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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BÁSICAS DA SAÚDE
DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FISIOLOGIA
AVALIAÇÃO DA INFLUÊNCIA DO CICLO ESTRAL E DA HIPERPLASIA
ENDOMETRIAL CÍSTICA – PIOMETRA SOBRE A SENSIBILIDADE À INSULINA E
CARACTERISTICAS DA LIGAÇÃO HORMÔNIO-RECEPTOR EM MÚSCULO DE
FÊMEAS CANINAS
ÁLAN GOMES PÖPPL
PORTO ALEGRE
2008
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Livros Grátis
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Milhares de livros grátis para download.
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BÁSICAS DA SAÚDE
DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FISIOLOGIA
LABORATÓRIO DE METABOLISMO E ENDOCRINOLOGIA COMPARADA
AVALIAÇÃO DA INFLUÊNCIA DO CICLO ESTRAL E DA HIPERPLASIA
ENDOMETRIAL CÍSTICA – PIOMETRA SOBRE A SENSIBILIDADE À INSULINA E
CARACTERISTICAS DA LIGAÇÃO HORMÔNIO-RECEPTOR EM MÚSCULO DE
FÊMEAS CANINAS
Autor: M.V. Álan Gomes Pöppl
Projeto de Mestrado apresentado ao Curso de
Pós-graduação em Ciências Biológicas:
Fisiologia como requisito parcial para obtenção
do grau de Mestre em Fisiologia.
Orientador: Profa. Dra. Roselis Silveira Martins
da Silva
Co-orientador: Prof. Dr. Luis Carlos Kucharski
PORTO ALEGRE
2008
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3
Este trabalho é dedicado a todos os cães que,
com a usual alegria e permissividade característica da
espécie, participaram deste estudo.
Dedico este trabalho especialmente à memória
de meu querido avô, Dr. Breno Martins Futuro, que
infelizmente faleceu nas fases finais de correção deste
trabalho não podendo prestigiar em vida a concretização
deste sonho.
4
AGRADECIMENTOS
Inicialmente gostaria de agradecer aos meus orientadores, Profa. Dra. Roselis Silveira
Matins da Silva e Prof. Dr. Luis Carlos Kucharski pela possibilidade de realização deste
trabalho. Desde minha entrada no laboratório, iniciação científica e posteriormente durante
minha residência, quando estive afastado do laboratório, nossas conversas sobre fisiologia e
possibilidades de pesquisas sempre me incentivaram a seguir este caminho, e hoje com imensa
gratidão agradeço a ambos por tudo que me proporcionaram.
A querida Profa. Dra. Ilma Simone Brum, minha “madrinha” no departamento de
fisiologia, primeira professora de fisiologia e de quem posteriormente fui monitor, pelas
oportunidades que me ofereceu e pelo grande incentivo para que eu me dedicasse à clínica e a
pesquisa; além claro do laboratório, nitrogênio e freezer sempre a disposição; o meu muito
obrigado.
Aos grandes amigos que fiz ao longo destes anos de LaMEC, pelos inúmeros
momentos de descontração em meio ao trabalho, não só pelas risadas que demos juntos, e não
foram poucas, mas por fazerem do nosso local de trabalho uma segunda casa, que muitas vezes
serviram como motivação para vir para o laboratório nas manhãs frias de inverno, ou no
trabalho até tarde nas noites de verão. Os momentos de discussão profunda sobre as técnicas,
resultados e interpretação, sempre regadas a muito café, ajudaram muito a nortear os rumos
deste trabalho. A todos o meu agradecimento por todos estes momentos. Ao grande amigo
Ubirajara de Oliveira, sempre disposto a ajudar independente de quão atarefado estivesse e a
querida colega Sandra Valle, parceira de todos os momentos durante a realização desta
dissertação, desde o ínicio até o final; os meus singelos agradecimentos por toda ajuda que me
ofereceram.
Aos alunos de iniciação científica que participaram deste estudo e doaram-se em
intermináveis curvas glicemicas e cirurgias, em finais de semana, feriados ou no frio das 7 da
manhã dos dias de inverno, serei eternamente grato. Sem o apoio de vocês a realização deste
5
trabalho não teria sido possível. Fernando, Karine, Juliana, Tatiane, Daniele, Vivian, Fabíola,
Cinthia, muitos dos quais já veterinários formados, espero que tenham aprendido e aproveitado
cada momento em que juntos construímos este trabalho. Aline, Gabriel, Luana, Karla, Camilas e
Gabrielas que como bolsistas ou voluntárias no laboratório sempre dispostas a atender aos
pedidos de ajuda, espero que nosso contato durante a realização deste trabalho tenha sido tão
proveitosa à formação de vocês, como foi para mim. A todos o meu muito obrigado.
A todos funcionários, técnicos e residentes do Hospital de Clínicas Veterinárias (HCV)
da UFRGS pela ajuda e paciência que foram fundamentais nas etapas inicias deste trabalho. A
Médica Veterinária Irene Breitsameter, obrigado pela oportunidade de atuar no saudoso projeto
castração, sem sua ajuda e compreensão não teria sido viável a realização deste mestrado em
tempo hábil. Ao grande amigo e profissional Prof. Dr. Carlos Afonso de Castro Back, pelo
apoio incondicional a realização deste trabalho. Muito obrigado não só pela autorização da
realização deste trabalho na instituição sobre sua responsabilidade, mas um obrigado especial
pela confiança e incentivo. A Profa. Rose, obrigado por ter me ensinado a ler lâminas de
citologia vaginal e pela colaboração ocasional lá no Pathos centrifugando alguma amostra para
mim em finais de semana. A vocês todos não tenho palavras para expressar meus
agradecimentos. Gisele e Michele, funcionárias do HCV, que sempre que eu precisava davam
um jeito de arrumar uma sala cirúrgica ou material para as cirurgias do projeto, mesmo quando
a autoclave estragava e a coisa mais valiosa do mundo era um avental cirúrgico esterilizado.
Lucas, valeu pelas inúmeras pacientes com piometra que não raramente te pedia ajuda para
preparar no pré-operatório.
Ao grande companheiro de longa data e parceiro na realização deste trabalho Prof. Dr.
Félix Hilário Díaz González e toda sua equipe do LACVet pela contribuição na execução deste
trabalho e viabilização de muitos aspectos deste, muito obrigado por ter aberto e ainda manter
assim, as portas do laboratório! As Médicas Veterinárias Camila Serina Lasta e Vanessa Esteves
muito obrigado por toda ajuda e compreensão, ainda mais quando eu aparecia com “trocentas”
amostras para dosar algum metabólito, sem vocês este trabalho também não teria sido possível.
Chico, valeu o dia em que salvou a realização do radioimunoensaio, pois o mestrando aqui
6
montou todo ensaio e esqueceu que as amostras estavam a uns 12 kilometros do ensaio, dentro
do frezer do LACVet.
Ao colega e amigo Juliano de Souza Leal, e seu orientador; o grande Prof. Dr. David
Driemeier, por prontamente mostrarem-se dispostos a me auxiliar nas etapas de análise
histopatológica das amostras das pacientes deste estudo, e pelos históricos churrascos para
definir as metas de leitura das lâminas. Obrigado pela amizade e ajuda nesta etapa. Ao amigo
Prof. Dr. João Batista pela confiança e ajuda ao me ceder seu laboratório para estoque de
nitrogênio e por abrir as portas do mundo do nitrogênio líquido para mim. Sem esta singular
colaboração talvez alguns pontos deste trabalho não teriam sido tão bem realizados.
A minha querida e amada Joaninha, não só pela ajuda nesta fase final de redação, mas
principalmente pela compreensão nos momentos difíceis onde tudo parece perdido, pela
compreensão dos momentos de ausência e por me fazer companhia, mesmo que eu estivesse
envolvido até os cabelos com a redação deste trabalho. Obrigado por todos os momentos ótimos
que passamos juntos e que me renovavam e enchiam de energia para perseverar e seguir adiante.
À minha família, que já acostumou-se acredito com minha ausência, mal humor e
chatice quando estou em fases críticas, como por exemplo agora durante a redação desta
dissertação. Obrigado por compreenderem que sento por último à mesa e saio correndo logo
após comer, e que não participo mais dos eventos em família, ou mesmo não procuro meus
parentes queridos mais próximos por estar envolvido com este prazeroso e árduo trabalho de
mestrado. Obrigado por tudo mesmo. Mãe, obrigado por toda ajuda e incentivo, desde lá na
primeira série até hoje em dia, quantas vezes me salvou me ditando por telefone qual era a
concentração da insulina que tinha calculado no caderno, ou salvou o mundo ao buscar amostras
para mim quando eu estava impossibilitado. Sem palavras para agradecer a vocês todos. Vô,
sabes o quão importante foi para mim chegar até onde cheguei e ainda almejar mais, obrigado
por toda ajuda intelectual, financeira e carinhosa a sua maneira!
7
Aos meus grandes amigos, sempre mais do que dispostos a me tirar a concentração e
me levar para uma boa roda de chimarrão ou de butiquim para uma boa cerveja gelada,
independente de eu estar dizendo que estava com a corda no pescoço para terminar algo.
Sempre foram um grande incentivo para terminar o que estava trabalhando para poder curtir a
amizade, companhia e dar risadas com vocês, que sigamos assim sempre.
8
“Os pacientes nunca param de produzir água, e
o fluxo é incessante como a abertura de
aquedutos.”
“Não se consegue impedi-los de beber água ou
urinar.”
“O diabetes é uma doença terrível, não muito
freqüente entre os homens, sendo um
detrimento da carne e dos membros para dentro
da urina”
Areteu de Cappadocia, Grécia século II
9
RESUMO
O diabetes mellitus canino (DMC) é uma afecção freqüente em cães, apresentando
diversos fatores etiológicos envolvidos, como raça, predisposição genética, alimentação
desquilibrada, obesidade ou presença de antagonismos hormonais; como é o caso do diestro
(fase luteal do ciclo reprodutivo). O DMC é mais freqüente em fêmeas, e cerca de 70% das
fêmeas que desenvolvem diabetes encontram-se na fase do diestro. Muitos autores consideram o
DMC, com início no diestro, análoga ao diabetes mellitus gestacional humano. Durante a fase
do diestro, a progesterona induz não só resistência à insulina, mas também acarreta uma série de
alterações no endométrio. Uma maior sensibilidade uterina à progesterona pode acarretar a
ocorrência de hiperplasia endometrial cística (HEC) e piometra, condição séptica / inflamatória
limitante à vida se não tratada. A ocorrência de qualquer anormalidade inflamatória, infecciosa,
hormonal ou neoplásica apresenta um importante potencial de estimular resistência à insulina. O
objetivo deste trabalho foi avaliar a sensibilidade à insulina durante as diferentes fases do ciclo
estral e na presença da condição patológica hiperplasia endometrial cística. Ao todo 44
pacientes foram avaliadas neste estudo, sendo dividas nos grupos anestro (n = 11), estro (n = 7),
diestro (n = 14), HEC (n = 5) e piometra (n = 8). Todas as pacientes passaram por avaliação
física e exames laboratoriais de saúde geral. As pacientes que se enquadraram nos critérios de
inclusão foram encaminhadas para realização de IVGTT (teste de tolerância à glicose intra-
venosa) após jejum de 8 a 12 horas (MATTHEEUWS et al., 1987), após o qual foi realizada a
cirurgia de castração das pacientes, de forma eletiva das pacientes na diferentes fases do ciclo
estral ou como parte do tratamento nas pacientes com HEC ou piometra. Durante o
procedimento operatório foram colhidas amostras de músculo para estudos de ligação hormônio
receptor conforme Kucharski et al., (1997) e estudos de fosforilação conforme Kucharski et al.,
(1999). Para análise dos resultados o trabalho foi dividido em dois capítulos: o primeiro sobre o
impacto do ciclo estral sobre a sensibilidade à insulina; e o segundo sobre o impacto do
complexo HEC-piometra sobre a sensibilidade à insulina. A análise dos resultados mostra que a
ocorrência do estro e do diestro afeta a sensibilidade tecidual à insulina reduzindo a afinidade da
ligação insulina-receptor nos sítios de alta afinidade e também leva a menor capacidade de
fosforilação basal dos resíduos de tirosina. Contudo, a maior capacidade de ligação destes sítios
10
tende a contrabalançar a menor sensibilidade tecidual a insulina não sendo possível observar
estado de intolerância à glicose nestas pacientes. Entretanto, nas pacientes com HEC-piometra
uma intensa resistência à insulina e intolerância à glicose pode ser observada, especialmente, em
decorrência de uma severa redução na afinidade da ligação hormônio-receptor nos sítios de alta
afinidade não acompanhada por um aumento na capacidade de ligação. A fosforilação dos
resíduos de tirosina nas pacientes com piometra não difere da menor fosforilação basal
observada nas pacientes em diestro. Na literatura consultada não foram encontrados estudos de
alterações nos receptores de insulina ou nos eventos pós-receptor na etiopatogênia do DMC.
Desta forma foi demonstrado pela primeira vez, alterações importantes na sensibilidade tecidual
à insulina durante as fases do estro e diestro, bem como na presença de HEC-piometra, as quais
podem causar uma maior predisposição à ocorrência do DMC; especialmente se as pacientes
estiverem expostas a outros fatores de risco já descritos para ocorrência de diabetes.
11
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Sinalização e transdução do sinal da insulina. O receptor de insulina após ativado
sofre uma autofosforilação, catalizando a fosforilação de diversas proteínas celulares. Estas vias
funcionam de forma cordenada na regulação do tráfego das vesículas, síntese de proteínas,
ativação e inibição enzimática e expressão gênica, que resultam na regulação do metabolismo da
glicose, lipídios e proteínas (SALTIEL & KAHN, 2001)............................................................26
Figura 2 - Regulação do metabolismo pela insulina, o mais potente hormônio anabólico
conhecido. A insulina promove a síntese de carboidratos, lipídios e proteínas, inibindo sua
degradação e liberação no sangue através do estimulo a captação de glicose, aminoácidos e
ácidos graxos para dentro da célula (SALTIEL; KAHN, 2001)...................................................30
Figura 3 – Efeitos da insulina no hepatócito. A insulina estimula a expressão de genes que
codificam enzimas glicolíticas e da síntese de ácidos graxos, enquanto inibe as enzimas
envolvidas na gliconeogênese. Estes efeitos são mediados por diversos fatores de transcrição
como SREBP-1, HNF-4, Fox e PGC-1. Além disto o hormônio também regula a atividade de
algumas enzimas como a glicogênio sintase e citrato liase através da alteração no estado de
fosforilação (SALTIEL; KAHN, 2001).......................................................................................30
Figura 4 – Inter-relações entre a sinalização do GH, IGF-1 e insulina (DOMINICI et al,
2005)..............................................................................................................................................45
Figura 5. Divisão dos grupos de estudo......................................................................................68
Figura 6. Valores médios de leucócitos totais observados na população estudada. Não foram
detectadas diferenças significativas pela análise variância de uma via (p > 0,05).......................90
Figura 7. Valores de fibrinogênio plasmático em cadelas em diferentes fases do ciclo estral.
Não foi detectada diferença significativa na análise variância de uma via (p > 0,05).................91
Figura 8. Concentração (média ± desvio padrão da média) de fructosamina sérica nos diferentes
grupos experimentais. Não foram detectadas diferenças significativas entre os grupos estudados
(p > 0,05).....................................................................................................................................92
Figura 9. Concentração (média ± desvio padrão da média) de glicose no plasma de cadelas dos
grupos anestro, estro e diestro ao longo do IVGTT. n = 7 - 14 animais......................................93
Figura 10. Concentração (média ± desvio padrão da média) de insulina plasmática nos grupos
anestro, estro e diestro ao longo do IVGTT. n = 3 - 7 animais....................................................94
Figura 11 a. Medianas, intervalos interquartis e percentis 10 e 90% do aumento no índice
HOMA B em relação ao basal (grupo anestro = 1). Não foram observadas diferenças
significativas pelo teste de Kruscall-Wallis (p = 0,530) n = 3 - 7 animais. Figura 11 b.
12
Medianas, intervalos interquartis e percentis 10 e 90% do índice HOMA R. Não foi detectada
diferença significativa na análise variância de uma via (p = 0,511). n = 3 - 7 animais...............94
Figura 12. Relação (média ± desvio padrão da média) ∆Ins/∆Gli aos 5 minutos de IVGTT. Não
foram observadas diferenças significativas pela ANOVA de uma via (p = 0,224). n = 3 – 7
animais..........................................................................................................................................95
Figura 13. Medianas, amplitude interquartil e percentis 10 e 90% do glicogênio muscular das
pacientes nos referidos grupos. Não foi observada diferença significativa pela ANOVA de uma
via (p = 0,290)..............................................................................................................................96
Figura 14 - Inibição competitiva da ligação de
125
I-insulina em membranas de músculo
esquelético, pelo aumento da concentração de insulina humana não marcada. Cada ponto
representa a média de duas preparações de membrana em duplicata.........................................100
Figura 15 a,b,c - Curvas de Scatchard em preparações de membrana de tecido muscular
esquelético de fêmeas caninas em diferentes fases do ciclo estral. Cada ponto representa a média
de duas preparações de membrana em duplicata. Curvas representativas dos grupos anestro (a),
estro (b) e diestro (c)...................................................................................................................100
Figura 16. Valores médios e desvio padrão da méida dos valores de fosforilação do substrato
sintético Poly (Glu, Tyr 4:1) em presença de albumina em preparações de membrana de tecido
muscular esquelético de pacientes em anestro, estro ou em diestro. * representa diferença
significativa (p < 0,05) em comparação a fosforilação basal do grupo anestro.........................102
Figura 17. Medianas, intervalos interquartis e percentis 10 e 90% dos valores de leucócitos
totais observados nos diferentes grupos. * representa diferença significativa através da análise
variância de uma via, seguido do teste de Tukey (p = 0,004). n = 5 – 14..................................123
Figura 18. Valores (média ± desvio padrão da média) de fructosamina no plasma dos grupos
diestro, HEC e piometra. * representa diferença significativa (p < 0,01) entre os grupos diestro e
piometra. ANOVA de uma via seguida de teste de Tukey. n = 5 – 14......................................125
Figura 19. Valores (média ± desvio padrão da média) de fibrinogênio plasmático dos grupos
diestro, HEC e piometra. n = 5 – 14...........................................................................................126
Figura 20. Valores médios de glicemia nos grupos diestro, HEC e piometra ao longo do
IVGTT.
#
representa diferença significativa (p < 0,05) entre HEC e piometra. * representa
diferença significativa entre HEC e piometra com relação ao grupo diestro (análise de variância
para medidas repetidas com comparação de contrastes)............................................................128
Figura 21. Valores médios de insulinemia obtidos nos grupos diestro e piometra ao longo do
IVGTT. * representa diferença significativa (p < 0,05) entre o grupo piometra e o grupo diestro
(análise de variância para medidas repetidas com comparação de contrastes)..........................128
*
13
Figura 22a. Medianas, amplitude interquartil e percentis 10 e 90% do aumento no índice
HOMA B em relação ao basal (grupo anestro = 1) dos grupos diestro e piometra. * representa
diferença significativa (p < 0,05) pelo teste de Mann-Whitney. Figura 22b. Medianas,
amplitude interquartil e percentis 10 e 90% do índice HOMA R dos grupos diestro e piometra. *
representa diferença significativa (p < 0,05) pelo teste t de Student..........................................129
Figura 23. Medianas, amplitude interquartil e percentis 10 e 90% do ∆Ins/∆Gli aos 5 minutos
de IVGTT dos grupos diestro e piometra. * representa diferença significativa (p < 0,05) pelo
teste t de Student.........................................................................................................................130
Figura 24. Medianas, amplitude interquartil e percentis 10 e 90% do glicogênio muscular das
pacientes nos grupos diestro, HEC e piometra. Não foi observada diferença significativa pela
ANOVA de uma via (p = 0,465). n = 4 a 12 animais por grupo................................................135
Figura 25 - Inibição competitiva da ligação de
125
I-insulina em membranas de músculo
esquelético, pelo aumento da concentração de insulina humana não marcada. Cada ponto
representa a média de duas preparações de membrana em duplicata.........................................137
Figura 26 a,b - Curvas de Scatchard em preparações de membrana de tecido muscular
esquelético de fêmeas caninas durante o diestro e em fêmeas com piometra. Cada ponto
representa a média de duas preparações de membrana em duplicata. Curvas representativas dos
grupos diestro (a) e piometra (b)................................................................................................138
Figura 27. Médias e desvio padrão dos valores de fosforilação do substrato sintético Poly (Glu,
Tyr 4:1) em preparações de membrana de tecido muscular esquelético de pacientes em diestro
ou com piometra. n = 6 animais por grupo.................................................................................139
14
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Média, desvio padrão da média e intervalo de idade, peso e escore corporal de cadelas
nas diferentes fases do ciclo estral................................................................................................89
Tabela 2. Média, desvio padrão e intervalo dos parâmetros hematológicos (eritrócitos,
hematócrito e hemogoblina) das pacientes avaliadas dentro do grande grupo ciclo estral..........89
Tabela 3. Média, desvio padrão da média e intervalo dos parâmetros de lipemia avaliados
(triglicerídeos e colesterol séricos) em cadelas em diferentes fases do ciclo estral. Não foram
observadas diferenças significativas (p > 0,05) pela analise de variância de uma via.................91
Tabela 4. Médias, desvio padrão e intervalo do índice insulinogênico e da relação
insulina/glicose corrigida..............................................................................................................96
Tabela 5. Razão de prevalância e intervalo de confiança 95% para alteração nos índices
∆Ins/∆Gli aos 5 minutos de IVGTT, índice insulinogênico e relação insulina/glicose corrigida.
......................................................................................................................................................97
Tabela 6. Valores de Kd (constante de dissociação) dos sítios de ligação à insulina de alta (Kd
1) e de baixa (Kd 2) afinidade e a capacidade de ligação máxima destes sítios (Bmax 1 e Bmax
2) em músculo de cadelas em diferentes fases do ciclo estral....................................................101
Tabela 7. Média, desvio padrão e intervalo de idade, peso e escore corporal das pacientes
avaliadas dentro do grande grupo hiperplasia endometrial cística - piometra...........................122
Tabela 8. Média, desvio padrão e intervalo dos parâmetros hematológicos (eritrócitos,
hematócrito e hemogoblina) das pacientes avaliadas dentro do grande grupo hiperplasia
endometrial cística - piometra....................................................................................................123
Tabela 9. Valores (média ± desvio padrão da média e intervalo) de triglicerídeos e de colesterol
séricos das pacientes em diestro (controles), com HEC e com piometra. Não foi observada
diferença significativa (p > 0,05) na analise de variância de uma via........................................124
Tabela 10. Médias, desvio padrão e intervalo do índice insulinogênico e da relação
insulina/glicose corrigida............................................................................................................131
Tabela 11. Resultados de r², r de Pearson e valores de p das variáveis de sensibilidade à insulina
correlacionadas aos fatores de confusão leucograma, idade e peso...........................................133
Tabela 12. Razão de chances (odds ratio) e intervalos de confiança de resultados alterados nos
testes de sensibilidade à insulina realizados...............................................................................134
15
Tabela 13. Média e desvio padrão dos valores de Kd (constante de dissociação) dos sítios de
ligação da insulina de alta (Kd 1) e de baixa (Kd 2) afinidade e a capacidade de ligação máxima
destes sítios (Bmax 1 e Bmax 2) nas pacientes em diestro ou com piometra............................138
16
LISTA DE ABREVIATURAS, SÍMBOLOS E UNIDADES
% por cento
±
mais ou menos
≥
maior ou igual
γ
32
P
isótopo 32 fósforo
μCi
microcurrie
μg
micrograma
(H) concentração hormônio
(HR) concentração complexo hormônio-receptor
μL
microlitro
μM
micromolar
μmol
micromol
(R) concentração receptor
μU
microunidades
< menor
> maior
∆Gli delta glicose
∆Ins delta insulina
125
I isótopo 125 iodo
A.C. antes de cristo
Ach acetilcolina
ADP adenosica di-fosfato
AG ácido graxo
AGL ácido graxo livre
Akt quinase serina / treonina
ANOVA análise de variância
APS proteína adaptadora com domínio PH e SH
ATP adenosina tri-fosfato
BAD proteína proaptótica da família Bcl-2
Bmax ligação máxima
BSA albumina sérica bovina
Ca
++
cálcio
CAVO complexo artério venoso ovariano
Cbl protooncogene Cbl
CCK colecistoquinina
CEP Comissão de Ética em Pesquisa
CHGM concentração de hemoglobina globular média
cm centímetro
CO
2
dióxido de carbono
COMPESQ Comissão de Pesquisa
cpm contagens por minuto
dL decilitro
DM diabetes mellitus
17
DMC diabetes mellitus canino
DMG diabetes mellitus gestacional
DMID diabetes mellitus insulino-dependente
DMNID diabetes mellitus não insulino-dependente
DP desvio padrão
EDTA ácido etilenodiaminotetracético
EP erro padrão
ER receptor de estrógeno
et al e colaboradores
exp expoente
FSH hormônio folículo estimulante
g grama
Gab-1 ligador associado so Grb2 – 1
GAD ácido glutâmico descarboxilase
GH hormônio do crescimento
Glu Glicina
GLUT transportador de glicose
GPT guanosina trifosfato
Grb proteína ligadora do receptor de fator de crescimento
GSK glicogênio sintase quinase
H
+
hidrogênio
HbA1c hemoglobina A1c
HCl ácido clorídrico
HCV Hospital de Clínicas Veterinárias
HE hemtoxilina-eosina
HEC hiperplasia endometrial cística
HEC-P hiperplasia endometrial cística – piometra
HMGB 1 proteína box de motilidade de grupo-1
HNF-4 fator nuclear hepático-4
HOMA
homestatic model assessment
i.e. isto é
IC intervalo de confiança
ICA anticorpo anti células da ilhota
ICBS Instituto de Ciências Básicas da Saúde
IDD diabetes insulino-dependente
IL interleucina
iNO óxido nítrico induzível
iNOS indução óxido nítrico síntase
IR receptor de insulina
IRD diabetes insulino-resistente
IRS substrato ao receptor de insulina
ITT teste de tolerância à insulina
IVGTT teste de tolerância à glicose intra-venosa
K
+
potássio
K
1
constante de afinidade
18
K
2
constante de dissociação
Ka constante de afinidade
Kd constante de dissociação
KOH hidróxido de potássio
KRM Krebs ringer mamífero
LACVet Laboratório de Análises Clínicas Veterinárias
LH hormônio luteinizante
ln logaritimo natural
LPS lipopolissacarídeo
M molar
MAPK proteina quinase ativadora de mitose
MG Minas Gerais
MHC complexo principal de histocompatibilidade
MIF fator inibidor de migração
mL mililitro
mM milimolar
mm3 milímetros cúbicos
mRNA ácido ribonucléico mensageiro
Muc-1 mucina-1
N normal
n tamanho da amostra
Na
2
SO
4
sulfato de sódio
NaCO
3
bicarbonato de sódio
NADH dinucleotideo adenina dicotinamida
NADPH dinucleotideo adenina dicotinamida fosfato
NF-κb fator nuclear κb
ng nanograma
nm nanômetro
nM nanomolar
NO óxido nítrico
º grau
ºC grau Celcius
OGTT teste de tolerância à glicose oral
OR
odds ratio
PEPCK fosfoenol piruvato carboxiquinase
pg picograma
PGC-1
peroxisome proliferator-activated receptor-
γ
coactivator-1
PGE
2
prostaglandina E
2
pH potencial de hidrogênio
PI3K fosfatidil inositol trifosfato
PIG polipeptideo inibidor gástrico
PKB proteína quinase B
pM picomolar
PMSF fenilmetilsulfoxido
PR receptor de progesterona
19
Proc. processo
PTEN gene homólogo fosfatase e tensina
RP razão de prevalência
rpm rotações por minuto
S.A. sociedade anônima
SAS
Statistical Analisys System
Ser serina
SH2 domínio homólogo a Src-2
SHP-2 domínio SH2 contendo inositol-5-fosfatase
SI sistema imune
SOCS proteínas supressoras da produção de citocinas
SRD sem raça definida
SREBP-1 proteína ligadora do elemento regulatório de esteróide – 1
STAT proteína ativadora de trancrição e transdução do sinal
TCA ácido tricloro acético
TES tris EDTA e sacarose
TM
trade mark
TNF-α
fator de necrose tumoral alfa
Tyr tirosina
UFRGS Universidade Federal do Rio Grande do Sul
VGM volume globular médio
VLDL lipoproteína de densidade muito baixa
20
SUMÁRIO
INTRODUÇÃO ......................................................................................................................... 22
Insulina: Síntese, Secreção, Sinalização e Efeitos Metabólicos ............................................................................ 24
Diabetes Mellitus Canina e o Papel da Progesterona e do GH.............................................................................. 34
Ciclo Estral Canino ............................................................................................................................................... 49
Complexo Hiperplasia Endometrial Cística - Piometra......................................................................................... 58
Resposta Inflamatória e a Sensibilidade à Insulina ............................................................................................... 65
OBJETIVOS .............................................................................................................................. 69
Objetivos Específicos ............................................................................................................................................ 69
MATERIAIS E MÉTODOS..................................................................................................... 71
Delineamento Experimental .................................................................................................................................. 71
Animais ................................................................................................................................................................. 72
Protocolo Experimental......................................................................................................................................... 73
Determinações Hematológicas .............................................................................................................................. 75
Citologia Vaginal .................................................................................................................................................. 75
Teste de Tolerância à Glicose Intra-Venosa (IVGTT) .......................................................................................... 76
Procedimento Operatório e Coleta de Tecidos ...................................................................................................... 78
Histopatologia Uterina........................................................................................................................................... 79
Radioimunoensaio e Determinações Bioquímicas ................................................................................................ 80
Dosagem do Glicogênio Muscular ........................................................................................................................ 82
Preparação das Membranas do Tecido Muscular .................................................................................................. 82
Dosagem de Proteínas ........................................................................................................................................... 83
Ensaios de Ligação da
125
I-Insulina em Presença de Diferentes Concentrações de Insulina Humana .................. 84
Fosforilação do Substrato Sintético Poly (Glu, Tyr 4:1) ....................................................................................... 86
Análise Estatística ................................................................................................................................................. 87
Medidas de Associação ......................................................................................................................................... 88
CAPÍTULO I ............................................................................................................................. 89
Influência do Ciclo Estral sobre a Sensibilidade à Insulina .................................................. 89
RESULTADOS..................................................................................................................................................... 89
Animais ............................................................................................................................................................. 89
Determinações Hematológicas .......................................................................................................................... 90
Determinações Bioquímicas.............................................................................................................................. 91
Teste de Tolerância à Glicose Intra-Venosa (IVGTT) ...................................................................................... 93
Determinação do Glicogênio Muscular............................................................................................................. 98
Ensaios de Ligação da
125
I-Insulina em Presença de Diferentes Concentrações de Insulina Humana .............. 99
Fosforilação do Substrato Sintético Poly (Glu,Tyr 4:1) .................................................................................. 103
DISCUSSÃO....................................................................................................................................................... 104
CAPÍTULO II.......................................................................................................................... 122
Influência do Complexo Hiperplasia Endometrial Cística – Piometra .............................. 122
sobre a Sensibilidade à Insulina............................................................................................. 122
RESULTADOS................................................................................................................................................... 122
Animais ........................................................................................................................................................... 122
Determinações Hematológicas ........................................................................................................................ 123
Determinações Bioquímicas............................................................................................................................ 124
Teste de Tolerância à Glicose Intra-Venosa (IVGTT) .................................................................................... 126
Correlações de Pearson e Odds ratio ............................................................................................................... 131
Determinação do Glicogênio Muscular........................................................................................................... 134
Ensaios de Ligação da
125
I-Insulina em Presença de Diferentes Concentrações de Insulina Humana ............ 135
Fosforilação do Substrato Sintético Poly (Glu,Tyr 4:1) .................................................................................. 139
DISCUSSÃO....................................................................................................................................................... 140
CONCLUSÕES GERAIS ....................................................................................................... 154
21
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS:................................................................................. 157
ANEXOS .................................................................................................................................. 170
22
INTRODUÇÃO
O Diabetes Mellitus (DM) é uma doença metabólica crônica conhecida há muito
tempo pela humanidade, tendo seus primeiros registros no papiro de Ebners, escrito pelo povo
egípcio 1500 anos A.C., que o descreveram associado à formação de muita urina (VIEIRA,
2004). Na Grécia do século II, Areteu de Cappadócia deu o nome diabetes (do grego: diabetes =
sifão) derivado da palavra grega diabaino (dia = através, baino = passar; “passar através”),
caracterizando a poliúria característica da doença (VOMERO, 2002). Areteu também
apresentou as primeiras definições clínicas da doença. Entre os séculos III e VI, médicos
indianos descreveram nos Vedas (livros sagrados), a existência de pacientes com poliúria e
urina adocicada que atraia formigas, moscas e outros insetos. Também relataram que a doença
acometia dois tipos de pessoas: umas magras que não sobreviviam muito tempo e outras idosas
e obesas (VIEIRA, 2004). O termo latino mellitus (do latim: mellitus = mel) só foi acrescentado
durante o século XVIII por Cullen (1709-1790) afim de distinguir a doença do diabetes
insipidus (VIEIRA, 2004).
O DM é conhecido em diversos animais além da espécie humana, como em
carnívoros, roedores, marsupiais, eqüídeos, répteis, ruminantes dentre outros. Em cães, a
descoberta da insulina teve uma grande importância nos estudos sobre diabetes (ROSENFELD,
2002). Em 1682, Bruner verificou que a retirada do pâncreas provocava poliúria e polidipsia em
cães. Contudo, somente em 1869, Von Mering e Minkowski demonstraram que a
pancreatectomia provocava diabetes mellitus no cão. Esse achado ocorreu no mesmo ano em
23
que Paul Langerhans (1847-1888) descrevia pela primeira vez as ilhotas pancreáticas, porém
sem sugerir qualquer função para elas (VIEIRA, 2004; CATCHPOLE et al., 2005).
Durante anos, muitos pesquisadores tentaram desvendar a função das ilhotas e a
relação do pâncreas com o diabetes. Nas duas primeiras décadas do século XX, diversos grupos
preparam extratos pancreáticos que obtiveram sucesso na redução da glicemia e glicosúria em
cães diabéticos por pancreatectomia. No entanto, os inúmeros efeitos colaterais como sepse,
febre, abscessos, intensa dor devido a presença de impurezas, reações tóxicas e proteases
presentes nos extratos, inviabilizavam o uso destes extratos em pacientes humanos
(ROSENFELD, 2002).
Em uma noite de insônia, o jovem cirurgião Frederick Grant Banting (1891-1941)
idealizou uma forma de administrar extratos pancreáticos mais inócuos a pacientes com diabetes
baseado em duas observações: (1) cães submetidos à pancreatectomia desenvolviam diabetes; e
(2) cães que tinham o ducto pancreático ligado, desenvolviam degeneração acinar sem qualquer
prejuízo às ilhotas, além de não apresentarem poliúria, polidipsia ou glicosúria. Assim, Banting
teve a idéia de ligar o ducto pancreático de cães, esperar que ocorresse a degeneração acinar e
então testar o extrato do pâncreas remanescente no controle do diabetes de cães submetidos a
pancreatectomia (ROSENFELD, 2002). Em 27 de julho de 1921, Banting e seus colaboradores,
Charles Best e John MacLeod, obtinham os primeiros resultados em cães diabéticos. O extrato
foi batizado de insulina (do latim: insula = ilha) e purificado pelo bioquímico James Collip
(1892-1965). Em 23 de janeiro de 1922, o extrato foi usado pela primeira vez em um paciente
humano diabético; uma criança de 14 anos de idade, obtendo sucesso na redução da glicemia.
24
Em 25 de outubro de 1923, a equipe recebia o prêmio Nobel pela descoberta da insulina
(ROSENFELD, 2002).
Atualmente o diabetes mellitus canino é uma doença endócrina bastante freqüente nas
rotinas clínicas, sendo uma das endocrinopatias mais comuns em cães. O estado diabético causa
transtornos aos proprietários e animais devido à poliúria e polidipsia característica da doença,
além da perda de visão decorrente de catarata, risco de cetoacidose diabética e predisposição às
infecções (FELDMAN & NELSON, 2004). Os gastos com um paciente diabético,
monitoramento e manejo terapêutico, podem facilmente ultrapassar o salário mínimo nacional; o
que justifica esforços na tentativa de esclarecer cada vez mais o universo do diabetes mellitus
nesta espécie.
Insulina: Síntese, Secreção, Sinalização e Efeitos Metabólicos
A insulina é sintetizada nas células β das ilhotas de Langerhans como um grande pré-
pró-hormônio formado após a transcrição gênica, como diversos outros hormônios protéicos. A
cadeia A é composta de 21 aminoácidos enquanto a cadeia B é composta por 30 resíduos. A pré-
pró-insulina com peso molecular de cerca de 11.500 daltons, apresenta um peptídio de 23
aminoácidos que é removido logo na entrada do retículo endoplasmático das células β após a sua
síntese a partir do mRNA mensageiro nos ribossomos do retículo endoplasmático rugoso. O
restante da molécula é então dobrada e formam-se as pontes dissulfeto originando a pró-insulina
com cerca de 9.000 daltons. O peptído que conecta as cadeias A e B facilita a alteração
conformacional da molécula de pró-insulina e é denominado peptídio-C. Este peptídio está
25
presente em concentrações eqüimolares nos grânulos secretórios, uma vez que é gerado após a
ação de duas proteases que geram então a insulina biologicamente ativa (5.508 daltons) separada
do peptídio-C (GANONG, 2005).
A secreção de insulina pelas células β pancreáticas é estimulada rapidamente após
aumentos na concentração plasmática de glicose. A glicose entra nas células β via um
transportador do tipo GLUT-2. A oxidação subseqüente da glicose, após a fosforilação da
molécula pela enzima glicoquinase, leva a um aumento rápido na concentração intra-celular de
ATP; na razão ATP/ADP, e nas concentrações de NADH, NADPH e H
+
. Canais de K
+
sensíveis
ao ATP fecham-se, inibindo o efluxo de potássio da célula. Como resultado ocorre uma
despolarização da célula β. Canais de cálcio regulados por voltagem são abertos; o que resulta
num aumento rápido na concentração de Ca
++
intra-celular responsável pela ativação do
processo de exocitose dos grânulos secretórios de insulina. Estes grânulos se movem ao longo
dos microtúbulos e ocorre a fusão dos grânulos com a membrana plasmática por meio da
interação entre uma GPTase (proteína G monomérica) e fusinas (proteínas de membrana). A
exocitose da insulina acontece na forma de hexâmeros, que rapidamente dissociam-se em
dímeros e enfim monômeros biologicamente ativos (BERNE et al., 2004).
Uma série de outros fatores apresentam a capacidade de estimular a secreção de
insulina, como por exemplo; atividade vagal, acetilcolina (Ach), atividade β-adrenérgica,
sulfoniluréias, meglitininas, assim como outros glicídeos, alguns aminoácidos, cetoácidos,
ácidos graxos livres (AGLs), K
+
, Ca
++
, glucagon, peptídeo 1 semelhante ao glucagon, PIG –
polipeptídeo inibitório gástrico, secretina e colecistoquinina (CCK). Diversos outros fatores
26
podem ser relacionados à inibição da secreção de insulina; como jejum, exercício,
somatostatina, galanina, pancreastatina, leptina, IL-1, atividade α-adrenérgica, PGE
2
e
diazóxido (BERNE et al., 2004).
Quando a insulina é secretada, circula de forma livre no sangue, apresentando uma
meia vida plasmática média de 6 minutos, sendo depurada da circulação dentro de 10 a 15
minutos. As moléculas que não se ligam ao receptor de insulina nos órgãos alvo são destruídas
pela enzima insulinase (proteína de membrana) no fígado, rins e músculos, assim como em
todos outros tecidos, porém em menor grau. A insulina que se liga ao receptor é internalizada e
destruída nos endossomos formados pelo processo de endocitose. A insulinase é internalizada
junto com a insulina, sendo responsável pela lise do hormônio (GANONG, 2005).
O receptor de insulina (IR) é uma molécula heterotetramérica composta de 2
subunidades glicoprotéicas α, responsáveis pela interação com a insulina, e duas subunidades
glicoprotéicas trans-membrana β, que apresentam atividade tirosina quinase; ambas sintetizadas
por um único mRNA que depois são separadas e unidas por pontes dissulfeto (GANONG, 2005;
DOMINICI et al., 2005). As subunidades α e β atuam como enzimas alostéricas, onde a
subunidade α inibe a atividade tirosina quinase da subunidade β. Quando a insulina interage
com a subunidade α, causa um desbloqueio da atividade tirosina quinase da subunidade β, que é
seguida por uma transfosforilação da mesma, com conseqüente alteração conformacional da
molécula, o que aumenta ainda mais a atividade tirosina quinase (SALTIEL & KAHN, 2001).
27
Segundo os mesmos autores, pelo menos nove substratos intracelulares do IR já foram
identificados, sendo que quatro destes pertencem à família das proteínas substrato do receptor
de insulina (IRS-1, IRS-2, IRS-3 e IRS-4), além dos substratos Gab-1, p60dok, Cbl, APS,
isoformas de Shc assim como sinais de transdução e ativadores de transcrição - STAT
(DOMINICI et al., 2005). Pirola et al. (2004) citaram a descoberta recente do IRS-5/DOK4 e
IRS6/DOK5. A fosforilação das tirosinas destes substratos agem como locais de ligação para
proteínas adaptadoras que regulam suas atividades e locação subcelular. Estas proteínas
apresentam domínios SH2 (Src-homogy-2), e podem ativar pequenas proteínas G. De forma
simplificada; a autofosforilação do IR em resposta a ligação com o hormônio, catalisa a
fosforilação de proteínas celulares membros da família IRS, GAB, Shc e Cbl. Em decorrência
da fosforilação da tirosina, estas proteínas interagem com moléculas sinalizadoras por meio de
seus domínios SH2, resultando em diversas séries de vias sinalizadoras (SALTIEL & KAHN,
2001; PIROLA et al., 2004; DOMINICI et al., 2005).
Alguns destes domínios SH2 são proteínas adaptadoras como a subunidade regulatória
p85 do fosfatidilinositol-3-OH quinase (PI3K) e a proteína ligadora 2 do receptor de fator de
crescimento (Grb2). Outros apresentam atividade enzimática intrínseca, como a fosfotirosina
fosfatase SHP-2 e a tirosina quinase citoplasmática Fyn. Coletivamente estas moléculas
orquestram as numerosas respostas fisiológicas mediadas pela insulina (DOMINICI et al.,
2005).
A associação entre a p85 com os IRS leva a ativação da subunidade catalítica p110. A
PI3K é necessária para muitas, mas não todas as ações da insulina (DOMINICI et al., 2005). A
28
ativação da via do PI3K é responsável; por exemplo, pela translocação dos GLUT-4 para a
membrana celular, síntese de glicogênio via proteína quinase B (PKB) (a qual inibe a
fosforilação da glicogênio sintase quinase – GSK-3 – enzima que contra regula a glicogênio
sintase), lipogênese via regulação da expressão do gene da enzima ácido graxo sintase, inibição
da gliconeogênese via regulação da fosfoenolpiruvato carboxiquinase (PEPCK), assim como
controle de padrões de expressão gênicas (PIROLA et al., 2004; DOMINICI et al., 2005).
A quinase serina/treonina (Akt), composta de duas isoformas (Akt1 e Akt2), é uma das
principais efetoras da PI3K e medeia muitas das respostas da insulina, fosforilando diversos
substratos, incluíndo a BAD (proteína pró-apoptótica envolvida na sobrevivência celular), GSK-
3 e o fator de transcrição FoxO1, que controla a expressão gênica de genes ligados a
estimulação da gliconeogênese hepática, diferenciação dos adipócitos e inibição da função das
células β (DOMINICI et al., 2005).
Segundo Saltiel & Kahn (2001) a translocação das vesículas com GLUT-4 para a
membrana celular não depende somente da via PI3K. Uma segunda via envolvendo o proto-
oncogene Cbl é necessária para tal, e desta forma após ativação do receptor de insulina as
proteínas acopladoras CAP e APS recrutam o Cbl, que é então fosforilado, resultando na
ativação da proteína G Tc10 e conseqüente ativação do efetor TCGAP, estimulando a
translocação das vesículas. Segundo Dominici et al., (2005) esta via poderia servir como um
sinal alternativo à ativação da via PI3K/Akt na estimulação da captação de glicose. No entanto,
a ativação da via CAP/APS/Cbl/TC10 está, de alguma forma, envolvida em mecanismos que
29
atenuam as ações da insulina, uma vez que camundongos knockout para APS e Cbl apresentam
sensibilidade aumentada à insulina.
A ativação da via Ras-Raf-Mek-Erk é a terceira via principal de sinalização da insulina
e resulta na ativação das proteínas quinases ativadoras de mitoses (MAPK) (DOMINICI et al.,
2005). A via das MAPK, apesar de apresentar um possível efeito sobre a translocação de
GLUT-4 para a membrana plasmática, parece estar mais envolvida com a regulação da
expressão gênica e controle do crescimento e diferenciação celular; estando envolvida com os
efeitos promotores do crescimento deste hormônio e parecendo ser relativamente dispensável na
regulação metabólica estimulada pela insulina (SALTIEL & KAHN 2001; PIROLA et al., 2004;
DOMINICI et al., 2005). A figura 1 ilustra de forma sumarizada as vias de sinalização intra-
celulares da insulina.
30
Figura 1 - Sinalização e transdução do sinal da insulina. O receptor de insulina após ativado
sofre uma autofosforilação, catalizando a fosforilação de diversas proteínas celulares. Estas vias
funcionam de forma coordenada na regulação do transporte das vesículas, da síntese de
proteínas, da ativação e da inibição enzimática e da expressão gênica, que resultam na regulação
do metabolismo da glicose, dos lipídios e das proteínas (SALTIEL & KAHN, 2001).
Em contraste à fosforilação da tirosina (Tyr), a qual serve para propagar o sinal
emitido a partir do IR, a fosforilação da serina (Ser) previne que o sinal da insulina atinja seu
destino final e ambos IR e IRS serão alvos desta modificação covalente. Muitas evidências
indicam que fosforilação da Ser controla muitas ações do IRS-1, incluindo sua interação com o
IR, assim como sua distribuição intra-celular e a sua destruição por proteassomos. Diversos
indutores de resistência à insulina, como a hiperinsulinemia crônica, TNF-α, e aumento nos AG
circulantes afetam a sinalização da insulina por este mecanismo. Um dos principais sítios de
31
fosforilação da Ser é o resíduo Ser
307
. Essas fosforilações inibitórias atuam em conjunto com as
fosfatases PTEN e SHP-2 e com proteínas inibitórias da família dos supressores de sinalização
das citocinas (SOCS) para limitar a sinalização intra-celular induzida pela insulina (DOMINICI
et al., 2005).
A insulina juntamente com os fatores de crescimento (insulin-like growth factors -
IGFs) têm um papel importante sobre o controle do metabolismo energético e do anabolismo em
vertebrados mamíferos e não mamíferos. Os IGFs (IGF-I e IGF-II) e a pró-insulina dos
vertebrados apresentam semelhanças na seqüência de aminoácidos e na estrutura terciária da
molécula, sugerindo-se que os IGFs e a insulina possuam um gene ancestral comum (CHAN &
STEINER 2000). Da mesma forma; os receptores de IGFs e o receptor de insulina pertencem a
mesma sub-família de receptores com atividade tirosina-quinase (DOMINICI et al., 2005). Com
relação ao metabolismo energético, os efeitos da insulina ocorrem sobre o metabolismo de
carboidratos, de gorduras e de proteínas. Os efeitos dos IGFs ocorrem, principalmente, sobre o
crescimento, a diferenciação e a proliferação celular (CHAN & STEINER 2000). Estas
moléculas são sintetizadas no fígado e em diversos outros tecidos, primariamente sob controle
do GH (GRIFFIN & OJEDA, 2004). No entanto, os IGFs apresentam a capacidade de se ligar ao
receptor de insulina, assim como a insulina apresenta a capacidade de se ligar aos receptores de
IGFs; contudo, com menor afinidade (DOMINICI et al., 2005).
No metabolismo de carboidratos a insulina aumenta a captação de glicose no tecido
adiposo e no tecido muscular, bem como aumenta a atividade glicolítica nestes tecidos. Este
hormônio também estimula a síntese de glicogênio em diversos tecidos; incluindo adiposo,
32
muscular e hepático, e inibe a glicogenólise no fígado e no músculo. A insulina ainda inibe a
gliconeogênese. Sobre o metabolismo de lipídios; observa-se inibição da lipólise no tecido
adiposo (inibição da enzima lípase hormônio sensível), com conseqüente redução na
concentração plasmática de ácidos graxos; estímulo à síntese de ácidos graxos e triglicerídeos
nos tecidos, assim como aumento na formação de VLDL (lipoproteínas de muito baixa
densidade) no fígado. A insulina ainda é responsável por uma maior captação de triglicerídeos
do sangue para o tecido adiposo através da estimulação à enzima lípase lipoprotéica em prol da
lipogênese, além de reduzir a oxidação de ácidos graxos no músculo e fígado e aumentar a
síntese de colesterol hepático.
No metabolismo protéico a insulina aumenta o transporte de muitos aminoácidos para
os tecidos, aumenta a síntese de proteínas no tecido adiposo, muscular, hepático dentre outros,
além de reduzir a proteólise e assim a síntese de uréia (NEWSHOLME & DIMITRIADIS,
2001). A figura 2 sumariza os efeitos anabólicos e anti-catabólicos da insulina. O fígado é alvo
central da ação da insulina, onde atua através da ativação e regulação gênica de algumas enzimas
chaves para armazenagem de glicose na forma de glicogênio e de lipídeos, e repressão da
atividade e transcrição de enzimas envolvidas na síntese de glicose e liberação desta para
circulação (SALTIEL & KAHN, 2001). Estes processos estão ilustrados na Figura 3.
33
Figura 2 - Regulação do metabolismo pela insulina, o mais potente hormônio anabólico
conhecido. A insulina promove a síntese de carboidratos, de lipídios e de proteínas, inibindo sua
degradação e liberação no sangue. através do estimulo a captação de glicose, aminoácidos e
ácidos graxos para dentro da célula em tecidos alvo (SALTIEL; KAHN, 2001).
Figura 3 – Efeitos da insulina no hepatócito. A insulina estimula a expressão de genes que
codificam enzimas glicolíticas e da síntese de ácidos graxos, enquanto inibe as enzimas
envolvidas na gliconeogênese. Estes efeitos são mediados por diversos fatores de transcrição
como SREBP-1, HNF-4, Fox e PGC-1. Além disto o hormônio também regula a atividade de
algumas enzimas como a glicogênio sintase e citrato liase através da alteração no estado de
fosforilação (SALTIEL; KAHN, 2001).
34
Diabetes Mellitus Canina e o Papel da Progesterona e do GH
O diabetes mellitus canino (DMC) é uma doença crônica sistêmica decorrente de uma
deficiência relativa ou absoluta de insulina. A doença é classificada basicamente de duas formas
(SCHULMAN, 2003). A primeira é baseada na classificação em humanos (tipo I - juvenil e tipo
II - senil) e considera mecanismos patofisiológicos e alterações patológicas das células β
pancreáticas (HOENIG, 2002). A segunda forma de classificação, considera a necessidade pela
terapia com insulina para estabelecer o controle glicêmico, prevenir a cetoacidose diabética e
consequentemente permitir a sobrevivência do paciente, classificando o DM em dependente de
insulina (DMID) ou DM não dependente de insulina (DMNID) (GUPTILL et al., 2002).
O DM tipo I é caracterizado por uma combinação de suscetibilidade genética e
destruição imunomediada das células β, com progressiva e muitas vezes completa deficiência de
insulina (FELDMAN & NELSON, 2004). Auto-anticorpos são formados contra a insulina
sérica, as células β e outros componentes das ilhotas pancreáticas; como a enzima ácido
glutâmico descarboxilase (GAD), estes anticorpos são utilizados na identificação de indivíduos
em risco de desenvolver DM tipo I, uma vez que já estão presentes na circulação sangüínea antes
do aparecimento de hiperglicemia e sinais clínicos (HOENIG, 2002). A destruição
imunomediada das ilhotas pancreáticas começa pela suscetibilidade genética, e a ocorrência de
um evento que irá desencadear a autoimunidade contra as células β.
Acredita-se que em cães o DM progrida de forma semelhante, mas infelizmente não é
identificado antes dos estágios finais, quando a terapia insulínica é fundamental. Uma vez
35
descompensadas, e na presença de hipoinsulinemia, as células β não são mais capazes de
recuperação (HOENIG, 2002). O DM em cães jovens é um achado extremamente raro (GRECO,
2001a), embora Souza et al. (2004) tenham relatado diabetes em cão Pincher de 5 meses. Estes
achados motivam as discussões sobre a classificação do DM em cães.
O DM tipo II ocorre por uma resistência periférica à insulina e por disfunção das
células β (HOENIG, 2002). Acredita-se que estes defeitos sejam de origem genética e são
evidentes por até mais de uma década antes do início da doença clínica. Fatores ambientais;
como a obesidade, podem acentuar o problema. Aumento nas concentrações séricas de ácidos
graxos livres na circulação portal induz menor ação hepática da insulina, resultando em excesso
de produção de glicose hepática e hiperglicemia pós-prandial persistente (McGARRY, 2002). A
resistência muscular à insulina leva a diminuição da captação muscular de glicose após as
refeições. Muitas alterações nos receptores à insulina e nas vias de sinalização pós-receptor
contribuem para a resistência ao hormônio, assim como a reduzida secreção de insulina, a qual é
um dos principais pontos da patogênese da intolerância à glicose no DM tipo II. Os pacientes
acometidos por esta forma da doença não dependem de insulina para controlar a doença
(NELSON, 2003). Este controle é obtido por meio de dieta apropriada, agentes hipoglicemiantes
de uso oral e exercícios (BEHREND, 2002). A terapia com insulina pode tornar-se necessária
frente a severa resistência à insulina e disfunção das células β. Alguns cães e gatos obesos são
identificados com resistência à insulina associada à reduzida secreção do hormônio (HOENIG,
2002).
36
Como a classificação do DM em humanos em tipos I e II é baseada em histórico
familiar, apresentação clínica (também conhecidas como diabetes juvenil e diabetes senil,
respectivamente, em decorrência da idade média dos indivíduos acometidos), presença de auto-
anticorpos contra células β e insulina, assim como testes com secretagogos de insulina (glicose,
glucagon), é clinicamente relevante e talvez mais correto classificar o DM em cães como DMID
e DMNID (FELDMAN & NELSON, 2004). Em cães, o histórico familiar normalmente não esta
disponível; a apresentação clínica não auxilia muito na diferenciação entre DM tipo I ou II; os
testes de secreção de insulina não são utilizados rotineiramente e os testes imunológicos não são
disponíveis nas rotinas clínicas.
Praticamente todos os cães apresentam DMID no momento do diagnóstico (NELSON,
1997). Em cães este tipo é caracterizado por hipoinsulinemia, acompanhada de ausência de
aumento nas concentrações séricas de insulina e/ou peptídio C após administração de um
secretagogo como a glicose (HOENIG, 2002). O uso de dietas apropriadas e agentes
hipoglicemiantes orais não é suficiente para manutenção do estado euglicêmico, o que gera
dependência de insulina para manutenção da glicemia (BEHREND, 2002; SCHULMAN, 2003).
Diversos fatores estão envolvidos na etiopatogênese do DM em cães. Dentre os fatores
etiopatogênicos envolvidos; a predisposição genética tem sido sugerida por associações
familiares e análises de pedigree (GUPTILL et al., 2002). Outros fatores potencialmente
envolvidos são a insulite imunomediada, pancreatite, obesidade, antagonismos hormonais
(hiperadrenocorticismo, diestro, acromegalia), fármacos (glicocorticóides, estreptozootocina),
infecções, doenças intercorrentes (insuficiência renal, doença cardíaca), hiperlipidemia e
37
amiloidose nas ilhotas; sendo este último não totalmente aceito (FELDMAN & NELSON,
2004). Segundo Fleeman; Rand (2001), a descoberta recente de que cerca de 50% dos cães
diabéticos apresentam anticorpos contra células β suporta a existência de uma auto-imunidade
humoral.
As lesões patológicas mais comuns em cães com DM são uma redução no número e no
tamanho das ilhotas de Langerhans, um reduzido número de células β nas ilhotas e degeneração
hidrópica das mesmas (HOENIG, 2002). Ausência absoluta congênita de células β, e aplasia ou
hipoplasia de ilhotas pancreáticas já foram descritas em cães com DM (NELSON, 1997).
Alterações menos severas nas células β e nas ilhotas podem predispor o cão adulto ao DM
quando exposto aos fatores ambientais de risco (FELDMAN & NELSON, 2004). Estes fatores
ambientais podem induzir a degeneração de células β secundariamente à resistência crônica à
insulina ou podem causar liberação de proteínas celulares provenientes de células β. Estas
proteínas podem se tornar alvos de destruição imunomediada das ilhotas de Langerhans
(FELDMAN & NELSON, 2004). Infiltração linfocitária é um achado raro em cães,
diferentemente do que ocorre no DM tipo I de humanos e de bovídeos. É provável que ocorram
infiltrados leucocitários nas ilhotas pancreáticas no início do processo auto-imune, porém já
haveriam desaparecido no momento da morte na maioria dos cães diabéticos (HOENIG, 2002).
Segundo o mesmo autor, após episódios de pancreatite, 30% dos casos apresentam destruição de
ilhotas, que são substituídas por tecido fibroso. Em outros casos ocorre degeneração de ilhotas
ou nenhuma ilhota é encontrada.
38
Intolerância aos carboidratos, induzida por obesidade, e a presença de amilóide em
ilhotas, já foram encontrados em alguns cães diabéticos. Embora o reconhecimento clínico de
DMNID seja bastante raro em cães (MATTHEEUWS et al., 1984; HOENIG, 2002). Sowa et al.
(1990) demonstraram que o polipeptídio amilóide pancreático causa resistência periférica à
insulina in vivo. A proteína amilóide presente nas ilhotas é considerada uma importante
característica do DM tipo II em humanos (HOENIG, 2002). Uma pequena porcentagem de cães
diabéticos apresenta aumento dos níveis de peptídio C em testes de liberação de insulina, o que
sugere a presença de algumas células beta funcionais (FELDMAN & NELSON, 2004).
Infelizmente estes cães necessitam de terapia com insulina para diminuir a hiperglicemia
(SCHULMAN, 2003).
Catchpole et al., (2005) classificaram o DM canino como diabetes insulino-deficiente
(IDD) e diabetes insulino–resistente (IRD). A IDD primária em cães seria caracterizada por uma
perda progressiva de células β pancreáticas; causada por doenças como hipoplasia/abiotrofia
congênita de células β, perda de células β secundária a doença pancreática exócrina, destruição
imuno-mediada de células β ou idiopática. A IRD primária resultaria de antagonismos à função
da insulina por outros hormônios (diestro/diabetes gestacional); secundária a outras doenças
endócrinas (hiperadrenocorticismo e acromegalia); iatrogênica (uso de glicocorticóides e
progestinas sintéticas) e ainda por intolerância a glicose associada à obesidade, porém não como
causa primária do DM em cães. A IRD pode ocasionar um estado diabético reversível;
extremamente incomum em cães, sendo considerado por alguns autores como DM tipo III
(KANEKO et al., 1997). Nestes casos, o reconhecimento precoce da resistência à insulina e
39
conseqüente tratamento adequado da endocrinopatia concomitante, pode resolver o DM tipo III
retornando a um estado euglicêmico sem o uso contínuo de insulina (BEHREND, 2002).
Apesar de haver adequada massa de células β funcionais, estas não conseguem secretar
insulina suficiente para a manutenção da euglicemia na presença de um antagonismo patológico
aos efeitos da insulina (BEHREND, 2002). Falhas em corrigir rapidamente estes antagonismos
resultam em perda de células β e eventual desenvolvimento de DMID secundário (FELDMAN
& NELSON, 2004). Fleeman & Rand (2001) relataram que uma hiperglicemia crônica (>250
mg/dL) por cerca de duas semanas é suficiente para causar perda de células β e DM permanente
devido a resistência periférica à insulina e supressão da secreção deste hormônio
(glicotoxicidade). A hiperglicemia persistente após pancreatite é outra forma de DM secundário.
A ativação de enzimas pancreáticas dentro dos acinos e sistema de ductos pancreáticos inicia a
pancreatite, e o envolvimento das ilhotas pode ocorrer por extensão da necrose e inflamação
pelos tecidos ao redor (FLEEMAN & RAND, 2001). Além disto, a auto-imunidade contra
células β, inflamação pancreática e a regulação da imunidade intestinal podem estar interligadas
na patogênese do processo, uma vez que pessoas com DM tipo I normalmente apresentam
regulação da imunidade intestinal anômala. Dois fatores de risco que estão freqüentemente
implicados na patogênese do DM tipo I são infecções enterovirais e exposição às proteínas do
leite de vaca (RAND et al., 2004).
A grande maioria dos cães recentemente diagnosticados com DM apresentam
concentrações de insulina menores que 12 μU/mL ou muitas vezes indetectáveis. Concentrações
maiores que 18 μU/mL sugerem a existência de células β funcionais e a possibilidade de DM
40
secundário com possibilidade de reversão do quadro a um estado não dependente de insulina se
os antagonismos hormonais presentes forem eliminados. Ainda assim, a terapia com insulina é
recomendada nestas situações para correção da hiperglicemia e redução do estresse às células
beta enquanto o antagonismo não é resolvido (FELDMAN & NELSON, 2004).
Ainda que a obesidade cause resistência à insulina em cães, não existem trabalhos bem
documentados que convincentemente demonstrem que o DM tipo II exista como uma doença
significante em cães (RAND et al., 2004). Nenhum trabalho epidemiológico foi publicado
avaliando a relação entre obesidade e DM em cães desde 1960. Contudo, Krook et al. (1960)
observaram que a prevalência de DM era maior em cães obesos. A obesidade é um fator de risco
bem estabelecido para DM tipo II em gatos e em humanos. Porém, em cães não há nenhum
relato de uma forma de diabetes semelhante ao tipo II. Nesta espécie a obesidade causa
resistência à insulina, que leva a hiperinsulinemia e a intolerância à glicose (MATTHEEUWS et
al., 1984). Entretanto, o estudo de Mattheeuws et al. (1984) utilizou 15 cadelas obesas com DM
e secreção residual de insulina. No entanto; das 15 pacientes, 13 eram fêmeas intactas, o que
torna difícil separar os efeitos da resistência à insulina induzida pelo diestro e da resistência à
insulina induzida pela obesidade (RAND et al., 2004).
A obesidade induzida por dieta rica em gorduras saturadas provoca efeitos
pronunciados. Cães alimentados com uma dieta rica em gordura desenvolvem resistência
insulínica não compensada por aumento na secreção hormonal, resultando em intolerância à
glicose mais severa; além de sofrerem uma redução no transporte de insulina para o SNC
(KAYALA et al., 1999; KAYALA et al., 2000; RAND et al., 2004). Um estudo epidemiológico
41
conduzido na região de Porto Alegre - Brasil evidenciou que 69% dos proprietários de cães
diabéticos consideravam seus cães com sobrepeso ou obesos antes do diagnóstico (PÖPPL &
GONZÁLEZ, 2005). O mesmo estudo documentou que 50% dos pacientes com diabetes
recebiam a cada refeição, comida caseira mais ração e que outros 29% deles recebiam somente
comida caseira como dieta até o momento do diagnóstico. Nesta população de pacientes
diabéticos estudada; 79% deles recebiam petiscos como pães, biscoitos, doces e chocolates fora
dos horários das refeições; o que corrobora com a hipótese de obesidade e de desequilíbrio
nutricional como fatores de risco para o desenvolvimento da DM canina (MATTHEEUWS et
al., 1984; KAYALA et al., 1999; PÖPPL & GONZÁLEZ, 2005).
Em um estudo de caso-controle conduzido na Suécia; Klinkenberg et al. (2006)
observaram também uma maior ocorrência de obesidade e de alimentação desequilibrada
(comida caseira sozinha ou associada à ração e petiscos) nos pacientes diabéticos quando
comparados aos controles. Além disto, evidências em outros modelos biológicos apontam para
os efeitos deletérios da obesidade sobre a sensibilidade à insulina e predisposição ao DM. Além
das diversas adipocitocinas liberadas pelos adipócitos, os AGLs reduzem a captação de glicose
muscular e a secreção de insulina e aumentam a produção hepática de glicose (McGARRY,
2002). Os AGL também estão associados à reduzida fosforilação de mensageiros intra-celulares,
resultando em menor resposta à insulina (SALTIEL & KAHN, 2001). A redução na secreção de
adiponectina na obesidade (adipocitocina com efeitos pró-insulina) é outro fator importante na
interação obesidade – homeostase da glicose (COSTA & DUARTE, 2006).
42
O pico de prevalência do DM em cães é entre os 7 e 9 anos (GRECO, 2001a), com uma
incidência de 1:100 a 1:500 (NELSON, 1997). Guptill et al. (2002) citam uma prevalência de
1:270 nos EUA, enquanto Pöppl & González (2005) observaram uma prevalência de 1:865
(0,11%) na região de Porto Alegre - Brasil. Segundo Catchpole et al., (2005) a prevalência de
diabetes esta estimada em algo entre 0,0005% e 1,5% (0,32% no Reino Unido). Esta incidência
esta aumentando significativamente nas últimas décadas (GUPTILL et al., 2002). Entre 1970 e
1999 a prevalência hospitalar de DM cresceu de 19 casos para cada 10.000 cães para 64 casos
para cada 10.000 cães nos Estados Unidos. Este aumento na prevalência deve-se não só a
avanços nas técnicas e no conhecimento dos veterinários (hipótese suportada pela redução na
mortalidade destes pacientes de 37% para 5% no mesmo período), mas também devido a maior
prevalência de obesidade, de alimentação desequilibrada, de estresse e de sedentarismo nos
animais (GUPTILL et al., 2002; NEUVIANS & BERGER, 2002; RAND et al., 2004;
CATCHPOLE et al., 2005; KLINKENBERG et al., 2006).
Apesar de em humanos não estar totalmente elucidado o componente genético do
DMID, sabe-se que estão envolvidos genes do MHC (complexo de histocompatibilidade
principal), responsáveis pela resposta imune. Em cães não foi encontrada correlação com estes
genes. Outros genes menos importantes envolvidos na patogênese do DM em humanos variam
amplamente entre diferentes etnias, nacionalidades e localizações geográficas. Possivelmente,
diversas raças puras de cães tenham diferentes genes envolvidos na patogênese do DM (HESS et
al., 2000).
43
Predisposição genética para o desenvolvimento da doença, via associações familiares e
estudos de pedigee, foram descritos em cães Keeshounds (Wolf Spitz, cão lobo), raça pouco
popularizada no Brasil e em Poodles miniatura, Samoiedas e Rottweillers (RAND et al., 2004).
Diversos estudos identificaram raças de cães com maior ou menor risco de desenvolver DM
(HESS et al., 2000; GUPTILL et al., 2002). Australian Terrier, Schnauzer, Samoieda, Pug, Fox
Terrier, Keeshound, Bichon Frise, Spitz, Husky Siberiano, Poodles toy e miniatura aparecem em
diferentes estudos como raças com maior chance de desenvolver DM comparados a cães sem
raça definida (HESS et al., 2000; GUPTILL et al., 2002). Nenhum fator genético responsável
pelo início da doença foi descoberto nessas raças e as alterações histopatológicas diferem em
cães que desenvolvem DM na infância (aplasia e hipoplasia de ilhotas) com relação àqueles que
desenvolvem DM na idade adulta (infiltrados inflamatórios e destruição de ilhotas) (GUPTILL
et al., 2002). Raças como o Pastor Alemão, Golden Retriever, American Pitbull, Terrier, Boxer,
Collie, Pequinês, e Pointer são raças com menor risco de desenvolver DM (HESS et al., 2000;
GUPTILL et al., 2002).
É importante ressaltar que a popularidade das raças em diferentes regiões pode alterar
estes dados com relação à predisposição à doença (FELDMAN & NELSON, 2004). Guptill et
al., (2002) não encontraram correlação entre a variação sazonal na incidência de DM. Contudo,
outros autores verificaram em cães uma maior incidência de DM entre os meses de novembro e
janeiro no hemisfério norte (RAND et al., 2004; CATCHPOLE et al., 2005)
Suspeita-se que raças nórdicas como Husky, Samoyeda, Spitz e Keeshound apresentem
um mecanismo metabólico semelhante ao observado em Psammomys obesus (gérbil, modelo de
44
pesquisa para estudos da Síndrome Metabólica Humana) e certas populações humanas que
apresentam alto risco de desenvolver DM tipo II, pois os ancestrais destas raças teriam sido
criados para sobreviver a longos períodos de pouca disponibilidade de alimentos (GUPTILL et
al., 2002).
Em fêmeas, a incidência de DM é duas vezes maior que em machos (FLEEMAN &
RAND, 2001), cerca de 70% dos pacientes diagnosticados com diabetes são fêmeas
(CATCHPOLE et al., 2005). Estudo em nossa região encontrou 95% de fêmeas diabéticas entre
20 pacientes diagnosticados com DM no período entre 2000 e 2004 (PÖPPL & GONZÁLEZ,
2005). Machos castrados apresentam maior chance de desenvolver DM que machos inteiros,
assim como cães com menos de 22 kg de peso têm mais chances que cães mais pesados
(GUPTILL et al., 2002). Segundo Greco (2001a,b) o DM em filhotes é extremamente raro,
sendo incomum o aparecimento da doença em cães com menos de um ano.
O DM em fêmeas intactas é freqüentemente associada com a fase do ciclo estral onde
predomina a progesterona (diestro), e assemelha-se ao diabetes gestacional (DMG) em humanos
(CATCHPOLE et al., 2005). Pöppl & González (2005) evidenciaram uma prevalência de 69%
de DM durante a fase de diestro. No Reino Unido, a redução no uso de progestágenos sintéticos
e a prática de esterilização das fêmeas não reprodutoras vem reduzindo a DM decorrente do
diestro em fêmeas caninas.
Em humanos, o diabetes mellitus gestacional é definido como qualquer grau de
intolerância à glicose com começo ou primeira constatação durante a gestação (RAND et al.,
45
2004). Durante uma gestação normal humana, há um aumento progressivo na secreção de
insulina em resposta à sobrecarga de glicose ou outros estímulos, observando-se uma menor
sensibilidade à insulina nos dois terços finais de gestação. As mulheres que desenvolvem DMG
manifestam vários graus de hiperglicemia e hiperlipidemia além de maior chance de
complicações no parto e morbidades para mãe e neonato. Etnia, obesidade, distribuição de
gordura corporal, idade, dieta e exercícios são os principais fatores não-gestacionais que
influenciam a sensibilidade à insulina (COUSINS, 1991; BEISCHER et al., 1991). Entretanto, o
principal fator envolvido no desenvolvimento do DMG seria as flutuações hormonais durante a
gestação (COUSINS, 1991). Ryan & Enns (1988) observaram em adipócitos de ratos, que
durante a gestação a ligação da insulina ao IR foi normal, porém o transporte de glicose foi
reduzido. A ligação máxima da insulina ao receptor foi observada com o aumento do estradiol. A
progesterona e o cortisol reduziram a ligação máxima da insulina ao receptor e o transporte de
glicose. A prolactina e o lactogênio placentário humano reduziram o transporte de glicose,
porém não alteraram a ligação da insulina ao seu receptor; fatores consistentes com defeitos de
sinalização da insulina durante a gestação (RYAN & ENNS, 1988).
Na espécie canina, a progesterona, assim como os progestágenos sintéticos, podem
aumentar a liberação de hormônio do crescimento (GH) pelo tecido mamário, sendo um
importante fator envolvido na resistência à insulina e também associado a tumores de mama e ao
complexo hiperplasia endometrial cística - piometra (FERREIRA & LOPES, 2000; RIJNBERK
et al., 2003). Normalmente ocorre uma redução na sensibilidade à insulina em cadelas prenhes
sadias entre os dias 30 e 35 da gestação, tornando-se mais grave no final da gestação. O diestro
na cadela dura aproximadamente o mesmo tempo de um gestação (9 semanas) e considera-se o
46
perfil hormonal do diestro e das prenhes praticamente idênticos (FLEEMAN & RAND 2001).
Cadelas com DM transitório, causado por diestro, apresentam grandes chances de desenvolver
DMID na próxima fase progesterônica do ciclo estral. Por este motivo é recomendada a
castração logo após o diagnóstico de DM (FLEEMAN & RAND, 2000). Cerca de 5% das
pacientes com diagnóstico inicial de DM durante o diestro podem reverter a um estado
euglicêmico se submetidas a castração (FELDAM & NELSON; 2004). Se o DM persistir após o
fim do diestro, deve-se reclassifica-lo como DMID (RAND et al., 2004).
O aumento na concentração sérica de progesterona durante o diestro pode causar
diabetes em cães, por promover um efeito antagônico à insulina, reduzindo a ligação de insulina
ao receptor e o transporte de glicose nos tecidos alvos (RYAN & ENNS, 1988; RAND et al.,
2004) e secundariamente por promover a liberação de GH pela glândula mamária (SELMAN et
al., 1994, RIJNBERK et al., 2003). O GH, um dos contra-reguladores da insulina, reduz a
concentração de receptores à insulina, reduzindo a captação de glicose nas células alvo
(MOLLER & FLIER, 1991). Contudo, Dominici et al. (2005) consideram a redução na
concentração do IR na membrana celular das células alvo, como conseqüência da down-
regulation decorrente da hiperinsulinemia devido à resistência insulínica gerada pelo GH. Os
efeitos lipolíticos do GH também são antagônicos aos efeitos da insulina (GANONG, 2005).
O reconhecimento da contra-regulação do GH sobre os efeitos da insulina data de
quase sete décadas, no entanto somente há pouco tempo os mecanismos moleculares envolvidos
na resistência insulínica promovida pelo GH tornaram-se conhecidos. Evidências acumuladas
sugerem que o GH modula a sensibilidade à insulina por múltiplos mecanismos, pois as vias de
47
sinalização intra-celular do GH e de seu principal efetor, o IGF-I, convergem com as vias de
sinalização da insulina (DOMINICI et al., 2005).
A exposição crônica a um excesso de GH está associada à redução na resposta à
insulina em termos de fosforilação do IR, IRS-1 e IRS-2, associação p85-IRS-1 e atividade da
PI3K no músculo esquelético. Em contraste, o excesso de GH leva a ativação crônica da via
IR/IRS-1/PI3K no fígado, bloqueando a ativação induzida pela insulina; sugerindo ser o fígado o
local primário de resistência à insulina frente ao GH. A inibição da sinalização da insulina no
músculo esquelético por exposição crônica ao GH parece envolver uma maior quantidade da
subunidade p85 da PI3K, uma proteína que exerce um papel negativo sobre a sinalização da
insulina. A modulação da ação da insulina pelo GH também parece envolver mecanismos de
atenuação do sinal da insulina como maior expressão de proteínas SOCS e maior fosforilação do
IRS-1 e resíduos de serina (Ser). A modulação da expressão de algumas adipocitocinas como a
adiponectina e visfatina também podem exercer um papel na resistência insulínica promovida
pelo GH (DOMINICI et al., 2005). A figura 4 ilustra as vias de sinalização cruzadas entre a
insulina, GH e IGFs envolvidas na resistência insulínica promovida pelo GH.
48
Figura 4 – Inter-relações entre a sinalização do GH, IGF-1 e insulina em células alvo
(DOMINICI et al, 2005).
Os avanços nas tecnologias disponíveis e nos estudos de manutenção nutricional do
paciente diabético, associados à maior consciência dos proprietários com relação à posse
responsável e ao maior cuidado dos veterinários com doenças concomitantes como as infecções
do trato urinário e de doenças periodontais, vêm contribuindo para o maior sucesso da terapia à
longo prazo dos animais diabéticos e conseqüente redução de mortalidade (GUPTILL et al.,
2002).
49
Ciclo Estral Canino
A cadela é considerada uma espécie monoéstrica sazonal, apresentando tipicamente
um ciclo estral a cada 7 meses, podendo haver intervalos interestrais de 4 a 13 meses em
decorrência de variações individuais, nutricionais, sazonais e raciais (HOFFMANN et al., 1996;
OLIVEIRA et al., 2003; FELDMAN & NELSON, 2004). O ciclo estral de uma forma geral é
caracterizado por 4 fases distintas (pró-estro, estro, diestro e anestro) e a duração de um ciclo
estral corresponde ao período entre o começo de um estro e a nova ocorrência de estro. O
intervalo inter-estral corresponde ao período entre o fim de um estro e o começo de um novo
pró-estro. As fases do estro e pró-estro assemelham-se à fase proliferativa (ou estrogênica) do
ciclo menstrual, enquanto a fase do diestro corresponde à fase secretora (ou lútea) do ciclo
menstrual (HOFFMANN et al., 1996; OLIVEIRA et al., 2003).
Apesar das cadelas apresentarem ciclos ovarianos ao longo do ano, há uma certa
preferência evolucionária por cios no final do inverno e começo da primavera, de forma a que
os filhotes nasçam em um ambiente mais favorável. À medida que os fêmeas caninas vão
envelhecendo (a idade ideal para procriação dura aproximadamente 7 anos) várias mudanças
podem ocorrer, como por exemplo, o progressivo aumento no intervalo inter-estral, redução no
tamanho das ninhadas, aumento na ocorrência de defeitos congênitos e problemas no parto.
Entretanto, cadelas saudáveis seguem ciclando durante toda a vida, diferentemente da espécie
humana que experimenta a menopausa (parada na atividade reprodutiva) (FELDMAN &
NELSON, 2004).
50
O pró-estro é o período de acentuada atividade folicular que precede o estro, quando os
machos são atraídos pelas fêmeas, no entanto elas recusam a cópula. O começo desta fase é
usualmente, e de forma mais confiável, definido quando sangramento vaginal inicia e termina
quando a fêmea permite que o macho monte e copule (RODRIGUES & RODRIGUES, 2002).
Critérios adicionais aplicados ao início e ao final do pró-estro incluem alterações nas paredes da
mucosa vaginal verificadas por endoscopia ou alterações na citologia esfoliativa das células do
epitélio vaginal (VANNUCHI et al., 1997). A duração desse período é normalmente entre 6 e
11 dias (média de 9), no entanto, variações de 2 a 25 dias podem ser observadas (HOFFMANN
et al., 1996; CONCANNOM et al., 1989).
No pró-estro, clinicamente fica marcante a atração dos machos pela a fêmea, em parte,
devido à secreção de feromônios, no entanto, não ocorre a monta. Ao longo do pró-estro, a
fêmea vai perdendo sua atitude anti-sexual e passa a ficar mais receptiva, já procurando e
brincando com os machos. A descarga vaginal sanguinolenta, freqüentemente observada nas
fêmeas durante o pró-estro, começa em decorrência da diapedese de eritrócitos a partir do
endométrio e do sub-epitélio vaginal por ruptura de capilares por influência do estrógeno. O
sangue desce pela cérvix que se encontra relaxada e escorre pela vulva. A vulva normalmente
encontra-se ingurgitada e aumentada de tamanho em decorrência do acúmulo de líquido, o que
ajuda a prevenir a penetração de um macho. Ao longo do pró-estro a vulva vai tornando-se mole
e suave (FELDMAN & NELSON, 2004).
A cadela em pró-estro está sob influência do estrogênio sintetizado e secretado pelos
folículos em desenvolvimento. Durante o final do anestro ocorrem pulsos de secreção de FSH e
51
LH em concordância. Durante o início do pró-estro há uma maior secreção de FSH,
acompanhada por uma maior secreção de LH (FELDMAN & NELSON, 2004). Os folículos que
se desenvolvem frente a estas gonadotropinas secretam estrógenos que participam na
manifestação dos sinais clínicos e comportamentais dessa fase, bem como na preparação uterina
para a gestação (THOMPSON, 2006). A concentração média de estrógeno durante o anestro
flutua entre 5 e 15 pg/mL, atingindo um pico de até 70 pg/mL entre 24 a 48 horas antes do
início do estro. O declínio na concentração sérica de estrógeno desencadeia o estro, retornando a
valores basais entre 5 e 20 dias, permanecendo neste patamar até a próxima fase folicular. A
concentração de progesterona em cadelas em anestro é pequena (basal, menor que 0,5 ng/mL),
permanecendo com valores menores que 1 ng/mL durante o pró-estro (9 dias) (OLIVEIRA et
al., 2003; FELDMAN & NELSON, 2004).
Diversos tecidos-alvo sofrem alterações frente ao aumento da concentração de
estrógeno no pró-estro. Estas incluem crescimento dos ductos e dos túbulos das glândulas
mamárias, engrossamento dos ovidutos e do endométrio, aumento na sensibilidade miometrial,
alongamento dos cornos uterinos, relaxamento da cérvix e proliferação do epitélio vaginal
(FELDMAN & NELSON, 2004). O principal marcador celular dos esfregaços vaginais do pró-
estro são os eritrócitos. No início desta fase a lâmina pode se assemelhar muito à do anestro em
função da presença de células parabasais, intermediárias, neutrófilos e bactérias. Com o avanço
do pró-estro deixa-se de observar neutrófilos na lâmina, uma vez que o espessamento do epitélio
não permite mais a passagem de leucócitos. As células epiteliais vão sendo substituídas por
células superficiais nucleadas e anucleadas e no final deste período cerca de 80% da lâmina
contém este padrão de células (VANNUCCHI et al., 1997).
52
A fase do estro é onde a fêmea permite a monta e a cópula do macho. O termo estro
deriva da palavra grega oistrus, significando “desejo veemente”. O primeiro dia em que a fêmea
aceita a monta marca o começo desta fase, que termina quando a fêmea refuga a monta pela
primeira vez. Nenhum outro critério define melhor esta fase (RODRIGUES & RODRIGUES,
2002; FELDMAN & NELSON, 2004). Os sinais clínicos do estro só ocorrem se tiver
acontecido um lento aumento na concentração de estrógenos seguida pelo declínio. Este
decréscimo na concentração de estrogênio reflete a maturação final dos folículos ovarianos,
alguns dias antes da ovulação. Os folículos ovarianos passam a sintetizar mais progesterona do
que o necessário para servir como precursor para síntese de estrógeno após dias do começo do
pró-estro (CONCANNOM et al., 1989). Em conjunto com a redução na concentração de
estrógeno, que começa nas 24-48 horas prévias ao estro, concentrações cada vez maiores de
progesterona são observadas no plasma, mantendo-se maior que 2 ng/mL em decorrência da
luteinização de células foliculares adicionais. A concentração de progesterona continua
aumentando durante o estro e as primeiras semanas do diestro (OLIVEIRA et al., 2003). Este
panorama hormonal (redução no estrógeno e elevação da progesterona) é responsável por dois
eventos importantes: (1) a mudança comportamental (i.e. aceitação do macho), ocasionada pela
elevação e posterior redução da concentração de estrógenos. (2) a intensa retroalimentação no
hipotálamo e hipófise, resultante da redução na concentração do estrógeno e elevação da
concentração da progesterona, levando à secreção de FSH e principalmente de LH no estro
(CONCANNOM et al., 1989).
53
Desta forma tem-se um aumento da concentração de progesterona antes da formação
de um corpo lúteo, o que reforça a idéia de que células foliculares são capazes de secretar
progesterona ainda no pró-estro (HOFFMANN et al., 1996; THOMPSON, 2006). A
progesterona é importante para manter e intensificar o comportamento de aceita da monta,
característico do estro. A liberação de LH estimulada pela alteração na relação
estrógeno/progesterona estimula a ovulação dentro de 24 a 48 horas, e logo após ocorre a
formação do corpo lúteo (CONCANNOM et al., 1989). Antes da formação do corpo lúteo,
cerca de dois dias depois da ovulação, a concentração de progesterona normalmente está entre 4
e 10 ng/mL. Quando a concentração de estrógeno fica abaixo dos valores basais (15 pg/mL) o
estro termina (HOFFMANN et al., 1996; FELDMAN & NELSON, 2004). Isto se reflete no
comportamento da fêmea, que passa a rejeitar a monta agressivamente. Também observa-se
uma redução na incidência de células superficiais na avaliação da citologia vaginal, bem como
redução na largura do epitélio vaginal e no tamanho da vulva. Nesta fase as fêmeas não mais
atraem os machos (VANNUCCHI et al., 1997; RODRIGUES & RODRIGUES, 2002).
As alterações hormonais que ocorrem no estro também se refletem no trato genital da
fêmea. A ovulação ocorre de 24 a 72 horas após o pico de LH, e o número de oócitos primários
(1 a 15) liberados depende de diversos fatores, sendo a raça um dos mais importantes
(HOFFMANN et al., 1996; OLIVEIRA et al., 2003). A cadela é uma das únicas espécies que
ovula oócitos primários, que sofrerão meiose somente na luz uterina (THOMPSON, 2006). A
ruptura de todos os folículos ovulatórios demora de 12 a 96 horas. No entanto, apesar deste
processo não ser perfeito (sincronia de ovulação), os oócitos liberados em momentos diferentes
estão no mesmo estágio de desenvolvimento, o que garante que o desenvolvimento embrionário
54
de todos os fetos ocorra de forma similar (FELDMAN & NELSON, 2004). Os folículos
rompidos luteinizam rapidamente e sofrem uma reorganização que dá origem ao corpo lúteo
capaz de manter a síntese de progesterona por 2 meses ou mais (RODRIGUES &
RODRIGUES, 2002). Durante este período o útero continua sua preparação para a implantação.
O sangramento a partir do endométrio usualmente cessa, contudo, o desenvolvimento glandular
e o aumento na irrigação endometrial ainda não estão completos (FELDMAN & NELSON,
2004).
A duração do estro é de usualmente 5 a 9 dias, no entanto, variações de 1 a 20 dias já
foram observadas (CONCANNOM et al., 1989; HOFFMANN et al., 1996; OLIVEIRA et al.,
2003). De uma forma resumida; no primeiro dia do estro há aumento dos valores de
progesterona e redução nos níveis de estrógeno, resultando no comportamento passivo frente ao
macho, o dia 2 do estro está associado ao pico de LH, sendo o dia 3 o de maturação final dos
folículos. A ovulação ocorre entre os dias 4 e 7, enquanto entre os dias 5 e 9 ocorre a maturação
dos oócitos primários em oócitos secundários que podem se fertilizados. O dia 10 normalmente
é o primeiro dia do diestro (HOFFMANN et al., 1996; FELDMAN & NELSON, 2004).
A citologia vaginal do estro é relativamente constante, com as células superficiais e
escamas anucleadas respondendo por 80 a 100% das células observadas no esfregaço. Não são
observados neutrófilos e eritrócitos são raros (VANNUCCHI et al., 1997). A secreção vaginal
observada nesta fase pode apresentar glicose em decorrência da intolerância aos carboidratos
induzida pela progesterona (FELDMAN & NELSON, 2004).
55
O diestro é definido como a fase de predomínio da progesterona após o estro; onde a
fêmea esta “fisiologicamente grávida”. Esta fase começa com a recusa de cópula e termina
quando a concentração sérica de progesterona declina a valores menores que 1 ng/mL,
sinalizando um retorno à fase de repouso do eixo hipófise-ovário (RODRIGUES &
RODRIGUES, 2002; OLIVEIRA et al., 2003). Após a síntese do corpo lúteo a concentração de
progesterona continua aumentando durante as primeiras duas a três semanas de diestro,
seguindo-se um platô (valores entre 15 – 90 ng/mL) por mais uma a duas semanas
(HOFFMANN et al., 1996; FELDMAN & NELSON, 2004).
As fêmeas nesta fase, mesmo não prenhes, são consideradas “pseudogestantes”, uma
vez que não há um sistema de reconhecimento da gestação na espécie canina. Desta forma, o
corpo lúteo permanece ativo o tempo de uma gestação, apesar de não haver fetos (THOMPSON,
2006). Na verdade o corpo lúteo da fêmea não prenhe é funcional por mais tempo (10 a 30 dias
a mais) que o corpo lúteo de uma fêmea gestante, que é abruptamente lisado por ação das
prostaglandinas no processo do parto. Evidencias apontam as prostaglandinas como único fator
luteolítico, tanto em cadelas prenhes como em “pseudogestantes” (FELDMAN & NELSON,
2004). O LH é luteotrófico, mantendo a função do corpo lúteo canino especialmente na primeira
fase do diestro. O aumento na concentração plasmática de prolactina aparece como um fator
luteotrófico na segunda metade do diestro (HOFFMANN et al., 1996; RODRIGUES &
RODRIGUES, 2002). O aumento da prolactina, associado com uma leve redução na
progesterona estimula a lactação e galactorréia em muitas fêmeas caninas. Algumas fêmeas
podem apresentar comportamento maternal, onde adotam e protegem filhotes de outros cães,
56
animais de outras espécies ou até mesmo objetos inanimados em um quadro clínico determinado
de pseudociese (OLIVEIRA et al., 2003).
Foram demonstradas alterações no padrão de secreção pulsátil de GH durante o
diestro, com maiores concentrações séricas com menos pulsos (KOOISTRA et al., 2000). Este
fenômeno é provavelmente causado por uma supressão parcial da liberação de GH pela hipófise
em decorrência da produção mamária de GH induzida pela progesterona. Este GH mamário,
além de efeitos autócrinos e parácrinos sobre a glândula mamária (proliferação e diferenciação
da glândula durante o diestro) também apresenta um papel endócrino sobre as transformações
hiperplásicas do endométrio e na resistência à insulina (SELMAN et al., 1994; KOOISTRA et
al., 2000). Apesar de se considerar o perfil hormonal de cadelas prenhes e não-prenhes
semelhante; nas prenhes observa-se maiores concentrações de relaxina de origem placentária,
entre a sexta e a sétima semana de gestação. Neste período, nas prenhes, também observa-se um
aumento súbito na concentração de estrógeno; que era basal desde o final do estro. Estas
alterações estão envolvidas no começo do parto (FELDMAN & NELSON, 2004).
Durante a fase lútea do ciclo, a progesterona promove e mantêm o crescimento
endometrial e a atividade glandular, suprime a atividade do miométrio e a função leucocitária
intra-uterina, fatores importantes para a manutenção da gestação, independente da presença de
fetos (THOMPSON, 2006). O tamanho máximo do útero não gestante é atingido cerca de 20 a
30 dias após o início do cio, coincidindo com o período de maior secreção de progesterona. Ao
final do diestro a involução uterina demora de 1 a 3 meses, representando um dos possíveis
fatores envolvidos no período inter-estral relativamente grande da espécie (FELDMAN &
57
NELSON, 2004). A duração do diestro normalmente fica entre 56 e 58 dias em fêmeas prenhes
e de 60 a 100 dias em não prenhes (RODRIGUES & RODRIGUES, 2002).
A citologia vaginal, já no primeiro dia do diestro, apresenta um predomínio de células
intermediárias e parabasais, evidenciando uma mudança súbita no perfil hormonal, com
algumas células escamosas e superficiais (cerca de 20%). Também aumenta a presença de
neutrófilos no esfregaço vaginal. Algumas células características desta fase (chamadas de célula
do metaestro, que são células intermediárias com um neutrófilo intra-celular) podem ser
observadas também. A presença de grupos de células parabasais é comum. Ao final do diestro, a
citologia vaginal assemelha-se a observada no anestro (VANNUCCHI et al., 1997).
Por definição, a fase do anestro é a fase de involução uterina. Clinicamente não há
nenhuma alteração que permita distinguir o término do diestro e início do anestro em fêmeas
não prenhes. Nas fêmeas prenhes, o anestro vai do parto até o próximo pró-estro, com uma
duração média de 4,5 meses; uma vez que a fêmea tipicamente apresenta um pró-estro a cada 7
meses (RODRIGUES & RODRIGUES, 2002). Do ponto de vista endócrino; detectam-se alguns
picos de FSH e LH durante o anestro. O pico de LH precede o pró-estro, enquanto os aumentos
esporádicos de FSH estão envolvidos com o recrutamento de folículos para o próximo ciclo
(THOMPSON, 2006). Também ocorrem picos na concentração basal de estrógeno como
decorrência das ondas foliculares estimuladas pelo FSH (THOMPSON, 2006). Em contraste, a
progesterona permanece em concentrações normalmente inferiores a 0,5 ng/mL (FELDMAN &
NELSON, 2004).
58
Complexo Hiperplasia Endometrial Cística - Piometra
O complexo da hiperplasia endometrial cística – piometra (HEC-P) é uma enfermidade
mediada por hormômios, ocorrendo tipicamente no diestro. O termo piometra designa uma
infecção intra-uterina bacteriana purulenta, que resulta em bacteremia e toxemia moderada a
severa com risco de vida se não tratada (NOAKES et al., 2001; NISKAMEN & THRUSFIELD,
1998). Geralmente, o útero sofre uma condição patológica prévia à infecção bacteriana
(piometra). Esta condição é chamada hiperplasia endometrial cística (HEC). Assume-se que a
HEC seja causada, em parte, por uma resposta uterina anormal à exposição crônica e repetida à
progesterona (SMITH, 2006). Mesmo assumindo-se que a HEC predispõe à piometra; pode
haver piometra sem ocorrência prévia de HEC, o que motiva discussões com relação à
classificação do complexo hiperplasia endometrial cística - piometra como duas entidades
diferentes (HEC ou piometra) (BOSSCHERE et al., 2002; BIGLIARDI et al., 2004).
Após a ovulação (9 a 12 semanas) a concentração de progesterona mantém-se em
valores superiores a 40 ng/mL, enquanto no anestro, a concentração não ultrapassa 0,5 ng/mL.
Durante esta fase a progesterona promove e suporta o crescimento endometrial e a secreção
glandular, ao mesmo tempo em que suprime a atividade miometrial; permitindo o acúmulo de
secreções glandulares no útero. Estas secreções são um excelente meio de cultura para o
crescimento bacteriano, sendo o quadro agravado pela inibição da resposta leucocitária uterina
por ação da progesterona. Freqüentemente, as bactérias envolvidas no quadro patológico da
piometra são as mesmas observadas na flora vaginal (SMITH, 2006). Essas bactérias passam
através da cérvix e são encontradas dentro do útero durante as fases do pró-estro e estro. No
59
entanto, além da presença das bactérias e de um útero marcado pela progesterona, outros fatores
agem para que ocorra a síndrome, uma vez que nem todas as cadelas em diestro sofrem dessa
afecção (FELDMAN & NELSON, 2004; SMITH, 2006).
Durante o diestro, ocorre uma hiperplasia do endométrio induzida pela progesterona.
Nesta fase do ciclo estral, as glândulas endometriais sofrem hiperplasia e hipertrofia, tornando-
se convolutas e revestidas de epitélio colunar alto. Este epitélio sofre uma lenta degeneração
gordurosa à medida que glicogênio vai sendo sintetizado e armazenado (GALABOVA et al.,
2003). Van Cruchten et al. (2004) demonstraram alterações no estroma, vasos sangüíneos e
criptas durante a proliferação do endométrio. No entanto, quando a hiperplasia torna-se
patológica aparecem cistos. O epitélio da mucosa torna-se tortuoso e com citoplasmas
hipertróficos e claros. O estroma torna-se edematoso e um infiltrado inflamatório está
invariavelmente presente (Van CRUCHTEN et al., 2004).
Em cadelas saudáveis, ocorre uma “down-regulation” dos receptores de estrógeno
(ER) frente às concentrações crescentes de progesterona. Entretanto, este mecanismo parece
falhar em cadelas com HEC, onde a expressão do ER não sofre alterações significativas
(DHALIWAL et al., 1999). Como conseqüência, o endométrio continua responsivo a pequenas
flutuações de estrógenos; o que pode resultar em proliferação das glândulas endometriais
durante um estágio onde há uma forte influência da progesterona (BOSSCHERE et al., 2002).
Ververidis et al., (2004) concluíram que a progesterona é o principal hormônio envolvido tanto
na regulação de receptores de estrógeno como de progesterona durante o diestro e o anestro em
úteros saudáveis e afetados pela síndrome. No entanto, os valores elevados de progesterona
60
durante o diestro em cadelas com HEC-P aparentemente leva a uma forte down-regulation dos
PR e também dos ER (VERVERIDIS et al., 2004).
De Cock et al. (2002) propuseram um papel para o IGF-I na patogênese da HEC, uma
vez que foi observada maior concentração deste fator de crescimento na superfície endometrial;
epitélio glandular e estroma em cadelas com HEC comparadas àquelas do grupo controle. A
regulação da produção de IGF-I, localmente, dá-se por uma fina interação entre estrógeno e
progesterona. O IGF-I pode modular a resposta desses hormônios no útero. Um possível papel
do GH sobre a regulação do IGF-I local uterino é pouco provável (De COCK et al., 2002).
Kooistra et al., (1997) demonstraram não haver relação entre produção local de GH no
desenvolvimento da HEC.
A superfície apical das células epiteliais do lúmen uterino é recoberta por mucinas, que
agem lubrificando e protegendo a mucosa contra infecções microbianas (ISHIGURO et al.,
2007). A Muc1 é uma mucina trans-membrana da superfície celular; sendo um dos principais
componentes do glicocálix, atuando como uma molécula anti-adesiva. Especula-se que a Muc1
sofra uma down-regulation no período de implantação do embrião (ISHIGURO et al., 2007).
Esta hipótese foi suportada pelo fato da Muc1 sofrer uma down-regulation por volta do décimo
dia do diestro. Nesta fase do diestro também foram demonstrados elevados valores de
progesterona e maior aderência e crescimento de bactérias no epitélio uterino. Fora deste
período (fase inicial do diestro) observam-se valores de Muc1 constantes. No entanto, foi
demonstrada a redução na expressão da Muc1 em cadelas com piometra. Desta forma a down-
regulation da Muc1 promovida pela progestrona pode ser um fator importante na evolução da
61
piometra; uma vez que um útero mais sensível a progesterona pode permitir um maior
crescimento bacteriano em decorrência da menor expressão de Muc1 (ISHIGURO et al., 2007).
Leitner et al. (2003) identificaram reduzidos índices de ligação de lectinas (boa
ferramenta para identificar glicoconjugados) no endométrio de cadelas com HEC-P,
possivelmente em decorrência de exaustão glandular após a HEC. A aderência bacteriana aos
resíduos de açúcares na HEC-P também justifica a reduzida ligação das lectinas. As alterações
que começam com a HEC, caracterizada por excessiva produção de glicoconjugados, podem
levar a piometra promovendo um ambiente favorável para adesão e crescimento bacteriano após
exaustão glandular, uma vez que os resíduos de açúcares na superfície apical das células
funcionam como sítios alvo para aderência bacteriana (LEITNER et al., 2003).
A aderência das bactérias depende da presença de certos carboidratos no glicocálix e
observou-se uma inibição na produção e na expressão de carboidratos no início do diestro,
contrariamente a outras fases (fim do diestro e anestro). Contudo, a presença de hialuronidase
(enzima que degrada glicoproteínas) aumenta pouco a aderência bacteriana o que reflete a
diversidade de atividade de enzimas e a complexidade destas interações sobre os vários tipos de
mucinas (ISHIGURO et al., 2007).
A hiperplasia endometrial, ocasionalmente, resulta no acúmulo de fluído fino ou
viscoso dentro do útero (FELDMAN & NELSON, 2004). A presença deste fluído no útero
recebe o nome de hidrometra ou mucometra conforme o conteúdo de mucina do fluído. A
piometra é a complicação mais comum da HEC; que também pode causar, porém menos
62
freqüentemente; infertilidade ou endometrite crônica. O diagnóstico de HEC é pouco comum
pois os sintomas só aparecem após a contaminação do fluído uterino (piometra) (FELDMAN &
NELSON, 2004).
As bactérias mais comumente encontradas são as observadas na flora vaginal, como a
E.coli, que ascendem ao útero durante as fases do pró-estro e do estro. Estafilococcos,
estreptococcos, Klebsiela, Pseudomonas, Proteus, Haemophilus, Pasteurela, Serratia e outras
bactérias já forma isoladas de úteros de cadelas com piometra (FELDMAN & NELSON, 2004;
WEISS et al., 2004). Outras fontes de contaminação uterina foram sugeridas; como as infecções
urinárias e/ou bacteremias concomitantes (SMITH, 2006). A presença prévia da HEC, elevação
da concentração de progesterona no diestro, ou ainda uso de progestágenos ou estrógenos
exógenos são alguns fatores que quando presentes contribuem ao desenvolvimento de piometra
(NOAKES et al., 2001).
A bactéria predominante E.coli pode aderir ao endométrio e miométrio via sítios
antigênicos específicos estimulados pela progesterona. Endotoxinas lipopolisacarídicas (LPS),
quimicamente estáveis e biologicamente ativas estão presentes na membrana celular da E.coli.
Esta endotoxina é liberada quando a bactéria morre e se desintegra. Endotoxemia clínica ocorre
quando a concentração sérica de LPS ultrapassa 0,05 ng/mL. A dose letal é de 0,7 ng/mL. Os
sinais clínicos de endotoxemia (hipotermia, desorientação e sinais de choque séptico) podem
piorar frente ao uso de antibióticos, uma vez que supostamente estão promovendo um aumento
na mortalidade bacteriana (FELDMAN & NELSON, 2004).
63
A HEC-P, tradicionalmente, trata-se de uma doença de prevalência em cadelas de
meia-idade ou idosas, com mais de 6 anos de idade. Tratar-se de um quadro cumulativo
decorrente de anos de exposição e de estimulação do útero pela progesterona, como parte de
cada ciclo ovariano (SMITH 2006). Também um grande número de fêmeas apresentam a HEC-
P jovens, algumas após o primeiro cio. A ocorrência deste quadro em cadelas jovens não pode
ser explicada por exposição crônica à progesterona e freqüentemente é associada ao uso de
progestágenos como anticoncepcionais, ou de estrógenos como abortivos / inibidores da
implantação após uma cópula indesejada (NOAKES et al., 2001; SMITH 2006). O estradiol
estimula o aumento do número de receptores de progestágenos no útero, tornando-o hiper-
responsivo à progesterona (FELDMAN & NELSON, 2004). Apesar disto, observa-se fêmeas
jovens com piometra que jamais foram expostas aos hormônios exógenos, em decorrência de
cistos ovarianos foliculares (FAYRER-HOSKEN et al., 1992) ou ainda sem nenhuma condição
patológica associada.
Provavelmente outros fatores além dos acima citados estão envolvidos na evolução da
HEC-P; como por exemplo, a competência imunológica da fêmea, a virulência da cepa
bacteriana presente no útero e a sensibilidade do útero aos efeitos da progesterona (FELDMAN
& NELSON, 2004). Algumas raças apresentam maior risco de desenvolver piometra; como por
exemplo, o Rottweiller, São Bernardo, Collies, Golden Retrivers. Outras raças como o
Dashchund e cães sem raça definida apresentam risco reduzido de desenvolvimento de HEC-P
(NISKEM & THRUSFIELD, 1998).
64
Niskem & Thrusfield (1998) em estudo realizado na Finlândia, observaram que fêmeas
nulíparas apresentam um risco maior de desenvolver piometra que fêmeas primíparas ou
multíparas (odds ratio ajustado 6,63) e que a idade média de desenvolvimento de piometra seria
por volta dos 9 anos. Dow (1959) observou que cerca de 75% das fêmeas com piometra eram
nulíparas. A administração de estrógenos aumentou a chance de cadelas com mais de 4 anos
desenvolverem piometra em mais de seis vezes. Nenhum risco significativo foi observado em
decorrência de tratamentos com acetato de medroxiprogesterona (progestina mais usada nas
rotinas clínicas) desde que a dose (1 a 5 mg/kg) e o intervalo de aplicação (semestral) sejam
respeitados (Niskem & Thrusfield, 1998), uma vez que nos modelos de indução de HEC as
doses são maiores (10 mg/kg) e os intervalos menores (cada 3 semanas) (KOOISTRA et al.,
1997).
Pacientes com piometra de cérvix aberta apresentam descarga vaginal sanguinolenta a
muco-purulento de 4 a 8 semanas após o estro (SMITH 2006). Outros sinais incluem poliúria,
polidipsia, letargia, depressão, inapetência, vômitos e diarréia. No entanto, as cadelas com
piometra de cérvix aberta freqüentemente apresentam-se com um bom aspecto geral apesar da
descarga vaginal (FELDMAN & NELSON, 2004). As fêmeas com piometra de cérvix fechada,
freqüentemente apresentam-se bastante debilitadas em decorrência da ausência de um sinal
clínico que indique aos proprietários algum problema (WEISS et al., 2004; SMITH 2006).
Nestes casos, a queixa do proprietário normalmente refere à perda de apetite, poliúria,
polidipsia, letargia, depressão, aumento de volume abdominal e perda de peso. Ocasionalmente,
ocorre a abertura da cérvix após o desenvolvimento de sinais clínicos mais severos, observando-
se intensa descarga vaginal (FELDMAN & NELSON, 2004).
65
Estes sinais associados aos vômitos e à diarréia podem evoluir para septicemia
progressiva e toxemia, com conseqüente desidratação progressiva, choque, coma e morte caso o
animal não for tratado (SMITH 2006). A severidade do quadro depende da capacidade do
proprietário em observar precocemente sinais que possam indicar a presença de um quadro
patológico como a piometra. Apesar da possibilidade de tratamento clínico com moduladores da
atividade do miométrio e de antibióticos, nenhum tratamento é mais efetivo do que a castração
(ovário-salpingo-histerectomia) (CORRADA et al., 2006; GOBELLO 2006; FIENE 2006,
SMITH 2006).
Não é possível correlacionar agente etiológico, grau de lesão uterina e dosagens
hormonais com a ocorrência de piometra de cérvix aberta ou fechada (WEISS et al., 2004). A
ultra-sonografia apresenta-se como a melhor ferramenta auxiliar no processo de diagnóstico;
permitindo inclusive, de acordo com experiência do ultra-sonografista e a qualidade do
aparelho, distinguir os diferentes tipos de classificação da HEC-P propostas por Dow (1959ab) e
Bosschere et al. (2002).
Resposta Inflamatória e a Sensibilidade à Insulina
A ocorrência da síndrome sepse associada a piometra é bastante comum e os sinais
cardeais desta síndrome resumem-se a (1) taquipnéia ou taquicardia, (2) hipertermia ou
hipotermia, (3) leucocitose ou (4) leucopenia (BLACKWELL & CHRISTMAN, 1996; BASSO
et al., 2006). A dosagem da proteína C reativa é um indicador de diagnóstico e prognóstico
66
nesses casos, por se tratar de uma proteína de fase aguda de inflamação. A determinação da
proteína C reativa permite a diferenciação entre HEC e piometra com 97% de probabilidade
quando associada aos sinais clínicos e a presença de desvio neutrofílico à esquerda no
hemograma (FRANSSON et al., 2004).
Ao longo dos últimos anos, o conhecimento das interações entre o sistema imune e o
sistema endócrino tem aumentado, sendo a interação entre a IL-1 e o metabolismo da glicose um
dos principais exemplos (BESEDOWSKI & Del REY, 1989). A citocina IL-1β reduz a ligação e
a fusão de grânulos secretores de insulina em células β pancreáticas, com decréscimo
preferencial da primeira fase de exocitose; característica da fase pré-diabética do diabetes (DM)
tipo I (OHAHA-IMAIZUMI et al., 2004). O fenômeno da glicotoxicidade parece envolver a
produção de IL-1β pelas células β pancreáticas em resposta à hiperglicemia (MAEDLER et al.,
2002). Também foi demonstrado o papel da IL-1 na estimulação de necrose das células β
pancreáticas (STEER et al., 2006) e a predisposição à maior vulnerabilidade das células β à
destruição auto-imune (WACHLIN et al., 2003).
Durante o desenvolvimento do DM tipo I diversas citocinas como a IL-1, IFN-γ e
TNF-α medeiam a disfunção e a degeneração das células β, em parte pela indução da óxido
nítrico sintase (iNOS) e produção de NO pelas células β (HEITMEIER et al., 2004). A
destruição imumomediada das células β segue dois passos básicos. Um evento inicial que
resulta na liberação de antígenos específicos pelas células β e posteriormente a morte celular
mediada pela ação dos linfócitos T. A IL-1 está envolvida na liberação do antígeno HMGB1 e
conseqüente na indução da morte celular imunomediada (STEER et al., 2006)
67
A sinalização inflamatória apresenta vias cruzadas com a sinalização da insulina, sendo
o IRS-1 um dos pontos onde a interação entre estas duas vias pode ocorrer, ajudando na
explicação da resistência à insulina em processos inflamatórios, como por exemplo, a
fosforilação do IRS-1 em resíduos de serina (KIM et al., 2005). Estudos demonstram uma
inibição da fosforilação do IRS-1 e associação com o fosfatidilinositol 3-quinase em resposta a
IL-1α em adipócitos (HE et al., 2006). Jager et al. (2006) demonstraram uma menor expressão
do IRS-1 induzida pela IL-1β.
A ativação do NF-κB, bem como elevadas concentrações e/ou ativação de substâncias
como o fator de inibição de migração (MIF), fator de necrose tumoral (TNF), IL-1, IL-6, radicais
livres, óxido nítrico indúzivel (iNO) e a hiperglicemia de estresse, são alguns dos fatores que
induzem a resposta inflamatória e a redução da função do miocárdio observada em quadros
sépticos. A insulina, assim como outras substâncias, apresenta a habilidade de suprimir a síntese
de MIF, TNF, IL-1, IL-6 e de radicais livres, e aumentar a produção de interleucinas anti-
inflamatórias como IL-10 e IL-4. Além do mais, a insulina corrige a hiperglicemia induzida por
estresse e melhora a função do miocárdio (DAS, 2003); o que suporta o uso clínico de insulina
com ou sem potássio não só no controle glicêmico, mas também como um modulador do
processo inflamatório (DAS, 2003b). Contudo, pacientes em choque séptico podem apresentar
hiperinsulinemia em decorrência da resistência à insulina induzida pelo quadro inflamatório
(KOGIKA et al., 2001). Os mediadores da resposta inflamatória (TNF-α, IL-1 e IL-6) iniciam
mudanças metabólicas no organismo para suprir de nutrientes o sistema imune. Estas mudanças
incluem hiperlipidemia e aumento da atividade gliconeogênica (GRIMBLE, 2002). No sistema
68
nervoso central a IL-1 reduz o ponto de ajuste da glicemia, promovendo hipoglicemia. Esta
regulação negativa do glucostato hipotalâmico, associado as ações periféricas da IL-1 podem
favorecer a captação de glicose pelas células imunes durante a resposta inflamatória (Del REY,
2006).
Estados inflamatórios crônicos como a periodontite, doença mais freqüente em cães,
atingindo cerca de 80% da população canina, aumentam os níveis plasmáticos de IL-1β e TNF-
α. Estas citocinas podem induzir resistência à insulina, como observada no diabetes. Também
essas substâncias estariam envolvidas no início da destruição imunomediada das células β
(IACOPINO 2001). Syrenicz et al., (2006) demonstraram que estados inflamatórios sub-clínicos
são importantes coadjuvantes na etiologia do diabetes, especialmente do DM tipo II, uma vez
que estão associados a fatores como resistência à insulina, valores elevados de HbA1c,
dislipidemia, hipertensão, histórico familiar de DM tipo II, sedentarismo e dieta rica em gordura
e em carboidratos.
Krook et al. (1960) observaram uma maior prevalência de piometra e de diabetes em
cães com sobrepeso ou obesos. A maior interconversão de hormônios esteróides sexuais pelo
tecido adiposo, bem como o estado pró-inflamatório encontrado em pacientes obesos em
decorrência de diversas citocinas inflamatórias produzidas pelos adipócitos, poderiam estar
associadas a maior prevalência de piometra em pacientes com elevada adiposidade (COSTA &
DUARTE, 2006; TILG & MOSCHEN, 2006).
69
OBJETIVOS
Este estudo tem como objetivo geral avaliar a influência das diferentes fases do ciclo
estral e do complexo hiperplasia endometrial cística – piometra sobre a sensibilidade à insulina,
em fêmeas caninas atendidas na rotina do Hospital de Clínicas Veterinárias da Universidade
Federal do Rio Grande do Sul.
Objetivos Específicos
Para atingir o objetivo principal do estudo, os seguintes objetivos específicos foram
estabelecidos:
1. Avaliar parâmetros de patologia clínica como hematologia e dosagem de metabólitos
sangüíneos como lipídeos e proteína glicosilada.
2. Avaliar a sensibilidade à insulina em cadelas em anestro, estro e diestro ou com HEC-
piometra por meio de teste de tolerância intravenoso à glicose (IVGTT) e cálculo de
índices de sensibilidade à insulina e funcionalidade das células β.
3. Avaliar a concentração de glicogênio muscular das pacientes dos diferentes grupos
experimentais como indicador do efeito metabólico celular da insulina.
70
4. Estimar a capacidade de ligação à insulina e constantes de dissociação hormônio-
receptor da insulina em tecido muscular esquelético das pacientes nos diferentes grupos
de estudo por meio de estudos de binding.
5. Determinar a capacidade de fosforilação do receptor insulínico por meio da fosforilação
do substrato sintético Poly (Glu;Tyr).
71
MATERIAIS E MÉTODOS
Delineamento Experimental
Estudo transversal controlado em fêmeas caninas apresentadas para atendimento por
preocupação de seus proprietários com relação à “castração” (ovário-salpingo-histerectomia -
OSH); ou pela apresentação de um quadro clínico de hiperplasia endometrial cística – piometra
(HEC-P).
As pacientes foram dividas em grupos (Figura 5), conforme o estágio do ciclo estral
(anestro, estro ou diestro) ou condição patológica (hiperplasia endometrial cística (HEC) ou
grupo piometra).
Figura 5. Divisão dos grupos de estudo.
Pacientes
Grupo Ciclo
Estral
Grupo HEC-P
Grupo Anestro Grupo Estro Grupo Diestro Grupo HEC
Grupo Piometra
72
Animais
Cinqüenta e sete cadelas foram avaliadas para participação no estudo no período de 23
de janeiro de 2006 a 18 de janeiro de 2007 no Hospital de Clínicas Veterinárias (HCV) da
Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS). Destas; trinta e oito pacientes foram
avaliadas na ação de extensão universitária Controle Reprodutivo de Cães e Gatos (Registro nº
00007195/116, Proc. 230780049710662 Pró-Reitoria de Extensão / UFRGS) realizada no HCV
/ UFRGS, sendo dividas em anestro, estro ou diestro conforme histórico reprodutivo, exame
físico, citologia vaginal e resultados de histopatologia uterina. As demais dezoito pacientes
foram avaliadas na rotina de atendimentos do HCV / UFRGS, após o diagnóstico de HEC-P,
sendo posteriormente divididas nos grupos HEC ou piometra conforme resultados da
histopatologia uterina segundo critérios sugeridos por Dow (1957); sendo os estágios I e II
considerados como HEC somente, e os estágios III e IV considerados como piometra.
Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa desta Universidade
(CEP/UFRGS - projeto nº 2006622) e pela Comissão de Pesquisa do Instituto de Ciências
Básicas da Saúde (COMPESQ/ICBS) sob Processo protocolo número 23078.021084/06-40. A
realização deste estudo no referido hospital também estava de acordo com a Direção da
entidade.
Foram aplicados como critérios de inclusão para o grupo ciclo estral os seguintes
aspectos: peso superior a 6 kg; hemograma sem alterações, ausência de doenças ou uso
concomitante de medicamentos, condição corporal eutrófica e não exposição a progestágenos ou
73
estrógenos exógenos nos últimos 6 meses. Para o grupo HEC-P além de peso superior a 6 kg,
ausência de doenças concomitantes, condição corporal eutrófica e não exposição a
progestágenos ou estrógenos exógenos nos últimos 6 meses. Também foram adotados como
critérios de inclusão neste grupo, hemograma com leucocitose e neutrofilia, e não uso de
soluções glicosadas no tratamento inicial do complexo HEC-P. Uso de antibióticos após o
diagnóstico inicial não foi considerado critério de exclusão.
Após avaliação criteriosa do total de 57 pacientes, 13 animais foram excluídos do
banco de dados inicial, permanecendo as demais 44 assim distribuídas, conforme histórico
reprodutivo e resultados de citologia vaginal e histopatologia uterina: grupo anestro (n = 11
animais); grupo estro (n = 7 animais); grupo diestro (n = 14 animais); grupo HEC ( n = 5
animais) e grupo piometra (n = 12 animais).
Protocolo Experimental
Os animais que chegavam para consulta pela ação de Controle Reprodutivo de Cães e
Gatos passavam por uma avaliação clínica, e os proprietários respondiam à anamnese e a um
questionário com informações a respeito da vida pregressa do animal com relação a histórico
reprodutivo, histórico alimentar, histórico de saúde e nível de atividade física (anexo 1). Nesta
ocasião apresentava-se o presente projeto de pesquisa aos proprietários dos animais, e a
autorização para a participação da paciente no projeto, era feita por meio de termo de
consentimento informado (anexo 2). As pacientes com diagnóstico de HEC-P, atendidas no
HCV-UFRGS no período de realização do estudo, que se enquadravam nos critérios de inclusão
74
tinham a participação autorizada pelos donos por meio do mesmo termo de consentimento
informado. Esses proprietários também foram questionados com relação às informações do
anexo 1, quando estas não haviam sido coletadas no prontuário de atendimento inicial da
paciente.
Após esta avaliação inicial; as pacientes do grupo ciclo estral passavam por uma ultra-
sonografia para confirmação de que não estavam prenhes, quando o histórico reprodutivo
suportasse esta hipótese, e em seguida era feita uma colheita de cerca de 3 mL sangue a partir da
veia jugular, em tubo com EDTA para determinação de hemograma, plaquetometria (avaliação
pré-operatória) e fibrinogênio; e outros 2 mL de sangue em tubo sem anti-coagulante (obtenção
de soro) para determinações bioquímicas. Neste momento também era realizada uma citologia
vaginal para determinação da fase do ciclo estral em que estava a paciente. As pacientes com
diagnóstico de HEC-P também passaram por ultra-sonografia abdominal para confirmação do
quadro patológico, coleta de sangue e citologia vaginal.
Uma vez realizada a avaliação inicial e com os resultados dos exames preliminares das
pacientes era marcada uma data para realização da OSH eletiva ou como parte do tratamento da
HEC-P. No pré-operatório foi realizado um teste de tolerância intravenoso a glicose, com as
pacientes mantidas acordadas e sem nenhuma sedação, sendo posteriormente durante o
procedimento operatório, coletados tecidos para posterior estudo sobre as características dos
receptores insulínicos.
75
Determinações Hematológicas
Todas determinações hematológicas forma realizadas no Laboratório de Análises
Clínicas Veterinárias do HCV/UFRGS (LACVet). A quantidade total de eritrócitos, leucócitos e
hemoglobina foi determinada por diluição do sangue e leitura em contador automático (Celm
CC-530, São Paulo, Brasil). O hematócrito foi obtido por centrifugação do sangue total em tubo
capilar (10.000 rpm por 5 minutos). Os valores de VGM e CHGM foram calculados (THRALL,
2004). A leucometria diferencial foi determinada por leitura de esfregaço sangüíneo corado pelo
método Panótico rápido. A proteína plasmática total foi determinada por refratometria. A
plaquetometria foi determinada a partir de contagem em câmara de Neubauer.
Citologia Vaginal
A citologia vaginal foi realizada conforme descrito por Vannucchi et al. (1997). Uma
haste plástica (swab) com ponta recoberta de algodão era umidificada em solução salina estéril,
e após limpeza externa da vulva introduzia-se a haste na cavidade vaginal da paciente pela
comissura dorsal da vagina em ângulo de 45º em sentido cranio-dorsal. Após, rotacionava-se o
swab delicadamente sobre a parede dorsal e lateral da vagina. Em seguida o swab foi levemente
rotacionado sobre uma lâmina de microscopia, sendo esta corada pelo método Panótico rápido,
para posterior análise microscópica.
76
Teste de Tolerância à Glicose Intra-Venosa (IVGTT)
Durante o período pré-operatório as pacientes passaram por um IVGTT conforme
descrito por Mattheeuws et al. (1984). Após um jejum noturno de 8 a 12 horas, as pacientes
foram recebidas no HCV/UFRGS para início do teste. Em cada paciente um cateter foi colocado
nas veias cefálicas dos membros anterior direito e esquerdo. Após a colocação do primeiro
cateter, uma amostra de sangue foi coletada para dosagem de glicemia (uma gota) e para
determinação de insulinemia (3 mL de sangue total em tubo sem anti-coagulante) e
posteriormente o cateter foi mantido com uma seringa heparinizada para demais coletas de
sangue. As determinações de glicemias foram realizadas com glicômetro portátil (Accu-Check
Active, Roche Diagnóstica, Brasil). Pelo segundo cateter foi administrada uma dose de 500
mg/kg de glicose em menos de 30 segundos; correspondente a 1 mL/kg de uma solução de
glicose a 50%. Posteriormente esta via venosa foi mantida por meio de infusão lenta de uma
solução de NaCl a 0,9%. Amostras de sangue para determinação de glicemia foram coletadas
nos tempos 3, 5, 7, 15, 30, 45 e 60 minutos após infusão de glicose. Amostras para
determinação de insulinemia foram colhidas nos tempos 5 e 60 após infusão de glicose em tubos
sem anti-coagulante; exceto no grupo HEC, onde não foi determinada insulinemia. As amostras
colhidas para determinação da concentração de insulina foram centrifugadas a 10.000 rpm por
10 minutos, sendo o soro posteriormente separado e congelado a -20ºC até posterior análise.
Alguns índices foram calculados com base nos resultados do IVGTT, como os índices
HOMA R e HOMA B (MATTHEWS et al., 1985), ∆I/∆G aos 5 minutos de IVGTT (adaptado
de OMORI et al., 1991) além do índice insulinogênico (GUTT et al., 2000) e a relação
77
insulina/glicose corrigida (FELDMAN & NELSON, 2004). Para cálculo do HOMA R, HOMA
B, ∆I/∆G, índice insulinogênico e relação insulina/glicose corrida foram utilizadas as seguintes
fórmulas:
HOMA R =
Insulinemia (μU/mL) x Glicemia (mmol/L)
22,5
∆I/∆G =
Glicemia (mmol/L) – 3,5
Insulinemia (pM) aos 5 minutos de IVGTT – Insulinemia basal (pM)
Glicemia (mM) aos 5 minutos de IVGTT – Glicemia basal (mM)
Índice Insulinogênico =
Insulinemia (μU/mL)
Glicemia (mg/dL)
Relação Insulina / Glicose
Corrigida
=
Insulinemia (μU/mL) x 100
Glicemia (mg/dL) - 30
20 x Insulinemia (μU/mL)
HOMA B (%) =
78
Procedimento Operatório e Coleta de Tecidos
Em seguida ao término do IVGTT as pacientes recebiam 3 mg/kg de meperidina
(Dolosal® - Cristália) como analgesia pré-operatória por via intra-muscular e 22 mg/kg de
ampicilina sódica (Ampicilina Veterinária® - Univet) como antibioticoterapia profilática. Em
seguida a anestesia era induzida com 5 mg/kg de propofol (Provine® - Core), seguindo-se
intubação oro-traqueal e manutenção do plano anestésico com isoflurano (Forane® - Abbot) à
2% em oxigênio (White Martins).
A OSH foi realizada por técnica padrão (SLATTER, 2007), com utilização de três
pinças para ressecção do complexo artério-venoso ovariano (CAVO) de cada lado e ressecção
do corpo uterino cranial à cérvix, seguindo-se ligadura dos pedículos ovarianos e coto uterino
com fio mononylon. Após a retirada dos ovários e útero, três segmentos uterinos foram colhidos
e colocados em formol a 10% (um de cada corno uterino e um do corpo uterino) para análise
histopatológica. Amostras do endométrio foram colhidas em tubos tipo eppendorf e congeladas
em nitrogênio líquido.
Antes da rafia da parede abdominal, duas amostras de 1 g cada, foram colhidas do
músculo reto-abdominal, uma de cada lado, e imediatamente envoltas em papel alumínio,
identificadas e congeladas em nitrogênio líquido para posterior análise. Os tecidos congelados
inicialmente em nitrogênio líquido foram mantidos a -80ºC até análise.
79
A sutura da parede abdominal foi realizada de forma rotineira, utilizando-se fio
mononylon em padrão de sutura de Sultan interrompido. A redução do espaço-morto
subcutâneo foi feita utilizando-se fio mononylon em padrão contínuo simples e a síntese de
pele, utilizando-se o mesmo fio, foi feita em padrão intradérmico contínuo. No pós-operatório
imediato; as pacientes atendidas no projeto Controle Reprodutivo de Cães e Gatos recebiam
40.000 U/kg de penicilina benzatina (Pentabiótico® - Fort Dodge) por via intra-muscular, como
antibioticoterapia pós operatória, e 2 mg/kg de cetoprofeno (Ketofen ® - Merial) por via intra-
muscular como analgésico e anti-inflamatório. Estas pacientes recebiam prescrição de
continuação do uso do cetoprofeno na dose de 1 mg/kg por mais 2 ou 3 dias por via oral a cada
24 horas, mantendo limpeza diária da ferida operatória com solução salina estéril até retirada
dos pontos em média após 10 dias. As pacientes operadas com HEC-P tiveram as
recomendações e medicações pós-operatórias prescritas pelos médicos veterinários responsáveis
pelo caso de acordo com a necessidade de cada paciente.
Histopatologia Uterina
As amostras de útero coletadas foram processadas no Setor de Patologia Veterinária da
Faculdade de Medicina Veterinária desta Universidade. As amostras colhidas foram clivadas e
posteriormente incluídas em parafina líquida. Os blocos de parafina foram posteriormente
fatiados em um micrótomo e preparadas as lâminas. Estas foram coradas pelo método da
hematoxilina e eosina (HE) segundo Prophet et al. (1992). A análise das lâminas foi feita de
acordo com critérios descritos por Galabova et al., (2003) e Van Cruchten et al., (2004) para
80
auxiliar na classificação da fase do ciclo estral; e por Dow (1959a,b) para classificação do
complexo HEC-P em HEC não complicada, ou HEC complicada – piometra.
Radioimunoensaio e Determinações Bioquímicas
Para determinação dos valores de insulinemia foi utilizado um Kit de
radioimunoensaio para insulina humana (ImmuChem
TM
Coated Tube Insulin
125
I RIA Kit – MP
Biomedicals, LLC Orangeburg, NY). Após preparação prévia do ensaio, 100 μL de cada padrão
de insulina, controles de insulina e amostras foram pipetados nos tubos revestidos de anticorpos
anti-insulina. Em seguida 900 μL da solução tampão contendo
125
I-insulina (< 5 μCi) foram
adicionados aos tubos, que após agitação foram incubados a temperatura ambiente por 18 horas.
Após incubação as amostras foram decantados e lavados com água deionizada e após secagem
os tubos vazios tiveram a radioatividade determinada em contador gama LKB. Os valores de
cpm de cada amostra foram divididos pelo valor de cpm do padrão 0 μU/mL, gerando a razão
%B/B
0.
Os valores das razões %B/B
0
dos padrões de insulina foram utilizados para elaboração
de um gráfico, e posteriormente foi determinada a equação de regressão logarítimica da curva
apresentando um r
2
no primeiro ensaio de 0,9919 e de 0,9504 no segundo. Os resultados foram
expressos em μU/mL. A determinação da insulinemia nas pacientes com HEC, não foi
determinada em decorrência das amostras estarem muito hemolisadas e não haver
disponibilidade de kits para todas as dosagens.
As concentrações séricas de colesterol total e de triglicerídeos foram determinadas
utilizando kits diagnósticos (Labtest Diagnóstica S.A., Lagoa Santa, MG, Brasil) por meio de
81
sistema enzimático por reação de ponto final. As absorbâncias das amostras foram determinadas
em espectrofotômetro ajustado para leitura do colesterol em 500 nm e 505 nm para a leitura dos
triglicerídeos. Os resultados de triglicerídeos e de colesterol sérico foram expressos em mg/dL.
Para determinação da concentração sérica de fructosamina foi utilizado o método da redução do
azul de nitrotetrazólio (Labtest Diagnóstica S.A., Lagoa Santa, MG, Brasil) com leitura dos
resultados em espectrofotômetro ajustado em 530 nm. Os resultados de fructosaminemia foram
expressos em μmol/L. Também foi determinado o fibrinogênio plasmático das pacientes através
de precipitação por calor. Os resultados foram expressos em g/L.
82
Dosagem do Glicogênio Muscular
O glicogênio foi extraído segundo técnica descrita por Van Handel (1965). Foram
utilizados de 50 a 100 mg de tecido muscular de cada paciente. Estes tecidos foram aquecidos a
100ºC por 1 hora em 2 mL de KOH a 30%. Após o banho; 5 gotas de Na
2
SO
4
saturado foram
adicionados, seguindo-se adição de 4 mL de álcool. Após homogeneização e centrifugação a
2.700 rpm por 10 minutos descartou-se o sobrenadante e o precipitado foi dissolvido em 2 mL
de água quente, seguindo-se nova adição de 4 mL de álcool. Seguiu-se uma nova centrifugação
a 2.700 rpm por 10 minutos com descarte do sobrenadante.
O precipitado foi ressuspenso com 2 mL de água quente. Em uma amostra de 300 μL
de glicogênio foi realizada a hidrólise ácida com HCl 4 N. Uma curva padrão de glicogênio foi
feita a partir de uma solução de glicogênio (1 mg/mL). Em seguida as amostras e os padrões de
glicogênio foram aquecidos a 100ºC por 1 hora, resfriados, e 300 μL de Na
2
CO
3
foi adicionado.
Após liberação de todo CO
2
formado a dosagem de glicose foi realizada pelo método glicose-
oxidase com kit reagente (Labtest Diagnóstica S.A., Lagoa Santa, MG, Brasil). A absorbância
das amostras foi determinada em espectrofotômetro ajustado para leitura na faixa de 505 nm. Os
resultados foram expressos como mg de glicogênio em 100 g de tecido.
Preparação das Membranas do Tecido Muscular
As membranas de músculo foram preparadas conforme Kucharski et al. (1999) e Orcy
et al. (2005) com algumas modificações. Para cada preparação de membrana dos experimentos
83
de fosforilação e ligação, foram utilizados dois animais de cada grupo, escolhendo-se as
pacientes conforme similaridade de peso, idade, grupo racial, glicemia e resposta ao IVGTT. Os
tecidos foram inicialmente picados em pequenos pedaços em solução Krebs Ringer para
mamífero (KRM); pH 7,4 a 4ºC e posteriormente homogeneizados em um ultra-turrax a 4ºC por
cerca de 30 segundos em um tampão TES com PMSF (10 mM TRIS, 1 mM EDTA, 250 mM
sacarose e 100 mM de PMSF – phenylmethylsulfonyl fluoride). Este homogenado foi
centrifugado inicialmente a 3.000 g (5.000 rpm) por 5 minutos a 4ºC. O sobrenadante foi
novamente centrifugado a 30.000 g (16.000 rpm) por 20 minutos a 4ºC, sendo o precipitado
ressuspenso em 250 a 350 μL de TES com PMSF.
As membranas preparadas para os experimentos de ligação hormônio-receptor
(binding) foram incubadas por 5 minutos a 25ºC em ácido acético 1 mM na proporção de 1/1
(v/v) após ressuspensão do precipitado final como descrito acima. A reação foi interrompida
com tampão TES com PMSF na proporção de 2/1 (v/v) (TURYN et al., 1986), seguindo-se
nova centrifugação a 30.000 g (16.000 rpm) por 30 minutos a 4ºC, sendo o precipitado
ressuspenso em 250 - 350 μL de TES com PMSF.
Dosagem de Proteínas
Amostras de 50 μL da solução contendo as membranas foram separadas para a
dosagem de proteínas. A concentração de proteínas foi determinada segundo o método de
Bradford (1976) com o Coomassie brilliant blue, utilizando albumina sérica bovina (BSA)
como controle.
84
Ensaios de Ligação da
125
I-Insulina em Presença de Diferentes Concentrações de Insulina
Humana
Os estudos de ligação com
125
I-insulina foram realizados de acordo com Kucharski et
al. (1999) com pequenas modificações para o tecido muscular de cães. Para cada amostra de
membrana foram utilizados 2 animais de cada grupo e cada ponto das curvas corresponde a uma
média de 6 a 8 animais. As soluções de membrana (400 μg de proteína por tubo) foram
incubadas em agitador metabólico Dubnoff em um volume final de ensaio de 200 μL, contendo
tampão (KRM) pH 7,4 com albumina sérica bovina (BSA) a 1% na presença de concentrações
crescentes de insulina regular humana (Eli Lilly) - 0,1 μg/mL, 1 μg/mL, 10 μg/mL, 100 μg/mL,
250 μg/mL e 500 μg/mL - mais 20.000 cpm de
125
I -insulina humana (Amersham Bioscience –
2000 Ci/mmol) ou somente na presença de insulina marcada (ligação total). Após 2 horas de
incubação a 25ºC, o conteúdo dos tubos foi filtrado em filtros de microfibra de vidro (filtro
Whatman GF/B 2,4 cm) adaptados a uma bomba de vácuo. Cada filtro foi lavado 5 vezes com 1
ml de KRM 0,1% BSA. Depois de secos a radioatividade retida no filtro (complexo
125
I -
insulina humana / receptor) foi contada em contador de gama LKB. Tecido muscular de ratos
Wistar foi usado como controle da técnica.
Para análise dos sítios de ligação da insulina foram utilizados os dados da curva de
competição (saturação fria) que foram lançados no programa Kell for Windows
TM
(version 6,
Biosoft). O método gráfico utilizado para análise dos dados da união de ligandos a proteínas foi
o método de Scatchard (SCATCHARD, 1949). O gráfico de Scatchard resulta em uma reta onde
85
a inclinação da mesma informa sobre a constante de dissociação (Kd) e a intersecção da reta
com o eixo das abscissas indica a capacidade de ligação (Bmax). Os valores de Kd e Bmax
foram gerados pelo programa Kell for Windows
TM
através do sub-diretório LIGAND /
Saturação Fria (MUNSON & RODBARD, 1980; McPHERSON, 1985).
A interação entre o hormônio e o receptor forma um complexo que é reversível e
representado pela seguinte reação:
onde K
1
e K
2
são as constantes de velocidade de associação e dissociação,
respectivamente. Quando o sistema atinge o equilíbrio, para cada complexo HR formado, um
outro complexo HR dissocia-se em H e R. A velocidade da reação é a mesma nos dois sentidos
e a constante de associação (K
a
), pode ser calculada como:
onde [HR] é a concentração do complexo hormônio-receptor, [H] é a concentração do
hormônio livre e [R] é a concentração de receptores não ocupados. Quando metade dos
receptores estiverem ligados ao hormônio, [R] será igual a [HR]. A constante de associação que
corresponde ao K
a
e seu inverso K
d
a constante de dissociação.
(H) + (R) (HR)
K
2
K
1
[HR]
[H] . [R]
K
a
=
86
Desta forma, a concentração de hormônio livre necessária para saturar metade dos
receptores será igual ao K
d
. Desta forma os valores de K
d
foram utilizados como um índice de
afinidade dos receptores , sendo que pode-se estabelecer que quanto menor o K
d
, maior a
afinidade do hormônio por seu receptor e menor a tendência de dissociação do complexo HR
(SANVITTO, 1992).
Fosforilação do Substrato Sintético Poly (Glu, Tyr 4:1)
Para cada amostra de membrana foram utilizados 2 animais de cada grupo, utilizando-
se pelo menos 6 animais por grupo. As membranas preparadas como descrito anteriormente (40
μg de proteína) foram incubadas por 30 minutos a 25ºC em tampão Hepes (25 mM, pH 7,4) com
100 nM de albumina bovina, na presença de ortovanadato de sódio (1 mM), cloreto de
manganês (10 mM) e cloreto de magnésio (10 mM); em um volume final de 45 μL. Em seguida,
foi adicionado a esta solução [γ
32
P] ATP a 0,5 μCi (Amersham Biosciences – 3000 Ci/mmol)
juntamente com ATP não marcado (5 μM), mantendo-se a incubação a 25ºC por mais 10
minutos. Após, foi adicionado 1 mM do substrato sintético poly (Glu, Tyr) 4:1 e as amostras
incubadas por 1 h a 25ºC. A reação foi interrompida pipetando-se a amostra em papéis de
fosfocelulose – Gibco BRL (ORCY et al., 2005). Seguiu-se uma lavagem com TCA a 10% e
três lavagens com ácido fosfórico (75 mM). Os papéis secos foram colocados em líquido de
cintilação [tolueno – triton X-100 (2:1), PPO (0,4%) e POPOP (0,01%)] e a incorporação do
[γ
32
P] ATP ao substrato exógeno foi medida em um contador beta LKB.
87
Análise Estatística
Os resultados dos experimentos realizados foram expressos em média (±) desvio
padrão da média ou mediana e amplitude interquartil conforme distribuição dos resultados
(WAGNER, 1998). Para fins de interpretação, as análises foram realizadas comparando-se o
grupo ciclo estral entre si (anestro - controle, estro e diestro); e o grupo HEC-P entre si;
utilizando o grupo diestro como controle, uma vez que o complexo HEC-P é uma moléstia
característica do diestro. Para os dados obtidos, quando comparando-se duas médias, foi
aplicado o teste t de Student (uma vez que algumas determinações não foram realizadas nas
pacientes com HEC somente), e quando comparadas três médias foi utilizada análise de
variância de uma via (ANOVA One Way), seguido do teste de Tukey. Quando necessário,
conforme distribuição, normalidade e variância dos dados foram aplicados respectivamente os
testes de Mann-Whitney, e Kruskal-Wallis em substituição ao teste t de Student e ANOVA One
Way. Também realizou-se análise de correlação de Pearson entre algumas dos índices de
sensibilidade à insulina quando pertinente. Para estas análises foi utilizado o programa, Sigma
Stat 2.0 para Windows; considerando-se significativa uma diferença entre médias com p <
0,05.Para análise estatística dos valores de glicemia e insulinemia durante o IVGTT foi aplicada
uma análise de variância para medidas repetidas com o fator grupo e o fator de repetição tempo.
Para estas análises foi utilizado o programa SAS (Statistical Analysis System) versão 9.1.
considerando-se significativa uma diferença entre médias com p < 0,05.
88
Medidas de Associação
Para complementação dos resultados obtidos foram calculadas medidas de associação
para alterações nos índices de sensibilidade à insulina frente aos diferentes fatores de exposição.
Para análise do grupo ciclo estral, foi adotada a razão de prevalência (RP), com respectivos
intervalos de confiança 95%. Para cálculo da RP foi adotada a seguinte fórmula:
RP = (eventos/n do grupo exposto) / (eventos/n do grupo não exposto). O intervalo de
confiança foi calculado com a fórmula IC
RP
= exp[ln(RP) ± Z
α
. EP
ln(RP)
]; onde EP
ln(RP)
= raiz
quadrada de (1/a -1/a+b) + (1/c – 1/c+d) (WAGNER & CALLEGARI-JAQUES, 1998).
Na análise dos dados do grupo HEC-P, foram calculadas as razões de chance (odds
ratio) para valores alterados em cada um dos testes de sensibilidade à insulina calculados a
partir do IVGTT; utlizando-se a fórmula: OR = (eventos/não eventos) na população exposta /
(eventos/não eventos) na população não exposta. O cálculo dos intervalos de confiança 95% (IC
95%) foi feita segundo a fórmula: IC 95% OR = exp[ln(OR) ± Z
α
. EP
ln(OR)
], onde EP
ln(OR)
= raíz
quadrada de (1/a + 1/b + 1/c + 1/d). O OR médio foi calculado a partir da média aritmética dos
OR dos índices calculados. Os IC 95% e IC 99% para o OR médio foram calculados segundo a
fórmula IC (μ) = χ ± t
α;gl
. EP; onde EP = DP/raiz quadrada do n (WAGNER & CALLEGARI-
JACQUES, 1998).
89
CAPÍTULO I
Influência do Ciclo Estral sobre a Sensibilidade à Insulina
RESULTADOS
Animais
Após a análise dos critérios de inclusão e resultados de citologia vaginal, histopatologia
uterina e hemograma, 32 cadelas compuseram o grupo ciclo estral, sendo 11 cadelas em anestro
(6 SRD, 1 Boxer, 1 Pastor Alemão, 1 Pitt-Bull, 1 Beagle e 1 Cocker), 7 cadelas em estro (6 SRD
e 1 Cocker) e 14 cadelas em diestro (6 SRD, 2 Cockers, 1 Boxer, 1 Akita, 1 Rottweiller, 1 Fox e
1 Pitt-Bull). Para fins de classificação as cadelas em pró-estro e estro foram avaliadas dentro do
mesmo grupo por tratar-se de uma fase de predomínio do estrógeno. A tabela 1 apresenta as
médias, desvio padrão e intervalo da idade, peso e escore corporal das cadelas de cada grupo
estudado. A análise de variância aplicada à idade (P = 0,081) e ao peso (p = 0,860) não
apresentou diferenças significativas. Contudo; com relação ao escore corporal [(escala de 1 a 5;
sendo 3 considerado ideal; adaptado de Laflamme (1997)] observou-se diferença significativa,
porém sem relevância biológica, entre o grupo diestro e o grupo anestro (p = 0,025). Foi
utilizado teste de Kruskal-Wallis para idade, e teste de ANOVA de uma via seguido de teste de
Tukey para peso e escore corporal.
90
Tabela 1. Média, desvio padrão da média e intervalo de idade, peso e escore corporal de cadelas
nas diferentes fases do ciclo estral.
Idade (anos) Peso (kg) Escore Corporal
Anestro (n = 11)
1,32 ± 0,6 (0,5 – 2) 14,9 ± 6,19 (7,5 – 29) 2,81 ± 0,32 (2,5 – 3,5)
Estro (n = 7)
2,34 ± 1,26 (0,9 – 2,5) 15,7 ± 7,36 (6 – 29) 3,14 ± 0,24 (3 – 3,5)
Diestro (n = 14)
3,65 ± 3,25 (0,7 – 10) 16,6 ± 8,5 (6,1 – 26,6) 3,15 ± 0,31 (3 – 3,5)*
* indica diferença significativa com relação ao grupo controle (anestro), p < 0,05 (ANOVA de
uma via seguida de teste de Tukey).
Determinações Hematológicas
A tabela 2 apresenta os valores do eritrograma dos grupos de cadelas em anestro, estro e
diestro, não foram constatadas variações significativas dos valores de hemoglobina, eritrócitos e
hematócrito entre os diferentes grupos experimentais.
A Figura 6 representa os resultados dos leucócitos totais nas cadelas estudadas, não
sendo verificadas diferenças significativas dos parâmetros estudados entre os grupos
experimentais.
Tabela 2. Média, desvio padrão e intervalo dos parâmetros hematológicos (eritrócitos,
hematócrito e hemogoblina) das pacientes avaliadas dentro do grupo ciclo estral.
Eritrócitos (10
6
/mm
3
) Hematócrito (%) Hemoglobina (g/dL)
Anestro
6,83 ± 0,95 (5,5 – 7,16) 42,2 ± 5,51 (34 – 50) 14 ± 1,56 (11,7 –17,5)
Estro
7,28 ± 0,74 (6,24 – 8,4) 50,7 ± 3,68 (46 – 57) 17,1 ± 1 (16,1 – 18,4)
Diestro
7,06 ± 1,13 (5,42 – 7,9) 49,1 ± 8,5 (40 – 60) 16,7 ± 2,6 (13,9 – 21,6)
91
Figura 6. Valores médios de leucócitos totais observados na população estudada. Não foram
detectadas diferenças significativas pela análise variância de uma via (p > 0,05).
Determinações Bioquímicas
A figura 7 representa os valores de fibrinogênio plasmático nas cadelas estudadas, não
sendo verificadas diferenças significativas entre os grupos experimentais.
A tabela 3 representa os resultados obtidos para ambos parâmetros de lipemia;
representados em média ± desvio padrão da média. A análise de variância dos valores de
triglicerídeos (p = 0,185) e colesterol sérico (p = 0,091) não apresentou diferença significativa
entre os grupos de estudo avaliados.
Leucócitos totais e fibrinogênio plasmático das
pacientes estudadas
0
2
4
6
8
10
12
14
Anestro Estro Diestro
Leucócitos totais (x10³/mm³) e
Fibrinogênio plasmático (g/L)
Leucograma
Fibrinogênio
0
2
4
6
8
10
12
14
Anestro Estro Diestro
Leucócitos totais (x10³/mm³)
92
A figura 8 apresenta os resultados de fructosaminemia obtidos representados em
média ± desvio padrão da média. Na determinação da fructosamina sérica não foi verificada
diferença significativa (p = 0,520) entre as cadelas em anestro, estro e diestro.
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
Anestro Estro Diestro
Fibrinogênio plasmático (g/L)
Figura 7. Valores de fibrinogênio plasmático em cadelas em diferentes fases do ciclo estral.
Não foi constatada diferença significativa na análise variância de uma via (p > 0,05).
Tabela 3. Média, desvio padrão da média e intervalo dos parâmetros de lipemia avaliados
(triglicerídeos e colesterol séricos) em cadelas em diferentes fases do ciclo estral. Não foram
observadas diferenças significativas (p > 0,05) pela analise de variância de uma via.
Triglicerídeos (mg/dL) Colesterol (mg/dL)
Anestro
63
±
22,4 (40,6 – 100,8) 142,6 ± 26,1 (111,2 – 183,8)
Estro
76,4
±
29,4 (32 – 108,2) 128,2 ± 26,8 (88,7 – 175,06)
Diestro
82,2
±
38,7 (42,2 – 179,68) 156,45 ± 47,3 (79 – 236)
93
0
50
100
150
200
250
300
350
400
Anestro Estro Diestro
Fructosamina umol/L
Anestro
Estro
Diestro
Figura 8. Concentração (média ± desvio padrão da média) de fructosamina sérica nos diferentes
grupos experimentais. Não foram detectadas diferenças significativas entre os grupos estudados
(p > 0,05).
Teste de Tolerância à Glicose Intra-Venosa (IVGTT)
A avaliação da glicemia e insulinemia em conjunto é uma importante ferramenta para
investigação da sensibilidade à insulina (AHREN & PACINI, 2004). Na Figura 9 estão
representados os valores de glicose plasmática basal e durante o IVGTT em cadelas em anestro,
estro e diestro. Não foram verificadas diferenças significativas dos valores de glicose plasmática
basais entre os três grupos experimentais estudados. O padrão temporal de resposta glicêmica à
sobrecarga de glicose não apresentou diferença significativa (p > 0,05) entre os grupos anestro,
estro e diestro.
Os valores de insulina plasmática, antes e após (5 e 60 minutos) do IVGTT, nos três
grupos experimentais estudados, estão representados na Figura 10. Os valores de insulina no
plasma aos 5 minutos após a administração da sobrecarga de glicose no estro e diestro foram
94
40% e 21% menores, respectivamente, que aqueles observados no anestro. Contudo, não foram
verificadas diferenças significativas (p > 0,05) entre estes resultados.
Com os resultados obtidos no IVGTT foram calculados os índices de atividade das
células β (HOMA B) (Fig. 11a) e índice aproximado de resistência à insulina (HOMA R) (Fig.
11b); bem como a relação entre as respostas ∆Ins/∆Gli aos 5 minutos do IVGTT (Fig. 12).
Apesar do índice HOMA B ser maior nas cadelas em estro e em diestro, a diferença entre as
medianas não obteve significância aplicando-se o teste de Kruskall-Wallis (p > 0,05). Da
mesma forma as médias do HOMA R não apresentaram diferenças significativas entre os
grupos estudados pela análise de variância de uma via (p > 0,05). Os valores da relação da
resposta insulínica e glicêmica aos 5 minutos foram 41% e 40% menores nos grupos estro e
diestro, respectivamente, do que aqueles verificados no anestro, entretanto, não foram
significativamente diferentes.
0
50
100
150
200
250
300
350
400
0 102030405060
Tempo (minutos)
Glicemia (mg/dL)
Anestro
Estro
Diestro
Figura 9. Concentração (média ± desvio padrão da média) de glicose no plasma de cadelas dos
grupos anestro, estro e diestro ao longo do IVGTT. n = 7 - 14 animais.
95
0
20
40
60
80
100
120
140
160
0 102030405060
Tempo (min)
Insulinemia uUI/mL
Anestro
Estro
Diestro
Figura 10. Concentração (média ± desvio padrão da média) de insulina plasmática nos grupos
anestro, estro e diestro ao longo do IVGTT. n = 3 - 7 animais.
a
Figura 11 a. Medianas, intervalos interquartis e percentis 10 e 90% do aumento no índice
HOMA B em relação ao basal (grupo anestro = 1). Não foram observadas diferenças
significativas pelo teste de Kruskall-Wallis (p = 0,530) n = 3 - 7 animais. Figura 11 b.
Medianas, intervalos interquartis e percentis 10 e 90% do índice HOMA R. Não foi detectada
diferença significativa na análise variância de uma via (p = 0,511). n = 3 - 7 animais.
Anestro Estro Diestro
01234
HOMA R
0
1
2
3
Anestro Estro Diestro
01234
Aumento HOMA B em comparação ao basal (=1)
0
1
2
3
4
5
a
b
96
0
20
40
60
80
100
120
Anestro Estro Diestro
Delta Ins/Gli 5 minutos IVGTT
Anestro
Estro
Diestro
Figura 12. Relação (média ± desvio padrão da média) ∆Ins/∆Gli aos 5 minutos de IVGTT. Não
foram observadas diferenças significativas pela ANOVA de uma via (p = 0,224). n = 3 – 7
animais.
Ainda com base nas concentrações de glicose e de insulina no tempo zero do IVGTT
(jejum), foram calculados os índices insulinogênico e a relação insulina/glicose corrigida.
Segundo Kogika et al. (2001) considera-se o paciente com hiperinsulinemia relativa, quando o
índice insulinogênico ultrapassar o valor de 0,235 e a relação insulina/glicose corrigida passar
de 30. A tabela 4 apresenta as médias, desvio padrão e intervalo dos índices calculados. Apesar
do índice insulinogênico no grupo diestro apresentar valores cerca de 25% maiores que aqueles
constatados nos outros dois grupos experimentais e a relação insulina/glicose corrigida valores
24% e 30% maiores que aqueles verificados no estro e anestro, respectivamente, não houve
diferença significativa. No entanto, a média do grupo diestro para ambos índices encontra-se na
faixa considerada de resistência a insulina (0,250 e 39,1 respectivamente).
97
Tabela 4. Médias, desvio padrão e intervalo do índice insulinogênico e da relação
insulina/glicose corrigida.
Índice Insulinogênico* Relação Ins / Gli Corrigida**
Anestro
Estro
Diestro
0,186 ± 0,06 (0,127 – 0,262)
0,187 ± 0,07 (0,140 – 0,271)
0,250 ± 0,12 (0,131 – 0,418)
27,8 ± 9,26 (21,8 – 39,2)
29,9 ± 10,64 (23,15 – 42,2)
39,1 ± 22,04 (19,37 – 80,8)
* valor de referência: aumentado > 0,235
** valor de referência: aumentado > 30.
Para os índices ∆Ins/∆Gli aos 5 minutos de IVGTT, índice insulinogênico e relação
insulina/glicose corrigida foi calculada a razão de prevalência (RP) de valores alterados
(desfecho) a partir dos valores de referência citados nos trabalhos originais < 54, > 0,235 e > 30,
respectivamente. Para isto foram comparados os grupos estro e diestro (grupos expostos) ao
grupo controle anestro (não exposto). Para os índices HOMA B e HOMA R não foi calculada
esta medida de associação em decorrência da ausência de valores de referência para a espécie
estudada.
A tabela 5 traz os resultados das razões de prevalência para a alteração destes índices
com os respectivos intervalos de confiança 95%.
Tabela 5. Razão de prevalância e intervalo de confiança 95% para alteração nos índices
∆Ins/∆Gli aos 5 minutos de IVGTT, índice insulinogênico e relação insulina/glicose corrigida.
Estro – RP (IC 95%) Diestro – RP (IC 95%)
∆Ins/∆Gli aos 5 minutos de IVGTT
1,66 (0,43 – 6,23) 2,14 (0,71 – 6,35)
Índice insulinogênico
0,83 (0,12 – 5,52) 1,05 (0,07-15,33)
Relação insulina/glicose corrigida
0,83 (0,12 – 5,52) 1,42 (0,4 – 4,95)
98
Determinação do Glicogênio Muscular
A Figura 13 mostra os valores de glicogênio muscular após o IVGTT nos grupos
experimentais estudados. Não foram verificadas diferenças significativas nos valores de
glicogênio muscular entre os grupos anestro, estro e diestro.
Figura 13. Medianas, amplitude interquartil e percentis 10 e 90% do glicogênio muscular das
pacientes nos referidos grupos. Não foi observada diferença significativa pela ANOVA de uma
via (p = 0,290).
Anestro Estro Diestro
01234
mg de glicogênio por g de tecido
0
50
100
150
200
250
300
99
Ensaios de Ligação da
125
I-Insulina em Presença de Diferentes Concentrações de Insulina
Humana
A figura 14 apresenta as curvas de inibição competitiva da ligação de
125
I-insulina em
membranas de músculo esquelético, pelo aumento da concentração de insulina humana não
marcada. Os ensaios de ligação da
125
I-Insulina ao receptor, em presença de concentrações
crescentes de insulina não marcada, mostraram que no músculo reto-abdominal de cadelas
ocorreram sítios de ligação à insulina de alta e de baixa afinidade. As figuras 15 a, b e c
apresentam as curvas de Scatchard dos resultados do estudo de ligação insulina-receptor das
pacientes ao longo do ciclo estral. A relação da insulina ligada/livre (Bound/Free – B/F) foi
representada graficamente contra a quantidade de insulina ligada (Bound – B) por pM de
proteina.A constante de dissociação dos sítios (Kds) de alta e de baixa afinidade serão referidas
como Kd 1 e Kd 2, respectivamente. A capacidade máxima de ligação destes sítios também foi
determinada sendo aqui referida como Bmax 1 e Bmax 2. Os valores de Kd e Bmax para os
sítios de alta afinidade foram expressos em fM/mg de proteína, enquanto que para os sítios de
baixa afinidade; os valores de Kd e Bmax foram expressos em pM/mg de proteína.
A tabela 6 representa os valores de Kd e de Bmax, para cada um dos sítios de ligação
à insulina, em tecido muscular de cadelas nas diferentes fases do ciclo estral. As cadelas em
anestro apresentaram os menores valores de Kd 1 e Bmax 1 em comparação aos grupos estro e
diestro (p < 0,001). O grupo estro apresentou os maiores valores de Kd 1, sendo significativa
(p<0,001) a diferença em relação os grupos anestro e diestro. Com relação aos valores de Kd e
Bmax dos sítios de baixa afinidade; não foram observadas diferenças significativas entre os
100
grupos experimentais estudados (p = 0,730 para Kd 2 e p = 0,05 para Bmax 2). Os menores
valores de Kd 2 foram observados no grupo diestro e os menores valores de Bmax 2 foram
verificados no grupo estro. Todos os parâmetros foram analisados através de ANOVA de uma
via seguido de teste de Tukey.
Figura 14 - Inibição competitiva da ligação de
125
I-insulina em membranas de músculo
esquelético, pelo aumento da concentração de insulina humana não marcada. Cada ponto
representa a média de duas preparações de membrana em duplicata.
101
a
b
102
Figura 15 a, b e c - Curvas de Scatchard em preparações de membrana de tecido muscular
esquelético de fêmeas caninas em diferentes fases do ciclo estral. Cada ponto representa a média
de duas preparações de membrana em duplicata. Curvas representativas dos grupos anestro (a),
estro (b) e diestro (c).
Tabela 6. Valores de Kd (constante de dissociação) dos sítios de ligação à insulina de alta (Kd
1) e de baixa (Kd 2) afinidade e a capacidade de ligação máxima destes sítios (Bmax 1 e Bmax
2) em músculo de cadelas em diferentes fases do ciclo estral.
Kd 1
(fM/mg ptn)
Bmax 1
(fM/mg ptn)
Kd 2
(pM/mg ptn)
Bmax 2
(pM/mg ptn)
Anestro
6,54 ± 2,77ª 0,35 ± 0,061ª 26,06 ± 22,29ª 0,79 ± 0,52ª
Estro
28,54 ± 6,94
b
0,83 ± 0,42
b
25,68 ±12,79ª 0,35 ± 0,2ª
Diestro
15,56 ± 3,88
c
1,24 ± 0,24
b
18,56 ± 7,36ª 0,77 ± 0,37ª
Média ± desvio padrão da média
Letras diferentes (
a,b,c
) representam diferença significativa (p < 0,001) entre os grupos. ANOVA
de uma via seguida de teste de Tukey.
c
103
Fosforilação do Substrato Sintético Poly (Glu,Tyr 4:1)
Na figura 16 estão representados os resultados de fosforilação do substrato sintético
Poly (Glu, Tyr 4:1) nas preparações de membrana de tecido muscular esquelético das pacientes
nas diferentes fases do ciclo estral. Os resultados mostraram uma fosforilação basal nas
pacientes em anestro 42% e 46% superior àquelas observadas nas pacientes em estro ou diestro,
respectivamente (p < 0,001).
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
10000
Anestro Estro Diestro
cpm
Figura 16. Valores médios e desvio padrão da média dos valores de fosforilação do substrato
sintético Poly (Glu, Tyr 4:1) em presença de albumina em preparações de membrana de tecido
muscular esquelético de pacientes em anestro, estro ou diestro. * representa diferença
significativa (p < 0,05) em comparação a fosforilação basal do grupo anestro.
* *
104
DISCUSSÃO
A determinação do escore corporal, conforme critérios definidos por Laflame (1997) e
adaptado neste trabalho a uma escala de 1 a 5; sendo 1 = caquético, 2 = magro, 3 = ideal, 4 =
sobrepeso e 5 = obeso; foi importante para a determinação de grupos de cadelas homogêneos
com relação à condição corporal, evitando assim possíveis diferenças na sensibilidade à insulina
em decorrência de sobrepeso ou caquexia. Mesmo tendo-se observado diferença significativa
entre a condição corporal do grupo anestro e dos demais grupos, as flutuações estão ao redor do
escore 3 (ideal). As idades também apresentaram homogeneidade, afastando a possibilidade de
alterações na sensibilidade à insulina em decorrência de diferenças marcantes na idade; uma vez
que há tendência de menor sensibilidade à insulina em animais idosos (FELDMAN &
NELSON, 2004). Também as diferenças em relação a medida de porte do animal foram
minimizadas, pois todas as pacientes eram eutróficas. Com relação às raças presentes no grupo
ciclo estral; somente o fox (uma ocorrrência no grupo diestro) consta em listas de raças com
maior predisposição ao desenvolvimento de diabetes (odds ratio 3,02 IC 95% 1,94 – 4,7); as
demais raças das pacientes que participaram do estudo, na verdade apresentam-se com menor
risco de desenvolvimento de diabetes (odds ratio entre 0 e 1), utilizando-se os cães SRD como
referência (odds ratio 1) (HESS et al., 2000; GUPTILL et al., 2003; CATCHPOLE et al.,
2005).
As determinações hematológicas evidenciaram o adequado estado de saúde das
pacientes participantes no estudo, evitando assim inclusão de pacientes com mordidades
passíveis de alterar os testes de sensibilidade à insulina (RAND et al., 2004; FELDMAN &
105
NELSON, 2004). Alterações na sensibilidade à insulina podem se manifestar por meio de
alterações nos indicadores de lipemia dos pacientes (PÖPPL & GONZÁLEZ, 2005). No
presente estudo não foram observadas diferenças significativas nos valores de triglicerídeos e de
colesterol nos diferentes grupos. Estes resultados estão de acordo com achados de Renauld et al.
(1998) que também observaram que as diferentes fases do ciclo estral não alteram
significativamente os valores de triglicerídeos, lipídeos e colesterol basais, assim como de
ácidos graxos livres e glicerol (RENAULD et al., 1999). Contudo, em pacientes naturalmente
diabéticas não castradas, durante as fases estrogênicas e lútea do ciclo estral, observam-se
concentrações maiores de lipídeos quando comparadas aquelas verificadas em pacientes
diabéticas em anestro. Em testes de tolerância à insulina em pacientes diabéticas (ITT – insulin
tolerance test) a resposta dos triglicerídeos à insulina das pacientes em anestro foi superior a de
pacientes em diestro ao fim do teste. Já o contrário foi observado em pacientes não diabéticas
(RENAULD et al., 1998).
A fructosamina é considerada uma das principais ferramentas no controle a longo
prazo da glicemia de pacientes diabéticos, também apresentando um importante valor para
diferenciar de animais estressados (JENSEN 1995; BEHREND 2001; GRECO 2001b; LOSTE
& MARCA 2001; SCHULMAN 2003). A fructosamina é sintetizada quando uma molécula de
glicose em sua forma aberta (cerca de 0,001% da glicose circulante) combina-se de forma não
enzimática e reversível a um grupamento amino, normalmente resíduos de lisina nas proteínas.
Este composto (aldimina – base de Schiff) vai transformando-se lenta e irreversivelmente por
meio do rearranjo de Amadori em um estável composto cetoamina (JENSEN, 1995). Este
processo ocorre em praticamente todas proteínas corpóreas, como as proteínas plasmáticas,
106
colágeno e elastinas. A concentração de fructosamina é uma mensuração de todas as proteínas
glicosiladas séricas, no entanto a albumina é a principal proteína sérica, e é muito mais sensível
a glicosilação (JENSEN, 1995). Desta forma como a meia vida da fructosamina é de cerca de 2
semanas, a concentração de fructosamina oferece um indicador da glicemia nas últimas duas
semanas (KANEKO et al., 1997). A mensuração sérica de fructosamina nas pacientes estudadas
não evidenciou diferenças significativas que pudessem indicar ou suportar alterações no estado
glicêmico das pacientes.
A resposta glicêmica ao IVGTT, das pacientes estudadas nos diferentes grupos, não
apresentou diferenças significativas, bem como a glicemia de jejum. A ocorrência de resistência
à insulina e intolerância à glicose associada à fase do diestro é freqüentemente comparada ao
diabetes mellitus gestacional humano (DMG). O DMG é caracterizado como uma intolerância
aos carboidratos identificada pela primeira vez durante a gestação (RUSSELL et al., 2007).
Divergências existem em diferentes paises para critérios de diagnóstico de DMG e pontos de
corte para o diagnóstico, contudo, uma resposta glicêmica superior a 140 mg/dL após 1 hora de
uma dose oral de 50 g de glicose (OGTT – oral glucose tolerance test) em mulheres entre a 26ª-
28ª semana de gestação é considerado preditivo de DMG (PHILLIPS, 2006). Para confirmação
do diagnóstico; é necessário uma glicemia de jejum maior que 100 mg/dL após uma dieta rica
em carboidratos por 3 dias ou uma glicemia superior a 144 mg/dL após 2 horas de uma dose
oral de 75 g de glicose (PHILLIPS, 2006). Russell et al. (2007) consideram para fins de
diagnóstico uma resposta glicêmica ≥ 135 mg/dL no segundo trimestre de gestação ou ≥ 173
mg/dL no terceiro semestre após 2 horas durante um OGTT de 75 g de glicose.
107
A prevalência de DMG pode variar de 1 a 14% conforme a população estudada
(NILSSON et al., 2007) e muito da semelhança entre o DMG e a DM canina reside no fato de
que mulheres com DMG podem retomar aos valores glicêmico normais após o parto em até
90% dos casos (KIM et al., 2007). Contudo, a ocorrência de DMG em humanos em uma
gestação aumenta em até 62% a incidência de diabetes durante a vida da paciente (NILSSON et
al., 2007). De fato, na população canina, cerca de 5% das pacientes identificadas com diabetes
durante o diestro, podem reverter a necessidade de insulina se castradas imediatamente após o
diagnóstico. As cadelas que sofreram diabetes reversível durante o diestro e não foram castradas
apresentam grandes chances de tornarem-se diabéticas na próxima fase lútea do ciclo,
independente da presença ou não de gestação (RAND et al., 2004; FELDMAN & NELSON,
2004).
No entanto, a ocorrência de DMG humana, e o desenvolvimento posterior de DM tipo
I ou tipo II após a gestação, estão associados a uma série de fatores de risco genéticos, auto-
imunes e ambientais (CHU et al., 2007; KIM et al., 2007; NILSSON et al., 2007; WATANAKE
et al., 2007). Na literatura, observa-se uma ampla variação no índice de recorrência de DMG em
mulheres, bem como na incidência e severidade da doença, conforme raça/etnia (BEISCHER et
al., 1991; KIM et al., 2007). Nilsson et al. (2007) demonstraram a presença de auto-anticorpos
contra GAD, células das ilhotas (ICA – islet cell antibody) e contra a enzima tirosina fosfatase
(IA-2A) em 24 de 385 mulheres com DMG. Destas, 50% desenvolveram DM tipo I entre 6
meses e 10 anos após o parto, o que reforça a idéia de que a ocorrência de DMG pode
desencadear o aparecimento de DM tipo I. Esta afirmativa baseia-se na constatação da presença
de auto-anticorpos, que podem ser detectados anos antes do início dos sintomas. Assim, a
108
resistência à insulina durante a gestação levaria a um aumento na demanda das células β
remanescentes e já afetadas pelo processo auto-imune. Desta forma a DMG pode na verdade
mascarar um estágio inicial do DM tipo I ao ser interpretada somente como DMG (NILSSON et
al., 2007).
A mesma lógica poderia ser aplicada ao diabetes mellitus canino com início durante o
diestro. Evidencias acumuladas apontam para a presença de auto-anticorpos contra células β em
cerca de 50% dos pacientes caninos com diagnóstico recente de DM (HOENIG, 2002).
Entretanto, de cada 100 cães que recebem diagnóstico de DM, cerca de 70% são fêmeas
(CATCHPOLE et al., 2005), e destas fêmeas com diagnóstico recente de diabetes,
aproximadamente 70% encontravam-se no diestro no começo da doença (PÖPPL &
GONZÁLEZ, 2005). Não seria nenhuma surpresa a detecção de auto-anticorpos, evidenciando
um diabetes auto-imune (insulite imunomediada), em uma proporção significativa de cadelas
com diagnóstico de DM durante o diestro. Neste cenário o diestro poderia ser um fator
agravador do processo auto-imune no diabetes. Como não foi realizada a dosagem de auto-
anticorpos neste estudo; e a população estudada foi relativamente pequena, não foi possível
verificar esta hipótese. A maior predisposição ao desenvolvimento de diabetes, encontrada em
algumas raças, pode também influenciar na ocorrência de resistência à insulina durante o
diestro.
No presente estudo não foram observadas diferenças siginicativas na resposta
glicêmica ao IVGTT entre os diferentes grupos do ciclo estral. Este fato pode ser explicado, em
parte, pela utilização de animais de raças e origem diferentes que não apresentavam outros
fatores predisponentes à intolerância à glicose, fora a fase lútea do ciclo, como por exemplo a
109
obesidade. Apesar disto; algumas evidências encontradas neste estudo apontam para uma menor
sensibilidade à insulina nas pacientes em diestro; apesar de não terem atingido significância
estatística.
A obesidade aparece como um dos principais fatores ambientais de risco à ocorrência
de DMG e a grande maioria das pacientes com DMG, posteriormente tornam-se diabéticas do
tipo II (CHU et al., 2007; KIM et al., 2007). A meta-análise realizada por Chu et al. (2007)
evidenciou odds ratio de 2,14 (IC 95% 1,82 - 2,53); 3,56 (IC 95% 3,05 – 4,21) e 8,56 (IC 95%
5,07 – 16,04) entre mulheres com sobrepeso, obesas ou severamente obesas, respectivamente,
para o desenvolvimento de DMG. Segundo Rand et al., (2004), o clássico trabalho de
Mattheeuws et al., (1984) associando a obesidade à intolerância à glicose não pode descartar a
ocorrência conjunta de antagonismo promovido pela progesterona, uma vez que de 15 cadelas
avaliadas, 13 não eram castradas.
Da mesma forma que diversos genes já foram descritos como possivelmente
envolvidos na ocorrência de diferentes formas de diabetes, podendo inclusive, ser pesquisados
com objetivo de identificação de pacientes em risco; alguns genes são candidatos ao
envolvimento no início de ambas formas do DMG (auto-imune e não auto-imune)
(WATANAKE et al., 2007).
Diversos autores postularam que a ocorrência da resistência à insulina, intolerância à
glicose e predisposição ao diabetes nas fêmeas caninas durante a fase do diestro pode depender
não somente de altas concentrações de progesterona e de GH, características desta fase do ciclo
110
(EINEGENMANN et al., 1983), mas sim depender de fatores genéticos, auto-imunes ou
ambientais associados (FELDMAN & NELSON, 2004; RAND et al., 2004; CATCHPOLE et
al., 2005) como observado no estudo de Pöppl & González (2005). Eingenmann et al. (1983)
evidenciaram a ausência na supressão do GH frente à hiperglicemia em fêmeas em diestro ou
tratadas com medroxiprogesterona. O presente trabalho evidenciou pela primeira vez, a
influência do ciclo estral sobre as características da ligação da insulina ao IR, afinidade da
ligação insulina-receptor, bem como nos passos iniciais da transdução do sinal insulínico no
músculo de cadelas nas fases do ciclo estral. Esses achados levantam um novo foco de estudos
na compreensão da resistência insulínica observada no diestro, e ajudam a refutar a idéia de que
essa resistência à insulina deva-se somente a elevadas concentrações de GH frente a
progesterona, uma vez que este achado é mais freqüentemente observado em cadelas idosas
(EINGENMANN et al., 1983; SELMAN et al., 1994; RIJINBERK et al., 2003) e a população
deste estudo era composta de cadelas jovens.
O índice HOMA (homeostatic model assessment) de percentual de atividade das
células β (HOMA B) e de resistência à insulina (HOMA R) foi desenvolvido por Matthews et
al. (1985). Este índice tem como objetivo de avaliar a sensibilidade à insulina e a atividade das
células β, utilizando somente os valores de glicemia e de insulinemia em jejum. Neste estudo, a
aplicação do índice HOMA foi adaptada, uma vez que foi desenvolvido para uso em humanos.
Como o estudo original considerou que pacientes saudáveis com peso normal e menos de 35
anos apresentavam atividade das células β de 100% e resistência à insulina = 1; para fins de
comparação, considerou-se, neste trabalho, que o grupo anestro (composto de cadelas com
111
menos de 2 anos, saudáveis e com escore corporal ideal) apresentava atividade de células β de
100% e resistência à insulina = 1.
O HOMA B mostrou-se levemente aumentado nas pacientes em estro ou em diestro
quando comparado aos valores encontrados em cadelas em anestro; apesar de não ter atingido
significância estatística. Como este índice é calculado a partir de valores obtidos em jejum,
quando a liberação de insulina pelas células β é baixa, índice com valores mais altos indicariam
que o mecanismo glicose-secreção de insulina pode estar acometido. Este resultado talvez
indique que nestas fases do ciclo estral ocorra um “esforço” maior das células β para a
manutenção de uma euglicemia em jejum.
No entanto, os valores de insulinemia observados durante o IVGTT revelam valores
maiores de insulina no grupo anestro, em comparação aos demais grupos. Porém esta maior
secreção de insulina no grupo anestro não foi significativa. Renauld et al., (1990) demonstraram
que, a indução artificial de ciclo estral por meio da administração seqüencial de estrógenos e
progesterona, promove um acúmulo pancreático de insulina, reduzindo a resposta insulínica
após desafio com glicose, o que está de acordo com o observado neste estudo (menor secreção
de insulina nas fases de estro e diestro quando comparadas ao grupo anestro, apesar da diferença
não ter sido significativa).
Da mesma forma, o HOMA R não apresentou diferença estatística, apesar do maior
valor no grupo diestro em comparação ao anestro. A falta de valores de referência para estes
parâmetros em cães, bem como pontos de corte em testes provocativos prejudicam a avaliação
112
destes parâmetros e justificam este tipo de investigação. Oliveira et al. (2005) revisando a
utilização clínica do índice HOMA na pratica clínica reconhecem o prejuízo da falta de um
valor de corte estabelecido para classificação dos resultados em pacientes humanos.
O ∆Ins/∆Gli aos 5 minutos de IVGTT, foi adaptado de Omori et al. (1991).
Originalmente o ∆Ins/∆Gli foi aplicado ao OGTT e verificado o ∆Ins/∆Gli aos 30 minutos de
teste, como método auxiliar no diagnóstico de pacientes com DMG. Pacientes humanas com
valores de ∆Ins/∆Gli inferiores a 54 são consideradas como fracamente responsivas (low
responders) ao desafio com glicose; mesma resposta observada em pacientes humanos com
diabetes. Pesquisas clínicas evidenciaram que eventualmente estas low responders irão
desenvolver diabetes no futuro após término da gestação (OMORI et al., 1991). Apesar da
diferença não ter sido significativa com relação ao grupo anestro; as medias dos grupos estro e
diestro encontram-se dentro da faixa considerada de risco (< 54). De acordo com estes achados,
Renauld et al. (1990) evidenciaram menor resposta insulínica frente à glicose em decorrência de
exposição aos estrógenos e à progesterona em cães.
O índice insulinogênico; proposto inicialmente como uma ferramenta ainda mais fácil
de avaliação da sensibilidade à insulina, sem necessidade de uso de equações ou programas
computacionais como exigido para cálculo do HOMA (GUTT et al., 2000), e a relação glicose /
insulina corrigida (KOGIKA et al., 2001; FELDMAN & NELSON, 2004); apesar de mostrarem
a média do grupo diestro na faixa de hiperinsulinemia relativa, em relação aos grupos anestro e
estro, não houve significância estatística.
113
A avaliação da razão de prevalência para estes índices com os respectivos intervalos de
confiança com 95% de confiancia também falhou em mostrar associação significativa entre
estas variáveis, uma vez que o intervalo de confiança passa pelo valor trivial 1 (WAGNER &
CALLEGARI-JAQUES, 1998). No entanto, a partir dos valores dos intervalos de confianças
pode-se tirar duas grandes conclusões: (1) o amplo intervalo reforça a necessidade de aumentar
o número (n) amostral para que se possa identificar mais facilmente pacientes em maior risco de
DM na população, (2) os valores relativamente altos dos limites superiores dos intervalos de
confiança 95%; afastando-se do 1 de forma moderada a intensa, evidenciam que apesar de não
significativa a associação entre a fase do ciclo estral e a resistência à insulina, a exposição
(ocorrência de estro ou diestro) representam um importante fator de risco para população
(WAGNER & CALLEGARI-JAQUES, 1998). Cianni et al. (2007) evidenciaram a presença de
risco de morbidades associadas ao DMG mesmo em mulheres gestantes com somente um valor
alterado durante um OGTT, mostrando que os efeitos metabólicos da DMG podem estar
presentes mesmo quando os testes falham em demonstrar este quadro.
Scaramal et al., (1997), estudando o impacto do ciclo estral sobre a sensibilidade à
insulina, observaram resultados diferentes do presente estudo; talvez em parte por diferenças
metodológicas, como por exemplo, o uso de uma dose de 1 g / kg de glicose para realização do
IVGTT. Renauld & Garrido (1992) demonstraram em cães diferentes respostas de glicose e de
insulina frente a diferentes doses de glicose para realização de IVGTT. No estudo de Scaramal
et al. (1997) nos grupos estro e diestro os picos de glicose foram menores após infusão de
glicose, ao passo que no grupo estro a resposta insulínica foi maior. Contudo nas pacientes nas
fases de estro e diestro com diabetes, ocorre uma falha na resposta insulínica durante IVGTT em
114
decorrência de fatores pancreáticos (lesões histológicas às ilhotas de Langerhans) e extra-
pancreáticos (hiperprodução basal de GH e falha na supressão da produção do GH frente a
hiperglicemia) (EIGENMANN et al., 1983; SCARAMAL et al., 1997).
Os achados deste estudo, apesar de não significativos, concordam com Renauld et al.
(1990) e Scaramal et al. (1997) na observação de valores menores de resposta insulínica durante
o diestro e que este potencial diabetogênico, começa já durante o estro (EIGENMANN et al.,
1983; SCARAMAL et al., 1997; SELMAN et al., 1994; RIJNBERK et al., 2003). Contudo,
somente uma pequena minoria das cadelas não castradas desenvolvem diabetes (apesar da
maioria das que desenvolvem estarem no diestro) (CATCHPOLE et al., 2005; PÖPPL &
GONZÁLES, 2005). A maior secreção de GH frente a concentrações normais de progesterona
acontece somente em pacientes mais idosas, o que ajuda a explicar porque a apresentação típica
de um canino diabético, costuma ser uma fêmea, não castrada, com idade normalmente superior
a 7 anos e com início dos sintomas no diestro (FELDMAN & NELSON; PÖPPL &
GONZÁLEZ, 2005).
Assim, pode-se concluir que a fase do diestro, per se, não seria a responsável pela
indução do diabetes (RENAULD et al., 1990; SCARAMAL et al., 1997). Da mesma forma,
diversas evidências apontam que a ocorrência do DMG humano também depende de uma série
de fatores genéticos e ambientais (COUSINS, 1991; CHU et al., 2007; KIM et al., 2007;
WATANAKE et al., 2007). Assim, a patogênese do diabetes iniciado durante o diestro seria
mais complexa do que a simples superprodução de GH frente a progesterona como postulado
por Eingenmann et al. (1983), e dependeria mais de diversos fatores ambientais, auto-imunes,
115
raciais e genéticos. Contudo, a ocorrência do diestro em pacientes que apresentam qualquer
anormalidade pancreática que falhe em compensar a resistência à insulina característica desta
fase, representa um fator de risco ao desenvolvimento de diabetes. Pacientes idosas, mais
expostas temporalmente e periodicamente aos hormônios diabetogênicos; ou com qualquer
predisposição genética à ocorrência de DM estariam ainda mais suscetíveis a desenvolver DM
no diestro (SCARAMAL et al.,1997; FELDMAN & NELSON, 2004).
A determinação da concentração muscular de glicogênio não mostrou diferenças
metabólicas do tecido muscular em resposta à insulina durante o ciclo estral em cadelas. Uma
vez que a síntese de glicogênio depende do estímulo insulínico (NEWSHOLME &
DIMITRIADIS, 2001), um estado de resistência à insulina poderia provocar menor captação de
glicose e síntese de glicogênio nas pacientes estudadas. Todos animais passaram por jejum de 8
a 12 horas para realização do IVGTT e OSH; sendo que a coleta dos tecidos foi realizada
aproximadamente 2 horas após a infusão de glicose. Talvez, se no presente estudo a avaliação
do glicogênio hepático tivesse sido realizada, uma vez que na situação de jejum pré-operatório,
o fígado teria suas reservas de glicogênio significativamente reduzidas, e responderia
prontamente ao estímulo insulínico após o IVGTT, com síntese de novo glicogênio, essa
determinação auxiliria na investigação dos efeitos celulares da insulina. Esta avaliação fica
comprometida no tecido muscular em decorrência da sua característica de preservar seu
glicogênio mais para atividade muscular, sofrendo pequena variação frente a um jejum curto
como estabelecido no pré-operatório.
116
Desta forma, os estudos realizados in vivo, apesar de sugerirem a presença de
alterações interessantes na sensibilidade insulínica e capacidade de resposta secretora pelas
células β pancreáticas, não foram eficazes em comprovar estas alterações. Contudo, os estudos
in vitro sobre as características do receptor insulínico e a ativação da via de sinalização intra-
celular da resposta insulínica no músculo, apresentaram resultados bem interessantes,
evidenciando prejuízo na sensibilidade tecidual à insulina no estro e no diestro. Este achado é
muito importante, pois não se conhece na literatura veterinária, o papel de alterações nas
características dos receptores de insulina e dos passos pós-receptor de sinalização da insulina na
etiopatogênese do diabetes mellitus canino.
Diferenças marcantes foram detectadas na sensibilidade tecidual à insulina no que diz
respeito à capacidade de ligação máxima (Bmax) dos receptores insulínicos e na quantidade de
hormônio necessária para dissociar 50% dos sítios de ligação (Kd). Estas diferenças ficam claras
na análise da curva de inibição competitiva da ligação da
125
I-insulina frente a concentrações
crescentes de insulina não marcada, onde observa-se a necessidade de maiores concentrações de
hormônio não marcado para inibir 50% da ligação total nos grupos estro e diestro. A análise dos
resultados das curvas de saturação com hormônio não marcado pelo método de Scatchard
(1959); utilizando o programa Kell for Windows (MUNSON & RODBARD, 2000;
McPHERSON, 1985), evidenciou a presença de dois sítios de ligação à insulina no tecido
muscular das pacientes; sendo uma população de receptores de alta afinidade / baixa capacidade
(1) e outra de baixa afinidade / alta capacidade (2). A relação curvilínea observada nas
diferentes fases do ciclo estral na representação gráfica da relação B/F (Bound/Free) contra a
quantidade ligada de hormônio (B) por pM de proteina, confirma a presença destes sítios. Os
117
mesmos sítios de ligação foram demonstrados em músculo, coração e fígado de cães neonatos e
adultos por Johnston et al. (1991). Estes autores evidenciaram nos sítios de alta afinidade uma
maior capacidade de ligação hormonal no tecido muscular de cães neonatos em comparação aos
adultos, porém sem diferenças de afinidade hormônio-receptor.
Neste trabalho foi observada uma maior capacidade de ligação dos sítios de alta
afinidade (Bmax1) em pacientes durante o estro ou diestro, quando comparadas ao grupo
anestro. Contudo, a maior capacidade de ligação foi acompanhada de uma maior constante de
dissociação (Kd1) nos grupos estro e diestro; o que representa uma menor capacidade de ligação
/ afinidade; uma vez que mais hormônio é necessário para que 50% dos receptores permaneçam
ocupados (GRIFFIN & OJEDA, 2004). Desta forma; pode-se inferir, que durante o ciclo estral
ocorrem alterações fisiológicas na afinidade de ligação entre a insulina e seus receptores de alta
afinidade, e o maior número de sítios de ligação, com objetivo de manter a homeostase da
resposta insulínica face às variações hormonais características do ciclo estral, parece compensar
esta menor afinidade. Os testes de sensibilidade a insulina falharam em evidenciar a presença de
um estado de resistência à insulina, confirmando que as alterações das características da ligação
insulina-receptor mantêm a resposta fisiológica da insulina no tecido muscular de cadelas
durante as fases do ciclo estral. Nenhuma alteração significativa foi encontrada na capacidade
máxima de ligação dos sítios de baixa afinidade (Bmax2); ou em suas constantes de dissociação
(Kd2). O único trabalho encontrado na literatura a avaliar estes parâmetros em cães através de
estudos de ligação com
125
I-insulina; verificando diferenças nas propriedades de ligação da
insulina entre neonatos e cães adultos também não observou diferenças com relação aos sítios
de baixa afinidade (JOHNSTON et al., 1991). Estes achados motivam a especulação sobre o
118
caráter constitutivo e não passível de regulação dos receptores de baixa afinidade / alta
capacidade.
É importante ressaltar que estes achados de menor sensibilidade à insulina foram no
tecido muscular esquelético. Diferenças na sensibilidade à insulina são esperadas em diferentes
tecidos alvo, como fígado, tecido adiposo sub-cutâneo, tecido adiposo intra-abdominal, tecido
adiposo marrom e tecido muscular (GRIFFIN & OJEDA, 2004). O índice HOMA R, bem como
o índice insulinogênico e a relação insulina/glicose corrigida são baseados em medidas estáticas,
e desta forma avaliam basicamente a sensibilidade hepática à insulina (MATTHEWS et al.,
1985; OLIVEIRA, et al., 2005). O uso de testes mais simples, como o índice HOMA, tem sido
validado para uso clínico diante do padrão ouro para avaliação da sensibilidade à insulina
(clamp euglicemico hiperinsulinêmico). A técnica do clamp apresenta a capacidade de avaliar
tanto a resistência periférica como a hepática aos efeitos da insulina, assim como o IVGTT.
(KIRWAN et al., 2001; OLIVEIRA et al., 2005). A ausência de alterações significativas nas
respostas ao IVGTT, assim como nos índices calculados a partir da insulinemia e glicemia
basais, permite inferir que o tecido muscular seria o principal sítio de resistência à insulina
durante o diestro, apesar desta resistência não desencadear intolerância à glicose na população
estudada.
Ryan & Enns (1988) avaliando a ligação da insulina em adipócitos de ratos, não
observaram alterações na ligação em ratas prenhes, contudo; o transporte de glicose foi reduzido
nestas células; sugerindo um defeito pós-receptor para esta alteração. Em estudo in vitro de
cultura de adipócitos de ratos; o estradiol aumentou a ligação máxima, ao passo que a
119
progesterona reduziu não só a ligação mas também o transporte de glicose. O mesmo foi
promovido pela prolactina (RYAN & ENNS, 1991). Vargas et al. (2004) estudaram alterações
na concentração e distribuição celular de GLUT 4 em cadelas em anestro, obesas e diabéticas. A
falta de trabalhos neste campo da pesquisa em diabetes mellitus canina dificulta a interpretação
destes achados.
Após a ligação da insulina ao IR, ocorre a autofosforilação das sub-unidades β do
receptor em resíduos de tirosina. A fosforilação destes resíduos estimula o recrutamento de
moléculas intra-celulares chamadas de IRSs (substratos ao receptor de insulina), os quais sofrem
fosforilação e intermediam os primeiros passos intra-celulares na propagação do sinal insulínico
(PIROLA et al., 2004). A capacidade de fosforilação destes receptores também foi avaliada
neste trabalho, por meio da fosforilação do substrato sintético Poly (Glu;Tyr 4:1); o qual
mimetiza o IRS-1 (KUCHARSKI et al., 1999; ORCY et al., 2005). A fosforilação do IRS-1 é
considerada o primeiro passo intra-celular da transdução do sinal insulínico (SALTIEL &
KAHN, 2001; PIROLA et al., 2004; DOMINICI et al., 2005). A fosforilação basal apresentou-
se reduzida nas pacientes em estro e diestro quando comparadas aquelas dos animais em
anestro.
O principal marcador hormonal da fase estrogência do ciclo estral canino é o estradiol,
que aumenta durante o pró-estro e reduz durante o estro. Apesar da progesterona ser o marcador
hormonal do diestro; seus níveis começam a elevar-se já no começo do pró-estro em decorrência
do aumento da atividade folicular (HOFFMAMM et al., 1996; OLIVEIRA et al., 2003;
RODRIGUES & RODRIGUES, 2002). A maior secreção de GH pela glândula mamária foi
120
evidenciada em cadelas em resposta a exposição à progesterona (SELMAN et al., RIJINBERK
et al., 2003). Dominici et al. (2005) propõem uma série de mecanismos pelos quais o GH pode
promover seus efeitos diabetogênicos, dentre os quais é proposto que a exposição crônica ao
GH está associada à menor resposta à insulina em termos de IR, IRS-1 e outros mensageiros
intra-celulares no músculo esquelético. A modulação da sensibilidade à insulina pelo GH parece
envolver também uma maior expressão de proteínas SOCS e maior fosforilação do IRS-1 em
resíduos de serina.
De uma forma geral, as diferentes fases do ciclo estral não mostraram alterações de
sensibilidade à insulina; uma vez que diferentes provas de sensibilidade ao hormônio (glicemia
de jejum, lipemia, fructosamina, IVGTT, HOMA B, HOMA R, ∆Ins/∆Gli 5 min. IVGTT, índice
insulinogênico e relação insulina / glicose corrigida) falharam em demonstrar um estado de
resistência insulínica durante as fases de estro ou de diestro, apesar dos intervalos de confiança
das razões de prevalecia chamarem a atenção para o risco no estro e no diestro.
No entanto importantes alterações nos receptores e nas etapas pós-receptor foram
identificadas e abrem caminhos para investigações com relação à modulação molecular da
sensibilidade à insulina durante o ciclo estral. Atualmente, desconhece-se o papel de eventos ou
defeitos nos receptores de insulina ou em passos pós-receptor na etiologia do diabetes mellitus
canino (FELDMAN & NELSON, 2004).
Concluindo, as fases do ciclo estral promovem uma menor sensibilidade do IR frente à
insulina, no entanto esta é compensada por um aumento na concentração do IR, de forma que a
121
sensibilidade tecidual à insulina é pouco afetada. A falha neste mecanismo compensatório pode
ser o fator determinante do desenvolvimento de DM em fêmeas durante o diestro. Esta nova
proposta fisiopatológica do desenvolvimento do diabetes canino vem complementar as hipóteses
já citadas (EIGENMANN et al., 1983; RYAN & ENNS, 1988; SCARAMAL et al., 1997) para
explicar a maior prevalência de DM durante o diestro em cães (RAND et al., 2004; PÖPPL &
GONZÁLEZ, 2005; CATCHPOLE et al., 2005).
122
CAPÍTULO II
Influência do Complexo Hiperplasia Endometrial Cística – Piometra
sobre a Sensibilidade à Insulina
RESULTADOS
Animais
Após a análise dos critérios de inclusão e os resultados de citologia vaginal, de
histopatologia uterina e de hemograma, 13 pacientes compuseram o grupo hiperplasia
endometrial cística (HEC)- piometra, sendo 5 classificadas no grupo HEC (2 Filas, 1 Cocker, 1
Dobermann e 1 Rottweiller) e as outras 8 classificadas no grupo piometra (2 SRD, 2 Collies, 1
Boxer, 1 Fila Brasileiro, 1 Weimaraner e 1 Pastora Branca). A composição dos grupos HEC e
piometra foi feita de acordo com os achados da histopatologia uterina, segundo critérios
descritos por Dow (1957). Por tratar-se de morbidades associadas ao diestro (SMITH, 2006),
como controle foram utilizadas as pacientes do grupo diestro (6 SRD, 2 Cockers, 1 Boxer, 1
Akita, 1 Rottweiller, 1 Fox e 1 Pitt-Bull).
As médias da idade e do peso das cadelas HEC e piometra foram significativamente
maiores que aqueles verificados nos animais do grupo controle diestro. Foi observada diferença
significativa do escore corporal entre as cadelas em diestro e aquelas HEC, porém sem
relevância biológica (Tabela 7).
123
Tabela 7. Média, desvio padrão e intervalo de idade, peso e escore corporal das pacientes
avaliadas dentro do grupo hiperplasia endometrial cística - piometra.
Grupo Idade (anos) Peso (kg) Escore Corporal
Diestro (n = 14)
3,65 ± 3,25 (0,7 – 10) 16,6
±
8,5 (6,1 – 26,6) 3,15 ± 0,31 (3 – 3,5)
HEC (n = 5)
9 ± 1,87 (6 – 11)* 29,7
±
13,6 (10 – 43)* 2,5 ± 0,61 (2 – 3,5)*
Piometra (n = 8)
7,12 ± 3,09 (4 – 13)* 27,7
±
11,3 (17 – 53)* 3 ± 0,26 (2,5 – 3,5)
* indica diferença significativa com relação ao grupo controle / diestro, p < 0,05 (ANOVA de
uma via seguida de teste de Tukey).
Determinações Hematológicas
A tabela 8 apresenta os valores do eritrograma dos grupos de cadelas HEC, piometras
e controles (diestro). Não foram constatadas variações significativas dos valores de
hemoglobina, eritrócitos e hematócrito entre os diferentes grupos experimentais.
Na figura 17 estão representados os valores de leucócitos totais sanguíneos nos
diferentes grupos experimentais estudados. As pacientes dos grupos HEC e piometra
apresentaram valores de leucócitos significativamente maiores que aquele observado no grupo
diestro. Contudo, não foi verificada diferença significativa entre os grupos HEC e piometra.
Tabela 8. Média, desvio padrão e intervalo dos parâmetros hematológicos (eritrócitos,
hematócrito e hemogoblina) das pacientes avaliadas dentro do grande grupo hiperplasia
endometrial cística - piometra.
Grupo Eritrócitos (x10
6
/mm
3
) Hematócrito (%) Hemoglobina (g/dL)
Diestro
7,06 ± 1,13 (5,42 – 7,9) 49,1
±
8,5 (40 – 60) 16,7 ± 2,6 (13,9 – 21,6)
HEC
4,68 ± 1,57 (2,6 – 6,35) 31,6
±
11,9 (16 – 47) 11,04 ± 4,1 (5,7 – 16,5)
Piometra
4,32 ± 1,07 (3,9 – 5,54) 31,68
±
8 (29 – 41) 10,76 ± 2,7 (9,9 – 14,2)
124
Figura 17. Medianas, intervalos interquartis e percentis 10 e 90% dos valores de leucócitos
totais observados nos diferentes grupos. * representa diferença significativa através da análise
variância de uma via, seguido do teste de Tukey (p = 0,004). n = 5 – 14.
Determinações Bioquímicas
Na tabela 9 estão representados os resultados de triglicerídeos e de colesterol dos
grupos diestro, HEC e piometra. Não foram observadas diferenças significativas dos valores de
triacilglicerol e de colesterol entre os grupos experimentais estudados.
Diestro HEC Piometra
01234
Leucócitos Totais x10³/uL
0
20
40
60
80
100
120
*
*
125
As concentrações séricas de fructosamina nos grupos diestro, piometra e HEC estão
representadas na figura 18. No grupo piometra foi constatada uma diminuição significativa da
concentração de fructosamina quando comparada aquela verificada no grupo controle diestro.
Entre os outros grupos não foram verificadas diferenças significativas.
Tabela 9. Valores (média ± desvio padrão da média e intervalo) de triglicerídeos e de colesterol
séricos das pacientes em diestro (controles), com HEC e com piometra. Não foi observada
diferença significativa (p > 0,05) na analise de variância de uma via.
Triglicerídeos (mg/dL) Colesterol (mg/dL)
Diestro
82,2
±
38,7 (42,2 – 179,68) 156,45 ± 47,3 (79 – 236)
HEC
93
±
47,4 (66,4 – 159,4) 140,6 ± 33,6 (101,7 – 179,21)
Piometra
86,4
±
32,7 (46,9 – 161,7) 199,8 ± 105,1 (111,7 – 406,9)
0
50
100
150
200
250
300
350
400
Diestro HEC Piometra
Fructosamina umol/L
Diestro
HEC
Piometra
Figura 18. Valores (média ± desvio padrão da média) de fructosamina no soro dos grupos
diestro, HEC e piometra. * representa diferença significativa (p < 0,01) entre os grupos diestro e
piometra. ANOVA de uma via seguida de teste de Tukey. n = 5 – 14.
*
126
As concentrações de fibrinogênio plasmático nos grupos experimentais diestro, HEC e
piometra estão representadas na figura 19. Não foram verificadas variações significativas
(p>0,05) dos valores de fibrinogênio entre os grupos estudados. Porém, os valores de
fibrinogênio nos grupos HEC e piometra foram cerca de 63% e 40%, respectivamente, maiores
que aqueles verificados no grupo diestro.
0
1
2
3
4
5
6
7
Diestro HEC Piometra
Fibrinogênio (g/L)
Diestro
HEC
Piometra
Figura 19. Valores (média ± desvio padrão da média) de fibrinogênio plasmático dos grupos
diestro, HEC e piometra. n = 5 – 14.
Teste de Tolerância à Glicose Intra-Venosa (IVGTT)
Os resultados de glicemia e de insulinemia basais, e os valores observados nos tempos
de IVGTT avaliados foram analisados por meio da análise de variância com medidas repetidas e
comparação por contrastes. Na figura 20 estão representados os valores de glicose plasmática
basal e durante o IVGTT em cadelas em diestro, HEC e piometra. Não foram verificadas
127
diferenças significativas dos valores de glicose plasmática basais entre os três grupos
experimentais estudados.
Contudo, observou-se diferença significativa entre os grupos HEC e piometra em
comparação ao grupo diestro nos tempos 30 (p < 0,001), 45 (p = 0,002) e 60 (p = 0,026)
minutos de IVGTT. Nos tempos 7 (p = 0,043) e 30 (0,019) minutos foram constatadas
diferenças significativas entre os grupos HEC e piometra (Figura 20). Com respeito a
insulinemia ao longo do IVGTT; a interação dos fatores tempo mais grupo não foi significativa
(p = 0,073), sendo significativo somente o fator grupo (diestro vs. Piometra, p < 0,0001)
(Figura 21) com valores mais elevados de insulinemia nas pacientes com piometra nos tempos
de IVGTT estudados.
As Figuras 22 a e b representam os valores dos índices de atividade de células β
(HOMA B) e de resistência à insulina (HOMA R), calculados com base nos resultados de
glicemia e insulinemia basais. No grupo piometra, o índice HOMA B apresentou um aumento
significativo (p = 0,038) em relação ao grupo diestro pelo teste de Mann-Whitney. Da mesma
forma o índice HOMA R de resistência à insulina apresentou uma diferença significativa pelo
teste t de Student (p = 0,029) entre o grupo piometra e o grupo diestro.
Também foi calculada a relação entre a resposta glicêmica e insulínica aos 5 minutos
do IVGTT (∆Ins/∆Gli) (Figura 23). As pacientes com piometra apresentaram um ∆Ins/∆Gli aos
5 minutos de IVGTT significativamente maior (p = 0,023) que aquelas do grupo diestro, quando
analisadas pelo teste t de Student.
128
0
50
100
150
200
250
300
350
400
0 102030405060
Tempo (min)
Glicemia (mg/dL)
Diestro
HEC
Piometra
Figura 20. Valores médios de glicemia nos grupos diestro, HEC e piometra ao longo do
IVGTT.
#
representa diferença significativa (p < 0,05) entre HEC e piometra. * representa
diferença significativa entre HEC e piometra com relação ao grupo diestro (análise de variância
para medidas repetidas com comparação de contrastes).
0
50
100
150
200
250
300
350
400
0 102030405060
Tempo (min)
Insulinemia (uU/mL)
Diestro
Piometra
Figura 21. Valores médios de insulinemia obtidos nos grupos diestro e piometra ao longo do
IVGTT. * representa diferença significativa (p < 0,05) entre o grupo piometra e o grupo diestro
(análise de variância para medidas repetidas com comparação de contrastes).
*
#
*
*
*
*
*
#
129
Diestro Piometra
0123
Aumento HOMA B em comparação ao basal (=1)
0
2
4
6
8
10
Diestro Piometra
0123
HOMA R
0
1
2
3
4
5
Figura 22a. Medianas, amplitude interquartil e percentis 10 e 90% do aumento no índice
HOMA B em relação ao basal (grupo anestro = 1) dos grupos diestro e piometra. * representa
diferença significativa (p < 0,05) pelo teste de Mann-Whitney. Figura 22b. Medianas,
amplitude interquartil e percentis 10 e 90% do índice HOMA R dos grupos diestro e piometra. *
representa diferença significativa (p < 0,05) pelo teste t de Student.
*
a
b *
130
Figura 23. Medianas, amplitude interquartil e percentis 10 e 90% do ∆Ins/∆Gli aos 5 minutos
de IVGTT dos grupos diestro e piometra. * representa diferença significativa (p < 0,05) pelo
teste t de Student.
Ainda com base nas concentrações de glicose e de insulina no tempo zero do IVGTT
(jejum), foram calculados os índices insulinogênico e a relação insulina/glicose corrigida.
Segundo Kogika et al. (2001), considera-se o paciente com hiperinsulinemia relativa, quando o
índice insulinogênico ultrapassar o valor de 0,235 e a relação insulina/glicose corrigida passar
de 30. A tabela 10 apresenta as médias, desvio padrão e intervalo dos índices calculados.
Ambos índices apresentaram-se bons indicadores de resistência à insulina (p = 0,032 e p = 0,03
respectivamente), apresentando valores significativamente maiores no grupo piometra em
comparação ao grupo diestro pelo teste t de Student.
Diestro Piometra
0123
Δ
Ins/
Δ
Gli 5 - min. IVGTT
0
50
100
150
200
250
300
*
131
Tabela 10. Médias, desvio padrão e intervalo do índice insulinogênico e da relação
insulina/glicose corrigida.
Índice Insulinogênico* Relação Ins / Gli Corrigida**
Diestro
Piometra
0,250 ± 0,12 (0,131 – 0,418)
0,504 ± 0,24 (0,162 – 0,805)
#
39,1 ± 22,04 (19,37 – 80,8)
78,35 ± 36,46 (25,09 – 122,9)
#
* valor de referência: aumentado > 0,235.** valor de referência: aumentado > 30.
#
diferença
significativa em relação ao grupo diestro (p < 0,05).
Correlações de Pearson e Odds ratio
Frente à diferença significativa entre idade e peso das pacientes com piometra em
comparação as pacientes em diestro; foi determinada a correlação linear de Pearson entre
leucograma, idade e peso e os índices de sensibilidade à insulina calculados a partir dos
resultados do IVGTT. A correlação entre os fatores de confusão leucograma, idade e peso
também foi determinada. A tabela 11 apresenta os valores de r
2
, r de Pearson e valor do p das
correlações realizadas. O leucograma foi a variável que melhor se relacionou com os índices de
sensibilidade à insulina, sendo significativa a correlação (p < 0,05) para HOMA R, ∆Ins/∆Gli
aos 5 minutos de IVGTT, índice insulinogênico e relação insulina/glicose corrigida. A variável
peso só apresentou correlação com o HOMA R; enquanto a idade apresentou correlação
somente com o HOMA B. Não foi observada correlação significativa entre leucograma, peso ou
idade (p > 0,05).
A partir das diferenças observadas entre os índices de sensibilidade à insulina foi
calculada a razão de chances (odds ratio – OR) das pacientes com piometra (fator de exposição)
132
apresentarem resistência à insulina (evento) em comparação as pacientes em diestro (grupo não
exposto) sendo possível a determinação do OR médio (tabela 12). Para o cálculo do OR dos
índices HOMA B e HOMA R foram considerados como resistentes as pacientes com valor
superior a media do grupo anestro mais dois desvios padrão. Para cálculo do OR dos índices
∆Ins/∆Gli aos 5 minutos de IVGTT, índice insulinogênico e relação insulina/glicose corrigida
foram adotados os pontos de corte descritos nos trabalhos originais (i.e., < 54 para ∆Ins/∆Gli
aos 5 minutos de IVGTT; > 0,235 para índice insulinogênico e > 30 para relação
insulina/glicose corrigida – OMORI et al., 1992; KOGIKA et al., 2001; FELDMAN &
NELSON, 2004). Contudo para cálculo do OR médio não foi considerado o parâmetro
∆Ins/∆Gli aos 5 minutos de IVGTT. Para cada OR foi calculado o intervalo de confiança 95%
(IC 95%), sendo que para o OR médio, também foi calculado o intervalo de confiança 99% (IC
99%).
Apesar dos elevados OR calculados para os índices de sensibilidade à insulina, HOMA
B, HOMA R, índice insulinogênico e relação insulina/glicose corrigida, terem apresentando
nulidade de associação (IC 95% passando pelo valor 1 = trivial); o cálculo do OR médio (7,58)
apresentou significância em ambos níveis (α 0,05 e 0,01). O OR do ∆Ins/∆Gli aos 5 minutos de
IVGTT apresentou associação negativa significativa (OR < 1).
133
Tabela 11. Resultados de r², r de Pearson e valores de p das variáveis de sensibilidade à insulina
correlacionadas aos fatores de confusão leucograma, idade e peso.
Variáveis correlacionadas r² r de Pearson Valor de p
Leucograma vs. HOMA B
Leucograma vs. HOMA R
Leucograma vs. ∆Ins/∆Gli 5 min IVGTT
Leucograma vs. Índice insulinogênico
Leucograma vs. Ins/Gli corrigida
Idade vs. HOMA B
Idade vs. HOMA R
Idade vs. ∆Ins/∆Gli 5 min IVGTT
Idade vs. Índice insulinogênico
Idade vs. Relação Ins/Gli corrigida
Peso vs. HOMA B
Peso vs. HOMA R
Peso vs. ∆Ins/∆Gli 5 min IVGTT
Peso vs. Índice insulinogênico
Peso vs. Relação Ins/Gli corrigida
Peso vs. Leucograma
Peso vs. Idade
Idade vs. Leucograma
0,073
0,502
0,305
0,421
0,381
0,638
0,244
0,152
0,145
0,164
0,142
0,368
0,205
0,172
0,153
0,235
0,240
0,104
0,272
0,709
0,553
0,649
0,618
0,799
0,494
0,390
0,382
0,406
0,378
0,607
0,453
0,415
0,392
0,485
0,490
0,324
0,346
< 0,01*
0,040*
0,012*
0,0186*
< 0,001*
0,072
0,168
0,178
0,150
0,183
0,021*
0,104
0,140
0,166
0,078
0,075
0,258
* representa diferença significativa (p < 0,05) para análise de correlação de Pearson.
134
Tabela 12. Razão de chances (odds ratio) e intervalos de confiança de resultados alterados nos
testes de sensibilidade à insulina realizados.
Índice Calculado Odds ratio (Intervalo de Confiança 95%)
HOMA B
5,0 (0,74 – 33,44)
HOMA R
12,0 (0,8
– 177)
∆Ins/∆Gli 5 min IVGTT
0,03 (0,001 – 0,6)
#
Índice insulinogênico
6,66 (0,49 – 82,2)
Relação Ins/Gli corrigida
6,66 (0,49 – 82,2)
OR médio (IC 95% da média)
7,58 (3,84 – 11,32)*
OR médio (IC 99% da média)
7,58 (1,37 – 13,79)**
#
representa associação não nula (IC não incluí o valor 1). * representa associação não nula para
um α 95% e 3 gl. ** representa associação não nula para um alfa de 99% e 3 gl.
Determinação do Glicogênio Muscular
A Figura 24 representa os valores de glicogênio muscular nos diferentes grupos
experimentais estudados. Não foram constatadas diferenças significativas na concentração de
glicogênio muscular após o IVGTT entre os grupos experimentais diestro, HEC e piometra.
135
Figura 24. Medianas, amplitude interquartil e percentis 10 e 90% do glicogênio muscular das
pacientes nos grupos diestro, HEC e piometra. Não foi observada diferença significativa pela
ANOVA de uma via (p = 0,465). n = 4 a 12 animais por grupo.
Ensaios de Ligação da
125
I-Insulina em Presença de Diferentes Concentrações de Insulina
Humana
Os ensaios de ligação da
125
I-Insulina em presença de concentrações crescentes de
insulina não marcada evidenciou, por meio da análise de saturação com hormônio não marcado
com o programa Kell for Windows, sítios de ligação à insulina de alta e baixa afinidade. A
constante de dissociação destes sítios (Kds) serão aqui referidos como Kd 1 e Kd 2,
respectivamente. A capacidade máxima de ligação destes sítios também foi determinada sendo
aqui referida como Bmax 1 e Bmax 2. Os valores de Kd e Bmax para os sítios de alta afinidade
Diestro HEC Piometra
01234
mg de glicogênio /100g de músculo
0
50
100
150
200
250
136
foram expressos em fM/mg de proteína, enquanto que para os sítios de baixa afinidade; os
valores de Kd e Bmax foram expressos em pM/mg de proteína.
A figura 25 apresenta as curvas de inibição competitiva da ligação de
125
I-insulina em
membranas de músculo esquelético, pelo aumento da concentração de insulina humana não
marcada. As figuras 26 a e b apresentam as curvas de Scatchard elaboradas a partir das curvas
de competição entre
125
I-insulina e insulina humana não marcada em tecido muscular das
pacientes em diestro e com piometra. A relação da insulina ligada/livre (Bound/Free – B/F) foi
representada graficamente contra a quantidade de insulina ligada (Bound – B) por pM de
proteina. A relação curvilínea observada nestes gráficos demonstra a presença de sítios de alta e
baixa afinidade.
A tabela 13 representa os resultados obtidos de Kd e Bmax para cada sítio de ligação à
insulina em tecido muscular de cadelas nas diferentes em diestro ou com piometra. As pacientes
com piometra apresentaram o Kd 1 quase três vezes maior que aquele encontrado em pacientes
em diestro (p = 0,004). Apesar da observação de maiores valores de Bmax 1 nas pacientes com
piometra e de maiores valores de Bmax 2 nas pacientes em diestro; estas diferenças não foram
significativas (p = 0,158 e p = 0,092 respectivamente). Quanto aos valores de Kd 2 não foram
observadas diferenças significativas entre os dois grupos (p = 0,970). Todos os parâmetros
foram analisados através de teste t de Student.
137
Figura 25 - Inibição competitiva da ligação de
125
I-insulina em membranas de músculo
esquelético, pelo aumento da concentração de insulina humana não marcada. Cada ponto
representa a média de duas preparações de membrana em duplicata.
a
138
Figura 25 a e b - Curvas de Scatchard em preparações de membrana de tecido muscular
esquelético de fêmeas caninas durante o diestro e em fêmeas com piometra. Cada ponto
representa a média de duas preparações de membrana em duplicata. Curvas representativas dos
grupos diestro (a) e piometra (b).
Tabela 13. Média e desvio padrão dos valores de Kd (constante de dissociação) dos sítios de
ligação da insulina de alta (Kd 1) e de baixa (Kd 2) afinidade e a capacidade de ligação máxima
destes sítios (Bmax 1 e Bmax 2) nas pacientes em diestro ou com piometra.
Kd 1
(fM/mg ptn)
Bmax 1
(fM/mg ptn)
Kd 2
(pM/mg ptn)
Bmax 2
(pM/mg ptn)
Diestro
15,56 ± 3,88 1,24 ± 0,24 18,56 ± 7,36 0,77 ± 0,37
Piometra
41,04 ± 16,95* 2,09 ± 1,35 18,37 ± 11,8 0,49 ± 0,23
* Representa diferença significativa (p < 0,01) em relação ao grupo controle (diestro) pelo teste
t de Student. n = 8 animais por grupo.
b
139
Fosforilação do Substrato Sintético Poly (Glu,Tyr 4:1)
A Figura 27 representa os resultados de fosforilação basal nas preparações de
membrana de músculo de cadelas em diestro ou com piometra. Os resultados de fosforilação do
substrato sintético Poly (Glu, Tyr 4:1) não apresentaram diferenças significativas, por meio de
teste t de Student, entre as pacientes em diestro e as pacientes com piometra.
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
Diestro Piometra
cpm
Figura 27. Médias e desvio padrão dos valores de fosforilação do substrato sintético Poly (Glu,
Tyr 4:1) em preparações de membrana de tecido muscular esquelético de pacientes em diestro
ou com piometra. n = 6 animais por grupo.
140
DISCUSSÃO
A maior incidência do complexo HEC-P por volta dos 9 anos de idade e a maior
predisposição de certas raças à doença; como o Rottweiller, o Pastor Alemão e o Collie (raças
do grupo HEC ou piometra) justificam a diferença significativa observada entre a idade e os
pesos das pacientes dos grupos HEC e piometra quando comparados aqueles do grupo controle
diestro (NISKANEN & THRUSFIELD, 1998). A diferença significativa na idade e no peso das
pacientes do grupo HEC-P poderia representar fatores de confusão na interpretação dos
resultados. Primeiramente, pode-se esperar uma menor sensibilidade à insulina em pacientes
mais idosas (FELDMAN & NELSON, 2004), assim como em pacientes com maior peso,
representando maior porte das pacientes (uma vez que para serem admitidas no estudo a
condição eutrófica foi um critério de inclusão). Cães de grande porte apresentam maior secreção
do hormônio GH durante o crescimento (FAVIER et al., 2001) e também maior concentração de
somatotrofos na hipófise (KROOK et al., 1960). A análise da correlação de Pearson entre as
variáveis, idade, peso e leucograma (indicador de estado inflamatório) não foi significativa (r <
0,5; p > 0,05).
Também como critério de inclusão nos grupos HEC e piometra, foi adotada a presença
de leucocitose como um indicador de processo inflamatório/infeccioso (THRALL, 2004).
Feldman & Nelson (2004) salientam o potencial de resistência à insulina frente a qualquer
moléstia inflamatória, infecciosa, hormonal ou neoplásica. A ocorrência do complexo HEC-P
atende a todas estas condições; exceto a de moléstia neoplásica. Contudo, estes animais
apresentam hiperplasia endometrial (ARORA, et al., 2006; SMITH, 2006). O fibrinogênio
141
plasmático é considerado uma proteína de fase aguda, cuja concentração plasmática aumenta
frente a um processo inflamatório (THRALL, 2004). No presente estudo, não foram constatas
diferenças significativas nas concentrações do fibrinogênio plasmático entre os grupos
experimentais estudados, apesar de valores acima do limite de referência (2-4 g/L) terem sido
evidenciados nas pacientes dos grupos HEC e piometra.
A diferenciação entre o quadro de HEC e de piometra pode ser estabelecida pelo o
hemograma, os sinais clínicos e a determinação da proteína C reativa; com até 97% de
segurança (FRANSSON et al., 2004). No presente estudo a diferenciação entre estes dois
quadros patológicos (HEC e piometra) foi feita de acordo com critérios definidos por Dow
(1959a,b), que distinguiu quatro estágios histopatológicos do complexo HEC-P. Os estágios I
(HEC não complicada) e II (HEC com infiltrado plasmocitário) foram considerados como HEC.
Os estágios III (HEC com endometrite aguda) e IV (HEC com endometrite crônica) foram
considerados como piometra. A análise da apresentação clínica das pacientes, respostas à terapia
e às provas de sensibilidade à insulina, risco anestésico ou mesmo resposta do hemograma e do
fibrinogênio plasmático não foram úteis para a diferenciação entre o complexo HEC e P; assim
foi adotado como critério na separação dos grupos a histologia do útero.
A síndrome sepse representa um espectro de alterações patofisiologicas que resultam
de uma resposta inflamatória exuberante pelo hospedeiro em resposta a um evento estimulador
específico (BLACKWELL & CHRISTMAN, 1996; DAS, 2003a). A inflamação apresenta um
papel fundamental no processo de morte dos patógenos ao criar um ambiente hostil via
produção de moléculas oxidantes e ativação dos linfócitos B e T (GRIMBLE, 2002). O quadro
142
clínico da síndrome sepse pode variar de alterações fisiológicas moderadas a severa disfunção
múltipla de órgãos e a morte (BLACKWELL & CHRISTMAN, 1996). Durante uma resposta
inflamatória aguda ocorre uma alteração metabólica de forma a permitir uma maior aporte de
nutrientes para o sistema imunológico (SI). Assim, a presença de um estado de resistência à
insulina moderado, promove uma menor captação de glicose pelos tecidos muscular e adiposo,
favorecendo a utilização da glicose pelo SI. Da mesma forma, há uma tendência a hiperlipemia,
especialmente hipertrigliceridemia (GRIMBLE, 2002). Citocinas pró-inflamatórias como a IL-
1, IL-6, TNF-α medeiam o aumento nos lipídeos, estimulam a gliconeogênese e a produção de
hormônios diabetogênicos e reduzem a sensibilidade à insulina (BLACKWELL &
CHRISTMAN, 1996; GRIMBLE, 2002; DAS, 2003a).
Basso et al. (2006) evidenciaram que 54% das pacientes com piometra avaliadas
apresentavam pelo menos dois sinais de cardinais de sepse; como leucocitose ou leucopenia,
taquicardia, taquipnéia e hipo ou hipertermia. Todas as pacientes dos grupos HEC ou piometra
do presente estudo apresentaram pelo menos dois destes sinais. Contudo; não foi observada
correlação entre o estado inflamatório/infeccioso das pacientes com HEC-P, e aumento
significativo nos parâmetros de lipemia avaliados.
A determinação do colesterol sérico aproximou-se da significância (p = 0,09), o que
deixa margem para discussão se uma possível diferença não poderia ter sido observada se fosse
verificado o colesterol LDL e HDL, separadamente. Das (2003a) reporta a ocorrência de
menores valores de colesterol HDL e maiores valores de VLDL, LDL, triglicerídeos, glicerol e
ácidos graxos livres em pacientes humanos com sepse quando comparados aos controles
143
saudáveis. A principal lipoproteína nos cães é a HDL (BAILHACHE et al., 2003). Eventuais
reduções na sua concentração dificilmente teriam as mesmas repercussões observadas em
humanos; como por exemplo, aterosclerose e maior risco cardiovascular; comumente associados
à resistência à insulina e aos quadros inflamatórios/sépticos crônicos (GRIMBLE, 2002).
A redução significativa de captação de glicose promovido pelo estado inflamatório
aumenta os valores de glicemia (DAS, 2003a). Maiores valores de HbA1c também já foram
detectados em pacientes humanos sofrendo de quadros inflamatórios crônicos (GRIMBLE,
2002). A fructosamina, utilizada como um indicador das flutuações glicêmica de curto prazo,
representando a glicemia média das últimas semanas (± 2 semanas), vem cada vez mais sendo
utilizada para diagnóstico e monitoramento glicêmico em cães (LOSTE & MARCA, 2001).
Contudo; neste estudo observa-se valores de fructosaminemia significativamente menores nas
pacientes com piometra, quando comparado aqueles encontrados em fêmeas com HEC ou em
diestro. A provável explicação para esse achado reside no fato de que a fructosamina deriva das
proteínas séricas em especial da albumina (JENSEN, 1995). A concentração de fructosamina
deve ser avaliada juntamente com a concentração plasmática total de proteínas e de albumina
em especial, uma vez que a hipoproteinemia e a hipoalbuminemia podem facilmente provocar
valores reduzidos de fructosamina (LOSTE & MARCA, 1999).
Apesar de no presente estudo não termos detectado diferenças significativas dos
valores de proteína total (dados não apresentados), entre os grupos diestro, HEC e piometra,
acredita-se que as fêmeas com piometra apresentaram, frente à intensa reação inflamatória, um
aumento da síntese e liberação de globulinas. A redução na síntese de albumina em decorrência
144
da maior síntese de globulinas, com objetivo de manutenção do equilíbrio osmótico do líquido
intra-vascular, pode ter promovido um estado de hipoalbuminemia, o qual justificaria os valores
mais baixos de fructosamina no grupo piometra (KANEKO et al., 1997). O catabolismo
protéico geralmente presente em quadros sépticos (GRIMBLE, 2002), levaria à redução na
síntese de proteínas plasmática e consequentemente reduziria a formação de fructosamina no
plasma (THRALL, 2004).
De fato, não foi detectada diferença significativa na concentração de glicose
plasmática entre as pacientes em diestro ou em HEC-P. A ocorrência de hiperglicemia nas fases
iniciais da síndrome sepse, assim como a hipoglicemia, característica da fase final de um quadro
séptico (DAS, 2003a) não foram observadas neste estudo. A significativa diferença de idade
entre as pacientes também não influenciou nos valores de glicemia basal, de acordo com
achados de Faria et al. (2005). No entanto, a resposta glicêmica das pacientes com HEC ou
piometra ao desafio com glicose foi significativamente diferente das pacientes em diestro,
evidenciando intolerância à glicose. A intolerância à glicose foi mais evidente no grupo
piometra que no grupo HEC; especialmente nos tempos 7 e 30 minutos de IVGTT,
possivelmente, por alterações na primeira e na segunda fase de secreção de insulina. A
insulinemia foi mensurada somente nas pacientes com piometra. A concentração de insulina
circulante basal e durante o IVGTT foi significativamente maior nas cadelas com piometra,
quando comparadas àquelas verificadas nas cadelas em diestro. Esse padrão de resposta
evidencia não só o processo de intolerância à glicose, mas principalmente um quadro de
resistência à insulina em decorrência do quadro infeccioso/inflamatório.
145
Das (2003a) sugere que a resistência à insulina presente em quadros sépticos
possivelmente seja em decorrência de citocinas como por exemplo a IL-1, IL-2, IL-6, TNF-α;
resultando em menor captação de glicose para os tecidos. A captação de glicose no tecido
muscular durante a sepse deve-se em parte a uma maior expressão de GLUT-1, e a glicose
captada é preferencialmente metabolizada a lactato; motivo pelo qual é comum ocorrência de
hiperlactatemia, hiperglicemia e hiperinsulinemia em pacientes com sepse (DAS, 2003a).
Paradoxalmente, a redução da sensibilidade à insulina, que contribuí para o processo patológico,
pode apresentar um efeito benéfico na resposta à infecção e à injúria. Este estado de menor
sensibilidade à insulina permite que o SI utilize esta glicose não captada, uma vez que não
depende deste hormônio para captação de glicose (BESEDOVSKY & DEL REY, 1990). Além
do mais, a secreção dos hormônios contra-reguladores à insulina aumenta o catabolismo
protéico e modulam as ações anabólicas e anti-catabólicas da insulina sobre o metabolismo
intermediário (GRIMBLE, 2002; DAS, 2003a).
Diversos mecanismos para a resistência insulínica presente em quadros
inflamatórios/sépticos já foram descritos (GRIMBLE, 2002; DAS 2003a,b; KIM et al., 2005;
HE et al., 2006; JAGER et al. 2006). Alguns destes mecanismos puderam ser avaliados neste
estudo. A avaliação dos índices de sensibilidade à insulina HOMA R, índice insulinogênico e
relação insulina/glicose corrigida foram eficazes na demonstração de um estado significativo de
resistência à insulina frente à condição piometra em comparação ao grupo diestro.
Apesar da ausência de valores de referência em cães para fins de comparação dos
índices HOMA R e HOMA B prejudicar a análise do quadro de resposta insulínica as variações
146
glicêmicas (OLIVEIRA et al., 2005), neste trabalho ficou claro a presença de uma resistência à
insulina (HOMA R) associada a uma maior atividade das células β (HOMA B) em pacientes
com piometra (MATTHEWS et al., 1985). Katz et al. (2000) demonstraram a validade da
utilização do índice HOMA em substituição ao uso do clamp euglicemico hiperinsulinemico.
De acordo com esta observação, a interpretação do ∆Ins/∆Gli aos 5 minutos de IVGTT (Omori
et al., 1991) evidencia que as pacientes com piometra apresentam uma resposta esperada de
secreção de insulina; especialmente quando comparadas as pacientes em diestro que
apresentaram uma maior tendência a menor liberação de insulina, como evidenciado nos
resultados do capítulo anterior.
O odds ratio médio, calculado para as alterações nos índices de sensibilidade à
insulina utilizados neste trabalho, evidenciou que as pacientes com piometra apresentam 7,58
vezes mais chances de desenvolverem resistência à insulina quando comparadas a fêmeas em
diestro.
Segundo diversos autores (Maedler et al., 2002; Das 2003a; Wachlin et al., 2003;
Ohaha-Imaizumi et al., 2004; Steer et al., 2006) em quadros sépticos ocorreria menor secreção
de insulina devido ao aumento, principalmente, na concentração de IL-1. Este mecanismo de
hipo-secreção das células beta e estímulo à necrose em presença de IL-1 são semelhantes
aqueles envolvidos na etiopatogênese do diabetes tipo I (MAEDLER et al., 2002; OHAHA-
IMAIZUMI et al., 2004; STEER et al., 2006). Contrariamente, neste trabalho foi observado em
pacientes com piometra um aumento na secreção de insulina e uma resistência periférica à
insulina, contudo, os valores de IL-1 não foram dosados nestas pacientes. Assim, a resistência à
147
insulina associada a uma maior resposta das células β, podem levar à exaustão da produção de
insulina e ao estabelecimento de um quadro de DM, especialmente, em pacientes com outros
fatores de risco associados; como idade avançada, diestro, alimentação desequilibrada e
predisposição genética (RAND et al., 2004).
Uma grande discussão envolve o uso de insulina em quadros sépticos não somente
para estabilizar os níveis glicêmicos, mas com o objetivo de suprimir a síntese de MIF, TNF,
IL-1, IL-6 e de radicais livres e aumentar a produção de interleucinas anti-inflamatórias como
IL-10 e IL-4 que, sabidamente, são os efeitos anti-inflamatórios deste hormônio (KOGIKA et
al., 2001; DAS, 2003a,b). Kogika et al. (2001) ressaltam que em quadros sépticos é necessária
uma avaliação cautelosa antes da indicação de terapia insulínica, que deve ser restrita aos
pacientes com resistência periférica a ação do hormônio ou aqueles com redução na
concentração sérica de insulina; uma vez que muitos pacientes apresentam-se hipoglicemicos ou
hiperinsulinêmicos durante as fases mais avançadas de um quadro séptico. No caso das
pacientes com piometra, o uso de soluções glicosadas para fluidoterapia destas pacientes,
procedimento de uso corrente na rotina hospitalar, também deve ser visto com cautela devido à
resistência insulínica muitas vezes presentes nessa pacientes. Quando possível o uso da insulina
corrige a hiperglicemia induzida por estresse, melhora a função do miocárdio (DAS, 2003a) e
modula o processo inflamatório (DAS, 2003b), o que suporta o uso clínico de insulina, com ou
sem potássio.
A idade e o peso médio das pacientes com HEC-P foram superiores aqueles
verificados nas pacientes do grupo diestro. A determinação de qual fator, piometra, idade ou
148
peso, foi importante para a explicação da ocorrência da resistência à insulina em pacientes com
piometra, foi realizada pela análise de correlação de Pearson. Esta ferramenta evidenciou que o
leucograma apresentou correlação significativa com os índices HOMA R, ∆Ins/∆Gli aos 5
minutos de IVGTT, índice insulinogênico e relação insulina/glicose corrigida. A idade
apresentou correlação significativa somente com o HOMA B, enquanto o peso apresentou
correlação significativa somente com o HOMA R. Desta forma, pode-se assumir que a maior
idade e o maior peso das pacientes com piometra pouco influenciou o quadro de resistência à
insulina, sendo o prinicipal determinante desta resistência à insulina o quadro piometra;
caracterizado pelos elevados valores de leucograma.
Na literatura consultada foram encontrados somente dois artigos que correlacionaram
piometra à DM. Krook et al., (1960), revisando arquivos de 10.993 necropsias no período de
1930 a 1957, evidenciaram 487 casos de piometra e 167 casos de diabetes. Os autores
encontraram 5 casos onde co-existiram a condição piometra e diabetes; apesar de julgarem que
esta associação provavelmente é maior, pois somente a análise dos arquivos de necropsia não
permitiu a adequada identificação de mais casos de diabetes. Klinkenberg et al. (2006) sugerem
a castração como um procedimento protetor contra o desenvolvimento de diabetes e para evitar
ocorrência de piometra, apesar de não terem identificado casos de piometra antes do
desenvolvimento de diabetes nos casos estudados em seu trabalho.
Pöppl & González (2005) relataram um caso de diagnóstico conjunto de diabetes e de
piometra, marcado por poliúria, polidipsia, hiperglicemia e glicosúria. A castração da paciente
não reverteu os sintomas de diabetes, assim, a terapia insulínica foi instituinda para o controle a
149
longo prazo da glicemia da paciente (DMID). Pöppl et al. (2005) relataram a ocorrência de
diabetes mellitus hiperosmolar não cetósico (DMHNC) em uma paciente diabética não castrada
que veio a desenvolver piometra. O DMHNC é uma condição de extrema resistência à insulina
(CAMPOS et al., 2003), possivelmente, em decorrência do quadro séptico e agravado pela fase
do diestro.
O estudo de Krook et al. (1960) evidenciou uma associação significativa entre
obesidade, diabetes e piometra; o que eles denominaram síndrome da diabetes-obesidade-
piometra; uma vez que 79% das pacientes com diabetes e 78% das pacientes com piometra eram
obesas ou apresentavam sobrepeso; no entanto, os autores não definiram uma relação de causa-
efeito para esta associação. Atualmente é conhecido o efeito pró-inflamatório da obesidade,
mediado principalmente pela maior secreção de citocinas / hormônios, como o TNF-α e a
leptina, assim como o papel destas adipocitocinas na redução da sensibilidade à insulina
(GRIMBLE, 2002). Da mesma forma; a maior inter-conversão de hormônios esteróides pelo
tecido adiposo pode estar envolvida na prevalência da ocorrência de piometra nas fêmeas com
sobre peso (CORBOULD et al., 2002; COSTA E DUARTE, 2006). Uma maior produção de
estrógenos a partir da aromatização de andrógenos (BÉLANGER et al., 2006) pode aumentar a
sensibilidade do endométrio à progesterona (DHALIWAL et al., 1999; BOSSCHERE et al.,
2002; VERVERIDIS et al., 2004), o que em última análise, poderia estimular o
desenvolvimento de HEC e de piometra (FAYRER-HOSKEN et al., 1992; NISKANEN &
THRUSFIELD, 1998).
150
A determinação do glicogênio muscular não foi eficaz em evidenciar prejuízos aos
efeitos intra-celulares da insulina. No entanto menores concentrações de glicogênio muscular
(valores não significativos) foram observadas em pacientes com HEC-P. A resistência à insulina
presente nestas pacientes pode explicar estes valores reduzidos de glicogênio, pois a insulina
estimula a síntese do glicogênio ativando a enzima glicogênio sintase e impede a glicogenólise
via inibição da enzima glicogênio fosforilase (NEWSHOLME & DIMITRIADIS, 2001).
No primeiro capítulo deste trabalho foi demonstrado, pelo aumento significativo no Kd
nos sítios de ligação à insulina de alta afinidade, que pacientes em diestro apresentam uma
redução importante na afinidade entre a insulina e o IR. O aumento compensatório na
capacidade total de ligação (Bmax) desses sítios foi capaz de compensar esta menor afinidade,
motivo pelo qual as provas de sensibilidade à insulina mantiveram-se inalteradas.
Os experimentos de competição entre
125
I-insulina e insulina humana não marcada,
com posterior análise dos resultados com o programa Kell / Ligand (MUNSON & RODBARD,
1980; McPHERSON, 1985) evidenciaram que a condição piometra reduz a afinidade hormônio-
receptor dos sítios de alta afinidade de forma mais severa do que ocorre no diestro (valores de
Kd quase três vezes maiores que no diestro e 4 vezes maiores que no anestro). No entanto um
aumento compensatório na capacidade de ligação máxima (Bmax) destes sítios não foi
observado, o que resulta em uma resistência tecidual à ação da insulina ainda mais intensa. A
menor capacidade de ligação observada para os sítios de baixa afinidade (Bmax 2) não foi
significativa, assim como observou-se no capítulo anterior deste trabalho onde não se encontrou
diferenças significativas entre Bmax e Kds dos sítios de baixa afinidade. Johnston et al. (1991)
151
estudando a ligação insulina-receptor em tecidos de cães adultos e de filhotes não observaram
diferenças nas características de ligação dos sítios de baixa afinidade. Estes achados sugerem
que os receptores de baixa afinidade e alta capacidade seriam constitutivos. Assim a modulação
fisiológica dos receptores de insulina seria via receptores de alta afinidade e baixa capacidade.
A resistência à insulina nas pacientes com piometra fica clara quando se compara a
curva glicêmica destas pacientes com aquelas em diestro (controles), constatando-se uma
redução dos valores glicêmicos mais lenta. Após 60 minutos da sobrecarga de glicose eles ainda
acham-se 47% mais elevados que os valores iniciais. Nas cadelas em diestro, o retorno dos
valores glicêmicos a valores semelhantes ao tempo 0 ocorre aos 45 minutos após a injeção de
glicose.
Contudo, frente ao estado séptico/inflamatório das pacientes com piometra, também
ficou evidente uma menor ação hepática da insulina através da análise dos valores do HOMA R,
índice insulinogênico e relação insulina/glicose corrigida (OLIVEIRA et al., 2005). A análise
destes índices reflete principalmente a ação da insulina no fígado por utilizar no cálculo a
mensuração de insulinemia e glicemia basal. Estes fatores associados provocaram uma maior
resposta das células β frente ao quadro de resistência à insulina; identificado através da análise
da resposta insulínica durante o IVGTT, assim como na avaliação dos índices HOMA B e
∆Ins/∆Gli aos 5 minutos de IVGTT, o que a longo prazo pode servir como fator desencadeante
de um estado diabético em decorrência de exaustão na produção de insulina.
152
Neste trabalho não foi verificada alteração significativa da fosforilação do susbstrato
sintético poly (Glu:Tyr) nas pacientes com piometra quando comparadas as cadelas em diestro.
Contudo, alguns trabalhos demonstram que a fosforilação do IR e IRS-1 está reduzida em
quadros sépticos (DAS, 2003a); assim como, a fosforilação do IRS-1 em resíduos de serina
(KIM et al., 2005) e a menor expressão do IRS-1 induzida pela IL-1β (JAGER et al., 2006).
Outras causas já relatadas para as pertubações no metabolismo lipídico e da glicose,
observadas nos quadros sépticos são: o desenvolvimento de auto-anticorpos contra o IR; efeito
das endotoxinas semelhante à insulina (insulin-like), pertubações nas ações celulares da insulina
pelas endotoxinas e alterações no padrão de secreção da insulina (DAS, 2003a). Não constam na
literatura consultada trabalhos que tenham avaliado os receptores de insulina ou eventos pós-
receptor em quadros sépticos em cães; como por exemplo, a condição HEC-P. Desta forma, este
trabalho pela primeira vez evidência que um estado inflamatório/infeccioso crônico, como a
piometra, é capaz de induzir profundas alterações metabólicas, resultando em resistência à
insulina e risco de desenvolvimento de DM em cães. Trabalhos em humanos já associaram a
ocorrência de estados inflamatórios/infecciosos crônicos e risco de diabetes (IACOPINO, 2001;
SYRENICZ et al., 2006).
Apesar deste trabalho não ter avaliado citocinas inflamatórias, pode-se inferir que o
processo séptico/inflamatório induzido pelos microorganismos intra-uterinos ou toxinas (LPS)
ativam linfócitos T e B para realizarem uma up-regulation de suas respostas imunológicas
(DAS, 2003a). A ativação do receptor de LPS ativa o fator nuclear κB (NF-κB), que uma vez
ativado induz a expressão de moléculas como o TNF-α e IL-1. Também moléculas como o
153
próprio TNF-α, IL-1 e IL-6 podem ativar o NF-κB. Esta moléculas estimulam a atividade
citosólica da fosfolipase A
2
(PLA
2
), induzindo a liberação de ácido araquidônico e a produção
de radicais livres e óxido nítrico livre, os quais apresentam potentes efeitos pró-inflamatórios
(BLACKWELL & CHRISTMAN, 1996; GRIMBLE, 2002; DAS, 2003a). Os resultados deste
estudo permitem supor que esta resposta intensa, com objetivo de resolver a injúria, através da
criação de um micro-ambiente hostil aos patógenos; acabaram gerando um estado de menor
ação hepática da insulina e resistência muscular ao hormônio, com consequente intolerância à
glicose e hiperinsulinemia. Os achados deste trabalho evidenciaram no tecido muscular uma
menor afinidade de ligação do hormônio aos receptores de insulina de alta afinidade, não
acompanhada por uma maior capacidade de ligação. Este achado representa um maior risco de
desenvolvimento de diabetes mellitus em pacientes pré-dispostas.
154
CONCLUSÕES GERAIS
A maior ocorrência de diabetes durante o diestro nas fêmeas caninas parece envolver
uma série de fatores predisponentes, da mesma forma que se observa no diabetes mellitus
gestacional em humanos. A ocorrência de DM durante o diestro na espécie canina é
freqüentemente relacionado ao DMG humano. Os mecanismos citados na literatura para
explicar a maior associação entre diestro e diabetes, parecem não ocorrer em todas as fêmeas no
diestro. A maior produção de GH pela glândula mamária estaria mais evidente em pacientes
mais idosas; da mesma forma que a questão da exposição crônica e repetida aos hormônios
diabetogênicos ao longo da vida; motivo pelo qual é maior a incidência de diabetes em cadelas
com idade avançada. Como somente uma pequena minoria das cadelas não castradas
desenvolve diabetes durante o diestro na idade adulta ou senil, outros fatores de risco podem
estar envolvidos para determinar o ínicio do diabetes, como a predisposição genética, a insulite
imunomediada, a obesidade, a alimentação desequilibrada, os distúrbios endócrinos, a
pancreatite crônica, dentre outros. É menos provável que o diestro per se seja capaz de induzir
diabetes em uma paciente saudável, e sem pré-disposição gênica, apesar de prejudicar o
tratamento de pacientes diabéticas sob terapia insulínica.
Nossos resultados demonstraram que as diversas fases do ciclo estral com sua
caracteristicas próprias regulam a sensibilidade à insulina no tecido muscular. A ocorrência de
estro e de diestro está associada a uma menor afinidade entre os receptores de insulina de alta
afinidade e o hormônio, bem como menor atividade tirosina quinase. Contudo, a resposta do
sistema a esta menor afinidade e atividade tirosina quinase, foi um aumento na capacidade de
155
ligação HR no tecido muscular. Esta maior capacidade de ligação foi capaz de manter a
tolerância à glicose e evitar o surgimento de uma resistência insulínica severa. Desta forma, um
dos fatores que determinariam o surgimento de uma resistência insulínica severa no diestro,
seria o desequilíbrio desse mecanismo compensatório de aumento na capacidade de ligação no
tecido muscular.
Este trabalho é o primeiro a avaliar o impacto do complexo hiperplasia endometrial
cística – piometra, patologia característica da fase do diestro e com pico de incidência em
pacientes idosas com cerca de 8 anos de idade, assim como a diabetes, sobre a sensibilidade à
insulina. Na presença de piometra ficou clara a intensa resistência à insulina e intolerância à
glicose promovida pelo estado inflamatório / séptico das pacientes. A maior secreção
pancreática de insulina na tentativa de vencer a resistência ao hormônio e aumentar a captação
de glicose pelos tecidos não é suficiente para evitar a intolerância à glicose frente ao desafio do
IVGTT. Estas alterações observadas devem-se em parte a intensa redução na afinidade de
ligação hormônio receptor observada nas pacientes com piometra, sendo esta redução ainda
mais intensa que aquela observada durante o estro e o diestro. Entretanto, nos casos de piometra,
esta menor afinidade de ligação não esteve acompanhada de aumento na capacidade de ligação
do hormônio ao receptor no tecido muscular, como observado nas fases de estro e de diestro.
Esta falha em compensar a menor afinidade com aumento na capacidade de ligação resulta em
maior secreção pancreática de insulina para manter a homeostasia da glicose. Esta maior
secreção, a longo prazo, pode resultar em exaustão das células secretoras de insulina e
estabelecimento do diabetes.
156
Estudos com técnicas de biologia molecular poderiam complementar os resultados
deste trabalho, determinando as alterações na expressão dos receptores de insulina ao longo do
ciclo estral e na condição HEC-P. Também outro evento que deveria ser estudado com mais
profundidade seria o mecanismo de transdução do sinal insulínico em outros tecidos nestes
modelos experimentais.
No entanto, os achados desta dissertação chamam atenção e abrem um campo ainda
pouco explorado na medicina veterinária; as características dos receptores de insulina e a
transdução do sinal insulínico em tecidos de cães ao longo do ciclo estral e em patologias
hormonais.
157
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS:
ÁHREN, B.; PACINI, G. Importance of quantifying insulin secretion in relation to insulin
sensitivity to accurately assess beta cell function in clinical studies. Euroepan Journal of
Endocrinology. v. 150: 97-104; 2004.
ARORA, N.; SANFORD, J.; BROWNING, G.F.; SANDY, J.R.; WRIGTH, P.J. A model for
cystic endometrial hyperplasia/pyometra complex in the bitch. Theriogenology. v. 66: 1530-
1536; 2006.
BAILHACHE, E.; NGUYEN, P.; KREMPF, M.; SILIART, B.; MAGOT, T.; OUGUERRAM,
K. Lipoproteins abnormalities in obese insulin-resistant dogs. Metabolism. v. 52 (5): 559-564;
2003.
BASSO, P.C.; BRUN, M.V.; BARCELLOS, H.H.A.; RIVIERA, F.B.; KREUTZ, L.C.;
ANZILIERO, D.; MELATTI, L.; BAIRROS, M.C.; ZILIO, P.P. Validação dos critérios de sepse
em cães com piometra. Anais XVII Congresso Estadual de Medicina Veterinária. Gramado, 25 a
28 de outubro de 2006 – CDROM.
BATISTA, M.R.; SMITH, M.S.; SNEAD, W.L.; CONNOLLY, C.C.; LACY, D.B.; MOORE,
M.C. Chronic estradiol and progesterone treatment in conscious dogs: effects on insulin
sensitivity and response to hypoglicemia. American Journal of Physiology Regulatory
Integrative and Comparative Physiology. v. 289: R1064-R1073; 2005.
BEHREND, E.N. Diabetes mellitus: an update on oral hypoglycemic agents and monitoring
options. Veterinary Medicine. October, p. 743-751, 2002.
BEISCHER, N.A.; OATS, J.N.; HENRY, O.A.; SHEEDY, M.T.; WALSTAB, J.E. Incidence
and severiry of gestacional diabetes mellitus according to country of birth in woman living in
Australia. Diabetes. v. 40, suppl 2: 35-38; 1991.
BÉLANGER, A.G.; HOULDC, F.; LEBELC, S.; BIRONC, S.; BROCHUC, G.; TCHERNOF,
A. Omental and subcutaneous adipose tissue steroid levels in obese men. Steroids. v. 71(8):
674-82; 2006.
BERNE, R.M.; LEVY, M.N.; KOEPPEN, B.M.; STANTON, B.A. Fisiologia. 5ª ed. Rio de
Janeiro: Elsevier, 2004. 1082 p.
BESEDOVSKY, H.O.; DEL REY, A. Interleukin-1 and glucose homeostasis: an example of the
biological relevance of immune-neuroendocrine interactions. Hormone Resarch. v. 31 (1-2):
94-99; 1989.
158
BIGLIARDI, E.; PARMIGIANI, E.; CAVIRANI, S.; LUPPI, A.; BONATI, L.; CORRADI, A.
Ultrassonography and cystic hyperplasia-pyometra complex in the bitch. Reproduction in
Domestic Animals. v. 39: 136-140; 2004.
BLACKWELL, T.S.; CHRISTMAN, J.W. Sepsis and cytokines: current status. British Journal
of Anaesthesia. v. 77: 110-117; 1996.
BOSSCHERE, H.D.; DUCATELLE, R.; VERMEIRSCH, H.; SIMOENS, P.; CORYN, M.
Estrogen-α receptor and progesterone receptor expression in cystic endometrial hyperplasia and
pyometra in the bitch. Anim. Reprod. Sci. 70: 251-259, 2002.
BRADFORD, M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities
of protein utilizen of the protein dye bibding. Anal Biochemistry. v. 72: 248-254; 1976.
CAMPOS, M.V.; BASTOS, M.; MARTINS, T.; LEITÃO, P.; LEMOS, M.; CARVALHEIRO,
M.; RUAS, A. Hiperosmolaridade diabética: Análise retrospectiva de 60 casos. Acta Médica
Portuguesa. v.16: 13-19; 2003.
CATCHPOLE, B.; RISTIC, J.M.; FLEEMAN, L.M.; DAVISON, L.J. Canine diabetes mellitus:
can old dogs teach us new tricks? Diabetologia. v. 48: 1948-1956; 2005.
CHAN, S.J.; STEINER, D.F. Insulin through the ages: phylogeny of a growth promoting and
metabolic regulatory hormone. American Zoology. v. 40, p. 213-222, 2000.
CHU, S.Y.; CALLAGAN, W.M.; KIM, S.Y.; SCHMID, C.H.; LAU, J.; ENGLAND, L.J.;
DIETZ, P.M. Maternal obesity and risk of gestacional diabetes mellitus. Diabetes Care. v. 30
(8): 2070-2076; 2007.
CIANNI, G.D.; SEGHIERI, G.; LENCIONI, C.; CUCCURU, I.; ANICHINI, R.; BELLIS, A.D.;
GHIO, A.; TESI, F.; VOLPE, L.; PRATO, S.D. Normal glucose tolerance and gestacional
diabetes mellitus. What is in between? Diabetes Care. v. 30 (7): 1783-1788; 2007.
CONCANNON, P.W.; MCCANN, J.P.; TEMPLE, M. Biology and endocrinology of ovulation,
pregnancy and parturition in the dog. Journal of Reproduction and Fertillity Suppl. v. 39: 3-25;
1989.
CORBOULD, A.M.; BAWDEN, M.J.; LAVRANOS, T.C.; RODGERS, R.J.; JUDD, S.J. The
effect of obesity on the ratio of type 3 17b-hydroxysteroid dehydrogenase mRNA to cytochrome
P450 aromatase mRNA in subcutaneous abdominal and intra-abdominal adipose tissue of
women. International Journal of Obesity. v. 26: 165–175; 2002.
CORRADA, Y.; ARIAS, D.; RODRÍGUEZ, R.; TORTORA, M.; GOBELLO, C. Combination
dopamine agonist and prostaglandin agonist treatment of cystic endometrial
hyperplasiapyometra complex in the bitch. Theriogenelogy. v. 66-(6-7):1557-1559, 2006.
159
COSTA, J.V.; DUARTE, J.S. Tecido adiposo e adipocitocinas. Acta Medica Portuguesa. v.
19: 251-256; 2006.
COUSINS, L. Insulin sensitivity in pregnancy. Diabetes. v. 40, suppl 2: 39-43; 1991.
DAS, U.N. Current advances in sepsis and septic shock with particular emphasis on the role of
insulin. Med Sci Monit. v. 9 (8): RA181-192, 2003.
DAS, U.N. Insulin in sepsis and septic shock. Journal of the Association of Physicians from
India. v. 51: 695-700; 2003.
De COCK, H.; DUCATELLE, R.; TILMANT, K.; SCHEPPER, J.D. Posible role for insulin-
like growth factor-I in the pathogenesis of cystic endometrial hyperplasia pyometra complex in
the bitch. Theriogenology. 57(9): 2271-2287, 2002.
DEL REY, A.; ROGGERO, E.; RANDOLF, A.; MAHUAD, C.; MCCANN, S.; RETTORI, V.;
BESEDOVSKY, H.O. IL-1 resets glucose homeostasis at central levels. PNAS. v. 103 (43):
16039–16044; 2006.
DHALIWAL, G.K.; ENGLAND, G.C.W.; NOAKES, D.E. Oestrogen and progesterone
receptors in the uterine wall of bitches with cystic endometrial hyperplasia/pyometra. The
Veterinary Record. v. 154: 455-457; 1999.
DOMINICI, F.P.; ARGENTINO, D.P.; MUÑOZ, M.C.; MIQUET, J.G.; SOTELO, A.I.;
TURYN, D. Influence of the crosstalk between growth hormone and insulin signalling on the
modulation of insulin sensitivity. Growth Hormone & IGF Research. v. 15: 324-336; 2005.
DOW, C. Experimental reproduction of the cystic hyperplasia-pyometra complex in the bitch.
Journal of Pathology & Bacteriology. n. 78: 267-278, 1959.
DOW, C. The cystic hyperplasia-pyometra complex in the bitch. Journal of Comparative
Pathology. v. 69: 237-250; 1959.
EINGENMANN, J.E.; EINGENMANN, R.Y.; RIJINBERK, A.; GAAG, I.; ZAPF, J.;
FROESCH, E.R. Progesterona-controlled growth hormone overproduction and naturally
occurring canine diabetes and acromegaly. Acta Endocrinologica. v. 104: 167-176; 1983.
FARIA, P.F.; ARAÚJO, D.F.; SOTO-BLANCO, B. Glicemia em cães obesos e senis. Acta
Scientiae Veterinariae. v. 33 (1): 47-50; 2005.
160
FAVIER, R.P.; MOL, J.A.; KOOISTRA, H.S.; RIJNBERK, A. Large body size in the dog is
associated with transient GH exsses at a young age. Journal of Endocrinology. v. 170: 479-
484; 2001.
FAYER-HOSKEN, R.A.; DURHAM, D.H.; ALLEN, S.; MILLER-LIEBL, D.M.; CAUDLE,
A.B. Follicular cystic ovaries and cystic endometrial hyperplasia in a bitch. Journal of the
American Veterinary Medical Association. 201(1): 107-108, 1992.
FELDMAN, E.C.; NELSON, R.W. Canine and Feline Endocrinology and Reproduction. 3.
ed. Missouri: Saunders, 2004. 1089 p.
FERREIRA, C.R.; LOPES, M.D. Complexo hiperplasia cística endometrial/piometra em
cadelas – revisão. Clínica Veterinária. n. 27, p. 36-44, 2000.
FIENI, F. Clinical evaluation of the use of aglepristone, with or without cloprostenol, to treat
cystic endometrial hyperplasia-pyometra complex in bitches. Theriogenology. v. 66 (6-7):
1550-1556; 2006.
FLEEMAN, L.M.; RAND, J.S. Managament of canine diabetes. Veterinary Clinics of North
Amrica: Small Animal Practice. v. 31, n. 5, p. 855-879, 2001.
FLEEMAN, L.M.; RAND, J.S. Tratamiento a largo plazo del perro diabético. Waltham Focus.
v. 10 (3): 16-23; 2000.
FRANSSON, B.A.; KARLAM, E.; BERGSTROM, A. LAGERSTEDT, A.S.; PARK, J.S.;
EVANS, M.A. RAGLE, C.A. C-reactive protein in the differentiation of pyometra from cystic
endometrial hyperplasia/mucometra in dogs. Journal of the American Animal Hospital
Association. v. 40(5): 391-399; 2004.
GALABOVA, G.; EGERBACHER, M.; AURICH, J.E.; LEITNER, M.; WALTER, I.
Morphological changes of the endometrium epithelium in the bitch during metoestrus and
anoestrus. Reproduction Domestic Animals. v. 38: 415-420, 2003.
GANONG, W.F. Review of Medical Physiology. 22
a
ed. Connecticut: Lange, 2005. 912 p.
GOBELLO, C. Dopamine agonists, anti-progestins, anti-androgens, long-term-release GnRH
agonists and anti-estrogens in canine reproduction: A review. Theriogenology. v. 66: 1560–
1567; 2006.
GRECO, D.S. Diagnosis and treatment of juvenile endócrine disorders in puppies and kittens.
Veterinary Clinics of North America: Small Animal Practice. v. 31, n. 2, p. 401-407, 2001.
161
GRECO, D.S. Diagnosis of diabetes mellitus in dogs. Veterinary Clinics of North America:
Small Animal Practice. v. 31, n. 5, p. 844-853, 2001.
GRIFFIN, J.E.; OJEDA, S.R. Textbook of Endocrine Physiology. 5
th
ed. New York: Oxford
University Press, 2004. 431 p.
GRIMBLE, R.F. Inflammatory status and insulin resistance. Current Opinion in Clinical
Nutrition and Metabolic Care. v. 5:551-559; 2002.
GUPTILL, L.; GLICKMAN, L.; GLICKMAN, N. Time trends and risk factors for diabetes
mellitus in dogs: analysis of veterinary medical data base records. The Veterinary Journal. v.
165, p. 240-247, 2003.
GUTT, M.; DAVIS, C.L.; SPITZER, S.B.; LLABRE, M.M.; KUMAR, M.; CZARNECKI,
E.M.; SCHNEIDERMAN, N.; SKYLER, J.S.; MARKS, J.B. Validation of the insulin
sensitivity index (ISI0,120): comparison with other measures. Diabetes Research and Clinical
Practice. v. 47: 177–184; 2000.
HE, J.; USUI, I.; ISHIZUKA, K.; KANATANI, Y.; HIRATANI, K.; IWATA, M.; BUKHARI,
A.; HARUTA, T.; SASAOKA, T.; KOBAYASHI, M. Interleukin-1β inhibits insulin signaling
with phosphorylating insulin receptor substrate-1 on serine residues in 3T3-L1 adipocytes.
Molecular Endocrinology. v. 20: 114–124; 2006.
HEITMEIER, M.R.; KELLY, C.B.; ENSOR, N.J.; GIBSON, K.A.; MULLIS, K.G.; CORBETT,
J.A.; MAZIASZ, T.J. Role of cyclooxygenase-2 in cytokine-induced β-cell dysfunction and
damage by isolated rat and human islets. The Journal of Biological Chemistry . v. 279 (51):
53145–53151; 2004.
HESS, R.B.; KASS, P.H.; WARD, C.R. Breed distribution of dogs with diabetes mellitus
admitted to a tertiary care facility. Journal of American Veterinary Medical Association. v.
216, n. 9, p. 1414-1417, 2000.
HOENIG, M. Comparative aspects of diabetes mellitus in dogs and cats. Molecular and
Cellular Endocrinology. v. 197, p.221-229, 2002.
HOFFMANN, B.; RIESENBECK, A.; KLEIN, R. Reproductive endocrinology of bitches.
Animal Reproduction Science. v. 42: 275-288; 1996
IACOPINO, A.M. Periodontitis and diabetes interrelationships: role of inflammation. Annals
Periodontology. v. 6 (1): 125-137; 2001.
ISHIGURO, K.; BABA, E.; TORII, R.; TAMADA, H.; KAWATE, N.; HATOYA, S.;
WIJEWARDANA, V.; KUMAGAI, D.; SUGIURA, K.; SAWADA, T.; INABA, T. Reduction
of mucin-1 gene expression associated with increased Escherichia coli adherence in the canine
uterus in the early stage of dioestrus. The Veterinary Journal, v. 173: 325–332; 2007.
162
JAGER, J.; GRÉMEAUX, T.; CORMONT, M.; MARCHAND-BRUSTEL, Y.L.E.; TANTI, J-
F. Interleukin-1β−induced insulin resistance in adipocytes through down-regulation of IRS-1
expression. Endocrinology. First published ahead of print October 12, 2006 as
doi:10.1210/en.2006-0692
JENSEN, A.L. Gycated blood proteins in canine diabetes mellitus. Veterinary Record. v. 137:
401-405; 1995.
JOHNSTON, V.; FRAZZINI, V.; DAVIDHEISER, S.; PRZYBYLSKI, R.J.; KLIEGMAN,
R.M. Insulin receptor nunber and binding affinity in newborn dogs. Pediatric Research. v. 29
(6): 611-614; 1991.
KAIYALA, K.J.; PRIGEON, R.L.; KAHN, S.E.; WOODS, S.C.; PORTE, T.; SCHWARTEZ,
M.W. Reduced β-cell function contributes to impaired glucose tolerance in dogs made obese
with a high-fat feeding. American Journal of Physiology. v. 277, n. 40, p. E659-E667, 1999.
KAIYALA, K.J.; PRIGEON, R.L.; KAHN, S.E.; WOODS, S.C.; SCHWARTEZ, M.W. Obesity
induced by a high-fat diet is asscociated with reduced brain insulin transport in dogs. Diabetes.
v. 49, p. 1525-1533, 2000.
KANEKO, J.J.; HARVEY, J.W.; BRUSS, M.C. Clinical Biochemistry of Domestic Animals.
5. ed. Missouri: Academic Press, 1997. 932 p.
KATZ, A.; NAMBI, S.S.; MATHER, K.; BARON, A.D.; FOLLMANN, D.A.; SULLIVAN, G.;
QUON, M.J. Quantitative insulin sensitivity check index: a simple, accurate method for
assessing insulina sensitivity in humans. The Journal of Clinical Endocrinology &
Metabolism. v. 85 (7): 2402-2410; 2000.
KIM, C.; BERGER, D.K.; CHAMANY, S. Recurrence of gestacional diabetes mellitus.
Diabetes Care. v. 30 (5): 1314-1319; 2007.
KIM, J.A.; YEH, D.C.; VER, M.; LI, Y.; CARRANZA, A. Phosphorylation of ser24 in the
pleckstrin homology domain of insulin receptor substrate-1 by mouse pelle-like
kinase/interleukin-1 receptor-associated kinase: cross-talk between inflammatory signaling and
insulin signaling that may contribute to insulin resistance. The Journal of Biological
Chemistry. v. 280 (24): 23173–23183; 2005.
KIRWAN, J.P.; HUSTON-PRESLEY, L.; KALHAN, S.C.; CATALANO, P.M. Clinically
useful estimates of insulin sensitivity during pregnancy: validation studies in women with
normal glucose tolerance and gestacional diabetes mellitus. Diabates Care. v. 24 (9): 1602-
1607; 2001.
KLINKENBERG, H.; SALLANDER, M.H.; HEDHAMMAR, A. Feeding, exercise and weight
identified as risk factors in canine diabetes mellitus. The Journal of Nutrition. v. 136: 1985S-
1987S; 2006.
163
KOGIKA, M.M.; BRANDÃO, L.P.; JERICÓ, M.M.; HAGIWARA, M.K.; SIMÕES, D.M.N.;
MENDONÇA, B. Determinação das concentrações séricas de glicose e insulina de cães em
choque endotóxico. Ciência Rural. v. 31 (5): 813-817; 2001.
KOOISTRA, H.S.; den HERTOG, E.; OKKENS, A.C.; MOL, J.A.; RIJNBERK, A. Pulsatile
secretion pattern of growth hormone during the luteal phase and mild-anoestrus in beagle
bitches. Journal of Reproduction and Fertility. v.119: 217-222; 2000.
KOOISTRA, H.S.; OKKENS, A.C.; MOL, J.A.; Van GARDEREN, E.; KIRPENSTEIJN, J.;
RIJNBERK, A. Lack of association of progestin-induced cystic endometrial hyperplasia with
GH gene expression in the canine uterus. Journal of Reproduction And Fertillty. Suppl. v.
51: 355-61, 1997.
KROOK, L.; LARSSON, S.; ROONEY, J.R.; The interrelationship of diabetes mellitus, obesity
and pyometra in the dog. American Journal of Veterinary Research. January, p. 120-124,
1960.
KUCHARSKI, L.C.R.; RIBEIRO, M.F.; SCHEIN, V.; DA SILVA, R.S.M.; MARQUES, M.
Insulin binding sites in the gills of the estuarine crab Chasmagnathus granulata. Journal of
Experimental Zoology. v. 279: 118-125; 1997.
KUCHARSKI, L.C.R.; CAPP, E.; CHITTÓ, A.L.F.; TRAPP, M.; SILVA, R.S.M.; MARQUES,
M. Insulin signaling: tyrosine kinase activity in the crab Chasmagnathus granulata gills.
Journal of Experimental Zoology. 283: 91-94, 1999.
LAFLAME, D.P. Development and validation of a body condition score system for dogs.
Canine Practice. v. 22 (2):10-15; 1997.
LEITNER, M.; AURICH, J.E.; GALABOVA, G.; AURICH, C.; WALTER, I. Lectin binding
patterns in normal canine endometrium and in bitches with pyometra and cystic endometrial
hyperplasia. Histology and Histopathology. 18: 787-795, 2003.
LOSTE, A.; MARCA, M.C. Study of the effect of total serum protein and albumin
concentrations on canine fructosamine concentration. Canadian Journal of Veterinary
Research. v. 63: 138-141; 1999.
LOSTE, A.; MARCA, M.C. Fructosamine and glycated hemoglobin in the assesment of
glycaemic control in dogs. Veterinary Research. v. 32: 55-62, 2001.
MAEDLER, k.; SERGEEV, P.; RIS, F.; OBERHOLZER, J.; JOLLER-JEMELKA, H.I.;
SPINAS, G.A.; KAISER, N.; HALBAN, P.A.; DONATH, M.Y. Glucose-induced β-cell
164
production of IL-1β contributes to glucotoxicity in human pancreatic islets. Journal of Clinical
Investigation. v. 110: 851-860; 2002.
MATTHEEUWS, D.; ROTTIERS, M.D.; KANEKO, J.J.; VERMEULEN, M.D. Diabetes
mellitus in dogs: relationship of obesity to glucose tolerance and insulin response. American
Journal of Veterinary Research. v. 45: 98-103; 1984.
MATTHEWS, D.R.; HOSKER, J.P.; RUDENSKI, A.S.; NAYLOR, B.A.; TREACHER, D.F.;
TURNER, R.C. Homeostasis model assessment: insulin resistance and β-cell function from
fasting glucose and insulina concentrations in man. Diabetologia. v. 28: 412-419; 1985.
McGARRY, J.D. Dysregulation of fatty acid metabolism in the etiology of tipe 2 diabetes.
Diabetes. v. 51, p. 7-18, 2002.
McPHERSON, G.A. Analysis of radioligand binding experiments: A collection of computer
programs for the IBM PC. Journal of Pharmacological Methods. v.14: 213-228; 1985.
MOLLER, D.; FLIER, J.S. Insulin resistance. Mechanisms, syndromes, and implications. New
England Journal of Medicine. 3325:938, 1991.
MUNSON, P.J.; RODBARD, D. LIGAND: A versatile computerized approach for
characterization of ligand-binding systems. Analytical Biochemistry. v. 107: 220-239; 1980.
NELSON, R.W. Diabete melito. In: ETTINGER, S.J.; FELDMAN, E.C. (eds.) Tratado de
Medicina Interna Veterinária. 4. ed. São Paulo: Manole, 1997. v2,. p.2085-2122.
NELSON, R.W. Disorders of the endocrine pancreas. In: NELSON R.W. and COUTO, C.G.
(eds.) Small Animal Internal Medicine. 3. ed. St Louis: Mosby, 2003. p. 729-778.
NEUVIANS, T.P.; BERGER, M. Diabetes care in cats and dogs. Diabetic Medicine. v. 19, p.
77-79, 2002.
NEWSHOLME, E.A.; DIMITRIADIS, G.; Integration of biochemical and physiologic effects
of insulin on glucose metabolism. Experimental Clinical Endocrinology Diabetes. v. 109, s.
2, p. S122-S134, 2001.
NILSSON, C.; URSING, D.; TÖRN, C.; ABERG, A.; LANDIN-OLSSON, M. Presence of
GAD antibodies during gestacional diabetes mellitus predicts type 1 diabetes. Diabetes Care. v.
30 (8): 1968-1971; 2007.
NISKANEN, M.; THRUSFIELD, M.V. Associations between age, parity, hormonal therapy
and breed, and pyometra in Finnish dogs. The Veterinary Record. v. 143: 493-498; 1998.
165
NOAKES, D.F.; DHALIWAL, G.K.; ENGLAND, G.C. Cystic endometrial
hyperplasia/pyometra in dogs: a review of the causes and patogénesis. Journal of
Reproduction and Fertility. Suppl. 57: 395-406, 2001.
OHARA-IMAIZUMI, M.; CARDOZO, A.K.; KIKUTA, T.; EIZIRIK, D.L.; NAGAMATSU, S.
The cytokine interleukin-1 reduces the docking and fusion of insulin granules in pancreatic β-
cells, preferentially decreasing the first phase of exocytosis. The Journal of Biological
Chemistry. v. 279 (4): 41271-41274; 2004
OLIVEIRA, E.P.; SOUZA, M.L.A.; LIMA, M.D.A. Índice HOMA (homeostasis model
assessment) na prática clínica: uma revisão. Jornal Brasileiro de Patologia e Medicina
Laboratorial. v. 41 (4): 237-243; 2005.
OLIVEIRA, E.R.S.; MARQUES JUNIOR, A.P.; NEVES, M.M. Endocrinologia reprodutiva da
fertilidade da cadela – revisão. Archives of Veterinary Science. v. 8 (1): 1-12; 2003.
OMORI, Y.; MINEI, S.; UCHIGATA, Y.; SHIMIZU, M.; SANAKA, M.; HONDA, M.;
HIRATA, Y. Comparison of diagnostic criteria of IGT, borderline e GDM: blood glucose curve
and IRI response. Diabetes. v. 40 (2); 30-34; 1991.
ORCY, R.B.; BRUM, I.; SILVA, R.S.M.; KUCHARSKI, L.C.R.; CORLETA, H.v.E.; CAPP,
E. Insulin receptor tyrosine kinase activity and substrate 1 (IRS-1) expression in human
myometrium and leiomyoma. European Journal of Obstetrics & Gynecology and
Reproductive Biology. v. 123(1): 107-10; 2005.
PHILLIPS, P.J. Gestacional diabetes. Worth finding and actively treating. Australian Family
Physician. v. 35 (9): 701-703; 2006.
PIROLA, L.; JOHNSTON, A.N.; Van OBBERGHEN, E. Modulation of insulin action.
Diabetologia. v.47, p. 170-184, 2004
PÖPPL, A.G.; GONZÁLEZ, F.H.D. Aspectos epidemiológicos e clínico-laboratoriais da
diabetes mellitus em cães. Acta. Scien. Veterin. 33(1): 33-40, 2005.
PÖPPL, A.G.; MUCCILLO, M.S.; NEUWALD, E.B.; SORTICA, M.S.; CHEUICHE, S.;
LAMBERTS, M.; GOMES, C. Diabetes mellitus hiperosmolar não cetósico em uma cadela com
piometra – relato de caso. Revista da Universidade Rural – Série Ciências da Vida. v. 25
(supl.):193-194; 2005.
PROPHET, E.B.; MILLS, B.; ARRINGTON, J.B.; SOBIN, L.H. Laboratory methods in
histotechnology. Armed Forces Institute of Pathology. American Registry of Pathology,
Washington, 279 p.; 1992.
166
RAND, J.S.; FLEEMAN, L.M.; FARROW, H.A.; APPLETON, D.J.; LEDERER, R. Canine and
feline diabetes mellitus: nature or nurture? The Journal of Nutrition. v. 134: 2072S-2080S;
2004.
RENAULD, A.; GARRIDO, D. Effect of glucose infusion in dogs on blood sugar, insulinemia
and serum free fatty acid responses. Medicina (Buenos Aires). v. 52: 150-156; 1992.
RENAULD, A.; GOMEZ, N.V.; SCARAMAL, J.D.; GARRIDO, D.; WANKE, M.M. Natural
estrous cycle in normal and diabetic bitches. Basal serum total lipids and cholesterol. Serum
tryglicerides profiles during glucose and insulin tests. Acta Physiology Pharmacology
Theratogeny Latino America. v. 48, p. 41-51, 1998.
RENAULD, A.; GOMEZ, N.V.; SCARAMAL, J.D.; GARRIDO, D.; WANKE, M.M. Serum
insulin, glucose and non esterified fatty acids after administration of follicle-stimulating and
luteinizing hormones in bitches. Medicina (Buenos Aires). v. 63: 28-32; 2003.
RENAULD, A.; GOMEZ, N.V.; SCARAMAL, J.D.; GARRIDO, D.; WANKE, M.M. Natural
estrous cycle in normal and diabetic bitches. II) serum nonesterified fatty acids and serum free
glycerol levels during glucose and insulin tests. Acta Physiology Pharmacology Theratogeny
Latino America. v. 49, p. 44-56, 1999.
RENAULD, A.; SVEDLIK, R.C. Blood sugar, serum insulin and free fatty acid levels in normal
dogs. Sex differences. Acta Physiologyca Latinoamericana. v. 25: 458-461; 1975.
RENAULD, A.; SVERDLIK, R.C.; AGÜERO, A.; PÉREZ, R.L. Influence of estrogen-
progesterone sequential administration on pancreas cytology. Serum insulin anda metabolic
adjustmentes in female dogs. Acta Diabetológica Latina. v. 27: 315-327; 1990.
RENAULD, A.; SVERDLIK, R.C.; LAWZEWITSCH, I.V.; AGÜERO, A.; PÉREZ, R.L.;
RODRÍGUEZ, R.R.; FOGLIA, V.G. Metabolic and hitologycal pancreatic changes induced by
ovariectomy in the female dog. Acta Physiologica Pharmacologica Latinoamericana. v. 37:
289-304; 1987.
RIJNBERK, A.; KOOISTRA, H.S.; MOL, J.A. Endocrine diseases in dogs and cats: similarities
and differencas with endocrine diseases in humans. Growth Hormone and IGF Reasearh. v.
13, p. S158-S164, 2003.
RODRIIGUES, B.A.; RODRIGUES, J.L. Endocrinologia reprodutiva na cadela. Clínica
Veterinária. v. 40: 50-58; 2002.
ROSENFELD, L. Insulin: discovery and controversy. Clinical Chemistry. v. 48, n.12, p. 2270-
2288, 2002.
RUSSELL, M.A.; CARPENTER, M.W.; COUSTAN, D.R. Screening and diagnosis of
gestacional diabetes mellitus. Clinical Obstetrics and Gynecology. v. 50 (4): 949-958; 2007.
167
RYAN, E.A.; ENNS, L. Role of gestacional hormones in the induction of insulin resistance.
Journal of Clinical Endocrionology and Metabolism. 67:341, 1988.
SALTIEL, A.R.;KAHN, C.R. Insulin signalling and the regulation of glucose and lipid
metabolism. Nature. v. 414, p. 799-806, 2001.
SANVITTO, G.L. Estudo filogenético dos receptores cerebrais para insulina. Tese (Doutorado
em Ciências Biológicas: Fisiologia) – Instituto de Ciências Básicas da Saúde, Porto Alegre:
Universidade Federal do Rio Grande do Sul, 1992.
SCARAMAL, J.D.; RENAULD, A.; GOMEZ, N.V.; GARRIDO, D.; WANKE, M.M.;
MARQUEZ, A.G. Natural estrous cycle in normal and diabetic bitches in relation to glucose and
insulin tests. Medicina (Buenos Aires). v. 57: 169-180; 1997.
SCATCHARD, G. The attraction of proteins for small molecules and ions. Annals of the New
York Academy of Sciences. v. 51: 660-677; 1949.
SCHULMAN, R.L. Insulin and others therapies for diabetes mellitus. Veterinary Medicine. p.
334-347, april, 2003.
SELMAN, P.J.; MOL, J.A.; RUTTEMAN, G.R.; RIJNBERK, A. Progestin treatment in the dog
I. Effects on growth hormone, insuli-like growth factorI anf glucose homeostasis. European
Journal of Endocrinology. v. 131, p. 413-421, 1994.
SLATTER, D. Manual de Cirurgia de Pequenos Animais. 3ª ed. São Paulo: Manole. 2 vol.
2713 p. 2007.
SMITH, F.O. Canine pyometra. Theriogenology. v. 66: 610-612; 2006.
SOUZA, A.A.; OLIVEIRA, B.A.; BENJAMIM, S.M.Jr.; OLIVEIRA, C.R.; OLIVEIRA, F.E.;
RIBEIRO, V.M. Diabete melito em cão jovem – relato de caso. ANCLIVEPA Brasil. N. 2, p.
50, 2004. Resumo.
SOWA, R.; SANKE, T. HIRAYAMA, H.; TABATA, H.; FURUTA, H.; NISHIMURA, S.;
NANJU, H. Islet amloyd polipeptide amide causes pheriferal insulin resistance in vivo in dogs.
Diabetologia. v. 33, p. 118-120, 1990.
STEER, S.A.; SCARIM, A.L.; CHAMBERS, K.T.; CORBETT, J.A. Interleukin-1 stimulates b-
cell necrosis and release of the immunological adjuvant HMGB1. PLoS Medicine. v.3 (2):
0253-266; 2006.
SYRENICZ, A.; GARANTY-BOGACKA, B.; SYRENICZ, M.; GEBALA, A.; WALCZAK,
M. Low-grade systemic inflammation and the risk of type 2 diabetes in obese children and
adolescents. Neurology and Endocrinology Letters. v. 27 (4):
Epub ahead of print; 2006.
168
THOMPSON, F.N. Reprodução em mamíferos do sexo feminino. In: REECE, W.O. Dukes:
Fisiologia dos Animais Domésticos. 2ª ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan. p. 644-669;
2006.
THRALL, M.A. Veterinary Hematology and Clinical Biochemistry. Maryland: Lippincott
Williams & Wilkins, 518 p. 2004.
TILG, H.; MOSCHEN, A.R. Adipocytokines: mediators linking adipose tissue, inflammation
and immunity. Nature Reviews Immunology. v. 6:772-786; 2006.
TURYN, D.; SILVA, R.S.M.; MARQUES, M.; DELLACHA, J.M. Caracterization of insulin-
binding sites in turtlethyroid microssomes. Journal Endocrinology. v. 118:157-162; 1986.
Van CRUCHTEN, S.; Van den BROECK,; D’HAESELEER, M.W.; SIMOENS, P.
Proliferation patterns in the canine endometrium during the estrous cycle. Theriogenology. 62:
631-641, 2004.
Van HANDEL, E. Estimation of glycogen in small amounts of tissue. Analytical Biochemistry.
v. 11: 256-265; 1965.
VANNUCCHI, C.I.; SATZINGER, S.; SANTOS, S.E.C. Técnica de citologia vaginal como
método de diagnóstico da fase do ciclo estral em cadelas. Clínica Veterinária. nº9: 14-19;
1997.
VARGAS, A.M.; BARROS, R.P.A.; ZAMPIERI, R.A.; OKAMOTO, M.M.; PAPA, P.C.;
MACHADO, U.F. Abnormal subcellular distribution of GLUT4 protein in obese and insulin-
treated diabetic female dogs. Brazilian Journal of Medical and Biological Research. v. 37:
1095-1101; 2004.
VERVERIDIS, H.N.; BOSCOS, C.M.; STEFANAKIS, A.; SARATSIS, P.; STAMOU, A.I.;
KRAMBOVITIS, E. Serum estradiol-17β, progesterone and respective uterine cytosol receptor
concentrations in bitches with spontaneus pyometra. Theriogenology. 62: 614-623, 2004.
VIEIRA, R. Histórico do diabetes mellitus. Home Page do Prof. Ricardo Viera. Disponível
em <http://www.geocities.com/capecanaveral/launchpad/9071/histórico.html>. Acesso em: 03
nov. 2004.
VOMERO, M.F. Diabete, o novo mal do século. Super Interessante. ed. 180, p. 42-50, 2002.
WACHLIN, G.; AUGSTEIN, P.; SCHRO¨DER, D.; KUTTLER, B.; KLO¨ TING, I.; HEINKE,
P.; SCHMIDT, S. IL-1β, IFN-γ and TNF-α increase vulnerability of pancreatic beta cells to
autoimmune destruction. Journal of Autoimmunity. v. 20: 303–312; 2003.
169
WAGNER, M.B. Aspectos básicos da sumarização de informações em medicina. Jornal de
Pediatria. v. 74: 71-76; 1998.
WAGNER, M.B.; CALLEGARI-JACQUES, S.M. Medidas de associação em estudos
epidemiológicos: risco relativo e odds ratio. Jornal de Pediatria. v. 74: 247-251; 1998.
WATANAKE, R.M.; BLACK, M.H.; XIANG, A.H.; ALLAYEE, H.; LAWRENCE, J.M.;
BUCHANAN, T.A. Diabetes Care. v. 30 suppl(2): S134-S140; 2007.
WEISS, R.R.; CALOMENO, M.A.; SOUSA, R.S.; BRIERSDORF, S.M.; CALOMENO, R.A.;
MURADAS, P. Avaliação histopatológica, hormonal e bacteriológica da piometra na cadela.
Archives of Veterinary Science. v. 9 (2): 81-87; 2004.
170
ANEXOS
ANEXO 1
ANAMNESE PADRÃO PROJETO
Paciente número ____ Grupo ____ Fase Ciclo Estral ____________________________
Proprietário: ______________________ Telefones:______________________________
Idade: _________
Peso: __________
Apetite: _____________________________________________________________________________
Tipo Alimento: _______________________________________________________________________
Freqüência refeições: __________________________________________________________________
Micção/evacuação: ____________________________________________________________________
Cios regulares: _______________________________________________________________________
Último cio: __________________________________________________________________________
Uso de progestágenos: _________________________________________________________________
Número de cruzas/gestações: ____________________________________________________________
Ambiente (casa/apto): __________________________________________________________________
Atividade diária (1-5): _________________________________________________________________
Vacinas: ____________________________________________________________________________
Vermifugação: _______________________________________________________________________
Medicações: _________________________________________________________________________
Doenças anteriores: ___________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________
Vômitos/diarréia:_____________________________________________________________________
Secreções óculo-nasais, auricular, vaginal: _________________________________________________
___________________________________________________________________________________
Tosse/espirros: _______________________________________________________________________
Tempo de evolução (piometras): _________________________________________________________
Doenças concomitantes: ________________________________________________________________
____________________________________________________________________________________
Observações: _________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________________
O que motivou a procura pela castração ? __________________________________________
____________________________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________
171
ANEXO 2
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL
HOSPITAL DE CLÍNICAS VETERINÁRIAS
TERMO DE CONSENTIMENTO INFORMADO
Avaliação da sensibilidade à insulina ao longo do ciclo estral e durante a condição hiperplasia endometrial
cística – piometra.
As Fêmeas da espécie canina apresentam um ciclo reprodutivo chamado de ciclo estral, composto
basicamente de quatro fases: pro-estro (fase onde há corrimento vaginal sanguinolento e atração de machos), estro
(fase onde a fêmea aceita o macho), diestro (fase lútea do ciclo onde a fêmea não aceita mais o macho, porém
existe uma atividade hormonal ovariana caracterizada por um aumento na concentração do hormônio Progesterona
na circulação) e o anestro (fase de descanso, onde não há atividade hormonal). Em algumas fêmeas, durante o
diestro, há um crescimento exagerado do endométrio (hiperplasia endometrial cística) de forma a provocar um
acúmulo de líquido dentro deste órgão, evoluindo para um acúmulo de pus em decorrência das bactérias
naturalmente presentes no trato genital (piometra).
A diabetes mellitus é uma doença endócrina decorrente da deficiência de insulina para manter níveis
normais de glicose no sangue. As fêmeas caninas, idosas, não castradas apresentam uma maior predisposição para
desenvolver esta doença em decorrência da progesterona circulante durante o diestro. Esta progesterona promove
um antagonismo à insulina, e cronicamente, pode levar ao estado diabético caso o paciente apresente predisposição
a esta doença. Doenças inflamatórias, infecciosas, neoplásicas ou endócrinas podem também causar antagonismo à
insulina e predispor o paciente a diabetes mellitus.
Este estudo visa avaliar a sensibilidade à insulina em cadelas em anestro, diestro ou com o complexo
hiperplasia endometrial cística – piometra. Para tal os pacientes participantes do estudo que forem submetidos à
castração (eletiva ou como parte do tratamento para piometra), passarão por uma bateria de avaliações composta
por exames de sangue (hemograma, perfil bioquímico), teste de tolerância intravenoso à glicose, citologia vaginal e
ultrassonografia; antes do procedimento cirúrgico. Durante o ato cirúrgico uma amostra de aproximadamente uma
(01) grama do músculo reto-abdominal será coletada e congelada em nitrogênio líquido para posterior análise. Os
proprietários interessados em participar deste projeto, e beneficiar seu animal de estimação com este exames
gratuitos necessitam assinar este termo de consentimento informado, cientes de que os custos do procedimento
cirúrgico não serão cobertos pelo projeto, da mesma forma que não haverá nenhum custo adicional pela
participação neste estudo.
Eu ___________________________________________ proprietário da paciente ________________ raça
________________ idade _____ ficha clínica __________ autorizo a participação do animal acima descrito neste
projeto de pesquisa.
Paciente número ______
Grupo ______
_________________________ _____________________________
Proprietário Médico Veterinário
Porto Alegre ____ de _________ de ______
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