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Universidade de Brasília
Pós-Graduação em Biologia Animal
Caracterização química e biológica da secreção
cutânea do anuro Leptodactylus labyrinthicus:
peptídeos antimicrobianos e anticarcinogênicos,
fosfolipases e peptidases
Michelle da Silva Libério
Orientadora: Profa. Dra. Mariana S. Castro
Co-orientador: Prof. Dr. Osmindo Rodrigues Pires Júnior
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Biologia Animal da
Universidade de Brasília como parte dos
requisitos para obtenção do título de
Mestre.
Brasília
2008
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i
“Dois importantes fatos, nesta vida, saltam aos olhos;
primeiro, que cada um de nós sofre inevitavelmente
derrotas temporárias, de formas diferentes, nas ocasiões
mais diversas. Segundo, que cada adversidade traz
consigo a semente de um benefício equivalente. Ainda
não encontrei homem algum bem-sucedido na vida que
não houvesse antes sofrido derrotas temporárias. Toda
vez que um homem supera os reveses, torna-se mental e
espiritualmente mais forte... É assim que aprendemos o
que devemos à grande lição da adversidade.” (Andrew
Carnegie a Napoleon Hill).
“Comece fazendo o que é necessário, depois o que é
possível, e de repente você estará fazendo o impossível.”
(São Francisco de Assis)
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ii
DEDICATÓRIA:
A Deus por toda misericódia e socorro,
principalmente nos momento mais difíceis,
me dando força para suportá-los e fé para
acreditar que eles seriam temporários.
Aos meus pais por todo o incentivo, amor,
compreensão e por acreditarem no meu
potencial.
Por me apoiarem nos momentos mais difíceis,
sendo exemplos de força, coragem, fé e
dedicação, por muitas vezes abdicando de
suas próprias vidas em prol da minha.
Por todo suporte e por terem sempre estendido
a mão para me ajudar a levantar sempre que
caí.
iii
AGRADECIMENTOS
À Profa. Dra. Mariana de Souza Castro pela orientação, amizade e compreensão dos
momentos nos quais tive que me afastar do laboratório, além de ter acreditado no meu
trabalho me dando toda a liberdade necessária.
Ao Prof. Dr. Osmindo Rodrigues Pires Jr. pela co-orientação, amizade, paciência e pelas
sugestões sempre úteis para o desenvolvimento dessa dissertação.
Aos professores do Laboratório de Bioquímica e Química de Proteínas, Dr. Wagner
Fontes, Dr. Carlos André O. Ricart, MSc. Pedro José P. Zanotta, Dr. Marcelo Valle de Sousa
Dra. Consuelo Medeiros Rodrigues de Lima e Dr. Ricardo Bastos Cunha, pela constante
disposição em colaborar.
À Dra. Izabela Dourado, ao Prof. Dr. Jaime Santana, ao Dr. Sebastién Charneau, ao
Tiago Sangas e a todos as pessoas que me acolheram no laboratório de Patologia Molecular e
que me ajudaram a caracterizar a atividade proteolítica da secreção estudada.
Ao Prof. Dr. Carlos Roberto Félix por estar sempre solícito para emprestar reagentes.
À Profa. Dra. Cynthia Kyaw por ceder a infra-estrutura para a realização dos ensaios
antimicrobianos e à MSc. Elaine Aquino pelo auxílio nos ensaios antibacterianos.
Ao Prof. Dr. Eduardo Cilli, pela síntese de peptídeos.
Ao Dr. Natan Maciel pela ajuda nas análises filogenéticas.
À FUB/UnB (Fundação Universidade de Brasília) e à CAPES (Coordenação de
Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior) que possibilitaram a realização do presente
trabalho.
Aos amigos Jimmy, Diana, Liudy, Gabriel, Fábio, Jayner, Camila, Elaine, Karine,
Anne, Adriana, Carla, Rafael, Anna, Liz, “meninos do milho” Gabriel, Luciana e Tatiana, e
outros não citados, mas igualmente importantes, do laboratório de Bioquímica e Química de
Proteínas por estarem sempre disponíveis pra auxiliarem no desenvolvimento desse trabalho,
pelo companheirismo, pelos momentos de descontração e por alegrar os dias mais tristes.
Ao Prof. Dr. Ricardo Bentes Azevedo pela colaboração na realização dos ensaios
antitumorais.
À minha amiga MSc. Graziella Joanitte por todo o auxílio nos ensaios de atividade
anticarcinogênica, mas principalmente pela paciência para ouvir meus desabafos e por me
aconselhar nos momentos mais difíceis.
Ao amigo MSc. Carlos Enrique Uribes pela ajuda nas análises estatísticas.
Ao amigo MSc. Sócrates Sornelas por ajudar a documentar os ensaios fluorogênicos em
gel.
iv
Ao amigo Félix por ajudar na leitura dos ensaios fluorogênicos.
Ao Nuno Domingues e Antônio Rufino pelo apoio operacional e a constante disposição
em ajudar.
Aos colegas do laboratório de Toxinologia, mas principalmente ao Thompson por
sempre me ajudar na extração do veneno dos animais estudados, mesmo quando estava
ocupado.
Aos meus amigos que carrego para vida toda Yuri, Laura, Eri, Cantilis, Muri, Rafael,
Lilze, Veronica, Jesine, Glaucia, Vanessa, Monaliza, Breno, Fernanda, Mafê e muitos outros
por todos os momentos alegres, por terem dado apoio nos momentos em que mais precisei e
por compreenderem o meu afastamento.
Aos meus amigos da dança por terem me ajudado a manter a sanidade mental.
Ao meu irmão pelo apoio e pelas conversas de madrugada.
Aos meus familiares por todo apoio e por confiarem no meu potencial.
À Nara e à Thais pelo carinho e atenção na resolução de todos os problemas na
Secretaria da Pós-graduação em Biologia Animal
v
SUMÁRIO
Página
Dedicatória ________________________________________________________________ ii
Agradecimentos ____________________________________________________________ iii
Lista de abreviaturas ________________________________________________________ viii
Lista de figuras _____________________________________________________________ xi
Lista de tabelas ____________________________________________________________ xiv
Resumo __________________________________________________________________ xv
Abstract __________________________________________________________________ xvi
1. Introdução ______________________________________________________________ 1
1.1. Peptídeos antimicrobianos (PAMs) ________________________________________ 2
1.1.1. Aspectos Gerais _________________________________________________ 2
1.1.2. Mecanismos de seletividade e toxicidade específica _____________________ 5
1.1.3. Mecanismos de ação ______________________________________________ 5
1.1.4. Aplicações ____________________________________________________ 12
1.1.5. Mecanismos de resistência bacteriana aos PAMs ______________________ 15
1.2. Peptídeos com atividade anticarcinogênica (PACs) __________________________ 16
1.2.1. Mecanismos de ação dos PACs ____________________________________ 19
1.2.2. A seletividade dos PACs pelas células tumorais _______________________ 23
1.2.3. Estratégias para aumentar a eficiência dos PACs _______________________ 24
1.3. Enzimas proteolíticas __________________________________________________ 26
1.3.1. Aspártico-peptidases _____________________________________________ 27
1.3.2. Metalo-peptidases _______________________________________________ 28
1.3.3. Glutâmico-peptidases ____________________________________________ 28
1.3.4. Serino-peptidases _______________________________________________ 29
1.3.5. Cisteíno-peptidases ______________________________________________ 29
1.3.6. Treonino-peptidases _____________________________________________ 29
1.4. Fosfolipases _________________________________________________________ 30
1.4.1. Fosfolipases A
2
_________________________________________________ 31
1.5. Leptodactylus labyrinthicus (Spix, 1824) __________________________________ 33
2. Justificativa ____________________________________________________________ 35
3. Objetivos ______________________________________________________________ 38
3.1. Objetivos Gerais _____________________________________________________ 38
3.2. Objetivos específicos __________________________________________________ 38
4. Materiais e Métodos _____________________________________________________ 39
4.1. Reagentes químicos ___________________________________________________ 39
4.2. Obtenção da secreção cutânea ___________________________________________ 39
vi
4.3. Cromatografia líquida de alta eficiência - fase reversa (RP-HPLC) ______________ 39
4.3.1. Fracionamento da secreção bruta ___________________________________ 39
4.3.2. Purificação dos peptídeos _________________________________________ 39
4.4. Espectrometria de massa _______________________________________________ 40
4.5. Determinação da presença de amidação C-terminal __________________________ 40
4.6. Bioinformática _______________________________________________________ 41
4.7. Ensaio hemolítico ____________________________________________________ 41
4.7.1. Ensaio preliminar _______________________________________________ 42
4.7.2. Determinação da HC
50
___________________________________________ 42
4.8. Ensaio antimicrobiano _________________________________________________ 42
4.8.1. Ensaio preliminar _______________________________________________ 42
4.8.2 Determinação de MIC ____________________________________________ 43
4.9. Síntese Química ______________________________________________________ 43
4.10. Linhagens Celulares _________________________________________________ 44
4.11. Manutenção da cultura de células _______________________________________ 44
4.12. Tratamento das células com os peptídeos de Leptodactylus labytinthicus ________ 45
4.13. Análise de efeitos citostáticos __________________________________________ 47
4.13.1. Ciclo Celular __________________________________________________ 47
4.14. Análise de efeitos citotóxicos __________________________________________ 47
4.14.1. Viabilidade Celular (MTT) _______________________________________ 47
4.14.2. Fragmentação de DNA __________________________________________ 48
4.14.3. Potencial de Membrana Mitocondrial ______________________________ 49
4.14.4. Integridade da Membrana Plasmática_______________________________ 49
4.14.5. Morfologia Celular _____________________________________________ 50
4.15. Quantificação protéica ________________________________________________ 50
4.16. Eletroforese em Gel Desnaturante de Poliacrilamida 12% (SDS-PAGE) ________ 50
4.17. Coloração com nitrato de prata _________________________________________ 51
4.18. Atividade caseinolítica _______________________________________________ 51
4.19. Atividade gelatinolítica _______________________________________________ 52
4.20. Ensaio fluorogênico __________________________________________________ 53
4.20.1. Em placa _____________________________________________________ 53
4.20.2. Influência da concentração protéica na atividade ______________________ 55
4.20.3. Determinação do pH ótimo ______________________________________ 55
4.20.4. Em gel SDS-PAGE 10% ________________________________________ 55
4.20.5. Ensaio de inibição ______________________________________________ 56
4.21. Ensaio de atividade fosfolipásica _______________________________________ 57
5. Resultados _____________________________________________________________ 59
5.1. Fracionamento da secreção cutânea e análise por espectrometria de massa ________ 59
5.2. Ensaios preliminares hemolítico, antimicrobiano e análise por espectrometria de massa
______________________________________________________________________ 61
vii
5.3. Purificação dos peptídeos de interesse ____________________________________ 61
5.4. Caracterização química dos peptídeos _____________________________________ 64
5.5. Determinação de HC
50
, MIC e IC
50
_______________________________________ 69
5.6. Efeitos citostáticos e citotóxicos _________________________________________ 74
5.7. Perfil protéico em SDS-PAGE __________________________________________ 79
5.8. Atividade proteolítica _________________________________________________ 79
5.9. Atividade de PLA
2
____________________________________________________ 88
6. Discussão ______________________________________________________________ 89
6.1. Atividade antimicrobiana e hemolítica ____________________________________ 89
6.2. Atividade anticarcinogênica ____________________________________________ 95
6.3. Atividade enzimática _________________________________________________ 102
7. Considerações finais ____________________________________________________ 108
8. Perspectivas ___________________________________________________________ 110
9. Referências Bibliográficas _______________________________________________ 112
Anexos_______________________________________________________________________________125
viii
LISTA DE ABREVIATURAS
[M+H]
+
. Massa molecular monoisotópica.
<µH>. Anfipaticidade.
<H>. Hidrofobicidade média.
AA. Ácido araquidônico.
AMC. 7-amino-4-metilcumarina.
AS. Ácido 3,5-dimetoxi-4-hidroxicinámico.
ATP. Adenosina trifosfato.
ATTC. American Type Culture Collection.
CE. Célula endotelial.
CFU. Unidade formadora de colônia.
CHAPS. 3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate.
CL. Cardiolipina.
COX. Ciclo-oxigenase.
CTL. Linfócito T citotóxico.
DMEM. Dulbecco/Vogt modified Eagle's minimal essential medium.
DMSO. Dimetilsulfóxido.
DNA. Ácido desoxoribonucléico.
DST. Doença sexualmente transmissível.
DTT. Ditiotreitol.
EDTA. Ácido etilenodiaminotetraacético.
EM. Esfingomielina.
FC. Fosfatidilcolina.
FE. Fosfatidiletanolamina.
FG. Fosfatidilglicerol.
FGF. Fator de crescimento de fibroblasto.
FS. Fosfatidilserina.
G-P-AMC. Gly-Pro-7-amide-4-methylcoumarin.
HC
50
. Concentração capaz de promover 50% de hemólise.
HCCA. Ácido α-ciano-4-hidroxicinâmico.
HEPES. Ácido 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic.
HETE. Ácidos hidroxieicosatetraenóicos.
ix
HIF-1α. Fator iduzido por hipóxica.
HIV. Vírus da imunodeficiência humana.
IAP. Proteínas inibidoras de apoptose.
IC
50.
Concentração que inviabiliza 50% das células.
IDO. Idolamina 2,3 dioxigenase.
IL-10. Interleucina-10.
IUCN. International Union for Conservation of Nature.
L
-Alanyl-
L
-Alanyl-
L
-F-A-AMC. L-Alanyl-L-Alanyl-L-Phe-Ala-AMC.
L
-L-AMC.
L
-Leu-7-amide-4-methylcoumarin hydrochloride.
LOX. Lipo-oxigenase.
LPS. Lipopolisacarídeos.
LT. Leucotrieno.
MALDI-TOF. Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight.
MDP. Dipeptídeo de origem microbiana muramil.
MIC. Concentração inibitória mínima.
MES. 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid.
Mm. Marcador molecular.
MMP. Metalo-peptidase de matriz.
MS. Mass spectrometry.
MTT. 3(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide.
NK. Células natural killers.
nNOS. Isoforma neuronal da óxido nítrico sintase.
N-Suc-G-P-L-G-P-AMC. N-Succynil-Gly-Pro-Leu-Gly-Pro-AMC.
N-Suc-I-A-AMC. N-Succynil-Ile-Ala-AMC.
PAC. Peptídeo anticarcinogênico.
PAGE. Eletroforese em gel de poliacrilamida.
PAM. Peptídeo antimicrobiano
PBS. Phosphate buffered saline.
PG. Prostaglandina.
pI. Potencial isoelétrico.
PLA
2
. Fosfolipase tipo 2.
PMSF. Phenylmethanesulphonylfluoride.
pRb. Proteína retinoblastoma.
x
PSA. Persulfato de Amônio.
PTH. Feniltioidantoína.
RMD. Resistência multi-drogas.
RP-HPLC. Reversed-phase high performance liquid chromatography.
SD. Desvio padrão.
SDS. Dodecil sulfato de sódio.
Tampão AMT. Ácido acético, MES e Tris.
TCA. Ácido tricloroacético.
TEMED. N,N,N,N tetrametil enediamina.
TFA. Ácido trifluoroacético.
TFE. Trifluoroetanol.
TGF-β. Fator transformador do crescimento-β.
TLCK. Tosyl lysyl chloromethyl ketone.
TNF. Fator de necrose tumoral.
TPCK. Tosyl phenylalanyl chloromethyl ketone.
UF. Unidade de fluorescência.
u-PA. Ativador plasminogênico do tipo uroquinase.
UV. Ultravioleta.
VEGF. Fator de crescimento endotelial vascular.
VEGF. Fator de crescimento endotelial.
xi
LISTA DE FIGURAS
Página
Figura 1. Mecanismo da especificidade de peptídeos antimicrobianos
pela membrana citoplasmática das bactérias. __________________________________ 7
Figura 2. Representação esquemática do modelo barrel-stave e do
modelo poro toroidal. ____________________________________________________ 9
Figura 3. Ilustração do modelo carpet-like.______________________________________ 10
Figura 4. Esquema do modelo Shai-Matsuzaki-Huang. ____________________________ 11
Figura 5. Esquema simplificativo do modo de ação intracelular de
peptídeos antimicrobianos. _______________________________________________ 12
Figura 6. Alvos terapêuticos para regressão tumoral. ______________________________ 17
Figura 7. Representação simplificada das duas principais vias de
sinalização para a morte celular programada. _________________________________ 20
Figura 8. Estágios do desenvolvimento do câncer que podem ser alvos
de inibidores de proteases. ________________________________________________ 22
Figura 9. Etapas da angiogênese e metástase tumoral susceptíveis à
inibição por peptídeos antiangiogênicos. ____________________________________ 23
Figura 10. Sítios de clivagem das fosfolipases. ___________________________________ 30
Figura 11. Efeitos farmacológicos das enzimas PLA
2
isoladas da
peçonha de serpentes. ___________________________________________________ 32
Figura 12. Exemplar de Leptodactylus labyrinthicus. ______________________________ 34
Figura 13. Princípio dos substratos marcados com o fluoróforo 7-amino-
4-metilcumarina (AMC). _________________________________________________ 53
Figura 14. Perfil cromatográfico típico do fracionamento da secreção
cutânea de L. labyrinthicus. _______________________________________________ 59
Figura 15. Composição peptídica/protéica da secreção cutânea de L.
labyrinthicus representada em faixas de massas moleculares
monoisotópicas obtidas pela análise por espectrometria de massa
MALDI-TOF das frações oriundas de uma corrida de RP-HPLC. _________________ 60
Figura 16. Purificação dos peptídeos estudados. __________________________________ 62
xii
Figura 17. Espectro de massa dos peptídeos (A) 1563 Da, (B) 2193 Da,
(C) 2547 Da, (D) 2541 Da e (E) 1761 Da purificados por RP-HPLC
em coluna analítica C
18
. __________________________________________________ 63
Figura 18. Espectros de massa obtidos após a incubação dos peptídeos
(A) fallaxin (2.547 Da) e (B) pentadactylin (2.541 Da) com o
reagente HCl metanólico no experimento de Esterificação de Fisher. ______________ 65
Figura 19. Multi-alinhamento das seqüências de peptídeos isolados de
leptodactilídeos. ________________________________________________________ 66
Figura 20. Árvore neighbor-joining baseada no alinhamento entre os
peptídeos de leptodactilídeos. _____________________________________________ 67
Figura 21. Comparação entre as projeções em hélice dos peptídeos
antimicrobianos fallaxin, pentadactylin, syphaxin e laticeptin. ___________________ 68
Figura 22. Porcentagem de células viáveis das linhagens celulares de
câncer de colo uterino (HeLa), de mama (MCF-7), de pele (B16F10)
e de fibroblasto normal (FHN) após a incubação por 24 h com
diferentes concentrações de fallaxin. ________________________________________ 73
Figura 23. Porcentagem de células viáveis das linhagens celulares de
câncer de colo uterino (HeLa), de mama (MCF-7) e de fibroblasto
normal (FHN) após a incubação por 24 h com diferentes
concentrações de pentadactylin nativo ou sintético. ____________________________ 73
Figura 24. Concentração de fallaxin e pentadactylin que reduz em 50% a
viabilidade celular das linhagens celulares de câncer de mama
(MCF-7), de pele (B16F10), de colo uterino (HeLa) e de fibroblastos
normais (FHN) após 24 h de incubação a 37°C. _______________________________ 74
Figura 25. Microscopia de contraste de fase de células de câncer de colo
do útero (HeLa) após 24 horas de incubação na ausência de peptídeo
(A); com 128 µM dos peptídeos pentadactylin (B) e fallaxin (C). _________________ 76
Figura 26. Microscopia de contraste de fase de células de câncer de
mama (MCF-7) após 24 horas de incubação na ausência de peptídeo
(A); com 128 µM dos peptídeos pentadactylin (B) e fallaxin (C). _________________ 76
Figura 27. Microscopia de contraste de fase de células de câncer de pele
murino (B16F10) após 24 horas de incubação na ausência de
peptídeo (A); com 128 µM do peptídeo fallaxin (B). ___________________________ 77
Figura 28. Microscopia de contraste de fase de células de fibroblasto
(FHN) após 24 horas de incubação na ausência de peptídeo (A); com
128 µM dos peptídeos pentadactylin (B) e fallaxin (C). _________________________ 77
Figura 29. Microscopia de contraste de fase de células de câncer de
mama (MCF-7) após 24 horas de tratamento na ausência do peptídeo
xiii
(A) e na presença de pentadactylin sintético na concentração de 49
µM (B). ______________________________________________________________ 78
Figura 30. Análise por citometria de fluxo de células da linhagem de
câncer de mama MCF-7 tratadas por 24 h com 0 µM (A) e 49 µM
(B) de pentadactylin sintético. _____________________________________________ 78
Figura 31. Resultados sobre o mecanismo de ação anticarcinogênico do
peptídeo pentadactylin sobre células da linhagem celular de câncer
de mama MCF-7. _______________________________________________________ 79
Figura 32. Perfil protéico da secreção cutânea de L. labyrinthicus em
SDS-PAGE 12%. _______________________________________________________ 80
Figura 33. Localização dos prováveis pontos de clivagem (barras
vermelhas) observados nos peptídeos fallaxin, pentadactylin,
syphaxin e ocellatins 1 a 5. _______________________________________________ 81
Figura 34. Análise das condições ótimas da atividade caseinolítica
utilizando-se 40 μg de secreção cutânea de L. labyrinthicus. _____________________ 82
Figura 35. Atividade gelatinolítica da secreção de L. labyrinthicus em
SDS-PAGE 9%-gelatina 0,1%. ____________________________________________ 83
Figura 36. Atividade gelatinolítica da secreção de L. labyrinthicus (40
µg) em SDS-PAGE 9%-gelatina 0,1% sob diferentes condições. _________________ 84
Figura 37. Monitoramento da atividade proteolítica da secreção cutânea
de L. labyrinthicus (15,6 µg de proteína) sobre os substratos Gly-
Pro-AMC, L-Leu-AMC e L-Alanyl-L-Alanyl-L-Phe-Ala-AMC ao
longo de 30 min. _______________________________________________________ 85
Figura 38. Influência da concentração protéica da secreção cutânea de L.
labyrinthicus na atividade proteolítica (mUF/min) sobre três
peptídeos fluorogênicos: Gly-Pro-AMC, L-Leu-AMC e L-Alanyl-L-
Alanyl-L-Phe-Ala-AMC. _________________________________________________ 85
Figura 39. Perfil da atividade proteolítica da secreção bruta de L.
labyrinthicus (25,6 µg de proteína) em diferentes pHs. _________________________ 86
Figura 40. Atividade proteolítica de 15.2 µg de secreção cutânea fresca
de L. labyrinthicus em SDS-PAGE 10% incubado com três
substratos fluorogênicos e fotodocumentados sob UV. _________________________ 87
Figura 41. Atividade de PLA
2
da secreção cutânea de L. labyrinthicus
(40 µg). ______________________________________________________________ 89
xiv
LISTA DE TABELAS
Página
Tabela 1. Paralelismo entre os mecanismos de ação dos peptídeos
antimicrobianos e os de resistência apresentados pelos
microorganismos. ______________________________________________________ 15
Tabela 2. Substratos fluorogênicos (Sigma-Aldrich Company) utilizados
no experimento em placa de atividade proteolítica. ____________________________ 54
Tabela 3. Inibidores utilizados no ensaio fluorogênico. ____________________________ 56
Tabela 4. Comparação entre alguns dos peptídeos antimicrobianos e seus
fragmentos de 22 e 16 resíduos de aminoácidos isolados de
leptodactilídeos, incluindo: fallaxin, pentadactylin, laticeptin e
syphaxin. _____________________________________________________________ 69
Tabela 5. Atividade antimicrobiana e hemolítica dos peptídeos
estudados. ____________________________________________________________ 70
Tabela 6. Comparação dos MICs e do HC
50
de PAMS purificados da
secreção cutânea de leptodactilídeos. _______________________________________ 70
Tabela 7. Comparação das características químicas e biológicas de
vários PAMs isolados da secreção cutânea de anfíbios e que também
apresentam atividade antitumoral. __________________________________________ 72
Tabela 8. Possíveis fragmentos dos peptídeos fallaxin e pentadactylin
detectados por MALDI-TOF MS. __________________________________________ 81
Tabela 9. Efeitos de diferentes inibidores sobre a atividade proteolítica
da secreção cutânea de L. labyrinthicus (25,6 µg de proteínas) na
hidrólise dos substratos fluorogênicos Gly-Pro-AMC,
L-Leu-AMC e
L-Alanyl-L-Alanyl-L-Phe-Ala-AMC. _______________________________________ 88
xv
RESUMO
Atualmente, o surgimento de resistência às drogas disponíveis no mercado pelos
microorganismos e pelas células de câncer tornou o desenvolvimento de novas formas
terapêuticas imprescindível. A secreção cutânea dos anfíbios é uma rica fonte natural de
peptídeos com atividades anticarcinogênica (PAC) e antimicrobiana (PAM). Entretanto, o
veneno desses animais também é constituído de outras macromoléculas, por exemplo,
enzimas, as quais têm sido pouco investigadas. O presente estudo teve como objetivo
caracterizar, de forma geral, a secreção glandular da rã-pimenta Leptodactylus labyrinthicus.
Especificamente, buscou-se identificar e caracterizar química e biologicamente alguns dos
peptídeos presentes, além de investigar a presença de atividades enzimáticas. O estudo
revelou a ocorrência de inúmeros peptídeos e proteínas, demonstrando a riqueza e o potencial
biológico desse veneno. Os dois peptídeos antimicrobianos purificados foram fallaxin e
pentadactylin, os quais já haviam sido isolados de outras espécies do gênero Leptodactylus.
Ambos apresentaram atividade contra bactérias Gram-positivas e Gram-negativas; e fallaxin
foi identificado como fracamente hemolítico. Como vários PAMs de amplo espectro de ação
também são citotóxicos para células de câncer, os dois peptídeos isolados foram testados
contra as linhagens celulares de câncer HeLa, MCF-7 e B16F10, demonstrando-se efetivos
contra todas as linhagens. Observou-se também que os dois PACs são pouco seletivos, pois
foram mais tóxicos para células normais de fibroblasto (FHN) do que para as células
tumorais. Portanto, o uso terapêutico desses PACs deverá ser via estratégias que aumentem a
especificidade dos mesmos. Os estudos de mecanismo de ação com pentadactylin não foram
conclusivos, sugerindo a morte de células de MCF-7 via apoptose, podendo ser seguida pelo
processo necrótico. Além desses, o fragmento Flx-16 de fallaxin e o peptídeo PGL-Ll, rico
em glicina e leucina, foram testados, contudo nenhuma atividade biológica foi detectada. A
investigação da atividade enzimática da secreção revelou a presença de enzimas proteolíticas
pertencentes aos clãs das metalo- e serino-peptidases e que atuam de maneira ótima em pH
neutro a ligeiramente básico; e de fosfolipases do tipo A
2
. O estudo e caracterização da
composição da secreção cutânea de anfíbios são de extrema relevância, podendo ajudar a
esclarecer questões taxonômicas, identificar drogas terapêuticas em potencial, além de
auxiliar no entendimento da biologia dos anfíbios.
xvi
ABSTRACT
Nowadays, the emergence of resistance to the current available chemotherapeutic
drugs by microorganisms and cancer cells make the development of new agents imperative.
The skin secretion of amphibians is a natural rich source of antimicrobial (PAM) and
anticancer peptides (PAC). Nevertheless, the venom of these animals is also composed by
other macromolecules, such as enzymes, which have not been studied extensively yet. The
aim of this study was to characterize the glandular secretion of the pepper-frog Leptodactylus
labyrinthicus, targeting to identify and characterize chemically and biologically some of the
peptides present, besides detecting enzymatic activities. The research has found a variety of
peptides and proteins, showing the richness and the biological potential of this venom. Two
PAMs were purified, fallaxin and pentadactylin, which have already been isolated from other
species of the genus Leptodactylus. Both peptides were active against Gram-positive and
Gram-negative bacterias; moreover, fallaxin showed a weak hemolytic activity. As some
PAMs of broad spectrum of action are also toxic to cancer cells, the two peptides isolated
were tested against the cancer cell lines HeLa, MCF-7 and B16F10, being effective against all
of them. We noticed that both PACs aren’t specific, since they have been more toxic to
normal fibroblast cells (FHN) than to tumor cells. Therefore, it is mandatory that the
therapeutic use of these PACs be accompanied by strategies that enhance their selectiveness.
The studies of action mechanism with pentadactylin were not conclusive, suggesting that
MCF-7 cells die by apoptosis; however it may be followed by necrosis. The peptide PGL-Ll,
rich in glycine and leucine, and the fragment Flx-16 from fallaxin were tested, though no
biological activity was found. The research of enzyme activity of the secretion revealed the
presence of proteolytic enzymes of the clans metallo- and serine-peptidases, and that they act
optimally at neutral to slightly basic pH, and of phospholipases A
2
. The study and
characterization of the skin secretion of amphibians is of extreme relevance, helping to
elucidate taxonomic issues, identifying putative therapeutic drugs, besides helping to
understand the biology of amphibians.
1
1. Introdução
A classe Amphibia contém cerca de 4550 espécies vivas descritas divididas entre as
ordens Ápoda (cecílias), Caudata (salamandras) e Anura (sapos e rãs). Devido às adaptações
comportamentais, fisiológicas e morfológicas, esses animais conseguiram habitar, tanto o
ambiente terrestre, como o aquático. A pele, uma de suas maiores adaptações, possui diversas
funções, tais como: proteção contra abrasão, respiração cutânea, osmorregulação,
termorregulação e, finalmente, secreção de substâncias protetoras (Barra & Simmaco, 1995;
Nascimento et al., 2003).
A pele dos anfíbios tem sido fonte de uma grande variedade de substâncias com
atividade biológica, todavia menos de 1/3 dos gêneros conhecidos foram avaliados (Daly et
al., 2004). Dois tipos principais de glândulas são observadas nos anfíbios: as glândulas
mucosas e as granulosas (serosa ou venenosa). A secreção envolvida na proteção contra
predadores e patógenos é produzida pelas glândulas granulosas, localizadas principalmente no
tegumento da região dorsal e tais glândulas são envolvidas por miócitos e inervadas por fibras
simpáticas. A estimulação adrenérgica dos miócitos provoca a contração das células serosas e
a liberação do seu conteúdo (Toledo & Jared, 1995; Conlon et al., 2004). A ocorrência
generalizada de glândulas granulosas nos anuros sugere que elas representam uma
característica primitiva da ordem. É provável que estas glândulas, antes de produzirem
toxinas, estivessem envolvidas com o armazenamento e a condensação de substâncias. A
secreção das glândulas granulosas nos anfíbios geralmente exerce um efeito nocivo ou tóxico
por meio do contato com a mucosa da boca ou com o fluxo sanguíneo de uma grande
variedade de vertebrados (Toledo & Jared, 1995).
A secreção granulosa contém um grande número de compostos biologicamente
ativos como aminas biogênicas, esteróides, alcalóides, bufodienolídeos, peptídeos e proteínas.
Estas substâncias apresentam diversas atividades biológicas como neurotóxica,
vasoconstritora, alucinógena, anestésica, hipotensiva, antimicrobiana, cardiotóxica,
hemotóxica, miotóxica e citotóxica. As glândulas mucosas também participam da proteção
contra predadores com a produção de compostos tóxicos ou escorregadios, além de serem
responsáveis pela manutenção da umidade, lubrificação da pele, interferirem na respiração
cutânea, reprodução, adesão ao substrato e termorregulação pela produção de mucinas
(Toledo & Jared, 1995; Nascimento et al., 2003).
2
A composição da secreção evoluiu independentemente nos diferentes grupos de
anfíbios de acordo com a sua interação com o meio ambiente. Peptídeos com atividade
antimicrobiana apresentam um importante papel na imunidade inata que constitui a primeira
linha de defesa contra patógenos invasores, além de serem importantes para angiogênese,
reparo tecidual, no processo inflamatório e na quimiotaxia (Izadpanah & Gallo, 2005). Muitos
destes peptídeos prestam funções idênticas ou análogas às encontradas em peptídeos de
tecidos extra-cutâneos, incluindo o sistema nervoso central e periférico e o trato
gastrointestinal de todas as classes de vertebrados. Alguns exemplos destes peptídeos são
bradicinins, bombesins, dermofins e angiotensins. Isto ocorre devido à origem embriônica-
ectodermal comum da pele dos vertebrados e do cérebro. Assim, essas substâncias atuam
como neurotransmissores, neuromoduladores, microbicidas ou neurohormônios. Portanto,
estas moléculas possuem uma importância biológica comum, sendo estudadas farmacológica
e clinicamente, podendo ser empregadas com fins terapêuticos (Erspamer, 1994; Barra &
Simmaco, 1995).
As células sinciciais que revestem as glândulas granulosas de alguns anfíbios
co-sintetizam, armazenam e co-secretam diferentes polipeptídeos, aminas e alcalóides com
um amplo espectro de atividade (Erspamer, 1994 & Rollins-Smith et al., 2005). Essas células
funcionam como algumas células endócrinas de mamíferos (ex: células enterocromafins), as
quais são conhecidas por conterem tanto aminas biogênicas quanto hormônios polipeptídicos.
Funcionam como neurônios centrais e periféricos, nos quais mensageiros amínicos e
peptídicos co-existem (Erspamer, 1994).
Até o momento, inúmeros peptídeos já foram isolados da secreção cutânea de
anuros. Estas moléculas são agrupadas em diversas famílias com base na sua estrutura
química, afinidade e espectro de atividade biológica (Erspamer, 1994). Esses polipeptídeos
vêem sendo amplamente estudados devido ao aumento de bactérias resistentes aos
antibióticos disponíveis no mercado.
1.1. Peptídeos antimicrobianos (PAMs)
1.1.1. Aspectos Gerais
Devido à constante presença de microorganismos patogênicos, os organismos
multicelulares apresentam um aparato de resistência denominado imunidade inata (Rinaldi,
2002). Como a resposta imune patógeno-específica ocorre lentamente, a imunidade inata age
3
como uma primeira linha de defesa, na qual há a produção de moléculas antimicrobianas pelas
células epiteliais, atuando rapidamente e controlando o crescimento de um amplo espectro de
microorganismos, além de auxiliarem em processos cicatrizatórios (Barra & Simmaco, 1995;
Schröder, 1999). Esta atividade antimicrobiana ocorre por meio da alteração da membrana
citoplasmática, seja por separação de fase, afinamento da membrana, formação de poros e de
estruturas não-lamelares ou da quebra da camada fosfolipídica, podendo ser estes apenas
passos para a desestabilização da membrana, processo que ocorre muito rapidamente
(Nascimento et al., 2003).
A superfície dos eucariotos superiores como as plantas, os invertebrados e os
vertebrados, incluindo os humanos, é normalmente coberta por microorganismos, mas
geralmente não ocorre infecção por eles. Este fato decorre, além da presença de uma barreira
física, devido à produção de peptídeos antimicrobianos codificados geneticamente,
sintetizados no ribossomo e detentores de 10-60 aminoácidos (Schröder, 1999; Rinaldi, 2002).
Os peptídeos bioativos são liberados por mecanismo holócrino, alguns são
constitutivamente expressos, outros induzidos pela presença do microorganismo ou por
citocinas endógenas pró-inflamatórias em situações de estresse ou injúria (Nicolas & Mor,
1995; Schröder, 1999; Mangoni et al., 2001). Todos os peptídeos antimicrobianos derivam do
processamento de um precursor que contém uma seqüência sinal e uma pró-região acídica
bastante semelhantes, entretanto as suas seqüências são pouco homólogas. Isto sugere a
conservação de um cassete secretor e uma provável convergência para agir de maneira ótima
no ambiente no qual é produzido e contra uma ampla variedade de microorganismos locais a
um reduzido custo metabólico. Esse fato reforça a hipótese que um exon codificador de
peptídeo sinal de vários precursores não relacionados surgiu nos primórdios da evolução dos
anfíbios. Além de que a conservação dessa seqüência sugere que a mesma deve possuir um
papel adicional ainda não descoberto (Charpentier et al., 1998; Hancock & Chapple, 1999).
No caso dos anfíbios, a porção sinal do precursor direciona o peptídeo para um local
apropriado na glândula. Quando o animal é estimulado, uma segunda protease remove a
região ácida, liberando o peptídeo, o qual, após alguns minutos, é desativado por proteases,
evitando a toxicidade para o animal. Modificações pós-traducionais ocorrem com freqüência e
incluem a amidação C-terminal e, mais raramente, a isomerização de aminoácidos
(Charpentier et al., 1998; Rinaldi, 2002; Pukala et al., 2006). Estudos demonstraram que a
amidação C-terminal provoca o aumento da atividade antimicrobiana, este fato pode estar
4
relacionado a mudanças no momento dipolar e à redução da susceptibilidade à degradação por
carboxipeptidases (Nascimento et al., 2003).
A pele de sapo tem sido utilizada com propósitos medicinais por séculos e ainda
hoje é usada em países da América do Sul, incluindo o Brasil (Hancock & Chapple, 1999). O
uso de veneno de Phyllobates bicolor para a caça e na guerra é feito na Colômbia pelos índios
do Chocó. Essa substância, conhecida localmente como kokoi, é extremamente tóxica e
utilizada na ponta de flechas de zarabatanas (Marki & Witkop, 1963; Myers & Daly, 1983).
O primeiro peptídeo antimicrobiano (bombinin) foi isolado há quase quarenta anos
da secreção cutânea de Bombina variegata (Csordas & Michl, 1970), todavia o estudo dessas
moléculas só se intensificou e consolidou no final da década de 80 com o isolamento das
magainins de Xenopus laevis por Zasloff (1987), detentoras de uma ampla atividade contra
fungos, bactérias e protozoários (Barra & Simmaco, 1995; Rinaldi, 2002; Nascimento et al.,
2003).
Os peptídeos antimicrobianos provenientes do veneno de anuros possuem algumas
características em comum, tais como: 10–50 resíduos de aminoácidos, um grande número de
resíduos hidrofóbicos, usualmente possuem uma carga total positiva, conformação em α-
hélice anfipática, momento hidrofóbico alto e uma ampla face apolar em contraste com uma
pequena face polar (Hancock & Chapple, 1999; Brogden, 2005). A maioria dos peptídeos
antimicrobianos é composta por L-aminoácidos, todavia, estudos demonstram que D-isômeros
mantêm a sua atividade antimicrobiana, sugerindo assim que esta atividade independe da
interação com um receptor ou com outro centro quiral, além de reduzir a atividade hemolítica
e citolítica (Conlon et al., 2005; Conlon et al., 2007a). Pequenos peptídeos antibióticos como
os bombinins H 3-5 possuem L- e D-aminoácidos. Esta coexistência resulta em uma estrutura
única com propriedades completamente diferentes dos peptídeos formados exclusivamente
por
L-aminoácidos (Shai, 1999; Mangoni et al., 2006).
Estruturalmente, os peptídeos antimicrobianos são divididos em três grupos: (1)
peptídeos lineares com conformação em α-hélice anfipática sem cisteínas (ex: magainins e
dermaseptins), (2) peptídeos com uma ponte dissulfeto formando um loop C-terminal (ex:
brevinins e esculetins) e (3) peptídeos de 10-13 resíduos de aminoácidos (temporins),
primeiramente isolados da Rana temporaria. Todavia, a cada ano são descobertos novos
peptídeos com características estruturais únicas que acabam por constituir novas famílias, por
exemplo, tigerins, pseudins, maximins, japonicins, nigrocins e distinctins. Os tigerins têm 11
ou 12 resíduos, estrutura em folha β, além de uma ponte dissulfeto formando um anel
5
nonapeptídico (e não com sete) (Sai et al., 2001). O japonicin-2 possui um anel com
octapeptídeo (Isaacson et al., 2002). O temporin-1Od e o temporin-1Ja isolados da Rana
ornativentris e da Rana japonica, respectivamente, não possuem resíduo básico na sua
seqüência, possuindo apenas a carga positiva associada ao grupo α-amino (Kim, et al., 2001;
Isaacson et al., 2002). Um surpreendente peptídeo antimicrobiano heterodimérico foi isolado
da Phyllomedusa distincta, distinctin, o qual possui duas cadeias diferentes conectadas por
uma ponte dissulfeto. Em água, este peptídeo possui a conformação de folha β anti-paralela,
entretanto quando em um ambiente similar ao de uma membrana, ocorre um decréscimo da
conformação em folha β e um forte aumento da estrutura em hélice (Batista et al., 2001).
1.1.2. Mecanismos de seletividade e toxicidade específica
Estruturas ou funções inerentes de microorganismos contribuem para a seletividade
dos PAMs por esses. Primeiramente, a composição, a hidrofobicidade e a carga da membrana
de microorganismos difere da dos eucariotos. A membrana dos eucariotos é constituída
principalmente de fosfatidilcolina (FC), esfingomielina (EM), fosfatidiletanolamina (FE) e
esteróis que são moléculas neutras. Em contrapartida, a membrana dos microorganismos é
carregada de moléculas negativas, tais como fosfatidilglicerol (FG), cardiolipina (CL) e
fosfatidilserina (FS) que atraem os peptídeos catiônicos. Outras características como a
distribuição, composição e saturação de fofolipídios, a carga, a anfipaticidade e o potencial
mais negativo das membranas interna e externa também são responsáveis pela preferência dos
PAMs. Já a toxicidade dos PAMs pode ser reduzida pela localização e expressão estratégica
que minimizam a interação dos mesmos com tecidos vulneráveis do hospedeiro, por exemplo,
a secreção dos PAMs em superfícies epiteliais relativamente inertes como a pele dos anfíbios
(Yeaman & Yount, 2003).
1.1.3. Mecanismos de ação
Análises microscópicas mostraram que diferentes PAMs apresentam distintos efeitos
em microorganismos díspares, o que indica que diferentes peptídeos atuam em alvos
diferentes ou possuem mecanismo de ação diferenciado (Brogden, 2005). O mecanismo de
ação dos PAMs ainda é alvo de controvérsia, entretanto todos concordam que ocorre uma
disruptura seletiva da membrana celular, que a atividade citolítica não é mediada por um
receptor específico e que a estrutura anfipática dos peptídeos possui um papel fundamental
neste mecanismo (Reddy et al., 2004). Um fator importante para a atividade antimicrobiana é
6
o estado agregacional do peptídeo em solução, pois se verificou que peptídeos agregados
usualmente não são ativos contra bactérias Gram-negativas, mas sim contra as
Gram-positivas. Possivelmente isto é decorrente da presença de uma membrana externa nas
primeiras que impede a rápida agregação na membrana interna para lisar a célula (Nascimento
et al., 2003).
As propriedades antimicrobianas e citolíticas dos peptídeos são determinadas por
uma interação complexa entre cationicidade, hidrofobicidade, α-helicidade, anfipaticidade
e ângulo polar (Powers & Hancock, 2003). A estrutura em hélice anfipática possui cadeias
polares alinhadas ao longo de um lado e resíduos hidrofóbicos dispostos no lado oposto da
hélice, favorecendo a interação entre os peptídeos e a estrutura anfifílica das membranas
biológicas (Dathe & Wieprecht, 1999). Atualmente, sabe-se que um elevado grau de
helicidade e/ou anfipaticidade (momento hidrofóbico) está correlacionado ao aumento da
toxicidade contra células compostas por fosfolipídios neutros (Yeaman & Yount, 2003).
Assim, o momento hidrofóbico possui um pequeno papel na permeabilização de membranas
lipídicas altamente carregadas, no entanto, influencia substancialmente os efeitos dos PAMs
em membranas lipídicas neutras (Dathe & Wieprecht, 1999). Estudos com dicroísmo circular
mostraram que a conformação em hélice é atingida apenas no contato com vesículas
fosfolipídicas ou com um solvente mimetizador de membrana, o que altera o momento
hidrofóbico e o ângulo polar, conseqüentemente previne a atividade citotóxica do PAM até
que ele atinja o seu alvo (Conlon et al., 2007a).
Já a cationicidade (grande número de aminoácidos básicos distribuídos ao longo da
face hidrofílica da hélice, varia geralmente de +2 a +9) faz com que ocorra uma maior
afinidade dos peptídeos pelos fosfolipídios ácidos, carregados negativamente, (ex: FG, FE e
CL) situados nas membranas das bactérias, ao invés de interagirem com os fosfolipídios
zwitteriônicos (ex: FC e EM) expostos nas células de mamíferos (Figura 1). Todavia, estudos
demonstraram que o excesso de cationicidade pode aumentar a atividade hemolítica e reduzir
a antimicrobiana dos peptídeos, por causa do aumento da repulsão intermolecular nos poros
(Dathe & Wieprecht, 1999).
A importância da hidrofobicidade, porcentagem de resíduos hidrofóbicos, foi
demonstrada por Wieprecht et al. (1997) com o aumento do momento hidrofóbico de
análogos de magainin, onde ocorreu um aumento da ligação do peptídeo à membrana devido
ao aumento das interações hidrofóbicas entre as cadeias acil dos lipídios e a porção
hidrofóbica da hélice. O aumento dos níveis de hidrofobicidade, momento hidrofóbico e
helicidade estão fortemente relacionados ao aumento da citotoxicidade contra células de
mamíferos e bactérias Gram-positivas, e perda de especificidade para bactérias Gram-
negativas (Dathe et al., 1997; Blondelle et al., 1999; Dathe & Wieprecht, 1999).
O ângulo polar é uma medida da proporção relativa de facetas polares versus
não-polares de um peptídeo em α-helice. Em inúmeros estudos, um pequeno ângulo polar (e
então uma grande superfície hidrofóbica) foi associado à grande capacidade de permeabilizar
membranas, e a uma maior estabilidade e meia-vida dos poros. (Yeaman & Yount, 2003).
Figura 1. Mecanismo da especificidade de peptídeos antimicrobianos pela membrana
citoplasmática das bactérias (Modificado de Zasloff, 2002).
Um grande número de peptídeos se liga a lipopolisacarídeos (LPS) da parede celular
de bactérias Gram-negativas e a ácidos teicóicos em Gram-positivas, tornando a membrana
externa destes microorganismos permeável aos peptídeos. Como os peptídeos catiônicos
possuem uma afinidade pelo menos três vezes maior para estas moléculas do que os LPS
pelos cátions divalentes Ca
2+
e Mg
2+
, eles desalojam competitivamente estes íons e
desordenam a membrana externa por serem volumosos. A membrana externa sofre pequenas
rachaduras que permitem a passagem de uma variedade de moléculas, inclusive do peptídeo.
Os processos que se seguem ainda não são bem compreendidos. Entretanto, nem sempre
existe uma correlação direta entre a ligação aos LPS e a atividade antimicrobiana. Outros
peptídeos também podem se ligar às moléculas de ácido siálico presentes na superfície de
7
8
eritrócitos, mas a ligação e a penetração são menos eficientes (Hancock & Chapple, 1999;
Shai, 1999; Nascimento et al., 2003).
Estudos ex vivo indicaram que alguns peptídeos formam canais heterogêneos
voltagem-dependente permeáveis a íons em membranas lipídicas planas. Estes canais
possuem tamanhos e duração variada, sendo que a sua formação pode ser explicada pelo
mecanismo barrel-stave.
Modelo Barrel-stave: Este mecanismo envolve a ligação paralela e inserção
perpendicular de monômeros em α-hélice anfipática na membrana formando poros, de modo
que sua superfície hidrofóbica interaja com o núcleo lipídico da membrana e a sua face
hidrofílica revista o centro, formando um poro aquoso (Figura 2A). A orientação
perpendicular dos peptídeos na membrana só ocorre após o aumento da proporção entre
peptídeos/lipídios. Esse é o modelo mais aplicável para peptídeos citolíticos de células
bacterianas e de mamíferos (Conlon et al., 2007a). O tamanho do poro aumenta a partir do
recrutamento de novos monômeros, levando ao vazamento do conteúdo celular e,
conseqüentemente, à morte da célula. O recrutamento de monômeros é crucial para a inserção
dos peptídeos, visto que não é energeticamente favorável a inserção de uma única α-hélice
anfipática (Hancock & Chapple, 1999; Shai, 1999; Nascimento et al. 2003; Reddy et al.,
2004). Existe ainda um tipo particular deste modelo chamado de Poro Toroidal. Um
mecanismo que atende a peptídeos que interagem fortemente com grupos lipídicos, por
exemplo, magainin de X. laevis. Neste modelo, os peptídeos em α-hélice se orientam
paralelamente a membrana e após atingirem um limiar de concentração, se inserem
perpendicularmente na camada lipídica, todavia a ligação entre o monômero e o lipídio não é
quebrada durante a reorganização da camada lipídica, formando ao final um poro aquoso de
meia vida curta, íon seletivo e com a parede formada por monômeros do peptídeo intercalados
com lipídios da membrana biológica (Figura 2B) (Nascimento et al. 2003; Brogden, 2005).
Figura 2. (A) Representação esquemática do modelo barrel-stave. 1) Os peptídeos se ligam à
membrana plasmática tomando a conformação de α-hélice. 2) Ligação de mais peptídeos à
membrana. 3) Inserção das hélices na bicamada lipídica. 4) Recrutamento de mais
monômeros para aumento do poro. 5) Vazamento do material citoplasmático, seguida da
morte celular. (B) Esquema do modelo poro toroidal onde os peptídeos se intercalam aos
fosfolipídios para formar o poro. O azul das hélices (peptídeos) representa a face hidrofílica e
o vermelho a hidrofóbica (Retirado de Brogden, 2005).
Entretanto a formação de canais pelo modelo acima nem sempre explica a quebra da
integridade da membrana por certos peptídeos. Assim, mecanismos alternativos sugiram, por
exemplo, o modelo carpet-like.
Modelo Carpet-like: Este modelo foi descrito primeiramente para dermaseptins.
Nele, as moléculas de peptídeo saturam a superfície da membrana se ligando
preferencialmente às cabeças dos fosfolipídios. Após o alinhamento dos monômeros de modo
que as suas superfícies hidrofílicas estejam em contato com as cabeças dos fosfolipídios ou
com as moléculas de água, ocorre a reorientação dos resíduos hidrofílicos em direção ao
centro hidrofóbico da membrana, sem, entretanto, perderem o contato com as cabeças dos
fosfolipídios. Provocando a desagregação da membrana através da quebra da integridade da
sua curvatura (Figura 3) (Shai, 1999; Nascimento et al. 2003; Yeaman & Yount, 2003; Reddy
et al., 2004).
9
10
Figura 3. Ilustração do modelo carpet-like. 1) Ligação dos peptídeos aos fosfolipídios da
membrana. 2) Alinhamento dos monômeros de peptídeo de modo que os resíduos
hidrofóbicos fiquem em contato com as cabeças dos fosfolipídios. 3) Reorientação dos
peptídeos para o centro hidrofóbico da membrana. 4) Desintegração da membrana devido a
quebra da curvatura (Retirado de Brogden, 2005).
Modelo Shai-Matsuzaki-Huang: Envolve a formação de carpete e de poro pela
adesão de moléculas de peptídeos à membrana externa dos microorganismos, causando o seu
adelgaçamento. A bicamada é esticada e ocorre a formação de poros, os quais permitem a
passagem dos peptídeos que podem difundir para o citoplasma celular, atingindo possíveis
alvos intracelulares. Por último, a membrana tem a sua integridade perdida (Nascimento et al.
2003). Este modelo contempla pequenos peptídeos que não podem atravessar completamente
a membrana, sendo assim impossível a formação do poro multimérico do modelo
barrel-stave. Também leva em consideração a entrada do peptídeo dentro da célula,
interferindo, por exemplo, nas funções metabólicas, como ocorre com a molécula magainin 2
e uma dermaseptin em Escherichia coli. Estes achados indicam que os peptídeos
antimicrobianos de anfíbios podem ter múltiplos alvos nas bactérias, ou seja, tanto a
membrana citoplasmática como sítios intracelulares (Figura 4) (Zasloff, 2002; Nascimento et
al. 2003; Reddy et al., 2004).
Figura 4. Esquema do modelo Shai-Matsuzaki-Huang. a) Formação de um carpete de
peptídeos na camada externa da membrana. b) Integração do peptídeo à membrana e
afinamento da camada externa. c) Formação de poros transientes. d) Transporte de lipídios e
peptídeos para a camada interna. e) Difusão dos peptídeos para alvos intracelulares (em
alguns casos). f) Colapso da membrana em fragmentos. (Modificado de Zasloff, 2002).
Uma vez no citoplasma, os peptídeos translocados podem alterar a formação do
septum da membrana citoplasmática, inibir a síntese da parede celular, inibir a atividade
enzimática, alterar a renaturação de proteínas, promover perda de ATP, dentre outros
mecanismos (Figura 5) (Brogden, 2005). Portanto, os PAMs podem matar a mesma espécie
de patógeno por mais de um mecanismo de ação, dependendo de fatores individuais como
fase de crescimento, localização tecidual, e a presença ou ausência de outros mecanismos
imunes ou agentes antimicrobianos exógenos sinérgicos (Yeaman & Yount, 2003).
11
Figura 5. Esquema simplificativo do modo de ação intracelular de peptídeos antimicrobianos.
Modificado de Brogden (2005).
1.1.4. Aplicações
Um dos mais fascinantes aspectos oriundos de estudos de peptídeos ativos de
anfíbios é que a maioria dos peptídeos das secreções apresenta múltiplas funções. Por
exemplo, o neuropeptídeo caerulein, presente em Leptodactylus labyrinthicus, contrai e relaxa
músculo liso, afeta a pressão sanguínea e é um potente analgésico (Pukala et al., 2006).
Taxonomia e filogenia
Apesar da estrutura primária dos peptídeos antimicrobianos de várias famílias de
anuros apresentarem uma baixa similaridade, a seqüência de aminoácidos do peptídeo sinal e
da pró-região ácida é bastante conservada nos diferentes precursores. Esta observação leva à
especulação de que estes peptídeos derivaram de um gene ancestral comum e que a atual
diversidade dessas moléculas deve-se a múltiplas duplicações deste gene em cada espécie.
Durante os processos evolutivos, a pró-região N-terminal foi conservada enquanto a região
funcional C-terminal desenvolveu-se rapidamente em resposta à exposição aos diversos
microorganismos, originando uma grande variedade de peptídeos com atividade
antimicrobiana. Esta grande heterogeneidade molecular pode ser utilizada para a identificação
de espécies e para um melhor entendimento das inter-relações filogenéticas entre as espécies
(Conlon et al., 2004).
12
13
Transgênicos
Alguns grupos de pesquisa estão utilizando peptídeos antimicrobianos na
construção de plantas e animais transgênicos. Um destes trabalhos foi publicado por Ponti et
al. (2003), no qual foi expresso o peptídeo esculetin-1 de Rana esculenta na planta Nicotiana
tabacum, provendo à planta uma maior resistência a fitopatógenos bacterianos e fúngicos,
além de propriedades inseticidas.
Uso terapêutico
O potencial terapêutico dos peptídeos antimicrobianos é atribuído a sua capacidade
de lisar membranas, matando rapidamente um amplo espectro de microorganismos, inclusive
fungos, bactérias e vírus resistentes à múltiplas drogas (Reddy et al., 2004). Devido ao seu
mecanismo de ação relativamente não específico, o surgimento de resistência aos peptídeos
pelos microorganismos ocorre a uma taxa bem menor que a dos antibióticos convencionais
(Conlon et al., 2004). Outro fator positivo é o sinergismo que ocorre com o uso concomitante
destes peptídeos com antibióticos clássicos e com misturas de peptídeos (com estrutura e
origem bastante diferente para evitar o aumento da toxicidade), bastante útil no combate às
infecções por patógenos multi-resistentes (Barra & Simmaco, 1995; Nascimento et al., 2003).
Entretanto, os maiores obstáculos para o uso dos peptídeos como agentes
anti-infecciosos são a sua toxicidade, principalmente se forem administrados sistemicamente,
e a pequena meia-vida na circulação. O uso de D-peptídeos tem sido sugerido como possível
uso sistêmico, já que não são degradados pelas enzimas, mantêm a atividade antimicrobiana,
além de perderem a atividade hemolítica (Papo & Shai, 2004; Mangoni et al., 2006).
Experimentos realizados por Conlon et al. (2007a) sugerem uma estratégia para produzir
análogos mais eficazes: aumentar seletivamente a cationicidade e anfipaticidade e, ao mesmo
tempo, reduzir a helicidade e a hidrofobicidade. Pequenas alterações estruturais provocam
profundas mudanças conformacionais, por tanto, o desenho de análogos é um processo
bastante delicado, que deve ser realizado com bastante cuidado.
Estudos mostraram que os peptídeos antimicrobianos também são nocivos para
protozoários como, por exemplo, derivados de dermaseptin S3 matam o parasita Plasmodium
falciparum intraeritrociticamente sem lisar o eritrócito (Nascimento et al., 2003). Outro
achado é o peptídeo dermaseptin DS-01 isolado de Phylomedusa oreades e P. distincta, o
qual possui atividade contra Trypanossoma cruzi na sua forma tripomastigota, podendo ser
usado na prevenção de infecções durante a transfusão de sangue (Leite et al., 2005). Os
14
peptídeos bombinins H2 e H4 foram recentemente descritos como detentores de atividade
anti-Leishmania (Mangoni et al., 2006).
Os peptídeos antimicrobianos isolados de anfíbios também demonstraram serem
eficazes na luta contra o vírus HIV, visto que os peptídeos caerin 1.1, caerin 1.9,
maculatin 1.1 e dermaseptin 4 inibiram a infecção das células T em concentrações não tóxicas
às células-alvo, além de combaterem também algumas DSTs associadas ao aumento da
transmissão do vírus HIV como, por exemplo, o vírus da herpes (Rinaldi, 2002; Reddy et al.,
2004; Lorin et al., 2005; VanCompernolle et al., 2005).
Poucos peptídeos foram testados para um potencial contraceptivo, mas estudos
recentes demonstraram uma atividade espermicida de magainin-A (Reddy, Shahani &
Meherji, 1996) e de dermaseptin-4 (Zairi et al., 2005).
Um uso em potencial para dermaseptins é como carreador de drogas terapêuticas. O
peptídeo dermaseptin K4-S4(1-13)a se liga à membrana dos eritrócitos e é transportado pela
corrente sangüínea até encontrar o microorganismo-alvo pelo qual possui uma maior
afinidade, ligando-se à sua membrana e provocando a lise celular (Rinaldi, 2002 &
Nascimento et al., 2003).
Em estudos realizados por Doyle e sua equipe (2003) citropin 1.1 demonstrou
atividade antitumoral e função inibidora de nNOS (isoforma neuronal da óxido nítrico
sintase).
Tratamento de infecção de peixes, preservadores de alimentos e flores, aerossol
contra infecções pulmonares contra Pseudomonas aeruginosa, tratamento de candidíase oral
em pacientes imunocomprometidos e de acne são alguns usos em potencial dos peptídeos de
anfíbios (Nascimento et al., 2003; Conlon et al., 2007a).
A descoberta de novos peptídeos pode inspirar o desenho de análogos, sintetizados
quimicamente em fase sólida, por síntese recombinante, pelo sistema de expressão em
baculovírus ou em fungos ou por transgenía em plantas ou animais (Schröder, 1999; Rinaldi,
2002). Atualmente, vários peptídeos antimicrobianos de anfíbios estão passando por testes
laboratoriais, entretanto poucos chegaram aos testes clínicos como o pexiganan (fase III),
derivado de magainin, previsto para o tratamento de ulcerações infecciosas nos pés de
diabéticos (Reddy, et al., 2004).
15
1.1.5. Mecanismos de resistência bacteriana aos PAMs
Apesar da atividade dos PAMs contra as bactérias não ser via receptor, as bactérias
apresentam inúmeros mecanismos para resistirem à ação dessas moléculas. Os mecanismos de
resistência atuam em contrapartida ao mecanismo de ação dos PAMs (Tabela 1). Existem dois
tipos fundamentais de resistência adotados pelos patógenos resistentes: resistência
constitutiva e resistência induzida.
Os mecanismos de resistência constitutiva são propriedades inerentes ao organismo
e são normalmente expressas. Esses mecanismos incluem alteração da energia da membrana
(ex: redução do potencial transmembrana), apresentação de glicocálices (carregados
negativamente) na membrana e escolha de nichos específicos.
Já a resistência adaptativa envolve respostas coordenadas ao estresse causado pelos
PAMs. Essas estratégias de resistência envolvem a regulação da expressão gênica. Por
exemplo, ocorre a expressão de peptidases, modificações sintéticas e enzimáticas de estruturas
da superfície de membrana, produção de sistemas de efluxo dos PAMs dependentes de
energia, além da modificação de alvos intracelulares (Yeaman & Yount, 2003; Brogden,
2005).
Tabela 1. Paralelismo entre os mecanismos de ação dos peptídeos antimicrobianos e os de
resistência apresentados pelos microorganismos. Adaptado de Yeaman & Yount (2003).
Local Mecanismo de ação Mecanismo de resistência
Tecido do
hospedeiro
Imunidade contexto específica/
Sinergismo
Fuga do sistema imune
nicho-específica
Opsonização Alteração da cápsula aniônica
Estrutura resistente a protease Proteases
Membrana
externa
Componentes negativos como
alvo
Amidação dos constituintes de
lipídio A
Parede celular
Interferência na integridade da
parede celular
Modificação das vias da parede
celular ou precursores
Membrana
citoplasmática
Fosfolipídios eletronegativos
como alvo
Modificação de fosfolipídios de
membrana
16
Exploração do potencial
transmembrana
Redução do potencial
transmembrana
Transição de conformação/
multimerização
Prevenção da transição de fase/
multimerização
Citoplasma
Acesso intracelular Efluxo peptídico
Atuação em ligantes intracelulares
específicos
Modificação de alvos
intracelulares específicos
Estrutura resistente às proteases Proteases
Atuação em organelas
intracelulares
Modificação de organelas
Ácido nucléico
Atuação em motivos específicos
de ácido nucléico
Mutação da seqüência de pares de
base
Sinergismo de efeitos Adaptação coordenada
1.2. Peptídeos com atividade anticarcinogênica (PACs)
Apesar dos recentes avanços na terapêutica do câncer, ele continua sendo a maior
fonte de morbidade e mortalidade no mundo. O termo câncer se refere a diferentes tipos de
doenças, afetando diferentes tecidos e tipos de células. Entretanto, todas as formas de câncer
são caracterizadas pelo crescimento celular anormal, resultante de mutações genéticas
induzidas pelo ambiente ou herdadas (Hoskin & Ramamoorthy, 2008). Os tumores são
caracterizados por comportamentos específicos como ilimitado potencial replicativo, auto-
suficientes a sinais de crescimento, ou seja, produzem seus próprios fatores de crescimento,
insensíveis a fatores inibidores do crescimento, conseguem escapar da morte celular,
apresentam angiogênese intensa e são evasivos ao sistema imunológico, sendo essas
características também os principais alvos para o desenvolvimento de novas drogas (Figura 6)
(Bhutia & Maiti, 2008).
Figura 6. Alvos terapêuticos para regressão tumoral. Abreviações: CTL, linfócito T
citotóxico; FGF, fator de crescimento de fibroblasto; IDO, idolamina 2,3 dioxigenase; IL-10,
interleucina-10; MMP, metaloprotease de matriz; NK, células natural killers; pRb, proteína
retinoblastoma; TGF-β, fator transformador do crescimento-β; u-PA, ativador plasminogênico
do tipo uroquinase; VEGF, fator de crescimento endotelial vascular. Modificado de Bhutia &
Maiti (2008).
Embora cânceres localizados possam ser tratados por cirurgia ou radioterapia, a
quimioterapia continua sendo o tratamento de escolha para os casos mais graves. Todavia, os
agentes quimioterápicos convencionais, os quais exibem atividade contra células em
proliferação pela inibição da síntese de ácido nucléico, causam indesejáveis efeitos colaterais.
Além disso, células cancerígenas quiescentes ou que se proliferam lentamente são refratárias a
esse tipo de tratamento. O tratamento é ainda complicado pela resistência adquirida pelos
tumores aos quimioterápicos, por exemplo, expressão de enzimas desintoxificadoras e
transportadores de drogas (ex: P-glicoproteína), habilidade em reparar o DNA danificado,
alteração da interação entre a droga e o seu alvo e defeitos na maquinaria que leva à apoptose
(Dennison et al., 2006; Hoskin & Ramamoorthy, 2008).
A resistência é então um dos maiores problemas enfrentados no tratamento do
câncer, sendo assim de extrema importância a descoberta de novas drogas que ajam
especificamente em células tumorais e que não sejam propensas aos efeitos da resistência
multi-drogas (RMD). Recentemente, o desenvolvimento de terapias baseadas em peptídeos
antimicrobianos tem surgido como uma nova estratégia no tratamento do câncer. Esses
tratamentos são vantajosos pelos peptídeos serem altamente específicos para os seus alvos,
17
18
apresentarem baixa toxicidade, boa penetrabilidade nos tecidos devido aos seus reduzidos
tamanhos, atuarem rapidamente, não estimularem o aparecimento de resistência pelas células,
apresentarem sinergismo com quimioterápicos clássicos, possuírem um amplo espectro de
atividade e serem capazes de destruírem tumores primários, além de prevenirem metástase
(Shadidi & Sioud, 2003; Bhutia & Maiti, 2008; Hoskin & Ramamoorthy, 2008).
Na última década, estudos revelaram que muitos peptídeos antimicrobianos
apresentavam atividade anticarcinogênica (PAC). Esses peptídeos possuem importante papel
na imunidade inata de diversos organismos, além do recente surgimento de evidências que
eles também modulam a imunidade, afetando infecções e inflamações. Atualmente, sugere-se
que a atividade antitumoral desses peptídeos deriva primariamente da interação com a
membrana plasmática das células ou com a membrana mitocondrial (Dennison et al., 2006).
De acordo com o espectro de atividade, os PAMs são divididos em dois grupos. O primeiro
grupo inclui peptídeos que são extremamente potentes contra bactérias e células de câncer,
mas que não afetam células normais de mamíferos (ex: magainins). O outro grupo é formado
por peptídeos tóxicos para bactérias, células tumorais e normais de mamíferos (ex: melittin).
Todavia, nem todos os PAMs apresentam atividade antitumoral (Papo & Shai, 2005).
Um diverso espectro de organismos produz PACs, entretanto, a maior fonte desses
peptídeos é a pele dos anfíbios (ex: aurein 1.2, citropin 1.1, gaegurins, magainins). Muitos
anfíbios possuem secreções glandulares que contêm pelo menos um peptídeo antibiótico de
amplo espectro, juntamente com outros que apresentam um espectro limitado de atividade
contra uma ou poucas bactérias. Muitos desses peptídeos antibióticos de amplo espectro de
ação apresentam a porção C-terminal amidada e também exibem atividade anticâncer. Essa
dupla função sugere que o mecanismo de ação de ambas as atividades é similar (Pukala et al.,
2006).
Magainins são os PACs isolados de anfíbios mais estudados. O peptídeo magainin 2
e seus análogos sintéticos causam uma rápida lise de linhagens celulares hematopoiéticas e de
tumores sólidos a concentrações 5–10 vezes menores que a concentração causadora de lise em
neutrófilos e linfócitos humanos normais. Lehmann et al. (2006) também revelaram que
magainin 2 é ativo contra células de câncer de bexiga, apresentando um IC
50
de
aproximadamente 200 µM. Experimentos indicaram que as macromoléculas magainins lisam
as células tumorais pela formação de canais iônicos na membrana celular, contudo, outros
estudos evidenciam a desestabilização da membrana pelo modelo carpet-like. Recentemente,
demonstrou-se que esses peptídeos entram na célula por um mecanismo independente de
19
energia e receptor, podendo levar a célula à apoptose por meio da formação de poros nas
mitocôndrias. Portanto, ainda não está claro se os PAMs magainins matam células tumorais
humanas primariamente por lise da membrana e/ou apoptose (Hoskin & Ramamoorthy,
2008).
1.2.1. Mecanismos de ação dos PACs
Atividade necrótica
A maioria dos peptídeos atuantes em membranas se liga rapidamente à membrana
plasmática das células tumorais desestabilizando-a e levando à necrose. A membrana
citoplasmática das células cancerígenas hiper-expressam FS carregada negativamente e
mucinas O-glicosiladas, o que torna a membrana dessas células mais negativa que a das
células eucarióticas normais. Esses peptídeos, freqüentemente pequenos, catiônicos e
anfipáticos, causam desestabilização da membrana tanto pelo modelo carpet-like como pelo
barrel-stave, levando à morte necrótica das células tumorais, sendo que os peptídeos que
atuam como no último modelo também lisam células normais. Os peptídeos necróticos
possuem uma alta especificidade para células tumorais, atuam independentemente do estado
proliferativo das células e são ativos contra células de câncer RMD por não atuarem em
receptores. Experimentos demonstraram que o potencial de membrana é fundamental para a
atividade desses peptídeos (Papo & Shai, 2005; Bhutia & Maiti, 2008). Durante a última
década, membros desse grupo foram isolados de Litoria sp. e apresentam atividade contra
todas as classes de cânceres humanos testados (Apponyi et al., 2004).
Atividade apoptótica
As células tumorais são resilientes ao processo apoptótico devido à desregulação de
proteínas pró e anti-apoptóticas como Bax e Bcl-2, o que torna de grande relevância o
desenvolvimento de drogas detentoras de atividade apoptótica. A maioria das drogas
indutoras de apoptose não age diretamente na maquinaria apoptótica, induzindo apoptose
indiretamente, atingindo sinais responsáveis pela sobrevivência e proliferação
celular (Alam, 2003).
Os alvos apoptóticos que estão atualmente sendo explorados para o tratamento de
câncer incluem o fator de necrose tumoral (TNF) relacionado a receptores induzidos por
ligantes relacionados à apoptose (TRAIL), proteínas anti-apoptóticas da família Bcl-2,
proteínas inibidoras da apoptose (IAP) e MDM2 (Figura 7) (Fesik, 2005).
Vários peptídeos catiônicos como magainin 2 e derivados de gaegurin 6 são
capazes de induzir apoptose. Os resultados do estudo com magainin sugerem perturbação da
membrana mitocondrial, a qual é carregada negativamente, levando à liberação do citocromo
c que promove o processo apoptótico (Kim et al., 2003; Papo & Shai, 2005; Bhutia & Maiti,
2008).
Figura 7. Representação simplificada das duas principais vias de sinalização para a morte
celular programada. Modificado de Fesik (2005).
Peptídeos que interagem com receptores
Pequenos peptídeos que atuam em receptores, principalmente nos hormonais, têm
sido alvo de grandes estudos. Isso porque análogos de receptores hormonais exibem uma
potente atividade anticâncer (Leuschner & Hansel, 2005). Por exemplo, peptídeos
antagonistas da bradicinina foram desenvolvidos para atuarem contra três aspectos do
desenvolvimento tumoral, crescimento, migração e invasão, oferecendo uma terapia
combinatória em uma única droga. Outros alvos como os receptores dos fatores que
promovem a angiogênese também vêm sendo estudados (Bhutia & Maiti, 2008).
20
21
Peptídeos que atuam em genes
Observou-se que o peptídeo melittin atua seletivamente em células de mamífero que
hiper-expressam o oncogene ras. Esse peptídeo estimula a produção de fosfolipase A
2
(PLA
2
)
pelo oncogene das células transformadas, levando à destruição seletiva (Sharma, 1992).
Peptídeos que se ligam às proteínas de adesão celular
Inibidores da adesão celular alteram as propriedades das proteínas da matriz
extracelular, as quais possuem um papel central na invasão tumoral e angiogênese (Shadidi &
Sioud, 2003).
Inibidores das proteínas cinases
As proteínas cinase C fazem parte da família das serino/treonina cinases, as quais
estão envolvidas na transdução de sinais para a proliferação celular, diferenciação, apoptose e
angiogênese. A desregulação dessas proteínas provoca tumorigenicidade e resistência a
drogas. As proteínas cinases são comumente ativas nas células de câncer, o que as torna um
alvo atrativo para a terapia anticâncer. Pequenos peptídeos como o P15 estão sendo testados
para inibirem a interação das cinases com o seu substrato sem efeitos colaterais, todavia, essa
é uma tarefa difícil pelos múltiplos papéis desempenhados por essas proteínas (Mackay &
Twelves, 2007).
Inibidores de proteases
Tumores expressam várias proteases responsáveis pela invasão e metástase.
As principais classes de proteases atuantes nesses eventos são as catepsinas, uroquinases e
metalopeptidases (MMP), tornando-se, portanto, os principais alvos para a terapêutica.
Inibidores de proteases podem atuar inibindo estágios da progressão do câncer (Figura 8).
Para ilustrar, peptídeos cíclicos contendo a seqüência His-Trp-Gly-Phe inibem seletivamente
as MMP-2 e MMP-9, suprimindo a angiogênese, migração e invasão de tumores (Yip et al.,
1999; Bhutia & Maiti, 2008). Entretanto, estudos recentes demonstraram um grande número
de proteases com atividade antitumoral (López-Otín & Matrisian, 2007).
Figura 8. Estágios do desenvolvimento do câncer que podem ser alvos de inibidores de
proteases. Modificado de López-Otín & Matrisian (2007).
Atividade antiangiogênica e antivascular
Inibidores da angiogênese podem interferir em qualquer passo da formação de um
novo vaso sanguíneo, dentre eles a degradação da membrana basal do endotélio, proliferação
e migração das células endoteliais, inibindo assim o crescimento e a metástase do tumor
(Figura 9) (Fan et al., 2006). A expressão diferenciada de marcadores na superfície do
endotélio de vasos sangüíneos de tumores é um ótimo alvo para a terapia do câncer. Uma
grande vantagem em utilizar esses alvos é que as células vasculares tumorais são
geneticamente estáveis e, portanto, menos propensas a se tornarem resistentes a drogas
(Shadidi & Sioud, 2003).
A maioria dos inibidores endógenos da angiogênese é formada por fragmentos
complexos muito grandes para penetrarem na célula, fácil de serem eliminados pelo
organismo e muito caros para serem comercializados como drogas. Assim, inúmeros estudos
buscam o desenvolvimento de peptídeos que imitem os efeitos dessas moléculas, mas sem as
suas desvantagens (Brannon-Peppas & Blanchette, 2004; Bhutia & Maiti, 2008).
Agentes antivasculares atuam destruindo rapidamente e seletivamente vasos já
existentes, levando à morte das células do tumor. Peptídeos que se ligam seletivamente a
vasos sanguíneos de tumores e induzem a coagulação e/ou a morte celular estão sendo
desenvolvidos. O peptídeo exherin, inibidor de N-cadherin, envolvido na integridade
estrutural dos vasos sangüíneos, causa hemorragia em tumores de células animais e se
encontra na fase I dos testes clínicos (Tozer, Kanthou & Baguley, 2005).
Atividade imunoestimulatória
Em cânceres, a resposta imune do paciente é geralmente fraca ou suprimida.
A produção de moléculas imuno-supressoras pelas células tumorais faz com que as mesmas
driblem o sistema imunológico. Portanto, é importante a estimulação do sistema imunológico
22
do paciente em tratamento. Por exemplo, o dipeptídeo de origem microbiana muramil (MDP)
atua como adjuvante de vacina e demonstra potencial para o combate ao câncer (Bhutia &
Maiti, 2008).
Figura 9. Etapas da angiogênese e metástase tumoral susceptíveis à inibição por peptídeos
antiangiogênicos. CEs- células endoteliais; MMPs- metaloproteinases; VEGF- fator de
crescimento endotelial; HIF-1α- fator iduzido por hipóxica. Modificado de Fan et al. (2006).
1.2.2. A seletividade dos PACs pelas células tumorais
Mudanças na membrana de uma célula são de extrema importância para o
desenvolvimento do câncer. Para ilustrar, a expressão de certos constituintes na membrana
promove a habilidade de crescer na ausência de sinais estimulatórios, de atacar e responder
diferentemente às células vizinhas, afetar a mobilidade das células cancerígenas, facilitando a
invasão e a metástase.
Diferenças entre a membrana das células tumorais e normais são responsáveis pela
especificidade de certos PACs (outrora referidos como PAMs) contra células de câncer.
As interações eletrostáticas entre os PACs catiônicos e os componentes aniônicos da
membrana celular são as maiores responsáveis pela especificidade desses peptídeos.
23
24
As membranas das células cancerígenas são carregadas negativamente devido à presença de
moléculas aniônicas tais como a FS, as mucinas O-glicosiladas e ácido siálico. Além disso, o
potencial de membrana mais negativo dessas células anormais também pode contribuir para a
seletividade dos PACs. Outros fatores como a maior fluidez da membrana (por causa da
reduzida quantidade de colesterol) que facilita a sua desestabilização e a maior área
superficial devido à presença de inúmeras microvilosidades, as quais permitem a ligação de
uma maior quantidade de peptídeos, também são responsáveis pela eficácia dos PACs contra
as células tumorais (Dennison et al., 2006; Hoskin & Ramamoorthy, 2008).
Entretanto, existem PACs que são tóxicos para todos os tipos de células. Além disso,
existe grande variabilidade na especificidade e na eficiência para diferentes células-alvo.
Vários estudos sugerem que a seletividade também pode depender de características
físico-químicas e estruturais do peptídeo, juntamente com a organização e a composição da
membrana-alvo e de camadas associadas (Dennison et al., 2006).
1.2.3. Estratégias para aumentar a eficiência dos PACs
Apesar do grande potencial terapêutico, o uso de peptídeos naturais tem sido
inviabilizado por inúmeros fatores como meia-vida curta no sangue, baixa biodisponibilidade
em tecidos e órgãos, depuração renal e potencial ativação do sistema imune (Shadidi & Sioud,
2003). O desenvolvimento de terapias baseadas em peptídeos deve possuir forte atividade
tumoricida e baixa toxicidade (Kim et al., 2003).
Assim, uma série de táticas tem sido adotada para melhorar a eficácia dos PACs.
As mais simples são a substituição de aminoácidos e o uso de
D-aminoácidos (Kim et al.,
2003). No último caso, experimentos revelaram uma perda da atividade citotóxica contra
células normais, todavia, a atividade antitumoral foi mantida, além da redução da inativação
pelo soro e degradação enzimática in vivo (Bessalle et al., 1990; Papo & Shai, 2003; Papo &
Shai, 2004; Hoskin & Ramamoorthy, 2008).
Os peptídeomiméticos são outra importante abordagem, originando peptídeos
altamente específicos com características farmacodinâmicas e farmacocinéticas otimizadas.
A engenharia de peptídeos, onde dois peptídeos são reunidos originando um híbrido mais
potente, também está sendo utilizada. É o caso da união da região NH
2
-terminal de cecropin A
(α-hélice positivamente carregada) com a região NH
2
-terminal (α-hélice hidrofóbica) de
melittin ou de magainin 2, exibindo atividade citolítica contra linhagens de câncer de pulmão
e apresentando pouca ou nenhuma atividade hemolítica (Hoskin & Ramamoorthy, 2008).
25
Em uma estratégia similar, um domínio responsável pela rápida entrada do peptídeo na célula
é acoplado a outro que causa perturbação de membrana mitocondrial, levando à apoptose.
Todavia, esse tipo de híbrido precisa ser direcionado para células tumorais, evitando a
toxicidade sistêmica (Shadidi & Sioud, 2003).
Peptídeos chamados de hunter-killers foram desenhados para atingir e então destruir
apenas vasos sanguíneos de tumores, os quais apresentam endotélio e estroma diferenciados.
Eles são compostos por dois domínios, um que direciona o peptídeo para o vaso e outro que
induz apoptose, servindo como uma alternativa menos tóxica para a terapia de câncer (Zhu &
Witte, 1999; Neri & Bicknell, 2005). Outra estratégia que representa um importante passo no
uso de peptídeos líticos na terapia do câncer é o uso da entrega de genes codificadores de
peptídeos líticos nas células tumorais por vetores (Winder et al., 1998; Brannon-Peppas &
Blanchette, 2004).
Como alguns PACs são exógenos ao organismo humano, podem ser neutralizados
por anticorpos ou provocarem respostas alérgicas. Uma medida para evitar que esses eventos
ocorram é usar peptídeos de origem humana ou co-administrar PACs exógenos com drogas
imunossupressoras. Alternativamente, peptídeos imunogênicos poderiam ser encapsulados em
lipossomas construídos para entregar o conteúdo no local dos tumores, reduzindo a
probabilidade do desenvolvimento de uma resposta imunológica (Shadidi & Sioud, 2003;
Hoskin & Ramamoorthy, 2008).
Outra alternativa é a funcionalização dos PACs, isto é, a utilização desses peptídeos
com quimioterápicos convencionais ou moléculas radio-marcadas. Por exemplo, o uso de
peptídeos antagonistas de receptores conjugados às drogas tradicionais utilizadas no
tratamento de câncer. Essas pró-drogas são desenhadas pela fusão de quimioterápicos a
peptídeos que se ligam especificamente a células tumorais com um sítio de clivagem que é
reconhecido pelas proteases associadas ao tumor (Shadidi & Sioud, 2003). Finalmente, o
potencial desses peptídeos pode ser aumentado por meio de sistemas de entrega. Carreadores
de drogas e associação com soro albumina estão sendo usados para aumentar a longevidade,
estabilidade, permeabilidade e retenção no corpo dessas moléculas (Zhu & Witte, 1999;
Brannon-Peppas & Blanchette, 2004; Papo & Shai, 2005).
Infelizmente, os custos para isolar e sintetizar PACs de origem natural ainda são muito
elevados. Investimentos das indústrias farmacêuticas levarão, em um futuro próximo, ao
desenvolvimento de novas técnicas que viabilizarão a comercialização dessas moléculas, as
quais serão uma alternativa real aos quimioterápicos atuais (Hoskin & Ramamoorthy, 2008).
26
1.3. Enzimas proteolíticas
As enzimas proteolíticas são importantes enzimas que hidrolisam ligações peptídicas
e estão presentes em todos os organismos. Atualmente, as enzimas proteolíticas são chamadas
de peptidases (proteases), estando classificadas em endopeptidases (proteinase) e em
exopeptidase (Barrett & McDonald, 1986). As endopeptidases clivam ligações internas, já as
exopeptidases hidrolisam as ligações peptídicas da porção N- ou C-terminal. Todavia,
algumas peptidases apresentam tanto atividade de endo quanto de exopeptidase, e por este
motivo, não podem ser inseridas dentro desta classificação (Barret, 2001).
As peptidases são essenciais para a sobrevivência de qualquer organismo e são
codificadas por aproximadamente 2% do total de genes (Rawlings et al., 2004). Antigamente,
eram reconhecidas apenas pela sua propriedade de digerir proteínas. Todavia, a visão atual é
outra, além de promoverem a hidrólise não específica de proteínas, as proteases também
atuam como enzimas processadoras, as quais clivam substratos específicos de forma
altamente seletiva, limitada e eficiente, influenciando vários processos biológicos. As
peptidases apresentam várias funções de processamentos pós-traducionais, por exemplo,
remoção de sinais alvos (peptídeos sinais) e ativação de zimogênios; e desativam proteínas
como os peptídeos hormonais. Os eventos de processamento proteolítico são fundamentais em
processos como a ovulação, desenvolvimento embrionário, regulação do ciclo celular,
inflamação, apoptose, entre outros (Puente, 2003; Rawlings & Morton, 2008). As peptidases
são importantes alvos de drogas, pois patógenos utilizam-se dessas enzimas para invasão
tecidual e a proteólise descontrolada pode levar a graves doenças como a artrite. Assim, a sua
atividade precisa ser mantida sob controle por meio de vários mecanismos distintos
(Rawlings, Tolle & Barrett, 2004).
O processamento proteolítico pode ser limitado pela especificidade da peptidase,
acessibilidade à ligação peptídica do substrato, a ativação obrigatória de um precursor
enzimático, a ação de inibidores de protease, ou pela combinação desses fatores. Em termos
de especificidade, algumas peptidases possuem uma única proteína como substrato, já outras
são extremamente inespecíficas. Essas enzimas também utilizam estratégias distintas para
definir a sua localização espacial (intra ou extracelular) e, em muitos casos, atuam em uma
rede complexa com outras proteases, substratos, inibidores, receptores e ligantes. Todas as
peptidases específicas são reguladas por inibidores específicos. Todavia, alguns precursores
de protease podem se auto-regular (ex: tripsinogênio), enquanto outros não necessitam da
27
clivagem da ligação peptídica para a sua ativação (ex: plasminogênio) (Neurath, 1999;
Puente, 2003).
Existem dois tipos de classificação para as enzimas proteolíticas, o sistema EC da
IUBMB e o MEROPS. O sistema EC não leva em conta os grupos estruturais das peptidases,
os quais refletem as relações evolutivas, agrupando enzimas muito diferentes. O banco de
dados MEROPS resolveu esse problema, organizado em 51 clãs, representam diferentes
estruturas terciárias e origens evolutivas. A relação entre o tipo catalítico e o clã não é direta,
já que o clã pode conter peptidases de diferentes tipos catalíticos. Os resíduos do sítio ativo
das peptidases estão entre os resíduos mais conservados de uma família, entretanto,
substituições ocorrem, levando à perda de atividade. Portanto, podem existir peptidases
homólogas onde uma não possui atividade enzimática. O número desses resíduos é
geralmente o mesmo para todos os membros de uma família (Rawlings & Morton, 2008).
A classificação das peptidases é baseada nas relações estruturais e evolutivas
(Rawlings & Barrett, 1993). Com base na natureza química do sítio catalítico, as peptidases
são classificadas em: aspártico-, metalo-, glutâmico-, cisteíno-, serino- e treonino-peptidases.
As enzimas proteolíticas das três primeiras classes usam uma molécula de água ativada como
nucleófilo para atacar a ligação peptídica do substrato. Já nas outras classes, o nucleófilo é um
resíduo de aminoácido catalítico (Cys, Ser ou Thr, respectivamente) localizado no sítio ativo.
As diferentes classes são divididas em famílias de acordo com a seqüência de aminoácidos,
sendo que todas as peptidases dentro de uma família estão relacionadas evolutivamente.
As famílias são agrupadas em clãs com base na similaridade da conformação tridimensional
(Barret, 2001; Puente, 2003). Algumas peptidases não são agrupadas em clãs por
apresentarem o mecanismo catalítico desconhecido e outras são classificadas em um clã que
agrupa peptidases de diferentes sítios catalíticos (Rawlings et al., 2008).
1.3.1. Aspártico-peptidases
Formado por endopeptidases, sendo algumas de ativação auto-catalítica.
Os componentes desse grupo apresentam atividade ótima em pH ácido (ex: pepsina),
levando-se a acreditar que grupamentos carboxil estão envolvidos no aparato catalítico,
constituído de duas cadeias laterais de ácido aspártico. Acredita-se que esse grupo é capaz de
catalisar a clivagem de ligações peptídicas sem o ataque nucleofílico de um grupo funcional
da enzima, assim não há formação de um intermediário entre a enzima e o fragmento de
substrato. A enzima nativa contém uma molécula de água onde os hidrogênios estão
28
fortemente ligados aos dois sítios ativos de ácido aspártico. As aspártico-peptidases atuam
sobre ligações peptídicas flanqueadas por resíduos de aminoácidos hidrofóbicos e são inibidas
especificamente pela pepstatina A ou por compostos diazoacetil (Dunn, 2001; Rawlings et al.,
2008).
1.3.2. Metalo-peptidases
Possuem como característica principal a presença de um cátion divalente,
normalmente o zinco, no sítio ativo. Quando o cátion é o cálcio, hipotetiza-se que este teria o
papel de estabilizar o sítio catalítico durante a reação enzimática. Como as
aspártico-peptidases, as metalo-peptidases não formam um intermediário covalente, elas
apresentam uma solução mais direta para o efeito catalítico no grupo carbonil da ligação a ser
clivada. Ao invés de se basear na ligação de hidrogênio via um “papel oxiânion”, a
metalo-peptidase utiliza a coordenação de um íon metálico, geralmente o zinco, para exercer
este efeito. O íon metálico funciona como uma forte fonte eletrolítica para ajudar o ataque
pela molécula de água (Dunn, 2001). O clã mais estudado é o das termolisinas (isoladas de
Bacillus thermoproteolyticus). Os tipos de atividade incluem as aminopeptidases,
carboxipeptidases, peptidil-dipeptidase, oligopeptidase e endopeptidase, podendo ser inibidas
por agentes quelantes de íons metálicos como o EDTA, a fenantrolina e o fosforamidon.
As metalo-peptidases de matriz (MMP) e as de peçonhas de serpente têm sido objeto de
intensivos estudos. Algumas peptidases são sintetizadas na forma de pró-enzimas, ativadas
pela remoção do pró-peptídeo N-terminal (Rawlings et al., 2008).
1.3.3. Glutâmico-peptidases
Representado por endopeptidases glutâmicas, é o clã mais novo. As estruturas
terciárias determinadas para essas peptidases mostram que são compostas por duas folhas
betas em sanduíche. Atuam otimamente em pH ácido. Enzimas da família das xilanases e
glucanases apresentam um dobramento parecido ao dessa família. O mecanismo de catálise
sugerido é o ataque nucleofílico por uma molécula de água ativada pela cadeia lateral do
resíduo Glu136, assistido eletrofilicamente e estabilizado pela cadeia lateral do Gln53
(Rawlings et al., 2008).
29
1.3.4. Serino-peptidases
A classe das serino-peptidases é a mais estudada na enzimologia. Agrupada em
13 clãs, é composta tanto de endo quanto de exopeptidases, apresentando o aminoácido Ser
como nucleófilo. Apresentam uma tríade catalítica, na qual o ácido aspártico e a histidina
cooperam com a serina, podendo o complexo ser inibido por diisopropilfluorofosfato.
A transferência intermediária da porção acil do substrato para formar uma ligação covalente
com o grupo funcional da enzima, liberando como primeiro produto uma porção amino do
substrato, é uma característica deste grupo. Essas enzimas apresentam múltiplas origens
evolucionárias. A atividade ótima ocorre em pH ligeiramente alcalino. Normalmente
pertencem à família da quimotripsina, da subtilisina ou da prolil oligopeptidase (Barrett &
Rawlings, 1995; Dunn, 2001).
1.3.5. Cisteíno-peptidases
Com mais de cinqüenta famílias incluídas neste grupo, essas enzimas estão
amplamente distribuídas na natureza, sendo que em eucariotos o clã da papaína é
predominante. Geralmente localizam-se no citossol e em lisossomos, podendo ser encontradas
em compartimentos extracelulares durante condições patológicas. Muitos membros desse
grupo são sintetizados como pró-enzimas inativas. As cisteíno-peptidases possuem grande
similaridade catalítica com as serino-proteases, em ambas ocorre a formação de um
intermediário covalente. Nesse caso, o nucleófilo é um átomo de enxofre da cadeia lateral da
cisteína 25 (numeração da papaína) e a cadeia lateral da histidina 159 está envolvida no papel
de aceptor/translocador de hidrogênio. A atividade proteolítica das cisteíno-peptidases pode
ser inibida pelo inibidor E-64 (Dunn, 2001). Outra família importante é a das calpaínas,
endopeptidases altamente distribuídas em animais e dependentes de pH neutro, condições
redutoras e íons de cálcio. Estas enzimas estão envolvidas em variados processos fisiológicos
como reorganização do citoesqueleto e a apoptose, além de estarem relacionadas a eventos
como derrame e infarto do miocárdio (Rawlings et al., 2008).
1.3.6. Treonino-peptidases
Composta de apenas uma família (T5) é representada pela enzima auto-processadora
precursora da ornitina acetiltransferase (Saccharomyces serevisiae). Apenas o precursor da
ornitina acetiltransferase apresenta atividade proteolítica. O produto da maturação do
precursor é um heterodímero de 57 kDa que catalisa a troca reversível de um grupo acetil
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1.4.1. Fosfolipases A
2
Características gerais
Como dito anteriormente, as fosfolipases A
2
(PLA
2
) catalisam a hidrólise das
ligações éster sn-2 dos fosfolipídios, produzindo ácidos graxos livres e lisofosfolipídios. A
família das enzimas PLA
2
é composta pelas formas citosólicas (cPLA
2
), secretadas (sPLA
2
) e
as independentes de cálcio (iPLA
2
) (Diaz & Arm, 2003). Possuem diferentes papéis em vários
processos celulares, sendo de extrema importância em cada um deles, assim que são as mais
estudadas das fosfolipases. O estudo da atividade destas moléculas iniciou-se no começo do
século 20, utilizando-se como fonte dessas enzimas o suco pancreático e a peçonha de
serpentes. A princípio, essas enzimas extracelulares foram divididas em três grandes grupos e
vários subgrupos (de acordo com a seqüência de aminoácidos), todavia o surgimento de
fosfolipases que não se encaixavam nesta classificação tornou necessária a reformulação dos
grupos. Ao longo dos anos, pesquisas revelaram que a maioria destas pequenas moléculas
secretadas era dependente de cálcio, possuía várias ligações dissulfeto e resíduos catalíticos de
histidina e aspartato (Dennis, 1994; Six & Dennis, 2000).
As PLA
2
são as únicas enzimas hidrolíticas que hidrolisam substratos fosfolipídicos
insolúveis na água. Elas hidrolisam os fosfolipídios arranjados monomericamente, na forma
de micela ou de membrana lipídica, exibindo um grande e abrupto aumento de atividade
quando atuam em micelas. O sítio de reconhecimento, independente do catalítico, é
responsável pela rara propriedade de se ligar a interface entre a fase polar aquosa e os
fosfolipídios não polares, e a ativação interfacial. Apesar das enzimas PLA
2
exibirem
afinidade diferenciada pelos grupos da cabeça dos fosfolipídios, a eficiência catalítica é
determinada pelas propriedades físicas do agregado, tais como: densidade do empacotamento,
temperatura da fase de transição, cristalinidade do líquido e a presença de outras moléculas.
Baseada nas diferenças dos passos de ligação interfacial, a hidrólise das vesículas compostas
de duas camadas pode ocorrer de duas maneiras distintas. No modo hopping, a ligação e a
dissociação ocorrem a cada ciclo de catálise. No modo scooting, a enzima permanece ligada à
interface enquanto hidrolisa moléculas de substrato fosfolipídico (Dennis, 1994; Kini, 2003).
Efeitos farmacológicos
As enzimas PLA
2
de mamíferos possuem diversos papéis importantes, tais como: na
fertilização, proliferação celular, contração da musculatura lisa, hipersensibilização e nas
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incluem os ácidos hidroxieicosatetraenóicos (HETE), lipoxinas, ácidos epoxieicosatriênicos e
isoprostanos, os quais também podem modular respostas inflamatórias. Os AA também
podem regular processos biológicos independentes de maiores modificações enzimáticas
(Diaz & Arm, 2003; Yedgar et al., 2006).
Como todas as enzimas PLA
2
hidrolisam fosfolipídios para produzir mediadores
lipídicos inflamatórios, é aceito que diferentes isoformas de PLA
2
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ou sinergísticas. Todavia, estudos recentes sugerem que diferentes isoformas de PLA
2
podem
agir independentemente de, e possivelmente antagonisticamente a, cada uma em diferentes
condições inflamatórias (Dennis, 1994; Yedgar et al., 2006).
1.5. Leptodactylus labyrinthicus (Spix, 1824)
O gênero Leptodactylus pertence à família Leptodactitidae e contém 81 espécies
espalhadas nas Américas do Norte e do Sul, e nas Índias Orientais (Frost, 2007), entretanto,
apenas cinco espécies desse gênero foram examinadas para peptídeos com atividade biológica
(Nascimento et al., 2004; King et al., 2005; Rollins-Smith et al., 2005; Conlon et al., 2006;
Dourado et al., 2007; Nascimento, 2007; Nascimento et al., 2007).
O leptodactilídeo Leptodactylus labyrinthicus (Figura 12) é uma rã de grande porte,
conhecida como rã-pimenta, é generalista quanto à utilização de hábitat e adapta-se facilmente
aos ambientes antropizados, sendo o seu status de conservação definido como de menor
preocupação pela IUCN (Heyer et al., 2004). Ocorre nos cerrados e caatingas do Brasil
central e no sudeste, costa da Venezuela, leste do Paraguai, Bolívia e norte da Argentina. Sua
pele e carne apresentam potencial econômico (Gordo & Campos, 2005; Frost, 2007).
Apresenta uma dieta do tipo oportunista caracterizada principalmente por artrópodes,
existindo relatos de prática batracofágica na espécie (Rodrigues & Ferreira, 2004; Shepard &
Caldwell, 2005). A maioria dos adultos da espécie apresenta a barriga no padrão labirintina,
semelhante ao desenho de um labirinto (Heyer, 2005).
Figura 12. Exemplar de Leptodactylus labyrinthicus (Foto de R. J. Sawaya).
A espécie L. labyrinthicus possui um longo período de acasalamento associado às
chuvas. Os machos costumam vocalizar às margens de corpos de água permanentes ou
temporários, iniciando ao entardecer. Os ovos dessa espécie são encontrados em ninhos de
espuma às margens de poças temporárias protegidas pela vegetação. Uma média de 6,5% dos
ovos presentes no ninho é fertilizada, sendo o restante possivelmente usado como alimento
pelos girinos, caso a água das chuvas não os carregue para corpos de água maiores com
alimentação (Zina & Haddad, 2005).
34
35
2. Justificativa
A pele dos anfíbios é fonte de uma grande quantidade de moléculas bioativas,
produzidas pelas células sinciciais das paredes das glândulas serosas ou granulosas do
tegumento (Erspamer, 1994). O tegumento dos anfíbios e o seu veneno vêm sendo utilizados
desde longa data para o tratamento de doenças e em rituais místicos, principalmente pela
população da região norte do Brasil. O veneno destes animais faz parte da sua imunidade
inata, atuando como primeira linha de defesa contra microorganismos. Durante a evolução
dos anfíbios, este mecanismo de defesa evoluiu independentemente em cada espécie, como
resultado da interação com os seus respectivos ambientes (Toledo & Jared, 1995). Assim, a
composição do veneno varia de acordo com a espécie, podendo ser utilizada na elucidação de
questões taxonômicas (Zheng et al., 2005).
Estudos ao longo dos anos revelaram diversas funções para os peptídeos encontrados
na secreção cutânea destes animais, dentre elas estão: antimicrobiana, antitumoral, antiviral,
contraceptiva e antiparasitária. Entretanto, os peptídeos que possuem atividade antimicrobiana
(não excluindo as outras funções) são os mais procurados devido à crescente resistência aos
antibióticos convencionais e a necessidade de novos antibióticos para a terapia humana
(Zasloff, 2002). Potenciais peptídeos antimicrobianos devem apresentar uma toxicidade
seletiva, rápida ação, amplo espectro antimicrobiano e não selecionar mecanismos de
resistência nos microorganismos (Matsuzaki, 1999). E é exatamente o que acontece com os
peptídeos antimicrobianos isolados da secreção cutânea de anuros, eles são bastante diferentes
dos antibióticos usados na terapêutica atual, tanto na sua estrutura quanto no mecanismo de
ação (Schröder, 1999).
Um dos mais fascinantes aspectos dos peptídeos bioativos de anfíbios é que a
maioria deles possui mais de uma atividade biológica. Por exemplo, muitos peptídeos
antibióticos de amplo espectro também exibem atividade anticâncer, o que sugere o mesmo
mecanismo de ação contra bactérias e células tumorais (Pukala et al., 2006). O uso de
peptídeos no tratamento do câncer está ganhando cada vez mais força, principalmente, devido
aos efeitos colaterais provocados pelos quimioterápicos tradicionais e pelo surgimento de
resistência a drogas pelas diversas linhagens celulares de câncer. A estratégia de usar
peptídeos para combater o câncer apresenta inúmeras vantagens, tais como, elevada
especificidade, baixa toxicidade, boa penetrabilidade nos tecidos, ação rápida, ausência de
surgimento de resistência pelas células, sinergismo com quimioterápicos clássicos, amplo
36
espectro de atividade e destruição de tumores primários, além de prevenção de metástase
(Bhutia & Maiti, 2008; Hoskin & Ramamoorthy, 2008).
A maioria dos esforços farmacêuticos é para o desenvolvimento de agentes tópicos,
por exemplo, o pexiganan, análogo de magainin, principalmente devido à segurança do uso
tópico e da falta de conhecimento sobre os efeitos toxicológicos do uso sistêmico prolongado
(Zasloff, 2002). Entretanto, outros problemas dificultam o uso terapêutico dos peptídeos, por
exemplo, a instabilidade no soro e a produção em larga escala. O primeiro problema tem sido
contornado usando inibidores de proteases juntamente com os peptídeos ou modificando a
seqüência de aminoácidos, impedindo a identificação pelas proteases. Já a produção em larga
escala está sendo solucionada pela tecnologia da síntese recombinante (Reddy et al., 2004).
Inúmeras outras estratégias estão sendo desenvolvidas para otimizar a ação desses peptídeos
(Shadidi & Sioud, 2003).
As secreções cutâneas de leptodactilídeos têm sido alvo de intensos estudos
realizados pelo grupo da Profa. Mariana S. Castro e, em particular, da secreção de
L. labyrinthicus já foram isolados e caracterizados quimicamente quatro peptídeos com
prováveis efeitos citolíticos. A presente dissertação de mestrado deu continuidade aos estudos
envolvendo tais peptídeos avançando na caracterização biológica de tais moléculas.
Em contrapartida aos inúmeros estudos acerca de peptídeos bioativos, poucos
estudos sobre o processamente de tais peptídeos na secreção cutânea dos anfíbios foram
realizados. Sabe-se que os peptídeos da secreção cutânea são sintetizados na forma de
pró-peptídeos que são ativados pela clivagem de enzimas proteolíticas, todavia, praticamente
nada se sabe sobre essas e outras enzimas presentes no veneno de anfíbios (Conceição et al.,
2007).
Além das peptidases, outro grupo enzimático presente na secreção cutânea de anuros
é o das fosfolipases tipo 2 (PLA
2
). As PLA
2
da peçonha de serpentes e de mamíferos são
bastante estudadas, contudo, apenas em 2000 foi publicado o primeiro trabalho de uma PLA
2
isolada do veneno de um anfíbio (Rana rugosa), a qual possui atividade inibitória contra os
receptores de adenosina A1, adenosina A2 e muscarínicos (Baek et al., 2000).
As PLA
2
e as peptidases participam de uma variada gama de processos celulares,
atuando tanto beneficamente para a homeostase do indivíduo, quanto em processos
patológicos. O conhecimento de todas as vias de participação destas enzimas ainda está longe
de ser atingido, porém é de suma importância, pois podem ser alvos de manipulação no
37
tratamento terapêutico. O estudo dessas enzimas presentes na secreção cutânea dos anfíbios
pode ajudar a atingir essa meta.
O Brasil possui uma extensa fauna de anfíbios, mas poucas espécies foram
estudadas. Estudos como estes também são importantes por agregarem valor à espécie,
auxiliando na conservação desse grupo taxonômico, o qual se encontra em vertiginoso
declínio populacional (Blaustein & Johnson, 2003; Rachowicz et al., 2005). Felizmente,
graças ao advento de novos métodos e tecnologias, atualmente, uma pequena quantidade de
material é suficiente para a caracterização química e farmacológica, evitando assim que
populações inteiras sejam dizimadas, levando finalmente a descoberta de novos agentes que
terão um grande impacto na biomedicina e na elucidação do papel desses compostos nas
interações biológicas no nosso planeta (Daly, 2003; Schwartz et al., 2007).
38
3. Objetivos
3.1. Objetivos Gerais
Identificar a composição peptídica/protéica da secreção cutânea de L. labyrinthicus,
buscando verificar a presença de diferentes atividades biológicas e caracterizando as
macromoléculas responsáveis por tais funções.
3.2. Objetivos específicos
1. Caracterizar o proteoma da secreção cutânea de L. labyrinthicus via RP-HPLC,
espectrometria de massa e perfil protéico em SDS-PAGE unidimensional;
2. Avaliar as atividades antimicrobiana, hemolítica, antitumoral e enzimáticas da
secreção cutânea de L. labyrinthicus;
3. Obter as concentrações determinantes de MIC para as bactérias testadas, HC
50
e o IC
50
para distintas linhagens celulares de câncer e de células normais;
4. Sugerir possíveis mecanismos de ação do peptídeo anticâncer testado contra
células da linhagem MCF-7;
5. Determinar as melhores condições de atividade das enzimas proteolíticas;
6. Sugerir em que grupos de peptidases essas enzimas estão inseridas.
39
4. Materiais e Métodos
4.1. Reagentes químicos
Apenas reagentes de grau analítico provenientes de diferentes fontes comerciais
foram utilizados nos experimentos. Todas as soluções foram preparadas com água Milli-Q
(Millipore Reagent Water System, USA).
4.2. Obtenção da secreção cutânea
Adultos de ambos os sexos da rã-pimenta Leptodactylus labyrinthicus foram
coletados em agosto de 2006 na região de Luziânia-GO e mantidos em cativeiro no
Laboratório de Toxinologia da Universidade de Brasília. A secreção cutânea foi obtida por
estimulação elétrica moderada de corrente contínua de até 150 V e de baixa amperagem.
Os animais foram lavados com água Milli-Q, sendo o material obtido coletado em um béquer,
congelado e imediatamente liofilizado. A amostra seca foi aliqüotada em frações de 5 mg e
armazenada a −20
o
C até o seu uso. Nenhum animal foi sacrificado durante os experimentos,
reassumindo seu comportamento normal após a estimulação.
4.3. Cromatografia líquida de alta eficiência - fase reversa (RP-HPLC)
4.3.1. Fracionamento da secreção bruta
Alíquotas (5 mg) da secreção bruta de L. labyrinthicus liofilizada foram
ressuspendidas em 230 μL de 0,1% (v/v) de TFA/água e centrifugadas por 10 min a 15.887 g.
O sobrenadante obtido foi aplicado em uma coluna analítica C
18
de fase reversa (Vydac
218TP54, 4,6 x 250 mm) e a eluição foi realizada empregando-se fluxo de 1 mL/min.
Primeiramente, a coluna foi equilibrada com 0,1% (v/v) de TFA/água (solvente A) e, em
seguida, foi aplicado gradiente linear de 0–60% por 60 min e de 60–100% de acetonitrila
contendo 0,1% de TFA (solvente B) por 5 min, seguido de uma lavagem de 5 min com 100%
de solvente B. A absorvância foi monitorada a 216 nm e as frações foram manualmente
coletadas, secadas a vácuo e armazenadas a −20°C.
4.3.2. Purificação dos peptídeos
Os peptídeos de interesse foram recromatografados e acumulados por meio de
RP-HPLC em coluna C
18
Vydac (218TP54, 4,6 x 250 mm) ou de sílica monolítica Onyx
(CHO-7643, 4,6 x 100 mm). Ambas as colunas foram equilibradas com solvente A. O
40
gradiente utilizado variou de acordo com o tempo de retenção da amostra. A eluição realizou-
se com fluxo de 1 mL/min e detecção UV a 216 nm. Os peptídeos purificados foram
coletados, secados a vácuo e utilizados nos experimentos subseqüentes.
4.4. Espectrometria de massa
A espectrometria de massa (MS) determina as massas moleculares de compostos
químicos por meio da separação dos íons moleculares de acordo com sua relação massa-carga
(m/z) (Cunha et al., 2007).
Neste trabalho, todas as frações peptídicas foram caracterizadas com relação a sua
composição peptídica/protéica por meio da determinação das massas moleculares
experimentais das frações cromatográficas em espectrômetro de massa do tipo
MALDI-TOF/TOF Autoflex II (Bruker Daltonics, Bremen, Germany).
As frações foram dissolvidas em 0,1% (v/v) de TFA/água e 1 μL de cada fração
aplicado em placa de aço inoxidável juntamente com 1 μL da matriz reconstituída de ácido
α-ciano-4-hidroxicinâmico (HCCA 20 µg/µL) ou ácido 3,5-dimetoxi-4-hidroxicinâmico
(ácido sinapínico - AS 20 µg/µL) ressuspendidas em 50% (v/v) acetonitrila/0,1% (v/v) TFA.
Dois tipos de análises foram realizadas com cada fração cromatográfica plaqueada: modo
refletor de íons positivos e linear. O procedimento realizado no modo refletor utilizou a
solução Peptide Mix (Brucker Daltonics) para a calibração e matriz HCCA, sendo a faixa m/z
analisada de 500 a 4000 Da. Já os espectros de massa de 4 kDa a 20 kDa Da foram calibrados
com citocromo C e a matriz usada foi o AS.
Os peptídeos recromatografados foram submetidos ao mesmo procedimento descrito
acima para a verificação do grau de pureza antes da realização dos ensaios de atividade
biológica.
4.5. Determinação da presença de amidação C-terminal
A amidação da porção C-terminal dos peptídeos estudados foi confirmada por meio
de análise em espectrômetro de massa dos peptídeos nativos e metilados seguindo-se o
protocolo de Esterificação de Fisher (Hunt et al., 1986). Alíquotas de cada peptídeo foram
dissolvidas em 20 µL de reagente HCl metanólico (10 µL de cloreto de acetila em 250 µL de
metanol anidro) e incubadas por 30 min à temperatura ambiente. Em seguida, o solvente foi
removido por liofilização e os peptídeos metilados reconstituídos em 20 µL de 0,1% (v/v)
TFA em 50% (v/v) acetonitrila para análise por MALDI-TOF MS como descrito na sessão
41
anterior. Nesse experimento, os resíduos ácidos presentes nos peptídeos são metilados
juntamente com a porção C-terminal livre.
4.6. Bioinformática
Os seguintes programas foram utilizados: (1) Expasy pI/Mw tool
(http://www.expasy.ch/tools/pi_tool.html), para cálculo da massa molecular teórica; (2)
BLAST 2 (Altschul et al., 1997 - http://au.exspasy.org/tools/blast/), para busca de
similaridades no UnitProt Knowledgebase; (3) Clustal W (Thompson et al., 1994 -
http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/index.html), para alinhamento de múltiplas seqüências;
(4) http://cti.itc.virginia.edu/~cmg/Demo/wheel/wheelApp.html, para a construção das
projeções em hélice dos peptídeos; (5) Peptide property calculator
(http://www.innovagen.se/custom-peptide-synthesis/peptide-propertycalculator/peptide-
property-calculator.asp), para cálculo do ponto isoelétrico (pI); (6) HydroMCalc
(http://www.bbcm.univ.trieste.it/~tossi/HydroCalc/HydroMCalc.html#Description), para
cálculo da hidrofobicidade e do momento hidrofóbico médio de acordo com a escala de
Eisenberg (1982); (7) SOPMA algorithm (http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-
bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html), para a predição da estrutura secundária; (8)
PAUP 4.0 (Swofford, 1993) para análises filogenéticas por parsimônia e de similaridade por
neighbor-joining, bootstrap 50% majority-rule com 1000 réplicas.
4.7. Ensaio hemolítico
O ensaio hemolítico utilizado foi modificado do protocolo descrito por Onuma et al.
(1999). Eritrócitos de sangue humano O
+
,
obtidos no HEMOCENTRO de Brasília, foram
separados do plasma por sedimentação e lavados três vezes com tampão Tris-HCL 0,01 M pH
7,4 contendo NaCl 0,15 M e CaCl
2
0,01 M. Utilizou-se o mesmo tampão para solubilizar as
amostras e preparar uma solução 1% (v/v) de hemáceas. As amostras ressuspendidas em
100 μL de tampão foram incubadas por 60 min à temperatura ambiente com 100 μL da
suspensão de eritrócitos. Após esse período, os tubos foram centrifugados a 729 g por 2 min.
Uma alíquota de 100 μL de cada sobrenadante foi transferida para uma placa de 96 poços de
fundo chato (Nunc, Denmark) e a leitura da absorvância realizada a 405 nm (BioRad 3550-
UV). Para as amostras de referência utilizaram-se 100 μL da suspensão de eritrócitos 1% (v/v)
incubada com 100 μL de Triton X-100 1% (v/v) como referência de 100% de lise e 100 μL da
suspensão de eritrócitos 1% (v/v) com tampão salino como referência de 0% de hemólise.
42
4.7.1. Ensaio preliminar
A fim de verificar quais componentes da secreção cutânea de L. labyrinthicus
apresentariam atividade hemolítica, cada fração cromatográfica de uma corrida de RP-HPLC
foi solubilizada em tampão e incubada com a suspensão de hemáceas de acordo com o
método descrito acima.
4.7.2. Determinação da HC
50
Para a determinação da concentração capaz de promover 50% de hemólise (HC
50
), os
peptídeos de interesse purificados foram diluídos serialmente a partir de uma solução estoque
de 128 µM e incubados com a solução de eritrócitos como descrito anteriormente. O ensaio
foi realizado em triplicata. O valor de HC
50
foi obtido após ajuste por regressão logarítmica.
4.8. Ensaio antimicrobiano
Linhagens referenciais de bactérias, obtidas do Banco de Culturas Tropicais da
Fundação André Tosello (Campinas, SP), foram cultivadas em 5 mL de meio Mueller-Hinton
contendo 10 mM de CaCl
2
sob agitação a 37°C até a densidade óptica igual a 1 a 595 nm.
As bactérias, em fase logarítimica, foram diluídas no mesmo meio de cultura nas proporções
1:50 para as Gram-negativas e 1:100 para as Gram-positivas. Uma alíquota de 50 μL de cada
cultura bacteriana (contendo 2 a 5 x 10
5
CFUs) foi incubada por 22 h a 37°C com 50 μL de
amostra ressuspendida em água Milli-Q estéril. Os controles para ausência de crescimento e
crescimento pleno foram, respectivamente, formaldeído 0,4% (v/v) e água Milli-Q estéril,
ambos incubados com as suspensões bacterianas. A inibição do crescimento foi determinada
pela leitura da densidade óptica a 595 nm com uma leitora de placas BioRad (Modelo
3550-UV, Hercules, CA, USA).
4.8.1. Ensaio preliminar
Para verificar a presença de frações peptídicas ativas contra microorganismos, foi
realizado um ensaio antimicrobiano inicial em placa multi-poços (Nunc F96, Denmark) contra
as bactérias patogênicas Gram-negativas Escherichia coli (ATCC 25922) e Pseudomonas
aeruginosa (ATCC 27853), e a Gram-positiva Staphylococcus aureus (ATCC 25923).
Cada fração cromatográfica de uma mesma corrida de RP-HPLC foi solubilizada em água
Milli-Q e incubada com a suspensão bacteriana, de acordo com o método descrito acima.
43
Após 22 h de incubação a 37°C, as placas foram analisadas em 595 nm por meio da leitora de
placa da BioRad (Modelo 3550-UV, Hercules, CA, USA).
4.8.2 Determinação de MIC
Os peptídeos que apresentaram atividade antimicrobiana no ensaio preliminar ou
que se apresentavam em grande quantidade foram acumulados para a determinação da
concentração inibitória mínima (MIC), ou seja, a menor concentração onde nenhum
crescimento é detectado por meio de leitura espectrofotométrica. Foram realizadas
determinações de MIC para as bactérias Escherichia coli (ATCC 25922), Pseudomonas
aeruginosa (ATCC 27853), Staphylococcus aureus (ATCC 25923) e Bacillus subtilis (ATCC
19659). Alíquotas de 50 μL de diluições seriadas de cada peptídeo puro, feitas a partir de uma
solução-estoque de 256 μM esterilizada por filtração em filtro Millex GV 0,22 μm, foram
incubadas com 50 μL de suspensão bacteriana, contendo de 2 a 7 x 10
5
CFUs, dependendo da
linhagem bacteriana utlizada. Após a incubação por um período de 22 h a 37°C, as placas
foram analisadas a 595 nm, em leitora BioRad (Modelo 3550-UV, Hercules, CA, USA). Os
ensaios foram realizados em triplicata.
4.9. Síntese Química
O peptídeo pentadactylin usado nos ensaios para inferência sobre o mecanismo de
ação da atividade anticarcinogênica foi obtido por meio da síntese química manual, segundo o
protocolo de Atherton & Sheppard (1989) pelo Prof. Eduardo Cilli (UNESP- Araraquara).
Utilizaram-se os seguintes grupos de proteção da cadeia lateral: Boc (t-butoxicarbonil) para
K; tBut (t-butil) para D, T e E e Pmc (2,2,5,7,8 pentametil-chromane-6-sulfonil) para Q e N.
Cada ciclo de síntese consistiu na desproteção de Na-Fmoc com piperidina/dimetilformamida
20% (v/v) durante 20 min, seguido por lavagem com diclorometano e dimetilformamida e
acoplamento ao próximo resíduo. Ao final da síntese, a clivagem do peptídeo foi realizada em
um coquetel contendo água ultra-pura 5% (v/v); fenol 5% (v/v); 1,2 etanoditiol 2,5% (v/v) e
tioanisol 5% (v/v) em TFA, por 2 h, sob agitação. O peptídeo foi então precipitado com éter
etílico gelado e filtrado em placa porosa juntamente com a resina. O peptídeo, retido na placa,
foi dissolvido em solução aquosa de ácido acético 10% (v/v) e separado da resina por
filtração. O filtrado foi liofilizado, solubilizado em TFA 0,045% (v/v) em água (solvente A) e
purificado por RP-HPLC, utilizando-se coluna semi-preparativa (Beckman C
18
1 cm x 25
cm), gradiente linear de 10 a 40% de TFA 0,036% (v/v) em acetonitrila (solvente B) durante
44
90 min, detecção em 220 nm e fluxo de 5 mL/min. As impurezas derivadas do processo de
síntese foram retiradas por meio de RP-HPLC em coluna C
18
(Vydac 218TP54, 4.6 X 250
mm). A identidade do peptídeo sintético foi confirmada por espectrometria de massa do tipo
MALDI-TOF/TOF (Bruker, Autoflex II).
4.10. Linhagens Celulares
A linhagem celular derivada de câncer de mama utilizada no estudo foi a MCF-7 e a
derivada de câncer cervical foi a HeLa. Ambas de origem humana foram obtidas do banco de
células American Type Culture Collection (ATCC). A linhagem MCF-7 apresenta como
principais características: crescer de forma aderente ao substrato, ser responsiva à presença de
estrógeno e não possuir caspase 3 (Levenson & Jordan, 1997; Burow et al., 1998).
A linhagem celular HeLa apresenta um crescimento aderente e morfologia epitelial. Estudos
reportam que células de HeLa contêm seqüências do papiloma vírus humano (HPV-18).
A linhagem celular de melanoma murino B16F10 também foi utilizada nos ensaios.
A linhagem B16F10 apresenta uma elevada característica metastásica, baixa imunogenicidade
e moderada virulência (Rodrigues et al., 2008).
Devido ao conhecimento bem estabelecido de suas características morfológicas,
bioquímicas e moleculares, essas linhagens têm servido como os modelos celulares mais
utilizados na pesquisa de câncer, tanto no estudo de efeitos de compostos anticarcinogênicos
quanto na elucidação dos mecanismos de ação dos mesmos.
A linhagem de fibroblastos normais humanos (FHN) utilizada no presente trabalho
foi gentilmente cedida pelo Prof. Dr. Rui Curi do Departamento de Fisiologia e Biofísica
(ICB) da Universidade de São Paulo (USP). É uma linhagem imortalizada que cresce de
forma aderente ao substrato e apresenta morfologia fusiforme.
Todos os ensaios de atividade anticarcinogênica foram realizados no Laboratório de
Morfologia e Morfogênese da Universidade de Brasília.
4.11. Manutenção da cultura de células
Todos os procedimentos foram realizados com materiais rigorosamente esterilizados
e em câmara de fluxo laminar, cuja luz ultra-violeta permaneceu ligada de 30 a 40 minutos
antes do uso.
Alíquotas de células de câncer e fibroblastos foram removidas de um estoque em
nitrogênio líquido e descongeladas rapidamente a 37
o
C. Alíquotas de 500 µL foram
45
lentamente adicionados em 3 mL de meio de cultura DMEM completo (tamponado com
bicarbonato de sódio, suplementado com 10% de soro fetal bovino e 1% de antibiótico).
Esse meio de cultura foi utilizado em todos os outros procedimentos experimentais. Em
seguida, as células foram centrifugadas a 750 g por 5 minutos, ressuspensas em 5 mL de meio
de cultura DMEM, transferidas para um frasco de cultura de células e incubadas em estufa a
37
o
C e 5% de CO
2
.
Para assegurar a qualidade das células a serem utilizadas nos experimentos, a cada
48 horas o meio de cultura foi substituído por um meio de cultura novo. A cultura de células
foi observada em microscópio de luz invertido e monitorada quanto ao crescimento celular,
aspectos morfológicos e presença de contaminantes.
Ao atingir o estágio de confluência (elevada densidade de células em uma
determinada área), as células foram removidas do frasco de cultura e re-cultivadas em uma
densidade menor seguindo o procedimento descrito a seguir. O meio de cultura foi descartado
e 2 mL de solução de tripsina-EDTA foram adicionados ao frasco de cultura para a remoção
da monocamada de células. Após 2 minutos de incubação em estufa a 37
o
C, a remoção das
células foi observada em microscópio de luz invertido. Em seguida, foram acrescentados
2 mL de meio de cultura para inativar a atividade da tripsina. A suspensão de células foi
centrifugada a 750 g por 5 minutos. O sobrenadante foi removido e as células ressuspensas
em meio de cultura. Aproximadamente, 10% das células foram re-cultivadas em frascos de
cultura e incubadas em estufa a 37
o
C e 5% de CO
2
. O restante foi utilizado em experimentos
ou recebeu a adição de hipoclorito de sódio e detergente e, após 24 horas, foram descartados.
Após o término dos experimentos, as células de câncer e fibroblastos foram
congeladas de acordo com o procedimento descrito a seguir. No estágio de confluência, as
células foram removidas dos frascos de cultura e centrifugadas (como descrito acima). Após o
descarte do meio de cultura, as células foram ressuspensas em meio de congelamento
(DMEM, 20% soro fetal bovino, 1% de antibiótico, 5% de DMSO). A suspensão celular foi
rapidamente transferida para criotubos, os quais foram identificados e envolvidos por uma
espessa camada de papel toalha e mantidos a −80
o
C por 24 horas. Em seguida, os criotubos
foram estocados imersos em nitrogênio líquido.
4.12. Tratamento das células com os peptídeos de Leptodactylus labytinthicus
Ao atingir o estágio de confluência, as células de câncer ou fibroblastos normais
foram removidas do frasco de cultura e centrifugadas como descrito anteriormente. O
sobrenadante foi descartado e as células ressuspensas em 1 mL de meio de cultura. Para a
determinação do número de células, 10 µL da suspensão de células foi adicionado a 40 µL de
solução de azul tripan (0,4% diluídos em PBS, p/v). Uma alíquota de 8 µL dessa mistura foi
depositada gentilmente em uma câmara de Neubauer, onde células presentes nos quatro
quadrantes maiores laterais foram contadas em microscópio de luz. O número de células foi
determinado pela seguinte fórmula:
Número de células/ mL = Número de células contadas x fator de diluição (=5) x 10
4
Numero de quadrantes contados (=4)
As células contadas foram transferidas para placas de cultura e incubadas em estufa
a 37
o
C e 5% de CO
2
por 12 a 16 horas para a completa adesão das células no fundo da placa.
As células foram transferidas para placas de tamanhos diferentes dependendo do experimento
a ser realizado. Placas de 96 poços foram utilizadas para ensaios de viabilidade celular por
MTT (ver descrição abaixo) com concentração inicial de 5 x 10
3
células/poço. Placas de
12 poços foram utilizadas no restante dos experimentos com concentração inicial de 5 x 10
4
células/poço.
Após o período de incubação na estufa, as placas de cultura foram observadas em
microscópio de luz invertido para a avaliação da morfologia, dispersão das células pela placa
e presença de contaminação. Essa análise foi realizada para decidir se as células estavam
homogeneamente dispersas e saudáveis para serem submetidas aos ensaios com os peptídeos.
O meio de cultura contendo os peptídeos de interesse foi preparado a partir da
diluição seriada das soluções estoque dessas moléculas (512 µM) em meio de cultura. As
doses utilizadas nos experimentos variaram a partir de 128 µM para o ensaio de viabilidade
celular MTT; e para os ensaios de mecanismo de ação utilizou-se a dose calculada para o IC
50
.
O meio de cultura do grupo controle (ausência dos peptídeos) continha apenas água nanopura
na mesma proporção que foi adicionada aos outros grupos experimentais.
O meio de cultura das placas foi substituído pelo que continha os peptídeos. As
placas foram incubadas em estufa a 37
o
C e 5% de CO
2
por 24 horas. Após o período de
incubação, as células foram preparadas de maneira adequada para a realização dos testes.
Todos os experimentos foram realizados em triplicata.
46
47
4.13. Análise de efeitos citostáticos
Esses testes têm como objetivo avaliar se o peptídeo pentadactylin induz efeitos
relacionados ao bloqueio da proliferação e do ciclo celular. Tal avaliação é importante,
considerando que a proliferação celular descontrolada é uma das principais características do
câncer. Além disso, moléculas indutoras de efeitos citostáticos em células tumorais são
promissoras para tratamentos terapêuticos dessa doença.
4.13.1. Ciclo Celular
A identificação das fases do ciclo celular foi realizada de acordo com protocolo
descrito por Peres e Curi (2005). Após o tratamento com 49 µM de pentadactylin sintético,
células de MCF-7 ressuspensas em 100 µL de meio de cultura (ver item 4.12) foram
incubadas em 200 µL de tampão de lise (0,1% de citrato de sódio, 0,1% Triton X-100 e
20 µg/mL de iodeto de propídio diluído em PBS, pH 7,4) por 30 minutos em temperatura
ambiente. As amostras foram protegidas da luz durante o tempo de incubação. Em seguida,
essa suspensão foi avaliada em citômetro de fluxo no canal FL2-A (sensível a detecções na
faixa de 560 e 580 nm) para a identificação das fases do ciclo celular. Os dados obtidos foram
analisados com o programa CellQuest 3.0.1 (Becton & Dickinson, EUA). O cálculo da
proporção de células em cada uma das fases do ciclo celular foi realizado considerando-se
apenas as células com DNA não fragmentado. A significância das proporções das médias das
triplicatas foi analisada por teste t. Foi considerado estatisticamente significativo p<0,05.
4.14. Análise de efeitos citotóxicos
Esses testes tiveram como objetivo avaliar se o PAM pentadactylin induz efeitos em
estruturas celulares vitais levando a morte celular. Tal avaliação foi feita em diversas
estruturas celulares visando observar diferentes aspectos dos efeitos dessa molécula nas
células. Essas observações forneceram pistas valiosas sobre os possíveis mecanismos de ação
do peptídeo estudado. Considerando que a indução de morte celular é uma das principais
estratégias utilizadas em tratamentos contra o câncer, a identificação de novas moléculas com
tais efeitos é potencialmente promissora.
4.14.1. Viabilidade Celular (MTT)
A viabilidade celular foi avaliada pelo método de MTT estabelecido por Mosmann
(1983). Esse é um dos métodos colorimétricos mais utilizados em testes preliminares para
48
identificar e determinar as concentrações ativas de novas moléculas anticarcinogênicas. Em
células metabolicamente viáveis, enzimas mitocondriais, como a succinil-desidrogenase,
reduzem o substrato MTT (3(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)
formando formazan, um produto de cor azulada. Dessa forma, a quantificação da produção de
formazan por células submetidas a determinado tratamento está correlacionada com sua
viabilidade.
As células tumorais (MCF-7, HeLa e B16F10) e normais (FHN) foram cultivadas e
tratadas com os peptídeos PGL-Ll, fallaxin e pentadactylin em placas de 96 poços como
descrito no item acima. Após o período de incubação, o meio de cultura das placas foi
removido e 150 µL de solução de uso de MTT (15 µL de MTT 5mg/mL diluídos em 135 µL
de DMEM completo) foram adicionados em cada poço. As células foram incubadas por
3 horas em estufa a 37
o
C e 5% de CO
2
. Em seguida, o meio de cultura foi removido e 100 µL
de DMSO foram adicionados em cada poço para dissolver o formazan formado.
A quantificação do formazan foi feita pela medida da absorvância dos poços no comprimento
de onda de 595 nm em espectrofotômetro conjugado a uma leitora de microplacas (BioRad
3550-UV).
A viabilidade celular foi determinada pela média da triplicata de cada concentração
testada. A concentração inibitória mínima (IC
50
) representa a concentração em que a
viabilidade celular foi reduzida em 50% e foi calculada utilizando-se o software Graph Pad
Prism 5.
4.14.2. Fragmentação de DNA
A determinação da fragmentação de DNA foi realizada de acordo com protocolo já
descrito (PERES et al., 2005). Após o tratamento com 49 µM de pentadactylin sintético,
células de MCF-7 ressuspensas em 100 µL de meio de cultura (ver item 4.12) foram
incubadas em 200 µL de tampão de lise (0,1% de citrato de sódio, 0,1% Triton X-100 e
20 µg/mL de iodeto de propídio diluído em PBS, pH 7,4) por 30 minutos em temperatura
ambiente. As amostras foram protegidas da luz durante o tempo de incubação. Em seguida,
essa suspensão foi avaliada em citômetro de fluxo no canal FL2-H (sensível a detecções na
faixa de 560 e 580 nm). Os dados obtidos foram analisados no programa CellQuest 3.0.1
(Becton & Dickinson, EUA). A significância das proporções das médias das triplicatas foi
analisada por teste t. Foi considerado estatisticamente significativo p<0,05.
49
4.14.3. Potencial de Membrana Mitocondrial
A rodamina 123 é uma molécula fluorescente catiônica permeável à membrana
plasmática e rapidamente seqüestrada por mitocôndrias com potencial de membrana
normalizado. Alterações no potencial de membrana da mitocôndria desencadeiam um efluxo
da rodamina 123 da mitocôndria (Chen et al., 1982). Muitos grupos de pesquisa vêm
utilizando esse composto para analisar alterações no potencial de membrana mitocondrial de
células tratadas com compostos citotóxicos (Peres et al., 2005).
No presente estudo, a determinação do potencial de membrana mitocondrial foi
realizada de acordo com protocolo já descrito (Peres et al., 2005). Após o tratamento com
49 µM de pentadactylin sintético, células de MCF-7 ressuspensas em 100 µL de meio de
cultura (ver item 4.12) foram lavadas com 500 µL de PBS. Em seguida, as células foram
ressuspensas em 500 µL de PBS e incubadas no escuro com 0,5 µL de solução de rodamina
123 (5 mg/mL diluídos em etanol) por 15 minutos à temperatura ambiente. Após a incubação,
as células foram lavadas 2 vezes com PBS. Por fim, elas foram incubadas com 300 µL de
PBS por 30 minutos (temperatura ambiente e no escuro) e avaliadas em citômetro de fluxo no
canal FL1-H (sensível a detecções na faixa de 515 a 530 nm). Os dados obtidos foram
analisados no programa CellQuest 3.0.1 (Becton & Dickinson, EUA). Todas as etapas de
lavagem foram seguidas por centrifugação (750 g por 3 minutos) e descarte do sobrenadante.
A significância das proporções das médias das triplicatas foi analisada por teste t. Foi
considerado estatisticamente significativo p<0,05.
4.14.4. Integridade da Membrana Plasmática
A integridade da membrana plasmática foi avaliada pelo método de exclusão do azul
de tripan. Em células viáveis, esse corante penetra pela membrana plasmática, mas é
rapidamente externalizado. Já em células que apresentam a membrana plasmática
comprometida, o azul de tripan não sai da célula, a qual permanece corada de azul (Freshney,
2000).
Após tratamento com 49 µM de pentadactylin sintético, as células de MCF-7 foram
ressuspensas em 100 µL de meio de cultura (ver item 4.12). Uma alíquota de 10 µL dessa
suspensão foi adicionada a 20 µL de solução de azul tripan, sendo que 8 µL dessa mistura
foram lentamente depositados em câmara de Neubauer. As células foram contadas
diferencialmente, sendo que células brancas foram consideradas com a membrana plasmática
íntegra e células coradas de azul com a membrana plasmática danificada. Em seguida, a
50
proporção de células coradas em azul em relação ao número total de células foi determinada.
A significância das proporções das médias das triplicatas foi analisada por teste t. Foi
considerado estatisticamente significativo p<0,05.
4.14.5. Morfologia Celular
A morfologia celular é um importante indicativo de viabilidade. Alterações severas
desencadeadas por agentes citotóxicos geralmente culminam na modificação da morfologia
celular. A microscopia de contraste de fase consiste na passagem da luz do microscópio por
um anel de contraste, que atinge a amostra e produz um efeito de destaque, onde estruturas
claras ficam mais claras e estruturas escuras ficam mais escuras. Dessa forma é possível
observar e analisar rapidamente a morfologia de células imersas em meio de cultura sem
utilização de fixadores ou corantes.
No presente trabalho, após o período de tratamento (ver item 4.12), as placas de
cultura foram observadas em microscópio de contraste de fase invertido (UNICO, EUA) para
análise de possíveis alterações morfológicas. A aquisição das imagens foi realizada com o uso
de câmera digital acoplada a ocular do microscópio e o software de aquisição Scope (versão
1.0.0.0, 2003).
4.15. Quantificação protéica
A fim de determinar a concentração protéica das alíquotas que seriam utilizadas nos
ensaios proteolíticos e de atividade fosfolipásica, foi realizada a quantificação do conteúdo
protéico da secreção cutânea de L. labyrinthicus por meio do microensaio de Bradford, com
curva de calibração construída a partir de diluições de albumina sérica bovina
(solução-estoque 2 μg/μL). Esse é um método rápido e acurado de estimar a concentração
protéica de uma amostra, o qual se baseia na ligação do corante Coomassie blue G250 às
proteínas (Kruger, 2002). A quantificação de peptídeos puros para a realização dos ensaios
antimicrobianos, hemolíticos e antitumorais foi realizada por pesagem em microbalança.
4.16. Eletroforese em Gel Desnaturante de Poliacrilamida 12% (SDS-PAGE)
O protocolo de SDS-PAGE foi uma das ferramentas mais úteis desenvolvidas na
área da biologia molecular. A separação de proteínas e peptídeos por esse método torna
possível a quantificação do total de uma determinada proteína/peptídeo e a determinação
51
aproximada de sua massa molecular. Esse gel em tampão de corrida do tipo glicina resolve
proteínas entre 3-200 kDa (Judd, 2002).
O gel de poliacrilamida 12% foi preparado entre placas de vidro utilizando o sistema
de eletroforese da Hoefer. O gel separador foi feito em um volume de 16 mL, sendo composto
por 5,44 mL de água Milli-Q, 40% de acrilamida/bisacrilamida (PlusOne), 25% de Tris-HCl
1,5 M pH 8,8, 1% de SDS 10% (p/v), 1% de PSA 10% (p/v) e 0,04% (v/v) de TEMED. O gel
concentrador foi preparado em um volume de 5 mL e polimerizado sobre o separador entre as
placas de vidro juntamente com o pente. O concentrador foi constituído de 2,8 mL de água
Milli-Q, 12,6% de acrilamida/bisacrilamida, 25% de Tris-HCl 0,5 M pH 6,8, 1% de SDS 10%
(p/v), 5% de PSA 10% (p/v) e 0,08% (v/v) de TEMED (Santos, 2007).
Após a polimerização, 15 e 20 µg da secreção de L. labyrinthicus foram misturadas
ao tampão de amostra (Tris-HCl 0,0625 M pH 6,8, SDS 2%, DTT 0,1M, azul de bromofenol e
água Milli-Q), fervidos por 3 min e aplicados no gel. O marcador de massa molecular
(Amersham Pharmacia-Biotech) utilizado foi uma mistura de proteínas de massas moleculares
conhecidas: fosforilase b (94 kDa), albumina (67 kDa), ovoalbumina (43 kDa), anidrase
carbônica (30 kDa), inibidor de tripsina (20,1 kDa), e lactolbumina (14,4 kDa). A eletroforese
foi realizada em tampão Tris-base 0,55 mol/L - Glicina 1,92 mol/L pH 8,3, sob corrente
constante de 3 mA, 21°C por 16 h.
4.17. Coloração com nitrato de prata
Após a eletroforese, o gel foi corado com nitrato de prata segundo Blum et al.
(1987). Primeiramente, o gel foi fixado com etanol 50% (v/v), ácido acético 12% (v/v) e
formaldeído 0,05% (v/v) por 1 h. Em seguida, incubado em etanol 50% (v/v) por 20 min e
sensibilizado por tiossulfato de sódio 0,02% (p/v) por 1 min. A sensibilização foi seguida de
lavagem em água Milli-Q por 1 min e impregnação com solução de nitrato de prata 0,2%
(v/v) e formaldeído 0,075% (v/v) por 20 min. Finalmente, o gel foi lavado por 1 min em água
Milli-Q e revelado em sala escura com carbonato de sódio 6% (p/v), formaldeído 0,05% (v/v)
e tiossulfato de sódio 0,27% (p/v). A reação foi interrompida incubando-se o gel por 1 h na
mesma solução utilizada na fixação.
4.18. Atividade caseinolítica
O teste de atividade caseinolítica evidencia a clivagem da caseína por enzimas
proteolíticas, fazendo com que os peptídeos resultantes da clivagem permaneçam em
52
suspensão após precipitação com ácido tricloroacético, de tal modo que o sobrenadante obtido
após a centrifugação das amostras incubadas com a caseína possa ser medido com relação à
sua absorvância a 280 nm (Cominetti, 2007).
O ensaio foi realizado como descrito por Sousa (2003). A uma alíquota de 40 μg de
secreção de L. labyrinthicus (quantificada por microensaio de Bradford), solubilizada em
250 μL de tampão HEPES 100 mM pH 8,0, contendo CaCl
2
10 mM, acrescentaram-se 500 μL
de solução de caseína 0,1% (p/v), preparada com o tampão HEPES. Como controle negativo,
adicionaram-se 250 μL de tampão a 500 μL da solução de caseína. A incubação foi feita a
temperatura ambiente por 2 h. Ao final, acrescentou-se 1,25 mL de TCA 10% (p/v) para parar
a reação. A amostra e o controle foram centrifugados a 8.106 g por 10 min e fez-se a leitura
de absorvância a 280 nm em cubeta de quartzo.
Para a verificação da termolabilidade e do pH ótimo de atividade, o ensaio acima foi
repetido em diferentes condições. O efeito da temperatura foi verificado realizando-se o
ensaio caseinolítico com incubação a 25, 37 e 50°C. Para o estudo do efeito do pH, o ensaio
foi realizado com os tampões contendo CaCl
2
10 mM: acetato de sódio 100 mM pH 4,0 e
pH 5,0; HEPES 100 mM pH 6,0 e pH 7,0 e Tris-HCl 100 mM pH 8,0, pH 9,0 e pH 10,0.
Todos os testes foram realizados em duplicata. A análise estatística dos dados foi feita por
ANOVA de uma via seguida do teste de comparação múltipla de Bonferroni. Foi considerado
estatisticamente significativo p<0,05.
4.19. Atividade gelatinolítica
O ensaio de atividade gelatinolítica foi realizado como em Menezes et al. (2006)
com modificações por zimografia. Este ensaio é extremamente sensível, capaz de detectar
picomoles de enzimas proteolíticas, além de ser capaz de separar enzimas de agentes
mascaradores da atividade (Almeida et al., 2002).
Alíquotas de 40 μg de secreção de L. labyrinthicus, sem aquecimento prévio, foram
misturadas ao tampão de amostra (Tris-HCl 62,5 mM pH 6,8, SDS 2% (p/v), glicerol 15%
(v/v) e azul de bromofenol) e aplicadas em gel SDS-PAGE 9% contendo 0,1% (p/v) de
gelatina como substrato para atividade proteolítica. A eletroforese ocorreu a 4°C, em aparelho
Mini Protean II (BioRad), com voltagem constante de 90V. Após a corrida, os géis foram
submetidos a cinco lavagens de 15 min em 2,5% (v/v) de Triton X-100 para remover traços de
SDS. Finalmente, foram lavados com água destilada para remover o excesso de Triton X-100
e incubados a 25°C por 22 h em diferentes tampões de incubação, como descrito a seguir.
Os géis foram corados em solução de Coomassie Blue R250 0,25% (p/v) em solvente
metanol/ácido acético/água (50:10:40) e descorados no mesmo solvente, para revelar as
bandas onde houve atividade gelatinolítica. A digestão da gelatina foi identificada como zonas
claras de lise contra o fundo corado em azul.
Para a verificação do melhor tampão de incubação, os seguintes tampões em pH 8,0
foram testados: Tris-HCl 50 mM; Tris-HCl 50 mM contendo CaCl
2
1 mM ou 10mM;
Tris-HCl 50 mM, NaCl 150 mM, CaCl
2
10 mM e 0,02% CHAPS (p/v); o tampão anterior
contendo EDTA 10 mM; Tris-HCl 50 mM, CaCl
2
1 mM e SO
4
Zn 1 mM.
O pH de atividade ótima foi observado incubando-se os géis em diferentes tampões
contendo CaCl
2
10 mM: acetato de sódio 50 mM pH 4,0 e pH 5,0; HEPES 50 mM pH 6,0 e
pH 7,0 e Tris-HCl 50 mM pH 8,0, pH 9,0 e pH 10,0.
4.20. Ensaio fluorogênico
Todos os ensaios fluorogênicos foram feitos no Laboratório de Patologia e analisados
no Laboratório de Enzimologia da Universidade de Brasília.
4.20.1. Em placa
Ensaios com substratos enzimáticos baseados no fluoróforo 7-amino-4-
metilcumarina (AMC) são ferramentas bastante populares e bem estabelecidas para estudo de
atividade e especificidade de peptidases (Thornberry et al., 1997; Zhu et al., 2003). Nesses
substratos, o AMC está ligado ao peptídeo pela formação de uma ligação entre a amina
cumarínica e o grupo carboxil do resíduo de aminoácido C-terminal (Figura 13). A proteólise
dessa ligação libera o AMC livre, resultando em um grande aumento da fluorescência que
pode ser detectada a 445 nm após excitação a 345 nm. Bibliotecas de peptídeos ligados ao
AMC já foram sintetizadas para a investigação da especificidade ao substrato por proteases.
Figura 13. O emprego dos substratos marcados com o fluoróforo 7-amino-4-metilcumarina
(AMC) está relacionado à liberação do grupo AMC por ataque proteolítico, levando a um
aumento na fluorescência do meio detectado em 445 nm após excitação a 345 nm.
53
54
No presente ensaio, foi determinada a especificidade do substrato para o conjunto de
proteases presentes na secreção cutânea de L. labyrinthicus usando diferentes aminoácidos
acoplados ao fluoróforo AMC (Sigma-Aldrich Company) (Tabela 2). Estoques de 200 µM de
cada substrato foram preparados em tampão HEPES 25 mM pH 7,5. Em cada poço de uma
placa de 96 poços de fundo chato, foram adicionados 10 µL (15,6 µg) da secreção cutânea
recém-extraída e não-liofilizada de L. labyrinthicus e 80 µL do mesmo tampão em que se
prepararam os substratos. Como controle, utilizou-se tampão no lugar da amostra. A reação
foi iniciada pela adição de 10 µL da solução-estoque de substrato usando uma pipeta
multicanal. A liberação do AMC foi imediatamente acompanhada em uma leitora de
fluorescência de placa (Spectra Max M2 - Molecular Devices) a λ
ex
= 345 nm e λ
em
= 445 nm
com leituras a cada 3 min por 30 min. A velocidade de cada reação foi calculada pelo
software Soft Max Pro (Molecular Devices) em mili-UF/min. O ensaio foi realizado em
triplicata.
Tabela 2. Substratos fluorogênicos (Sigma-Aldrich Company) utilizados no experimento em
placa para avaliação da atividade proteolítica.
Substratos fluorogênicos
N-Succynil-Gly-Pro-Leu-Gly-Pro-AMC
a
Gly-Pro-AMC
N-Succynil-Ile-Ala-AMC
L-Pro-AMC
N-Succynil-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC
L-Leu-AMC
N-Succynil-Leu-Tyr-AMC
Nα-CBZ-Gly-Gly-Arg-AMC
N-CBZ-Gly-Gly-Arg-AMC
N-CBZ-Phe-Arg-AMC
L-Alanyl-L-Alanyl-L-Phe-Ala-AMC
Nα-CBZ-L-Arg-AMC
a
AMC: 7-amino-4-metilcumarina
55
4.20.2. Influência da concentração protéica na atividade
O mesmo ensaio fluorogênico em placa foi feito analisando-se a atividade hidrolítica
de diferentes concentrações do veneno da rã-pimenta sobre 10 µL dos peptídeos
Gly-Pro-AMC, L-Leu-AMC e L-Alanyl-L-Alanyl-L-Phe-Ala-AMC na concentração final de
20 µM. O tampão utilizado foi o HEPES 50 mM pH 7,5 e as concentrações testadas foram:
0, 2, 4, 8, 16, 32 e 64 µL (1,25 µg/µL). As leituras foram realizadas em intervalos de 3 min
durante 30 min para a determinação da velocidade máxima de cada concentração.
4.20.3. Determinação do pH ótimo
O ensaio descrito acima foi realizado novamente incubando-se 32 µL (25,6 µg) de
secreção fresca com 58 µL de tampão AMT (ácido acético 25 mM, MES 25 mM e Tris-base
25 mM) nos pHs 5,0; 6,0; 7,0; 7,5; 8,0; 8,5; 9 e 10 por 15 min a temperatura ambiente. A
hidrólise foi iniciada pela adição de 10 µL da solução-estoque dos substratos Gly-Pro-AMC,
L-Leu-AMC e L-Alanyl-L-Alanyl-L-Phe-Ala-AMC usando uma pipeta multicanal. A liberação
do fluoróforo AMC foi monitorada em uma leitora de fluorescência de placa (Spectra Max
M2 - Molecular Devices) a λ
ex
= 345 nm e λ
em
= 445 nm por 30 min para a determinação (Soft
Max Pro - Molecular Devices) da velocidade máxima (mili-UF/min) nos diferentes pHs.
4.20.4. Em gel SDS-PAGE 10%
Alíquotas de 16,3 μL (15,2 µg) de secreção de L. labyrinthicus, sem aquecimento
prévio, foram misturadas ao tampão de amostra (Tris-HCl 62,5 mM pH 6,8, SDS 2% (p/v),
glicerol 15% (v/v) e azul de bromofenol) e aplicadas em gel SDS-PAGE 10%. A eletroforese
ocorreu a 4°C, em aparelho Mini Protean II (BioRad), com voltagem constate de 90V. Após a
corrida, os géis foram submetidos a quatro lavagens de 15 min em 2,5% (v/v) de Triton X-100
para remover traços de SDS, sendo então lavados três vezes por 15 min com tampão HEPES
25 mM pH 7,5 para remover o excesso de Triton X-100 e promover a renaturação das
proteínas. Finalmente, os géis foram incubados por 15 min com os substratos fluorogênicos
(20 µM) Gly-Pro-AMC, L-Leu-AMC e L-Alanyl-L-Alanyl-L-Phe-Ala-AMC e os resultados
foto-documentados sob exposição à luz UV. Esses substratos foram selecionados por terem
sido clivados pela amostra testada no ensaio realizado em placa de 96 poços de fundo chato
descrito anteriormente.
56
4.20.5. Ensaio de inibição
O ensaio fluorogênico em placa foi repetido na presença de diferentes inibidores,
cada um em uma determinada concentração (Tabela 3), para a determinação do grupo a que
pertenciam as proteases presentes na secreção cutânea de L. labyrinthicus. Alíquotas de 10 µL
da solução-estoque 10x de inibidor foram incubados com 32 µL (25,6 µg) de secreção cutânea
fresca de L. labyrinthicus por 45 min à temperatura ambiente. Logo em seguida, foram
adicionados 10 µL dos substratos que foram clivados nos ensaios anteriores. Cada substrato
foi testado com todos os inibidores. Como controle de 100% de inibição, utilizou-se tampão
HEPES 50 mM pH 7,5 no lugar da amostra e para 0% de inibição, incubou-se a amostra com
o mesmo tampão na ausência de inibidores. A influência dos solventes metanol e isopronanol
em que os inibidores foram dissolvidos foi obtida incubando-se 10 µL de cada solvente com a
amostra pelo mesmo período. A análise dos resultados foi realizada como descrita acima e
apresentada na forma de atividade relativa (%) em relação ao controle.
Tabela 3. Inibidores utilizados no ensaio fluorogênico, especificando-se o seu alvo de
inibição, a concentração utilizada e o solvente em que foi ressuspendido.
Inibidor Alvo Concentração
final
Estoque
100x
Solvente
TPCK
Irreversível
serino/cisteíno-peptidases
100 µm 10 mM Metanol
PMSF
Irreversível
serino/cisteíno-peptidases
1 mM 100 mM Isopropanol
TLCK
Irreversível
serino/cisteíno-peptidases
100 µm 10 mM Água
pH 3,0
Pepstatina A
Reversível, ativos na presença de
DTT
peptidases aspárticas e acídicas
1 µm 100 µm Metanol
57
Leupeptina
Reversível, ativos na presença de
DTT
serino/cisteíno-peptidases
100 µm 10 mM Água
EDTA
Metalo-peptidases
10 mM 1 M Água
pH 8,0
E-64
Cisteíno-peptidases
10 µM 1 mM Água
Bestatina
Amino-peptidases 10 µM 1 mM Metanol
Fenantrolina
Metalo-peptidases 10 mM 1 M Metanol
4.21. Ensaio de atividade fosfolipásica
A secreção cutânea liofilizada de L. labyrinthicus foi submetida a um ensaio de
atividade fosfolipásica do tipo A
2
descrito por Price III (2007) com modificações. Este ensaio
parte do princípio que a liberação de ácidos graxos pela enzima PLA
2
altera o pH, alteração
esta detectável pela mudança da absorvância do corante indicador.
Amostras da secreção cutânea de L. labyrinthicus e da peçonha de Crotalus durissus
terrificus (controle positivo) foram diluídas em tampão HEPES 2 mM e o pH ajustado para
7,0. Alíquotas de 20 µL de cada amostra ou do tampão HEPES 2 mM pH 7,0 foram
transferidas para os poços de uma placa de 96 poços de fundo chato. Posteriormente,
adicionaram-se 180 µL da solução de ensaio contendo HEPES 2 mM, Triton X-100 5 mM,
CaCl
2
10 mM, fosfatidilcolina 25 mM (Sigma; tipo II-S; 20%) e 0,0124% (p/v) de azul de
bromotimol (Vetec) em água pH 8,0. A cinética da reação foi imediatamente analisada em
uma leitora de microplaca a 595 nm (BioRad 3550-UV), com leituras realizadas em intervalos
de 1 min durante 5 min e em intervalos de 5 min por mais 25 min.
Todas as soluções do ensaio foram preparadas e armazenadas a 4°C, exceto o
substrato (fosfatidilcolina), o qual foi dissolvido na concentração de 76 mg/mL em metanol
apenas na hora do uso, visto que sofre hidrólise em meio aquoso. A dissolução em metanol foi
realizada após 5 minutos de agitação e 15 min de sonicação. Este é um teste colorimétrico
simples e barato, feito em pH fisiológico e que possui uma alta sensibilidade, além de utilizar
uma pequena quantidade de enzima por ser realizado em pequeno volume. Os resultados
58
foram analisados por ANOVA de duas vias seguido do pós-teste de Bonferroni. Foi
considerado estatisticamente significativo p<0,05.
5. Resultados
5.1. Fracionamento da secreção cutânea e análise por espectrometria de massa
Alíquotas de 5,0 mg da secreção bruta foram inicialmente fracionadas em coluna C
18
por RP-HPLC a um fluxo de 1 mL/min, obtendo-se o perfil cromatográfico abaixo
(Figura 14). O perfil apresentou uma boa reprodutividade ao longo das corridas
cromatográficas realizadas, totalizando uma média de 58 frações coletadas manualmente.
Figura 14. Perfil cromatográfico típico do fracionamento da secreção cutânea de L.
labyrinthicus em coluna C
18
(Vydac 218TP54) em sistema HPLC com emprego de gradiente
linear de acetonitrila/TFA 0,1%. O monitoramento das frações foi a 216 nm e a eluição
realizada com fluxo de 1 mL/min. As frações contendo os peptídeos utilizados ao longo do
trabalho estão indicadas pelas massas moleculares dos peptídeos (1563 Da, 2193 Da,
2547 Da, 2541 Da e 1761 Da). As frações que apresentaram atividade nos screenings
biológicos estão identificadas pelos seguintes símbolos: * hemolítica; **contra E. coli; ***P.
aeruginosa; ****S. aureus.
59
Após secagem, cada fração obtida foi ressuspendida em tampão apropriado,
plaqueada e analisada em espectrômetro de massa do tipo MALDI-TOF/TOF (Autoflex II,
Bruker Daltonics, Alemanha) cobrindo uma faixa de m/z de 500 a 20.000 Da. Os peptídeos e
proteínas cujas massas [M + H]
+
foram identificadas (apresentados no Anexo 2) foram
agrupados e representados na Figura 15.
27
23
24 24
16
22
16
12
9
0
7
0
0
5
10
15
20
25
30
Número de peptídeos detectados
Intervalos de massas moleculares [M + H]
+
(Da)
A
24
21
16
10
3
5
3
0
2
0
0
5
10
15
20
25
30
Número de peptídeos detectados
Intervalos de massas moleculares [M + H]
+
(Da)
B
Figura 15. Composição peptídica/protéica da secreção cutânea de L. labyrinthicus
representada em grupos de massa molecular monoisotópicas obtidos pela análise por
espectrometria de massa MALDI-TOF das frações oriundas de uma corrida de RP-HPLC. (A)
Quantidade de peptídeos presentes na secreção que possuem até 4 kDa [M+H]
+
. (B) Número
de peptídeos/proteínas com m/z entre 4 e 20 kDa [M+H]
+
.
60
61
5.2. Ensaios preliminares hemolítico, antimicrobiano e análise por espectrometria de
massa
A partir das frações obtidas com uma corrida cromatográfica, realizou-se um ensaio
preliminar de atividade antimicrobiana (contra E. coli, P. aeruginosa e S. aureus) e de
atividade hemolítica. A fração 48/49 foi ativa contra as três bactérias testadas. A fração 53
demonstrou atividade contra as bactérias Gram-negativas e as frações 50 e 54 apenas contra
E. coli. As frações 14, 15, 16, 48/49 apresentaram fraca atividade hemolítica (Figura 14).
As frações 48/49, 53 e 54 de várias corridas foram reunidas e analisadas no
espectrômetro de massa do tipo MALDI-TOF/TOF. A massa monoisotópica [M+H]
+
dos
peptídeos responsáveis pela atividade biológica da fração 48/49 foi 2.547 Da, da fração 53 foi
2.541 Da e da 54 foi 1.761 Da. É importante ressaltar que as frações não se apresentavam
puras, os peptídeos indicados como os responsáveis pelas funções testadas eram os mais
abundantes de cada amostra.
5.3. Purificação dos peptídeos de interesse
As frações contendo os peptídeos de massa monoisotópica 1.563 Da, 2.193 Da,
2.547 Da, 2.541 Da e 1.761 Da foram acumuladas e recromatografadas em coluna C
18
(Onyx
monolítica ou Vydac 218TP54) por RP-HPLC, sendo a eluição realizada a 1 mL/min segundo
os gradientes apresentados na Figura 16.
Os materiais resultantes das recromatografias foram analisados quanto ao grau de
pureza por espectrometria de massa do tipo MALDI-TOF no modo refletor de íons positivos
na faixa de massa de 500 a 4.000 Da. A faixa de massa de 4 a 20 kDa também foi analisada
em busca de possíveis contaminantes, verificando-se que os três peptídeos estudados
encontravam-se puros (Figura 17).
Fi
gu
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C
18
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Figura 17. Espectros de massa dos peptídeos (A) 1.563 Da, (B) 2.193 Da, (C) 2.547 Da, (D)
2.541 Da e (E) 1.761 Da purificados por RP-HPLC em coluna analítica C
18
. As massas de
1.783 Da e 1.799 Da observadas na figura E são os adutos de sódio e de potássio do peptídeo
de 1.761 Da. Os espectros foram obtidos plaqueando-se as amostras com HCCA 20 µg/µL e
analisando-se na faixa de massa de 500 a 4000 Da no modo refletor de íons positivos
calibrado com Pepmix.
64
5.4. Caracterização química dos peptídeos
As estruturas primárias dos peptídeos de interesse foram determinadas em estudos
anteriores por degradação de Edman em seqüenciador automático de proteínas e peptídeos
modelo 477A da Applied Biosystems. O peptídeo de 1.761 Da, rico em glicina e leucina, foi
denominado de PGL-Ll e apresentou a seguinte estrutura primária:
1
GLLGGLLGPLLGGGGGGGGGLL
22
. O peptídeo de massa monoisotópica 2.541 Da:
1
GLLDTLKGAAKNVVGSLASKVMEKL
25
; e o de 2.547 Da:
1
GVVDILKGAAKDIAGHLASKVMNKL
25
. Dois fragmentos do peptídeo anterior foram
identificados, o de menor tempo de eluição possui 1.563 Da e foi denominado de Flx-16:
1
GVVDILKGAAKDIAGH
16
; o outro de 2.193 Da, chamado de Flx-22, apresenta a seguinte
seqüência:
1
GVVDILKGAAKDIAGHLASKVM
22
.
Por meio de esterificação de Fisher, constatou-se que apenas os peptídeos 2.541 Da e
2.547 Da apresentam a porção C-terminal amidada (Figura 18). A busca por seqüências
similares foi realizada pelo Blast 2. Os peptídeos estudados também foram comparados
off-line a outros peptídeos de leptodactilídeos usando as informações disponíveis na literatura,
visto que a maioria dessas moléculas não se encontra cadastradas no banco de dados públicos
disponíveis via internet. A análise de similaridade revelou que os peptídeos 2.541 Da e o de
2.547 Da já haviam sido isolados de outras espécies do gênero Leptodactylus. O peptídeo
2.541 Da é conhecido como pentadactylin, previamente isolado de L. pentadactylus (King et
al., 2005), e o de 2.547 Da é o fallaxin, presente na secreção de L. pentadactylus e L. fallax
(King et al., 2005; Rollins-Smith et al., 2005). Nenhum peptídeo similar ao PGL-Ll foi
encontrado.
A busca também revelou uma maior similaridade de fallaxin e pentadactylin a outros
peptídeos antimicrobianos isolados do gênero Leptodactylus, tais como: syphaxin (Dourado et
al., 2007), laticeptin (Conlon et al., 2006) e ocellatins (Nascimento et al., 2004; Nascimento,
2007; Nascimento et al., 2007). O alinhamento dessas seqüências pelo ClustalW evidenciou
um elevado grau de conservação da porção N-terminal, sendo a porção C-terminal mais
variada (Figura 19). A seqüência de consenso encontrada para esses peptídeos foi
1
GVLDILKGAAKDXXXHLA-KVMEKX
25
, onde X indica ambigüidade, demonstrando uma
grande conservação da estrutura primária desses peptídeos maduros. Dentre os peptídeos
analisados, os peptídeos ocellatins são os que apresentaram menor grau de similaridade com
os peptídeos fallaxin e pentadactylin estudados no presente trabalho.
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6
6
Figura 20. Árvore neighbor-joining baseada no alinhamento entre os peptídeos de
leptodactilídeos. Os valores de distância estão indicados em cada ramo.
O método da parcimônia produz filogenias com base no menor número de passos
(mudanças evolutivas) possíveis. Apesar de amplamente usado, não é um método que permite
a inclusão de parâmetros para avaliar a evolução de um grupo de dados e, além disso, não
necessariamente a história de um grupo de organismos poderia ser explicada da maneira mais
parcimoniosa possível. Nas análises de parcimônia, foram geradas 100 árvores. Cinco grupos
externos foram usados: dermaseptin, brevinin 1, magainin 2, japonicin 1 e aurein 1.1. A
árvore strict consesus não apresentou resolução entre os ramos e os valores de suporte do
bootstrap foram menores que 50%, não tendo sido possível a determinação de qual caractér é
mais antigo e qual é o mais derivado dentre os analisados.
Como já visto em outros trabalhos, as predições das estruturas secundárias dos
PAMs fallaxin, pentadactylin, laticeptin e syphaxin mostraram que os mesmos apresentam
propensão para formar α-hélice, possuem anfipaticidade moderada e são catiônicos. Essas
características são evidenciadas nas projeções de Schiffer & Edmundson (1967) (Figura 21),
nas quais se pode notar também a idêntica distribuição de resíduos de aminoácidos com as
mesmas características de polaridade nos PAMs fallaxin, syphaxin e laticeptin. Deve-se
lembrar que não é possível afirmar com certeza que esses peptídeos adotam uma conformação
helicoidal, visto que apenas experimentos como o de dicroísmo circular podem esclarecer
completamente a questão. Algumas das características químicas como hidrofobicidade e pI
desses peptídeos e de seus fragmentos estão sintetizadas na Tabela 4.
67
Figura 21. Comparação entre as projeções em hélice de Schiffer & Edmundson (1967) dos
peptídeos antimicrobianos fallaxin, pentadactylin, syphaxin e laticeptin. As projeções
permitem uma melhor visualização da anfipaticidade dessas moléculas.
68
69
Tabela 4. Comparação entre alguns dos peptídeos antimicrobianos e seus fragmentos de 22 e
16 resíduos de aminoácidos isolados de leptodactilídeos, incluindo: fallaxin, pentadactylin,
laticeptin e syphaxin. Os parâmetros comparados são a massa molecular monoisotópica
(Mm); anfifilicidade, como momento hidrofóbico médio (<µH>); hidrofobicidade média
(<H>); carga em pH neutro; ponto isoelétrico (pI), porcentagem de resíduos hidrofóbicos
(%H); atividade contra Gram-positivas (+) e Gram-negativas (−); predição da estrutura
secundária.
Peptídeos Mm
(Da)
Carga pI <µH><H> %H Atividade Estrutura
Fallaxin
2.547 +3.1 10.5 0.07 −0.14 68 +/− α-hélice
Flx-22
2.193 +1.1 9.8 0.16 −0.07 73 s.a.
a
α-hélice
Flx-16
1.563 +0.1 7.8 0.32 −0.07 75 s.a. α-hélice
Pentadactylin
2.541 +3.0 10.5 0.09 −0.16 64 +/− α-hélice
Syphaxin
2.543 +3.1 10.5 0.05 −0.11 72 n.d.
b
α-hélice
SPX(1–22)
2.188 +1.1 9.8 0.13 −0.05 77 +/− α-hélice
SPX(1–16)
1.576 +0.1 7.8 0.31 −0.08 75 +/− α-hélice
Laticeptin
2.561 +3.1 10.5 0.06 −0.14 72 − α-hélice
a
Sem atividade.
b
Não determinada.
5.5. Determinação de HC
50
, MIC e IC
50
Dos quatro peptídeos testados (PGL-Ll, pentadactylin, fallaxin e seu fragmento Flx-
16) apenas fallaxin foi capaz de lisar eritrócitos humanos na maior concentração testada, e
mesmo assim a potência verificada foi baixa (9% de lise). Portanto, não foi possível
determinar o HC
50
para esse peptídeo.
Os mesmos peptídeos foram testados contra E. coli, P. aeruginosa, S. aureus e
B. subtilis para determinação de MIC. Entretanto, apenas os peptídeos fallaxin e pentadactylin
apresentaram atividade antimicrobiana, sendo que a determinação de MIC para o segundo só
foi possível contra as bactérias E. coli e B. subtilis, visto que na concentração máxima testada
com as outras linhagens não houve inibição do crescimento bacteriano. As Tabelas 5 e 6
sumarizam os resultados de MIC e HC
50
obtidos neste e em outros estudos com PAMs
isolados de anfíbios do gênero Leptodactylus.
70
Tabela 5. Atividade antimicrobiana e hemolítica dos peptídeos estudados. Os valores dos
MICs foram obtidos por meio de testes contra cepas de bactérias ATCC. A determinação de
HC
50
foi realizada incubando-se os peptídeos em diferentes concentrações com eritrócitos de
sangue humano O
+
.
Peptídeo
MIC (µM)
HC
50
(µM)
E. coli P. aeruginosa S. aureus B. subtilis
Fallaxin
32 64 32 16 >128
a
Pentadactylin
32 >128 >128 2 s.a.
b
PGL-Ll s.a.
b
s.a.
b
s.a.
b
s.a.
b
s.a.
b
Flx-16 s.a.
b
s.a.
b
s.a.
b
s.a.
b
s.a.
b
a
Cerca de 9% dos eritrócitos foram lisados na concentração de 128 µM.
b
Sem atividade.
Tabela 6. Comparação dos MICs e do HC
50
de PAMS purificados da secreção cutânea de
leptodactilídeos. Os valores dos MICs foram obtidos por meio de testes contra cepas de
bactérias ATCC. A determinação de HC
50
foi realizada incubando-se o peptídeo em diferentes
concentrações com eritrócitos de sangue humano O
+
.
Peptídeo MIC (µM) HC
50
(µM) Referência
E. coli P.aeruginosa S. aureus
Fallaxin
40
a
32
a
100
a
80
b
64
b
>100
b
>160
c
32
d
>100
e
>200 (8)
>128 (9)
>50 (0)
Rollins-Smith et al.(2005)
Este trabalho (2008)
Nielsen et al. (2007)
Flx-16
>128
a
>128
b
>128
d
>128 (0) Este trabalho (2008)
>100
a
>100
b
>100
e
>100 (0) Nielsen et al. (2007)
Pentadactylin
25
a
100
b
200
c
>400 (29) King et al. (2005)
32
a
>128
b
>128
d
>128 (0) Este trabalho (2008)
SPX(1-22)
3,6
a
n.d. 14,6
e
>29,5 Dourado et al. (2007)
SPX(1-16)
10,1
a
n.d. 40,5
e
n.d.
f
Dourado et al. (2007)
Laticeptin
50
a
100
b
>200
c
>400 Conlon et al. (2006)
O valor entre parêntesis representa a porcentagem de hemólise na maior concentração testada.
a
ATCC 25922;
b
ATCC 27853;
c
NCTC 8325;
d
ATCC 25923;
e
ATCC292132.
f
Não determinado.
71
Apesar do fragmento Flx-16 não ter apresentado atividade biológica nos testes
preliminares, ele foi utilizado para a determinação de MIC e HC
50
por apresentar-se em
quantidade suficiente para a realização dos testes. Além disso, apesar de apenas três peptídeos
terem apresentado atividade nos ensaios preliminares, não quer dizer que não existam outras
moléculas bioativas na secreção estudada, pode ser que a concentração em que apareçam em
uma corrida não seja suficiente para desencadear alguma atividade significativa.
Como alguns dos PAMs catiônicos com amplo espectro de ação também são
citotóxicos para células de câncer (Tabela 7), os peptídeos fallaxin e pentadactylin foram
testados quanto a sua ação anticarcinogênica. Os dois peptídeos antimicrobianos fallaxin e
pentadactylin (dissolvidos em água), e o peptídeo PGL-Ll (dissolvido em DMSO 10%) foram
incubados por 24 h com linhagens celulares de câncer de mama (MCF-7) e de colo uterino
(HeLa) para análise de viabilidade celular. O peptídeo fallaxin também foi testado contra uma
linhagem murina de melanoma (B16F10). Para analisar o efeito na viabilidade celular de
células normais humanas, esses peptídeos foram incubados com uma linhagem de células de
fibroblasto normais (FHN) pelo mesmo período de tempo. O mesmo ensaio com a linhagem
MCF-7 foi refeito com pentadactylin sintético e os resultados corroboraram os resultados
observados com o peptídeo nativo.
Tabela 7. Comparação das características químicas e biológicas de vários PAMs isolados da secreção cutânea de anfíbios e que também
apresentam atividade antitumoral. Os parâmetros comparados são a massa molecular monoisotópica (Mm); anfifilicidade, como momento
hidrofóbico médio (<µH>); hidrofobicidade média (<H>); carga em pH neutro; ponto isoelétrico (pI), porcentagem de resíduos hidrofóbicos
(%H); atividade contra Gram-positivas (+) e Gram-negativas (−); predição da estrutura secundária.
Peptídeo Seqüência Mm
(Da)
<µH><H> Carga pI %H Atividade Estrutura Espécie
Fallaxin
GVVDILKGAAKDIAGHLASKVMNKL-NH
2
2547 0.07 −0.14 +3.1 10.5 68
+/
−
α-hélice
L. fallax
L. pentadactylus
L. labyrinthicus
Pentadactylin
GLLDTLKGAAKNVVGSLASKVMEKL-NH
2
2541 0.09 −0.16 +3.0 10.5 64
+/
−
α-hélice
L. pentadactylus
L. labyrinthicus
Magainin 2
GIGKFLHSAKKFGKAFVGEIMNS-NH
2
2465 0.36 −0.15 +4.1 11.0 65
+/
−
α-hélice
X. laevis
Gaegurin 5
FLGALFKVASKVLPSVKCAITKKC-OH
2550 0.27 −0.15 +4.9 10.4 71
+/
−
α-hélice
Rana rugosa
Gaegurin 6
FLPLLAGLAANFLPTIICFISYKC-OH
2627 0.10 0.19 +0.9 8.3 87
+/
−
α-hélice
Rana rugosa
Aurein 1.2
GLFDIIKKIAESF-NH
2
1479 0.48 −0.06 +1.0 9.9 62
+/
−
α-hélice
Litoria raniformis
Citropin 1.1
GLFDVIKKVASVIGGL-NH
2
1614 0.37 0.05 +2.0 10.6 75 + α-hélice
Litoria citropia
Maculatin 1.1
GLFGVLAKVAAHVVPAIAEHF-NH
2
2145 0.25 0.16 +1.2 10.1 90
+/
−
α-hélice
Litoria
genimaculata
72
O peptídeo PGL-Ll não interferiu na viabilidade celular de nenhuma das linhagens
testadas. O peptídeo fallaxin reduziu a viabilidade celular de todas as linhagens com as quais
foi incubado, porém foi mais potente contra células normais do que contra células de câncer
(Figura 22). Já o peptídeo pentadactylin apresentou atividade contra ambas as linhagens de
câncer testadas, sendo menos eficaz na redução da viabilidade celular que o fallaxin (Figura
23). A concentração que reduz em 50% a viabilidade celular foi obtida pelo programa
GraphPad Prism 5, estando os IC
50
de ambos os peptídeos apresentados na figura 24.
73
0 32 64 96 128
0
20
40
60
80
100
120
HeLa
MCF-7
B16F10
FHN
Concentração de fallaxin (μM)
Células viáveis (%)
0 32 64 96 128
0
20
40
60
80
100
120
HeLa
MCF-7 (nativo)
MCF-7 (sintético)
FHN
Concentração de pentadactylin (μM)
Células viáveis (%)
Figura 22. Porcentagem de células
viáveis das linhagens celulares de
câncer de colo uterino (HeLa), de
mama (MCF-7), de pele (B16F10) e de
fibroblasto normal (FHN) após a
incubação por 24 h com diferentes
concentrações de fallaxin. O peptídeo
testado por meio do ensaio do MTT
apresentou uma maior citotoxicidade
contra a linhagem FHN. Os valores são
expressos como média ± SD de um
experimento feito em triplicata.
Figura 23. Porcentagem de células viáveis
das linhagens celulares de câncer de colo
uterino (HeLa), de mama (MCF-7) e de
fibroblasto normal (FHN) após a incubação
por 24 h com diferentes concentrações de
pentadactylin nativo ou sintético. Os valores
são expressos como média ± SD de um
experimento feito em triplicata.
MCF-7
B
16F1
0
HeLa FHN
0
20
40
60
80
fallaxin
pentadacty
lin
46.8
23.1
26.8
17.7
53.4
46.8
72.4
35.9
Linhagem celular
IC
50
(
μ
M)
Figura 24. Concentração de fallaxin e pentadactylin que reduz em 50% a viabilidade celular
das linhagens celulares de câncer de mama (MCF-7), de pele (B16F10), de colo uterino
(HeLa) e de fibroblastos normais (FHN) após 24 h de incubação a 37°C. A atividade do
peptídeo pentadactylin não foi avaliada sobre a linhagem celular de câncer de pele B16F10.
Figura 24. Concentração de fallaxin e pentadactylin que reduz em 50% a viabilidade celular
das linhagens celulares de câncer de mama (MCF-7), de pele (B16F10), de colo uterino
(HeLa) e de fibroblastos normais (FHN) após 24 h de incubação a 37°C. A atividade do
peptídeo pentadactylin não foi avaliada sobre a linhagem celular de câncer de pele B16F10.
5.6. Efeitos citostáticos e citotóxicos 5.6. Efeitos citostáticos e citotóxicos
Após o tratamento com os peptídeos, as linhagens celulares foram analisadas por
microscopia de contraste de fase e foto-documentadas em duas condições de incubação: 1) na
ausência do peptídeo (controle) e 2) em sua presença na concentração de 128 µM quanto a
possíveis alterações morfológicas, utilizando-se um microscópio de contraste de fase
invertido. As linhagens HeLa (Figura 25), MCF-7 (Figura 26) e FHN (Figura 28) foram
tratadas com diferentes concentrações dos peptídeos fallaxin e pentadactyllin. Os controles de
todas as linhagens usadas apresentaram morfologia bem definida, membrana citoplasmática
íntegra, núcleo e nucléolos definidos. Observou-se, após a incubação de 24 h, que as células
de todas as linhagens incubadas com 128 µM de peptídeo haviam perdido a integridade da
membrana e deixaram de apresentar núcleo e nucléolos definidos. Resultado diferente foi
observado depois do tratamento da linhagem B16F10 com fallaxin (Figura 27), onde se notou
alteração da morfologia das células, as quais apresentaram o seu volume bastante reduzido,
mas sem perderem aparentemente a integridade da membrana plasmática. Apesar de a
foto-documentação ter ocorrido apenas na maior concentração, notou-se que algumas
concentrações mais baixas, como a de 64 µM, também causaram efeitos semelhantes, todavia
com uma intensidade menor. Nas linhagens de células de câncer tratadas com os PACs
Após o tratamento com os peptídeos, as linhagens celulares foram analisadas por
microscopia de contraste de fase e foto-documentadas em duas condições de incubação: 1) na
ausência do peptídeo (controle) e 2) em sua presença na concentração de 128 µM quanto a
possíveis alterações morfológicas, utilizando-se um microscópio de contraste de fase
invertido. As linhagens HeLa (Figura 25), MCF-7 (Figura 26) e FHN (Figura 28) foram
tratadas com diferentes concentrações dos peptídeos fallaxin e pentadactyllin. Os controles de
todas as linhagens usadas apresentaram morfologia bem definida, membrana citoplasmática
íntegra, núcleo e nucléolos definidos. Observou-se, após a incubação de 24 h, que as células
de todas as linhagens incubadas com 128 µM de peptídeo haviam perdido a integridade da
membrana e deixaram de apresentar núcleo e nucléolos definidos. Resultado diferente foi
observado depois do tratamento da linhagem B16F10 com fallaxin (Figura 27), onde se notou
alteração da morfologia das células, as quais apresentaram o seu volume bastante reduzido,
mas sem perderem aparentemente a integridade da membrana plasmática. Apesar de a
foto-documentação ter ocorrido apenas na maior concentração, notou-se que algumas
concentrações mais baixas, como a de 64 µM, também causaram efeitos semelhantes, todavia
com uma intensidade menor. Nas linhagens de células de câncer tratadas com os PACs
74
75
fallaxin e pentadactylin também se verificou a presença de pequenas vesículas, as quais se
encontravam suspensas no meio de cultura, nas maiores concentrações de peptídeo.
As linhagens incubadas com o peptídeo PGL-Ll não foram foto-documentadas, pois não
ocorreu redução da viabilidade celular das linhagens celulares testadas no ensaio do MTT.
A análise das células da linhagem MCF-7 tratadas com 49 µM (IC
50
) de
pentadactylin sintético mostraram resultados interessantes. Primeiramente, a redução da
viabilidade celular foi bem menor que 50%, o esperado já que a concentração utilizada foi a
do IC
50
. Não se observou por microscopia óptica de contraste de fase perda da integridade da
membrana, contudo, notou-se a presença de pequenas vesículas livres no meio (Figura 29).
Observou-se também um pequeno, mas significativo (teste t: t = 5,478, df = 4; p = 0,0054)
aumento (5,21% versus 11,73%) do número de células pequenas e de baixa granulosidade
após o tratamento com o peptídeo (Figura 30). As análises por teste t (t = 3,170, df = 4)
também mostraram que o pequeno aumento (0,16% versus 0,51%) de granulosidade das
células foi significativo (p = 0,0339). Os dados obtidos pelo método de exclusão de azul de
tripan pela célula corroboraram os resultados acima de que a membrana das células tratadas
permaneceu íntegra (Figura 31A). A determinação do potencial transmembrânico da
mitocôndria por citometria de fluxo demonstrou que a alteração do potencial não foi
significativa após o tratamento (Figura 31B).
Todavia, as análises por citometria de fluxo para determinação da fragmentação de
DNA e das proporções das células nas diferentes fases do ciclo celular apresentaram
alterações significativas. A porcentagem média de DNA fragmentado aumentou, em
aproximadamente, 4,5 vezes nas células tratadas em relação ao controle (33,46% versus
7,38%), este aumento foi significativo de acordo com o teste t utilizado para as análises
estatísticas (t = 18,25, df = 4, p<0,0001) (Figura 31C). Já a análise do ciclo celular
demonstrou que as células não estão conseguindo se dividir para voltar para a fase G1 como
evidenciado pela redução da porcentagem de células em G1 em cerca de 2,8 vezes (60,9%
versus 21,5%; teste t: t = 9,186, df = 3, p = 0,0027) e o aumento de 2,09 vezes (36,6% versus
17,5%; teste t: t = 14,98, df = 3, p = 0,0006) da quantidade de células em G2/M (Figura 31D).
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7
6
6
77
Figura 27. Microscopia de contraste de
fase de células de câncer de pele murino
(B16F10) após 24 horas de incubação na
ausência de peptídeo (A); com 128 µM
do peptídeo fallaxin (B). Barra = 30 µm.
As setas indicam células que tiveram o
seu tamanho reduzido e a sua forma
alterada.
Figura 28. Microscopia de contraste de
fase de células de fibroblasto (FHN)
após 24 horas de incubação na ausência
de peptídeo (A); com 128 µM dos
peptídeos pentadactylin (B) e fallaxin
(C). Barra = 30 µm. As setas indicam a
presença de debris celulares, sugerindo a
perda da integridade da membrana
plasmática.
A
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g
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sintético.
A
Fi
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Membrana plasmática lisada
Concentração de pentadactylin (μM)
Freq
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0 49
0
20
40
60
80
100
Potencial normal
Potencial alterado
Concentração de pentadactylin (μM)
Freq
üência (%)
A
B
0 49
0
10
20
30
40
*
Concentração de pentadactylin (μM)
DNA fragmentado (%)
0 49
0
20
40
60
80
G1 S G2/M
*
*
Concentração de pentadactylin (μM)
Freq
üência (%)
D
C
Figura 31. Resultados sobre o mecanismo de ação anticarcinogênico do peptídeo
pentadactylin sobre células da linhagem celular de câncer de mama MCF-7. As células foram
incubadas por 24 h com o peptídeo na concentração de 49 µM. (A) Freqüência de células com
membrana plasmática íntegra ou lisada observadas por microscopia de luz pela exclusão do
azul de tripan. (B) Análise do potencial transmembrânico da mitocôndria; alterado: exclusão
de rodamina 123 e emissão menor de fluorescência. (C) Porcentagem de DNA fragmentado
após o tratamento com o peptídeo. (D) Proporção de células nas diferentes fases do ciclo
celular determinada pela excitação do iodeto de propídeo. Os resultados estão apresentados
como a média ± desvio padrão. As análises estatísticas foram feitas pelo teste t. *: p<0,05.
79
5.7. Perfil protéico em SDS-PAGE
A complexidade protéica do veneno de L. labyrinthicus foi avaliada por um gel
SDS-PAGE 12%, corrido overnight a 3 mA (Figura 32). Após a coloração com nitrato de
prata, foi possível observar a presença de proteínas de elevada massa molecular na secreção
estudada.
Figura 32. Perfil protéico da secreção cutânea de L. labyrinthicus em SDS-PAGE 12%.
Eletroforese realizada a 3 mA e corada com nitrato de prata. Mm: marcador de massa
molecular; Ll: secreção cutânea de L. labyrinthicus (15 e 20 µg).
5.8. Atividade proteolítica
A análise da composição peptídica/protéica da secreção cutânea de L. labyrinthicus
por espectrometria de massa indica a presença de possíveis fragmentos dos peptídeos
antimicrobianos fallaxin e pentadactylin (Tabela 8). Todavia, apenas os fragmentos Flx-16
(1.563 Da) e Flx-22 (2.193 Da) do peptídeo fallaxin foram confirmados, tendo as suas
seqüências obtidas por degradação de Edman. A presença desses fragmentos sugere a ação de
enzimas proteolíticas, importantes, por exemplo, na inativação dos peptídeos citotóxicos
potencialmente prejudiciais para o animal após algum tempo em contato com a pele.
Exemplos de possíveis sítios de clivagem nos PAMs por peptidases presentes na secreção
cutânea de leptodactilídeos podem ser vistos na Figura 33.
80
Tabela 8. Possíveis fragmentos dos peptídeos fallaxin e pentadactylin detectados por
MALDI-TOF MS.
Peptídeos Massa molecular (Da)
Teórica Experimental
Fallaxin
GVVDILKGAAKDIAGHLASKVMNKL-NH
2
2.547,46 2.546,65
GVVDILKGAAKDIAGHLASKVM
a
2.192,24 2.192,40
GVVDILKGAAKDIAGHLASK 1.962,13 1.962,36
GVVDILKGAAKDIAGHLAS 1.834,04 1.834,12
GVVDILKGAAKDIAGHLA 1.747,00 1.747,09
GVVDILKGAAKDIAGH
a
1.562,88 1.562,97
GVVDILKGAAKDIA
1.368,80 1.367,50
Pentadactylin
GLLDTLKGAAKNVVGSLASKVMEKL-NH
2
2.541,46 2.540,29
GLLDTLKGAAKNVVGSLAS 1.813,03 1.813,12
GLLDTLKGAAKNVVGSLA 1.726,00 1.725,72
GLLDTLKGAAKNVVGSL 1.654,96 1.653,96
GLLDTLKGAAKNV 1.298,76 1.298,70
GLLDTLKGAAKN 1.199,69 1.199,78
a
Fragmento seqüenciado.
Figura 33. Localização dos prováveis pontos de clivagem (barras vermelhas) observados nos
peptídeos fallaxin, pentadactylin, syphaxin e ocellatins 1 a 5. Em preto, destacam-se os
resíduos hidrofóbicos; em vermelho, os negativamente carregados; em azul, os positivamente
carregados e, em verde, polares não-carregados.
A partir desses achados, buscou-se a identificação de peptidases na secreção cutânea
do animal estudado por meio dos ensaios caseinolíticos, gelatinolíticos e com o emprego de
substratos fluorogênicos. O ensaio espectrofotométrico com caseína como substrato protéico
81
inespecífico revelou a presença de enzimas proteolíticas (serino- e/ou metalo-peptidases) na
secreção testada. Observou-se um discreto aumento da atividade à temperatura ambiente
(25°C), porém valores semelhantes foram obtidos a 37°C e 50° C (Figura 34A). A análise
estatística por ANOVA de uma via seguida do teste de comparação múltipla de Bonferroni
indicou que as diferentes temperaturas testadas não afetaram significativamente a atividade
mensurada (F
2, 3
= 6,975, p = 0,0745). Os testes realizados para a determinação do pH ótimo
de atividade caseinolítica não puderam determinar o melhor pH para atividade proteolítica da
secreção, visto que a atividade foi bastante similar entre o pH 4,0 e pH 10,0 (Figura 34B), não
diferindo significativamente entre si (ANOVA de uma via com pós-teste de Bonferroni:
F
6,7
= 1,836, p = 0,2225).
25 37 50
0.00
0.02
0.04
0.06
Temperatura (°C)
Abs
218 nm
4 5 6 7 8 9 10
0.00
0.02
0.04
0.06
pH
Abs
218 nm
A
B
Figura 34. Análise das condições ótimas da atividade caseinolítica utilizando-se 40 μg de
secreção cutânea de L. labyrinthicus. Os dados são apresentados como o aumento da
absorvância a 218 nm da duplicata da reação com amostra em relação à média da duplicata do
seu controle. (A) Avaliação da influência da temperatura (25, 37 e 40°C). (B) Influência do
pH na atividade proteolítica. Os valores são expressos como média ± SD em relação aos
controles de um experimento feito em duplicata.
A atividade gelatinolítica foi visualizada por meio de zimografia. A aplicação de
40 μg de secreção de L. labyrinthicus liofilizada e 10 µL (15,2 µg de proteínas) de secreção
fresca em gel SDS-PAGE 9% co-polimerizado com 0,1% (p/v) de gelatina, incubado em
pH 8,0, revelou leve perda de atividade gelatinolítica durante o processo de congelamento e
liofilização da amostra (Figura 35), todavia a quantidade de amostra liofilizada utilizada foi
suficiente para detectar atividade. Duas bandas de atividade proteolítica com cerca de 65 kDa
e 70 kDa foram visualizadas, sendo a atividade da primeira mais intensa.
82
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2550
2750
2950
3150
3350
0 6 12 18 24 30
Atividade (mUF/min)
Tempo (min)
Gly-Pro-AMC L-Leu-AMC L-Alanyl-L-Alanyl-Phe-Ala-AMC
Figura 37. Monitoramento da atividade proteolítica da secreção cutânea de
L. labyrinthicus (15,6 µg de proteína) sobre os substratos Gly-Pro-AMC, L-Leu-AMC e
L-Alanyl-L-Alanyl-L-Phe-Ala-AMC ao longo de 30 min. mUF/min = mili-unidades de
fluorescência por minuto.
800
30800
60800
90800
120800
150800
0 12,8 25,6 38,4 51,2
Atividade (mUF/min)
Concentração protéica (µg)
Gly-Pro-AMC L-Leu-AMC L-Alanyl-L-Alanyl-Phe-Ala-AMC
Figura 38. Influência da concentração protéica da secreção cutânea de L. labyrinthicus na
atividade proteolítica (mUF/min) sobre três peptídeos fluorogênicos: Gly-Pro-AMC,
L-Leu-AMC e L-Alanyl-L-Alanyl-L-Phe-Ala-AMC. O ensaio foi realizado em tampão HEPES
25 mM, pH 7,5. mUF/min = mili-unidades de fluorescência por minuto.
85
86
0
20
40
60
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5678910
Atividade relativa (%)
pH
Gly-Pro-AMC
0
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40
60
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5678910
Atividade relativa (%)
pH
L-Leu-AMC
A
B
0
20
40
60
80
100
5678910
Atividade relativa (%)
pH
L-Alanyl-L-Alanyl-L-Phe-Ala-
AMC
Figura 39. Perfil da atividade proteolítica
da secreção bruta de L. labyrinthicus
(25,6 µg de proteína) em diferentes pHs.
Substratos: (A) Gly-Pro-AMC; (B)
L-Leu-AMC; (C) L-Alanyl-L-Alanyl-L-
Phe-Ala-AMC. Os ensaios foram feitos
em tampão AMT e os resultados estão
expressos como atividade relativa à
atividade máxima obtida.
C
Por meio da incubação de 15,2 µg de secreção fresca corrida em gel SDS-PAGE
10% com os três substratos fluorogênicos testados anteriormente, observou-se atividade
proteolítica localizada em uma banda de cerca de 50 kDa (Figura 40). Atividade peptidásica
em duas bandas com mais de 220 kDa que não entraram no gel também foi observada.
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Tabela 9. Efeitos de diferentes inibidores sobre a atividade proteolítica da secreção cutânea
de L. labyrinthicus (25,6 µg de proteínas) na hidrólise dos substratos fluorogênicos Gly-Pro-
AMC, L-Leu-AMC e L-Alanyl-L-Alanyl-L-Phe-Ala-AMC. A incubação da secreção bruta
com os inibidores foi realizada em tampão HEPES 50 mM pH 7,5 por 45 min.
Inibidor Concentração
(mM)
Atividade relativa (%)
Gly-Pro-
AMC
L-Leu-AMC L-Alanyl-L-Alanyl-L-
Phe-Ala-AMC
Fenantrolina
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10 0,0 0,0 51,8
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10 80,8 100,0 100,0
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b
0,1 81,5 94,6 81,4
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b
0,1 89,4 55,8 65,4
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b
1 66,8 85,4 11,4
Leupeptina
b
0,1 87,1 98,3 98,1
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c
0,01 100,0 100,0 100,0
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0,001 74,2 100,0 80,4
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Inibidor de metalo-peptidase.
b
Inibidor de serino/cisteíno-peptidase.
c
Inibidor de cisteíno-peptidase.
d
Inibidor de aspártico-peptidase.
5.9. Atividade de PLA
2
As PLA
2
são moléculas encontradas freqüentemente nos venenos de vários animais.
Sabe-se que essas enzimas estão envolvidas em processos inflamatórios, doenças e estão
distribuídas em vários tecidos diferentes, o que sugere um papel fundamental em vários
processos fisiológicos. A análise da secreção cutânea de L. labyrinthicus detectou a atividade
de PLA
2
(Figura 41A). A atividade detectada foi menos potente que a observada na peçonha
de Crotalus durissus terrificus (cascavel), todavia a análise estatística por ANOVA de duas
vias demonstrou que os resultados são significativos (p<0,01).
A ANOVA de duas vias (modelo 3 × 11) (Amostra × Tempo) demonstrou que existe
um efeito estatisticamente significativo do fator amostra (F
2, 66
= 8484, p<0,0001) sobre a
absorvância. O fator tempo exerceu também um efeito significativo sobre a absorvância
(F
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6. Discussão
6.1. Atividade antimicrobiana e hemolítica
A análise da secreção cutânea da rã-pimenta L. labyrinthicus por espectrometria de
massa do tipo MALDI-TOF revelou a imensa riqueza química dessa secreção (Figura 15 e
Anexo 2). Contudo, essa enorme riqueza se apresenta subestimada por questões
metodológicas. De acordo com Zheng e colaboradores (2005), o perfil peptídico da secreção
cutânea de anfíbios possui o potencial de ser utilizado para a elucidação de questões de
taxonomia biológica, já que o perfil peptídico da secreção de espécimes da mesma espécie é
significativamente similar e, entre espécies do mesmo gênero, existe alguma similaridade.
Outra importante aplicação do perfil peptídico é na identificação de peptídeos funcionais
comuns entre diferentes espécies. Entretanto, essa metodologia é limitada para peptídeos sem
pontes dissulfeto com massa molecular entre 300 a 4.000 Da (Favreau et al., 2006).
O presente estudo permitiu a caracterização de um peptídeo inédito de 1.761 Da
(PGL-Ll) (Figuras 16E e 17E) que não apresenta similaridade a nenhum outro disponível no
banco de dados UniProt Knowledgebase. Tal peptídeo é rico em glicina e leucina, devendo
ser inserido assim no grupo dos peptídeos ricos em determinados aminoácidos. Apesar dos
estudos preliminares de atividade terem indicado possível atividade antimicrobiana e
hemolítica (Figura 14), ensaios realizados com o peptídeo puro revelaram que este não
apresenta atividade contra as bactérias testadas e nem contra eritrócitos humanos (Tabela 5).
Provavelmente, a atividade detectada no ensaio preliminar foi causada pelo peptídeo
pentadactylin que elui praticamente junto com esse peptídeo. Todavia, existe a probabilidade
desse peptídeo atuar em sinergismo com o PAM pentadactylin. Estudos demonstraram que
peptídeos neutros, como plasticins, podem atuar como pertubadores primários da membrana,
adotando uma orientação transmembrânica, atuando em sinergismo com peptídeos catiônicos.
A falta de carga não previne a adsorção de interações hidrofóbicas, mas podem evitar maiores
rearranjos do peptídeo responsáveis pela atividade biológica (Amri et al., 2006).
A ausência de atividade antimicrobiana e hemolítica condiz com as características
químicas do peptídeo, o qual é extremamente hidrofóbico (todos os resíduos), não é propenso
a formar α-hélice e, portanto, não é anfipático, além de não ser catiônico (carga igual a zero
em pH 7,0); características inerentes à maioria dos PAMs conhecidos. Devido a sua presença
em grande quantidade na secreção cutânea de L. labyrinthicus, o peptídeo PGL-Ll deve
possuir alguma função biológica desconhecida que não seja a antimicrobiana, antitumoral ou
91
hemolítica. Outros testes de atividade biológica devem ser realizados para a determinação da
função desse curioso peptídeo, lembrando-se de realizar esses ensaios dissolvendo a
macromolécula testada em solvente apolar.
Os PAMs fallaxin e pentadactylin também foram isolados da secreção estudada.
O PAM fallaxin foi originalmente purificado da secreção cutânea de L. fallax (Rollins-Smith
et al., 2005) e posteriormente de L. pentadactylus (King et al., 2005), espécie da qual também
foi isolado o peptídeo pentadactylin. A presença de fallaxin e pentadactylin na secreção
cutânea das espécies L. fallax, L. labyrinthicus e L. pentadactylus corrobora os resultados
obtidos por Hedges & Heinicke (2007), no qual as três espécies foram colocadas juntas no
grupo dos pentadactylus por meio da análise de seqüências de DNA mitocondrial, sendo as
espécies L. labyrinthicus e L. pentadactylus mais aparentadas entre si. Análises de seqüências
de DNA também mostraram que os leptodactilídeos podem ser um grupo parafilético.
A impossibilidade da obtenção de um cladograma bem definido a partir das seqüências dos
peptídeos de leptodactilíldeos não anula a importância dessas moléculas em estudos
filogenéticos. Apenas sugere a necessidade de um maior número de caracteres para a análise,
evidenciando a importância do estudo dos PAMs, ou que os dados não são
espécie-específicos. Atualmente, está cada vez mais em uso a utilização de diferentes tipos de
caracteres em estudos evolutivos, resultando em dados mais precisos e confiáveis, assim, será
possível desenvolver estudos evolutivos de leptodactilídeos por meio da análise combinatória
com os vários dados disponíveis como seqüências de DNA, de peptídeos e caracteres
morfológicos (Conlon et al., 2007b).
As estruturas primárias desses peptídeos possuem grande similaridade a de outros
peptídeos antimicrobianos isolados do gênero Leptodactylus (Figura 19). A seqüência
N-terminal desses peptídeos é extremamente conservada, com a conservação dos resíduos G1,
D4 e K11; substituições conservativas nas posições 2, 3, 12 e 13; e trocas semi-conservativas
nos resíduos de 6 a 10 e 15. Essas observações sugerem a enorme importância desempenhada
por esses PAMs ao longo da história evolutiva desses animais, indicando a possibilidade de
apresentarem concomitantemente outras funções, como por exemplo, a anticarcinogênica
avaliada no presente trabalho (Vanhoye et al., 2003). O alinhamento múltiplo realizado com o
emprego do ClustalW revelou uma identidade de 92% entre fallaxin e o peptídeo laticeptin; e
de 68% entre pentadactylin e fallaxin. Entretanto, de acordo com as distâncias dos ramos da
árvore neighbor-joining o peptídeo pentadactylin é mais similar aos ocellatins,
principalmente ao ocellatin 2, do que ao PAM fallaxin. Essa divergência pode ser devido ao
92
próprio método, visto que a análise por neighbor-joining pelo PAUP usa um algoritmo que
envolve fatores diferentes dos que os utilizados para o cálculo de graus de similaridade pelo
ClustalW.
Dessa maneira, nota-se significativa atuação da pressão evolutiva na conservação da
seqüência dos aminoácidos dos peptídeos antimicrobianos. Essa observação é consistente com
a hipótese de que muitos PAMs são relacionados evolutivamente, tendo surgido de múltiplas
duplicações de um gene ancestral que existia antes da radiação das várias famílias de anfíbios.
A diversificação dos PAMs poderia então ser parte de uma estratégia evolutiva direcionada
pela rápida evolução dos patógenos (Duda Jr. et al., 2002). A distribuição de aminoácidos
nesses tipos de peptídeos não é aleatória, pois sempre contêm uma alta proporção de resíduos
que promovem a conformação em α-hélice (Ala, Leu, Lys, Met, His), enquanto resíduos que
desestabilizam essa conformação são sub-representados. A importância dos resíduos de
aminoácidos terminais da parte mais variável da estrutura primária do peptídeo foi ressaltada
pela síntese de análogos do PAM citropin 1.1 em um estudo anterior (Doyle et al., 2003).
Assim, a presença de PAMs tão semelhantes como fallaxin e pentadactylin presentes na
secreção cutânea da rã L. labyrinthicus pode ser porque cada um embora possua um alvo e
uma potência específica, atuando em conjunto, minimizam as chances dos patógenos
apresentarem resistência contra ambos. Além do mais, estudos demonstram que a mistura de
PAMs de uma secreção podem ter uma eficiência de 10 a 100 vezes maior que a dos
peptídeos isolados (Vanhoye et al., 2003).
A tabela 4 evidencia a semelhança das características químicas e biológicas entre os
peptídeos antimicrobianos de leptodactilídeos. Todos possuem massa molecular semelhante,
ponto isoelétrico, carga e atividade antimicrobiana bastante parecidas. Contudo a
hidrofobicidade média e o momento hidrofóbico variam, influenciando os diferentes HC
50
e
MICs observados. Os MICs contra bactérias Gram-negativas determinados para fallaxin no
presente trabalho estão em total acordo com os obtidos por Rollins-Smith et al.(2005), o que é
extremamente coerente, visto que as linhagens bacterianas utilizadas foram as mesmas.
Todavia, nossos resultados revelaram que o peptídeo em questão é ativo contra a bactéria
Gram-positiva S. aureus, contradizendo os resultados obtidos por Rollins-Smith et al.(2005) e
Nielsen et al. (2007), sendo que os MICs antimicrobianos do último trabalho diferiram dos
anteriores (Tabela 6). Contudo, como o ensaio antimicrobiano é sensível aos parâmetros do
ensaio e à linhagem bacteriana utilizada, e os três estudos usaram diferentes linhagens de
S. aureus, a divergência dos resultados pode estar relacionada a estas questões.
93
Diferentemente da ausência de atividade antimicrobiana contra bactérias Gram-
positivas pelo PAM fallaxin apresentada em outros trabalhos, nosso estudo detectou atividade
contra B. subtilis, além da já mencionada atividade contra S. aureus. As razões dessa
ocorrência ainda não são totalmente compreendidas, sendo necessários maiores estudos,
principalmente com relação à interação entre o peptídeo e a membrana celular da bactéria,
mas podendo ser influenciada pelas condições do teste. Todavia, a ausência de atividade
antimicrobiana e hemolítica do peptídeo truncado Flx-16 também foi observada por Nielsen et
al. (2007). A perda de atividade biológica com a clivagem sugere que a seqüência completa é
necessária para o desempenho da função e que, provavelmente, a amidação C-terminal é
importante para o desempenho da atividade.
Resultado divergente do obtido por King et al. (2005) foi encontrado no MIC
determinado para pentadactylin testado contra P. aeruginosa, possivelmente decorrente das
diferentes condições de ensaio, já que a linhagem bacteriana utilizada foi a mesma. As outras
concentrações inibitórias mínimas e o HC
50
obtidos estão em pleno acordo com o trabalho
anterior (Tabela 6).
A análise do multi-alinhamento dos PAMs de leptodactilídeos mostrou que o PAM
mais similar a fallaxin é o laticeptin, ocorrendo apenas duas substituições conservativas nas
posições 13 e 19. Essa similaridade é refletida na semelhança entre os MICs obtidos nos
trabalhos publicados. Outro peptídeo que deve apresentar um MIC bastante parecido aos dos
peptídeos citados é o syphaxin, pois apresenta a mesma distribuição de resíduos de
aminoácidos considerando-se a polaridade. Infelizmente, no trabalho de Dourado et al. (2007)
não foi possível realizar estudos mais aprofundados com este PAM, entretanto os MICs de
seus fragmentos SPX(1–16) e SPX(1–22) foram determinados. Curiosamente, esses truncados
apresentaram MICs mais potentes que os encontrados para os PAMs íntegros de
leptodactilídeos. No presente trabalho e no de Nielsen et al. (2007), o fragmento de fallaxin
Flx-16 foi testado e nenhuma atividade biológica foi encontrada, como dito anteriormente,
apesar da enorme semelhança com o truncado SPX(1–16) (Tabela 4). O ensaio
antimicrobiano realizado por Nielsen et al. (2007) utilizou as mesmas linhagens de E. coli e S.
aureus que Dourado et al. (2007), todavia, o protocolo usado foi diferente, inclusive da
metodologia do presente trabalho. De acordo com os resultados do trabalho realizado por
Zelezetsky et al. (2005), pequenas alterações das características químicas do peptídeo, como
tamanho da face polar, profundidade do setor hidrofóbico e o gradiente longitudinal de
hidrofobicidade, podem produzir grandes impactos na atividade biológica. Por exemplo,
94
verificou-se que resíduos de aminoácidos hidrofóbicos com cadeia lateral curta reduzem a
atividade antimicrobiana e esse pode ser o caso dos fragmentos mencionados acima, onde
ocorreu a substituição de uma leucina no peptídeo syphaxin por valina no fallaxin, sendo que
a cadeia lateral da valina é menor que a da leucina. A divergência entre os resultados dos
trabalhos levanta a questão da necessidade de padronização dos ensaios antimicrobianos,
favorecendo e validando a comparação dos resultados disponíveis na literatura.
A amidação C-terminal é altamente conservada entre os peptídeos antimicrobianos
de leptodactilídeos. Essa modificação pode aumentar a atividade antimicrobiana, pois reduz a
repulsão eletrostática entre a porção C-terminal do peptídeo e o grupo fosfodiéster dos
fosfolipídeos (Cao et al., 2005). Uma importante qualidade de um antibiótico é ser seletivo,
assim a eficácia de um peptídeo antimicrobiano é determinada pela comparação entre as
atividades hemolítica e antimicrobiana, atuando como um índice terapêutico. A natureza
seletiva dos peptídeos antimicrobianos vem sendo atribuída a diferenças na composição da
membrana das células de mamíferos e de microorganismos. Enquanto, os primeiros possuem
fosfolipídeos “zwitteriônicos”, a membrana externa das bactérias é carregada negativamente
(Yeman & Yount, 2003). Portanto, seria de se esperar que um aumento na carga positiva pela
amidação C-terminal devesse aumentar não apenas a atividade antimicrobiana, como
melhorar a seletividade por células bacterianas (Cao et al., 2005). Além disso, o aumento da
atividade devido à amidação C-terminal também pode ser ocasionado pela indução da
formação de uma hélice C-terminal ou estabilização das conformações em hélice já existentes,
alteração do momento dipolo e redução da susceptibilidade à degradação por
carboxipeptidases (Mor & Nicolas, 1994; Shalev et al., 2002).
A predição da estrutura secundária para os peptídeos testados fallaxin e
pentadactylin indica uma forte propensão para adotar a conformação α-hélice. Entretanto, a
projeção helicoidal (Figura 21) ilustra que a natureza anfipática da hélice é baixa com dois
resíduos de lisina segregados de um lado da hélice e outros dois na face posterior. As
propriedades antimicrobianas e citolíticas dos peptídeos são determinadas pela complexa
interação entre cationicidade, hidrofobicidade, capacidade de adotar a conformação α-hélice e
anfipaticidade (Yeaman & Yount 2003).
Estudos demonstram que a conformaçao em α-hélice anfipática é fundamental para
a nocividade contra bactérias Gram-positivas, mas menos necessária contra Gram-negativas
(Giangaspero et al., 2001). Desde que a cationicidade e a hidrofobicidade sejam mantidas,
peptídeos com pouca anfipaticidade ainda são ativos, como é observado nos peptídeos de
95
Leptodactylus. Semelhantemente, foi demonstrado que o aumento do momento hidrofóbico
promove a atividade hemolítica contra eritrócitos humanos (Dathe & Wieprecht, 1999).
A presença de cinco resíduos básicos no fallaxin contra quatro no pentadactylin torna o
peptídeo mais catiônico, resultando na maior potência antimicrobiana dessa macromolécula.
Assim, é provável que as baixas potências hemolíticas dos PAMs fallaxin e
pentadactylin sejam influenciadas pela moderada anfipaticidade dos peptídeos. Além disso, a
atividade relativamente baixa contra as bactérias testadas pode ser conseqüência da sua
reduzida cationicidade e da presença de dois resíduos carregados negativamente, o que pode
prejudicar a interação com a membrana das bactérias. Os peptídeos estudados são encontrados
em grande quantidade no veneno bruto, então, apesar da baixa potência, sua concentração
pode exceder o valor do MIC para muitos dos patógenos aos quais o animal possa estar
exposto no seu ambiente silvestre.
A importância dos parâmetros estruturais dos peptídeos consiste nos seus diferentes
papéis na interação com as membranas de células procarióticas e eucarióticas (Dathe &
Wiepreccht, 1999). A comparação e a compreensão desses parâmetros auxiliarão o desenho
de novos antibióticos, suprindo a urgente necessidade de novos fármacos para combater
linhagens de microorganismos resistentes (Oren et al., 1999). Além disso, devido à
semelhança entre os peptídeos isolados de leptodactilídeos, estudos nessa linha poderão
auxiliar a elucidar questões taxonômicas do grupo.
6.2. Atividade anticarcinogênica
A literatura indica que muitos dos peptídeos antimicrobianos ativos contra um amplo
espectro de microorganismos também desempenham uma função antitumoral (Tabela 7).
Comparado ao grande número de PAMs já isolados de anfíbios, poucos estudos foram
realizados para a verificação de atividade contra linhagens de câncer e sobre o mecanismo de
ação (Cruz-Chamorro et al., 2006). Freqüentemente, os PACs possuem o C-terminal amidado,
apesar dessa característica não ser uma regra, por exemlo, os peptídeos gaegurins isolados de
Rana rugosa; e são catiônicos. Todavia, peptídeos pouco catiônicos como o gaegurin 6
também podem ser citotóxicos ou citostáticos contra células carcinogênicas.
Estudos observaram uma maior incidência dos resíduos de aminoácido I e K nos PACs do que
nos PAMs e que o balanço inversamente proporcional entre anfifilicidade e hidrofobicidade é
importante para os PACs na invasão das membranas celulares das células tumorais (Dennison
et al., 2006). A análise da tabela 7 nos permite verificar que os PACs menos catiônicos
96
apresentam maior hidrofobicidade média (<H>), contudo, também sugere que, como na
atividade antimicrobiana, a atividade anticarcinogênica é decorrente de um sinergismo de
características químicas do peptídeo.
Os dados obtidos nos ensaios de atividade anticarcinogênica indicam que os PAMs
fallaxin (Figura 22) e pentadactylin (Figura 23) são ativos contra as linhagens celulares de
câncer testadas. Como no ensaio antimicrobiano, o peptídeo fallaxin demonstrou ser mais
potente que o pentadactylin (Figura 24). Esse resultado pode ser decorrente de uma provável
similaridade entre os mecanismos de ação dos peptídeos em ambas as atividades testadas,
visto que alguns PACs atuam nas membranas celulares levando à necrose da célula.
Considerando-se que o mecanismo anticarcinogênico desses peptídeos seja via membrana, a
diferença encontrada nos valores de IC
50
para as diferentes linhagens celulares testadas sugere
que a atividade dos PACs como a dos PAMs é dependente da composição da membrana
plasmática da célula testada. Assim, a interação entre as características do peptídeo e a
composição da membrana das células utilizadas é que determina a especificidade e a potência
da atividade desempenhada pelo peptídeo (Dennison et al., 2006).
Infelizmente, os PAMs testados demonstraram ser mais citotóxicos para a linhagem
celular normal de fibroblasto (FHN) do que para as linhagens de câncer (Figura 24), sendo
portanto classificados no grupo dos PACs representado por melittin,os quais são ativos contra
células de câncer e células normais. Este resultado vai de encontro aos dados obtidos nesse e
em outros estudos que concluíram que os peptídeos fallaxin e pentadactylin são fracamente
hemolíticos e, portanto, pouco citotóxicos para células normais. Diferentemente do peptídeo
pentadactylin, o peptídeo magainin 2 foi seletivo para células tumorais no trabalho de
Haimovich & Tanaka (1995). Helmerhorst e colaboradores (1999) demonstraram que a
atividade de vários peptídeos catiônicos é fortemente influenciada pela força iônica. No seu
trabalho, histatins e magainins foram inativas contra eritrócitos humanos e Candida albicans
em PBS, mas apresentaram potente atividade quando testados em meio de menor força iônica.
Ensaios hemolíticos são feitos em Tris ou PBS, condições muito salinas para os ensaios
antimicrobianos ou antitumorais. Assim, é questionável se os resultados de ensaios
hemolíticos conduzidos nesses tampões possam ser comparados apropiadamente a resultados
de ensaios conduzidos em um meio de baixa força iônica e sob diferente tempo de incubação.
A influência da força iônica na atividade sugere que a interação peptídeo-hemácia é
governada primeiramente por forças eletrostáticas. Outros fatores também influenciam no
resultado hemolítico, tais como tempo de armazenamento dos eritrócitos e diferenças
97
individuais nos antígenos dos grupos sanguíneos. Portanto, inferências sobre a citotoxicidade
de um peptídeo devem ser feitas com muita precaução e de forma criteriosa, sendo necessária
a condução dos ensaios sob condições semelhantes, viabilizando futuras comparações
(Helmerhorst et al., 1999).
Apesar da citotoxicidade dos peptídeos pentadactylin e fallaxin ter sido maior para
células normais de fibroblasto do que para as células tumorais testadas, esses peptídeos
podem vir a ser usados como uma alternativa no combate ao câncer. Alternativas que
aumentem a seletividade desses peptídeos tornariam possível o uso dessas potentes moléculas,
as quais apresentaram IC
50
menor que a do PAC magainin 2 ativo contra células de câncer de
bexiga (Lehmann et al., 2006). Pesquisas revelaram que peptídeos análogos compostos de D-
e L-aminoácidos possuem a sua especificidade contra célula tumoral aumentada, sendo a
seletividade provavelmente determinada principalmente pela atração eletrostática dos
peptídeos aos componentes acídicos (mucinas O-glicosiladas) da superfície das células de
câncer, mas podendo ser influenciada pela maior superfície de contato (microvilos) dessas
células. Além da redução da toxicidade, a composição simples desses análogos, a sua
estabilidade frente à degradação enzimática e inativação por componentes do soro e a
reduzida antigenicidade fazem desses peptídeos excelentes candidatos a novos
quimioterápicos (Papo & Shai, 2003). Como a toxicidade para as células normais também é
uma característica dos quimioterápicos convencionais, estratégias desenvolvidas para
aumentar a sua eficiência também podem ser empregadas no uso de pentadactylin.
Por exemplo, o direcionamento do PAC para a célula tumoral por meio do uso de vetores,
como peptídeos que se ligam especificamente a determinadas células tumorais (Enbäch &
Laakkonen, 2007) e vírus (Guo, Thorne & Bartlett, 2008).
Alterações da viabilidade celular das linhagens testadas também foram confirmadas
pela observação em microscópio de contraste de fase das células tratadas com os peptídeos
fallaxin e pentadactylin (Figuras 25, 26, 27 e 28). Notou-se que todas as linhagens tratadas
com as maiores concentrações de peptídeo tiveram a sua morfologia celular modificada, seja
por perda da integridade da membrana celular e indefinição do núcleo e do nucléolo, outrora
bastante definidos, ou por redução do tamanho das células. Nas maiores concentrações
testadas, foi possível a observação de uma grande quantidade de debris celulares,
evidenciando uma forte atividade contra a integridade da membrana dessas células, com
exceção da linhagem B16F10 incubada com fallaxin, na qual aparentemente não houve perda
da integridade da membrana plasmática.
98
O ensaio de viabilidade celular com MCF-7 foi repetido para o peptídeo sintético
pentadactylin, tendo sido o resultado encontrado bastante coerente ao obtido com o peptídeo
nativo (Figura 23). Assim, os ensaios de citostaticidade e citotoxicidade para inferência do
mecanismo de ação do PAC pentadactylin foram realizados com o IC
50
do peptídeo sintético.
Apesar da utilização da concentração que deveria reduzir em 50% a viabilidade celular,
aparentemente, uma porcentagem muito menor de células foi afetada. A relação dose-
dependência também foi constatada por Risso et al. (1998) com os peptídeos BMAP, os
quais, em concentrações mais baixas causavam pouca permeabilidade da membrana celular e
necrose, no entanto, em altas concentrações induziam a maioria das células U937 à morte por
necrose.
Os resultados oriundos da análise por citometria de fluxo demonstraram que ocorreu
um aumento da fragmentação de DNA (Figura 31C) e o ciclo celular das células incubadas
com o pentadactylin foi alterado de forma significativa (Figura 31D). A fragmentação do
DNA e a condensação de cromatina foram verificadas pela redução do número de eventos
com alta fluorescência e aumento dos eventos com baixa fluorescência. Já o ciclo celular foi
interrompido, observando-se uma redução da quantidade de células em G1 e o aumento
proporcional de células estacionadas em G2/M, sugerindo que as células não estão
conseguindo se dividir, que o ciclo foi obstruído.
Em células somáticas normais, a fase M do ciclo celular envolve dois passos:
mitose, onde cromátides-irmãs são alinhadas e segregadas em duas células; e citocinese,
caracterizada pela partição do citoplasma e de seus componentes nas duas células-filhas. O
ponto de checagem G2 do ciclo celular é responsável pela suspensão da mitose quando o
DNA é danificado. Os danos no DNA ativam várias moléculas que promovem atividades
celulares como interrupção do ciclo celular, reparo do DNA ou apoptose por meio da via do
p53, se o dano não puder ser reparado. Outros pontos de checagem também podem levar à
interrupção do ciclo celular caso algo de errado seja detectado, um deles detectando a má
formação do fuso mitótico, o outro verificando o posicionamento do fuso. Algumas vezes a
célula retorna ao ciclo mitótico, acumulando danos, o que leva à sua morte por catástrofe
mitótica, caracterizada por células gigantes micro ou multinucleadas, com cromatina não-
condensada (Erenpreisa et al., 2000; Okada & Mak, 2004; Jin & El-Deiry, 2005; Erenpreisa
& Cragg, 2007). O DNA é o principal alvo de vários quimioterápicos utilizados na terapêutica
do câncer, os quais atuam direta ou indiretamente nessa molécula, ou bloqueando funções
99
metabólicas envolvidas com o DNA, por exemplo, a da DNA polimerase (Roos & Kaina,
2006).
Como dito anteriormente, a fragmentação do DNA pode levar à apoptose (Igney &
Krammer, 2002). O grau de degradação de DNA varia de acordo com o estágio do processo
apoptótico, tipo celular e a natureza do agente indutor da morte celular. Os danos secundários
causados pela danificação do DNA e desbalanceamento do crescimento geralmente causam
alterações na morfologia celular e no metabolismo, apresentando características tanto do
processo apoptótico, quanto do necrótico (Darzynkiewicz et al., 1997).
Além da fragmentação do DNA, foram observadas por citometria de fluxo (Figura
30) alterações no tamanho (redução do volume celular) e na granulosidade das células
(redução da granulosidade), as quais sugerem morte celular por apotose. A habilidade de
espalhar luz do feixe de laser do citômetro de fluxo é alterada durante a morte celular,
refletindo mudanças morfológicas das células. Entretanto, tais mudanças não são específicas
de apoptose, podendo ser resultado de quebra mecânica das células, isolamento do núcleo
celular ou do processo necrótico. É provável que o resultado obtido seja oriundo do
aparecimento de pequenas vesículas livres no meio, como visualizado na análise por
microscopia de contraste de fase (Figura 29), já que alterações da morfologia das células não
foram vizualizadas. De acordo com Barros e colaboradores (2003), tais vesículas podem
indicar morte celular pela via apoptótica. Portanto, as imagens obtidas na microscopia refutam
a interpretação dos resultados da citometria de fluxo de alteração da morfologia das células de
MCF-7 incubadas com o peptídeo. Apesar da técnica de citometria de fluxo ser um
procedimento rápido, objetivo e sensível, é necessário que o mecanismo de morte celular seja
sempre confirmado por microscopia de luz ou eletrônica (Darzynkiewicz et al., 1997).
O ensaio com rodamina 123 mostrou que o potencial transmembrânico da
mitocôndria não foi alterado com o tratamento por pentadactylin (Figura 31B), todavia a
apoptose é caracterizada pela redução do referido potencial. O experimento para verificação
da integridade da membrana plasmática pela exclusão do azul de tripan (Figura 31A) indicou
que a mesma permaneceu inalterada. A exclusão do azul de tripan de dentro da célula e outros
métodos baseados na integridade da membrana plasmática apesar de simples e baratos podem
falhar na identificação de células em apoptose. A exclusão desses corantes não ocorre em
células necróticas e em apoptose tardia, entretanto, o experimento é falho na detecção de
células em estágios iniciais de apoptose que excluem o corante, podendo ser alterado também
pelo tipo de célula e pelo modo de indução da apoptose. Portanto, tais resultados não refutam
100
a hipótese de morte por apoptose, visto que células em estágios iniciais desse processo
apresentam integridade estrutural, preservação da função da membrana plasmática e das
organelas. A inexistência de evidências confirmando a apoptose celular com um método em
particular não significa a ausência de apoptose. Por isso é importante o uso de diferentes
métodos, visando à análise de diferentes características (Darzynkiewicz et al., 1997).
Além das características observadas nas células de MCF-7 tratadas, o processo
apoptótico apresenta outras peculiaridades, tais como DNA picnótico, desintegração do
envelope nuclear e presença de corpos apoptóticos que são fagocitados sem causar inflamação
local. A morte celular por apoptose nem sempre é acompanhada por todas essas
características, podendo ser atípica (Darzynkiewicz et al., 1997).
A translocação pela membrana plasmática de células de HeLa pelo PAM buforin 2
sem a perturbação da sua organização lipídica foi observada por Takeshima et al. (2003).
Contudo, apesar da ação antimicrobiana pela inibição de síntese de proteína, o mesmo não
apresentou toxicidade contra as células testadas, em oposição à atividade dispensada pelo
PAM pentadactylin. Resultado interessante também foi obtido com o PAM dermaseptin S3, o
qual é tóxico apenas para o parasita intraeritocítico, agindo sem danificar a integridade da
membrana do eritrócito (Ghosh et al., 1997). Infelizmente, o processo pelo qual buforin 2,
dermaseptin S3 e pentadactylin transpõem a membrana celular (se é que transpõem) ainda não
foi elucidado. Foi sugerido que alguns peptídeos se ligam paralelamente à membrana
induzindo uma curvatura positiva, aumentando a área da superfície da camada externa. Esse
fato leva à redução da espessura do cerne hidrofóbico da membrana, o que pode facilitar a
penetração dos peptídeos, atingindo alvos intracelulares (Sato & Feix, 2006). Os PACs
citotóxicos também para células normais geralmente provocam a morte celular via modelo
barrel-stave. Outra forma de morte de células tumorais causada por PACs é pela formação de
poros toroidais, caracterizado pela formação de poros temporários. Enquanto abertos, esses
poros também podem permitir a entrada dos peptídeos dentro da célula, atingindo alvos
celulares e desencadeando a via apoptótica, assim a ação dos PACs pode ter múltiplos alvos
(Dennison et al., 2006).
Os dados obtidos com a incubação do PAM pentadactylin com células da linhagem
de câncer de mama MCF-7 sugerem morte celular pela via apoptótica. O PAC magainin
isolado de anfíbio também parece inviabilizar células de leucemia promielocíticas HL-60 por
apoptose (Cruz-Chamorro et al., 2006). Nesse estudo foram verificados sinais apoptóticos
como liberação de citocromo c, aumento da atividade proteassômica, fragmentação de DNA,
101
externalização de fosfatidilserina e aumento da geração de espécies reativas de oxigênio.
É possível que o PAC pentadactylin não entre na célula para desencadear a via apoptótica,
podendo esta ser iniciada pela via extrínseca, visto que não houve permeabilização da
membrana externa da mitocôndria, evento central da via intrínseca. Portanto, o PAC
pentadactylin pode estar atuando nos receptores de morte, desencadeando a cascata de
caspases, responsáveis pelas alterações químicas e morfológicas típicas da apoptose (Igney &
Krammer, 2002). Entretanto, existe a possibilidade da via apoptótica não ser a principal
responsável pela morte celular. Por exemplo, Zaffaroni et al. (2001) cogitaram que a droga
C1311, a qual bloqueia o ciclo celular em G2/M de células osteogênicas, pode levar ao
processo de apoptose como resultado de uma autólise generalizada, já que apenas um pequeno
número de células apresentavam características apoptóticas e de uma maneira
tempo-dependente.
Resultados como a fragmentação do DNA, a alteração do ciclo celular e a presença
de vesículas na cultura de células de MCF-7 tratadas com pentadactylin sugerem morte
celular por apoptose, visto que a ativação da caspase 3 resulta nas características
mencionadas. Entretanto, a fragmentação da membrana plasmática de células incubadas com
maior concentração de pentadactylin sugere o mecanismo de morte celular por necrose,
contudo, a perda de integridade da membrana pode ocorrer nos estágios finais do processo
apoptótico. Também é possível que o processo apoptótico seja seguido de necrose.
Durante o início do processo apoptótico ocorre a perda da assimetria dos
fosfolipídeos da membrana plasmática, levando à exposição de fosfatidilserina na face
externa, tornando a membrana mais suscetível à desestabilização pelo peptídeo, levando à
necrose da célula. A perda de integridade de membrana observada sob altas concentrações
pode indicar o mecanismo de ação carpet-like, pois pode ser que a destruição da membrana
dependa que a concentração de peptídeos ligados atinja um limiar específico, levando ao
colapso inúmeros poros toroidais (Dennison et al., 2006). Esse mecanismo de ação
(carpete/poro toroidal) foi recentemente descrito para o peptídeo melittin (Allende, Simon &
McIntosh, 2005). Portanto, o cálculo de IC
50
para esse tipo de peptídeo não é satisfatório, pois
este valor, caso não seja o da concentração limitante para o desempenho da atividade
biológica, não inviabilizará metade das células.
Outro mecanismo pelo qual as células tratadas poderiam perder a sua integridade de
membrana seria pelo modelo Shai-Matsuzaki-Huang, no qual ocorre um adelgaçamento da
membrana seguido da formação de poros transientes e colapso da membrana. Nesse caso, os
102
poros também permitiriam que os peptídeos atingissem alvos intracelulares capazes de
desencadearem o processo apoptótico antes da desintegração da membrana (Dennison et al.,
2006).
A apoptose é um modo ativo e fisiológico de morte celular sujeito a processos
regulatórios complexos (Darzynkiewicz et al., 1997). Ainda não se sabe se apoptose,
senescência, necrose, autofagia e catástrofe mitótica são programas independentes ou que se
relacionam em algum grau; e se ocorrem sucessivamente ou simultaneamente. Um importante
aspecto da tumorigenicidade e do desenvolvimento de resistência a drogas anticâncer é a
resistência a morte celular, principalmente via apoptose. Assim, novas estratégias capazes de
induzir o processo apoptótico em células de câncer são bem-vindas, modulando a
sensibilidade do tumor e das células normais aos agentes antitumorais, via os mecanismos
regulatórios da apoptose (Okada & Mak, 2004).
Além do papel antimicrobiano dos peptídeos catiônicos de anfíbios, várias
evidências já indicam o seu uso na terapêutica do câncer, visto que os PACs apresentam
potente atividade contra células tumorais, são pouco imunogênicos e são pequenos, reduzindo
os custos da síntese. Vale ressaltar que a maior parte dos estudos foram realizados em
modelos in vitro, portanto o desempenho desses PACs pode ser totalmente alterado in vivo. O
estudo do mecanismo de ação e o desenvolvimento de estratégias capazes de aumentar a
potência, seletividade e resistência a componentes do soro podem representar um importante
avanço dos modelos terapêuticos (Kim et al., 2003; Shadidi & Sioud, 2003; Cruz-Chamorro
et al., 2006). Contudo, ainda não está claro se o animal utiliza a atividade anticâncer dos
PACs, ou se essa atividade é apenas um feliz bônus originado da possível atividade
membranolítica desses peptídeos (Doyle et al., 2003).
6.3. Atividade enzimática
O perfil eletroforético da secreção cutânea da rã-pimenta apresentou algumas bandas
principais como: várias bandas acima de 90 kDa, bandas com cerca de 45 kDa, 50 kDa e
30 kDa; e em torno de três bandas ao redor de 16 kDa (Figura 32). Os dados gerados pela
análise da secreção cutânea de L. labyrinthicus por espectrometria de massa revelaram vários
possíveis fragmentos dos peptídeos estudados fallaxin e pentadactylin, sendo que dois desses
fragmentos foram confirmados por Edman (Flx-16 e Flx-22) (Tabela 8).
A presença desses truncados é um forte indicador de atividade peptidásica.
Formas truncadas de peptídeos também foram observadas nas secreções de outros
103
leptodactilídeos (Figura 33): Dourado et al. (2007) identificaram seis fragmentos do peptídeo
syphaxin de Leptodactylus syphax, Nascimento (2007) obteve a confirmação de quatro dos 17
possíveis fragmentos derivados de ocellatins 1 a 5 (L. ocellatus) e o truncado Flx-22
identificado no presente trabalho também foi isolado por Rollins-Smith et al. (2004) da
secreçao de L. fallax.
Assim, esforços foram voltados para a pesquisa de enzimas proteolíticas
do veneno estudado.
Os pontos de clivagem correspondentes aos prováveis fragmentos situam-se entre as
posições 12 e 23 dos PAMs pentadactylin e fallaxin (Figura 33). Não foi possível identificar a
presença de uma característica específica nas seqüências que cause o reconhecimento como
substrato para peptidases, porém nenhuma clivagem após resíduo ácido foi detectada. Assim,
sugere-se que a clivagem seja realizada por proteases com diferentes especificidades,
podendo, até mesmo, existir peptidases inespecíficas no veneno. Até o momento, não foram
encontrados nas secreções cutâneas de leptodactilídeos peptídeos truncados que resultem de
clivagens entre as posições 1 e 11. Os fragmentos de syphaxin descritos por Dourado et
al.(2007) originaram-se de cisões após os resíduos 16, 19, 22, 23 e 24, enquanto os
fragmentos de ocellatins 1 a 5 resultaram da clivagem após o resíduo 12 ao 17 e depois do 19
(Nascimento, 2007) (Figura 33). Como até agora nenhuma clivagem antes do resíduo 12 foi
observada, é possível que esse segmento N-terminal, o qual é extremamente conservado, seja
menos importante para o desempenho da atividade biológica do que a porção C-terminal.
Sabe-se que peptídeos como citropin 1.1 são armazenados na forma inativa nas glândulas da
pele, mas quando o sapo é estressado, fica doente ou é atacado, uma endoprotease cliva o
peptídeo espaçador e o peptídeo ativo é liberado na pele. Como esses peptídeos podem ser
tóxicos para o anfíbio, 10 minutos após ser secretado, endoproteases removem resíduos do
peptídeo, destruindo a sua atividade biológica (Doyle et al., 2003). Porém, o número de
peptídeos resultantes de processamento proteolítico conhecidos até o momento é muito
reduzido, não permitindo conclusões definitivas a respeito da ocorrência ou da freqüência de
clivagens nas regiões N-terminais e a respeito da especificidade dessas cisões.
Como os fragmentos de fallaxin Flx-16 e Flx-22 não apresentaram atividade
antimicrobiana e nem hemolítica nos testes preliminares ou nos ensaios para determinação de
HC
50
e MIC no caso do primeiro fragmento, sugere-se que a clivagem do PAM fallaxin tenha
ocorrido com o propósito da inativação do peptídeo, visando à proteção do animal. Foi
observado que alguns fragmentos peptídicos isolados das secreções de outras famílias de
anuros sofrem amidação C-terminal após a clivagem (Resnick et al., 1991), o que pode
104
restaurar a atividade antimicrobiana perdida com a cisão (Sitaram & Nagaraj, 1999) ou ativar
os fragmentos para o desempenho de outras funções, por exemplo, hormonais. Todavia,
existem relatos de fragmentos como o SPX(1–16) e SPX(1–22), de syphaxin, com potente
atividade biológica e que não sofreram processamento após a clivagem (Dourado et al.,
2007).
Os experimentos com substrato fluorogênico identificaram enzimas proteolíticas
capazes de clivar após os resíduos de leucina (L), prolina (P) e alanina (A), todos hidrofóbicos
como verificado na maioria das clivagens dos prováveis fragmentos encontrados (Figura 37).
Observa-se também que apenas os peptídeos com o N-terminal livre foram sujeitos à atuação
das peptidases do veneno, indicando a presença de aminopeptidases. Existe a possibilidade
que a secreção testada seja capaz de clivar após resíduos de tirosina (Y) e arginina (R),
hidrofóbico e básico respectivamente. Todavia, como a extremidade N-terminal dos peptídeos
contendo os resíduos citados antes do AMC apresenta-se bloqueada, a atividade proteolítica
tenha sido impossibilitada. Por exemplo, os peptídeos fluorogênicos N-Succynil-Gly-Pro-
Leu-Gly-Pro-AMC e N-Succynil-Ile-Ala-AMC não sofreram hidrólise enzimática, já os Gly-
Pro-AMC e L-Alanyl-L-Alanyl-L-Phe-Ala-AMC liberaram AMC em contato com a secreção
testada. Apesar dos peptídeos Gly-Pro-AMC, L-Alanyl-L-Alanyl-L-Phe-Ala-AMC e L-Leu-
AMC terem sido clivados, a atividade proteolítica foi maior no primeiro substrato, o qual é
específico para dipeptidilaminopeptidase (Figura 37). A menor atividade detectada foi com o
peptídeo L-Alanyl-L-Alanyl-L-Phe-Ala-AMC. Os resultados obtidos após a incubação do gel
SDS-PAGE 10% com os substratos acima revelaram que a mesma banda de
aproximadamente 50 kDa é responsável pela clivagem dos três peptídeos fluorogênicos
testados (Figura 40). As outras duas bandas de atividade de proteínas que não entraram no gel
separador podem ser resultado da oligomerização da proteína de 50 kDa, visto que a amostra
não foi fervida e que o tampão de amostra não possui agente redutor como DTT. Contudo,
essa observação não significa que a mesma enzima é responsável pelas clivagens, podem
existir outras enzimas de massas semelhantes gerando proteólise, visto que o padrão de
inibição resultante do ensaio em placa com inibidores foi diferente, além de perfis de pH
ótimo e velocidade máxima distintos.
Utilizando-se os peptídeos fluorogênicos para os quais a secreção cutânea de
L. labyrinthicus apresentou atividade proteolítica, testou-se a influência da concentração
protéica na atividade, revelando que a atividade enzimática sobre os substratos testados
aumenta com o aumento da quantidade de proteína na secreção testada (Figura 38). O mesmo
105
ensaio foi utilizado para verificar o pH ótimo de atividade (Figura 39). O pH ótimo de
atividade proteolítica foi distinto para cada substrato e para os substratos L-Alanyl-L-Alanyl-
L-Phe-Ala-AMC e L-Leu-AMC houve mais de um pico de atividade, indicando a atuação de
enzimas diferentes. O peptídeo L-Leu-AMC (Figura 39B) sofreu maior hidrólise no pH 7,0 e
picos nos pHs 8,0 e 10,0, já com o substrato L-Alanyl-L-Alanyl-L-Phe-Ala-AMC , houve pico
de liberação de fluoróforo nos pHs 7,5 e 8,0 (Figura 39C). Entretanto, para todos os
substratos, a atividade máxima foi observada em pH neutro a levemente básico, o que é
extremamente coerente com o pH 6,9 da secreção estudada, visto que é nesse pH que as
enzimas atuam. Observou-se também que as enzimas que clivam os substratos Gly-Pro-AMC
e L-Alanyl-L-Alanyl-L-Phe-Ala-AMC perdem a atividade em pH 5,0, pH 6,0 e pH 10,0,
enquanto o peptídeo L-Leu-AMC é hidrolizado por peptidases que reduzem a sua atividade
principalmente nos pHs 5,0 e 9,0.
Verificou-se a presença de atividade caseinolítica na secreção, mesmo que esta tenha
sido baixa. Não foi possível a identificação da temperatura (Figura 34A) e do pH (Figura
34B) ótimos para essa atividade, pois os resultados não foram estatisticamente significativos,
variando muito pouco. Possivelmente esse fato se deve às características desse ensaio, capaz
de evidenciar a presença de diferentes enzimas (serino- e metalo-peptidases) que requerem
condições específicas para clivarem o substrato inespecífico caseína, além da baixa
sensibilidade do mesmo.
A atividade gelatinolítica de duas bandas entre 60 e 70 kDa foi observada na
zimografia (Figura 35). A massa molecular das enzimas gelatinolíticas não pôde ser
determinada com acurácia, pois as amostras não foram aquecidas e nem reduzidas, não
evitando a agregação entre proteínas, e porque a presença de gelatina pode resultar em
interações capazes de afetar a mobilidade das proteínas (Almeida et al., 2002). A atividade
testada foi observada apenas nos pHs 7,0; 8,0; 9,0 e 10,0, coincidindo com o pH ótimo neutro
a alcalino observado no ensaio fluorogênico (Figura 36B). Entretanto, como no ensaio
caseinolítico, não foi possível identificar o melhor pH para a atividade proteásica. A
incubação do gel com diferentes tampões mostrou que a atividade observada é dependente de
cálcio e é inibida na presença de EDTA e de excesso de zinco (Figura 36A), características
indicadoras da presença de metalo-peptidases (Souza, Gerlach & Line, 2001). O tampão de
incubação contendo Tris-HCl 50 mM, CHAPS 0,02% (p/v), CaCl
2
10 mM e NaCl 150 mM
foi o que favoreceu mais a atividade das enzimas gelatinolíticas identificadas. Estudos
sugerem que o detergente CHAPS pode modular a atividade e a estabilidade de algumas
106
proteínas (Sah & Kim, 2006), entretanto o aumento observado pode ser devido também ao
aumento da força iônica gerado pelo NaCl. Todavia, a determinação de qual dos dois fatores
influencia no aumento da atividade detectada só poderá ser feita após a realização de
experimentos testando cada uma das variáveis separadamente.
O ensaio fluorogênico com diferentes inibidores sugere que a proteólise observada
pela secreção glandular da rã-pimenta é gerada por metalo- e serino-peptidases (Tabela 9),
pois inibições da atividade menores que 25% não foram consideradas significativas. A
clivagem do peptídeo Gly-Pro-AMC foi inibida por inibidores de metalo- e serino-peptidases.
A inibição total ocorreu após a incubação com o inibidor de metalo-peptidase fenantrolina,
ocorrendo também em menor intensidade com os inibidores bestatina e EDTA, reforçando a
idéia de que a hidrólise desse substrato é feita principalmente por metalo-peptidases.
Aparentemente, a proteólise do substrato
L-Leu-AMC acontece por metalo- e serino-
peptidases, visto que não houve inibição por E-64, inibidor exclusivo de cisteíno-peptidase, e
por pepstatina A, inibidor de aspártico-peptidase. Já a hidrólise do peptídeo fluorogênico
L-
Alanyl-L-Alanyl-L-Phe-Ala-AMC é menos reduzida por fenantrolina que com os outros
substratos, todavia a inibição por PMSF chegou a 88% da atividade máxima, indicando, além
da presença de metalo-peptidases, forte atuação de serino-peptidases. Como, em todos os
ensaios realizados, não houve atividade proteolítica em meio ácido, sugere-se a ausência de
glutâmico- e aspártico-peptidases. Os resultados do ensaio de inibição estão em conformidade
com os perfis de atividade versus pH obtidos, pois metalo- e serino-peptidases são mais ativas
em pH neutro a ligeiramente básico (Barrett & Rawlings, 1995; Dunn, 2001; Rawlings et al.,
2008).
O ensaio de atividade fosfolipásica demonstrou a presença de fosfolipases na
secreção glandular da rã-pimenta. A atividade detectada passou a ser estatisticamente
significativa após o segundo minuto de leitura. Já a peçonha de C. durissus terrificus usada
como controle positivo alterou rapidamente o pH do ensaio (Figura 41). Portanto, a secreção
cutânea de L. labyrinthicus apresenta atividade fosfolipásica assim como a do anfíbio
Phyllomedusa hypochondrialis (Conceição et al., 2007). Como a maioria das fosfolipases A
2
possuem entre 13 kDa e 20 kDa, as bandas em torno de 16 kDa e algumas em torno de 14,4
kDa detectadas por SDS-PAGE 12% (Figura 32) e as massas de cerca de 15 kDa observadas
na análise por MALDI-TOF das últimas frações (Anexo) podem ser de fosfolipases.
Apesar da detecção de diferentes tipos de atividade enzimática na secreção cutânea
de L. labyrinthicus, a identificação dos grupos de peptidases e fosfolipases só poderá ser feita
107
de forma conclusiva após a purificação e seqüenciamento dessas proteínas. A análise de
proteínas presentes na secreção de anuros não é muito comum, sendo a busca por peptídeos
bioativos mais corriqueira. A atividade das enzimas observadas na secreção de
L. labyrinthicus pode estar envolvida na regulação da homeostase da pele, processamento de
peptídeos (por ex: PAMs) ou atuando como moléculas de defesa. Finalmente, mais estudos
são necessários para melhor caracterizar as proteínas dessa secreção e elucidar as suas funções
bioquímicas.
108
7. Considerações finais
O presente estudo constatou a enorme riqueza peptídica/protéica da secreção cutânea
de L. labyrinthycus, sendo esta uma possível fonte de peptídeos com as mais diversas funções
biológicas. Toda essa variedade possui relevante potencial para o desenvolvimento de novas
drogas, principalmente contra bactérias ou células tumorais resistentes aos fármacos
convencionais.
Os peptídeos antimicrobianos caracterizados neste trabalho, fallaxin e pentadactylin,
haviam sido previamente purificados da secreção de L. fallax e L. pentadactylus
respectivamente por outros grupos de pesquisa. A presença dos mesmos PAMs em três
espécies diferentes sugere a importância evolutiva dessas macromoléculas, indicando também
que os mesmos possuem outras funções igualmente importantes como a antibacteriana.
Nossos resultados mostraram que os dois peptídeos são ativos contra bactérias Gram-positivas
e Gram-negativas, além de não apresentarem atividade hemolítica significativa.
A divergência dos resultados antimicrobianos e de toxicidade celular deste trabalho
com relação a trabalhos de outros pesquisadores evidencia a necessidade de padronização de
um protocolo único e com condições que viabilizem comparações posteriores.
Como verificado para outros PAMs de anfíbios, os peptídeos fallaxin e
pentadactylin também são anticarcinogênicos. A descoberta de novas moléculas antitumorais
é de extrema importância e urgência devido ao surgimento de resistência aos quimioterápicos
disponíveis no mercado. Infelizmente, ambos os peptídeos são pouco seletivos para células de
câncer, tendo apresentado o menor IC
50
para células de fibroblasto normais, portanto o seu
uso terapêutico deverá ser acoplado a mecanismos que reduzam a toxicidade dos mesmos.
Os resultados dos estudos do mecanismo de ação de pentadactylin contra a linhagem
celular de câncer de mama MCF-7 sugerem que uma das vias de morte celular induzida por
este peptídeo é a apoptótica, já que algumas características de apoptose inicial foram
observadas nas células tratadas com uma dose equivalente ao IC
50
. Contudo, células de MCF-
7 tratadas com 128 µM do peptídeo perderam completamente a integridade da membrana
celular, podendo essa observação ser resultado do processo apoptótico avançado ou de morte
celular por necrose. No último caso, o processo necrótico aconteceria após o início da via
apoptótica, de forma dependente da concentração do peptídeo, sugerindo a inviabilização
celular pelo mecanismo poro toroidal/carpet-like. Todavia, essas são apenas sugestões,
109
necessitando-se de maiores estudos para chegar a conclusões sobre o verdadeiro mecanismo
de ação do PAC pentadactylin.
Apesar da maioria dos estudos de secreção glandular de anfíbios investigar
peptídeos biologicamente ativos, verificou-se a presença de importantes componentes
enzimáticos. Notou-se a presença de enzimas proteolíticas pertencentes, provavelmente, ao
grupo das metalo- e serino-peptidases, as quais atuam de maneira ótima em pH neutro a
ligeiramente básico. Verificou-se no ensaio gelatinolítico a presença de duas bandas de
atividade proteolítica dependentes de cálcio e inibidas por EDTA e excesso de zinco,
características de metalo-peptidases. Além da atividade proteolítica, uma fraca atividade
fosfolipásica também foi detectada. Ainda não se sabe a verdadeira importância dessas
proteínas, podendo estar envolvidas no processamento dos peptídeos biologicamente ativos
presentes no veneno ou atuar como um mecanismo de defesa. Assim, este é um campo
praticamente inexplorado, capaz de gerar inúmeros resultados interessantes e importantes para
a melhor compreensão da biologia dos anfíbios.
110
8. Perspectivas
Como verificado nas análises por MALDI-TOF MS, a secreção cutânea de
L. labyrinthicus é riquíssima em peptídeos. Além dos dois peptídeos com atividade biológica
caracterizados neste trabalho, outros peptídeos responsáveis pela atividade hemolítica
observada em algumas frações ainda precisam ser purificados e caracterizados tanto química
como biologicamente. Além disso, outros ensaios preliminares de atividade biológica podem
ser realizados buscando moléculas com diferentes funções, por exemplo, antiparasitária e
antiviral.
Brevemente será realizado um ensaio antimicrobiano, testando-se em conjunto os
peptídeos pentadactylin e PGL-Ll para verificar a hipótese levantada de que, apesar da falta
de atividade antibacteriana detectada para o último, possa ocorrer uma ação sinérgica entre os
dois.
Neste trabalho, o perfil peptídico da secreção estudada baseia-se apenas nas massas
moleculares; a obtenção da estrutura primária dessas moléculas aumentará a fonte de dados
disponíveis para elucidar questões taxonômicas do grupo dos leptodactilídeos, facilitando
também a identificação de peptídeos com atividades em potencial.
Experimentos de atividade com os fragmentos Flx-16 e Flx-22 poderão ser
realizados seguindo-se o protocolo utilizado por Dourado et al. (2007) no estudo dos
fragmentos de syphaxin, extremamente parecidos com os de fallaxin, todavia detentores de
uma potente atividade antibacteriana. Assim, será possível determinar até onde as condições
do ensaio influenciaram no resultados de ausência de atividade detectada para esses
fragmentos.
Para o maior conhecimento do padrão de clivagem dos PAMs pelas peptidases do
veneno estudado, os fragmentos prováveis dos PAMs isolados poderão ser confirmados por
seqüenciamento.
Muito ainda deve ser esclarecido acerca da atividade anticarcinogênica dos
peptídeos fallaxin e pentadactylin. Logo deverão ser feitos outros experimentos para
determinação do mecanismo de ação do PAC pentadactylin, como análise morfológica por
microscopia eletrônica e estudos com anexina V, além de testar outras concentrações do
peptídeo. Ensaios para verificar se o peptídeo entra ou não na célula também são de extrema
relevância. Os mesmos ensaios serão realizados com o peptídeo fallaxin, o qual já se encontra
sintetizado.
111
Tendo em vista a citotoxicidade de fallaxin e pentadactilin para células normais de
fibroblasto, a qual não foi observada para eritrócitos humanos, torna-se necessário a
verificação da toxicidade desse peptídeo para outras células normais por meio de um
protocolo que possibilite comparações posteriores. Caso a citotoxicidade seja confirmada,
esse problema poderá ser minimizado, por exemplo, pela construção de análogos com D- e L-
aminoácidos com maior especificidade para células tumorais.
Quanto aos estudos acerca das enzimas presentes na secreção cutânea da rã-pimenta,
muito ainda tem a ser feito. Outras condições podem ser utilizadas para verificar a atividade
proteolítica do veneno, por exemplo, a influência da temperatura e da força iônica sobre a
atividade. Para identificar a que grupos pertencem às proteínas detectadas na zimografia, o gel
poderá ser incubado com diferentes inibidores. Futuramente, as enzimas proteolíticas e
fosfolipásicas responsáveis pelas atividades detectadas poderão ser purificadas e sua estrutura
primária determinada.
Apesar da diversidade funcional dos peptídeos antimicrobianos atrair a atenção para
que sejam fontes de novas drogas, o caminho para o seu uso clínico é longo e cheio de
entraves. Algumas das dificuldades enfrentadas são o elevado custo de produção e a
susceptibilidade às enzimas proteolíticas. Portanto, concomitantemente à descoberta de novos
peptídeos biologicamente ativos, deve-se desenvolver novas estratégias capazes de sanar os
problemas existentes e aumentar a seletividade e a potência dessas fascinantes moléculas.
112
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ANEXOS
Anexo 1. Perfil cromatográfico típico do fracionamento do extrato bruto da secreção cutânea
de L. labyrinthicus em coluna C
18
(Vydac 218TP54) em um sistema RP-HPLC com um
gradiente linear de acetonitrila/TFA 0,1%. O monitoramento das frações foi a 216 nm e a
eluição a 1 mL/min. As frações estão numeradas de acordo com a ordem de coleta.
125
126
Anexo 2. Tabela com as massas moleculares [M+H]
+
dos peptídeos observados nas frações
obtidas por RP-HPLC em coluna C
18
(Vydac 218TP54). Todas as frações foram plaqueadas
com matriz HCCA e AS antes de serem analisadas por espectrometria de massa do tipo
MALDI-TOF nas faixas m/z 500–4000 Da e 4–20 kDa.
Fração Massa molecular [M + H]
+
1
530,079 560,005 772,766
2
509,199 525,173 711,209
4
917,127
10
537,195 557,372 765,221 1.745,456 1.751,352
11
598,042 614,168 634,151 650,135 656,129 765,255
825,169 845,127 879,053 891,000
12
862,325 880,337 977,328 995,366 1.009,363 1.124,389
1.239,401
13
890,980 1.124,495 1.239,546 1.368,499
14
636,202 1.497,452 5590,358
15
956,290 981,267 1.054,599 1.382,387 1.479,358 1.497,542
1.553,422
16
1.461,456 14.79,479 1.501,487
18
1.461,605 1.479,550 2.284,063
19
1.461,746
20
785,276
22
670,201 818,598 834,600
23
624,095 833,542 891,032 1.254,861 5.835,737 7.041,452
24
506,379 624,276 1.255,218
25
506,210 711,410 751,350 767,349 891,011 917,474
1.018,850 1.024,700
26
1.148,427
127
27
623,983 890,895 1.017,549 1.101,999 4.093,377 4.576,338
4.592,452 5.053,202 5.203,752
28
550,683 891,002 1.033,460 1.196,743 4.073,489 4.571,798
4.589,558 5.053,154 5.203,752
29
917,397 1.310,609 4.073,489 4.571,798 4.589,558 5.053,154
5.203,752
30
601,341 619,265 633,939 676,266 795,449 1.043,079
1.180,832 1.259,053 1.272,817 1.294,458 1.310,832 1.564,256
1.826,012 1.842,361 4.428,115 4.558,192
31
619,273 623,996 676,290 795,445 890,909 1.294,508
1.563,898 1.688,054 1.825,985 1.938,175 2.086,039
32
591,264 611,393 640,353 661,566 676,326 755,289
862,362 925,486 1.032,681 1.081,609 1.104,599 1.258,626
1.272,401 1.294,536 1.310,506 1.328,441 1.334,500 1.377,630
1.482,713 1.563,960 1.587,797
33
658,374 676,384 734,387 755,474 862,442 918,470
998,310 1.090,847 1.104,717 1.144,503 1.166,553 1.182,559
1.199,781 1.249,558 1.272,620 1.294,612 1.310,621 1.328,585
1.334,584 1.354,712 1.377,694 1.456,918 1.482,828 1.496,040
1.546,086 1.564,093 1.585,032 1.698,105 1.784,286 1.823,200
1.938,226 1.963,300 2.178,720 4.165,335 4.179,920
34
619,326 676,349 862,392 891,011 1.166,492 1.182,455
1.272,528 1.294,590 1.310,537 6.266,710 6.804,843 7.616,806
8.029,962 8.101,209 8.156,505 9.379,169 9.507,558
35
825,092 1.166,665 1.182,569 1.276,726 1.294,708 1.310,606
1.543,063 6.268,642 6.809,626 7.112,554 8.034,064 8.143,283
9.386,262
36
1.276,511 1.292,572 1.359,830 1.455,959 1.512,917 1.563,995
1.748,086 1.938,232 2.259,322 4.119,382 6.807,864 7.106,894
37
1.563,990 1.765,967 2.177,454 7.109,981
38
672,213 1.101,582 1.299,704 1.938,130 6.345,215
39
695,330 703,546 719,276 760,574 794,535 818,642
852,560 2.009,082 2.025,118 4.089,863 6.148,911 6.208,632
6.345,458 7.103,293 7.145,530
128
40
1.954,325 2.009,198 2.025,215 7.099,950
41
825,190 1.578,101 1.938,329 4.274,349 7.085,560 7.145,014
42
1.923,374 1.938,219 6.367,839 7.146,562
43
1.500,967 1.655,051 1.688,001 1.712,077 1.727,128 1.769,280
1.783,156 1.814,125 1.938,311 1.963,358 1.984,368 4.036,959
5.009,915 6.229,808 7.126,714 7.144,241
44
930,625 966,716 1.421,995 1.479,005 1.500,864 1.654,959
1.748,061 1.835,125 1.954,444 1.968,244 4.383,962 4.463,923
4.715,680 4.926,255 5.012,291 5.104,084 6.154,894 6.212,961
6.316,809 6.352,022 6.367,595
45
894,639 908,523 964,543 1.020,463 1.969,333 4.365,597
5.742,644 6.367,108
46
634,109 825,096 845,049 930,677 1.592,034 4.446,408
5.103,866
47
634,107 825,048 845,005 930,560 1.033,988 1.520,817
1.592,104 1.613,739 2.193,014 2.209,440 4.073,294 4.442,949
5.003,438 5.210,798 5.228,654 5.736,172
48
1.536,008 2.547,587 2.563,619 4.703,116 5.066,224 5.211,899
5.441,933 5.648,921 5.738,902
49
1.307,746 1.364,766 1.421,779 2.172,107 2.188,116 2.547,274
2.563,317 4.703,116 5.066,224 5.211,899 5.441,933 5.648,921
5.738,902
50
1.251,048 1.649,044 1.670,676 1.726,720 2.004,776 2.547,973
4.703,116 4.978,863 5.066,224 5.093,844 5.211,899 5.441,933
5.648,921 5.738,902
51
1.043,545 1.100,501 1.157,517 1.214,524 1.556,552 1.577,786
1.626,576 1.670,627 1.686,664 4.892,049 4.948,552 5.287,951
5.654,426
52
1.817,624 2.103,780 2.511,007 2.527,885 2.532,979 4.110,965
4.232,360 4.901,657 5.304,828
53
1.761,706 1.805,701 2.541,460 5.284,180 5.560,746
54
1.761,705 5.085,789 5.286,176 5.562,794
129
55
1.761,985 1.932,085 5.084,702 7.652,799 15.282,877
56
509,591 634,160 668,044 825,087 878,955 890,864
5.084,702 7.652,799 15.282,877
57
959,105 5.083,007 7.558,334 15.100,478
58
2.601,044 2.617,093 4.298,320
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