( PDF ) A modulação da via cAMP-PKA pelo sensor neuronal de cálcio-1 independe de receptores de dopamina

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Bruno Rezende de Souza

A MODULAÇÃO DA VIA cAMP / PKA PELO

SENSOR NEURONAL DE CÁLCIO - 1 INDEPENDE

DE RECEPTORES DE DOPAMINA

Belo Horizonte

2007

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Bruno Rezende de Souza

A MODULAÇÃO DA VIA cAMP / PKA PELO

SENSOR NEURONAL DE CÁLCIO - 1 INDEPENDE

DE RECEPTORES DE DOPAMINA

Tese de doutorado submetida ao curso

de pós-graduação do Departamento de

Farmacologia da Universidade Federal

de Minas Gerais, como requisito parcial

para obtenção do grau doutor em

Biologia: .Farmacologia Bioquímica e

Molecular

Orientação: Marco Aurélio Romano-Silva

Belo Horizonte

2007

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Dedico esse trabalho aos meus pais, meu irmão

e a Mone

AGRADECIMENTOS

Agradeço ao meu orientador, Marquinho, por realmente ensinar-me a fazer pesquisa.

Seus conselhos, apoio e principalmente confiança foram essenciais no meu sucesso.

Plagiando-o, és meu “pai científico”. Espero suprir as expectativas e ter a competência

necessária para ser seu futuro colaborador

Aos professores Marcus Vinícius, Marco Antônio, Luis Armando e Wolfanga. A

convivência já leva ao aprendizado.

Aos amigos e colegas. Vossas presenças me ajudaram muito nessa jornada, tanto

aumentando quanto aliviando as dificuldades diárias de uma jornada profissional. De

qualquer forma, em sua própria natureza, foram estímulos para a conclusão de uma

etapa.

Agradeço às amigas especiais, Anete e Karen. Admiração profissional é minimalista pra

explicar meu sentimento por vocês.

Aos meus “eternos ICs” e futuros companheiros de profissão, Bernardo, Caetano e

Flávio, pela amizade, pela paciência com minhas loucuras e pela cooperação. Admiro e

confio muito em vocês.

Ao meu irmão, grande amigo e conselheiro, mesmo sendo caçula. Se irmão a gente

pudesse escolher, seria o escolhido. Mantenha seu brilho.

Ao papai e à mamãe. Meu sucesso é de vocês. O apoio, educação, incentivo, carinho e

atenção são incomparáveis e lhes devo muito. São meus eternos exemplos.

À Mone, minha gatinha, fiel companheira, maior amiga, minha paixão, minha maior

inspiração. Sua importância é indescritível. Muito brigado por toda a paciência,

compreensão e apoio durante essa jornada. Te amo muito muito!

À toda minha família e à família da Mone pelo carinho e apoio.

À vida.

"Uma vida sem questionamentos não vale a pena ser vivida”

(Sócrates)

“A imaginação é uma das maiores prerrogativas do homem. Por essa

faculdade ele une imagens e idéias criadas, independentes da

vontade, e desse modo cria resultados novos e brilhantes”

(Charles Darwin)

“A maior inimiga da verdade não é a mentira, mas a convicção”

(Friedrich Nietzsche)

“A mente que se abre a uma nova idéia jamais voltará ao seu

tamanho original”

(Albert Einstein)

Este trabalho foi realizado com o auxílio das seguintes instituições:

- Conselho Nacional do Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)

- Coordenação de Aperfeiçoamento de Nível Superior (CAPES)

-Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG)

RESUMO

A proteína sensora neuronal de cálcio-1 (NCS-1) é a proteína evolutivamente

mais antiga da superfamília das EF-hands, um grupo de proteínas que pode ser

ligar ao cálcio. Uma de suas característcas é a presença da cauda miristoil N-

terminal que pode se inserir em membranas lipídicas. NCS-1 apresenta diversas

funções, como inibir a dessensibilização do receptor dopaminérgico D

e ativar

PI4K. A fosfoproteína regulada por dopamina e AMPc-32kDa (DARPP-32) tem um

papel importante na modulação da transdução da sinalização dopaminérgica.

Quando fosforilada na Treonina 34, DARPP-32 inibe a proteína fosfatase-1 (PP-1)

e consequentemente modula a integração das sinalizações. Recentemente foi

demonstrado que no córtex pré-frontal (CPF) de indivíduos com esquizofrenia

ocorre um aumento da expressão de NCS-1 e uma redução da expressão de

DARPP-32. Nesse trabalho, investigamos o papel de NCS-1 na modulação da

sinalizacão intracelular da via AMPc/PKA. Também investigamos, em modelo in

vitro e in vivo, se tratamento crônico com antipsicóticos típicos e atípicos modulam

a expressão de NCS-1 e DARPP-32. Utilizamos células PC12 selvagem e

superexpressando NCS-1, sendo que estas últimas apresentaram redução dos

níveis de expressão de DARPP-32 e nos níveis de AMPc, pDARPP-32(Thr34) e

pCREB(Ser133). Porém, as mesmas não apresentaram alteração nos níveis de

expressão do receptor de dopamina D

, Calcyon, pDARPP-32(Thr75), Akt e

pAkt(Ser473). Observamos que a alteração dos níveis de pDARPP-32(Thr34) são

independentes da sinalização dopaminérgica através de diversos tratamentos

com agonistas e antagonistas dopaminérgicos. Demonstramos que, tanto células

PC12 como diferentes regiões cerebrais de ratos, tratados com antipsicóticos

típicos e atípicos, não apresentaram alterações nos níveis de NCS-1 e DARPP-

32. Portanto, observamos que NCS-1 modula expressão de DARPP-32 e altera a

sinalização da via AMPc/PKA independentemente da dopamina.

ABSTRACT

Neuronal calcium sensor-1 (NCS-1) is the most ancient protein of EF-hands super

family which is a group of proteins that binds calcium. It was shown that NCS-1

has many functions such as its capacity of inhibiting dopamine receptor D

desensitization and its capacity to activate phosphatidylinositol 4-kinase (PI4K).

The dopamine and cAMP regulated phosphoprotein-32kDa (DARPP-32) has a

central role in modulation of transduction of dopaminergic signaling. When

phosphorylated at Threonine 34, DARPP-32 turns into a potent inhibitor of protein

phosphatase-1 (PP-1) and consequently modulates the signaling integration.

Recently it was demonstrated upregulation of NCS-1 and DARPP-32

downregulation in prefrontal (PFC) cortex of schizophrenic patients. In our study

we have investigated the role of NCS-1 on cAMP/PKA intracellular signaling

pathway modulation. We also investigated if chronic treatment with typical and

atypical antipsychotics modulates NCS-1 and DARPP-32 expression, both in vitro

and in vivo (in rat model). We used pheochromocytome PC12 wild-type cells (WT)

and overexpressing NCS-1 (Clone). Our results showed that Clone PC12 cells

have reduction in DARPP-32 expression, cAMP levels, pDARPP-32(Thr34) and

pCREB(Ser133). However, there was no alteration in D

, Calcyon, pDARPP-

32(Thr75), Akt and pAkt(Ser473) in these same cells. WT and Clone PC12 cells

were treated with specific dopaminergic agonists and antagonists and we show

that alteration in pDARPP-32(Thr34) levels in Clone PC12 cells is independent of

dopaminergic signaling. Also, we demonstrated that both PC12 cells and different

brain regions of rats treated chronically with typical and atypical antipsychotics did

not present alteration in NCS-1 and DARPP-32 expression. Therefore, we

observed that NCS-1 modulates DARPP-32 expression and cAMP/PKA signaling

pathway independently of dopamine.



SUMÁRIO

INTRODUÇÃO

1.1 A dopamina e sistema dopaminérgico

1.1.1 Síntese e liberação de dopamina

1.1.2 Receptores dopaminérgicos e sinalização de segundo mensageiro

1.1.3 Modulação de receptor

1.2 DARPP-32 na sinalização dopaminérgica

1.3 NCS-1 na modulação do receptor dopaminérgico D

1.4 Esquizofrenia e alterações na sinalização dopaminérgica

OBJETIVOS

2.1 Objetivo geral

2.2 Objetivos específicos

MATERIAL E MÉTODOS

3.1 Experimentos in vitro

3.1.1 Cultura celular

3.1.2 Drogas e reagentes

3.1.3 Procedimentos farmacológicos

3.2 Experimentos in vivo

3.2.1 Animais experimentais

3.2.2 Drogas e reagentes

3.2.3 Procedimentos farmacológicos

3.3 Dosagem de proteína

3.4 ELISA

3.5 Imunofluorescência

3.6 Microscopia confocal

3.7 Marcação de proteínas intracelulares para citometria de fluxo

3.8 Aquisição e análise dos dados por citometria de fluxo

3.9 Imunoblot

3.10 Análise dos imunoblots

3.11 Análise estatística

RESULTADOS

4.1 Expressão de NCS-1 em células PC12 NCS-1

4.2 Expressão e exposição do receptor dopaminérgico D

em células PC12

superexpressando NCS-1

4.3 Níveis de AMPc em células PC12 superexpressando NCS-1

4.4 Alteração nos níveis de expressão de DARPP-32 em células PC12

superexpressando NCS-1

4.5 Alteração nos níveis de fosforilação de DARPP-32 na Treonina 34 em células

PC12 superexpressando NCS-1

4.6 Alteração nos níveis de fosforilação de CREB na Serina 133 em células PC12

superexpressando NCS-1

4.7 Níveis de fosforilação de DARPP-32 na Treonina75 em células WT e Clone

4.8 Expressão do receptor dopaminérgico D

e níveis de expressão de Calcyon

em células PC12 WT e Clone

4.9 Níveis de expressão do receptor AMPA e fosforilação de AMPA na Serina845

em células PC12 superexpressando NCS-1

4.10 Níveis de expressão de Akt e fosforilação de Akt na Serina473 em células

PC12 superexpressando NCS-1

4.11 Níveis de expressão de DARPP-32 e fosforilação de DARPP-32 na

Treonina34 em células PC12 WT e Clone tratadas 5 minutos com Quinpirole

4.12 Níveis de expressão de DARPP-32 e fosforilação de DARPP-32 na

Treonina34 em células PC12 WT e Clone tratadas com Quinpirole 1µM

4.13 Níveis de expressão de DARPP-32 e fosforilação de DARPP-32 na

Treonina34 em células PC12 WT e Clone tratadas 5 minutos com Raclopride

5µM

4.14 Níveis de expressão de DARPP-32 e fosforilação de DARPP-32 na

Treonina34 em células PC12 WT e Clone tratadas 10 minutos com Haloperidol

5µM

4.15 Níveis de expressão de DARPP-32 e fosforilação de DARPP-32 na

Treonina34, em células PC12 WT submetidas à 1 hora 30 minutos de starving,

tratadas 5 minutos com 5µM de Quinpirole, Raclopride, Haloperidol e SCH-

23390

4.16 Níveis de expressão de DARPP-32 e NCS-1 em células PC12 WT e Clone

tratadas com Forskolin 5µM e 10µM

4.17 Níveis de expressão de DARPP-32 e NCS-1 em células PC12 WT e Clone

tratadas 14 dias com antipsicóticos típicos e atípicos

4.18 Controle para investigação dos níveis de espressão de DARPP-32 e NCS-1

em ratos submetidos ao tratamento com antipsicóticos típicos e atípicos por 28

dias

4.19 Níveis de expressão de DARPP-32 e NCS-1 no córtex pré-frontal de ratos

submetidos ao tratamento com antipsicóticos típicos e atípicos por 28 dias

4.20 Níveis de expressão de DARPP-32 e NCS-1 no hippocampus de ratos

submetidos ao tratamento com antipsicóticos típicos e atípicos por 28 dias

4.21 Níveis de expressão de DARPP-32 e NCS-1 no striatum de ratos submetidos

ao tratamento com antipsicóticos típicos e atípicos por 28 dias

4.22 Níveis de expressão de DARPP-32 e NCS-1 no córtex de ratos submetidos ao

tratamento com antipsicóticos típicos e atípicos por 28 dias

4.23 Níveis de expressão de DARPP-32 e NCS-1 no cerebellum de ratos

submetidos ao tratamento com antipsicóticos típicos e atípicos por 28 dias

DISCUSSÃO

CONCLUSÃO

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

LISTA DE FIGURAS

LISTA DE ABREVIATURAS

101

103

105

116

123

144

147



1- INTRODUÇÃO

1.1 DOPAMINA E O SISTEMA DOPAMINÉRGICO

A dopamina é responsável pela regulação de muitas funções em mamíferos, tais

como o controle motor, hormonal, de processos cognitivos, de humor, da resposta

imune, da motivação e da atenção, entre outros (Giros e cols., 1996; Packard e

Knowlton, 2002; Lourenco e cols., 2005; Kavelaars e cols., 2005).

Até a metade da década de 1950, pouco se sabia sobre esse neurotransmissor,

sendo considerada exclusivamente um precursor intermediário da biossíntese de

outros neurotransmissores, como noradrenalina e adrenalina. Porém, houve um

considerável avanço nos estudos sobre a dopamina e suas vias nesses últimos

anos.

Foram as diferenças marcantes na distribuição regional de dopamina e

noradrenalina que levaram investigadores suecos, na década de 1960, a propor um

papel biológico específico desta na sinalização neuronal. (Carlsson e cols, 1958;

Carlsoon e Waldeck, 1958). Portanto, a dopamina, a partir daquela década, foi

relacionada como mais um neurotransmissor, evidenciando sua importância no

funcionamento cerebral.

A dopamina diferentemente de outros sistemas de neurotransmissão, encontrados

difusamente no sistema nervoso central, se distribui de maneira circunscrita

(Glenthoj, 1995) no SNC, sendo encontrada também no sistema nervoso periférico.

Atualmente são conhecidas quatro projeções principais do sistema dopaminérgico

(Stahl, 2002) (FIG 1). Destas quatros projeções, três se originam do mesencéfalo e

uma na substância negra (Kandell e cols., 2003):

- Via mesolímbica - projeta-se dos corpos celulares da área tegumentar ventral

do mesencéfalo para os axônios terminais das áreas límbicas do cérebro,

como o núcleo acumbens. Essa via tem importante função para afeto,

emoção e motivação.

- Via mesocortical - os corpos celulares desta via surgem na área tegumentar

ventral, próximo aos corpos celulares dos neurônios dopaminérgicos da via

mesolímbica, e projetam-se para áreas do córtex cerebral, particularmente do

córtex límbico. Também tem importante função para afeto, emoção e

motivação.

- Via nigroestriatal - projeta-se dos corpos celulares da substância negra do

mesencéfalo por meio de axônios que terminam nos gânglios da base ou

striatum. Esta via é importante para controle do movimento.

- Via túbero-infundibular- projeta-se do hipotálamo para a glândula pituitária

anterior. Esta via regula a secreção de hormônios.

Figura 1: As quatro vias dopaminérgicas. (a) via nigroestriatal, (b) via mesolímbica,

1.1.1 SÍNTESE E LIBERAÇÃO DE DOPAMINA

A dopamina é um neurotransmissor catecolaminérgico sintetizado a partir de tirosina

por duas reações seqüenciais catalizadas pelas enzimas tirosina hidroxilase (TH)

(formação de 3,4-dihidroxifenilalanina ou L-DOPA) e descarboxilase de L-

aminoácidos aromáticos (AAAD) (FIG 2A).

Após a síntese, a dopamina livre no citosol é rapidamente captada pelo

transportador vesicular de monoaminas (VMAT) que utiliza um gradiente

eletroquímico de prótons para transportá-la para o interior das vesículas, sendo que

este apresenta duas isoformas: VMAT-1, presente na periferia, e VMAT-2,

localizado em estruturas do SNC (Erickson e cols., 1992). As vesículas são então

preenchidas com dopamina e ancoradas próximas à membrana do neurônio pré-

sináptico. Através da despolarização da membrana, abrem-se os canais de Ca

sensíveis à voltagem levando ao influxo de Ca

e conseqüentemente a liberação

dos neurotransmissores.

Algumas proteínas ativadas por Ca

são essenciais para a exocitose, como a

proteína receptora anexada ao fator sensível à N-etilmaleimida solúvel (SNARE),

SNAP-25, proteína de membrana associada à vesícula (VAMP), sinaptobrevina,

sintaxina e proteína de ligação à sintaxina, munc 18 (Staal e cols., 2004; Binda e

cols., 2005). Apesar dos mecanismos de síntese e liberação de dopamina já serem

bem descritos, recentemente ainda ocorrem avanços no conhecimento desse

mecanismo. Binda e cols. (2005) sugeriram que a interação de receptores pré-

sinápticos D

com proteína ativadora de secreção dependente de cálcio (CAPS)

pode consistir em um mecanismo de regulação direta entre receptor e componentes

da via da exocitose.

Após a liberação da dopamina na fenda sináptica, ocorre a ativação de receptores

específicos, pré-sinápticos e pós sinápticos. A dopamina é então recaptada pelo

transportador de dopamina (DAT) e posteriormente degradada no citosol, em

produtos inativos (FIG 2B) pela monoamina oxidase (MAO) e pela catecol-O-metil-

transferase (COMT). Resultam da degradação 3-metoxitiramina, ácido

diidroxifenilacético e o ácido homovanílico (Thorpe e cols., 1987).

Figura 2: Vias de síntese (2A) e degradação (2B) da dopamina

1.1.2 RECEPTORES DOPAMINÉRGICOS E SINALIZAÇÃO DE SEGUNDOS-

MENSAGEIROS

Em 1966, Van Rossum apresentou receptores como importantes pontos

modulatórios da via dopaminérgica e a transtornos a ela relacionados. Até 1990,

acreditava-se que existiam somente dois tipos de receptores: D1 e D2. No entanto,

estudos realizados através de técnicas de biologia molecular possibilitaram a

identificação de mais três tipos: D3, D4 e D5. Avaliando-se as propriedades

bioquímicas, estruturais e farmacológicas in vitro e in vivo, estes foram agrupados

(A) (B)

em duas famílias: receptores do tipo D1 (D

e D

) e receptores do tipo D2 (D

, D

) (Levant, 1997).

Os receptores dopaminérgicos pertencem à superfamília de receptores acoplados

heteromericamente à proteína G (GPCR) (Civelli e cols., 1993), classificados assim

como receptores metabotrópicos. Os receptores dopaminérgicos também podem

interagir entre si e outros receptores, formando heterodímeros com propriedades

farmacológicas distintas. (Rocheville e cols., 2000; Scarselli e cols., 2001;

Nimchinsky e cols., 1997; Lee e cols., 2002; Fiorentini e cols., 2003; Gines e cols.,

2000; Franco e cols., 2000; Lavine e cols., 2002).

Apesar de as superfamílias de receptores dopaminérgicos serem acopladas a

proteína G, G

e G

têm efeitos antagônicos na via de sinalização por AMPc. Os

receptores do tipo D

são acoplados a proteína G

α/G

olf

α (FIG 3) que ativam a

adenilato ciclase (AC) resultando no aumento dos níveis intracelulares do AMPc e

conseqüentemente a ativação da Proteína Quinase A (PKA) (Missale e cols., 1998).

Já os do tipo D

estão acoplados a G

α/G

α gerando inativação desta enzima e

redução dos níveis de AMPc (Missale e cols. 1998; Vallone e cols., 2000;

Bentivoglio e Morelli, 2005) e conseqüentemente a diminuição da ativação de PKA

(Missale e cols., 1998). Também foram descritos o aumento de níveis de Ca

intracelular e ativação da cascata de sinalização da fosfolipase C (PLC)/proteína

fosfatase 2B (PP-2B) (Nishi e cols., 1997) através da sinalização via D

. PKA,

quando ativada, fosforila canais de Na

, levando a uma diminuição do fluxo de íon

(Li e cols., 1992; Cantrell e cols., 1999; Smith e Goldin, 1997), e a fosfoproteína

regulada por AMPc e dopamina – peso molecular 32kDa (DARPP-32) na treonina

34 (Svenningsson, 2004), modulando assim diversas outras vias; além de estimular

a fosforilação da proteína ligante de elemento em reposta ao AMPc (CREB) na

serina 133, regulando assim a expressão de diversos genes (Svenningsson, 2004).

Figura 3: Modulação da adenilato ciclase (AC) mediada por receptores

dopaminérgicos (GDP: guanosina difosfato, GTP: guanosina trifosfato). (Modificado

de Stahl, 2002)

Além da via clássica do AMPc / PKA, recentemente foi descrito que o estímulo de

receptores dopaminérgicos, especificamente D

e D

, alteram a ativação da via Akt,

independente de PI3K (Brami-Cherrier e cols, 2002; Beaulieu e cols, 2007). Sendo a

Akt um importante mediador de efeitos fisiológicos de vários fatores de crescimento

e de sobrevivência através da inibição da apoptose (Datta e cols, 1999), sugere-se a

participação da sinalização dopaminérgica nesses eventos (Brami-Cherrier e cols,

2002). Nair & Sealfon (2003) demonstraram que a estimulação de D

por

bromocriptina leva a ativação de PI3K através de c-Src e, consequentemente, a

fosforilação de Akt na serina 473, inibindo a apoptose induzida por H

. Já

Beaulieu e cols (2004) demonstraram que o estímulo prolongado de receptores D

levam a desfosforilação de Akt na treonina 308 sem afetar a fosforilação de Akt na

serina 473. Essa ativação de receptores D

leva à formação de complexos com β-

arrestina 2, PP-2A e Akt, inativando Akt através da diminuição da fosforilação na

treonina 308 e consequente aumento da ativação de GSK3 (FIG 4) (Beaulieu e cols

2004; Beaulieu e cols, 2005)

Figura 4: Efeitos da sinalização dopaminérgica tanto na via AMPc quanto na via

Akt. (Retirado de Beaulieu e cols., 2004)

Portanto, devido aos diferentes mecanismos de sinalização por segundos-

mensageiros, esses dois subtipos de receptores, D

e D

, podem ser diferenciados

pelas suas propriedades farmacológicas e ações nos segundos-mensageiros

intracelulares (Missale e cols., 1998; Vallone e cols., 2000).

Ambos os subtipos de receptores dopaminérgicos foram descritos no córtex pré-

frontal (CPF) (Levey e cols., 1993; Lidow e cols., 1998; Meador-Woodruff e cols.,

1996), região cortical envolvida em transtornos psiquiátricos, como esquizofrenia e

transtorno bipolar (Albert e cols., 2002; Lewis e cols., 2005; Ogden e cols., 2004).

A importância funcional dos receptores dopaminérgicos D

é demonstrada através

da sua afinidade pelos antipsicóticos típicos e atípicos (Lidow e cols., 1998; Strange,

2001). Porém, a função do receptor D

na transmissão sináptica no CPF é bem

menos entendida que a do receptor D

nesta mesma região (Lidow, 2000; Goldman-

Rakic e cols., 2000). Mesmo no striatum, onde existe em alta densidade, a função

do receptor D

na atividade neuronal é altamente controversa, (Nicola e cols., 2000).

Portanto, a necessidade de um melhor entendimento do mecanismo de

funcionamento de D

no CPF é evidente devido a sua importância

farmacoterapêutica.

Diversos estudos demonstraram que a sinalização dopaminérgica mediada por

receptores D

inibe a sinalização de segundos-mensageiros intracelulares (Gerfen e

cols., 1990; West e Grace, 2002; Svenningsson e cols., 2000), porém, estudos

eletrofisiológicos sugerem um complexo de ações excitatórias e inibitórias de D

CPF (Zheng e cols., 1999; Seamans e cols., 2001, Urban e cols., 2002; Tseng e

O’Donnell, 2004) devido à localização de receptores D

em processos dendríticos,

tanto pré-sinápticos quanto pós-sinápticos, de neurônios piramidais, interneurônios

e glia (Paspalas e Goldman-Rakic, 2004; Khan e cols., 2001; Negyessy e Goldman-

Rakic, 2005).

1.1.3 MODULAÇÃO DO RECEPTOR

Sabe-se que, para modulação da sinalização através de receptores metabotrópicos

ocorre um mecanismo de dessensibilização e ressensibilização do receptor. O

mecanismo de dessensibilização do receptor representa uma adaptação contra a

super-estimulação do mesmo (Lohse, 1993; Krupkick e Benovic, 1998). A

dessensibilização de receptores metabotrópicos é mediada pela fosforilação dos

resíduos de serina e treonina em domínios intracelulares do receptor (Ferguson,

2001). No entanto, a fosforilação do receptor promove a ligação de arrestina e sua

internalização (Krupnick e Benovic, 1998) (FIG 5), deixando-o temporariamente

inapto para a ativação por neurotransmissores. O mecanismo de dessensibilização

foi descrito demonstrando que, tanto quinases dependente de segundos-

mensageiros, como a proteína quinase sensível a AMPc (PKA), quanto quinase

acoplado a proteína G receptor (GRK), contribuem para a dessensibilização de

receptores dopaminérgicos ativados (Mason e cols., 2002). Foi observado que o

receptor dopaminérgico D

ativado é internalizado pela co-expressão de GRK2 e

GRK5 (Ito e cols., 1999; Iwata e cols., 1999). Portanto, a dessensibilização pode ser

modulada pela ativação da via do AMPc, atuando assim como um feedback

negativo.

Figura 5: Mecanismo de internalização e dessensibilização de receptor

metabotrópico (retirado de Callier e cols., 2003)

Sabe-se que existem certas dificuldades metodológicas para estudar os efeitos

fisiológicos da ativação de D

no CPF, devido ao seu processo de sensibilização e

dessensibilização (Maggio e cols., 1995; Kabbani e cols., 2002). Esses processos,

especialmente a dessensibilização, podem potencializar ou até mesmo diminuir os

efeitos de tratamentos terapêuticos (Negyessy e Goldman-Rakic, 2005). Kabbani e

cols. (2002) mostraram que o sensor neuronal de cálcio-1 (NCS-1) forma complexos

com a GRK2 e com o receptor de dopamina D

, regulando, assim, a

dessensibilização do receptor D

ativado. Devido a esta interação, NCS-1 é

importante para regulação dos processos mediados por D

in vivo já que foram

demonstrados que D

e NCS-1 estão colocalizados no CPF de primatas, existindo

uma coexistência de aproximadamente 10%, em estruturas pré-sinápticas e pós

sinápticas (Negyvessy e Goldman-Rakic, 2005).

1.2 DARPP-32 E SINALIZAÇÃO DOPAMINÉRGICA

A proteína DARPP-32 foi descoberta por S. Ivar Walaas e Dana W. Aswad (Walaas,

Aswad e Greengard, 1983) e extensivamente estudada desde então. Estudos sobre

os mecanismos de funcionamento da DARPP-32 têm desempenhado um papel

central na compreensão da sinalização dopaminérgica e suas interações com outros

neurotransmissores, drogas terapêuticas e de abuso (Self e cols., 1998; Maldve e

cols., 2002). Sabe-se que se localiza em neurônios que possuem receptores

dopaminérgicos, sendo identificada como o maior alvo dos produtos da adenilato

ciclase ativada por dopamina no striatum (Wallas e cols., 1983) (FIG 6).

Figura 6: Sinalização dopaminérgica em neurônios pós-sinápticos (modificado de

Greengard, 2001)

Através da ativação de adenilato ciclase e consequente aumento da disponibilidade

de AMPc, ocorre ativação da PKA, que fosforila a DARPP-32 no resíduo de treonina

na posição 34 (Thr34) (FIG 7), passando a atuar como potente inibidor da proteína

fosfatase 1 (PP-1) (Yan e cols., 1999). Além da Thr34, essa fosfoproteína apresenta

outros três sítios de fosforilação:

- treonina na posição 75 (Thr75), que ao ser fosforilada pela quinase

dependente de ciclina 5 (Cdk-5) provoca inibição de PKA e

conseqüentemente a diminuição da fosforilação da própria DARPP-32 na

Thr34;

- serina na posição 102 (Ser102), que fosforilada pela caseína quinase 2 (CK-

2) favorece a fosforilação da Thr34 pela PKA, amplificando a inibição de PP-

- serina na posição 137 (Ser137), fosforilada pela caseína quinase 1 (CK-1)

passa a inibir a atividade da proteína fosfatase 2B (PP-2B) que desfosforila o

resíduo Thr34, também amplificando a inibição de PP-1 (King e cols., 1984;

Girault e cols., 1989; Desdouits e cols., 1998; Bibb e cols., 1999; Nishi e cols.,

1999).

A PP1, cuja atividade é modulada pela DARPP-32, é capaz de regular o estado de

ativação de diversos canais iônicos, como canais de Ca

e de Na

; receptores,

como GABA

; e o fator de regulação da transcrição gênica p-CREB (Greengard e

cols., 1999; Hsieh-Wilson e cols., 1999).

Figura 7: Sítios de fosforilação da DARPP-32 (adaptado de Svennigsson e cols.,

2004). Em vermelho são indicadas vias inibitórias e em azul as estimulatórias.

Diversos estudos realizados em camundongos que não expressam DARPP-32

(Fienberg, e cols., 1998) têm permitido maior detalhamento do envolvimento desta

proteína nas ações da dopamina. Há evidências de um importante papel na

mediação dos efeitos deste neurotransmissor nas mudanças em longo prazo na

excitabilidade neuronal, através da indução de ambas, depressão e potenciação de

longa duração (LTD e LTP, respectivamente), formas opostas de plasticidade

sináptica (Calabresi e cols., 2000). O envolvimento pode ser explicado pelo fato

destes efeitos serem mediados via proteína quinase sensível a GMPc (PKG) e PKA.

No entanto, mudanças a longo prazo na plasticidade sináptica geram alterações na

transcrição gênica que são importantes para manutenção das adaptações

moleculares e início das adaptações morfológicas. Há evidências de que a

regulação da transcrição gênica envolve fosforilação alterada de fatores de

transcrição, e conseqüente modulação de sua atividade (Hyman e cols., 2001).

Glutamato e GABA são os principais neurotransmissores que controlam a

fosforilação da DARPP-32 estriatal. O principal efeito anti-dopaminérgico do

glutamato é a desfosforilação da DARPP-32 na Thr34, através da ativação da PP-

2B induzida pelos receptores NMDA/AMPA.

Além deste, o glutamato tem vários outros efeitos regulatórios na fosforilação da

DARPP-32. Através da via mGluR1/CK1/Cdk5/pDARPP-32(Thr75), o glutamato

antagoniza a sinalização PKA/fosfo-Thr34-DARPP-32. Porém, o glutamato pode

potencializar a sinalização PKA/fosfo-Thr34-DARPP-32 através de três cascatas

por:

- receptores NMDA-AMPA/Ca2+/PP-2A/desfosforilação da DARPP-32 na

Thr75;

- favorecer a formação de AMPc acoplado ao receptor A2A mediada pela

ativação de receptores mGlu5;

- aumentar a fosforilação na Ser137 da DARPP-32 mediada através da

ativação induzida do receptor mGlu da CK1 (Nishi e cols., 2003).

Através de estudos realizados em fatias estriatais, foi demonstrado que o GABA foi

capaz de produzir um rápido aumento no estado de fosforilação da Thr34. Este

efeito foi prevenido por bicuculina antagonista de receptores GABA

. GABA

potencializou significativamente o aumento na fosforilação da Thr34 da DARPP-32

produzido por forskolina, ativador de adenilato ciclase. Isto sugere que o GABA

aumenta a fosforilação da Thr34 através da inibição de PP-2B (Snyder e cols.,

1994).

Como se sabe, o tratamento com antagonistas de D

e 5HT

, e atualmente o efeito

agonista parcial de D

, representam as terapias mais comum para esquizofrenia

(Meltzer e cols., 2003; Lindgren e cols., 2003; Lieberman, 2004) e ambos os

receptores sinalizam através da fosforilação de DARPP-32 em Thr34. Portanto,

DARPP-32 está envolvida nas ações de uma variedade de substâncias usadas para

o tratamento de vários transtornos psiquiátricos e neurológicos. Um efeito comum

das drogas antipsicóticas é agir como antagonista de receptores D

(Lindgren e

cols., 2003). A ativação de receptores D

inibe a ativação de PKA e

conseqüentemente o estado de fosforilação na Thr34 de DARPP-32. Portanto,

reduzindo-se a inibição da ativação de PP-1, que por sua vez atua em diversos

receptores e canais iônicos.

Mostrou-se que o tratamento com diferentes antidepressivos, incluindo fluoxetina,

favorece a eficácia da sinalização de PKA em vários níveis diferentes no córtex pré-

frontal, hipocampo e núcleo accumbens (Nestler e cols., 2002). O tratamento agudo

e crônico com fluoxetina causou um aumento na fosforilação da DARPP-32 na

Thr34 e uma diminuição na fosforilação da Thr75 no hipocampo, córtex frontal e

corpo estriado (Svenningsson e cols., 2002).

Logo, DARPP-32 aparece como um elemento intermediário com potencial para

associar o funcionamento de diversas vias sinalizatórias, e o estudo de sua

expressão pode auxiliar na compreensão das vias envolvidas em transtornos

psiquiátricos e neurológicos.

1.3 NCS-1 E MODULAÇÃO DO RECEPTOR DOPAMINÉRGICO D

O processo de transdução espaço-temporal do sinal de cálcio em funções

específicas intracelulares deve-se, em grande parte, à interação desse íon com

algumas proteínas conhecidas como ligantes de cálcio (“calcium binding proteins”)

e/ou sensoras de cálcio (“calcium sensor proteins”), dentre elas a proteína NCS-1.

A NCS-1 é uma proteína ligante de cálcio específica de neurônios, expressa no

cérebro de diferentes espécies, como demonstrado no cérebro humano (Martone e

cols., 1999; Chen e cols., 2002). Pertence a uma família de proteínas do tipo “EF-

hand” apresentando 4 sítios de ligação ao Ca

, um grupo miristoil capaz de

interagir com membranas e regiões de associação com quinases e outras proteínas

(Bourne e cols., 2001). Porém, NCS-1 não depende de Ca

para expor sua cauda

miristoil N-terminal (O’Calaghan e cols, 2002). Localizada em terminações axonais e

estruturas pré- e pós-sinápticas, sugere-se que tenha função na transmissão

sináptica no córtex. (Marton e cols., 1999; Negyessy e Goldman-Rakic, 2005). Sabe-

se que tanto a NCS-1 quanto sua ortóloga freqüenina encontrada em Drosófila sp.

são capazes de (FIG 8):

- regular a exocitose de neurotransmissores e agentes secretórios (de Barri e

cols, 2006);

- controlar o tráfego de proteínas celulares e modular a atividade de canais

iônicos, como os canais de Ca

e os canais de K

(Taverna e cols, 2007);

- modular alguns processos de plasticidade celular (Pongs e cols., 1993;

Nakamura e cols., 2001; Mora e cols., 2002; Tsujimoto, 2002).

- controlar a formação de neuritos pela formação do complexo com TRP5

(Hui e cols, 2006)

Figura 8: Funções de proteínas sensoras de cálcio. Em vermelho são indicadas

funções da NCS-1 (Zucker, 2003).

No entanto, evidências sugerem o envolvimento da NCS-1 no processo de

facilitação da neurotransmissão, atuando tanto pré quanto pós-sinapticamente.

Também é possível que NCS-1 esteja relacionada a alguns transtornos do sistema

nervoso, como a esquizofrenia e o transtorno bipolar.

Recentemente alguns trabalhos têm mostrado que a NCS-1 ocupa uma posição

importante na regulação de diversas vias de sinalização intracelular. Esta é capaz

de inibir/ativar canais de cálcio e potássio dependentes de voltagem, ativar a

calcineurina e a óxido nítrico sintase, inibir a guanilato ciclase, inibir a

dessensibilização de receptores de dopamina D

, ativar a fosfatidilinositol 4-

hidroxiquinase-β do tipo III (PI4Kβ-III) dentre outras (Rajebhosale e cols., 2003).

A dessensibilização do receptor metabotrópico, caracterizada pelo declínio da

resposta a agonistas, representa um mecanismo de adaptação que protege o

receptor de uma superestimulação (Lohse, 1993; Krupnick e Benovic, 1998). A

dessensibilização das proteínas metabotrópicas ativadas é mediado pela

fosforilação dos resíduos de serina e treonina nos domínios intracelulares dos

receptores (Ferguson, 2001). Portanto, a fosforilação do receptor atua no

desacoplamento do receptor com a proteína G, promovendo a ligação de arrestina e

a internalização (Krupnick e Benovic, 1998). Também foi demonstrado o papel da

dinamina-2 na regulação da internalização de D

. (Kabbani e cols., 2004).

Sabe-se que GRK2 atua na fosforilação do receptor D

e consequentemente sua

internalização e dessensibilização. (Ito e cols., 1999; Itawa e cols., 1999; Kim e

cols., 2001). Porém, foi observado que NCS-1 atenua a fosforilação de D

, e

consequentemente sua internalização, ou seja, NCS-1 inibe a dessensibilização de

amplificando sua sinalização (Kabbani e cols., 2002). A inibição da

dessensibilização de D

ocorre com a interação entre receptor D

, NCS-1 e GRK2.

(FIG 6) (Kabbani e cols., 2002).

Na maioria dos mamíferos, a ativação de D

leva à redução dos níveis de AMPc

(Missale e cols., 1998). Portanto, foi demonstrado que a super-expressão de NCS-1

diminui os níveis de cAMP (Kabbani e cols., 2002).

Recentemente, Negyessy e Goldman-Racik (2005) compararam, em córtex pré-

frontal de primatas, a localização ultraestrutural de D

e de NCS-1. Foi observada

imunorreatividade abundante de NCS-1 em estruturas pré e pós-sinápticas, nas

quais também havia colocalização com D

(Negyessy e Goldman-Racik, 2005).

Estes dados corroboram com a idéia de um papel da NCS-1 na dessensibilização

de D

no córtex pré-frontal, fortalecendo ainda mais a hipótese sobre a importância

de NCS-1 na sinalização por D

Sabe-se que a ativação de PKA e PKC, ativações que podem ser iniciadas com a

ativação de D

, pode levar à formação de complexos NCS-1-GRK2 e D

(FIG 9)

(Mason e cols., 2002; Ferguson, 2001). Portanto, esse mecanismo é importante

para dessensibilização de D

e amplificação de sua sinalização, sendo considerado

um feedback negativo da ativação de D

e manutenção do equilíbrio do mecanismo

de sinalização dopaminérgica.

Figura 9: Modulação de GRK2/ D2 por NCS-1(modificado de Braunewell, 2005)

Recentemente Nakamura e cols (2006) demonstraram que NCS-1 também atua

como um importante fator de sobrevivência celular. Células superexressando NCS-1

foram mais tolerantes à morte celular causada por diversos estressores, quando

comparada a células expressando o mutante negativo (E120Q). Também foi

demonstrada que a expressão de NCS-1 é aumentada em lesões induzidas de

neurônios do núcleo dorsal motor. Confirmando a hipótese de que NCS-1 estaria

envolvida na sobrevivência neuronal, foi demonstrado que NCS-1 medeia a

neuroproteção induzida por GDNF através da via da Akt.

1.4 ESQUIZOFRENIA E SUAS ALTERAÇÕES DOPAMINÉRGICAS

A importância da pesquisa sobre esquizofrenia é diretamente proporcional a sua

importância social e econômica. A esquizofrenia é uma doença que afeta

aproximadamente 1% da população mundial (Lewis e Lieberman, 2000 apud Lewis

e cols., 2005). Indivíduos afetados, frequentemente são diagnosticados no final da

adolescência ou no início da vida adulta, e cerca de 10% destes indivíduos irão

cometer suicídio. Como resultado, a esquizofrenia está associada a enorme

sobrecarga emocional para familiares e leva a um custo econômico elevado para a

sociedade através de gastos médicos e perda de produtividade (Lewis e cols.,

2005).

Diversas publicações científicas vêm demonstrando a influência genética na

esquizofrenia. O risco para seu desenvolvimento é diretamente proporcional à

predisposição genética relacionada à susceptibilidade de genes já identificados

(Gottesman, 1991 apud Lewis e cols., 2005). Porém, o risco conferido para cada

gene demonstrou-se ser pequeno já que o grau de concordância para esquizofrenia

em gêmeos homozigóticos é de cerca de 50%, o que indica que apenas o fator

genético não é suficiente para o desenvolvimento da doença. Consistente com esta

interpretação, vários fatores ambientais, como idade avançada do pai na concepção

e uso de Cannabis durante a adolescência, demonstraram aumentar o risco de

desenvolvimento da esquizofrenia durante a vida (Lewis e Levitt, 2002 apud Lewis e

cols., 2005). No entanto, pode-se afirmar que, para o desenvolvimento da etiologia,

é necessária uma interação entre susceptibilidade genética e fatores de risco

ambientais (Lewis e cols., 2005). Assim, estudos sobre os mecanismos de

funcionamento neuronal e cerebral visam elucidar as causas e efeitos dessa

etiologia.

Apesar dos grandes avanços nos estudos relacionados à esquizofrenia no último

século, atualmente não existem procedimentos laboratoriais, métodos de

neuroimagem e testes psicológicos que auxiliar no diagnóstico de esquizofrenia

(Lewis e cols., 2005). A esquizofrenia só é diagnosticada com base em síndromes

clínicas. A American Psychiatry Association (1994) apresenta critérios para o

diagnóstico, como a presença de duas ou mais das seguintes características

clínicas: delírios, alucinações, pensamento desorganizado (ex: fala incoerente),

comportamento catatônico e sintomas negativos. Os sintomas negativos incluem

embotamento afetivo (sem expressão emocional), alogia (pobreza na fala) e

avolição (sem iniciativa para atividades). Além dessas disfunções, deve existir

evidência de disfunção social e ocupacional, duração contínua por seis meses e a

certeza de que as disfunções não estão atribuídas à outra desordem. No entanto, é

interessante o desenvolvimento de marcadores para um diagnóstico seguro da

esquizofrenia.

Indivíduos com esquizofrenia demonstram déficits cognitivos. Certos déficits

cognitivos cruciais na esquizofrenia parecem refletir em alterações na representação

contextual e manutenção de funções, como a memória de trabalho, que depende do

córtex pré-frontal dorsolateral (CPFDL). Indivíduos com esquizofrenia tendem a ter

um baixo desempenho em tarefas que exigem memória de trabalho, demonstrando

redução na ativação do CPFDL (Weinberger e cols., 1986 apud Lewis e cols., 2005;

Perlstein e cols., 2001 apud Lewis e cols., 2005). No entanto, avanços na pesquisa

sobre os mecanismos da memória de trabalho vêm ajudando no esclarecimento do

seu funcionamento anormal e de transtornos relacionados, como a esquizofrenia.

Devido à hipótese e evidências do mau funcionamento da memória de trabalho em

indivíduos com esquizofrenia, estudos vêm demonstrando várias alterações no

CPFDL em indivíduos com a doença (MacDonald e cols., in the press apud Lewis e

cols., 2005).

Existem trabalhos demonstrando que, durante alguns episódios psicóticos, em

indivíduos com esquizofrenia, existe um funcionamento anormal do CPFDL.

Blakemore e cols.(2003) demonstraram, através de experimentos com Tomografia

de Emissão Positrônica (PET), que indivíduos com esquizofrenia durante delírios,

nos quais estariam sendo passivamente controlado por alienígenas, têm maior

ativação do CPFDL esquerdo que quando realizando movimentos voluntários ou

através de movimentos passivos reais. Também foi relatada ativação do CPFDL

durante alucinação auditiva em indivíduos com esquizofrenia (Copolov e cols.,

2003). Portanto, existem evidências do funcionamento anormal do CPFDL de

indivíduos com esquizofrenia não apenas no déficit cognitivo, mas também durante

os processos psicóticos.

Algumas alterações já foram descritas, como: reduções nos níveis de RNAm para

codificação de ácido glutâmico descarboxilase (GAD67), uma enzima que sintetiza

ácido γ-aminobutírico (GABA) (Akbarian e cols., 1995; Mirnics e cols., 2000);

diminuição de níveis protéicos e RNAm do fator neurotrófico derivado do cérebro

(BDNF) e seu receptor, tirosina quinase Trk (tropomyosin-related kinase) B

(Hashimoto e cols., 2005; Takahashi e cols., 2000); redução do RNAm (Burnet e

cols., 1996) e de receptores serotoninérgicos 5-HT

(Dean e cols., 1999;

Matsumoto e cols., 2005); redução de receptores muscarínicos M

(Crook e

cols., 2001); redução de receptores dopaminérgico D

(Okubo e cols., 1997; Abi-

Dargham e cols., 2002); e aumento dos receptores canabinóides CB1 (Biegon e

Kerman, 2001; Dean e cols., 2001). No entanto, evidências sugerem que o

mecanismo de funcionamento anormal do CPFDL em indivíduos com esquizofrenia

é multifatorial.

Porém, apesar de muitas destas alterações serem descritas do CPFDL de

indivíduos com esquizofrenia, a hipótese dopaminérgica da esquizofrenia continua

sendo, após décadas de estudo, a mais proeminente das investigações desta

fisiopatologia (Bennet, 1998; Calrsson, 2001; Kasper, 2002). Sabe-se que no

CPFDL são encontrados tanto receptores dopaminérgicos D

quanto D

(Levey e

cols., 1993; Lidow e cols., 1998; Meador-Woodruff e cols., 1996).

Disfunções no mecanismo de funcionamento do sistema dopaminérgico estão

relacionadas com diversos transtornos neuropsiquiátricos. Foi demonstrado

reduções de dopamina no striatum de pacientes com Parkinson e a demonstração

que L-DOPA tem efeitos benéficos nesses pacientes tornando evidente a

importância da dopamina nesse distúrbio (Walton-Hadlock, 2005). Também foi

demonstrado que transtorno do déficit de atenção e hiperatividade (TDAH) é outra

manifestação clínica cuja etiologia é creditada a um desequilíbrio em sistemas de

neurotransmissão, entre eles o dopaminérgico. Outros quadros clínicos como

depressão maior, depressão bipolar, alcoolismo, transtorno do pânico, dependência

de drogas e déficits cognitivos estão também associados com perturbações nesse

sistema (Tsuang e cols., 2004; Tupala e Tiihonen, 2004). Já a esquizofrenia, como

foi descrito anteriormente, é um transtorno com ampla variedade de sintomas que

sugerem disfunção nos circuitos de recompensa e do córtex pré-frontal (Goldstein e

Deutch, 1992; Lewis e cols., 2005).

Recentemente, experimentos realizados com amostras de cérebro de indivíduos

com esquizofrenia foram relatados por diferentes grupos de pesquisa, os quais

estudaram a expressão de duas proteínas moduladoras da sinalização celular na

região do CPFDL, DARPP-32 e NCS-1 (Albert e cols., 2002; Ishikawa e cols., 2007;

Bai e cols., 2003; Bergson e cols., 2004).

Sabe-se que DARPP-32 é uma proteína para qual diversos sinais de segundo

mensageiros convergem (Svenningsson, 2003), sugerindo assim que seu

funcionamento normal seria de importância para o mecanismo de sinalização

dopaminérgica. Albert e cols (2002) demonstraram que DARPP-32, na região

CPFDL em esquizofrênicos, está significativamente reduzida quando comparado

com indivíduos controles pareados. O trabalho consistiu da mensuração, tanto da

quantidade de DARPP-32 quanto de outras proteínas neuronais, em amostras post-

mortem de cérebros de indivíduos com esquizofrenia. Além disso, nesse trabalho foi

demonstrado que as demais proteínas sinapsina I e subunidade alfa da proteína

quinase dependente de cálcio/calmodulina, não estavam alteradas no CPFDL de

indivíduos com esquizofrenia. Já recentemente, Ishikawa e cols (2007) demonstrarm

que indivíduos tanto CPF de indivíduos esquizofrênicos quanto bipolar tem uma

redução na expressão de DARPP-32 comparados com indivíduos normais. Apesar

da demonstração de alterações nos níveis de expressão proteica de DARPP-32 em

CPF de esquizofrênicos, os níveis de RNAm não parecem estar alterados na

mesma região (Baracskay e cols, 2006)

Li e cols (2006) investigaram a existência de mutações na DARPP-32 que poderiam

estar relacionadas coma esquizofrenia. Porém, seus resultados foram negativos,

sugerindo que a diminuição da expressão proteica de DARPP-32 no CPF não

estaria associada à nenhuma das mutações estudadas. Já Meyer-Lindenberg e cols

(2007) demonstraram em cérebros humanos postmortem, a associação entre

haplótipos e melhora de funções cognitivas dependentes da ativação frontoestriatal.

Além dos estudos, acima descritos, que demonstram evidências na alteração na

expressão de DARPP-32, e consequentemente na sinalização de segundo

mensageiros relacionado ao sistema dopaminérgico, recentemente foram

publicados dois trabalhos demonstrando alteração no sistema de regulação da

sinalização dopaminérgica em indivíduos com esquizofrenia. Sabe-se que NCS-1

tem um papel na modulação da sinalização dopaminérgica, regulando a liberação

de neurotransmissores e aumentando a sinalização via receptores D

, inibindo sua

dessensibilização (Rajebhosale e cols., 2003). No entanto, em dois trabalhos foi

demonstrado um aumento significativo nos níveis de proteína e RNAm de NCS-1 e

Calcyon, proteína responsável pela dessensibilização de D

, no CPFDL de

indivíduos com esquizofrenia, comparados com indivíduos controle, sem o

diagnóstico de esquizofrenia (Bai e cols., 2004; Koh e cols., 2003). Koh e cols.

descreveram um aumento maior que 50% nos níveis de NCS-1 na região CPFDL de

pacientes esquizofrênicos e bipolares, comparados com controles normais.

Controles para o uso de antipsicóticos e/ou estabilizadores do humor também foram

feitos, o que foi confirmado por estudo dos níveis de NCS-1 em macacos

submetidos a tratamento crônico com haloperidol, onde não foi observada diferença

significativa com o grupo controle (Negyessy e Goldman-Rakic, 2005).

Bai e cols., além de mensurar os níveis protéicos de NCS-1 e Calcyon, investigou

também os níveis de RNAm em amostras de cérebros provenientes do banco de

cérebros Brain Collection of the Mount Sinai Medical School/Bronx Veterans

Administration Medical Center. Foi demonstrado que os níveis protéicos e de RNAm

de NCS-1 e Calcyon estavam aumentados no CPFDL de indivíduos com

esquizofrenia. Nesse trabalho, foi demonstrado também um aumento de RNAm de

NCS-1 no córtex occipital de indivíduos com esquizofrenia, porém, sem o aumento

dos níveis protéicos de NCS-1. Como todos os indivíduos com esquizofrenia

estavam sob medicação de antipsicóticos, foram estudados os efeitos destes nos

níveis de NCS-1 e Calcyon em cérebros de primatas não-humanos. Como já foi

descrita a função de NCS-1 em amplificar a sinalização via D

, uma via inibitória,

suqere que o aumento desta proteína no CPFDL de indivíduos com esquizofrenia

também está associado aos seus transtornos cognitivos.

Sabe-se que estas proteínas estão envolvidas na regulação eletrofisiológica,

transcricional e respostas comportamentais a estímulos fisiológicos e

farmacológicos, incluindo antidepressivos, neurolépticos e dependência de drogas.

(Svenningsson, 2004), portanto, têm um importante papel no mecanismo de

funcionamento neuronal. Porém, apesar de já ter sido demonstrado que ambas

proteínas fazem parte da sinalização do sistema dopaminérgico e que estão

associadas à esquizofrenia, não existem estudos e nem evidências associando

NCS-1 e DARPP-32.

Foi demonstrada a localização de D

e NCS-1 em neurônios piramidais e

interneurônios no CPF de primatas (Negyessy e Goldman-Racik, 2005). No entanto,

Koh e cols, (2003) demostraram que a NCS-1 encontra-se superexpressa no córtex

pré-frontal de pacientes esquizofrênicos e bipolares postmortem. Sabe-se que o

tratamento com antipsicóticos atua na inibição por antagonistas de D

e que esse

receptor está associado à NCS-1, que o dessensibiliza. Portanto, essa associação

entre os altos níveis da NCS-1 encontrada em pacientes esquizofrênicos e bipolares

e a regulação da atividade dos receptores D

favorecem, assim, a hipótese do

envolvimento da NCS-1 em transtornos neurológicos e psiquiátricos.

2- OBJETIVOS

Objetivo geral

Investigar alterações em vias de sinalização intracelular das vias do AMPc/PKA e

Akt, em células PC12 que superexpressam estavelmente NCS-1 (Clone). Observar

se alterações na sinalização intracelular estão envolvidas com receptores

dopaminérgicos, através de tratamentos com agonistas e antagonistas

dopaminérgicos.

Verificar alteração na expressão de proteínas envolvidas na sinalização intracelular

dopaminérgica, em ratos tratados com antipsicóticos.

Objetivos específicos

- verificar a expressão de NCS-1 em células PC12 WT e Clone;

- verificar alterações na via da sinalização intracelular por AMPc nas células PC12

Clone;

- verificar alterações na via de sinalização intracelular por Akt nas células PC12

Clone.

-verificar o papel da sinalização dopaminérgica na modulação da sinalização

intracelular de células PC12 Clone

- investigar a modulação de antipsicóticos típicos e atípicos na expressão de NCS-1

e DARPP-32 in vitro.

-investigar a modulação de antipsicóticos típicos e atípicos na expressão de NCS-1

e DARPP-32 in vivo.

3– MATERIAL E MÉTODOS

3.1 – EXPERIMENTO IN VITRO



3.1.1- CULTURA CELULAR

Células PC12 (Rat pheochromocytoma) Selvagem (wild type - WT) e que

superexpressam NCS-1 de rato (Clone) foram gentilmente fornecidas pelo Dr.

Andreas Jeromin (Division of Neuroscience, Baylor College of Medicine, Vivian

Smith Building, One Baylor Plaza, Houston, Texas, USA). As células não

diferenciadas foram mantidas em meio DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s

medium) alta glicose (GIBCO) suplementadas com 5% de soro eqüino (ES)

(GIBCO), 5% de soro fetal bovino (FSB) (GIBCO), 1% de penicilina (GIBCO) e 1%

de streptomicina (GIBCO) em frascos de 50cm

na estufa a 37°C e 5% de CO

, com

troca de meio a cada 2 dias e passagens a cada 7 dias. Células Clone foram

cultivadas em meio seletivo contendo G418 (400mg/mL - Clontech).

3.1.2- DROGAS E REAGENTES

Haloperidol (H1512), Clozapina (C6305), Risperidona (R118), R-(+)SCH-23390

(D054), (±)Quinpirole (Q111), S(-)Raclopride (R121) e Forskolin (F6886) foram

adquiridos da Sigma-Aldrich Corporation. Demais reagentes eram de grau analíticos

e obtidos de fontes comerciais diversas.

3.1.2- PROCEDIMENTOS FARMACOLÓGICOS

Células PC12 WT e Clone foram tratadas com (±)Quinpirole (0,5; 1,0; 2,5; 5,0; 10,0;

25 e 50 µM) por 5 minutos e (±)Quinpirole 1 µM por 1, 2, 5, 10, 30 minutos e 1 hora

para posterior análise de fosforilação de proteina. Células PC12 WT e Clone foram

tratadas com S(-)Raclopride (0,5; 1,0 e 5 µM) por 5 minutos e Haloperidol (0,5; 1,0;

5,0; 10,0 e 25,0 µM) por 10 minutos para posterior análise de fosforilação de

proteína.

Células PC12 WT foram submetidas a privação (starving) de 1 hora e 30 minutos em

meio DMEM alta glicose (GIBCO) sem soro, DMEM baixa glicose (GIBCO) sem soro

e PBS 1x. Posteriormente as células foram tratadas com 5µM de Haloperidol, R-

(+)SCH-23390, (±)Quinpirole, S(-)Raclopride por 5 minutos para posterior análise de

fosforilação de proteína.

Células PC12 WT e Clone foram tratadas com Haloperidol (1,0; 10,0 e 20 µM),

Clozapina (20 µM) e Risperidona (20µM) por 14 dias, e Forskolin (5µM e 10 µM) por

24, 48 e 72 horas para posterior análise de expressão proteica.

3.2- EXPERIMENTO ANIMAL

3.2.1- ANIMAIS EXPERIMENTAIS

Os tratamentos de animais foram realizados pelo grupo do Prof. João Quevedo

(UNESC) e os cérebros congelados foram enviados por via aérea para nosso

laboratório em Belo Horizonte para processamento e análise.

Ratos Wistar macho (2 meses de idade) foram obtidos da colônia do Laboratório de

Neurociências da Universidade do Extremo Sul Catarinense em Criciúma. Os

animais foram mantidos em gaiolas com comida e água diponíveis ad libitum, e

mantidos em ciclos de claro/escuro de 12 horas (luzes ligadas às 07:00h). Todos os

procedimentos experimentais foram realizados de acordo com as normas para

experimentação animal do NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals e

Sociedade Brasileira de Neurociências e Comportamento (SBNeC), com a

aprovação do comitê de ética local.

3.2.2 – DROGAS E REAGENTES

Água deionizada foi obtida em sistema Milli-Q, Millipore, Bedford, MA, USA.

Haloperidol (HAL) (Haldol®) foi adquirido da Cristália Prod. Quim. e Farmacêuticos,

Itapira, Brazil. Clozapina (CLO) (Leponex®) foi adquirida da Novartis Biociências AS,

São Paulo, Brazil. Olanzapina (OLZ) (Zyprexa®) foi adquirida da Eli Lilly do Brasil

Ltda, São Paulo, Brazil. Aripiprazole (Ari) (Abilify®) foi adquirida da Bristol-Myers

Squibb, São Paulo, Brazil.

3.2.3 – PROCEDIMENTOS FARMACOLÓGICOS

Os animais receberam injeções intraperitoneais (i.p.) diárias de HAL (1,5 mg/kg),

CLO (25 mg/kg), OLZ (2,5; 5 or 10 mg/kg) ou Ari (2, 10 or 20 mg/kg) num volume de

1,0 mL/kg por 28 dias. Todas as drogas foram dissolvidas em solução salina Tween

1%. Animais controle receberam solução salina (1,0 mL/Kg). Três dias após a última

injeção, os ratos foram sacrificados por decapitação e o córtex pré-frontal (CPF), o

hippocampus (HP), striatum (ST), córtex (CX) e cerebellum (CB) foram removidos

imediatamente.

3.3 - DOSAGEM DE PROTEÍNA

Para a quantificação protéica foi utilizado o método descrito por Bradford. Entre 1,0

e 2,0μL de extrato protéico foram adicionados a 1,0mL de solução de NaCl 0,15M e

1,0mL de reagente de Bradford (0,06% (p/v) de azul de Comassie G-250 e 3% (v/v)

de ácido perclórico). Após a homogeneização, incubou-se a mistura por 2 minutos a

temperatura ambiente. Foram feitas as leituras das absorbâncias no

espectrofotômetro (Kinetics/ Endpoint System Analyser - Hitachi) no comprimento de

onda de 595nm. Em cada dosagem, uma curva de calibração com albumina bovina

(1 a 10μg) foi utilizada.

3.4 - ELISA

Foram incubadas 1 x 10

células PC12 WT e Clone em 100µL de meio DMEM alta

glicose descrito acima, em estufa a 37°C e 5% de CO

por uma noite. Os níveis de

AMPc foram determinados por imunoensaio enzimático (Biotrak, Amersham-

Biosciences) sem acetilação, conforme instruções do kit. Os valores demonstrados

através de unidades absolutas e foram corrigidos através da dosagem de proteínas

pelo método Bradford descrito acima.

3.5

- IMUNOFLUORESCÊNCIA

Para detecção de DARPP-32 e NCS-1, as células PC12 foram fixadas com metanol

gelado por 20 minutos. As células fixadas foram lavadas com PBS (Na

HPO

23mM,

NaH

6,7mM, NaCl 34,2mM, pH 7,4) gelado 2 vezes por 10 minutos. Para

detecção de D

R, D

R e TrkB, as células foram fixadas com paraformaldeído 3% por

20 minutos em temperatura ambiente. Foi feita a permeabilização com solução

bloqueadora (PBS, Triton X-100 0.1%, BSA 0.5%) por 10 minutos para a detecção

de DARPP-32 e NCS-1, e apenas bloqueio sem permeabilização para detecção de

receptores dopaminérgicos D

e D

. Em seguida as células foram incubadas

overnight a 4°C com anticorpo policlonal coelho anti-DARPP-32 (1:200 - H-62 -

Santa Cruz) e policlonal coelho anti-NCS-1 (1:200 - FL-190 - Santa Cruz). Em

seguida as células foram incubadas por 1 hora, em temperatura ambiente e

protegidas da luz, com anticorpo Alexa Fluor 488 cabra anti-coelho (1:200 -

Molecular Probes). Como controle de marcação específica, algumas lamínulas não

foram incubadas com anticorpo primário. As imagens das células foram obtidas

utilizando microscópio confocal (ver adiante).

3.6 - MICROSCOPIA CONFOCAL

As imagens foram obtidas em microscópio confocal Bio-Rad (modelo 1024,

acoplado a microscópios Zeiss - Axiovert 100), utilizando o software Lasersharp

(versão 3.1; Bio-Rad) com objetiva de 40X de imersão em óleo. Foi utilizado laser

UV de argônio (488nm) para excitar Alexa 488, e a luz emitida foi selecionada com

os filtros 522/35 para FITC. Todas as imagens foram coletadas com a mesma

configuração. As análises após a aquisição foram feitas com Lasersharp (Bio-Rad),

Confocal Assistent e Adobe Photoshop.

3.7

– MARCAÇÃO DE PROTEÍNAS INTRACELULARES PARA CITOMETRIA DE

FLUXO

Células PC12 em cultura foram incubadas com PBS EDTA 5mM, por cinco min, e

centrifugadas por 3 min a 1000g. O sobrenadante foi descartado e as células foram

ressuspensas em PBS em placas de 96 poços. Em seguida, as PC12 foram

permeabilizadas com solução de PBS contendo 0,5% de saponina, 0,1% de BSA e

2mM de azida sódica, por 30 minutos, a temperatura ambiente. Após a

permeabilização as células foram incubadas com os anticorpos primários: anticorpo

policlonal coelho anti-DARPP-32 (1:20 - H-62 - Santa Cruz) e policlonal coelho anti-

NCS-1 (1:30 - FL-190 - Santa Cruz). As preparações foram lavadas com solução de

PBS contendo 0,5% de saponina, 0,1% de BSA e incubadas por 15 min, em

temperatura ambiente e protegidas da luz, com anticorpo Alexa Fluor 488 cabra

anti-coelho (1:200 - Molecular Probes). As preparações foram novamente lavadas

com solução de PBS contendo 0,5% de saponina, 0,1% de BSA e, finalmente,

lavadas em solução de PBS contendo 2mM de azida sódica, por centrifugação a

200g, 4

C, 10 minutos. Em seguida, as células foram fixadas com solução de PBS

contendo 2% de formaldeído, para posterior aquisição FACS

CAN

Becton & Dickison.

Anticorpos Alexa Fluor 488 cabra anti-coelho foram utilizados como controles.

3.8 - AQUISIÇÃO E ANÁLISE DOS DADOS POR CITOMETRIA DE FLUXO

As preparações celulares marcadas com os anticorpos fluorescentes foram

avaliadas em citômetro de fluxo FACS

CAN

(Becton & Dickinson) após a coloração.

Durante a aquisição dos dados foram coletados 30000 eventos. Os dados coletados

foram analisados através do programa de computador Cell Quest (Becton &

Dickinson). A primeira etapa do processo de análise consistiu na determinação da

população celular de interesse. Isto foi feito baseando-se no perfil de tamanho e

granulosidade das populações adquiridas. Uma vez definida a população celular de

interesse procedeu-se às análises de fluorescência. Para isto, foram montados

gráficos pontuais de fluorescência e a delimitação dos quadrantes foi definida a

partir do posicionamento de células marcadas com os anticorpos fluorescentes,

respeitando-se a definição da população celular. Definido o posicionamento dos

quadrantes, o Cell Quest forneceu uma análise estatística dos dados, baseada na

percentagem ou no número absoluto de células posicionadas nas regiões definidas

e na intensidade de fluorescência média de expressão proteica.

3.9 - IMUNOBLOT

Para a preparação dos extratos celulares e de tecido para imunoblot, o material foi

incubado com tampão de lise (20mM MOPS – pH7, 2mM EGTA, 5mM EDTA, 30mM

Floreto de sódio, 40mM ß-glicerofosfato – pH 7,2, 20mM Pirofosfato, 1mM

Ortovanadato de sódio, 1mM Fenilmetilsulfonil fluoreto, 3mM Benzamidina, 10µM

Leupeptina e 0,5% Nonidet P40) no gelo por 30 minutos e centrifugado a 13.000 g

por 30 minutos a 4°C. O sobrenadante foi coletado e armazenado em freezer -80°C.

Extrato de hipocampo de rato foi utilizado como controle positivo. Em seguida, foram

retiradas alíquotas para dosagem de proteínas pelo método de Bradford, usando

albumina sérica bovina (BSA) como padrão. Quantidades iguais de proteína (50μg)

foram preparadas para eletroforese com tampão de amostra NuPAGE LDS

(Invitrogen) e 10% de ß-Mercaptoetanol, fervidas a 70°C por 10 minutos e aplicadas

em gel Bis-Tris NuPAGE 4-12% (Invitrogen) para eletroforese. Após eletroforese, foi

realizada transferência para membrana de nitrocelulose (Hybond - Amersham

Biosciences) e coloração com Ponceau vermelho. A eletroforese e a transferência

foram realizadas conforme orientações do kit. As membranas, para análise de

proteína total, foram incubadas em solução de bloqueio PBS (Na

HPO

23mM,

NaH

6,7mM, NaCl 34,2mM, pH 7,4) contendo 0,5% de Tween 20 e 5% de leite

desnatado por 40 minutos. Para análise de proteínas fosforiladas, as membranas

foram incubadas em solução de bloqueio TBS (Tris 20mM, NaCl 137mM, pH 7,4)

contendo 0,1% de Tween 20 e 5% de BSA por 40 minutos. Em seguida, incubaram-

se as membranas overnight a 4

C com anticorpo monoclonal camundongo anti-

actina (1:2000 - MAB1521R - Chemicon), policlonal coelho anti-DARPP-32 (1:250 -

H-62 - Santa Cruz) e policlonal coelho anti-NCS-1 (1:2000 - FL-190 - Santa Cruz),

policlonal camundongo anti-CREB (1:1000 – MAB5432 – Chemicon), policlonal

cabra anti-Calcyon (1:1000 – E20 – Santa Cruz Biotechnology), monoclonal

camundongo anti-Akt1(1:1000 – 05-591 – Upstate), policlonal coelho anti-AMPA

(1:500 – AB1504 – Chemicon), policlonal coelho anti-D2 (1:500 – AB1558 –

Chemicon), policlonal coelho anti-D1 (1:500 – AB1784P), todos diluídos em PBS

Tween 0,5%. Para análise de proteínas fosforiladas, incubou-se as membranas

overnight a 4°C com anticorpo policlonal coelho anti-p-CREB (1:1000 - AB3442 -

Chemicon), policlonal coelho anti-pDARPP-32(Thr34) (1:1000 – AB9206 –

Chemicon); policlonal coelho anti-pDARPP-32(Thr75) (1:1000 – AB9208 –

Chemicon), policlonal coelho anti-pAMPAt(Ser845) (1:1000 - AB5849 – Chemicon),

policlonal coelho anti-pAkt(Ser473) (1:1000 – sc-7985-R – Santa Cruz) diluído em

TBS Tween 0,1%. Após a incubação em anticorpos primários, as membranas foram

lavadas 3 vezes e incubadas com anticorpo secundário cabra anti-camundongo

peroxidase-linked IgG (1:7000 - Molecular Probes), cabra anti-coelho horseradish

peroxidase-linked IgG (1:15000 - Molecular Probes) ou coelho anti-cabra

horseradish peroxidase-linked IgG (1:7000 - Molecular Probes) por uma hora em

temperatura ambiente, sendo o anticorpo secundário das proteínas fosforiladas

diluído em TBS Tween 0,1% e os demais em PBS Tween 0,5%. As membranas

foram submetidas à detecção quimioluminescente conforme instruções do kit ECL

Plus (Amersham Biosciences), e vizualizadas através do ImageQuant.

3.10 – ANÁLISE DOS IMUNOBLOTS

Bandas imunorreativas não saturadas foram submetidas à varredura densitométrica

e a quantificação pelo Scion Image Software versão Beta 4.0.2 (Scion Corporation,

National Institutes of Health, USA). Os valores obtidos para proteínas total e

fosforiladas foram corrigidos pelos valores da actina.

3.11 – ANÁLISE ESTATÍSTICA

Os dados foram analisados pelo programa Sigmaplot/Sigmastat 9.0 através testes t

Student ou análise variância (ANOVA) e foram considerados estatisticamente

significativos para valores de p< 0.05 e poder >0,8.

4 - RESULTADOS

4.1 – EXPRESSÃO DE NCS-1 EM CÉLULAS PC12 Clone

Para a caracterização e a confirmação de que células PC12 Clone estão

superexpressando NCS-1, foram realizadas análises por microscopia confocal,

western blot e citometria de fluxo.

Para a visualização da expressão da proteína NCS-1, imagens foram obtidas

através da microscopia confocal. As células foram fixadas e permeabilizadas para a

marcação com anticorpo anti-NCS-1 (ver Material e Métodos). Na figura 10A

podemos observar um aumento na expressão de NCS-1 em células Clone (FIG

10Ab) quando comparadas à expressão de NCS-1 nas células WT (FIG 10Aa)

Para a caracterização bioquímica da expressão proteica de NCS-1, foram realizados

imunoblots, demonstrando que os níveis de NCS-1 estão aumentados nas células

Clone (FIG 10B). Análise quantitativa da expressão de NCS-1, normalizada com a

expressão de actina, demonstrou que a diferença entre as células WT e Clone é

significativa. A média dos níveis de NCS-1 nas células Clone é 133% maior do que

o valor da média dos níveis de NCS-1 nas células WT (FIG 10C).

Também foi verificado os níveis de expressão de NCS-1 através da citometria de

fluxo, onde células foram fixadas e permeabilizadas para a marcação com anti-NCS-

1. Foi observado que os níveis de intensidade média de fluorescência de NCS-1 são

55% maiores nas células Clone quando comparadas as células WT (FIG 10D). Foi

observado, entretanto, uma grande variação na expressão de NCS-1 nas células

Clone.

Figura 10: Níveis da expressão proteica de NCS-1 em células PC12 WT e Clone.

Imagens de células PC12 WT e Clone obtidas através de microscopia confocal

foram realizadas para visualização de expressão de NCS-1. Observa-se o aumento

de expressão de NCS-1 em células Clone (Ab) em relação às células WT (Aa).

Imunoblot com extratos de células WT e Clone foram realizados para análise de

expressão de NCS-1 (B). Quantificação da expressão das proteínas NCS-1 foi

normalizada com a expressão da actina (C). Observa-se um aumento significativo de

133% de expressão de NCS-1 nas células Clone comparadas com as células WT.

Análises por citometria de fluxo foram realizadas para avaliar os níveis de NCS-1

nas células PC12. Observou-se que a intensidade média de fluorescência nas

células Clone foi 55% maior que em células WT (D). Os experimentos de imunoblot

foram realizados em duplicata com n=9. O experimento de citometria de fluxo foi

realizado com n=11. (*p<0,01, t-student, média, desvio padrão)

4.2 – EXPRESSÃO E EXPOSIÇÃO DO RECEPTOR DOPAMINÉRGIO D

CÉLULAS PC12 SUPEREXPRESSANDO NCS-1

A liberação de dopamina (Greene e cols, 1976; Magyar e cols, 2004) e expressão

endógena de receptor dopaminérgico D

(Courtney e cols, 1991; Chiasson e cols,

2006.; Wang e cols, 2006) é bem descrita em células PC12. Porém, para confirmar

a existência deste receptor e verificar se ocorre alguma alteração na expressão de

nas células Clone, foram realizadas análises de imunoblot com anticorpo

específico anti-D

. Na figura 11A podemos observar a existência de D

. Análise

quantitativa da expressão de D

, normalizada pela expressão de actina, demonstrou

que não existe diferença nos níveis de expressão proteica do receptor

dopaminérgico D

entre células WT e Clone (FIG 11B).

Foi demonstrado que a inibição da internalização do receptor D

pela NCS-1 é

dependente da estimulação por agonistas (Kabbani e cols, 2002). Verificamos se os

níveis de exposição do receptor D

estariam alterados nas células Clone sem a

estimulação por agonistas dopaminérgicos. Células PC12 WT e Clone não

permeabilizadas foram marcadas com anti-D

e posteriormente analisadas por

citometria de fluxo. Foi observado que não existe diferença nos níveis de exposição

de D

entre as células WT e Clone sem a estimulação por agonistas (FIG 11C).

Figura 11: Níveis da expressão do receptor dopaminérgico D

em células PC12

WT e Clone.

Imunoblot com extratos de células WT e Clone foram realizados para análise de

expressão de D

(A). Quantificação da expressão das proteínas D

foi normalizada

com a expressão da actina (B). Observa-se que não existe diferença nos níveis de

expressão proteica de D

entre as células WT e Clone. Exposição de D

foi

analisada por citometria de fluxo em células PC12 WT e Clone não-permeabilizadas.

Observa-se que não existe diferença na intensidade média de fluorescência entre

células WT e Clone (C). Os experimentos de imunoblot foram realizados em

duplicata com n=4. O experimento de citometria de fluxo foi realizado com n=11. (t-

student; média e desvio padrão)

4.3 – NÍVEIS DE AMPc EM CÉLULAS PC12 SUPEREXPRESSANDO NCS-1

Sabe-se que NCS-1 diminui a dessensibilização do receptor D

quando estimulados

por agonistas (Kabbani e cols., 2002). Observamos que os níveis de expressão e

exposição do receptor dopaminérgico D

não estão alterados nas células Clone sem

estimulação por agonistas (FIG 12). Esses receptores são acoplados a proteína G,

que inibe a atividade de Adenilato Ciclase, a formação de cAMP e

conseqüentemente a ativação de PKA. Investigamos os níveis de AMPc nas células

WT e Clone para avaliar se ocorrem alterações na via de sinalização cAMP/PKA em

células PC12 superexpressando NCS-1. Foram realizadas análises ELISA para

verificação dos níveis totais de AMPc em células PC12 WT e Clone. Os valores

foram normalizados através da dosagem de proteínas. Foi observado que a média

dos níveis de AMPc em células Clone é 125% menor que média de AMPc de

células WT (FIG 12).

Figura 12 – Representação quantitativa dos níveis totais de AMPc em células

PC12 WT e Clone.

Os níveis totais de AMPc de células WT e Clone foram mensurados através de

ELISA e normalizadas através de dosagem de proteínas, demonstrando uma

diminuição de 125% de AMPc nas células Clone. Todos os experimentos foram

realizados em duplicata (*p<0,01, t-student, média, desvio padrão e n=4).

4.4 – ALTERAÇÃO NOS NÍVEIS DE EXPRESSÃO DE DARPP-32 EM CÉLULAS

PC12 SUPEREXPRESSANDO NCS-1

Para a visualização da expressão da proteína DARPP-32, imagens foram obtidas

através da microscopia confocal. As células foram fixadas e permeabilizadas para a

marcação com anticorpo anti-DARPP-32 (ver Material e Métodos). Na figura A

podemos observar uma diminuição na expressão de DARPP-32 em células Clone

(FIG 13Ab) quando comparadas à expressão de DARPP-32 nas células WT (FIG

13Aa).

Imunoblots foram realizados para verificar os níveis de expressão de DARPP-32,

demonstrando que os níveis de DARPP-32 estão reduzidos nas células Clone (FIG

13B). Análise quantitativa da expressão de DARPP-32, normalizada com a

expressão de actina, demonstrou que a diferença entre as células WT e Clone é

significativa. A média dos níveis de DARPP-32 nas células Clone é 50% menor do

que o valor da média dos níveis de DARPP-32 nas células WT (FIG 13C).

Também foram verificados os níveis de DARPP-32 através da citometria de fluxo,

onde células foram fixadas e permeabilizadas para a marcação com anti-DARPP-

32. Foi observado que os níveis de intensidade média de fluorescência são 50%

menor nas células Clone quando comparadas as células WT (FIG 13D).

Figura 13: Diminuição dos níveis de expressão de DARPP-32 em células PC12

NCS-1.

Imagens de células PC12 WT e Clone obtidas através de microscopia confocal

foram realizadas para visualização de expressão de DARPP-32. Observa-se a

diminuição de expressão de DARPP-32 em células Clone (Ab) em relação às

células WT (Aa). Imunoblot com extratos de células WT e Clone foram realizados

para análise de expressão de DARPP-32 (B). Quantificação da expressão das

proteínas DARPP-32 foi normalizada com a expressão da actina (C). Observa-se

uma diminuição significativa na expressão de DARPP-32 nas células Clone

comparadas com as células WT. Análises por citometria de fluxo foram realizadas

para avaliar os níveis de DARPP-32 nas células PC12. Observou-se que a

intensidade média de fluorescência nas células Clone foi 50% menor que em células

WT (D). Os experimentos de Imunoblot foram realizados em duplicata com n=9. O

experimento de citometria de fluxo foi realizado com n=11. (*p<0,01, t-student,

média e desvio padrão).

4.5 – ALTERAÇÃO NOS NÍVEIS DE FOSFORILAÇÃO DE DARPP-32 NA

TREONINA 34 EM CÉLULAS PC12 SUPEREXPRESSANDO NCS-1

Sabe-se que AMPc ativa a quinase PKA (Hayes e Mayer, 1981). Após a observação

de que as células Clone apresentavam menores níveis de AMPc, investigamos se

os níveis de fosforilação de DARPP-32 na Treonina 34, um dos sítios de fosforilação

de PKA, em células Clone estariam menores que em células WT. Para verificar

possíveis alterações nos níveis de pDARPP-32(Thr34) e consequente ativação de

DARPP-32, foram realizados imunoblots utilizando-se anticorpos específicos anti-

pDARPP-32(Thr34). Foi observado que os níveis de pDARPP-32(Thr34) estão

diminuídos nas células Clone quando comparadas com células WT (FIG 14A).

Análise quantitativa da fosforilação de DARPP-32 na Thr34, normalizada pela razão

DARPP-32/actina, demonstrou que a diferença entre as células WT e Clone é

significativa. A média dos níveis de pDARPP-32(Thr34) nas células Clone é 290%

menor do que o valor da média dos níveis de NCS-1 nas células WT (FIG 14B).

Figura 14: Níveis de fosforilação de DARPP-32 na Treonina 34 em células PC12

WT e Clone.

Imunoblot com extratos de células WT e Clone foram realizados para análise dos

níveis de pDARPP-32(Thr34) (A). Quantificação dos níveis de DARPP-32(Thr34) foi

normalizada pela razão DARPP-32/actina (B). Observou-se os níveis de pDARPP-

32(Thr34) são 290% menor nas células Clone quando comparados com as células

WT. (*p<0,01; t-student, média e desvio padrão; N=3)

4.6 – ALTERAÇÃO NOS NÍVEIS DE FOSFORILAÇÃO DE CREB NA SERINA 133

EM CÉLULAS PC12 SUPEREXPRESSANDO NCS-1

Outro sítio relevante de fosforilação por PKA é a Serina-133 do fator de transcrição

CREB (Ofir e cols., 1991). Após a observação de que as células Clone

apresentavam menores níveis de AMPc e menores níveis de pDARPP-32(Thr34),

investigamos os níveis de pCREB(Ser133). Primeiramente foram verificados se os

níveis de CREB total estariam alterados nas células Clone. Foram realizados

imunoblots com anticorpo anti-CREB (FIG 15A) e, análise quantitativa da expressão

de CREB, normalizada pela expressão de actina, demonstrou que não existe

diferença entre as células WT e Clone (FIG 15B). Para verificar os níveis de

pCREB(Ser133) nas células WT e Clone, foram realizados imunoblots

demonstrando que células Clone têm níveis menores de pCREB(Ser133) quando

comparados com células WT (FIG 15A). Análise quantitativa dos níveis de

pCREB(Ser133), normalizada com a razão CREB/actina, demonstrou que a média

dos níveis de pCREB(Ser133) nas células Clone é 74% menor que os níveis nas

células WT (FIG 15C)

Figura 15 - Níveis de CREB e pCREB(Ser133) em células PC12 WT e Clone

Imunoblot com extratos de células WT e Clone foram realizados para análise dos

níveis de CREB. (A). Quantificação dos níveis de CREB foi normalizada pelos níveis

de expressão de actina. Observou-se que não existe diferença nos níveis de CREB

entre células WT e Clone (B). Para verificar os níveis de pCREB(Ser133) foi

realizado imunoblot (A). Quantificação dos níveis de pCREB(Ser133) foi

normalizada pela razão DARPP-32/actina (C). Observou-se que os níveis de

pCREB(Ser133) são 74% menor nas células Clone quando comparados com as

células WT. (*p<0,05, t-student, média, desvio padrão e n=3).

4.7 –NÍVEIS DE FOSFORILAÇÃO DE DARPP-32 NA TREONINA 75 EM

CÉLULAS WT E CLONE

Foi demonstrado que os níveis de cAMP, pDARPP-32(Thr34) e pCREB(Ser133)

estão reduzidos nas células Clone. Além do sítio de fosforilação na Thr34, a

proteína DARPP-32 apresenta outros 3 sítios de fosforilação, sendo um destes a

Thr75 que é fosforilada pela cdk5 e desfosforilada pela PP-2A. A DARPP-32,

quando fosforilada na Thr75, inibe a atividade de PKA, diminuindo sua própria

fosforilação na Thr34. Sabe-se que tanto NCS-1 quanto cdk5 estão envolvidos na

diferenciação celular (Cheng e cols, 2001; Cheung e cols, 2007). Portanto, para

verificar se a via cdk5/p35 também estaria alterada nas células Clone, verificamos

se os níveis de pDARPP-32(Thr75) estariam alterados nestas células. Foram

realizados imunoblots utilizando-se anticorpos específicos para anti-pDARPP-

32(Thr75) (FIG 16A). Análise quantitativa da fosforilação de DARPP-32(Thr75),

normalizada pela razão DARPP-32/actina, demonstrou que não existe diferença

entre as células WT e Clone (FIG 16B).

Figura 16: Níveis de fosforilação de DARPP-32 na Treonina 75 em células PC12

WT e Clone.

Imunoblot com extratos de células WT e Clone foram realizados para análise dos

níveis de pDARPP-32(Thr75) (A). Quantificação dos níveis de DARPP-32(Thr75) foi

normalizada pela razão DARPP-32/actina (B). Observou-se que não existe diferença

nos níveis de pDARPP-32(Thr75) entre células Clone e células WT. (p=0,88; t-

student, média e desvio padrão; N=10)

4.8 – EXPRESSÃO DO RECEPTOR DOPAMINÉRGICO D

E NÍVEIS DE

EXPRESSÃO DE CALCYON EM CÉLULAS PC12 WT E CLONE

Calcyon é uma proteína sensora de cálcio que interage com receptor dopaminérgico

(Lezcano e cols., 2000) e modula seu estado de afinidade (Lidow e cols., 2001).

Foi demonstrado que CPF de indivíduos com esquizofrenia e transtorno bipolar têm

um aumento nos níveis de RNAm e expressão proteica de Calcyon (Koh e cols.,

2003, Baracskay e cols., 2006). Portanto, para verificar a expressão endógena do

receptor dopaminérgico D

, e se existe alguma alteração nos níveis de Calcyon nas

células Clone, foram realizados imunoblots de extratos de células WT e Clone com

anticorpos anti-D

e anti-Calcyon (FIG 17A-B). Análise quantitativa dos níveis de

Calcyon, normalizada pela expressão de actina, demonstrou que não existe

diferença entre as células WT e Clone (FIG 17B).

Figura 17: Níveis de Calcyon em células PC12 WT e Clone.

Imunoblot com extratos de células WT e Clone foram realizados para análise dos

níveis de D

(A) e Calcyon (B). Quantificação dos níveis de Calcyon foi normalizada

pela expressão de actina (C). Observou-se que não existe diferença nos níveis de

Calcyon entre células Clone e células WT. (p=0,79; t-student, média e desvio

padrão; N=6)

4.9 –NÍVEIS DE EXPRESSÃO DO RECEPTOR AMPA E FOSFORILAÇÃO DE

AMPA NA SERINA 845 EM CÉLULAS PC12 SUPEREXPRESSANDO NCS-1

Sabe-se que pDARPP-32(Thr34),é um potente inibidor de PP-1. Um dos alvos para

desfosforilação por PP-1 é a Ser845 do receptor AMPA (Greengard e cols, 2001).

Após a observação de que as células Clone apresentavam menores níveis de

pDARPP-32(Thr34), investigamos se os níveis de pAMPA(Ser845) também

estariam alterados nas células Clone. Primeiramente foram verificados os níveis de

expressão do receptor AMPA estariam alterados. Foram realizados imunoblots com

anticorpo anti-AMPA (FIG 18A), e análise quantitativa dos resultados da expressão

de AMPA, normalizada pela expressão de actina, demonstrou que não existe

diferença entre as células WT e Clone (FIG 18B). Para verificar os níveis de

pAMPA(Ser845) nas células WT e Clone, foram realizados imunoblots com

anticorpos específicos (FIG 18A). Análise quantitativa dos resultados dos níveis de

pAMPA(Ser845), normalizada pela razão AMPA/actina, demonstrou existir diferença

entre a média dos níveis de pAMPA(Ser845) nas células WT e Clone, porém sem

diferença estatisticamente significativa (FIG 18C).

Figura 18 - Níveis de AMPA e pAMPA(Ser845) em células PC12 WT e Clone

Imunoblot com extratos de células WT e Clone foram realizados para análise dos

níveis de AMPA. (A). Quantificação dos níveis de AMPA foi normalizada pelos níveis

de expressão de actina. Observou-se que não existe diferença nos níveis de AMPA

entre células WT e Clone (B). Para verificar os níveis de pAMPA(Ser845) foi

realizado imunoblot (A). Quantificação dos níveis de pAMPA(Ser845) foi

normalizada pela razão AMPA/actina (C). Observou-se que não existe diferença nos

níveis de pAMPA(Ser845) nas células Clone quando comparados com as células

WT. (p=0,22, t-student, média, desvio padrão e n=4).

4.10 –NÍVEIS DE EXPRESSÃO DE AKT E FOSFORILAÇÃO DE AKT NA SERINA

473 EM CÉLULAS PC12 SUPEREXPRESSANDO NCS-1

Dois trabalhos demonstraram que NCS-1 não altera a fosforilação de Akt na Ser473

(Mora e cols, 2002; Kapp-Barnea e cols 2006). Já Nakamura e cols (2006)

demonstraram que NCS-1 aumenta os níveis de fosforilação de Akt em cultura

primária de neurônios corticais. Nair & Sealfon (2003) também demonstraram que a

estimulação de D

por bromocriptina leva a ativação de PI3K através de c-Src e,

consequentemente, a fosforilação de Akt na Serina 473, inibindo a apoptose

induzida por H

. Após a observação de alterações na sinalização da via

AMPc/PKA nas células Clone, investigamos se a via mediada por Akt também

estaria alterada nas mesmas. Foram realizados imunoblots com anticorpo anti-Akt1

(FIG 19A), e análise quantitativa de resultados da expressão de Akt1, normalizada

pela expressão de actina, demonstrou que não existe diferença entre as células WT

e Clone (FIG 19B). Para verificar os níveis de pAkt(Ser473) nas células WT e Clone,

foram realizados imunoblots com anticorpos específicos (FIG 19A). Análise

quantitativa de resultados parciais dos níveis de pAkt(Ser473), normalizada através

darazão Akt/actina, demonstrou não existir diferença entre a média dos níveis de

pAkt(473) nas células Clone e células WT (FIG 19C).

Figura 19 - Níveis de Akt e pAkt(Ser473) em células PC12 WT e Clone

Imunoblot com extratos de células WT e Clone foram realizados para análise dos

níveis de Akt1. (A). A quantificação dos níveis de Akt foi normalizada pelos níveis de

expressão de actina. Observou-se que não existe diferença nos níveis de Akt1 entre

células WT e Clone (B). Para verificar os níveis de pAkt(Ser473) foi realizado

Imunoblot (A). Quantificação dos níveis de pAkt(Ser473) foi normalizada pela razão

Akt1/actina (C). Observou-se que não existe diferença nos níveis de pAkt(473) nas

células Clone quando comparados com as células WT. (p>0,8, t-student, média,

desvio padrão e n=7).

4.11 –NÍVEIS DE EXPRESSÃO DE DARPP-32 E FOSFORILAÇÃO DE DARPP-32

NA TREONINA 34 EM CÉLULAS PC12 WT E CLONE TRATADAS 5 MINUTOS

COM QUINPIROLE

NCS-1 interage com receptores dopaminérgicos D

, inibindo sua internalização

induzida por agonistas (Kabbani e cols, 2002). Apesar de observarmos uma

diminuição da ativação da via AMPc/PKA, não encontramos aumento nos níveis de

receptores expostos na membrana celular (FIG 11C). Porém, para investigarmos se

existe diferença entre celulas WT e Clone, na resposta à estimulação da sinalização

dopaminérgica do receptor D

, células PC12 WT e Clone foram tratadas por 5

minutos com Quinpirole (agonista específico de D

) nas concentrações 0,5µM,

1,0µM, 2,5µM, 5,0µM, 10,0µM, 25µM e 50,0µM. Para análise da resposta ao

tratamento, foi investigado os níveis de pDARPP-32(Thr34). Foram realizados

imunoblots com anticorpos específicos anti-DARPP-32 e anti-pDARPP-32(Thr34).

Análise quantitativa dos resultados dos níveis de DARPP-32 normalizada pela

actina demonstrou que tratamento com Quinpirole não altera a expressão de

DARPP-32 (FIG 20A-B). Análise quantitativa dos resultados dos níveis de pDARPP-

32(Thr34) normalizada pela razão DARPP-32/Actina demonstrou ausência na

alteração dos níveis de fosforilação de DARPP-32 na Thr34 (FIG 20C-D) após

tratamento das células PC12 com Quinpirole por 5 minutos.

Figura 20: Níveis de fosforilação de DARPP-32 na Treonina 34 em células PC12

WT e Clone tratadas 5 minutos com diversas concentrações de Quinpirole

Imunoblot com extratos de células WT e Clone foram realizados para análise dos

níveis de DARPP-32 e pDARPP-32(Thr34). Quantificação dos níveis de DARPP-32

foi normalizada pelos níveis de expressão de actina. Observou-se que, tanto nas

células WT quanto nas células Clone, não ocorre alteração nos níveis de expressão

de DARPP-32 após tratamento com Quinpirole em diversas concentrações, por 5

minutos (A-B). Quantificação dos níveis de pDARPP-32(Thr34) foi normalizada pela

razão DARPP-32/actina. Observou-se que, tanto nas células WT quanto nas células

Clone, não ocorre alteração nos níveis de pDARPP-32(Thr34) após tratamento com

Quinpirole em diversas concentrações, por 5 minutos (C-D). (p>0,2, one way

ANOVA, média, desvio padrão e n=8).

4.12 –NÍVEIS DE EXPRESSÃO DE DARPP-32 E FOSFORILAÇÃO DE DARPP-32

NA TREONINA 34 EM CÉLULAS PC12 WT E CLONE TRATADAS COM

QUINPIROLE 1µM

Não foi observado alterações nos níveis de pDARPP-32(Thr34), tanto em células

WT quanto em células Clone, tratadas com Quinpirole por 5 minutos em diversas

concentrações (FIG 20). Para investigar a necessidade de um tempo maior para

alteração da fosforilação de DARPP-32 na Thr34 com o tratamento com Quinpirole,

células PC12 WT e Clone foram tratadas com Quipirole 1µM por 1 minuto, 2

minutos, 5 minutos, 10 minutos, 30 minutos e 1 hora. Foram realizados imunoblots

com anticorpos específicos anti-DARPP-32 e anti-pDARPP-32(Thr34). Análise

quantitativa dos resultados dos níveis de DARPP-32 normalizada pela actina

demonstrou que tratamento com Quinpirole 1µM por diversos períodos de tempo

não altera a expressão de DARPP-32 (FIG 21A-B). Análise quantitativa dos

resultados dos níveis de pDARPP-32(Thr34) normalizada pela razão DARPP-

32/Actina demonstrou ausência na alteração dos níveis de fosforilação de DARPP-

32 na Thr34 após tratamento das células PC12 com Quinpirole 1µM por diversos

períodos de tempo (FIG 21C-D).

Figura 21: Níveis de fosforilação de DARPP-32 na Treonina 34 em células PC12

WT e Clone tratadas com Quinpirole 1µM por diversos períodos de tempo

Imunoblot com extratos de células WT e Clone foram realizados para análise dos

níveis de DARPP-32 e pDARPP-32(Thr34). Quantificação dos níveis de DARPP-32

foi normalizada pelos níveis de expressão de actina. Observou-se que, tanto nas

células WT quanto nas células Clone, não ocorre alteração nos níveis de expressão

de DARPP-32 após tratamento com Quinpirole 1µM por diversos períodos de tempo

(A-B). Quantificação dos níveis de pDARPP-32(Thr34) foi normalizada pela razão

DARPP-32/actina. Observou-se que, tanto nas células WT quanto nas células Clone,

não ocorre alteração nos níveis de pDARPP-32(Thr34) após tratamento com

Quinpirole 1µM em diversos períodos de tempo (C-D). (média, desvio padrão e n=2).



4.13 –NÍVEIS DE EXPRESSÃO DE DARPP-32 E FOSFORILAÇÃO DE DARPP-32

NA TREONINA 34 EM CÉLULAS PC12 WT E CLONE TRATADAS 5 MINUTOS

COM RACLOPRIDE

Não foram observadas alterações nos níveis de pDARPP-32(Thr34), tanto em

células WT quanto em células Clone, tratadas com Quinpirole em diversas

concentrações por 5 minutos (FIG 20) e Quinpirole 1µM por diversos períodos de

tempo (FIG 21). Para investigarmos se existe diferença entre células WT e Clone,

na resposta à inibição da sinalização dopaminérgica do receptor D

, células PC12

WT e Clone foram tratadas por 5 minutos com Raclopride (antagonista específico de

) 0,5µM, 1,0µM e 5µM. Foram realizados imunoblots com anticorpos específicos

anti-DARPP-32 e anti-pDARPP-32(Thr34). Análise quantitativa dos resultados dos

níveis de DARPP-32 normalizada pela actina demonstrou que tratamento por 5

minutos com Raclopride 0,5µM, 1,0µM e 5µM não altera a expressão de DARPP-32

(FIG 22A-B). Análise quantitativa dos resultados dos níveis de pDARPP-32(Thr34)

normalizada pela razão DARPP-32/Actina demonstrou ausência na alteração dos

níveis de fosforilação de DARPP-32 na Thr34 após tratamento das células PC12

por 5 minutos com Raclopride 0,5µM, 1,0µM e 5µM (FIG 22C-D).

Figura 22: Níveis de fosforilação de DARPP-32 na Treonina 34 em células PC12

WT e Clone tratadas 5 minutos com diferentes concentrações de Raclopride

Imunoblot com extratos de células WT e Clone foram realizados para análise dos

níveis de DARPP-32 e pDARPP-32(Thr34). Quantificação dos níveis de DARPP-32

foi normalizada pelos níveis de expressão de actina. Observou-se que, tanto nas

células WT quanto nas células Clone, não ocorre alteração nos níveis de expressão

de DARPP-32 após tratamento por 5 minutos com Raclopride em diversas

concentrações (A-B). Quantificação dos níveis de pDARPP-32(Thr34) foi

normalizada pela razão DARPP-32/actina. Observou-se que, tanto nas células WT

quanto nas células Clone, não ocorre alteração nos níveis de pDARPP-32(Thr34)

após tratamento por 5 minutos com Raclopride em diversas concentrações (C-D).

(média, desvio padrão e n=2).



4.14 –NÍVEIS DE EXPRESSÃO DE DARPP-32 E FOSFORILAÇÃO DE DARPP-32

NA TREONINA 34 EM CÉLULAS PC12 WT E CLONE TRATADAS 10 MINUTOS

COM HALOPERIDOL

Não foram observadas alterações nos níveis de pDARPP-32(Thr34), tanto em

células WT quanto em células Clone, tratadas com Quinpirole em diversas

concentrações por 5 minutos (FIG 20), Quinpirole 1µM por diversos períodos de

tempo (FIG 21) e Raclopride (FIG 22) em diversas concentrações por 5 minutos.

Para investigarmos se existe diferença entre células WT e Clone, na resposta à

inibição da sinalização dopaminérgica do receptor D

com antipsicótico típico,

células PC12 WT e Clone foram tratadas por 10 minutos com Haloperidol 0,5µM,

1,0µM, 5,0µM, 10,0µM e 25,0µM. Foram realizados imunoblots com anticorpos

específicos anti-DARPP-32 e anti-pDARPP-32(Thr34). Análise quantitativa dos

resultados dos níveis de DARPP-32 normalizada pela actina demonstrou que

tratamento por 10 minutos com Haloperidol 0,5µM, 1,0µM, 5,0µM, 10,0µM e 25,0µM

não altera a expressão de DARPP-32 (FIG 23A-B). Análise quantitativa dos

resultados dos níveis de pDARPP-32(Thr34) normalizada pela razão DARPP-

32/Actina demonstrou ausência na alteração dos níveis de fosforilação de DARPP-

32 na Thr34 após tratamento das células PC12 por 10 minutos com Haloperidol

0,5µM, 1,0µM, 5,0µM, 10,0µM e 25,0µM (FIG 23C-D).

Figura 23: Níveis de fosforilação de DARPP-32 na Treonina 34 em células PC12

WT e Clone tratadas 10 minutos com diferentes concentrações de Haloperidol

Imunoblot com extratos de células WT e Clone foram realizados para análise dos

níveis de DARPP-32 e pDARPP-32(Thr34). Quantificação dos níveis de DARPP-32

foi normalizada pelos níveis de expressão de actina. Observou-se que, tanto nas

células WT quanto nas células Clone, não ocorre alteração nos níveis de expressão

de DARPP-32 após tratamento por 10 minutos com Haloperidol em diversas

concentrações (A-B). Quantificação dos níveis de pDARPP-32(Thr34) foi

normalizada pela razão DARPP-32/actina. Observou-se que, tanto nas células WT

quanto nas células Clone, não ocorre alteração nos níveis de pDARPP-32(Thr34)

após tratamento por 10 minutos com Haloperidol em diversas concentrações (C-D).

(p>0,1, One way ANOVA, média, desvio padrão e n=4).

4.15 –NÍVEIS DE EXPRESSÃO DE DARPP-32 E FOSFORILAÇÃO DE DARPP-32

NA TREONINA 34, EM CÉLULAS PC12 WT SUBMETIDAS À 1 HORA 30

MINUTOS DE STARVING, TRATADAS 5 MINUTOS COM 5µM DE QUINPIROLE,

RACLOPRIDE, HALOPERIDOL E SCH-23390

Não foram observadas alterações nos níveis de pDARPP-32(Thr34), tanto em

células WT quanto em células Clone, tratadas com Quinpirole em diversas

concentrações por 5 minutos (FIG 20), Quinpirole 1µM por diversos períodos de

tempo (FIG 21), Raclopride em diversas concentrações por 5 minutos (FIG 22) e

Haloperidol em diversas concentrações por 10 minutos. Para investigarmos se

diferentes meios de cultura, os quais as células PC12 são mantidas, alteram as

respostas aos tratamentos com agonistas e antagonistas específicos, células PC12

WT foram submetidas ao starving por 1hora e 30 minutos em meio DMEM alta

glicose sem soro, DMEM baixa glicose sem soro e PBS. Após starving as células

foram tratadas 5 minutos com 5µM de Quinpirole, Raclopride, Haloperidol e SCH-

23390 (antagonista específico de D

). Foram realizados imunoblots com anticorpos

específicos anti-DARPP-32 e anti-pDARPP-32(Thr34). Análise quantitativa dos

resultados dos níveis de DARPP-32 normalizada pela actina demonstrou que após

1hora e 30 minutos de starving, tratamento com 5µM de Quinpirole, Raclopride,

Haloperidol e SCH-23390 por 5 minutos não altera a expressão de DARPP-32 (FIG

24A-C-E-G). Análise quantitativa dos resultados dos níveis de pDARPP-32(Thr34)

normalizada pela razão DARPP-32/Actina demonstrou inconsistência na alteração

dos níveis de fosforilação de DARPP-32 na Thr34 após tratamento das células

PC12 por 5 minutos com 5µM de Quinpirole, Raclopride, Haloperidol e SCH-23390

(FIG 24B-D-F-H).

Figura 24 - Níveis de fosforilação de DARPP-32 na Treonina 34 em células

PC12 WT submetidas à 1 hora 30 minutos de starving, tratadas 5 minutos com

5µM de quinpirole, raclopride, haloperidol e sch-23390

Imunoblot com extratos de células WT foram realizados para análise dos níveis de

DARPP-32 e pDARPP-32(Thr34). Quantificação dos níveis de DARPP-32 foi

normalizada pelos níveis de expressão de actina. Observou-se que nas células WT

não ocorre alteração nos níveis de expressão de DARPP-32 em células tratadas 5

minutos com 5µM de Quinpirole, Raclopride, Haloperidol e SCH-23390 após starving

de 1 hora e 30 minutos(A-C-E-G). Quantificação dos níveis de pDARPP-32(Thr34)

foi normalizada pela razão DARPP-32/actina. Observou-se inconsistência nas

alterações nos níveis de fosforilação de DARPP-32 na Thr34 de células WT tratadas

por 5 minutos com 5µM de Quinpirole, Raclopride, Haloperidol e SCH-23390 após

starving de 1 hora e 30 minutos (B-D-F-H). (n=1).

4.16 –NÍVEIS DE EXPRESSÃO DE DARPP-32 E NCS-1 EM CÉLULAS PC12 WT

E CLONE TRATADAS COM FORSKOLIN 5µM E 10µM

É bem conhecido que antipsicóticos típicos são potentes antagonistas do receptor

dopaminérgico D

. Para verificar se o aumento da atividade da via AMPc/PKA por

tempo prolongado alteraria expressão proteica de NCS-1 e DARPP-32, células

PC12 WT e Clone foram tratadas com Forskolin 5µM e 10µM por 24 e 48 horas.

Para análise sobre a influência da via AMPc/PKA na expressão de DARPP-32 e

NCS-1, foram realizados imunoblots com anticorpos específicos. Análise

quantitativa dos resultados dos níveis de NCS-1 normalizada pela actina

demonstrou que tratamento de células PC12 WT e Clone com tanto com Forskolin

5µM (FIG 25A-B) quanto 10µM (FIG 25E-F) por 24 horas e 48 horas não altera a

expressão de NCS-1. Análise quantitativa dos resultados dos níveis de DARPP-32

normalizada pela actina demonstrou que tratamento de células PC12 WT e Clone

com Forskolin 5µM (FIG 25C-D) e 10µM (FIG 25G-H) por 24 horas e 48 horas não

alteram a expressão de DARPP-32.



Figura 25: Níveis de expressão de NCS-1 e DARPP-32 em células PC12 WT e

Clone tratadas com Forskolin 5µM e 10µM por 24 e 48 horas

Imunoblot com extratos de células WT e Clone foram realizados para análise dos

níveis de NCS-1 e DARPP-32. Quantificação dos níveis de DARPP-32 foi

normalizada pelos níveis de expressão de actina. Observou-se que, tanto nas

células WT quanto nas células Clone, não ocorre alteração nos níveis de expressão

de NCS-1 após 24 horas e 48 horas de tratamento Forskolin 5µM e 10µM (A-B-E-F).

Quantificação dos níveis de DARPP-32 foi normalizada pela actina. Observou-se

que, tanto nas células WT quanto nas células Clone, não ocorre alteração nos níveis

de DARPP-32 após 24 horas e 48 horas de tratamento com Forskolin 5µM e 10µM

(C-D-G-H). (p>0,1, one way ANOVA, média, desvio padrão e n=6).

4.17 –NÍVEIS DE EXPRESSÃO DE DARPP-32 E NCS-1 EM CÉLULAS PC12 WT

E CLONE TRATADAS 14 DIAS COM ANTIPSICÓTICOS TÍPICOS E ATÍPICOS

Estudos recentes demonstraram um aumento dos níveis de NCS-1 (Bai e cols.,

2004; Koh e cols., 2003) e redução de DARPP-32 (Albert e cols., 2002; Ishikawa e

cols, 2007) no CPF de esquizofrênicos e bipolares. Para investigar se tratamento

crônico com antipsicóticos típicos e atípicos alteram expressão de NCS-1 e DARPP-

32, células PC12 WT e Clone foram tratadas com Haloperidol 1,0µM, 10,0µM e

20,0µM, Risperidona 20,0µM e Clozapina 20,0µM, por 14 dias. Para análise da

expressão de NCS-1 e DARPP-32, foram realizados imunoblots com anticorpos

específicos. Análise quantitativa dos resultados dos níveis de NCS-1 normalizada

pela actina demonstrou que tratamento de células PC12 WT e Clone com

antipsicóticos típicos e atípicos por 14 dias não alteram os níveis de expressão de

NCS-1 (FIG 26A-B). Análise quantitativa dos resultados dos níveis de DARPP-32

normalizada pela actina demonstrou que tratamento de células PC12 WT e Clone

com antipsicóticos típicos e atípicos por 14 dias não alteram os níveis de expressão

de DARPP-32 (FIG 26C-D).

Figura 26: Níveis de NCS-1 e DARPP-32 células PC12 WT e Clone tratados com

Haloperidol 1µM, 10µM e 20µM, Risperidona 20µM e Clozapina 20µM por 14

dias.

Foram realizados imunoblots para análise dos níveis de NCS-1 e DARPP-32.

Quantificação dos níveis de DARPP-32 foi normalizada pelos níveis de expressão de

actina. Observou-se que, tanto nas células WT quanto nas células Clone, não ocorre

alteração nos níveis de expressão de NCS-1 após 14 dias de tratamento com

antipsicóticos típicos e atípicos (A-B). Quantificação dos níveis de DARPP-32 foi

normalizada pela actina. Observou-se que, tanto nas células WT quanto nas células

Clone, não ocorre alteração nos níveis de DARPP-32 após 14 dias de tratamento

com antipsicóticos típicos e atípicos (C-D). (p>0,1, one way ANOVA, média, desvio

padrão e n=3).

4.18 –CONTROLE PARA INVESTIGAÇÃO DOS NÍVEIS DE EXPRESSÃO DE

DARPP-32 E NCS-1 EM RATOS SUBMETIDOS AO TRATAMENTO COM

ANTIPSICÓTICOS TÍPICOS E ATÍPICOS POR 28 DIAS

Foi observado que, em experimento in vitro, células PC12 WT e Clone tratadas com

antipsicóticos típicos e atípicos por 14 dias não apresentam alteração nos níveis de

expressão de NCS-1 e DARPP-32 (FIG 26). Para verificar se ocorre alteração nos

níveis de expressão proteica de NCS-1 e DARPP-32 em animais tratados com

antipsicóticos típicos e atípicos, ratos Wistar receberam, intraperitonealmente,

injeções de HAL (1,5 mg/kg), CLO (25 mg/kg), OLZ (2,5; 5 ou 10 mg/kg) ou Ari (2,

10 or 20 mg/kg) por 28 dias. Foram analisadas a expressão de NCS-1 e DARPP-32

em cinco diferentes regiões cerebrais: córtex pré-frontal, hippocampus, striatum,

córtex e cerebellum. Os fármacos HAL, CLO, OLZ e Ari foram solubilizados em

solução salina Tween1%, portanto, para controle experimental, foi analisado se

existe alteração nos níveis de NCS-1 e DARPP-32 no cérebro de ratos tratados com

solução salina e solução salina Tween1%. Foram realizados imunoblots com

anticorpos específicos e análise quantitativa dos resultados dos níveis de NCS-1

normalizada pela actina demonstrou que não existe diferença nos níveis de

expressão de NCS-1 no cérebro de ratos submetidos a solução salina e solução

salina Tween1% (FIG 27A). Imunoblots com anticorpos específicos e análise

quantitativa dos resultados dos níveis de NCS-1 normalizada pela actina também

demonstrou que não existe diferença nos níveis de expressão de DARPP-32 no

cérebro de ratos submetidos a solução salina e solução salina Tween1% (FIG 27B).

Figura 27: Níveis de NCS-1 e DARPP-32 no córtex pré-frontal, hippocampus,

striatum, córtex e cerebellum de ratos Wistar submetidos a injeções i.p. de

solução salina e solução salina Tween1%.

Foram realizados imunoblots para análise controle dos níveis de NCS-1 e DARPP-

32. Quantificação dos níveis de NCS-1 foi normalizada pelos níveis de expressão de

actina. Observou-se que ratos submetidos a 28 dias de injeções i.p. de solução

salina Tween1% não tem alteração nos níveis de expressão de NCS-1 (A).

Quantificação dos níveis de DARPP-32 foi normalizada pelos níveis de expressão de

actina. Observou-se que ratos submetidos a 28 dias de injeções i.p. de solução

salina Tween1% não tem alteração nos níveis de expressão de DARPP-32 (A).

(p>0,7, t student, média, desvio padrão e n=3)

4.19 –NÍVEIS DE EXPRESSÃO DE DARPP-32 E NCS-1 NO CÓRTEX PRÉ-

FRONTAL DE RATOS SUBMETIDOS AO TRATAMENTO COM

ANTIPSICÓTICOS TÍPICOS E ATÍPICOS POR 28 DIAS

Foi demonstrado que células PC12 WT e Clone tratadas com antipsicóticos típicos e

atípicos por 14 dias não apresentam alteração nos níveis de expressão de NCS-1 e

DARPP-32 (FIG 26). Para verificar se ocorre alteração nos níveis de expressão de

NCS-1 e DARPP-32 no córtex pré-frontal de ratos tratados com antipsicóticos

típicos e atípicos, ratos Wistar receberam, intraperitonealmente, injeções de SAL,

HAL (1,5 mg/kg), CLO (25 mg/kg), OLZ (2,5; 5 or 10 mg/kg) ou Ari (2, 10 or 20

mg/kg) por 28 dias. Foram realizados imunoblots com anticorpos específicos anti-

NCS-1 e anti-DARPP-32. Análise quantitativa dos resultados dos níveis de NCS-1

normalizada pela actina demonstrou que não existe diferença nos níveis de

expressão de NCS-1 no córtex pré-frontal de ratos submetidos a tratamentos com

antipsicóticos típicos e atípicos por 28 dias (FIG 28A). Imunoblots com anticorpos

específicos e análise quantitativa dos resultados dos níveis de DARPP-32

normalizada pela actina também demonstrou que não existe diferença nos níveis de

expressão de DARPP-32 no córtex pré-frontal de ratos submetidos a tratamentos

com antipsicóticos típicos e atípicos (FIG 28B).

Figura 28: Níveis de NCS-1 e DARPP-32 no córtex pré-frontal de ratos Wistar

submetidos a 28 dias de tratamento com antipsicóticos típicos e atípicos.

Foram realizados imunoblots para análise de NCS-1 e DARPP-32. Quantificação

dos níveis de NCS-1 foi normalizada pelos níveis de expressão de actina. Observou-

se que ratos submetidos a 28 dias de tratamento com antipsicóticos típicos e

atípicos não têm alteração nos níveis de expressão de NCS-1 (A). Quantificação dos

níveis de DARPP-32 foi normalizada pelos níveis de expressão de actina. Observou-

se que ratos submetidos a 28 dias de tratamento com antipsicóticos típicos e

atípicos não têm alteração nos níveis de expressão de DARPP-32 (B). (p>0,1, One

Way ANOVA, média, desvio padrão e n=6)

4.20 –NÍVEIS DE EXPRESSÃO DE DARPP-32 E NCS-1 NO HIPPOCAMPUS DE

RATOS SUBMETIDOS AO TRATAMENTO COM ANTIPSICÓTICOS TÍPICOS E

ATÍPICOS POR 28 DIAS

Foi demonstrado que o córtex pré-frontal de ratos wistar tratados com antipsicóticos

tí[icos e atípicos por 28 dias não apresentam alteração nos níveis de expressão de

NCS-1 e DARPP-32 (FIG 28). Para verificar se ocorre alteração nos níveis de

expressão de NCS-1 e DARPP-32 no hippocampus de ratos tratados com

antipsicóticos típicos e atípicos, ratos Wistar receberam, intraperitonealmente,

injeções de SAL, HAL (1,5 mg/kg), CLO (25 mg/kg), OLZ (2,5; 5 or 10 mg/kg) ou Ari

(2, 10 or 20 mg/kg) por 28 dias. Foram realizados imunoblots com anticorpos

específicos anti-NCS-1 e anti-DARPP-32. Análise quantitativa dos resultados dos

níveis de NCS-1 normalizada pela actina demonstrou que não existe diferença nos

níveis de expressão de NCS-1 no hippocampus de ratos submetidos a tratamentos

com antipsicóticos típicos e atípicos por 28 dias (FIG 29A). Imunoblots com

anticorpos específicos e análise quantitativa dos resultados dos níveis de DARPP-

32 normalizada pela actina também demonstrou que não existe diferença nos níveis

de expressão de DARPP-32 no hippocampus de ratos submetidos a tratamentos

com antipsicóticos típicos e atípicos (FIG 29B).

Figura 29: Níveis de NCS-1 e DARPP-32 em hippocampus de ratos Wistar

submetidos a 28 dias de tratamento com antipsicóticos típicos e atípicos.

Foram realizados imunoblots para análise de NCS-1 e DARPP-32. Quantificação dos

níveis de NCS-1 foi normalizada pelos níveis de expressão de actina. Observou-se

que hippocampus de ratos submetidos a 28 dias de tratamento com antipsicóticos

típicos e atípicos não têm alteração nos níveis de expressão de NCS-1 (A).

Quantificação dos níveis de DARPP-32 foi normalizada pelos níveis de expressão de

actina. Observou-se que hippocampus de ratos submetidos a 28 dias de tratamento

com antipsicóticos típicos e atípicos não têm alteração nos níveis de expressão de

DARPP-32 (B). (p>0,1, One Way ANOVA, média, desvio padrão e n=6)

4.21 –NÍVEIS DE EXPRESSÃO DE DARPP-32 E NCS-1 NO STRIATUM DE

RATOS SUBMETIDOS AO TRATAMENTO COM ANTIPSICÓTICOS TÍPICOS E

ATÍPICOS POR 28 DIAS

Foi demonstrado que o córtex pré-frontal e hippocampus de ratos wistar tratados

com antipsicóticos típicos e atípicos por 28 dias não apresentam alteração nos

níveis de expressão de NCS-1 e DARPP-32 (FIG 28-29). Para verificar se ocorre

alteração nos níveis de expressão de NCS-1 e DARPP-32 no striatum de ratos

tratados com antipsicóticos típicos e atípicos, ratos Wistar receberam,

intraperitonealmente, injeções de SAL, HAL (1,5 mg/kg), CLO (25 mg/kg), OLZ (2,5;

5 or 10 mg/kg) ou Ari (2, 10 or 20 mg/kg) por 28 dias. Foram realizados imunoblots

com anticorpos específicos anti-NCS-1 e anti-DARPP-32. Análise quantitativa dos

resultados dos níveis de NCS-1 normalizada pela actina demonstrou que não existe

diferença nos níveis de expressão de NCS-1 no striatum de ratos submetidos a

tratamentos com antipsicóticos típicos e atípicos por 28 dias (FIG 30A). Imunoblots

com anticorpos específicos e análise quantitativa dos resultados dos níveis de

DARPP-32 normalizada pela actina também demonstrou que não existe diferença

nos níveis de expressão de DARPP-32 no striatum de ratos submetidos a

tratamentos com antipsicóticos típicos e atípicos (FIG 30B).

Figura 30: Níveis de NCS-1 e DARPP_32 em striatum de ratos Wistar

submetidos a 28 dias de tratamento com antipsicóticos típicos e atípicos.

Foram realizados imunoblots para análise de NCS-1 e DARPP-32. Quantificação dos

níveis de NCS-1 foi normalizada pelos níveis de expressão de actina. Observou-se

que striatum de ratos submetidos a 28 dias de tratamento com antipsicóticos típicos

e atípicos não têm alteração nos níveis de expressão de NCS-1 (A). Quantificação

dos níveis de DARPP-32 foi normalizada pelos níveis de expressão de actina.

Observou-se que striatum de ratos submetidos a 28 dias de tratamento com

antipsicóticos típicos e atípicos não têm alteração nos níveis de expressão de

DARPP-32 (B). (p>0,1, One Way ANOVA, média, desvio padrão e n=6)

100

4.22 –NÍVEIS DE EXPRESSÃO DE DARPP-32 E NCS-1 NO CÓRTEX RESTANTE

DE RATOS SUBMETIDOS AO TRATAMENTO COM ANTIPSICÓTICOS TÍPICOS

E ATÍPICOS POR 28 DIAS

Foi demonstrado que o córtex pré-frontal, hippocampus e striatum de ratos wistar

tratados com antipsicóticos típicos e atípicos por 28 dias não apresentam alteração

nos níveis de expressão de NCS-1 e DARPP-32 (FIG 28-29-30). Para verificar se

ocorre alteração nos níveis de expressão de NCS-1 e DARPP-32 no córtex de ratos

tratados com antipsicóticos típicos e atípicos, ratos Wistar receberam,

intraperitonealmente, injeções de SAL, HAL (1,5 mg/kg), CLO (25 mg/kg), OLZ (2,5;

5 or 10 mg/kg) ou Ari (2, 10 or 20 mg/kg) por 28 dias. Foram realizados imunoblots

com anticorpos específicos anti-NCS-1 e anti-DARPP-32. Análise quantitativa dos

resultados dos níveis de NCS-1 normalizada pela actina demonstrou que não existe

diferença nos níveis de expressão de NCS-1 no córtex de ratos submetidos a

tratamentos com antipsicóticos típicos e atípicos por 28 dias (FIG 31A). Imunoblots

com anticorpos específicos e análise quantitativa dos resultados dos níveis de

DARPP-32 normalizada pela actina também demonstrou que não existe diferença

nos níveis de expressão de DARPP-32 no córtex de ratos submetidos a tratamentos

com antipsicóticos típicos e atípicos (FIG 31B).

101

Figura 31: Níveis de NCS-1 e DARPP-32 córtex restante de ratos Wistar

submetidos a 28 dias de tratamento com antipsicóticos típicos e atípicos.

Foram realizados imunoblots para análise de NCS-1 e DARPP-32. Quantificação dos

níveis de NCS-1 foi normalizada pelos níveis de expressão de actina. Observou-se

que córtex de ratos submetidos a 28 dias de tratamento com antipsicóticos típicos e

atípicos não têm alteração nos níveis de expressão de NCS-1 (A). Quantificação dos

níveis de DARPP-32 foi normalizada pelos níveis de expressão de actina. Observou-

se que córtex de ratos submetidos a 28 dias de tratamento com antipsicóticos típicos

e atípicos não têm alteração nos níveis de expressão de DARPP-32 (B). (p>0,1, One

Way ANOVA, média, desvio padrão e n=6)

102

4.23 –NÍVEIS DE EXPRESSÃO DE DARPP-32 E NCS-1 NO CEREBELLUM DE

RATOS SUBMETIDOS AO TRATAMENTO COM ANTIPSICÓTICOS TÍPICOS E

ATÍPICOS POR 28 DIAS

Foi demonstrado que o córtex pré-frontal, hippocampus, striatum e córtex de ratos

wistar tratados com antipsicóticos típicos e atípicos por 28 dias não apresentam

alteração nos níveis de expressão de NCS-1 e DARPP-32 (FIG 28-29-30-31). Para

verificar se ocorre alteração nos níveis de expressão de NCS-1 e DARPP-32 no

cerebellum de ratos tratados com antipsicóticos típicos e atípicos, ratos Wistar

receberam, intraperitonealmente, injeções de SAL, HAL (1,5 mg/kg), CLO (25

mg/kg), OLZ (2,5; 5 or 10 mg/kg) ou Ari (2, 10 or 20 mg/kg) por 28 dias. Foram

realizados imunoblots com anticorpos específicos anti-NCS-1 e anti-DARPP-32.

Análise quantitativa dos resultados dos níveis de NCS-1 normalizada pela actina

demonstrou que não existe diferença nos níveis de expressão de NCS-1 no

cerebellum de ratos submetidos a tratamentos com antipsicóticos típicos e atípicos

por 28 dias (FIG 32A). Imunoblots com anticorpos específicos e análise quantitativa

dos resultados dos níveis de DARPP-32 normalizada pela actina também

demonstrou que não existe diferença nos níveis de expressão de DARPP-32 no

cerebellum de ratos submetidos a tratamentos com antipsicóticos típicos e atípicos

(FIG 32B).

103

Figura 32: Níveis de NCS-1 e DARPP-32 cerebellum de ratos Wistar submetidos

a 28 dias de tratamento com antipsicóticos típicos e atípicos.

Foram realizados imunoblots para análise de NCS-1 e DARPP-32. Quantificação dos

níveis de NCS-1 foi normalizada pelos níveis de expressão de actina. Observou-se

que cerebellum de ratos submetidos a 28 dias de tratamento com antipsicóticos

típicos e atípicos não têm alteração nos níveis de expressão de NCS-1 (A).

Quantificação dos níveis de DARPP-32 foi normalizada pelos níveis de expressão de

actina. Observou-se que cerebellum de ratos submetidos a 28 dias de tratamento

com antipsicóticos típicos e atípicos não têm alteração nos níveis de expressão de

DARPP-32 (B). (p>0,1, One Way ANOVA, média, desvio padrão e n=6)

104

5 – DISCUSSÃO

105

A NCS-1 é encontrada em terminações pré e pós-sinápticas de interneurônios e

neurônios piramidais do neocórtex de primatas humanos e não-humanos, co-

localizando com receptores dopaminérgicos D

, sugerindo assim que tenha função

na modulação da transmissão sináptica dopaminérgica (Martone e cols., 1999; Chen

e cols., 2002; Negyesse e Goldman-Rakic, 2005). A sinalização pelo receptor D

inibe tanto a formação de AMPc e consequentemente a fosforilação de DARPP-32

na Treonina 34, quanto a ativaçao de Akt pela fosforilação na Treonina 308.

Foram encontradas alterações nos níveis de expressão NCS-1 e DARPP-32 no CPF

de indivíduos com esquizofrenia. Recentes estudos demonstraram que existe

redução dos níveis de expressão de DARPP-32 (Albert e cols., 2002; Ishikawa e

cols, 2007) e aumento dos níveis de expressão protéica e RNAm de NCS-1 (Bai e

cols., 2004; Koh e cols., 2003) no CPF de indivíduos com esquizofrenia. Porém, não

existem relatos descrevendo correlação entre NCS-1 e a sinalização por DARPP-32.

Portanto, com o objetivo de investigar essa correlação utilizamos células PC12 WT

e células PC12 superexpressando NCS-1.

Primeiramente caracterizamos as células Clone para verificar a superexpressão de

NCS-1. Através da microscopia confocal, observamos um aumento considerável dos

níveis de NCS-1 nas células Clone (FIG 10). Observamos através de imunoblot e

citometria de fluxo os níveis de NCS-1 e confirmamos que células Clone têm um

aumento significativo de expressão de NCS-1 comparado com as células WT (FIG

10). Também observamos que estas células apresentavam uma localização celular

de NCS-1 equivalente à localização demonstrada por Koizumi e cols.(2002), com

uma presença considerável na superfície celular (FIG 10).

106

Através de um mecanismo de adaptação, o receptor dopaminérgico D

é fosforilado

pela GRK2, formando um complexo D

-Arrestina-GRK2 que é responsável pela

internalização e dessensibilização deste receptor (Kuprinick & Benovic, 1998; Ito e

cols., 1999; Iwata e cols., 1999; Kim e cols., 2001). Recentemente, foi demonstrado

que NCS-1 inibe a dessensibilização de D

quando estimulado com agonista

(Kabbani, e cols., 2002; Bergsson e cols., 2003). A liberação de dopamina (Greene

e cols, 1976; Magyar e cols, 2004) e expressão endógena de receptor

dopaminérgico D

(Courtney e cols, 1991; Chiasson e cols, 2006.; Wang e cols,

2006) já é descrita em células PC12. Porém, para confirmar a existência deste

receptor e verificar se ocorre alguma alteração na expressão de D

nas células

Clone, foram realizadas análises de imunoblot com anticorpo específico anti-D

Observamos a existência desse receptor nas células PC12 WT e Clone, porém, não

existe diferença nos níveis de expressão de D

entre células WT e Clone (FIG 11).

Imagens obtidas através de imunofluorescência e microscopia confocal também

demonstraram a existência de receptores D

nas células PC12 (dados não

publicados). Também observamos, através de citometria de fluxo em células PC12

não-permeabilizadas e marcadas com anti-D

, que não existe diferença na

exposição de D

entre as células PC12 WT e Clone (FIG 11). Porém, estas células

não foram estimuladas com agonistas como demonstrado por Kabbani e cols

(2002).

Como o receptor dopaminérgico D

modula a sinalização da via AMPc/PKA,

verificamos através de ELISA se os níveis de AMPc estariam alterados em células

Clone. Apesar de McFerran e cols (1999) não observarem alteração nos níveis de

107

AMPc em células cromafins bovinas expressando NCS-1, observamos uma

diminuição significativa dos níveis de AMPc nas células Clone (FIG 12), sugerindo a

modulação da formação de AMPc pela NCS-1.

Uma das funções bem conhecidas de PKA é a fosforilação de DARPP-32(Thr34) o

que a torna um importante inibidor de PP-1. Após a observação de que os níveis de

AMPc estavam alterados nas células Clone, verificamos a ativação de DARPP-32

nessas células. Primeiramente, observamos através de microscopia confocal que

células Clone apresentavam uma diminuição considerável dos níveis de DARPP-32

(FIG 13). Através de imunoblot e citometria de fluxo, confirmamos que essa

diminuição é significativa (FIG 13). Verificamos então os níveis de ativação de

DARPP-32 através de imunoblot e observamos uma diminuição significativa nos

níveis de pDARPP-32(Thr34) nas células Clone (FIG 14). Sugerimos então que

NCS-1 altera a sinalização por DARPP-32.

Outra função conhecida da PKA é sua capacidade para fosforilar CREB na Serina

133, que ativa o fator de transcrição CRE (Svenningsson, 2004). Como foi

demostrado uma diminuição de AMPc e pDARPP-32(Thr34), verificamos se os

níveis de pCREB(Ser133) estariam alterados nas células Clone. Observamos,

através de imunoblot, que os níveis de pCREB(Ser133) estão significativamente

menores nas células Clone (FIG 15). Sugerimos que essa diminuição da ativação de

CREB é mais uma evidência da diminuição da ativação da via AMPc / PKA nas

células Clone.

108

Porém, a regulação de pDARPP(Thr34) também pode ser regulada pela PP-2B cuja

ativação é regulada por Ca

Além de PP-2B, Ca

também ativa PP-2A, que

desfosforila pDARPP-32(Thr75). A fosforilação de DARPP-32 na Treonina 75 inibe a

fosforilação de pDARPP-32(Thr34) por PKA (Lindskog e cols., 2006). Portanto,

verificamos se alterações da fosforilação de pDARPP-32(Thr75) estariam envolvidas

na alteração de pDARPP-32(Thr34) nas células Clone. Através de imunobot

observamos que não existem diferenças nos níveis de pDARPP-32(Thr75) entre as

células WT e Clone (FIG 16). Sugerimos portanto que a diminuição dos níveis de

pDARPP-32(Thr34) nas células Clone ocorre através da diminuição da atividade da

via AMPc / PKA.

Outra alteração descrita no CPF de esquizofrênicos foi o aumento da expressão de

Calcyon (Koh e cols., 2003; Baracskay e cols., 2006). Calcyon interage com o

receptor dopaminérgico D

(Lezcano e cols., 2000) modulando seu estado ativo

(Lidow e cols., 2001). Como Calcyon e NCS-1 modulam o sinergismo da sinalização

intracelular dopaminérgica, verificamos se os níveis de Calcyon estariam alterados

na células Clone. Como demonstrado na Figura 17, não observamos diferença nos

níveis de Calcyon entre células WT e Clone.

Sabe-se que o receptor glutamatérgico AMPA é um dos alvos de PP-1. Portanto,

para verificar se os níveis de pAMPA(Ser845) estariam alterados nas células Clone,

realizamos imunoblot e observamos que existe diferença tanto nos níveis de

expressão do receptor AMPA quanto nos nos níveis de pAMPA(Ser845) entre

células WT e Clone (FIG 18). Porém, não observamos diferença estatisticamente

significativa. Como essa fosforilação ocorre no decorrer da cascata da sinalização,

109

sugerimos que outras modulações devem ocorrer nesse mesmo receptor, já que

NCS-1 também aumenta a liberação de glutamato (Guimarães e cols, dados não

publicados).

Trabalhos recentes demonstraram que NCS-1 não altera fosforilação de Akt na

Ser473 (Mora e cols, 2002; Kapp-Barnea e cols 2006). Sabe-se também que, além

da via clássica do AMPc/PKA, foi descrito que a ativação de receptors D

alteram a

ativação da via Akt (Brami-Cherrier e cols, 2002; Beaulieu e cols, 2007).

Recentemente, trabalhos demonstraram diferentes resultados na fosforilação de Akt

na Ser473 pelo receptor D

(Nair & Sealfon, 2003; Beaulieu e cols, 2004).

Verificamos se os níveis de pAkt(Ser473) estariam alterados nas células Clone

através de imunoblot e observamos que não existe diferença tanto na expressão de

Akt quanto na fosforilacão de Akt na Ser473 entre as células WT e Clone (FIG 19).

Foi demonstrado que CPF de esquizofrênicos e bipolares têm uma diminuição na

expressão de DARPP-32 (Albert e cols., 2002; Ishikawa e cols, 2007). Também

observamos uma dminuição na expressão de DARPP-32 nas células Clone (FIG

13), sugerindo um possível papel de NCS-1 na modulação da expressão de

DARPP-32. Recentes trabalhos demonstraram que NCS-1 não altera fosforilação de

Akt na Ser473 (Mora e cols, 2002; Kapp-Barnea e cols 2006) ou aumenta os níveis

de fosforilação de Akt (Nakamura e cols., 2006). Como descrito anteriormente, a

fosforilação de Akt na Thr308 por TrkB aumenta a expressão de DARPP-32

(Stroppolo e cols, 2002; Bogushi e cols, 2007). Portanto, são necessários estudos

demonstrando se existe alteração na fosforilação de Akt na Thr308 em células PC12

110

Clone e posteriormente, caso exista alteração nos níveis desta fosforilação, se esta

alteração está envolvida na expressão de DARPP-32.

Como citado anteriormente, sabe-se que a liberação de dopamina (Greene e cols,

1976; Magyar e cols, 2004) e expressão endógena de receptor dopaminérgico D

(Courtney e cols, 1991; Chiasson e cols, 2006.; Wang e cols, 2006) já é descrita em

células PC12. Sabe-se também que NCS-1 inibe a dessensibilização de D

quando

estimulado com agonista (Kabbani, e cols., 2002; Bergsson e cols., 2003).

Demonstramos que existe uma diminuição significativa nos níveis de AMPc,

DARPP-32, pDARPP-32(Thr34) e pCREB(Ser133) nas células PC12 Clone (FIG 12,

13, 14 e 15). Inicialmente sugerimos a existência de uma maior inibição na

internalização de D

devido a superexpressão de NCS-1. Porém, demonstramos

que células Clone não apresentavam níveis maiores de expressão e exposição na

membrana de D

(FIG 11). Portanto, para avaliarmos a função do receptor D

alteração da fosforilação de DARPP-32 na Thr34 em células Clone, realizamos

tratamentos com agonistas e antagonistas dopaminérgicos específicos. Realizamos

tratamentos com o agonista de D

, Quinpirole, em diferentes concentrações e em

diferentes períodos de tempo, porém não observamos alterações nos níveis de

pDARPP-32(Thr34) nas células PC12 WT e Clone (FIG 20-21). Realizamos

tratamentos com antagonista de D

, Raclopride, emdiversas concentrações por 5

minutos e não observamos alterações nos níveis de pDARPP-32(Thr34) tanto nas

células PC12 WT quanto nas Clone (FIG 22). Posteriormente realizamos

tratamentos com antipsicótico típico, Haloperidol, forte antagonista de D

, em

diversas concentrações por 10 minutos e também não observamos alterações nos

111

níveis de pDARPP-32(Thr34), tanto nas células PC12 WT quanto nas células Clone

(FIG 23).

Como observamos, diversos tratamentos com agonista, antagonista e antipsicótico

típico em células PC12 não alteraram os níveis de fosforilação de DARPP-32 na

Thr34. Sabe-se que diferentes reagentes em que as células são mantidas em

cultura, como soro e fatores de crescimento, alteram a ativação de diversas vias de

sinalização (Nakao e cols., 1996; Harthill e cols., 2002; Bogush e cols., 2007).

Portanto, para verificar se o meio de cultura em que células PC12 estavam sendo

mantidas, estaria influenciando na resposta das PC12 aos tratamentos, realizamos

starving de 1 hora e 30 minutos, em células PC12 WT, com meio DMEM alta glicose

sem soro, verificando a influência do soro, DMEM baixa glicose sem soro,

verificando a influência da glicose, e PBS, verificando a influência do fenol. Após o

período de starving, as células foram tratadas por 5 minutos com Quinpirole 5µM,

Raclopride 5µM, Haloperidol 5µM e SCH-23390 5µM (antagonista específico de D

Porém, não observamos alteração nos níveis de pDARPP-32(Thr34) nas células

PC12 WT após os tratamentos (FIG 24). Também foi observado a ausência na

fosforilação de DARPP-32 na Thr34 em células PC12 WT e Clone diferenciadas

tratadas com Raclopride 5 e 10µM por 10 e 30 minutos (resultados não mostrados).

Foi observado que células PC12 superexpressando NCS-1 apresentam uma

diminuição da ativação da via AMPc/PKA. Porém, células PC12 não apresentaram

resposta aos tratamentos com agonistas e antagonistas dopaminérgicos

específicos. Portanto, sugerimos que a modulação da sinalização intracelular pela

NCS-1 é independente da sinalização dopaminérgica.

112

Observamos que células Clone apresentam diminuição dos níveis de AMPc. Sabe-

se que AMPc modula a atividade de NCS-1, aumentando sua interação com

receptor D

(Kabbani e cols., 2002), e de DARPP-32, fosforilando-a na Thr34

(Svenningsson e col., 2004). Observamos que células PC12 WT e Clone tratadas

com Forskolin 5µM e 10µM por 24, 48 e 72 horas, não apresentaram alterações nos

níveis de expressão de NCS-1 e DARPP-32 (FIG 25). Portanto, sugerimos que a

alteração nos níveis de expressão de DARPP-32 nas células Clone não é modulada

pela diminuição da atividade da via AMPc/PKA, e que expressão de NCS-1 não é

modulada pela ativação da mesma via.

Alterações nos níveis de expressão proteica e mRNA de NCS-1 e DARPP-32 foram

encontradas CPF de indivíduos com esquizofrenia. Foi observado que tratamento

crônico por 14 dias com antipsicóticos típicos e atípicos, em células PC12 WT e

Clone, não alteraram os níveis de expressão de NCS-1 e DARPP-32 (FIG 26).

Também foi observado que tratamento crônico por 28 dias com antipsicóticos típicos

e atípicos em ratos Wistar não altera a expressão de NCS-1 e DARPP-32 nas

regiões do CPF, hippocampus, striatum, córtex e cerebellum (FIG 27-32).

Sugerimos, com estes resultados in vitro e in vivo, que as alterações nos níveis de

NCS-1 e DARPP-32 no CPF de esquizofrênicos não estão associados aos

tratamentos com antipsicóticos, mas sim à patologia em si.

Durante testes para memória operacional, foi observado uma diminuição da

ativação do CPFDL de indivíduos com esquizofrenia comparados com indivíduos do

grupo controle. Foi demonstrado a colocalização de receptor D2 e NCS-1 em

113

neurônios piramidais do CPF de primatas e que existe um aumento na expressão de

NCS-1 no CPFDL de indivíduos com esquizofrenia. Também foi demonstrada a

diminuição na expressão proteica de DARPP-32 na mesma região além do

envolvimento de polimorfismos de base única (SNP) em DARPP-32 com morfologia

fronto-estriatal e funções cognitivas. Podemos inferir que a diminuição da atividade

da via AMPc/PKA pela NCS-1, independentemente de receptores dopaminérgicos

diminui a ativação de redes neuronais piramidais, e consequentemente o

funcionamento cognitivo normal para formulação de pensamentos complexos e

inibição latente.

Foi demonstrado que durante processos psicóticos, tanto na alucinação quanto

delírio, ocorre a ativação anormal do CPFDL de indivíduos com esquizofrenia.

Também foi demonstrado a colocalização de receptor D2 e NCS-1 em

interneurônios do CPF de primatas e, como descrito anteriormente, existe um

aumento na expressão de NCS-1 no CPFDL de indivíduos com esquizofrenia além

da a diminuição de DARPP-32 na mesma região. Podemos inferir que a diminuição

da atividade da via AMPc/PKA diminui a ativação de interneurônios e

consequentemente a modulação da ativação cortical normal do CPFDL.

Recentes trabalhos demonstraram que a superexpressão de NCS-1 em cultura de

células neuronais protegem estas contra a morte celular causada por diversos

agentes estressores. No mesmo trabalho foi demonstrado que NCS-1 está

aumentado em neurônios do núcleo dorsal motor de ratos após axotomia,

demonstrando seu papel na regeneração (Nakamura e cols., 2006). Diversos

trabalhos demonstraram uma diminuição da massa cortical de indivíduos

114

esquizofrênicos e que proteínas envolvidas na sinalização anti-apoptótica, como

Akt, BDNF e TrkB, estão diminuídas no CPF de indivíduos com esquizofrenia

(Hazlett e cols., 2008, Emamian e cols., 2004, Hashimoto e cols., 2005; Welckert e

cols., 2003; Takahashi e cols., 2000). Sugerimos que a NCS-1 esteja envolvida

portanto, num mecanismo de proteção neuronal devido às alterações na sinalização

de sobrevivência celular. Através do aumento da expressão de NCS-1 em

consequência da alteração desta via de sinalização, pode-se ocorrer alteração na

sinalização intracelular do AMPc/PKA/DARPP-32 indepententemente de dopamina,

como demonstramos neste trabalho, e consequentemente, alterações cognitivas

nesse indivíduo.

Além de alterações dopaminérgicas no CPFDL de indivíduos com esquizofrenia,

sabe-se que existem outras alterações, como a diminuição dos níveis de RNAm e

protéicos de BDNF e seu receptor, TrkB (Hashimoto e cols., 2005; Welckert e cols.,

2003; Takahashi e cols., 2000). Como já foi discutido, a ativação de TrkB por BDNF,

aumenta a expressão de DARPP-32 através da fosforilação de Akt (Stroppolo e

cols., 2001) na Thr308. Portanto, podemos sugerir que a diminuição de BDNF e

TrkB no CPFDL de indivíduos com esquizofrenia pode ter participação na

diminuição de DARPP-32 na mesma região cerebral.

Demonstramos que NCS-1 modula a sinalização da via AMPc/PKA e a expressão

de DARPP-32 independentemente da sinalização dopaminérgica, sugerindo assim

ser um importante modulador da transdução de neurotransmissão. Porém, ainda é

necessário uma investigação sobre quais os mecanismos envolvidos nesta

modulação. Também demonstramos que tratamento crônico com antipsicóticos não

115

alteram os níveis de expressão de NCS-1 e DARPP-32 em células PC12 e em

diferentes regiões cerebrais de ratos, sugerindo que as alterações observadas no

CPF de esquizofrênicos estão associadas à patologia, e não ao tratamento. Deve-se

levar em consideração a limitação ds modelos in vitro e in vivo para mimetizar

características principais da esquizofrenia. Portanto, somente a caracterização dos

diversos elementos dessas vias de sinalização pode colaborar na elucidação dos

mecanismos relacionados à esquizofrenia e seu tratamento farmacológico.

116

6 - CONCLUSÃO

117

Células PC12 superexpressando NCS-1 apresentam níveis de AMPc,

pCREB(Ser133), DARPP-32 e pDARPP-32(Thr34) menores que as células WT. As

mesmas apresentam níveis de AMPA e pAMPA(Ser845) alterados, porém sem

diferença estatística significativa. Não existe diferença dos níveis de pDARPP-

32(Thr75) entre células PC12 WT e superexpressando NCS-1, sugerindo qua as

vias dependentes de CK1 / CDK5 e PP2A não estão alteradas, e que a diminuição

da fosforilação de DARPP-32 na Treonina 34 não está modulada por outros sítios

de fosforilação de DARPP-32. Não existe diferença nos níveis de Calcyon, Akt e

pAkt(Thr473) entre células PC12 WT e células que superexpressam NCS-1,

sugerindo que outras vias não estão alteradas (FIG 33).

Não existe diferença nos níveis de expressão e exposição do receptor

dopaminérgico D

, sem estímulo por agonistas, entre células PC12 WT e Clone.

Tambem foi demonstrada a presença do receptor dopaminérgico D

nas mesmas.

Porém, diversos tratamentos com agonistas e antagonistas dopaminérgicos não

alteraram a sinalização AMPc/PKA e a expressão de DARPP-32, sugerindo que a

superexpressão de NCS-1 modula a sinalização intracelular da via AMPc/PKA e

expressão de DARPP-32 por via independente dos receptors dopaminérgicos (FIG

34-36).

Tanto células PC12 WT e Clone, quanto ratos wistar, submetidos ao tratamento

crônico com antipsicóticos típicos e atípicos não apresentaram alteração na

expressão de NCS-1 e DARPP-32. (FIG 37-38)

118



Células WT Células Clone

Figura 33 – Alterações na via do AMPc/PKA em células PC12

superexpressando NCS-1

Foi demonstrado que células PC12 Clone têm diversas alterações na via do

AMPc/PKA, independente de receptores de dopamina. Células PC12 Clone,

superexpressando NCS-1, apresentam menores níveis de AMPc, DARPP-32,

pDARPP-32(Thr34), pCREB(Ser133) e pAMPA(Ser845). Também foi observado

que estas apresentam níveis aumentados de receptores AMPA e nenhuma

alteração nos níveis de receptores dopaminérgicos D

e D

e exposição de D

membrana celular. Também não foi observado nenhuma alteração nos níveis de

CREB, pDARPP-32(Thr75), Calcyon, Akt e pAkt(Ser473).

119

Figura 34 – Tratamentos com agonistas e antagonistas dopaminérgicos para

avaliação de pDARPP-32(Thr34).

Células PC12 foram tratadas em diferentes tempos com diversas concentrações de

Quinpirole para avaliação da fosforilação de DARPP-32 na Thr34. Estas também

foram tratadas com Raclopride por 5 minutos com diversas concentrações e

Haloperidol por 10 minutos em diversas concentrações. Não foi observado alteração

nos níveis de pDARPP-32(Thr34) em nenhum dos tratamentos.

120

Figura 35 – Tratamentos com agonistas e antagonistas dopaminérgicos após

starving de 1 hora e 30 minutos para avaliação de pDARPP-32(Thr34)

Células PC12 foram tratadas por 5 minutos com 5µM de Quinpirole, Raclopride,

Haloperidol e SCH-23390, após 1 hora e 30 minutos de starving. Foram feitos

starvings em meios de cultura sem soro, com baixa glicose e sem fenol para testar

se alguns reagentes encontrados no meio de cultura celular estariam impedindo a

fosforilação de DARPP-32 na Thr34 através de tratamentos com agonistas e

antagonistas dopaminérgicos específicos. Não foi observado alteração nos níveis de

pDARPP-32(Thr34) em nenhum dos tratamentos após diferentes starvings.

121

Figura 36 – Tratamentos com Raclopride em células PC12 diferenciadas por 3

dias para avaliação de pDARPP-32(Thr34)

Células PC12 foram diferenciadas por 3 dias com NGF e tratadas por 10 e 30

minutos com três diferentes concentrações de Raclopride, 1µM, 5µM e 10µM, para

avaliação dos níveis de fosforilação de DARPP-32 na Thr34. Não foi observado

alteração nos níveis de pDARPP-32(Thr34) em nenhum dos tratamentos após a

diferenciação celular.

122

Figura 37 – Níveis de expressão de DARPP-32 e NCS-1 em células PC12 WT e

Clone tratadas com forskolin, antipsicóticos típicos e atípicos.

Células PC12 foram tratadas com forskolin em duas concentrações, 5µM e 10µM,

por 1dia, 2 dias e 3 dias. Células PC12 também foram tratadas com antipsicótico

típico, Haloperidol em três concentrações, 1µM, 5µM e 10µM, e antipsicóticos

atípicos, Risperidona e Clozapina a 20µM, por 14 dias. Não foi observado alteração

nos níveis de DARPP-32 e NCS-1 nas células PC12 WT e Clone em nenhum dos

tratamentos.

123

Figura 38 – Níveis de expressão de DARPP-32 e NCS-1 em regiões cerebrais

de ratos wistar submetidos ao tratamento com antipsicóticos típicos e atípicos

por 28 dias.

Ratos wistar foram tratados com antipsicótico típico, Haloperidol, e antipsicóticos

atípicos, Clozapina, Olanzapina em três concentrações, e Aripiprazole em três

concentrações, por 28 dias. Foram analisados os níveis de expressão de DARPP-32

e NCS-1 em cinco regiões cerebrais após o tratamento: córtex pré-frontal,

hippocampus, striatum, cortex restante e cerebellum. Foi demonstrado que

nenhuma das regiões cerebrais de ratos têm alteração nos níveis de DARPP-32 e

NCS-1 após o tratamento com antipsicóticos típicos e atípicos por 28 dias.

124

7 - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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145

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: As quatro vias dopaminérgicas

Figura 2: Vias de síntese e degradação de dopamina

Figura 3: Modulação da adenilato ciclase

Figura 4: Efeitos da sinalização dopaminérgica tanto na via AMPc quanto na via Akt

Figura 5: Mecanismo de internalização e dessensibilização de receptor

metabotrópico

Figura 6: Sinalização dopaminérgica em neurônios pós-sinápticos

Figura 7: Sítios de fosforilação da DARPP-32

Figura 8: Funções de proteínas sensoras de cálcio

Figura 9: Modulação de GRK2/D2 por NCS-1

Figura 10: Níveis da expressão proteica de NCS-1 em células PC12 WT e Clone

Figura 11: Níveis da expressão do receptor dominérgico D

em células PC12 WT e

Clone

Figura 12: Representação quantitativa dos níveis totais de AMPc em células PC12

WT e Clone

Figura 13: Diminuição dos níveis de expressão de DARP-32 em células PC12 WT e

Clone

Figura 14: Níveis de fosforilação de DARPP-32 na Treonina em células PC12 WT e

Clone

Figura 15: Níveis de CREB e pCREB (Ser133) em células PC12WT e Clone

Figura 16: Níveis de fosforilação de DARPP-32 ena Treonina 75 em células PC12

WT e Clone

146

Figura 17: Níveis de Calcyon em células PC12WT e Clone

Figura 18: Níveis de AMPA e pAMPA (Ser 845) em células PC12 WT e Clone

Figura 19: Níveis de Akt e pAkt (Ser473) em células PC12 WT e Clone

Figura 20: Níveis de fosforilação de DARPP-32 na Treonina 34 em células PC12 WT

e Clone tratadas 5 minutos com diversas concentrações de Quinpirole

Figura 21: Níveis de fosforilação de DARPP-32 na Treonina 34 em células PC12 WT

e Clone tratadas com Quinpirole 1µM por diversos períodos de tempo

Figura 22: Níveis de fosforilação de DARPP-32 na Treonina 34 em células PC12 WT

e Clone tratadas 5 minutos com diferentes concentrações de Raclopride

Figura 23: Níveis de fosforilação de DARPP-32 na Treonina 34 em células PC12 WT

e Clone tratadas 10 minutos com diferentes concentrações de Haloperidol

Figura 24: Níveis de fosforilação de DARPP-32 na Treonina 34 em células PC12 WT

submetidas à 1 hora e 30 minutos de starving, tratadas 5 minutos com 5µM de

quinpirole, raclopride, haloperidol e sch-23390

Figura 25: Níveis de expressão de NCS-1 e DARPP-32 em células PC12 WT e Clone

tratadas com Forskolin 5µM e 10µM por 24 e 48 horas

Figura 26: Níveis de NCS-1 e DARPP-32 em células PC12 WT e Clone tratados com

Haloperidol 1µM, 10µM e 20µM, Risperidona 20µM e Clozapina 20µM por 14 dias

Figura 27: Níveis de NCS-1 e DARPP-32 em córtex pré-frontal, hippocampus,

striatum, córtex e cerebellum de ratos Wistar submetidos a injeções i.p. de solução

salina e solução salina Tween 1%

Figura 28: Níveis de NCS-1 e DARPP-32 em córtex pré-frontal de ratos Wistar

submetidos a 28 dias de tratamento com antipsicóticos típicos e atípicos

Figura 29: Níveis de NCS-1 e DARPP-32 em hippocampus de ratos Wistar

submetidos a 28 dias de tratamento com antipsicóticos típicos e atípicos

Figura 30: Níveis de NCS-1 e DARPP-32 em striatum de ratos Wistar submetidos a

147

28 dias de tratamento com antipsicóticos típicos e atípicos

Figura 31: Níveis de NCS-1 e DARP-32 em córtex de ratos Wistar submetidos a 28

dias de tratamento com antipsicóticos típicos e atípicos

Figura 32: Níveis de NCS-1 e DARP-32 em cerebellum de ratos Wistar submetidos a

28 dias de tratamento com antipsicóticos típicos e atípicos

Figura 33 – Alterações na via do AMPc/PKA em células PC12 superexpressando

NCS-1

Figura 34 – Tratamentos com agonistas e antagonistas dopaminérgicos para

avaliação de pDARPP-32(Thr34)

Figura 35 – Tratamentos com agonistas e antagonistas dopaminérgicos após

starving de 1 hora e 30 minutos para avaliação de pDARPP-32(Thr34)

Figura 36 – Tratamentos com Raclopride em células PC12 diferenciadas por 3 dias

para avaliação de pDARPP-32(Thr34)

Figura 37 – Níveis de expressão de DARPP-32 e NCS-1 em células PC12 WT e

Clone tratadas com forskolin, antipsicóticos típicos e atípicos

Figura 38 – Níveis de expressão de DARPP-32 e NCS-1 em regiões cerebrais de

ratos wistar submetidos ao tratamento com antipsicóticos típicos e atípicos por 28

dias.

100

102

117

118

119

120

121

122



148

LISTA DE ABREVIATURAS



A2A

AAAD

AMPA

AMPc

Ari

BDNF

CAPS

CB1

cDNA

Cdk-5

CLO

COMT

CPF

CPFDL

CREB

DARPP-32

DAT

Receptor adrenérgico α2a

Adenilato ciclase

Descarboxilase de L-aminoácidos aromáticos

Alfa-amino-3-hidróxido-5-metil-isoxazole-propionato

Adenosina monofosfato cíclico

Aripiprazole

Fator neurotrófico derivado do cérebro

Proteína ativadora de secreção dependente de cálcio

Receptor canabinóide 1

Ácido desoxiribonucleico complementar

Quinase dependente de ciclina 5

Caseína quinase

Clozapina

Catecol-O-metil-transferase

Córtex Pré-Frontal

Córtex Pré-Frontal Dorsolateral

Elemento ligante responsivo a AMPc

Receptor de dopamina

Dalton

Fosfoproteína regulada por dopamina e AMPc de 32 KDa

Transportador de dopamina

149

DMEM

DNA

dNTP

FGF-2

GABA

GAD67

GDP

GMP

GTP

GPCR

GRK2

GSK

HAL

H2O2

L-DOPA

LTD

LTP

MAO

NMDA

NCS-1

NGF

OLZ

PAGE

Meio Eagle modificado Dulbecco

Ácido desoxirribonucleico

Desoxirribonucleotídeo trifosfato

Fator de crescimento para fibroblasto

Ácido γ-aminobutírico

Ácido glutâmico descarboxilase

Guanosina difosfato

Guanosina monofosfato

Guanosina trifosfato

Receptores acoplados heteromericamente à proteína G

Proteína quinase 2 acoplada à proteína G

Glicogênio sintase quinase

Haloperidol

Peróxido de hidrogênio

3,4-dihidroxifenilalanina

Depressão de longa duração

Potencial de longa duração

Receptor muscarínico

Monoamino oxidase

N-metil-D-aspartato

Sensora de cálcio neuronal 1

Fator de crescimento neuronal

Olanzapina

Eletroforese em gel de poliacrilamida

150

PBS

PC12

PI3K

PKA

PKC

PKG

PLC

PET

RNA

SAL

SDS

SNC

SNAP

SNARE

Ser

TDAH

Thr

Trk

VAMP

VMAT

5HT

Tampão fosfato salino

Célula feocromocitoma de rato

Fosfatidil inositol 3 quinase

Proteína quinase A

Proteína quinase C

Proteína quinase G

Fosfolipase C

Proteína fosfatase

Tomografia de emissão Positrônica

Ácido ribonucleico

Salina

Dodecil sulfato de sódio

Sistema nervoso central

Synaptossome-associated protein

Proteína receptora anexada ao fator sensível à N-etilmaleimida solúvel

Serina

Transtorno de déficit de atenção e hiperatividade

Tirosina hidroxilase

Treonina

Tirosina quinase

Proteína de membrana associada à vesícula

Transportador vesicular de monoaminas

Tipo selvagem

Receptor serotoninérgico

ORIGINAL PAPER

DARPP-32 and NCS-1 Expression is not Altered in Brains of Rats

Treated with Typical or Atypical Antipsychotics

Bruno R. Souza Æ Bernardo S. Motta Æ Daniela V. F. Rosa Æ Karen C. L. Torres Æ

Adalberto A. Castro Æ Clarissa M. Comim Æ Andre

M. Sampaio Æ

Fabrı

cio F. Lima Æ Andreas Jeromin Æ Joa

o Quevedo Æ Marco A. Romano-Silva

Accepted: 24 July 2007 / Published online: 31 August 2007

Ó Springer Science+Business Media, LLC 2007

Abstract Dopamine-mediated neurotransmission imbal-

ances are associated with several psychiatry illnesses, such

as schizophrenia. Recently it was demonstrated that two

proteins involved in dopamine signaling are altered in

prefrontal cortex (PFC) of schizophrenic patients. DARPP-

32 is a key downstream effector of intracellular signaling

pathway and is downregulated in PFC of schizophrenic

subjects. NCS-1 is a neuronal calcium sensor that can

inhibit dopamine receptor D

internalization and is upreg-

ulated in PFC of schizophrenic subjects. It is well known

that dopamine D

receptor is the main target of antipsy-

chotic. Therefore, our purpose was to study if chronic

treatment with typical or atypical antipsychotics induced

alterations in DARPP-32 and NCS-1 expression in ﬁve

brain regions: prefrontal cortex, hippocampus, striatum,

cortex and cerebellum. We did not ﬁnd any changes in

DARPP-32 and NCS-1 protein expression in any brain

region investigated.

Keywords DARPP-32 Á NCS-1 Á Antipsychotic Á

Schizophrenia

Introduction

Dopaminergic neurotransmission is involved in many

functions in mammalians [1–4], and dopamine-mediated

neurotransmission imbalances are associated with several

psychiatry illnesses, such as schizophrenia [5–6].

Schizophrenia is a major psychiatry disease that affects 1%

of worldwide population [7]. It is the most disabling of psy-

chiatry disorders and it is characterized by psychosis, apathy

and social withdrawal, and cognitive impairment, which

results in altered functioning in many aspects of life. It is a life-

long disorder and, although exact disease cause remains

unknown, it is well known that the disease can be triggered by

a combination of genetic and environmental factors [8].

Recently, some studies have demonstrated alteration in

the expression of two proteins, associated with regulation of

the dopaminergic signaling, in the prefrontal cortex (PFC) of

patients with schizophrenia [9]. One of them is dopamine and

cyclic adenosine 3

-monophosphate-regulated phospho-

protein of relative molecular mass 32,000 (DARPP-32).

Downregulation of DARPP-32 expression in PFC of

schizophrenia patients was reported [10–11]. Dopamine

receptors are G protein-coupled receptors (GPCR) classiﬁed

into two subtypes: D

-like receptor subtypes (D

), pos-

itively coupled to adenylyl cyclase (G

), and D

-like receptor

subtypes (D

), negatively coupled to adenylyl

cyclase (G

)[12]. Activation of D

receptor subtypes

enhances phosphorylation of DARPP-32 at threonine 34

B. R. Souza Á B. S. Motta Á D. V. F. Rosa Á

K. C. L. Torres Á A. M. Sampaio Á F. F. Lima Á

M. A. Romano-Silva

Laborato

rio de Neurocie

ncias, Departamento de Sau

de Mental,

Faculdade de Medicina, Universidade Federal de Minas Gerais,

Av Alfredo Balena 190, Belo Horizonte, MG 30130-100, Brazil

A. A. Castro Á C. M. Comim Á J. Quevedo

Laboratorio de Neurocie

ncias, Programa de Po

s-Graduac¸a

oem

Cie

ncias da Sau

de, Universidade do Extremo Sul Catarinense,

Criciuma, SC 88806-000, Brazil

A. Jeromin

Center for Learning and Memory, University of Texas at Austin,

Austin, TX, USA

M. A. Romano-Silva (&)

Departamento de Farmacologia – ICB, Universidade Federal de

Minas Gerais, Av Antonio Carlos, 6627, Belo Horizonte, MG

CEP 31270-901, Brazil

e-mail: [email protected]

123

Neurochem Res (2008) 33:533–538

DOI 10.1007/s11064-007-9470-2

through protein kinase A (PKA) activity [13–14]. This effect

is counteracted by the action of D

receptors [15]. Since

DARPP-32 phosphorylated at Thr34 inhibits protein phos-

phatase-1 (PP-1), it is a key downstream effector in

transducing dopamine signal, integrating the signaling of

different neurotransmitters and neuromodulators [16].

Another protein with altered expression in PFC of schizo-

phrenic patients is Neuronal Cacium Sensor-1 (NCS-1). It was

demonstrated that both protein expression and mRNA levels

of NCS-1 are upregulated in dorsolateral prefrontal cortex

(DLPFC) of schizophrenic subjects [17–18]. NCS-1 is a

member of the EF-hand superfamily, which is a group of

proteins that can bind to calcium and then be inserted into a

lipid bilayer membrane anchoring the protein [19–21].

However, NCS-1 is not dependent on free Ca

to expose its

N-terminal myristoyl tail [22], then it is predominantly

localized in trans-Golgi network (TNG) and plasma mem-

brane [23]inbothpreandpostsynapticstructures[24]. It is

involved in several functions and one of them is inhibition of

dopamine D

receptor desensitization [25]. Desensitization

and internalization of a receptor is a process that reduces

cell responsiveness to neurotransmitters [26]. D

receptor

internalization is regulated by phosphorylation by G-protein-

coupled receptor kinase 2 (GRK2) and, only in its phosphor-

ylated state, arrestin can bind to trigger sequestration [27].

However, NCS-1 forms a complex with GRK2 and D

receptors, inhibiting this receptor phosphorylation and con-

sequently, inhibiting its internalization [25]. Recently, it was

demonstrated that NCS-1 colocalizes with D

receptors in pre

and post-synaptic structures of pyramidal neurons and inter-

neurons in primate prefrontal cortex (PFC) [28].

Antipsychotics are drugs used in pharmacological

treatment to reduce schizophrenia symptoms. According to

their difference in receptor afﬁnities and side effects, they

are classiﬁed as typical and atypical. Typical antipsychot-

ics, such as haloperidol (HAL), are D

antagonists with

strong afﬁnity and slow dissociation kinetics from the

receptor, which is frequently associated with extrapyra-

midal effects [8, 29]. Atypical antipsychotics, such as

clozapine (CLO) and olanzapine (OLZ) show reduced

afﬁnity to D

and are antagonists of serotonin receptors.

Aripiprazole (Ari) is a partial agonist of D

receptors. Due

to these properties, atypical antipsychotics show much

lower levels of extrapyramidal effects [29]. Although it is

well known that antipsychotics moderate schizophrenia

symptoms, the molecular and biochemical mechanisms

implicated in this improvement is not well established.

Because of the roles of both DARPP-32 and NCS-1 in

dopaminergic signaling, which is the main target of anti-

psychotics, and their alterations in PFC of schizophrenia

patients, our purpose was to study the effects of typical and

atypical antipsychotics on the expression of DARPP-32

and NCS-1 in the prefrontal cortex (PFC), hippocampus

(HP), striatum (ST), cortex (CX) and cerebellum (CB) of

male Wistar rats using western blot.

Experimental procedures

Animals

Male Wistar rats (2 months old) were obtained from our

colony. Animals were housed ﬁve to a cage with food and

water available ad libitum, and maintained on a 12-h light/

dark cycle (lights on at 07:00 h). All experimental proce-

dures were performed in accordance with the NIH Guide

for the Care and Use of Laboratory Animals and the Bra-

zilian Society for Neuroscience and Behavior (SBNeC)

recommendations for animal care, with the approval of the

local ethics committee.

Drugs and chemicals

LC-grade water was obtained from Milli-Q system, Milli-

pore, Bedford, MA, USA. Haloperidol (Haldol

) was

purchased from Crista

lia Prod. Quim. e Farmace

uticos,

Itapira, Brazil. Clozapine (Leponex

) was purchased from

Novartis Biocie

ncias AS, Sa

o Paulo, Brazil. Olanzapine

(Zyprexa

) was provided from Eli Lilly do Brasil Ltda,

o Paulo, Brazil. Aripiprazole (Abilify

) was purchased

from Bristol-Myers Squibb, Sa

o Paulo, Brazil.

Pharmacological procedures

Animals received daily intraperitoneal (i.p.) injections of

HAL (1.5 mg/kg), CLO (25 mg/kg), OLZ (2.5, 5 or 10 mg/

kg) or Ari (2, 10 or 20 mg/kg) in a 1.0 ml/kg volume for

28 days. All the drugs were dissolved in Tween 1% solu-

tion (saline). Control animals received saline (1.0 ml/kg).

Three days after the last injection [30–31], the rats were

sacriﬁced by decapitation, and the prefrontal cortex (PFC),

the hippocampus (HP), striatum (ST), cortex (CX) and

cerebellum (CB) and were immediately removed.

Preparation of tissue sample

Tissue was incubated with lysis buffer (20 mM MOPS—

pH 7, 2 mM EGTA, 5 mM EDTA, 30 mM sodium

ﬂuoride, 40 mM b-glycerophosphate—pH 7.2, 20 mM

pyrophosphate, 1 mM sodium orthovanadate, 1 mM

phenylmethylsulfonyl ﬂuoride, 3 mM benzamidine, 10 lM

leupeptin e 0.5% Nonidet P40, ﬁnal pH 7.2). Lysates were

sonicated and incubated on ice for 30 min before

534 Neurochem Res (2008) 33:533–538

123

centrifugation at 13,000g for 20 min at 4°C. Supernatants

were transferred to plastic tubes, protein was quantiﬁed

[32] and extracts stored at À80°C.

Immunoblot

Equal amounts of protein (50 lg) of each sample was

prepared for electrophoresis with sample buffer NuPAGE

LDS (Invitrogen) plus 10% of b-mercaptoethanol and

incubated at 70°C for 10 min. The samples were loaded

into bis-Tris NuPAGE 4–12% gels (Invitrogen) and sub-

mitted to electrophoresis as recommended by the

manufacturer, followed by transfer to nitrocellulose mem-

branes (Hybond ECL, Amersham Pharmacia Biotech).

Protein loading and efﬁciency of blot transfer were moni-

tored by staining with Ponceau S (Sigma Chemical Co.,

USA). The membranes were blocked for 45 min with TBS

(tris-buffered saline, pH 7.4) Tween 20 0.1% plus non-fat

milk 5%. Membrane blots were incubated with polyclonal

anti-NCS-1 antibody (1:2,000—FL-190, Santa Cruz Bio-

tecnology), polyclonal anti-DARPP-32 (1:500—H-62,

Santa Cruz Biotechnology) and monoclonal anti-actin

antibody (1:7,000—MAB1501R—Chemicon) diluted in

TBS Tween 20 0.1% overnight at 4°C. Then, membranes

were washed and incubated for 1 h at RT with horseradish

peroxidase (HRP)-conjugated secondary antibodies, goat

anti-rabbit IgG (1:15,000) and goat anti-mouse IgG

(1:7,000) (secondary antibodies were purchased from

Molecular Probes). Membranes were submitted to chemi-

luminescent detection with ECL Plus (Amersham

Biosciences) as described by manufacturer, and visualized

on ImageQuant. Densitometric analysis was performed

using Scion Image Software version Beta 4.0.2 (Scion

Corporation, National Institutes of Health, USA).

Statistical analysis

All data are presented as means ± Standard Error of the

Mean (SEM). Differences among experimental groups in

experiments evaluating protein expression were determined

by one-way ANOVA. In all experiments, P-values lower

than 0.05 were considered to signiﬁcant.

Results

DARPP-32 expression in brain regions of rats treated

with antipsychotics

Adult male Wistar rats (2 months) were treated with SAL,

HAL, CLO, OLZ (2.5, 5 or 10 mg/kg) or Ari (2, 10 or

20 mg/kg) for 28 days. Five different brain regions, PFC,

HP, ST, CX and CB, were prepared to examine DARPP-32

protein expression after drug treatment and it was observed

no changes in expression of this protein in brains of rats

after chronic treatment with either typical or atypical an-

tipsychotics (Fig. 1).

NCS-1 expression in brain regions of rats treated with

antipsychotics

Adult male Wistar rats (2 months) were treated with SAL,

HAL, CLO, OLZ (2.5, 5 or 10 mg/kg) or Ari (2, 10 or

20 mg/kg) for 28 days. After chronic treatment, ﬁve dif-

ferent brain regions, PFC, HP, ST, CX and CB, were

prepared to examine NCS-1 protein expression. It was not

observed any alteration in NCS-1 protein expression in

brains of rats after chronic treatment with either typical or

atypical antipsychotics (Fig. 2).

Discussion

Drugs that target D

receptors are commonly used in the

treatment of subjects with schizophrenia [8], which is

evidence of the involvement of dopaminergic signaling

pathway in this psychopathology. However, although there

are data showing that there are no changes in D

receptor

expression in brains of schizophrenia patients [33], it was

postulated that changes in receptor-associated signaling

complex and second messengers might be involved with

dopamine disturbance in these patients [9, 33].

DARPP-32 is a key downstream effector in transducing

dopamine signaling, integrating the pathways of different

neurotransmitters and neuromodulators [16]. Since it was

showed that DARPP-32 is downregulated in PFC of

schizophrenia subjects [10, 11] and that there are genetic

variations associated with PFC cognitive functions [34], we

did not ﬁnd alterations in the expression of DARPP-32 in

ﬁve brain regions, PFC, HP, ST, CX and CB, of rats after

chronic treatment with typical or atypical antipsychotics.

Our results of chronic treatment with typical antipsychotic

was similar to that already observed in other studies

with chronic treatment with haloperidol or a speciﬁc D

antagonist, raclopride [35, 36].

NCS-1 inhibits phosphorylation of dopamine D

recep-

tor by GRK2 and consequently D

-Arrestin-GRK2

complex formation, which is responsible for internalization

and desensitization of D

[27, 37, 38]. Also it was reported

a colocalization of NCS-1 and D

in PFC of primates [28].

Since it was previously shown that NCS-1 was upregulated

in DLPFC of schizophrenic subjects [17, 18], we investi-

gated the expression of this protein in ﬁve different brain

Neurochem Res (2008) 33:533–538 535

123

regions, PFC, HP, ST, CX and CB, of rats after chronic

treatment with typical or atypical antipsychotics. We

observed that there was no signiﬁcant different in the levels

of NCS-1 in all brain regions after chronic antipsychotic

treatment.

Although the results were negative in all brain regions

studied, our ﬁndings allow the suggestion that both

downregulation of DARPP-32 and upregulation of NCS-1

reported to occur in the PFC of schizophrenia patients

might be associated with the psychopathology of the dis-

ease and not with treatment with antipsychotic drugs.

Taking into consideration that there is no good animal

model able to mimic the major characteristics of schizo-

phrenia, and of the limitations of postmortem studies in

DARPP-32 expression levels in brain regions

of rats treated with antipsychotics

Prefrontal

RAD fo .D.OP nitca yb dezilamron 23-P

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

Sal

Cloz

Halo

Olz 2.5

Olz 5

Olz 10

Ari 2

Ari 5

Ari 10

Hippocampus

Striatum

Cortex

Cerebellum

Fig. 1 Densitometry analyses of western blots showing the conse-

quences of 28 days antipsychotic treatments on rats’ prefrontal cortex

(PFC), hippocampus (HP), striatum (ST), cortex (CX) and cerebellum

(CB). The results show that there are no alterations in DARPP-32

protein expression levels followed by chronic antipsychotic

administration. Results are presented in arbitrary units normalized

by actin. Data represent means ± SEM. for duplicates of n = 7 and

statistically analyzed using one-way ANOVA. Sal, saline; Cloz,

clozapine; Hal, haloperidol; Olz, olanzapine (2.5, 5.0 and 10.0 mg/

kg); Ari, aripiprazole (2.0, 5.0 and 10.0 mg/kg)

NCS-1 expression levels in brain regions

of rats treated with antipsychotics

Prefrontal

nitca yb dezilamron 1-SCN fo .D.O

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

Sal

Cloz

Halo

Olz 2.5

Olz 5

Olz 10

Ari 2

Ari 5

Ari 10

Hippocampus

Striatum

Cortex

Cerebellum

Fig. 2 Densitometry analyses of western blots showing the conse-

quences of 28 days antipsychotic treatments on rats’ prefrontal cortex

(PFC), hippocampus (HP), striatum (ST), cortex (CX) and cerebellum

(CB). The results show that there are no alterations in NCS-1 protein

expression levels followed by chronic antipsychotic administration.

Results are presented in arbitrary units normalized by actin. Data

represent means ± SEM. for duplicates of n = 7 and statistically

analyzed using one-way ANOVA. Sal, saline; Cloz, clozapine; Hal,

haloperidol; Olz, olanzapine (2.5, 5.0 and 10.0 mg/kg); Ari, aripip-

razole (2.0, 5.0 and 10.0 mg/kg)

536 Neurochem Res (2008) 33:533–538

123

humans, this is an idea difﬁcult to be tested. Thus, only an

extensive investigation of intracellular integrators and

modulators will shed more light on the signaling mecha-

nisms involved in this serious psychiatric disorder and its

treatment.

Acknowledgements This research was supported by grants from Eli

Lilly do Brazil, UNESC and CNPq.

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