esse composto na matriz gelatinosa de
G. crenularis, mas sem sucesso.
Também não conseguimos realizar os experimentos de indução da
reação acrossômica com os espermatozóides de G. crenularis. Existem dados
na literatura sobre a fertilização envolvendo essa espécie. Há relatos de
experimentos de fertilização cruzada entre G. crenularis e Hemicentrotus
pulcherrinus, mas a taxa de fertilização cruzada é extremamente baixa, em
torno de 1,5%, enquanto a de fertilização homóloga é bem alta, cerca de 99,1%
(OSANAI, 1972). Além disso, também já foram feitos experimentos envolvendo
os peptídeos ativadores obtidos da matriz gelatinosa dos ouriços-do-mar (os
SAPs). G. crenularis possui esses receptores e eles aumentam a taxa de
respiração, produção e aumento nas concentrações de AMPc e GMPc nos
próprios espermatozóides (SUZUKI et al., 1988), resultando em um efeito na
fertilização.
108
A estrutura do polissacarídeo sulfatado encontrado na matriz
gelatinosa dos óvulos de G. crenularis também é muito distinta daquelas
encontradas em outras espécies de ouriços-do-mar. Esse polissacarídeo é
formado por unidades dissacarídicas de β-D-galactose, sulfatadas na posição -
2 do primeiro resíduo. Esse é o primeiro relato de uma β-galactose sulfatada
em ouriços-do-mar. Esse tipo de polissacarídeo foi relatado apenas em algas
(Farias, 2000, Pereira, 2005). Em ouriços-do-mar encontramos polisscarídeos
com unidades do tipo α.
Cadeias de galactose na configuração α são mais rígidas enquanto
aquelas constituídas de β-galactose são mais flexíveis. A sulfatação não
parece interferir significativamente na conformação do polissacarídeo. Nossa
explicação para o não reconhecimento da galactana de G. crenularis pelos
espermatozóides de E. lucunter, é que essa galactana não consegue assumir
exatamente a conformação da galactana sulfatada homóloga, apesar de sua
versatilidade conformacional. Já a fucana sulfatada de S. franciscanus é capaz
de induzir a reação acrossômica em espermatozóides de E. lucunter.
Simultaneamente observamos que essa fucana possui um mapa
conformacional semelhante ao da galactana sulfatada de E. lucunter.
Em síntese, nossos resultados estendem o estudo sobre a relação entre
estrutura de polissacarídeos sulfatados e sua capacidade de induzir a reação
acrossômica em espermatozóides de ouriços-do-mar para um nível
conformacional da cadeia polissacarídica.
Conclusões Finais
109
1) As espécies de ouriços-do-mar desenvolveram diferentes
mecanismos para o reconhecimento entre os seus gametas e a manutenção
da espécie-especificidade na fertilização. Para a diferenciação entre S.
droebachiensis e S. pallidus a posição da ligação glicosídica do
polissacarídeo sulfatado 3- ou 4-ligado é o fator preponderante para o
reconhecimento do espermatozóide. Para S. purpuratus, a espécie-
especificidade se baseia preponderantemente na interação bindina e seu
receptor na superfície do óvulo. As espécies presentes no litoral do Rio de
Janeiro (A. lixula, E. lucunter e L. variegatus) têm um mecanismo de
reconhecimento espermatozóide-óvulo baseado na reação acrossômica. Para
essas espécies, todos os componentes da cadeia polissacarídica como o tipo
de açúcar constituinte, a posição da ligação glicosídica e o seu padrão de
sulfatação são importantes para a indução da reação acrossômica.
2) A matriz gelatinosa de L. variegatus possui duas fucanas
sulfatadas. Uma delas é secretada pelo óvulo durante todo o ano (Mulloy,
1994), Outra aparece apenas no período de baixa reprodução da espécie.
Essa segunda fucana sulfatada foi purificada e teve sua estrutura
caracterizada. É formada por unidades monossacarídicas repetitivas, unidas
por ligação glicosídica 1→3, sulfatadas na posição -4. Esse polissacarídeo foi
testado nos espermatozóides de L. variegatus e não foi capaz de induzir a
reação acrossômica, nem a captação de cálcio. Acreditamos que essa fucana
sulfatada não tem função no reconhecimento entre os gametas.
110
Provavelmente seu papel é prevenir a fertilização nos períodos desfavoráveis
ao desenvolvimento do embrião.
3) Finalmente, caracterizamos o polissacarídeo sulfatado presente
na matriz gelatinosa de uma espécie de ouriço-do-mar proveniente do Japão,
G. crenularis. Pela primeira vez não encontramos o glicoconjugado rico em
ácido siálico em uma espécie de ouriço-do-mar. E, ainda, encontramos uma
nova galactana sulfatada, composta por unidades dissacarídicas repetitivas de
β galactose, unidas por ligação glicosídica do tipo 1→3, alternando resíduos 2
sulfatados e não sulfatados. Análise conformacional mostrou que a β-
galactana sulfatada possui uma estrutura mais flexível do que α-galactana
sulfatada. Em seguida testamos a galactana de G. crenularis como indutora da
reação acrossômica em espermatozóides de E. lucunter. Essa espécie possui
como polissacarídeo homólogo uma α-galactana sulfatada. Curiosamente
observamos que a β-galactana presente em G. crenularis não induz a reação
acrossômica nos gametas de E. lucunter. Nossa explicação para essa
observação é que apesar da versatilidade conformacional da galactana
sulfatada de G. crenularis, esse polissacarídeo não consegue assumir a
conformação preponderante da α-galactana sulfatada. Esses estudos
estendem a análise da relação entre estrutura x função de polissacarídeos na
fertilização de ouriços-do-mar por um nível conformacional.
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124
Anexo 1: Carbohydrate-based species recognition in sea urchin
fertilization: another avenue for speciation? Evolution & Development,
6:5, 353–361 (2004).
125
126
127
128
129
130
131
132
133
134
Anexo 2:
Expression of two different sulfated fucans by females of Lytechinus
variegatus may regulate the seasonal variation in the fertilization of the sea
urchin. Glycobiology vol. 17 no. 8 pp. 877–885, 2007.
135
136
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138
139
140
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143
144
CURRICULUM VITAE
Nome: Michelle Oliveira de Castro
Nascimento: 28/12/1978
Naturalidade: Minas Gerais
Formação Acadêmica:
-Faculdade de Biologia- Modalidade Médica pela Universidade Federal do Estado do
Rio de Janeiro
- Doutorado em Química Biológica no Instituto de Bioquímica Médica – Universidade
Federal do Rio e Janeiro
Orientação de Estudante
Livia Loiola dos Santos - iniciação científica de março de 2004/ julho de 2006
Clarice dos Reis Garcia- iniciação científica de março de 2005/dezembro de 2007
Comunicações em Congresso
- 12 comunicações em congressos nacionais
- 2 comunicações em congressos internacionais
Publicações
CASTRO, M. O., Cinelli, L.P., Santos, L.L., GARCIA, C. R., Vilela-Silva, A.C.E.S.,
Mourão, P.A.S. Expression of two different sulfated fucans by females of Lytechinus
variegatus may regulate the seasonal variation in the fertilization of the sea urchin.
Glycobiology (Oxford). , V.17, p.877 - 885, 2007.
BIERMANN, C., Marks, J.A., Vilela-Silva, A.C.E.S., CASTRO, M. O., Mourão, P.A.S.
Carbohydrate-based species recognition in sea urchin fertilization: another avenue for
speciation? Evolution and Developmental. , V.6, p.353 -, 2004.
Vilela-Silva, A.C.E.S., CASTRO, M. O., Valente, A.P., BIERMANN, C., Mourão, P.A.S.
Sulfated Fucans from the Egg Jellies of the Closely Related Sea urchins
Strongylocentrotus droebachiensis and Strongylocentrotus pallidus ensure species-
specific fertilization. Journal of Biological Chemistry. V.277, p.379 - 387, 2002.
Comunicações e Resumos Publicados em Anais de Congressos ou Periódicos
(resumo)
Santos, L.L., CASTRO, M. O., GARCIA, C. R., Hirohashi, N., Vilela-Silva, A.C.E.S.,
Mourão, P.A.S. A deep-water sea urchin: Evolution X Fertilization In: First Pan
American Congress in Developmental Biology, 2007, Cancun. Developmental
Biology. Elsevier, 2007. v.306. p. A-134 - A-134
CASTRO, M. O., Santos, L.L., GARCIA, C. R., Vilela-Silva, A.C.E.S., Mourão, P.A.S.
Structural differences in sulfated polysaccharides: Significance for the fertilization
success In: First Pan American Congress in Developmental Biology, 2007, Cancun.
Developmental Biology. Elsevier, 2007. v.306. p.A-135 - A-135.
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