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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FACULDADE DE FILOSOFIA, CIÊNCIAS E LETRAS DE RIBEIRÃO PRETO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PSICOBIOLOGIA
“Avaliação da administração de drogas serotonérgicas intra-
hipotálamo-ventromedial nas respostas comportamentais de defesa
obtidas em dois modelos animais de ansiedade”
Selma Conceição Poltronieri
Tese apresentada à Faculdade de Filosofia,
Ciências e Letras de Ribeirão Preto – USP,
como parte das exigências para obtenção do
título de Doutor em Ciências, área de
Psicobiologia.
Ribeirão Preto
- 2007 -
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FICHA CATALOGRÁFICA
Poltronieri, Selma Conceição
Avaliação da administração de drogas serotonérgicas intra-
hipotálamo-ventromedial nas respostas comportamentais de
defesas obtidas no labirinto em T elevado. Ribeirão Preto, 2007.
93 p. : il. ; 30cm
Tese de Doutorado, apresentada à Faculdade de Filosofia,
Ciências e Letras de Ribeirão Preto/USP. Área de concentração:
Psicobiologia.
Orientadora: Viana, Milena de Barros.
1. 5-HT. 2. Porção dorsal do hipotálamo ventromedial. 3.
Ansiedade. 4. Labirinto em T elevado.
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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FACULDADE DE FILOSOFIA, CIÊNCIAS E LETRAS DE RIBEIRÃO PRETO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PSICOBIOLOGIA
“Avaliação da administração de drogas serotonérgicas intra-
hipotálamo-ventromedial nas respostas comportamentais de defesa
obtidas em dois modelos animais de ansiedade”
Selma Conceição Poltronieri
Tese apresentada à Faculdade de Filosofia,
Ciências e Letras de Ribeirão Preto – USP,
como parte das exigências para obtenção do
título de Doutor em Ciências, área de
Psicobiologia.
Orientadora: Profa. Dra. Milena de Barros Viana
Ribeirão Preto
- 2007 -
FOLHA DE APROVAÇÃO
Selma Conceição Poltronieri
“Avaliação da administração de drogas serotonérgicas intra-hipotálamo-ventromedial
nas respostas comportamentais de defesa obtidas em dois modelos animais de
ansiedade”
Tese apresentada à Faculdade de Filosofia,
Ciências e Letras de Ribeirão Preto – USP,
como parte das exigências para obtenção do
título de Doutor em Ciências.
Área de Concentração: Psicobiologia.
Aprovado em:
Banca Examinadora
Prof. Dr. ________________________________________________________
Instituição:___________________________Assinatura:___________________
Prof. Dr. ________________________________________________________
Instituição:___________________________Assinatura:___________________
Prof. Dr. ________________________________________________________
Instituição:___________________________Assinatura:___________________
Prof. Dr. ________________________________________________________
Instituição:___________________________Assinatura:___________________
Prof. Dr. ________________________________________________________
Instituição:___________________________Assinatura:___________________
Dedico este trabalho em homenagem ao meu herói e irmão
Silvio J. Poltronieri
(In memorian)
AGRADECIMENTOS
À Profa. Dra. Milena de Barros Viana, por todo empenho na condução e orientação
deste trabalho e pelas oportunidades científicas oferecidas.
À Profa. Dra. Cláudia Maria Padovan, por todo acolhimento em seu laboratório,
permitindo que este trabalho fosse concluído.
À Profa. Regina Cláudia, pela contribuição e participação na minha banca.
Ao Prof. Dr. Silvio Morato de Carvalho, pela assessoria deste projeto.
Ao Prof. Dr. Marcus Lira Brandão, pelas sugestões no decorrer da minha pesquisa,
bem como exemplo de humanismo no meio acadêmico.
Ao Prof. Dr. Hélio Zangrossi Júnior, pelos esclarecimentos durante este trabalho.
Aos amigos do Laboratório: Gustavo, Cíntia e aos meus novos amigos: Paulo, Mateus,
Simone, Diego, Cecília e, em especial, Melissa e Aline, meu muito obrigada pelo apoio
na parte experimental deste trabalho!
Aos meus pais Helvécio e Idalsina, pelo exemplo de luta e força. Obrigada por tudo!
Ao meu irmão Sérgio e aos meus adoráveis sobrinhos Mateus e Júlia!
Aos meus primos: Aldo, Patrícia, Vanilda, Edílson e Eliete, Marlene e Carlinho.
Aos meus especiais amigos: Márcia, Machado, Marcelo, Valéria, Danilo,Tatá, Javier,
Chico, Beto, Moacir, Dr. Décio, Dra. Marlene e outros aqui não citados, muito obrigada
por me dar todo apoio na alegria ou na tristeza. Adoro vocês!
Às alunas da Unifesp/Santos, pelo carisma e participação deste trabalho.
À Márcia e Cláudia (Serviço Social), todo o meu apreço!
Ao pessoal da casa de Pós-Graduandos II, que me acolheram com carinho.
À Renata B. Vicentini, pelo exemplo de competência.
Aos técnicos Dalmo e João, pela solicitude.
Ao Conselho Nacional de Pesquisa (CNPQ) pelo apoio financeiro neste trabalho.
“...Quando não podemos controlar a direção dos ventos, temos que ajustar
as velas do nosso barco..” (Amir Kink)
RESUMO
O hipotálamo é uma estrutura de fundamental importância para a adaptação
frente a situações de estresse ou eventos que alterem a homeostase do organismo.
Dentre as diferentes regiões hipotalâmicas, a zona medial do hipotálamo tem sido
descrita como uma região com ação modulatória sobre respostas comportamentais
de defesa e processos emocionais que as acompanham, como o medo e a
ansiedade. Neste sentido, alguns autores têm proposto a idéia de um sistema
defensivo hipotalâmico medial, que seria composto pelos núcleos anterior, pré-
mamilar dorsal e pela porção dorsal do hipotálamo ventromedial (dHVM). De fato, a
neurotransmissão gabaérgica e o antagonismo glutamatérgico têm sido relacionados
à modulação da ansiedade via dHVM. Entretanto, até o momento, poucos estudos
avaliaram a participação da neurotransmissão serotonérgica na modulação da
ansiedade neste núcleo, embora a neurotransmissão mediada por serotonina (5-HT)
seja um dos principais sistemas neuroquímicos implicados com a ansiedade. O
objetivo do trabalho foi avaliar o efeito de drogas serotonérgicas administradas intra-
dHVM (8-OH-DPAT, doses de 0,8, 1,6 e 3,2 nmoles; DOI, doses de 4, 8 e 16 nmoles;
quetanserina, doses de 5, 10 e 20 nmoles; todas em volume de 0,2 µL), nas
respostas comportamentais de defesa de ratos submetidos a 2 modelos animais de
ansiedade: labirinto em T elevado (LTE, para medidas de esquiva inibitória e fuga de
um dos braços abertos do modelo) e modelo da transição claro-escuro (para
medidas de número de transições entre compartimentos e tempo no compartimento
claro). Numa tentativa de evitar falsos negativos ou positivos, os animais foram, em
seguida, testados em uma arena para avaliação da atividade motora. Os resultados
demonstraram que o agonista 5-HT1A 8-OH-DPAT não apresentou nenhum efeito,
nem na esquiva inibitória e nem na tarefa de fuga dos braços abertos do LTE. Por
outro lado, o agonista preferencial 5-HT2A DOI, bem como o antagonista 5-HT
2A/2C quetanserina, apresentaram efeito ansiolítico nas 2 tarefas medidas no LTE.
Esses resultados não foram devidos a alterações na atividade locomotora. Enquanto
o DOI apresentou efeito ansiolítico em um outro modelo animal de ansiedade, o
modelo de transição claro-escuro, nenhuma das demais drogas utilizadas alteraram
as medidas avaliadas neste modelo. Em conjunto, os resultados sugerem a
participação de receptores 5-HT do tipo 2A/2C do dHVM em diferentes respostas
comportamentais de defesa. Entretanto, tendo em vista que tanto um agonista de
receptores 5-HT2 quanto um antagonista exerceram o mesmo efeito no LTE é
possível que outros sistemas de neurotransmissão estejam envolvidos com os
efeitos ansiolítico/panicolítico obtidos com as drogas. Para verificar esta questão,
novos experimentos serão necessários.
Palavras-chaves: 5-HT, porção dorsal do hipotálamo ventromedial, ansiedade,
labirinto em T elevado.
ABSTRACT
The hypothalamus is a fundamental structure of the central nervous system
(CNS) related to the maintenance of homeostasis and to the adaptation of the
organism to different stressful situations. Among the different hypothalamic regions,
the medial hypothalamus has been implicated in the modulation of fear/anxiety
related responses. Moreover, the dorsomedial part of the VMH (VMHdm), together
with the anterior hypothalamic nucleus and the dorsal premammillary nucleus, are
thought to be part of a distinct circuit, called the medial hypothalamic defensive
system, critically involved in the organization of defensive behavior. In fact, it has
been previously shown that administration of GABA agonists or glutamatergic
antagonists into the region alters anxiety-related responses. Nevertheless, until the
present moment, few studies were directed to the evaluation of serotonin modulation
in anxiety-related responses in this nucleus. The main purpose of the present study
was to investigate the effect of serotonergic drugs intra-VMHdm (5-HT1A agonist 8-
OH-DPAT: 0.8, 1.6 and 3.2 nmols; 5-HT2A preferential agonist DOI: 4, 8 and 16
nmols; 5-HT2A/2C antagonist ketanserin: 5, 10 and 20 nmols) on defensive
behavioral responses in rats submitted to two animal models of anxiety: the elevated
T maze (ETM, for inhibitory avoidance and one-way escape measurements) and the
light-dark transition model (for number of transition between the two compartments
and the time spent in the lighted compartment). To avoid false negatives or positives,
the animals were tested in an open field immediately after being exposed to the
anxiety models, for locomotor activity evaluation. The results showed that while 8-
OH-DPAT failed to alter anxiety-related responses in either model, both DOI and
ketanserin significantly altered inhibitory avoidance and one-way escape in the ETM.
DOI also showed anxiolytic effects in the light-dark transition model. None of the
drugs altered locomotor activity in the open field. Taking that into account, these
results suggest the involvement of 5-HT2A/2C receptors of the VMH in different
behavioral responses. Nevertheless, since both an agonist of 5-HT2 receptors and an
antagonist exerted the same effect in the ETM it is possible that other
neurotransmitter systems are involved in this anxiolytic/panicolytic effect. To answer
this question, further investigations are warranted.
Keywords: 5-HT, dorsal portion of the ventromedial hypothalamus, anxiety, T-maze.
LISTA DE ABREVIATURAS
ACTH: hormônio adeno-corticotrófico
AM: amígdala
APA: Associação Americana de Psiquiatria
AVP: arginina-vasopressina
BZD: benzodiazepínico
CCK: colecistonina
CRF: corticotrofina
DA: dopamina
DAG: distúrbio de ansiedade generalizada
dHVM: porção dorsal do hipotálamo ventromedial
DOI: 2,5-dimetoxi-4-iodoanfetamina
DP: distúrbio do pânico
DSM: Diagnostic Statistical Manual (Manual da Associação Psiquiátrica Norte-
Americana)
GABA: ácido gama-aminobutírico
HDM: hipotálamo dorsomedial
HM: hipotálamo medial
HPA: eixo hipotálamo-hipófise-adrenal
LTE: labirinto em T elevado
NA: noradrenalina
NDR: núcleo dorsal da rafe
NPV: núcleo periventricular
PCPA: para-cloro-fenilalanina
SCP: substância cinzenta periaquedutal
SCPD: porção dorsal da substância cinzenta periaquedutal
SNC: sistema nervoso central
5-HT: 5-hidróxi-triptamina (serotonina)
5-HTP: 5-hidróxi-triptofano
5-HT1AA: ácido-hidróxi-indolacético
8-OH-DPAT: 8-hidróxi-2(di-n-propilamino)tetralina
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Classificação dos distúrbios de ansiedade, segundo o DSM-IVR
....
16
Tabela 2: Níveis de defesa, substrato neural e emoção relacionada
..............
19
Tabela 3: Classificação dos agrupamentos serotonérgicos............................
23
Tabela 4: Subtipos de receptores serotonérgicos...........................................
28
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Representação esquemática do sistema cerebral
aversivo..................
21
Figura 2: Projeções serotonérgicas ascendentes.............................................. 32
Figura 3: Representação esquemática do hipotálamo......................................
36
Figura 4: Ilustração do modelo do
LTE...............................................................
48
Figura 5: Ilustração da arena.......
.........................................................................
48
Figura 6: Ilustração do modelo de transição claro-escuro
....................................
49
Figura 7: Ilustração de uma cirurgia estereotáxica...............................
................
50
Figura 8: Efeito do 8-OH-DPAT intra-dHVM no modelo do LTE
........................
59
Figura 9: Efeito do 8-OH-DPAT intra-dHVM na arena
........................................
60
Figura 10: Efeito do 8-OH-DPAT intra-dHVM na transição claro-escuro
...........
61
Figura 11: Efeito do DOI intra dHVM no modelo do LTE
....................................
62
Figura 12: Efeito do DOI intra-dHVM na arena
...................................................
63
Figura 13: Efeito do DOI intra-dHVM na transição claro-escuro
.........................
64
Figura 14: Efeito da quetanserina intra-dHVM no modelo do LTE
.....................
65
Figura 15: Efeito da quetanserina intra-dHVM na arena
....................................
66
Figura 16: Efeito da quetanserina intra-dHVM na transição claro-escuro
............
67
Figura 17: Representação histológica do dHVM
...............................................
93
SUMÁRIO
RESUMO
ABSTRACT
I - INTRODUÇÃO..................................................................................................
14
1. Ansiedade
..........................................................................................................
14
1.1. O normal e o patológico.................................................................................
15
1.1.1. Distúrbio do pânico
..................................................................................
16
1.1.2. Distúrbio de ansiedade generalizada......................................................
17
2. Neuroanatomia da ansiedade
............................................................................
18
3. Neuroquímica da ansiedade
..............................................................................
21
3.1. Biossíntese e metabolismo da serotonina
......................................................
22
3.2. Neurônios serotonérgicos
...............................................................................
22
3.2.1. Localização...........................
....................................................................
22
3.2.2.Projeções ascendentes
..............................................................................
24
3.2.3. Projeções descendentes......................................
.....................................
25
3.3. Receptores serotonérgicos
.............................................................................
26
3.3.1. Receptores 5-HT1............................................................................
.........
27
3.3.2. Receptores 5-HT2
.....................................................................................
29
4. Serotonina e a ansiedade
..................................................................................
30
4.1. Teoria do papel dual da ansiedade................................................................
31
5. Modelos animais de ansiedade.........................................................................
32
6. Hipotálamo....................................
.....................................................................
35
6.1. Hipotálamo e defesa
.......................................................................................
37
6.2. Sistema defensivo do hipotálamo medial e do dHVM....................................
40
II -OBJETIVOS....................................................................................................
...
45
III – MATERIAIS E MÉTODOS..........................................................................
.....
47
1. Animais.......................................................................................................
47
2. Equipamentos
.............................................................................................
47
3. Cirurgia............
............................................................................................
49
4. Microinjeção
................................................................................................
50
5. Drogas........................................
.................................................................
51
6. Procedimento
..............................................................................................
51
7. Perfusão...................................................................
...................................
52
8. Histologia
.....................................................................................................
53
IV - ANÁLISE ESTATÍSTICA............................................................................
....
54
V - RESULTADOS
..................................................................................................
55
1. Experimento 1 (8-OH-DPAT)
......................................................................
55
2. Experimento 2 (DOI).......
............................................................................
56
3. Experimento 3 (quetanserina)....................................................................
57
VI - DISCUSSÃO.........................................................
..........................................
68
VII – CONCLUSÕES
.............................................................................................
79
VIII - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS......................................................
.........
80
IX – ANEXO..........................................................................................................
93
INTRODUÇÃO
1. Ansiedade
A ansiedade tem sido definida como um sentimento que acompanha um
sentido geral de perigo, advertindo-nos que há algo há ser temido no futuro. Ao
mesmo tempo, alimenta o planejamento de ações, buscando saídas, alternativas e
ensaiando ações de enfrentamento ou fuga do perigo (HOEHN-SARIC, 1998).
Etimologicamente, a palavra é derivada do termo grego anshein (sufocação),
caracterizando-se em uma emoção desagradável, frequentemente envolvendo
apreensão, temores exagerados, insegurança, acompanhada de alterações
comportamentais, neurovegetativas e hormonais (NUTT, 1991).
Nos últimos tempos, a Psiquiatria passou a assimilar conceitos biológicos,
interpretando os transtornos psiquiátricos como desvios de comportamentos
evolutivamente adaptativos, que são compartilhados por espécies filogeneticamente
relacionadas. Nesse sentido, a ansiedade passou a ser relacionada com as
manifestações de medo, tendo em vista que ambos podem ser entendidos como
originários das respostas de defesa dos animais a perigos encontrados em seu meio
ambiente (GRAEFF e GUIMARÃES, 2000). Assim, diante de ameaças, animais
comumente optam entre a luta, a fuga da situação aversiva, ou ainda, podem
apresentar uma paralisação na emissão de comportamentos (freezing), ou
comportamentos de avaliação de risco, cuja função é a proteção do organismo
contra o perigo.
14
1.1. Ansiedade: o normal e o patológico
Enquanto emoção básica, a ansiedade é considerada essencial dentro do
repertório humano, uma vez que certo grau de ansiedade torna-se necessário para a
execução de tarefas ou bom desempenho em atividades de naturezas motora e
cognitiva. Porém, passa a assumir um caráter patológico em consequência das
interferências de sua sintomatologia nas atividades produtivas normais ou cotidianas
na vida do indivíduo (PRATT, 1992; RANG et al., 1993).
A ansiedade patológica pode se dar em decorrência a diversos eventos
estressantes (doenças, uso de medicamentos), caracterizando-se em ansiedade
secundária. Porém, ela pode surgir como uma manifestação primária de alguns
transtornos psiquiátricos.
Os transtornos de ansiedade podem ser agrupados segundo alguns critérios
operacionais, de acordo com sua sintomatologia, através de manuais diagnósticos
estatísticos, utilizados mundialmente, dentre eles, o Código Internacional de
Doenças (CID-10) e a quarta edição do Manual de Diagnóstico e Estatística da
Associação Norte Americana de Psiquiatria (APA) (DSM-IV, 1994), este último agora
em sua versão revisada (DSM-IV-TR) (ver tabela 1).
15
Tabela 1 – Classificação dos transtornos de ansiedade, segundo o DSM-IV-TR.
• Transtorno do pânico sem agorafobia
• Transtorno do pânico com agorafobia
• Agorafobia sem história de transtorno do pânico
• Fobia específica
• Fobia social
• Transtorno obssessivo-compulsivo
• Transtorno de estresse pós-traumático
• Transtorno de estresse agudo
• Transtorno ansioso generalizado
• Transtorno ansioso devido a uma condição médica
• Ansiedade devido ao uso de substância
• Transtorno ansioso não especificado
(Retirada do Manual do DSM-IV-TR, 2000)
No presente trabalho, serão enfatizadas apenas as descrições do transtorno
de pânico (TP) e do transtorno de ansiedade generalizada (TAG), uma vez que as
medidas realizadas pelos modelos animais de ansiedade utilizados no presente
estudo tem sido relacionadas a estes dois subtipos de ansiedade encontrados no
clínica (GRAEFF e ZANGROSSI, 2002).
1.1.1. Transtorno do Pânico
De acordo com DSM-IV-TR, um ataque de pânico é conceituado como sendo
um episódio de medo intenso ou desconforto, acompanhado pelo menos de 4 entre
16
13 sintomas somáticos ou cognitivos. O ataque ocorre de forma súbita e é
geralmente acompanhado por um sentimento de morte ou perigo iminente e uma
necessidade de fuga da situação. Dentre alguns sintomas estão: palpitação,
tremores, náuseas, tonturas, dificuldade de respiração, sensação de choque,
sentimentos de falta de controle, medo de enlouquecer ou de morrer.
O diagnóstico do TP ocorre quando o paciente apresenta recorrência de
ataques súbitos ou inesperados (no mínimo 4 ataques em 4 semanas), que podem
ser acompanhados por mudanças significativas no comportamento do indivíduo e por
preocupações persistentes quanto à recorrência, às implicações e às conseqüências
de outros ataques. Este quadro clínico pode, eventualmente, levar a um
comportamento de evitação mais ou menos generalizada, principalmente dos locais
ou situações em que possam sentir-se desprotegidos ou dos quais não possam
evadir-se com facilidade, ou esquiva agorafóbica, o que pode gerar mais limitações
nas atividades triviais do indivíduo.
1.1.2. Transtorno de Ansiedade Generalizada
Segundo o DSM-IV-TR, o TAG é caracterizado como um quadro clínico,
definido por uma ansiedade e preocupação excessivas, ocorrendo na maioria dos
dias de um período de pelo menos seis meses, a respeito de vários eventos ou
atividades. O indivíduo encontra dificuldade em controlar suas preocupações. A
ansiedade e preocupação devem ser acompanhadas de pelo menos três sintomas
adicionais, de uma lista que inclui inquietação, fadiga, dificuldade de concentração,
irritabilidade, tensão muscular e perturbações do sono. O diagnóstico deve excluir
aspectos característicos de outros transtornos de ansiedade, tais como, preocupação
com a possibilidade de ataques de pânico (como no TP), de encontrar-se longe de
17
casa ou dos parentes (como na ansiedade de separação), de ganhar peso (como na
anorexia nervosa), de possuir uma doença grave (como na hipocondria) e de sentir-
se embaraçado frente a situações de evidência (como na fobia social). Ainda de
acordo com o DSM-IV-TR, o indivíduo portador do TAG, nem sempre descreve suas
preocupações como excessivas, no entanto, descreve a ocorrência de estresse
devido a preocupações constantes, dificuldade de controlar estas preocupações e de
manter um funcionamento social e ocupacional adequado. Por fim, o DSM-IV-TR
enfatiza que o quadro não pode ser conseqüência direta dos efeitos fisiológicos de
uma droga ou medicamento, de uma doença somática ou de outro transtorno
psiquiátrico.
Os critérios operacionais do DSM-IV-TR visam essencialmente caracterizar os
transtornos de ansiedade fundamentados em análises clínico-descritivas (GRAEFF,
1990), atribuindo à ansiedade humana a noção de heterogeneidade, o qual é
apoiado pela hipótese da existência de mecanismos neurais distintos, subjacentes às
diferentes subtipos de ansiedade, embora haja controvérsias sobre esta concepção
(PRATT, 1992).
2. Neuroanatomia da Ansiedade
Embora a ansiedade, enquanto psicopatologia, seja por definição um
fenômeno de má adaptação, tipicamente humano, dentro de uma perspectiva
biológica, as raízes funcionais da ansiedade encontram uma analogia nas reações
de defesa que os animais exibem frente a estímulos ou situações de perigo. Esta
abordagem é baseada na premissa de que importantes aspectos do comportamento
humano são originários de padrões comportamentais funcionalmente significativos,
encontrados em outras espécies animais (ver tabela 2).
18
Tabela 2 – Níveis de defesa, substrato neural, emoção relacionada.
Perigo Reação de defesa Estruturas
cerebrais
Emoção
Potencial Avaliação de risco/
Inibição comportamental
Septo-hipocampo/
Amígdala
Ansiedade
Antecipado
Congelamento Amígdala/
Periquedutal ventral
Ansiedade
Antecipatória
Distal Esquiva
Escape
Amígdala/
Hipotálamo medial
Ansiedade
condicionada
Ansiedade
incondicionada
Proximal Fuga/Congelamento Periaquedutal
dorsal
Pânico
(Adaptada de Graeff e Zangrossi Jr., 2002).
O conceito de níveis de defesa supracitados, provém da análise eto-
experimental do comportamento de ratos realizada pelos pesquisadores Robert e
Caroline Blanchard (1988), da Universidade do Havaí. O primeiro nível parece ser
determinado por situações potencialmente perigosas. Nestes casos, o animal exibe
um comportamento exploratório cauteloso, denominado pelos pesquisadores de risk
assessment behavior (ou, em português, “comportamento de avaliação de risco”). O
animal mantém o corpo distendido, com o ventre rente ao solo, avançando e
recuando a cabeça, repetidamente e, ao menor sinal de perigo, reage com uma
intensidade bem maior do que reagiria em situações seguras.
Em casos onde os sinais de perigo tornam-se explícitos, porém encontram-se
à distância do animal, a reação típica apresentada pelos ratos é a de freezing
(“imobilidade tensa”). Se possível, neste segundo nível de defesa, o animal escapa
da situação. Entretanto, quando o escape é impossível, o animal apresenta uma
19
inibição da atividade vigente, permanecendo completamente imóvel – exceto por
movimentos ocasionais e rápidos das vibrissas. Esta imobilidade é acompanhada,
entretanto, por uma série de alterações autonômicas e neurovegetativas.
O último nível de defesa ocorre quando o perigo está muito próximo do
animal. Neste caso, o rato reage com posturas e vocalizações ameaçadoras. Caso a
ameaça não seja suficiente para refrear o ataque do agressor, ocorre a fuga. E, por
último, se a fuga for impossível, resta a luta defensiva. A tabela 2 faz referência às 3
estratégias básicas de defesa supracitadas. A mesma tabela enumera algumas
estruturas do Sistema Nervoso Central (SNC) que têm sido implicadas nos
comportamentos defensivos. Em primeiro lugar, destacam-se o sistema septo-
hipocampal (S-H; GRAY e McNAUGHTON, 2000) e a amígdala (AM). Ambos
serviriam de interface entre o neocórtex e o sistema límbico subcortical. Tanto o S-H
quanto a AM recebem densas projeções do córtex temporal polimodal, onde se
verifica a síntese das informações colhidas pelos diferentes sistemas sensoriais, bem
como informações sensoriais de natureza olfativa e interoceptiva diretamente.
Outras evidências indicam, no entanto, que as áreas cerebrais propostas por
Gray e McNaughton (2000) não seriam as únicas envolvidas na geração da
ansiedade. Assim, tem sido demonstrado que um conjunto de estruturas encefálicas
longitudinalmente organizadas, compreendendo além de partes da AM, a substância
cinzenta periaquedutal (SCP) em sua porção dorsal (SCPD), determinados núcleos
hipotalâmicos, e interligado por vias nervosas ascendentes e descendentes, também
se constitui em substrato neural da ansiedade (para revisão ver GRAEFF, 1990;
GRAEFF et al., 1993). Este circuito coordenaria diferentes estratégias de defesa,
como a imobilidade tensa ou congelamento e os comportamentos de luta e de fuga.
Por isso, essas regiões foram denominadas áreas encefálicas de defesa. Sua
20
ativação também evoca sensações extremamente desagradáveis (medo intenso, dor
não localizada) no homem. Além disso, animais de laboratório aprendem
rapidamente a desligar a estimulação elétrica do hipotálamo e da SCPD. Por este
motivo, Graeff (1990) tem designado este circuito neural de sistema encefálico
aversivo ou sistema cerebral aversivo (ver figura 1).
Figura 1 – Representação esquemática do sistema cerebral aversivo (Retirada de
Deakin e Graeff, 1991).
3. Neuroquímica da Ansiedade – A Serotonina
Além da ênfase dos aspectos neuroanatômicos, o estudo da fisiopatologia da
ansiedade tem dedicado considerável atenção à participação de diferentes sistemas
neuroquímicos na gênese de respostas comportamentais e fisiológicas a estímulos
aversivos. Neste sentido, a importância da participação dos sistemas GABAérgicos e
serotonérgico na ansiedade têm sido destacada pela eficácia clínica de drogas no
tratamento de diferentes transtornos da ansiedade. Por outro lado, a introdução na
21
clínica de compostos ansiolíticos como a buspirona e análogos, que atuam
primariamente sobre o sistema serotonérgico, tem despertado um grande interesse
na investigação da serotonina (5-HT) na modulação da ansiedade.
3.1. Biossíntese e Metabolismo da Serotonina
A 5-hidroxitriptamina (5-HT) é uma indolamina, sintetizada a partir do
aminoácido essencial triptofano, produto da hidroxilação e descarboxilação do
aminoácido L-triptofano. O triptofano é carregado para o interior do neurônio, por
meio de transporte ativo, cujo transportador participa também do transporte de outros
aminoácidos essenciais. Assim, os níveis cerebrais de triptofano decorrem de sua
concentração plasmática, bem como da concentração plasmática de outros
aminoácidos.
O triptofano é convertido através da ação da enzima triptofano hidroxilase em
5-hidroxi-triptofano, que por sua vez, é transformado em 5-HT, pela enzima
descarboxilase de aminoácidos L-aromáticos. A degradação da 5-HT é realizada
através da enzima monoaminoxidase (MAO-A), resultando no ácido 5-
hidroxiindolacético (5-HTIAA). A eliminação desse metabólito dá-se através da urina.
3.2. Neurônios Serotonérgicos
3.2.1. Localização
Os corpos celulares dos neurônios serotonérgicos encontram-se
principalmente nos núcleos da rafe, localizados no tronco encefálico, tanto no núcleo
mediano da rafe (NMR), bem como densamente no núcleo dorsal da rafe (NDR).
Ainda, os neurônios serotonérgicos podem ser encontrados em algumas regiões da
formação reticular.
22
Dalstrom e Fuxe (1964) nomearam os grupos de neurônios serotonérgicos
inicialmente identificados, de acordo com a topografia. Assim, os grupos celulares de
neurônios serotonérgicos, pertencentes ao agrupamento mais caudal, foram
denominados de B1 a B9 (localizados nos núcleos da rafe). A porção rostal do
sistema serotonérgico da rafe apresenta-se em um núcleo linear caudal, localizado
no mesencéfalo e se estendendo à ponte, denominado núcleo dorsal da rafe (NDR),
enquanto que o núcleo mediano da rafe (NMR) é localizadona ponte (ver tabela 3).
Tabela 3 – Classificação dos agrupamentos serotonérgicos.
Estruturas Agrupamento neuronal
Núcleo pálido da rafe B1
Núcleo obscuro da rafe B2
Obscuro da rafe, porção dorsolateral B4
Núcleo magno da rafe B3
Bulbo rostral, porção ventrolateral B3
Núcleo reticular paragigantocelular lateral B3
Bulbo caudal, porção ventrolateral B1
Núcleo mediano da rafe, porção caudal B5
Núcleo mediano da rafe, porção rostral B8
Núcleo dorsal da rafe, porção caudal B6
Núcleo dorsal da rafe, porção rostral B7
Núcleo linear caudal B8
Núcleo oral da ponte B8/B9
Região supralemniscal B9
(Adaptada de Viana,1996)
23
3.2.2. Projeções Ascendentes
As projeções serotonérgicas enviam projeções para áreas do SNC, bem como
os núcleos da rafe recebem conexões recíprocas de áreas inervadas. Além disso,
estes núcleos são interconectados, permitindo a integração de informações. Estas
projeções terminam no prosencéfalo e na medula (VIANA, 1996).
Como se pode observar na tabela supracitada, dos nove agrupamentos
serotonérgicos, quatro enviam projeções ascendentes para o prosencéfalo. Além
disso, o NDR e o NMR são responsáveis por cerca de 80% da 5-HT prosencefálica.
Através da lesão dos núcleos, Jacobs e colaboradores (1974) demonstraram a
distribuição diferencial de fibras dos núcleos dorsal e mediano da rafe. Estes
achados foram corroborados pela técnica de mapeamento auto-radiográfico
(BOBILLIER et al., 1975). Ademais, estudos utilizando a técnica de
imunocitoquímica, através de leucoaglutinina extraída de Phaoseolus vulgaris
(KOSOFSKY e MOLLIVER, 1987) identificaram dois tipos de axônios: axônios finos,
que possuem varicosidades fusiformes pequenas, originando-se a partir do NDR, e
os axônios grossos, que possuem varicosidades grandes e esféricas, estabelecendo
conexões sinápticas com as regiões inervadas a partir do NMR.
As vias ascendentes serotonérgicas, oriundas do NDR e NMR podem ser
subdivididas entre aquelas que fazem parte da via prosencefálica medial (o trato
mesencefálico do NDR e o trato prosencefálico do NMR) e as que não fazem parte
(trato arqueado do NDR, trato periventricular do NDR, trato cortical do NDR e trato
medial da rafe), a seguir:
- Via prosencefálica medial (via ventral): O trato prosencefálico do NDR corre
pela porção ventrolateral da via prosencefálica medial, inervando principalmente
estruturas prosencefálicas laterais, como os gânglios basais, a AM e o córtex
24
piriforme. Por outro lado, o trato prosencefálico do NMR, corre pela porção
ventromedial da via prosencefálica medial, inervando estruturas como o córtex
cingulado, o septo e o hipocampo.
- Via prosencefálica não medial: O trato cortical do NDR localiza-se na porção
ventrolateral do fascículo medial longitudinalmente entre as células do núcleo
intersticial de Cajal. As fibras ascendem rostralmente através do subtálamo e
movem-se lateralmente através da zona incerta e juntam-se às fibras da cápsula
interna, distribuindo-se para os núcleos caudado-putámen e para o córtex têmporo-
parietal. Por outro lado, o trato periventricular do NDR localiza-se abaixo do
aqueduto cerebral, na substância cinzenta periaquedutal (SCP). As fibras se
localizam na porção rostral, circundando a região periventricular do tálamo e
hipotálamo, enquanto que o trato arqueado do NDR corre lateralmente através do
tegmento mesencefálico, alcançando a porção ventrolateral do tronco cerebral.
Neste trato, as fibras se projetam para a substância negra e para o núcleo
geniculado, ascendendo rostralmente como parte das fibras comissurais
supraópticas de Meynert, alcançando o núcleo hipotalâmico supraquiasmático. Por
fim, o trato medial da rafe recebe fibras tanto do NDR quanto do MNR, inervando o
núcleo interpeduncular e o corpo mamilar (Viana, 1996).
3.2.3. Projeções Descendentes
A medula recebe um grande número de projeções serotonérgicas, em
especial algumas regiões da substância cinzenta medular como o corno dorsal da
medula, especialmente as lâminas I e II; os núcleos motores do corno ventral
(lâminas VIII e IX); a medula toráxica e a coluna intermédia lateral. As fibras destas
regiões partem do núcleo magno da rafe e da formação reticular ascendente.
25
Os neurônios motores destacam-se como uma importante área de terminação
de projeções descendentes na medula. Além disso, os neurônios pré-ganglionares
sinápticos da coluna intermédia lateral recebem diversas projeções serotonérgicas,
oriundas da medula oblonga ventrolateral (VIANA, 1996).
O sistema serotonérgico, então, encontra-se em uma posição estratégica para
a coordenação de complexos padrões sensoriais e motores, durante a elaboração de
diferentes respostas autonômicas e comportamentais (COOPER e DORISH, 1990) .
3.3. Receptores Serotonérgicos
A serotonina produz seus efeitos através de uma variedade de receptores. A
5-HT e seus receptores são encontrados tanto no SNC quanto no sistema nervoso
periférico, bem como em tecidos não neuronais como o sistema cardiovascular e no
sangue.
A maioria dos receptores serotonérgicos são acoplados a proteína G, exceto o
5-HT3, que se liga a canais iônicos.
A classificação de receptores 5-HT iniciou-se em 1957, quando foi
demonstrado que respostas funcionais de porcos poderiam ser bloqueadas por
morfina. Nesta época, Gaddun e Picarelli (1957) propuseram uma subdivisão de dois
novos receptores “M” e “D”. Entretanto, essa classificação não foi específica e não
discriminava os diferentes ligantes de outros sistemas serotonérgicos.
A partir de 1976, a utilização de técnicas de binding-radioligantes permitiu a
identificação de outros receptores na membrana cortical de ratos (BENNETT e
SNYDER, 1976). Com a utilizaçao dessa técnica, foi demonstrado posteriormente
dois outros ligantes: (3H)-5-HT e (3)-espiperona-LSD, os quais foram posteriormente
denominados 5-HT1 e 5-HT2.
26
Em 1986, Bradley e colaboradores elaboraram um esquema de classificação
baseado em critérios funcionais, propondo a existência de três grupos de receptores:
5-HT, 5-HT2 e 5-HT3.
Com o progresso do sequenciamento do genoma, tornou-se clarificada a
identificação de receptores, representando cerca de 2% do genoma humano. Até o
momento, mais de 100 receptores tem sido identificados. Então, o Comitê de
Nomenclatura de receptores serotonérgicos propôs um novo sistema de
classificação baseado em critérios operacionais, estrutural e informação
transducional (HUMPHREY; HARTIG e HOYER, 1993).
A classificação atual (HOYER; HANON e MARTIN, 2002), através do Comitê
de Nomenclatura Internacional de Farmacologia, reconhece sete famílias de
receptores serotonérgicos (HOYER; HANON e MARTIN, 2002).
No presente estudo, foram estudados os subtipos 1A e 2A/2C, ambos
predominantemente envolvidos com a modulação da ansiedade.
3.3.1. Receptores 5-HT1
A classe de receptores 5-HT1 é composto por 5 subtipos (5-HT1A, 5-HT1B, 5-
HTD, 5-HT1E e 5-HTF) (ver tabela 4).
Os receptores 5-HT1A estão largamente distribuídos no SNC. Nos núcleos da
rafe, eles são somotadendríticos e atuam como autorreceptores, inibindo o disparo
(firing) das células, enquanto que os receptores 5-HT1A pós-sinápticos estão
presentes em estruturas límbicas, particularmente no hipocampo.
Tem sido estabelecido o envolvimento de receptores 5-HT1A em grande
número de efeitos comportamentais e fisiológicos, bem como na regulação
neuroendócrina do hormônio adrenocorticotrófico (ACTH).
27
Tabela 4 – Subtipos de receptores serotonérgicos.
Subtipo Localização Função Agonista
seletivo
Antagonista
seletivo
5-HT1A
NDR
Hipocampo
auto-receptor 8-OH-DPAT WAY-100135
5-HT1B
Subículo
Substância negra
Auto-receptor Inexistente inexistente
5-HT1D
Veias cranianas Vasoconstrição Sumotriptofano inexistente
5-HT1F
Cérebro
Periferia
Desconhecida Inexistente inexistente
5-HT2A
Plaquetas
Músculo liso
Córtex
Agregação de
plaquetas
Constrição
Alfa-metil-5-HT
DOI
Quetanserina
LY 53857
5-HT2B
Estômago Excitação
neuronal
Alfa-metil-5-HT
DOI
LY 53857
5-HT2C
Plexo coróide Contração Alfa-metil-5-HT
DOI
LY 53857
5-HT3
Nervos periféricos
Área próstema
Anti-emético Alfa-metil-5-HT
Ondasetron
Tropsetron
5-HT4
Hipocampo
Trato-
grastrointestinal
Excitação
neuronal
renzapride GR 113808
5-HT5A
Hipocampo Desconhecida inexistente inexistente
5-HT5B
Ausência de
dados
Ausência de
dados
inexistente inexistente
5-HT6
Estriado Desconhecida inexistente inexistente
5-HT7
Hipotálamo
Intestino
Desconhecida inexistente inexistente
(Adaptada de Hoyer et al, 2002).
O pressuposto do papel de receptores 5-HT1A na modulação da ansiedade é
suportado por estudos recentes utilizando receptores 5-HT1A em camundongos
28
nocaute. Esses animais demonstraram aumento da ansiedade em vários paradigmas
experimentais, especialmente no labirinto em cruz.
Agonistas de receptores 5-HT1A como a buspirona e a gepirona são utilizados
clinicamente no tratamento da ansiedade e na depressão (DEN BOER; BOSKER e
SLAAP, 2000). Muitos agonistas mostraram seletividade para receptores 5-HT1A,
particularmente 8-OH-DPAT, que atua como agonista pleno. A síntese de vários
antagonistas seletivos para esse receptor tem apresentado maiores dificuldades.
Atualmente, um dos antagonistas para receptores 5-HT1A mais utilizados é o WAY-
100635 (FORSTER, 1996; FLETCHER, 1996).
3.3.2. Receptores 5-HT2
Os receptores 5-HT2 compreendem os tipos 2A, 2B e 2C.
O receptor 5-HT2A tem sido localizado no cromossoma humano 13q-q21 e é
compreeendido por cerca de 471 aminoácidos, em ratos. No SNC, esses receptores
estão distribuídos no córtex, claustrum, gânglios da base. A ativação de receptores
5-HT2A estimula a secreção de ACTH, corticosterona, oxitocina e prolactina (VAN
DE KAR et al., 2001).
Alguns dos ligantes com afinidade para o receptor 5-HT2A são a
quetanserina, a risperidona, a olanzapina e o MDL 100907. Esses agentes foram
desenvolvidos inicialmente para o tratamento da hipertensão. A quetanserina é
também um antagonista de alfa1-adrenoceptores. Já a risperidona e a olanzapina
são utilizadas no tratamento clínico da esquizofrenia, o que parte da hipótese de que
a combinação do antagonismo D2 e 5-HT2A possui atividade antipsicótica.
Os receptores 5-HT2C foram um dos primeiros receptores serotonérgicos a
serem clonados. Estes receptores encontram-se distribuídos em várias estruturas
29
límbicas, mas principalmente no plexus coróide. A ativação desses receptores
parece exercer inibição tônica dopaminérgica e adrenérgica fronto-cortical. Além
disso, há estudos promissores com ligantes 5-HT2C para o tratamento de
transtornos alimentares.
4. Serotonina e ansiedade
As primeiras evidências que relacionavam a 5-HT à ansiedade partiram de
trabalhos realizados com modelos animais de conflito. Já no início da década de 70,
alguns trabalhos (ROBICHAUD e SLEDGE, 1969; GRAEFF e SCHOENFELD, 1970)
indicavam que o inibidor da síntese serotonérgica, a para-clorofenilalanina (PCPA), e
alguns antagonistas serotonérgicos eram capazes de liberar o comportamento
punido por choque elétrico. Por sua vez, o precursor da síntese serotonérgica, 5-
hidroxitriptofano (5-HTP), revertia o efeito anticonflito da PCPA (GELLER e BLUM,
1970).
Alguns anos mais tarde, um grupo de pesquisa liderado por Stein (WISE et
al., 1972) demonstrou que o BZD oxazepam reduzia a renovação de 5-HT no
cérebro de ratos, nas mesmas doses em que liberava o comportamento punido em
modelos de conflito. Analisando as evidências obtidas em conjunto, Stein e
colaboradores (1973) forneceram o primeiro modelo teórico sobre o possível
funcionamento da 5-HT na ansiedade. Segundo estes autores, a 5-HT estaria
mediando os efeitos da punição através da estimulação de regiões prosencefálicas e
mesencefálicas que comandavam a inibição comportamental. Em outras palavras, a
estimulação do sistema serotonérgico induzia a ansiedade.
Entretanto, ainda na década de 70, evidências contrárias à teoria clássica
serotonérgica proposta por Stein e colaboradores (1973) começaram a ser
30
publicadas. A maior parte dessas evidências era decorrente de experimentos que
utilizavam a estimulação elétrica aversiva da SCPD de ratos.
Inicialmente, Kiser e colaboradores (1978) demonstraram que a injeção
intraperitoneal do precursor da síntese serotonérgica, 5-HTP, ou do inibidor de
recaptação de 5-HT/NA, clomipramina, inibia o comportamento de pressão à barra,
responsável pela redução da intensidade de estimulação elétrica aversiva na SCPD.
Por sua vez, o inibidor da síntese de 5-HT, PCPA, facilitava este comportamento.
Complementando estes resultados, Schenberg e Graeff (1978) demonstraram que
antagonistas serotonérgicos, injetados intraperitonealmente, diminuíam as latências
de pressão à barra, que interrompia a estimulação elétrica da SCPD, de forma
semelhante ao efeito obtido com o PCPA.
Além das inconsistências demonstradas em trabalhos pré-clínicos, evidências
obtidas a partir de estudos clínicos quanto ao papel desempenhado pela 5-HT na
ansiedade também são contraditórias. Enquanto o efeito ansiolítico de BZDs sobre a
ansiedade generalizada pode estar relacionado com a inibição da neurotransmissão
serotonérgica (BLIER e MONTIGNY, 1987), drogas que facilitam a neurotransmissão
de 5-HT, como os inibidores de recaptação de 5-HT, são prescritos na clínica para o
tratamento de alguns transtornos de ansiedade, como por exemplo o pânico.
4.1. Teoria do Papel Dual da Ansiedade
Com o intuito de solucionar e conciliar esta aparente contradição, Deakin e
Graeff (1991) formularam uma teoria que pressupõe um papel dual atribuído a 5-HT
na modulação de respostas defensivas, devido a sua atuação oposta na AM e na
SCPD. Essa teoria sugere que, mediante um perigo potencial, projeções
serotonérgicas distintas (ver figura 2), oriundas do núcleo dorsal da rafe (NDR)
31
seriam ativadas, o que liberaria 5-HT tanto na AM quanto na SCPD. O aumento
desta monoamina na AM facilitaria respostas de esquiva, ao passo que este
aumento na SCPD inibiria respostas de fuga. Portanto, a AM (importante estrutura
relacionada à aprendizagem de estímulos sinalizadores de perigo), se relacionaria
com a ansiedade antecipatória e com o TAG, enquanto que a SCPD (estrutura
responsável pela coordenação de reações de luta/fuga), se relacionaria com o TP
(DEAKIN e GRAEFF, 1991) (ver figura 2).
Figura 2 – Vias serotonérgicas ascendentes provindas do núcleo dorsal da rafe
(NDR) e que inervam a amígdala e a substância ou matéria cinzenta periaquedutal
(MCP) (Retirada de Graeff e Guimarães, 2000).
5. Modelos animais de ansiedade
A importância do uso de modelos animais concentra-se na tentativa de se
reproduzir em laboratório, alguns aspectos da sintomatologia e da etiologia dos
chamados transtornos de ansiedade, e em possibilitar a seleção de novos
32
compostos com potencial terapêutico para o tratamento destes transtornos, durante
a fase de investigação pré-clínica (GRAEFF e GUIMARÃES, 2000).
Atualmente, existe uma grande variedade de modelos animais de ansiedade.
Alguns dos primeiros modelos animais de ansiedade utilizados envolviam situações
de conflito do tipo aproximação-evitação do estímulo aversivo e baseavam-se na
inibição ou supressão de respostas. Em sua grande maioria, esses modelos também
envolviam punição (VOGEL e CLODY, 1971). Por outro lado, outros modelos, muito
utilizados nos últimos anos, envolvem a emissão de respostas comportamentais de
defesa como a fuga ou esquiva ativa. É o caso, por exemplo, dos modelos que
utilizam a estimulação elétrica ou química de estruturas encefálicas, como o teste de
estimulação aversiva da SCPD (GRAEFF et al., 1991). Há ainda os modelos
denominados “mistos” (HANDLEY et al., 1993), que envolvem tanto inibição quanto
emissão de respostas comportamentais de defesa, tais como o labirinto em cruz
elevado (HANDLEY e MITHANI, 1984; PELOW e FILE, 1985).
Considerando o fato da ansiedade não ser um fenômeno unitário, podendo
ser subdividida em diferentes subtipos específicos que respondem diferentemente ao
tratamento farmacológico, o modelo do labirinto em T elevado (LTE) foi desenvolvido
(GRAEFF et al., 1993; VIANA, 1994). Um dos fatores que norteou o desenvolvimento
deste modelo foi a possibilidade de verificação de alguns dos pressupostos da teoria
do papel dual da 5-HT, proposta por Deakin & Graeff (1991). O modelo possibilita a
separação, em um mesmo animal, de uma resposta comportamental relacionada à
inibição comportamental (a esquiva inibitória) e de uma resposta comportamental
relacionada à ativação motora (a fuga de uma via). Estes dois tipos de respostas
comportamentais, medidas através das duas tarefas propostas pelo modelo do LTE
33
(esquiva e fuga), têm sido relacionadas, em termos clínicos, a dois subtipos de
ansiedade: o TAG e o TP, respectivamente.
A validação inicial do modelo do LTE mostrou que compostos de três classes
de ansiolíticos – o agonista de receptores benzodiazepínicos diazepam, o agonista
5-HT
1A
buspirona, e o antagonista não seletivo de receptores 5-HT
2
ritanserina,
diminuem as latências de esquiva inibitória, sem alterarem as medidas de fuga do
braço aberto do modelo (GRAEFF et al., 1998). Evidências clínicas mostram que o
TAG é sensível a estas classes de ansiolíticos (NUTT, 1991; DAVIDSON, 2001), o
que corrobora o pressuposto de que a esquiva inibitória dos braços abertos do LTE
esteja relacionada ao TAG. Por outro lado, a administração crônica de compostos
antidepressivos eficazes para o TP, como a imipramina e fuoxetina, apresentaram
efeito ansiolítico sobre a tarefa de fuga do modelo (CUSTÓDIO TEIXEIRA et al.,
2000, POLTRONIERI et al., 2003).
Um outro modelo animal de ansiedade utilizado é o modelo de transição claro-
escuro desenvolvido por Crawley e Goodwin (1980), no qual os índices de ansiedade
são medidos pelo tempo gasto no compartimento escuro e o número de transição
entre os compartimentos têm sido relacionados à atividade exploratória do animal
(CRAWLEY e GOODWIN, 1980).
Estudos recentes demonstraram os efeitos de ligantes serotonérgicos,
especificamente aos receptores 5-HT2. Assim, foi demonstrado que tanto os
agonistas serotonérgicos DOI, MCPR, quanto os antagonistas desse subtipo de
receptor SR 46349B e a quetanserina, quando injetados intraperitonealmente em
ratos não apresentaram algum efeito nesse modelo de transição-claro-escuro. Por
outro lado, estudos conduzidos em nosso laboratório demonstraram que o agonista
5-TH1A 8-OH-DPAT intra-NDR apresentou efeito ansiolítico neste modelo (SENA et
34
al., 2003). De maneira semelhante, a microinjeção intra-AM do agonista GABAA
muscimol apresentou um aumento significativo do tempo gasto no compartimento
claro no modelo de transição claro-escuro, ou seja, um efeito ansiolítico (BUENO et
al., 2005).
6. Hipotálamo
O hipotálamo relaciona-se à manutenção da sobrevivência e à homeostase do
indivíduo. Sua circuitaria é responsável pela integração endócrina, autonômica e
comportamental que garante a sobrevivência e a reprodução (BJORKLUND et al.,
1987). Suas várias funções vão desde a regulação da ingestão e água e nutrientes
até o preparo neuroendócrino do organismo para a reprodução, ou para a defesa
frente ameaças à sobrevivência e ao bem estar do indivíduo.
Anatomicamente, o hipotálamo localiza-se acima da glândula pituitária e
ocupa a parte ventral do diencéfalo dos dois lados do terceiro ventrículo.
Tradicionalmente, ele é dividido em cerca de 24 grupos de células distintas
(GURDJAN, 1927). Posteriormente a essa caracterização, Crosby e Woodburne
(1940), propuseram uma subdivisão para o hipotálamo em três regiões distintas: a
periventricular, a medial e a lateral, sugerindo ainda, 4 níveis de organização rostro-
caudal: a região pré-óptica, a supra-óptica ou anterior, a tuberal e a mamilar.
A região periventricular contém a maioria dos motoneurônios do sistema
endócrino. A zona medial dessa região consiste de uma série de grupos de células
bem definidos, que recebem a maioria dos inputs de diferentes partes das regiões
límbicas do telencéfalo, estando assim envolvidos na iniciação e integração de
comportamentos motivados (CANTERAS, 2002), e a zona lateral é constituída de
35
neurônios localizados entre as fibras do feixe prosencefálico medial, que conecta
estruturas prosencefálicas com o tronco cerebral (ver figura 3).
Figura 3 – Representação esquemática do hipotálamo (Retirada de
www.piscobio.com.br, 2003)
O hipotálamo é atravessado por 4 principais sistemas de fibras: o feixe
prosencefálico medial, o sistema periventricular, o sistema fórnix e a estria terminal
(stria terminalis), responsáveis pelo fluxo de informações que chegam ou partem do
hipotálamo (NIEWENHUYS et al., 1982).
O feixe prosencefálico medial atravessa a parte lateral do hipotálamo. Possui
fibras ascendentes e descendentes e se estende de regiões do prosencéfalo até
regiões ventrais do tronco cerebral. Sua maior ramificação, o trato amígdalo-fugal,
passa na região acima do trato óptico e, interliga a amígdala, o hipotálamo e o
tálamo.
36
O sistema periventricular é constituído por fibras finas centradas nas regiões
periventriculares do hipotálamo, tálamo e mesencéfalo.
O sistema fornix pós-comissural inicia-se no subiculum (SWANSON e
COWAN, 1975) e termina na zona medial, nos corpos mamilares ou na região do
núcleo ventromedial (trato córtico-hipotalâmico medial).
O componente hipotalâmico da stria terminalis finda igualmente no núcleo
ventromedial, apesar de que algumas de suas fibras terminem em áreas mais
rostrais da zona medial (SIMERLY e SWANSON, 1986).
A organização do hipotálamo pode ser melhor compreendida segundo o
modelo proposto por Canteras (2002), que subdivide-o em dois esquemas
longitunais: a zona motora neuroendócrina e a coluna de controle comportamental. O
primeiro seria centrado na zona periventricular clássica e inclui um conjunto de
neurônios secremotores do sistema neuroendócrino, enquanto que o segundo
esquema (sentido rostro-caudal) seria constituído de núcleos distintos da região
medial que controlam a expressão de três classes de comportamentos motivados
necessários à sobrevivência do indivíduo e da espécie: controle do comportamento
de ingestão de nutrientes e água (divisão descendente do núcleo paraventricular,
NPV), comportamento reprodutivo (núcleo pré-óptico medial, parte ventrolateral do
núcleo ventromedial e a parte ventral do núcleo pré-mamilar) e comportamento
defensivo (núcleo anterior do hipotálamo, parte dorsomedial do núcleo ventromedial
– dHVM - e a parte dorsal do núcleo pré-mamilar).
6.1. O Hipotálamo e Defesa
O hipotálamo é uma estrutura fundamental para a adaptação do organismo a
situações de estresse, seja ele provocado por situações aversivas, por estresse
37
físico, ou por qualquer situação que altere a homeostase do indivíduo (SWANSON,
1987, CANTERAS, 2002).
Os circuitos neuroanatômicos envolvidos nos comportamentos de medo e
ansiedade são modulados por várias substâncias químicas, que compõem
verdadeiros sistemas de neurotransmissão, tais como os peptídeos, fator de
liberação de corticotrofina (CRF), a colecistonina (CCK), a substância P, assim como
neurotransmissores como a 5-HT, a noradrenalina (NA), a dopamina (DA), o ácido-
gama-aminobutírico, GABA e o glutamato (GLU) (CHARNEY, 2003).
Dentre as regiões hipotalâmicas que participam ativamente das respostas
envolvidas com o estresse, destacam-se o NPV, pela produção e liberação de CRF,
arginina-vasopressina (AVP) e a oxitocina, implicadas nas alterações fisiológicas
induzidas pelo estresse.
O CRF está envolvido na regulação das respostas endócrinas, autonômicas e
comportamentais a situações de estresse e ansiedade (DE SOUZA, 1995; CRATTY
et al., 1995), como também relacionado à adaptação, à novidade e à regulação da
ingestão de alimentos (GROSS et al., 1994). A ativação de mecanismos de controle
homeostático depende da aferência de estímulos estressores ao hipotálamo. De
modo geral, diversos estressores convergem para células da divisão parvocelular do
NPV, tendo como consequência, um aumento de liberação de ACTH (hormônio
adenocorticotrófico) e de beta-endorfinas pela hipófise anterior. Esses estressores
provocam aumentos na liberação de CRF, AVP e de outras substâncias dentro do
PVN, que, por sua vez, são responsáveis por uma cascata de eventos que culminam
na liberação de corticosteróides induzidos pelo ACTH, encontrados no plasma em
estados de ansiedade (CULLINAN et al., 1996). Essas alterações fisiológicas
envolvidas nos mecanismos adaptativos ao estresse, aparentemente resultam da
38
ativação de regiões que exercem modulação excitatória ou inibitória sobre o eixo-
hipotálamo-hipófise-adrenal (HPA).
A área anterior do hipotálamo está envolvida com a elaboração de
comportamentos defensivos, juntamente com o núcleo dorsomedial do hipotálamo.
Ambos estão igualmente envolvidos também com a alteração da resposta
cardiovascular. A estimulação dessas regiões produz aumento na concentração de
ACTH e de corticosterona plasmática (DE NOVELLIS et al., 1995). No entanto,
importantes projeções dessas regiões para o NPV, são gabaérgicas, e exercem
modulação inibitória sobre ele.
O hipotálamo foi inicialmente testado por Hess e Brugger em gatos, através
de estimulação elétrica (1943). Os resultados deste estudo mostraram que, em
consequência da estimulação, diversas alterações autonômicas e comportamentais,
denominadas na época de reação afetiva de defesa, eram obtidas. Estas alterações
incluíam o arqueamento do dorso, a elevação da cauda, ataque orientado, exposição
das garras e midríase. Outros estudos demonstraram, entretanto, que a microinjeção
de GLU, intra-HM, nos mesmos locais onde a estimulação elétrica costuma induzir
defesa (hipotálamo ventral), fuga e aumento do estado de alerta (hipotálamo
dorsomedial), não apresentaram o efeito esperado (GRAEFF et al.,1993). Porém, a
estimulação química com doses subtóxicas de ácido caínico microinjetado intra-HM,
provocou aumento na locomoção, exploração dirigida e outros comportamentos
também encontrados na estimulação elétrica ou na estimulação química com
antagonistas gabaérgicos (SILVEIRA e GRAEFF, 1992).
Os neurônios que controlam a defesa no hipotálamo parecem estar mais
dispersos do que na SCP. No entanto, sem eles, seria difícil explicar os
comportamentos defensivos eliciados por microinjeções de antagonistas
39
GABAérgicos, assim como os resultados obtidos com agonistas colinérgicos em
cérebro de gatos, provocando defesa afetiva (BAXTER, 1968).
As reações de defesa eliciadas pelo hipotálamo diferem das oriundas da
estimulação da SCP, por uma característica que sugere organização e
intencionalidade na expressão da resposta defensiva. Esse aspecto foi evidenciado
em ratos sob estimulação química do hipotálamo medial colocados em uma arena,
que exibiam saltos e comportamentos locomotores coordenados, aparentemente
voltados para o objetivo de encontrar a saída (SCHMITT et al., 1996), enquanto que
na fuga eliciada pela estimulação da SCP, ocorrem saltos e corridas aparentemente
sem sentido ou orientação. Parece, então, que o hipotálamo está envolvido em
mecanismos de coordenação da fuga, tanto em resposta à estimulação elétrica,
quanto à defesa anti-predatória.
6.2. Sistema defensivo hipotalâmico medial, porção dorsal do hipotálamo-
ventromedial (dHVM) e defesa
A área medial do hipotálamo tem sido descrita como um sistema defensivo,
composto basicamente por três núcleos principais, o anterior, o pré-mamilar dorsal e
o dHVM (THOMPSON e SWANSON, 1998). Aliada a observações anatômicas,
evidências comportamentais sugerem a implicação dessa região com a defesa.
Neste sentido, um estudo realizado por Canteras e colaboradores (1997) com a
técnica de imunorreatividade à proteína Fos mostrou, por exemplo, que a exposição
direta ao predador, capaz de evocar comportamento de freezing, saltos e respostas
de fuga em ratos, era também capaz de aumentar a expressão de Fos nestes três
sítios específicos da região medial. Entretanto, é interessante salientar que no
estudo de Canteras e colaboradores (1997), imunorreatividade à proteína Fos foi
40
também observada em outras regiões hipotalâmicas, como a área pré-óptica lateral e
o núcleo dorsomedial.
O sistema defensivo do hipotálamo medial recebe aferências principalmente
de áreas prosencefálicas, em especial dos núcleos medial e basomedial da
amígdala, da área septal lateral, e do córtex pré-frontal (THOMPSOM e SWANSON,
1998). Além disso, outros núcleos hipotalâmicos, em especial núcleos da região
lateral do hipotálamo, também enviam projeções para o hipotálamo medial
(THOMPSON e SWANSON, 1998). Finalmente, alguns sítios do tronco encefálico se
comunicam com o hipotálamo medial, em especial o núcleo pré-comissural, a porção
dorsolateral da SCP, a região parabraquial e o núcleo tegmental ventral
(THOMPSON e SWANSON, 1998).
Por sua vez, o hipotálamo medial envia projeções ao septo lateral, estria
terminal e amígdala lateral, no telencéfalo; tálamo dorsal e ventral, no diencéfalo; e
no tronco encefálico, o núcleo pré-comissural e SCP representam os principais alvos
do hipotálamo medial (THOMPSON e SWANSON, 1998). Além disso, os núcleos do
hipotálamo medial comunicam-se com outros núcleos hipotalâmicos, como a área
pré-óptica lateral, a região perifornical, o núcleo posterior e o núcleo dorsomedial
(THOMPSON e SWANSON, 1998).
De fato, com exceção do núcleo pré-mamilar, os outros dois componentes do
hipotálamo medial enviam projeções ao núcleo dorsomedial do hipotálamo
(THOMPSON e SWANSON, 1998; CANTERAS, 2002). Tem sido demonstrado que o
núcleo dorsomedial, à semelhança dos três núcleos do hipotálamo medial
supracitados, também parece ser ativado por uma série de situações estressantes,
como choque elétrico nas patas, contenção, nado forçado, desidratação e exposição
a um predador (CULLINAN et al., 1996; CANTERAS et al., 1997; LI e SAWCHENKO,
41
1998). Com base nestas observações, tem sido sugerido que o núcleo dorsomedial é
uma das principais partes desse sistema defensivo hipotalâmico, exercendo
importantes funções no que diz respeito à regulação de respostas cardiovasculares
ao estresse, como o fluxo sanguíneo do miocárdio e a taquicardia associada a
respostas comportamentais de defesa. Entretanto, é interessante salientar que
embora o núcleo dorsomedial tenha sido tradicionalmente visto como pertencendo
ao hipotálamo medial, alguns estudos neuroanatômicos mais recentes têm sugerido
que ele deveria ser considerado como parte da região periventricular (THOMPSON e
SWANSON, 1998; CANTERAS, 2002).
Com relação aos três núcleos que fazem parte do sistema defensivo do
hipotálamo medial, o envolvimento em especial do dHVM com a defesa vem sendo
reforçada a partir de uma série de estudos comportamentais realizados nos últimos
anos. Foi demonstrado, por exemplo, que a administração intra-dHVM do
antagonista de receptores GABA
A
bicuculina diminuiu o tempo gasto no
compartimento claro do modelo de transição claro-escuro, efeito ansiogênico. Por
outro lado, a administração intra-dHVM de GABA apresentou efeito ansiolítico em
tarefas que envolvem a esquiva como resposta de defesa, a esquiva de uma
plataforma iluminada e a esquiva de uma situação potencialmente perigosa
(TALALAENKO; PANKRATEV e GONCHARENKO, 2001). Corroborando esses
dados, foi demonstrado que a administração intra-dHVM do agonista BZD midazolam
apresentou efeito ansiolítico nos modelos do labirinto em cruz elevado e teste do
beber-punido de Vogel (JARDIM et al., 2005). O mesmo foi obtido com a
administração intra-HDM do antagonista glutamatérgico AP7 (JARDIM e
GUIMARÃES, 2001). Esses resultados corroboram as observações
imunohistoquímicas realizadas por Canteras e colaboradores (1997), que
42
demonstraram a participação do núcleo na modulação de respostas
comportamentais de defesa. Conforme já mencionado, no estudo citado, foi
observado um aumento na expressão de Fos em núcleos da região medial do
hipotálamo, inclusive no dHVM, após a exposição de ratos a um predador, um gato.
Resultados similares foram obtidos quando os animais foram expostos ao odor de
gato (STAPLES et al., 2005). Corroborando estes dados, a exposição do rato a um
coleira impregnada com odor de gato aumentou o tempo gasto no esconderijo e a
expressão de Fos no dHVM (DIELENBERG et al., 2001). Finalmente, a resposta de
fuga após a estimulação elétrica da SCPD também provocou um aumento na
ativação da proteína Fos (VIANNA et al., 2003).
Estudos recentes conduzidos em nosso laboratório com o LTE, demonstraram
que a administração intra-dHVM de midazolam, muscimol e bacoflen, prejudicou
tanto a esquiva inibitória, efeito ansiolítico, quanto a tarefa de fuga de um dos braços
abertos do modelo, um efeito panicolítico. Por outro lado, a administração intra-
dHVM do agonista inverso BDZ FG 7142 facilitou as duas respostas
comportamentais de defesa, efeito ansiogênico e panicogênico, respectivamente
(BUENO et al., 2005). Quando comparados aos resultados obtidos com outra
estrutura que tem sido relacionada à modulação de respostas comportamentais de
defesa, a SCPD, estes resultados diferem no seguinte sentido: Com exceção do que
foi observado com o FG 7142, que quando administrado intra-SCPD alterou também
as respostas de esquiva, todas as outras drogas administradas na estrutura foram
seletivas para a tarefa de fuga (BUENO et al., 2005). Esta observação nos levou a
concluir que, embora os receptores GABA/BDZ da SCPD estejam primordialmente
envolvidos na mediação de um comportamento defensivo que tem sido associado ao
transtorno do pânico, a fuga dos braços abertos do LTE, os mesmos receptores no
43
dHVM aparentemente encontram-se relacionados aos dois subtipos de ansiedade
associados às tarefas comportamentais medidas, o TAG e o TP.
44
OBJETIVOS
O sistema mediado por serotonina é um dos principais sistemas de
neurotransmissão que têm sido implicados na modulação de respostas
comportamentais a estímulos aversivos e aos processos emocionais que
acompanham estas respostas, como o medo e a ansiedade. De fato, o papel
desempenhado pela neurotransmissão serotonérgica da AM, SCPD e NDR sobre a
modulação de respostas comportamentais de defesa vem sendo bastante
investigado nos últimos anos, através da utilização de diferentes modelos animais de
ansiedade. Merecem atenção especial os estudos realizados com o modelo do LTE,
que permite a comparação dos efeitos da manipulação serotonérgica sobre duas
respostas comportamentais distintas em um mesmo animal. Por outro lado, não
existem até o presente momento estudos direcionados à verificação da função
exercida pela 5-HT, via hipotálamo medial, sobre os dois comportamentos de defesa
medidos no modelo do LTE, muito embora esta região hipotalâmica tenha sido
implicada na modulação da ansiedade.
Neste sentido, o objetivo do presente trabalho foi verificar a participação do
sistema serotonérgico de um núcleo específico do sistema defensivo hipotalâmico
medial, o dHVM, sobre a modulação de respostas comportamentais de defesa,
através da utilização do modelo LTE. Para tanto, animais foram pré-expostos a um
dos braços abertos do modelo do LTE, e um dia após a pré-exposição,
microinjetados com drogas serotonérgicas (agonista 5-HT1A 8-OH-DPAT, o agonista
5-HT2A/2C DOI, o antagonista preferencial 2A quetanserina) intra-dHVM, e
subsequentemente, testados no modelo. Após a avaliação do comportamento dos
animais no labirinto, os ratos foram submetidos ao modelo da transição claro/escuro.
Este último modelo foi utilizado com o intuito de se estender a verificação dos efeitos
45
das manipulações farmacológicas das estruturas sobre a esquiva inibitória do LTE,
uma vez que tanto as medidas do claro/escuro quanto a medida de esquiva do LTE
respondem positivamente ao tratamento com BZDs e buspirona e, portanto, têm sido
correlacionadas em termos clínicos à TAG. Numa tentativa de evitar falsos negativos
ou positivos devido ao efeito das drogas sobre a atividade exploratória, os animais
foram testados em uma arena após os testes com o LTE, para as medidas do
número de cruzamentos e levantamentos.
46
MATERIAIS E MÉTODOS
1. Animais
Foram utilizados ratos Wistar, machos, provenientes do biotério central do
campus da Universidade de São Paulo – Ribeirão Preto, com peso médio de 250-
300 g no dia do teste. Os animais foram alojados em grupos de 4-6 por caixa, com
livre acesso a água e alimento e mantidos em um biotério com temperatura
controlada em 22 ± 1º C e programa de iluminação com ciclo claro/escuro 12h x 12h,
com início do período claro às 7:00 h. Após a cirurgia, os animais eram alojados aos
pares.
2. Equipamentos
Labirinto em T elevado: o LTE (Figura 4) é constituído por três braços de madeira de
iguais dimensões (50 cm x 12 cm de largura), elevados 50 cm em relação ao solo.
Um dos braços é circundado por paredes laterais (40 cm de altura) e está disposto
perpendicularmente aos dois outros braços abertos (desprovidos de paredes). Para
evitar a queda dos animais, os braços abertos são circundados por uma tira de
acrílico transparente de 1 cm de altura (GRAEFF et al., 1993).
47
Figura 4 – Ilustração do Labirinto em T elevado
Arena: Objetivando avaliar a atividade locomotora dos animais, logo após o teste
com o modelo do LTE, os animais foram submetidos a uma arena, constituída de
uma caixa de madeira medindo 60 x 60 cm, com paredes laterais de 40 cm de altura
(Figura 5). Este teste é conduzido colocando-se o animal no centro da arena e
filmando-o por 5 minutos. Posteriormente, são quantificados os números de
cruzamentos e de levantamentos.
Figura 5 – Ilustração da Arena
48
Modelo da transição claro/escuro: O aparelho confeccionado em madeira, possui
dimensões de 48 x 24 x 27 cm, sendo dividido em dois compartimentos de
dimensões iguais (Figura 6). Os compartimentos, um de cor preta (compartimento
escuro) e outro de cor branca (compartimento iluminado), são separados por uma
barreira que contém no centro uma passagem (10 x 10 cm), permitindo a transição
do animal entre os dois compartimentos. O assoalho é constituído por grades de
ferro separadas em 5 cm. A tampa de acrílico que recobre o compartimento
iluminado é translúcida. A que recobre o compartimento escuro é pintada em preto.
Figura 6 – Ilustração do modelo da transição claro-escuro
3. Cirurgia
Cinco a dez minutos antes da cirurgia estereotáxica (Figura 7), cada animal
era anestesiado intraperitonealmente (IP) com tribromoetanol (2,5 g/100 ml, 10
ml/kg, Aldrich, EUA). Em seguida, os animais eram afixados ao aparelho
estereotáxico (Stoelting, EUA), com a barra dos incisivos 3,5 mm abaixo da linha
interaural. Imediatamente após, recebiam subcutaneamente o anestésico local,
49
cloridrato de lidocaína (Lidocaína 3%, PROBEM, Brasil), assim como o
antiinflamátório Banamine (1ml/kg, Schergin-Plough, Brasil) e o pentabiótico
veterinário (0,2 ml, Fort Dodge, Brasil) intra-muscularmente.
Após a exposição do crânio e da devida assepsia do local, dois pequenos
orifícios eram abertos: um para o parafuso, com o intuito de auxiliar a fixação de uma
prótese de acrílico, e o segundo para a inserção da cânula-guia. Foi utilizada cânula-
guia de 14 mm de comprimento e 0,3 mm de diâmetro externo, inserida a 2 mm da
estrutura, seguindo as seguintes coordenadas: ângulo de 0º, -3,0 mm ântero-
posterior ao bregma, +0,6 mm lateral e – 7,8 mm ventral à superfície do crânio.
Figura 7 – Ilustração de uma cirurgia estereotáxica
4. Microinjeção
Agulhas dentais de 15 mm de diâmetro externo, conectadas a uma seringa
Hamilton de 10 µL através de um tubo de polietileno, foram introduzidas pela cânula-
guia, após a remoção do mandril. Um minuto depois da introdução da agulha dental,
50
iniciou-se a administração da droga ou veículo. Em todos os experimentos, um
volume de 0,2 µL foi administrado por um período de dois minutos. Após a
administração, a agulha permaneceu por 60 segundos adicionais no interior da
cânula para evitar refluxos.
5. Drogas
Foram utilizadas as seguintes drogas: 8-OH-DPAT (RBI; USA; doses de 0,8,
3,2 e 16 nmoles), DOI (RBI; USA; doses de 4, 8 e 16 nmoles), quetanserina (SIGMA;
USA; doses de 5, 10 e 15 nmoles). Com exceção da quetanserina, as drogas foram
diluídas em salina (cloreto de sódio 0,9%). A quetanserina foi dissolvida em salina
estéril 0,9% e Tween 80 (Sigma, EUA) a 2%. Os animais do grupo controle da
quetanserina receberam salina 0,9% e Tween 80 a 2%. As drogas foram
microinjetadas em volume de 0,2 µL. Todas as drogas foram conservadas em
freezer, em eppendorfs, contendo 20 µL cada, até o dia dos experimentos.
6. Procedimento
LABIRINTO EM T ELEVADO: No dia seguinte à sua chegada ao biotério, os animais
foram submetidos à cirurgia estereotáxica para implantação da cânula-guia no
dHVM. Cinco dias depois, estes animais foram pré-expostos a um dos braços
abertos do modelo do LTE, por um período de 30 min. Após 24 horas, cada animal
era microinjetado com uma das drogas (Experimento 1, 8-OH-DPAT: 0,8, 1,6 e 3,2
nmoles/0,2 µL ou salina; Experimento 2: DOI 4, 8 e 16/0,2 µL ou salina;
Experimento 3: quetanserina 5,10 e 20 nmoles/0,2 µL ou salina mais Tween 80 a
2%) e, após dez minutos, era colocado na extremidade distal do braço fechado do
LTE, com a cabeça voltada para o centro do aparelho. Cronometrava-se, então, a
51
latência de saída, com as quatro patas, do braço fechado em direção ao aberto
(latência basal). Imediatamente após, o animal era retirado do labirinto e colocado
em uma caixa, por trinta segundos. Em seguida, a mesma medida foi tomada por
mais duas vezes consecutivas (latências de Esquiva Inibitória 1 e 2), com intervalo
de 30 segundos entre elas. O animal era então colocado na extremidade do braço
aberto para registro do tempo de saída deste braço com as quatro patas (Fuga 1).
Esse procedimento foi repetido por mais duas vezes consecutivas, com intervalos de
trinta segundos entre elas, para a aquisição das medidas de Fuga 2 e Fuga 3.
ARENA: Após a última medida de fuga, o animal foi colocado na arena e filmado por
cinco minutos para posterior registro de número de cruzamentos e levantamentos.
TRANSIÇÃO CLARO-ESCURO: Imediatamente após a arena, os animais eram
colocados no compartimento iluminado com a face voltada para a passagem de
transição entre os dois compartimentos, sendo cronometrado o tempo a partir do
momento em que o animal entrava no compartimento escuro. Após esta primeira
transição, foram cronometrados 5 minutos adicionais de permanência na caixa, no
qual se media o tempo de permanência no compartimento claro e o número de
transições entre os compartimentos.
7. Perfusão
Após o término dos testes comportamentais, os animais foram anestesiados com
uretana a 25% e foram perfundidos via cardíaca com salina seguida por formol a
10%. Os cérebros foram removidos e armazenados em formol a 10%, até a data da
confecção das lâminas histológicas.
52
8. Histologia
Os cérebros foram cortados em secções coronais de 60 µm de espessura por
meio de um criostato (modelo Cryocut 1800, Leica, Alemanha) para verificação
macroscópica do sítio da microinjeção, segundo as fotomicrografias do atlas do
cérebro de rato de Paxinos e Watson (1997). Foram incluídos na análise somente os
animais que tiveram os sítios de injeção localizados no dHVM (ver Anexo 1).
53
ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os dados da esquiva e da fuga coletados no LTE foram submetidos à análise
de variância (ANOVA) do tipo split-plot, com o tratamento como o fator independente
e as tentativas, como o fator dependente. Caso o resultado do tratamento ou da
interação tratamento versus tentativas desse significativo, era realizada ANOVA de
uma via, seguida do teste post-hoc de Duncan. Os dados comportamentais da arena
e do modelo de transição claro-escuro foram submetidos à ANOVA de uma via,
seguida do teste post-hoc de Duncan. O resultado foi considerado significativo para
valores de p≤ 0,05.
54
RESULTADOS
Experimento 1: Efeito da administração do 8-OH-DPAT intra-dHVM no LTE
A Figura 8 (painel superior) demonstra a ausência de efeito do tratamento com 8-
OH-DPAT administrado intra-dHVM sobre a esquiva inibitória dos braços abertos do
LTE. A ANOVA do tipo split-plot indicou efeito significativo das tentativas
[F(2,62)=46,97; p<0,001], mas não do tratamento [F(3,31)=0,18; p=0,911] e nem da
interação tratamento versus tentativas [F(6,62)=0,38; p=0,891].
A Figura 8 (painel inferior) demonstra a ausência de efeito do tratamento com 8-
OH-DPAT administrado intra-dHVM sobre a fuga do braço aberto do modelo. A
ANOVA do tipo split-plot não indicou efeito significativo das tentativas [F(2,62)=0,12;
p=0,886], nem do tratamento [F(3,31)=2,29; p=0,098] e nem da interação tratamento
versus tentativas [F(6,62)=1,46; p=0,205].
Experimento 1: Efeito da administração do 8-OH-DPAT intra-dHVM sobre o
comportamento locomotor na arena
A Figura 9 demonstra os efeitos dos tratamentos sobre a atividade locomotora dos
animais testados na arena. A ANOVA de uma via não indicou diferenças
significativas em nenhuma das duas medidas: número de cruzamentos [F(3,31=1,32;
p=0,4893] e número de levantamentos [F(3,31)=1,63; p=0,9187].
Experimento 1: Efeito da administração do 8-OH-DPAT intra-dHVM no modelo
de transição claro-escuro
A Figura 10 demonstra os efeitos dos tratamentos sobre o número de transição e o
tempo de permanência no compartimento claro no modelo de transição claro-escuro.
A ANOVA de uma via não indicou diferenças significativas no número de transição
55
[F(3,31)=3,3524; p=0,8794] e nem no tempo de permanência no compartimento claro
[F(3,31)=4,3714; p=0,7451].
Experimento 2: Efeito da administração do DOI intra-dHVM no LTE
A Figura 11 (painel superior) demonstra os efeitos do tratamento com DOI
administrado intra-dHVM sobre a esquiva inibitória dos braços abertos do LTE. A
ANOVA do tipo split-plot indicou efeito significativo do tratamento [F(3,23)=4,52;
p=0,012], das tentativas [F(2,46)=28,75; p<0,01], e da interação tratamento versus
tentativas [F(6,46)=2,78; p=0,022]. A ANOVA de uma via não indicou diferença
significativa na latência basal [F(3,26)=3,49; p=0,319], mas indicou diferença
significativa na esquiva 1 [F(3,26)=3,74; p=0,0253] e na esquiva 2 [F(3,26)=3,71;
p=0,028]. O teste post-hoc de Duncan demonstrou que o efeito significativo (p <
0,05) entre os grupos tratados com DOI e o grupo controle se deu na esquiva 1
(doses de 4 e 8 nmol) e na esquiva 2 (dose de 8 nmol).
A Figura 11 (painel inferior) demonstra os efeitos dos tratamentos com DOI sobre a
fuga do braço aberto do modelo. A ANOVA do tipo split-plot indicou efeitos
significativos do tratamento [F(3,26)=4,517; p=0,016], mas não das tentativas
[F(6,46)=1,89; p=0,162] e nem da interação tratamento versus tentativas
[F(6,46)=1,27; p=0,292]. A ANOVA de uma via indicou diferença significativa entre os
grupos apenas na fuga 3 [F(3,26)=4,17; p=0,0169]. O teste post-hoc de Duncan
indicou que este efeito significativo se deu entre os grupos tratados com 4 e 8
nmoles do DOI em relação ao controle (p < 0,05).
Experimento 2: Efeito da administração do DOI intra-dHVM sobre o
comportamento locomotor na arena
56
A Figura 12 demonstra os efeitos dos tratamentos sobre a atividade locomotora dos
animais testados na arena. A ANOVA de uma via não indicou diferenças
significativas em nenhuma das duas medidas: número de cruzamentos
[F(3,26)=0,83; p=0,49] e número de levantamentos [F(3,26)=1,45; p=0,25].
Experimento 2: Efeito da administração do DOI intra-dHVM no modelo de
transição claro-escuro
A Figura 13 demonstra os efeitos dos tratamentos sobre o número de transição e o
tempo de permanência no compartimento claro no modelo de transição claro-escuro.
A ANOVA de uma via não indicou diferenças significativas no número de transição
[F(3,26)=2,4597; p=0,9884], mas apresentou diferenças significativas com relação ao
tempo de permanência no compartimento claro [F(3,26)=4,3714; p=0,0142]. O teste
post-hoc de Duncan indicou que este efeito significativo se deu entre todos os grupos
tratados com o DOI em relação ao controle (p < 0,05).
Experimento 3: Efeito da administração da quetanserina intra-dHVM no LTE
A Figura 14 (painel superior) demonstra os efeitos do tratamento com quetanserina
administrado intra-dHVM sobre a esquiva inibitória dos braços abertos do LTE. A
ANOVA do tipo split-plot indicou efeito significativo do tratamento F(3,19)=4,59;
p=0,01], das tentativas [F(2,46)=28,75; p<0,01], e da interação tratamento versus
tentativas F(2,38)=49,23; p=0,000]. A ANOVA de uma via não indicou diferença
significativa na latência basal [F(3,19)=0,884; p=0,9655], mas indicou efeito
significativo na esquiva 1 [F(3,19)=2,1783; p=0,02] e na esquiva 2 [F(3,19)=4,4722;
p=0,0155]. O teste post-hoc de Duncan demonstrou que o efeito significativo
57
(p<0,05) de todos grupos tratados com quetanserina na esquiva 2, quando
comparados com o grupo controle.
A Figura 14 (painel inferior) demonstra os efeitos dos tratamentos com
quetanserina sobre a fuga do braço aberto do modelo. A ANOVA do tipo split-plot
indicou efeitos significativos do tratamento [F(3,19)=4,92; p=0,016], mas não das
tentativas [F(2,38)=1,03; p=0,16] e nem da interação tratamento versus tentativas
[F(6,38)=0,59; p=0,3,67]. A ANOVA de uma via indicou diferença significativa entre
os grupos apenas na fuga 3 [F(3,38)=3,98; p=0,0161]. O teste post-hoc de Duncan
indicou que este efeito significativo se deu entre do grupo tratado com 5 nmoles de
quetanserina em relação ao controle (p<0,05).
Experimento 3: Efeito da administração da quetanserina intra-dHVM sobre o
comportamento locomotor na arena
A Figura 15 demonstra os efeitos dos tratamentos sobre a atividade locomotora dos
animais testados na arena. A ANOVA de uma via não indicou diferenças
significativas em nenhuma das duas medidas: número de cruzamentos
[F(3,19)=0,0556; p=0,9822] e número de levantamentos [F(3,19)=0,3099; p=0,8179].
Experimento 3: Efeito da administração da quetanserina intra-dHVM no modelo
de transição claro-escuro
A Figura 16 demonstra os efeitos dos tratamentos sobre o número de transição e o
tempo de permanência no compartimento claro no modelo de transição claro-escuro.
A ANOVA de uma via não indicou diferenças significativas no número de transições
[F(3,19)=0,5949; p=0,5949], e nem no tempo de permanência no compartimento
claro [F(3,19)=40,4618; p=0,7123].
58
0
50
100
150
200
250
300
Latência
Basal
Esquiva 1 Esquiva 2
latência (s)
salina
DPAT 0,8 nmol
DPAT 1,6 nmoles
DPAT 3,2 nmoles
0
5
10
15
20
Fuga 1 Fuga 2 Fuga 3
latência (s)
salina
DPAT 0,8 nmol
DPAT 1,6 nmoles
DPAT 3,2 nmoles
Figura 8: Efeito do 8-OH-DPAT intra dHVM sobre as medidas de esquiva inibitória
(painel superior) e fuga (painel inferior) dos braços abertos do LTE. Barras
representam média ± EPM para 7-10 ratos por grupo de tratamento. As medidas de
Latência Basal (LB), Esquiva 1, Esquiva 2, Fuga 1, Fuga 2 e Fuga 3 foram realizadas
com 30 segundos de intervalo entre cada, começando 10 minutos após a
microinjeção de droga ou veículo.
59
0
10
20
30
40
50
60
cruzamentos levantamentos
número
salina
DPAT 0,8 nmol
DPAT 1,6 nmoles
DPAT 3,2 nmoles
Figura 9: Efeito do tratamento com 8-OH-DPAT intra-dHVM sobre o comportamento
motor na arena. Barras representam média ± EPM para 7-10 ratos por grupo de
tratamento.
60
0
5
10
15
20
número de transições
salina
DPAT 0,8 nmol
DPAT 1,6 nmol
DPAT 3,2 nmoles
0
10
20
30
40
50
60
tempo no compartimento claro (s)
salina
DPAT 0,8 nmol
DPAT 1,6 nmoles
DPAT 3,2 nmoles
Figura 10
:
Efeito do tratamento com 8-OH-DPAT intra-dHVM sobre as medidas de
número de transições e tempo de permanência no compartimento claro do modelo
da transição claro/escuro. Barras representam média ± EPM para 7-10 ratos por
grupo de tratamento.
61
0
50
100
150
200
250
300
Latência
Basal
Esquiva 1 Esquiva 2
latência (s)
salina
4nmoles
8 nmoles
16 nmoles
* *
*
0
5
10
15
20
Fuga 1 Fuga 2 Fuga 3
latência (s)
salina
4 nmoles
8 nmoles
16 nmoles
*
*
Figura 11: Efeito do DOI intra-dHVM sobre as medidas de esquiva inibitória (painel
superior) e fuga (painel inferior) dos braços abertos do LTE. Barras representam
média ± EPM para 6-7 ratos por grupo de tratamento. As medidas de Latência Basal
(LB), Esquiva 1, Esquiva 2, Fuga 1, Fuga 2 e Fuga 3 foram realizadas com 30
segundos de intervalo entre cada, começando 10 minutos após a microinjeção de
droga ou veículo. *p<0,05 em relação ao controle (ANOVA seguida do teste post-hoc
de Duncan).
62
0
10
20
30
40
50
60
cruzamentos levantamentos
número
salina
DOI 4 nmoles
DOI 8 nmoles
DOI 16 nmoles
Figura 12:
Efeito do tratamento com DOI intra-dHVM sobre o comportamento motor
na arena. Barras representam média ± EPM para 6-7 ratos por grupo de tratamento.
Os animais foram expostos por 5 minutos à arena imediatamente após serem
testados no LTE.
63
0
5
10
15
número de transições
salina
DOI 4 nmoles
DOI 8 nmoles
DOI 16 nmoles
0
10
20
30
40
50
60
tempo gasto no compartimento claro(s)
salina
DOI 4 nmoles
DOI 8 nmoles
DOI 16 nmoles
*
*
*
Figura 13: Efeito do tratamento com DOI intra-dHVM sobre as medidas de número
de transições e tempo de permanência no compartimento claro do modelo de
transição claro/escuro. Barras representam média ± EPM para 6-7 ratos por grupo de
tratamento. *p<0,05 em relação ao controle (ANOVA seguida do teste post-hoc de
Duncan).
64
0
50
100
150
200
250
300
Latência basal Esquiva 1 Esquiva 2
latência (s)
sal + tween
5 nmoles
10 nmoles
20 nmoles
*
*
*
0
5
10
15
20
Fuga 1 Fuga 2 Fuga 3
latência (s)
sal + tween
5 nmoles
10 nmoles
20 nmols
*
Figura 14: Efeito da quetanserina intra-dHVM sobre as medidas de esquiva inibitória
(painel superior) e fuga (painel inferior) dos braços abertos do LTE. Barras
representam média ± EPM para 5-7 ratos por grupo de tratamento. As medidas de
Latência Basal (LB), Esquiva 1, Esquiva 2, Fuga 1, Fuga 2 e Fuga 3 foram realizadas
com 30 segundos de intervalo entre cada, começando 10 minutos após a
microinjeção de droga ou veículo. *p<0,05 em relação ao controle (ANOVA seguida
do teste post-hoc de Duncan).
65
0
10
20
30
40
50
60
cruzamentos levantamentos
número
sal + tween
QUE 5 nmoles
QUE 10 nmles
QUE 20 nmoles
Figura 15: Efeito do tratamento com quetanserina intra-dHVM sobre o
comportamento motor na arena. Barras representam média ± EPM para 5-7 ratos por
grupo de tratamento.
66
0
5
10
15
20
25
30
número de transições
sal + tween
QUE 5 nmoles
QUE 10 nmles
QUE 20 nmoles
0
10
20
30
40
50
60
tempo gasto no compartimento claro(s)
sal + tween
QUE 5 nmoles
QUE 10 nmles
QUE 20 nmoles
Figura 16: Efeito do tratamento com quetanserina intra-dHVM sobre as medidas de
número de transições e tempo gasto no compartimento claro do modelo da transição
claro/escuro. Barras representam média ± EPM para 5-7 ratos por grupo de
tratamento.
67
DISCUSSÃO
O presente trabalho avaliou os efeitos de drogas serotonérgicas intra-dHVM
em animais pré-expostos aos braços abertos do LTE e, posteriormente submetidos a
dois modelos animais de ansiedade: o LTE e o modelo da transição claro-escuro.
Para a verificação da atividade locomotora, os animais foram também submetidos a
uma arena.
O agonista 5-HT1A 8-OH-DPAT intra-dHVM (Experimento 1) não alterou as
tarefas de esquiva inibitória e nem de fuga dos braços abertos do LTE, não alterando
também a atividade locomotora dos animais. Estes resultados contrapõem-se ao
efeito antiaversivo observado com a mesma droga, quando microinjetada em outras
estruturas encefálicas relacionadas à defesa. A administração de 8-OH-DPAT intra-
SCPD, por exemplo, apresentou efeito antiaversivo no modelo da estimulação
elétrica aversiva da estrutura, aumentando o limiar de intensidade de corrente
elétrica necessário para produzir uma resposta de fuga (NOGUEIRA e GRAEFF,
1995). No LTE, a administração intra-SCPD de 8-OH-DPAT prejudicou tanto a
esquiva inibitória, efeito ansiolítico, quanto a fuga dos braços abertos deste modelo,
efeito panicolítico (DE PAULA SOARES e ZANGROSSI, 2004; ZANOVELI et al.,
2003). Juntos, esses resultados demonstraram a participação de receptores 1A da
SCPD em duas respostas comportamentais de defesa: esquiva e fuga. O prejuízo na
resposta de esquiva inibitória do LTE também foi evidenciado após a administração
intra-AM basolateral (ZANGROSSI et al., 2001) e intra-núcleo mediano da rafe da
droga. Quando microinjetado nessas duas estruturas, a droga não alterou
significativamente as respostas de fuga. Portanto, a ativação de receptores 1A da
AM e núcleo mediano da rafe aparentemente alteram seletivamente uma resposta
comportamental de defesa: a esquiva. Finalmente, quando administrado intra-NDR, a
68
droga prejudicou as respostas de esquiva inibitória, um efeito ansiolítico, facilitando
ao mesmo tempo as respostas de fuga, efeito panicogênico (SENA et al., 2003).
Esses resultados levaram os autores a proporem a existência de duas vias
serotonérgicas distintas, oriundas do NDR, que regulariam também de maneiras
distintas, estas duas respostas comportamentais de defesa, esquiva e fuga. É
importante lembrar que esses resultados também trazem importantes contribuições
para a clínica, se levarmos em conta que essas duas respostas comportamentais de
defesa, tem sido relacionadas a subtipos distintos de ansiedade, o TAG e o TP,
respectivamente.
A ausência de efeito da administração intra-dHVM de 8-OH-DPAT nas duas
respostas comportamentais de defesa medidas pelo LTE sugere que, ao contrário
das outras estruturas previamente investigadas, a mediação serotonérgica da defesa
neste núcleo não se dá via receptores 1A. Esses resultados são fortalecidos pela
observação de que a droga também não alterou as medidas avaliadas em um outro
modelo animal de ansiedade, o modelo de transição claro-escuro. É importante
lembrar que tanto o número de transições entre compartimentos quanto o tempo de
permanência no compartimento claro do modelo da transição claro-escuro são
medidas que, em função da validação farmacológica do modelo, têm sido
relacionadas à ansiedade generalizada, à semelhança da esquiva inibitória dos
braços abertos do LTE (GRAEFF e ZANGROSSI, 2002). Por fim, é interessante
lembrar que a não participação de receptores 1A do dHVM em respostas
comportamentais de defesa é corroborada por um estudo prévio realizado com
camundongos nocaute. Neste estudo, Li e colaboradores (2004) demonstraram a
participação de receptores 1A do dHVM na regulação da resposta endócrina ao
69
estresse e na modulação da atividade locomotora, mas não em respostas
comportamentais de defesa.
Contrariamente aos resultados obtidos com o Experimento 1, os resultados
obtidos com o agonista 5-HT2A/2C DOI (Exp. 2) demonstraram um prejuízo
significativo nas latências de esquiva inibitória dos braços abertos do modelo do LTE,
efeito ansiolítico, e uma facilitação significativa das latências de fuga de um dos
braços abertos do modelo, efeito panicolítico. Esses resultados não são dose-
dependentes e aparentemente não foram decorrentes de nenhuma alteração
significativa na atividade locomotora dos animais avaliada na arena. Ainda no
Experimento 2, as três doses administradas intra-dHVM de DOI apresentaram efeito
ansiolítico nas medidas obtidas no modelo de transição claro-escuro.
Na clinica, agonistas 5-HT2A não são utilizados para o tratamento de
transtornos de ansiedade, sendo que o perfil ansiolítico de antagonistas 2A/2C, como
a ritanserina, já foi demonstrado (NUTT, 1991). Entretanto, com base em
observações oriundas de estudos comportamentais, alguns autores sugerem que a
ativação de receptores 5-HT2 pode ou aumentar, ou diminuir a ansiedade,
dependendo da estrutura neuroanatômica envolvida (DEAKIN; GRAEFF e
GUIMARÃES, 1993; NOGUEIRA E GRAEFF, 1995; POBBE E ZANGROSSI, 2005;
MCNAUGHTON E CORR, 2004). Isto vai de encontro à observação de que o efeito
de agonistas 5-HT2A em modelos animais de ansiedade é bastante controverso.
Assim, no modelo da transição claro-escuro, a administração intraperitoneal de DOI
apresentou ausência de efeito (ONAIVI E MARTIN, 1989), e efeito ansiogênico
(YOUNG E JOHNSON, 1991 a, b; NIC DHONNCHADHA et al, 2003). No LTE, a
administração de aleph-2, um agonista 5-HT2A/2C (ACUNÃ-CASTILLO et al, 2000),
não alterou a esquiva inibitória, alterando, entretanto, a fuga e as medidas de
70
número de entradas e tempo gasto nos braços abertos do labirinto em cruz elevado
(SCORZA et al, 1996). Ademais, Nic Dhonnchadha e colaboradores (2003)
demonstraram efeito ansiolítico da administração periférica de DOI no labirinto em
cruz elevado e no teste das quatro placas. Este efeito, entretanto, foi completamente
abolido com a administração de agonistas alfa2-adrenérgicos, como a clonidina.
Assim, os autores concluem que o efeito ansiolítico do DOI é regulado por receptores
alfa2-adrenérgicos. Em um estudo realizado recentemente com o teste das quatro
placas, a administração intraperitoneal de DOI também apresentou efeito ansiolítico
(MASSE et al, 2005). Neste mesmo estudo, os autores demonstraram também que a
administração de agonistas BZD e GABAA potencializou o efeito do DOI. Já a
administração de antagonistas gabaérgicos, como a bicuculina e a pricrotoxina, e do
agonista GABAB baclofen inibiu o efeito ansiolítico da droga. Desta forma, os autores
concluem que o sistema GABAérgico parece estar envolvido com a atividade
antiaversiva do DOI. Tendo em vista estes resultados, é possível levantar a hipótese
de que, também no presente estudo, a atividade ansiolítica do DOI intra-dHVM,
observada a partir da diminuição da latência de esquiva inibitória no LTE e no
número de transições e tempo gasto no compartimento claro no modelo de transição
claro/escuro, seja devido à interferência de outros sistemas de neurotransmissão.
Assim, por exemplo, a ativação de receptores 5-HT2A no dHVM poderia ativar
interneurônios gabaérgicos, o que por sua vez suprimiria os disparos de outros
grupos neuronais envolvidos com a modulação da ansiedade. De fato, um estudo
eletrofisiológico realizado por Sokal e colaboradores (2005) demonstrou que a
ativação da amígdala lateral, evocada pela estimulação elétrica do núcleo geniculado
medial do tálamo, é inibida tanto pela administração do agonista GABAB baclofen
quanto do agonista 5-HT2A DOI, administrados por via endovenosa. Os autores
71
explicam estes resultados sugerindo que a ativação de receptores 5-HT2A ativa
interneurônios inibitórios que por sua vez suprimem a atividade de neurônios
piramidais que interligam o núcleo geniculado lateral à amígdala lateral.
O efeito antipânico do DOI corrobora evidências prévias obtidas com outros
agonistas 5-HT2 no modelo do LTE. A administração intraperitoneal de mCPP e
TFMPP, agonistas 5-HT1B/2C, por exemplo, apresentaram efeito antipânico no
modelo, aumentando significativamente as latências de fuga de um dos braços
abertos do labirinto (GRAEFF et al., 1998). As mesmas drogas apresentaram efeito
ansiogênico no labirinto em cruz elevado (GRIEBEL et al.,1994; SETEM et al.,1999).
Esta discrepância pode estar relacionada ao fato do labirinto em cruz elevado ser um
modelo misto de ansiedade, não permitindo a separação entre respostas
relacionadas a diferentes subtipos de ansiedade encontrados na clínica (HANDLEY
E MCBLANE, 1993). De fato, em um outro modelo animal de pânico, o modelo da
estimulação elétrica aversiva da SCPD, a administração de intra-SCPD de DOI, e
também de 8-OH-DPAT, aumentou o limiar aversivo necessário para produzir uma
resposta de fuga (NOGUEIRA E GRAEFF, 1995). Estes resultados levaram os
autores a concluírem que tanto a ativação de receptores 1A quanto a ativação de
receptores 2A da SCPD inibe a resposta de fuga, ou seja, possuem efeito
panicolítico. De maneira semelhante, a administração do agonista preferencial 5-
HT2A DOI intra-SCPD apresentou efeito panicolítico no modelo do LTE, aumentando
as latências de fuga (ZANOVELI et al., 2003).
Também de forma semelhante aos resultados obtidos no Experimento 2, o
antagonista preferencial 2A/2C quetanserina (Exp. 3), foi capaz de aumentar
significativamente as latências de esquiva inibitória 2, nas três doses utilizadas
(efeito ansiolítico), assim como diminuiu a latência da tarefa de fuga 3 de um dos
72
braços abertos do modelo do LTE, na dose de 5 nmoles (efeito panicolítico).
Novamente, esses achados não foram devidos a alteração significativa da atividade
locomotora dos animais avaliada na arena. No outro modelo utilizado no presente
estudo, o modelo da transição claro-escuro, a quetanserina não alterou as medidas
de ansiedade avaliadas, o que se contrapõe, portanto, ao observado com o modelo
do LTE.
À semelhança do observado com o DOI, estudos com a quetanserina em
modelos animais de ansiedade apresentam-se controversos. Deste modo, a
administração sistêmica de quetanserina em camundongos demonstrou ausência de
efeito no teste de Geller-Seifter (KENNETT et al., 1994), efeito ansiolítico nas
medidas avaliadas no modelo do labirinto em cruz elevado e efeito ansiogênico no
modelo de transição claro-escuro (NIC DHONNCHADHA, 2003). No labirinto em
cruz, outros autores também têm relatado resultados controversos para a mesma
droga. Assim, Critchley e Handley (1987) demonstraram efeito ansiolítico da
administração periférica da droga (doses de 0,1-1,0 mg/kg), à semelhança de Bourin
e Hascoet (2003). Motta e colaboradores (1992) também descreveram efeito
semelhante para a dose de 0,5 mg/kg da droga, porém efeito ansiogênico para a
dose de 1,0 mg/kg. Finalmente, Griebel e colaboradores (1997) demonstraram
ausência de efeito na mesma faixa de doses utilizada por Critchley e Handley (1987).
Embora não existam estudos prévios com a administração periférica de quetanserina
no LTE, quando microinjetada intra-SCPD, a droga não apresentou nenhum efeito
sobre as medidas avaliadas no modelo (DE PAULA SOARES e ZANGROSSI, 2004),
apesar de ter sido capaz de antagonizar os efeitos ansiogênico e panicolítico
induzidos pela administração intra-SCPD de 5-HT.
73
O porquê dos resultados obtidos no presente estudo com a esquiva inibitória e
com o modelo da transição claro-escuro não apresentarem correspondência é
estranho e merece ser melhor investigado. Conforme mencionado previamente,
ambos os modelos têm sido relacionados, em função de sua validação farmacológica
e comportamental, ao TAG (GRAEFF E ZANGROSSI, 2002). Assim, era de se
esperar que à semelhança do obtido com o DOI, a quetanserina também alterasse
as medidas obtidas no claro-escuro. Uma possibilidade é que mecanismos
farmacocinéticos estejam envolvidos com a ausência de efeito da quetanserina no
claro-escuro. Isto é, como as medidas com o claro-escuro só são tomadas após o
LTE e a verificação da atividade locomotora na arena, o pico de ação da droga já
tenha passado quando os animais são submetidos ao modelo. Entretanto, tendo em
vista a grande variabilidade de resultados obtidos com a droga, pode-se pensar
também que o próprio mecanismo de ação da quetanserina seja responsável pela
não-concordância observada entre os resultados da esquiva inibitória e claro-escuro.
A quetanserina é um antagonista 5-HT2A/2C, com afinidade por receptores
alfa1-adrenérgicos e histaminérgicos do tipo 1. O envolvimento dos sistemas
histaminérgico e noradrenérgico na modulação da ansiedade tem sido fundamentado
com base em estudos clínicos e com modelos animais de ansiedade.
No início dos anos 80, foi demonstrado por dois laboratórios, trabalhando
independentemente, que grupos neuronais histaminérgicos estavam localizados no
hipotálamo posterior e se projetavam para todo o sistema nervoso central
(WATANABE et al., 1983; PANULA et al., 1984). Mais recentemente, foi
demonstrado que a ativação do sistema histaminérgico altera uma série de
processos fisiológicos e comportamentais, que incluem consciência e sono,
aprendizado e memória, locomoção, modulação da ansiedade, ingestão de água e
74
alimentos, e regulação neuroendócrina (para uma revisão ver PASSANI et al.,2007).
Com relação à ansiedade propriamente dita, tem sido demonstrado, por exemplo,
que várias situações estressantes, como contenção, frio e choque elétrico,
aumentam a taxa de renovação da histamina no encéfalo de roedores (TAYLOR e
SNYDER, 1971; YOSHITOMI, OISHI e SAEKI, 1986). Além disso, em uma situação
de estresse agudo, um aumento nos níveis de histamina no hipotálamo de ratos
também tem sido reportado (MAZURKIEWICZ-KWILECKI e TAUB, 1978). A
destruição da região tuberomamilar rostroventral do hipotálamo de ratos, de onde
partem axônios de neurônios histaminérgicos, induz efeitos ansiolíticos no labirinto
em cruz elevado (FRISCH et al., 1998). Além disso, camundongos nocaute para
receptores histaminérgicos do tipo 1 demoram mais para sair do compartimento claro
no modelo da transição claro-escuro, o que sugere que estes animais são menos
ansiosos que os controle. A relação da histamina e de agentes histaminérgicos com
a ansiedade também tem sido evidenciada em diferentes estruturas encefálicas
como o núcleo accumbens, o colículo inferior, a SCPD e o núcleo basal
magnocelular (PRIVOU et al., 1998; OROFINO et al., 1999). Além disso, drogas
ansiolíticas como o BZD diazepam e o agonista 5-HT1A serotonina também
diminuem a taxa de renovação da histamina em camundongos e ratos (YOSHITOMI,
OISHI e SAEKI, 1986). De fato, parece haver uma interação entre a atividade do
sistema histaminérgico e outros sistemas de neurotransmissão. Assim, tem sido
demonstrado que a administração periférica do agonista H1 2-metilhistamina
aumentou a liberação de catecolaminas no hipotálamo posterior de gatos (PHILIPPU
et al., 1984). A administração periférica de compostos histaminérgicos também
corrobora a relação deste sistema com a modulação da ansiedade. Desta maneira, a
ativação de receptores H1 apresentou efeito ansiogênico no modelo de transição
75
claro-escuro (MALMBERG et al., 2002). De maneira semelhante, a administração
periférica do agonista H1 L-histadina em ratos demonstrou efeito ansiogênico no
modelo do labirinto em cruz elevado (VIJAYA; KRISHNA e PALIT, 2007). Ainda
reforçando a implicação de agentes histaminérgicos na modulação da ansiedade, foi
demonstrado que agonistas histaminérgicos administrados intra-AM em ratos
apresentam um perfil ansiogênico no modelo do labirinto em cruz elevado, sugerindo
que a histamina modula a ansiedade via ativação de receptores H1 na AM
(ZARRINDAST et al., 2005).
Como o sistema histaminérgico, o sistema noradrenérgico também tem sido
implicado na modulação de respostas comportamentais e fisiológicas ao estresse
(para revisão ver MORILAK et al., 2005). Segundo Graeff (2007), o conceito de
estresse é baseado na observação de que tipos distintos de condições físicas ou
psicológicas, ameaçadoras à homeostase do organismo, eliciam o mesmo conjunto
de alterações corporais (a chamada "síndrome de adaptação geral"). Frente a um
estímulo estressor, ocorre a liberação do hormônio adrenocorticotrópico (ACTH) e
corticóides (cortisol em humanos e cortisona em ratos) na corrente sangüínea,
resultado da ativação do eixo hipotálamo-hipófise-adrenal (HPA). Os estressores
podem ser físicos (como danos ao tecido ou mudanças drásticas na temperatura),
mas podem ser também psicológicos. No que diz respeito aos estressores
psicológicos, resultados demonstram consistentemente que o eixo HPA e o sistema
nervoso simpático são ativados pela novidade ou indícios que sinalizem que ocorrerá
punição ou ausência de uma recompensa esperada (frustração), gerando, dessa
forma, ansiedade antecipatória (GRAEFF, 2007). Além da ativação do eixo HPA,
estímulos estressores agudos também ativam a divisão simpática do sistema
neurovegetativo como parte da reação de luta ou fuga. Como resultado, a
76
noradrenalina é liberada de fibras nervosas simpáticas em diferentes células-alvo,
bem como a adrenalina da medula adrenal na corrente sanguínea (GRAEFF, 2007).
Além de alterações fisiológicas e comportamentais, a resposta ao estresse vem
acompanhada de um componente afetivo, que pode ser descrito como ansiedade
(MORILAK et al., 2005). De fato, a relação entre noradrenalina e ansiedade tem sido
evidenciada em diferentes modelos animais de ansiedade, como o modelo da
interação social, o labirinto em cruz elevado e o modelo do ocultamento defensivo
(FILE, 1995; TREIT et al.,1981). Além disso, tem sido demonstrado que um aumento
da neurotransmissão noradrenérgica induzido, por exemplo, pela administração
sistêmica do composto ansiogênico ioimbina, uma antagonista de receptores alfa2-
adrenérgico (CHARNEY et al., 1987), é capaz de promover um aumento da
ansiedade em diferentes modelos animais de ansiedade, à semelhança do efeito de
estressores agudos. Estes resultados sugerem que a ativação do sistema
noradrenérgico em áreas límbicas pode induzir um aumento da ansiedade em
situações estressantes. Por outro lado, os únicos compostos utilizados na clínica dos
transtornos de ansiedade que atuam predominantemente sobre o sistema
noradrenérgico são os beta-bloqueadores (um exemplo é o propanolol). Estas
drogas são utilizadas, sobretudo, para tratamento de uma modalidade de ansiedade
social, a ansiedade de desempenho (GRAEFF e GUIMARÃES, 2000). Este tipo de
ansiedade se caracteriza pela presença de ansiedade exagerada em situações em
que o indivíduo é submetido a testes. Os beta-bloqueadores aliviam as
manifestações fisiológicas do quadro sem produzirem alterações cognitivas. Assim,
ao que tudo indica, os benefícios da terapia com estas drogas devem-se aos seus
efeitos periféricos, ou seja, da atenuação das manifestações simpáticas, decorrente
do bloqueio de beta-adrenoceptores periféricos.
77
Portanto, é importante ressaltar que tendo em vista que as drogas utilizadas
no presente trabalho atuam sobre diferentes sistemas de neurotransmissão, a
interpretação dos resultados obtidos não pode deixar de mencionar a possibilidade
de que ao menos parte dos resultados observados deva-se à interferência destas
drogas com outros sistemas que não o serotonérgico. Isto explicaria também o
porquê do mesmo efeito (ansiolítico e panicolítico) ser observado com duas drogas
que, pelo menos em se tratando do sistema serotonérgico, atuam de maneira
antagônica, o agonista 2A/2C DOI e o antagonista 2A/2C quetanserina. Também
com relação a esta última observação, não podemos descartar outras prováveis
explicações, como por exemplo, um possível efeito de difusão das drogas para
regiões situadas nas proximidades do dHVM, no momento da microinjeção local.
Com isto, teríamos regiões distintas, que exercem funções diferentes na modulação
da ansiedade, sendo ativadas. Esta possibilidade só pode ser descartada com a
inserção de um controle microinjetado com as drogas em regiões próximas ao núcleo
estudado.
Por fim, os resultados obtidos no presente estudo sugerem a participação do
dHVM na modulação da ansiedade e do pânico, por mecanismos serotonérgicos,
principalmente via ativação/bloqueio de receptores 2A. Entretanto, outros estudos
são necessários para a verificação do papel exercido principalmente por
mecanismos histaminérgicos e noradrenérgicos no núcleo em questão.
78
CONCLUSÕES
Os resultados obtidos no presente estudo demonstraram que:
• O agonista 5-HT1A| 8-OH-DPAT não apresentou nenhum efeito, nem na
tarefa de esquiva inibitória e nem na tarefa de fuga dos braços abertos do LTE.
• O agonista preferencial 5-HT2A DOI, bem como o antagonista 5-HT2A/2C
quetanserina, apresentaram efeito ansiolítico nas duas tarefas medidas no LTE.
Esses resultados não foram devidos a alterações na atividade locomotora.
• O DOI apresentou efeito ansiolítico em um outro modelo animal de ansiedade,
o modelo de transição claro-escuro.
• Nenhuma das demais drogas utilizadas alteraram as medidas avaliadas no
modelo de transição claro-escuro.
• Os efeitos ansiolítico/panicolítico obtidos tanto com o agonista preferencial 5-
HT2A, DOI, como o antagonista preferencial 2A quetanserina no modelo do LTE
sugerem também o envolvimento de outros sistemas de neurotransmissão, e abrem
caminho para futuras investigações destes sistemas do dHVM na modulação da
ansiedade.
79
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9, 2005.
92
ANEXO 1
Bregma -2,30 Bregma -2,56
Bregma -2,80 Bregma -3,14
Figura 17: Localização histológica representativa dos sites de microinjeção intra-
hipotálamo-ventromedial (porção dorsomedial: dHVM) em diagramas baseado no
Atlas de Paxinos e Watson (1997). Números indicam coordenadas ântero-posterior a
partir do bregma.
93
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