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Alexandra Cifuentes Muñoz
ESTUDO DO MODELO DE QUIMERAS DE
MEDULA ÓSSEA (WT/IFNγ
γγ
γR-KO) PARA
EXAMINAR O PAPEL DO IFN-γ
γγ
γ SOBRE AS
CÉLULAS NÃO LEUCOCITÁRIAS NA INFECÇÃO
PELO
Trypanosoma cruzi
São Paulo
2008
Dissertação apresentada ao Instituto de
Ciências Biomédicas da Universidade
de São Paulo, para obtenção do Título
de Mestre em Ciências (Imunologia).
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Alexandra
Cifuentes
Muñoz
ESTUDO DO MODELO DE QUIMERAS DE MEDULA
ÓSSEA (WT/IFNγ
γγ
γR-KO) PARA EXAMINAR O PAPEL
DO IFN-γ
γγ
γ SOBRE AS CÉLULAS NÃO LEUCOCITÁRIAS
NA INFECÇÃO PELO
Trypanosoma cruzi
São Paulo
2008
Dissertação apresentada
ao Instituto de
Ciências Biomédicas da Universidade de São
Paulo, para obtenção do Título de Mestre em
Ciências (Imunologia).
Área de concentração: Imunologia
Orientador: Prof. Dr. José Maria Álvarez Mósig
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Este trabalho foi realizado no laboratório de Imunologia das parasitoses do
Departamento de Imunologia, do Instituto de Ciências Biomédicas, da Universidade
de São Paulo, com o auxílio financeiro do CNPq (Conselho nacional de
desenvolvimento científico e tecnológico), Programa de Estudantes-Convênio de
Pós-Graduação - PEC-PG, processo número190464/2006-2.
A Deus pela fortaleza,
A Deus pela fortaleza,A Deus pela fortaleza,
A Deus pela fortaleza,
Aos meus pais pela vida, apoio e incentivo,
Aos meus pais pela vida, apoio e incentivo,Aos meus pais pela vida, apoio e incentivo,
Aos meus pais pela vida, apoio e incentivo,
À Lina e Sarah pela compreensão e espera,
À Lina e Sarah pela compreensão e espera,À Lina e Sarah pela compreensão e espera,
À Lina e Sarah pela compreensão e espera,
A F
A FA F
A Fá
áá
ábio pelo amor, amizade e a dedicação,
bio pelo amor, amizade e a dedicação,bio pelo amor, amizade e a dedicação,
bio pelo amor, amizade e a dedicação,
Obrigada por estarem sempre do meu lado!
Obrigada por estarem sempre do meu lado! Obrigada por estarem sempre do meu lado!
Obrigada por estarem sempre do meu lado!
Com carinho.
Com carinho.Com carinho.
Com carinho.
AGRADECIMENTO ESPECIAL
Meus sinceros agradecimentos
ao meu orientador
José Maria Álvarez Mósig “Pepe”,
pela disposição, compreensão e apoio.
AGRADECIMENTOS
A prof
a
. Maria Regina D`Imperio Lima, pela colaboração e apoio no desenvolvimento
do projeto.
Aos companheiros do laboratório: Christian, Fernando, Luiz Sardinha, Sergio, Luis
Natividad, Sheyla, Daniela, Sandra, Claudia e Ana Paula pelo apoio.
A Dra. Luciana de Deus Vieira de Moraes, a Dra. Maria Carolina Quartim B Elias
Sabbaga e o Dr.Niels Olsen Saraiva Câmara, pelas pertinentes críticas e sugestões
no Exame de Qualificação.
A todos os professores do Departamento de Imunologia, pela colaboração e ensinos
transmitidos.
A Silvia, Regina e Thais e todos os funcionários do biotério pelo fornecimento e
cuidado dos animais.
A Rogério Silva, especial agradecimento não somente pela preparação dos
materiais, mas também pela colaboração e disposição para as irradiações. Pela
força nos momentos difíceis. Obrigada pela constante ajuda.
A Meire, obrigada pela simpatia. Por manter o laboratório sempre em ordem. Pela
convivência alegre e divertida.
Ao Paulo Albe por toda ajuda no processamento dos órgãos e obtenção dos cortes
histológicos.
Ao meu querido amigo André pelo apoio, amizade, sinceridade e carinho. Por me
dar força nos momentos que mais necessitei.
A todos os que de alguma forma ajudaram-me na realização deste projeto.
RESUMO
Muñoz AC. Estudo do modelo de quimeras de medula óssea (WT/IFNγR-KO) para
examinar o papel do IFN-γ sobre as células não leucocitárias na infecção pelo
Trypanosoma cruzi [Dissertação (Mestrado em Imunologia)]. São Paulo (Brasil):
Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo; 2008.
Conhecemos o papel dos leucócitos no controle do Trypanosoma cruzi, mas
ignoramos qual a contribuição das populações estruturais (miócitos, hepatócitos,
etc). Estas populações poderiam sinalizar a presença do parasita e/ou ter ação
efetora que poderia aumentar em resposta a citocinas como o IFN-γ. Para verificar
se as células estruturais respondem ao IFNγ contribuindo à destruição do T. cruzi,
analisamos a infecção em quimeras WT/IFNγR-KO (WT/KO) geradas em
camundongos IFNγR-KO reconstituídos com medula óssea de camundongos
selvagens (WT), nas quais parte dos leucócitos é IFNγR
+
, mas as células não
leucocitárias são deficientes. Quimeras WT/KO e quimeras controle WT/WT foram
estudadas em relação à carga parasitária e inflamação. O parasitismo sistêmico e
tissular é maior nas quimeras WT/KO do que nas quimeras WT/WT, mas inferior à
dos controles IFNγR-KO. Nos animais WT/KO o aumento de ninhos no coração e
músculo não se acompanha de aumento no infiltrado leucocitário. Os resultados
sugerem que as células não leucocitárias contribuem à defesa frente ao T. cruzi.
Palavras-chave: IFN – gama; T. Cruzi; Células não leucocitárias; Quimeras de
medula óssea; Resposta imune; Quimeras WT/IFNγR-KO.
ABSTRACT
Muñoz AC. Analysis of the bone marrow chimera model (WT/IFNγR-KO) to examine
the role of IFN-γ upon non leukocytes in Trypanosoma cruzi infection [Dissertação
(Mestrado em Imunologia)]. São Paulo (Brasil): Instituto de Ciências Biomédicas da
Universidade de São Paulo; 2008.
Although we know the role played by leukocytes in Trypanosoma cruzi control, we
ignore the contribution of structural cells (myocytes, hepatocytes, etc). These cells
could signal the presence of the parasite and/or mediate an effector activity which
could increase in response to cytokines, as IFN-γ. To evaluate if non-leukocytes
respond to IFNγ, contributing to T. cruzi destruction, we analysed the infection in
WT/IFNγR-KO (WT/KO) chimaeras, generated in IFNγR-KO mice reconstituted with
bone marrow of wild-type mice (WT) so that most leukocytes are IFNγR
+
but
structural cells are deficient. WT/KO chimaeras and control WT/WT chimaeras were
infected by T. cruzi and the parasite load and inflammation analyzed in various
organs. Systemic and tissue parasite loads were higher in WT/KO chimeras than in
WT/WT chimeras, but lower than in control IFNγR-KO mice. In WT/KO chimaeras the
increased parasite load at the heart and skeletal muscle was not followed by an
increase of inflammatory infiltrates. Our results suggest that structural cells contribute
to T. cruzi control.
Key words: IFN – gamma; T. Cruzi; non-leukocyte cells; Bone-marrow chimeras;
Immune response; WT/IFNγR chimeras.
LISTA
DE
ILUSTRAÇÕES
Figura 1 - Análise da freqüência de células IFNγR
+
nas populações de
células CD3
+
e B220
+
nos camundongos da 1ª experiência......................................47
Figura 2 - Percentagem de reconstituição de células CD3
+
IFNγR
+
e
B220
+
IFNγR
+
da 1ª experiência.................................................................................48
Figura 3 - Análise comparativa da carga parasitária sistêmica (sangue) em
camundongos controle positivo (WT), controle negativo (IFNγR-KO),
quimera WT/WT e quimera WT/KO da 1ª experiência...............................................50
Figura 4 - Análise comparativa do número de ninhos presentes no
tecido cardíaco nos animais do grupo controle KO, grupo controle WT
e grupos quimera WT/WT e WT/KO da 1ª experiência..............................................53
Figura 5 - Análise comparativa do infiltrado cardíaco nos animais do
grupo controle KO, grupo controle WT e grupos quimera WT/WT e WT/KO
da 1ª experiência-.......................................................................................................54
Figura 6 - Análise comparativa do número de ninhos presentes no fígado
dos animais do grupo controle KO, grupo controle WT e grupos
quimera WT/WT e WT/KO da 1ª experiência.............................................................56
Figura 7 - Análise comparativa da intensidade de hepatite nos animais
do grupo controle KO, grupo controle WT e grupos quimera WT/WT e
WT/KO da 1ª experiência...........................................................................................57
Figura 8 - Análise comparativa do número de ninhos presentes no
músculo estriado esquelético nos animais do grupo controle KO, grupo
controle WT e grupos quimera WT/WT e WT/KO da 1ª experiência.........................58
Figura 9 - Análise comparativa do infiltrado inflamatório no músculo
estriado esquelético nos animais do grupo controle KO, grupo controle
WT e grupos quimera WT/WT e WT/KO da 1ª experiência.......................................59
Figura 10 - Análise da freqüência de células IFNγR
+
nas populações de
células CD3
+
e B220
+
nos camundongos da 2ª experiência......................................61
Figura 11 - Segunda avaliação da freqüência de células IFNγR
+
nas
populações de células CD3
+
e B220
+
nos camundongos da 2ª experiência..............62
Figura 12 - Percentagem de reconstituição de células CD3
+
IFNγR
+
e
B220
+
IFNγR
+
da 2ª experiência.................................................................................63
Figura 13 - Análise comparativa da carga parasitaria sistêmica (sangue)
nos grupos controle negativo (IFN
γR-KO), controle positivo (WT),
quimera WT/WT e quimera WT/KO 2ª experiência....................................................64
Figura 14 - Análise comparativa do número de ninhos presentes no
tecido cardíaco dos animais do grupo controle KO, grupo controle WT e
grupos quimera WT/WT e WT/KO da 2ª experiência.................................................67
Figura 15 - Análise comparativa do infiltrado cardíaco nos animais do
grupo controle negativo KO, grupo controle positivo WT e grupos
quimera WT/WT e WT/KO da 2ª experiência.............................................................67
Figura 16 - Análise comparativa do número de ninhos presentes no fígado
nos animais do grupo controle negativo KO, grupo controle positivo KO,
grupo quimera WT/WT e WT/KO da 2ª experiência...................................................68
Figura 17 - Análise comparativa da intensidade de hepatite nos animais do grupo
controle negativo KO, grupo controle positivo WT e grupos quimera WT/WT e
WT/KO da 2ª experiência...........................................................................................69
Figura 18 - Análise comparativa do número de ninhos presentes no
músculo estriado esquelético nos animais do grupo controle negativo
KO, grupo controle positivo WT e grupos quimera WT/WT e WT/KO
da 2ª experiência.... ...................................................................................................69
Figura 19 - Análise comparativa do infiltrado inflamatório no músculo
estriado esquelético nos animais do grupo controle negativo KO, grupo
controle WT, grupo quimera WT/WT e grupo quimera WT/KO
2ª experiência.............................................................................................................70
Figura 20 - Análise da freqüência de células IFNγR
+
nas populações de
células CD3
+
e B220
+
nos camundongos da 3ª experiência......................................72
Figura 21 - Percentagem de reconstituição de células CD3
+
IFNγR
+
e
B220
+
IFNγR
+
da 3ª experiência.................................................................................74
Figura 22 - Análise comparativa da carga parasitaria em camundongos
dos grupos controle negativo (IFNγR-KO), controle positivo (C57BL/6),
quimera WT/WT e quimera WT/KO da 3ª experiência...............................................75
Figura 23 - Correlação entre o nível de reconstituição e número de
parasitas circulantes no sangue de animais WT/KO da 3ª experiência.....................76
Figura 24 - Analise comparativa do número de ninhos e infiltrados
inflamatórios presentes no coração dos animais da 3ª experiência...........................80
Figura 25 - Análise comparativa entre número de ninhos e número de
infiltrados inflamatórios no coração dos animais da 3ª experiência...........................82
Figura 26 - Análise comparativa do número de ninhos e infiltrados
inflamatórios presentes no fígado dos animais da 3ª experiência. ...........................83
Figura 27 - Análise comparativa do número de ninhos e infiltrado
inflamatórios presentes no músculo estriado esquelético nos animais
da 3ª experiência........................................................................................................84
Figura 28 - Análise da freqüência de células IFNγR
+
nas populações de
células CD3
+
e B220
+
nos camundongos da 4ª experiência......................................86
Figura 29 - Percentagem de reconstituição de células CD3
+
IFNγR
+
e
B220
+
IFNγR
+
da 4ª experiência. ...............................................................................87
Figura 30 - Análise comparativa da carga parasitaria em camundongos
dos grupos controle negativo (IFNγR-KO), controle positivo (C57BL/6),
quimera WT/WT e quimera WT/KO da 4ª experiência. .............................................89
Figura 31 - Correlação entre o nível de reconstituição e número de
parasitas circulantes no sangue dos animais WT/KO da 4ª experiência...................91
Figura 32 - Analise comparativa do número de ninhos e infiltrados
inflamatórios presentes no coração dos animais da 4ª experiência. .........................92
Figura 33 - Correlação entre parasitemias e número de ninhos presentes
no coração dos animais da 4ª experiência. ...............................................................93
Figura 34 - Análise comparativa entre número de ninhos e número de
infiltrados inflamatórios no coração dos animais da 4ª experiência...........................94
Figura 35 - Análise comparativa do número de ninhos e infiltrados
inflamatórios presentes no fígado dos animais da 4ª experiência. ...........................95
Figura 36 - Análise comparativa do número de ninhos e infiltrados
inflamatórios presentes no músculo estriado esquelético nos animais
da 4ª experiência. ......................................................................................................96
Figura 37 – Patologia cardíaca (aurícula). ................................................................99
Figura 38 – Patologia cardíaca (aurícula)................................................................100
Figura 39 – Patologia cardíaca.................................................................................101
Figura 40 – Patologia hepática.................................................................................102
Figura 41 – Patología da musculatura esquelética estriada....................................103
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Resultados da 1ª experiência. Quimeras em fundo C57BL/6. Infecção
com T. cruzi da cepa Sylvio X10/4.............................................................................52
Tabela 2 - Resultados da 2ª experiência. Quimeras em fundo C57BL/6. Infecção
com T. cruzi da cepa Y...............................................................................................66
Tabela 3 - Resultados da 3ª experiência. Quimeras em fundo C57BL/6. Infecção
com T. cruzi da cepa Y..............................................................................................78
Tabela 4 - Resultados da 4ª experiência. Quimeras em fundo C57BL/6. Infecção
com T. cruzi da cepa Sylvio X10/4............................................................................98
Tabela 5 - Estatística dos resultados de WT/KO (em relação à WT/WT) ...............104
Tabela 6 - Estatística dos resultados de WT/KO (em relação à KO).......................105
SUMÁRIO
1 I
NTRODUÇÃO
............................................................................................................21
1.1 Aspectos gerais e ciclo de vida do Trypanosoma cruzi................................22
1.2 Mecanismos imunopatológicos da Doença de Chagas.................................24
1.3 Mecanismos efectores da resposta imune no coração infectado
pelo T. cruzi...............................................................................................................25
1.4 O papel sinalizador e efetor das células não leucocitárias no
coração infectado pelo T. cruzi...............................................................................26
1.5 O papel fundamental do IFN-γ
γγ
γ na infecção pelo T. cruzi: efeitos
sistêmicos e locais...................................................................................................28
1.6 Particularidades da infecção pelo T. cruzi das cepas Sylvio X10/4 e Y........29
2 O
BJETIVOS
.............................................................................................................31
2.1 Objetivo principal...............................................................................................32
2.2 Objetivos específicos .......................................................................................32
3 A
BORDAGEM EXPERIMENTAL
..................................................................................34
4 D
ETALHAMENTO EXPERIMENTAL
..............................................................................36
4.1 Obtenção das quimeras e relação de quimeras pretendidas........................37
4.2 Avaliação do estado quimérico........................................................................38
4.3 Estudos pretendidos nas quimeras.................................................................38
5 M
ATERIAL E
M
ÉTODOS
...........................................................................................39
5.1 Animais...............................................................................................................40
5.2 Preparação das quimeras.................................................................................40
5.2.1 Coleta de células da medula óssea.............................................................40
5.2.2 Irradiação.......................................................................................................41
5.2.3 Reconstituição..............................................................................................41
5.2.3.1 Avaliação do grau de reconstituição.........................................................41
5.3 Infecção com T. cruzi.........................................................................................42
5.4 Avaliação de parasitemias, carga parasitária local e análise
histopatológica........................................................................................................ 43
5.5 Analise estatística..............................................................................................44
6 R
ESULTADOS
.........................................................................................................45
6.1 1ª EXPERIÊNCIA: Avaliação do estado quimérico........................................46
6.2 1ª EXPERIÊNCIA: Avaliação da infecção pelo T. cruzi..................................49
6.3 2ª EXPERIÊNCIA: Avaliação do estado quimérico.......................................60
6.4 2ª EXPERIÊNCIA: Avaliação da infecção pelo T. cruzi..................................63
6.5 3ª EXPERIÊNCIA: Avaliação do estado quimérico........................................71
6.6 3ª EXPERIÊNCIA: Avaliação da infecção pelo T. cruzi..................................74
6.7 4ª EXPERIÊNCIA: Avaliação do estado quimérico........................................85
6.8 4ª EXPERIÊNCIA: Avaliação da infecção pelo T.cruzi...................................88
7 D
ISCUSSÃO
..........................................................................................................106
8 C
ONCLUSÕES
.......................................................................................................112
R
EFERÊNCIAS
B
IBLIOGRÁFICAS
...................................................................................115
ANEXO A - 3ª EXPERIÊNCIA: Avaliação do estado quimérico (excluídos
os animais que apresentaram baixa percentagem de reconstituição).............122
Figura A.1 - Freqüência de células IFNγ
γγ
γR
+
nas populações de
células CD3
+
e B220
+
nos camundongos da 3ª experiência,
excluídos os animais que apresentaram baixa percentagem
de reconstituição....................................................................................................122
Figura A.2 – Percentagem de reconstituição de células CD3
+
IFNγ
γγ
γR
+
e B220
+
IFNγ
γγ
γR
+
da 3ª experiência, excluindo os animais que
apresentaram baixa percentagem de reconstituição respeito às
duas populações....................................................................................................123
ANEXO B - 3ª EXPERIÊNCIA: Avaliação da infecção pelo T. cruzi (excluídos os
animais com baixa percentagem de reconstituição)..........................................124
Figura B.1 – Análise comparativa da carga parasitaria em
camundongos dos grupos controle negativo (IFNγR-KO), controle
positivo (C57BL/6), quimera WT/WT e quimera WT/KO da 3ª
experiência, excluindo os animais que apresentaram baixa
percentagem de reconstituição............................................................................124
Figura B.2 – Correlação entre o nível de reconstituição e número de
parasitas circulantes no sangue de animais WT/KO da 3ª
experiência, excluindo os animais que apresentaram baixa
percentagem de reconstituição............................................................................125
Figura B.3 – Analise comparativa do número de ninhos e
infiltrados inflamatórios presentes no coração dos animais da 3ª
experiência, excluindo os animais que apresentaram baixa
percentagem de reconstituição............................................................................126
Figura B.4 – Análise comparativa entre número de ninhos e número
de infiltrados inflamatórios no coração dos animais da 3ª experiência,
excluindo os animais que apresentaram baixa percentagem de
reconstituição.........................................................................................................127
Figura B.5 – Análise comparativa do número de ninhos e
infiltrados inflamatórios presentes no fígado dos animais da
3ª experiência, excluindo os animais que apresentaram
baixa percentagem de reconstituição..................................................................128
Figura B.6 – Análise comparativa do número de ninhos e
infiltrados inflamatórios presentes no músculo estriado esquelético
nos animais da 3ª experiência, excluindo os animais que
apresentaram baixa percentagem de reconstituição..........................................129
ANEXO C - Tabela de comparação das diferenças estatísticas
observadas na 1ª e 2ª análise da 3ª experiência. Quimeras em
fundo C57BL/6. Infecção com T. cruzi da cepa Sylvio X10/4.............................130
__________________________________________________________Cifuentes Muñoz, A.
21
1 I
NTRODUÇÃO
__________________________________________________________Cifuentes Muñoz, A.
22
1.1 Aspectos gerais e ciclo de vida do Trypanosoma cruzi
Descrita por Carlos Chagas há quase um século (CHAGAS, 1909), a Doença
de Chagas constitui ainda um grande problema de saúde pública em –América
Latina, estando presente em 18 paises do continente americano. Calcula-se que 9
milhões de pessoas estejam infectadas e que aproximadamente 40 milhões corram
o risco de contrair a doença nas áreas endêmicas. (WORLD HEALTH
ORGANIZATION (WHO), 2005).
O agente etiológico da doença de Chagas é o Trypanosoma (Schizotrypanum)
cruzi, um protozoário heteroxênico, que apresenta no hospedeiro invertebrado, o
triatomíneo, as formas epimastigota e tripomastigota metacíclica, e no hospedeiro
vertebrado, as formas amastigota e tripomastigota sanguícola. O hospedeiro
invertebrado, o "barbeiro", é um inseto hematófago de habito noturno, da sub-família
Triatominae, que se alimenta exclusivamente de vertebrados homeotérmicos. A
transmissão do parasita ao homem se dá frequentemente pela picada do barbeiro,
mas outras formas de transmissão, tais como a placentária, a por transfusão de
sangue e hemoderivados, a digestiva e a acidental ou de laboratório, são também
possíveis. O "barbeiro", ao picar uma pessoa ou animal infectado, suga, juntamente
com o sangue, as formas de T. cruzi. Os tripanossomas chegam ao intestino do
"barbeiro" onde se multiplicam, sendo eliminados através das fezes ou urina. Após
novo repasto sanguíneo de um barbeiro infectado, os tripomastigotas metacíclicos
das fezes ou urina são depositados sobre a pele da pessoa. Geralmente, a picada
provoca coceira, lesionando a pele e facilitando a penetração do parasita pelo local
da picada. O T. cruzi contido nas fezes do "barbeiro" pode também penetrar pela
mucosa dos olhos, nariz e boca, ou através de feridas ou cortes recentes existentes
na pele (DIAS, 1986). Uma vez no hospedeiro vertebrado, os tripomastigotas
metacíclicos invadem diversos tipos de células, se transformando na forma
replicativa intracelular chamada amastigota, que através de divisão binária gera um
ninho ou pseudocisto. Completado o ciclo de replicação, a ruptura do ninho libera os
tripomastigotas sanguícolas que através do meio extracelular e sangue propiciam a
disseminação do parasita.
__________________________________________________________Cifuentes Muñoz, A.
23
A doença de Chagas pode ser classificada em aguda e crônica. A fase aguda
caracteriza-se por se apresentar com febre, mal estar, falta de apetite, edemas
localizados na pálpebra (sinal de Romanha) ou em outras partes do corpo (chagoma
de inoculação), infartamento de gânglios, linfadenopatia generalizada e hepato-
esplenomegalia leve ou moderada (DIAS et al., 1956). Outra manifestação clínica
observada na fase aguda pode ser a miocardite difusa, que pode estar
acompanhada ou não de pericardite serosa e/ou endocardite. Nesta fase os
parasitos se multiplicam de forma exponencial e podem ser detectados na corrente
sanguínea e sob a forma de ninhos em tecidos, principalmente no tecido muscular.
Em crianças, o quadro pode se agravar e levar à morte. Frequentemente, entretanto,
não há qualquer manifestação clínica da doença nesta fase, podendo passar
despercebida.
Após a fase aguda, o número de parasitas na corrente sanguínea cai
dramaticamente pela acentuada resposta imunológica no indivíduo, dando inicio às
fases indeterminada e crônica da infecção.
A fase indeterminada, que se apresenta no período de transição entre a fase
aguda a crônica, ou que pode perdurar pela vida do hospedeiro, caracteriza-se por
ausência de parasitemia patente e de sinais clínicos, eletrocardiográficos e
radiológicos. O coração, esôfago e cólon mostram aspecto normal, sendo a
parasitemia somente detectada por hemocultura, xenodiagnóstico ou PCR. Estudos
epidemiológicos em áreas endêmicas revelaram que 50-60% dos pacientes
cronicamente infectados permanecem nesta forma. Cerca de 10% dos pacientes
desenvolvem a forma sintomática digestiva que envolve aperistalse e dilatação do
esôfago e/ou intestino, dando origem a megaesôfago e/ou megacólon. Finalmente,
20- 30% dos pacientes, após períodos de até 10 anos, evoluem para a forma crônica
cardíaca. Durante a fase crônica os pacientes podem passar um longo período, ou
mesmo toda a sua vida, sem apresentar nenhuma manifestação da doença, embora
sejam portadores do T. cruzi. Em outros casos, a doença prossegue ativamente,
passada a fase inicial, podendo comprometer diversos setores do organismo,
salientando-se o coração e o aparelho digestivo (DIAS et al., 1956).
__________________________________________________________Cifuentes Muñoz, A.
24
A lesão no coração é caracterizada por infiltrados de células mononucleares,
destruição de fibras musculares e fibrose intersticial. A intensidade do infiltrado
inflamatório, não é proporcional à freqüência ou ao tamanho dos ninhos do parasita,
extremamente escasso no tecido cardíaco na fase crônica. Lesões significativas
podem levar à insuficiência cardíaca congestiva. Mais ainda, as alterações da
função cardíaca, anormalidades de condução e episódios de arritmias, predispõem
os pacientes chagásicos à morte súbita (DIAS et al., 1956). Uma vez que a morbidez
da infecção pelo T. cruzi decorre fundamentalmente da disfunção cardíaca o estudo
da fisiopatologia deste órgão, assim como o estudo dos mecanismos efetores do
sistema imune no próprio tecido cardíaco, merecem destaque especial.
1.2 Mecanismos imunopatológicos da Doença de Chagas
O T. cruzi, protozoário responsável pela Doença de Chagas humana, tem
potencial de infectar uma ampla gama de células, apesar de mostrar freqüentemente
uma preferência por células musculares (cepas miotrópicas) ou por células da
estirpe macrofágica (cepas reticulotrópicas) (BICE e ZELEDON, 1970; BRENER,
1973).
O coração é um dos órgãos que podem ser colonizados pelo T. cruzi, sendo
que o parasita pode invadir cardiomiócitos, fibroblastos, adipócitos, células
endoteliais e macrófagos tissulares, ou seja, todas as populações celulares
estruturais e residentes do tecido cardíaco. Na fase aguda da infecção pelo T. cruzi,
a miocardite é uma das alterações patológicas mais freqüentemente encontradas,
tanto em humanos como em camundongos. (FUENMAYOR et al., 2005; ELIZARI,
1999; ANDRADE, 1983; ANDRADE et al., 1994; RIBEIRO, 2002).
Por outro lado, como citamos acima, em 20-30% das pessoas infectadas, assim
como em alguns dos modelos experimentais murinos, há desenvolvimento de um
quadro crônico de miocardite. Este quadro crônico foi considerado por muito tempo
como de natureza auto-imune (CUNHA-NETO et al., 1996; VAN VOORHIS; EISEN,
__________________________________________________________Cifuentes Muñoz, A.
25
1989; MINOPRIO, 2001), mas estudos recentes sugerem que seja principalmente o
resultado da atividade efetora continuada frente aos T. cruzi que persistem no local
(TARLETON, 2001; PALOMINO et al., 2000; VAGO et al., 1996; ANEZ et al., 1999;
MARINHO et al., 2004).
A persistência do parasita no coração do hospedeiro crônico pode ser
conseqüência da entrada contínua de parasitas a partir do sangue e/ou, mais
provavelmente, da ineficiência da resposta imune local que não conseguindo a
destruição completa dos parasitas, permite que parte dos tripomastigotas liberados
na ruptura de um ninho venha a colonizar secundariamente as células vizinhas.
Mas qual a atividade efetora frente ao T. cruzi no coração do hospedeiro aguda
ou cronicamente infectado?
1.3 Mecanismos efetores da resposta imune no coração infectado
pelo T. cruzi
A atividade efetora frente aos T. cruzi presentes no coração é mediada pelos
elementos do sistema imune recrutados, o que abrange populações celulares das
séries linfocitária e monocitária e fatores solúveis, como anticorpos, complemento e
outros elementos humorais. O nosso conhecimento da atividade efetora no coração
infectado é em grande parte uma extrapolação, a partir de estudos in vitro e
sistêmicos, sobre os achados de celularidade diferencial e citocinas produzidas no
coração infectado. Assim, o controle local das formas extracelulares, liberadas como
conseqüência da ruptura espontânea de um ninho, acredita-se que ocorra pela ação
dos anticorpos específicos IgG (RODRIGUEZ et al., 1981) com atividade
opsonizante (que possibilitam a fagocitose por macrófagos) e/ou ativadora de
complemento (que possibilitam a opsonização e permitem à liberação de
anafilotoxinas, moléculas indutoras de inflamação e recrutamento de leucócitos). Por
outro lado, a destruição das células parasitadas e a potencialização da destruição do
T. cruzi no interior dos macrófagos residentes ou recrutados, são funções
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26
respectivamente atribuídas aos linfócitos T CD8
+
e aos linfócitos T CD4
+
com perfil
funcional TH1 (ROTTENBERG et al.,1993; TARLETON et al., 1992; RUSSO et
al.,1996).
Finalmente, o recrutamento de macrófagos e linfócitos ao coração infectado,
resultado da secreção de quimiocinas por diversas populações celulares
(MACHADO et al., 2005; HARDISON et al., 2006), é considerado elemento
fundamental na atividade efetora celular. Neste contexto, a ativação de macrófagos
pelo IFNγ produzido por linfócitos T CD4
+
, T CD8
+
e Tγδ
+
, assim como também
pelas células “natural killer” (NK) (SARDINHA et al., 2006; CARDILLO et al.,1996)
resulta em aumento da atividade tripanocida, um efeito mediado, ao menos em
parte, através da produção de óxido nítrico (GAZZINELLI et al., 1996). No entanto,
apesar destes elementos do sistema imune ser considerados efetivos na destruição
sistêmica do T. cruzi desconhecemos a singularidade de sua ação no tecido
cardíaco, assim como a sua variabilidade nos diferentes indivíduos e sua efetividade
sobre parasitas de diferentes cepas. De qualquer forma, como citado acima, em uma
fração dos indivíduos infectados este conjunto de mecanismos efetores parece
insuficiente para determinar a destruição completa dos parasitas que persistem no
tecido cardíaco (TARLETON, 2001; PALOMINO et al., 2000; VAGO et al., 1996;
ANEZ et al., 1999; MARINHO et al., 2004). Caso exista uma contribuição de um
componente autoimune à patologia cardíaca, anticorpos e clones de linfócitos T
específicos para antígenos próprios devem se somar aos elementos reativos frente
ao parasita na sua ação lesiva direta ou promotora de recrutamento de células
fagocíticas.
1.4 O papel sinalizador e efetor das células não leucocitárias no
coração infectado pelo T. cruzi
O quadro das populações efetoras descrito acima é completo? Há participação
das populações não leucocitárias residentes no coração? Comumente, o papel das
__________________________________________________________Cifuentes Muñoz, A.
27
populações estruturais (cardiomiócitos, fibroblastos, adipócitos, células endoteliais) é
ignorado, sendo exclusivamente consideradas alvos da infecção pelo parasita e/ou
de destruição pelos mecanismos efetores da resposta imune. No entanto, nos
últimos anos, estudos in vitro, assim como estudos de hibridização in situ com
sondas para mRNA, tem mostrado que células não leucocitárias produzem
mediadores imunológicos, sugerindo que poderiam participar ativamente como
elementos sinalizadores da presença de patógenos (CHANDRASEKAR, et al.,
1998a.; CHANDRASEKAR, et al.,1998b.; FICHERA, et al., 2004; HUANG, et al.,
2000; MACHADO et al.,2000). Assim, a sinalização da presença do T. cruzi no
coração infectado poderia acontecer, não somente através dos macrófagos
(histiócitos) e células dendríticas residentes (HARDISON et al., 2006), mas também
pela ação das células estruturais acima citadas. A priori, mediadores solúveis como
quimiocinas, citocinas, derivados do ácido araquidônico, bradicinina, endotelina, etc,
poderiam estar envolvidos na sinalização da presença do T. cruzi por células
estruturais. Experimentos in vitro (MACHADO et al., 2000; FICHERA et al., 2004;
CHANDRASEKAR et al., 1998a; HUANG et al., 2000) e in vivo (CHANDRASEKAR
et al., 1998b) têm mostrado que cardiomiócitos produzem citocinas e quimiocinas,
assim como alteram a sua expressão de proteínas de membrana quando infectados
pelo parasita. Em forma similar, fibroblastos infectados pelo T. cruzi produzem
IFNα/β (VAENA DE AVALOS et al., 2002), sendo que nestas células o parasita ativa
vias de sinalização celular diferentes às utilizadas pelos miócitos (HALL et al., 2000).
Por outro lado, após o recrutamento de leucócitos, as células estruturais infectadas
tornam-se alvo da ação de células citotóxicas CD8
+
, ao sinalizarem a presença
intracelular do parasita através da expressão de peptídeos do parasita nas
moléculas do MHC de classe I.
Aprofundando-nos na hipótese da participação na resposta imunológica das
células não leucocitárias, cabe ainda a possibilidade das populações estruturais do
coração desempenhar, não somente uma função sinalizadora, mas também uma
ação efetora frente ao T. cruzi. Será que no coração infectado não há participação
direta das células estruturais como elementos que limitam a replicação do parasita?
Sabemos que a enzima iNOS pode ser detectada in vivo nas fibras musculares do
animal infectado, mas será que outros mediadores com atividade anti-parasita não
poderiam ser também produzidos? Machado e col. mostraram através de
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28
experimentos in vitro que o IFNγ potencializa a produção de óxido nítrico por
cardiomiócitos embrionários murinos infectados pelo T. cruzi, resultando
secundariamente em uma maior destruição do parasita (MACHADO et al., 2000).
Assim, um papel efetor das células não leucocitárias poderia acontecer como
conseqüência da própria infecção pelo parasita, ou, indiretamente, em resposta às
citocinas (como o IFNγ) produzidas por linfócitos CD4
+
, CD8
+
e outras populações
celulares. Nos macrófagos, o IFNγ, além de um potente indutor de óxido nítrico e
peróxido de hidrogênio, possui ação sinalizadora / recrutadora de células, ao induzir
a produção secundária das quimiocinas CXCL9/Mig, CXCL10/IP-10, CXCL11/ITAC
(ZHAO et al., 2002).
Neste contexto existe a possibilidade das populações estruturais do coração,
responderem a IFNγ produzido por outras células, não somente através da produção
de óxido nítrico (atividade efetora), mas também através da produção de
quimiocinas que aumentariam o recrutamento celular (atividade efetora/
sinalizadora) (SANA et al., 2005).
1.5 O papel fundamental do IFN-γ
γγ
γ na infecção pelo T. cruzi: efeitos
sistêmicos e locais
O IFNγ é provavelmente a citocina mais importante no controle do T. cruzi.
Prova da sua notável importância é o efeito devastador da sua ausência ou do seu
bloqueio em modelos murinos de infecção (CARDILLO et al., 1996; SARDINHA et
al., 2006; MARINHO et al., 2007). Curiosamente, utilizando parasitas da cepa
Colombiana foi mostrado que camundongos deficientes em IFNγ são até mais
susceptíveis á infecção pelo T. cruzi do que animais deficientes em MyD88,
molécula adaptadora fundamental na progressão do sinal gerado após o
reconhecimento do parasita por diversos receptores TLR (CAMPOS et al., 2004).
O papel protetor do IFNγ na infecção pelo T. cruzi decorre de um amplo leque
de ações que inclui: a) ativação de macrófagos, que como citamos acima, advém da
indução de óxido nítrico e peróxido de hidrogênio, duas moléculas com potente ação
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29
tripanocida (GAZZINELLI et al., 1992; MUNOZ-FERNANDEZ et al., 1992); b)
indução de moléculas de classe II, moléculas coestimuladoras e TLRs por células
dendríticas e macrófagos o que possibilita uma eficiente apresentação antigênica
dos antígenos do parasita (SCHRODER et al., 2007); c) adoção do perfil funcional
TH1; d) na resposta humoral, o IFNγ promove a mudança de classe para aquelas
subclasses de IgG dotadas de maior atividade opsonizadora e ativadora do
complemento (BOSSIE e VITETTA, 1991); a respeito disso, nosso grupo têm
recentemente mostrado que camundongos IFNγ-KO infectados por T. cruzi da cepa
Sylvio X10/4 desenvolvem uma resposta IgG dominada por IgG1 e com ausência de
IgG2a (MARINHO et al., 2007); e) este ultimo efeito do IFNγ vê-se complementado
pela indução de FcγRI por macrófagos (GUYRE, 1983), receptor que possibilita a
remoção dos tripomastigotas recobertos de IgG2a (UMEKITA e MOTA, 2000); e f)
indução secundária das quimiocinas Mig, IP-10 e ITAC por diversos tipos celulares.
Além destes efeitos e como citado acima, existem dados na literatura que
sugerem que na infecção pelo T. cruzi o IFNγ promove a atividade efetora das
células não leucocitárias. Assim, o IFNγ estimula a produção de óxido nítrico por
cardiomiócitos embrionários murinos infectados e, secundariamente, promove uma
redução marcada do número de T. cruzi (MACHADO et al., 2000). Resta saber se
esta atividade efetora também acontece in vivo, no coração e outros órgãos, como
fígado e músculo esquelético, do indivíduo infectado pelo T. cruzi.
1.6 Particularidades da infecção pelo T. cruzi das cepas
SylvioX10/4 e Y
O T. cruzi apresenta uma grande diversidade de cepas que diferem no seu
tropismo celular preferencial e na sua resistência a alguns dos mecanismos da
resposta imune (ALCÂNTARA e BRENER, 1978). Por quase uma década o nosso
grupo de pesquisa tem trabalhado com os parasitas das cepas Y e Sylvio X10/4. A
cepa Y (SILVA e NUSSENZWIEG, 1953) pertence ao grupo genético II de T. cruzi,
frequentemente envolvido na infecção peri-domiciliar, e constitui uma das cepas
mais utilizadas nos modelos experimentais de infecção em camundongos e ratos. O
__________________________________________________________Cifuentes Muñoz, A.
30
T. cruzi Y induz altos níveis de parasitemia e mortalidade na maioria das linhagens
de camundongo (SARDINHA et al., 2006). No entanto, os camundongos da
linhagem C57BL/6 são relativamente resistentes (COSTA et al., 2006; SEBASTIAN,
2003) e conseguem sobreviver a inóculos de até 1000 tripomastigotas sanguícolas.
Nesta dose, a infecção resulta em parasitemia moderada que atinge seu pico nos
dias 11-12 e declina posteriormente até não ser mais patente no exame direto. No
entanto, como na doença humana, o parasita persiste em níveis sub-patentes por
toda a vida do hospedeiro. Na fase aguda da infecção pelo T. cruzi Y observam-se
escassos ninhos no coração e músculo esquelético do camundongo C57BL/6, que,
no entanto, desenvolve uma miocardite moderada/intensa que tem seu pico por volta
do dia 15-16 de infecção (SARDINHA et al., 2006; e dados não publicados). No
entanto, na fase crônica da infecção por parasitas da cepa Y e independentemente
da linhagem de camundongo, os níveis de miocardite e miosite são muito baixos, se
não inexistentes.
Por outro lado, o parasita Sylvio X0/4 constitui um clone de T. cruzi que é
normalmente mantido in vitro em cultura de células. Este parasita pertence ao grupo
genético I, freqüentemente envolvido no ciclo selvático de infecção, e foi isolado de
um triatomídeo utilizado no xenodiagnóstico em um paciente do Pará (Brasil)
(SILVEIRA et al., 1979). No nosso laboratório observamos que este parasita não
induz parasitemias patentes em camundongos imunocompetentes, mas induz níveis
elevados de parasitemia no camundongo IFNγ-KO (MARINHO et al., 2007). No
camundongo C57BL/6, a infecção por 10
5
T. cruzi Sylvio X10/4 induz níveis discretos
de miocardite e miosite, com escassos ninhos, por volta do dia 18 pós-infecção
(dados não publicados), enquanto que no camundongo IFNγ-KO resulta em
patologia intensa e precoce no coração e músculo esquelético com destaque para
um alto número de ninhos de amastigotas (MARINHO et al., 2007). De interesse,
apesar de se tratar de um parasita aparentemente pouco virulento para o animal
imunocompetente, temos mostrado que na linhagem de camundongos C3H/HePAS
o T. cruzi Sylvio X10/4 induz uma miocardite crônica intensa que apresenta
características similares à miocardite crônica da doença de Chagas humana
(MARINHO et al., 2004).
__________________________________________________________Cifuentes Muñoz, A.
31
2 O
BJETIVOS
__________________________________________________________Cifuentes Muñoz, A.
32
2.1 Objetivo principal
O presente projeto tem como objetivo avaliar se o modelo experimental de
quimeras de medula óssea é adequado para analisar o papel do IFN-gama (IFNγ)
sobre as populações estruturais (não leucocitárias) do coração, músculo esquelético
e fígado, na infecção pelo T. cruzi.
2.2 Objetivos específicos
Analisar a susceptibilidade à infecção por parasitas de duas cepas distintas de
T. cruzi em animais deficientes especificamente de IFNγ-R nas células não-
leucocitárias (WT/KO), assim como nos diferentes controles, animais IFNγR-KO
(KO), animais WT e quimeras WT/WT. A susceptibilidade será avaliada pelo:
A- grau de parasitemia;
B- número de ninhos no coração, fígado e músculo esquelético;
C- grau de infiltração leucocitária nestes órgãos.
Uma vez que o coração é o órgão mais freqüentemente afetado na doença de
Chagas crônica humana, uma ênfase especial deverá ser dada ao estudo da carga
parasitária (número de ninhos) e infiltração leucocitária neste órgão.
Por tanto focamos os conseqüentes aspectos:
1. Examinar, a nível sistêmico, se os animais WT/KO são mais resistentes
ao T. cruzi do que os animais IFNγR-KO (KO);
2. Examinar, a nível sistêmico, se os animais WT/KO manifestam maior
susceptibilidade à infecção pelo T. cruzi do que os animais WT/WT;
3. Averiguar, nos três órgãos de estudo, se as células não leucocitárias
contribuem ao controle local do parasita pela sua resposta ao IFNγ;
__________________________________________________________Cifuentes Muñoz, A.
33
4. Verificar se as células não leucocitárias dos órgãos em estudo respondem
ao IFNγ potenciando o recrutamento celular;
5. Analisar se nos animais WT/KO existe correlação entre o nível de
reconstituição por leucócitos IFNγR
+
e a intensidade do parasitismo
sistêmico e/ou tissular.
__________________________________________________________Cifuentes Muñoz, A.
34
3 A
BORDAGEM
E
XPERIMENTAL
__________________________________________________________Cifuentes Muñoz, A.
35
A abordagem experimental do projeto é o estudo da infecção pelo T. cruzi em
camundongos quiméricos (quimeras de medula óssea), que contenham leucócitos
funcionalmente normais e células estruturais (qualquer célula não leucocitária)
deficientes no receptor para IFNγ.
A nossa hipótese de trabalho é que caso exista alguma atividade efetora frente
ao T. cruzi mediada pelo IFNγ sobre as células não leucocitárias, o animal quimérico
WT/KO infectado deve ter um número maior de ninhos no coração, músculo
esquelético e fígado que o animal quimérico controle WT/WT. Além disso, na
eventualidade do IFNγ induzir nas células não leucocitárias a produção secundária
de quimiocinas e/ou outros mediadores quimiotácticos, devemos esperar que o
camundongo quimérico WT/KO infectado apresente uma infiltração leucocitária
menor no coração, músculo e fígado do que o animal quimérico WT/WT.
Nas nossas experiências iremos utilizar duas cepas distintas de T. cruzi, a cepa
Sylvio X10/4 e a cepa Y, que no camundongo imunocompetente induzem infecções
de curso muito diferente. Assim, a cepa Y é altamente virulenta e resulta em altas
parasitemias na fase aguda da infecção, enquanto que a cepa Sylvio X10/4 é pouco
virulenta e determina uma infecção sem parasitemia patente.
Em relação à linhagem de camundongo, temos no Biotério de Isogênicos do
ICB duas linhagens IFNγR-KO, uma em “background” C57BL/6 e a outra em
“background” 129Sv. Optamos pela utilização de animais IFNγR-KO em
“background” C57BL/6 que permitem uma maior resistência ao T. cruzi, com maior
tempo de sobrevida.
__________________________________________________________Cifuentes Muñoz, A.
36
4 D
ETALHAMENTO EXPERIMENTAL
__________________________________________________________Cifuentes Muñoz, A.
37
Foram obtidas quimeras de medula óssea utilizando camundongos deficientes
em IFNγR, irradiados e reconstituídos com medula óssea de camundongos
selvagens (“wild-type” WT). Oito semanas após a transferência, estabeleceu-se o
estado quimérico, no qual parte dos leucócitos expressa IFNγR, mas as células não
leucocitárias continuam deficientes neste receptor. Como controle, foram
estabelecidas quimeras controle (animais WT irradiados e reconstituídos com
medula WT, nos quais tanto os leucócitos como as células estruturais expressam
receptores para IFNγ).
Depois de confirmado o estado quimérico nas quimeras experimentais, os
animais quiméricos e os controles normais e deficientes foram infectados pelo T.
cruzi, procedendo-se ao estudo do curso da infecção (carga parasitária e infiltração
leucocitária) no coração, músculo esquelético, e fígado.
4.1 Obtenção das quimeras e relação de quimeras pretendidas
Para a obtenção das quimeras os animais receptores foram irradiados com
dose letal (para criar espaço) e reconstituídos com células totais da medula óssea
do animal doador. Desta forma obtemos animais nos quais:
- as células não profissionais do sistema imune (o que do ponto de vista dos
imunologistas constituem o arcabouço do animal) que inclui fibroblastos, células
musculares, células do endotélio vascular, adipócitos, hepatócitos, entre outras,
são derivadas do receptor irradiado;
- enquanto que os leucócitos são total ou parcialmente derivados das células de
medula transplantada, ou seja, do doador.
Assim, dois tipos de quimeras tiveram que ser construídas:
__________________________________________________________Cifuentes Muñoz, A.
38
1) quimera controle: WT-WT, construída com animais C57BL/6 irradiados e
reconstituídos com medula óssea de animais C57BL/6;
2) quimera WT-IFNγRKO (WT/KO), construída com animais IFNγR-KO em
“background”” C57BL/6 irradiados e reconstituídos com medula óssea de animais
C57BL/6.
Avaliando o curso da infecção nas quimeras WT/KO em relação às quimeras
WT-WT e á camundongos IFNγR-KO (KO) e WT (C57Bl/6), como controles,
verificaremos se alguma atividade sinalizadora ou efetora frente ao T. cruzi é
induzida pelo IFNγ nas células não leucocitárias.
4.2 Avaliação do estado quimérico
No caso de quimeras realizadas em animais IFNγR-KO inoculados com medula
de camundongo C57BL/6, a reconstituição foi avaliada estimando em uma pequena
alíquota de sangue periférico, através de citometria de fluxo, a percentagem de
células T (CD3
+
) e B (B220
+
) que expressam IFNγR.
4.3 Estudos pretendidos nas quimeras
Camundongos quiméricos WT/KO e controles são infectados pelo T. cruzi e
estudados em relação a:
- evolução geral da infecção: carga parasitária e mortalidade;
- estudo histopatológico cardíaco, prestando-se especial atenção ao nível local de
parasitismo (número de ninhos) e à intensidade do infiltrado inflamatório;
- estes mesmos estudos são realizados no fígado e músculo esquelético dos
animais infectados.
__________________________________________________________Cifuentes Muñoz, A.
39
5 M
ATERIAL E MÉTODOS
__________________________________________________________Cifuentes Muñoz, A.
40
5.1 Animais
Camundongos isogênicos machos ou fêmeas das linhagens C57BL/6 e IFNγR-
KO em “background” C57BL/6, foram utilizados ao atingirem 10 semanas de idade.
Esses animais foram criados no Biotério de Camundongos Isogênicos do
Departamento de Imunologia do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade
de São Paulo, (ICB- II e IV) com água e ração autoclavadas e mantidos em estantes
para animais em experimentação.
5.2 Preparação das quimeras
A preparação das quimeras foi realizada em três etapas: coleta das células da
medula óssea, irradiação e reconstituição. Todos os camundongos foram tratados
um dia antes de serem irradiados e até quatro semanas após a irradiação com
solução de ciprofloxacina CIPRONIL (Farmabase Saúde Animal Ltda., Brasil) nos
bebedouros na concentração de 1 mg/ml de água autoclavada.
5.2.1 Coleta de células da medula óssea
Foram coletadas células totais da medula óssea de fêmur e tíbia de
camundongos C57BL/6 (WT) sacrificados por narcose em CO
2
e manipulados em
condições estéreis. A pele foi aberta com material estéril, defletindo esta até chegar
ao fêmur e à tíbia, dissecando os tecidos do lado de fora dos ossos e colocando
estes em RPMI 1640 (Gibco) suplementado com 1% S.F.B. Depois, os extremos dos
ossos foram cortados e enxugados, passando 3 ml de RPMI 1640 - S.F.B. 3% até o
osso ficar branco, e coletando as células em tubo de polipropileno.
Após coletada a medula, foram retirados os grumos precipitados e o
sobrenadante centrifugado a 1200 rpm por 8 minutos. Depois, as células foram
ressuspendidas em RPMI 1640 - 1% S.F.B., para realizar a contagem celular na
câmara de Neubauer e estimar a percentagem de células vivas.
__________________________________________________________Cifuentes Muñoz, A.
41
5.2.2 Irradiação
Os camundongos das linhagens IFNγR-KO e C57BL/6 (WT) foram
anestesiados com Xylazina (Rompum
TM
; 0,25 mg/animal) e clorhidrato de ketamina
(Ketamina
TM
; 1,25 mg/animal), e seguidamente irradiados com 1200 rads (DAY et
al., 2006), usando um irradiador biológico de fonte selada de Césio (Empresa
Internacional CIS, subsidiária da Companhia ORIS Indústria S.A.) que está situado
no Departamento de Imunologia do ICB, ou um irradiador com fonte de cobalto (CO-
60 panorâmica), situado no Instituito de Pesquisas Energéticas e Nucleares (IPEN).
5.2.3 Reconstituição
Os animais irradiados foram reconstituídos seguidamente, pela via
intraperitoneal (i.p.), com 24-30 X10
6
células da medula óssea de camundongos
C57BL/6, ressuspendidas em 300 µl de RPMI 1640 sem S.F.B.
5.2.3.1
Avaliação do grau de Reconstituição
Para avaliar o grau de reconstituição das quimeras foi realizada uma análise
através de citometria de fluxo nos leucócitos do sangue periférico, 8 semanas após a
inoculação das células da medula óssea. Trinta microlitros de sangue periférico
obtido pela cauda de cada camundongo foram misturados com 100 µl de PBS
1X/Heparina e 10 ml de RPMI 1640 (Gibco) e centrifugados à 300 g por 10 minutos.
As hemácias foram lisadas com tampão de lise pH 7,4 (0,5125 g de TRIS base e
2,14 g de NH4CL) na proporção volume/volume 1:9 durante 4 minutos e no gelo. A
lise foi bloqueada usando RPMI 1640 - 3% de S.F.B. Após centrifugação a 300 g por
10 minutos, o pellet foi ressuspendido em tampão de FACS e as células novamente
centrifugadas a 300g por 10 minutos.
As suspensões celulares foram marcadas com anticorpos anti-CD3 – FITC, -
CD45R (B220) – Cy e -IFNγR – biotina, incubando por 30 minutos a 25 °C. Numa
segunda etapa e após 3 lavados, as células foram incubadas com estreptoavidina –
__________________________________________________________Cifuentes Muñoz, A.
42
PE. Após novo ciclo de lavados, as células foram analisadas usando o citômetro
FACS calibur (Becton and Dickinson., San José, C.A., USA).
5.3 Infecção com T. cruzi
A infecção dos animais com os parasitas das cepas de Sylvio X10/4 ou Y foi
realizada após confirmar a reconstituição. Na primeira, terceira e quarta
experiências utilizamos parasitas da cepa Sylvio X10/4 provenientes de culturas de
células LLCMK2. Os parasitas provenientes da cultura foram colocados em tubo de
polipropileno de 50 mL e centrifugados a 3000 rpm, por 5 minutos, a 4
o
C. Após a
centrifugação, o sobrenadante foi descartado e o pellet ressuspendido em meio
RPMI 1640. O sedimento ressuspendido permaneceu no gelo enquanto os parasitos
foram contados em câmara de Neubauer. O número de parasitas T. cruzi Sylvio
X10/4 inoculado foi 1x10
5
parasitas por animal, que foram administrados pela via i.p.
na primeira experiência e pela via endovenosa (plexo oftálmico) na terceira e quarta
experiências.
Na segunda experiência, os animais foram infectados i.p. com 1000
tripomastigotas sanguícolas da cepa Y, mantida através de repique semanal em
camundongos A/J. Neste caso, uma alíquota de sangue de animal infectado foi
examinada em câmara de Neubauer e ajustada para conter 1000 tripomastigotas em
0,2 ml de PBS.
Em todos os casos, após a infecção e pelo resto da experiência, os animais
foram tratados com solução de CIPRONIL na água de beber.
__________________________________________________________Cifuentes Muñoz, A.
43
5.4 Avaliação de parasitemias, carga parasitémica local e análise
histopatológica
As parasitemias dos camundongos infectados com 1X10
5
tripomastigotas de
cultura de T. cruzi clone Sylvio X10/4 ou 1x10
3
tripomastigotas sanguícolas de T.
cruzi da cepa Y foram realizadas a partir do sétimo dia de infecção, a partir de 5 µl
do sangue da cauda, colocados em lâmina, contando 50 campos microscópicos em
objetiva de 40X.
Os animais foram anestesiados e sangrados até a morte através de punção
cardíaca e os órgãos coletados, fixados por 24h em solução de formaldeído a 10%,
e posteriormente, em álcool 70% por 24h. Os órgãos fixados foram inclusos em
blocos de parafina. O coração foi dividido sagitalmente em duas partes, cada uma
contendo as quatro cavidades. Quatro cortes sagitais de 5 µm, não consecutivos,
foram obtidos do coração, assim como do fígado e músculo estriado esquelético
(quadríceps) e corados com hematoxilina-eosina. Seções de cada tecido foram
analisadas na sua totalidade através de microscopia óptica, usando o microscópio
Olympus (Olympus Optical Co., Tokyo., Japan). A carga parasitária local nos
diferentes órgãos foi avaliada através da contagem do número de ninhos nas
preparações histológicas coradas com hematoxilina-eosina. Os resultados são
expressos para cada órgão de cada animal pela média do número de ninhos nos
diferentes cortes histológicos. Para registrar os infiltrados inflamatórios, um dos
elementos centrais da analise histopatológica, consideramos que para ser um foco
inflamatório devia conter 10 ou mais leucócitos por campo microscópico observado
na objetiva de 40X (TALVANI e RIBEIRO, 2000), de acordo com a seguinte escala
de valores:
- (0) nenhum infiltrado em 50 campos microscópicos (objetiva de 40x);
- (1) de 1 - 10 infiltrados em 50 campos microscópicos (objetiva de 40x);
- (2) de 11 - 20 infiltrados em 50 campos microscópicos (objetiva de 40x);
- (3) de 21 - 30 infiltrados em 50 campos microscópicos (objetiva de 40x);
- (4) mais de 31 infiltrados em 50 campos microscópicos (objetiva de 40x).
__________________________________________________________Cifuentes Muñoz, A.
44
5.5 Análise Estatística
Os resultados são expressos pela média +/- desvio padrão de cada grupo. A
análise estatística (realizada no programa InStat – GraphPad Software) foi avaliada
por ANOVA utilizando o método de Tukey para comparações múltiplas. A
comparação de parasitemias entre o grupo WT/WT e WT/KO foi realizada a cada dia
de infecção através do T de Student. Foi considerada significância estatística se
p<0,05.
__________________________________________________________Cifuentes Muñoz, A.
45
6 R
ESULTADOS
__________________________________________________________Cifuentes Muñoz, A.
46
Mostraremos o resultado de quatro experiências. Os resultados de cada uma
delas são apresentados em separado, divididas em duas partes: 1) Avaliação do
estado quimérico após reconstituição, e 2) Avaliação da infecção pelo T. cruzi.
6.1 1ª EXPERIÊNCIA: Avaliação do estado quimérico
Inicialmente, construímos quimeras WT/WT e WT/KO, conforme descrito no
capítulo de materiais e métodos.
Quatro grupos de animais foram estabelecidos:
- controles positivos: 5 animais C57BL/6 (WT);
- controles negativos: 5 animais IFNγR-KO em “background” C57BL/6
(KO);
- quimeras WT/WT (WT/WT): 8 animais C57BL/6 irradiados com 1200 rads
e reconstituídos via i.p. com 34 X10
6
células da medula óssea obtidas de
camundongos C57BL/6, em 300 µl de RPMI 1640 sem S.F.B;
- quimeras WT/IFNγR-KO (WT/KO): 9 animais IFNγR-KO irradiados com
1200 rads e reconstituídos via i.p. com 34 X10
6
de células da medula óssea
obtida de camundongos C57BL/6, em 300 µl de RPMI 1640 sem S.F.B.
Com o objetivo de avaliar a eficiência da reconstituição nos animais WT/KO, ás
oito semanas após a irradiação/reconstituição, foi realizado o teste de avaliação do
estado quimérico, descrito no capítulo de materiais e métodos.
Espera-se nestes animais que uma fração elevada das populações celulares
CD3
+
e B220
+
expresse IFNγR. Já os animais dos grupos WT e WT/WT deverão
expressar o receptor para IFNγ na totalidade ou maior parte das células B220
+
e
CD3
+
, enquanto que nos animais do grupo KO, o esperado é que a fração positiva
seja mínima.
__________________________________________________________Cifuentes Muñoz, A.
47
Figura 1. Análise da freqüência de células IFNγ
γγ
γR
+
nas populações de células
CD3
+
e B220
+
nos camundongos da 1ª experiência. Oito semanas
após a transferência de medula óssea foi analisada a freqüência de
células IFNγR
+
nas populações de células CD3
+
e B220
+
do sangue
periférico, em animais quiméricos e controles (1ª experiência).
Nos animais do grupo KO encontramos baixa freqüência de células IFNγR nas
populações CD3
+
e B220
+
. Este grupo mostrou diferença estatística para as duas
populações celulares se comparado ao grupo WT/KO (p<0,001). Nos animais do
grupo WT/WT a expressão de IFNγR foi por volta de 95% nas duas populações, e
não houve diferença estatística com o grupo WT, mas sim frente ao grupo WT/KO
(p<0,001) (Figura 1).
Nas quimeras experimentais WT/KO, a freqüência de células do sangue
periférico que expressam IFNγR mostrou uma grande variação entre os diferentes
animais. De fato, 33.3% (3 de 9 animais) do grupo de quimeras experimentais não
mostraram nenhum grado de reconstituição, já que a fração de células IFNγ-
positivas foi menor que 5%. O 66% do grupo WT/KO (6 dos 9 animais), entretanto,
mostrou uma reconstituição acima de 40%, mas pouco homogênea. A percentagem
de expressão de receptor para IFNγ nestes animais oscilou entre 40-72% das
células T (CD3
+
) e 47-83% das células B (B220
+
). Deste modo, vemos que 4 de 6
B220+
0
20
40
60
80
100
KO
B220+
WT
WT/WT
WT/KO
p<0.001
p<0.001
B220+
CD3+
B220+CD3+ CD3+
% Células IFNgR
+
CD3+
__________________________________________________________Cifuentes Muñoz, A.
48
animais expressam freqüência de células IFNγR acima de 62% e abaixo de 72% nas
células CD3
+
e expressão maior de 65% e menor de 83% nas células B220
+
.
Interessantemente, na totalidade dos animais dos grupos KO e quimera
experimental WT/KO observamos que a expressão de IFNγR nas células B220
+
foi
discretamente maior do que nas células CD3
+
.
0
20
40
60
80
100
KO WT
WT/KO WT/WT
Expressão de IFNγ
γγ
γR em células CD3
+
A
KO vs WT
KO vs WT/WT
KO vs WT/KO
WT/KO vs WT
WT/KO vs WT/WT
WT/WT vs WT
P < 0.001
P < 0.001
P < 0.001
P < 0.001
P < 0.001
P > 0.05
% Reconstituição
0
20
40
60
80
100
KO WT
WT/KO
Expressão de IFNγ
γγ
γR em células B220
+
WT/WT
KO vs WT
KO vs WT/WT
KO vs WT/KO
WT/KO vs WT
WT/KO vs WT/WT
WT/WT vs WT
P < 0.001
P < 0.001
P < 0.001
P < 0.001
P < 0.001
P > 0.05
B
% Reconstituição
Figura 2. Percentagem de reconstituição de células CD3
+
IFNγ
γγ
γR
+
e B220
+
IFNγ
γγ
γR
+
da 1ª experiência. Oito semanas após a transferência de medula
óssea, foi analisada a percentagem de reconstituição, no sangue de
animais quiméricos e controles (1ª experiência). A. Expressão de IFNγR
em células CD3
+
.
B. Expressão de IFNγR em células B220
+
.
Desconsiderando os três animais WT/KO não reconstituídos, as medias de
reconstituição de células IFNγR
+
nas populações CD3
+
e B220
+
do sangue, foram
respectivamente de 59% e 66% (Figura 2).
Depois de confirmado o estado quimérico nos animais WT/KO, foi realizada a
infecção com tripomastigotas de cultura da cepa Sylvio X10/4 de T. cruzi. Os 3
animais não reconstituídos do grupo quimera experimental WT/KO foram infectados,
mas foram excluídos das análises posteriores.
__________________________________________________________Cifuentes Muñoz, A.
49
6.2 1ª EXPERIÊNCIA: Avaliação da infecção pelo T. cruzi
Nesta seção mostraremos o curso da infecção (carga parasitária e infiltração
leucocitária no coração, fígado e músculo esquelético) dos animais quiméricos e
controles da 1ª experiência, após infecção. Os 27 camundongos foram infectados via
i.p. com 100.000 formas de T. cruzi da cepa Sylvio X10/4, em um volume de 300 µl
de RPMI 1640 sem S.F.B. Para evitar infecções secundárias devidas à manipulação,
os animais foram tratados com antibiótico por toda a experiência, começando um dia
antes da infecção.
Uma vez infectados, os camundongos dos diferentes grupos experimentais
foram estudados em relação a:
- evolução geral da infecção: carga parasitária e mortalidade;
- estudo histológico cardíaco, prestando-se especial atenção ao nível local de
parasitismo (número de ninhos) e à intensidade do infiltrado inflamatório;
- estes mesmos estudos foram realizados no músculo esquelético e fígado.
__________________________________________________________Cifuentes Muñoz, A.
50
Curvas de parasitemia
(1
a
Experiência)
0.0
2.5
5.0
KO
WT
WT/WT
WT/KO
10
11
12 13 16
14
15
15
40
65
90
1/5
1/4
1/3
2/4
2/4
0/3
0/6
Dias após infecção
Parasitas x 10
4
/ml
Figura 3. Análise comparativa da carga parasitária sistêmica (sangue) em
camundongos controle positivo (WT), controle negativo (IFNγR-KO),
quimera WT/WT e quimera WT/KO da 1ª experiência. Os animais
foram infectados com 10
5
tripomastigotas da cepa Sylvio X10/4 de T.
cruzi e as parasitemias analisadas em diferentes dias da infecção. Os
números na figura indicam o número de animais positivos no total de
animais do grupo.
No dia 10 pós infecção (p.i.), a parasitemia tornou-se positiva em 1 dos 5
animais do grupo controle negativo (KO), em outros 2 animais no dia 12 p.i. e, em
mais um, no dia 13 p.i. Contudo, é notável que 2 animais permaneciam negativos no
dia 13 p.i. A precipitada positividade do grupo KO era de se esperar já que esta
linhagem é muito susceptível ao T. cruzi pela sua condição de deficiente do receptor
para IFNγ. Em relação à mortalidade um dos animais morreu espontaneamente no
dia 11-12 p.i., e, em função do mal estado apresentado, o restante do grupo KO foi
sacrificado nos dias 12 (01 animal) e 13 (03 animais). A necessidade de coletar os
órgãos em ótimas condições para realizar a análise histopatológica não permite
esperar a morte espontânea dos animais, razão pela que é impossível estudarmos
curvas de mortalidade.
No grupo WT/KO, a parasitemia positivou no dia 15 p.i. em 33% (2 de 6
animais) do grupo. No entanto, 66% (4 de 6 animais) do grupo WT/KO nunca
__________________________________________________________Cifuentes Muñoz, A.
51
mostraram parasitemias positivas. Para realizarmos a análise histopatológica, os
animais de grupo WT/KO foram sacrificados no dia 13 (02 animais) e dia 16 (04
animais). Nenhum animal morreu espontaneamente.
Diferentemente dos grupos KO e WT/KO, nos animais dos grupos WT (05
animais) e WT/WT (08 animais) a parasitemia nunca positivou até o dia 16 p.i. Dois
animais WT e dois WT/WT foram sacrificados no dia 13 p.i., e o restante dos animais
no dia 16 p.i. Estes resultados são esperados, uma vez a cepa Sylvio X10/4 não
determina parasitemia patente nos camundongos C57BL/6.
Os dados individuais de parasitemia podem ser observados na Tabela 1. De
interesse não observamos correlação inversa entre o nível de reconstituição das
quimeras WT/KO e a parasitemia. Assim, e como exemplo, os dois animais que
tiveram maior reconstituição por células IFNγR
+
foram aqueles com parasitemia mais
elevada.
Em relação ao parasitismo cardíaco, registrado pela contagem do número total
de ninhos de amastigotas em 50 campos microscópicos no objetivo de 40x,
observamos que os ninhos estavam praticamente ausentes no dia 13 p.i., mas foram
revelados em forma clara no dia 16 p.i. (Figura 4). Entretanto, não houve diferenças
estatísticas entre os grupos WT/WT e WT/KO, apesar de que 1 animal do grupo
WT/KO exibiu um número elevado de ninhos no dia 16 de infecção. As médias de
ninhos no coração no dia 16 p.i. foram 4,5, 2,8 e 11,7 ninhos/corte histológico,
respectivamente para os grupos WT, WT/WT e WT/KO.
__________________________________________________________Cifuentes Muñoz, A.
52
__________________________________________________________Cifuentes Muñoz, A.
53
Figura 4. Análise comparativa do número de ninhos presentes no tecido
cardíaco nos animais do grupo controle KO, grupo controle WT e
grupos quimera WT/WT e WT/KO da 1ª experiência. Os animais foram
sacrificados nos dias 12, 13 e 16 da infecção com 10
5
tripomastigotas de
cultura da cepa Sylvio X10/4.
Ao correlacionarmos em cada animal a carga parasitária cardíaca com o
número de parasitas no sangue (Tabela 1), observamos que os dois animais WT/KO
com maior parasitemia no dia 16 p.i. são aqueles com maior número de ninhos no
coração. No entanto, na mesma data alguns dos animais WT e WT/WT também
mostram ninhos no coração, mas não apresentam tripomastigotas no sangue. Mais
ainda, nos dias 12-13 p.i. há animais controle KO que apresentam altas parasitemias
e não apresentam ninhos no coração.
__________________________________________________________Cifuentes Muñoz, A.
54
Figura 5. Análise comparativa do infiltrado cardíaco nos animais do grupo
controle KO, grupo controle WT e grupos quimera WT/WT e WT/KO
da 1ª experiência. Os animais foram sacrificados nos dias 12, 13 e 16
de infecção com 10
5
tripomastigotas de cultura da cepa Sylvio X10/4.
Intensidade do infiltrado: (0) nenhum infiltrado, (1) 1 - 10 infiltrados, (2)
11 - 20 infiltrados, (3) 21 - 30 infiltrados e (4) mais de 31 infiltrados.
No dia 12 p.i., os animais do grupo KO mostraram, como máximo, grau 1 de
infiltração leucocitária no coração (média 0,66), ou seja, um nível muito discreto. Nos
animais do grupo WT/KO, os infiltrados no coração foram discretos no dia 13 p.i.
(média 1) e moderados no dia 16 p.i. (média 2), mas não observamos diferenças
estatísticas em relação aos animais do grupo WT/WT (média 2,25) (Figura 5).
Em relação ao parasitismo no fígado, observamos que alguns animais do grupo
KO apresentam ninhos nos dias 12 e 13 p.i., ou seja, em uma data na qual não são
__________________________________________________________Cifuentes Muñoz, A.
55
detectados no coração. Por outro lado, existe uma tendência (p=0,075) dos animais
do grupo WT/KO a exibirem um número maior de ninhos no dia 16 de infecção do
que nos animais do grupo WT/WT (Figura 6). Nesta data, 3 dos 4 animais WT/KO
apresentam ninhos no fígado (média de 3,25 ninhos/animal), enquanto que nos 6
animais WT/WT a procura de ninhos deu resultado negativo.
Em relação à infiltração leucocitária no fígado, observamos que alguns dos
animais KO mostraram nível 2 ou 3 de infiltração leucocitária nos dias 12-13 de
infecção (Figura 7), superior ao encontrado no coração (comparar as Figuras 5 e 7).
Por outro lado, os animais do grupo WT/KO mostraram grau moderado de infiltração
leucocitária nos dias 13 (média 1,5) e 16 p.i. (média 2), similar à dos animais do
grupo WT/WT.
__________________________________________________________Cifuentes Muñoz, A.
56
Figura 6. Análise comparativa do número de ninhos presentes no fígado dos
animais do grupo controle KO, grupo controle WT e grupos quimera
WT/WT e WT/KO da 1ª experiência. Os animais foram sacrificados nos
dias 12, 13 e 16 da infecção com 10
5
tripomastigotas de cultura da cepa
Sylvio X10/4.
__________________________________________________________Cifuentes Muñoz, A.
57
Figura 7. Análise comparativa da intensidade de hepatite nos animais do
grupo controle KO, grupo controle WT e grupos quimera WT/WT e
WT/KO da 1ª experiência. Os animais foram sacrificados nos dias 12,
13 e 16 da infecção com 10
5
tripomastigotas de cultura da cepa Sylvio
X10/4. Intensidade do infiltrado: (0) nenhum infiltrado, (1) 1 - 10
infiltrados, (2) 11 - 20 infiltrados, (3) 21 - 30 infiltrados e (4) mais de 31
infiltrados.
Já em relação à presença de ninhos na musculatura estriada (quadríceps),
estes não foram detectados no dia 13 p.i.. No entanto, no dia 16 p.i., eles puderam
ser visualizados nos animais WT/KO e WT/WT, sem diferenças estatísticas entre
estes dois grupos (Figura 8). As médias de ninhos/corte histológico nos grupos
WT/WT e WT/KO foram de 1,16 e 1,75, respectivamente.
Não foram detectadas grandes diferenças no grau de infiltração leucocitária no
músculo estriado (miosite) dos diferentes grupos, exceto no dia 16 p.i., quando se
__________________________________________________________Cifuentes Muñoz, A.
58
observa que o infiltrado celular é significativamente mais intenso nos animais
WT/WT do que nos animais WT/KO (p<0,01) (Figura 9).
Figura 8. Análise comparativa do número de ninhos presentes no músculo
estriado esquelético nos animais do grupo controle KO, grupo
controle WT e grupos quimera WT/WT e WT/KO da 1ª experiência.
Os animais foram sacrificados nos dias 12, 13 e 16 de infecção com 10
5
tripomastigotas de cultura da cepa Sylvio X10/4.
__________________________________________________________Cifuentes Muñoz, A.
59
Figura 9. Análise comparativa do infiltrado inflamatório no músculo estriado
esquelético nos animais do grupo controle KO, grupo controle WT e
grupos quimera WT/WT e WT/KO da 1ª experiência. Os animais foram
sacrificados nos dias 12, 13 e 16 de infecção com 10
5
tripomastigotas de
cultura da cepa Sylvio X10/4. Intensidade do infiltrado: (0) nenhum
infiltrado, (1) 1 á 10 infiltrados, (2) 11 á 20 infiltrados, (3) 21 á 30
infiltrados e (4) mais de 31 infiltrados.
A tentativa de acharmos nos animais WT/KO uma correlação entre o grau de
reconstituição e a patologia nos diferentes órgãos não revelou nenhuma associação
de interesse. Assim, em forma análoga ao descrito quando da análise individual das
parasitemias, o grau de reconstituição individual dos animais WT/KO não mostrou
correlação inversa com o parasitismo tissular.
__________________________________________________________Cifuentes Muñoz, A.
60
6.3 2ª EXPERIÊNCIA: Avaliação do estado quimérico
Interessados em avaliar o modelo de quimeras de medula óssea
(WT/IFNγ
γγ
γR-
KO)
, decidimos fazer outra experiência mudando alguns aspectos na tentativa de
melhorar o modelo e cumprir os nossos objetivos.
Na segunda experiência decidimos mudar a cepa do T. cruzi com o objetivo de
observar em forma mais clara diferenças nas parasitemias, na intensidade dos
infiltrados inflamatórios e número de ninhos dos órgãos em estudo, nos diferentes
grupos.
Assim, os animais WT/KO, WT/WT, C57BL/6 e IFNγR-KO em “background”
C57BL/6 foram infectados com 10
3
tripomastigotas sanguícolas da cepa Y de T.
cruzi.
Quatro grupos foram estabelecidos:
- controles positivos: 9 animais C57BL/6 (WT);
- controles negativos: 4 animais IFNγR-KO em “background” C57BL/6 (KO);
- quimeras WT/WT: 17 animais C57BL/6, irradiados com 1200 rads e
reconstituídos via i.p. com 24 X10
6
células da medula óssea obtidas de
camundongos C57BL/6, em 300 µl de RPMI 1640 sem S.F.B.;
- quimeras WT/IFNγR-KO (WT/KO): 14 animais IFΝγR-KO, irradiados
com 1200 rads e reconstituídos via i.p. com 24 X106 de células da medula
óssea obtidas de camundongos C57BL/6, em 300 µl de RPMI 1640 sem S.F.B.
__________________________________________________________Cifuentes Muñoz, A.
61
Figura 10. Análise da freqüência de células IFNγ
γγ
γR
+
nas populações de células
CD3
+
e B220
+
nos camundongos da 2ª experiência. Oito semanas
após a transferência de medula óssea foi analisada a freqüência de
células IFNγR
+
nas populações de células CD3
+
e B220
+
do sangue
periférico, em animais quiméricos e controles da 2ª experiência.
Oito semanas após a irradiação/reconstituição fomos avaliar a eficiência da
reconstituição dos grupos de quimeras WT/WT e WT/KO. O grupo controle negativo
KO mostrou baixa freqüência de células CD3
+
IFNγR
+
e células B220
+
IFNγR
+
(Figura 10), assim como o grupo WT e grupo quimera WT/WT mostraram alta
expressão do IFNγR
+
para as duas populações. De outro lado, o grupo quimera
WT/KO (14 animais) mostrou células CD3
+
IFNγR
+
com uma freqüência que oscilou
entre 62% e 2.75% e para a população de B220
+
IFNγR
+
a freqüência oscilou entre
69% e 1.49%. Em função da grande diferença entre as percentagens de
reconstituição dos animais, decidimos excluir aqueles com reconstituição mais baixa.
Conseqüência deste fato e da morte de alguns animais dias após, o grupo
experimental WT/KO ficou reduzido a 4 camundongos. De outro lado, o grupo
WT/WT, originalmente constituído por 17 animais, foi reduzido para 6 animais.
__________________________________________________________Cifuentes Muñoz, A.
62
0
20
40
60
80
100
KO
CD3+ B220+
WT WT/WT WT/KO
CD3+ B220+ B220+CD3+B220+ CD3+
% Células IFNγ
γ
γ
γ
R
Figura 11. Segunda avaliação da freqüência de células IFNγ
γγ
γR
+
nas populações
de células CD3
+
e B220
+
nos camundongos da 2ª experiência. Onze
semanas após a transferência de medula óssea foi analisada a
freqüência de células IFNγR
+
nas populações de células CD3
+
e B220
+
do sangue periférico, em animais quiméricos e controles para
confirmação do estado quimérico.
Na semana onze após a irradiação/reconstituição realizamos uma segunda
avaliação para confirmar o estado quimérico do grupo de quimeras experimentais
com que iríamos trabalhar (Figura 11). Os resultados mostram que a média da
freqüência de células CD3
+
e B220
+
que expressam IFNγR nos animais do grupo
quimera WT/KO foi de 44% para a população de CD3
+
e de 54% para a população
B220
+
. No entanto, 1 de 4 animais mostrou uma reconstituição baixa, 18% para as
células CD3
+
e de 27% para a população B220
+
. O resto do grupo mostrou uma
reconstituição acima de 44% para as células CD3
+
e de 46% para a população
B220
+
. Como esperado, os animais dos grupos WT e WT/WT tiveram expressão de
IFNγR acima de 90% e os do grupo KO mostraram uma freqüência baixa para este
receptor. Diferenças estatísticas entre os grupos WT/WT e WT/KO foram
observadas (p<0,001).
Nesta experiência, chama de novo a atenção que a expressão de IFNγR nas
células B220
+
é discretamente maior do que nas células CD3
+
(Figuras 11 e 12).
__________________________________________________________Cifuentes Muñoz, A.
63
Pelo fato de não observarmos um comportamento diferente após infecção (em
relação à parasitemia e patologia nos órgãos) no animal WT/KO com menor
percentagem de reconstituição (ver mais adiante na Tabela 2), decidimos não excluí-
lo e estudá-lo junto com os demais animais do seu grupo.
0
25
50
75
100
KO WT WT/KO
Expressão de IFNγ
γγ
γR em células CD3+
WT/WT
KO vs WT
KO vs WT/WT
KO vs WT/KO
WT/KO vs WT
WT/KO vs WT/WT
WT/WT vs WT
P < 0.001
P < 0.001
P < 0.001
P < 0.001
P < 0.001
P > 0.05
A
% Reconstituição
0
25
50
75
100
KO
WT
WT/KO
Expressão de IFNγ
γγ
γR em células B220+
KO vs WT/WT
KO vs WT
KO vs WT/KO
WT/KO vs WT/WT
WT/KO vs WT
WT vs WT/WT
P < 0.001
P < 0.001
P < 0.001
P < 0.001
P < 0.001
P > 0.05
WT/WT
B
% Reconstituição
Figura 12. Percentagem de reconstituição de células CD3
+
IFNγ
γγ
γR
+
e B220
+
IFNγ
γγ
γR
+
da 2ª experiência. Onze semanas após a transferência de
medula óssea, foi analisada a reconstituição leucocitária no sangue de
animais quiméricos e controles (2ª experiência). A. Expressão de IFNγR
em células CD3
+
.
B. Expressão de IFNγR em células B220
+
.
Apos de conferir o estado de reconstituição, os animais WT/KO, WT/WT,
C57BL/6 e IFNγR-KO em “background” C57BL/6 foram infectados com 10
3
tripomastigotas sanguícolas da cepa Y de T. cruzi, e tratados com antibiótico por
toda a experiência, começando um dia antes da infecção.
6.4 2ª EXPERIÊNCIA: Avaliação da infecção pelo T. cruzi
No dia 7 p.i. todos os animais do grupo controle negativo KO tiveram níveis
baixos de parasitemia (média: 5,5 parasitas X 10
-4
/ml) que foram aumentando até
chegar a valores muito altos (média: 1680 parasitas X 10
-4
/ml), no dia 12 p.i., quando
os animais começaram a ficar em mal estado e foi necessário sacrificá-los.
__________________________________________________________Cifuentes Muñoz, A.
64
No grupo quimera WT/KO, todos os animais tiveram parasitemia positiva no
dia 10 p.i. (média: 134 parasitas X 10
-4
/ml) que foi aumentando até o sacrifício no dia
13 p.i. (média: 290 parasitas X 10
-4
/ml), mas sempre em níveis inferiores aos dos
animais do grupo controle negativo KO (Figura 13).
Curvas de parasitemia
(2
a
Experiência)
0
200
400
KO
WT/WT
WT/KO
1500
2000
2500
WT
7
1311
9 10 128
1/4
5/5
4/4
6/6
5/5
Dias após infecção
Parasitas x 10
4
ml
Figura 13. Análise comparativa da carga parasitaria sistêmica (sangue) nos
grupos controle negativo (IFNγR-KO), controle positivo (WT),
quimera WT/WT e quimera WT/KO 2ª experiência. Os animais foram
infectados com 10
3
tripomastigotas da cepa Y de T. cruzi e as
parasitemias analisadas em diferentes dias da infecção. Nos dias 12 e
13 p.i., WT/WT versus WT/KO p<0.0005. Os números na figura indicam
o número de animais positivos no total de animais do grupo.
No grupo controle WT, todos os animais positivaram no dia 10 p.i. Neste dia foi
atingido o pico de parasitemia (média: 41 parasitas X 10
-4
) com sensível queda nos
dias 12 e 13 p.i. (média no dia 13 p.i.: 8,8 parasitas X 10
-4
/ml)
No grupo WT/WT, todos os animais positivaram no dia 10 p.i., e, em forma
análoga ao grupo controle WT, o pico de parasitemia foi atingido neste dia (média:
190 parasitas X 10
-4
/ml), com sensível queda nos dias sub-seguintes (média no dia
13 p.i.: 19 parasitas X 10
-4
/ml).
__________________________________________________________Cifuentes Muñoz, A.
65
Diferentemente destes dois grupos, no grupo quimera WT/KO as parasitemias
continuaram crescendo após o dia 10, atingindo valores elevados (média no dia 13
p.i.: 291 parasitas X 10
-4
/ml), porém inferiores aos exibidos pelo grupo KO no dia 12
p.i. Para os dias 12 e 13 p.i., houve diferença estatística entre os grupos WT/WT e
WT/KO (p<0,0005).
Os dados individuais de parasitemia podem ser observados na Tabela 2. Da
mesma forma que na 1ª experiência, não observamos correlação inversa entre o
nível de reconstituição das quimeras WT/KO e a parasitemia. Assim, as curvas de
parasitemia exibidas pelos animais que tiveram 17% e 62% de células IFNγR
+
na
população CD3
+
não foram muito diferentes. No entanto, o animal com 17% de
reconstituição nas células T foi o único animal WT/KO que positivou no dia 7 p.i.
Neste experimento nenhum animal morreu espontaneamente.
__________________________________________________________Cifuentes Muñoz, A.
66
__________________________________________________________Cifuentes Muñoz, A.
67
Figura 14. Análise comparativa do número de ninhos presentes no tecido
cardíaco dos animais do grupo controle KO, grupo controle WT e
grupos quimera WT/WT e WT/KO da 2ª experiência. Os animais foram
sacrificados nos dias 12 (KO) e 13 (outros grupos) de infecção com 10
3
tripomastigotas da cepa Y de T. cruzi.
Em relação ao parasitismo tissular (Figura 14), no dia 12 p.i. o grupo controle
negativo KO mostrou a presença de ninhos no tecido cardíaco com uma média de 8
ninhos/animal. No dia 13 p.i. destaca-se os animais do grupo WT/KO que
apresentavam um número maior de ninhos (média: 13 ninhos/animal) do que os
animais dos grupos WT e WT/WT (média: 3,8 e 2 ninhos/animal, respectivamente),
havendo diferença estatística entre os grupos WT/WT e WT/KO (p<0,05).
Figura 15. Análise comparativa do infiltrado cardíaco nos animais do grupo
controle negativo KO, grupo controle positivo WT e grupos quimera
WT/WT e WT/KO da 2ª experiência. Os animais foram sacrificados nos
dias 12 (KO) e 13 (outros grupos) de infecção com 10
3
tripomastigotas
da cepa Y de T. cruzi. Intensidade do infiltrado: (0) nenhum infiltrado, (1)
1 - 10 infiltrados, (2) 11 - 20 infiltrados, (3) 21 - 30 infiltrados e (4) mais
de 31 infiltrados.
__________________________________________________________Cifuentes Muñoz, A.
68
No dia 13 p.i., apesar dos infiltrados inflamatórios serem ainda discretos,
observamos que estes são inferiores no grupo WT/KO se comparados ao dos
grupos WT e WT/WT (Figura 15). A análise estatística revelou diferença entre os
grupos WT/KO e WT/WT (p< 0,05).
Em relação ao número de ninhos no fígado (Figura 16), é importante destacar
que o grupo controle negativo KO apresentou um número elevado de ninhos no dia
12 p.i. (média: 43 ninhos/animal). Por outro lado, no dia 13 p.i., o grupo quimera
WT/KO apresentou um número maior de ninhos (média: 10 ninhos/animal) que os
grupos controle positivo WT (média: 1,4 ninhos/animal) e quimera WT/WT (média:
2,2 ninhos/animal). Observa-se diferença estatística entre os animais dos grupos
WT/WT e WT/KO com p=0,007.
Figura 16. Análise comparativa do número de ninhos presentes no fígado nos
animais do grupo controle negativo KO, grupo controle positivo KO,
grupo quimera WT/WT e WT/KO da 2ª experiência. Os animais foram
sacrificados no dias 12 (KO) e 13 (outros grupos) de infecção com 10
3
tripomastigotas da cepa Y de T. cruzi.
__________________________________________________________Cifuentes Muñoz, A.
69
Figura 17. Análise comparativa da intensidade de hepatite nos animais do
grupo controle negativo KO, grupo controle positivo WT e grupos
quimera WT/WT e WT/KO da 2ª experiência. Os animais foram
sacrificados nos dias 12 (KO) e 13 (outros grupos) de infecção com 10
3
tripomastigotas da cepa Y de T. cruzi. Intensidade do infiltrado: (0)
nenhum infiltrado, (1) 1 - 10 infiltrados, (2) 11 - 20 infiltrados, (3) 21 - 30
infiltrados e (4) mais de 31 infiltrados. Não há diferenças estatísticas
WT/WT vs WT/KO, mas há uma tendência com p=0.057.
Em relação à intensidade de hepatite no fígado (Figura 17), não observamos
diferenças estatísticas entre os animais dos grupos WT/WT (média 2,33) e WT/KO
(média 1,75), mas existe uma tendência dos animais WT/KO mostrarem níveis
inferiores de hepatite (p=0,057).
Figura 18. Análise comparativa do número de ninhos presentes no músculo
estriado esquelético nos animais do grupo controle negativo KO,
grupo controle positivo WT e grupos quimera WT/WT e WT/KO da 2ª
experiência. Os animais foram sacrificados nos dias 12 (KO) e 13
(outros grupos) de infecção com 10
3
tripomastigotas da cepa Y de T.
cruzi. Não há diferenças estatísticas WT/WT vs WT/KO.
__________________________________________________________Cifuentes Muñoz, A.
70
As secções de tecido do músculo esquelético da 2ª experiência não revelaram
ninhos T. cruzi em nenhum dos grupos (Figura 18).
Figura 19. Análise comparativa do infiltrado inflamatório no músculo estriado
esquelético nos animais do grupo controle negativo KO, grupo
controle WT, grupo quimera WT/WT e grupo quimera WT/KO 2ª
experiência. Os animais foram sacrificados nos dias 12 (KO) e 13
(outros grupos) de infecção com 10
3
tripomastigotas da cepa Y de T.
cruzi. Intensidade do infiltrado: (0) nenhum infiltrado, (1) 1 - 10 infiltrados,
(2) 11 - 20 infiltrados, (3) 21 - 30 infiltrados e (4) mais de 31 infiltrados.
Não há diferenças estatísticas WT/WT vs WT/KO.
Em concordância com a ausência de ninhos, a figura 19 mostra que
praticamente não houve miosite nos animais da 2ª experiência, exceto em um
animal do grupo controle positivo WT que apresentou miosite grau 1, o que é pouco
relevante.
Analisando nos animais WT/KO a correlação individual entre a percentagem de
reconstituição e o grau de patologia, observamos não existe uma correlação inversa
entre a freqüência de células IFNγR
+
e a intensidade dos infiltrados, ou entre a
freqüência de células IFNγR
+
e o número de ninhos, nos diferentes órgãos (Tabela
2).
__________________________________________________________Cifuentes Muñoz, A.
71
6.5 3ª EXPERIÊNCIA: Avaliação do estado quimérico
Interessados em demonstrar a hipótese de trabalho e confirmar os dados
obtidos nas duas experiências anteriores, decidimos avaliar o modelo de quimeras
de medula óssea
(WT/IFNγ
γγ
γR-KO)
através de uma experiência com um número
grande de quimeras WT/KO e WT/WT, usando camundongos C57BL/6 WT e IFNγR-
KO com “background” C57BL/6. Visto que o modelo experimental usado no segundo
experimento (infecção pelo T. cruzi da cepa Y) resultou em altas parasitemias que
poderiam influenciar o grau de invasão do coração dificultando a interpretação dos
resultados decidimos retomar nesta nova experiência o modelo de infecção com
parasitas da cepa Sylvio X10/4 usado no primeiro experimento.
Assim, foram infectados camundongos WT/KO, WT/WT, C57BL/6 e IFNγR-KO
em “background” C57BL/6 com 100.000 formas de T. cruzi da cepa Sylvio X10/4, via
i.p. em um volume de 300 µl de R.P.M.I. sem S.F.B. Com o interesse de impedir que
infecções secundárias, agravadas pela manipulação, afetassem os animais, eles
foram tratados com antibiótico por toda a experiência, começando um dia antes da
infecção.
Os grupos de quimeras WT/WT e WT/KO, foram construídos conforme foi
descrito no capítulo de materiais e métodos.
Os quatro grupos de animais foram estabelecidos assim:
- controles positivos: 3 animais C57BL/6 (WT);
- controles negativos: 5 animais IFNγR-KO em “background” C57BL/6 (KO);
- quimeras WT/WT: 15 animais C57BL/6, irradiados com 1200 rads e
reconstituídos via i.p. com 34 x 10
6
células da medula óssea obtidas de
camundongos C57BL/6, em 300 µl de RPMI 1640 sem S.F.B.;
- quimeras WT/IFNγR-KO (WT/KO): 18 animais IFNγR-KO, irradiados com
1200 rads e reconstituídos via i.p. com 34 x 10
6
células da medula óssea
obtidas de camundongos C57BL/6, em 300µl de RPMI 1640 sem S.F.B.
__________________________________________________________Cifuentes Muñoz, A.
72
Passadas 24 semanas após a irradiação/reconstituição foi realizado o teste de
avaliação do estado quimérico, descrito anteriormente no capítulo de materiais e
métodos.
A expectativa deste teste é que nos animais do grupo WT/KO, a maior parte
das células CD3
+
e B220
+
, expressem o receptor para IFNγ. Os animais dos grupos
WT e WT/WT deverão expressar o IFNγR quase na totalidade das populações
celulares B220
+
e CD3
+
, e nos animais do grupo KO a expressão deste receptor
deverá ser mínima ou nula.
0
20
40
60
80
100
WT/WT
B220
+
***
***
CD3
+
B220
+
CD3
+
B220
+
CD3
+
B220
+
CD3
+
WT/KO
WT
KO
WT/WT
B220
+
CD3
+
B220
+
CD3
+
B220
+
CD3
+
B220
+
CD3
+
WT/KO
WT
KO
WT/WT
B220
+
CD3
+
B220
+
CD3
+
B220
+
CD3
+
B220
+
CD3
+
WT/KO
WT
KO
% Células IFNgR
+
Figura 20. Análise da freqüência de células IFNγ
γγ
γR
+
nas populações de células
CD3
+
e B220
+
nos camundongos da 3ª experiência. Vinte quatro
semanas após a transferência de medula óssea foi analisada a
freqüência de células IFNγR
+
nas populações de células CD3
+
e B220
+
do sangue periférico, de animais WT/WT, WT/KO, WT e KO (3ª
experiência). *** p<0,001.
__________________________________________________________Cifuentes Muñoz, A.
73
Nos animais IFNγ-KO foi confirmada a baixa freqüência de expressão do
receptor de IFNγ nas populações de células CD3
+
e B220
+
, os grupos WT e WT/WT
mostraram uma alta expressão do IFNγR
+
para as duas populações. Se comparado
o grupo WT frente ao grupo de animais KO, encontramos uma diferença estatística
altamente significativa com p<0,001.
Nos animais do grupo WT/WT a expressão de IFNγR ficou por volta de 95%
nas duas populações (Figura 20), e não houve diferença estatística com o grupo
WT.
Já o grupo WT/KO (18 animais) foi altamente heterogêneo em relação à
freqüência de IFNγR com valores que oscilaram entre 73,9% e 3,5% para a
população de células CD3
+
e entre 76,7% e 1% para a população de células B220
+
.
Ao se compararem os grupos WT/WT e WT/KO para as duas populações celulares
(CD3
+
e B220
+
), pode se observar diferença estatística (p<0,001).
Em relação à reconstituição da população CD3
+
, no grupo WT/KO o 27,7% do
grupo (5 de 18 animais) mostrou mínimo grau de reconstituição, já que a fração de
células IFNγ-R positivas foi menor que 20%, contudo, o 72,2% do grupo (13 dos 18
animais), apresentou percentagens de reconstituição acima de 20%, porém, não
homogênea. (Figura 20). No caso da reconstituição de células B220
+
, o 66% (12 de
18 animais) do grupo mostrou freqüência de células IFNγR+ maior de 20%.
Neste experimento, não foi registrada uma expressão ligeiramente maior do
receptor para IFNγ nas células B220
+
do que nas células CD3
+
, como aconteceu nos
dois experimentos anteriores.
__________________________________________________________Cifuentes Muñoz, A.
74
0
25
50
75
100
KO WT WT/KO
Expressão de IFNγ
γγ
γR em células CD3
+
KO vs WT
KO vs WT/WT
KO vs WT/KO
WT vs WT/WT
WT vs WT/KO
WT/WT vs WT/KO
P < 0.001
P < 0.001
P < 0.001
P > 0.05
P < 0.001
P < 0.001
WT/WT
A
% Reconstituição
0
25
50
75
100
Expressão de IFNγ
γγ
γR em células B220
+
KO vs WT
KO vs WT/WT
KO vs WT/KO
WT vs WT/WT
WT vs WT/KO
WT/WT vs WT/KO
P < 0.001
P < 0.001
P < 0.05
P > 0.05
P < 0.001
P < 0.001
KO WT WT/KOWT/WT
B
% Reconstituição
Figura 21. Percentagem de reconstituição de células CD3
+
IFNγ
γγ
γR
+
e B220
+
IFNγ
γγ
γR
+
da 3ª experiência. Vinte quatro semanas após a transferência de
medula óssea foi analisada a percentagem de reconstituição, no sangue
de animais quiméricos e controles (3ª experiência). A. Expressão de
IFNγR
em células CD3
+
.
B. Expressão de IFNγR em células B220
+
.
O 50% dos animais do grupo WT/KO mostra percentagens de reconstituição
acima da média (36% e 30%) do grupo para as populações CD3
+
e B220
+
,
respectivamente (Figura 21).
Após a confirmação do estado quimérico do grupo WT/KO, os animais foram
infectados com 10
5
formas de tripomastigotas de cultura da cepa Sylvio X10/4 de T.
cruzi.
6.6 3ª EXPERIÊNCIA: Avaliação da infecção pelo T. cruzi
Os camundongos deste experimento foram infectados com 100.000 formas de
T. cruzi da cepa Sylvio X10/4, por via endovenosa (plexo oftálmico) em um volume
de 300 µl de RPMI 1640 sem S.F.B. Com a finalidade de evitar a morte precoce dos
camundongos por infecções secundárias, começamos tratamento com antibiótico
um dia antes da infecção e até o final do experimento.
__________________________________________________________Cifuentes Muñoz, A.
75
Curvas de parasitemia (3
a
Experiência)
18 20 22 24 26 28 30 32
0
4
8
KO
WT/WT
WT
WT/KO
20
50
80
5/18
11/18
15/18
12/12
5/5
3/5
Dias após infecção
Parasitas x 10
4
/ml
Figura 22. Análise comparativa da carga parasitaria em camundongos dos
grupos controle negativo (IFNγR-KO), controle positivo (C57BL/6),
quimera WT/WT e quimera WT/KO da 3ª experiência. Os animais
foram infectados com 10
5
tripomastigotas da cepa Sylvio X10/4 de T.
cruzi e as parasitemias analisadas em diferentes dias da infecção. Os
números na figura indicam o número de animais positivos do total de
animais do grupo. Existem diferenças estatísticas nos dias 25, 27, 29 e
31 p.i. entre WT/WT e WT/KO, p<0,05.
No dia 20 p.i., 60% (3 de 5 camundongos) do grupo controle negativo KO
positivaram, mostrando níveis baixos de parasitemia com média de 0,8 parasitas X
10
-4
/ml. No dia 23 p.i., todos os animais do grupo KO estavam positivos. Neste grupo
os níveis de parasitemia foram aumentando até alcançar o pico no dia 25 p.i. com
média: 8,2 parasitas X 10
-4
/ml (Figura 22). No dia 27 p.i., o mal estado de um dos
animais KO tornou necessário o sacrifício do grupo completo. Neste dia, as
parasitemias dos animais KO diminuíram e em 1 de 5 animais ela se tornou
negativa, em tal forma que a média de parasitas circulantes caiu para 2,6 parasitas
X 10
-4
/ml.
__________________________________________________________Cifuentes Muñoz, A.
76
No grupo quimera WT/KO, 27% dos animais (5 de 18) positivaram no dia 23 p.i.
(Média: 1,06 parasitas X 10
-4
/ml). No dia 29 p.i. todos os animais do grupo WT/KO
estavam positivos e o número de parasitas no sangue foi aumentando em todos os
animais até o dia do sacrifício. O sacrifico dos animais deste experimento foi
realizado aleatoriamente em três dias diferentes. Os dados individuais podem ser
observados na Tabela 3.
Nos animais dos grupos WT (03 animais) e WT/WT (15 animais), as
parasitemias nunca positivaram até o final do experimento e nenhum animal morreu
espontaneamente. Houve diferenças estatísticas entre WT/WT vs WT/KO, nos dias
27, 29 e 31 p.i. com p< 0,05.
Figura 23. Correlação entre o nível de reconstituição e número de parasitas
circulantes no sangue de animais WT/KO da 3ª experiência. O valor
da carga parasitária apresentado é a média dos valores de parasitemias
a partir do dia de positivação (dia 20 p.i.) até o primeiro dia do sacrifício
dos animais (dia 27 p.i.). A. Correlação respeito às células CD3
+
. B.
Correlação respeito às células B220
+
.
Cabe anotar que novamente, não foi observada uma correlação inversa entre o
nível de reconstituição das quimeras WT/KO e a parasitemia (Figura 23 A e B).
Assim, os 5 animais com índice de reconstituição menor de 20% e a maior parte dos
animais com reconstituição acima de 20% apresentaram baixos níveis de
A B
__________________________________________________________Cifuentes Muñoz, A.
77
parasitemia, enquanto que os 3 animais que apresentaram parasitemias maiores
tiveram índices de reconstituição entre 37 e 56% (Tabela 3).
A pesar de termos planejado realizar esta experiência com um número elevado
de animais tivemos uma perda acidental dos blocos de histologia de alguns dos
animas (identificados com asterisco na Tabela 3). Assim, a análise histopatológica
da 3ª experiência é mais reduzida que as análises de reconstituição e parasitemia.
__________________________________________________________Cifuentes Muñoz, A.
78
__________________________________________________________Cifuentes Muñoz, A.
79
__________________________________________________________Cifuentes Muñoz, A.
80
0
20
40
60
80
100
Dia 27 p.i. Dia 29 p.i.
** ***
A
Número de ninhos
0
1
2
3
4
Dia 27 p.i. Dia 29 p.i.
WT/KO
WT/WT
KO
B
Nível de miocardite
Figura 24. Analise comparativa do número de ninhos e infiltrados
inflamatórios presentes no coração dos animais da 3ª experiência.
Animais sacrificados nos dias 27 p.i. (grupo controle negativo KO, grupo
quimera WT/WT e grupo quimera WT/KO) e 29 p.i. (grupos quimera
WT/WT e quimera WT/KO). A. Número de ninhos no coração. B. Nível
de miocardite. Infecção com 10
5
tripomastigotas da cepa Sylvio 10X/4 de
T. cruzi. Intensidade do infiltrado: (0) nenhum infiltrado, (1) 1 - 10
infiltrados, (2) 11 - 20 infiltrados, (3) 21 - 30 infiltrados e (4) mais de 31
infiltrados. Existem diferenças estatísticas entre WT/WT e WT/KO,
respeito ao número de ninhos presentes no coração: dia 27 p.i. **p<
0,005; dia 29 p.i. ***p< 0,001.
O parasitismo cardíaco no grupo WT/KO, exibiu um número elevado de ninhos
no dia 27 p.i., que aumentaram no dia 29 p.i. (Figura 24 A), entretanto, houve
escassa presença de ninhos nas duas datas no grupo WT/WT, apresentando
diferenças estatísticas significativas entre os dois grupos, com p<0,005 e p< 0,001,
respectivamente, para cada data. As médias do número de ninhos presentes no
coração no dia 27 p.i. para os grupos WT/WT e WT/KO foram 2,2 e 54,1
__________________________________________________________Cifuentes Muñoz, A.
81
ninhos/corte histológico, respectivamente, e para o dia 29 p.i. foram 0,20 e 71,3
ninhos/corte histológico. A totalidade dos animais do grupo WT/KO mostrou
parasitismo cardíaco e o 50% apresentaram um número de ninhos maior à média
em cada uma das duas datas de sacrifício.
No grupo WT/WT só 50% (2 animais de 4) dos animais apresentaram ninhos
no coração, e em baixo número, no dia 27 p.i., (ver Tabela 3), e no dia 29 p.i., um
animal de 5 apresentou 1 ninho/corte histológico. No grupo KO o 60% dos animais
(3 de 5), mostraram número de ninhos acima da média (média: 40 ninhos/corte
histológico). Neste grupo, a análise do parasitismo cardíaco não mostrou diferença
em relação à do grupo WT/KO no dia 27 p.i.
Já em relação à presença de infiltrados, no dia 27 p.i., os animais do grupo KO
mostraram níveis homogêneos de infiltração leucocitária no coração, com média 2.
Nos animais do grupo WT/KO, os infiltrados no coração no dia 27 p.i. apresentaram
média 2 que aumentou para média 3 no dia 29 p.i. Não foram observadas diferenças
estatísticas na intensidade do infiltrado cardíaco entre os grupos KO e WT/KO no dia
27 p.i., assim como entre os grupos WT/KO e WT/WT nas duas datas (Figura 24 B).
Se compararmos entre si os animais do grupo WT/KO, observamos que não há
uma correlação direta absoluta entre carga parasitária cardíaca e parasitemia.
Assim, a tabela 3 mostra que nem sempre os animais com elevado número de
ninhos no coração apresentam os maiores valores de parasitemia, tanto no dia 27
p.i. como no dia 29 p.i. (isto sugere não serem totalmente análogos os controles dos
parasitismos cardíacos e sanguíneos).
O grupo KO apresentou parasitemias positivas e número elevado de ninhos no
coração, diferente do grupo WT/WT que mostrou alguns ninhos no coração, mas
não apresentou tripomastigotas no sangue.
__________________________________________________________Cifuentes Muñoz, A.
82
0 25 50 75 100
0
1
2
3
4
A
N°
°°
° de Ninhos
N° I. I. Miocardio
0 25 50 75 100
0
1
2
3
4
WT/WT
WT/KO
KO
B
N° de Ninhos
Figura 25. Análise comparativa entre número de ninhos e número de
infiltrados inflamatórios no coração dos animais da 3ª experiência.
Infecção com 10
5
tripomastigotas da cepa Sylvio 10X/4 de T. cruzi. A.
Animais sacrificados no dia 27 p.i., grupo KO (5 animais), WT/WT (4
animais) e WT/KO (6 animais). B. Animais sacrificados no dia 29 p.i.,
grupo WT/WT (5 animais) e WT/KO (6 animais). Intensidade do infiltrado:
(0) nenhum infiltrado, (1) 1 - 10 infiltrados, (2) 11 - 20 infiltrados, (3) 21 -
30 infiltrados e (4) mais de 31 infiltrados.
Ao correlacionar o número de infiltrados inflamatórios e o número de ninhos
presentes no coração dos animais sacrificados no dia 27 p.i. (Figura 25 A) se
observa que 60% do grupo KO (3 de 5 animais) apresenta um considerável número
de infiltrados inflamatórios (acima de nível 3) e igualmente de ninhos. No grupo
WT/KO, observamos similarmente uma resposta inflamatória alta (por volta de três)
e número elevado de ninhos que variam entre 16 a 100. No grupo WTWT,
entretanto, 50% do grupo apresenta uma forte resposta inflamatória com baixo
número de ninhos. No dia 29 p.i. (Figura 25 B), as diferenças entre WT/WT e WT/KO
são ainda mais nítidas. Assim, os animais do grupo WT/WT se caracterizam por
mostrar alto número de infiltrados (80% do grupo apresentou infiltrados acima do
nível 3) com escasso número de ninhos, enquanto que no grupo WT/KO se observa
que tanto a resposta inflamatória como o número de ninhos aumentaram em relação
ao dia 27 p.i., com 66% do grupo mostrando nível 4 de inflamação e número de
ninhos acima de 100.
__________________________________________________________Cifuentes Muñoz, A.
83
0
1
2
3
4
Dia 29 p.i.Dia 27 p.i.
A
Número de ninhos
0
1
2
3
4
***
**
Dia 29 p.i.Dia 27 p.i.
WT/WT
WT/KO
KO
B
Nível de hepatite
Figura 26. Análise comparativa do número de ninhos e infiltrados
inflamatórios presentes no fígado dos animais da 3ª experiência.
Animais sacrificados nos dias 27 p.i., grupo KO (5 animais), WT/WT (4
animais) e WT/KO (6 animais). Animais sacrificados no dia 29 p.i., grupo
WT/WT (5 animais) e WT/KO (6 animais). Intensidade do infiltrado: (0)
nenhum infiltrado, (1) 1 - 10 infiltrados, (2) 11 - 20 infiltrados, (3) 21 - 30
infiltrados e (4) mais de 31 infiltrados. A. Número de ninhos no fígado.
Não houve diferenças estatísticas entre WT/WT vs WT/KO. B. Nível de
hepatite. Há diferenças estatísticas entre WT/WT vs WT/KO, nos dias 27
e 29 p.i. respectivamente. *** p< 0,0001. **p< 0,005.
No fígado, observamos que, nas datas analisadas, a carga parasitária foi
baixa nos grupos KO e WT/KO e ausente no grupo WT/WT. No dia 27 p.i., o 40% (2
de 5) dos animais do grupo KO e 16% (1 de 6, com 2 ninhos/corte histológico) dos
animais do grupo WT/KO apresentaram ninhos. No dia 29 p.i. nenhum dos grupos
exibiu carga parasitária no fígado (Figura 26 A). Diferenças estatísticas não foram
observadas.
__________________________________________________________Cifuentes Muñoz, A.
84
Em relação ao grau de infiltração leucocitária no fígado, notamos que, no dia
27 p.i., 100% dos animais do grupo KO mostraram nível 3 de infiltração leucocitária
(Figura 26 B). Por outro lado, os animais do grupo WT/KO mostraram nível de
infiltração leucocitária com média de 3 no dia 27 p.i., que se mantém no dia 29 p.i.
Já o grupo WT/WT apresenta um menor e decrescente grau de infiltração
inflamatória com média de 1,75 e 1,25 nos dias 27 e 29 p.i., respectivamente,
significativamente diferentes aos do grupo WT/KO.
0
5
10
15
20
Dia 29 p.i.Dia 27 p.i.
A
Número de ninhos
0
1
2
3
4
Dia 29 p.i.Dia 27 p.i.
KO
WT/WT
WT/KO
B
Nível de Miosite
Figura 27. Análise comparativa do número de ninhos e infiltrada inflamatórios
presentes no músculo estriado esquelético nos animais da 3ª
experiência. Animais sacrificados no dia 27 p.i., grupo KO (5 animais),
WT/WT (4 animais) e WT/KO (6 animais). Animais sacrificados no dia 29
p.i., grupo WT/WT (5 animais) e WT/KO (6 animais). Infecção com 10
5
tripomastigotas da cepa Sylvio X10/4 de T. cruzi. A. Número de ninhos
no músculo: não existem diferenças estatísticas entre WT/WT vs WT/KO
no dia 27 p.i., mas no dia 29 p.i. observa-se uma tendência (p= 0,07). B.
Nível de miosite. Intensidade do infiltrado: (0) nenhum infiltrado, (1) 1 -
10 infiltrados, (2) 11 - 20 infiltrados, (3) 21 - 30 infiltrados e (4) mais de
31 infiltrados. Não existem diferenças estatísticas entre WT/WT vs
WT/KO.
__________________________________________________________Cifuentes Muñoz, A.
85
Respeito à presença de ninhos no músculo (Figura 27 A), observamos que no
dia 27 p.i. 80% dos animais do grupo KO foram positivos (média: 1,80 ninhos/corte
histológico). No grupo WT/WT só 25% do grupo (um animal de 4) apresentou um
ninho (média 0,25 ninhos/corte histológico), e no grupo WT/KO evidenciaram-se
ninhos em 33% (2 de 6 animais) dos animais do grupo (média 0,83 ninhos/corte
histológico). No dia 29 p.i., somente 1 dos 5 animais WT/WT apresentou ninhos que,
no entanto, foram observados na totalidade dos animais WT/KO. Assim, observou-
se uma tendência dos animais WT/KO terem maior carga parasitária no quadríceps
que os animais WT/WT.
De outro lado, observamos que todos os grupos apresentaram certo grau de
miosite (Figura 27 B), sem diferenças estatísticas significativas. A miosite aumentou
levemente do dia 27 p.i. para o dia 29 p.i. nos grupos WT/WT e WT/KO. As médias
no dia 27 p.i. foram 2,05, 1,81 e 1,88, para os grupos KO, WT/WT e WT/KO
respectivamente. No dia 29, as médias foram 2,45 e 2,48 para os grupos WT/WT e
WT/KO, respectivamente.
Na análise histopatológica da 3ª experiência (mostrada acima) foram incluídos
todos os animais. No entanto, como tivemos vários animais com reconstituição
inferior a 10%, realizamos uma segunda análise na qual foram excluídos os animais
com baixa reconstituição (ver anexo A e B). Nesta nova análise as conclussões e
significância estatística foram idênticas às obtidas na primeira análise (ver anexo C).
6.7 4ª EXPERIÊNCIA: Avaliação do estado quimérico
De acordo como foi exposto no capítulo de materiais e métodos, quimeras
WT/WT e WT/KO foram estabelecidas. Quatro grupos de animais foram formados:
- controles positivos: 3 animais C57Bl/6 (WT);
- controles negativos: 3 animais IFNγR-KO em “background”
C57BL/6(KO);
__________________________________________________________Cifuentes Muñoz, A.
86
- quimeras WT/WT (WT/WT): 4 animais C57BL/6 irradiados com 1200 rads
e reconstituídos via i.p. com 34 X10
6
células da medula óssea obtidas de
camundongos C57BL/6, em 300 µl de RPMI 1640 sem S.F.B.;
- quimeras WT/IFNγR-KO (WT/KO): 10 animais IFNγR-KO irradiados com
1200 rads e reconstituídos via i.p. com 34 X10
6
de células da medula
óssea obtida de camundongos C57BL/6, em 300 µl de RPMI 1640 sem
S.F.B.
Oito semanas após a irradiação/reconstituição, foi realizado o teste de
avaliação do estado quimérico, conforme foi descrito no capítulo de materiais e
métodos.
0
20
40
60
80
100
WT/WT
B220
+
B220
+
CD3
+
B220
+
WT/KO
KO
CD3
+
CD3
+
B220
+
CD3
+
WT/WT
B220
+
B220
+
CD3
+
B220
+
WT/KO
KO
CD3
+
CD3
+
B220
+
CD3
+
WTWT
***
% Células IFN
γ
γ
γ
γ
R
+
Figura 28. Análise da freqüência de células IFNγ
γγ
γR
+
nas populações de células
CD3
+
e B220
+
nos camundongos da 4ª experiência. Oito semanas
após a transferência de medula óssea foi analisada a freqüência de
células IFNγR
+
nas populações de células CD3
+
e B220
+
do sangue
periférico, em animais quiméricos e controles. *** p<0,001.
Inicialmente os grupos WT/WT e WT/KO foram constituídos por um número
muito maior de animais, mas, devido a um problema técnico apresentado com o
equipamento de irradiação do ICB, devimos realizar a irradiação no IPEN. Esta
__________________________________________________________Cifuentes Muñoz, A.
87
irradiação provocou a morte de grande parte dos animais do grupo WT/WT e de
alguns animais WT/KO, reduzindo assim o grupo experimental.
Na avaliação do estado quimérico, descrita anteriormente no capítulo de
materiais e métodos, realizada às oito semanas após a irradiação/ reconstituição,
observamos como esperado, que o grupo KO apresenta baixa freqüência de células
CD3
+
IFNγR
+
e células B220
+
IFNγR
+
(Figura 28). Distintamente, os animais dos
grupos controle WT e quimera WT/WT, indicaram uma elevada expressão do IFNγR
+
para as populações CD3
+
e B220
+
.
A reconstituição no grupo quimera WT/KO (10 animais) foi bastante
homogênea, pois a freqüência de células CD3
+
IFNγR
+
oscilou entre 81% e 51% e
para a população de células B220
+
IFNγR oscilou entre 95% e 74%.
Diferenças estatísticas foram observadas entre o grupo de animais WT
comparado frente ao grupo de animais KO com p<0,001 e entre o grupo de animais
WT/WT e WT/KO com p<0,001, neste último casso, foi observado só respeito à
freqüência de células CD3
+
IFNγR
+
(Figuras 28 e 29).
0
25
50
75
100
KO WT/KOWT/WT
% Expressão de IFNγ
γγ
γR em células CD3
+
***
A
WT
% Reconstituição
0
25
50
75
100
% Expressão de IFNγ
γγ
γR em células B220
+
ns
KO WT/KOWT/WTWT
B
% Reconstituição
Figura 29. Percentagem de reconstituição de células CD3
+
IFNγ
γγ
γR
+
e B220
+
IFNγ
γγ
γR
+
da 4ª experiência. Oito semanas após a transferência de
medula óssea, foi analisada a percentagem de reconstituição, no
sangue de animais quiméricos e controles. A. Expressão de IFNγR
em
células CD3
+
.
B. Expressão de IFNγR em células B220
+
.
A população de células CD3
+
apontou uma média de freqüência de expressão
do IFNγR de 67% e de 89% para a população B220
+
.
__________________________________________________________Cifuentes Muñoz, A.
88
A expressão de IFNγR no grupo WT/WT esteve acima de 95% para as duas
populações (Figura 29), e não houve diferença estatística com o grupo WT.
Os valores de reconstituição no grupo WT/KO são homogêneos para as duas
populações linfócitárias, e nenhum animal se mostrou abaixo de 20% de
reconstituição. Assim como aconteceu na 1ª e 2ª experiência e distintamente da 3ª
experiência, a expressão de IFNγR nas células B220
+
dos animais WT/KO foi maior
do que nas células CD3
+
(Figuras 28 e 29).
Posteriormente à confirmação do estado quimérico dos animais WT/KO, foi
realizada a infecção com tripomastigotas de cultura da cepa Sylvio X10/4 de T. cruzi.
6.8 4ª EXPERIÊNCIA: Avaliação da infecção pelo T. cruzi
Depois de avaliar a eficiência da reconstituição, camundongos WT/KO,
WT/WT, C57BL/6 e IFNγR-KO em “background” C57BL/6 foram infectados com
100.000 formas de T. cruzi da cepa Sylvio X10/4, via endovenosa (plexo oftálmico)
em um volume de 300 µl de R.P.M.I. sem S.F.B.
Os animais foram tratados com antibiótico como descrito no capítulo de
matérias e métodos, evitando assim infecções secundárias que poderiam se agravar
com a manipulação durante a realização da experiência.
__________________________________________________________Cifuentes Muñoz, A.
89
Curvas de parasitemia
(4
a
Experiência)
5 10 15 20 25 30 35
0
5
KO
WT/WT
WT
9/10
2/3
WT/KO
15
40
65
3/3
8/10
9/10
Dias após infecção
Parasitas x 10
4
/ml
Figura 30. Análise comparativa da carga parasitaria em camundongos dos
grupos controle negativo (IFNγR-KO), controle positivo (C57BL/6),
quimera WT/WT e quimera WT/KO da 4ª experiência. Os animais
foram infectados com 10
5
tripomastigotas da cepa Sylvio X10/4 de T.
cruzi e as parasitemias analisadas em diferentes dias da infecção. Os
números na figura indicam o número de animais positivos do total de
animais do grupo. Existem diferenças estatísticas entre KO vs WT/KO e
entre WT/WT vs WT/KO. p<0,05.
As parasitemias do grupo WT/KO positivaram o dia 23 p.i. Em 80 % do grupo
(8 de 10 animais), e foram aumentando até o final da experiência. Para a primeira
data de sacrifício, dia 29 p.i. a média foi 5,5 parasitas X 10
-4
e para a segunda data
de sacrifício (dia 32 p.i.) a média foi 7,5 parasitas X 10
-4
. Um animal nunca positivou
até o final da experiência (Figura 30). Um dos animais deste grupo, apesar de
apresentar parasitemia positiva (dia 29 p.i., 7 parasitas X 10
-4
), se mostrou negativo
o dia 31 p.i., voltando a mostrar o mesmo número de parasitas no sangue no dia
seguinte (32 p.i.) (ver Tabela 4).
Nos animais do grupo controle KO, as parasitemias positivaram o dia 12 p.i. (2
animais de 3), com média: 1 parasita X 10
-4
, e todos os animais estavam positivos
no dia 14 com média: 1,67 parasitas X 10
-4
. A análise individual (Tabela 4) mostrou
que a parasitemia dos animais deste grupo apresenta uma curva ondulante, com
dois ou três picos marcados, que não são, entretanto perceptíveis quando
__________________________________________________________Cifuentes Muñoz, A.
90
observamos a média do grupo. Os animais KO foram sacrificados o dia 29 p.i.,com
média: 22,3 parasitas X10
-4
(Figura 30). O perfil ondulante da curva de parasitemia
pode ser também intuído (com intensidade muito menor do que no grupo KO) em
alguns dos animais do grupo WT/KO.
Nos grupos WT e WT/WT o 100% dos animais jamais positivaram durante toda
a experiência.
Diferenças estatísticas foram encontradas entre os grupos KO vs WT/KO, nos
dias 12, 14, 15, 23, 25, 27 e 29 p.i., (p<0,05) e entre os grupos WT/WT vs WT/KO
nos dias 25, 27, 29, 31 e 32 p.i., (p<0,05).
__________________________________________________________Cifuentes Muñoz, A.
91
Figura 31. Correlação entre o nível de reconstituição e número de parasitas
circulantes no sangue dos animais WT/KO da 4ª experiência. O valor
da carga parasitária apresentado é a média dos valores de parasitemias
a partir do dia de positivação (dia 12 p.i.) ate o primeiro dia do sacrifício
dos animais (dia 29 p.i.). A. Correlação respeito às células CD3
+
. B.
Correlação respeito às células B220
+
.
Ao correlacionar a percentagem de expressão de IFNγR nas células CD3
+
e
B220
+
, se observa que tomando o conjunto dos animais dos quatro grupos há
correlação inversa entre a percentagem da expressão do receptor para o IFNγ e os
níveis de parasitemia (Figura 31 A). No entanto, quando a análise se restringe aos
animais do grupo WT/KO não parece existir uma forte correlação entre a intensidade
da reconstituição e a parasitemia (Figura 31 B).
A
B
__________________________________________________________Cifuentes Muñoz, A.
92
0
20
40
60
80
100
Dia 29 p.i. Dia 32 p.i.
** A
Número de ninhos
0
1
2
3
4
Dia 29 p.i. Dia 32 p.i.
B
KO
WT/KO
WT/WT
WT
***
Nível de miocardite
Figura 32. Analise comparativa do número de ninhos e infiltrados
inflamatórios presentes no coração dos animais da 4ª experiência.
Animais sacrificados nos dias 29 p.i. (grupo controle negativo KO, grupo
quimera WT/WT e grupo quimera WT/KO) e 32 p.i. (grupos quimera
WT/WT e quimera WT/KO). A. Número de ninhos no coração. B. Nível
de miocardite. Infecção com 10
5
tripomastigotas da cepa Sylvio 10X/4 de
T. cruzi. Intensidade do infiltrado: (0) nenhum infiltrado, (1) 1 - 10
infiltrados, (2) 11 - 20 infiltrados, (3) 21 - 30 infiltrados e (4) mais de 31
infiltrados. Existem diferenças estatísticas entre WT/WT e WT/KO,
respeito ao número de infiltrados e ninhos presentes no coração. Dia 32
p.i. ***p< 0,005.
Os animais dos grupos KO (dia 29 p.i.) e WT/KO (dias 29 e 32 p.i.) revelaram a
presença de elevado número de ninhos no tecido cardíaco; contudo, na media o
parasitismo cardíaco do grupo WT/KO no dia 29 p.i. (média: 74 ninhos/corte
histológico) foi similar ao do que o grupo KO (87,7 ninhos/corte histológico). No dia
32 p.i., o número de ninhos no grupo WT/KO sofreu um aumento em relação ao
observado no dia 29 p.i.
__________________________________________________________Cifuentes Muñoz, A.
93
O 100% dos animais do grupo WT/KO mostrou parasitismo cardíaco e no dia
32 p.i., 66% (4 de 6 animais) deste grupo tiveram um número de ninhos superior a
100 ninhos/corte histológico. Embora a parasitemia fosse mais elevada do grupo KO
do que no grupo WT/KO, no coração as diferenças na carga parasitária destes dois
grupos não foram tão marcadas (Tabela 4).
Distintamente, o parasitismo cardíaco nos grupos WT e WT/WT se caracterizou
pela ausência de ninhos nas duas datas de sacrifício, na totalidade dos animais.
Diferenças estatísticas significativas foram observadas no dia 32 p.i., se comparados
o grupo WT/WT e o grupo WT/KO, com p<0,005.
Em relação à presença de infiltrados no coração no dia 29 p.i. (Figura 32 B),
uma alta infiltração leucocitária foi observada no grupo KO (média: 3,8), assim como
no grupo WT/KO (média: 3,3). Já no dia 32 p.i., o número de infiltrados no grupo
WT/KO aumentou discretamente apresentando média de 3,6. Para este mesmo dia,
os animais dos grupos WT e WT/WT apresentaram infiltração leucocitária menos
intensa com média de 2,5 e 1,8 para cada grupo de animais respectivamente.
Diferenças estatísticas foram observadas entre os grupos WT/WT vs WTKO, com
p<0,005.
0
5
10
15
20
25
95 10530 60
N°
°°
° de ninhos
Parasitas x 10
4
/ml
Figura 33. Correlação entre parasitemias e número de ninhos presentes no
coração dos animais da 4ª experiência. Infecção com 10
5
tripomastigotas da cepa Sylvio 10X/4 de T. cruzi. A. Animais sacrificados
no dia 27 p.i., (4 animais) e no dia 29 p.i (6 animais), do grupo WT/KO.
Os valores das parasitemias foram promediadas a partir do dia em que
cada animal se positivou e até o dia do sacrifício.
__________________________________________________________Cifuentes Muñoz, A.
94
Correlacionando os parâmetros de carga parasitária sistêmica e local,
observamos que nos animais do grupo WT/KO não há uma correlação direta entre o
nível de parasitemia e o número de ninhos no coração (Figura 33).
0 25 50 75 100
0
1
2
3
4
A
N° de Ninhos
Dia 29 p.i.
N° I. I. Miocardio
0 50 100
0
1
2
3
4
WT
WT/KO
KO
B
WT/WT
N° de Ninhos
Dia 32 p.i.
Figura 34. Análise comparativa entre número de ninhos e número de
infiltrados inflamatórios no coração dos animais da 4ª experiência.
Infecção com 10
5
tripomastigotas da cepa Sylvio 10X/4 de T. cruzi. A.
Animais sacrificados no dia 29 p.i., grupo KO (3 animais) e WT/KO (4
animais). B. Animais sacrificados no dia 32 p.i., grupo WT (3 animais),
WT/WT (4 animais) e WT/KO (6 animais). Intensidade do infiltrado: (0)
nenhum infiltrado, (1) 1 - 10 infiltrados, (2) 11 - 20 infiltrados, (3) 21 - 30
infiltrados e (4) mais de 31 infiltrados.
No grupo WT/KO se observa um elevado número de ninhos acompanhado de
um considerável número de infiltrados inflamatórios, nas duas datas de sacrifício.
Este evento pode ser notado também no grupo KO, no dia 29 p.i. Distintamente, no
dia 32 p.i., os grupos WT e WTWT se apresentam com ausência de ninhos e uma
resposta inflamatória que apesar de clara é inferior à dos animais WT/KO (Figura
34).
__________________________________________________________Cifuentes Muñoz, A.
95
0
1
2
3
4
5
Dia 29 p.i. Dia 32 p.i.
A
Número de ninhos
0
1
2
3
4
Dia 29 p.i. Dia 32 p.i.
B
KO
WT/KO
WT/WT
WT
******
**
Nível de hepatite
Figura 35. Análise comparativa do número de ninhos e infiltrados
inflamatórios presentes no fígado dos animais da 4ª experiência.
Animais sacrificados no dia 29 p.i., grupo KO (3 animais) e WT/KO (4
animais) e no dia 32 p.i., grupo WT (3 animais), grupo WT/WT (4
animais) e WT/KO (6 animais). Intensidade do infiltrado: (0) nenhum
infiltrado, (1) 1 - 10 infiltrados, (2) 11 - 20 infiltrados, (3) 21 - 30 infiltrados
e (4) mais de 31 infiltrados. A. Número de ninhos no fígado. Não houve
diferenças estatísticas entre WT/WT vs WT/KO. B. Nível de hepatite. Há
diferenças estatísticas entre KO e WT/KO e WT/WT vs WT/KO, nos dias
29 e 32 p.i. respectivamente. ** p< 0,001.
Nas duas datas de sacrifício, não se evidenciaram ninhos no fígado em
nenhum dos grupos (Figura 35 A).
Em relação ao grau de infiltração leucocitária no fígado, observamos que o
fígado foi um dos órgãos mais afetados da experiência 4. No grupo KO, o 100% dos
animais mostraram infiltração leucocitária acima do nível 3 (média: 3,5) no dia 9 p.i.
Já os animais do grupo WT/KO mostraram nesta data um nível menor (média: 2,6)
__________________________________________________________Cifuentes Muñoz, A.
96
(Figura 35 B). No dia 32 p.i., a inflamação hepática aumentou nos animais do grupo
WT/KO (média: 3,8), atingindo níveis muito superiores aos dos animais dos grupos
WT/WT (média: 1,9) e WT (média: 1).
0
10
20
30
Dia 29 p.i. Dia 32 p.i.
A
Número de ninhos
0
1
2
3
4
Dia 29 p.i. Dia 32 p.i.
B
KO
WT/KO
WT/WT
WT
**
Nível de miosite
Figura 36. Análise comparativa do número de ninhos e infiltrados
inflamatórios presentes no músculo estriado esquelético nos
animais da 4ª experiência. Animais sacrificados no dia 29 p.i., grupo
KO (3 animais), WT/KO (4 animais) e no dia 32 p.i., grupo WT (3
animais), grupo WT/WT (4 animais) e WT/KO (6 animais). Infecção com
10
5
tripomastigotas da cepa Sylvio X10/4 de T. cruzi. A. Número de
ninhos no músculo: no dia 32 p.i., observa-se uma tendência (p= 0,07);
B. Nível de miosite. Intensidade do infiltrado: (0) nenhum infiltrado, (1) 1 -
10 infiltrados, (2) 11 - 20 infiltrados, (3) 21 - 30 infiltrados e (4) mais de
31 infiltrados. Dia 29 p.i., existe diferença estatística entre KO vs WT/KO,
p<0,005.
No músculo esquelético, no dia 29 p.i., a presença de ninhos foi evidenciada
em 66% dos animais do grupo KO (média: 6,7 ninhos/corte histológico) e em
__________________________________________________________Cifuentes Muñoz, A.
97
nenhum dos animais do grupo WT/KO (Figura 36 A). As diferenças entre estes
grupos não foram significativas, mas observou-se uma tendência (p= 0,079). No dia
32 p.i., observou-se carga parasitária positiva no músculo de 66% dos animais do
grupo WT/KO (4 de 6 animais, com média: 5,5 ninhos/corte histológico), mas em
nenhum dos animais WT/WT e WT. As diferenças não foram significativas, mas o
grupo WT/KO exibiu uma tendência a mostrar maior número de ninhos que o grupo
WT/WT com p= 0,076.
Em relação ao infiltrado inflamatório apresentado no dia 29 p.i., notamos que o
grupo KO apresentou altos níveis de miosite, com média de 3,7, e o grupo WT/KO
mostrou níveis menores (média de 2,3), com diferenças significativas entre os
grupos (p<0,005). No dia 32 p.i., os grupos WT e WT/WT mostraram níveis de
miosite próximos, com médias de 2,3 e 2,4, respectivamente. Já no grupo WT/KO, a
infiltração leucocitária aumentou em relação ao dia 29 p.i., exibindo uma média de
3,2. Neste grupo o 100% dos animais exibiram infiltração, e 83% dos animais
apresentaram valores dentro da média de infiltração leucocitária para o grupo.
Contudo, não houve diferença estatística do grupo WT/KO frente ao grupo WT/WT.
__________________________________________________________Cifuentes Muñoz, A.
98
__________________________________________________________Cifuentes Muñoz, A.
99
Figura 37 Patologia cardíaca (aurícula). A. corte histológico da aurícula de
camundongo KO (40x); note-se a presença de pericardite, ninhos e
infiltrados inflamatórios. B. corte histológico da aurícula de camundongo
WT/KO, (40x). Note-se a presença de ninhos acompanhados de
infiltrados inflamatórios.
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100
Figura 38 Patologia cardíaca (aurícula). A. corte histológico da aurícula de
camundongo WT/KO (20x); note-se a presença de pericardite, alto
número de ninhos e infiltrados inflamatórios. B. corte histológico da
aurícula de camundongo WT/WT (20x); note-se a presença de escassa
pericardite, ausência de ninhos e escassos infiltrados inflamatórios.
__________________________________________________________Cifuentes Muñoz, A.
101
Figura 39. Patologia cardíaca: Corte histológico do ventrículo de camundongo
WT/KO, (20x). No inserto, ninhos e infiltrados inflamatórios.
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102
Figura 40. Patologia hepática. A-B. Corte histológico do fígado de um
camundongo WT/WT sem infiltrados inflamatórios (A: 10x; B: 20x) C-D.
Corte histológico do fígado de camundongo WT/KO com infiltrados
inflamatórios, (C: 10x; D: 20x).
__________________________________________________________Cifuentes Muñoz, A.
103
Figura 41. Patologia da musculatura esquelética estriada. Corte histológico do
quadríceps de camundongo WT/KO com ninho e infiltrado inflamatório.
40X.
Quadros resumo das diferenças estatísticas entre WT/KO e WT/WT ou entre WT/KO
e KO podem ser consultados nas Tabelas 5 e 6.
__________________________________________________________Cifuentes Muñoz, A.
104
__________________________________________________________Cifuentes Muñoz, A.
105
__________________________________________________________Cifuentes Muñoz, A.
106
7 DISCUSSÃO
__________________________________________________________Cifuentes Muñoz, A.
107
Apesar de conhecermos com bastante detalhe a participação dos diferentes
elementos do sistema imune no controle do T. cruzi (BRENER e GAZZINELLI, 1997;
MINOPRIO e JOSKOWICZ, 1991) desconhecemos qual o papel das células não
leucocitárias. Uma vez que o IFNγ é uma das citocinas mais importantes no controle
do T. cruzi, operando através de um amplo leque de ações efetoras, temos
analisado se esta citocina estimula as células não leucocitárias a exercer direta ou
indiretamente um papel efetor sobre o parasita.
Com este objetivo, no presente projeto temos avaliado se o modelo
experimental de quimeras de medula óssea é adequado para analisar o papel do
IFNγ sobre as populações não leucocitárias. Camundongos IFNγR-KO em fundo
C57BL/6 foram irradiados e reconstituídos com medula óssea de camundongos
C57BL/6. A escolha do “background” C567BL/6 foi motivada pela nossa
necessidade de trabalharmos com uma linhagem resistente ao T. cruzi. Quimeras
WT/WT foram estabelecidas como controle. Após confirmação do quimerismo, os
animais foram infectados pelo T. cruzi das cepas Sylvio X10/4 ou Y.
Excetuando a quarta experiência na qual tivemos valores homogêneos de
reconstituição, as três primeiras experiências exibiram níveis muito dispares de
reconstituição para as células T e B. Na primeira experiência os animais com baixa
reconstituição mostraram comportamento análogo aos KOs e foram excluídos. Nas
experiências 2 e 3, entretanto, mantivemos os animais com taxa de reconstituição
inferior a 20%, e isto não alterou as conclusões obtidas. No seu conjunto, 5 animais
com reconstituição abaixo (ou próxima a 20%) foram mantidos na avaliação (1 na
experiência 2, e 4 na experiência 3). Desconhecemos o porquê da disparidade na
reconstituição entre animais de uma mesma experiência, mas cabe a possibilidade
de existir algum erro na calibração do irradiador do ICB, que foi a maquina utilizada
para obter das quimeras das 3 primeiras experiências.
Em três das quatro experiências chama a atenção que a percentagem de
reconstituição por células IFNγR
+
foi discretamente maior nas células B do que nas
células T. Consideramos isto seja um artefato, uma vez que a maior freqüência de
células B IFNγR
+
foi também observada nos controles negativos KO. Enquanto que
um falso positivo poderia resultar da ligação não específica do anticorpo anti-IFNγR
__________________________________________________________Cifuentes Muñoz, A.
108
aos receptores FcγRIIb expressos pelas células B, estudos em humanos têm
mostrado que após transplante de medula óssea, a reconstituição acontece mais
cedo nas células B e células CD8
+
do que nas células CD4
+
(GEDDES, 2007;
ISAACS et al., 2004).
Os resultados das parasitemias indicam que os animais WT/KO são mais
susceptíveis ao T. cruzi do que os animais WT/WT, e mais resistentes do que os
animais KO. Isto foi visivelmente evidenciado na 2ª, 3ª e 4ª experiência e mostrou-se
como uma tendência na primeira. Mais ainda, o maior parasitismo tissular no
coração, fígado e no músculo esquelético dos animais WT/KO constitui uma prova
adicional da maior susceptibilidade destes animais. A maior susceptibilidade ao T.
cruzi dos animais WT/KO indica que o IFNγ sinaliza as células não leucocitárias a
promover direta ou indiretamente o controle do parasita. Acreditamos que a maior
susceptibilidade dos animais WT/KO não seja o resultado da uma reconstituição
incompleta. Esta afirmação tem como base a ausência de uma correlação inversa
entre o grau de reconstituição e a parasitemia / parasitismo tissular dos diferentes
animais. Acreditamos que garantido um nível basal de reconstituição, o animal
WT/KO se comporte em forma semelhante, independentemente da reconstituição ter
sido completa ou não. Isto é ilustrado claramente na primeira experiência, na qual o
animal com maior reconstituição exibe os níveis mais elevados de parasitemia e
parasitismo tissular do grupo WT/KO. Mais ainda, na experiência 2, o único animal
com reconstituição baixa (17% de reconstituição nas células CD3
+
) mostra o menor
parasitismo tissular. Na quarta experiência os valores de R
2
da curva de regressão
mostram valores muito baixos, pouco ou nada sugestivos de uma correlação entre
reconstituição e parasitemia. Contudo, como citado acima, os três animais WT/KO
da primeira experiência que foram excluídos da análise em função da sua baixa
reconstituição (<5%; ver Figura 1), se comportaram, após infecção, como animais
KO (dados não mostrados). De qualquer forma, no conjunto, os resultados indicam
que o aumento de susceptibilidade ao T. cruzi das quimeras WT/KO (em relação às
quimeras WT/WT) não é devido a uma reconstituição leucocitária incompleta. Em
conseqüência, os resultados validam a abordagem experimental de quimeras
WT/KO e confirmam a nossa hipótese da ação do IFNγ sobre as células não
leucocitárias.
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109
Além de um maior parasitismo sistêmico e tissular, os animais WT/KO
apresentam infiltrados inflamatórios no coração, fígado e músculo esquelético. A
análise das eventuais diferenças na intensidade dos infiltrados entre os animais
WT/KO e WT/WT é um assunto complexo. A principio consideramos seja difícil
obtermos conclusões precisas a este respeito, em parte porque na infiltração
leucocitária depende da produção local de quimiocinas, processo ao qual contribuem
diversos elementos, como complemento, macrófagos tissulares e células estruturais
que são ativados pela interação com o parasita/moléculas do parasita. Mais ainda,
após o recrutamento dos primeiros leucócitos, estes se somam aos elementos
residentes na sua capacidade de produção de quimiocinas. Neste contexto
altamente complexo, o IFNγ pode potenciar a produção de quimiocinas por alguns
dos elementos leucocitários e não leucocitários. Por outro lado, a produção de
quimiocinas também é diretamente influenciada pelo tamanho da carga parasitária
local e não podemos esquecer que esta está aumentada nos camundongos WT/KO
(em relação aos camundongos WT/WT).
Para facilitar a análise dos resultados de infiltração leucocitária discutiremos
separadamente os resultados para cada órgão. No coração, os animais WT/KO
mostraram (em relação aos animais WT/WT) níveis semelhantes de infiltração e
carga parasitária na 1ª exp., níveis inferiores de infiltrado (apesar da maior carga
parasitária) na 2ª exp., níveis semelhantes de infiltrado (apesar da maior carga
parasitária) na 3ª exp. e níveis superiores de infiltração e carga parasitária na 4ª exp.
No seu conjunto estes resultados são compatíveis com uma tendência dos animais
WT/KO a exibirem no coração uma resposta inflamatória discretamente inferior à dos
animais WT/WT frente à mesma carga parasitária. No músculo esquelético, os
resultados e conclusões são semelhantes às do coração. Assim, os animais WT/KO
mostram menor infiltrado no músculo esquelético que os WT/WT (apesar de
exibirem a mesma carga parasitária) na 1ª experiência, ausência de ninhos e de
infiltrados na 2ª experiência, níveis semelhantes de infiltrado (apesar da maior carga
parasitária) na 3ª experiência, e uma tendência a exibirem maior infiltração e carga
parasitária na 4ª experiência.
Já em relação ao fígado, resulta mais difícil especular se os animais WT/KO
mostram tendência a exibir menor infiltrado do que os animais WT/WT frente à
__________________________________________________________Cifuentes Muñoz, A.
110
mesma carga parasitária local. Acreditamos que esta limitação deva-se em parte ao
fato da colonização e resposta inflamatória hepática ter se iniciado muito antes à
data de sacrifício dos animais. Estudos anteriores de nosso laboratório têm
mostrado que o fígado se afeta muito cedo na infecção pelo T. cruzi. Assim, aos 5
dias de infecção de camundongos C57BL/6 por parasitas Sylvio X10/4 já
observamos inflamação hepática intensa com presença de ninhos, enquanto que
neste momento não existe o menor indicio de colonização pelo parasita, ou de
resposta inflamatória a este, no coração ou músculo estriado (dados não
publicados). Mais ainda, a importância das células estruturais como elementos
produtores de quimiocinas em resposta ao IFNγ deve ser menor no fígado, órgão
que contém a grande população das células de Kuppfer que são elementos de
origem leucocitário e devem ter sido parcialmente substituídos por células IFNγR
+
nas quimeras WT/KO. Por outro lado, o fígado constitui um local onde a resposta ao
IFNγ deve acontecer em forma intensa e rápida, dado que contém populações
leucocitárias residentes pré-ativadas, tais como linfócitos NK-T, linfócitos Tγδ
+
e
linfócitos NK, que produzem IFNγ (SARDINHA et al., 2006). Assim, o
reconhecimento local do T. cruzi por estes linfócitos deve determinar prontamente a
secreção de IFNγ, que poderia sinalizar células de Kuppfer (e talvez também as
células estruturais) a controlar a proliferação local do parasita.
Assim, podemos pensar que no coração e no músculo estriado a infiltração
depende da ação das células não leucocitárias, enquanto que no fígado depende
mais das células de Kuppfer e linfócitos residentes que das células não leucocitárias.
Desta forma, não é surpreendente que no nosso estudo não se observem diferenças
claras no grau de infiltração hepática entre os animais dos grupos WT/KO e WT/WT.
Como discutido acima, os nossos resultados claramente indicam que os
camundongos WT/KO apresentam maior susceptibilidade á infecção pelo T. cruzi
que os animais WT/WT, que se expressa por um aumento na carga parasitária
sistêmica e nos diversos órgãos estudados. Estes resultados indicam que as células
estruturais (não leucocitárias) respondem ao IFNγ propiciando um maior controle do
parasita. Mas será que o quadro de susceptibilidade acrescentado ao T. cruzi
observado nos animais WT/KO pode ser aplicado a todos os órgãos analisados
neste estudo? A principio a resposta é sim, mas devemos ser cautelosos em relação
__________________________________________________________Cifuentes Muñoz, A.
111
ao coração e músculo esquelético uma vez que nestes órgãos a colonização pelo T.
cruzi e o desenvolvimento da patologia se iniciam posteriormente ao envolvimento
hepático. Assim, é difícil descartar que o maior número de ninhos observado no
coração e músculo esquelético dos animais WT/KO não seja secundário a uma
colonização mais intensa deste órgão em decorrência ao aumento na parasitemia.
Neste sentido a infecção por parasitas da cepa Sylvio X10/4 representa a escolha
mais apropriada para testar o modelo de quimeras WT/KO, já que na infecção pelo
T. cruzi da cepa Y os níveis de parasitemia são muito mais elevados.
Diversos são os órgãos e populações estruturais que podem estar envolvidos no
efeito protetor do IFNγ frente ao T. cruzi. Análise por microscopia de fluorescência
realizada no nosso laboratório mostrou que as fibras musculares cardíacas de
animais WT ou WT/WT expressam intensamente o receptor de IFNγ (dados não
mostrados, que correspondem à tese de mestrado de Daniella Bucci). Detalhes
desta marcação, assim como a confirmação da positividade do parênquima hepático
e músculo esquelético estão sendo realizadas. Hepatócitos, fibroblastos, células
epiteliais, células do endotélio vascular, miócitos e cardiomiócitos, são alguns
exemplos de populações não leucocitárias que poderiam ser ativados pelo IFNγ a
produzirem mediadores com atividade tripanostática ou tripanocida ou atividade
quimiotática que favoreçam indiretamente a eliminação do parasita.
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112
8 C
ONCLUSÕES
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113
1 O grupo WT/KO manifesta maior susceptibilidade geral à infecção pelo T.
cruzi do que o grupo WT/WT. Isto é evidenciado pela maior parasitemia e
maior número de ninhos no fígado, coração e músculo estriado dos animais
WT/KO. Este resultado apóia nossa hipótese de trabalho indicando que as
células não leucocitárias contribuem ao controle do parasita pela sua
resposta ao IFNγ.
2 Como esperado, os animais WT/KO são mais resistentes ao T. cruzi do
que os animais IFNγR-KO (KO).
3 Na 1ª experiência, os animais WT/KO mostram infiltrados inflamatórios
menos intensos no músculo esquelético do que os animais WT/WT,
enquanto que na 2ª experiência o mesmo é observado para o coração. Na
4ª experiência, entretanto, e tal vez por exibirem carga parasitária local
intensa, os animais WT/KO mostram maior infiltração leucocitária cardíaca
(e talvez muscular) do que os animais WT/WT. No seu conjunto, os dados
são compatíveis com a hipótese das células não leucocitárias destes
órgãos responderem ao IFNγ potenciando o recrutamento celular.
4 As diferenças na intensidade do infiltrado hepático entre os grupos WT/KO
e WT/WT não são tão evidentes como nos outros órgãos.
5 Na análise individual dos animais WT/KO não encontramos correlação
inversa importante entre o nível de reconstituição por células IFNγR
+
e a
intensidade do parasitismo sistêmico e/ou tissular. Isto sugere que acima
de um determinado nível a reconstituição não precisa ser completa para se
tornar efetiva.
6 O modelo de quimera de medula óssea é adequado para verificar o
envolvimento geral das células não leucocitárias na infecção pelo T. cruzi.
Isto pode ser afirmado com certeza em relação ao fígado, órgão que é
colonizado no inicio da infecção, mas não podemos concluir taxativamente
seja adequado para o estudo do papel das células não leucocitárias no
coração e músculo esquelético.
7 O achado dos grupos WT/WT e WT/KO exibirem diferente número de
ninhos no coração e músculo estriado com pouca diferença na intensidade
de infiltrado sugere que as células estruturais contribuem (pela sua
__________________________________________________________Cifuentes Muñoz, A.
114
resposta ao IFNγ) ao recrutamento leucocitário nestes órgãos, contribuição
que parece ter uma menor importância no fígado.
8 O modelo de infecção de quimeras WT/KO e WT/WT pelo T. cruzi Sylvio
X10/4 parece ser mais apropriado para o estudo da resposta ao IFNγ pelas
células não leucocitárias do que o modelo de infecção por parasitas da
cepa Y.
__________________________________________________________Cifuentes Muñoz, A.
115
R
EFERÊNCIAS
B
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__________________________________________________________Cifuentes Muñoz, A.
121
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vasculopathy and acute rejection. J. Immunol., v. 169, n. 3, p. 1556-1560, 2002.
__________________________________________________________Cifuentes Muñoz, A.
122
ANEXO A
3ª EXPERIÊNCIA: Avaliação do estado quimérico (excluídos os
animais que apresentaram baixa percentagem de reconstituição)
Os animais da 3ª experiência foram re-analisados excluindo os camundongos
WT/KO com baixas percentagens de reconstituição. A exclusão destes animais,
entretanto, não alterou a significância mostrada na analise anterior para ninhos e
infiltrados nos diferentes órgãos (que tinha sido realizada com a totalidade dos
animais).
0
20
40
60
80
100
Q WT/WT
B220
+
***
***
CD3
+
B220
+
CD3
+
B220
+
CD3
+
B220
+
CD3
+
Q WT/KO
WT
KO
Q WT/WT
B220
+
CD3
+
B220
+
CD3
+
B220
+
CD3
+
B220
+
CD3
+
Q WT/KO
WT
KO
Q WT/WT
B220
+
CD3
+
B220
+
CD3
+
B220
+
CD3
+
B220
+
CD3
+
Q WT/KO
WT
KO
% Células IFNgR
+
Figura A.1 - Freqüência de células IFNγ
γγ
γR
+
nas populações de células CD3
+
e
B220
+
nos camundongos da 3ª experiência, excluídos os animais
que apresentaram baixa percentagem de reconstituição. Vinte
quatro semanas após a transferência de medula óssea foi analisada a
freqüência de células IFNγR
+
nas populações de células CD3
+
e B220
+
do sangue periférico, de animais WT/WT, WT/KO, WT e KO (3ª
experiência). *** p<0,001.
__________________________________________________________Cifuentes Muñoz, A.
123
O grupo WT/KO com formado por 13 animais, apresentou diferença estatística
com p<0,001, se comparado frente ao grupo WT/WT (Figura 1).
A porcentagem de células IFNγR
+
dos animais WT/KO foi maior nas células
CD3
+
do que nas células B220
+
.
0
25
50
75
100
KO WT WT/KO
Expressão de IFNγ
γγ
γR em células CD3
+
KO vs WT
KO vs WT/WT
KO vs WT/KO
WT vs WT/WT
WT vs WT/KO
WT/WT vs WT/KO
P < 0.001
P < 0.001
P < 0.001
P > 0.05
P < 0.001
P < 0.001
WT/WT
A
% Reconstituição
0
25
50
75
100
Expressão de IFNγ
γγ
γR em células B220
+
KO vs WT
KO vs WT/WT
KO vs WT/KO
WT vs WT/WT
WT vs WT/KO
WT/WT vs WT/KO
P < 0.001
P < 0.001
P < 0.001
P > 0.05
P < 0.001
P < 0.001
KO WT WT/KOWT/WT
B
% Reconstituição
Figura A.2 - Percentagem de reconstituição de células CD3
+
IFNγ
γγ
γR
+
e B220
+
IFNγ
γγ
γR
+
da 3ª experiência, excluindo os animais que apresentaram
baixa percentagem de reconstituição respeito às duas
populações. Vinte quatro semanas após a transferência de medula
óssea foi analisada a percentagem de reconstituição, no sangue de
animais quiméricos e controles (3ª experiência). A. Expressão de
IFNγR
em células CD3
+
.
B. Expressão de IFNγR em células B220
+
.
O 38% dos animais do grupo WT/KO mostra percentagens de reconstituição
acima da média (45% e 40%) do grupo para as populações CD3
+
e B220
+
,
respectivamente (Figura 2).
__________________________________________________________Cifuentes Muñoz, A.
124
ANEXO B
3ª EXPERIÊNCIA: Avaliação da infecção pelo T. cruzi (excluídos os
animais com baixa percentagem de reconstituição)
Curvas de parasitemia
(Experimento 3)
18 20 22 24 26 28 30 32
0
5
10
15
KO
WT/WT
WT
40
80
5/13
10/13
11/13
9/9
5/5
3/5
WT/KO
Dias após infecção
Parasitas x 10
4
/ml
6/6
Figura B.1 - Análise comparativa da carga parasitaria em camundongos dos
grupos controle negativo (IFNγR-KO), controle positivo (C57BL/6),
quimera WT/WT e quimera WT/KO da 3ª experiência, excluindo os
animais que apresentaram baixa percentagem de reconstituição.
Os animais foram infectados com 10
5
tripomastigotas da cepa Sylvio
X10/4 de T. cruzi e as parasitemias analisadas em diferentes dias da
infecção. Os números na figura indicam o número de animais positivos
do total de animais do grupo. Existem diferenças estatísticas nos dias
25, 27, 29 e 31 p.i entre WT/WT e WT/KO, p<0,05.
Houve diferenças estatísticas entre WT/WT vs WT/KO, no dia 25 p.i. (p< 0,05),
nos dias 27, 29 p.i. (p< 0,005) e no dia 31 p.i. (p< 0,001).
__________________________________________________________Cifuentes Muñoz, A.
125
20 40 60 80
0
5
10
15
20
% IFNγ
γγ
γR em CD3
+
Parasitas x 10
4
/ml
A
0 20 40 60 80 100
0
10
20
B
% IFNγ
γγ
γR em B220
+
Parasitas x 10
4
/ml
Figura B.2 - Correlação entre o nível de reconstituição e número de parasitas
circulantes no sangue de animais WT/KO da 3ª experiência,
excluindo os animais que apresentaram baixa percentagem de
reconstituição. O valor da carga parasitária apresentado é a média
dos valores de parasitemias a partir do dia de positivação (dia 20 p.i.)
até o primeiro dia do sacrifício dos animais (dia 27 p.i.). A. Correlação
respeito às células CD3
+
. B. Correlação respeito às células B220
+
.
__________________________________________________________Cifuentes Muñoz, A.
126
Como citado nos resultados da tese, a análise histopatológica da experiência 3
é mais reduzida que as análises de reconstituição e parasitemia, devido à perda
acidental dos blocos de histologia.
0
20
40
60
80
100
Dia 27 p.i. Dia 29 p.i.
** **
A
Número de ninhos
0
1
2
3
4
Dia 27 p.i. Dia 29 p.i.
WT/KO
WT/WT
KO
B
Nível de miocardite
Figura B.3- Analise comparativa do número de ninhos e infiltrados
inflamatórios presentes no coração dos animais da 3ª experiência,
excluindo os animais que apresentaram baixa percentagem de
reconstituição. Animais sacrificados nos dias 27 p.i. (grupo controle
negativo KO, grupo quimera WT/WT e grupo quimera WT/KO) e 29 p.i.
(grupos quimera WT/WT e quimera WT/KO). A. Número de ninhos no
coração. B. Nível de miocardite. Infecção com 10
5
tripomastigotas da
cepa Sylvio 10X/4 de T. cruzi. Intensidade do infiltrado: (0) nenhum
infiltrado, (1) 1 - 10 infiltrados, (2) 11 - 20 infiltrados, (3) 21 - 30
infiltrados e (4) mais de 31 infiltrados. Existem diferenças estatísticas
entre WT/WT e WT/KO, respeito ao número de ninhos presentes no
coração nos dias 27 e 29 p.i. **p< 0,005.
__________________________________________________________Cifuentes Muñoz, A.
127
0 25 50 75 100
0
1
2
3
4
A.
N°
°°
° de Ninhos
N° I. I. Miocardio
0 25 50 75 100
0
1
2
3
4
WT/WT
WT/KO
KO
B.
N° de Ninhos
Figura B.4 - Análise comparativa entre número de ninhos e número de
infiltrados inflamatórios no coração dos animais da 3ª experiência,
excluindo os animais que apresentaram baixa percentagem de
reconstituição. Infecção com 10
5
tripomastigotas da cepa Sylvio 10X/4
de T. cruzi. A. Animais sacrificados no dia 27 p.i., grupo KO (5
animais), WT/WT (4 animais) e WT/KO (4 animais). B. Animais
sacrificados no dia 29 p.i., grupo WT/WT (5 animais) e WT/KO (4
animais). Intensidade do infiltrado: (0) nenhum infiltrado, (1) 1 - 10
infiltrados, (2) 11 - 20 infiltrados, (3) 21 - 30 infiltrados e (4) mais de 31
infiltrados.
__________________________________________________________Cifuentes Muñoz, A.
128
0
1
2
3
4
Dia 29 p.i.Dia 27 p.i.
A
Número de ninhos
0
1
2
3
4
**
***
Dia 29 p.i.Dia 27 p.i.
WT/WT
WT/KO
KO
B
Nível de hepatite
Figura B.5 - Análise comparativa do número de ninhos e infiltrados
inflamatórios presentes no fígado dos animais da 3ª experiência,
excluindo os animais que apresentaram baixa percentagem de
reconstituição. Animais sacrificados nos dias 27 p.i., grupo KO (5
animais), WT/WT (4 animais) e WT/KO (4 animais). Animais
sacrificados no dia 29 p.i., grupo WT/WT (5 animais) e WT/KO (4
animais). Intensidade do infiltrado: (0) nenhum infiltrado, (1) 1 - 10
infiltrados, (2) 11 - 20 infiltrados, (3) 21 - 30 infiltrados e (4) mais de 31
infiltrados. A. Número de ninhos no fígado. Não houve diferenças
estatísticas entre WT/WT vs WT/KO. B. Nível de hepatite. Há
diferenças estatísticas entre WT/WT vs WT/KO, nos dias 27 e 29 p.i.
respectivamente. ** p< 0,005. ***p< 0, 0001.
__________________________________________________________Cifuentes Muñoz, A.
129
0
5
10
15
20
Dia 29 p.i.Dia 27 p.i.
A
*
Número de ninhos
0
1
2
3
4
Dia 29 p.i.Dia 27 p.i.
KO
WT/WT
WT/KO
B
Nível de Miosite
Figura B.6 - Análise comparativa do número de ninhos e infiltrados
inflamatórios presentes no músculo estriado esquelético nos
animais da 3ª experiência, excluindo os animais que apresentaram
baixa percentagem de reconstituição. Animais sacrificados no dia 27
p.i., grupo KO (5 animais), WT/WT (4 animais) e WT/KO (4 animais).
Animais sacrificados no dia 29 p.i., grupo WT/WT (5 animais) e WT/KO
(4 animais). Infecção com 10
5
tripomastigotas da cepa Sylvio X10/4 de
T. cruzi. A. Número de ninhos no músculo: existem diferenças
estatísticas entre WT/WT vs WT/KO no dia 29, com *p<0,05. B. Nível
de miosite. Intensidade do infiltrado: (0) nenhum infiltrado, (1) 1 - 10
infiltrados, (2) 11 - 20 infiltrados, (3) 21 - 30 infiltrados e (4) mais de 31
infiltrados. Não existem diferenças estatísticas entre WT/WT vs
WT/KO.
__________________________________________________________Cifuentes Muñoz, A.
130
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