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LARYSSA KATHLIN RAUH
AVALIAÇÃO
DA
ATIVIDADE
ANTIINFLAMATÓRIA
TÓPICA
DA
Vernonia
scorpioides (Lam) Persons EM MODELOS DE INFLAMAÇÃO CUTÂNEA EM
CAMUNDONGOS
CURITIBA
2008
Dissertação desenvolvida no Departamento de
Farmacologia do Setor de Ciências Biológicas da
Universidade Federal do Paraná durante o Curso de
Pós-graduação em Farmacologia, como requisito
parcial para a obtenção do título de Mestre em
Farmacologia.
Orientadora: Prof
a
Dr
a
Daniela de Almeida Cabrini
Co-orientador: Prof. Dr. Michel Fleith Otuki
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aquilo que acontece com elas.
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As pessoas que progridem na vida são aquelas que
acordam pela manhã e procuram as circunstâncias
que desejam, e se não as encontram, as criam.
Jorge Bernard Shaw
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AGRADECIMENTOS
A Deus, dono de todo conhecimento e sabedoria, por conceder essa conquista,
por estender suas mãos nos momentos de desânimo e por me apresentar a pessoas
tão especiais e auxiliadoras no decorrer do mestrado como a Alliete, Evelise, Cíntia e
Shirley.
Aos meus Pais, Nelso e Mara, e ao meu irmão Alisson, por tudo que
representam na minha vida e pela compreensão nos momentos de ausência.
Aos companheiros de laboratório e colegas de mestrado, pelo auxílio e pelos
momentos alegres que proporcionaram, com certeza vocês tornaram tudo mais leve e
agradável.
Ao grande Fernandinho “do citômetro”, por ter sido tão prestativo e dedicado me
auxiliando em alguns experimentos.
Aos meus orientadores, Daniela Cabrini e Michel Otuki, pelo exemplo de
competência e por despertarem em mim a paixão pela pesquisa.
Ao meu querido “Nemo”, Gledson, pelo carinho e incentivo, você é mais do que
especial.
E principalmente a Vó Duda (in memorian) pelo
exemplo de integridade, sabedoria e amor.
v
RESUMO
A Vernonia scorpioides Lam. Persons (Asteraceae) é uma planta de ocorrência
comum na mata atlântica do Brasil, sendo utilizada topicamente na medicina tradicional
para tratar uma variedade de afecções cutâneas. Em sua composição fitoquímica estão
presentes as lactonas sesquiterpênicas e flavonóides, nos quais já demonstraram
atividade antiinflamatória em vários estudos. O presente estudo teve por objetivo a
avaliação da atividade antiinflamatória tópica do extrato etanólico da Vernonia
scorpioides (EEVS), bem como das frações e do composto isolado luteolina sobre os
processos inflamatórios cutâneos agudos e crônicos, utilizando o modelo de edema de
orelha em camundongos (Swiss fêmeas e machos, pesando entre 25 a 30 g) induzido
pela aplicação tópica do 12-O-tetradecanoil forbol acetato (TPA), ácido araquidônico
(AA), capsaicina, fenol, histamina, oxazolona e óleo de cróton. A aplicação tópica do
EEVS inibiu o edema induzido pelo TPA de maneira dose-dependente, com uma
DI
50
=0,31 (0,21-0,45) mg/orelha e Imax de 80±5% (1 mg/orelha). A infiltração de
neutrófilos, através da avaliação da atividade da mieloperoxidase (MPO), também foi
inibida (Imax = 77±8%, 1 mg/orelha) nesse modelo, sendo esses resultados
confirmados na análise histológica. Todas as frações testadas (diclorometano, acetato,
acetato enriquecido e hexano), assim como o composto isolado luteolina, promoveram
um efeito anti-edematogênico (70±5%, 57±5%, 53±4%, 35±8% e 44±11%,
respectivamente). Da mesma forma que o EEVS, a fração diclorometano e acetato
também inibiram de maneira dose-dependente a formação do edema, bem como a
atividade da MPO. O EEVS e a luteolina reduziram a formação de ROS em amostras de
orelhas submetidas à aplicação do TPA. A aplicação tópica do EEVS no modelo do AA
também resultou na redução do edema com uma DI
50
=0,68 (0,41-1,13) mg/orelha e
Imax = 60±8% (1 mg/orelha). O EEVS aplicado topicamente foi capaz de alterar a
formação do edema em outros modelos de inflamação cutânea aguda, como no modelo
de edema de orelha induzido pela capsaicina (25±7%), fenol (88±6%) e histamina
(25±7%). No modelo de hipersensibilidade tardia, o EEVS se mostrou efetivo já nas
primeiras 24 h após o desafio com a oxazolona quando o tratamento foi realizado
vi
somente na fase efetora ou em ambas as fases (indução e efetora), com uma inibição
de 63,4% e 42,9%, respectivamente, mantendo esse efeito até a última medida do
edema (96 h). A atividade da MPO foi inibida de forma significativa pelo EEVS quando
avaliada 24 h após a re-exposição à oxazolona (53±16%). No entanto, o EEVS não
atuou sobre a proliferação dos linfócitos CD
4
+
e CD
8
+
presentes no linfonodo. No modelo
de inflamação crônica da pele, o EEVS reduziu o edema e a hiperproliferação
epidérmica após a aplicação repetida do óleo de cróton (inibição de 31 ± 2% no nono
dia de tratamento). O EEVS também inibiu a atividade da MPO, porém não foi capaz de
atuar sobre a atividade da n-acetil-β-D glucosaminidase (NAG). Em conclusão, os
resultados obtidos sugerem que o EEVS é efetivo na inibição de processos
inflamatórios cutâneos agudos e crônicos, bem como na resposta inflamatória envolvida
na reação de hipersensibilidade do tipo tardia, e que o efeito antiinflamatório do EEVS
provavelmente resulta da ação sinérgica de vários compostos que promovem a redução
da síntese de metabólitos do AA e a redução de ROS na derme. Assim, o presente
trabalho valida o uso popular da V. scorpioides sobre processos inflamatórios cutâneos
e introduz a V. scorpioides como uma planta de significativo interesse para o
desenvolvimento de um novo antiinflamatório tópico.
Palavras-chave: Vernonia scorpioides; Asteraceae; edema de orelha, inflamação
cutânea.
vii
ABSTRACT
The Vernonia scorpioides Lam. (Asteraceae) Persons, is a native Brazilian medicinal
plant commonly used topically in the folk medicine to treat some skin disorders,
including chronic ulcers, allergies, irritations and pruritus. Some compounds as lactones
sesquiterpenes and flavonoids are present in this specie and have been presenting anti-
inflammatory activities. The aim of the present study was to evaluate the topical anti-
inflammatory activity of Vernonia scorpioides in acute and chronic skin inflammation,
using the mice ear oedema model (female and male Swiss, 25-30 g) induced by topical
application of 12-O-tetradecanoilforbol acetate (TPA), arachidonic acid (AA), capsaicin,
phenol, histamine, oxazolone and croton oil. The topical application of ethanolic extract
of V. scorpioides (EEVS) caused a dose-related inhibition of oedema in TPA-induced
ear oedema model, showing a DI
50
=0,31 (0,21-0,45) mg/ear and 80±5% of inhibition (1
mg/ear). The neutrophils infiltration, evaluated by myeloperoxidase (MPO) activity, also
was inhibited in this acute model (I
max
=77±8%, 1 mg/ear), confirmed by histological
analysis. All the fractions tested, dichlorometane (DCM), acetate, enriched acetate and
hexane, as well the isolated compound luteoline, promoted an anti-oedematogenic
effect (70±5%, 57±5%, 53±4%, 35±8% e 44±11%, respectively). As shown by EEVS,
the DCM and acetate fraction also promoted a dose-related inhibition of ear oedema
and the MPO activity induced by TPA. The EEVS and luteoline reduced the ROS
production in the ear treated with TPA. The topical application of EEVS also resulted in
reduction of the AA-induced ear oedema [DI
50
=0,68 (0,41-1,13) mg/ear and I
max
=60±8%
(1 mg/ear)]. The EEVS applied topically was able to inhibit the oedema formation when it
was caused by capsaicin, phenol and histamine (25±7%, 88±6% and 25±7%,
respectively). In the delayed hypersensitivity model, the EEVS showed to be effective in
the first 24 h after the challenge with oxazolone when the treatment occurred in the
effector phase or both phases (induction and effector), with an inhibition of 63,4% and
42, 9%, respectively, sustaining this effect until the last measurement (96 h). The MPO
activity was inhibited by EEVS when it was evaluated 24 h after the challenge with
oxazolone (53±16%). However, EEVS did not show any effect on lymphocytes CD
4
+
and
viii
CD
8
+
proliferation in the lymphonode. In the inflammation chronic model, the EEVS
reduced the oedema formation and the epidermal hiperproliferation (inhibition of 31 ±
2% in day 9). The EEVS also inhibited the MPO activity, but it was not able to reduce the
n-acetil-β-D glucosaminidase activity (NAG). In conclusion, these results taken together
suggest that EEVS is effective to inhibit acute and chronic inflammatory responses of
skin, as well as the inflammatory process involved in delayed hypersensitivity reaction
and suggests that the V. scorpioides mechanism of action results from a synergic action
of several compounds that probably promotes de synthesis reduction of AA metabolites
and reduction of ROS. Thus, it validates the traditional use of V. scorpioides as a
medicinal plant and introduces this plant as interesting to the development of a new
topical anti-inflammatory.
Key words: Vernonia scorpioides; Asteraceae; ear oedema; skin inflammation.
ix
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS
...............................................................................
xii
LISTA DE ABREVIATURAS
....................................................................
xiv
1. INTRODUÇÃO
...................................................................................
1
1.1. Estrutura e Fisiologia da pele
..............................................................
2
1.2. Inflamação cutânea
...........................................................................
7
1.3. Doenças inflamatórias cutâneas e tratamento farmacológico
....................
12
1.4. Plantas medicinais como alvo de novos antiinf
lamatórios
tópicos
..................................................................................................
16
1.5. Vernonia scorpioides
.........................................................................
20
1.5.1. Aspectos Botânicos e Etnofarmacológicos
.........................................
20
1.5.2. Descrição Fitoquímica
....................................................................
22
1.4.3. Estudos Farmacológicos com a Vernonia scorpioides
..........................
25
2. OBJETIVOS
......................................................................................
2
6
2.1. Objetivo geral
..................................................................................
27
2.2. Objetivos específicos
........................................................................
27
3. MATERIAL E MÉTODOS
....................................................................
29
3.1. Extrato e frações da Vernonia scorpioides
...........................................
3
0
3.2. Animais e manutenção
.....................................................................
3
0
3.3. Drogas e soluções
...........................................................................
3
1
3.4. Protocolos experimentais (Modelo de edema de orelha)
...................
3
2
3.4.1. Avaliação do edema de orelha
........................................................
32
x
3.4.2. Edema de orelha induzido pela aplicação tópica de TPA
.......................
32
3.4.3. Edema de orelha induzido pela aplicação tópica do ácido araquidônico
...
33
3.4.4. Edema de orelha induzido pela aplicação tópica de Fenol
.....................
33
3.4.5. Edema de orelha induzido pela aplicação tópica de capsaicina
..............
34
3.4.6. Edema de orelha induzido pela aplicação intradérmica da histamina
.......
34
3.4.7. Edema de orelha induzido pela aplicação tópica de oxazolona
...............
35
3.4.8. Edema de orelha induzido pela aplicação múltipla de óleo de cróton
.......
35
3.5. Medida da atividade enzimática de mieloperoxidase
(MPO)..............
36
3.6. Medida da atividade enzimática da n-acetil-β-D-glucosaminidase
(NAG)
...................................................................................................
37
3.7. Avaliação da atividade antioxidante do extrato etanólico da V.
scorpioides
...........................................................................................
38
3.8. Análise do marcador de superfície celular da população de
leucócitos por citometria de fluxo
...........................................................
38
3.9. Análise de marcadores de superfície celular de subpopulações de
linfócitos por citometria de fluxo
............................................................
39
3.10. Análise histológica
........................................................................
40
3.11. Análise Estatística
.........................................................................
40
4. RESULTADOS
...................................................................................
41
4.1. Efeito do extrato etanólico da Vernonia scorpioides (EEVS) no modelo de
edema de orelha induzido por TPA
............................................................
42
4.2. Efeito tópico das diferentes frações da Vernonia scorpioides no modelo de
edema de orelha induzido por TPA
............................................................
48
4.3. Efeito antioxidante do extrato etanólico da Vernonia scorpioides (EEVS) e
do composto isolado luteolina
...................................................................
52
4.4. Efeito do extrato etanólico da Vernonia scorpioides (EEVS) no modelo de
xi
edema de orelha induzido por ácido araquidônico
........................................
52
4.5. Efeito do extrato etanólico da Vernonia scorpioides (EEVS) no modelo de
edema de orelha induzido por Fenol
..........................................................
53
4.6. Efeito do extrato etanólico da Vernonia scorpioides (EEVS) no modelo de
edema de orelha induzido por capsaicina
....................................................
54
4.7. Efeito do extrato etanólico da Vernonia scorpioides (EEVS) no modelo de
edema de orelha induzido por histamina
.....................................................
55
4.8. Efeito do extrato etanólico da Vernonia scorpioides (EEVS) no modelo de
edema de orelha induzido por oxazolona
....................................................
56
4.9. Efeito do extrato etanólico da Vernonia scorpioides (EEVS) no modelo de
edema de orelha induzido pela aplicação múltipla de óleo de cróton..................
61
4.10. Avaliação da estabilidade do extrato etanólico da Vernonia scorpioides
(EEVS)
..................................................................................................
67
5. DISCUSSÃO
......................................................................................
68
6. CONCLUSÕES
...................................................................................
88
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
.......................................................
91
ANEXOS
...........................................................................................
119
xii
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 Esquema simplificado de uma seção transversal da pele
..........
2
FIGURA 2 Esquema simplificado de uma seção transversal da epiderme
...
FIGURA 3 Vernonia scorpioides Lam. (Astearacea)
................................
3
21
FIGURA 4 Vernonia scorpioides Lam. (Astearacea). A- Vegetal florido, C-
Inflorescência característica, D – folhas, E- Ramo não florido
...
FIGURA 5 Compostos isolados e caracterizados a partir das folhas e
inflorescências da Vernonia scorpioides
................................
21
23
FIGURA 6 Hirsutinolídeos isolados da Vernonia tiflosculosa
.....................
24
FIGURA 7 Curva dose-resposta do EEVS no edema de orelha induzido
por TPA
............................................................................
43
FIGURA 8 Efeito do EEVS sobre o edema de orelha e aumento na
atividade da MPO induzido por TPA
......................................
44
FIGURA 9 Efeito do EEVS sobre a atividade da enzima MPO in vitro
........
45
FIGURA 10 Análise histológica do efeito do EEVS sobre o edema e
infiltrado leucocitário no modelo de edema de orelha induzido
por TPA
..........................................................................
46
FIGURA 11 Efeito do EEVS por via oral sobre o edema de orelha induzido
por TPA
..........................................................................
48
FIGURA 12 Efeito do EEVS e das frações da Vernonia scorpioides sobre o
edema de orelha induzido por TPA
......................................
49
FIGURA 13 Curva dose-resposta de diferentes frações obtidas do EEVS no
edema de orelha induzido por TPA
......................................
50
FIGURA 14 Efeito da fração Ace e DCM da Vernonia scorpioides sobre o
aumento da atividade da MPO induzida por TPA
....................
51
FIGURA 15 Efeito antioxidante do EEVS e do composto isolado luteolina
xiii
em modelo de edema de orelha induzido por TPA
..................
52
FIGURA 16 Curva dose-resposta do EEVS no edema de orelha induzido
por ácido araquidônico
........................................................
53
FIGURA 17 Efeito do EEVS no edema de orelha induzido por fenol
..........
54
FIGURA 18 Efeito do EEVS no edema de orelha induzido por capsaicina
....
55
FIGURA 19 Efeito do EEVS no edema de orelha induzido pela aplicação
intradérmica de histamina
....................................................
56
FIGURA 20 Efeito do EEVS no modelo de hipersensibilidade tardia
induzida pela oxazolona
.....................................................
58
FIGURA 21 Efeito do EEVS sobre a proliferação de linfócitos T CD
4
na
hipersensibilidade do tipo tardia
...........................................
59
FIGURA 22 Efeito do EEVS sobre a proliferação de linfócitos T CD
8
na
hipersensibilidade do tipo tardia
...........................................
60
FIGURA 23 Efeito do EEVS sobre a atividade da enzima mieloperoxidase
(MPO) no modelo de hipersensibilidade do tipo tardia induzida
por oxazolona
...................................................................
61
FIGURA 24 Efeito do EEVS no edema induzido pela aplicação múltipla de
óleo de cróton
...................................................................
63
FIGURA 25 Análise histológica do efeito do EEVS sobre o edema, infiltrado
leucocitário e hiperproliferação epidérmica no modelo de
edema de orelha induzido pela aplicação múltipla do óleo de
cróton
..............................................................................
65
FIGURA 26 Efeito do EEVS sobre a infiltração de leucócitos totais no tecido
durante o processo inflamatório crônico
.................................
66
FIGURA 27 Avaliação da estabilidade do EEVS
......................................
67
xiv
LISTA DE ABREVIATURAS
AA – Ácido Araquidônico
AceE – Acetato enriquecido
Acet - Acetato
AP-1 – Proteína ativadora-1
cAMP – 3’, 5’ - Adenosina monofosfato cíclico
cGMP - Guanosina monofosfato cíclico
CGRP – Peptídeo relacionado ao gene da calcitonina
Cys
38
– Cisteína 38
Cys
120
– Cisteína 120
COX-1 – Cicloxigenase 1
COX-2 – Cicloxigenase 2
DCM – Diclorometano
Dexa – Dexametasona
DI
50
– Dose do EEVS ou frações que reduziram a resposta em 50%
DMSO - Dimetilsulfóxido
EEVS – Extrato Etanólico da Vernonia scorpioides
EPP – Etilfenilpropiolato
FDA – Food and Drug Administration
Hex - Hexano
HTBA – Hexadeciltrimetilamônia
IgE – Imunoglobulina E
IFN-γ – Interferon gama
IL – Interleucina
iNOS – Óxido Nítrico Sintetase induzida
KGF – Fator de Crescimento dos Queratinócitos
LS – Lactonas Sesquiterpênicas
LOX – Lipoxigenase
5-LOX – 5-lipoxigenase
xv
MAPK – Proteína Quinase Ativada por Mitógeno
mDO – mili-Densidade Óptica
MHC I - Complexo Principal de Histocompatibilidade tipo I
MHC II - Complexo Principal de Histocompatibilidade tipo II
MPO – mieloperoxidase
NAG – N-acetil-β-D glucosaminidase
NF-kB – Fator de Transcrição Nuclear-
Кappa B
NO – Óxido Nítrico
NOS – Óxido Nítrico Sintetase
OMS – Organização Mundial da Saúde
PBS – Tampão fosfato de sódio
PAF – Fator de agregação plaquetária
PG - Prostaglandina
PGE
2
– Prostaglandina E
2
PK - Proteína quinase
PKA – Proteína quinase A
PKC – Proteína quinase C
PLA
2
– Fosfolipase A
2
PMN - Polimorfonucleares
ROS – Espécies Reativas de Oxigênio
RNS – Espécies Reativas de Nitrogênio
Th – T helper
TMB – Tetrametilbenzidina HCl
TGF β1 – Fator de crescimento tumoral β1
TNFα – Fator de necrose tumoral
TPA – 12-O-tetradecanoilforbol acetato
Tyr
36
– Tirosina 36
UV – Ultravioleta
VECF – Fator de Crescimento do Endotélio Vascular
INTRODUÇÃO
2
1. INTRODUÇÃO
1.1. Estrutura e Fisiologia da Pele
A pele é um órgão complexo que isola e recobre aproximadamente 2 m
2
da
superfície corpórea e representa 15% do peso corporal, sendo constituída por três
camadas de estrutura e propriedades distintas: a epiderme, derme e hipoderme (figura
1), dispostas e inter-relacionadas de modo a adequar-se de maneira harmônica ao
desempenho de suas funções. A estrutura, as propriedades e a composição da pele
variam consideravelmente em relação à idade. O sistema tegumentar (pele e derivados
epidérmicos) desempenha várias funções: protege contra lesões físicas, químicas e
biológicas, impede a perda de água, promove as sensações de dor, pressão, tato e
temperatura, sintetiza certos hormônios (dehidrotestosterona) e vitaminas (vitamina D),
promove a regulação térmica, metaboliza xenobióticos e excreta certas substâncias
através das glândulas sudoríparas (CHUONG et al., 2002; HAAKE et al., 2000;
SAMPAIO et al., 2000; SHAEFER e REDELMEIER, 1996; ROSS et al., 1993).
Figura 1: Esquema simplificado de uma seção transversal de pele demonstrando as três
camadas da pele (epiderme, derme e hipoderme) e os tipos celulares presentes. Fonte:
Adaptado de Freinkeil e Woodley, 2001.
EPIDERME
DERME
terminações
nervosas
Vasos
fibroblastos
mastócitos
neutrófilos
macrófagos
HIPODERME
queratinócitos
3
A camada superior da pele é a epiderme, sendo esta constituída por um epitélio
estratificado pavimentoso cuja espessura apresenta variações topográficas ao longo do
organismo (CANDI et al., 2005; SAMPAIO et al., 2000).
A epiderme é classificada basicamente em quatro camadas (figura 2), cada uma
apresentando uma função distinta (NORRIS, 2004; ROSS et al., 1993):
1) Camada córnea - atua como uma grande barreira à penetração de organismos
externos e toxinas, além de prevenir a perda de água;
2) Estrato granuloso – nessa camada inicia-se o processo de cornificação, onde as
células sofrem apoptose diferenciando-se em corneócitos;
3) Estrato espinhoso – os queratinócitos presentes nessa camada são
responsáveis pela produção dos filamentos de queratina (queratinização) que
interagem com os desmossomas, síntese de agentes antioxidantes (glutationa
redutase, peroxidase, catalase), citocinas, quimiocinas, queratohialina, etc.
4) Estrato basal - camada mais profunda responsável pela proliferação celular,
sendo essa camada resistente ao processo apoptótico.
Figura 2: Esquema simplificado de uma secção transversal da epiderme. Fonte: Adaptado de
Segre, 2006.
Camada Córnea
Estrato
Granuloso
Estrato Espinhoso
Camada
Basal
Envelope cornificado
Microfibrilas de
Queratinócitos
Bicamada lipídica
“Tight
junctions”
4
A epiderme é constituída de múltiplos tipos celulares que possuem diferentes
origens embrionárias. Aproximadamente 80-85% da epiderme é constituída de
queratinócitos, 10-13 % de melanócitos, 4% de células de langerhans e 1% de células
de Merckel (KOSTER e ROOP, 2004; FREINKEIL e WOODLEY, 2001)
.
A manutenção
do número de células na epiderme depende do balanço entre proliferação celular e
morte celular (diferenciação/apoptose) dos queratinócitos. Esse processo é governado
pela comunicação parácrina e autócrina via hormônios, fatores de crescimento e
citocinas ou por comunicação intercelular via célula-célula e célula-matrix de adesão, ou
ainda pela comunicação intercelular na região da “gap junction” (HAAS e HERLYN,
2005; HAAKE et al., 2000). A epiderme tem a capacidade de auto-renovação tanto sob
condições homeostáticas como em condições nocivas, devido à presença de uma
população celular mitoticamente ativa na camada basal. Em condições normais, a
renovação epidérmica é balanceada pela descamação da camada córnea na superfície
da pele, onde se verifica uma diferenciação celular progressiva, através do processo de
queratinização e cornificação, a partir da camada basal em direção a superfície (CANDI
et al., 2005; FUCHS e RAGHAVAN, 2002).
Os queratinócitos representam o principal tipo celular presente na epiderme, sendo
responsáveis pela manutenção da integridade da estrutura epidérmica. Os
queratinócitos também estão envolvidos na resposta imunológica do tecido cutâneo,
uma vez que expressam diferentes citocinas, quimiocinas e também moléculas do
complexo principal de histocompatibilidade da classe II (MHC-II). No processo de
diferenciação celular os queratinócitos passam a produzir a queratina, uma proteína
resistente e impermeável que preenche as células mais superficiais da epiderme
(corneócitos) e que promove força mecânica, mantêm a estrutura do queratinócito e
contribui na adesão celular. As propriedades estruturais e funcionais dos queratinócitos
presentes na epiderme de humanos e pequenos mamíferos são extraordinariamente
semelhantes (CHAN, 2004).
Os melanócitos são as células produtoras de melanina que contribuem para a
coloração da pele e para a proteção contra a radiação ultravioleta (UV). Os melanócitos
são células arredondadas com prolongamentos dentríticos longos que se estendem
5
pelas duas camadas inferiores da pele (ROSS et al., 1993). Essas células estão
localizadas na camada basal da epiderme (camada basal), onde formam uma unidade
com os queratinócitos cuja proporção é de 1:5, que é mantida através da regulação da
divisão dos melanócitos (HAAS e HERLYN, 2005; FITZPATRICK et al., 1979). Os
melanócitos sintetizam a melanina na forma de melanossomas, que são transferidos
para os queratinócitos das camadas superiores através da passagem dos seus
prolongamentos dentríticos, cujo processo é chamado de secreção citócrina (ROSS et
al., 1993). Além da pele, os melanócitos também estão presentes no epitélio de
mucosas, no bulbo capilar, no sistema nervoso central, na retina e no aparelho ocular
(SAMPAIO et al., 2000).
As células de langerhans estão localizadas nas camadas suprabasais da epiderme
da pele e das mucosas, onde desempenham um importante papel na reposta imune
cutânea (CHAN, 2004). As células de langerhans são células migratórias que possuem
vários receptores de membrana envolvidos no processo imunológico (ex.: MHC classe
II, IgG - imunoglobulina G, C
3
-fator do complemento C
3
). Assim, essas células são
responsáveis pelo reconhecimento, captação, processamento e apresentação de
antígenos solúveis e haptenos aos linfócitos T. Em certas doenças inflamatórias
cutâneas, como na dermatite de contato e em processos alérgicos, verifica-se que as
células de langerhans se tornam mais abundantes (NORRIS, 2004; HAAKE et al.,
2000).
As células de Merckel são células epidérmicas modificadas, localizadas no estrato
basal (ROSS et al., 1993). No citoplasma dessas células existem grânulos que contem
catecolaminas, além disso esse tipo celular está freqüentemente próximo ou em contato
com nervos não-mielinizados, onde formam sinapses com terminações nervosas
periféricas (NORRIS, 2004). Assim, as células de Merckel atuam como
mecanoreceptores e também contribuem no desenvolvimento do plexo nervoso na
porção superior da derme (HAAKE et al., 2000).
Além das células residentes da epiderme (queratinócitos, melanócitos, células de
langerhans e células de Merkel), outras células migram para a epiderme em resposta
aos mais variados estímulos nas quais incluem: os linfócitos, macrófagos, neutrófilos e
6
eosinófilos, sendo essas células elementos da resposta de defesa inata ou adquirida
(RANG et al., 2007; NORRIS, 2004).
A derme consiste num tecido conectivo, cuja espessura é superior ao da epiderme,
porém com uma população celular inferior. Esta estrutura confere à pele elasticidade,
força tensil e resistência mecânica. Além disso, a derme interage com a epiderme
através da junção dermoepidérmica, garantindo assim as trocas de elementos nutritivos
e metabólicos entre essas camadas (HAAKE et al., 2000). A derme é dividida em
camada papilar, que é a camada mais próxima da epiderme, e a camada reticular, que
é formada por um tecido conectivo denso e constitui a maior parte da derme (NORRIS,
2004). A constituição da derme envolve polissacarídeos (hialuronidatos e
condroitinsulfatos), substância fundamental (glicoproteínas, proteoglicanas e
glicosaminoglicanas), material fibrilar (fibras colágenas, fibras elásticas e fibras
reticulares), receptores sensoriais (ex.: corpúsculos de Meissner, corpúsculos de
Pacini), células dérmicas (fibroblastos), vasos sanguíneos e linfáticos. Os fibroblastos
sintetizam diferentes macromoléculas que entram na constituição da matriz celular
como, por exemplo, o colágeno e a elastina (HAAKE et al., 2000; SAMPAIO et al.,
2000; ROSS, 1993). Durante um processo inflamatório ou de cicatrização ocorre o
aumento da proliferação e da atividade de fibroblastos devido a ação de alguns
mediadores pró-inflamatórios como a interleucina 1α (IL-1α) e interleucina 1β (IL-1β)
(FREINKEL e WOODLEY, 2000).
Os vasos sangüíneos presentes na derme permitem que ocorra a infiltração de
células migratórias importantes no processo de resposta de defesa inata ou imune e de
cicatrização, como os macrófagos, linfócitos, eosinófilos, neutrófilos, etc (RYAN, 2004).
As inervações vegetativas presentes na derme inervam glândulas sudoríparas, músculo
pilo-eretor e vasos sanguíneos, auxiliando no controle da temperatura corporal. A
inervação sensitiva, por sua vez, conduz a estímulos mecânicos, térmicos, químicos e
dolorosos para o sistema nervoso central (GOODWIN e WHEAT, 2004).
A interação coordenada entre os diferentes tipos celulares presentes nas camadas
da pele permite que este órgão responda, prontamente e efetivamente, a uma
variedade de estímulos nocivos que ocorrem na interface do organismo com o meio
7
externo, como a ação de toxinas, organismos patogênicos, radiação ultravioleta,
extremos de temperatura, garantindo assim a manutenção da homeostasia cutânea
(BURBACH, et al., 2000; HAAKE et al., 2000; WILLIAMS e KUPPER, 1996). A camada
córnea é rompida pelas estruturas anexas (folículos pilosos e glândulas sebáceas) e as
infecções nessas regiões são suprimidas pela resposta imune inata, que inclui vários
elementos como os macrófagos, células dendríticas e neutrófilos, bem como várias
citocinas e quimiocinas. Além disso, também se verifica nas células epidérmicas a
presença de receptores para agentes invasores como o CD
14
, receptores toll-like e
receptores de manose. A pele, além de ser um dos principais locais para a invasão de
bactérias, fungos, parasitas e vírus, também é um importante local para a indução de
tumores, porém todos esses processos são influenciados pela resposta imune
adquirida, que inclui células dendríticas especializadas (ex.: células de langerhans) e
linfócitos T helper (Th
1
e Th
2
)
(NORRIS, 2004). Nesse contexto, a pele é muito mais do
que simplesmente uma barreira física passiva entre o meio externo e interno, mas
também uma extensão do sistema imunológico (WILLIAMS e KUPPER, 1996).
1.2. Inflamação cutânea
A pele, como interface com o meio externo, tem um papel importante de proteção,
termoregulação, resposta imunológica, bem como na manutenção e desenvolvimento
de defesa, uma vez que está constantemente sujeita a estímulos externos, tais como
patógenos, agentes mecânicos, agentes químicos e resposta auto-imune. Tais
estímulos desencadeiam uma resposta imediata de proteção ao organismo,
denominada resposta inflamatória, cuja finalidade é erradicar o agente agressor, de
forma a evitar sua disseminação a outras regiões do organismo, promover o reparo
tecidual e restabelecer a homeostasia da pele (FIRESTEIN, 2004; BECKER, 1997). A
resposta inflamatória é caracterizada, a nível clínico, por quatro sinais clássicos, que
incluem calor, eritema, edema e dor. Porém, uma resposta inflamatória exacerbada
pode promover uma descompensação fisiológica, levando a perda de função do tecido
e/ou órgão (RANG et al., 2007; SERHAN e SAVILL, 2005).
8
A cascata de eventos desencadeada após uma agressão ou estímulo resulta no
aumento do calibre microvascular, aumento da permeabilidade vascular, recrutamento
de leucócitos, como conseqüência de uma interação complexa entre diferentes tipos
celulares residentes no tecido cutâneo (queratinócitos, fibroblastos, mastócitos, células
endoteliais, macrófagos) e vários mediadores pró-inflamatórios (NICKLOFF e NESTLÉ ,
2004; SHERWOOD e TOLIVER-KINSKY, 2004). Os mediadores pró-inflamatórios
liberados durante o processo inflamatório, tanto pelas células residentes do tecido
cutâneo quanto pelas células transientes (neutrófilos, linfócitos, monócitos), incluem os
metabólitos do ácido araquidônico (AA), histamina, serotonina, substância P, citocinas,
óxido nítrico (NO), espécies reativas de oxigênio (ROS – do inglês, reactive oxigen
species) etc (SIMMONS, 2006; KUPPER
a
, 1990).
Os queratinócitos constituem as células envolvidas na primeira linha de defesa do
sistema imune cutâneo devido à produção de vários mediadores pro-inflamatórios,
como as citocinas, cuja produção se mostra consideravelmente aumentada após a
ativação dessas células por diferentes estímulos (WILLIAMS e KUPPER, 1996). Além
dos queratinócitos, outras células residentes na epiderme e derme, como fibroblastos,
células endoteliais, melanócitos e macrófagos também produzem diversas citocinas
mediante um estímulo (BURBACH et al, 2000; KUPPER
a
, 1990).
As citocinas são mediadores protéicos cujas ações envolvem o desenvolvimento da
resposta imune celular e humoral, indução da inflamação, controle da proliferação e
diferenciação celular, bem como a indução da cicatrização. As citocinas regulam, de
forma autócrina e parácrina, a resposta imune e inflamatória através da interação com
receptores específicos presentes nos queratinócitos, fibroblastos, células de
langerhans, células endoteliais e linfócitos T infiltrados, promovendo a mobilização de
leucócitos a partir do sangue e a ativação de outras células do tecido cutâneo (RANG et
al., 2007; UCHI et al., 2000; WILLIAMS e KUPPER, 1996).
Os queratinócitos produzem uma variedade de citocinas, incluindo as interleucinas
(IL), fatores de crescimento, o fator estimulador de colônia de macrófagos-granulócitos
(ex: GM-CSF) e algumas quimiocinas (UCHI et al., 2000). No entanto, entre todas as
citocinas produzidas pelos queratinócitos, somente as primárias (IL-1α, IL-1-β e TNF-α -
9
fator de necrose tumoral) ativam um número suficiente de mecanismos efetores
capazes de desencadear uma resposta inflamatória cutânea (KUPPER
b
, 1990).
A epiderme contém uma grande quantidade de IL-1α pré-formada e ativa, além de
uma quantidade significativa de IL-1β imatura, ambas armazenadas a nível intracelular,
mas frente a um estímulo ou dano celular essas citocinas são liberadas, atuando
seguidamente nos seus receptores específicos, como o receptor IL-1 tipo 1 (GROVES
et al.,1996; MIZUTANI et al., 1991). Contrário à IL-1α, a produção constitutiva das
outras citocinas é mínima ou até mesmo indetectável, mas a expressão, produção e
liberação das citocinas para o meio extracelular pode ser induzida por uma variedade
de estímulos exógenos (WILMER et al., 1994).
As citocinas primárias desempenham um importante papel na homeostasia e na
modulação da resposta inata e imune da pele frente a agentes nocivos (vírus, fungos,
bactérias, agentes químicos e radiação UV), considerando que estas citocinas são
potentes iniciadores do processo inflamatório e de reparo com ampla atividade
biológica, incluindo a ativação das células endoteliais e a indução de várias citocinas
secundárias algumas delas com ação quimiotática e ativadora de leucócitos (BURBACH
et al., 2000; UCHI et al., 2000; GROVES et al., 1996; WILLIAMS e KUPPER, 1996;
WILMER et al., 1994).
A exposição celular as citocinas primárias (IL-1 e TNF- α) resulta na ativação de
algumas vias de sinalização, como das proteínas quinases (PKC, PKA) e proteínas
quinases ativadas por mitógenos (MAPK), que culmina na estimulação da atividade de
alguns fatores de transcrição nuclear, como o fator de transcrição nuclear-kB (NF-kB) e
a proteína ativadora-1 (AP-1). Estes fatores de transcrição quando ativados induzem a
transcrição gênica de diversas citocinas (TNF- α, IL-1, IL-2, IL-6, IL-8, GM-CSF, TGF-
B
1
- fator de crescimento tumoral
,
), quimiocinas, moléculas de adesão e enzimas
responsáveis pela produção de mediadores inflamatórios secundários óxido nítrico
sintetase induzida (iNOS) e cicloxigenase-2 (COX-2) (PASCUAL e GLASS, 2006;
DELHASE, 2003; WINYARD, 2003; BARNES e KARIN, 1997). Assim, a principal função
da IL-1 e do TNF-α, é desencadear a resposta inflamatória inata e atuar como uma
molécula co-estimulatória da resposta imunológica (UCHI et al., 2000). Além disso, o
10
TNF-α também tem um papel importante no processo de remodelação do tecido após
um dano, pois atua como fator angiogênico e como fator de crescimento dos
fibroblastos (BURBACH et al., 2000).
Entre as citocinas secundárias convém destacar a IL-8, um potente agente
quimiotático responsável pelo recrutamento de leucócitos, preferencialmente os
neutrófilos. Essa quimiocina estimula o movimento dos leucócitos e regula a migração
destes do sangue para a região extravascular (SCHRAMM e THORLACIUS, 2004).
Assim, a IL-8 coopera com a IL-1 e TNF-α no processo de infiltração leucocitária,
considerando que a IL-1 e TNF-α induzem a expressão de moléculas de adesão nas
células endoteliais, o que é um prelúdio à migração leucocitária ao local lesado
(ABBAS e LICHTMAN, 2005).
Além das citocinas, os metabólitos do AA (prostanóides) também desempenham um
papel importante no processo inflamatório cutâneo. Estes mediadores possuem uma
ampla ação mediada por receptores específicos presentes em células-alvo. Na pele,
sabe-se que os prostanóides são produzidos abundantemente e que os seus
receptores também estão expressos de forma considerável. No entanto, o papel
fisiológico dos prostanóides no tecido cutâneo ainda não está totalmente esclarecido
(KABASHIMA e MIYACHI, 2004).
A produção das prostaglandinas e dos leucotrienos é iniciada com a liberação do
ácido araquidônico a partir dos fosfolipídios de membrana, uma reação catalisada pela
fosfolipase A
2
(PLA
2
). A PLA
2
é ativada em resposta a vários estímulos, tais como: ação
da trombina nas plaquetas, do fator do complemento C5a (C5a) nos neutrófilos, da
bradicinina nos fibroblastos, das reações antígeno-anticorpo nos mastócitos e da lesão
celular promovida por diferentes agentes (ROS - espécies reativas de oxigênio, UV-B,
agentes químicos, etc) (RANG et al, 2007). O AA uma vez liberado serve de substrato
para as duas isoformas da enzima cicloxigenase (COX-1 e COX-2), onde é convertido
em prostaglandinas e tromboxanos (PGE
2,
PGD
2,
PGF
2α,
PGI
2,
TXA
2
), e também para a
5-lipoxigenase (5-LOX), sendo por essa via metabólica convertido em leucotrienos
(LTB
4
, LTC
4,
LTD
4,
LTE
4
). Na pele normal, a COX-1 está distribuída em toda a epiderme,
11
enquanto a COX-2 se localiza principalmente nos queratinócitos supra-basais, sendo
essa isoforma prontamente induzida frente a um estímulo inflamatório.
A prostaglandina E
2
(PGE
2
)
é a principal prostaglandina presente no tecido cutâneo,
onde modula vários eventos inflamatórios, como o aumento da permeabilidade vascular
e vasodilatação, contribuindo assim na formação do edema e na adesão e diapedese
dos neutrófilos e monócitos. No entanto, o tráfego dos linfócitos a partir do lúmen pós-
capilar para o espaço intersticial já é um processo mediado em parte pelo LTB
4
(SHERWOOD e TOLIVER-KINSKY, 2004; LEE et al., 2003). As PGE
2
e PGD
2
, por sua
vez, induzem a transcrição de enzimas requeridas para a síntese de uma outra classe
de eicosanóides envolvidas na fase de resolução da fase inflamatória, como as
lipoxinas (SERHAN e SAVILL, 2005).
Outros mediadores químicos também desempenham uma ação importante durante
o processo inflamatório cutâneo como, por exemplo, a histamina. A histamina atua em
muitos processos fisiológicos celulares, mas também intervêm nas reações alérgicas e
na inflamação, sendo esse um dos principais motivos dos mastócitos estarem
estrategicamente localizados na microvasculatura dos tecidos que estão em contato
com o meio externo, como a pele, os pulmões e intestinos. A liberação da histamina
ocorre pelo processo de exocitose durante as reações inflamatórias ou alérgicas
através da interação de fatores do sistema complemento (C3a e C5a) e de antígenos
com anticorpos IgE fixados nos mastócitos. Após a degranulação dos mastócitos, a
histamina atua em receptores específicos (receptores histaminérgicos) promovendo a
constrição do músculo liso, vasodilatação, aumento da permeablidade vascular e
prurido (RANG et al, 2007; SCHARAMM e THORLACIUS, 2004; SILVA e CARVALHO,
2004; SHERWOOD e TOLIVER-KINSKY, 2004).
Outros mediadores químicos como a serotonina, substância P e neurocinina A
também participam da regulação dos processos vasculares, contribuindo assim na
resposta inflamatória (HOLZER, 1991).
A função coordenada da população celular presente na derme e epiderme permite
que ocorra uma resposta rápida e efetiva frente à variedade de estímulos que ocorrem
na interface entre o organismo e o meio externo (WILLIAMS e KUPPER, 1996). Assim,
12
num estado fisiológico normal a resposta inflamatória é benéfica, uma vez que protege
o tecido contra danos, por exemplo, na defesa contra tumores e infecções. No entanto,
a falha de algum dos mecanismos envolvidos na resposta inflamatória pode fazer com
que este processo, inicialmente resolutivo, perca o controle e desregule a homeostase
do tecido, predispondo o mesmo a desenvolver um processo inflamatório crônico.
A instalação de um processo inflamatório crônico tem sido considerada a base de
muitas doenças, incluindo doenças cardiovasculares, diabetes, asma, esclerose
múltipla, artrite reumatóide, doença de Alzheimer, câncer e algumas doenças cutâneas
como dermatites e psoríase (MUELLER, 2006; DEBENEDICTIS et al. 2001; ROBERT e
KUPPER, 1999). Desta forma, é necessária a manutenção do equilíbrio entre os efeitos
benéficos da inflamação e o seu potencial de persistência que, a longo prazo, pode ser
deletério por promover a destruição tecidual (SIMMONS, 2006).
1.3. Doenças inflamatórias cutâneas e tratamento farmacológico
As doenças dermatológicas que tem em sua etiologia componentes inflamatórios
e/ou imunológicos, nas quais incluem as dermatites, eczemas e psoríase, caracterizam-
se por alterações cutâneas que conferem um aspecto desagradável à pele e que
necessitam de tratamento prolongado, além de envolver componentes emocionais, nos
quais promovem recidivas ou exacerbação das lesões (SOARES, 1995). As doenças
inflamatórias da pele como dermatites e psoríase afetam vários indivíduos no mundo e
a prevalência dessas doenças tem duplicada nos últimos 10 a 15 anos (RUSSEL-
JONES et al, 2005; LJUBOJEVIE et al, 2002). Os mecanismos envolvidos na
patogênese das doenças inflamatórias cutâneas podem ser distintos, sendo algumas
doenças iniciadas por um processo alérgico ou irritativo. Assim, as doenças
inflamatórias cutâneas não envolvem necessariamente o mesmo perfil e,
conseqüentemente o mesmo tipo de tratamento (FIRESTEIN, 2004; LEUNG et al.,
2004).
A dermatite atópica é uma doença inflamatória crônica que tem seu início antes dos
5 anos de idade em 80% dos casos e que pode persistir até a fase adulta. Caracteriza-
13
se por um estado de hiper-reatividade cutânea a estímulos normalmente inócuos a
indivíduos não-atópicos, ressecamento intenso (xerose), prurido, eritema, níveis
elevados de IgE e eosinofilia. A etiologia da dermatite atópica é bastante complexa,
porém vários estudos indicam que nessa condição cutânea está envolvida a ativação
de diferentes vias imunológicas e inflamatórias. A dermatite atópica é inicialmente
caracterizada por níveis elevados de IL-4 e IL-13, em conseqüência da presença de um
infiltrado de células Th
2
. Essas citocinas induzem a síntese de IgE e IL-5, e esta, por
sua vez, tem uma importante função no desenvolvimento e sobrevivência dos
eosinófilos. No entanto, durante a fase crônica ocorre uma inversão do perfil de
citocinas para o tipo Th
1
, associada ao aumento da expressão de IFN-γ (interferon)
(GUTTMAN-YASSKY et al., 2007; LEUNG et al., 2004).
Outra doença inflamatória crônica é a psoríase, na qual afeta aproximadamente 2 a
3% da população mundial e apresenta caracteristicamente remissão e exacerbação
espontâneas. A psoríase pode iniciar em qualquer idade, porém estudos
epidemiológicos revelam que o seu início é mais comum entre os 15 e 25 anos.
Atualmente, a psoríase é reconhecida como uma doença auto-imune causada por uma
ativação inapropriada do sistema imune celular, sendo caracterizada como uma doença
papulo-escamosa, como conseqüência da hiperproliferação excessiva dos
queratinócitos e da formação de um foco inflamatório. A sua patogenia envolve a
integração de leucócitos infiltrados no tecido cutâneo (células T, neutrófilos e
mastócitos), células residentes e uma variedade de citocinas pró-inflamatórias,
quimiocinas, fatores de crescimento e eicosanóides (KRUEGER e BAWCOCK, 2006;
NICKOLOFF e NESTLE, 2004).
A dermatite de contato, por sua vez, é uma dermatose inflamatória freqüente nos
países industrializados, sendo uma das doenças ocupacionais mais comuns. É
caracterizada por eritema, pápulas e vesículas, seguidas de ressecamento e
descamação. De acordo com os mecanismos fisiopatológicos envolvidos, podem-se
distinguir dois tipos de dermatite de contato: a dermatite de contato irritativa, decorrente
dos efeitos tóxicos e pró-inflamatórios de xenobióticos capazes de ativar a imunidade
inata da pele; e a dermatite de contato alérgica, também conhecida como
14
hipersensibilidade de contato, que requer a ativação da imunidade adquirida antígeno-
específica, levando ao desenvolvimento de células T efetoras, que são mediadoras da
inflamação cutânea (HENNINO et al., 2005).
Embora haja uma sucessão previsível dos fenômenos envolvidos na resposta
inflamatória, existem modificações no padrão de resposta que depende diretamente da
natureza do agente agressor, dos componentes de reconhecimento do sistema imune,
da produção de mediadores, do tipo de células infiltradas no sítio da inflamação e do
tempo de permanência dessa resposta (RANG et al., 2007; SILVA e CARVALHO,
2004). Várias são as vias e cascatas envolvidas no processo inflamatório presente nas
doenças inflamatórias cutâneas, assim existe uma variedade de alvos moleculares que,
quando antagonizados ou neutralizados, bloqueiam uma via ou cascata, conduzindo a
um efeito antiinflamatório e/ou imunosupressor (SIMMONS, 2006). Nesse contexto, a
compreensão da ação e do uso de fármacos antiinflamatórios e imunosupressores nas
doenças inflamatórias cutâneas exigem o conhecimento do tipo de reação inflamatória
presente.
A melhor compreensão da imunologia cutânea permitiu grandes avanços em
relação ao desenvolvimento de novas terapias na última década e aumentou o arsenal
de agentes disponíveis para o tratamento de doenças inflamatórias cutâneas tanto na
forma de monoterapia quanto na forma de um esquema terapêutico que inclui
diferentes agentes utilizados simultaneamente (SKINNER, 2005).
Os agentes imunosupressores são utilizados no tratamento de afecções cutâneas
que tenham em sua patogênese o envolvimento do sistema imune e exercem seus
efeitos via inibição da produção ou ação da IL-2 (ex.: tacrolimus, pimecrolimus,
ciclosporina), inibição da expressão de genes de citocinas (ex.: glicocorticóides) e
inibição da síntese de purinas ou pirimidinas (ex.: micofenolato de mofetila) (RANG et
al, 2007). Os imunomoduladores macrolactâmicos, como o pimecrolimus e o tacrolimus,
inibem seletivamente a ativação das células T e a síntese de citocinas pró-inflamatórias,
(IL-3, IL-4, IL-5 e IFN-γ – interferon). A terapia tópica com esses agentes
imunomoduladores já se mostrou efetiva em diversas condições dermatológicas, como
na dermatite atópica, dermatite de contato, dermatite seborreíca, etc (SKINNER, 2005).
15
Os glicocorticóides restringem a proliferação clonal das células Th através da
redução da transcrição gênica para IL-2, porém também interferem na transcrição de
outras citocinas (TNF-α, IFN-γ, IL-1, etc). O micofenolato de mofetila tem sido cada vez
mais utilizado no tratamento de doenças inflamatórias e auto-imunes na dermatologia,
sendo útil como agente poupador do uso de glicocorticóides em certas condições
dermatológicas como distúrbios bolhosos auto-imunes, incluindo o pênfigo vulgar.
Também é eficaz no tratamento de doenças inflamatórias como a psoríase, dermatite
atópica e piodermia gangrenosa (FOX et al, 2006).
Os fármacos anticitocinas representam um dos maiores avanços no tratamento de
doenças inflamatórias crônicas graves nos últimos anos (RANG et al., 2007). Esses
fármacos tem como alvo moléculas de superfície das células T (ex.: Efalizumab e
Alefacept) ou bloqueiam a ação de citocinas, como por exemplo agentes anti-TNFα
(Etanercept), sendo efetivos no tratamento da psoríase e da dermatite de contato, com
o uso já aprovado pelo FDA. No entanto, esses fármacos são anticorpos frutos da
engenharia recombinante, assim o seu custo é elevado, o que limita seu uso (TAN et
al., 2007; SIMMONS, 2006; WERTH, 2006).
O sistema imune como alvo no tratamento de algumas condições dermatológicas e
a compreensão do mecanismo de ação destes agentes permite a transição da terapia
clássica com os glicorticóides tópicos para a terapia com agentes imunomoduladores
(SKINNER, 2005;
NICKOLOFF e NESTLE, 2004). No entanto, os glicocorticóides ainda
são os agentes antiinflamatórios mais empregados no tratamento de doenças
inflamatórias cutâneas, devido aos seus efeitos sobre a resposta imune e sua ação
antiinflamatória. Porém, o uso contínuo dos glicocorticóides é freqüentemente
acompanhado de efeitos adversos severos e muitas vezes irreversíveis, incluindo a
atrofia cutânea, telangiectasias, hipertricose, alterações no processo de cicatrização,
Síndrome de Cushing, entre outros (SCHOEPE et al., 2006; SCHÄCKE et al., 2002).
Mesmo com o arsenal de agentes antiinflamtórios e imunosupressores disponíveis,
alguns fatores comprometem a adesão do paciente ao tratamento como o esquema
posológico, efeitos adversos indesejáveis, custo elevado do tratamento, etc
(GOTTLIEB, 2005; LEUNG et al. 2004). Além disso, alguns medicamentos não atingem
16
a eficácia desejada ou comprometem a resposta imunológica, aumentando o risco a
infecções e a emergência de linhagens celulares malignas (RANG et al., 2007; FOX et
al., 2006; DISEPIO et al., 1999). Assim, tanto a academia quanto a indústria
farmacêutica tem voltado sua atenção aos produtos naturais, na busca de um fármaco
efetivo no tratamento das doenças inflamatórias cutâneas e com efeitos adversos
reduzidos.
1.4. Plantas medicinais como alvo de novos antiinflamatórios tópicos
A utilização das plantas na medicina tradicional é tão antiga quanto a própria
humanidade. Tradicionalmente o uso de plantas e a forma na qual são utilizadas em
uma doença é transferida oralmente de geração em geração em uma comunidade. É
admirável que este conjunto de conhecimentos tenha subsistido durante milênios sem
nunca, porém, cair no esquecimento (SAMUELSSON, 2004; SILVA e CARVALHO,
2004). Assim, uma estratégia útil no desenvolvimento de fármacos a partir de produtos
naturais é, justamente, utilizar o vasto conhecimento popular em relação ao uso de
plantas e produtos de origem animal em diversas enfermidades, pois este tipo de
informação permite guiar a química de produtos naturais na busca de novos agentes
terapêuticos. Muitos dos medicamentos atualmente disponíveis no mercado que são
derivados de produtos naturais provêm desta informação, definida como informação
etnobotânica ou etnofarmacológica (CLARK, 2002).
Os produtos naturais tem sido a maior fonte de fármacos por séculos, como
demonstrado com o isolamento da morfina a partir do ópio no início do século XIX e o
isolamento de outros fármacos que se seguiram como a cocaína, codeína, digitoxina e
quinina (BUTLER, 2004; NEWMAN et al., 2000). Estima-se que atualmente 25% a 30%
dos medicamentos utilizados derivam de produtos naturais (CALIXTO, 2005;
GREENWALDG, 1998).
Segundo Henkel et al. (1999), dos 30.000 bioativos de origem natural, atualmente
conhecidos, 35% são provenientes de bactérias, 27% de plantas medicinais, 26% de
fungos e 13% de animais. A diversidade molecular encontrada nos produtos naturais é
17
a principal razão que tem motivado várias corporações farmacêuticas a direcionarem
seus estudos na busca de protótipos que possuam atividades inibitórias ou
antagonistas em alvos biológicos bem definidos (TURNER, 1998; BORRIS, 1996). A
transição da busca de novos fármacos pela busca de um “lead compound” ou protótipo
tornou-se possível através do avanço da química orgânica e da química medicinal.
Nesse contexto, a importância da investigação de plantas medicinais reside
principalmente na identificação de protótipos, cuja atividade farmacológica permita o
desenvolvimento de novos fármacos. No entanto, ainda existe um grande desafio
dentro da química medicinal que é tornar um protótipo num fármaco apropriado para o
uso terapêutico (BORRIS, 1996).
As substâncias biologicamente ativas presentes nas plantas são chamadas de
metabólitos secundários e são produzidas através de rotas biossintéticas diversas cujos
compostos de partida são os metabólitos primários, nos quais incluem os carboidratos,
proteínas e lipídeos, que são essenciais para as funções vitais da planta (POSER e
MENTZ, 2004). Os metabólitos secundários são substâncias de baixo peso molecular,
de estrutura complexa, marcante atividade biológica e, contrariamente aos metabólitos
primários, são encontrados em concentrações relativamente baixas e somente em
determinados grupos de plantas (POSER e MENTZ, 2004; ALVES, 2001).
Atualmente são conhecidos 140.000 metabólitos secundários que apresentam
diversidade de esqueletos e grupamentos funcionais. De acordo com a estrutura e/ou
origem biogênica, os metabólitos secundários podem ser divididos em diferentes
grupos, tais como: esteróides, alcalóides, flavonóides, terpenos, taninos, cumarinas,
lignanas, etc (STROHL, 2000; VERPOORTE, 2000; PHILLIPSON, 1999). Assim sendo,
o reino vegetal representa um forte manancial para a investigação de novas moléculas
e terapias, considerando que dentre as 250.000 espécies conhecidas somente uma
pequena porcentagem (8 a 12%) foi investigada sob o ponto de vista químico e, ainda,
uma menor fração foi submetida a ensaios de atividade biológica (WILLIAMSON et al.,
1996).
Os metabólitos secundários, como moléculas biologicamente ativas, podem
interferir em vários mecanismos ou mediadores envolvidos no processo inflamatório,
18
tais como: metabólitos do ácido araquidônico, peptídeos, citocinas, enzimas (NOS,
COX-2, fosfolipase A
2
), produção de segundos mensageiros (proteína-quinase, cGMP,
cAMP), fatores de transcrição (NF-κB, AP-1), etc (CALIXTO, 2003). Assim, a
considerável diversidade e complexidade das estruturas químicas e a atividade
biológica encontrada nos metabólitos secundários, predispõem a identificação de
protótipos com atividade interessente antiinflamatória interessante. Nesse contexto, o
interesse pelas plantas medicinais permanece forte, pois permite o desenvolvimento de
novos fármacos para tratamento de diversas doenças, inclusive aquelas que acometem
a pele, considerando que os medicamentos atualmente disponíveis para o tratamento
de várias dermatoses (psoríase, dermatite atópica, eczemas, etc), como os
antiinflamatórios não-esteroidais, anti-histamínicos, glicocorticóides e
imunosupressores, muitas vezes não apresentam a eficácia desejada, além de
promoverem efeitos adversos que limitam seu uso (FIRESTEIN, 2004; CLARK, 2002).
O tratamento com plantas medicinais tornou-se extremamente popular. De acordo
com a Organização Mundial de Saúde (OMS), aproximadamente 88% da população faz
uso de plantas medicinais como tratamento primário de diversas doenças, de forma que
6 a 8% das pessoas as utilizam com a finalidade de tratar patologias relacionadas com
a pele (ERNST, 2000; WHO, 2002). Além disso, 30% dos produtos provenientes da
medicina tradicional têm são utilizados no tratamento de diferentes condições
dermatológicas (SOSA et al, 2002; CAUWENBERGH, 2002).
Plantas que são utilizadas tradicionalmente na cicatrização, febre, infecção, edema
ou doenças reumáticas, são indicadores da presença de compostos com propriedades
antiinflamatórias e, assim, devem ser investigadas e a sua eficácia comprovada. A
evolução no entendimento dos aspectos moleculares da patofisiologia da inflamação
favoreceu o estabelecimento de novos sistemas de testes in vitro para a seleção de
diversas substâncias que permitem a identificação de novos compostos
antiinflamatórios (CARVALHO, 2004). Existem vários ensaios in vitro que são utilizados
para testar a atividade antiinflamatória, porém o procedimento de triagem mais comum
é a verificação da inibição da COX e/ou da 5-LOX. Extratos ou compostos isolados de
várias plantas utilizadas na medicina tradicional demonstraram promover a inibição da
19
COX e/ou 5-LOX, como a Achillea millefolium, Echinacea angustifólia, Echinacea
purpurea, Hamamelis virginiana, Juniperus communis, Ledum palustre, Polygonum
aviculare, Sanguinaria canadensis e Tanacetum vulgare (BORCHERS et al., 2000).
Outras plantas revertem o processo inflamatório por atuarem em outros alvos como, por
exemplo, a Glycyrrhiza glabra que, além de inibir a atividade da COX, também promove
a inibição da atividade da enzima PLA
2
, exibindo uma atividade comparável à
hidrocortisona. Além disso, a Glycyrrhiza glabra também inibe a formação de ROS
pelos neutrófilos no sítio inflamado (AKAMATSU et al., 1991; OKIMASU et al, 1983;
OHUCHI e TSURUFUJI, 1982). A Arnica montana, por sua vez, inibe um alvo central do
processo inflamatório: o fator de transcrição NF-kB, que resulta na supressão da
transcrição gênica de alguns mediadores pró-inflamatórios (MERFORT, 2003).
Muitas plantas que apresentam atividade antiinflamatória já tiveram os compostos
responsáveis por tal atividade isolados e caracterizados, como por exemplo, os
terpenos presentes na Matricaria recutita (os monoterpenos α-bisabolol e azuleno), na
Calêndula officinalis (os triterpenos taraxasterol e o lupeol), na Arnica montana (a
lactona sesquiterpênica helenalina), na Glycyrrhiza glabra (o triterpeno glicirrizina ou
ácido glicirrízico), no Rosmarinus officinalis (os triterpenos ácido ursólico, ácido
oleanólico e ácido micromerico), Salvia officinalis (o triterpeno ácido ursólico), na Cordia
verbenaceae (o sesquiterpeno α-humuleno), etc (ALTINIER et al., 2007; FERNANDES
et al., 2007; BLUMENTHAL, 2003; AKAMATSU et al., 1991; OKIMASU et al, 1983).
Cerca de 300 preparações de plantas medicinais destinadas ao tratamento de
doenças inflamatórias cutâneas, tiveram sua eficácia comprovada e seu uso tradicional
validado pela entidade reguladora de medicamentos da Alemanha (Comissão E), nas
quais estão incluídas a Arnica montana, Calendula officinalis, Matricaria recutita,
Echinacea sp., Sanguinária canadenses, Hammamelis virginiana, Aveno sativa, Aloe
Vera e Hypericum perforatum (MEYER et al, 2005; DATTNER, 2003; BEDI e
SHENEFELT, 2002). No entanto, grande parte das plantas utilizadas na medicina
tradicional ainda não foi submetida a estudos que comprovem sua eficácia e segurança
e o uso popular não é suficiente para validá-las como medicamentos eficazes e
seguros. Afinal, as plantas medicinais não se diferenciam de qualquer outro xenobiótico
20
sintético e a preconização ou autorização oficial do seu uso como medicamento, devem
estar fundamentadas em evidências experimentais (SIMÕES et al., 2000).
1.5. Vernonia scorpioides
1.5.1. Aspectos botânicos e Etnofarmacológicos
A espécie Vernonia scorpioides (Lam.) Persons, pertence à família Asteraceae que
reúne cerca de 1100 gêneros com aproximadamente 2500 espécies de ampla
distribuição, sendo a família com o maior número de espécies entre as dicotiledôneas.
Além disso, as espécies da família Asteraceae apresentam inúmeras propriedades
farmacológicas devido a variedade dos metabólitos secundários presentes como, por
exemplo, os terpenos, flavonóides, poliacetilenos e as lactonas sesquiterpênicas
(FREIRE et al., 1996; LOPES, 1991; DAVINO, 1989; CUNHA, 1989). A família
Asteraceae é composta por 13 tribos, na qual se destaca a tribo Vernoniae com cerca
de 70 gêneros e 1500 espécies. No Brasil, existem 40 gêneros e entre eles está
presente o gênero Vernonia (CUNHA, 1989). As espécies do gênero Vernonia são
utilizadas na medicina popular, principalmente na África, América central e América do
Sul e tem sido objeto de vários estudos em relação a sua atividade antiinflamatória,
antipirética, antitumoral e antimalárica (GUPTA et al., 2003; MAZUMDER et al., 2003;
IWALEWA et al., 2003; LAMBERTINI et al., 2004; MUREGI et al., 2003).
No Brasil, são estimadas 200 espécies do gênero Vernonia, onde várias destas são
utilizadas na medicina popular, incluindo a Vernonia scorpioides (figura 3), sendo esta
uma erva comum da vegetação secundária da encosta atlântica e da floresta latifoliada
do alto do Uruguai, no extremo oeste catarinense. Porém, apresenta uma extensa
distribuição geográfica, sendo encontrada desde o Ceará até o Rio Grande do Sul,
como também no centro-oeste (CORREA, 1984; CABRERA, 1980).
21
Figura 3: Vernonia scorpioides Lam. (Asteracea). Fonte: Buskühl, 2007.
Em relação à descrição botânica, a Vernonia scorpioides é uma espécie perene,
subarbustiva, bastante ramificada, com caule lanuginoso-pubescente, medindo entre 1
a 2 metros de altura. As folhas são alternadas, membranáceas, glabras na face superior
e cerício-pilosa na inferior, pecioladas, medindo 6 a 12 cm de comprimento e 3 a 6 cm
de largura. As inflorescências são terminais, em cimeiras escorpiódes de capítulos
sésseis. As flores são violáceas em número de 20 a 30 por capítulo (figura 4)
(LORENZI, 1982).
Figura 4: Vernonia scorpioides Lam. (Asteracea). A - Vegetal florido, C – Inflorescência
característica, D – folhas, E – Ramo não florido. Fonte: Adaptado de Toigo, 2007.
22
A V. scorpioides é popularmente conhecida como assa-peixe, piracá, enxuga, erva-
de-são-simão, erva-de-preá, capichingui, capichingui-de-bicho e nogueira.
Tradicionalmente é utilizada por via tópica no tratamento de várias desordens cutâneas,
incluindo úlceras crônicas, alergias, irritações, prurido, edemas provocados por
traumatismos ou infecção, nevralgia, processos inflamatórios e lesões cutâneas em
geral (CABREIRA,1980; MORAES, 1997). Além disso, nos levantamentos
etnobotânicos também foi constatado a utilização da V. scorpioides em úlceras
gástricas (chás), como sedativo (chás), hemorróidas e leucorréia (banho das partes
afetadas), sendo as folhas a parte do vegetal preferencialmente empregada na
medicina tradicional (DREUX, 2005).
1.5.2. Descrição fitoquímica
Vários compostos foram isolados a partir do gênero Vernonia, tais como flavonóides,
esteróides e polissacarídeos (NERGARD et al., 2004; HUANG et al, 2003; TCHINDA et
al., 2003). A composição química da V. scorpioides ainda não está bem descrita, porém
foi verificado que as partes aéreas da planta possuem um óleo essencial cuja
composição inclui germacreno D, transcariofileno, limoneno, ∆-cardineno, biciclo-
germacreno, β-pineno, β-mirceno, α-copaeno, α-humuleno e aloaroaromadendreno
(TOIGO et al., 2004). Também foram isolados alguns compostos característicos do
gênero Vernonia, como as lactonas sesquiterpênicas (LS), destacando-se entre elas o
escorpiolídeo, escorpioidina e um novo guaianolideo (GOMES et al., 1987; WARNING
et al., 1987; DREW et al., 1980). Buskühl (2007) isolou e caracterizou o cafeato de etila,
um poliacetileno inédito na literatura (5-octa-2,4,6-triinil-5H-furan-2-ona) e uma mistura
de lactonas sequiterpênicas, na qual inclui alguns hirsutinolídeos e um glaucolídeo a
partir do extrato das partes aéreas (figura 5), durante o processo de isolamento destes
compostos também foi identificada a presença de alguns flavonóides, a luteolina e a
apigenina.
As LS são descritas como os constituintes ativos das plantas medicinais da família
Asteraceae, usadas na medicina tradicional para o tratamento de doenças
23
inflamatórias. As atividades biológicas atribuídas às LS, conforme demonstrado em
diferentes estudos, englobam ação antiinflamatória, anti-helmíntica, fungicida e
citotóxica, além de promover um efeito relaxante sobre o músculo liso (CAMPOS et al.,
2003; KRISHINA-KUMARI et al, 2003; KUO et al, 2003;). Assim, as LS não são
somente marcadores taxonômicos interessantes do gênero Vernonia, como também
merecem considerável atenção devido à sua atividade antiinflamatória, conforme
demonstrado em diferentes modelos de inflamação (HALL et al., 1979; SIEDLE et al.,
2004).
A B
C
D E
Figura 5: Compostos isolados e caracterizados a partir das folhas e inflorescências da Vernonia
scorpioides. Hirsutinolídeos (A, B, C, D) e Glaucolídeo (E). Fonte: Buskühl, 2007.
As LS modulam muitos processos inflamatórios, como a liberação de histamina
pelos mastócitos e de serotonina pelas plaquetas, a exocitose da elastase pelos
O
O
O
OH
OH
OH
OH
OH
OH
1
4
7
8
13
14
15
11
O
O
OCOCH
3
OH
OH
O
O
1
4
8
13
10
14
15
11
12
O
O
OCOCH
3
OCOCH
3
O
OH
OH
O
1
4
8
13
10
14
15
11
12
O
OCOCH
3
OCOCH
3
OH
O
O
O
OH
1
4
8
13
10
15
11
12
14
O
O
OCOCH
3
OCOCH
3
O
OH
OH
1
4
8
13
10
14
15
11
12
24
neutrófilos humanos, a inibição da 5-LOX e a leucotrieno C
4
sintetase, diminuição da
produção de citocinas inflamatórias (IL-1β, IL-6, IL-8 e TNF-α) e a proliferação de
linfócitos, como demonstrado, por exemplo, pelas LS da classe dos hirsutinolídeos
isoladas da Vernonia triflosculosa (figura 6). Assim, sugerindo que o efeito supressor
das LS envolve o fator de transcrição NF-кB (KOS et al., 2006; SIEDLE et al., 2003;
KOCH et al., 2001; HALL et al, 1980; HALL et al., 1979).
Figura 6: Hirsutinolideos isolados da Vernonia tiflosculosa (1 R1=CH3; R2=4-OH-metacriloil;
2 R1=H; R2=4-OH-metacriloil). Fonte: Adaptado de Kos et al., 2006.
Os flavonóides são compostos fenólicos que estão presentes nas espécies do
gênero Vernonia, inclusive na espécie V. scorpioides onde foi identificada a presença
dos flavonóides luteolina e apigenina (BUSKÜHL, 2007; HUANG, 2003). Os flavonóides
representam um dos grupos fenólicos mais importantes e diversificados entre os
produtos de origem natural. O emprego terapêutico de plantas contendo flavonóides é
vasto e, na maioria dos casos, empírico.
Algumas propriedades farmacológicas já foram atribuídas aos flavonóides, entre as
quais se destacam as atividades antioxidante, antiviral, antiinflamatória, anti-alérgica,
antitumoral, hormonal e atividade sobre a permeabilidade capilar (ZUANAZZI e
MONTANHA et al, 2004; KIMATA et al, 2000). De acordo com alguns estudos, a
atividade antiinflamatória dos flavonóides ocorre via modulação de enzimas
relacionadas com o metabolismo do AA, como a PLA
2
, COX e/ou LOX, bem como a
inibição do fator de transcrição nuclear NF-кB, dependendo da estrutura do composto
(YANAMOTO e GAYNOR, 2001; PARK et al., 2001), justificando assim o uso
25
tradicional de muitos extratos de plantas como antiinflamatórios, cujos constituintes
fitoquímicos presentes são os flavonóides (PARK et al., 2001).
1.5.4. Estudos farmacológicos com a Vernonia scorpioides
Os primeiros estudos realizados com a V. scorpioides demonstraram a atividade
fungicida e uma moderada atividade bactericida do extrato bruto das folhas e das
frações hexano e clorofórmio (CAMPOS, 2001; FREIRE et al., 1996). Posteriormente,
Leite et al. (2002) investigaram a ação cicatrizante do extrato etanólico das folhas da V.
scorpioides e demonstraram que o tratamento com o extrato não acelerou o tempo de
fechamento da ferida, mas contribuiu no processo de regeneração e organização
tecidual da lesão.
Estudos mais recentes revelaram propriedades antiinflamatórias e anti-tumorais da
V. scorpioides, onde Dreux (2005) demonstrou que o extrato hidroalcóolico,
administrado por via intraperitonial, promoveu a inibição de processos inflamatórios
agudos em modelos de edema de pata induzido por carragenina e histamina. A
administração oral desse extrato também diminuiu a migração de neutrófilos e
leucócitos mononucleares em modelo de peritonite induzida por carragenina, sendo
este resultado confirmado em análise histológica de amostras teciduais provenientes do
modelo de edema de pata induzido por carragenina. Pagno et al. (2006), por sua vez,
investigaram o efeito da fração diclorometano sobre o tumor ascítico de Erlich, em
camundongos, e demonstraram a atividade anti-tumoral e citotóxica dessa fração. Da
mesma forma, algumas lactonas sesquiterpênicas isoladas a partir da fração
diclorometano, como hirsutinolídeos e glaucolídeo, apresentaram atividade citotóxica in
vitro sobre algumas linhagens celulares (Hela, L929, B16F10), sendo essa ação
decorrente tanto do processo de necrose quanto de apoptose (BUSKÜHL, 2007).
Apesar da V. scorpioides ter sido submetida a alguns estudos farmacológicos,
nenhum estudo que comprove a atividade antiinflamatória tópica dessa planta e
justifique o seu uso pela população no tratamento de doenças inflamatórias cutâneas,
foi realizado até o presente momento.
OBJETIVOS
27
2. OBJETIVOS
2.1. OBJETIVO GERAL
Avaliar o efeito antiinflamatório tópico do extrato etanólico da V. scorpioides (EEVS)
e de algumas frações, além do composto isolado luteolina, em modelos de inflamação
cutânea aguda e crônica em camundongos, bem como investigar os possíveis
mecanismos envolvidos com a atividade antiinflamatória dessa planta, através de
técnicas farmacológicas e bioquímicas.
2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
• Avaliar o efeito antiinflamatório do EEVS e de diferentes frações, bem como do
composto isolado luteolina, em modelo de edema de orelha mediado por 12-O-
tetradecanoilforbol acetato (TPA) em camundongos;
• Avaliar a atividade antioxidante do EEVS no modelo de edema de orelha
induzido pela aplicação tópica do TPA;
• Avaliar o efeito antiinflamatório do EEVS em modelo de edema de orelha
induzido pelo ácido araquidônico (AA), capsaicina, fenol e histamina em
camundongos;
• Avaliar o efeito antiinflamatório do EEVS em processos de hipersensibilidade
cutânea mediado pela aplicação tópica da oxazolona em camundongos;
• Avaliar o efeito antiinflamatório do EEVS em processos inflamatórios cutâneos
crônicos, através do modelo de edema de orelha mediado pela aplicação
múltipla do óleo de cróton em camundongos;
• Avaliar a migração celular em tecido cutâneo no modelo de edema de orelha
induzido pela aplicação de TPA, oxazolona e aplicação múltipla de óleo de
cróton em camundongos tratados com o EEVS e com a fração DCM da V.
scorpioides;
• Avaliar os parâmetros de inflamação (hiperproliferação celular, edema e
infiltração leucocitária) através da análise histológica das orelhas obtidas nos
modelos de edema de orelha induzido pela aplicação tópica de TPA e pela
aplicação múltipla de óleo de cróton.
MATERIAL E MÉTODOS
30
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. EXTRATO E FRAÇÕES DA Vernonia scorpioides
O extrato etanólico da V. scorpioides (EEVS), as diferentes frações (hexano,
diclorometano, acetato e acetato enriquecido) e o composto isolado luteolina foram
fornecidos pela Prof. Dra Maique Biavatti do departamento de fitoquímica da
Universidade do Vale do Itajaí (Itajaí, SC). As partes aéreas (folhas e flores) da
Vernonia scorpioides (Lam.) Pers. (Asteraceae) foram coletadas em Novembro de
2005, em Navegantes (SC), e a identificação foi realizada pela Dra Ana Claudia Araújo
(Universidade do Vale do Itajaí, Santa Catarina). O voucher foi depositado no Herbário
Barbosa Rodrigues [M. Biavatti 11 (15/03/01)], em Itajaí (SC).
As folhas e flores da planta foram macerados em etanol bidestilado por 7 dias, na
ausência de luz, e o extrato obtido foi filtrado e concentrado em rotavapor até
evaporação do álcool, utilizando para tal um Rotavapor a vácuo (Quimis, São Paulo).
Posteriormente, foi realizado o fracionamento fitoquímico do extrato bruto etanólico em
1/3 de água através da partição líquido-líquido com solventes de polaridade crescente
(hexano, diclorometano e acetato de etila), originando assim as frações hexano,
diclorometano e acetato, respectivamente. A fração acetato enriquecido foi obtida a
partir da junção de uma sub-fração da fração diclorometano (DCM) com uma sub-fração
da fração acetato de etila, da qual foi isolado o composto luteolina. Todos os compostos
foram armazenados sob temperatura de 4°C em potes d essecadores.
3.2. ANIMAIS E MANUTENÇÃO
Para a realização dos experimentos foram utilizados camundongos Swiss fêmeas e
machos (25-35g) do Biotério Setorial do Departamento de Farmacologia, CCB-UFPR,
mantidos em condições de temperatura controlada (22±2 °C), respeitando uma fase
clara/escura de 12 horas e com livre acesso a água e ração comercial (Nuvital). Antes
31
do início dos experimentos os animais foram mantidos no laboratório por um período de
pelo menos 1 hora para adaptação, não sendo estes animais reutilizados em testes
posteriores. Os protocolos experimentais foram aprovados pelo CEEA da Universidade
Federal do Paraná sob o número 127 e os experimentos conduzidos de acordo com as
orientações para os cuidados com animais de laboratórios (CEEA, 2003).
DROGAS E REAGENTES
As drogas e reagentes utilizados foram: 12-O-tetradecanoilforbol acetato (TPA),
ácido araquidônico, capsaicina , dihidrocloridrato de histamina , óleo de cróton,
oxazolona, indometacina, Tetrametilbenzidina (TMB), 4-nitrofenil-N-acetil-β-D-
glucosaminida, diacetato de 2’,7’-diclorofluoresceína (DSFA-DA),
hexadeciltrimetilamônio (HTAB) (Sigma Chemical Co, EUA), fenol (Merck Biosciences,
Germany ), ácido alfa-lipóico (Galena), anti-mouse CD45/FITC; anti-mouse CD4/PE,
anti-mouse CD8/PE (BD Pharmigen), dimetilformamida, acetona, formaldeído, ácido
acético glacial, fosfato de sódio (Na
2
HPO
4
) (Merck Biosciences, Germany), peróxido de
hidrogênio, álcool absoluto, eosina, hematoxilina, floxina B, xilol, tween 80 (Vetec, Rio
de Janeiro, Brasil).
O extrato etanólico da Vernonia scorpioides (EEVS) e o composto isolado luteolina,
quando administrados topicamente, foram pré-solubilizados em 3% de Tween 80 e 30%
de etanol, sendo posteriormente diluído em 77% do volume final de acetona. As frações
da V. scorpioides, a dexametasona, a indometacina, bem como os agentes flogísticos
(TPA, ácido araquidônico, capsaicina, fenol, óleo de cróton e oxazolona) foram
diretamente solubilizados em acetona grau P.A., com exceção da histamina que foi
solubilizada em salina em decorrência da via na qual esta foi administrada. Em relação
à administração oral do EEVS, este foi pré-solubilizado em 3% de tween 80, sendo
posteriormente diluído em salina.
32
3.4. PROTOCOLOS EXPERIMENTAIS (MODELO DE EDEMA DE ORELHA)
3.4.1. Avaliação do edema de orelha
O edema de orelha foi expresso como o aumento da espessura da orelha dos
camundongos (µm), de acordo com a metodologia revisada por Hecker e Schmidt
(1974). A espessura da orelha foi medida próxima à extremidade medial da mesma,
com o auxílio de um micrômetro digital (GREAT MT – 045B), antes e após determinado
tempo da indução do processo inflamatório, dependendo do agente flogístico utilizado.
O EEVS, as frações (hexano, DCM, acetato e acetato enriquecido), o composto isolado
luteolina e os agentes flogísticos foram dissolvidos em 20 µL de acetona e aplicados na
orelha direita de camundongos. Para minimizar variações concernentes à técnica, os
experimentos foram conduzidos sempre por um único experimentador.
3.4.2. Edema de orelha induzido pela aplicação tópica do TPA
O TPA é um éster de forbol presente no óleo de cróton (Croton tiglium L.), sendo um
potente agente flogístico e promotor de tumor capaz de promover uma resposta
inflamatória e hiperproliferativa bastante intensa, assemelhando-se com algumas
doenças cutâneas (GÁBOR, 2003; GÁBOR, 2000). Esse modelo de inflamação cutânea
aguda permite identificar inibidores da biossíntese das PG e LT, assim é amplamente
utilizado na triagem de compostos que pertencem à classe dos inibidores da COX e/ou
LOX, bem como compostos com atividade corticóide-like (GÁBOR, 2000).
Para avaliar a atividade do EEVS nesse modelo, o edema de orelha foi induzido
pela aplicação tópica de 2,5 µg/orelha de TPA, dissolvido em 20 µL de acetona. O
EEVS (0,003 a 1 mg/orelha), as frações (0,003-0,6 mg/orelha) da V. scorpioides, bem
como os controles positivos dexametasona (0,05 mg/orelha) e indometacina (2
mg/orelha), foram aplicados topicamente logo após o tratamento com o TPA. A
espessura da orelha foi avaliada 6 horas após a aplicação do TPA (DE YOUNG et al,
33
1989), conforme descrito no item 3.4.1. Amostras das orelhas dos camundongos
(círculos de 6 mm de tecido) foram coletadas 24 horas após a aplicação do TPA e
submetidas a análise histológica, a avaliação da atividade da enzima mieloperoxidase
(MPO) e a quantificação de espécies reativas.
Para avaliar o efeito antiedematogênico do EEVS administrado por outra via
(sistêmica) no modelo de edema orelha induzido por TPA, os animais foram tratados
por via oral, 1 h antes da aplicação do TPA, com 1000 mg/kg do extrato dissolvido em
salina. A avaliação do edema foi realizada como descrito anteriormente.
3.4.3. Edema de orelha induzido pela aplicação tópica de ácido araquidônico.
O ácido araquidônico quando aplicado topicamente é metabolizado em vários
mediadores que promovem a formação do edema, como a PGE
2
, LTC
4
e LTD
4
, como
conseqüência do processo inflamatório instalado (HUMES et al., 1986). Assim,
compostos que inibem o metabolismo do ácido araquidônico em prostaglandinas e
leucotrienos são identificados neste modelo. Para avaliação da ação do EEVS sobre o
edema de orelha induzido pelo ácido araquidônico, este foi diluído em acetona, de
forma a atingir uma concentração de 2 mg/20 µL, sendo posteriormente administrado
por via tópica na orelha direita dos camundongos. Em seguida, o EEVS (0,03 a 1
mg/orelha) e o controle positivo indometacina (2 mg/orelha), também dissolvidos em 20
µL de acetona, foram aplicados topicamente. O edema foi avaliado 1 hora após o
desafio com o agente flogístico, conforme descrito no item 3.4.1. (YOUNG et al., 1984;
CRUMMEY et al., 1987).
3.4.4. E Edema de orelha induzido pela aplicação tópica do fenol
O modelo de edema de orelha induzido pela aplicação tópica do fenol consiste num
modelo animal de inflamação cutânea causada por um agente irritante que se
assemelha à dermatite de contato que ocorre em humanos (LIM et al., 2004). A ação da
EEVS sobre a resposta inflamatória mediada por um agente irritante foi avaliada
34
através da aplicação tópica do fenol na orelha de camundongos. A solução de fenol a
10% (v/v) foi dissolvida em acetona (20 µL) e aplicada na orelha direita dos
camundongos, seguida da aplicação tópica de 20 µL do EEVS (1 mg/orelha) ou
dexametasona (0,1 mg/orelha), diluídos em acetona. Neste modelo, o edema na orelha
dos animais alcança uma intensidade máxima 1 hora após a aplicação do fenol, assim
o aumento da espessura da orelha foi avaliado 1 hora após o desafio com este agente
irritante, conforme procedimento descrito no item 3.4.1. (GÁBOR, 2000).
3.4.5. Edema de orelha induzido pela aplicação tópica da capsaicina
A capsaicina (8-metil-N-vanilil-6-nonenemida), quando aplicada topicamente, induz a
liberação de vários mediadores pró-inflamatórios que promovem vasodilatação e
eritema como resposta imediata, seguido da formação de edema cujo pico máximo é
atingido até 30 minutos após sua aplicação (GÀBOR; 2000; ZEGARSKA et al., 2006).
Com o objetivo de avaliar o efeito do EEVS em um modelo de inflamação cutânea
neurogênica, o EEVS foi administrado 30 minutos antes da aplicação da capsaicina
(200 µg/orelha) na orelha direita de camundongos. O aumento da espessura da orelha
foi avaliado 30 minutos após a aplicação da capsaicina conforme descrito anteriormente
(GABOR e RAZGA, 1992).
3.4.6. Edema de orelha induzido pela aplicação intradérmica da histamina
O efeito do EEVS na reação de hipersensibilidade do tipo imediata foi avaliada
através do modelo de edema de orelha induzido pela histamina. Para tal, os animais
foram anestesiados com cetamina (0,02 mL) e xilazina (0,01 mL) e em seguida foi feita
a medida da espessura da orelha. O volume de 5 µL de uma solução de histamina (100
mg/ mL de salina) foi administrada, intradermicamente, na região ventral da orelha
direita dos camundongos com o auxílio de uma agulha hipodérmica 30 G. O grupo
SHAM foi submetido à administração do mesmo volume de salina. O EEVS (1 mg/20
µL) foi aplicado topicamente na região dorsal da orelha direita dos animais 30 minutos
35
antes da administração da solução de histamina (BRAND et al, 2002). O edema foi
avaliado 2 horas após a administração da histamina ou salina, considerando este o
tempo no qual ocorre o pico máximo do edema.
3.4.7. Edema de orelha induzido pela aplicação tópica da oxazolona
A dermatite de contato alérgica é definida como uma reação de hipersensibilidade
do tipo tardia que envolve duas fases: a fase de sensibilização ou indução e a fase
efetora (RANG et al., 2007; BAS et al., 2007). Com o objetivo de avaliar o efeito do
EEVS em uma resposta inflamatória de ação imediata, como verificada nas respostas
alérgicas, foi utilizado o modelo de hipersensibilidade do tipo tardia induzido pela
oxazolona. Este modelo se assemelha com as dermatites observadas em humanos, na
qual se verifica a formação do edema, migração de leucócitos polimorfonucleares e
linfócitos T (CD
4
+
e CD
8
+
) (BAS et al., 2007; FUJI et al., 2002).
Os animais foram sensibilizados através da aplicação tópica de 50 µL de uma
solução de oxazolona a 2% (p/v) em acetona na parte ventral (abdômen) dos animais
por 2 dias consecutivos, sendo os animais tricotomizados na região abdominal 2 dias
antes do início do experimento. Após 6 dias da sensibilização o desafio foi realizado,
onde foi aplicado topicamente 30 µL da solução de oxazolona a 2% (15 µL/15 µL em
cada face) na orelha direita dos animais, sendo o EEVS administrado 1 hora antes da
aplicação da oxazolona. A administração por via tópica do EEVS prosseguiu nos
tempos de 24, 36, 48, 60, 72, 84 e 96 horas após o desafio, sendo o edema avaliado a
cada 24 horas no decorrer desse período (RECIO et al., 2000). Após a avaliação do
edema no último dia do experimento, foram coletadas amostras das orelhas (círculos de
6 mm do tecido) para avaliação da atividade da enzima mieloperoxidase. Os linfonodos
auriculares também foram retirados para serem submetidos à contagem de linfócitos T.
3.4.8. Edema de orelha induzido pela aplicação múltipla do óleo de cróton
Para avaliar o efeito antiinflamatório do EEVS em um processo inflamatório já
estabelecido, foi utilizado um modelo de inflamação crônica, caracterizado pela
36
aplicação múltipla do óleo de cróton. O processo inflamatório crônico foi induzido pela
aplicação do óleo de cróton (0,4 mg/orelha em 20 µL de acetona) em dias alternados
durante 9 dias. O EEVS (1 mg/orelha) e a dexametasona (0,1 mg/orelha, controle
positivo), foram dissolvidos em 20 µL de acetona e posteriormente aplicados por via
tópica durante 4 dias (2 vezes ao dia) após o quinto dia do experimento, sendo o
edema avaliado diariamente (STANLEY et al., 1991). No 9° dia do experimento os
animais foram sacrificados e círculos de 6 mm de tecido das orelhas foram coletados
para serem, posteriomente, submetidas a avaliação da atividade das enzimas
mieloperoxidase e n-acetil-β-D-glucosaminidase, bem como a análise histológica e a
contagem de leucócitos totais.
3.5. MEDIDA DA ATIVIDADE ENZIMÁTICA DA MIELOPEROXIDASE (MPO)
A atividade da enzima MPO, utilizada como indicativo da presença de leucócitos
polimorfonucleares, foi avaliada utilizando a metodologia de Bradley et al. (1982)
modificada por De Young et al. (1989). As amostras (círculos de 6 mm do tecido das
orelhas de camundongos) foram adicionadas a 0,75 mL de tampão fosfato de sódio 80
mM (pH 5,4) contendo 0,5% de hexadeciltrimetilamônio (HTBA) e homogeneizado por
cerca de 45 s a 0°C. O homogenato foi decantado em microtubos e adicionado a 0,75
mL do tampão anteriormente descrito. A amostra (1,5 mL) foi colocada em microtubo e
centrifugada a 12000 x g a 4°C por 15 minutos. Dupl icatas de 30 µL do sobrenadante
foram colocadas em placas de 96 poços, onde posteriormente foi adicionado 200 µL de
uma mistura contendo 100 µL de tampão fosfato de sódio 80 mM (pH 5.4), 85 µL de
PBS 0,22M (pH 5.4) e 15 µL de peróxido de hidrogênio 0,017% em cada poço. A
reação foi iniciada com a adição de 20 µL de tetrametilbenzidina HCl (TMB) 18,4 mM
dissolvida em uma solução aquosa de dimetilformamida a 8 %. A placa foi
posteriormente incubada a 37°C por 3 minutos e a re ação interrompida pela adição de
30 µL de acetato de sódio 1,46 M (pH 3.0) em cada poço. A atividade enzimática foi
determinada colorimetricamente usando leitor de placas (Bio-Tek Ultra Microplate
reader EL 808) com comprimento de onda de 620 nm, sendo expressa em mDO/tecido.
37
A avaliação do efeito direto do extrato sobre a atividade da MPO foi realizada
através da incubação do extrato com a amostra do tecido submetida a uma única
aplicação de TPA. O homogenato da amostra tecidual foi adicionado à placa e
posteriormente incubado com diferentes concentrações do EEVS (0,3 – 30 µM/mL)
durante 15 minutos. Em seguida, foi realizado o protocolo descrito anteriormente.
3.6. MEDIDA DA ATIVIDADE ENZIMÁTICA DA n-acetil-β-D glucosaminidase
(NAG)
Para avaliar a atividade da enzima NAG é utilizada como indicativo da presença de
leucócitos mononucleares e foi realizada a partir de amostras de orelhas de
camundongos submetidas à aplicação repetida do óleo de cróton no modelo de
inflamação cutânea crônica, seguindo a metodologia de Sanchez e Moreno (1999). As
amostras do tecido (círculos de 6 mm de tecido da orelha dos camundongos) foram
adicionadas a 0,75 mL de solução de fosfato de sódio 80 mM (pH 5,4) contendo 0,5%
de hexadeciltrimetilamonio (HTAB) e homogeneizado por cerca de 45 s a 0°C. O
homogenato foi decantado em microtubos e foram adicionados 0,75 mL do tampão
anteriormente descrito. As amostras (1,5 mL) foram adicionadas em microtubos e
centrifugadas a 12000 x g a 4°C por 15 min. Triplic atas de 25 µL do sobrenadante
foram colocadas em placas de 96 poços e posteriormente foi adicionado 100 µL de
tampão citrato 50 mM (pH 4,5). A reação foi iniciada pela adição de 25 µL de p-
nitrofenil-acetamida-µ-D-glicopiranosídeo (2,24 mM) dissolvido água miliQ. A seguir a
placa foi incubada a 37°C por 1 h e a reação interr ompida pela adição de 30 µL de
tampão glicina 200 nM (pH 10,4) em cada poço. A atividade enzimática foi determinada
colorimetricamente usando um leitor de placas (Bio-Tek Ultra Microplate reader EL
808), cuja leitura foi realizada na absorbância de 405 nm e os resultados expressos
como mDO/tecido.
38
3.7. AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DO EXTRATO ETANÓLICO DA V.
scorpioides
O ensaio da diclorofluoresceína consiste na quantificação do composto
fluorescente 2’-7’ diclorofluoresceína (DCFA), o qual é um indicador da formação de
ROS. O composto fluorogênico diacetato de 2’-7’ diclorofluoresceína (DCFA-DA) é
amplamente utilizado como marcador do estresse oxidativo, pois quando adicionado a
um meio biológico se liga rapidamente com espécies oxidantes, formando o composto
fluorescente DCFA (KORYSTOV, et al., 2007; MYHRE et al., 2003; ROTA et al., 1999).
Os animais foram desafiados com TPA ( do mesmo modo que esta descrito no
item 4.4.2.) e os grupos experimentais tratados em seguida por via tópica com EEVS
(0,6 mg/orelha), o composto isolado luteolina (0,6 mg/orelha) ou com o antioxidante
ácido α-lipóico (0,6 mg/orelha), utilizado como controle positivo. Seguido 6 horas da
aplicação tópica do TPA amostras de 6 mm de diâmetro da orelha dos camundongos
foram coletadas, sendo diretamente homogenizadas em solução de PBS 80 a 4°C. Em
seguida, os homogenatos foram incubados por 40 minutos com 0,4873 mg da sonda
fluorescente diacetato de 2’-7’ diclorofluoresceína (DSFA-DA) dissolvida em 50 µl de
DMSO, de forma a atingir uma concentração de 1 µM. A intensidade de fluorescência
promovida pela formação do composto fluorescente 2’-7’ diclorofluoresceína (DCFA) foi
mensurada através de um espectrofluorofotometro (RF-5301 PC, Shimadzu), com
comprimento de onda de excitação de 488 nm e de emissão de 520 nm (ROTA et al.,
1999).
3.8. ANÁLISE DO MARCADOR DE SUPERFÍCIE CELULAR DA POPULAÇÃO DE
LEUCÓCITOS POR CITOMETRIA DE FLUXO
A quantificação de leucócitos totais foi realizada utilizando a técnica de citometria
de fluxo, através da marcação do CD
45,
que é uma molécula de superfície comum a
todos os leucócitos. Amostras de 6 mm de diâmetro de orelhas coletadas de
camundongos submetidos à aplicação múltipla do óleo de cróton (item 3.4.8) foram
39
homogenizadas em 1 ml de PBS estéril em microtubo e filtrado num filtro filcon (100
µm) acoplado a uma seringa. Posteriormente, adicionou-se 2 mL de PBS com 1% de
soro fetal bovino (SFB) ao pool das orelhas de cada grupo, sendo em seguida
submetidos à centrifugação (1200 rpm por 8 min). O sobrenadante foi retirado e o pellet
ressuspendido em 1 mL de PBS (1% SFB) e centrifugado nas mesmas condições
descritas anteriormente, sendo esse processo repetido em seguida. Uma alíquota de 60
µL da suspensão do pool de cada grupo foi transferido para um tubo de citômetro e
incubado com 1 µL do anticorpo anti-mouse CD
45
/FICT a 4ºC por 30 min. Após a
incubação, foi adicionado 1 mL de PBS com SFB 1% e a suspensão foi novamente
centrifugada, sendo esse processo repetido. Em seguida, o pellet foi ressuspendido em
300 µL de PBS e as células (10
5
) foram adquiridas no citômetro de fluxo (BD - FACS
Calibur), pelo software CellQuest e os dados analisados no software WinMDI 2.9.
3.9. ANÁLISE DE MARCADORES DE SUPERFÍCIE CELULAR DE
SUBPOPULAÇÕES DE LINFÓCITOS POR CITOMETRIA DE FLUXO
A quantificação de linfócitos foi realizada por citometria de fluxo a partir dos
linfonodos coletados de camundongos 24 horas após a fase efetora, submetidos ao
modelo de hipersensibilidade do tipo tardia induzido pela oxazolona, para investigação
de uma possível ação imunomoduladora do EEVS (item 3.4.7). O linfonodo foi
processado nas mesmas condições descritas na técnica anterior (item 3.8.), com
exceção dos anticorpos utilizados. Assim, alíquotas de 60 µL da suspensão do pool dos
diferentes grupos foram incubados com 1 µL de diferentes anticorpos (anti-mouse
CD
4
/PE, CD
8
/PE) a 4ºC por 30 min. Após a incubação, foi adicionado 1 mL de PBS com
SFB 1% e a suspensão foi novamente centrifugada, sendo esse processo repetido. Em
seguida, o pellet foi ressuspendido em 300 µL de PBS e as células (10
5
) foram
adquiridas no citômetro de fluxo (BD - FACS Calibur), pelo software CellQuest e os
dados analisados no software WinMDI 2.9.
40
3.10. ANÁLISE HISTOLÓGICA
As amostras de orelhas coletadas dos camundongos submetidos ao modelo de
edema de orelha induzido pelo TPA e aplicação múltipla de óleo de cróton foram
fixadas em solução ALFAC (álcool 80%, formol 40% e ácido acético glacial) num
período de 16 horas, sendo em seguida conservadas em álcool 70% até início do
processo de desidratação. As orelhas foram posteriormente desidratadas, blocadas em
parafina, seccionadas em cortes de 5 µm em um micrótomo e coradas com
hematoxilina e eosina. A infiltração de leucócitos, edema e espessura da epiderme
foram avaliadas em áreas representativas com aumento de 200x e/ou 400x. A
quantificação dos leucócitos presentes na derme foi realizada através da contagem
dessas células por campo com aumento de 400 x, sendo analisados 5 campos de 3
cortes histológicos distintos.
3.11. ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os resultados foram apresentados como média ± erro padrão da média (EPM),
exceto para os valores das DI
50
(dose necessária para reduzir em 50% das respostas
dos grupos tratados em relação ao grupo controle), que foram representados como a
média geométrica acompanhada de seus respectivos intervalos de confiança de 95%.
Os dados foram avaliados pela análise de variância (ANOVA) de uma via, seguida do
teste de múltipla comparação de Newman-Keuls e pelo teste “t” de student. Valores de
P menores do que 0,05 (P< 0,05) foram considerados como indicativos de significância.
Os cálculos foram realizados utilizando o Software estatístico GraphPad Prism version
3.00, San Diego Califórnia, EUA.
RESULTADOS
42
4. RESULTADOS
4.1. EFEITO DO EXTRATO ETANÓLICO DA Vernonia scorpioides (EEVS) NO
MODELO DE EDEMA DE ORELHA INDUZIDO POR TPA
Conforme demonstrado na figura 7, a aplicação tópica do TPA na orelha dos
camundongos promoveu um aumento significativo da espessura da orelha após a sexta
hora do desafio com esse agente flogístico. Esse evento foi efetivamente revertido de
maneira dependente da dose, pela aplicação tópica do EEVS (0,003 – 1 mg/orelha) de
forma a promover a inibição da formação do edema (I
max
) de 81 ± 2% na dose de 1
mg/orelha e apresentando um valor de DI
50
de 0,24 (0,1 – 0,55) mg/orelha. Os controles
positivos utilizados, o glicocorticóide dexametasona (0,05 mg/orelha) e o inibidor não-
seletivo da COX indometacina (2 mg/orelha) também promoveram a inibição do edema
induzido por TPA (88 ± 2% e 80 ± 4%, respectivamente), enquanto o valor da DI
50
da
dexametasona e indometacina descrito na literatura é de 0,023 (0,016 – 0,034)
mg/orelha e 0,35 (0,15 – 0,43) mg/orelha, respectivamente (GÁBOR, 2000; SHINELLA
et al, 1998).
Os resultados obtidos demonstraram que não há diferença estatística entre o
efeito anti-edematogênico do EEVS e dos agentes antiinflamatórios utilizados como
controle positivo. Ainda, a aplicação tópica do veículo (acetona + Tween 80 + álcool),
por sua vez, não induziu a formação do edema.
43
V C 0,003 0,01 0,03 0,1 0,3 1 0,05 2
0
50
100
150
200
250
300
350
***
***
***
***
***
***
EEVS Dex Ind
(mg/orelha)
***
∆
∆
∆
∆ Edema de orelha (
µ
µ
µ
µm)
Figura 7: Curva dose-resposta do EEVS no edema de orelha induzido por TPA. Os
animais foram desafiados com o TPA (C) e logo em seguida tratados com o EEVS (0,003 a
1 mg/orelha, tópico), dexametasona (Dex, 0,05 mg/orelha, tópico) ou indometacina (Ind, 2
mg/orelha, tópico). Após 6 horas a espessura da orelha foi medida com o auxilio de um
micrometro. As barras representam a média ± E.P.M. (n = 5-10) do aumento da espessura
da orelha em micrômetros (µm). *** p<0,001 representa o nível de significância em relação
ao controle (C).
Posteriormente, foi avaliada a atividade da enzima MPO, que é um marcador
enzimático da infiltração de neutrófilos no tecido inflamado (LLORET e MORENO,
1995). Para tal, foram selecionadas as doses de 0,01; 0,1 e 1 mg/orelha do EEVS,
baseado no resultado obtido na curva dose-resposta do modelo de edema de orelha
induzido por TPA (figura 7). A aplicação tópica do TPA aumentou de forma intensa a
atividade da MPO, na qual foi inibida significativamente pela aplicação tópica das doses
de 0,1 e 1 mg/orelha, e dos controles positivos dexametasona (0,05 mg/orelha) e
indometacina (0,05 mg/orelha). A inibição máxima da atividade da MPO dos animais
tratados com 1 mg/orelha do EEVS foi de 77 ± 8 %, enquanto a inibição da atividade
desta enzima promovida pela dexametasona foi 80 ± 3% (figura 8), estando esse
resultado de acordo com a literatura onde está descrito uma inibição da atividade da
MPO de 93% para a dexametasona (GÁBOR, 2000).
44
Figura 8: Efeito do EEVS sobre o edema de orelha e aumento na atividade da MPO
induzida pelo TPA. Os animais foram desafiados com o TPA (C) e logo em seguida
tratados com o EEVS (0,01 a 1 mg/orelha, tópico) ou dexametasona (Dexa, 0,5 mg/orelha,
tópico). Após 6 horas a espessura da orelha foi medida com o auxilio de um micrometro
(A) e foram obtidas amostras das orelhas para avaliação da atividade da MPO (B). As
barras representam a média ± E.P.M. (n = 5-10) do aumento da espessura da orelha em
micrômetros (µm). Animais tratados com o veículo (V). ***p<0,001 representa o nível de
significância em relação ao controle (C).
A inibição da atividade da MPO pelo EEVS pode resultar de uma inibição direta
desta enzima ou da inibição da migração de neutrófilos no tecido. Assim, na tentativa
de determinar qual desses dois processos está sendo inibido pela aplicação tópica do
EEVS, foi realizada a avaliação do efeito in vitro do EEVS sobre a atividade da MPO.
Para tal, foram utilizadas amostras do tecido (6 mm de diâmetro da orelha) previamente
submetidos à aplicação tópica de TPA (24 h), porém sem tratamento com o EEVS. Na
figura 9, pode-se observar que a incubação direta do homogenato das amostras com o
EEVS em diferentes concentrações (0,3 – 30 µg/mL) não alterou a atividade da MPO
quando comparada ao grupo controle, indicando que o EEVS não exerce sua ação
diretamente sobre esta enzima.
C 0,01 0,1 1 0,05
0
50
100
150
200
250
300
***
***
***
***
EEVS
Dexa
(mg/orelha)
A
∆
∆
∆
∆
Edema de orelha (
µ
µ
µ
µ
m)
V C 0,01 0,1 1 0,05
0
1000
2000
3000
***
***
***
EEVS Dexa
(mg/orelha)
B
mDO/Biópsia
45
V C 0,3 1 10 30
0
450
900
1350
1800
EEVS (µ
µµ
µg/mL)
mDO/Biópsia
Figura 9: Efeito do EEVS sobre a atividade da enzima MPO in vitro. Os animais foram
desafiados com TPA (C), com exceção do grupo veículo que receberam a aplicação de
acetona (V). Amostras de 6 mm de diâmetro das orelhas dos animais de cada grupo foram
homogenizadas e incubadas durante 15 minutos com diferentes concentrações de EEVS
(0,3-30 µg/mL). A atividade enzimática foi quantificada através de leitor de placa (620 nm).
Os valores estão expressos como média ± EPM (n=4).
Para confirmação do efeito antiinflamatório do EEVS verificado nos experimentos
anteriores, foi realizada a análise histológica dos parâmetros de inflamação relativos à
aplicação do extrato. A análise dos cortes histológicos das orelhas dos camundongos
demonstrou que após 24 horas da aplicação tópica do TPA ocorre uma formação
bastante intensa de edema, bem como uma pronunciada infiltração de leucócitos
polimorfonucleares na derme (figura 10B). A histologia também revelou que os
parâmetros inflamatórios (edema e infiltração leucocitária) foram suprimidos pela
aplicação tópica do EEVS (1 mg/orelha) (figura 10C), bem como pelo controle positivo
dexametasona (0,05 mg/orelha) (figura 10D), sendo a inibição da infiltração leucocitária
confirmada através da quantificação dos neutrófilos presentes da derme (tabela 1).
46
Figura 10: Análise histológica do efeito do EEVS sobre o edema e infiltrado
leucocitário no modelo de edema de orelha induzido por TPA. Fotos representativas
de cortes transversais de orelhas de camundongos coradas com hematoxilina-eosina
(aumento de 200x, escala de 100 µm) coletadas 24 horas após a aplicação do TPA. (A)
veículo, (B) controle (TPA), (C) animal tratado com EEVS (1 mg/orelha) ou (D)
dexametasona (0,05 mg/orelha). As flechas indicam a presença de neutrófilos.
47
Tabela 1
Quantificação de neutrófilos em amostras de orelhas do modelo de
edema de orelha induzido por TPA
Média do número de neutrófilos observados por campo
Veículo Controle EEVS Dexa
12.2 74.6 36.4 29.3
* A quantificação de neutrófilos foi realizada com aumento de 400 x, sendo analisados 5
campos de 3 cortes histológicos distintos de cada grupo de animais.
Na tentativa de verificar se EEVS administrado por via oral mantém a atividade
antiinflamatória, como quando aplicado topicamente, os animais foram tratados com
uma dose de 1000 mg/Kg, v.o., 1 h antes da indução do edema com o TPA. No entanto,
conforme demonstrado na figura 11, o EEVS não se mostrou ativo sobre o edema de
orelha quando este extrato é administrado por via oral.
48
C
EEVS
0
100
200
300
∆
∆
∆
∆
Edema de orelha (
µ
µ
µ
µ
m)
Figura 11: Efeito do EEVS por via oral sobre o edema de orelha induzido por TPA. Os
animais foram pré-tratados com EEVS por via oral (1000 mg/Kg) 1 h antes da aplicação
tópica do TPA, enquanto o outro grupo foi desafiado com TPA (C). Após 6 horas a
espessura da orelha foi medida com o auxílio de um micrometro. As barras representam a
média ± E.P.M. (n = 5) do aumento da espessura da orelha em micrômetros (µm).
4.2. EFEITO TÓPICO DAS DIFERENTES FRAÇOES DA Vernonia scorpioides NO
MODELO DE EDEMA DE ORELHA INDUZIDO POR TPA
Após a constatação da atividade antiinflamatória do EEVS, foi verificado o efeito
das diferentes frações obtidas a partir do EEVS também no modelo de edema de orelha
induzido pela aplicação tópica de TPA, com o objetivo de identificar qual das frações
poderia conter o(s) composto(s) envolvidos na atividade anti-edematogênica da V.
scorpioides. Da mesma forma que o extrato, as frações hexano (Hex), acetato
enriquecido (AceE), acetato (Ace) e diclorometano (DCM), na dose de 0,5 mg/orelha,
foram capazes de reduzir o edema de orelha induzido por TPA, conforme demonstrado
na figura 13. A inibição do edema promovida pelas frações Hex, AcetE, Acet e DCM
foram 35 ± 8%, 53 ± 4%, 57 ± 5%, 70 ± 5%, respectivamente, enquanto para o EEVS foi
72 ± 14% e para dexametasona (controle positivo) 87 ± 3%.
49
C Hex AceE Ace DCM EEVS Dexa
0
100
200
300
0,5
0,05
***
***
***
***
***
***
∆
∆
∆
∆
Edema de orelha (
µ
µ
µ
µ
m)
Figura 12: Efeito do EEVS e das frações da Vernonia scorpioides sobre o edema de
orelha induzido por TPA. Os animais foram desafiados com o TPA (C) e logo em
seguida tratados com o EEVS, as frações hexano (Hex), acetato enriquecido (AceE),
acetato (Ace), diclorometano (DCM) (0,5 mg/orelha, tópico) e dexametasona (Dexa, 0,05
mg/orelha)). Após 6 horas a espessura da orelha foi medida com o auxilio de um
micrometro. As barras representam a média ± E.P.M. (n = 5-8) do aumento da espessura
da orelha em micrômetros (µm). ***p<0,001 representa o nível de significância em
relação ao controle (C).
Como todas as frações testadas no modelo de edema de orelha induzido por TPA
apresentaram atividade antiedematogênica, o passo seguinte foi realizar a curva dose-
resposta das frações para comparação da potência (obtenção da DI
50
)
.
Os resultados
apresentados da figura 13 mostram que as frações DCM e Ace foram capazes de inibir
a formação do edema induzido por TPA de maneira dose-dependente, com uma
inibição máxima de 63 ± 6% na dose de 0,6 mg/orelha e DI
50
de 0,4 (0,23-0,71)
mg/orelha para a fração DCM, e inibição máxima de 66 ± 6% (0,6 mg/orelha) e DI
50
de
0,08 (0,05-0,11) mg/orelha para a fração Ace. Diante dos valores de DI
50
para ambas as
frações, verifica-se que o efeito antiedematogênico da fração Ace é mais potente que o
efeito da fração DCM. As frações AceE e Hex, embora tenham apresentado atividade
antiedematogênica com inibição máxima de 54 ± 7% e 31 ± 4% , respectivamente, não
demonstraram um efeito dose-dependente. Da mesma forma que o EEVS, as frações
50
Ace e DCM da V. scorpioides também inibiram a atividade da MPO quando
administradas topicamente, apresentando uma I
max
de 78 ± 1% (0,6 mg/orelha) e 63,5 ±
5% (0,1 mg/orelha), respectivamente. Porém esse tratamento não promoveu um efeito
dose-dependente para o efeito sobre a atividade desta enzima (Figura 14).
Figura 13: Curva dose-resposta de diferentes frações obtidas do EEVS no edema de
orelha induzido por TPA. Os animais foram desafiados com o TPA e logo em seguida
tratados com a fração Ace (A), DCM (B), AceE (C) e Hex (D) (0,003 a 0,6 mg/orelha,
tópico). Após 6 horas a espessura da orelha foi medida com o auxilio de um micrometro.
As barras representam a média ± E.P.M. (n=4-5) do aumento da espessura da orelha em
micrômetros (µm). *** p< 0,001; ** p< 0,01 representam o nível de significância em relação
ao controle (C).
C 0,01 0,03 0,1 0,3 0,6
0
100
200
300
400
DCM (mg/orelha)
*** ***
***
***
***
∆
∆
∆
∆
Edema orelha (
µ
µ
µ
µ
m)
A
C
B
A
C 0,03 0,1 0,3 0,6
0
100
200
300
400
**
**
Hex (mg/orelha)
∆
∆
∆
∆
Edema orelha (
µ
µ
µ
µ
m)
C 0,003 0,03 0,1 0,3 0,6
0
100
200
300
***
***
***
Ace (mg/orelha)
***
∆
Edema orelha (
µ
m)
D
C 0,01 0,03 0,1 0,3 0,6
0
100
200
300
400
AceE(mg/orelha)
*
***
**
***
**
∆
∆
∆
∆
Edema orelha (
µ
µ
µ
µ
m)
51
Figura 14: Efeito da fração Ace e DCM da Vernonia scorpioides sobre o aumento da
atividade da MPO induzida pelo TPA. Os animais foram desafiados com o TPA (C) e
logo em seguida tratados com doses crescentes (0,01-0,6 mg/orelha, tópico) das frações
Ace (A) e DCM (B). Após 24 horas foram obtidas amostras das orelhas para avaliação da
atividade da MPO. As barras representam a média ± E.P.M. (n = 5-6) do aumento da
atividade da MPO. Animais tratados com o veículo (V). **, p<0,01; ***p<0,001 representam
o nível de significância em relação ao controle (C).
4.3. EFEITO ANTIOXIDANTE DO EXTRATO ETANÓLICO DA Vernonia scorpioides
(EEVS) E DO COMPOSTO ISOLADO LUTEOLINA
A figura 15A mostra que o composto isolado luteolina (0,6 mg/orelha) reverte de
forma significativa o edema de orelha induzido pela aplicação tópica de TPA,
promovendo uma inibição de 44 ± 11% frente a 68 ± 8% da inibição decorrente da
aplicação tópica do EEVS (0,6 mg/orelha). Em relação ao efeito antioxidante, o EEVS, o
composto isolado luteolina e o controle positivo ácido α-lipóico, reduziram
significativamente a formação de espécies reativas de oxigênio conforme verificado com
a diminuição de intensidade de fluorescência emitida pelo composto fluorescente
DCFA, porém o EEVS se mostrou mais efetivo que a luteolina e o ácido α-lipóico em
relação a atividade antioxidante (figura 15B).
A
B
V C 0,01 0,03 0,1 0,3 0,6
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
***
***
***
**
***
Ace (mg/orelha)
***
mDO/Biópsia
V C 0,01 0,03 0,1 0,3 0,6
0
300
600
900
1200
1500
1800
2100
***
***
***
***
***
***
DCM (mg/orelha)
***
mDO/Biópsia
52
Figura 15: Efeito antioxidante do EEVS e do composto isolado luteolina em modelo
de edema de orelha induzido por TPA. Os animais foram desafiados com o TPA (C) e
logo em seguida tratados com o EEVS (0,6 mg/orelha), luteolina (LUT) (0,6 mg/orelha) e
com o controle positivo ácido α-lipóico (AL) (0,6 mg/orelha). Após 6 horas a espessura da
orelha foi medida com o auxilio de um micrometro (A) e foram obtidas amostras das
orelhas para avaliação da formação de espécies reativas de oxigênio (ROS) (B). As
barras representam a média ± E.P.M. (n = 5-10) do aumento da espessura da orelha em
micrômetros (µm). Animais tratados com o veículo (V). ***p<0,001 representa o nível de
significância em relação ao grupo controle (C).
4.4. EFEITO DO EXTRATO ETANÓLICO DA Vernonia scorpioides (EEVS) NO
MODELO DE EDEMA DE ORELHA INDUZIDO POR ÁCIDO ARAQUIDÔNICO
O ácido araquidônico promoveu a formação do edema após 1 hora da sua
aplicação tópica, da mesma forma que descrito na literatura (YOUNG et al., 1984;
CRUMMEY et al., 1987). A aplicação tópica do EEVS (0,03 a 1 mg/orelha) no edema
induzido pelo ácido araquidônico, foi capaz de promover uma redução dose-
dependente do edema de orelha, apresentando um valor de DI
50
de 0,68 (0,41-1,13)
mg/orelha e Imax
de 60±8% na dose de 1 mg/orelha, enquanto o controle positivo
indometacina (2 mg/orelha) promoveu uma inibição de 65 ± 5% do edema induzido pelo
ácido araquidônico, conforme demonstrado na figura 16. A DI
50
estimada para a
indometacina no modelo do ácido araquidônico é de 0,4 mg/orelha (GÁBOR, 2000).
C
EEVS
LUT
AL
0
100
200
300
400
***
***
*
A
∆
∆
∆
∆
Edema de orelha (
µ
µ
µ
µ
m)
V
C
EEVS
LUT
AL
0.0
2.5
5.0
7.5
10.0
***
***
***
B
***
Intensidade de
Fluorescência (unid. arb.)
53
C 0,03 0,1 0,3 0,6 1 2
0
40
80
120
160
200
240
280
***
***
***
***
***
**
EEVS Ind
∆
∆
∆
∆
Edema orelha (
µ
µ
µ
µ
m)
Figura 16: Curva dose-resposta do EEVS no edema de orelha induzido por ácido
araquidônico. Os animais foram desafiados com o AA (2 mg/orelha) e logo em seguida
tratados com o EEVS (0,03 a 1 mg/orelha, tópico) ou indometacina (Ind, 2 mg/orelha,
tópico). Após 1 hora a espessura da orelha foi medida com o auxilio de um micrometro. As
barras representam a média ± E.P.M. (5-8) do aumento da espessura da orelha em
micrômetros (µm). **p<0,01, *** p<0,001 representa o nível de significância em relação ao
controle (C).
4.5. EFEITO DO EXTRATO ETANÓLICO DA Vernonia scorpioides (EEVS) NO
MODELO DE EDEMA DE ORELHA INDUZIDO POR FENOL
Conforme descrito na literatura, foi verificada uma formação intensa do edema na
orelha dos animais do grupo controle 1 hora após a aplicação tópica do fenol. Em
contrapartida, a aplicação tópica do EEVS (1 mg/orelha), bem como da dexametasona
(0,1 mg/orelha), promoveu uma inibição significativa da formação do edema induzido
pela aplicação deste agente irritante, sendo verificada uma inibição de 88 ± 6% para o
EEVS e de 91 ± 9% para a dexametasona.
54
C EEVS Dexa
0
50
100
150
200
250
300
350
***
***
∆
∆
∆
∆
Edema de orelha (
µ
µ
µ
µ
m)
Figura 17: Efeito do EEVS no edema de orelha induzido por fenol. O edema foi
induzido pela aplicação tópica de uma solução a 10% de fenol (20 µL/orelha), seguido da
aplicação do EEVS (1 mg/orelha, tópico) ou dexametasona (Dexa, 0,1 mg/orelha, tópico).
Após 1 hora a espessura da orelha dos animais foi medida com o auxilio de um
micrometro. As barras representam a média ± E.P.M. (n = 5-8 animais) do aumento da
espessura da orelha em micrômetros (µm). *** p<0,001 representa o nível de significância
em relação ao controle (C).
4.6. EFEITO DO EXTRATO ETANÓLICO DA Vernonia scorpioides (EEVS) NO
MODELO DE EDEMA DE ORELHA INDUZIDO POR CAPSAICINA
A aplicação tópica da capsaicina (200 µg/orelha) induziu a formação de edema com
uma intensidade máxima no tempo de 30 minutos. O pré-tratamento dos animais com 1
mg/orelha do EEVS preveniu a formação do edema induzido pela capsaicina, onde foi
verificado uma inibição de 25 ± 7%, conforme demonstrado na figura 18.
55
C EEVS
0
50
100
150
200
*
∆
∆
∆
∆
Edema orelha (
µ
µ
µ
µ
m)
Figura 18: Efeito do EEVS no edema de orelha induzido por capsaicina. Os animais
foram pré-tratados com o EEVS (1 mg/orelha) por via tópica 30 minutos antes da aplicação
da capsaicina (200 µg/orelha). Após 30 minutos do desafio com a capsaicina, a espessura
da orelha foi medida com o auxílio de um micrômetro. As barras representam a média ±
E.P.M. (n = 5-8 animais) do aumento da espessura da orelha em micrômetros (µm). *p<0,05
representa o nível de significância em relação ao controle (C).
4.7. EFEITO DO EXTRATO ETANÓLICO DA Vernonia scorpioides (EEVS) NO
MODELO DE EDEMA DE ORELHA INDUZIDO POR HISTAMINA
A aplicação intradérmica de uma solução de histamina na orelha de
camundongos resultou no aumento da espessura da orelha que foi significativamente
maior que o observado no grupo submetido à administração somente com salina,
quando avaliado 2 horas após as respectivas injeções. A aplicação tópica prévia do
EEVS (1 mg/orelha) promoveu uma inibição de 25 ± 7% do edema induzido pela
histamina, demonstrando assim um efeito anti-edematogênico desse extrato nesse
modelo.
56
V
C
EEVS
0
100
200
300
**
∆
∆
∆
∆
Edema de orelha (
µ
µ
µ
µ
m)
Figura 19: Efeito do EEVS no edema de orelha induzido pela aplicação intradérmica
da histamina. Os animais foram pré-tratados com o EEVS (1mg/orelha) por via tópica 30
minutos antes da administração intradérmica da solução de histamina (100 µg/5 µL). Após
2 horas, a espessura da orelha foi medida com o auxílio de um micrometro. As barras
representam a média ± E.P.M. (n = 5 animais) do aumento da espessura da orelha em
micrômetros (µm). Animais tratados com o veículo (V). **p<0,01 representa o nível de
significância em relação ao controle (C).
4.8. EFEITO DO EXTRATO ETANÓLICO DA Vernonia scorpioides (EEVS) NO
MODELO DE EDEMA DE ORELHA INDUZIDO POR OXAZOLONA
A sensibilização prévia dos animais com a oxazolona, fase que representa o primeiro
contato do animal com o hapteno, promoveu a formação do edema que perdurou até 96
h após o desafio (Figura 20). Entretanto, esse efeito não foi observado nos animais que
não foram expostos a oxazolona na fase de sensibilização (não-sensibilizados). Essa
resposta inflamatória, cujo parâmetro avaliado foi o edema, foi reduzida
significativamente já nas primeiras 24 horas após a aplicação tópica do EEVS (1
mg/orelha), onde foi verificada uma inibição de 42 ± 9%. O efeito do extrato se estendeu
até 96 h após o desafio, quando ainda apresentava uma inibição de 38 ± 12%. Efeito
inibitório semelhante foi obtido com o glicocorticóide dexametasona (0,05 mg/orelha),
usado como controle positivo deste modelo (figura 20 A). Entretanto, o EEVS (1
57
mg/sítio) quando administrado somente na fase de sensibilização não reverteu a
formação do edema quando o animal foi novamente exposto ao hapteno oxazolona
(figura 20 B).
Por outro lado, como observado na figura 20B, o tratamento com EEVS (1
mg/orelha), realizado somente na fase efetora, foi capaz de promover a inibição da
formação do edema de forma significativa nas primeiras 24 horas (Inibição de 63 ± 4%).
Esse efeito inibitorio do EEVS persistiu até 96 horas após o desafio (Inibição de 40 ±
11%), da mesma forma que o verificado quando o animal é submetido ao tratamento
com o EEVS nas duas fases de exposição ao hapteno.
O modelo de hipersensibilidade de contato tem sido considerado com um
modelo útil na ativação de células T nos linfonodos (HOMEY et al, 1998). Assim, para
verificar um possível efeito imunosupressor do EEVS na reação de hipersensibilidade
tardia foi investigada a ação desse extrato sobre a proliferação dos linfócitos T
presentes no linfonodo auricular (linfócitos T CD
4
+
e CD
8
+
), através da técnica de
citometria de fluxo (figura 21). O tratamento tópico com EEVS (1 mg/sítio) na fase de
sensibilização e fase efetora revelou não atuar sobre a proliferação dos linfócitos CD
4
e CD
8
presentes no linfonodo auricular quando a porcentagem de linfócitos foi
comparada ao grupo controle, da mesma forma a porcentagem de linfonodos desses
grupos também não foi diferente ao dos animais não sensibilizados, podendo esse
resultado ser observado na figura 21 e 22.
58
0 24 48 72 96
0
100
200
300
400
***
***
***
**
***
*
**
Controle
EEVS
Dexametasona
não sensibilizado
**
A
Tempo (horas)
∆
∆
∆
∆
edema de orelha (
µ
µ
µ
µ
m)
Figura 20: Efeito do EEVS no modelo de hipersensibilidade tardia induzido pela
oxazolona. Os animais foram sensibilizados e 6 dias após foram novamente expostos à
oxazolona (desafio). Para o desafio os animais receberam na orelha solução de oxazolona a
2% (15 µL em cada face), e depois de 1 h foram tratados topicamente com veículo (controle),
EEVS (1 mg/orelha) ou dexametasona (0,05 mg/orelha) na fase de sensibilização e fase
efetora (A); somente na fase de sensibilização (B) e somente na fase efetora (C). Outro grupo
de animais, que não foram previamente sensibilizados, foi tratado somente com oxazolona na
orelha direita (não sensibilizados). Os valores estão expressos como média ± EPM (n=5-6) do
aumento da espessura da orelha em micrômetros (µm). *** p<0,001; **p<0,01; *p<0,05
representam o nível de significância em relação ao grupo controle
.
0 24 48 72 96
0
100
200
300
400
**
**
Tempo (horas)
∆
∆
∆
∆
Edema de orelha (
µ
µ
µ
µ
m)
B C
0 24 48 72 96
0
100
200
300
400
**
***
***
***
*
***
***
Tempo (horas)
∆
∆
∆
∆
Edema de orelha (
µ
µ
µ
µ
m)
59
Figura 21: Efeito do EEVS sobre a proliferação de linfócitos T CD
4
na hipersensibilidade
do tipo tardia. O grupo de animais não sensibilizados (NS) foi exposto a oxazolona somente
na fase efetora, enquanto o grupo controle foi exposto a oxazolona na fase de sensibilização
e fase efetora. O tratamento com o EEVS (1 mg/sítio) foi realizado por via tópica nestas duas
fases em animais sensibilizados. Amostras do pool de linfonodos auriculares de animais de
cada grupo (10
-5
células/grupo) foram analisadas por citometria de fluxo, após marcação com
anticorpos específicos (anti-mouse CD
4
/PE).
25 ± 7%
Veículo
48,8%
Controle
68,13%
EEVS
72%
Não-sensibilizado
63,23%
60
Figura 22: Efeito do EEVS sobre a proliferação de linfócitos T CD
8
na hipersensibilidade
do tipo tardia. O grupo de animais não sensibilizados (NS) foi exposto a oxazolona somente
na fase efetora, enquanto o grupo controle foi exposto a oxazolona na fase de sensibilização
e fase efetora. O tratamento com o EEVS (1 mg/sítio) foi realizado por via tópica nestas duas
fases em animais sensibilizados. Amostras do pool de linfonodos auriculares de animais de
cada grupo (10
-5
células/grupo) foram analisadas por citometria de fluxo, após marcação com
anticorpos específicos (CD
8
/PE).
A infiltração leucocitária no modelo de hipersensibilidade tardia também foi
investigada através da avaliação da atividade da enzima MPO. Amostras das orelhas
dos animais tratados com o EEVS nas duas fases (sensibilização e efetora) foram
coletadas 24 horas após a segunda exposição do animal com a oxazolona, período
em que o edema atingiu o pico máximo. O resultado demonstrado na figura 23 revela
que o tratamento tópico com o EEVS (1 mg/sítio) inibe a atividade da enzima MPO de
forma significativa (53 ± 16%), enquanto os animais que não foram expostos a
oxazolona na fase de sensibilização (não sensibilizados) não apresentaram um
aumento da atividade da MPO quando comparado com o grupo controle, não
diferindo estatisticamente do grupo veículo.
Veículo
62,7%
Controle
74,44%
EEVS
72,8%
Não-sensibilizado
70,12%
61
0
500
1000
1500
2000
**
***
V EEVS
NS
C
***
mDO/Biópsia
Figura 23: Efeito do EEVS sobre a atividade da enzima mieloperoxidase (MPO) no
modelo de hipersensibilidade do tipo tardia induzida por oxazolona. Amostras das
orelhas dos animais tratados com o EEVS (1 mg/sítio) em ambas as fases de exposição a
oxazolona foram coletadas 24 horas após a fase efetora para avaliação da atividade da
MPO. Animais tratados com o veículo (V) e animais não sensibilizados (NS). Os valores
estão expressos como média ± EPM (n=5). ** p<0,01; ***p<0,001 representam o nível de
significância em relação ao controle (C).
4.9. EFEITO DO EXTRATO ETANÓLICO DA Vernonia scorpioides (EEVS) NO
MODELO DE EDEMA DE ORELHA INDUZIDO PELA APLICAÇÃO MÚLTIPLA DE
ÓLEO DE CRÓTON
A aplicação repetida de óleo de cróton em orelhas de camundongos promove uma
resposta inflamatória crônica caracterizada por edema, infiltração celular predominante
de células mononucleares e hiperproliferação celular na epiderme (STANLEY et al.,
1991). A figura 24A demonstra que, após o estabelecimento do processo inflamatório
crônico por aplicação repetida de óleo de cróton, o tratamento crônico com o EEVS (1
mg/orelha) e com a dexametasona (0,05 mg/orelha) foi capaz de promover a reversão
62
do edema de forma significativa, apresentando no nono dia de tratamento uma inibição
do edema de 31 ± 2% e 30 ± 9%, respectivamente. A infiltração de leucócitos
mononucleares é característica nesse modelo, assim a avaliação da atividade da NAG é
uma medida indireta da infiltração desses tipos celulares na derme. A figura 24B
demonstra que o EEVS não foi capaz de inibir a atividade da NAG; causando uma
alteração de somente 14 ± 7% na resposta não sendo estatisticamente significativo em
relação ao grupo controle. A dexametasona (controle positivo) promoveu uma inibição
significativa (25 ± 7%) da atividade da NAG, demonstrando que esse agente
antiinflamatório inibe a infiltração de leucócitos mononucleares. A avaliação da atividade
da MPO permite sugerir que tanto o EEVS como o controle positivo dexametasona
promovem a inibição da infiltração de neutrófilos (25 ± 10% e 57 ± 8%, respectivamente)
casada pelo óleo de cróton, conforme observado na figura 24C.
63
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0
500
1000
1500
**
**
*
*
Dexa
Controle
EEVS
Dias
Edema de orelha (
µ
µ
µ
µ
m)
A
Figura 24: Efeito do EEVS no edema induzido pela aplicação múltipla de óleo de
cróton. O processo inflamatório crônico foi induzido com a aplicação tópica de óleo de
cróton (0,4 mg/orelha) em dias alternados durante 9 dias. O EEVS (1 mg/orelha) e a
dexametasona (0,05 mg/orelha) foram aplicados topicamente durante 4 dias (2 vezes ao
dia) após o quinto dia do início da aplicação do óleo de cróton e a espessura da orelha
medida diariamente (A). No último dia de tratamento amostras das orelhas foram
coletadas para avaliação da atividade da NAG (B) e MPO (C). Os valores estão expressos
como média ± EPM (n=6). *** p< 0,001; ** p< 0,01 e *p<0,05 representam o nível de
significância em relação ao controle (C).
V
C
EEVS
Dexa
0
500
1000
1500
2000
2500
**
B
mDO/biópsia
V
C
EEVS
Dexa
0
500
1000
1500
2000
**
***
C
mDO/Biópsia
64
Os parâmetros da inflamação, como a infiltração leucocitária, edema e
hiperproliferação celular, também foram avaliados através da análise histológica. Na
figura 25 pode-se observar a inibição do edema tanto no grupo tratado com o EEVS (1
mg/orelha) como no grupo tratado com a dexametasona (0,05 mg/orelha). Além disso,
também foi verificada uma intensa infiltração leucocitária no grupo controle e no grupo
submetido ao tratamento com EEVS, mas não no grupo tratado com dexametasona,
confirmando assim os resultados obtidos anteriormente (figura 20). A aplicação repetida
do óleo de cróton na orelha dos camundongos também promove uma hiperproliferação
marcante dos queratinócitos, caracterizado por um aumento na espessura da epiderme
(acantose). A aplicação múltipla desse agente flogístico promoveu um aumento cerca
de 8 vezes maior da espessura da epiderme em relação ao grupo que recebeu apenas
veículo (acetona). Ao passo que, o tratamento tópico com o EEVS e com a
dexametasona foram capazes de inibir a hiperproliferação celular induzida pela
aplicação múltipla do óleo de cróton.
65
Figura 25: Análise histológica do efeito do EEVS sobre o edema, infiltrado leucocitário e
hiperproliferação epidérmica no modelo de edema de orelha induzido pela aplicação
múltipla de óleo de cróton. Fotos representativas de cortes transversais de orelhas de
camundongos coradas com hematoxilina-eosina (aumento de 200x, escala de 100 µm)
coletadas após a aplicação repetida de óleo de cróton. (A) veículo, (B) controle, (C) animal
tratado com o EEVS (1 mg/orelha) e (D) dexametasona (0,05 mg/orelha). As flechas indicam a
infiltração de leucócitos e o asterisco indica hiperplasia epidermal (acantose).
A ação do EEVS sobre a infiltração leucocitária no modelo de inflamação crônica
foi confirmada pela quantificação dos leucócitos totais presentes no tecido inflamado
utilizando a técnica de citometria de fluxo. Foi feita a detecção de células que
expressam a molécula CD
45
em sua superfície, que é caracteristicamente um marcador
comum para os leucócitos. Dentre as células presentes no pool do grupo controle foi
verificado que 36% eram leucócitos, enquanto no grupo submetido à aplicação tópica
C
A B
D
C
*
66
do veículo apenas 2,6% representaram esse tipo celular. Os grupos tratados com o
EEVS (1 mg/orelha) e a dexametasona (0,05 mg/orelha) apresentaram valores
inferiores ao grupo controle, onde 27% e 23% , respectivamente, representam a
presença de leucócitos no pool analisado (figura 26).
Figura 26: Efeito do EEVS sobre a infiltração de leucócitos totais no tecido durante o
processo inflamatório crônico. O óleo de cróton foi administrado topicamente nos
animais em dias alternados durante 9 dias. O EEVS (1 mg/orelha) e a dexametasona (0,05
mg/orelha) foram aplicados, também por via tópica, 2 vezes ao dia após o quinto dia do
início do experimento. Os animais foram sacrificados no nono dia do experimento e
amostras das orelhas foram coletadas, sendo posteriormente homogenizadas. Amostras
do pool das orelhas dos animais de cada grupo (10
5
células/grupo) foram analisadas por
citometria de fluxo, após marcação com anticorpo específico (anti-mouse CD
45
/FICT) das
células que expressam a molécula CD
45
em sua superfície (leucócitos). Dentre as células
presentes no pool analisado, 2.6%; 36%; 27% e 23% representam leucócitos no grupo
veículo (A), grupo controle (B), grupo tratado com EEVS (C) e Dexametasona (D),
respectivamente.
A B
C D
2,6%
36%
27% 23%
67
4.10. AVALIAÇÃO DA ESTABILIDADE DO EXTRATO ETANÓLICO DA Vernonia
scorpioides (EEVS)
A estabilidade do EEVS foi avaliada a fim de constatar se as condições de
armazenamento eram adequadas para preservar a atividade farmacológica dos
compostos presentes nesse extrato. Para tal, a atividade anti-edematogênica do
EEVS foi avaliada em vários períodos no decorrer do tempo em que os experimentos
do presente trabalho foram conduzidos, utilizando para tal o modelo de edema de
orelha induzido por TPA. Na figura 27 pode-se observar que a atividade farmacológica
do EEVS; avaliada através da comparação da inibição do edema de orelha em
diferentes tempos, manteve-se durante o período de 570 dias, demonstrando assim
que as condições de armazenamento não interferiram na atividade dos compostos
responsáveis pela propriedade anti-edematogênica do EEVS.
0 100 200 300 400 500 600
0
20
40
60
80
100
74%
69%
83%
81%
68%
78%
81%
Dias
Inibição do edema (%)
Figura 27: Efeito do EEVS no modelo de edema de orelha induzido pelo TPA no decorrer
do tempo. Os animais foram desafiados com TPA (2,5 µg/orelha, via tópica) e em seguida
tratados topicamente com EEVS (1 mg/orelha). A espessura da orelha foi avaliada após 6 horas
e os valores da inibição do edema de orelha (%) foram determinados em diferentes tempos,
durante o período de 570 dias. Os valores representam a inibição do edema obtida a partir de
grupos de 4-6 animais.
68
DISCUSSÃO
69
5. DISCUSSÃO
Vários estudos com algumas espécies do gênero Vernonia têm demonstrado que
algumas destas espécies apresentam atividade antiinflamatória e imunomoduladora
(KOS et al., 2006; NERGARD et al., 2004; MAZUNDER et al., 2003; IWALEWA et al.,
2003). O gênero Vernonia produz metabólitos típicos da família Astearacea, como as
lactonas sesquiterpênicas (LS), com várias atividades biológicas já descritas, tal como
atividade fungistática (KRISHNA-KUMARI et al., 2003), atividade citotóxica (KUO et al,
2003; PAGNO et al., 2006), atividade antiinflamatória, analgésica e antipirética (KOS et
al, 2006; IWALEWA, et al, 2003; MAZUNDER et al, 2003).
No entanto, nenhum estudo
avaliou o potencial antiinflamatório tópico de nenhuma espécie desse gênero, incluindo
a V. scorpioides que é utilizada topicamente pela população para tratar uma variedade
de afecções cutâneas (MORAES, 1997; CABREIRA, 1980). Assim, a investigação da
atividade antiinflamatória tópica da V. scorpioides se faz necessária para comprovação
da eficácia desta espécie nas doenças inflamatórias cutâneas, considerando que o uso
tradicional não é suficiente para validar eticamente nenhuma planta medicinal como um
medicamento eficaz e seguro (LAPA et al, 2004). Além disso, a interação dos estudos
químico/farmacológicos realizados em laboratórios com as informações provenientes da
abordagem etnofarmacológica junto às comunidades locais que fazem uso da flora
medicinal, resulta numa estratégia bastante útil na investigação de novos fármacos a
partir de plantas medicinais. Nesse contexto, o objetivo deste trabalho foi investigar a
atividade antiinflamatória tópica da V. scorpioides em processos inflamatórios agudos e
crônicos, utilizando para tal diferentes modelos experimentais de inflamação cutânea.
O processo inflamatório caracteriza-se por quatro sinais clássicos: calor, eritema,
edema e dor. Assim, a utilização do edema como parâmetro de avaliação em modelos
validados, como o modelo de edema de orelha induzido por diferentes agentes
flogísticos, permite avaliar o potencial antiinflamatório tanto por via tópica quanto
sistêmica de vários agentes, sejam eles compostos sintéticos, extratos de plantas ou
compostos isolados (GÁBOR, 2000; DE YOUNG et al., 1989). Além disso, quando o
objetivo é o desenvolvimento de medicamentos de uso tópico, esse modelo oferece
70
ainda a vantagem de identificar compostos que apresentam uma absorção cutânea
apropriada de forma a atingir concentrações adequadas na pele para exercer um efeito
farmacológico (BOUCLIER et al., 1990).
Os agentes flogísticos utilizados nos experimentos do presente trabalho apresentam
ação tópica e induzem uma inflamação local como resultado da produção de
mediadores pró-inflamatórios que promovem a vasodilatação, infiltração de células
PMN e extravasamento de plasma, conduzindo assim à instalação dos sinais clássicos
da inflamação (DE BERNARDIS et al, 1994; FURSTENBERGER et al., 1994). Assim,
os modelos de inflamação cutânea permitem identificar compostos com atividade
antiinflamatória que possam ser potencialmente úteis no tratamento de doenças
inflamatórias que acometem a pele, pois promovem condições que se assemelham com
alguns tipos de dermatites observadas em humanos (VANE, 2000; BOUCLIER et
al.,1990; CARLSON et al, 1985).
O modelo de edema de orelha induzido por TPA consiste num modelo útil para a
triagem da atividade antiinflamatória de compostos que atuam na fase aguda da
inflamação, bem como em processos inflamatórios hiperproliferativos (GÁBOR, 2000;
MARKS, 1990). A aplicação tópica do TPA induz uma resposta inflamatória cutânea
caracterizada por vasodilatação e formação de eritema já nas primeiras duas horas,
seguido do aumento da espessura da orelha como resultado do extravasamento celular
que atinge um pico máximo na sexta hora e tende a diminuir, atingindo os valores
basais após 24 horas. A aderência dos leucócitos PMN na parede dos vasos e a
degranulação de mastócitos é verificada entre a 4º e 6º hora. No entanto, a infiltração
máxima de leucócitos polimorfonucleares no tecido é atingida somente 24 horas após a
aplicação tópica do TPA (YOUNG et al., 1983). O mecanismo preciso pelo qual o TPA
exerce seu efeito é decorrente da ativação da PKC, bem como da ativação seqüencial
da via da MAP quinase, fosfolipase A
2
, indução da expressão da COX-2 e
translocação/ativação da LOX, que por sua vez culmina na síntese e liberação de
diversos mediadores pró-inflamatórios responsáveis pela formação de edema, migração
de leucócitos para a derme e hiperproliferação celular, sendo estas as características
da resposta inflamatória induzida pela aplicação tópica do TPA (MURAKAWA et al.,
71
2006; DE BERNARDIS et al, 1994). A ativação da via da MAPK pela PKC, promove a
ativação de alguns fatores de transcrição nuclear, como o NF-kB e a AP-1, os quais
têm um papel central na regulação da produção de diversas proteínas pró-inflamatórias,
tais como algumas citocinas (IL-1, IL-2, IL-6, IL-8, TNF-α), enzimas pró-inflamatórias
(COX-2, iNOS) e moléculas de adesão (PASCUAL e GLASS, 2006; GLASS e OGAWA,
2006; GARCIA-PIÑERES et al., 2001; SANCHEZ & MORENO, 1999). Enquanto a
fosforilação da PLA
2
pela PKC resulta na liberação do AA seguida da produção de PG e
LT via COX e LOX, respectivamente (WANG et al, 2001; YOUNG et al, 1984).
O aumento dos níveis teciduais dos metabólitos do AA, principalmente a PGE
2
e o
LTB
4
parece ser determinante para que o processo inflamatório se inicie após aplicação
do TPA (MURAKAWA et al, 2006). Também nesse sentido, Nakamura et al. (2003)
sugerem que os metabólitos do AA produzidos via 5-LOX são moléculas fundamentais
para a formação do edema e infiltração leucocitária nesse modelo, considerando que a
PGE
2
contribui no aumento do fluxo sangüíneo através de sua ação vasodilatadora,
enquanto os produtos via LOX (LT) são necessários para o extravasamento plasmático
e conseqüente formação do edema e infiltração leucocitária (YOUNG et al, 1984).
Evidências mais recentes demonstram que a resposta inflamatória do tipo persistente,
característica nesse modelo, decorre da produção seqüencial de mediadores
inflamatórios como os eicosanóides e citocinas, onde a PGE
2
e o TNFα seriam os
principais mediadores edematogênicos (MARAKAWA et al, 2006). Porém, é certo que
os metabólitos do AA são os principais mediadores envolvidos na resposta inflamatória
induzida pelo TPA. Assim, compostos capazes de inibir a cascata do AA se mostram
ativos no modelo de edema de orelha induzido pelo TPA, como efetivamente
demonstrado pelos corticóides, inibidores da PLA
2
e inibidores da COX e/ou LOX
(GÁBOR, 2000). Da mesma forma que esses agentes antiinflamatórios, a aplicação
tópica do EEVS, bem como das frações provenientes desse extrato e do composto
isolado luteolina, também preveniram de forma significativa a formação do edema após
a indução do processo inflamatório pelo TPA. Além disso, a ação antiedematogênica do
EEVS apresentou eficácia comparável ao corticóide dexametasona e ao inibidor não-
seletivo da COX indometacina.
72
Ao contrário da administração tópica, a administração do EEVS por via oral não
promoveu nenhum efeito sobre a inibição do edema induzido por TPA, confirmando
assim o uso tradicional da V. scorpioides por via tópica nas afecções cutâneas. Da
mesma forma, alguns agentes antiinflamatórios não-esteroidais, incluindo a
indometacina, aspirina e piroxicam, demonstraram ser efetivos na inibição do edema
induzido por TPA quando administrados topicamente, porém não apresentaram
nenhum efeito quando administrados por via oral (CARLSON et al., 1985). Esse
resultado pode ser justificado, considerando que a administração tópica direta no sítio
de inflamação permite que uma maior concentração dos compostos responsáveis pela
atividade antiinflamatória seja alcançada no local (GÁBOR, 2000). Assim, parece que a
via de administração é de fundamental importância para se obter uma atividade
antiinflamatória efetiva na pele.
O modelo de edema de orelha induzido pelo TPA também permite avaliar outros
parâmetros inflamatórios importantes envolvidos em muitas doenças cutâneas, como
por exemplo, a infiltração leucocitária no tecido lesado durante uma resposta
inflamatória aguda (WINYARD, 2003; GÁBOR, 2000). Os neutrófilos são os primeiros
tipos celulares a migrarem para a região exposta a um estímulo nocivo. Esse processo
envolve uma interação complexa dos leucócitos com o endotélio através da expressão
de moléculas de adesão de superfície (selectinas, ICAM – molécula de adesão
intercelular, e integrinas) sendo também facilitado pela ação de agentes quimiotáticos,
como a IL-8, C5a e LTB4 (RANG et al, 2007; SHERWOOD e TOLIVER-KINSKY, 2004;
ARNHOLD, 2003). Uma vez no local inflamado, os neutrófilos liberam uma variedade de
substâncias, tais como ROS, mediadores pró-inflamatórios e enzimas proteolíticas,
como a MPO, contribuindo de forma significativa na manutenção do processo
inflamatório (BRADLEY et al., 1982).
A aplicação tópica do TPA resulta no aumento gradual dos níveis da enzima MPO,
de forma que a avaliação da atividade desta enzima é utilizada como indicativo da
presença de leucócitos PMN no tecido inflamado, pois estudos demonstraram uma forte
correlação entre atividade da MPO e número de neutrófilos no tecido (BRADLEY et al,
1982). A inibição da atividade da MPO promovida pela administração de um composto
73
pode ser decorrente da redução do recrutamento de neutrófilos no tecido inflamado, da
inibição direta desta enzima ou ainda da redução da disponibilidade de seu substrato
(H
2
O
2
) (ARNHOLD, 2003). O EEVS e as frações Ace e DCM, promoveram uma
inibição marcante da atividade da MPO, sugerindo que pode estar ocorrendo
diminuição no número de neutrófilos infiltrados no tecido. Essa possibilidade foi
confirmada através da análise histológica e da avaliação da atividade in vitro do EEVS
sobre a MPO. De acordo com os resultados obtidos, pode-se inferir que o EEVS atua
especificamente na inibição da infiltração leucocitária no tecido cutâneo e não exerce
nenhum efeito inibitório direto sobre a atividade da enzima MPO, pelo menos nas
concentrações testadas. A infiltração leucocitária também se revelou diminuída quando
os camundongos foram submetidos ao tratamento com o extrato hidroalcóolico da V.
scorpioides (via oral) no modelo de peritonite induzido por carragenina (DREUX, 2005),
corroborando assim com os resultados obtidos no presente trabalho.
O acúmulo de neutrófilos e de leucócitos mononucleares no tecido cutâneo é uma
característica comum no modelo de edema de orelha induzido por TPA e está
relacionado com o aumento dos níveis de eicosanóides e da expressão da COX-2
(GÁBOR, 2000; SANCHEZ e MORENO, 1999). Assim, segundo Sanchez e Moreno
(1999), compostos que inibem o influxo de leucócitos no tecido também suprimem a
formação do edema e promovem a redução dos níveis de eicosanóides na área
inflamada. O fato do EEVS inibir a migração de neutrófilos é de grande importância,
tendo em vista que o aumento do número de neutrófilos na pele tem grande relação
com algumas doenças inflamatórias cutâneas como algumas dermatites e psoríase
(RANG et al, 2007; SCHAERLI et al., 2004). Diante dos resultados obtidos, a V.
scorpioides se mostra uma planta em potencial para o tratamento de afecções
inflamatórias cutâneas, considerando que esta é capaz de atuar de forma efetiva sobre
dois eventos importantes associados ao processo inflamatório, como o edema e a
infiltração de PMN.
Da mesma forma, as frações Ace e DCM obtidas a partir do EEVS também foram
efetivas na redução da formação do edema de orelha induzido pelo TPA, bem como na
inibição da atividade da MPO, demonstrando assim um efeito antiinflamatório dos
74
compostos presentes nessas frações. No entanto, estudos conduzidos por Pagno et al.
(2006) demonstraram que a fração DCM da V. scorpioides promove um aumento do
influxo de neutrófilos na cavidade peritonial, quando administrada por via intra-
peritonial, no modelo de tumor ascítico de Erlich.
As LS, metabólitos típicos da família Astearacea, foram isoladas a partir da
fração DCM do extrato etanólico da V. scorpioides, especificamente LS da classe dos
hirsutinolídeos e glaucolídeos (BUSKÜHL, 2007; PAGNO et al., 2006). Vários estudos
já demonstraram a capacidade das LS promoverem a inibição da formação do edema
induzido por diferentes agentes flogísticos (adjuvante de Freund, TPA, formalina e
carragenina) em diversos modelos de inflamação, como no modelo de edema de orelha
em camundongos e edema de pata em ratos (VALÉRIO et al., 2007; RECIO, 2000;
HALL et al., 1980; HALL et al., 1979).
O mecanismo de ação no qual várias LS promovem seu efeito antiinflamatório
envolve a inativação do fator de transcrição NF-kB, suprimindo assim a produção de
vários mediadores pró-inflamatórios, como demonstrado pela helenalina, uma LS
protótipo com atividade antiinflamatória (MERFORT, 2003; PAHL, 1999; RUNGELER et
al, 1999). LS isoladas de plantas usadas tradicionalmente como antiinflamatórios,
incluindo a Milleria quinqueflora, Vanillomopsis arborea, Mikania guaco e Mikania
cardifolia, demonstraram diminuir a produção de algumas citocinas pró-inflamatórias,
como a IL-1β, IL-6 e TNF-α, além da proliferação de linfócitos, reforçando as evidências
de que o efeito antiinflamatório e imunosupressor das LS envolvem o fator de
transcrição NF-кB (KOCH et al., 2001). A inibição do NF-кB pelas LS decorre da
alquilação de nucleófilos biológicos por uma reação tipo adição de Michael, sendo o
alvo primário os resíduos de Cys
38
e Cys
120
(cisteína) presentes no domínio de ligação
no DNA do fator de transcrição NF-кB (subunidade P65). A alquilação de ambos os
resíduos de cisteína pela LS torna impossível a interação da subunidade p65 com o
resíduo de Tyr
36
(tirosina) do DNA e assim a transcrição gênica de várias proteínas pró-
inflamatórias (RÜNGELER et al., 1999; KOCH et al., 2001; GARCIA-PINERES et al.,
2001). A transcrição gênica de algumas citocinas quimiotáticas como a IL-8 e a da
MCP-1 (proteína quimiotática de monócitos) são reguladas pelo fator de transcrição NF-
75
кB e algumas LS já demonstraram bloquear a produção destas citocinas de maneira
dose-dependente em células epiteliais (GRASSI et al., 2005). Da mesma forma, Kos et
al. (2006) demonstraram a capacidade de duas LS da classe dos hirsutinolídeos,
isoladas da espécie Vernonia tiflosculosa, promoverem a inibição da produção de IL-8
em estudos in vitro. Assim, a atividade do EEVS e da fração DCM sobre a infiltração de
neutrófilos poderia estar associada com a inibição da síntese desta potente citocina
quimiotática via inativação do NF-кB, o que torna a IL-8 um alvo interessante na
pesquisa de antiinflamatórios e as LS promissoras na intervenção terapêutica da
inflamação. Além disso, a ação das LS presentes na V. scorpioides sobre o NF-кB
também explicaria o efeito antiedematogênico desta planta por inibição da expressão
de outras proteínas pró-inflamatórias chaves no processo inflamatório.
Considerando as vias e os mediadores pró-inflamatórios envolvidos na resposta
inflamatória no modelo de edema de orelha induzido pelo TPA, verifica-se que vários
são os alvos sobre os quais os compostos presentes na V. scorpioides podem exercer
sua ação farmacológica. No entanto, parte da ação antiinflamatória dessa planta
também poderia ser decorrente de um efeito inibitório sobre a síntese de metabólitos do
AA ou bloqueando suas ações. Isso porque dados da literatura sugerem que compostos
como corticóides, inibidores da COX ou 5-LOX e antagonistas do LTB
4
também são
ativos nesse modelo (MURAKAWA et al., 2006; PARK et al., 2001; CARLSON et al.,
1985). Estudos in vitro e in vivo também demonstram que alguns compostos
antioxidantes presentes em plantas, como os flavonóides, apresentam atividade
antiinflamatória marcante, o que tem despertado grande interesse na investigação
destes compostos como agentes antiinflamatórios (HERNANDEZ et al., 2007; CALIXTO
et al., 2003).
A principal propriedade atribuída aos flavonóides é a atividade antioxidante, sendo
essa atividade decorrente da capacidade desses compostos atuarem como
seqüestradores de espécies reativas de oxigênio e de nitrogênio (SADIK et al., 2003).
Além da propriedade antioxidante, vários estudos também demonstraram a ação dos
flavonóides sobre os estágios iniciais do processo inflamatório, como a inibição da
76
infiltração de leucócitos e diminuição da permeabilidade capilar (ALCARAZ e
CARVALHO, 2004).
O EEVS também inclui algumas flavonas em sua composição fitoquímica, como a
luteolina e apigenina. Este grupo de flavonóides demonstraram inibir a produção de
alguns mediadores inflamatórios como a PGE
2
e o NO via diminuição da expressão da
COX-2 e iNOS (KIM et al., 1999). Além disso, a luteolina também promove a inibição da
produção de TNFα, além de ser um potente inibidor da PKC e da ativação de
mastócitos, o que explica o efeito antialérgico desse flavonóide (CALIXTO et al, 2003;
UEDA et al., 2002). Zheng et al. (2005) sugerem que os flavonóides luteolina e
apigenina exercem seus efeitos antiinflamatórios por inibição da atividade da enzima
LOX, em conseqüência de uma ação antioxidante, uma vez que a 5-LOX converte o AA
em leucotrienos através de uma reação de oxidação (lipoxigenação). Assim, muitos
compostos antioxidantes são também caracterizados como inibidores da 5-LOX
(BUCKLE e HEDGECOCK, 1997).
Diante dessas evidências, supõe-se que a atividade antiinflamatória do EEVS
poderia também estar parcialmente associada com a presença de flavonóides, como a
luteolina, uma vez que este flavonóide também demonstrou uma atividade anti-
edematogênica, porém não superior ao EEVS no modelo de edema de orelha induzido
pelo TPA, sugerindo assim um efeito aditivo ou sinérgico de mais de um composto
presente no EEVS.
Nas doenças inflamatórias, os níveis de ROS estão consideravelmente
aumentados, contribuindo para o dano tecidual e a exacerbação do processo
inflamatório (PÉREZ-GARCIA, 1996). Nesse contexto, teve-se por objetivo a avaliação
da atividade antioxidante do EEVS através da determinação indireta da formação de
ROS, onde foi demonstrada pela primeira vez a atividade antioxidante do EEVS e
confirmou a atividade antioxidante do composto isolado luteolina no modelo do TPA. A
capacidade do EEVS em reduzir os níveis teciduais de ROS se mostrou mais efetiva
que a do ácido α-lipóico, um potente agente antioxidante que atua como seqüestrador
de radicais livres, quelante de íons metálicos e regenerador de antioxidantes
endógenos e exógenos, como a ubiquinona, glutationa e ácido ascórbico (HO et al.,
77
2007). No entanto, também é importante considerar que a inibição da infiltração de
leucócitos na derme promovida pelo EEVS poderia ser o mecanismo dominante na
diminuição das ROS, uma vez que os neutrófilos quando ativados são responsáveis por
uma produção bastante intensa destas espécies reativas (NAKAMURA et al, 2003).
As ROS produzidas por via endógena ou exógena tendem a causar um dano
oxidativo no DNA, bem como a desregulação de vias de sinalização celular que estão
envolvidas nos estágios da carcinogênese. A aplicação tópica do TPA na pele de
camundongos resulta em alterações bioquímicas, mudanças nas funções celulares e
alterações histológicas que podem culminar na promoção de tumor cutâneo (HO et al.,
2007), dentre os quais incluem edema, hiperplasia epidérmica, inflamação, proliferação
celular e estresse oxidativo (FURSTENBERGER et al, 1983). Essas alterações são
consideradas marcadores da promoção de tumor na pele, sendo utilizados na avaliação
do potencial quimiopreventivo de agentes contra a tumorogênese (SLAGA, 1984). O
fato do EEVS inibir a formação de ROS durante o processo inflamatório, bem como
atuar sobre outros parâmetros, aponta para a possibilidade da V. scorpioides atuar na
prevenção de doenças relacionadas com um desequilíbrio do estado oxi-redutivo em
nível celular, como por exemplo o câncer de pele. Assim, seria interessante a
investigação da ação quimiopreventiva desta planta em modelos de câncer de pele,
pois vários agentes anticarcinogênicos, estruturalmente distintos, inibem o processo
inflamatório e a promoção do tumor através da diminuição da produção de ROS (PARK
et al., 2003). Além disso, a fração DCM já demonstrou atividade tumoricida sobre o
tumor de Erlich e algumas LS demostraram atividade citotóxica em cultura de células de
melanoma (BUSKÜHL, 2007; PAGNO et al., 2006).
Para auxiliar na investigação sobre o mecanismo pelo qual a V. scorpioides promove
seu efeito antiinflamatório, foram utilizados outros agentes flogísticos que
desencadeiam processos inflamatórios agudos por mecanismos distintos, como o ácido
araquidônico, fenol, capsaicina, histamina e oxazolona.
A aplicação tópica do AA gera uma resposta inflamatória rápida caracterizada por
intenso eritema e edema com pequeno acúmulo de neutrófilos, quando comparado com
a migração celular verificada no modelo de TPA, cujos principais mediadores envolvidos
78
são PGE
2
, LTC
4
e LTD
4
, (CRUMMEY et al., 1987; HUMES et al., 1986; YOUNG et al.,
1983). Porém, Recio et al. (2000) sugerem que o edema induzido pelo AA é
preferencialmente um modelo de triagem para identificação de inibidores da LOX. Os
antiinflamatórios não-esteroidais (AINE) inibem a via da COX, impedindo, portanto a
síntese das PG (BROOKS e DAY, 1991). Assim, o fármaco de referência utilizado neste
modelo experimental foi a indometacina, um AINE cuja ação antiinflamatória está
relacionada com a inibição não-seletiva das isoformas da COX (COX-1 e COX-2) e que
reverte efetivamente o edema induzido pela aplicação tópica do AA, conforme descrito
na literatura (GÁBOR, 2000). Da mesma forma que a indometacina, o EEVS também se
mostrou efetivo na inibição da formação do edema neste modelo.
Segundo Carlson e colaboradores (1985), o modelo de edema de orelha induzido por
TPA e AA são extremamente úteis na detecção in vivo de inibidores da COX/LOX ou 5-
LOX. No entanto, os metabólitos do AA também promovem a degranulação de
mastócitos, de forma que a liberação de histamina contribui parcialmente na formação
do edema neste modelo (CAMP, 1982). Assim, deve-se considerar que o modelo do AA
não é específico para a identificação de compostos que inibem exclusivamente a COX
e/ou LOX, pois outros agentes como antagonistas da histamina e antioxidantes também
reduzem o edema induzido pelo AA (CRUMMEY, 1987). Em geral, os corticóides e as
LS não promovem nenhum efeito no modelo do AA, ao passo que os flavonóides se
mostram ativos nesse modelo (GÀBOR, 2000; RECIO, 2000). Da mesma forma, estudos
demonstram que a atividade da COX-1 não é influenciada por algumas LS e que o modo
de ação pelos quais estes compostos atuam não está diretamente relacionado com o
metabolismo do AA (LYSS et al., 1997; BORK et al., 1997; HWANG et al., 1996; HALL et
al., 1980).
Sendo assim, os resultados obtidos nos modelos de TPA e AA demonstraram a
eficácia da V. scorpioides nos processos inflamatórios cutâneos agudos, além de
fornecerem evidências de que a ação antiinflamatória desta planta provavelmente
envolva a redução dos níveis dos metabólitos do AA no tecido cutâneo. A confirmação
dessas evidências, através da quantificação de PG e LT presentes no tecido, reafirmaria
79
a eficácia da V. scorpioides, considerando o fato do AA e seus metabólitos estarem
implicados na patogênese de várias doenças inflamatórias cutâneas (GÀBOR, 2000).
Outros mediadores, além dos metabólitos do AA, também estão envolvidos na
promoção do edema durante a inflamação, como a histamina, serotonina, bradicinina e
substância P, que agem diretamente em receptores específicos presentes no endotélio
celular e nas vênulas pós-capilares e que também devem ser considerados
(SHERWOOD e TOLIVER-KINSKY, 2004; RECIO et al., 2000). A capsaicina (8-metil-N-
vanilil-6-nonenemida), um alcalóide encontrado na espécie Capsicum annuum L.,
quando aplicada topicamente produz uma resposta inflamatória neurogênica imediata,
caracterizada por vasodilatação arteriolar, aumento de fluxo sangüíneo e conseqüente
formação de edema por extravasamento plasmático, além de sensibilização a dor. Esse
efeito provém da estimulação de neurônios sensoriais de pequeno diâmetro e da
liberação de mediadores neurogênicos da inflamação como a histamina, serotonina e de
neuropeptídeos, seguido da formação de edema cujo pico máximo é atingido até 30
minutos após a aplicação tópica da capsaicina (ZEGARSKA et al., 2006; SHOLZEN et
al, 2003; GÀBOR; 2000; HOLZER, 1991). No entanto, é proposto que o edema induzido
pela capsaicina seja primariamente mediado por neuropeptídeos (substância P, CGRP,
VIP e neurocinina A) liberados após ativação dos neurônios sensoriais, e estes, por sua
vez, estimulam a liberação de histamina e serotonina, sendo estes últimos os
mediadores responsáveis pelo aumento da permeabilidade vascular no tecido inflamado
(INOUE et al., 1993). O EEVS inibiu a formação do edema, apesar dessa inibição ter
sido pouco eficaz. Assim, os compostos presentes no EEVS parecem não agir
diretamente nos receptores nos quais a capsaicina promove seu efeito (receptores
TRPV1). Alguns estudos demonstram que o edema induzido pela aplicação tópica da
capsaicina é inibido por antagonistas da histamina e serotonina, mas não por inibidores
da COX, como a indometacina. Por outro lado, assim como a dexametasona
(antiinflamatório esteroidal), clorfeniramina (bloqueador dos receptores H
1
) e metisergida
(antagonista de receptores 5-HT), o EEVS promove a redução do edema tanto no
modelo da capsaicina, quanto no modelo do AA, porém com eficácias diferentes
(GÁBOR, 2000).
80
Para uma melhor caracterização das propriedades farmacológicas da V. scorpioides
foi avaliado o efeito do EEVS sobre outros modelos de inflamação cutânea como o
modelo de edema de orelha induzido pelo fenol, histamina e pela oxazolona, que
mimetizam a dermatite de contato irritativa, reações alérgicas do tipo imediata e a
dermatite de contato alérgica (hipersensibilidade do tipo tardia), respectivamente.
O fato do EEVS inibir o edema induzido por um agente irritante como o fenol
demonstra a possível eficácia desse extrato no tratamento da dermatite de contato frente
a agentes irritantes. Em resposta a estímulos exógenos, como o fenol, os queratinócitos
produzem mediadores químicos importantes na irritação primária de contato, incluindo
citocinas associadas a propriedades pró-inflamatórias, tais como IL-1 α, TNF- α e IL-8
(LIM et al., 2004; WILMER et al., 1994). Um dos mecanismos pelos quais o fenol
promove a irritação cutânea seria a ruptura da membrana plasmática dos queratinócitos
por efeito direto, resultando na liberação da IL-1α pré-formada, além de outros
mediadores inflamatórios como os metabólitos do AA e ROS. As citocinas pró-
inflamatórias são induzidas nesse modelo por um mecanismo distinto daquele
observado no modelo de inflamação cutânea induzido pelo TPA, onde a indução das
citocinas ocorre via ligação a receptores específicos, através de vias dependentes da
PKC, nas quais envolvem fatores de transcrição nuclear (WILMER et al., 1994). No
entanto, apesar da resposta inflamatória ser desencadeada por diferentes vias, ambos
os modelos compartilham do envolvimento dos metabólitos do AA e ROS na resposta
inflamatória instalada. Assim, esses dados sugerem que o EEVS pode estar exercendo
sua ação antiinflamatória por atuar sobre esses mediadores, como eficientemente
demonstrado nos modelos do AA e TPA, e pela sua ação antioxidante.
Os mastócitos desencadeiam reações imediatas do tipo alérgica em resposta a
diversos alérgenos, através da interação dos seus receptores de superfície com a IgE,
conduzindo a degranulação e liberação de diversos mediadores vasoativos, pró-
inflamatórios e nociceptivos, como a histamina, citocinas (IL-6, IL-8, IL-13),
prostaglandinas (PGD
2
), leucotrienos (LTC
2
), TNF-α e o fator de crescimento do
endotélio vascular (VEGF) (THEOHARIS et al., 2007). A histamina causa vasodilatação
e um aumento na permeabilidade vascular, promovendo uma resposta edematogênica
81
em poucos minutos (BRAND et al., 2002). Além dessas ações, a histamina ainda
estimula fibras nervosas sensitivas através de mecanismos H1-dependentes que resulta
em prurido. Uma das principais funções fisiopatológicas da histamina é a sua ação como
mediador das reações de hipersensibilidade do tipo I, como a urticária (RANG et al,
2007; BRAND et al., 2002).
A reação de hipersensibilidade imediata desenvolve-se após a degranulação dos
mastócitos e liberação da histamina. A aplicação tópica prévia do EEVS promoveu a
inibição do edema induzido pela histamina. Da mesma forma, o composto
sesquiterpênico α-humuleno, extraído do óleo essencial da Cordia verbanacea e que
também está presente no óleo essencial da V. scorpioides, foi capaz de diminuir a
formação do edema de pata induzido pela injeção intraplantar da histamina em
camundongos (FERNANDES et al., 2007). Apesar do EEVS ter apresentado um efeito
antiedematogênico moderado na resposta inflamatória cutânea da histamina quando
comparado com os resultados obtidos no modelo do TPA, AA e fenol, este extrato
poderia ainda ser útil no alívio de alguns sintomas da hipersensibilidade imediata, como
o prurido presente em algumas situações como picadas de insetos, re-exposição de
contato com alérgenos, como por exemplo, alguns oriundos de plantas ou até mesmo o
níquel. No entanto, para tal indicação ainda é necessário a realização de experimentos
que confirmem sua atividade anti-pruriginosa.
A dermatite de contato alérgica pode ser induzida por vários alérgenos e alguns
destes são utilizados como ferramentas farmacológicas experimentais, como a
oxazolona e o dinitrofluorobenzeno (DNFB). O modelo de edema de orelha induzido pela
oxazolona mimetiza a reação de hipersensibilidade de contato do tipo tardia (dermatite
de contato), caracterizada por uma resposta imunológica mediada por células,
acompanhada de infiltração celular e liberação de diversas citocinas (RANG et al, 2007;
ABBAS e LICHTMAN, 2005). Duas fases dissociadas temporo-espacialmente são
necessárias para atingir uma reação de hipersensibilidade máxima: a fase de
sensibilização e a fase efetora. A fase de sensibilização ocorre no primeiro contato da
pele com a oxazolona e é a fase responsável pela expansão das células T no linfonodo.
A oxazolona aplicada topicamente penetra na epiderme onde é captada pelas células
82
apresentadoras de antígenos (células de langerhans), que migram para os linfonodos de
drenagem e apresentam as moléculas de MHC associadas à oxazolona aos precursores
de células T específicas (linfócitos T CD
4
e CD
8
imaturas), onde estas são ativadas e
expandem-se no linfonodo sob influência da IL-12, sendo a partir desse momento
designadas de células T “sensibilizadas” (RANG et al, 2007; TUCKERMANN et al, 2007;
HENNINO et al., 2005). A fase efetora ocorre após o contato subseqüente com a
oxazolona, que induz a produção de quimiocinas, ativação de células endoteliais e de
mastócitos, que resultam na ativação da microvasculatura, permitindo a infiltração dos
leucócitos nas primeiras 2 horas. Em resposta a algumas citocinas, os linfócitos T
sensibilizados migram para a derme e são re-estimulados pelas células de langerhans
residentes, onde passam a secretar mediadores pro-inflamatórios que promovem uma
segunda infiltração maciça de leucócitos (TUCKERMANN et al, 2007; HENNINO et al.,
2005). Algumas citocinas secretadas pelos linfócitos T ativados tais como a IL-2, TNF-β
e IFNγ promovem a ativação dos macrófagos e estes, por sua vez, estimulam a
inflamação aguda por meio da secreção de outras citocinas, principalmente TNF-α e IL-
1, quimiocinas, PG e LT (ABBAS e LICHTMAN, 2005; DEBENEDICTS et al., 2001).
Assim, a sensibilização dos camundongos com a aplicação repetida da oxazolona
produz uma hipersensibilização por contato caracterizada por extravasamento
plasmático (edema), hiperplasia epidérmica intensa, infiltração de células inflamatórias
como monócitos, granulócitos e macrófagos, além do aumento da população de
linfócitos T (CD
8
+
) nos linfonodos (SHIN, 2005; FUJII et al., 2002; WANG et al., 2000).
Os animais submetidos ao tratamento com o EEVS em ambas as fases de exposição
a oxazolona apresentaram uma redução dos parâmetros inflamatórios avaliados, como o
edema e a infiltração de leucócitos, bem como o tratamento do EEVS somente na fase
efetora também se mostrou efetivo em relação a formação do edema. No entanto, o
tratamento dos animais somente na fase de sensibilização com o EEVS, assim como a
dexametasona, não reverteu o processo inflamatório que é desencadeado na fase
efetora, bem como não reduziu o número de linfócitos T CD
4
e CD
8
, demonstrando que o
EEVS não apresenta uma ação imunosupressora, provavelmente por não alterar a
produção ou as ações de citocinas essenciais envolvidas no processo de apresentação
83
de antígenos, bem como na expansão e diferenciação dos linfócitos T. Os resultados
obtidos pelo tratamento do EEVS nesse modelo se assemelham com a ação dos
corticóides, onde Tuckermann et al. (2007) assumem que a fase efetora é responsiva ao
tratamento com os glicocorticóides, pois o tratamento nessa fase preveniu efetivamente
a resposta inflamatória, enquanto estes agentes não alteraram essa resposta na fase de
sensibilização no modelo de hipersensibilidade de contato. É provável que o EEVS
promove um efeito essencialmente antiinflamatório nesse modelo via supressão de
citocinas, quimiocinas, expressão de moléculas de adesão ou outros mediadores
envolvidos na resposta inflamatória desencadeada após a fase efetora. A ação coletiva
destes mediadores na resposta imune mediada por células promove uma inflamação
local com uma infiltração intensa de neutrófilos (ABBAS e LICHTMAN, 2005). Assim, a
redução da infiltração de neutrófilos por ação do EEVS pode estar diretamente
relacionada com a reversão da resposta inflamatória verificada, pois os neutrófilos
ativados presentes no foco inflamatório contribuem significativamente na liberação de
alguns mediadores inflamatórios (LT, PG e elastase humana leucocitária) tanto nas
doenças essencialmente inflamatórias como nas reações de hipersensibilidade cutânea.
O bloqueio das enzimas responsáveis pela síntese de alguns mediadores inflamatórios
também explica a atividade antiinflamatória dos extratos de muitas plantas que são
utilizadas na medicina popular com a finalidade de tratar doenças inflamatórias cutâneas
(PRIETO et al., 2003). No entanto, apesar dos níveis das PG e LT se apresentarem
aumentados após a fase efetora, demonstrando assim o envolvimento desses
mediadores na resposta inflamatória desencadeada nesse modelo, inibidores seletivos
das enzimas COX e 5-LOX não o revertem, ao contrário dos corticóides que suprimem o
edema e reduzem os níveis desses mediadores lipídicos (BAS et al., 2006; MEURER et
al., 1988). De qualquer forma, diante dos resultados obtidos, o EEVS demonstra que
também é capaz de inibir a resposta inflamatória (efetora) mediada pelo sistema imune,
como as dermatites alérgicas observadas em humanos, e não somente inibir a resposta
inflamatória por irritação imediata, como verificado nos modelos inflamação aguda (FUJII
et al., 2002).
84
A ação do EEVS sobre processos inflamatórios cutâneos crônicos foi avaliada
através do modelo de aplicação múltipla do óleo de cróton. Segundo Stanley et al.
(1991), este consiste num modelo mais relevante para avaliação de compostos
antiinflamatórios do que o modelo de TPA agudo, considerando que a forma de
tratamento dos compostos a serem testados se assemelha ao tratamento clínico usual
dos medicamentos antiinflamatórios, que é justamente a sua utilização após o
estabelecimento do processo inflamatório. Assim, este modelo permite avaliar a
atividade de compostos capazes de promover a resolução de um processo inflamatório
crônico (ALFORD et al., 1992). Como discutido anteriormente, ésteres de forbol
presentes no óleo de cróton, como o TPA, ativam a PKC, aumentam a permeabilidade
vascular, induzem a síntese de metabólitos do AA e induzem a expressão da COX-2, IL-
1β, TNF-α e da molécula de adesão ICAM-1 (CHI et al, 2003; GUPTA et al., 1989; DE
YOUNG et al., 1989). A aplicação múltipla do óleo de cróton promove uma reação
inflamatória persistente acompanhada do aumento do peso das orelhas, intensa
migração de neutrófilos, macrófagos e linfócitos T (CD
4
+
e CD
8
+
) e hiperproliferação
epidérmica (acantose), aproximando este modelo das características presentes em
algumas doenças inflamatórias crônicas da pele (STANLEY et al.,1991).
Antiinflamatórios esteroidais (corticóides) e inibidores da LOX são ativos nesse modelo,
enquanto os inibidores da COX, como a indometacina, se mostram inativos (GREEN e
SHUSTER, 1987). Da mesma forma que os corticóides, a aplicação tópica do EEVS foi
capaz de suprimir o edema quando o processo inflamatório já estava instalado, sendo
que esse efeito foi confirmado na análise histológica através da verificação da espessura
total da pele e da redução na formação de acantoses.
A inflamação aguda é uma resposta rápida frente a diversos agentes ou estímulos
que envolvem o recrutamento e ativação de neutrófilos. No entanto, quando o estímulo
não é eliminado o processo inflamatório persiste, tornando-se crônico. A principal
característica da transição do processo inflamatório agudo para crônico é a mudança na
composição do infiltrado leucocitário, onde os neutrófilos são substituídos por células
mononucleares fagocíticas e linfócitos T (POBER e SESA, 2007). Alford et al. (1992)
demonstraram no modelo de aplicação múltipla do TPA que a mudança do perfil
85
leucocitário ocorre a partir do décimo dia, onde ocorre um declínio do número de PMN e
a prevalência de mononucleares. A redução da migração de macrófagos, neutrófilos e
linfócitos para o sítio de inflamação por um determinado composto é importante na
reversão do processo inflamatório crônico. A aplicação tópica do EEVS demonstrou
exercer seu efeito sobre a migração de PMN nesse modelo de inflamação crônica da
pele, assim como na resposta inflamatória aguda. Porém, ao contrário da
dexametasona, esse efeito não foi reproduzido em relação aos leucócitos
mononucleares, baseando-se no estudo da atividade da NAG. A NAG é uma enzima
lisossômica produzida por monócitos ativados (macrófagos) e é utilizada como um
indicador da infiltração de dessas células nos sítios inflamatórios (BAILEY, 1988). Ainda
que os PMN não sejam os principais tipos celulares envolvidos na resposta inflamatória
crônica, a redução do número dos PMN no tecido promovido pelo tratamento com o
EEVS pode contribuir na resolução da resposta inflamatória, considerando que os
neutrófilos liberam radicais livres, mediadores inflamatórios e enzimas proteolíticas
(ARNHOLD, 2003; BRADLEY et al., 1982). Em certas afecções cutâneas crônicas, como
na psoríase, existe uma infiltração marcante de neutrófilos. Os mediadores liberados
pelos neutrófilos são responsáveis pela sustentação de um processo inflamatório agudo
na placa psoriática, através da ativação de queratinócitos e linfócitos T (TERUI, 2000).
Nesse contexto, a investigação da ação do EEVS nesse tipo de condição cutânea seria
de grande interesse.
A quantificação dos leucócitos totais presentes no tecido das orelhas tratadas
cronicamente mostrou que ocorre uma redução semelhante destas células nos grupos
tratados com o EEVS e dexametasona. Esse resultado estaria em desacordo com os
resultados obtidos na avaliação da atividade enzimática da MPO e NAG, onde a
diferença observada entre os grupos foi mais pronunciada. Assim, era esperada uma
redução mais intensa no número de leucócitos infiltrados do grupo tratado com a
dexametasona, considerando que um dos mecanismos de ação dos corticóides envolve
a regulação negativa de genes de múltiplas proteínas inflamatórias, como citocinas
quimiotáticas e moléculas de adesão (SCHIMMER e PARKER, 2006; BARNES, 1998).
No entanto, Alford et al. (1992) demonstraram que o glicocorticóide hidrocortisona afeta
86
de modo diferente os tipos celulares presentes no tecido, de forma que no modelo de
inflamação crônica induzida pela aplicação múltipla de TPA em orelhas de
camundongos, o número de PMN e linfócitos T foram significativamente reduzidos pela
ação tópica da hidrocortisona, enquanto o número de macrófagos não foi alterado por
esse tratamento. Essas evidências tornam os achados desse trabalho consistentes, pois
o EEVS inibe a migração dos neutrófilos, enquanto a dexametasona inibiu
preferencialmente a migração de neutrófilos em relação aos macrófagos. Assim, o
balanço final de leucócitos presentes na derme não seria tão pronunciado entre os
grupos tratados com o EEVS e com a dexametasona, conforme verificado nos
resultados obtidos.
O tratamento com o óleo de cróton na pele de camundongos resulta numa resposta
pleiotrópica envolvendo, além da formação do edema e de uma intensa infiltração
leucocitária, a alteração do crescimento e diferenciação dos queratinócitos. A resposta
hiperproliferativa nesse modelo assemelha-se com algumas doenças de pele como a
psoríase (GÁBOR, 2000). A análise histológica demonstrou que o tratamento repetido
com o EEVS inibe de forma efetiva a hiperproliferação epidérmica, como demonstrada
pela ausência de acantose. Os níveis da IL-1β e TNF-α, além da expressão da COX-2,
estão consideravelmente aumentados na inflamação crônica induzida pela aplicação
múltipla de TPA em orelha de camundongos (CHI et al, 2003; GUPTA et al., 1989). As
citocinas inflamatórias IL-1β e TNF-α promovem o aumento da expressão do fator de
crescimento de queratinócitos (KGF) nos fibroblastos. Esses fatores de crescimento,
nomeadamente o KGF-1 e KGF-2, quando secretados pelos fibroblastos estimulam a
proliferação e diferenciação dos queratinócitos (BROUGHTON et al, 2006). A síntese de
PGE
2
na epiderme também está envolvida no processo de hiperproliferação epidérmica
e este processo pode ser prevenido por inibidores da COX, como a indometacina
(SCHOLZ et al, 1995). Além disso, a inibição da síntese de algumas citocinas, como a
IL-1 e dos metabólitos do AA, são alguns dos mecanismos pelos quais os
glicocorticóides exercem seus efeitos antiinflamatórios (TOWBIN et al., 1995). Os
compostos presentes no EEVS também podem estar atuando através de mecanismos
semelhantes, como por exemplo, LS que já tem sua atividade sobre a inibição do NF-
87
kB. A inibição desse fator de transcrição pelas LS presentes no EEVS poderia
promover a diminuição da expressão de vários mediadores inflamatórios, entre eles a
IL-1 e a enzima COX-2, resultando na reversão da acantose, edema e infiltração
leucocitária. O tratamento com substâncias antioxidantes também foi capaz de reduzir a
citopatologia da pele psoriática, provavelmente por inibição da síntese de LT. Além
disso, o efeito do uso tópico do inibidor da 5-LOX lonapaleno, em nível clínico, se
mostrou efetivo na resposta inflamatória presente na psoríase, provavelmente por
inibição da síntese do LTB
4
(BLACK et al., 1990; LASSUS e FORSSTROM, 1985).
Assim, a efetividade do EEVS nesse modelo poderia também ser resultado da sua ação
sobre a síntese dos metabólitos do AA, considerando que a PGE
2
e LTB
4
são
mediadores relevantes da patologia dos processos inflamatórios hiperproliferativos.
A avaliação da estabilidade do extrato de uma planta na qual a atividade
farmacológica está sendo investigada é de extrema importância, pois existe a
necessidade de garantir a confiabilidade dos resultados gerados bem como identificar
plantas que possuam compostos com atividade farmacológica que se degradam
facilmente, o que limitaria o seu desenvolvimento como produto. A estabilidade do EEVS
se manteve durante o período em que foram realizados os experimentos, uma vez que a
atividade antiedematogênica desse extrato permaneceu constante, demonstrando que
os compostos responsáveis por tal atividade não se degradaram nas condições no qual
o EEVS foi armazenado.
Da mesma forma que algumas plantas são amplamente utilizadas na indústria
cosmética, devido as suas propriedades antiinflamatórias e/ou antioxidantes, tais como a
Carapa guianensis (Andiroba), Camellia sinensis (Chá verde), Glycyrrhiza glabra
(Alcaçuz), Matricaria recutita (Camomila), Calendula officinalis (Calêndula), etc
(DATTNER, 2004), os resultados obtidos nesse trabalho também tornam a V.
scorpioides uma planta interessante a ser utilizada no desenvolvimento de formulações
dermocosméticas destinadas ao tratamento de diversas condições dermatológicas. No
entanto, estudos adicionais são necessários para elucidar o mecanismo de ação pelo
qual essa planta exerce seus efeitos, bem como estudos que comprovem a segurança
do seu uso tópico em humanos.
CONCLUSÕES
89
6. CONCLUSÕES
Os resultados observados no presente trabalho demonstraram que:
• O EEVS, diferentes frações e o composto isolado luteolina apresentaram atividade
antiedematogênica no modelo de inflamação cutânea aguda induzida pelo TPA,
sugerindo que o EEVS possui mais de um composto responsável por tal atividade
quando administrado topicamente;
• O EEVS não apresentou ação antiedematogênica quando administrado por via oral,
sugerindo uma melhor ação quando aplicado topicamente;
• O EEVS e a luteolina foram capazes de reduzir a formação das ROS no modelo de
edema de orelha induzido pelo TPA, demonstrando uma possível ação antioxidante
desse extrato que contribui para sua ação antiinflamatória;
• O EEVS e fração DCM inibiram a atividade da MPO no modelo de edema de orelha,
indicando a presença de um ou mais compostos capazes de atuar sobre a migração
leucocitária;
• A formação do edema de orelha induzido pelo AA foi inibida pelo EEVS, indicando
que o mecanismo de ação pelo qual o EEVS promove seu efeito antiedematogênico
possivelmente envolva a redução dos níveis dos metabólitos do AA no foco
inflamatório;
• O EEVS promove uma inibição moderada do edema presente na inflamação
neurogênica, conforme verificado no modelo de edema induzido pela capsaicina;
90
• O EEVS foi capaz de inibir a formação do edema durante a resposta inflamatória
causada por um agente irritante (fenol), indicando uma possível eficácia no
tratamento da dermatite de contato irritativa;
• O EEVS preveniu a formação de eventos importantes da resposta inflamatória, como
o edema na hipersensibilidade imediata, edema e infiltração de PMN na
hipersensibilidade tardia, conforme demonstrado do modelo de edema induzido pela
histamina e pela oxazolona, sugerindo assim uma possível eficácia em condições
dermatológicas como processos alérgicos e dermatite de contato alérgica;
• O EEVS parece não exercer nenhuma ação sobre a fase de sensibilização no
modelo de hipersensibilidade tardia, sugerindo que esse extrato não possui ação
imunosupressora e que a reversão da resposta inflamatória nesse modelo seja
decorrente da inibição de mediadores inflamatórios envolvidos na resposta inata;
• O EEVS foi eficaz na reversão de vários parâmetros inflamatórios importantes
presentes na inflamação crônica, tais como edema, migração de PMN e
hiperproliferação celular, porém parece não atuar sobre a migração de leucócitos
mononucleares durante o processo inflamatório cutâneo crônico;
Em resumo, os resultados observados nos diferentes modelos de inflamação cutânea
utilizados no presente trabalho, sugerem que o efeito antiinflamatório do EEVS pode ser
o resultado de um efeito sinérgico decorrente de vários compostos, não-relacionados
estruturalmente, que atuam em alvos distintos de forma a promover a reversão das
respostas inflamatórias agudas e crônicas, bem como daquelas desencadeadas na
resposta de hipersensibilidade imediata e tardia. Nesse contexto, o presente trabalho
fornece evidências científicas que validam o uso popular por via tópica da V. scorpioides
no tratamento de processos inflamatórios cutâneos, bem como demonstra o potencial do
extrato bruto desta planta para o desenvolvimento de um novo antiinflamatório tópico.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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4
+
Th1 and CD
8
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Farmacognosia: da planta ao medicamento. 2. ed. Porto Alegre/Florianópolis:
Universidade/UFRGS/UFSC,2000.
ANEXOS
FLUXOGRAMA DA OBTENÇÃO DAS FRAÇÕES DO EXTRATO ETANÓLICO DA
Vernonia scorpioides
E. Bruto
Partição liq -liq
Hexano I
16,5g
CH2Cl2 I
10,96g
ETOAc I
10,84g
Fase Aq
D - Hexano II
D - ETOAc II
4,6 g
D - MeOH II
~4g
Cromatografia Sílica Recuperada Cromatografia Sílica Recuperada
A - Hexano II
A - CH2Cl2 II
1,27g
A - ETOAc II
5,69g
A- MeOH II
~5g
D - CH2Cl2 II
3g
Junção Acetato / Acetato III
COLETA NOVEMBRO / 2005
2ª Maceração
FLUXOGRAMA DA OBTENÇÃO DO COMPOSTO ISOLADO LUTEOLINA
Junção Acetato / Acetato III
J-DCM
J-DCM/AC (4,14g)
J-AC/MeOH
Cromatografia em sílica
DA
DA-1 DA-2
DA-3
DA-4
DA-5
Cromatografia em sílica
Cromatografia em sílica
Luteolina
Junção Acetato / Acetato III
J-DCM
J-DCM/AC (4,14g)
J-AC/MeOH
Cromatografia em sílica
DA
DA-1 DA-2
DA-3
DA-4
DA-5
Cromatografia em sílica
Cromatografia em sílica
Luteolina
O
OH
OH
O
OH
OH
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