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A
VALIAÇÃO DA TRANSFERÊNCIA MATERNO-INFANTIL DE ANTICORPOS SÉRICOS E
SECRETORES DIRIGIDOS AO POLISSACARÍDEO DA CÁPSULA DE
HAEMOPHILUS
INFLUENZAE TIPO B
(HIB) EM AMOSTRAS PRÉ E PÓS-VACINAIS DE MÃES
IMUNIZADAS COM
PRP CONJUGADO AO TOXÓIDE TETÂNICO (PRP-T)
Dissertação apresentada ao Instituto de Ciências
Biomédicas da Universidade de São Paulo para obtenção
do Título de Mestre em Ciências (Imunologia).
SÃO PAULO
2008
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A
VALIAÇÃO DA TRANSFERÊNCIA MATERNO-INFANTIL DE ANTICORPOS SÉRICOS E
SECRETORES DIRIGIDOS AO POLISSACARÍDEO DA CÁPSULA DE
HAEMOPHILUS
INFLUENZAE TIPO B
(HIB) EM AMOSTRAS PRÉ E PÓS-VACINAIS DE MÃES
IMUNIZADAS COM
PRP CONJUGADO AO TOXÓIDE TETÂNICO (PRP-T)
Dissertação apresentada ao Instituto de Ciências
Biomédicas da Universidade de São Paulo para obtenção
do Título de Mestre em Imunologia.
Área de concentração: Imunologia
Orientadora:
Dra. Magda Maria Sales Carneiro-Sampaio
SÃO PAULO
2008
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"Não importa o que fizeram conosco, mas que
fazemos com o que fizeram conosco”
Jean Paul Sartre
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A minha mãe, Sebastiana Apolinária Cardoso,
pelo primeiro estímulo ao estudo, companheirismo,
amor, carinho e compreensão.
Ao meu pai, Mário Silésio Cardoso por ter me e
nsinado a viver com honestidade...
(in memorian)
A todos os meus familiares pelo apoio e carinho
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A Profa. Dra. Magda M. S. Carneiro-Sampaio pela orientação,
dedicação e acolhimento em seu laboratório.
A Dra. Patrícia Palmeira, por sua orientação,
experiência profissional, dedicação e ajuda obrigada
por tudo.
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Agradecimentos
À amiga Christina Arslanian Kubo pela grande ajuda nos testes experimentais e
pela sabedoria, força, carinho e amizade que tanto me enriquecem pessoalmente.
À amiga Leuridan Torres, sempre disposta a ajudar e incentivar nos momentos
que mais precisei, obrigada por tudo.
À amiga Simone Corrêa pela colaboração constante, incentivo, companhia e
alegria.
Ao meu namorado Otto Luiz Dutra Cerqueira pelo companheirismo
À amiga Ana Lucia Silveira Lessa Marques pela ajuda e companhia nas eternas
horas que passei no laboratório.
À amiga Rosana Rezende de Oliveira incentivo, alegria e colaboração constante.
À amiga Mariana Acenjo Kmiliauskis pela amizade e carinho de sempre.
À amiga Fabiana Ghilard pela amizade e companheirismo nas longas jornadas
de trabalho.
À amiga Gerlandia Neres Pontes pelos trabalhos que realizamos juntas.
Às amigas Camila Quinello, Gabriela Comenale, Silvana Lucchini,, Dora Lisa
Friedlander Del Nero, Denise Amazonas.
Aos amigos Josias Brito Frazão, Otávio Cabral Marques, Juliana Moreira,
Patrícia Macchiaverni, Paulo Vitor Soeiro, Walmir Cutrim Aragão Filho, e aos
outros colegas da pós-graduação pelo carinho e amizade.
Às enfermeiras do Amparo Maternal e Hospital Universitário pelo
profissionalismo.
Às professoras Maria Isabel e Maria Alice da Escola de enfermagem pelo
aprendizado e conhecimento compartilhado, muito obrigada.
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As técnicas e auxiliares de enfermagem do Hospital Universitário e Amparo
Maternal pela disponibilidade e empenho.
Às gestantes e seus familiares que fizeram parte deste estudo pela dedicação e
comprometimento.
À José Dermival Vilanova e Marlene de Souza Bernardes pela manutenção do
laboratório.
À Mickie Takaggi pelo suporte com relação À obtença do antígenos PRP
Às funcionários da Pós Graduação do Instituto de Ciências Biomédicas Valéria
Machado dos Santos e Jotelma Leite Ribeiro
À todos aqueles que tornaram este trabalho possível.
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R
ESUMO
Cardoso EC. Avaliação da transferência materno-infsntil de anticorpos séricos e
secretores dirigidos ao polisscarídeo da cápsula de Haemophilus influenzae tipo b
(Hib) em amostras pré e pós vacinal de mães imunizadas com PRP conjugado ao
toxóide Tetânico (PRP – T) [dissertação/dissertation de mestrado]. São Paulo:
Instituto de Ciencias Biomédicas da Universidade de São Paulo; 2008
Introdução: O Haemophilus influenzae type b (Hib) é a primeira maior causa de
meningites e pneumonias provocadas por bactérias encapsuladas. Trabalhos
revelam que anticorpos maternos, séricos e secretores, podem proteger recém
nascidos (RN) destes patógenos encapsulados e contribuem para a maturação do
sistema imune do infante. Objetivo: O presente estudo teve como objetivo investigar
a transferência materno-infantil de anticorpos anti-Hib em mães vacinadas e que não
receberam a vacina anti-Hib. Materiais e Métodos: Nós avaliamos 29 mulheres
saudáveis, das quais 13 foram vacinadas e 16 não receberam a vacina ActHib®.
Destas mães foram obtidas amostras de sangue periférico e do cordão umbilical,
colostro e leite, sendo determinadas as imunoglobulinas totais (IgG e IgA) e suas
subclasses (IgG1 e 2) por Imunodifusão Radial Quantitativa (IDR) e nefelometria. A
concentração de anticorpos IgG, as subclasses (IgG1 e 2) e IgA anti-Hib foram
analisados por ensaio imunoenzimático (ELISA), também utilizado para determinar a
avidez dos anticorpos IgG e IgA anti-Hib. Avaliação qualitativa destes anticorpos foi
realizada a partir de ensaios de immunoblotting (IB). Resultados: As amostras
maternas de mães vacinadas não apresentaram diferenças quantitativas de
imunoglobulinas secretoras (IgA), séricas (IgG) e suas subclasses (IgG1 e 2) totais,
comparadas às amostras de mães que não receberam a vacina anti-Hib. O grupo
vacinado mostrou maior concentração e avidez de anticorpos específicos para o Hib
quando relacionados ao grupo de mães não vacinado. Os soros de cordões
umbilicais de mães imunizadas apresentaram menor taxa de passagem
transplacentária que os cordões de mães não vacinadas. Em ambos os grupos, as
amostras de colostro apresentaram maior concentração de imunoglobulinas totais e
específicas para o Hib que as amostras de leite. O IB revelou o mesmo padrão de
42
Resultados
reconhecimento antigênico para o Hib entre as amostras maternas, nas duas
populações. Conclusão: Os resultados revelaram que o perfil de resposta humoral
de mães vacinadas pode proteger mais o infante que as mães não vacinadas, pois o
primeiro grupo transferiu maior quantidade de anticorpos com melhor avidez para a
criança, conferindo proteção eficaz com relação às doenças causadas por Hib.
Palavras-chave: Haemophilus influenzae tipo b; transferência placentária; colostro;
leite; anticorpos; recém-nascido.
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Resultados
A
BSTRATCT
Cardoso EC. Avaliation of maternal-infant transfer of seric and secretory antibodies
reactive to capsule polysaccharides Haemophilus influenzae type b (Hib) in pre and
post vaccine samples of immunized mothers in PRP conjugate with tetanic-toxóide
(PRP-T). [Master thesis dissertation]. São Paulo Instituto de Ciencias Biomédicas da
Universidade de São Paulo; 2008
Background: Haemophilus influenzae type b (Hib) has been one of the major causes
of bacterial meningitis and pneumonia. Recent works show that maternal, seric and
secretory antibodies, may protect the newborn and contribute the maturation of the
infant immune system. Objective: The present study has as aim to investigates the
maternal-infantile transfer of anti-Hib antibodies in immunized and not immunized
mothers’ with anti-Hib vaccine. Material and Methods: We evaluated 29 healthy
women, from whitch 13 mothers were immunized and 16 not immunized mothers with
the ActHib® vaccine. From these mothers it were obtained peripheric and cord
serum, colostrum and milk samples, the total immunoglobulin (IgG and IgA) and its
subclass (IgG1 and IgG2) was determined by Quantitative Radial Immunodiffusion
(IDR) and nephelometry. The concentration of anti-Hib IgG, subclass (IgG1 IgG2) and
IgA antibodies were analyzed by immunoenzymatic assay (ELISA), it also were
utilized to determine the antibodies avidities’. Qualitative evaluation these antibodies
were determined by Immunoblotting assays (IB). Results: The results didn’t show
difference between maternal samples of the immunized and not immunized mothers
in the concentration of the total secretory and seric imunoglobulins as well as its total
immunoglobulins subclasses. The immunized set showed higher avidity and anti-Hib
antibody levels comparing to the non-immunized mother sets. The umbilical cord
serums’ from immunized mothers revealed lower rate of placental transfer than the
cord serum of not immunized mothers. In both sets, the colostrum sample showed
higher antibody levels comparing to the milk samples. IB revealed the same
recognition pattern of Hib antigens between mother and cord serum IgG and
colostrum and milk IgA, in both populations. Conclusion: The results shows that the
antibodies profile response of the immunized mother can protect more the infant than
44
Resultados
the not immunized mother, because the first set transported higher quantity of
antibodies with better avidity for the children, these antibodies confere an efficient
protection to infections provoked by Hib.
Keywords: Haemophilus influenzae type b, Placental transfer, colostrums, Milk,
Antibodies, Newborn.
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Resultados
1 I
NTRODUÇÃO
O Haemophilus influenzae tipo b (Hib) é um importante agente etiológico de
infecções graves como meningite, pneumonia, sepse, endocardite, artrite, celulite, e
epiglotite (Mäkelä et al., 1992). Esta bactéria possui uma cápsula protetora,
composta por polissacarídeos, que a protege da fagocitose, conferindo ao
microrganismo maior resistência e patogenicidade. Tal patógeno acomete crianças
até cinco anos de idade, principalmente, a faixa etária entre seis semanas a dois
anos de vida (Funkhouser et al., 1991; Bijilmer, 1994).
A prevalência de doenças causadas pelo Hib nos menores de dois anos
(Mäkelä et al., 1992; Gray e Dillon, 1986), ocasionou a elaboração de estudos
relacionados à imunidade passiva materno-infantil, via transplacentária, e após o
nascimento, pela amamentação. Durante a gestação, o puerpério e a lactação, a
mãe oferece anticorpos que são fundamentais para adaptação do neonato no
ambiente extra-uterino. A gestante transfere para o feto, por meio da placenta,
anticorpos IgG e após o parto, durante a amamentação anticorpos IgA, além de
outros fatores de resistência anti-infecciosa.
Os anticorpos transferidos para a criança durante a gestação e lactação são
conseqüentes da resposta imunológica frente a antígenos, os quais a mãe entrou em
contato ao longo de sua vida. Logo, durante os primeiros meses de vida do neonato,
as imunoglobulinas maternas, adquiridas durante a transferência transplacentária e o
aleitamento materno irão conferir ao infante, proteção contra agentes infecciosos,
como o Hib.
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Resultados
1.1 Haemophilus influenzae tipo b (Hib)
1.1.1HistóricoeepidemiologiadoHib
O Haemophilus influenzae tipo b (Hib) é um cocobacilo Gram-negativo,
identificado por Pfeifer em 1852, o qual tem o homem como hospedeiro exclusivo.
No final da década de 90, estimava-se que o Hib seria responsável por três milhões
dos casos de doenças graves e de mortes anualmente (WHO, 1998). Nos Estados
Unidos, a morbidade anual estimada em estudos de vigilância, antes do
licenciamento da vacina em 1985, foi de 20.000 casos por ano. Em 1998, após a
introdução da vacina, a morbidade foi de 61 casos de doença invasiva em crianças
com menos de cinco anos de idade, representando o percentual de diminuição
superior a 99% (American Academy of Pediatrics, 2000; Garpenholt et al., 1996).
A doença invasiva por Hib apresenta uma incidência maior nos países em
desenvolvimento. Tal agente etiológico provoca infecções, principalmente, em
crianças com idade inferior a 12 meses (Funkhouser et al., 1991; Bijilmer, 1994). O
prognóstico da meningite por Hib foi pior nos países em desenvolvimento. Em
Saharan, na África, 20 a 40% dos pacientes que chegam aos serviços de saúde
morrem da doença, e proporção significante dos sobreviventes evolui com seqüelas
neurológicas (Bijilmer, 1994). A incidência de indivíduos que apresentaram
colonização por Hib em nasofaringe foi maior e mais precoce nos países em
desenvolvimento (Bijilmer et al., 1989).
No Brasil, entre 1987 a 1991, o Hib foi o principal agente identificado como
causador de meningite bacteriana em crianças menores de cinco anos, sendo
detectado em mais de 40% dos casos (Nery-Guimarães et al., 1981). Em 1991, o
coeficiente de doença invasiva por Hib em crianças menores de cinco anos foi de
18,4 por 100.000 habitantes (Bouskela, 1995).
Após a introdução da vacina na rede pública, em julho de 1999, dados do
Ministério da Saúde indicam diminuição dos casos notificados de meningite por Hib.
A média anual de 1.548 casos, observada na década de 90, caiu para apenas 106
casos em todo o Brasil, no ano de 2000 (Ministério da Saúde, 2003).
47
Resultados
1.1.2CaracterísticasdopolissacarídeodacápsuladoHaemophilusinfuenzae
tipob(PSHib).
O PS do Hib é um polímero constituído por duas moléculas de açúcar ribosil e
ribitol, e uma de fosfato poliribosilribitol fosfato (PRP). Anderson e colaboradores
(1991), a partir de técnicas em gel de filtração, utilizaram o Dextram, como padrão
de polissacarídeo, e conseguiram estimar o tamanho entre 10
5
e 10
6
Da, para o PRP
não degradado.
Contudo, trabalhos mais recentes avaliaram que o peso do PRP, usando o
método cromatográfico de exclusão por tamanho, é 105.000 Da, correspondendo
aproximadamente a 300 unidades repetitivas, por molécula (Fujimura,1990). Os
resultados revelados pelo método cromatográfico também indicaram que a molécula
de PS Hib é rígida, composta por uma estrutura secundária altamente ordenada,
possivelmente com conformação helicoidal, com pouca ou nenhuma tendência para
interações terciárias dentro da molécula (Takano, 1997).
A cápsula do Hib tem característica hidrofílica, pois é composto pelo PRP, o
qual é constituído por ligações intramoleculares fosfodiéster eletronegativas
(Barington, 1995). Estas características moleculares dificultam a fagocitose destas
bactérias encapsuladas, pois impedem o contato direto do fagócito com o
microrganismo. Portanto, o PRP desempenha papel importante na resistência à
fagocitose e atividade do sistema Complemento por polimorfonucleares (Figura 1).
48
Resultados
Figura 1. – Molécula do Polissacarídeo presente na cápsula do Hib – PRP
Fonte: http://www.fcf.usp.br/Ensino/Graduacao/Disciplinas/LinkAula/Hemofilos.PDF
O PRP do Hib favorece outros fatores importantes que repercutem na
aderência ao muco e às células não ciliadas, e na penetração por meio dos espaços
intercelulares. O Hib sintetiza enzimas betalactamatase e acetiltransferase que
determinam resistência à penicilina e ao clorofenicol, respectivamente. Esta bactéria
também produz enzimas IgA protease, capaz de destruir sIgA nas mucosas.
1.2 Resposta Imune ao Hib
1.2.1RespostaTimoindependente
Os antígenos não protéicos, como polissacarídeos e lipídios, estimulam a
produção de anticorpos na ausência de células T auxiliares, e por isso são
denominados antígenos timo-independentes ou T-independentes (TI). A produção de
anticorpos frente a antígenos TI difere, em vários aspectos, da resposta humoral
constituída para os antígenos T-dependentes (TD) (Fagarasan e Honjo, 2000).
Os antígenos protéicos são fagocitados e processados por células
apresentadoras de antígenos (APCs) que expõem o peptídeo, no contexto do
complexo principal de histocompatibilidade (MHC), classe I ou II, ao linfócito T CD8
ou T CD4, respectivamente. Após a interação APC e linfócito T, as células T
auxiliares promovem a mudança de isótipos, a maturação da afinidade e a memória
49
Resultados
imunológica a partir da expressão e da interação das moléculas de CD40L com
CD40 presente na célula B, entre outras moléculas co-estumuladoras (Brandzaeg e
Johansen, 2005).
Diferentemente, os antígenos TI não são processados e apresentados em
associação com as moléculas de MHC, e por isso não são reconhecidos pelas
células T auxiliares. Muitos dos antígenos TI são polivalentes, os quais são
compostos por inúmeros determinantes antigênicos, fato que induz uma agregação
máxima das imunoglobulinas presentes na membrana das células B, levando a
ativação destes linfócitos sem a necessidade da cooperação das células T
(Fagarasan e Honjo, 2000).
Em adição, muitos polissacarídeos ativam o sistema Complemento pela via
alternativa, gerando C3d, que se liga ao antígeno, formando o complexo antígeno-
anticorpo que é reconhecido pelas moléculas CD21 e Imunoglobulinas de membrana,
respectivamente. A molécula de CD21 é expresso nas células B maduras formando
um complexo com outras duas proteínas de membrana, CD19 e CD81. Os anticorpos
produzidos durante a resposta TI caracterizam-se por serem de baixa afinidade, com
predomínio de anticorpos IgM, e mudança de classe para IgA e subclasses de IgG
(Fagarasan e Honjo, 2000) (figura 2).
Bactérias polissacarídeas podem estimular a produção de isótipos, como IgG
e IgA, na ausência de CD40L, devido a presença de outras moléculas indutoras. A
mudança de classes das imunoglobulinas pode se iniciar quando as APCs
expressam uma proteína que estimula os linfócito B (BLyS também conhecida como
BAFF, TALL-1, THANK e zTNF4) (Stavnezer, 1996; Mond et al., 1995; Fagarasan e
Honjo, 2000; Hahne, et al., 1998 Rennertt et al., 2000).
Para tanto, as células B expressam receptores para BLys que são: o ligante
interador de cyclophilin, modulador de cálcio e ativador transmembrânico (TACI),
antígeno de maturação de células B (BCMA) e o receptor para BAFF (BAFF-R). As
APCs induzem também um segundo sinal, o ligante indutor de proliferação (APRIL),
o qual se liga com alta afinidade com BCMA e de baixa afinidade com TACI (Hahne,
et al., 1998 Rennertt et al., 2000).
50
Resultados
Portanto, a ligação de BLyS com TACI, BCMA e BAFF-R ativa e modula a
resposta imune via TI, proporcionando a sobrevivência das células B, por meio da
regulação de moléculas antiapoptóticas, como NFkB e Bcl2 (Do et al,. 2000). Estas
interações entre moléculas sinalizadoras, também, possibilitam a constituição de
resposta humoral com mudança de classes de imunoglobulinas para IgG e IgA
(Figura 2).
Figura 2 – Reconhecimento de antígenos TI e constituição de reposta imune
Fonte: Adaptado de Fagarasan e Honjo, 2000
Embora, o mecanismo de resposta frente a antígenos TI necessite de mais
estudos, pesquisadores pressupõem que a proteína BLys esteja envolvida com
outros mecanismos de sinalização em relação à célula B. Infere-se que estes sinais
emitidos possam estimular proliferação e diferenciação de células B da zona
marginal (ZM) e subpopulação B1 – presente no peritônio e na mucosa.
Fagarasan e Honjo (2000) postulam que células B da ZM produzem respostas
específicas a antígenos polissacarídeos, enquanto, linfócitos B1 sejam responsáveis
pela produção de anticorpos naturais – estimulados por bactérias que colonizam o
trato gastrointestinal. Muitos destes anticorpos naturais são reativos com
carboidratos e são de baixa afinidade. Eles estão presentes na circulação de
indivíduos normais e são aparentemente produzidos sem estimulação antigênica
(Fagarasan e Honjo, 2000).
A literatura mostra que há 2 tipos de antígenos TI: os antígenos TI 1 e TI 2. Os
TI 1 em elevadas concentrações são ativadores policlonais das células B, induzindo
a proliferação e diferenciação destas células independente da especificidade
antigênica (Fagarasan e Honjo, 2000). Um típico antígeno TI 1 é o LPS, reconhecido
por receptores Toll-like (TRL), especificamente o TLR-4, presentes em células
dendríticas e fagócitos (Ogata et al., 2000). Estudos in vivo, em camundongos,
evidenciaram que as subpopulações de células do B-1 estejam envolvidas nas
respostas de TI-1, pois camundongos XID, que apresentam deficiência de linfócitos
B-1, são incapazes de responder a antígenos TI-1 (Fagarasan e Honjo, 2000).
Já os antígenos TI-2 estimulam células B específicas da ZM e não funcionam
como ativadores policlonais. Antígenos TI-2 são geralmente carboidratos com
51
Resultados
seqüências repetitivas multivalentes que fazem ligação cruzada com os receptores
de linfócitos B (BCRs) (Snappere Mond, 1996). Estes açúcares, como o ®Dextran e
o PRP do Hib, não funcionam como mitógenos, mas seus epitopos repetitivos e
multivalentes fazem ligação cruzada com os receptores de linfócitos B (BCRs)
(Snappere Mond, 1996), podendo ativá-los (Fagarasan e Honjo, 2000).
1.2.1VacinasPolissacarídeaseConjugadas
As vacinas compostas de antígenos polissacarídeos induzem a imunidade
protetora longa que pode estar relacionado a não degradação deste antígeno, o qual
pode ficar por longo período nos tecidos linfóides estimulando células B naive.
Entretanto, não se conhece muito o mecanismo de resposta utilizado, mas sabe-se
que uma típica, rápida, eficiente resposta secundária com mudança de isótipo de
anticorpos é elaborada frente à reapresentação destes antígenos ao sistema imune
(Fagarasan e Honjo, 2000).
O lactente aos 18 meses apresenta linfócitos B em estado de maturação. Para
tanto, foi necessário acoplar ao PRP uma proteína carreadora para se obter uma
resposta TD eficaz nestes lactentes, durante a vacinação. Desta forma, a resposta
humoral passa pela estimulação dos linfócitos T, que ativam os linfócitos B por
intermédio de fatores solúveis (citocinas). Isto permite uma produção precoce, a
partir do segundo mês, de anticorpos IgG anti-PRP, e doses subseqüentes
estimulam a memória imunológica (Cavalcante, 2002).
Em 1980, Schneerson e colaboradores fizeram modificações que tornaram o
polissacarídeo de Haemophilus influenzae tipo b mais imunogênico, ligando-o
quimicamente a uma proteína carreadora. A vacina constituída por este composto foi
testada em crianças de diferentes faixas etárias e o resultado foi bastante satisfatório
para crianças menores de 18 meses.
Vacina anti-Hib e produção de anticorpos
52
Resultados
Os anticorpos pós-vacinal produzidos após a imunização com a vacina anti-
Hib-PS são predominantemente das subclasses IgG1 e IgG2. O repertório de
anticorpos produzidos por vacinas anti-Hib-PS em humano foi relativamente restrito.
Estudos moleculares da região variável da cadeia pesada (V
H
) mostram que pelo
menos dois genes presentes no Locus V
H
III são expressos com considerável
heterogenecidade (Adderson et al., 1991).
Baseado na expressão de genes que compõe a região variável da cadeia leve
(V
L
), o repertório de anticorpos pode ser dividido em dois tipos: anticorpos A2 e não-
A2. O primeiro grupo contém anticorpos expressos por um único gene presente no
Locus V
K
II, o gene A
2
, que é dominante entre os anticorpos anti-Hib-PS. Este gene é
responsável pela produção de anticorpos A2, os quais estão relacionados à resposta
humoral induzida pela vacinação com o PRP (Scott et al., 1989).
Em contra partida, outro repertório de resposta humoral, conseqüente da
expressão de genes presentes na região V
L
, é montado e menos freqüente, expresso
por pelo menos dois genes no Locus V
K
I, e um gene no Loci V
K
II, V
K
III, V
K
IV e V
λ
, os
quais parecem conter mutações somáticas. Estas imunoglobulinas produzidas são
conhecidas como anticorpos não A2 e, geralmente, não está associada à resposta
pós-vacinal anti-Hib-PS (Tarrand et al., 1989). Interessantemente, anticorpos
produzidos por genes A2 não têm reação cruzada com carboidratos, enquanto
anticorpos produzidos por genes não A2 têm reação cruzada com outros
carboidratos (Scott et. al, 1992).
1.3 Proteção Materno-Infantil
1.3.1TransporteTransplacentáriodeAnticorposMaternoseimunizaçãodas
gestantes
Brambell e colaboradores (1949) elaboraram os primeiros estudos sobre
transmissão de imunoglobulinas da mãe para o feto. Tal grupo de pesquisadores, a
partir dos trabalhos realizados com coelhos, sugeriu que a IgG materna era
transferida para o feto por meio do saco vitelino. Posteriormente, demonstrou-se que
53
Resultados
a porção Fc da molécula de IgG estava envolvida na passagem destas
imunoglobulinas para o feto (Brambell et al., 1959). O mesmo grupo de
pesquisadores descobriu que o mecanismo de transferência de IgG, similar ao acima
descrito, ocorre em filhotes de roedores. Após o nascimento, a absorção de IgG, do
leite materno, acontece a partir de receptores específicos, presentes no intestino
destes filhotes recém-nascidos (Halliday, 1955).
Com base nessas evidências experimentais, Brambell e colaboradores (1958)
elaboraram a hipótese de que o anticorpo entra na célula através de pinocitose de
uma maneira não seletiva. Segundo estes estudiosos, receptores presentes na
superfície celular sofrem processo de invaginação e recobrem a superfície interna do
fagossoma. Parte das moléculas de IgG ligam-se a receptores, sendo posteriormente
liberadas no espaço intercelular sem sofrer processo de digestão; as moléculas de
IgG que não se ligam a receptores são degradadas por enzimas presentes nos
lisossomas (Brambell et al., 1958).
Trabalhos anteriores demonstraram que o transporte de anticorpos IgG pela
placenta humana, inicia-se na 20ª semana de gestação com a participação do
receptor FcRN, receptor específico para a porção Fc da IgG, o qual está presente no
sinciciotrofoblasto e endotélio fetal. A literatura demonstra que a passagem de
anticorpos maternos inicia-se neste período e aumenta progressivamente até o
nascimento (Saji et al., 1994).
Kohler e colaboradores (1966) mostraram que o transporte de anticorpos via
placenta foi ativo e que a concentração de mais anticorpos no sangue de cordão que
no sangue materno. Entretanto, trabalhos que analisaram pares de amostras das
mães e dos cordões umbilicais das africanas e européias, observaram que o
transporte de IgG foi ativo somente quando os níveis séricos maternos de IgG total
são baixos ou dentro da faixa de normalidade (Michaux et al., 1966). Quando a
concentração de anticorpos foi elevada (geralmente acima de 15 g/l), os níveis
séricos de IgG no sangue de cordão são mais baixos que os níveis maternos
correspondentes (Michaux et al., 1966).
54
Resultados
Logo, a quantidade de IgG transferida para o feto depende da população de
receptores na superfície celular e a taxa de transferência foi determinada, de acordo
com a taxa de ligação e de liberação de moléculas de IgG dos receptores FcRN. O
caráter seletivo do processo depende de uma ou de ambas as taxas e pode até
mesmo variar entre diferentes subclasses de IgG. Outra possibilidade foi imaginar
diferentes receptores modulando a taxa de transferência de várias subclasses de
IgG, conforme o número e a afinidade de receptores para cada subclasse (Brambell
et al., 1966).
Radulescu e colaboradores (2004) com o intuito de compreender a
especificidade do receptor FcRN, trataram moléculas de imunoglobulinas da classe
IgG com dietilpirocarboneto, o qual reage bloqueando o aminoácido histidina,
presentes nas imunoglobulinas, modificando assim a estrutura molecular destes
anticorpos. Durante os ensaios para a avaliação da internalização de IgG, foi
verificado que as imunoglobulinas modificadas molecularmente não são
reconhecidas pelo receptor FcRN, mostrando a especificidade deste receptor,
principalmente, para com a porção Fc da subclasse IgG1 (Radulescu et al., 2004).
Figura 3 – Receptor de FcRN
Fonte: Adaptado do site:
www.nature.com/.../v7/n9/fig_tab/nri2155_F2.html
55
Resultados
Conseqüentemente, a passagem placentária de IgG1 foi mais eficiente do que
a IgG2 (Rote, 1985). Do ponto de vista clínico, é importante lembrar que anticorpos
anti-polissacarídeos em adultos são principalmente da subclasse IgG2. Dessa forma,
anticorpos contra antígenos polissacarídeos têm uma menor taxa de transporte
materno-fetal e estão presentes em baixa concentração no sangue de cordão
umbilical (Ferrante et al., 1990).
A resposta de anticorpos específicos ao polissacarídeo do Hib é do tipo IgG1 e
IgG2. Ghea (1988) demonstrou que crianças maiores de dois anos, vacinadas contra
o Hib, produzem resposta humoral a este antígeno com concentrações elevadas de
anticorpos IgG2. Entretanto, crianças menores de 17 meses, após a imunização,
produzem anticorpos anti-Hib com predomínio da subclasse IgG1 (Costa-Carvalho,
2004).
Portanto, a mãe para proteger o RN deve dispor de níveis protetores de
anticorpos séricos específicos da classe IgG, principalmente a subclasse IgG1, no
seu sangue, para poder transferi-los ao seu feto. Quanto mais anticorpos específicos
o feto recebe, acima do nível protetor, maior será a proteção após o nascimento. O
período no qual a imunização materna é efetiva depende do tempo que a mãe leva
para montar uma resposta imune à vacina, e também do transporte de IgG
transplacentário (Cavalcante, 2002).
No início dos anos 90, a Organização Mundial de Saúde desenvolveu um
estudo multicêntrico envolvendo 4 países em desenvolvimento (Etiópia, Gâmbia,
Papua Nova Guiné e Filipinas), cujo intuito era avaliar os aspectos clínicos e os
agentes etiológicos responsáveis por infecções graves entre crianças abaixo de 3
meses de idade. Em todos os estudos foi observada uma passagem de anticorpos
IgG específicos significativamente maior do que a observada nos controles
saudáveis não vacinados (Quiambao et al., 2003). Além disso, foi verificada uma
imunidade específica na criança, que persistiu durante 6 meses pós-parto (Lehmann
et al., 2003) e uma concentração significativamente maior de anticorpos IgA
específicos no leite, obtido até 6 meses pós-parto de mães imunizadas em relação
aos controles não imunizados (Lehmann et al., 2003; Englund e Glezen, 2003).
56
Resultados
Diversos trabalhos foram realizados com o objetivo de induzir a resposta
imune na mãe por meio da vacinação durante a gestação, e otimizar a transferência
de anticorpos para o feto. A vacinação durante a gravidez resulta em níveis mais
elevados de anticorpos IgG anti-PRP durante os dois primeiros meses de vida em
diversas populações (Englund et al., 1997; Mulholland et al., 1996; Santosham et al.,
2001). Um exemplo que demonstra o sucesso da imunização materna durante o
terceiro trimestre de gestação é a vacinação com o toxóide tetânico, que resultou na
prevenção do tétano neonatal e maternal nos países desenvolvidos (Miller, 1972).
Imprinting comportamental da mãe no RN
Em mamíferos, a imunização passiva materna protege a prole nos primeiros
meses de vida, proporcionando sua adaptação ao meio extra-uterino. Além da
proteção passiva, os anticorpos maternos, recebidos no período intrauterino
neonatal, influenciam em múltiplos parâmetros o desenvolvimento do sistema imune
do neonato (Lemke e Lange, 1999)
A literatura revela que diversas destas características são geralmente
induzidas durante os chamados períodos sensíveis, que ocorrem logo depois do
nascimento, período conhecido como “Konrad Lorenz”, no qual ocorre o imprinting
comportamental da mãe no RN. Lemke e Lange (1999) consideram que o imprinting
imunológico ocorre antes do desenvolvimento ontogênico do sistema imune do
neonato.
A maturação do sistema imune do neonato foi influenciada por anticorpos
maternos e outros fatores imunomodulatórios, como as citocinas. Dentre as
imunoglobulinas maternas, transferidas via placenta e amamentação, encontram-se à
passagem de anticorpos idiotipos, os quais têm seu sítio de ligação ao antígeno,
reconhecidos por outros anticorpos, denominados anti-idiotipos (Hanson et al., 1999).
Figura 4 – Anticorpo Idiotipo
Fonte:
Adaptado do site: http://www.fcf.usp.br/Ensino/Graduacao/Disciplinas/LinkAula/Hemofilos.PDF
57
Resultados
Hanson e colaboradores (1989) observaram que anticorpos anti-idiotipos,
devido sua capacidade de competir com antígeno no sitio de ligação do anticorpo
idiotipo, pode funcionar como a imagem do antígeno. O anticorpo anti-idiotipo e o
antígeno se ajustam ao mesmo sitio de ligação, específico do idiotipo (Hanson et al,
1989). Com isso, o anticorpo anti-idiotipo pode aumentar a produção de idiotipo, da
mesma maneira que o antígeno (Hanson et al, 1999).
Figura 5 – Esquema mostrando rede anti-idiotípica
Fonte: Adaptado de Hanson, 1989.
Conseqüentemente, os anticorpos maternos também exercem estimulação
ativa indicando sua influência na regulação da expressão de isótipos.Os anticorpos
anti-idiotipos provocam alterações ao longo do tempo como: determinação do
repertório de células B e T no adulto, aumento precoce da afinidade dos anticorpos
produzidos na resposta primária, proteção antimicrobiana por meio de anticorpos
não-reativos ao antígeno, os anticorpos anti-idiotipos, supressão alérgeno-específica
da responsividade de IgE, e sob condições patológicas, a transferência de doenças
auto-imunes (Lemke et al., 2004).
A conexão entre a rede anti-idiotípica e o desenvolvimento do repertório de
células B e T são guiados pela experiência imunológica da mãe. O efeito imprinting
de anticorpos maternos nos sistema imune do neonato beneficia a estabelecimento
58
Resultados
de uma resposta imune específica, ao longo dos anos (Lemke, 2004). Portanto, as
imunoglobulinas maternas, conseqüentes da experiência imunológica da mãe, são de
extrema importância para o desenvolvimento ontogênico do sistema imune do
neonato (Lemke e Lange, 1999).
1.3.2Imunidadeoferecidaduranteaamamentação
Há décadas que se investe na promoção do aleitamento materno, por meio de
Programas de Saúde de organizações governamentais e não governamentais, na
tentativa de reverter o desmame precoce (Pereira et al., 2004). Além da importância
nutricional, o colostro e o leite humano contêm anticorpos e polipeptídeos
antibacterianos inespecíficos, incluindo, lactoferrina, lisozima e peroxidase,
importantes na ação contra a colonização das mucosas por microrganismos,
proporcionando proteção ao lactente (Goldman, 1993).
Para tanto, as células presentes nas glândulas mamárias produzem fatores
estimuladores de colônias como GM-CSF, G-CSF e M-CSF, que estimulam a
proliferação de populações celulares. O colostro e o leite humano contêm citocinas
pró-inflamatórias e mediadoras da imunidade inata como IL-1, IL-6, TNF-, IFN-γ, e
os mediadores de imunidade adaptativa como IL-2, IL-4 que apresentam ação
estimuladora sobre linfócitos T e B, e a IL-10 que estimula a produção de IgA (Bernt
e Walker, 1999).
Os anticorpos encontrados no leite representam um repertório variável
resultante de complexas interações entre mãe e meio ambiente. Desde sua
descoberta, sabe-se que a imunoglobulina A (IgA) representa 90% do conteúdo total
das imunoglobulinas presentes no colostro e leite, sendo encontrada normalmente
sob a forma polimérica (pIgA) (Hanson et al., 1961). Este anticorpo constitui-se,
geralmente, de um dímero ligado covalentemente a um polipeptídeo denominado de
cadeia J, que é sintetizada por plasmócitos produtores de IgA (Xanthou, 1998;
Brandtzaeg, 2003).
59
Resultados
A pIgA é reconhecida pelo receptor de imunoglobulina polimérica (plgR), o
qual é produzido por células epiteliais e expresso na membrana baso-lateral das
mesmas (Goldman, 1993; Brandtzaeg, 2003). Na lâmina própria das mucosas, a
pIgA secretada liga-se a esses receptores e, após a formação do complexo, o
mesmo é transportado para a superfície apical da célula e liberada para o lúmen.
Durante a secreção o receptor plgR é clivado, formando uma nova molécula, o
componente secretor (SC) que fica acoplado à molécula de imunoglobulina
constituindo a IgA secretora (sIgA). Este processo é regulado por hormônios
produzidos no final da gestação ou durante a lactação e por citocinas como IL-5 e IL-
6 (Strober et al., 2000). A concentração de IgA total pode chegar a 5.000 mg/dl no
colostro e 25 mg/dl no leite (Strober et al., 2000).
Outros isótipos são encontrados no colostro e no leite materno como a IgG,
que raramente excede a concentração de 100 mg/dl. As proporções das subclasses
de IgG diferem daquelas presentes no soro, pois os valores percentuais de IgG2 e
IgG4 estão significativamente mais elevados no colostro do que no soro humano
(Xanthou, 1998). Este dado pode ser relevante, uma vez que a IgG2 é eficaz contra
polissacárides, e sua passagem transplacentária está prejudicada em relação a
concentração de IgG1 e IgG3 (Costa-Carvalho et al., 1996). O leite também contém
aproximadamente 25 mg/l de IgM (Xanthou, 1998).
Diante do exposto, os anticorpos séricos e secretores, os quais a mãe
produz e transfere para o infante, conferem proteção com relação às doenças
inerentes à infância, principalmente, as respiratórias. Além disto, estes anticorpos
têm funções imuno-reguladoras e imuno-estimuladoras que podem repercutir no
processo de maturação do sistema imune do neonato. Para tanto, o presente
trabalho propôs a vacinação de gestante, com a vacina anti-Hib, para constituição de
um grupo de mães vacinadas, o qual foi comparado a um grupo de mães não
vacinado para compreender melhor a produção e a especificidade de anticorpos
anti-Hib, e sua transferência para a criança.
60
Resultados
2
OBJETIVO
O objetivo deste trabalho foi comparar a transferência materno-infantil de
anticorpos séricos e secretores anti-Hib nas populações de mães vacinadas e não
vacinadas com a vacina anti-hib, tendo como perspectiva a produção e a
especificidade destes anticorpos.
61
Resultados
3. Materiais e Métodos
3.1 Casuística
3.1.1 Áreas de abrangência do estudo
As gestantes foram selecionadas no serviço de pré-natal do Hospital
Universitário (HU) da USP e do Amparo Maternal. A área de abrangência do HU
compreende basicamente as regiões do Rio Pequeno, Jaguaré e Butantã. Contudo,
a população atendida por este hospital também é composta por estudantes e
funcionários da USP, ou seja, ele acaba compreendendo não somente as regiões
citadas. Logo, a clientela atendida por este serviço de saúde é heterogênea, pois há
uma variação entre os pacientes quanto a sua situação socioeconômica e cultural.
O Amparo Maternal é um centro de parto normal localizado na Vila
Clementino, onde são atendidas gestantes oriundas de diversas regiões, inclusive de
áreas fora do Estado de São Paulo. Esta Instituição tem um serviço social, o qual
acolhe gestante moradora de rua, provendo a elas moradia, alimentação e vestuário,
durante toda a gestação e parte do puerpério. As gestantes selecionadas no Amparo
Maternal foram especificamente moradoras do alojamento social desta Instituição.
Tal caráter mostra as diferenças: social, econômica e cultural, presente no
grupo de gestante, escolhido para o trabalho. Entretanto, a maioria das amostras
coletadas foi de gestantes de baixa renda.
3.1.2 Realização do pré-natal e entrevistas
As consultas do pré-natal e as entrevistas realizadas com as gestantes do
alojamento social do Amparo Maternal foram avaliadas pela enfermeira investigadora
62
Resultados
deste estudo. A entrevista da gestante ocorreu durante as consultas de pré-natal e
foi preenchido o questionário contendo a identificação e sua história gestacional
(ficha em anexo). A partir desta seleção, a gestante foi acompanhada até o final da
gestação por meio das consultas do pré-natal e acompanhamento ativo por telefone.
Em relação às gestantes que foram selecionadas no serviço de pré-natal do
HU, as consultas foram feitas pelos médicos desta Instituição. Em paralelo, às
consultas do pré-natal, as entrevistas foram realizadas pela enfermeira investigadora
deste trabalho que procedeu da mesma forma que no Amparo Maternal.
3.1.3 Critérios de inclusão e exclusão
Foram usados os seguintes critérios de inclusão: idade entre 18 a 35 anos;
ausência de quadros de diabetes e/ou hipertensão; reações sorológicas negativas
para HIV, sífilis e hepatite; idade gestacional para vacinação entre 28 a 34 semanas
determinados a partir da avaliação da ultra-sonografia (USG) e da data da última
menstruação (DUM); e no pós-parto, acompanhamos os recém-nascidos (RN) sadios
com peso adequado para idade gestacional.
Durante a realização do trabalho foram excluídas: mulheres com hipertensão,
diabetes mellitus, cardiopatias, obesidade, insuficiência renal, doenças crônicas em
geral e uso prolongado de corticoterapia. Os RNs com anomalias congênitas ou que
necessitaram de cuidados intensivos após o nascimento e aqueles que nasceram
com intervalo menor que duas semanas após a administração da vacina na mãe,
foram excluídos do trabalho.
3.1.4 População estudada
Participaram do estudo 29 mulheres saudáveis atendendo aos critérios de
inclusão e exclusão acima descritos. Destas mães, 13 gestantes receberam a vacina
anti-Hib e 16 não receberam.
63
Resultados
3.1. 5 Vacinação
As 13 gestantes foram imunizadas com a vacina anti-Hib, denominada
ActHib®, Pasteur Merieux. A vacina foi administrada em dose única nas gestantes
com idade gestacional entre 28 a 34 semanas, de acordo com USG e/ou DUM,
sendo que a dose aplicada foi de 0,5 ml por via intramuscular, na região do deltóide.
Cada 0,5 ml de vacina ActHib® contém 10 microgramas de Hib PS conjugado com
24 microgramas de toxóide tetânico (PRP-T). Os números dos lotes utilizados foram:
Y0199-2 e Y1083-3.
3.1.6 População controle não vacinada
Foram utilizadas 16 amostras de soros de parturientes clinicamente sadias e
de seus cordões umbilicais pareados com suas amostras de colostro e leite. As mães
foram selecionadas, durante meu projeto de iniciação científica, seguindo os mesmos
critérios descritos acima. As mães foram informadas dos objetivos do projeto e seus
fins, a coleta só ocorreu com o consentimento informado da mesma.
3.1.6 Amostras
Amostras de sangue periférico materno e de sangue do cordão umbilical
Amostras pré-vacinal e pós-vacinal maternas
As amostras, pré-vacinal maternas, foram colhidas através de punção venosa,
com seringa a vácuo, imediatamente antes da imunização. Enquanto as amostras,
pós-vacinal das puérperas, foram coletadas, na mesma condição, em até, 48 horas
pós-parto. Após a coleta as amostras de sangue periférico foram centrifugadas e o
soro armazenado a -20
o
C.
Amostras de sangue do cordão umbilical
As amostras de sangue do cordão foram colhidas por meio da punção da veia
umbilical, lado fetal, com seringa e agulha. Após a coleta as amostras de sangue
umbilical foram armazenadas a -20
o
C.
64
Resultados
Amostras de colostro e leite
O colostro e o leite foram coletados por ordenha manual, sendo o primeiro
retirado entre 48 a 72 horas após o parto, e o segundo 10 a 60 dias após o parto. As
amostras de colostro e leite foram centrifugadas e delipidadas, o soro obtido foi
armazenado a -20
o
C.
3.2 Ensaios Laboratoriais
3.2.1 Dosagem de IgG e IgA total por imunodifusão radial quantitativa (IDRQ)
A técnica de imunodifusão radial inicia-se com o preparo da agarose 1%, em
PBS 7,4. Posteriormente, o Eelenmeyer contendo agarose é transferido para o
banho a 56
o
.C até a estabilização da temperatura. Nos testes para dosagem de
anticorpos totais, para cada 6 mL de agarose, foram colocados 70 L de anti-IgG
humano ou 120 L de anti-IgA humano, ambos de carneiro (Biolab). A temperatura
da agarose fundida não deve ultrapassar a temperatura de 56
º
C para colocar anti-
IgG ou IgA humano, pois uma temperatura mais elevada pode provocar a
desnaturação dessas proteínas.
Para dosar IgG total foram utilizados, como padrão, o soro de uma paciente
previamente selecionada, o qual se iniciou com uma diluição de 1:10 até 1:320. Dois
controles foram utilizados a partir de soros de pacientes sadios, diluídos a 1:20 e
1:40. As demais amostras a serem testadas também foram diluídas a 1:20 e 1:40.
Enquanto, para determinarmos os valores de IgA total utilizamos, como
padrão um anticorpo de captura – IgA secretora – como controles, foram utilizadas
as mesmas amostras dos ensaios para detecção de IgG total, sendo que a diluição
realizadas para a curva iniciou-se em 1:1 até 1:16. Para os dois controles e as
demais amostras, nós utilizamos a diluição de 1:8 e 1:16.
Os halos foram realizados com diâmetro de 5 mm, no gel de agarose, e foram
aplicados 5µL das amostras (devidamente diluída em tampão PBS 7,4). A seguir, a
placa foi incubada em câmara úmida por 48 horas a 4º C. Após esse período, os
65
Resultados
diâmetros dos halos de precipitação foram medidos e os valores colocados no
gráfico com uma curva padrão. Os resultados finais foram obtidos a partir do o
programa Graphpad Prisma ® (Microsoft – E.U.A).
3.2.2 Dosagem das subclasses de IgG
Os níveis de subclasses de IgG1 e IgG2 presentes nos soros de mães
imunizadas e não-imunizadas e dos seus respectivos RNs, também foram avaliados
através do método de nefelometria, utilizando nefelômetro Behring (BN 100) com
padrões e controles apropriados.
3.2.3 Ensaio imunoenzimático (ELISA) para detecção de anticorpos anti –
polissacarídeos
(PS) de Hib
Para verificar a presença de anticorpos IgG anti-Hib pré e pós-vacinal nas
amostras maternas e do soro do cordão umbilical e anticorpos IgA anti-Hib nas
amostras de colostro e leite, foram realizados testes de ELISA em fase sólida,
conforme técnica descrita por Takano (1997).
Segundo Barra e colaboradores (1988), distintos métodos de avaliação
descritos na literatura com o mesmo objetivo, relatam as dificuldades para a
detecção de anticorpos anti-PS de Hib. Um dos problemas se refere a uma
característica inerente ao antígeno polissacarídeo de Hib, carregado negativamente
em razão das ligações fosfodiester, o que dificulta sua ligação à fase sólida da placa
de microtitulação do ELISA.
A maioria das técnicas padronizada para o ELISA procura contornar essa
dificuldade, conjugando previamente o poliribosilribitol fosfato (PRP) da cápsula do
Hib com substâncias protéicas, como a poli-L-lisina, que se liga às placas mais
facilmente (Gray, 1979; Herrmann et al., 1992). Harada e colaboradores (1985)
utilizaram pérolas de vidro como fase sólida, adsorvendo primeiro anticorpos anti-PS
de Hib produzidos em coelho para posterior ligação do PS do Hib.
66
Resultados
Detecção de IgG anti – Hib nas amostras de soro
O ensaio imunoenzimático para detectar IgG anti-Hib iniciou com a adsorção do
antígeno à placa de microtitulação Covalink (Nunc). O Hib (Pasteur-Mérieux) foi
utilizado na concentração final de 5 g/ml em solução contendo Carbodiimide -
EDAC a 1% em água destilada. Posteriormente, foram adicionados 100l/poço desta
solução nas placas, que foram colocadas em câmara úmida, durante 16 horas a 37º
C.
O pool Hib foi a amostra de soro usada como referência para a construção da
curva padrão do ELISA e para a dosagem de anticorpos IgG anti-Hib. Esse pool de
soro foi formado por 20 amostras de sangue de adultos saudáveis com igual
distribuição para o sexo. Segundo Takano (1997), o pool Hib apresenta 77g/mL de
IgG anti-PS, cujas dosagens foram realizadas pelo laboratório Pasteur-Mérieux
(França) por meio da técnica de radioimunoensaio.
As placas foram lavadas com solução de PBS – Tween 20 0,1% por 4 vezes.
Seqüencialmente, para evitar ligações inespecíficas com o antígeno, as placas foram
bloqueadas com 100l/poço de solução de leite desnatado (Molico) a 1% em PBS
7,4. Após este procedimento, foram incubadas por 1 hora a 37º C.
Após a incubação, foram realizadas lavagens, adicionou-se nos primeiros
poços da placa: 100l de curva padrão, controles, amostras de soro ou de colostro
ou de leite, os quais foram diluídos previamente em solução de leite Molico 10% em
PBS-Tween 20 0,1%. Nos demais poços foram colocados 50 l do tampão para
diluição serada. Depois, as placas foram incubadas à 37º C durante 2 horas.
Depois de 2 horas de incubação, as placas foram novamente lavadas, em
seguida, adicionou-se 50l/poço do conjugado. O conjugado consiste em um anti-IgG
(IgG) marcado com peroxidase (Hybridoma, USA, clone HP – 6043), utilizado na
diluição de 1:5.000 no mesmo tampão de diluição das amostras. O tempo de
incubação desse processo ocorreu em 1 hora e 30 minutos à 37º C.
67
Resultados
No término desse período, as placas foram novamente lavadas, foram
adicionados 100 l do substrato, constituído por 1 pastilha de 10mg de
ortofenilenodiamina (OPD) dissolvida em 25ml de tampão citrato fosfato pH 5.0 e
10l de água oxigenada (H
2
O
2
). Após 30 minutos, foram adicionados 50l em cada
poço da solução de ácido sulfúrico a 2,5N. A realização da leitura da placa ocorreu
no leitor de ELISA com comprimento de onda 492nm.
Detecção de IgA anti – Hib nas amostras colostro e leite
Para verificarmos a presença anticorpos IgA anti-Hib, em amostras pré e pós-
vacinal de colostro e leite materno, padronizamos algumas etapa do teste de ELISA.
Para tanto, foram realizados cerca de 8 ensaios, sendo que os mesmos tiveram boa
reprodutibilidade.
Nos testes para padronização, a placa foi sensibilizada com 5 g/ml de PRP,
na mesma condição que o ensaio para detecção de IgG anti-Hib. As amostras
testadas foram o pool SE e 98, os quais foram diluídos em solução de leite Molico
10% em PBS-Tween 20 0,1%, nas diluições entre 1:25 à 1:200. Em seguida, este
pool foi utilizado como controle nos testes de ELISA para as dosagens de IgA
secretora, no colostro e leite de mães vacinadas e não vacinadas.
Para a constituição do “pool” SE foram usados 3 mL do sobrenadante de 32
amostras de colostro de mães não imunizadas com a vacina anti-Hib e pré -
selecionadas no Hospital Universitário (H.U.). Segundo Palmeira (2001), o pool 98
foi formado por 50 amostras de colostro de puérperas também selecionadas no H.U.
A seleção, de mães para ambos grupos, seguiu os mesmos critérios estipulados para
a coleta de soro, no presente trabalho.
Após a sensibilização da placa e o período de incubação das amostras, o
conjugado foi adicionado, um anticorpo monoclonal anti-IgA humano marcado com
peroxidase (Hybridoma, USA, clone HP – 6043), testado nas diluições de 1:2.000,
1:3.000, 1:4.000 e 1:5.000, no mesmo tampão de diluição das amostras. O tempo de
incubação desta etapa foi de 1 hora e 30 minutos à 37º C. Os melhores resultados
68
Resultados
foram adquiridos usando o conjugado na diluição de 1:4.000, a qual foi adotada nos
ensaios seqüentes.
Nos testes finais referentes à padronização foram dosadas amostras de
colostro e leite coletadas seis meses pós-parto de uma paciente portadora de
hipogamaglobulinemia, grave nas diluições de 1:2 e de 1:4, respectivamente. O
intuito foi observar a existência de ligações inespecífica, uma vez que esta paciente
não possui níveis detectáveis de imunoglobulinas das classes IgG, IgA e IgM.
Os testes mostraram que, de acordo com o esperado, os valores de
absorbância foram baixos, próximos do branco, tanto para a amostra de colostro
quanto de leite da paciente com hipogamaglobulinemia, confirmando a especificidade
do ensaio. Após a realização de vários testes, observou-se que os poços
considerados como branco do ensaio, nas posições H
1
e
H
2
da placa, também não
revelaram valores de absorbâncias significativos, demonstrando que não houve
reação inespecífica.
Os resultados finais obtidos dos ELISAs realizados para detectar IgA anti Hib
são dados na forma de titulos. Diante da necessidade de termos dados
quantitativos mensuráveis para compararmos, de forma mais específica, a
quantidade de IgA, presente no leite, com a IgG do soro, resolvemos padronizar os
resultados do ELISA. Para tanto, foi utilizado o método de Fomsgaard (1990) para
determinarmos as concentrações dos anticorpos IgA anti Hib.
Determinação subclasses IgG1 e 2 anti-Hib
Para detectarmos as subclasses IgG 1 e 2 anti-Hib utilizamos o mesmo
protocolo para a dosagem da classe IgG anti-Hib, substituindo o habitual conjugado
pelo anticorpo monoclonal IgG 1 anti-PRP (clone – 8c/6-39) e IgG 2 anti-PRP (clone
– HP6014), respectivamente, nas diluições de 1:500 e 1:1000, a avidina conjugada
com peroxidase, utilizada também, respectivamente, nas concentrações de 1: 500 e
1:1000.
69
Resultados
Determinação dos índices de avidez de anticorpos anti-Hib
A avidez relativa dos anticorpos foi determinada das amostras de mães
imunizadas e não-imunizadas, assim como das amostras de seus respectivos
cordões, utilizando-se tiocianato de potássio em diferentes molaridades para eluir os
complexos formados pela reação antígeno-anticorpo, segundo técnica descrita por
Jones et al. (1987). Os resultados foram expressos como a molaridade (M) de KSCN
necessária para eluir 50% dos complexos formados.
3.2.4 Western blotting para determinação qualitativa de anticorpos anti-Hib
SDS-PAGE
As amostras de extrato de bactéria total do Haemophilus influenzae tipo b,
utilizado no immunoblotting, cepa GB3291, foi gentilmente, doado pela Dra Takagi.
As amostras de extratos de bactéria foram diluídas em tampão de amostra contendo
a 2% de SDS, 5% -mercaptoetanol e de azul de bromofenol suficiente para que a
concentração final de proteína fosse igual a 1μg de proteína por μL de tampão de
amostra, a mistura foi fervida durante 10 minutos.
Eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE )
A eletroforese foi realizada de acordo com metodologia empregada por
Carbonare e colaboradores (1995). A corrida de SDS-PAGE foi feita em gel de
acrilamida 12,5%. Como padrão de massa molar foi utilizado um "Kit" (Pharmacia,
Upsala). As corridas foram realizadas com voltagem constante de 100V e corrente
variável por 90 minutos.
“Immunoblotting” para detecção qualitativa de anticorpos reativos ao
Haemophilus influenzae tipo B
70
Resultados
Os ensaios de “immunoblotting” (IB) foram realizados de acordo com a
metodologia empregada por Carbonare et al. (2003). A partir de um gel de SDS-
PAGE foi preparado um "sanduíche" com os papéis de filtro, o gel e a folha de
nitrocelulose (BioRad, USA) embebidos em tampão tris glicina. A corrida de
transferência foi realizada em sistema semi-seco, fixado na voltagem de 14 volts,
durante 40 minutos.
Após a corrida de transferência, a membrana de nitrocelulose foi corada com
Ponceau S e cortada em tiras. Depois do bloqueio com leite desnatado a 5%
(Molico), as amostras foram adicionadas na diluição apropriada, de acordo com as
dosagens de IgG e IgA obtidas por ELISA. A incubação foi feita durante 15 a 18
horas à temperatura ambiente, em agitador basculante.
No dia seguinte, após lavagem com tampão tris salina 0,01M tween 1%, os
conjugados anti IgG ou anti-IgA (Sigma, St. Louis, MO), marcados com peroxidase,
foram adicionados nas diluições 1:1000 para IgG e 1:4000 para IgA. Após incubação
de 2 horas a temperatura ambiente, as fitas foram lavadas e foi adicionado o
substrato com 3,3’- diaminobenzidina (DAB) (Sigma, St. Louis, MO) a 50 mg em
tampão tris 0,05M pH 7,6 e 5 μl/mL de H2O2, obtendo a revelação das bandas
antigênicas.
3.3 Análise Estatística
Para análise estatística do presente trabalho foi usado teste não paramétrico,
especificamente o de teste de Mann-Whitney. Segundo Siegel (1975), a estatística
não-paramétrica representa um conjunto de ferramentas de uso mais apropriado em
pesquisas que não se conhece a distribuição da população e seus parâmetros. O
presente estudo compara duas populações em que os testes não-paramétricos são
classificados de acordo com o nível de mensuração e o número de grupos que se
pretende relacionar, pois o teste de Mann-Whitney é aplicado quando estão em
comparação dois grupos independentes e a variável deve ser de mensuração
ordinal.
71
Resultados
4
RESULTADOS
O presente estudo avaliou 29 gestantes, das quais 13 foram imunizadas com
a vacina ActHib®, e 16 não foram vacinadas. As 29 gestantes continuaram no
estudo, até o puerpério, destas mães coletamos sangue materno, sangue do cordão
umbilical, colostro e leite. O intervalo de coleta entre as amostras pré e pós-vacinais
foi de 4 a 12 semanas, correspondendo ao período em que ocorreu o parto. Em
ambos os grupos de mães, foram dosados anticorpos séricos, secretores e
subclasses (IgG1 e IgG2) totais e específicos para o Hib. Nos conjuntos de amostras
também verificamos a avidez dos anticorpos séricos e secretores específicos para o
Hib e em algumas destas amostras realizamos os ensaios de “Immunoblotting”.
4.1 Dosagem de imunoglobulinas totais (IgG sérica e IgA Secretória) e
subclasses de IgG (IgG1 e IgG2)
Foram dosados anticorpos IgG totais e subclasses (IgG1 e IgG2) séricos em
amostras de sangue de gestantes vacinadas e não vacinadas, e em seus respectivos
cordões umbilicais. Também determinamos anticorpos SIgA nas amostras de
colostro e leite.
Anticorpos IgG Totais
As amostras de soro de mães vacinadas e não vacinadas apresentaram níveis
totais de IgG semelhantes aos de seus recém nascidos. Como esperado, no grupo
de mães vacinadas, e seus respectivos RNs, não observamos aumento quanto à
72
Resultados
produção de imunoglobulinas totais quando comparado com o conjunto de mães não
vacinadas e seus RNs (Tabela 1, Figura 6 – gráficos: A, B, C e D – e figura 7). As
amostras pré-vacinais revelaram valores de imunoglobulinas similares ao grupo não
imunizado. Os soros pós-vacinais mostraram também o mesmo perfil de
concentração de IgG total, ou seja níveis de imunoglobulinas equivalentes ao grupo
não vacinado (Figura 6 – gráfico D).
73
Resultados
Resultados
Subclasses IgG 1 e IgG 2
Não foram dosadas as subclasses em todas as amostras maternas, pois o
volume obtido das amostras, durante a coleta, não foi suficiente para realizarmos os
ensaios referentes à dosagem de subclasses “totais”. Contudo, nas amostras
dosadas obtivemos resultados similares aos dos experimentos referentes à IgG total,
ou seja, observamos que os grupos de gestantes vacinadas e não vacinadas
também não apresentaram diferenças quantitativas quanto à concentração das
subclasses de IgG 1 e IgG 2.
Nas duas populações foi verificado que a passagem transplacentária de IgG1
ocorre de forma eficiente (Figura 8) . A concentração desta subclasse nos RNs foi
equivalente aos níveis maternos. Enquanto, a transferência pela placenta de IgG2
ocorreu de forma menos eficiente que IgG1, em ambas as populações. (Figuras 8 e
9).
Figura 8. Concentração da subclasse IgG1 (µg/ml) em amostras de soro maternas vacinadas (n=7) e
não vacinadas (n=12) e a concentração desta subclasse em amostras de soro de cordão
umbilical de mães vacinadas – RNs (V) e não vacinados – RNs (NV)
Figura 9. Concentração da subclasse IgG2 (µg/ml) em amostras de soro maternas vacinadas (n=4) e
não vacinadas (n=6) e a concentração desta subclasse em amostras de soro de cordão de
mães vacinadas – RNs (V) e não vacinadas – RNs (NV).
Resultados
Anticorpos IgA Totais
Foram dosadas IgA total em 13 amostras de colostro de mães vacinadas 10
amostras de leite destas mesmas mães, faltaram três amostras de leite, porque duas
destas puérperas não residiam em São Paulo, retornando a cidade de origem, e uma
deixou de amamentar nos primeiros dias pós-parto. Quanto ao grupo de mães não
imunizadas, com a vacina anti-Hib, foram determinadas a concentração de IgA
secretória total em 16 amostras de colostro e leite.
As amostras de colostros de mães vacinadas e não vacinadas apresentaram
níveis totais de IgA secretória elevados, quando comparados aos níveis deste
anticorpo presentes no leite, como mostra a figura 10 (mães vacinadas P<0.0001 e
U=18; mães não vacinadas P<0.0001 e U=0). Entretanto, o grupo que recebeu a
vacina não apresentou aumento de imunoglobulinas totais comparado ao grupo não
vacinado.
Figura 10. Concentrações de anticorpos SIgA (µg/ml) em amostras de colostro e leite materno de
puérperas vacinadas com vacina anti-Hib (n=13) e não vacinadas (n=16), coletadas nos
períodos entre 48 a 72 horas (colostro) e 10 a 60 dias pós-parto (leite). P<0,05.
Resultados
As amostras de colostro de mães vacinadas não apresentaram nível de
imunoglobulina maior que as amostras de mães não vacinadas (P=0,1456 e U=
76,50). O mesmo ocorre com as amostras de leite, pois em ambos os grupos a
concentração de IgA secretória foi equivalente (P=0,9812 e U=92,50) (Figura 11).
Figura 11. Concentrações de anticorpos SIgA (µg/ml) em amostras de colostro de puérperas
vacinadas com vacina anti-Hib (n=13) e não vacinadas (n=16), coletadas nos períodos entre
48 a 72 horas pós-parto.
Figura 12. Concentrações de anticorpos SIgA em amostras de leite materno de puérperas vacinadas
(n=10) e não vacinadas com vacina anti-Hib (n=16), coletadas nos períodos entre 10 a 60
dias pós-parto.
Resultados
4.2 Avaliação anticorpos específicos
Dosagem de anticorpos IgG anti-Hib
Foram dosados anticorpos anti-Hib nas amostras de soro materno e cordão
umbilical de parturientes vacinadas (n=13) e não vacinadas (n=16). As amostras pré-
vacinais de mães imunizadas e o grupo não vacinado mostraram dosagem de IgG
anti-Hib equivalentes (P=0,9475 e U= 102) (Figura 14 – gráfico A). Entretanto, os
resultados dos soros pós-vacinais destas parturientes imunizadas, quando
comparados às amostras de mães que não receberam a vacina, apresentaram maior
concentração destes anticorpos (P≤ 0,0001 e U=4) (Figura 14 – gráfico B). O mesmo
ocorre com os valores pré e pós-vacinais (P≤ 0,0001 e U=4) (Figura 14 – gráfico C),
na população vacinada. Todas as amostras pós-vacinais do grupo vacinado
mostraram aumento de anticorpos anti-Hib (Figura 16). A passagem placentária
ocorreu nos dois grupos, a concentração de anticorpos nas mães e em seus
respectivos RNs foi similar (Figura 17). Os cordões umbilicais, destas mães, também
mostram maior concentração de IgG anti-Hib com relação aos cordões de
parturientes não vacinadas(Figura 15), embora, a taxa de transferência seja menor
na população vacinada (T= 46,6%) em relação a não vacinada (T=87,0%) (Figura 17,
Anexo x).
Figura 13. Concentrações de anticorpos (µg/ml) IgG séricos anti-Hib em amostras pré e pós-vacinais
de mães imunizadas com vacina anti-Hib (n=13) e grupo controle de parturientes não
vacinadas (n=16).
Resumo
Figura 14. Concentrações de anticorpos (µg/ml) IgG séricos anti-Hib em amostras de mães vacinadas
com vacina anti-Hib (n=13) e não vacinadas (n=16): (A) comparação entre amostras pré e
não vacinadas; (B) relação entre amostras pós-vacinais e não vacinadas; (C) comparação
entre as amostras pré e pós-vacinais.
Resumo
Figura 15. Concentrações de anticorpos (µg/ml) IgG séricos anti-Hib em amostras de cordões
umbilicais de mães vacinadas com a vacina anti-Hib (n=13) – RNs (V) e não vacinadas
(n=16) – RNs (NV).
Figura 16. Concentrações de anticorpos (µg/ml) IgG séricos anti-Hib em amostras maternas
individuais pré e pós-vacinal de gestantes imunizadas com vacina anti-Hib e seus
respectivos cordões umbilicais (n=13) – RNs (V).
Resumo
Mães(pós) RNs (V) Mães RNs (NV)
0.1
1
10
100
1000
Amos
pós v
tras de sangue
acinal
Amos
umbi
tras de cordão
lical (vacinada)
Am
Mães
ostras de sangue de
não vacinadas
Am
umb
ostras de soro do cordão
ilical (não vacinada)
0.3974
67.50
P=
U=
0.9549
126.0
P=
U=
Mediana de *T=46,6%
Mediana de *T=87%
oncentração de IgG anti-Hib
valores em log
10
g/ml
C
Figura 17. Concentração de anticorpos (µg/ml) IgG séricos anti-Hib entre amostras maternas
vacinadas com vacina anti-Hib (n=13) e não vacinadas (n=16). *Taxa de transferência
materno fetal
.
Dosagem de subclasse IgG1 e IgG2 anti-Hib
As amostras de mães vacinadas apresentaram valores de IgG1 e IgG2 mais
elevados que as amostras de mães não imunizadas (Figuras 18, 19 e 20). Com
relação às amostras de sangue de cordão, observou-se que a população vacinada
apresentou maior concentração destes anticorpos quando comparado com o grupo
não vacinado (Figura 18 B).
Resumo
Figura 18. Relação entre a concentração (µg/m) de anticorpos IgG1 anti-Hib em
conjuntos de amostras de soros de mães vacinadas (n=13) e não vacinadas (n=16) e
seus respectivos RNs: (A) Comparação entre as amostras pré e pós-vacinal de mães
vacinadas e mães não vacinadas; (B) Relação entre os soros de cordões umbilicais
de mães vacinadas – RNs (V) e mães não vacinadas – RNs (NV)
Resumo
Figura 19. Concentração de anticorpos IgG2 anti-Hib (µg/m): (A) amostras pré e pós-vacinal de mães
vacinadas (n=13) e mães não vacinadas (n=16); (B) amostras de sangue de cordões
umbilicais das mães vacinadas – RNs (V) e não vacinadas – RNs (NV)
Resumo
Figura 20. Concentração de subclasses anti-Hib (µg/m) (n=13): (A) Concentração de IgG1
anti-Hib em amostras maternas individuais; (B) Relação entre a concentração de
anticorpos IgG2 anti-Hib em amostras maternas individuais.
Resumo
Figura 21. Concentração de subclasses IgG anti-Hib (µg/m): (A) Relação de anticorpos
IgG1 anti-Hib nos conjuntos de amostras; Concentração de anticorpos IgG2 anti
Hib em amostras de soros de mães vacinadas (=13) e não vacinadas (n=16). P
<0,05.
*Taxa de transferência materno fetal.
Resumo
Dosagem de anticorpos IgA anti-Hib
Os níveis de anticorpos IgA anti-Hib no colostro e leite de mães vacinadas foram
mais elevados quando comparados aos das mães não vacinadas (Figuras 23 A e B).
Nestes dois grupos, observou-se que a concentração de anticorpos anti-Hib no
colostro foi mais elevada que no leite (Tabela 1 e Figura 22). Entretanto, os
resultados apresentados nas amostras de colostro e leite inerentes ao grupo de
mães vacinadas não mostraram diferenças significativas (P=0,1366 e U=40,50).
Figura 22. Concentração de anticorpos (µg/m) IgA anti-Hib entre as amostras de colostro (n=13) e
leite (n=10) de puérperas vacinadas e não vacinadas(colostro e leite n=16), coletadas nos
períodos entre 48 a 72 horas (colostro) e 10 a 60 dias pós-parto (leite). P<0,05.
Resumo
Figura 23. Concentração de anticorpos (µg/m) IgA anti-Hib em amostras de colostro e leite humanos
de puérperas vacinadas e não vacinadas, coletados nos períodos entre 48 e 72 horas
(colostro) e 10 e 60 dias (leite): (A) Relação entre Colostro (n=13) de mães vacinadase não
vacinadas (n=16); (B) Comparação entre o leite de puérperas vacinadas (n=10) e não
vacinadas (n=16). P<0,05.
Resumo
Tabela 1 – Níveis de anticorpos séricos (IgG), secretores (IgA) (g/ml) Totais e anti-
Hib detectados em 13 conjuntos de amostras (Mãe e RN) presentes em
parturientes vacinadas.
IgG anti-Hib IgG total IgA total IgA anti-Hib
Amostras
*NV **A V ***BV *NV **A V ***BV
+
CV
++
LV
+
CV
++
LV
1 4,6 720 288 22.300 27.748 22.55 3.360 1.500 64,5 12,60
2 2,8 136 64 18.000 23.570 12.708 2.800 1.550 5,2 1,00
3 0,5 4,89 2,7 21.096 11.630 15.660 9.600 1.000 3,2 0,30
4 0,43 12 12 20.520 19.800 21.680 7.400 1.540 10.2 0,40
5 0,37 18 9 21.086 23.400 3.311 4.170 1.546 16,0
#
NC
6 2,4 135 151 18.850 20.550 15.900 4.700 1.050 30,0 20,00
7 1,6 312 145 12.294 12.294 9.958 7. 295 970 28,0
#
NC
8 0,77 6,5 5.16 15.580 8.600 14.210 5.326 1.011 4.5
#
NC
9 0,16 120 19.2 11.800 15.430 11.720 1.777 977 25,0 13,00
10 5,48 115 40 13.520 12.560 15.000 4.000 1.410 27,7 19,00
11 13,8 640 588 8.260 4.110 5.033 1.865 730 24,0 18,00
12 8,5 681 282 10.680 10.000 7.000 2.946 706 12,3 8,00
13 2,3 80 37 10.060 9.000 6.910 2.900 700 0,09 0,09
Mínimo
0,164 4,89 2,7 8.260 4.110 12.780 1.777 1.011 0,09 0,09
Mediana
2,3 120,0 40,0 15.580 12.560 6.910 4.000 1.546 16,0 10,3
Maximo
13,80 720 588 21.096 23.570 21.680 9.600 1.550 30,00 20,00
*(NV) Concentração de anticorpos IgG totais e anti-Hib em amostras pré vacinais de soros maternos.
**(AV) Concentração de anticorpos IgG totais e anti-Hib em amostras pós vacinais de soros maternos. **
*(BV) Concentração de anticorpos IgG totais e anti-Hib em amostras de soros de cordão umbilical de mães
vacinadas.
+
(C) Concentração de IgA total e anti-Hib no colostro.
++
(L) Concentração de IgA total e anti-
Hib no leite.
#
(NC) Não Coletada.
Resumo
Tabela 2– Níveis de anticorpos séricos (IgG), secretores (IgA) (g/ml) Totais e anti-
Hib detectados em 16 conjuntos de amostras (Mãe e RN) presentes em
parturientes não vacinadas.
IgG anti-Hib IgG total IgA total IgA anti-Hib
Amostras
*A **B *A **B
+
C
++
L
+
C
++
L
1 0.52 0.45 15.600 17.030 13.708 1.493 0,55 0,55
2 4,60 3,10 15.340 14.300 3.013 312 0,09 0,04
3 2,26 2,26 13.930 10.230 1.470 1.080 3,00 0,60
4 3,60 4,09 6.290 12.620 9.878 2.540 0,23 0,19
5 2,90 1,80 14.360 15.160 2.400 740 0,84 0,38
6 2,20 2,70 27.230 14.890 7.326 1.011 1,27 0,27
7 1,10 2,20 17.934 10.787 13.777 977,0 4,16 0,20
8 3,30 2,90 8.610 10.910 18.886 1.029 3,30 0,18
9 0,96 0,38 7.507 7.010 18.935 1.493 1,20 0,21
10 0,96 0,74 13.965 16.512 5.295 970 1,16 0,17
11 25,40 26,7 8.130 16.000 3.726 837 1,30 0,187
12 1,00 1,40 17.270 12.800 5.600 9.500 2,00 0,74
13 1,60 1,50 8.760 11.750 5.190 1.060 0,50 0,10
14 1,70 1,60 14.850 14.190
8.510 705
1,60 0,30
15 1,60 1,50 8.760 11.750 5.190 1.060 0,50 0,10
16
0,46 0,41 27.230 15.000 7.326 1.011 1,40 0,63
Mínimos
0,46 0,38 6,29 7,01 1,47 1.011 0,09 0,04
Mediana
1,65 1,70 14.162 13.495 7.326 970 1,24 0,24
Máximo
25,40 26,70 27.230 17.030 18.935 2.540 4,16 0,74
*(A) Concentração de anticorpos IgG totais e anti-Hib em amostras de soros maternos. ** (B)
Concentração de anticorpos IgG totais e anti-Hib em amostras de soros de cordão umbilical.
+
(C)
Concentração de IgA total e anti-Hib no colostro.
++
(L) Concentração de IgA total e anti-Hib no leite.
Resumo
Tabela 3 – Níveis de anticorpos das subclasses IgG1 e IgG2 (g/ml) anti-Hib
detectados em 13 conjuntos de amostras (Mãe e RN) presentes em
parturientes imunizadas com vacina anti-Hib.
Amostras Mãe pré-vacinal Mãe pós-vacinal RN
IgG1 IgG2 IgG1 IgG2 IgG1 IgG2
1 2,33 0,76 42,88 22,13 41,38 6,5
2 0,13 0,08 7,84 6,7 7,68 1,12
3 0,1 0,035 1,5 0,175 0,20 0,1
4 0,11 0,068 3,4 0,15 3,50 0,14
5 0,001 0,066 0,53 2,105 0,49 1,172
6 0,012 0,22 10,48 0,48 1,88 0,2
7 0,06 0,035 4.3 4 2.1 1,8
8 0,01 0,06 13,8 0,04 1 0,02
9 0,01 0,01 0,55 6,4 0,50 0,8
10 0,1 0,025 1,26 0,3 0,80 0,1
11 0,03 0,06 60,78 0,39 115,00 0,19
12 1,52 0,001 26 4,6 25,20 1,36
13 0,24 0,5 4,15 0,16 5,76 0,137
Mínimo
0,001 0,001 0,53 0,04 0,2 0,02
Mediana
0,1 0,06 4,3 0,48 2,1 0,2
Máximo
2,33 0,76 60,78 22,13 115,0 6,5
Resumo
Tabela 4 – Níveis de anticorpos das subclasses IgG1 e 2 (g/ml) anti-Hib detectados
em 16 conjuntos de amostras (Mãe e RN) presentes em parturientes não
imunizadas com vacina anti-Hib.
Amostras Mães RNs
IgG1 IgG2 IgG1 IgG2
1
0,4 0,01 0,48 0,01
2
1,0 0,01 1,3 0,01
3
0,39 0,01 0,38 0,01
4
1,15 0,01 1,2 0,02
5
0,8 0,01 1,2 0,01
6
1,5 0,01 1,6 0,01
7
0,92 0,01 1,2 0,01
8
0,71 0,078 0,72 0,05
9
0,7 0,02 0,7 0,03
10
0,9 0,073 0,7 0,048
11
16,64 0,28 13,59 0,014
12
0,17 0,069 0,11 0,048
13
0,16 0,038 0,15 0,02
14
0,3 0,01 0,44 0,01
15
0,11 0,038 0,12 0,02
16
0,4 0,01 0,48 0,01
Mínimo
0,11 0,01 0,11 0,01
Mediana
0,700 0,010 0,700 0,012
Máximo
16,64 0,28 13,59 0,05
Resumo
Avaliação da avidez nos anticorpos anti-Hib
A avidez de anticorpos anti-Hib foi verificada nas amostras de mães vacinadas e
não vacinadas. Na população vacinada, a mediana dos valores de avidez foi mais
elevada na população vacinada (Tabelas 5 e 6 , Figuras 24,25 e 26).
Tabela 5 – Avaliação da avidez de anticorpos IgG (M) anti-Hib em soro materno e
soro de cordão da população vacinada
Grupo de mães vacinadas
Mãe RN Colostro leite
Amostra
IgG (pré) IgG (pós) IgG IgA IgA
1 0,30 2,00 2 2 2
2 0,30 2,00 1,77 2 2
3 0,38 2,50 2,5 2 1,88
4 0,03 0,40 0,46 0,63 0,6
5 0,27 0,50 0,2 1,7 N.C
6 1 1,10 0,9 1,0 1,5
7 0,60 0,80 0,5 1,7 *N.C
8 0,23 0,43 0,717 0,9 N.C
9 1,10 1,20 0,374 1,0 0,8
10 0,88 0,70 0,6 2,0 1,98
11 0,68 2,90 2,7 1,7 1,0
12 0,187 0,2 0,2 1,0 0 ,8
13 2.00 3,00 2,98 0,8 0,70
*NC - Não Coletada
Resumo
Tabela 6 – Avaliação da avidez de anticorpos IgG (M) anti-Hib em soro materno e soro
de cordão da população não vacinada
Grupo de mães não vacinadas
Mãe RN Colostro leite
Número
IgG IgG IgA IgA
1 0,392 0,28 0,628 0,419
2 0,4 0,241 1 0,93
3 1,4 1,173 2 2
4 0,108 0,093 1,032 0,915
5 0,491 0,336 0,81 0,085
6 0,222 0,222 1 0,918
7 0,321 0,2 1,7 1,3
8 0,321 0,2 1 0,918
9 0,585 0,33 1,8 2
10 0,222 0,222 0.685 0,628
11 0,574 0.787 0,202 0,291
12 0,246 0,256 0,145 0,1
13 0,5 0,44 0,8 0,8
14 0,458 0,392 0,189 0,173
15 0.124 0,104 0,8 0,8
16 1,0 1,0 0,694 0,577
Resumo
Figura 24. Avaliação da Avidez de anticorpos séricos IgG anti-Hib em amostras materna individuais
dos grupos de mães vacinadas e não vacinadas com a vacina anti-Hib: (A) Grupo
vacinado; (B) Grupo não vacinado.
Resumo
Figura 25. Avaliação da Avidez de anticorpos séricos IgG anti-Hib em conjuntos de amostras de mães
vacinadas (n=13) com a vacina anti-Hib vacinadas e não vacinadas (n=16): (A)
Comparação entre as amostras pré, pós-vacinal e grupo nãovacinado; (B) Relação entre
soro de cordões umbilicais de mães vacinadas e não vacinadas; (C)Grupos vacinados e
não vacinados
Resumo
Figura 26. Avaliação da Avidez de anticorpos secretores IgA anti-Hib em conjuntos de amostras de
mães vacinadas (n=13)e não vacinadas (n=16): (A) Relação entre amostras pré, pós
vacinais e grupo não vacinado; (B) Relação sangues de cordões umbilicais de mães
vacinadase não vacinadas; (C) Relação da avidez entre colostro e elite de ambos os
grupos
4.3 Determinação qualitativa de anticorpos anti-Hib
Os ensaios de Western blotting ou “Immunoblotting” foram realizados com o
objetivo de verificar a reatividade dos anticorpos séricos e secretores dirigidos aos
antígenos protéicos do Hib. Os resultados demonstraram que o padrão de
reconhecimento antigênico, das bandas protéicas entre mães vacinadas não
vacinadas e seus RNs, foi equivalente. Nestes testes qualitativos as amostras de
colostro (C) e leite (M) materno das mesmas mães também têm o mesmo padrão de
reconhecimento. Entretanto, quando comparamos os resultados apresentados pelas
amostras de soro com as amostras de colostro e leite, não verificamos equivalência
no padrão de reconhecimento antigênico pelos anticorpos séricos e secretores
(Figuras 27 e 28).
Figura 27. Avaliação da reação antigênica nas amostras de sangue materno (MS), sangue do cordão
umbilical (CS), colostro (C) e leite (M) de mães não imunizadas com a vacina anti-Hib.
Resumo
Figura 28. Avaliação da reação antigênica nas amostras de sangue materno pré-vacinal (NMS), pós-
vacinal (VMS), sangue do cordão umbilical (VCS), colostro (VC) e leite (VM) de mães
imunizadas com a vacina anti-Hib.
5. DISCUSSÃO
As doenças infecciosas do trato respiratório estão associadas à morbidade
e mortalidade, podendo acometer neonatos e lactentes. O Haemophilus influenzae
Resumo
tipo b (Hib) foi freqüentemente encontrado em cultura de esfregaços nasofaringeo de
crianças que apresentam otite média, meningite e outras doenças pertinentes à
infância. Com isso, são necessárias estratégias, que permitam maior proteção ao
neonato, no meio extra-uterino (Bouskela, 2000).
A transferência materno-infantil de anticorpos séricos e secretores
conferem proteção ao infante com relação às doenças causadas pelo Hib. Diante
disto, o presente trabalho propôs a vacinação de gestante para constituição de um
grupo de mães vacinadas, o qual foi comparado a um grupo de mães controle não
vacinado. O objetivo foi de compreender melhor a produção e a especificidade de
anticorpos anti-Hib, e sua transferência para a criança.
Para tanto, iniciamos o estudo vacinando as gestantes do Hospital
Universitário – HU e Amparo Maternal. As usuárias do pré-natal destas Instituições
que atendiam ao perfil proposto foram vacinadas com idades gestacionais
compreendidas entre 28 a 34 semanas, conforme a data da última menstruação
(DUM) e/ou ultra-sonografia (USG). Para a classificação da idade gestacional
foram associados à DUM e a USG, para minimizar os erros na determinação da
idade gestacional.
A DUM em alguns casos leva a erros, com relação à estimativa da idade
gestacional, porque ela pode ser reduzida quando ocorrem sangramentos, no início
da gestação, sendo confundido com período menstrual. Quando à concepção
acontece em fase folicular extensa, torna-se também difícil estipular o período da
última menstruação (Wilcox eSkjoerven, 1992), ou seja, acontecimentos fisiológicos
podem mascarar a idade gestacional.
A primeira USG para determinar a idade gestacional com segurança deve
ser feita entre 11 a 14 semanas (Wilcox eSkjoerven, 1992). As gestantes,
principalmente, do Amparo Maternal realizava após este período, tornando difícil
pressupor, com segurança, a idade gestacional pelo USG. Com isso, associamos os
dois métodos, junto instrumentos de análise clínica da gestante, como a observação
da altura uterina. Após avaliação da gestante e a sua vacinação, aguardou-se
entre 4 a 8 semanas o parto, para a realização da coleta de amostras.
Resumo
A resposta humoral necessita de quatro semanas para ser constituída. O
período entre 28 e 34 semanas foi escolhido com o objetivo de cobrir o período de
produção de anticorpos até a termo (38 semanas). Paralelamente, os anticorpos
maternos começam a ser transferidos para o feto, aproximadamente, na 20
o
semana
de gestação e aumenta progressivamente até o final (Saji et al.,1994). Logo, pode-se
beneficiar com a administração da vacina, a partir deste período, devido ao aumento
da passagem transplacentária de anticorpos que ocorre neste momento.
Após a coleta dos conjuntos das amostras, iniciamos a dosagem de
imunoglobulinas totais nas duas populações para observar o perfil humoral destes
conjuntos de amostras. Em ambos os grupos não foi observada diferenças
estatísticas significativas na concentração de IgG sérica e das suas subclasses (IgG1
e IgG2). As amostras pré e pós-vacinal de mães vacinadas e seus RNs
apresentaram valores de anticorpos similares aos das mães que não receberam a
vacina.
A concentração de anticorpos das mães vacinadas e não vacinadas foram
semelhantes. Ambos os grupos apresentaram colostros com os níveis de IgA
secretora elevados, quando comparados aos níveis destes anticorpos presentes no
leite (mães vacinadas: P<0.0001 e U=18; mães não vacinadas: P<0.0001 e U=0).
Striker e colaboradores (2004) explicam que a menor concentração de IgA
no leite em relação ao colostro, deve-se ao fato de que quanto mais precoce é
realizada a coleta do colostro, maior é a concentração de IgA. Os nossos resultados
também corroboram com Delneri e colaboradores (1996), que demonstraram uma
diminuição significativa na concentração de IgA total do colostro, especificamente,
após o período de 72 horas pós-parto, momento em que ocorre a apojadura e a
puérpera passa a secretar o leite.
Após traçarmos o perfil de produção de imunoglobulinas séricas e secretoras, nas
duas populações, passamos para a determinação de anticorpos específicos para o
Hib. Para tanto, foram dosados IgG anti-Hib nas amostras de soro materno e
cordão umbilical destes grupos de parturientes vacinadas e não vacinadas. As
amostras pré-vacinal de mães imunizadas e o grupo não vacinado mostraram
dosagem de IgG anti-Hib equivalentes (P=0,9475 e U= 102).
Resumo
Entretanto, os resultados dos soros pós-vacinal destas parturientes imunizadas,
quando comparados às amostras de mães que não receberam a vacina, revelaram
maior concentração destes anticorpos (P≤ 0,0001 e U=4). As amostras maternas
pós-vacinal apresentaram aumento de IgG anti-Hib com relação aos soros pré-
vacinal(P≤ 0,0001 e U=4). Os cordões umbilicais de parturientes vacinadas também
apresentaram níveis maiores de IgG anti-Hib quando comparados relação aos
cordões umbilicais de mães não vacinadas (P< 0,0001 e U=8,5).
Para delinearmos melhor a produção de anticorpos anti-Hib, por estes grupos
de mães, foram dosados as subclasses IgG1 e IgG2 anti-Hib. Os resultados
demonstraram que as amostras pós-vacinal de mães imunizadas apresentaram
valores de IgG1 e IgG2 mais elevados que as amostras de mães não imunizadas
(IgG1: P=0,0012 e U = 29,50 ; IgG2 : P< 0,0001 e U =7).
Os soros pós-vacinal também mostraram maior concentração das subclasses
IgG1 e IgG2 quando comparadas às amostras pré-vacinal destas parturientes
imunizadas (IgG1: P< 0,0001 e U=8; IgG2: P=0,0018 U=23,0). Os dados deste
trabalho corroboram com Adderson e colaboradores (1991), os quais afirmam que a
resposta humoral pós-vacinal para a vacina PRP-T constitui-se predominantemente
das subclasses IgG1 e IgG2.Os soros de cordões umbilicais também mostraram
maior concentração das subclasses IgG 1 e IgG2 anti-Hib comparados à população
não vacinada (IgG1: P=0,0149 e U = 48; IgG2: P< 0,0001 e U = 5,500).
A passagem placentária de IgG sérica e das suclasses IgG1 e IgG2 anti-Hib mostrou menor
taxa de transferência em mães vacinadas com a vacina anti-Hib que as mães não vacinadas.
Embora, estas parturientes tenham demonstrado menor transmissão de anticorpos para seus
RNs, nos dois grupos, ela ocorreu de forma efetiva, pois a concentração de anticorpos nas
mães e em seus respectivos RNs foi similar. Portanto, os infantes de mães vacinadas podem
estar mais protegidos, porque apresentam maior concentração de anticorpos anti-Hib.
As amostras maternas pós-vacinal e dos seus respectivos cordões umbilicais analisados
neste estudo demonstraram o aumento acentuado da subclasse IgG2 (P<0,0001;U=7,00) . A
Resumo
subclasse IgG2 é importante com relação à resposta humoral a antígenos polissacarídeos
(Fujimura, 1991). Conseqüentemente, a menor passagem transplacentária de IgG2 pode
estar relacionada à susceptibilidade dos lactentes a infecções por bactérias encapsuladas,
como o Hib (Fujimura, 1991). Portanto, a imunização das gestantes mostrou ser um ponto
de extrema relevância para diminuir a susceptibilidade de neonatos e lactentes a infecção
causada por Hib, mesmo que a passagem placentária de anticorpos IgG2 seja reduzida
quando comparada a de IgG1.
Durante anos, demonstrou-se paulatinamente que a transferência materno-infantil de
anticorpos proporciona proteção à criança nos seus primeiros meses de vida, períodos de
elevada susceptibilidade que ocorrem logo após o nascimento, conhecido como “Konrad
Lorenz”, no qual ocorre o imprinting comportamental da mãe no RN. Lemke e Lange
(1999) consideram que o imprinting imunológico ocorre antes do desenvolvimento
ontogênico do sistema imune do neonato.
Por conseguinte, estas observações fornecem a base para vacinação materna
que é praticada extensamente na medicina veterinária (Unkless et al., 1995 e Hundt
et al., 1992). Em humanos, vários trabalhos demonstram a importância da vacinação
das mães com o objetivo de proteger seus bebês com relação a algumas doenças.
Cavalcante (2004) propôs a vacinação de gestantes nutridas e desnutridas com Hib
e observou nas duas populações resposta pós-vacinal para o Haemophilus
influenzae tipo b.
No estudo multicêntrico realizado em 4 países em desenvolvimento
(Etiópia, Gâmbia, Papua Nova Guiné e Filipinas) foram realizados a imunização de
mães com a vacina pneumocócica 23-valente, e verificaram o aumento de anticorpos
IgG anti-pneumocócica nos cordões umbilicais quando comparados aos de mães
não vacinadas (Quiambao et al., 2003). Apesar da realização deste estudo que
comprova a importância da imunização com vacina pneumocócica 23-valente na
Resumo
gestante, até o momento, o calendário de vacinação da gestante ainda se restringe à
imunização apenas contra o tétano (Selvaraj et. al., 1988; Simister e Rees, 1985).
A transferência materno-fetal de anticorpos pós-vacinal específicos para o
Hib pode influenciar imprinting comportamental, repercutindo no processo de
maturação e modulação do sistema imune na criança. Os anticorpos maternos
conferem não somente proteção passiva, mas podem influenciar o sistema imune do
RN, pois eles têm funções imuno-moduladora e imuno-estimuladora, as quais
repercutiriam nas respostas imunes “antígeno-induzidas” que poderiam ser
suprimidas ou intensificadas (Lemke e Lange, 1999)
A literatura mostra que as imunoglobulinas pós-vacinal possuem
características específicas. A porção variável da cadeia pesada é codificada por
pelos menos dois genes presentes no locus V
H
III, os quais são expressos com
considerável heterogenecidade (Adderson et al., 1991). Quanto à região variável da
cadeia leve, o repertório de anticorpos pré e pós vacinais podem ser divididos em:
anticorpos A2 e não-A2 (Adderson et al., 1991).
O primeiro grupo contém anticorpos expressos por um único gene A2
presente no locus V
K
II. Este gene é responsável pela produção de anticorpos A2, os
quais estão relacionados à resposta humoral induzida pela vacinação (Scott et al.,
1989). Portanto, estão presentes em amostras pós-vacinal de puérperas imunizadas
com a vacina actHib que compões este trabalho. Em contra partida, amostras de
mães não vacinadas, nas quais os anticorpos foram produzidos naturalmente, ou
seja, por contato com o patógeno, outro repertório de resposta humoral foi
constituído a partir da expressão de genes não A2 (Adderson et al., 1991).
Os anticorpos não A2 também podem estar presentes nas amostras de mães
não vacinadas que constituem o grupo controle deste estudo. Estas anticorpos
apresentam a região V
L
expressa por dois genes no locus V
K
I, e um gene no loci
V
K
II, V
K
III, V
K
IV e V
λ
, os quais parecem conter mutações somáticas.
Interessantemente, anticorpos produzidos por genes não A2 têm reação cruzada
com outros carboidratos, enquanto anticorpos produzidos por genes A2 não têm
reação cruzada com carboidrato (Scott et. al, 1992), protegendo de forma efetiva o
RN.
Resumo
Os infantes de puérperas vacinadas com actHib devem estar mais protegidos
contra doenças infecciosas do trato respiratório causadas por Hib. Após o parto
dentre as imunoglobulinas transferidas vias placenta e amamentação, encontram-
se os anticorpos idiotipos que têm seus sítios de ligação ao antígeno reconhecido
por imunoglobulinas, os anticorpos anti-idiotipos.
Hanson e colaboradores (1999) observaram que anticorpos anti-idiotipos,
devido à sua capacidade de competir com antígeno no sitio de ligação do anticorpo
idiotipo, pode funcionar como a imagem do antígeno. Com isso, o anticorpo anti-
idiotipo pode aumentar a produção do idiotipo, da mesma maneira que o antígeno
(Hanson et al, 1999).
Conseqüentemente, os anticorpos maternos anti-idiotipo estimulam
ativamente o sistema imune do neonato, influenciando a regulação da expressão de
isótipos e alterações idiotípicas ao longo do tempo. Estes anticorpos oferecidos pela
mãe aumentam, de forma precoce, as afinidades das imunoglobulinas produzidas na
resposta primária e promovem proteção antimicrobiana por meio de anticorpos não-
reativos ao antígeno. Eles também, em condições patológicas, participam na
supressão alérgeno-específica da responsividade de IgE e na transferência de
doenças auto-imunes (Lemke et al., 2004).
A especificidade e afinidade de anticorpos são determinadas pelas estruturas
moleculares das regiões variáveis da cadeia pesada e leve (Scott e Nahm, 1992).
Os anticorpos idiotipos 1 e 2 anti-Hib (Id–1 e Id–2) são imunoglobulinas expressas,
respectivamente por genes A2 e não A2. Os Id–1 são anticorpos presentes no soro
de indivíduos vacinados, eles apresentam elevada avidez quando comparados as
imunoglobulinas Id–2 anti-hib (Lucas e Granoff, 1995).
Neste trabalho, a avidez de anticorpos anti-Hib foi verificada nas amostras de
mães vacinadas e não vacinadas, o índice de avidez foi mais alto nas amostras pós-
vacinal do grupo imunizado com a vacina anti-Hib, quando comparado com os soros
pré-vacinal (P=0,025 e U=39) de mães não vacinadas (P=0,0102 e U=45). Tais
resultados podem inferir na presença de anticorpos Id-1, uma vez que estes idiotipos
apresentam elevados índices de avidez.
Resumo
Para tanto, os anticorpos maternos anti-idiotipos, possivelmente, presentes
na população vacinada, quando em contato com sistema imune do RN podem
funcionar como um primeiro contato com o antígeno. Logo, neonatos ao receberem
a primeira dose da vacina anti-Hib podem vir a produzir imunoglobulinas com mais
avidez e especificidade. Estas propriedades proporcionam controle eficaz e efetivo
de infecções causadas por Hib e protegem melhor o neonato destas bactérias
(Silfverdal et al., 2006).
As doenças infecciosas causadas por Hib também são controladas pelo
colostro e leite materno, os quais podem apresentar anticorpos anti-idiotipos. Para
tanto, foram dosadas a concentração e a avidez dos anticorpos IgA anti-Hib, nas
duas populações. Os níveis de anticorpos IgA anti-Hib no colostro e leite de mães
vacinadas foram mais elevados quando comparados aos das mães não vacinadas
(colostro: P= 0,0002 U=18; leite: P=0,0048 e U=26). Nestes dois grupos, observou-se
que a concentração de imunoglobulinas anti-Hib no colostro foi mais elevada que no
leite. Entretanto, a concentração de anticorpos do colostro e leite do grupo de mães
vacinadas não mostraram diferença significativas ( P=0,1366 e U=40,50).
Neste estudo a concentração e avidez de anticorpos presentes nas amostras
maternas pós-vacinal do colostro e leite foi mais elevado quando comparados aos
das mães não vacinadas (colostro – P=0,0168 U=49,50 e leite – P=0,0063 U=28).
Os anticorpos encontrados no colostro e leite representam um repertório variável
resultante de complexas interações entre mãe e meio ambiente (Hanson et al.,
1961). A elevada concentração e da avidez de anticorpos IgA anti-Hib-PS presentes
nas secreções oriundas de mães vacinadas proporciona ao neonato proteção da
mucosa nasofaríngea, impedindo a colonização por Hib.
Hahn-Zoric et al. (1990) observaram que crianças alimentadas com leite
materno tem uma melhor resposta imunológica de anticorpos séricos e secretores,
às vacinas para poliovírus, toxóide diftérico e toxóide tetânico em relação às crianças
alimentadas com fórmulas comerciais.
Silfverdal e colaboradores (2006) mostraram que o colostro e leite maternos
podem influenciar na produção de IgG2, pois observaram que a duração da
amamentação esta relacionada com o aumento desta imunoglobulina em crianças
Resumo
saudáveis acima de 18 meses. Este estudo também mostrou que a expressão de
anticorpos idiotipos-1 e 2 foram associados com maiores concentrações de IgG2 e
que a amamentação também contribuiria para este aumento.
Portanto, os anticorpos idiotipos e anti-idiotipos presentes no colostro e leite
materno não protegem apenas de forma passiva. Mas, influenciam a resposta
humoral em lactentes saudáveis, desempenhando funções imuno-reguladoras e
imuno-estimuladoras. Com isto, a dosagem da concentração e avidez de IgA
secretora, no colostro e leite de mães vacinadas e não vacinadas, neste trabalho,
buscou uma melhor compreensão do processo de imunização materno-infantil na
tentativa de compreender o diálogo entre o perfil humoral sistêmico e de mucosas,
abordando anticorpos idiotipos e anti-idiotipos.
Deve-se considerar também, que os estudos laboratoriais relacionados à
proteção humoral pós-vacinal abordando a rede anti-idiotípica são recentes.
Informações sobre a imunização de gestantes e transferência materno-infantil de
anticorpos séricos e secretores com enfoque direcionado para rede anti-idiotípica
são assuntos interessantes, pois paulatinamente estudos moleculares estão sendo
acrescentados para que se possam compreender melhor estes fenômenos.
O equilíbrio entre anticorpos idiotipos e anti-idiotipos tem grande importância
na regulação da resposta imune neonatal. As imunoglobulinas maternas,
conseqüentes da experiência imunológica da mãe, são de extrema importância para
o desenvolvimento ontogênico do sistema imune do neonato (Lemke e Lange,
1999). Para tanto, realizamos também os testes de Western Blotting na população
vacinada e não vacinada com intuito de delinearmos melhor, de forma qualitativa,
estes anticorpos produzidos pelas mães contra o Hib.
Os grupos revelaram o mesmo reconhecimento protéico antigênico entre
mães e RN(s). Nestes testes qualitativos as amostras de colostro e leite materno
das mesmas mães têm o mesmo padrão de reconhecimento do antígeno.
Entretanto, observou-se que nestas secreções o perfil de reconhecimento é
diferente quando comparado com as amostras de soro destas mesmas puerperas.
Sabe-se que a resposta humoral específica em mães vacinadas e a sua
conseqüente transferência materno-infantil contribui para o desenvolvimento do
Resumo
sistema imune do neonato, não só de maneira passiva, mas também ativa. Diante
disso, nossa proposta de estudo foi avaliar o perfil de resposta humoral
específica em mães vacinadas e sua conseqüente transferência materno-infantil de
anticorpos anti-Hib.
Logo, os resultados obtidos no grupo imunizado sugerem fortemente que RNs
de mães vacinadas podem estar protegidos de doenças infantis causadas por Hib,
nos dois primeiros meses de vida. Considerando que estes anticorpos estão em
maior concentração e avidez, nesta população.
6
CONCLUSÃO
A transferência materno-infantil de anticorpos séricos e secretores
conferem proteção ao infante em relação às doenças causadas pelo Hib. Para tanto,
Resumo
foi proposto à vacinação de gestantes para constituição de um grupo de mães
vacinadas com objetivo de compreender melhor a produção e a especificidade de
anticorpos anti-Hib, e sua transferência para a criança. Os resultados
demonstraram que os neonatos de mães imunizadas com Hib apresentaram maiores
concentrações de anticorpos anti-Hib no soro, os quais mostraram elevado índice de
avidez. Conclui-se que a imunização da gestante pode ser uma estratégia eficaz
para reduzir a morbidade e a mortalidade causada pelo Hib, nos dois primeiros
meses de vida, antes da administração da vacina ao próprio lactente.
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