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UNIVERSIDADE DE RIBEIRÃO PRETO - UNAERP
CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS, NATURAIS E TECNOLÓGICAS
PROGRAMA DE PÓS GRADUAÇÃO EM TECNOLOGIA
AMBIENTAL
Estudo da biodegradação de gasolina
por bactérias presentes no solo da
área de armazenamento e de
distribuição de combustíveis no
município de Ribeirão Preto.
Usaldo Mendes Ramos
RIBEIRÃO PRETO
2006
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Milhares de livros grátis para download.
Usaldo Mendes Ramos
Estudo da biodegradação de gasolina por bactérias
presentes no solo da área de armazenamento e de
distribuição de combustíveis no município de
Ribeirão Preto.
DISSERTAÇÃO APRESENTADA À UNIVERSIDADE DE
RIBEIRÃO PRETO À COMISSÃO DE PÓS-GRADUAÇÃO
DO CURSO DE MESTRADO PROFISSIONALIZANTE EM
TECNOLOGIA AMBIENTAL COMO PARTE DOS
QUESITOS PARA OBTENÇÃO DO TÍTULO DE MESTRE
EM TECNOLOGIA AMBIENTAL.
ORIENTADORA: Prof
a
. Dra. MARISTELA SILVA MARTINEZ
RIBEIRÃO PRETO
2006
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FICHA CATALOGRÁFICA
Ficha catalográfica preparada pelo Centro de Processamento Técnico da
Biblioteca Central da UNAERP
- Universidade de Ribeirão Preto -
Ramos, Usaldo Mendes, 1950 –
Estudo da biodegradação de gasolina por bactérias
presentes no solo da área de armazenamento e
distribuição de combustíveis no município de Ribeirão
Preto / Usaldo Mendes Ramos. - Ribeirão Preto, 2006.
f. + anexos.
Orientador(a) : Profª Dra. Maristela Silva Martinez
Dissertação (mestrado) - Universidade de Ribeirão Preto,
UNAERP, Tecnologia Ambiental, área de concentração: Meio
Ambiente, Ribeirão Preto, 2006.
1. Tecnologia ambiental. 2. Hidrocarbonetos leves.
3. Biorremediação 4. Solo Contaminado. 5. Gasolina. I Titulo
CDD: 665
USALDO MENDES RAMOS
ESTUDO DA BIODEGRADAÇÃO DE GASOLINA POR BACTÉRIAS PRESENTES NO
SOLO DA ÁREA DE ARMAZENAMENTO E DISTRIBUIÇÃO DE COMBUSTÍVEIS NO
MUNICÍPIO DE RIBEIRÃO PRETO
DISSERTAÇÃO APRESENTADA A UNIVERSIDADE DE RIBEIRÃO
PRETO À COMISSÃO DE PÓS GRADUAÇÃO DO CURSO DE
MESTRADO PROFISSIONALIZANTE EM TECNOLOGIA
AMBIENTAL COMO PARTE DOS QUESITOS PARA OBTENÇÃO
DO TÍTULO DE MESTRE EM TECNOLOGIA AMBIENTAL.
APROVADO EM 01 DE SETEMBRO DE 2006
BANCA EXAMINADORA
Prof
a
. Dra. Maristela Silva Martinez - Orientadora
Universidade de Ribeirão Preto
Prof
a
. Dra. Cristina F. P. Rosa Paschoalato
Universidade de Ribeirão Preto
Prof
a
. Dra. Eny Maria Vieira
Instituto de Química de São Carlos
Universidade de São Paulo - USP
2006
AGRADECIMENTOS
À Universidade de Ribeirão Preto – UNAERP e ao programa de Pós-
graduação em Tecnologia Ambiental, pela oportunidade a mim dada;
Ao CENPES PETROBRAS, pela bolsa de estudo a mim concedida e por me
acreditar;
Ao Centro Estadual de Educação Tecnológica “Paula Souza”, por facilitar
a minha dedicação ao mestrado;
À Prof
a
. Dra Maristela Silva Martinez, pela orientação deste trabalho e sua
dedicação;
Ao Prof. Ms Rodrigo Latanze, pelos ensinamentos de cromatografia, pela
paciência, pela amizade e, sem o qual, essa pesquisa não seria possível;
À Prof
a
. Dra. Cristina Paschoalato pela amizade, pelo apoio, pelo incentivo
e por sua dedicação em todos os momentos;
Ao Prof. Dr. Carlos Alberto França Ribeiro, que muito colaborou no
desenvolvimento das técnicas microbiológicas;
Ao Dr. Justo Camejo Ferreira (CENPES) pelo apoio e incentivo no
desenvolvimento da pesquisa;
Às alunas do Laboratório de Recursos Hídricos-LRH, Patrícia Ferrari
Paulino, Dauane Tupinambá,Thaís de Paula Silveira e ao Márcio Resende
Trimailovas, pela colaboração e a assistência dada às análises laboratoriais.
Ao Eng.Químico Danilo Morais Baratto, do Laboratório de Química
Agrícola da UNAERP, pelas análises químicas de solo.
À empresa Ambiental 2000, pela cooperação nas coletas de solo no Terminal
de Combustíveis da Petrobrás.
A todos os colegas e Professores do Programa de Mestrado em Tecnologia
Ambiental da Universidade de Ribeirão Preto.
À todos aqueles que, de alguma forma, contribuíram para a realização deste
trabalho.
Muito obrigado!
Dedico este trabalho
À Deus por todos os momentos da minha vida.
À Silvana Benedini, por seu amor e carinho a mim dedicado e aos meus
filhos Fernanda Karina, Rafael, Marina, Ana Lídia e Rodrigo pelo incentivo e
carinho, pelo amor à natureza e pelos momentos de ausência tomados para a
realização e concretização desta pesquisa.
“O grande desafio humano é resistir à sedução do repouso,
pois nascemos para caminhar e nunca para nos satisfazer com as
coisas como estão.
A insatisfação é um elemento indispensável para quem, mais
do que repetir, deseja criar, inovar, refazer, modificar,
aperfeiçoar.”
(Mário Sérgio Cortella)
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS..................................................................................... i
LISTA TABELAS........................................................................................... ii
SIGLAS E ABREVIATURAS........................................................................ iii
RESUMO......................................................................................................... iv
ABSTRACT.................................................................................................... v
1 - INTRODUÇÃO......................................................................................... 1
2 - OBJETIVO................................................................................................. 6
3 - REVISÃO BIBLIOGRAFICA................................................................... 7
3.1 - Petróleo................................................................................................ 7
3.1.1 – Impactos ambientais do e da água por hidrocarbonetos do
petróleo............................................................................................................
9
3.1.2 – Classificação e produtos......................................................... 11
3.1.3 – Utilidades................................................................................ 13
3.2 – A gasolina........................................................................................... 14
3.3 – O Benzeno, Tolueno, Etilbenzeno e Xilenos (BTEX)........................ 17
3.4 – Comportamento da gasolina no solo (ou meio poroso)...................... 18
3.5 – Propriedades dos compostos de hidrocarbonetos............................... 19
3.5.1 – Densidade.............................................................................. 19
3.5.2 – Solubilidade em água............................................................. 19
3.6 – Remediação natural............................................................................ 21
3.7 – Biorremediação de Ambientes contaminados por hidrocarbonetos... 23
4 – MATERIAIS E MÉTODOS...................................................................... 26
4.1 – O terminal de combustíveis................................................................ 27
4.1.1– A coleta de amostras no terminal de combustíveis.................. 27
4.2 – Acondicionamento e transporte das amostras.................................... 29
4.3 – O preparo das amostras de solo.......................................................... 29
4.4 – O preparo para análises microbiológicas............................................ 30
4.4.1 – Primeira cultura de solo.......................................................... 30
4.4.2 – Segunda cultura de solo.......................................................... 32
4.4.3 – Terceira cultura de solo.......................................................... 33
4.4.4 – Culturas de bactérias em tubos de ensaio............................... 36
4.4.5 – Culturas em meio líquido....................................................... 36
4.4.6 – Culturas do solo contaminado com gasolina.......................... 37
4.5 – O preparo do solo para os reatores..................................................... 39
4.6 – Cromatografia em fase gasosa............................................................ 42
5 - RESULTADOS E DISCUSSÕES............................................................. 43
5.1 – Análise do BTEX............................................................................... 43
5.2 – A curva de calibração........................................................................ 43
5.3 – Padrão de BTEX do solo................................................................... 45
5.4 – Resultados das culturas de bactérias do solo sem contaminação...... 45
5.5 – Resultados das culturas de bactérias do solo com contaminação...... 53
5.6 – As análises cromatográficas dos reatores.......................................... 56
5.7 – Gráficos das degradações dos BTEXs............................................... 57
6- CONCLUSÕES E SUGESTÕES................................................................ 64
7– REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS....................................................... 66
8– APÊNDICE I............................................................................................. 69
9 – APÊNDICE II........................................................................................... 77
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Fotografia do terminal de combustíveis da Petrobrás em Ribeirão Preto.......
05
Figura 2 – Fluxograma simplificado da metodologia desenvolvida.................................
26
Figura 3 – Layout dos pontos de coleta de solo no terminal de combustíveis.................. 27
Figura 4 – Uso do amostrador para coleta de solo............................................................ 28
Figura 5 – Inoculação das bactérias nos reatores com solo contaminado......................... 40
Figura 6 – Frascos reatores prontos para observação da biodegradação.......................... 41
Figura 7 – Cromatógrafo de fase gasosa modelo HP 6890............................................... 42
Figura 8 – Cromatograma de um ponto da curva de calibração....................................... 44
Figura 9 – Amostras de colônias formadas da 3ª cultura de solo...................................... 49
Figura 10 – Colônia de fungos crescidos no meio de culturas.......................................... 53
Figura 11 – Foto das UFC formadas nos solos contaminados com gasolina, 270 dias.... 56
Figura 12 – Cromatograma de solo contaminados com gasolina e tempo de saída dos
gases...............................................................................................................
57
Figura 13 – Gráficos da degradação do Benzeno para as concentrações de 50, 300 e
500 uL de gasolina.........................................................................................
58
Figura 14 - Gráficos da degradação do Tolueno para as concentrações de 50, 300 e
500 uL de gasolina.........................................................................................
59
Figura 15 – Gráficos da degradação do Etilbenzeno para as concentrações de 50, 300 e
500 uL de gasolina.........................................................................................
60
Figura 16 – Gráficos da degradação do M/P Xileno para as concentrações de 50, 300 e
500 uL de gasolina.........................................................................................
61
Figura 17 – Gráficos da degradação do O Xileno para as concentrações de 50, 300 e
500 uL de gasolina.........................................................................................
62
LISTA DE TABELAS
Tabela 1- Composição química de uma gasolina comum............................ 14
Tabela 2- Característica do BTEX................................................................ 18
Tabela 3- Distribuição das fases do contaminante da gasolina em solo
tipo areia média............................................................................
19
Tabela 4- Identificação dos pontos de coleta e massa de solo da 1ª coleta... 30
Tabela 5- Identificação dos pontos de coleta e massa de solo da 2ª
coleta..............................................................................................
32
Tabela 6- Identificação dos pontos de coleta e massa de solo da 3ª
coleta e 1ª medição........................................................................
34
Tabela 7- Identificação dos pontos de coleta e massa de solo da 3ª
coleta e 1ª medição com repetição.................................................
35
Tabela 8- Massa de solo e concentração de gasolina para a 4ª cultura de
bactérias.........................................................................................
38
Tabela 9- Tempo de retenção (TR) do BTEX para a calibração................... 44
Tabela 10- Número de colônias formadas da 2ª cultura de solo em pH 7,0
e profundidade de 40 e de 80 cm e 24 h de incubação..................
46
Tabela 11- Número de colônias formadas da 2ª cultura de solo em pH
7,0 e profundidade de 40 e de 80 cm e 48 h de incubação............
47
Tabela 12- Massa de bactérias formadas por unidades de colônias com 48h
de incubação da 2ª coleta de solo..................................................
48
Tabela 13- Determinação da umidade do solo por método gravimétrico 50
Tabela 14- Número de colônias formadas na 3ª cultura em pH 7,0 e
em profundidades de 40 e 80 cm, 24 de incubação.......................
51
Tabela 15- Número de colônias formadas na 3ª cultura em pH 7,0 e
em profundidades de 40 e 80 cms, 48 h de incubação..................
52
Tabela 16- Culturas de bactérias do solo contaminadas com gasolina nas
concentrações de 50, 300 e 500 uL, 24 h de incubação, 270 dias.
54
Tabela 17- Culturas de bactérias do solo contaminadas com gasolina nas
concentrações de 50, 300 e 500 uL, 48 h de incubação, 270 dias.
55
SIGLAS E ABREVIATURAS
CONAMA – Conselho Nacional do Meio Ambiente
CETESB - Companhia de Tecnologia de Saneamento Ambiental
UFC – Unidade Formadora de Colônias
BTEX – Benzeno, Tolueno, Etilbenzeno e Xilenos
TPH – Total Petroleum Hydrocarbon
NAPL – Non-aqueous Phase Liquids
DNAPL – Dense Non-aqueous Phase Liquids
TR – Tempo de Retenção
ppm – Parte por milhão
uL – Microlitros
mg/L – Miligramas por litro
RESUMO
No Estado de São Paulo existem muitos postos de abastecimento de combustíveis e supõe-se que
a vida útil dos tanques de armazenamento de combustíveis seja de aproximadamente 25 anos. Ao
longo do tempo estes tanques, apresentam desgastes, podendo ocorrer vazamentos e possíveis
contaminações. Os maiores problemas da contaminação do solo e das águas subterrâneas por
combustível são atribuídos aos hidrocarbonetos monoaromáticos, estes são os constituintes mais
solúveis e móveis da fração da gasolina, tais como Benzeno, Tolueno, Etilbenzeno e Xilenos
(BTEX). Estes compostos podem atingir as águas subterrâneas e contaminá-las. Os compostos de
BTEX são muito tóxicos ao sistema nervoso central do homem, apresentando toxicidade crônica,
mesmo em pequenas concentrações. O objetivo desta pesquisa foi determinar a existência de
bactérias no solo do Terminal de Combustíveis da Petrobrás em Ribeirão Preto e avaliar a
capacidade dos microrganismos em biodegradar gasolina. Foi desenvolvida uma metodologia
para a identificação da biodegradação dos hidrocarbonetos (BTEX) através da análise por
cromatografia em fase gasosa utilizando um detetor de ionização de chama. Os ensaios foram
realizados em bancada com reatores de vidro, utilizou-se uma massa conhecida de solo coletado
na área de estudo e adicionou-se os microrganismos típicos do local, previamente selecionados e
enriquecidos, contaminou-se o solo dos reatores com diferentes volumes de gasolina, incubou-se
a temperatura ambiente em local escuro, após decorrido 60 e 270 dias, avaliou-se a quantidade de
BTEX presente em cada reator e os resultados obtidos mostraram que ocorreu uma redução da
quantidade inicial de BTEX adicionado, concluindo-se pela ocorrência de um processo de
biodegradação natural.
Palavras Chave: BTEX, biodegradação, bactérias, contaminação da água, gasolina.
ABSTRACT
In the State of São Paulo thousands of fuel supplying facilities exist and supposes that the
estimated lifetime of the fuel storage tanks are of approximately 25 years. In the long run, these
fuel tanks show signs of wear, being able to develop leaks and therefore possible
contaminations. The biggest problems of the contamination of soil and of the underground waters
by fuel are due to the monoaromatic hydrocarbons, which are the most soluble and
mobile compound of the gasoline, such as Benzene, Toluene, Ethylbenzene and Xylene
(BTEX). These compounds can reach the underground waters and contaminate them. The
compounds of BTEX are very toxic to the central nervous system of the human body,
showing signs of chronic toxicity, even in small concentrations. The purpose of this research was
to determine the existence of bacteria in the soil of the Fuel Terminals of Petrobras in Ribeirão
Preto city and to evaluate the capacity of the micro-organisms in biodegrade gasoline. It was
developed a methodology for the identification of the biodegradation of the hydrocarbons
(BTEX) through the analysis by chromatography in fizzy (gaseous) phase using a ionization
flame detector. The attempts were carried out on the workbench with glass reactors (glass test
tubes), using a known mass of soil collected in the area of study and added to itself the typical
micro-organisms of the area, previously selected and enriched, contaminating the soil of the
reactors with different volumes of gasoline, incubating them at room temperature in dark place,
after passing 60 and 270 days, evaluated the amount of BTEX present in each reactor (glass test
tube) and the obtained results showed a reduction of the initial amount of added BTEX,
concluding by the occurrence of a process of natural biodegradation.
Key words: BTEX, biodegradation, bacterias, water contamination, gasoline.
1
1 - INTRODUÇÃO
Os desgastes ambientais, os padrões de desenvolvimento tecnológicos e industriais se
interligam. Em muitos países em desenvolvimento, as políticas energéticas estão ligadas aos
desequilíbrios ambientais, à acidificação dos solos e corpos d’água, ao desflorestamento com
vistas à obtenção de lenha para uso como combustível, à extinção da flora e fauna, etc. Esses
desgastes ameaçam o desenvolvimento econômico e o meio ambiente. Portanto a economia e a
ecologia devem integrar-se perfeitamente nos processos decisórios e legislativos, não só para
proteger o ambiente, mas também para garantir e promover o desenvolvimento das nações. A
economia não é apenas a produção de riqueza, e a ecologia não é apenas a proteção da natureza,
ambas são também muito importantes para a qualidade de vida da humanidade (COMISSÃO
MUNDIAL SOBRE MEIO AMBIENTE E DESENVOLVIMENTO, 1991).
As inter-relações entre população, recursos naturais e desenvolvimento há muito tempo
têm sido objeto de preocupação social e de estudos científicos. Da mesma maneira, a
preocupação contemporânea de promover o desenvolvimento de países em desenvolvimento tem,
desde o seu início, tomado como fator primário de planejamento a base dos recursos naturais, e
esse interesse secular tem sido sistematicamente incorporado à análise. A preocupação com o
meio ambiente, entretanto, trouxe uma nova dimensão ao estudo dos recursos, que são agora
reconhecidos como mais do que um simples ponto de partida na equação do desenvolvimento.
Essa preocupação tem sido expressa repetidamente durante as últimas duas décadas e hoje é
amplamente aceita .
Segundo Mota (1997), o monitoramento pode evitar uma poluição ambiental, que
é resultado do lançamento ou liberação de matéria ou energia em um ambiente, em quantidade
2
ou intensidade tais, que o torne impróprio às formas de vida que ele normalmente abriga, ou
prejudique os seus usos.
Os locais de armazenamento dos derivados de petróleo devem ser monitorados
periodicamente, para que qualquer tipo de vazamento que eventualmente ocorra possa ser contido
imediatamente, antes que afete a saúde humana e que cause um grande desequilíbrio ecológico.
A ocorrência de vazamentos em sistemas de armazenamentos subterrâneos de
combustível, tem sido objetivo de crescente preocupação em função dos riscos associados a esses
acidentes, tanto para a segurança e saúde da população, como para o meio ambiente como um
todo. Além disso, outro motivo de preocupação refere-se à forma como estes acidentes se
manifestam, pois, na grande maioria dos casos, tanto as contaminações superficiais provocadas
por constantes e sucessivos derrames junto as bombas e locais de enchimento dos reservatórios,
como os vazamentos em tanques de armazenamentos e tubulações subterrâneas, somente são
percebidos após o afloramento do produto em galerias de esgoto, redes de drenagem de águas
pluviais, no subsolo de edifícios, em túneis, escavações e poços de abastecimento de água, razão
pela qual as ações emergenciais requeridas durante o atendimento a estas situações requerem o
envolvimento de diversos órgãos públicos, além das empresas privadas envolvidas.
É muito comum que os tanques de armazenamentos, por ação corrosiva ou por
ultrapassagem de sua vida útil, provocarem derramamentos de combustíveis que contaminam o
subsolo e o lençol aqüífero, prejudicando a qualidade da água e do solo para a atividade
produtiva e também, para o consumo humano.
A contaminação do solo e das águas subterrâneas por derramamento de petróleo e
derivados é um problema que vem ganhando grande importância no Brasil nos últimos anos em
função dos diagnósticos crescentes de áreas impactadas (SCHNEIDER, et al., 2003).
3
Com o desenvolvimento de novos instrumentos legais de padrões como o
Estabelecimento de Valores Orientadores para Solos e Águas Subterrâneas no Estado de São
Paulo ( CETESB , 2000 ) e a Resolução CONAMA 273, 2000, que dispõem sobre a prevenção e
controle da poluição em postos de combustíveis e serviços, têm exigido um encaminhamento
efetivo para o controle da poluição por petróleo e de combustíveis derivados deste. Seguindo o
exemplo de países industrializados de outros continentes, o gerenciamento de áreas impactadas
vem sendo realizado através da metodologia de análise de riscos (PEDROSO et al, 2002 ).
Por se tratar de um solvente, a água possui grande afinidade para dissolver substâncias
químicas, quer sejam constituinte natural do solo, quer sejam substâncias lançadas de forma
imprópria ou acidentais em conseqüência de vazamentos, tais como alguns hidrocarbonetos.
Tratando-se de águas subterrâneas, este comportamento tende a ser mais prolongado, pois
esses ambientes não contêm microorganismos aeróbios em quantidade suficiente para promover a
biodegradação desses poluentes. Assim, os processos de remediação dos poluentes tornam-se
muito onerosos devido ao custo para remoção de solo onde ocorreu o derrame e do tratamento do
resíduo produzido, envolvendo diversos órgãos públicos como também empresas privadas
especializadas além do custo financeiro do acompanhamento da área afetada por técnicos
especializados.
Considerando os fatos citados, pode-se observar que os vazamentos e derrames oriundos
dos tanques de armazenamento aéreos e subterrâneos causam, além dos impactos ambientais no
solo e na água, riscos à vida de operadores e de pessoas como também grandes prejuízos
financeiros às instituições públicas que atendem tais ocorrências. Além disso, o lençol freático,
devido às infiltrações, pode ser prejudicado, visto que suas águas são utilizadas por um grande
número de pessoas para seu consumo próprio e para a atividade agroindustrial no Brasil e em
4
países vizinhos. A descoberta de uma forma de biodegradação efetiva desses componentes
poderia auxiliar na solução de tais problemas.
Esse trabalho pretende identificar as bactérias existentes no solo da área de estocagem
de combustíveis da Petrobrás na cidade de Ribeirão Preto e verificar a capacidade delas em
biodegradar componentes de gasolina que são lançados sobre ele através de ensaios em
laboratório.
A área onde está localizado o Terminal de Combustíveis de Ribeirão Preto situa-se
sobre solo basalto da Formação Serra Geral, com espessura em torno de 140 metros. A superfície
do terreno mostra uma transição entre colinas e morros amplos, com interflúvios aplainados ou
arredondados e declividades suaves, menores que 10%. O solo considerado latossolo de
coloração roxa, possui até 16 metros de profundidade e é originário de basalto intemperizado. A
localização do terminal de combustíveis pode ser observado na Figura 1.
FIGURA 1: Fotografia do Terminal de Combustíveis da Petrobrás em Ribeirão Preto
5
Na área do Terminal, o aqüífero regional ( rocha Botucatu/Pirambóia ) encontra-se
protegido pela espessa camada basáltica (cerca de 140 metros) da Formação Serra Geral. Devido
a esta característica é improvável que haja contaminação de água subterrânea, mas mesmo assim
a água dos poços de monitoramento são analisadas periodicamente. Entretanto, os aqüíferos
livres superficiais são considerados sensíveis, o que requer constante observação.
O Terminal situa-se na microbacia do córrego Macaúba, do qual uma nascente se encontra
dentro da área da Petrobrás. Para esse córrego é drenada toda a água precipitada na área do
Terminal, tanto por escoamento superficial como através dos aqüíferos rasos livres, para o caso
das águas infiltrantes. Este córrego deságua no córrego Ribeirão Preto, afluente do rio Pardo,
após percorrer cerca de 4 km de área povoada.
A área onde está localizada a nascente tem sido preservada juntamente com o córrego que
ela origina. Estas áreas são consideradas Áreas de Preservação Permanente, passíveis de autuação
pelo órgão responsável, caso não seja respeitado a Legislação vigente.
6
2 - OBJETIVOS
- Selecionar as bactérias encontradas naturalmente no solo do terminal do Poliduto da
Petrobrás no município de Ribeirão Preto.
- Avaliar, dentre as bactérias encontradas , a capacidade que elas têm de biodegradar
hidrocarbonetos presentes na gasolina.
7
3 - REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
3.1 Petróleo
O petróleo é considerado uma fonte de energia não renovável, de origem fóssil e é matéria
prima da indústria petrolífera e petroquímica. O petróleo bruto possui em sua composição uma
cadeia de hidrocarbonetos, cujas frações leves formam os gases e as frações pesadas do óleo
cru. A distribuição destes percentuais de hidrocarbonetos é que define os diversos tipos de
petróleo existentes no mundo.
O petróleo quando encontrado na natureza está nos poros das rochas chamadas de rochas
reservatórios, cuja permeabilidade irá permitir a sua extração. Permeabilidade e porosidade
são duas propriedades características de rochas sedimentares, motivo pelo qual as bacias
sedimentares são os principais locais de ocorrência de petróleo. Porosidade é uma
característica física, definida como o percentual entre volume vazio e o volume total das
rochas. Permeabilidade é a característica física relacionada com a intercomunicação entre os
espaços vazios, e permite que ocorra a vazão de fluidos no meio poroso. Na natureza as rochas
sedimentares são as mais porosas, e quando possuem permeabilidade elevada, formam
condições para a ocorrência de reservatórios de petróleo economicamente exploráveis. O
Petróleo por possuir uma densidade média de 0,8 mg/L , inferior à das
rochas que constituem o subsolo, tende a migrar para a superfície provocando os clássicos
casos de exudações (afloramento); se no caminho para a superfície, o petróleo encontrar uma
estrutura impermeável que sirva como armadilha e que faça o seu confinamento e impeça a
8
sua migração, acaba formando um reservatório de petróleo. Vale informar que esse processo
ocorre muito lentamente (muitos milhares de anos).
Essas armadilhas impermeáveis são estruturas de grande proporção, que podem ser
anticlinais, falhas geológicas, derrame de basalto ou domos de sais, identificados por estudos
sísmicos e geológicos, mas o mais importante, é observar que devem existir várias camadas de
solo, motivo pelo qual o petróleo é mais facilmente encontrado em bacias sedimentares. A
origem do petróleo é bastante polêmica, existindo teorias orgânicas e inorgânicas. A mais
interessante delas é a da formação pela decomposição da matéria orgânica do plâncton
marinho, principalmente do fitoplâncton transformado em sedimentos no momento da
deposição, e a da inversão da atmosfera da terra originalmente composta por gás carbônico
(CO
2
), que explicaria o volume de petróleo existente no subsolo da terra.
Existem reservatórios de petróleo em diversas profundidades. Os mais rasos (10 m) que
podem ser explorados por mineração, são os mais pastosos e com predominância de
hidrocarbonetos de cadeias carbônicas pesadas (graxas) na sua composição. Os de grandes
profundidades que variam na faixa entre 2.500 m a 5.000 m, apresentam hidrocarbonetos
mais leves em sua composição.
O petróleo ocorre em muitas partes do mundo. Extensos depósitos têm sido encontrados
no golfo Pérsico, nos Estados Unidos, no Canadá, na Rússia (nos Urais e na Sibéria ocidental),
na Líbia, no delta do rio Níger, na Venezuela, no golfo do México, no mar do Norte e no
Brasil, principalmente na região marinha (http://www. ambientebrasil.com.br/composer).
9
3.1.1 Impactos ambientais do solo e da água por hidrocarbonetos de petróleo
O primeiro impacto da exploração do petróleo, ocorre quando acontece o estudo sísmico.
Esse estudo permite a identificação de estruturas do subsolo, e seu princípio tem como base a
velocidade de propagação do som e suas reflexões nas diversas camadas do subsolo. Na
superfície do solo, os dados sísmicos são coletados por meio de uma rede de microfones que
receberão o retorno das ondas sonoras provocadas por explosões efetuadas na superfície. São
abertas trilhas para a colocação dos microfones, e provocadas as explosões para a emissão das
ondas sonoras. No caso de oceanos, essas explosões são efetuadas em navios com canhões de
ar comprimido, com o arraste de microfones na superfície da água
(www.ambientebrasil.com.br/composer).
Junto à extração do petróleo, ocorre liberação de água, cuja quantidade dependerá das
características dos mecanismos naturais ou artificiais de produção, e das características de
composição das rochas reservatórios. Essa água produzida da rocha reservatório é identificada
pela sua salinidade e composição de sais, normalmente sais de magnésio e estrôncio
(www.ambientebrasil.com.br/composer)
Para manter as condições de pressão na rocha reservatório, fundamental para a migração
do petróleo para os poços, pode ser efetuada uma operação de injeção de água nas camadas
inferiores da rocha reservatório, e ou gás nas camadas superiores. Para impedir a precipitação
de sais nos poros das rochas no subsolo, muitas vezes são utilizados produtos químicos que
são injetados no subsolo, o que implica na existência destes produtos nas localidades de
produção, e seus cuidados relativos à sua presença no meio ambiente. Cuidados especiais
10
devem ser tomados com o descarte destas águas produzidas, devendo ser tratada como águas
de efluentes (www.ambientebrasil.com.br/composer).
Durante a perfuração de poços de petróleo, usa-se um fluído de perfuração, cuja
composição química induz a comportamentos físico químicos desejados, para permitir um
equilíbrio entre as pressões das formações e a pressão dentro dos poços. Esse equilíbrio é
fundamental impedindo que o fluído de perfuração invada a formação de petróleo danificando
a capacidade produtiva do poço, bem como impedir que o reservatório de petróleo possa
produzir de forma descontrolada para dentro do poço, provocando o que é chamado de “kick”
de óleo ou gás. Para o controle destes fluídos de perfuração são usados aditivos na lama de
perfuração, normalmente baritina e outras argilas. É de fundamental importância que esses
fluídos e produtos sejam devidamente armazenados e manipulados, evitando com isso um
impacto ecológico localizado. (www.ambientebrasil.com.br/composer).
Também para análise das formações atravessadas pelo poço perfurado, utliza-se
ferramentas de perfilagem radioativas e todo o cuidado devem ser tomados tanto com os
fluídos utilizados para amortecimento dos poços como com a manipulação, transporte e
armazenagem dessas ferramentas. Das operações de tratamento do petróleo resultam resíduos
oleosos que, mesmo em pequenas quantidades, devem receber cuidados. Inovações
tecnológicas vêm permitindo a reutilização de efluentes líquidos resultantes das operações de
produção. Os cuidados no refino, são muito importantes e as refinarias têm desenvolvido
sistemas de tratamento para os efluentes. Chaminés, filtros e outros dispositivos evitam a
emissão de gases, vapores e poeiras para a atmosfera; unidades de recuperação retiram o
enxofre dos gases, cuja queima produziria dióxido de enxofre, um dos principais poluentes
dos centros urbanos.
11
Os despejos líquidos são tratados por meio de processos físico-químicos e biológicos.
Além de minimizar a geração de resíduos sólidos, as refinarias realizam coleta seletiva, que
permite a reciclagem para utilização própria ou a venda a terceiros.
O resíduo não-reciclado é tratado em unidades de recuperação de óleo e de biodegradação
natural, onde microorganismos dos solos degradam os resíduos oleosos. Outros resíduos
sólidos são enclausurados em aterros industriais constantemente controlados e monitorados
para evitar impactos negativos no ambiente.
As refinarias vem empregando normas tecnológicas para processar os petróleos brasileiros
com baixo teor de enxofre, que dão origem a combustíveis menos poluentes ( http:
//www.ambientebrasil.com.br/composer).
3.1.2 Classificação e Produtos
O petróleo é um produto de grande importância mundial, principalmente em nossa
atualidade. Os solventes, óleos combustíveis, gasolina, óleo diesel, querosene, gasolina de
aviação, lubrificantes, asfalto, plástico entre outros são os principais produtos obtidos a partir
do petróleo. De acordo com a predominância dos hidrocarbonetos encontrados no óleo cru, o
petróleo é classificado:
Parafínicos
Quando existe predominância de hidrocarbonetos parafínicos. Este tipo de petróleo
produz subprodutos com as seguintes propriedades:
12
- Gasolina de baixo índice de octanagem.
- Querosene de alta qualidade.
- Óleo diesel com boas características de combustão.
- Óleos lubrificantes de alto índice de viscosidade, elevada estabilidade química e alto ponto
de fluidez.
- Resíduos de refinação com elevada percentagem de parafina.
- Possuem cadeias retilíneas.
Naftênicos
Quando existe predominância de hidrocarbonetos naftênicos. O petróleo do tipo naftênico
produz subprodutos com as seguintes propriedades principais:
- Gasolina de alto índice de octanagem.
- Óleos lubrificantes de baixo resíduo de carbono.
- Resíduos asfálticos na refinação.
- Possuem cadeias em forma de anel.
Mistos
Quando possuem misturas de hidrocarbonetos parafínicos e naftênicos, com propriedades
intermediárias, de acordo com maior ou menor percentagem de hidrocarbonetos parafínicos e
naftênicos.
13
Aromáticos
Quando existe predominância de hidrocarbonetos aromáticos. Este tipo de petróleo é raro,
produzindo solventes de excelente qualidade e gasolina de alto índice de octanagem. Não se
utiliza este tipo de petróleo para a fabricação de lubrificantes.
Após a seleção do tipo desejável de óleos crus, os mesmos são refinados através de
processos que permitem a obtenção de óleos básicos de alta qualidade, livres de impurezas e
componentes indesejáveis. Chegando às refinarias, o petróleo cru é analisado para conhecer-se
suas características e definir-se os processos a que será submetido para obter-se determinados
subprodutos. Evidentemente, as refinarias, conhecendo suas limitações, já adquirem petróleos
dentro de determinadas especificações. A separação das frações é baseada no ponto de
ebulição dos hidrocarbonetos. Os principais produtos provenientes da refinação são: gás
combustível, GLP, gasolina, nafta, querosene, óleo diesel, óleos lubrificantes, combustíveis,
matéria-prima para asfalto e parafina (http/ www. ambientebrasil.com.br/composer).
3.1.3 Utilidades
O petróleo é usado como combustível primário em máquinas de combustão interna, após
ser purificado e processado, sendo de grande importância para o homem. Em meados do
século XIX, a necessidade de combustível para iluminação principalmente querosene, e em
algumas áreas gás natural, levou ao desenvolvimento da indústria do petróleo. Ainda no
século XIX, o crescimento do transporte motorizado fez com que a demanda crescesse muito
rapidamente. Hoje em dia, o petróleo fornece grande parte da energia mundial utilizada no
14
transporte e nas indústrias e é a principal fonte de energia para muitas outras finalidades.
Dessa forma, o petróleo tornou-se fonte de milhares de produtos petroquímicos.
3.2 A gasolina
A gasolina é uma mistura complexa de derivados de petróleo, sendo constituída por uma
extensa composição de hidrocarbonetos hidrofóbicos relativamente voláteis, com a maior parte
dos seus constituintes classificados como alifáticos ou como aromáticos. As características físico-
químicas determinam o comportamento da gasolina e de seus constituintes no ambiente. Os
compostos alifáticos incluem constituintes como butano, pentano, hexano e octano. Os
compostos aromáticos incluem o benzeno, o tolueno, etilbenzeno e os xilenos (BTEX). Muitos
compostos oxigenados, tais como álcoois e ésteres são adicionados na gasolina para reduzir a
poluição atmosférica e melhorar a octanagem do combustível.
A Tabela 1 apresenta a composição química de uma amostra de gasolina regularmente
produzida nos Estados Unidos:
TABELA 1: Composição química de uma gasolina comum .
COMPONENTES FÓRMULA
QUÍMICA
MASSA
MOLECULAR
FRAÇÃO
MÁSSICA
FRAÇÃO
MOLAR
Propano
C
3
H
8
44,1 0,0001 0,0002
Isobutano C
4
H
10
58,1 0,0122 0,1999
n-butano C
4
H
10
58,1 0,0629 0,1031
Trans-2-buteno C
4
H
8
56,1 0,0007 0,0012
Cis-2-buteno C
4
H
8
56,1 0,0000 0,0000
3-metil-1-buteno C
5
H
10
70,1 0,0006 0,0008
Isopentano C
5
H
12
72,2 0,1049 0,1384
1-pentano C
5
H
10
70,1 0,0000 0,0000
15
2-metil-1-butano C
5
H
10
70,1 0,0000 0,0000
2-metil-1,3-butadieno C
5
H
8
68,1 0,0000 0,0000
n-pentano C
5
H
12
72,2 0,0586 0,0773
Trans-2-pentano C
5
H
10
70,1 0,0000 0,0000
2-metil-2-buteno C
5
H
10
70,1 0,0044 0,0060
3,3-dimetil-1-buteno C
6
H
12
84,2 0,0049 0,0055
Ciclopentano C
5
H
10
70,1 0,0000 0,0000
3-metil-1-penteno C
6
H
12
84,2 0,0000 0,0000
2,3-dimetilbutano C
6
H
14
86,2 0,0730 0,0807
2-metilpentano C
6
H
14
86,2 0,0273 0,0302
3-metilpentano C
6
H
14
86,2 0,0000 0,0000
n-hexano C
6
H
14
86,2 0,0283 0,0313
Metilciclopentano C
6
H
12
84,2 0,0000 0,0000
2,2-dimetilpentano C
7
H
16
100,2 0,0076 0,0093
Benzeno C
6
H
6
78,1 0,0076 0,0093
Ciclohexano C
6
H
12
84,2 0,0000 0,0000
2,3-dimetilpentano C
7
H
16
100,2 0,0390 0,0371
3-metil-hexano C
7
H
16
100,2 0,0000 0,0000
3-etilpentano C
7
H
16
100,2 0,0000 0,0000
2,2,4-trimetilpentano C
8
H
18
114,2 0,0121 0,0101
n-heptano C
7
H
16
100,2 0,0063 0,0060
Metilciclohexano C
7
H
14
98,2 0,0000 0,0000
2,2-dimetilhexano C
8
H
18
14,2 0,0055 0,0046
Tolueno C
7
H
8
92,1 0,0550 0,0568
2,2,4-trimetilpentano C
8
H
18
114,2 0,0121 0,0101
2-metil-heptano C
8
H
18
114,2 0,0155 0,0129
3-metilpentano C
8
H
18
114,2 0,0000 0,0000
n-octano C
8
H
18
114,2 0,0013 0,0011
2,4,4-trimetil-hexano C
9
H
20
128,3 0,0087 0,0065
2,2-dimetil-heptano C
9
H
20
128,3 0,0000 0,0000
p-xileno C
8
H
10
106,2 0,0957 0,0858
m-xileno C
8
H
10
106,2 0,0000 0,0000
3,3,4-trimetil-hexano C
9
H
20
128,3 0,0281 0,0209
o - xileno C
8
H
10
106,2 0,0000 0,0000
2,2,4-trimetil-heptano C
10
H
22
142,3 0,0105 0,0070
16
3,3,5-trimetil-heptano C
10
H
22
142,3 0,0000 0,0000
n-propilbenzeno C
9
H
12
120,2 0,0841 0,0666
2,3,4-trimetil-heptano C
10
H
22
142,3 0,0000 0,0000
1,3,5-trimetilbenzeno C
9
H
12
120,2 0,0411 0,0325
1,2,4-trimetilbenzeno C
9
H
12
120,2 0,0213 0,0169
Metilpropilbenzeno C
10
H
14
134,2 0,0351 0,0249
Dimetiletilbenzeno C
10
H
14
134,2 0,0307 0,0218
1,2,4,5-
tetrametilbenzeno
C
10
H
14
134,2 0,0133 0,0094
1,2,3,4,-
tetrametilbenzeno
C
10
H
14
134,2 0,0129 0,0091
1,2,4-trimetil-5-
etilbenzeno
C
11
H
16
148,2 0,0405 0,0260
n-dodecano C
12
H
26
170,3 0,0230 0,0129
Naftaleno C
10
H
8
128,2 0,0045 0,0033
n-hexilbenzeno C
12
H
20
162,3 0,0000 0,0000
Metilnaftaleno C
11
H
10
142,2 0,0023 0,0015
Total 0,9969 1,0000
Fonte: (JOHNSON, 1990)
A gasolina comercializada no Brasil possui ainda em sua composição o álcool
etílico anidro, na ordem de 22 à 25%, cuja função é reduzir a poluição atmosférica.
Segundo Guiguer (1994), alguns dos compostos aromáticos, os quais podem ser
indicadores úteis da quantidade de hidrocarbonetos resultante de vazamentos relativamente
recentes, representam os compostos voláteis e solúveis encontrados na gasolina. A maioria dos
óleos brutos não contém concentrações abundantes de hidrocarbonetos aromáticos, isto é,
benzeno, tolueno, etilbenzeno e xilenos (BTEX), pois os mesmos são produzidos durante o
processo de destilação e são associados aos produtos de petróleo refinados, por exemplo,
gasolina, diesel e querosene.
17
Os gases de petróleo, líquidos ou condensados, consistem principalmente de produtos de
vapor de alta pressão que, portanto, podem ser mantidos na fase líquida apenas sob pressão. A
maioria das moléculas encontradas no condensado é de baixa massa molecular e correspondem
aos hidrocarbonetos alifáticos.
Oliveira (1990), afirmou que para caracterizar a gasolina, não é viável um teste individual
para cada um dos mais de uma centena de compostos presentes. Por esta razão, uma série de
hidrocarbonetos (baseada no número de átomos de carbono) foi selecionada como representativa
do combustível em estudo. Para a gasolina, é geralmente a série de C
4
a
C
8
(alguns pesquisadores
usam C
4
a C
12
). Os hidrocarbonetos da série C
1
a C
3
apresentam ponto de ebulição muito baixo o
que os tornam gases sob condições normais de temperatura e pressão. Os indicadores específicos
usados para se caracterizar a contaminação por gasolina para a série C
4
a
C
8
são normalmente
BTEX. Além destes, o grupo não específico Total Petroleum Hydrocarbon - TPH , também é
comumente utilizado.
3.3 O Benzeno, Tolueno, Etilbenzeno e Xilenos ( BTEX)
Os BTEX são definidos como hidrocarbonetos aromáticos que possuem como característica o
anel benzênico na sua estrutura. Na Tabela 2, estão descritos a massa molecular e a solubilidade
em água do BTEX à temperatura de 20° C.
18
TABELA 2: Características dos BTEX
Nome Massa Molecular
( g/mol )
Solubilidade em água
( mg/L )
Benzeno 78,0 1750
Tolueno 92,1 526
Etilbenzeno 106,2 169
o-Xileno 106,2 198
m-Xileno - -
p-Xileno - -
Fonte: (API, 1999)
3.4 Comportamento da gasolina no solo ( ou meio poroso)
A gasolina, por apresentar uma extensa composição, afigura-se como uma grande
quantidade de substâncias com características diferentes de adsorção no solo, pressão de vapor e
solubilidade que, ao entrar em contato com o solo, podem situar-se em três, quatro ou até cinco
fases distintas. Ao migrar pela zona não saturada o produto é parcialmente retido (adsorção) pelas
partículas do solo, formando assim a fase adsorvida (que também pode ser encontrada como fase
líquida). Esta fase adsorvida pode ser subdividida em uma fase em que as moléculas do produto
estão aderidas às partículas sólidas do aqüífero denominadas de adsorvida corretamente e em
outras onde pequenas quantidades do produto estão isoladas e sem mobilidade nos vazios do solo,
denominada residual. Ao entrar em contato com o lençol freático ou com uma camada de
condutividade hidráulica muito baixa, a gasolina passa a fluir através do mesmo, gerando a fase
livre. Uma parcela do produto que atingiu o lençol se dissolve em contato com a água
subterrânea formando uma pluma de contaminação designada fase dissolvida. Vale ressaltar que
existem alguns autores, como Guiger, (1996), que considera a fase dissolvida como sendo os
19
hidrocarbonetos presentes na água do solo e nas superfícies dos sólidos do solo como películas.
Uma pequena parcela do produto pode ser encontrada como componente do vapor do solo, e com
isso gerando a fase vapor. Pode haver trocas entre as fases, sendo que os hidrocarbonetos que se
encontram na fase de vapor podem condensar e serem adsorvidos em sólidos do solo ou
dissolvidos na água do solo, por exemplo. A Tabela 3 representa a distribuição estimada por fases
para a contaminação de um solo caracterizado como areia média, com o lençol freático estando
situado a uma profundidade aproximada de 5 metros.
TABELA 3: Distribuição das fases do contaminante da gasolina em solo do tipo areia média.
Fase volume contaminado
(m
3
)
% do
Total
volume de contaminante
(m
3
)
% do
Total
Livre
Adsorvida
Dissolvida
7.100
250.000
960.000
1,0
20,0
79,0
18.500
10.000
333
62
33
1-5
Fonte: ( OLIVEIRA, 1992)
Segundo Oliveira (1992), os valores expostos na Tabela 3 deixam claro a participação de
cada uma das fases na contaminação do meio ambiente superficial. Ele afirmou ainda, que a
quantidade do produto dissolvido na água subterrânea, é relativamente pequena (1 a 5%) em
relação à composição do total derramado, mas é a responsável pela maior quantidade de matéria
contaminado (79%), uma vez que o escoamento da água subterrânea é o mecanismo de maior
capacidade de dispersão da contaminação, devido a sua alta mobilidade. A quantidade do produto
retida na fase adsorvida (33% do total derramado), embora de mobilidade baixíssima, funciona
como uma fonte permanente de contaminação das águas subterrâneas pela liberação lenta e
contínua do produto para a fase dissolvida.
20
3.5 Propriedades dos compostos de hidrocarbonetos
Os hidrocarbonetos apresentam algumas propriedades típicas e que são importantes como
fonte de contaminação da água. Dentre essas propriedades cita-se su8a densidade e sua
solubilidade em água.
3.5.1 Densidade
Segundo Fetter (1993), a densidade de um fluido é uma relação de sua massa por unidade
de volume. Esta propriedade varia com as interações entre as substâncias, a estrutura molecular e
a massa molecular . A principal razão de se conhecer a densidade de uma substância é determinar
se a mesma flutuará (densidade < 1,0 mg/L) ou afundará (densidade > 1,0 mg/L) na água. No
caso da gasolina, cuja densidade é da ordem de 0,72 mg/L, a mistura se comportará como um
líquido mais leve que a água.
3.5.2 Solubilidade em Água
A solubilidade de um composto químico em água é a medida da concentração deste
composto que será dissolvida em água pura em uma determinada temperatura. A solubilidade de
uma substância em água aumenta com a elevação da temperatura. É expressa, normalmente, na
forma de gramas de produto por litro de água, gramas de produto por 100 mL de água,
porcentagem ou em ppm (parte por milhão). Para compostos puros, a solubilidade em água é
função do tipo de estrutura molecular e das características eletroquímicas. Para mistura de
21
compostos orgânicos como a gasolina, a solubilidade é função da fração molar de cada
constituinte individual da mistura.
As frações aromáticas dos derivados de petróleo, como a gasolina, por exemplo, são
talvez do ponto de vista ambiental os que causam maiores preocupações. Benzeno, tolueno e
xilenos têm densidades menores do que 1. O benzeno é o mais solúvel dessa categoria (1780 ppm
à 20ºC). O tolueno tem uma solubilidade de 515 ppm à 20ºC e os isômeros do xileno possuem
diferentes solubilidades: 175 ppm para o orto e meta xilenos e 198 ppm atribuída ao para-xileno.
A solubilidade efetiva em água de um composto orgânico particular presente na gasolina
ou em uma mistura de líquidos de fase não aquosa (NAPL) pode ser estimada conhecendo-se a
solubilidade dos compostos puros e sua fração na gasolina. Esta solubilidade poderá aumentar se
a esta gasolina forem misturados compostos oxigenados tais como álcoois e ésteres. Quando
ocorre um derramamento dos tanques de armazenamento e a gasolina entra em contato com a
água, o álcool existente no combustível, sendo completamente miscível em água, formará uma
pluma de contaminação na água subterrânea. Uma alta concentração de etanol na água pode,
então, facilitar a transferência dos BTEXs presentes na gasolina para a fase aquosa, aumentando a
solubilidade dos hidrocarbonetos mono aromáticos na água subterrânea, processo denominado
efeito co-solvência (FERNANDES e CORSEUIL, 1996).
3.6 Remediação Natural
Uma nova abordagem para a contaminação de solos e águas subterrâneas, chamadas de
remediação natural, vem recentemente, ganhando aceitação principalmente em locais
contaminados por derramamentos de derivados de petróleo, como o que acontece em postos de
22
gasolina. A remediação natural é uma estratégia de gerenciamento que se baseia em mecanismos
naturais de atenuação para remediar contaminantes dissolvidos na água. A atenuação refere-se
aos processos físicos, químicos e biológicos que facilitam a remediação natural (WIEDMEIER et
al, 1996). Os dados obtidos em campos por vários pesquisadores (BARKER, et al; 1987,
CHIANG et al, CHAPELLE , 1994; DAVIS & KLIER 1994) tem mostrado que a atenuação
natural limita bastante o deslocamento dos contaminantes e portanto reduz a extensão da
contaminação ao meio ambiente. A remediação natural não é uma alternativa de ação de
tratamento, mas uma forma de minimizar os riscos para a saúde humana e para o meio ambiente,
monitorando-se o deslocamento da pluma e assegurando-se que os pontos receptores (poços de
captação para o abastecimento de água, rios, lagos, etc) não sejam contaminados.
Após a contaminação do lençol freático, a pluma se deslocará e será atenuada por
diluição, dispersão, adsorção, volatilização e biodegradação, que é o único destes mecanismos
que transforma os contaminantes em compostos inócuos a saúde. A biodegradação dos
compostos BTEX pode ser representada por uma reação química onde os hidrocarbonetos, em
presença de um aceptor de elétrons, nutrientes e microorganismos são transformados em água,
dióxido de carbono, e outros. Os aceptores de elétrons, compostos que recebem elétrons, portanto
reduzidos, são principalmente o oxigênio, nitrato, ferro III e sulfato (CORSEUIL et al., 1996). A
mineralização do tolueno e xileno também pode ocorrer em condições metanogênicas por
degradação anaeróbia (CHAPELLE, 1993).
Segundo Corseuil (1996), dependendo das condições hidrogeológicas do local
contaminado, a taxa da reação de biodegradação será mais rápida ou mais lenta. Uma vez que a
biodegradação é o principal mecanismo de transformação dos hidrocarbonetos de petróleo, a
determinação da taxa de transformação é de grande importância para se prever até onde a pluma
23
irá se deslocar. Quando a taxa de biodegradação for igual ou maior que a taxa de deslocamento
dos contaminantes a pluma deixará de se deslocar e diminuirá de tamanho. Neste caso, se a fonte
receptora não for atingida, não haveria a necessidade de implantação de tecnologias ativas de
remediação e a remediação natural seria a opção mais econômica de recuperação da área
contaminada.
3.7 Biorremediação de Ambientes Contaminados por Hidrocarbonetos
O aumento da atividade industrial e a disposição inadequada dos resíduos resultam na
degradação de ecossistemas naturais. Muitos dos produtos químicos orgânicos, produzidos em
grande escala como parte de uma atividade normal em sociedades industriais, são considerados
perigosos para humanos, plantas e animais. A persistência destes produtos químicos no solo e na
água varia; alguns podem ser degradados por microrganismos ou se decompõem naturalmente,
podendo desaparecer em algumas semanas, enquanto que outros persistem por anos (DUA et al,
2002).
Freqüentemente o solo e as águas subterrâneas são contaminados com hidrocarbonetos de
petróleo devido a vários fatores como o derramamento acidental de petróleo e vazamentos de
tanques de armazenagem. De acordo com Corseuil e Marins (1997), a gasolina por ser pouco
solúvel em água esta presente no subsolo como líquido de fase não aquosa (NAPLs) e seus
constituintes de maior solubilidade, os compostos BTEX (Benzeno, Tolueno, Etilbenzeno e
Xilenos), são os primeiros em atingir o lençol freático. Dentre os BTEX, o Benzeno é
considerado o mais tóxico com padrão de potabilidade de 10 ug/L, segundo as normas do
Ministério da Saúde. Após a contaminação do lençol freático, os compostos dissolvidos tornam-
se parte de uma fase em movimento, formando uma película de contaminação que se desloca em
24
direção ao fluxo regional das águas subterrâneas. Este deslocamento pode ser atenuado pela
biodegradação desses hidrocarbonetos, diminuindo a taxa de deslocamento e seu tamanho. Uma
grande variedade de contaminantes pode ser encontrada em águas subterrâneas, em ambientes
industriais, incluindo compostos orgânicos voláteis, hidrocarbonetos policíclicos aromáticos
(HPA), herbicidas, compostos nitro aromáticos, ésteres ftalatos e metais pesados. Os caminhos de
migração, mobilidade e persistência desses compostos no subsolo variam substancialmente em
cada caso, devido à natureza química especifica de cada espécie bem como à diversidade
geológica de cada caso (NOBRE, 2003).
A biorremediação consiste na biodegradação de substâncias poluentes por
microrganismos, que as transforma em substâncias menos tóxicas através de sua mineralização,
resultando na obtenção de CO
2
e H
2
O pela via aeróbica, assim como a formação de biomassa
(GRISI, 2000; DUA, et al 2002).
A biodegradação é um processo natural realizado por microrganismos do solo e aquáticos,
principalmente bactérias e fungos. Certos tipos de bactérias têm demonstrado a habilidade de
quebrar ou transformar produtos derivados do petróleo. Estudo de métodos empregados na
biorremediação em derramamento de óleos tem como objetivo a verificação de condições
favoráveis de oxigênio, temperatura e nutrientes para maximizar a transformação biológica dos
hidrocarbonetos do petróleo (KORDA et al, 1997).
A biorremediação de poluentes derivados de óleos é um aceleramento do processo natural
da degradação desses compostos, consistindo em um tratamento natural para o problema
(RAHMAN et al, 2002). As medidas biocorretivas para a descontaminação dos solos podem ser
tanto “in situ” (tratamento realizado no próprio local), quanto “ex situ” (remoção do solo
contaminado para tratamento em outro local). Entre as medidas de biorremediação adotadas“in
25
situ”, podemos citar a emulsificação desses hidrocarbonetos, facilitando sua biodisponibilidade
aos microrganismos.
Compostos orgânicos como os hidrocarbonetos de petróleo (BTEX) tendem a ficar
sorvidos na matriz do solo diminuindo sua disponibilidade aos microrganismos, limitando assim
sua degradação (RAIMUNDO; RIZZO, 2001).
Dua et al (2002) afirmam que avanços na área biotecnológica utilizando microrganismos
têm reduzido a concentração e a toxicidade destes compostos. As estratégias utilizadas para o
tratamento devem considerar a transformação do poluente em compostos menos tóxicos, a
disponibilidade do poluente ao microrganismo e a otimização da atividade biológica do
microrganismo.
É dada grande importância às ações corretivas de ambientes poluídos e às tecnologias de
biorremediação de áreas contaminadas que vêm ganhando espaço devido as suas vantagens
quando comparadas com as técnicas convencionais de despoluição. A biorremediação é viável
economicamente, além de ser ecologicamente correta, pois utiliza a capacidade dos
microrganismos em degradar diferentes tipos de poluentes em compostos inócuos ao meio
ambiente.
Experimentos prévios em laboratórios podem auxiliar no desenvolvimento dessas
tecnologias porque permitem selecionar linhagens microbianas que, para suprir suas necessidades
metabólicas, são capazes de degradar determinados compostos tóxicos, inclusive os compostos
poluentes encontrados na gasolina.
Nesse sentido, esse trabalho vem colaborar com o desenvolvimento dessas tecnologias
visando o bem estar do meio ambiente e o desenvolvimento sustentável.
26
4 - MATERIAIS E MÉTODOS
O presente trabalho foi desenvolvido em bancada seguindo a metodologia apresentada na
Figura 2.
FIGURA 2 : Fluxograma simplificado da metodologia desenvolvida.
Coleta de amostras
de solo no terminal
Cultura em meio
sólido
Esterilização e pesagem do solo (50g) para
cada reator e confirmação da esterilização
Culturas viáveis
15 unidades
Culturas não viáveis
Adição de gasolina nas porções
de solos
50 μL 300 μL 500 μL
Inoculação de solução de
bactérias nos reatores (5 mL)
branco
60 dias
Enriquecimento
em meio líquido
Análises por cromatografia gasosa de BTEX
Avaliação dos
resultados
270 dias
Culturas do
solo dos
reatores
27
4.1 O Terminal de Combustíveis
4.1.1 A coleta de amostras no Terminal de Combustíveis
As amostras foram coletadas no Terminal do Poliduto Paulínia-Brasília da Petrobrás no
município de Ribeirão Preto SP. No interior do terminal existem cinco poços de monitoramento
de água designados respectivamente de PM 1B, PM 2B, PM 3B, PM 4B, PM 5B além de mais
dois outros localizados fora do pátio interno, em vuma área de reserva florestal, um à montante e
outro a jusante, designados por PM 1A ( M) e PM 6B ( J ), conforme o layout representado na
Figura 3.
N
FIGURA 3: Layout dos pontos de coleta de solo no terminal de combustíveis.
TQ
5205
P-2B
P-3B
PONTOS DE
AMOSTRAGEM
P- 6B
P-4B
P-5B
P-1A
N
P-1B
TQ
5204
TQ
5202
TQ
5201
TQ
5207
28
As amostras de solo foram coletadas a aproximadamente 50 cm de distância dos poços de
monitoramento e a uma profundidade de 80 cm na primeira coleta e a 40cm e 80 cm na segunda e
terceira coleta de solo. A perfuração do solo foi realizada com cavadeira comum e as amostras
foram coletadas com um amostrador desenvolvido pelo laboratório de solos da Universidade de
Ribeirão Preto mostrado na Figura 4.
FIGURA 4: Uso do amostrador para coleta de solo.
Tomou-se o cuidado de retirar os resíduos que ficaram impregnados no coletor de solo
entre uma profundidade e outra e entre a coleta de um poço e outro evitando-se assim, possíveis
alterações nos resultados das análises microbiológicas.
As amostras foram coletadas utilizando-se luvas assépticas descartáveis para evitar
possíveis contaminações, identificadas segundo a profundidade e local de retirada,
acondicionadas em sacos plásticos estéreis com lacre, próprios para acondicionar alimentos, do
tipo Zip Loc.
29
4.2 Acondicionamento e transporte das amostras
Uma vez feita a coleta total das amostras, estas foram encaminhadas ao laboratório de
Recursos Hídricos da Universidade, armazenados em caixa de isopor e colocadas sob
resfriamento para posterior manipulação e preparo.
4.3 O preparo das amostras
Utilizou-se placas de Petri, onde pesou-se uma massa conhecida de solo para cada
amostra coletada em uma balança eletrônica de precisão considerando-se quatro casas decimais.
As placas foram identificadas e levadas à estufa a 110° C por 48 h e, após resfriamento, foram
submetidas a uma nova pesagem para a determinação da umidade de cada amostra de solo
conforme a fórmula apresentada a seguir. A umidade foi calculada pela equação (1).
U = M 2 - M 4 x 100 (g/100g ou % p/p)
M 3
Onde:
U= umidade das amostras de solo
M 1 = placa de Petri vazia
M 2 = placa + amostra de solo de massa conhecida
M 3 = massa da amostra ( M 1 – M 2 )
M 4 = massa da amostra após aquecimento a 110° C
30
4.4 O preparo para as análises microbiológicas
Para as análises microbiológicas, foram feitas quatro culturas de amostras de solo
coletadas no Terminal e seguiram o seguinte procedimento.
4.4.1 Primeira cultura de solo
A primeira coleta de amostras de solo no Terminal de Ribeirão Preto foi feita na segunda
quinzena do mês de Setembro de 2004, nos locais descritos no item 4.2.1, no período da manhã e
encaminhadas ao laboratório de Recursos Hídricos da Universidade de Ribeirão Preto, onde foi
pesado uma massa conhecida de solo para cada amostra coletada, representadas na Tabela 4.
TABELA 4: Identificação dos pontos e de
massa de solo da 1ª coleta de solo
Amostras Profundidade
(cm)
Massa de Solo
(g)
P 1A 40
80
3,50
2,60
P 1B 40
80
3,37
2,40
P 2B 40
80
2,48
2,56
P 3B 40
80
4,14
2,70
P 4B 40
80
6,90
3,10
P 5B 40
80
3,15
2,85
P 6B 40
80
3,37
2,48
31
A massa de solo utilizada para cada amostra foi medida ao acaso, sem levar em
consideração a precisão e uniformidade das massas porém, para as profundidades de 80 cm,
tomou-se o cuidado de utilizar uma massa menor de solo por amostra e mais homogênea que para
a profundidade de 40 cm.
A água utilizada nesta etapa para o preparo das amostras de solo, foi desmineralizada e
autoclavada a uma temperatura de 120° C por 20 minutos. Para cada amostra, realizou-se estudo
em pH 4,0 e pH 7,0. Para cada amostra preparou-se um frasco do tipo Erlenmayer com
capacidade de 250 mL e adicionado de 100 mL de água desmineralizada e autoclavada.
Homogeneizou-se as misturas e retirando-se de cada Erlenmayer 1 mL que foi colocado em tubo
de ensaio com 9 mL de água desmineralizada. A mistura foi homogeneizada por agitação e, em
seguida, retirou-se deste primeiro tubo 1 mL que foi novamente introduzido em um segundo tubo
de ensaio preparado igual ao primeiro, obtendo-se uma mistura mais diluída. Novamente repetiu-
se o procedimento para um terceiro e quarto tubos de ensaio, obtendo-se quatro misturas de
diferentes diluições para cada amostra de solo, totalizando 28 misturas em dois pH diferentes.
Essas misturas foram então encaminhadas ao laboratório de microbiologia para a inoculação nos
meios de cultura utilizando-se a câmara de fluxo laminar. Para a inoculação nos meios de
culturas, retirou-se 0,1 mL de cada uma das 28 misturas, colocando-as sobre os meios de culturas
tipo Agar Padrão Contagem em placas de Petri descartáveis com 10 cm de diâmetro
homogeneizando-se os inóculos com rodo de vidro apropriado e com repetição do procedimento
para misturas em pH 4,0. Os meios de culturas inoculados foram levados à estufa para
crescimento das possíveis colônias a uma temperatura de 38° C. Após 24 h de incubação, as
placas inoculadas foram submetidas à leitura para observação de crescimento de UFC (Unidades
Formadoras de Colônias). Depois, os meios de culturas foram devolvidos à estufa onde
32
permaneceram por mais 24 h, totalizando 48 h de incubação e novamente, foram submetidas à
contagem de colônias formadas. Uma vez contadas as unidades formadoras de colônias (UFC), as
placas foram acondicionadas e submetidas a resfriamento para inibição do crescimento e depois
descartadas após esterilização.
4.4.2 Segunda cultura de solo
Uma segunda coleta de solo foi feita no mês de novembro de 2004 repetindo-se os
procedimentos já estabelecidos no início da pesquisa para a primeira cultura. A segunda coleta de
amostras de solo, também foi realizada em duas profundidades, ou seja, 40 cm e 80 cm. Destas
amostras previamente identificadas, retirou-se uma massa conhecida de solo representada pela
Tabela 5.
TABELA 5: Identificação dos pontos e de
massa de solo da 2ª coleta de solo
Amostras Profundidade
(cm)
Massa de Solo
(g)
P 1A 40
80
1,32
1,52
P 1B 40
80
1,80
1,70
P 2B 40
80
1,94
1,80
P 3B 40
80
2,73
2,10
P 4B 40
80
2,60
2,20
P 5B 40
80
2,11
1,98
P 6B 40
80
1,87
1,85
33
Cada amostra foi misturada em frasco do tipo Erlenmayer de 250 mL contendo 100 mL
de água desmineralizada e autoclavada a uma temperatura de 121° C durante 15 minutos depois
de resfriada e em pH 7,0, somente. Repetiram-se os procedimentos da técnica utilizada na
primeira cultura, fazendo-se as contagens das UFC com 24 h e 48 h de incubação em estufa a
uma temperatura de 30º C. Após a contagem as colônias foram descartadas depois de
esterilizadas.
4.4.3 Terceira cultura de solo
As amostras da terceira cultura foram coletadas no dia 04/03/05 nas mesmas condições
das duas primeiras. Nestas amostras, estabeleceu-se determinar a umidade do solo como um novo
parâmetro de comparação sazonal. A massa de solo utilizada para essa nova cultura foi feita com
repetição de procedimentos para cada amostra e tomou-se o cuidado de se utilizar uma massa de
solo mais homogênea entre as duas profundidades, representada pela Tabela 6.
34
TABELA 6: Identificação dos pontos e de massa
de solo da 3ª coleta, 1ª medição.
Amostra Profundidade
(cm)
Massa de solo
(g)
P 1A
40
80
2,51
2,78
P 1B
40
80
3,08
3,21
P 2B
40
80
3,19
2,49
P 3B
40
80
2,91
3,18
P 4B
40
80
2,97
3,27
P 5B
40
80
2,44
2,92
P 6B
40
80
3,12
2,97
Uma vez que se estabeleceu as massas para repetição das culturas, novamente se aplicou
os procedimentos utilizados nas culturas anteriores e tomou-se o cuidado de utilizar massas de
solo mais homogêneas . Foram feitas a contagens de UFC após 24h e 48h de crescimento na
estufa a uma temperatura de 30°C que depois foram levadas à refrigeração.
No dia 19/03/05 uma nova amostra de massa de solo proveniente da terceira coleta em
duas profundidades foi pesada para se fazer a repetição das culturas, esses resultados estão na
Tabela 7.
35
TABELA 7: Identificação dos pontos de coleta e
de massa de solo da terceira coleta – Repetição
Amostras Profundidade
(cm)
Massa de solo
(g)
P 1A
40
80
2,20
2,06
P 1B
40
80
2,20
2,24
P 2B
40
80
2,12
2,09
P 3B
40
80
2,20
2,05
P 4B
40
80
2,02
2,08
P 5B
40
80
2,12
2,02
P 6B
40
80
2,01
2,09
Uma vez que se estabeleceu a massa para a repetição das culturas, novamente se aplicou o
procedimento utilizado nas culturas anteriores para obtenção do inóculo nos meios de culturas
nas placas de Petri. Essas placas devidamente cultivadas com os inóculos foram levadas à estufa
a uma temperatura de 30°C por 24 h e 48 h para crescimento das colônias de bactérias do solo.
Foram efetuadas duas contagens de UFC, uma após 24 h e a outra após 48 h de incubação.
Depois de 48 h de crescimento, as colônias formadas foram resfriadas para inoculação futura em
meio de cultura preparados em tubos de ensaio.
36
4.4.4 Culturas de bactérias em tubos de ensaios
Preparou-se um meio de cultura utilizando-se 4,5 g de Agar Padrão Contagem (Plate-
Count-Ágar) em pó, que foi adicionado em 200 mL de água desmineralizada e levada à fervura
durante 30 minutos para homogeneização. Ainda no estado líquido, retirou-se 3,0 mL deste meio
que foi adicionado em cada um dos 50 tubos de ensaio que depois foram autoclavados durante 15
minutos à temperatura de 121° C e tamponados com tufos de algodão. Depois de autoclavados,
os tubos contendo os meios de culturas foram colocados inclinados para solidificação (em torno
de 80° de inclinação) e depois levados à refrigeração. Da terceira cultura, selecionou-se as 50
maiores colônias de bactérias crescidas em placas de Petri. Cepas destas 50 colônias foram
inoculadas nos tubos de ensaio e levadas à estufa para crescimento a uma temperatura de 30° C
durante 72 h. Após esse tempo, os tubos de ensaios foram levados à refrigeração.
4.4.5 Culturas de bactérias em meio líquido
O meio de cultura líquido foi preparado utilizando-se 5,0 L de água desmineralizada onde
se adicionou 100 g de glicose, 50 g de peptona e 50 g de extrato de levedura numa proporção de
2% de glicose e de 1% de peptona e extrato de levedura, respectivamente. Em seguida essa
mistura foi levada à autoclave acondicionados em frascos âmbar de 3 litros a uma temperatura de
121° C durante 15 minutos e depois resfriado em temperatura ambiente.
Um volume de 150 mL de meio de cultura, foi introduzido em cada um dos 25 frascos de
vidro âmbar com capacidade de 200 mL, tampados com algodão e previamente esterilizados à luz
ultravioleta na capela de fluxo laminar durante oito minutos. Nestes frascos com o meio de
37
cultura líquido, foram inoculadas as melhores colônias de bactérias crescidas e selecionadas nos
tubos de ensaio. Uma vez feito isso, os frascos com os inóculos foram levados à estufa a uma
temperatura de 30° C durante 72 h para crescimento. Após esse tempo, as amostras cultivadas
foram levadas à refrigeração para posterior inoculação nos reatores com solo contaminado com
gasolina em diferentes diluições.
4.4.6 Cultura do solo contaminado com gasolina
Foram reservadas quinze amostras de solo inoculadas com gasolina adicionado com cinco
mL de meio de cultura líquido contendo bactérias em três tipos diferentes de concentração de
gasolina, sendo que em cinco amostras com concentração de 50 uL de gasolina, cinco com
concentração de 300 uL de gasolina e cinco amostras contendo 500 uL de gasolina para a para
cada 50 g de solo que foram introduzidas no interior dos reatores de vidro devidamente
tampados com batoques e tampas plásticas.
Esses quinze reatores foram destinados à análises microbiológicas de culturas bacterianas
para a comprovação da sobrevivência ou não das bactérias em solo contaminado com gasolina
após um período de 245 dias de degradação e do término das análises cromatográficas. Tais
amostras seguiram os seguintes procedimentos.
Para cada concentração de gasolina nas amostras, foram preparados cinco frascos de vidro
do tipo Erlenmeyer de 250 mL onde foram adicionados 100 mL de água desmineralizada em
cada um, tamponados com algodão , revestidos com papel alumínio e submetidos à autoclave a
uma temperatura de 120° C durante 20 minutos.
38
Após resfriar, adicionou-se uma massa conhecida de solo em cada frasco de Erlenmeyer
conforme demonstrado na Tabela 8.
Homogeneizou-se a mistura por agitação com a finalidade de formar uma solução
contendo bactérias que tivessem sobrevivido no solo adicionado nos frascos.
Observou-se, porém, um precipitado de solo nos Erlenmeyer após a homogeneização.
Desta solução, retirou-se 1 mL que foi adicionado em um tubo de ensaio com 9 mL de água
desmineralizada e previamente autoclavado e tamponados com algodão. Após homogeneização,
retirou-se deste tubo 1 mL da solução em que se adicionou em um segundo tubo de ensaio com 9
TABELA 8: Massa de solo e concentração de gasolina
utilizado para a 4ª cultura de bactérias
Concentração de
gasolina
ul / 50 g solo
Amostra Massa de solo
g/100 mL
50 A02 2,80
50 A06 2,12
50 A10 2,18
50 A12 2,48
50 A15 2,14
300 A04 2,20
300 A06 2,20
300 A11 2,30
300 A12 2,20
300 A15 2,30
500 A01 2,40
500 A05 2,50
500 A07 2,40
500 A10 2,20
500 A15 2,15
39
mL de água preparado como no primeiro, formando-se uma solução diluída a 10
-2
. Deste segundo
tubo de ensaio, retirou-se novamente 1 mL da mistura a qual foi adicionada em um terceiro tubo
com 9 mL de água formando uma solução diluída a 10
-3
. Esse procedimento foi repetido para as
amostras de solo com 300 uL e 500 uL de gasolina, totalizando 45 tubos de ensaio devidamente
identificados com a concentração de gasolina, a diluição e o número das amostras.
Para cada tubo de ensaio preparado, retirou-se um volume de 0,1 uL da solução após
agitação, com pipetador automático devidamente aferido que foi transferido para placa de Petri
com meio de cultura do tipo Agar Padrão Contagem, previamente preparado em condições
assépticas na câmara de fluxo laminar, repetindo o procedimento para cada amostra e totalizando
90 placas de Petri preparadas com o inóculo.
Em seguida, as placas foram encaminhadas à estufa para crescimento das possíveis
colônias de bactérias a uma temperatura de 30° C. Após 24h, efetuou-se a primeira contagem de
colônias formadas nas placas, repetindo-se a contagem após 48h de incubação.
4.5 O preparo do solo para os reatores
Uma amostra de 25 Kg de solo foi coletado no terminal de combustível da Petrobrás de
Ribeirão Preto e levado ao laboratório de Química Agrícola da Unaerp onde foi submetido à
análise química de minerais e de umidade. O solo restante foi peneirado e separado em frações de
50 g e, em seguida, esterilizados por radiação de luz ultravioleta durante 8 minutos na capela de
fluxo laminar para descontaminação de microrganismos naturais preservados no solo, evitando
assim, qualquer contaminação do solo experimental por possíveis bactérias ali encontradas, se
não aquelas cultivadas no laboratório.
40
Como reatores usou-se frascos de vidro âmbar com capacidade para 100 mL e 200 mL,
lavados e esterilizados em raio ultravioleta durante oito minutos na capela de fluxo laminar.
As amostras de solo esterilizadas foram adicionadas no interior dos frascos em um total de
225 amostras e em seguida, contaminou-se com gasolina. Estabeleceu-se fazer três níveis
diferentes de contaminação com gasolina nas amostras de solos introduzidas nos reatores; uma
com saturação baixa (50 uL), outra com saturação média (300 uL) e outra com saturação alta
(500 uL). Assim, para cada uma das quinze amostras de bactérias das 50 selecionadas das
culturas líquidas, foram utilizados quinze reatores com 50 g de solo onde, em cada um, colocou-
se 5 mL de cultura de bactérias, sendo que em cinco havia uma concentração de 50 µL de
gasolina, cinco com 300 µL de gasolina e outros cinco com 500 µL de gasolina, identificando-os
com os números das amostras, o tipo de diluição da gasolina e o tempo em que se deverá fazer a
leitura da biodegradação conforme demonstrado na Figura 5.
FIGURA 5: Inoculação das bactérias nos reatores com solo contaminado
41
Estabeleceu-se fazer a avaliação da degradação em três períodos diferentes,
respectivamente com 60, 90 e 270 dias, através de cromatografia em fase gasosa do BTEX
eliminados nos reatores. Foi utilizada também, uma amostra padrão de eliminação de gases de
um reator somente com solo coletado no Terminal de Combustíveis e outros três solos com
adição de gasolina em três diferentes diluições.
Posteriormente os frascos reatores foram acondicionados em caixas de papelão e
armazenados em local escuro a uma temperatura média de 25°C para as futuras leituras
cromatográficas para a comprovação da biodegradação representado na Figura 6.
FIGURA 6: Frascos reatores prontos para observação da biodegradação
42
4.6 Cromatografia em Fase Gasosa
A técnica analítica utilizada neste estudo, para a identificação e quantificação dos
compostos orgânicos voláteis (BTEX) liberados do solo contaminado por gasolina e do solo não
contaminado, foi a cromatografia em fase gasosa com detector de ionização de chama. Esta
técnica foi escolhida devido ao fato de ser uma técnica de alta sensibilidade, principalmente na
detecção dos hidrocarbonetos
O cromatógrafo utilizado para as realizações das análises de BTEX é o modelo HP 6890
plus, apresentado na Figura 7.
FIGURA 7: Cromatógrafo de fase gasosa modelo HP 6890 plus,
43
5 - RESULTADOS
5.1 Análise de BTEX
Para a análise do BTEX utilizou-se uma coluna capilar de sílica fundida (DB-624) de 30
m de comprimento, 0,32 mm de diâmetro interno e 1,8 μm de filme.
Condições do cromatógrafo:
9 Temperatura inicial de 40°C durante 3 minutos com posterior aquecimento até 80°C a uma
razão de aquecimento de 3°C/min onde permanece por 0,33 min e novo aquecimento até
180°C, a uma razão de 9°C/min, onde permanece por um período de 3 min;
9 Temperatura do injetor de 160°C;
9 Temperatura do detector de 300°C;
9 Fluxo de gás de arraste de 1,5 mL/min e
9 Injeção split 12:1
5.2 A curva de calibração
O cromatógrafo foi calibrado utilizando-se uma mistura padrão de BTEX (benzeno,
tolueno, etilbenzeno, e xilenos), com éter etílico como padrão interno. Os tempos de retenção (em
minutos) dos componentes da curva de calibração para análise do BTEX foi obtida conforme
descrita e apresentado na Tabela 9 e no Apêndice I.
44
Para verificar o perfil e os tempos de retenção para a análise do padrão de BTEX, foi feita
uma injeção de um dos pontos que representa uma das diluições da curva de calibração, cuja
representação gráfica e os tempos de retenção estão apresentados na Figura 8.
FIGURA 8: Cromatograma de um ponto da curva de calibração
TABELA 9: Tempo de retenção ( TR ) do BTEX para a calibração.
COMPONENTE TR em
(min)
Ponto 1
mg.L
-1
Ponto 2
mg.L
-1
Ponto 3
mg.L
-1
Ponto 4
mg.L
-1
Ponto 5
mg.L
-1
Padrão interno 4,15 - - - - -
Benzeno 7,434 0,016 0,040 0,080 0,160 0,320
Tolueno 12,551 0,016 0,040 0,080 0,160 0,320
Etilbenzeno 17,824 0,016 0,040 0,080 0,160 0,320
M/p xileno 18,275 0,032 0,080 0,0160 0,320 0,640
O xileno 19,492 0,016 0,040 0,080 0,160 0,320
45
5.3 Padrão de BTEX do solo
Para se fazer o padrão sem contaminação de gasolina, colocou-se 50 g de solo peneirado
em frasco âmbar de 250 ml, onde se adicionou 50 mL de água e 250 uL de BTEX a 8 mg L
-1
, em
seguida o frasco foi tampado com batoque plástico e tampa com septo de silicone,
homogeneizando-se a mistura por agitação. Depois deste procedimento, levou-se o frasco ao
aquecimento em banho maria a uma temperatura de 80°C durante 15 minutos. Após esse tempo
retirou-se do frasco 300 uL do gás preso no headscap formado no vidro, utilizando uma seringa
gasthit, a qual foi injetada no cromatógrafo para fazer a leitura do padrão de BTEX.
5.4 Resultados das culturas de bactérias do solo sem contaminação
Nas amostras de solo da primeira coleta que foram preparadas em pH 4,0 e 7,0 não se
observou crescimento de colônias de bactérias em pH 4,0. Isso se deve ao fato de que as bactérias
necessitam de fatores ecológicos ótimos para o seu crescimento e, a acidez do meio, é um fator
limitante desse crescimento, sendo então, desprezado este procedimento para as próximas
amostras a serem cultivadas.
Nas primeiras amostras de solo (1ª cultura) , estabeleceu-se utilizar a estufa a uma
temperatura de 38°C para a incubação das colônias. No entanto, para as outras duas incubações,
foi utilizado uma temperatura de 30°C. Essa diminuição da temperatura de 38°C para 30°C,
resultou em um maior crescimento de colônias por amostra de solo. Isso se deve ao poder seletivo
da temperatura no crescimento bacteriano. A temperatura de 38° C seleciona as bactérias
46
termófilas. O método utilizado para as culturas das bactérias demonstrou ser eficiente, visto que
na maioria das culturas obteve-se um grande crescimento de colônias.
As Tabelas 10 e 11 apresentam os resultados do crescimento das colônias formadas após
24 e 48 h de incubação, respectivamente.
TABELA 10: Número de colônias formadas da segunda cultura de solo em pH
7,0 e profundidade de 40 e 80 cm e 24h de incubação
Amostras
Diluições
10
-2
10
-3
10
-4
10
-5
280 23 0 0 P1A 40
80 302 0 0 0
incontável 0 0 0 P1 B 40
80 incontável 436 58 0
incontável 0 0 0 P2 B 40
80 incontável incontável 0 0
incontável incontável 0 0 P3 B 40
80 incontável 27 0 0
incontável 12 0 0 P4 B 40
80 incontável incontável 0 0
incontável 18 0 0 P5 B 40
80 incontável 16 0 0
incontável 10 0 0 P6 B 40
80 incontável 18 0 0
47
TABELA 11: Número de colônias formadas na segunda cultura de solo
em pH 7,0 e profundidade de 40 e 80 cm– 48h incubação
Amostras
Diluições
10
-2
10
-3
10
-4
10
-5
incontável 32 0 0 P1 A 40
80 incontável 7 2 0
incontável 20 1 0 P1 B 40
80 incontável 32 7 0
incontável 0 0 0 P2 B 40
80 incontável incontável 0 0
incontável incontável 0 0 P3 B 40
80 incontável 72 0 0
incontável 95 0 0 P4 B 40
80 incontável incontável 0 0
incontável 243 0 0 P5 B 40
80 incontável incontável 0 0
incontável incontável 0 0 P6 B 40
80 incontável 1920 0 0
Notou-se que nas culturas mais diluídas, o crescimento de colônias foi pequeno quando
incubadas por um período de 24 h e, quando incubadas por 48 h, o aumento do número de
colônias foi bem maior (Tabelas 10 e 11). É interessante observar também, que o crescimento das
colônias em profundidade de 80 cm foi maior que o crescimento em 40 cm de profundidade.
Provavelmente isso acontece em função da temperatura mais favorável nessa profundidade e
também da umidade do solo maior, visto que a camada superior está exposta à insolação por não
apresentar cobertura vegetal protetora, portanto, o solo é mais seco e quente. Uma vez que todos
os processos de crescimento dependem das reações químicas e que essas são influenciadas pela
temperatura, o crescimento bacteriano pode ser profundamente influenciado por essa condição. A
48
temperatura determinará, em parte o ritmo e a quantidade total do crescimento do organismo. As
variações térmicas também podem influenciar os processos metabólicos e a morfologia celular
(PELCZAR, CHAN, KRIEG. 2005).
Na Tabela 12, observa-se o cálculo de massa de bactérias por unidade de colônia
resultantes da segunda coleta de solo. Pode-se notar que em todos os pontos de coleta de amostras
forma-se uma grande massa de microrganismos, especialmente nos pontos de coleta mais
protegidos pela vegetação, como no ponto 6 B, demonstrando a importância da umidade como
fator ecológico para a microbiocenose.
TABELA 12: Massa de bactérias formadas por unidades de colônias em 48 h da 2ª
coleta de solo.
Amostra Nº de bactérias
10
x
Massa de solo / g UFC / g de solo.
10
x
1 A 3,2 x 10
5
1,32 2,4 x 10
5
1 B 2,0 x 10
5
1,80 1,1 x 10
5
2 B 5,1 x 10
5
1,94 2,6 x 10
5
3 B 7,2 x 10
5
2,76 2,6 x 10
5
4 B 9,5 x 10
5
2,60 3,6 x 10
5
5 B 2,43 x 10
6
2,11 1,2 x 10
6
6 B 1,92 x 10
7
1,87 1,0 x 10
7
Na Figura 9, pode-se observar amostras de algumas colônias de bactérias que se formaram
em placas de Petri, provenientes da segunda cultura, comprovando a diversidade de formas de
colônias e a sua formação.
49
FIGURA 9: Amostras de colônias formadas em placas de Petri provenientes
da 2ª cultura de solo.
Na terceira coleta de solo, retirou-se uma massa de solo de cada amostra, as quais foram
encaminhadas ao Laboratório de Química Agrícola da Universidade para medida da umidade e
que servirá como um novo parâmetro para interpretação do crescimento bacteriano. Na Tabela 13
estão apresentados os resultados das medidas de umidade do solo realizada na terceira coleta de
amostras.
50
TABELA 13: Determinação da umidade do solo, método gravimétrico .
Amostra Umidade %
1A 40 16,624
1A 80 18,694
1B 40 16,667
1B 80 18,692
2B 40 16,922
2B 80 18,918
3B 40 17,537
3B 80 17,084
4B 40 16,903
4B 80 17,053
5B 40 18,97
5B 80 20,894
6B 40 20,615
6B 80 21,059
Estes resultados servem como parâmetro de interpretação do crescimento bacteriano. Ele
comprova que em profundidades de 80 cm, a umidade do solo é maior na maioria das amostras,
permitindo melhores condições de sobrevivência para microrganismos e demonstrando que nos
locais de coleta coberto por vegetação a umidade é maior, como observado no ponto 6B, onde no
local a sobrevivência de uma microfauna mais diversa.
O comportamento do padrão de crescimento das culturas formadas a partir de amostras
de solo da terceira coleta foi semelhante ao das duas anteriores com poucas diferenças, sendo
portanto desprezíveis. As Tabelas 14 e 15 mostram o número de colônias formadas em 24 e 48 h,
respectivamente.
51
Pode-se observar que tanto na Tabela 14 como na Tabela 15, alguns meios de cultura não
tiveram crescimento de colônias de bactérias uniforme em todas as amostras. Isso se deve,
provavelmente, pela falta de homogeneização correta durante o processo de inoculação da
solução feita com o solo nos meios de culturas, visto que ocorre precipitação de bactérias no
interior dos tubos de ensaios e que, também, as bactérias utilizam as partículas do solo como
substrato para fixação.
TABELA 14: Numero de colônias formadas na 3ª cultura em pH 7,0 e em
profundidades de 40 e 80 cm e 24h de incubação.
Diluição
Amostras 10
-2
10
-3
10
-4
10
-5
12 incontáveis incontáveis 2 P 1 A 40
80
incontáveis incontáveis 1 0
18 incontáveis 2 3 P 1 B 40
80 1 1 2 2
incontáveis 0 10 0 P 2 B 40
80 7 1 0 0
incontáveis 1 0 0 P 3 B 40
80 incontáveis incontáveis 0 1
incontáveis incontáveis 0 0 P 4 B 40
80 incontáveis 0 0 0
incontáveis 0 0 0 P 5B 40
80 1 0 0 0
incontáveis incontáveis 28 1 P 6 B 40
80 2 0 0 1
52
TABELA 15: Número de colônias formadas na 3ª cultura em pH 7,0 e em
profundidades de 40 e 80 cm e 48h de incubação.
Diluição
Amostras 10
-2
10
-3
10
-4
10
-5
incontáveis incontáveis incontáveis 1
P 1 A 40
80 incontáveis incontáveis 1 0
incontáveis incontáveis 3 3 P 1 B 40
80 1 1 2 2
incontáveis 1 5 0 P 2 B 40
80 10 1 0 0
incontáveis 1 0 0 P 3 B 40
80 incontáveis incontáveis 1 1
incontáveis incontáveis 13 0 P 4 B 40
80 incontáveis 0 0 0
incontáveis 0 0 0 P 5 B 40
80 1 1 1 0
incontáveis incontáveis 31 7 P 6 B 40
80 9 0 1 1
As colônias que apresentaram um crescimento mais uniforme provenientes da terceira
cultura, e que foram inoculadas em meio de cultura sólido Agar Padrão, no interior dos tubos de
ensaios para multiplicação, apresentaram um grande crescimento de colônias. Posteriormente, as
amostras dessas colônias formadas nos tubos de ensaio, e que foram inoculadas em frascos de
vidro com meio de cultura líquido, tiveram um crescimento muito significativo observando-se a
formação de um grande número de colônias, condição ideal para a inoculação em solo
contaminado com gasolina porque dota-o de uma grande população de bactérias, facilitando a
probabilidade de sobrevivência delas nos reatores.
53
Em alguns casos, observou-se ainda, a formação de hifas de fungos nos meios de culturas
como mostrado na Figura 10, fato este que merece um estudo à parte, visto que esta análise não
condiz com os objetivos desta pesquisa.
FIGURA 10: Colônia de fungo crescida no meio de cultura
5.5 Resultados das culturas de bactérias do solo contaminado com gasolina
Após feitas as análises cromatográficas com 270 dias de degradação, foi analisado o
resultado das culturas dos solos em reatores contaminados com gasolina e adicionados de meios
de culturas contendo bactérias. As Tabelas 16 e 17, representam as UFC das culturas de solo
provenientes dos reatores testemunhas com 24 e 48 horas de incubação em estufa a uma
temperatura de 30° C.
54
TABELA 16: Resultado das culturas de bactérias do solo contaminado com gasolina nas
concentrações de 50 uL, 300 uL e 500 uL, com 24 h de incubação após 270 dias.
Concentração
de gasolina
ul / 50 g solo
Identificação
da amostra
Massa de
solo
usado
para
diluição
g/100 mL
UFC a 10
-1
com
repetição
UFC a 10
-2
com
repetição
UFC a 10
-3
Com
repetição
50
Repetição
A02 2,8 297
incontáveis
236
4
175
217
50
Repetição
A06 2,12 6
4
0
0
0
0
50
Repetição
A10 2,18 83
1
1
0
0
0
50
Repetição
A12 2,48 280
incontáveis
6
0
0
1
50
Repetição
A15 2,14 0
14
0
0
1
0
300
Repetição
A04 2,2 0
6
0
4
0
0
300
Repetição
A06 2,2 1
3
0
0
0
0
300
Repetição
A11 2,3 293
40
0
14
0
0
300
Repetição
A12 2,2 7
3
0
0
0
1
300
Repetição
A15 2,3 0
0
0
1
1
0
500
Repetição
A01 2,4 incontáveis
1
0
1
0
0
500
Repetição
A05 2,5 80
incontáveis
0
0
0
0
500
Repetição
A07 2,4 0
11
0
0
0
0
500
Repetição
A10 2,2 0
1
0
0
0
5
500
Repetição
A15 2,15 5
1
0
0
0
0
55
TABELA 17: Resultado das cultura de bactérias do solo contaminado com gasolina
nas concentrações de 50 uL, 300 uL e 500 uL, e 48 h de incubação após 270 dias.
Concentração
de gasolina
ul / 50 g solo
Identificação
da amostra
Massa de
solo usado
para
diluição
g/100 mL
UFC a 10
-1
com
repetição
UFC a 10
-2
com
repetição
UFC a 10
-3
Com
repetição
50
Repetição
A02 2,8 incontáveis
incontáveis
incontáveis
50
219
incontáveis
50
Repetição
A06 2,12 6
6
0
1
0
0
50
Repetição
A10 2,18 incontáveis
7
1
incontáveis
0
0
50
Repetição
A12 2,48 incontáveis
incontáveis
0
incontáveis
1
0
50
Repetição
A15 2,14 0
14
0
0
0
0
300
Repetição
A04 2,2 incontáveis
7
0
13
0
0
300
Repetição
A06 2,2 1
5
0
1
0
0
300
Repetição
A11 2,3 incontáveis
incontáveis
0
14
0
12
300
Repetição
A12 2,2 4
3
0
0
1
1
300
Repetição
A15 2,3 12
0
0
2
1
0
500
Repetição
A01 2,4 incontáveis
1
1
2
1
1
500
Repetição
A05 2,5 incontáveis
incontáveis
0
3
1
3
500
Repetição
A07 2,4 0
8
1
0
1
0
500
Repetição
A10 2,2 0
incontáveis
0
1
0
5
500
Repetição
A15 2,15 80
6
2
8
0
0
Como pode-se observar nas Tabelas 16 e 17, a formação de UFC foi muito representativa,
especialmente nas culturas de solo com diluições mais concentradas de meio de cultura.. A
Figura 11 mostra algumas das amostras das colônias de bactérias formadas nas culturas do solo
contaminado com gasolina.
56
FIGURA 11: Fotos das UFC formadas nos solos contaminados com gasolina
após 270 dias de incubação.
5.6 As análises cromatográficas dos reatores
Uma vez cumprido o prazo estabelecido para o início das análises dos hidrocarbonetos
liberados nos reatores com solo contaminado e adicionado de bactérias, iniciaram-se as leituras
dos BTEX através de cromatografia de fase gasosa para a primeira remessa de reatores com 60
dias. A Figura 12 mostra o cromatograma do solo contaminado ~somente com gasolina que se
utilizou como padrão no início do tempo de incubação, demonstrando a presença de BTEX no
solo contaminado e seus respectivos tempos de retenção no cromatógrafo. No Apêndice I,
57
observa-se os cromatogramas com solo contaminado com gasolina nas concentrações de 50, 300
e 500 uL.
FIGURA 12: Cromatograma de solo contaminado com gasolina e tempos de saída dos gases.
5.7 Gráficos das degradações dos BTEXs
As Figuras 13 a 17 apresentam a concentração de BTEX em função do tempo de contato
do solo contaminado com gasolina. Como pode-se observar nos gráficos, houve uma efetiva
queda nas concentrações dos hidrocarbonetos, especialmente durante a fase inicial da
biodegradação. Isso se deve, provavelmente, em função de uma maior disponibilidade de
nutrientes para os microrganismos nesta fase. A biodegradação nos reatores com concentração de
500 uL de gasolina, foi mais lenta para o Benzeno do que as amostras com menores
concentrações e isso, se deve à ação mais tóxica deste componente em comparação com as
demais. Para os demais hidrocarbonetos, o comportamento de degradação foi semelhante
apresentando uma velocidade de degradação mais intensa na fase inicial, isto é, nos primeiros
sessenta dias. Deve-se ressaltar que em muitas amostras, formaram-se muitos gases leves que
ficaram presos nos headscap durante o período de degradação e que mascararam o tempo de
58
retenção do Padrão Interno de BTEX, dificultando a interpretação dos cromatogramas ( Apêndice
II ).
BENZENO
0
0,4
0,8
1,2
0 60 270
Benzeno 50 uL
0
0,5
1
1,5
2
2,5
0 60 270
Benzeno 300 uL
0
0,5
1
1,5
2
2,5
0 60 270
Benzeno 500 uL
FIGURA 13: Gráficos da degradação do Benzeno para as concentrações
de 50, 300 e 500 uL de gasolina/tempo em dias.
59
TOLUENO
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
060270
Tolueno 50 uL
0
1
2
3
4
060270
Tolueno 300 uL
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
060270
Tolueno 500 uL
FIGURA 14: Gráficos da degradação do Tolueno para as concentrações
de 50, 300 e 500 uL de gasolina/tempo em dias.
60
ETILBENZENO
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0,4
0,45
0 60 270
Etilbenzeno 50 uL
0
0,1
0,2
0,3
0,4
060270
Etilbenzeno 300 uL
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
060270
Etilbenzeno 500 uL
FIGURA 15: Gráficos da degradação do Etilbenzeno para as concentrações
de 50, 300 e 500 uL de gasolina/tempo em dias.
61
M/P XILENO
0
0,4
0,8
1,2
060270
M/P Xileno 50 uL
0
0,4
0,8
1,2
1,6
0 60 270
M/P Xileno 300 uL
0
0,4
0,8
1,2
1,6
2
060270
M/P Xileno 500 uL
FIGURA 16: Gráficos da degradação do M/P Xileno para as concentrações
de 50, 300 e 500 uL de gasolina/tempo em dias.
62
O XILENO
0
0,2
0,4
0,6
0 60 270
O Xileno 50 uL
0
0,2
0,4
0,6
060270
O Xileno 300
uL
0
0,2
0,4
0,6
0,8
060270
O Xileno 500 uL
FIGURA 17: Gráficos da degradação do O Xileno para as concentrações
de 50, 300 e 500 uL de gasolina/tempo em dias.
63
Observou-se que algumas amostras com saturação de gasolina de 300 uL e
500 uL, não houve degradação do BTEX. Segundo Ururahy et al, (1998), em altas concentrações
de gasolina, as populações microbianas podem ser inibidas pelo efeito tóxico do poluente. Assim,
o aumento da concentração de gasolina pode diminuir o crescimento dos microrganismos devido
ao seu efeito tóxico representado principalmente pelos compostos aromáticos BTEXs. Os
cromatogramas das amostras analisadas estão representados no Apêndice II.
64
6 – CONCLUSÃO E SUGESTÕES
A partir dos resultados analisados podemos concluir que:
• Existem bactérias no solo analisado do Terminal de Combustíveis de Ribeirão
Preto. Essas bactérias podem ser selecionadas e cultivadas em bancada e, dentre
essas bactérias, existem variedades que degradam compostos tóxicos presentes na
gasolina.
• As análises cromatográficas dos reatores com solo contaminado com gasolina e
adicionado de bactérias nas diferentes concentrações com período entre 60 e 270
dias, demonstraram a efetiva degradação do BTEX na maioria das amostras.
• A metodologia utilizada foi eficiente porque comprovou a biodegradação do
BTEX no experimento.
A partir dos conhecimentos adquiridos e das dificuldades encontradas durante esta
pesquisa, reomenda-se o seguinte:
• Para continuidade futura desta pesquisa, é necessário identificar taxonômicamente
as variedades de bactérias utilizadas no experimento.
• É necessário pesquisar outros tipos de reatores em relação ao seu volume e forma
de vedação.
• Pesquisar quais são os gases leves que aparecem no interior dos reatores durante o
período de degradação e que são mostrados nas cromatografias.
65
• Que as análises cromatográficas sejam feitas em intervalos de tempo mais curtos e
em maior número de vezes.
• Que uma vez identificadas essas bactérias, elas possam ser úteis em processos de
biorremediação.
66
7 - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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8- APÊNDICE I
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9- APÊNDICE II
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