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FILIPE FEDOZZI
Caracterização protéica do micro-ambiente uterino durante
o período crítico em bovinos
Pirassununga
2008
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FILIPE FEDOZZI
Caracterização protéica do micro-ambiente uterino durante
o período crítico em bovinos
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Reprodução e
Produção Animal da Faculdade de
Medicina Veterinária e Zootecnia da
Universidade de São Paulo para obtenção
do título de Mestre em Medicina
Veterinária
DEPARTAMENTO:
Reprodução e Produção Animal
ÁREA DE CONCENTRAÇÃO:
Reprodução e Produção Animal
ORIENTADOR:
Prof. Dr. Mário Binelli
Pirassununga
2008
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Autorizo a reprodução parcial ou total desta obra, para fins acadêmicos, desde que citada a fonte.
DADOS INTERNACIONAIS DE CATALOGAÇÃO-NA-PUBLICAÇÃO
(Biblioteca Virginie Buff D’Ápice da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo)
T.1963 Fedozzi, Filipe
FMVZ Caracterização protéica do micro-ambiente uterino durante o período
crítico em bovinos / Filipe Fedozzi. – Pirassununga: F. Fedozzi, 2008
.
113 f. : il.
Dissertação (mestrado) - Universidade de São Paulo. Faculdade de
Medicina Veterinária e Zootecnia. Departamento de Reprodução e
Produção Animal, 2008.
Programa de Pós-Graduação: Reprodução e Produção Animal.
Área de concentração: Reprodução e Produção Animal.
Orientador: Prof. Dr. Mário Binelli.
1. Ambiente uterino. 2. Proteínas. 3. Eletroforese bidimensional.
4. Prenhez. 5. Bovino. I. Título.
FOLHA DE AVALIAÇÃO
Nome: FEDOZZI, Filipe
Título: Caracterização protéica do micro-ambiente uterino durante o período crítico
em bovinos
Dissertação apresentada ao Programa
de Pós-Graduação em Reprodução e
Produção Animal da Faculdade de
Medicina Veterinária e Zootecnia da
Universidade de São Paulo para
obtenção do título de Mestre em
Medicina Veterinária
Data:____/____/____
Banca Examinadora
Prof. Dr. _________________________ Instituição: __________________
Assinatura: _________________________ Julgamento: __________________
Prof. Dr. _________________________ Instituição: ___________________
Assinatura: _________________________ Julgamento: __________________
Prof. Dr. _________________________ Instituição: ___________________
Assinatura: _________________________ Julgamento: __________________
DEDICATORIA
Ao meu pai,
Modesto Fedozzi
Com todo amor e gratidão, pelo incentivo em todas as horas que precisei,
pelos conselhos e carinho nos momentos de difíceis decisões em minha vida, pela
participação constante em minhas alegrias e tristezas, pelo esforço e dedicação que
tornou possível a realização dessa etapa e principalmente, pelo que você sempre foi
e é.
A minha Família (Mãe, irmã e sobrinho),
Elisabete Mazero, Nathalia Fedozzi e João Victor.
Pela personalidade, pela sinceridade, pelo carinho e amor, pelo exemplo de
serem batalhadores e conquistadores na vida e sobre tudo por depositar em mim, a
confiança dessa etapa.
A minha noiva,
Marina DeNadai Bonin
Pela pureza e simplicidade, pelo amor, carinho e ternura, pela coragem e
valentia que sempre demonstra nos momentos difíceis, pela vontade de vencer e
viver de maneira digna, pela força e confiança que deposita em mim, por saber ser
mulher e nobre em minha vida.
AMO VOCÊS,
MEU ETERNO RECONHECIMENTO
E GRATIDÃO.
AGRADECIMENTOS
Ao Prof. Dr. Mário Binelli pela orientação, dedicação, ensinamentos e
profissionalismo.
À Universidade de São Paulo e à Faculdade de Medicina Veterinária e
Zootecnia, especialmente ao Departamento de Reprodução Animal.
Agradeço a CAPES pelo apoio financeiro na qual permitiu meu envolvimento
de maneira integral com o trabalho na área de pesquisa.
A Prefeitura do Campus Administrativo de Pirassununga pelo apoio e cessão
dos animais
A Profa. Dra. Erica Zimberknopf pela co-orientação, amizade e oportunidade
que me proporcionou e a confiança que em mim depositou.
Ao Prof. Dr. Rubens Paes de Arruda pela amizade e ensinamentos, assim
como a disponibilização do sêmen e materiais utilizados nos experimentos.
Ao Prof. Dr. Ed Hoffmann Madureira pelas longas conversas orientadoras e
materiais cedidos para realização dos experimentos.
A Prof. Anneliese de Souza Traldi pela orientação e companheirismo.
Aos Professores do Departamento de Reprodução animal da FMVZ/USP pelos
ensinamentos e ajuda prestada.
A Comissão de Pós-graduação pela ajuda e confiança no meu trabalho.
A Harumi, secretária da Pós-graduação do Departamento de Reprodução
Animal por toda atenção oferecida.
A Isabel, secretária do VRA-USP/Pirassununga pela atenção e ajuda.
À equipe de pesquisa do LFEM Cláudia Maria Bertan Membrive, Vanessa
Marques, Marcelo Cardoso de Lima, André Freire, Fabiana Bressan, Rafael S.
Bisinotto, Bruna Ibiapina, Eduardo Pontes, Adriano Siqueira, Mariana Giessetti,
Claudia Niemeyer por toda ajuda oferecida.
A amiga Prof.ª Cláudia Maria Bertan Membrive por toda ajuda e ensinamentos
prestados.
Ao amigo Marcelo Cardoso de Lima pelo apoio e ajuda na realização do
experimento
Aos meus amigos e irmãos, Silas e André Freire, por todos esses anos de
amizade e companheirismo, juntos independente de tudo.
Aos amigos da pós-graduação pela amizade, carinho, incentivo e colaborações
constantes e pelo convívio diário, compartilhando alegrias e tristezas, tornando a
vida na pós-graduação mais familiar. André Furugem, José Rodrigo Pimentel,
Fernando Pardo, Fernando Braga, Fabian, Raquel Fernandes e Cláudia Fernandes
Raphael.
Aos funcionários da prefeitura do campus administrativo de Pirassununga e da
FMVZ, especialmente ao Fernando Schalch.
Aos funcionários do CBRA Marcio, José Maria, João, Carlinhos, Edna e
Creusa.
Aos funcionários do Abatedouro Escola da prefeitura do Campus Administrativo
Élcio, Mauricio, Dito Beloni, Dito Rodrigues e Dori por toda colaboração e amizade
construída durante o experimento.
Ao Centro Paulista de Desenvolvimento Farmacotécnico pela doação de
hormônios e fármacos, necessários para a realização dos experimentos.
Ao Dr. Marcelo Roncoletta pelos ensinamentos e auxilio durante as analises do
experimento.
Ao Prof. Greene e sua equipe pela ajuda nas analises do experimento.
Ao Prof. Paulo Sobral e sua equipe por ceder seu laboratório e seus
equipamentos.
Ao Prof. Marcelo de Cerqueira César e as técnicas do laboratório Mirella e
Alessandra, pela enorme ajuda e apoio na conclusão do experimento.
À Profa. Dra. Maria Angélica Miglino do Departamento de Anatomia dos
Animais Domésticos e Silvestres FMVZ-USP pelo apoio cientifico.
Aos animais pelo conhecimento e desenvolvimento científico que me
proporcionou.
Enfim, a todos que têm colaborado de maneira direta ou indireta para a
realização deste trabalho, dedico meus sinceros agradecimentos.
RESUMO
FEDOZZI, F. Caracterização protéica do micro-ambiente uterino durante o
período crítico em bovinos. [Characterization of the protein profile of the uterine
environment during the critical period in cattle]. 2007. 113 f. Dissertação (Mestrado
em Medicina Veterinária) - Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia,
Universidade de São Paulo, São Paulo, 2008.
Em bovinos, o sucesso no estabelecimento da gestação depende de interações
entre o concepto e o útero. Tais interações ocorrem através de moléculas presentes
no ambiente uterino. Falhas nesse processo causam 30-40% de perdas de
gestação. As proteínas são constituintes desse ambiente e possuem um importante
papel nesse processo. Objetivou-se na presente dissertação caracterizar o perfil
protéico do ambiente uterino de fêmeas bovinas, ciclando ou prenhes, durante o
período crítico, utilizando eletroforese bidimensional. O objetivo específico foi
comparar a composição protéica de lavados uterinos obtidos in vivo, por sonda de
folley ou post-mortem no dia 18 após o estro de vacas não inseminadas ou
gestantes. Para a obtenção das amostras, 48 fêmeas bovinos tiveram seu ciclo
estral sincronizado e foram alocadas aleatoriamente para receberem lavagens in
vivo por sonda de folley (12 inseminadas e sete não inseminadas) ou para
receberem lavagens post-mortem (12 inseminadas e cinco não inseminadas) no dia
18 após o estro. Após a coleta, os lavados foram processados e submetidos à
eletroforese bidimensional. Os géis foram analisados utilizando o programa Image
Master-2D ELITE V. 4.01 (GE Healthcare) para determinação do ponto isoelétrico
(PI) e peso molecular relativo (PMR) das proteínas nos diferentes grupos e análise
da densidade óptica. Foram selecionadas 178 proteínas presentes nos lavados. Em
relação à distribuição das proteínas de acordo com o ponto isoelétrico, 74%
(132/178) apresentaram PI entre 5,5 e 8, em relação ao peso molecular, 44%
(79/178) das proteínas possuíam PMR menor que 50KDa enquanto 54% (95/178)
entre 50 e 100KDa. Nos lavados realizados por sonda de folley (FC ou FP) foram
selecionadas 151 proteínas, sendo 96 nos lavados de animais cíclicos e 86 nos
prenhes. Os lavados realizados post-mortem (PMC ou PMP) apresentaram apenas
54 proteínas, das quais 24 estiveram presentes nos lavados PMC e 36 nos lavados
PMP. Em relação ao estado reprodutivo 115 proteínas foram encontradas nos
lavados dos animais cíclicos (FC ou PMC), enquanto 104 proteínas foram
selecionadas nos lavados de animais prenhes (FP e PMP).
Entre os lavados realizados por sonda de folley (FC e FP) 31 proteínas foram
comuns entre os estados, enquanto entre os lavados realizados post-mortem (PMC
e PMP) apenas seis proteínas estiveram presentes em ambos os lavados. Nos
lavados realizados em animais ciclando (FC e PMC) cinco proteínas estiveram
presentes em ambos os tipos de lavados, enquanto nos lavados realizados em
animais prenhes (FP e PMP) 18 proteínas foram comuns em ambos os tipos de
lavado. Entre os lavados FC e PMP ou FP e PMC, 15 e 6 proteínas,
respectivamente, foram comuns. As proteínas presentes exclusivamente nos
lavados de vacas prenhes, possivelmente estão envolvidas no diálogo materno-
embrionário durante o processo de estabelecimento da gestação. Proteínas
detectadas exclusivamente nos lavados obtidos via sonda de folley podem ser
devidas ao influxo de proteínas do soro sanguíneo em resposta à manipulação do
trato reprodutivo durante a obtenção dos lavados. Esperava-se uma maior
efetividade dos lavados realizados post-mortem em relação aos realizados por
sonda de folley. Entretanto os lavados obtidos por sonda de folley foram melhores
por identificar um maior numero de proteínas, permitindo identificar diferenças
maiores entre os lavados de animais ciclando e prenhes. Concluiu-se que a
eletroforese bidimendional constitui um método adequado para avaliar
quantitativamente o perfil protéico do ambiente uterino bovino e que tanto o estado
reprodutivo quanto o método de obtenção de lavados uterinos modificam sua
composição protéica. Novos estudos são necessários para se obter a seqüência de
aminoácidos das proteínas localizadas para que se conheça sua identidade e função
na gestação inicial de bovinos.
Palavras-chave: Ambiente uterino. Proteínas. Eletroforese bidimensional. Prenhez.
Bovino.
ABSTRACT
FEDOZZI, F. Characterization of the protein profile of the uterine environment
during the critical period in cattle. [Caracterização protéica do micro-ambiente
uterino durante o período crítico em bovinos]. 2008. 113 f. Dissertação (Mestrado em
Medicina Veterinária) - Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade
de São Paulo, São Paulo, 2008.
In the cattle, the outcome for the establishment of pregnancy depends on interactions
between conceptus and uterus. These interactions occur through molecules presents
in the uterine environment. Failure in this process causes 30-40% of loss in
gestation. The proteins are component of this environment and have a important role
in this process. The aim of this dissertation was to characterize the protein profile of
the uterine environment in cows, cyclic or pregnant, during the critical period, using
two-dimensional electrophoresis. The specific aim was to compare the protein
composition of uterine washings recovered in vivo, through a folley catheter, with
washings recovered post-mortem at day 18 after estrus of not inseminated or
pregnant cows. To obtain the samples 48 cows had their estrous synchronized and
here aleatoric put in the group to receive washings in vivo through the folley catheter
(12 inseminated and seven not inseminated) or to be washed post-mortem (12
inseminated and five not inseminated) at day 18 after estrus. After the recover, the
washings were proceeded and submitted to two-dimensional electrophoresis. The
gels were analyzed using the software Image Master-2D ELITE V. 4.01 (GE
Heathcare) to determine the isoelectric point (PI) and relative molecular weight
(PMR) of the proteins presents in the different groups and analysis of the optical
density. One hundred and seventy eight proteins were presents in the washings. The
distribution of the proteins according to the PI, 74% (132/178) had PI between 5,5
and 8 and according to the PMR 44% (79/178) of the proteins showed PMR lower
than 50KDa, while 54% (95/178) had PMR between 50 and 100KDa. In the washings
recovered through the folley catheter (FC and FP) 151 proteins were selected, being
96 from the cyclic cows and 86 from the pregnant cows. The washings recovered
post-mortem (PMC and PMP) showed only 54 proteins, from those 24 were present
in the cyclic animals and 36 in the pregnant animals. According to the reproductive
status 115 proteins were found in the washings from the cyclic animals (FC and
PMC), while 104 proteins were selected from the washings of the pregnant animals
(FP and PMP). Among the washings recovered through the folley catheter (FC and
FP) 31 proteins were the same between the reproductive status. While in the
washings recovered post-mortem (PMC and PMP) only six proteins were present in
both washings. In washings done in the cyclic animals (FC and PMC) five proteins
were presents in both kind of washings, while in washings done in the pregnant
animals (FP and PMP) 18 proteins were the same in both kind of washings. Among
the washings FC and PMP or FP and PMC, 15 and six proteins, respectively were
the same. The proteins presents exclusively in the washings of the pregnant animals
are probably involved with the embryo-maternal interplay during the process of
pregnancy establishment. Proteins detected exclusively in the washings recovered
through the folley catheter may be inflow of proteins from the serum, in response to
the uterine manipulation during the process of washing. It was expected a better
effect from the washings post-mortem than the ones through the folley catheter.
However the washings from the folley catheter had a better result, because they
identified a greater number of proteins which allowed identify greater differences
between the washings from cyclic and pregnant animals. In conclusion, the two-
dimensional electrophoresis is a adequate method to analyze the quantitatively
proteins profile of the uterine environment in the cow and that both the reproductive
status and the method to obtain the uterine washings modify the proteins
composition. New studies are necessary to obtain the amino acids sequence of the
proteins found so that we know their identity and function in the beginning of
pregnancy in the cow.
Key words: Uterine environment. Proteins. Two-dimensional electrophoresis.
Pregnancy. Bovine.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Fotografia dos conceptos encontrados nos lavados uterinos obtidos por
sonda de folley (A) e post-mortem (B)......................................Pagina - 50
Figura 2 - Representação esquemática dos procedimentos
experimentais...........................................................................Pagina - 51
Figura 3 - Fotografia do procedimento de infusão de ringer pelo procedimento de
lavagem uterina por sonda de folley........................................ Pagina - 52
Figura 4 - Fotografia do procedimento de recuperação do lavado uterino por sonda
de folley....................................................................................Pagina - 52
Figura 5 - Fotografia do aparelho reprodutivo coletado após o abate dos
animais.....................................................................................Pagina - 53
Figura 6 - Útero dissecado e identificado para coleta de lavado uterino post-
mortem......................................................................................Pagina - 54
Figura 7 - Fotografia da infusão de ringer no corno uterino contra-lateral ao
CL.............................................................................................Pagina - 54
Figura 8 - Fotografia do processo de massageamento do útero no sentido de
lavagem do corno contra-lateral para o ipso-lateral ao CL.......Pagina - 55
Figura 9 - Fotografia da colheita do lavado uterino e concepto (no caso de animais
prenhes)....................................................................................Pagina - 55
Figura 10 - Fotografia do processo de liofilização das amostras..............Pagina - 56
Figura 11 - Fotografia do processo de reidratação das fitas com as amostras
liofilizadas.................................................................................Pagina - 58
Figura 12 - Fotografia das fitas reidratadas prontas para a focalização isoelétrica
no aparato Ettan IPGphor II IEF...............................................Pagina - 58
Figura 13 - Fotografia da incubação das amostras sobre a plataforma agitadora
com solução SDS de equilíbrio.................................................Pagina - 60
Figura 14 - Fotografia do posicionamento dos géis na cuba de corrida da segunda
dimensão da 2D-EF..................................................................Pagina - 60
Figura 15 - Fotografia do processo de coloração dos géis com Comassie Stain
Solution.....................................................................................Pagina - 60
Figura 16 - Gel representativo do perfil protéico bi-dimencional dos lavados
uterinos coletados por sonda de folley de vacas ciclando (A) ou prenhes
(B), ou post-mortem de animais ciclando (C) ou prenhes (D)..Pagina - 66
Figura 17 - Média aritmética (± erro padrão da média) do volume normalizado de
proteínas que apresentaram efeito de estado, tipo de lavado ou
interação estado x tipo de lavado (P<0,05), em lavados uterinos
coletados por sonda de folley (---○---) ou post-mortem (●) de
animais cíclicos (C) ou prenhes (P) no dia 18 pós-
estro..........................................................................................Pagina - 71
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Sumário da distribuição por ponto isoelétrico (PI) e peso
molecular relativo (PMR) das proteínas identificadas por região
do gel dos lavados uterinos coletados por sondas de folley ou
post-mortem de vacas ciclando (C) ou prenhes (P) 18 dias pós-
estro............................................................................Pagina - 65
Tabela 2 – Número de proteínas presentes concomitantemente em
lavados uterinos listados nas linhas e colunas, coletados por
sonda de folley (F) ou post-mortem (PM) de vacas ciclando (C)
ou prenhes (P) 18 dias pós
estro.......................................................................... Pagina - 68
Tabela 3 - Número de proteínas presentes em lavados uterinos listados
nas linhas, mas ausentes em lavados uterinos listados nas
colunas, coletados por sonda de folley (F) ou post-mortem
(PM) de vacas ciclando (C) ou prenhes (P) 18 dias pós
estro.......................................................................... Pagina - 69
Tabela 4 - Sumário da análise de variância da densidade óptica (volume
normalizado) das proteínas identificadas nos lavados uterinos
coletados por sonda de folley (F) ou post-mortem (PM) de
vacas ciclando (C) ou prenhes (P) 18 dias pós-
estro........................................................................... Pagina - 70
LISTA DE APÊNDICES
Apêndice A - Peso molecular, ponto isoelétrico e freqüência de ocorrência de
proteínas presentes em lavados uterinos coletados por sonda de
Folley (F) ou post-mortem (PM) de animais cíclicos (C) ou prenhes
(P) no dia 18 pós-estro......................................................Pagina - 102
Apêndice B - Média aritmética (± erro padrão da média) do volume normalizado de
proteínas presentes em lavados uterinos coletados por sonda de
Folley (F) ou Post-mortem (PM) de animais cíclicos (C) ou prenhes
(P) no dia 18 pós-estro......................................................Pagina - 106
Apêndice C - Análise de variância do volume normalizado de proteínas presentes
em lavados uterinos coletados por sonda de Folley ou Post-mortem
(efeito de tipo de lavado) de animais cíclicos ou gestantes (efeito de
estado) no dia 18 pós-estro..............................................Pagina - 110
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO.......................................................................................................19
2 REVISÃO BIBLIOGRAFICA..................................................................................23
2. 1 Desenvolvimento embrionário ....................................................................23
2. 2 Hormônios envolvidos na gestação...........................................................24
2. 3 Reconhecimento materno da gestação......................................................27
2. 4 INF-
τ
e bloqueio da luteólise........................................................................29
2. 5 Mortalidade embrionária..............................................................................32
2. 6 Caracterização do ambiente uterino de bovinos ......................................35
2. 7 Métodos de estudo para caracterização protéica do ambiente uterino..36
2.7.1 Técnicas para análise da composição protéica do ambiente uterino 37
2.7.2 Eletroforese Bidimensional...................................................................38
2.8 Proteínas presentes no ambiente uterino durante o ciclo estral e a
prenhez em bovinos............................................................................................42
3 MATERIAIS E MÉTODOS.....................................................................................49
3.1 Manejo reprodutivo e delineamento experimental..................................49
3.1.2 Obtenção dos lavados uterinos in vivo e Post-mortem.......................51
3.1.3 Preparação das amostras para Eletroforese ........................................55
3.1.4 Eletroforese Bidimensional....................................................................57
3.1.5 Analise dos géis de Eletroforese Bidimensional..................................61
3.1.6 Radioimunoensaio para Progesterona.................................................62
3.1.7 Análise estatística...................................................................................62
4 RESULTADOS......................................................................................................64
5 DISCUSSÃO.........................................................................................................77
6 CONCLUSÕES E IMPLICAÇÕES........................................................................84
REFERÊNCIAS.....................................................................................................87
APÊNDICES .......................................................................................................102
Introdução
Introdução 19
1 INTRODUÇÃO
A pecuária bovina de corte tem um importante papel sócio-econômico
mundial. Foram produzidas no ano de 2006, em equivalente de carcaça, 53,5
milhões de toneladas de alimento para a população mundial (SECEX/MDIC, 2007).
O PIB do setor agropecuário brasileiro atingiu R$ 148,31 bilhões em 2006. A
balança comercial do agronegócio registrou saldo de US$ 39,32 bilhões, de janeiro a
novembro de 2006, representando 96% do saldo total da balança comercial
brasileira no período (SECEX/MDIC, 2007).
O Brasil produziu em 2006 aproximadamente 8,9 milhões de toneladas de
carne bovina, em equivalente de carcaça, dos quais 2,22 milhões de toneladas
foram destinados à exportação. Esse valor representa 30% do comércio mundial do
produto (SECEX/MDIC, 2007).
Assim como a pecuária, a agricultura teve um grande destaque no PIB e na
balança comercial brasileira no ano de 2006. Aquecido pela agroenergia, o setor
sucro-alcooleiro encontra uma grande oportunidade no mercado internacional com a
busca por combustíveis renováveis. Este cenário gera uma competitividade dentro
do próprio setor agropecuário, o que exige que a pecuária bovina de corte aumente
sua produtividade e lucratividade para permanecer economicamente viável.
Um dos indicadores relacionados à produtividade da pecuária de corte é o
desempenho reprodutivo, o qual tem como referência o intervalo entre partos de
aproximadamente 12 meses. Embora atualmente a pecuária nacional tenha atingido
um alto nível tecnológico, alguns fatores prejudicam o desempenho reprodutivo dos
animais. Esses fatores mantêm a media de intervalo entre partos do rebanho
brasileiro em 22 meses. Com isso, diminui a produtividade, lucratividade e
consequentemente a competitividade da pecuária.
Sabe-se que fêmeas bovinas zebuínas possuem uma gestação de
aproximadamente 290 dias e que após o parto as matrizes passam por um estado
fisiológico conhecido como anestro pós-parto com duração de aproximadamente 45
dias. Esse período pode se estender de acordo com o escore corpóreo do animal,
sistema de produção e nível nutricional. Este período permite a reestruturação do
Introdução 20
aparelho reprodutor assim como o restabelecimento dos mecanismos endócrinos
responsáveis pela ciclicidade nos animas, tendo seu final determinado pela primeira
ovulação fértil (YAVAS; WALTON, 2000). Com a duração média de um ciclo estral
de 21 dias, adicionado ao período de anestro pós-parto e ao da gestação, é grande
o desafio de obter um intervalo entre partos de 365 dias. Por exemplo, a ocorrência
de falhas no processo de estabelecimento da prenhez eleva o intervalo entre partos,
prejudicando a eficiência e a lucratividade da pecuária.
Para se entender a natureza de tais falhas, é necessário recordar que a partir
da ovulação do folículo dominante ocorre a formação do corpo lúteo (CL). Essa
estrutura reprodutiva transitória é responsável pela secreção de progesterona,
hormônio fundamental para a gestação. Para o estabelecimento da gestação é
necessário que o concepto (embrião e membranas anexas) sinalize sua presença no
útero. Esse processo é caracterizado por um diálogo molecular entre o concepto e a
fêmea e resulta em mecanismos para a manutenção do CL e, consequentemente,
da gestação. Esse processo é denominado reconhecimento materno-embrionário
(HAFEZ, 2004).
Os dias 15 a 19 após o estro constituem um período crítico para a
manutenção da gestação. Nesse período, o útero, de animais não gestantes produz
e libera pulsos de prostaglandina F2α (PGF2α), molécula responsável pela luteólise,
que se caracteriza pela regressão funcional e estrutural do corpo lúteo. Após a
diminuição na concentração plasmática de progesterona ocorrem as etapas finais do
crescimento do folículo dominante pré-ovulatório, culminando na sua ovulação e
início de um novo ciclo estral. Entretanto, na ocorrência da concepção, o mecanismo
luteolítico deve ser bloqueado para possibilitar o estabelecimento da gestação.
Falhas no processo de bloqueio da luteólise foram relacionadas à mortalidade
embrionária precoce, responsável por 30 a 40% das perdas embrionárias nas
fêmeas bovinas (DISKIN; SREENAN, 1980; HUMBLOT 2001; SANTOS et al., 2004).
Tais perdas representam grande limitação biológica para que se atinjam índices
reprodutivos satisfatórios.
As causas de tais perdas são pouco conhecidas, mas têm sido associadas a
um ambiente uterino inapropriado. Nos ruminantes ungulados como ovinos, caprinos
e bovinos, o micro-ambiente uterino é composto por macromoléculas, secretadas
pelo concepto e endométrio e oriundas da circulação periférica. Entende-se que
Introdução 21
concentrações relativas ótimas dessas macromoléculas, especialmente as
proteínas, são necessárias para a manutenção funcional do corpo lúteo e
desenvolvimento do concepto. Desta forma torna-se evidente o interesse em
desenvolver metodologias para caracterização protéica do micro-ambiente uterino
durante o período crítico.
A Eletroforese Bidimensional (2D-EF), combinada com a identificação de
proteínas por espectrometria de massa é atualmente a melhor ferramenta para
análises proteômicas. A 2D-EF é uma tecnologia que pode ser rotineiramente
aplicada para análises quantitativas do perfil de expressão de proteínas. A técnica
possibilita a separação de proteínas de acordo com seu ponto isoelétrico (PI), peso
molecular (PMR), solubilidade e abundância relativa (GORG et al., 2004).
Portanto, o objetivo geral desse estudo foi caracterizar o perfil protéico do
micro-ambiente uterino de fêmeas bovinas, não inseminadas e gestantes, durante o
período crítico. Foi delineado o objetivo específico de comparar a composição
protéica de lavados uterinos obtidos in vivo, por sonda de folley ou post-mortem no
dia 18 após o estro de vacas não inseminadas ou gestantes, utilizando 2D-EF.
A hipótese da presente tese é que ocorrem diferenças no perfil de proteínas
presentes em lavados uterinos entre animais cíclicos e gestantes obtidos por sonda
de folley ou post-mortem no período crítico em bovinos.
Revisão Bibliográfica
Revisão Bibliográfica 23
2 REVISÃO BIBLIOGRAFICA
Nessa revisão de literatura foram abordados os conceitos relacionados ao
processo de reconhecimento materno da gestação. Para isso foram descritas as
etapas do desenvolvimento embrionário e seu controle hormonal, foi avaliado o
efeito da mortalidade embrionária nesse período e destacou-se a importância do
estudo do ambiente uterino e das proteínas presentes nesse meio.
2. 1 Desenvolvimento embrionário
Para a padronização dos termos utilizados na reprodução de bovinos, o
Comitê de Nomenclatura na Reprodução Bovina (1972) estabeleceu que o período
embrionário da gestação se estende da concepção até o final do estágio de
placentação, aproximadamente com 42 dias de gestação, e que o período fetal se
estende do 42º dia até o parto.
Depois da fertilização, o embrião alcança o útero em período que varia
dependendo da espécie. Passando por aproximadamente uma divisão mitótica por
dia, o zigoto da vaca chega ao útero entre o 3º e 5º dia de gestação com 16 a 32
células, no estádio de mórula, mantendo ainda sua capacidade de totipotência.
Nesse estágio, o embrião ainda está rodeado da zona pelúcida. No dia 6 a 7 nos
bovinos, começa a diferenciação do embrião, evidenciada pela formação do
trofoblasto, da massa celular interna e da blastocele. Nesse estádio, a zona pelúcida
se desprende e o trofoblasto que rodeia a massa celular interna demarca os limites
externos do blastocisto, nome dado ao embrião neste estágio, ficando em contato
com as secreções uterinas (SPENCER et al., 2006).
O estabelecimento da gestação em ruminantes domésticos (ovinos, bovinos e
caprinos) se inicia no estádio de blastocisto e envolve sinais de reconhecimento da
prenhez (SPENCER et al., 2006). De acordo com Guillomot (1995), as fases do
Revisão Bibliográfica 24
estabelecimento da gestação são divididas em eclosão da zona pelúcida; pré-
contato e orientação do blastocisto; alongamento do concepto; aposição; adesão; e
implantação. Todas essas fases ocorrem nos ruminantes domésticos, a implantação
nessas espécies se dá a partir 42º dia da gestação através da formação dos
placentomas, que permitem um contato íntimo entre a fêmea e o feto, possibilitando
as trocas entre as circulações (SPENCER et al., 2006).
Durante o período peri-implantação, as células gigantes binucleadas (CGB)
do trofoblasto começam a se diferenciar a partir das células mononucleadas do
trofoectoderma, migram e se fundem com o epitélio luminal do endométrio, assim
como entre si, para formarem as placas sinciciais multinucleadas. As CGB do
trofoblasto secretam moléculas que agem nas glândulas endometriais para estimular
sua diferenciação morfológica e funcional (SPENCER et al., 2006).
A implantação do embrião nos mamíferos se inicia próximo ao seu local de
contato com o útero e se estende perifericamente. Depois da aposição entre o
concepto e o útero, vem a fase de adesão com intervenção de glicoproteínas de
membrana, seguida da interdigitação entre o trofoblasto e o endométrio (SPENCER
et al., 2006).
O ambiente uterino fornece os nutrientes e o meio físico-químico adequado
para o desenvolvimento do embrião desde sua chegada no útero até a sua
implantação. As mudanças que ocorrem nas secreções uterinas são hormônio-
dependente e constituem a base da sincronia entre o embrião e o útero (SPENCER
et al., 2006).
2.2 Hormônios envolvidos na gestação
Durante o inicio da prenhez, o útero dos mamíferos é exposto
sequencialmente ao estrógeno, progesterona (P
4
), INF-τ e ao lactogênio placentário.
Resulta dessa exposição o inicio, manutenção e diferenciação morfológica e
funcional das glândulas endometriais de forma a dar suporte à gestação (SPENCER;
BAZER, 2004).
Revisão Bibliográfica 25
Durante a prenhez, a foliculogênese diminui, assim como se reduz a produção
de estrógeno por folículo no ovário ipsolateral ao corno uterino prenhe. Isso sugere
que o estrógeno desempenha um papel importante no processo de luteólise, e que a
supressão dos efeitos luteolíticos do estrógeno é necessária para o estabelecimento
da prenhez (THATCHER et al., 2001). Porém, Goff (2002) destaca que o estradiol e
a P
4
agem no endométrio estimulando a síntese de varias proteínas e
prostaglandinas importantes no período crítico.
A P
4
possui um papel fundamental no estabelecimento e na manutenção da
prenhez em mamíferos. Em todo o útero dos mamíferos, os receptores de
progesterona (PR) estão expressos no epitélio e estroma endometrial durante o
inicio da fase luteal, permitindo uma regulação direta na transcrição de uma série de
genes. Entretanto, a exposição continua do endométrio à P
4
diminui a expressão dos
PR no epitélio endometrial (SPENCER; BAZER, 2004). A expressão dos PR é
detectável no estroma e no miométrio de ovinos durante a maior parte da gestação.
O paradigma da diminuição na quantidade dos PR no epitélio após a implantação
ocorre na ovelha (SPENCER et al., 1995), nas vacas (KIMMINS; MACLAREN, 2001)
e nas porcas (GEISERT et al., 1994). A P
4
age no útero para estimular e manter as
funções uterinas que permitem o desenvolvimento embrionário inicial, a implantação,
a placentação e o desenvolvimento fetal a termo. Para a manutenção da gestação
são necessárias interações entre o concepto e o endométrio. Nos animais
domésticos as glândulas endometriais passam por um processo de hiperplasia
seguido de hipertrofia, que se mostra dependente das ações dos hormônios
placentários. As alterações na morfologia das glândulas endometriais durante a
prenhez possibilitam que o endométrio aumente a secreção de proteínas. A nutrição
histotrófica do endométrio é responsável pelo desenvolvimento do concepto no
período pré-implantação, sendo essencial para a sobrevivência e crescimento do
concepto nessa fase da gestação em animais domésticos (SPENCER; BAZER et al.,
2004).
Em bovinos, a concentração plasmática sistêmica de P
4
durante a fase luteal,
afetou o volume das secreções uterinas (GARRET et al.,1988), a taxa de
desenvolvimento do concepto (GARRET et al.,1988; MANN, et al., 1996) e a
capacidade do concepto de sintetizar INF-τ (GARRET et al.,1988; KERBLER et al.,
1997; MANN et al., 1999).
Revisão Bibliográfica 26
No endométrio, a P
4
age como um fator de diferenciação (CUMMINGS;
YOCHIM, 1984). Durante a fase folicular do ciclo estral, o estrógeno induz a
proliferação celular no endométrio. Porém, concentrações elevadas de P
4
,
durante a
fase luteal do ciclo estral, inibe a mitose no endométrio (PADYKULA et al., 1989). A
P
4
também induz a diferenciação do estroma em associação com o acumulo de
vacúolos basal no epitélio glandular (MASLAR et al., 1986), e alterações no padrão
de proteínas secretadas pelas células endometriais (MASLAR et al., 1986). Essas
proteínas uterinas proporcionam um ambiente favorável ao desenvolvimento
embrionário precoce. No miométrio, a P
4
induz a quiescência causando alterações
iônicas nas células miometriais (PARKINGTON, 1983), diminuindo a passagem de
cálcio do meio extracelular para o meio intracelular (TEZUKA et al., 1995). A
prevenção nas contrações uterinas também ocorre pelo bloqueio na capacidade do
estradiol em induzir os receptores α-adrenergicos, cuja ativação causa contrações
uterinas (BOTTARI et al., 1983). Em bovinos, o embrião/feto é dependente da P
4
luteal ate o 200º dia da gestação (CHEW et al., 1979). Para a manutenção da
gestação no terço final (após 200 dias) é necessário que a placenta sintetize P
4,
devido ao fato da atividade do corpo lúteo decair drasticamente a partir desse
período (SHEMESH, 1990). Porém, a P
4
sintetizada, presumidamente age
diretamente no útero, uma vez que a placenta não contribui para a concentração
plasmática periférica de P
4,
até próximo ao parto (SHEMESH, 1990).
A importância e efeitos do INF-τ sobre o processo de estabelecimento da
gestação nos bovinos, serão tratados em uma seção a seguir.
A placenta de varias espécies, incluindo roedores, humanos, primatas, ovinos
e bovinos, secreta hormônios, estruturalmente relacionados à prolactina pituitária e
ao hormônio do crescimento (GH), chamados de lactogênio placentário (LP)
(SOARES, 2004). O termo lactogênio placentário se origina do fato desses
hormônios exibirem atividade similar a prolactina em vários ensaios (ANTHONY et
al., 1995). O LP é produzido pelas células binucleadas do trofoblasto do concepto,
mas a regulação da sua síntese e secreção não foi esclarecida. Em ovinos esse
processo se inicia a partir do 16º dia da gestação, é detectado no soro materno no
50º dia e atinge um pico no sangue materno entre os dias 120 e 130 da gestação
(ANTHONY et al., 1995; MARTIAL; DJIANE, 1975). O LP dos ruminantes foi
purificado da placenta de ovinos (WARREN et al., 1990), caprinos (CURRIE et al.,
1990), e bovinos (MURTHY et al., 1982).
Revisão Bibliográfica 27
O LP age ativando os receptores de prolactina e do GH, o que sugere que
este seja o principal mecanismo do LP in vivo (GERTLER; DJIANE, 2002).
Os hormônios regulam e caracterizam o ambiente uterino de acordo com o
estado fisiológico. A gestação altera a síntese e secreção hormonal, preparando o
ambiente uterino para o processo de reconhecimento e manutenção da gestação.
2.3 Reconhecimento materno da gestação
Os ruminantes domésticos ovulam espontaneamente e seu ciclo estral é
útero-dependente, até o estabelecimento da prenhez (MCCRACKEN et al., 1999). O
estabelecimento da gestação envolve uma série de processos, entre eles o
reconhecimento da gestação e a implantação (SPENCER; BAZER et al., 2004).
O reconhecimento materno da gestação pode ser definido como um processo
fisiológico no qual o concepto (embrião e membranas anexas) sinaliza a sua
presença para o organismo materno e prolonga o período funcional do corpo lúteo
(CL) (SPENCER; BAZER et al., 2004). Esse processo envolve uma comunicação
bioquímica entre o concepto e a fêmea, capaz de bloquear a produção de
prostaglandina F2α (PGF2α) e assim manter a síntese e liberação de progesterona
(P
4
) pelo CL (SHOLL et al., 1983). O prolongamento do período funcional do CL é
uma característica distinta da gestação de mamíferos, nas espécies em que o
período de gestação excede a duração de um ciclo estral ou menstrual, como ocorre
nos animais domésticos, roedores e humanos (SPENCER; BAZER et al., 2004).
Binelli e Thatcher (1999), afirmaram que, durante o período crítico (i.e., dias 15
a 19 pós-estro), as células epiteliais do endométrio seguem uma programação pré-
estabelecida para liberar pulsos luteolíticos da PGF2α a menos que o concepto
envie sinais anti-luteolíticos apropriados para bloquear a produção da PGF2α.
Entretanto há algumas indicações cientificas de que a programação para o bloqueio
da luteólise parece ser acionada antes do período crítico. De acordo com Banu et al.
Revisão Bibliográfica 28
(2003) o embrião bovino já produz moléculas sinalizadoras da sua presença no útero
desde o 10º dia do seu desenvolvimento.
Na década de sessenta, pesquisadores apontaram para a ocorrência da
inibição da luteólise a partir da liberação de substâncias blastocísticas antes do
momento da implantação embrionária (MOOR; ROWSON, 1996). Posteriormente,
por ter sido isolada das células trofoblásticas, essa substância foi denominada de
trofoblastina ou proteína trofoblástica (MARTAL et al., 1979). Após sua purificação,
realizada na espécie ovina, e por apresentar grande semelhança estrutural com
algumas classes de interferons, passou a ser chamada de interferon-τ (INF-τ)
(IMAKAWA et al., 1987). Seu mecanismo de ação para o bloqueio da luteólise
envolve a supressão na expressão dos receptores endometriais para a ocitocina
(WATHES et al., 1998; MANN et al., 1999) e também a competição pelos sítios de
ligação desses mesmos receptores, culminando com a inibição da síntese de PGF2α
(DEMMERS et al., 2001).
Para o reconhecimento materno da gestação em ruminantes é necessário que
o concepto se alongue de uma forma esférica, para uma forma tubular e
posteriormente filamentosa para então produzir INF-τ (SPENCER et al., 1995;
ROBERTS et al., 1999; SPENCER; BAZER, 2004). O INF-τ é a principal molécula
sinalizadora da presença do concepto no útero materno e é secretado pelas células
mononucleares do trofoblasto, no estádio precoce de desenvolvimento embrionário
(THATCHER et al., 2001). Nos bovinos observa-se que a secreção de IFN-τ pelo
trofoectoderma inicia-se ao redor do sétimo dia de gestação, atingindo o pico
máximo entre os dias 17 e 22 (BARTOL et al.,1985; GEISERT et al., 1988).
Em mamíferos o crescimento e desenvolvimento do concepto necessita da
ação da progesterona e hormônios placentários no útero para regular a
diferenciação e função endometrial, a sinalização do reconhecimento da prenhez , a
receptividade do útero para a implantação do blastocisto (SPENCER; BAZER et al.,
2004).
Em síntese, entre os fatores que atuam no reconhecimento materno da
gestação, ressalta-se a importância dos hormônios maternos envolvidos na
preparação do ambiente uterino e as moléculas liberadas pelo concepto que tem
ação no endométrio. A principal molécula liberada pelo concepto com ação sobre o
reconhecimento materno fetal é o IFN-τ, que será abordado na seção a seguir.
Revisão Bibliográfica 29
2.4 INF-τ e bloqueio da luteólise
Interferons (INF) são citocinas sintetizadas e secretadas por células
somáticas das espécies mamíferas. A designação coletiva de interferons surgiu com
estudos de Stewart (1979) que assim as nomeou por sua capacidade de interferir na
biologia das células mamíferas induzindo um estado anti-viral contra diversos tipos
de vírus.
Na espécie bovina foram identificados múltiplos subtipos de INF, entre eles,
observou-se a expressão de interferon-tau (INF-τ), responsável pelo reconhecimento
materno nessa espécie (ROBERTS; CROSS; LEAMAN, 1992; ROBERTS et al.,
1999). Genes que codificam INF-τ foram identificados apenas em ruminantes
(LEAMAN; ROBERTS, 1994). Acredita-se que os genes para INF-τ tenham evoluído
de um IFN-ω ancestral há aproximadamente 36 milhões de anos (ROBERTS et al.,
1999). Apesar das diferenças na seqüência de aminoácidos, os interferons
apresentam estrutura tridimensional semelhante, compostas basicamente por
regiões α-hélices arranjadas em uma “trouxa” compacta (ROBERTS et al., 1999). Tal
característica estrutural, associada às propriedades biofísicas e atividades biológicas
comuns, como estabilidade de atividade em pH ácido e reconhecimento de classes
comuns de receptores de superfície celular, determinaram a designação coletiva
dessas moléculas como IFN tipo 1 (MOGENSEN et al., 1999).
O INF-τ apresenta diversas atividades inerentes aos interferons como
atividade anti-viral, inibição na proliferação celular e efeitos regulatórios nas células
do sistema imune semelhantes ao IFN-α. Sabe-se que o INF-τ é composto por 172
aminoácidos e apresenta 75% de homologia com o IFN-ω (EALY et al., 1998). Assim
como todos IFN tipo I, o INF-τ se liga às subunidades de receptor para interferons 1
e 2 (IFNAR1 e IFNAR2) (LI; ROBERTS, 1994a; LI; ROBERTS, 1994b), através dos
quais ativa fatores de transcrição (ALEXENKO et al., 1997; BINELLI et al., 2001)
induzindo ou inibindo a expressão de diversos genes (OTT et al., 1998; SPENCER;
OTT; BAZER, 1998).
Após a purificação das proteínas secretadas por conceptos, Demmers et al.
(2001) observaram que as isoformas de interferon-tau bovino (bINF-τ) apresentam
peso molecular entre 22 e 24KDa e glicosilações com oligossacarídeos ligados à
Revisão Bibliográfica 30
extremidade amino. Posteriormente descobriu-se que a transcrição do INF-τ ocorre
durante o período inicial da gestação em bovinos, ovinos e caprinos e codificam
proteínas que podem possuir atividades biológicas diferentes (EALY et al.,1998;
WINKELMAN et al., 1999; EALY et al., 2001). Em estudos recentes foram
reportadas 12 isoformas de INF-τ isolados na espécie bovina (ALEXENKO et al.,
2000). A razão para a transcrição de múltiplas isoformas de INF-τ permanece
desconhecida. Martal et al. (1990) e Ealy et al. (2004) sugeriram que uma tentativa
de estabelecer um mecanismo que amplifique a produção dessa proteína nesse
período, ou que tais isoformas diferentes desempenhem distintas atividades como
hormônios da gestação na espécie. Observou-se que o INF-τ é expresso apenas
pelas células do trofoectoderma extra-embrionário (BAZER; ROBERTS, 1984;
FARIN; IMAKAWA; ROBERTS 1989; GODKIN; GUILLOMOT et al., 1990). Alguns
autores observaram que o INF-τ já está expresso constitutivamente no
trofoectoderma no estágio de blastocisto em bovinos, mas em níveis bastante
inferiores aos observados nos dias seguintes (HERNANDEZ; LEDEZMA et al., 1992;
KUBISCH; LARSON; ROBERTS, 1998).
A ação do INF-τ no estabelecimento da gestação não se baseia em equilibrar
a expressão dos PR no epitélio endometrial durante a prenhez (SPENCER; BAZER,
1995). Demonstrou-se que o INF-τ, atua de forma paracrina no epitélio luminal (LE)
e epitélio glandular (GE) endometrial, suprimindo a transcrição gênica dos
receptores de estrógeno (ER) e receptores de ocitocina (OTR) (SPENCER; BAZER,
1995; FLEMING et al., 2001), prevenindo desta forma o desenvolvimento do
mecanismo luteolítico endometrial. O aumento na expressão gênica dos ER e OTR
no LE e no GE entre os dias 11 e 17 pós-estro, em ovelhas cíclicas, não ocorreu em
ovelhas prenhes (SPENCER; BAZER, 1995), ou em ovelhas cíclicas que receberam
infusão uterina de INF-τ (SPENCER et al., 1995). Pela inibição no aumento da
expressão do OTR, o INF-τ previniu a produção endometrial de pulsos luteolíticos de
PGF2α. Entretanto, o INF-τ não inibiu a produção basal de PGF2α, o qual é maior
em ovelhas prenhes do que em cíclicas. O concepto e o INF-τ, não afetam a
expressão da COX-2 no epitélio endometrial de ovelhas no inicio da gestação
(CHARPIGNY et al., 1997; KIM et al., 2003). Deste modo, a ação anti-luteolítica do
INF-τ se baseia em prevenir o aumento da expressão gênica de ER, PR e OTR no
Revisão Bibliográfica 31
epitélio, os quais são responsivos ao estrógeno, pela inibição direta na transcrição
gênica dos ERs (FLEMING et al., 2001).
Alguns autores observaram o efeito de INF-τ na inibição da síntese de PGF2α
em explantes endometriais (HELMER et al., 1987; HELMER et al., 1989) e em
células endometriais epiteliais (DANET-DESNOYERS et al., 1994; GODKIN et al.,
1997; XIAO et al., 1998; BINELLI et al., 2000) nas fêmeas bovinas. No entanto
nessa espécie a relação entre INF-τ, ER e de OTR ainda não é clara, (KIMMINS;
MACLAREN, 2001; ROBINSON et al., 2001). Inicialmente observaram-se diferenças
significativas na expressão de OTR endometrial entre as fêmeas bovinas prenhes e
cíclicas (FUCHS et al., 1990; JENNER; PARKINSON; LAMMING, 1991), sugerindo
que o INF-τ secretado pelo concepto suprime a expressão de OTR. A observação de
que o interferon-tau recombinante inibe a expressão de OTR em explantes
endometriais em cultivo apóia esse conceito (HORN et al., 1998; LEUNG et al.,
2001). Recentemente Robinson et al. (2001) estudaram a expressão de receptores
para ocitocina, estrógeno e progesterona no endométrio bovino durante o ciclo estral
ou período inicial da gestação através de hibridização in situ e imunohistoquímica.
Não detectou-se a expressão de RNA mensageiro (RNAm) para OTR entre os dias
12 e 18 pós-estro no endométrio de fêmeas bovinas gestantes. Entretanto a
presença de um concepto não teve efeito na expressão de RNAm para ER no
epitélio luminal uterino, glândulas superficiais ou estroma sub-epitelial entre os dias
12 e 14 pós-estro. Contudo entre os dias 16 e 18, observou-se um aumento nas
concentrações de RNAm para ER no epitélio luminal de fêmeas cíclicas, enquanto
nas fêmeas gestantes notou-se um declínio, tornando-se indetectável no décimo
oitavo dia. Esses resultados indicam que INF-τ não inibiu os OTR indiretamente via
ER nas fêmeas bovinas. Sabe-se que a região promotora do gene para OTR contém
um elemento de resposta ao interferon (ISRE) onde se ligam fatores regulatórios de
interferon -1 e -2 (BATHGATE; TILMANN; IVELL, 1998), portanto supõe-se que o
INF-τ possa inibir diretamente a expressão de OTR. Entretanto, Goff (2002) destaca
que o INF-τ pode ter outros papeis importantes no estabelecimento da gestação,
além do efeito sobre a secreção de prostaglandina.
Outros autores apontam possíveis mecanismos de ação anti-luteolítica nos
bovinos nos quais o bINF-τ atua modulando a expressão de genes endometriais e
Revisão Bibliográfica 32
conseqüentemente a síntese de proteínas que podem bloquear a síntese de PGF2α
(THATCHER et al., 1997; BINELLI et al., 2000; SCHAFER-SÖMI, 2003).
Ainda especula-se que o INF-τ possa inibir a luteólise alterando a produção
de PGF2α luteolítica para PGE2 que é luteotrófica (ASSELIN; FORTIER, 2000). Foi
observado que o INF-τ regula negativamente a expressão das enzimas
prostaglandina F2 sintase (PGF2S) e prostaglandina ceto-redutase (9K-PGR)
prevenindo a produção de PGF2α endometrial (ASSELIN; FORTIER, 2000).
Enquanto nas células estromais, consideradas como fonte primária de PGE2 (KIM;
FORTIER, 1995; ASSELIN; DROLET; FORTIER, 1998), o INF-τ estimula a
expressão de COX-2 (XIAO et al., 1998).
Os mecanismos pelos quais o INF-τ inibe a síntese endometrial de PGF2α
ainda não são completamente esclarecidos. No entanto, é esclarecido que a inibição
da síntese de PGF2α é mediada pelo INF-τ, sendo um mecanismo fundamental ao
sucesso da gestação.
O insucesso da ação dos hormônios e do INF-τ sobre o bloqueio da luteólise
e manutenção da gestação é responsável por grande parte da mortalidade
embrionária. A importância desse fato será discutida na seção seguinte.
2.5 Mortalidade embrionária
Já em 1978, experimentos realizados por Ayalon, indicavam que as taxas de
fertilização em bovinos eram usualmente altas (~95%). Comparando as taxas de
fertilização com as taxas de prenhez, sugere-se que a mortalidade embrionária é
responsável pela maior parte das perdas reprodutivas após a inseminação nos
rebanhos bovinos (ZAVY, 1994).
Estudos em vacas de corte lactantes apresentaram taxa de fertilização média
de 75%, com variação de 60 to 100% (BREUEL, et al. 1993). Em vacas de corte não
lactantes, a taxa de fertilização média é 98.6%, com variação de 94 a 100%, a qual é
maior que em vacas de corte lactando. Dados de dois estudos em novilhas de corte
em crescimento (MAURER; CHENAULT, 1993; DUNNE et al., 2000), avaliaram
Revisão Bibliográfica 33
entre os 2º e o 16º dia após IA e mostraram alta taxa de fertilização, com media de
88%, variando entre 75 e 100%.
Em vacas leiteiras, as taxas de fertilização são similares entre vacas lactentes
e não lactantes, com medias de 76.2%, variando entre 55.3 e 87.8%, e 78.1%, com
variação entre 58.0 e 98.0% (HUMBLOT, 2001).
A mortalidade embrionária associada à falha na manutenção da gestação
constitui um fator limitante que contribui para dilatar os intervalos entre partos
(HANK, 1979). Reportaram-se em alguns estudos que em fêmeas bovinas a
mortalidade embrionária é responsável em grande parte pelas baixas taxas de
prenhez.
Para Binelli e Thatcher (1999) a maioria das perdas reprodutivas ocorreu na
fase embrionária de gestação. Thatcher et al. (1994) realizaram estudos com
rebanhos leiteiros de alta produção e estimaram que 35% dos embriões fertilizados
não sobrevivem até o 18º dia de prenhez.
As taxas de sobrevivência do concepto diminuem gradualmente de 93% no dia
8 pós-inseminação, para 56%, 66% e 58% nos dias 12, 16 e 42, respectivamente,
segundo Diskin e Sreenan (1980) que ainda relataram que as falhas de fertilização
são responsáveis por 10% dos casos de fracasso reprodutivo, ao passo que as
mortes embrionárias, correspondem a 30% dos referidos casos. (DISKIN;
SREENAN, 1980).
Kunz et al. (2002) encontraram taxas de mortalidade entre 20% e 40% até os
dias 21 e 22 de prenhez em vacas de corte. Em vacas leiteiras, a taxa de parição,
após uma única inseminação artificial, está atualmente próxima ou até menor que
50% e vem decrescendo continuamente nos últimos 15 anos (HUMBLOT, 2001).
Para caracterizar a mortalidade embrionária, Humblot (2001), utilizou
experimentos, baseando-se na mensuração da P
4
diariamente e a remoção de
embriões em diferentes estágios após a inseminação artificial (IA), o que permitiu
distinguir dois tipos de mortalidade embrionária (HUMBLOT; DALLA PORTA, 1984).
A luteólise dentro de 24 dias após a IA, pode estar associada a falta de fertilização
ou a mortalidade embrionária precoce (MEP). Enquanto, a manutenção do CL e
retorno ao estro após 24 dias, pode estar associado a mortalidade embrionária tardia
(MET), ocorrendo após o 16 º dia da IA. Utilizando esses parâmetros foi observado
que a MEP representava até 43.6% das IA, enquanto a MET representou 17.5%
(HUMBLOT, 2001).
Revisão Bibliográfica 34
Santos et al. (2004) caracteriza a perda da prenhez antes do 24º dia como
morte embrionária precoce, e entre os dias 24 e 42-50, como perda embrionária
tardia. A perda da prenhez detectada após 50 dias da IA são caracterizadas como
morte fetal.
A mortalidade embrionária pode ocorrer devido a causas infecciosas e não
infecciosas. Em relação às causas infecciosas os agentes infecciosos específicos
que mais comumente causam problemas de mortalidade embrionária em bovinos
são o Campylobacter fetus subsp. veneralis (Campilobacteriose Genital Bovino), o
Trichomonas fetus (Tricomoníase) além do vírus vulvovaginite infecciosa pustular
(BHV-1) e o Vírus da Diarréia Viral Bovina (BVDV) (KUNZ et al., 2002). Além desses,
há os agentes infecciosos inespecíficos encontrados principalmente nos casos de
endometrites. Patógenos oportunistas da flora vaginal normal ou do ambiente podem
invadir o útero, que é um ambiente estéril, ao contrário da vagina que abriga
microrganismos. Às vezes, tais oportunidades ocorrem, sobretudo, mas não
exclusivamente, durante o parto, inseminação artificial e transferência de embriões
podendo levar á endometrite crônica ou sub aguda, afetando negativamente a
fertilidade (LEBLANC et al., 2002).
A mortalidade embrionária de origem não infecciosa, para Christianson (1992),
reputa em 70% da mortalidade embrionária total. O estresse térmico foi
responsabilizado por mortalidade embrionária de até 42,7% (SILKE et al., 2002). A
influência do estado nutricional da vaca para López-Gatius et al. (2002) e Silke et al.
(2002) representaram a causa de perdas significativas de prenhez quando houve
diminuição do escore de condição corporal.
Humblot et al (2001) destacaram que a freqüência da MEP e MET aumentou
com o número de partos. Esses autores associaram um decréscimo na fertilidade
em vacas com alto valor genético para produção de leite, com aumento na MEP. Foi
observada alta variabilidade na taxa de prenhez entre rebanhos (8,2 a 56,9%). Em
geral, altas taxas de prenhez foram associadas a baixas taxas de MEP, enquanto
baixas taxas de prenhez foram justificadas por altas taxas de MEP. Na maioria dos
casos, a taxa de MET foi de aproximadamente 15%.
O estresse calórico parece ter um grande impacto entre os vários fatores que
afetam a taxa de fertilização nos rebanhos bovinos (SARTORI et al., 2002).
O pH e a concentração iônica no ambiente uterino durante a fase luteal
possuem grande efeito sobre a fertilidade. O aumento nas concentrações de
Revisão Bibliográfica 35
nitrogênio uréico plasmático em animais consumindo dietas com alto teor protéico
altera o pH uterino, podendo reduzir a fertilidade, ao interferir na concentração de
progesterona e no ambiente uterino, criando assim condições sub-ótimas para o
desenvolvimento do embrião (BUTLER, 2001).
Portanto, esta caracterizado que em condições normais os rebanhos
possuem alta taxa de fertilidade, porém uma baixa taxa de prenhez, o que
caracteriza a mortalidade embrionária como um grande entrave para o sucesso
reprodutivo.
Em suma, uma vez que a taxa de mortalidade embrionária influencia
negativamente a taxa de prenhez, tal mortalidade causa prejuízos econômicos na
agropecuária mundial. Assim, é de suma importância que se conheçam
profundamente os mecanismos que controlam o reconhecimento materno da
gestação, e os fatores predisponentes à mortalidade embrionária precoce. Para isso
faz-se necessário o profundo conhecimento do ambiente uterino nos bovinos
durante o período crítico.
2.6 Caracterização do ambiente uterino de bovinos
Nos ruminantes o contato entre a circulação materna com a do concepto
ocorre apenas quando a implantação esta estabelecida, por volta do 42º dia da
gestação. Durante todo o período que antecede a implantação o concepto utiliza-se
do ambiente uterino para sua nutrição e comunicação com a vaca. Portanto para o
entendimento desse processo e a determinação de sua falhas é necessário que se
conheça esse ambiente.
O útero de todos os mamíferos é composto por um epitélio endometrial que
sintetiza, secreta ou transporta um mescla complexa de íons, carboidratos,
aminoácidos, enzimas, fatores de crescimento, hormônios, proteínas
transportadoras e outras substâncias. Este composto é chamado de histotrofo
(BAZER, 1975).
O bom desenvolvimento do embrião no início da prenhez depende do
ambiente uterino. No início da prenhez a sinalização local do concepto modifica o
Revisão Bibliográfica 36
ambiente uterino e induz a secreção de proteínas especificas pelo epitélio uterino
(MCCRACKEN, 1984). Estudos sobre as interações materno-fetais no início da
gestação são de grande importância. Moléculas de origem endometrial ou do
concepto são liberadas neste ambiente e interagem paracrinamente com ambos os
tecidos.
Durante o período que antecede a implantação, a nutrição do concepto
depende das secreções uterinas. As células epiteliais do lúmen uterino possuem
grande atividade secretora, enquanto o trofoblasto exibe uma intensa atividade
pinocitotica, a qual aumenta com o desenvolvimento do concepto (GUILLOMOT,
1995). Portanto, considera-se que os fatores que suportam o crescimento do
concepto durante a pré e peri-implantação, sejam obtidos primariamente do
histotrofo uterino (SPENCER et al., 2006).
A comunicação entre o ovário e o útero é essencial para a reprodução em
bovinos. A ação dos esteróides ovarianos causam mudanças cíclicas em inúmeras
respostas uterinas como no fluxo sanguíneo (FORD et al.,1979), na histologia e
citologia endometrial (PRIEDKALNS, 1976; MARINOV; LOVELL, 1968) e no perfil
protéico do fluido uterino (ROBERTS; PARKER, 1976). Essas alterações ocorrem
devido ao requerimento biológico para estabelecer um ambiente intra-uterino capaz
de sustentar o concepto bovino (SREENAN, 1978).
2.7 Métodos de estudo para caracterização protéica do ambiente uterino
Com o objetivo de se conhecer o ambiente uterino durante o processo de
reconhecimento materno da gestação é necessário caracterizar e identificar as
moléculas presentes nesse meio. A caracterização do ambiente uterino e a
determinação do perfil das proteínas que o compõe são geralmente alcançadas pela
análise do fluído uterino, obtido por técnicas in vitro, in vivo ou post-mortem.
Alavi-Shoushtari, Asri-Rezai e Abshenas (2006) analisaram as proteínas
contidas no lúmen de úteros obtidos post-mortem em diferentes dias do ciclo estral
através da técnica de curetagem. Para a determinação da fase do ciclo estral foram
examinadas estruturas presentes no ovário e a tonicidade do útero. As proteínas
Revisão Bibliográfica 37
contidas nos fluídos uterinos foram analisados pela técnica de eletroforese em géis
de agarose.
Freire (2006) e Lima (2006), com o intuito de monitorar as mudanças na
composição do ambiente uterino de forma continua durante o período crítico em
animais cíclicos e prenhes, posicionaram cirurgicamente um cateter no lúmen uterino
de animais experimentais, exteriorizaram a extremidade desse cateter e coletaram
amostras durante o período crítico. Porém o resultado não foi satisfatório, pois os
procedimentos da técnica e a presença dos cateteres no lúmen uterino levaram ao
insucesso na manutenção da gestação.
Niemeyer et al. (2007) utilizando eletroforese unidimensional analisaram
lavados uterinos obtidos por sonda de folley nos dias 14, 16 ou 18 pós-estro de
vacas ciclando ou prenhes e também lavados obtidos post-mortem 18 dias pós-
estro. Entretanto, não foi possível utilizando essa técnica verificar diferenças
significativas nos perfis protéicos das amostras.
Novas abordagens para a obtenção de fluidos uterinos in vivo, que preservem
o funcionamento fisiológico do órgão são necessárias e não estão disponíveis. Após
a obtenção das amostras é extremamente importante definir o processo e a técnica
de análise proteômica a ser utilizada.
2.7.1 Técnicas para análise da composição protéica do ambiente uterino
Após a recuperação do conteúdo presente no ambiente uterino, são
necessárias técnicas específicas de analise proteômica para separar e identificar as
proteínas ali presentes.
O conjunto de proteínas presentes em um determinado meio é chamado de
proteoma. O termo proteoma é oriundo da expressão Proteoma = PROTEínas
expressas pelo genOMA.
Existem muitas definições sobre o termo proteômica. Yates (2001) definiu
proteômica como a ciência de caracterizar e analisar as proteínas, as interações
protéicas e as modificações protéicas de um organismo.
Revisão Bibliográfica 38
A proteômica estrutural se refere ao desenvolvimento e aplicação de meios
para definir a estrutura funcional primária, secundária e terciária das proteínas.
Entretanto a proteômica funcional se refere ao desenvolvimento e aplicação de
experimentos para definir a função das proteínas.
Aebersold (2003) definiu a proteômica como a capacidade de
sistematicamente identificar todas as proteínas expressas em uma célula, tecido ou
meio, assim como determinar as diferentes propriedades de cada proteína como, por
exemplo, a abundância, as modificações no estado, ligações com outras proteínas e
outras. Outra definição apresenta como o estudo da expressão protéica das células,
tecidos ou organismos, e a capacidade de estudar os processos celulares a nível
molecular.
A proteômica tem contribuído grandemente para o entendimento da função
dos genes, na era pós-genoma (LIU et al., 2006). Entretanto, a análise proteômica é
tecnicamente desafiante, independente da técnica utilizada. Essa dificuldade é
devida ao grande número de diferentes proteínas expressas em um determinado
período, em determinada condições biológicas. Alem disso, os estudos do proteoma,
mostram que a maioria das proteínas identificadas são proteínas comuns a todas as
células e estão presentes em números de 10
5
a 10
6
copias por célula, enquanto
proteínas como os receptores, estão presentes em concentrações muito menores, e
normalmente não são detectadas.
Consequentemente são necessários métodos aperfeiçoados para
identificação de proteínas de baixa abundância, como os métodos de detecção mais
sensíveis e métodos quantitativos (GORG et al., 2004).
A separação de um grande número de proteínas pode ser obtida utilizando a
2D-EF, uma técnica considerada essencial para os estudos do proteôma.
2.7.2 Eletroforese Bidimensional
A 2D-EF foi inicialmente introduzida por O’Farrel e Klose em 1975 e é
atualmente uma técnica que pode ser aplicada rotineiramente para quantificação do
perfil de expressão de grande grupos de proteínas em células, tecidos e meios.
Revisão Bibliográfica 39
A técnica de 2D-EF permite a separação de complexos protéicos na primeira
dimensão com a focalização isoelétrica (IEF) a partir do ponto isoelétrico (PI), e na
segunda dimensão com gel desnaturante de poliacrilamida (SDS-PAGE) ocorre a
separação pelo peso molecular (PMR). Dependendo do tamanho do gel e do
gradiente de pH utilizado, a 2D-EF pode determinar mais de 5000 proteínas
simultaneamente. As proteínas são identificadas no gel através da visualização dos
spots, que são as manchas formadas pelas proteínas em seu respectivo ponto
isoelétrico e peso molecular. A intensidade do spot determina a concentração da
proteína presente na amostra, podendo ser detectados spots com concentrações
mínimas de 1ng de proteína. Uma das maiores virtudes da técnica é a capacidade
de estudar as proteínas que passaram por algum tipo de modificação pós-tradução,
como a fosforilação, glicosilação ou proteólise limitada, as quais podem ser
prontamente localizadas nos géis uma vez que aparecem como spots distintos. Além
disso, a 2D-EF não apenas fornece informações sobre as alterações nas proteínas e
no seu nível de expressão, mas também permite o isolamento das proteínas para
uma posterior determinação da sua composição de aminoácidos (GORG et al.,
2004).
Aebersold (2003) mostrou que com a associação da 2D-EF à espectrometria
de massa, detectaram-se as proteínas mais abundantes de um grupo de células.
Apesar das limitações, ainda é a técnica de multi-separação mais utilizada para o
estudo do proteoma de células e tecidos. Ao mesmo tempo, é um método confiável
para comparação de perfis protéicos de diferentes meios, estados ou laboratórios.
Após a digitalização e processamento dos géis, é possível através de programas de
computação específicos medir alterações na expressão pela comparação entre a
densidade óptica dos spots.
A 2D-EF possui utilização prática em diversas áreas de pesquisas onde
busca-se conhecer o perfil protéico das amostras.
Ueno et al. (2000) utilizou a 2D-EF para analisar as proteínas plasmáticas em
pacientes com o mal de Alzheimer. Simpson et al. (2000) realizou analise
proteômica das células de carcinoma de cólon de útero em humanos, utilizando 2D-
EF desenvolvendo um banco de dados das proteínas. Seow et al. (2000) utilizaram
2D-EF ara separar as proteínas das células de carcinoma hepatocelular em
humanos. Após a separação e coloração, as proteínas foram caracterizadas por
Revisão Bibliográfica 40
espectrometria de massa, e identificadas pela predição da seqüência do DNA ou
banco de dados de proteínas (YATES, 1998).
Roncolleta (2003) utilizou a 2D-EF para determinar o perfil protéico do plasma
seminal de bovinos e relacioná-lo com a fertilidade de cada animal, identificando
proteínas associadas à fertilidade nos animais.
Os principais passos para realizar a 2D-EF são (1) preparação da amostra e
solubilização das proteínas; (2) separação das proteínas pela 2D-EF; (3) detecção e
quantificação das proteínas; (4) identificação e caracterização das proteínas; (5)
formação de um banco de dados das proteínas (GORG et al., 2004).
Durante a preparação das amostras, para tirar proveito da alta resolução da
2D-EF, as proteínas da amostra devem ser desnaturadas, desagregadas, reduzidas
e solubilizadas. Esses processos devem alcançar um rompimento completo das
interações inter-moleculares para assegurar que cada spot represente um
polipeptídeo individual (GORG et al., 2004). Recomendações gerais sobre o preparo
de amostras foram descritas por Dunn (1993) e Dunn e Gorg (2001).
A separação das proteínas pela 2D-EF só é possível devido à característica
das proteínas de possuírem diferentes cargas iônicas. Essa particularidade é
explorada utilizando-se da IEF para realizar a primeira dimensão e pela SDS-PAGE
na segunda dimensão.
A IEF é um método eletroforético que separa as proteínas de acordo com o
seu PI. As proteínas são moléculas anfóteras, isso é, elas podem ter carga positiva,
negativa ou neutra, dependendo do pH à sua volta. O PI é o pH específico no qual a
carga da proteína é zero. As proteínas são carregadas positivamente quando o pH
esta abaixo do seu PI, e são carregadas negativamente quando o pH está acima do
seu PI (GORG et al., 2004).
A presença de um gradiente de pH é essencial para a técnica de IEF, pois,
sob a influência de um campo elétrico, cada proteína irá se mover no gradiente para
onde a sua carga é zero. As proteínas com carga positiva irão se mover em direção
ao cátodo, enquanto as proteínas com carga negativa irão em direção ao ânodo
(GORG et al., 2004).
Muitas das dificuldades em realizar a IEF foram superadas com o
desenvolvimento do gradiente de pH imobilizado em fitas denominadas IPG,
disponíveis comercialmente. O protocolo original da 2D-EF com o uso das IPG foi
Revisão Bibliográfica 41
descrito pro Gorg et al. (1988), e atualizado por Gorg et al. (2000) e Gorg et al.
(2004).
As fitas de IPG podem ser lineares ou não lineares com alta (3-12), média (4-
7) ou reduzida (4.9-5.3) variação de pH (GORG et al., 2004).
Após a focalização isoelétrica, a fita de IPG é posicionada sobre um gel de
acrilamida para que as proteínas sejam separadas em uma segunda dimensão pela
técnica SDS-PAGE.
A SDS-PAGE é um método eletroforético para separar as proteínas baseado
no seu PMR. Essa técnica é realizada em gel de poliacrilamida contendo dodecil-
sulfato de sódio (SDS). O gel de acrilamida é uma matriz porosa, formada após a
polimerização da acrilamida que separa as proteínas de acordo com o seu PMR. O
SDS é um detergente aniônico que, devido à sua composição química, se liga às
proteínas tornando-as carregadas negativamente. A quantidade de cargas negativas
é constante por unidade de massa da proteína. Dessa forma, a velocidade de
migração das proteínas no gel depende exclusivamente do seu PMR (GORG et al.,
2004).
Após completada a 2D-EF, as proteínas separadas devem ser visualizadas.
Isso é possível através de métodos de coloração, que podem ser específicos ou
universais. Independente do método de coloração, eles devem apresentar
propriedades importantes, como ter alta sensibilidade, detecção de proteínas de
baixa abundância, reprodutibilidade e ser compatível com procedimentos de
sequenciamento pós-eletroforese (como a espectrometria de massa) (GORG et al.,
2004).
Os métodos universais de coloração dos géis de 2D-EF incluem os corantes
aniônicos (i.e. Coomassie Blue), corantes negativos com cátions metálicos (i.e.
Imidazole de zinco) , o corante de prata, corantes ou marcadores fluorescentes e
isótopos radioativos (GORG et al., 2004). Dentre eles, o Coomassie Blue é o método
de detecção de proteínas mais difundido, por ser acessível, fácil de usar e
compatível com os processos subseqüentes de identificação protéica. A principal
limitação do uso do Coomassie Blue é sua baixa sensibilidade, tendo sua faixa de
detecção entre 200 e 500ng por spot (GORG et al., 2004).
A avaliação visual e comparação manual de géis de 2D-EF de alta resolução
pode não ser possível. Em estudos em larga escala com amostras contendo
milhares de proteínas, pode ser quase impossível detectar a aparição ou o
Revisão Bibliográfica 42
desaparecimento de alguma proteína. Dessa forma, torna-se necessária a captura e
análise das imagens dos géis de 2D-EF por programas computadorizados
específicos. A utilização de tal ferramenta é fundamental para detectar diferenças e
obter o máximo de informações sobre os géis (GORG et al., 2004).
Após digitalizadas, as imagens passam por uma análise seqüencial que
objetiva identificar e quantificar as proteínas presentes no gel. Para isso os
procedimentos incluem a determinação da área individual de cada proteína;
normalização do volume; determinação do ponto isoelétrico e peso molecular das
proteínas; sobreposição entre géis que se queira comparar, determinando-se
proteínas específicas como pontos de referência entre os géis; investigar a
coincidência entre as proteínas dos géis (matching); interpretação e analise dos
dados e criação de banco de dados das proteínas presentes no gel (GORG et al.,
2004).
Para a criação do banco de dados sobre o proteoma de uma determinada
amostra é necessária a identificação das proteínas por sequenciamento. O
mapeamento dos peptídeos por espectrometria de massa (MS) é o primeiro método
para triagem de proteínas, utilizado em muitos laboratórios, devida a sua inerente
simplicidade, precisão na determinação da massa e sensibilidade. A 2D-EF é
utilizada para primeiramente analisar, selecionar e purificar as proteínas, para então,
a MS identificar rapidamente as proteínas isoladas na 2D-EF (STENSBALLE;
JENSEN, 2001).
A identificação das proteínas pela MS é obtida através da digestão enzimática
do spot que fornece a massa do peptídeo. A partir desse ponto é feita uma busca no
banco de dados do proteoma da espécie, ou de outras espécies para então
determinar a identidade da proteína (ISSAQ, 2001).
2.8 Proteínas presentes no ambiente uterino durante o ciclo estral e a prenhez
em bovinos
O ambiente uterino é dinâmico e apresenta diferenças entre as fases do ciclo
estral (BUTLER, 2000). O ambiente uterino dos bovinos é composto por moléculas
Revisão Bibliográfica 43
que constituem o fluido presente no lúmen uterino dos animais cíclicos ou prenhes.
As moléculas ali presentes são originadas pela secreção das glândulas
endometriais, reguladas pelos hormônios do ciclo estral ou pela presença do
embrião ou difundidas a partir do plasma sanguíneo.
Entre as macromoléculas presentes no ambiente uterino, as proteínas
possuem papel de destaque por exercerem funções importantes na preparação do
ambiente uterino para o estabelecimento da prenhez ou para o inicio de um novo
ciclo. As proteínas presentes no ambiente uterino exercem papéis específicos no
processo de reconhecimento materno-embrionário, entre eles o controle do sistema
imune uterino, a nutrição e o processo de implantação do concepto. A identificação
dessas proteínas aumentará o conhecimento dos mecanismos que controlam a
reprodução dos bovinos.
O embrião também é responsável pela liberação de moléculas no ambiente
uterino. O INF-τ é a principal proteína liberada pelo concepto no ambiente uterino,
sua liberação e mecanismo de ação foram apresentados nessa revisão
anteriormente. O bom desenvolvimento do embrião no inicio da prenhez depende do
ambiente uterino. A sinalização local do blastocisto modifica ainda mais o ambiente
uterino e induz a secreção de proteínas especificas pelo epitélio uterino (SPENCER
et al., 2006).
Godkin et al. (1988) coletou conceptos bovinos no período de peri e pós-
adesão (dias 17-24 e 26-38, respectivamente) e após cultivo em meio com presença
de L-[3H] leucina caracterizaram a síntese de proteínas in vitro. O perfil de síntese
protéica foi analisado por 2D-EF seguido por fluorografia. Foram observados grupos
de proteínas ácidas de baixo peso molecular (LMWAP) que apresentaram diferenças
no número e na concentração relativa de proteínas. No grupo “A” as proteínas foram
sintetizadas em maior quantidade entre os dias 17 e 22 da prenhez e permaneceram
ate o dia 38. Foram observadas proteínas com PI entre 5,8 e 6,6 e PMR entre 22 e
26 KDa. Um segundo grupo, “A
1
”, foi formado por duas proteínas com o mesmo
peso molecular que o grupo “A”, porém eram mais ácidas. Apenas uma proteína foi
selecionada no grupo “B”, e apresentava um PI mais acido (5,0) e PMR menor que
os grupos “A
1
” e “A”. A produção das proteínas dos grupos “A
1
” e “B” diminuiu a
níveis indetectáveis após o dia 22. As proteínas do grupo “C” se tornaram visíveis a
partir dos dias 21 e 22 da prenhez e sua produção aumentou em relação as
proteínas do grupo “A” entre os dias 24 e 38. Entre os dias 24 e 29, o grupo era
Revisão Bibliográfica 44
formado por três proteínas com PMR entre 14 e 18KDa. Uma proteína ácida (PI <
4,5) com alto peso molecular (>200kD) classificada no grupo “D” foi liberada no meio
de cultivo entre os dias 17 e 29.
Alavi-Shoushtari et al. (2006) curetou, post-mortem, o lúmen uterino de vacas
em diferentes fases do ciclo estral. Utilizando eletroforese as proteínas da amostra
foram separadas em albumina e globulinas α1, α2, β1, β2, γ1 e γ2. A concentração
total de proteína e o perfil protéico do fluido uterino foram avaliados e comparados
com o do soro sanguíneo em cada fase do ciclo estral. O valor total de proteína e a
quantidade das globulinas α1, α2, β1 e β2 no útero foi maior do que no soro,
enquanto os valores da albumina e das globulinas γ1 e γ2 foram maiores no soro do
que no fluido uterino em todas as fases do ciclo estral, sugerindo que a albumina
não é facilmente transferida ao lúmen uterino.
Nas análises realizadas por Alavi-Shoushtari et al., (2006), foi observado que
durante o pró-estro, a concentração de β2-globulina foi maior do que nas outras
fases do ciclo. A concentração de α1-globulina foram maiores durante o pró-estro e
estro em relação ao meta-estro e diestro. Possivelmente, essa diferença reflita numa
preparação do útero para receber os espermatozóides nessa fase. Durante o meta-
estro, o valor da β1-globulina foi o menor em relação às outras fases do ciclo estral.
No diestro a γ1-globulina esteve menor em relação às outras fases do ciclo estral.
Dos valores obtidos para γ2-globulina, os valores do estro foram menores que nas
outras fases (ALAVI-SHOUSHTARI et al., 2006).
O estrógeno influenciou o aumento da concentração de α1-globulina no soro,
mecanismo o qual foi explicado por Hansen et al. (1986). Deve também ser
considerando o fato de que a α1-globulina é uma proteína presente na fase aguda
da inflamação e o útero possui um mecanismo de defesa mais ativo durante a fase
folicular do ciclo estral, do que durante a fase luteal (EVANS et al., 1986; LYNETTE;
BANDURANT, 2001). Um aumento nas imunoglobulinas no útero durante o pro-estro
e uma diminuição no estro foi observado por Lynette e Bandurant, (2001).
Considerando a γ1 e γ2-globulina como as principais imunoglobulinas no
organismo e seu papel na resposta imune, pode-se concluir que o seu baixo valor
durante o diestro pode favorecer o desenvolvimento embrionário, reduzindo a
resposta imune local e prevenindo uma possível rejeição do concepto (ALAVI-
SHOUSHTARI et al., 2006). As imunoglobulinas do fluido uterino continham γ1 e γ2-
globulina em todas as fases do ciclo menores que no soro, o que reflete um menor
Revisão Bibliográfica 45
taxa de síntese ou transporte dessas proteínas para o útero. Entretanto, o aumento
no pró-estro, pode ser atribuído a um aumento no fluxo sangüíneo e na
permeabilidade capilar que ocorre nessa fase (WINGFIELD; RICKEITS, 1982). A
diferença entre as proteínas do soro e do fluido uterino pode ser devida ao
transporte, síntese e secreção seletiva dessas proteínas para o útero (BEIER, 1978).
Alavi-Shoushtari et al. (2007) realizaram um novo estudo para investigar o
peso molecular do conteúdo protéico uterino, como primeiro passo para a sua
identificação e variação durante o ciclo estral, como parte do ajuste uterino para
preparar o ambiente uterino para os eventos fisiológicos dos bovinos. Usando a
mesma metodologia do seu trabalho anterior (ALAVI-SHOUSHTARI et al., 2006)
amostras de cada fase foram selecionadas aleatoriamente e submetidos a análise
por eletroforese unidimensional. Foram encontrados pesos moleculares de <14.4,
20, 30, 38, 40, 46, 67, 75, 85, 90, 160, 200, 210, 270 e 330KDa. Proteínas com PMR
menor que 14.4 e 46KDa foram observados apenas durante o metaestro. Proteínas
com PMR de 20, 40 e 200KDa foram encontradas apenas no diestro. Proteínas de
PMR de 30KDa no metaestro e diestro e proteínas de 38KDa foram observadas em
valores consideravelmente altos durante o pró-estro e estro. Proteínas de 67,75 e
330KDa foram observadas em todas as fases do ciclo estral, porém apresentando
diferentes concentrações. As maiores concentrações foram encontradaos no diestro,
pró-estro e metaestro, respectivamente. Proteínas com PMR de 85KDa foram
observadas em todas as fases, menos no diestro. Proteínas de 90KDa foram
observados durante o estro e diestro. Proteínas de 160KDa foram observadas no
pró-estro e metaestro. Finalmente, proteínas de 210 e 270KDa foram observadas
apenas no estro. Conclui-se que o perfil protéico do lúmen uterino nos bovinos
altera-se durante o ciclo estral, tanto em qualidade quanto em quantidade, o qual
pode ser parte da adaptação uterina para os eventos fisiológicos do ciclo estral ou
da gestação.
Nos ruminantes, a continua exposição do útero à P
4
induz as glândulas
uterinas a expressar proteínas e as secretá-las no lúmen uterino. As proteínas
melhor caracterizadas, neste período, são as proteínas do leite uterino (UTM). A
UTM são membros da família das inibidoras da protease no soro (PELTIER;
HANSEN, 2001), são excelentes marcadores da capacidade secretora do
endométrio durante a prenhez em ovinos (SPENCER et al., 1998) e possuem
grande atividade inibitória linfocitária (SKOPETS; HANSEN, 1993). Foram
Revisão Bibliográfica 46
identificadas entre elas duas proteínas, com ponto isoelétrico básico e peso
molecular de 55 e 57KDa respectivamente, a útero serpina (US) e a osteopontina
(OPN) (SKOPETS; HANSEN, 1993). A US esta relacionada a inibição na
proliferação linfocitária. A OPN se liga ao concepto, promovendo adesão, expansão
e migração celular, estimulando mudanças na morfologia das membranas extra-
embriônicas do concepto e induzindo a adesão entre o LE e o trofoderma, essencial
para a implantação e placentação (JOHNSON et al., 2003)
O fator de prenhez inicial aparece precocemente e é altamente especifico da
resposta maternal a gestação em todas as espécies mamíferas examinadas,
incluindo os bovinos, humanos, ratos, suínos, coelhos e ovinos (GANDOLFI et al.,
1992). Bioquimicamente é uma glicoproteína de 50KDa produzida pelo concepto
bovino a partir do dia 7 após a fecundação, e que se mantêm até a primeira metade
da gestação. É responsável pela diminuição na resposta linfocitária e regulação da
resposta imune maternal durante a prenhez (GANDOLFI et al., 1992).
Weise et al. (1993) avaliou as alterações na secreção de proteínas por
explantes endometriais de caprinos prenhes e cíclicos durante o período de
reconhecimento materno. Utilizando 2D-EF foi observado entre os dias 18 e 21 da
gestação um aumento no número e concentração de proteínas com peso molecular
entre 18 e 22KDa e ponto isoelétrico entre 6,2 e 7,2, em comparação a secreção de
explantes de animais no dia 18 do ciclo estral. Outras 3 proteínas foram encontradas
apenas na cultura de explantes de animais prenhes no dia 18 pós-estro. Uma
proteína básica (PI > 7,5) de 14KDa, outra com PI de 6,9 e outra de PI 6,0 e 15KDa.
Essas proteínas reduziram sua intensidade no dia 30 da gestação, caracterizando
seu envolvimento com o processo de reconhecimento materno-embrionário nos
caprinos.
Os fatores de crescimento de fibroblastos (FGFs) representam uma grande
família de moduladores autócrinos e parácrinos. Está esclarecido que a ação dos
FGFs não é restrita apenas ao crescimento celular, mas também influencia outros
eventos celulares, incluindo a migração, diferenciação e sobrevivência celular,
angiogênese e tumorigênese. Após a secreção os FGFs se associam à heparina
para estabilizarem sua estrutura e se proteger da proteólise. Essa associação
também limita a difusão dos FGFs e restringe a sua ação nas proximidades de seu
local de produção. Em bovinos, o RNA mensageiro para os FGFs estão presentes
no endométrio durante todo o ciclo estral e no inicio da gestação. Proteínas
Revisão Bibliográfica 47
imunoreativas de FGFs também podem ser detectadas no lúmem uterino de vacas
cíclicas e prenhes no dia 17 pós-estro. Recentemente, os FGFs demonstraram
regular a produção de INF-τ em bovinos. A sua produção aumenta drasticamente
entre os dias 14 e 15 da gestação em bovinos, coincidentemente com o inicio do
alongamento do concepto e a rápida proliferação do trofoectoderma (OCÓN-GROVE
et al., 2007).
O endométrio bovino de animais cíclicos e prenhes possui células
supressoras. Essas células são capazes de liberar fator de supressão com ação
direta sobre a resposta linfocitária e determina a atividade do fator de crescimento
transformante-β (TGF-β). O fator de supressão está associado ao TGF-β, tendo sido
encontrada uma macromolécula carreadora de > 40KDa entre as proteínas do lúmen
uterino (SHIPP; SEGERSON, 1998).
Resultados apresentados por Thomas et al. (1992) confirmaram que o lúmen
uterino de vacas cíclicas e prenhes contém proteína ligante de retinol (RBP). Foram
encontradas diversas isoformas, entre elas a mais abundante apresentava 22KDa
(RBP22) sendo sintetizada em parte pelo endométrio e em parte oriunda do soro
sanguíneo. Foram encontradas proteínas entre 25 e 30KDa (RBP25~30) e 55 e
65KDa (RBP55~65), sendo que possivelmente essa última isoforma seja a RBP22
ligada a albumina ou outra proteína carreadora.
O lúmen uterino é um ambiente complexo, composto por moléculas com
ações especificas de acordo com a fase do ciclo estral ou o estado fisiológico do
animal. A composição do ambiente uterino é alterada pela presença do
embrião/concepto e pelas alterações hormonais que ocorrem durante o processo de
estabelecimento da gestação. Foram citadas nessa revisão algumas poucas
proteínas do ambiente uterino que já foram caracterizadas, assim como a função
que desempenham. Entretanto a complexidade do ambiente uterino ainda requer
muitos estudos visando a identificação e caracterização das funções dessas
proteínas, assim como sua participação na interação materno-embrionária.
Materiais e Métodos
Materiais e Métodos 49
3 MATERIAIS E MÉTODOS
O experimento foi desenvolvido na cidade de Pirassununga, Universidade
de São Paulo, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, nas dependências
do Centro de Biotecnologia em Reprodução Animal (CBRA) do Departamento de
Reprodução Animal da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da USP e
no Laboratório de Fisiologia e Endocrinologia Molecular (LFEM). Todos os
procedimentos experimentais foram aprovados previamente pela Comissão de
Bioética da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da USP.
3.1 Manejo reprodutivo e delineamento experimental
Foram utilizadas fêmeas bovinas azebuadas ciclando (no mínimo meio
sangue zebu), não lactantes cedidas pela Prefeitura do Campus administrativo de
Pirassununga da Universidade de São Paulo. Os animais foram examinados
quanto à sanidade reprodutiva ultrasonograficamente (aparelho ALOKA modelo
SSD -500 equipado com transdutor linear de 7,5 MHz) para detecção de
possíveis anormalidades anatômicas ou patologias que pudessem acometer os
órgãos e estruturas reprodutivas. Os animais foram mantidos em sistema
intensivo de piquetes (Brachiaria decumbens) recebendo suplementação de 25
Kg vaca/dia de cana de açúcar (matéria original), sal mineral e água ad libitum.
Para o experimento foram utilizadas 48 fêmeas bovinas, as quais tiveram
as ovulações sincronizadas pela administração intramuscular de 2mg de
benzoato de estradiol (Centro Paulista de Desenvolvimento Farmacotécnico)
concomitante à aplicação de implante auricular contendo 3mg de norgestomet
(CRESTAR
®
-Intervet) após oito dias foram administrados 530µg de Cloprostenol
sódico (Cloprostenol Sódico
®
265µg /mL Centro Paulista de Desenvolvimento
Farmacotécnico) e foi retirado o implante auricular. No dia 9 os animais
receberam 1mg de benzoato de estradiol e, após 30 horas, 24 animais foram
Materiais e Métodos 50
aleatoriamente selecionados e inseminados. Para a inseminação artificial foi
utilizado sêmen descongelado de uma mesma partida, de um touro da raça
Simental, com características seminais avaliadas previamente e considerado apto
segundo a ASBIA, 2006 (motilidade 75%, vigor 02, concentração 287,5 x 10
6
espermatozóides/cm
3
e com 20% de alterações morfológicas totais). O sêmen foi
cedido pelo Laboratório de Biotecnologias do Sêmen e Andrologia (Centro de
Biotecnologia em Reprodução Animal da FMVZ/USP – Campus Pirassununga). A
dose inseminante utilizada foi de 40x10
6
espermatozóides móveis pós-
descongelamento. Os animais inseminados foram diagnosticados prenhes pela
visualização do concepto ou de seus fragmentos no lavado (Figura 1). Os animais
foram alocados aleatoriamente em grupos para receberem lavagens in vivo por
sonda de folley (12 inseminadas e 7 não inseminadas) ou para receberem
lavagens post-mortem (12 inseminadas e 5 não inseminadas) no dia 18 após o
estro (Figura 1B).
Figura 1 – Fotografia dos conceptos encontrados nos lavados uterinos
obtidos por sonda de folley (A) e post-mortem (B)
B
B A
Materiais e Métodos 51
Figura 2 – Representação esquemática dos procedimentos experimentais (ver
detalhes no texto)
3.1.2 Obtenção dos lavados uterinos in vivo e Post-mortem
Para a obtenção dos lavados uterinos in vivo, os animais receberam 2ml
de anestésico epidural (Lidocaína 2%, Centro Paulista de Desenvolvimento
Farmacotécnico) e no momento da lavagem a região perianal-vulvar foi
higienizada com água e sabão. A seguir, os animais tiveram seus úteros lavados
ANIMAIS
PROCESSAMENTO DOS LAVADOS
ELETROFORESE BIDIMENSIONAL
ANÁLISE DOS GÉIS
LAVADOS UTERINOS
D18
Post mortem
PRENHE
IATF
CICLANDO
I
n vivo
CICLANDO
IATF
PRENHE
Materiais e Métodos 52
por meio de uma sonda de folley siliconizada n
o
24 com 8mm de diâmetro
(Rush
®
) alojada, via transcervical, no corpo uterino. Utilizou-se um sistema de
mangueira Y, para infundir um volume total de 250ml de solução de Ringer a
37
o
C (Figura 3). Porções de 50ml da solução de Ringer foram infundidas e
recuperadas por gravidade em frascos de vidro acondicionados em gelo (Figura
4).
Figura 3 - Fotografia do procedimento de infusão de ringer pelo procedimento de
lavagem uterina por sonda de folley
Figura 4 - Fotografia do procedimento de recuperação do lavado uterino por sonda
de folley
Materiais e Métodos 53
Uma vez recuperados, os lavados foram mantidos em gelo até o transporte
para o laboratório, onde foram centrifugados a 3000 x g por 30 minutos a 4°C
para a remoção de debris celulares, aliquotados e armazenados a -20°C.
Amostras de sangue foram colhidas de todos os animais nos respectivos
dias dos lavados por venopunção da veia sacral mediana e depositados em tubos
de vidro 16 x 100 contendo 350µl de solução citrato de sódio a 30%. O volume
obtido foi mantido em caixa térmica contendo gelo até o momento da
centrifugação, realizada a 3000 x g por 30 minutos a 4 ºC para
hemosedimentação e obtenção do plasma que foi acondicionado em tubo
plástico de 7ml identificado e armazenado em freezer a -20ºC até a realização do
radioimunoensaio para dosagem de progesterona plasmática.
Os animais selecionados para a realização dos lavados post-mortem foram
abatidos por sangria da veia jugular, após insensibilização com pistola
pneumática no matadouro-escola do Campus Administrativo de Pirassununga da
Universidade de São Paulo. Após abertura da cavidade abdominal, coletou-se o
aparelho reprodutivo, dos ovários à cérvice uterina, que foi mantida ocluída por
uma pinça. O material colhido foi acondicionado em saco plástico identificado e
transportado rapidamente ao laboratório acondicionado em isopor com gelo
(Figura 5). As estruturas ovarianas foram observadas para identificação dos
cornos uterinos ipso e contra-lateral ao CL. O útero foi dissecado, removendo-se
os ovários, tubas uterinas, ligamentos e então levado ao fluxo laminar (Figura 6).
Figura 5 – Fotografia do aparelho reprodutivo coletado após o abate dos animais
Materiais e Métodos 54
Figura 6 – Útero dissecado e identificado para coleta de lavado uterino post-
mortem
Em aparelho de fluxo laminar desinfetado com álcool 70%, foram
infundidos pela extremidade cranial do corno uterino contra-lateral ao corpo lúteo
20 mL de Ringer a 37
o
C com o uso de uma seringa de 20 mL e agulha 40x12mm
(Figura 7). O útero foi gentilmente massageado no sentido de lavagem do corno
contra-lateral para o ipso-lateral ao CL (Figura 8). A extremidade cranial do corno
uterino ipsolateral ao CL foi segura com duas pinças e teve sua extremidade
cortada para facilitar a colheita do lavado uterino e do concepto, no caso dos
animais prenhes (Figura 9). O lavado foi colhido em recipiente estéril e após a
remoção do concepto, quando este estava presente, foi centrifugado a 12000 x g
durante 20 minutos para remoção de debris e o sobrenadante armazenado a -
20ºC em alíquotas de 1mL em microtubos esterilizados e identificados.
Figura 7 - Fotografia da infusão de ringer no corno uterino contra-lateral ao CL
Materiais e Métodos 55
Figura 8 – Fotografia do processo de massageamento do útero no sentido de
lavagem do corno contra-lateral para o ipso-lateral ao CL
Figura 9 – Fotografia da colheita do lavado uterino e concepto (no caso de
animais prenhes)
3.1.3 Preparação das amostras para Eletroforese
Para cada tipo de lavado, no mínimo quatro lavados de vacas prenhes e
quatro de vacas não inseminadas foram processados para análises posteriores.
Para a remoção de sais e troca do meio diluente, os quais poderiam alterar
as analises posteriores pela eletroforese, e para concentrar as proteínas
presentes nos lavados, estes foram submetidos à ultra-filtração, utilizando-se
Materiais e Métodos 56
Centricon Plus-20 (Millipore Corporation - EUA) segundo as recomendações do
fabricante para a retenção de moléculas com peso molecular superior a 10kDa. A
seguir, as amostras foram ressuspendidas em água ultrapura (Milli-Q) e
novamente ultra-filtradas. A concentração protéica do material ultra-filtrado
(fração enriquecida em macromoléculas de peso molecular maior que 10 kDa) foi
determinada pelo método de Bradford (1976) utilizando-se placas de 96
cavidades (n° 353911 Falcon
®
- NJ, EUA) e reagente para Bradford n°500-0006N
(BioRad
®
-UK). A seguir as amostras foram aliquotadas em microtubos de 1,5ml
(Axygen
®
-EUA) contendo 1000µg de proteína cada. A seguir, as amostras foram
liofilizadas por 12 horas em aparelho liofilizador da marca Heto-Holten no
Laboratório de Tecnologia de Alimentos FZEA-USP e armazenadas a –20°C
(Figura 10).
Figura 10 – Fotografia do processo de liofilização das amostras
Materiais e Métodos 57
3.1.4 Eletroforese Bidimensional
Para a determinação do perfil protéico do ambiente uterino, as amostras
de lavado uterino coletadas dos animais prenhes e não inseminados foram
submetidas à técnica de Eletroforese Bidimensional em gel de poliacrilamida 10%
seguida de coloração pelo método de Coomasie Blue e análise densitométrica do
perfil protéico.
Amostras liofilizadas contendo 1000µg de proteína foram solubilizadas em
450µl de solução contendo 8 M uréia, 2% CHAPS, 0,002% de Bromofenol-Blue,
1,26mg DTT e 0,5% de tampão IPG (GE Healthcare) e aplicadas em um poço da
bandeja de re-hidratação (GE Healthcare) nivelada sobre superfície plana. A
seguir, sobre a amostra colocou-se uma fita do tipo Immobiline
TM
DryStrip pH 3-
10, 24 cm (GE Healthcare), retiraram-se as bolhas de ar presentes entre a fita e a
amostra e o respectivo poço foi selado com aproximadamente 2ml de óleo
mineral (DryStrip Cover Fluid; Plusone). Fechou-se a tampa da bandeja e a re-
hidratação ocorreu por 15 horas em temperatura ambiente menor que 30º C
(Figura 11). Após a re-hidratação, a fita foi retirada do poço com o auxilio de uma
pinça pela extremidade e colocada verticalmente sobre papel filtro para que
escorresse o óleo excedente.
Para a primeira dimensão de separação das macromoléculas protéicas, na
qual foi realizada a focalização isoelétrica (IEF) as fitas re-hidratadas foram
colocadas individualmente em sarcófagos da bandeja ETTAN JP (GE Healthcare)
posicionada sobre o aparato para IEF Ettan IPGphor II IEF (GE Healthcare) com
a parte contendo o gel virada para baixo e as extremidades positiva e negativa da
fita posicionadas nos pólos positivo e negativo do aparelho, respectivamente. Em
cada extremidade de cada fita foi colocado um papel filtro, de 1,7 x 0,7 cm x 1mm
de espessura, embebido em água ultrapura (Milli-Q), que encontrava-se em
contato com o eletrodo, que foi posicionado posteriormente. Antes de iniciar a
corrida as fitas foram cobertas com óleo mineral (DryStrip Cover Fluid; Plusone).
Para a IEF, o aparelho foi programado em 20º C, 50µA/Strip, 1º passo: 500V –
500Vhr, 2º passo: 1000V – 1000 Vhr e 3º passo: 8000V – 62.500Vhr com tempo
de focalização de aproximadamente 10 horas (Figura 12).
Materiais e Métodos 58
Figura 11 - Fotografia do processo de reidratação das fitas com as amostras
liofilizadas
Figura 12 – Fotografia das fitas reidratadas prontas para a focalização isoelétrica
no aparato Ettan IPGphor II IEF
Após a conclusão da primeira dimensão, as fitas foram retiradas do
sarcófago com o auxilio de uma pinça e novamente colocadas verticalmente
sobre papel filtro para que escorresse o óleo excedente. A seguir, as fitas foram
equilibradas por 15 minutos em 10ml de solução SDS de equilíbrio, a qual
continha
50 mM Tris-HCl com pH 8.8, 6 M uréia, 2% w/v SDS, 30% v/v glycerol,
0.002% w/v bromofenol blue e 100mg de DTT em um volume final de 200mL
completado com água bidestilada e deionizada. Seguiu nova incubação, por 15
minutos, na mesma solução anterior, mas na qual substituiram-se 250mg de
iodoacetamina pelo DTT. As incubações foram realizadas sobre plataforma
Materiais e Métodos 59
agitadora (Figura 13).
A segunda dimensão da 2D-EF tem por princípio separar as proteínas de
acordo com seus respectivos pesos moleculares. Para fazer cada gel (25 x 20 cm
x 15 mm) foram utilizados 100mL de solução contendo 39.5mL de água
bidestilada e deionizada; 25 mL de TRIS-HCL 1.5M com pH 8,8; 33.3 mL de
solução estoque de acrilamida, constituída por 10% w/v acrilamida e 0,8% N-
methylenebisacrilamida; 1ml de solução de 10% w/v SDS; 1 ml de solução de
10% persulfato de amônio e 0,172 µL de TEMED. A fita foi posicionada
horizontalmente na parte superior da placa contendo o gel polimerizado estando
a extremidade da fita que previamente contatou o eletrodo positivo do lado
esquerdo. Ao lado esquerdo do gel, acomodou-se uma tira de papel filtro de 1,7 x
0,7 cm x 1mm de espessura, contendo 20µl de Padrão de Peso Molecular Full-
Range Rainbow™ (GE Healtcare). As placas (n=6) foram seladas com solução
de 0,5% agarose contendo 0,002% w/v Bromofenol Blue. Seis géis correram
simultaneamente na cuba Ettan DALTsix (GE Healtcare) com tampão de corrida
composto de 25 mM TrisBase, 192 mM Glicina e 0,1% w/v SDS na condição de 5
Watts/gel, 600 Volts, 400 mAmperes por 30 minutos (Figura 14). A seguir,
alterou-se a potência para 17 watts/gel e aguardou-se até que a linha de corrida,
que se detecta visualmente, houvesse chegado ao final da placa
(aproximadamente 5 horas). Toda a corrida foi realizada com circulador de água
(Quimes
®
) conectado à cuba e regulado a 10ºC para refrigerar o tampão de
corrida. Os géis foram corados com Comassie Stain Solution (BioRad, Califórnia-
EUA) por duas horas (Figura 15). Posteriormente foram descorados por 24 horas
com solução de 10% de acido acético glacial e 4% de metanol, escaneados pelo
programa LabScan v5.0 (Labcrew™) e digitalizados pelo programa Image
Scanner™II (GE Healthcare).
Materiais e Métodos 60
Figura 13 - Fotografia da incubação das amostras sobre a plataforma agitadora
com solução SDS de equilíbrio
Figura 14 – Fotografia do posicionamento dos géis na cuba de corrida da
segunda dimensão da 2D-EF
Figura 15 – Fotografia do processo de coloração dos géis com Comassie Stain
Solution
Materiais e Métodos 61
3.1.5 Analise dos géis de Eletroforese Bidimensional
Os géis foram analisados para caracterização do perfil protéico utilizando o
programa Image Master-2D ELITE V. 4.01 (GE Healthcare). Utilizando uma
ferramenta do programa, posicionou-se sobre a imagem uma escala do ponto
isoelétrico, baseado na faixa utilizada para a primeira dimensão, e outra do peso
molecular, baseado no posicionamento de cada padrão de peso molecular
adicionado no momento que se procedeu a segunda dimensão da eletroforese,
como descrito anteriormente.
Os géis (n=14) foram analisados individualmente para a identificação de
todas as proteínas presentes em cada um dos géis. As proteínas foram
selecionadas a partir do spot formado pela proteína no gel de acrilamida após
passar pelo processo da eletroforese. Para cada spot foi determinado o volume
normalizado, que foi calculado a partir do produto da área de cada spot pela
densidade óptica absoluta da proteína, após subtração do fundo (background),
sendo considerando para esse procedimento o valor mais baixo da margem
(lowest on boundary) de cada gel.
Após a conclusão das analises individuais, os géis foram agrupados em
um experimento dentro do programa. Foi criado um gel de referência que
continha todos as proteínas presentes em todos os géis. Após a criação do gel de
referência os géis individuais foram separados em grupos de acordo com o
estado e o tipo de lavado (Folley cíclico, n=4; Folley prenhe, n=3; Post-mortem
cíclico, n=4; Post-mortem prenhe, n=3). Para cada grupo foi criado um gel médio,
contendo todas as proteínas que estavam presentes em pelo menos dois géis ou
ausentes em todos os géis daquele grupo. Tanto para a criação do gel de
referência quanto para o gel médio, utilizou-se a ferramenta de overwapping do
programa.
Para realizar a coincidência entre as proteínas dos géis individuais com o
gel de referência e os géis médios respectivos foi realizado o “matching”. O
matching constitui em encontrar a proteína no gel de referência ou no gel médio
que coincidisse com uma determinada proteína no gel analisado. Primeiramente,
esse procedimento foi realizado entre cada um dos géis de cada grupo com seu
respectivo gel médio e depois, entre cada um dos géis médios de cada grupo
Materiais e Métodos 62
com o gel de referência. A seguir, a numeração das proteínas de cada gel,
fornecida automaticamente pelo programa, foi ajustada para que cada proteína
nos géis individuais coincidisse com a proteína respectiva no gel de referência.
Resultou desse procedimento uma tabela contendo os volumes normalizados de
todos as proteínas que atenderam aos critérios supramencionados, em cada um
dos géis.
3.1.6 Radioimunoensaio para Progesterona
A concentração plasmática de progesterona foi mensurada por
radioimunoensaio conforme descrito por Badinga (1992) e modificado por
Carrière e Lee (1994). Os coeficientes intra-ensaios para referências com baixa
concentração (1,25ng/mL) foram de 4,6%, para as de média concentração
(6,46ng/mL) foram de 3,05%, já para as de alta concentração (9,68ng/mL) foram
3,9%.
3.1.7 Análise estatística
Foram utilizados nas análises os animais que apresentaram concentrações
séricas de progesterona indicativas da presença de um corpo lúteo funcional no
momento da obtenção dos lavados uterinos (i.e., ≥ 1ng/mL).
Foi realizada análise de variância do volume normalizado de cada
proteína, considerando como variáveis independentes os efeitos de tipo de
lavado (Folley ou Post-mortem), estado (cíclica ou gestante) e a interação tipo de
lavado por estado. As médias foram apresentadas como média aritmética ± erro
padrão da média. Para as análises utilizou-se o procedimento GLM do software
SAS 9.1. (2002).
Resultados
Resultados 64
4 RESULTADOS
Nos animais sincronizados observou-se taxa de ovulação (número de animais
que ovularam/número de animais submetidos ao protocolo de sincronização da
ovulação) de 73%. A taxa de prenhez (presença do concepto no dia do lavado)
desse experimento foi de aproximadamente 27% (número de animais que foram
encontrados o concepto no lavado/número de animais inseminados). A
concentração de progesterona plasmática apresentou valores superiores a 1ng/mL
para todos os animais que participaram do experimento no dia do lavado.
O perfil protéico dos lavados uterinos obtidos por sonda de folley ou post-
mortem de vacas ciclando ou prenhes, através da 2D-EF constituiu-se de 178
proteínas, cujos pesos moleculares médios variaram entre 2KDa e 110KDa; e
pontos isoelétricos médios entre 3,45 e 8,52 como demonstrado no apêndice A e na
figura 16.
As proteínas foram distribuídas de acordo com o ponto isoelétrico da seguinte
forma: 22% (39/178) entre PI 3 e 5,5; 74% (132/178) entre PI 5,5 e 8 e 4% (7/178)
com PI superior a 8. Em relação ao peso molecular, 44% (79/178) das proteínas
possuíam peso molecular menor que 50KDa; 54% (95/178) entre 50 e 100KDa; 1%
(2/178) acima de 100KDa e 1% (2/178) não tiveram seu peso molecular estimado. A
distribuição das proteínas de acordo com seus pontos isoelétricos e pesos
moleculares estão mencionados abaixo (Tabela 1).
Resultados 65
Tabela 1 – Número de proteínas classificadas por ponto isoelétrico (PI) e peso molecular
relativo (PMR) por região do gel dos lavados uterínos coletados por sondas de
folley ou post-mortem de vacas ciclando (C) ou prenhes (P) 18 dias pós-estro.
PI
PMR Entre 3 e 5,5 Entre 5,5 e 8 > 8 Total
> 100
02
2 (1%)
Entre 50 e
100
20 75
95
(54%)
< 50
19 54 7
79
(44%)
Não
estimado
02
2 (1%)
Total
39 (22%) 132 (74%) 7 (4%) 178
Resultados 66
PI 3 a 10
PI 3 a 10
250
160
105
75
50
35
30
25
15
160
105
75
50
35
25
15
A
B
Resultados 67
PI 3 a 10
PI 3 a 10
250
160
105
75
50
35
30
25
15
250
160
105
75
50
35
30
25
15
Figura 16 – Gel representativo do perfil protéico bi-dimencional dos lavados
uterinos coletados por sonda de folley de vacas ciclando (A) ou
prenhes (B), ou post-mortem de animais ciclando (C) ou prenhes
(D)
C
D
Resultados 68
Foi sumarizada a distribuição das proteínas de acordo com a sua presença
(Tabela 2) ou ausência (Tabela 3) nos lavados uterinos coletados por sonda folley
(F) ou post-mortem (PM) de vacas ciclando (C) ou prenhes (P). Dentre o total de 178
proteínas selecionadas, os lavados realizados por sonda de folley (FC ou FP) foram
os que apresentaram o maior número de proteínas, 151, sendo que os lavados de
animais cíclicos apresentaram 96 proteínas e os de animais prenhes 86. Entretanto
os lavados realizados post-mortem (PMC ou PMP) apresentaram apenas 54
proteínas, das quais 24 estiveram presentes nos lavados PMC e 36 nos lavados
PMP. Em relação ao estado reprodutivo 115 proteínas foram encontradas nos
lavados dos animais cíclicos (FC ou PMC), enquanto 104 proteínas foram
selecionadas nos lavados de animais prenhes (FP e PMP).
Tabela 2 – Número de proteínas presentes concomitantemente em lavados uterinos
listados nas linhas e colunas, coletados por sonda de folley (F) ou post-mortem (PM)
de vacas ciclando (C) ou prenhes (P) 18 dias pós estro.
Grupos FC FP PMC PMP FC ou
FP
FC ou
PMC
FP ou
PMP
PMC ou
PMP
FC 96 31 5 15 96 96 36 17
FP 86 6 18 86 35 86 22
PMC 24 6 7 24 10 24
PMP 36 24 20 36 36
FC ou FP 151 98 91 25
FC ou PMC 115 39 36
FP ou PMP 104 40
PMC ou PMP 54
Resultados 69
Tabela 3 – Número de proteínas presentes em lavados uterinos listados nas linhas,
mas ausentes em lavados uterinos listados nas colunas, coletados por
sonda de folley (F) ou post-mortem (PM) de vacas ciclando (C) ou
prenhes (P) 18 dias pós estro
Grupos FC FP PMC PMP FC ou
FP
FC ou
PMC
FP ou
PMP
PMC ou
PMP
FC 0 55 19 19 55 19 68 37
FP 0 18 18 66 82 18 32
PMC 0 30 145 90 94 30
PMP 0 128 97 68 18
FC ou FP 0 17 13 27
FC ou PMC 0 63 18
FP ou PMP 0 14
PMC ou PMP 0
Analisando as proteínas de acordo com o tipo de lavado, 31 proteínas foram
comuns entre os lavados realizados por sonda de folley (FC e FP), enquanto entre
os lavados realizados post-mortem (PMC e PMP) apenas seis proteínas estiveram
presentes em ambos os lavados.
Nos lavados realizados em animais ciclando (FC e PMC) cinco proteínas
estiveram presentes em ambos os tipos de lavados, enquanto nos lavados
realizados em animais prenhes (FP e PMP) 18 proteínas foram comuns em ambos
os tipos de lavado. Entre os lavados FC e PMP ou FP e PMC, 15 e 6 proteínas,
respectivamente, foram comuns.
A média aritmética e o erro padrão da média do volume normalizado das
proteínas selecionadas presentes nos lavados uterinos coletados por sonda de folley
ou post-mortem de animais cíclicos ou prenhes foram listadas no apêndice B.
Foi realizado análise de variância do volume normalizado das proteínas
presentes nos lavados uterinos, coletados no dia 18 pós-estro, por sonda de folley
ou post-mortem para testar o efeito do tipo de lavado, de animais cíclicos ou
prenhes, para testar efeito de estado e o efeito da interação estado x lavado. Os
valores estão descritos no apêndice C.
Resultados 70
Na análise de variância 17 proteínas apresentaram efeito de estado (P <
0,05), sendo todas as médias do volume normalizado maiores nos animais prenhes
em relação aos animais cíclicos (Tabela 4 e Figura 17). Das proteínas que
apresentaram efeito de tipo de lavado (P < 0,05), 17 tiveram valores médios maiores
nos lavados realizados por sonda de folley em relação aos post-mortem, e apenas 3
apresentaram valores maiores nos lavados post-mortem em relação aos folley.
Dezessete proteínas apresentaram efeito da interação estado x lavado.
Tabela 4 - Sumário da análise de variância da densidade óptica (volume normalizado)
das proteínas identificadas nos lavados uterinos coletados por sonda de
folley (F) ou post-mortem (PM) de vacas ciclando (C) ou prenhes (P) 18 dias
pós-estro
Grupos Número de proteínas
P > C 17 Efeito de estado (P < 0,05)
a
C > P 0
F > PM 17 Efeito de tipo de lavado
(P < 0,05)
b
PM > F 3
Efeito de interação
estado x lavado (P < 0,05)
c
17
a
proteínas cujo volume normalizado foi afetado pelo estado reprodutivo da vaca (C: cíclica; P: prenhe).
b
proteínas cujo volume normalizado foi afetado pelo tipo de lavado realizado (F: sonda de Folley; PM: Post-mortem).
c
proteínas cujo volume normalizado foi afetado pela interação estado x lavado.
Resultados 71
P003
0
0,5
1
1,5
2
CP
Estado
Volume Normalizado (DO)
P044
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
CP
Estado
Volume Normalizado (DO)
P050
0
0,5
1
1,5
2
CP
Estado
Volume Normalizado (DO)
P052
0
0,5
1
1,5
2
CP
Estado
Volume Normalizado (DO)
P054
0
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1
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CP
Estado
Volum e Normalizado
(
DO
)
P072
0
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1
1,5
2
CP
Estado
Volume Normalizado (DO)
Figura 17 - Média aritmética (± erro padrão da média) do volume normalizado de proteínas que
apresentaram efeito de estado, tipo de lavado ou interação estado x tipo de lavado
(P<0,05), em lavados uterinos coletados por sonda de folley (---○---) ou post-mortem
(●) de animais cíclicos (C) ou prenhes (P) no dia 18 pós-estro
Resultados 72
P077
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CP
Estado
Volume Nornalizado (DO)
P079
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CP
Estado
Volume Normalizado (DO)
P088
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CP
Estado
Volume Normalizado (DO)
P105
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Volume Normalizado
(
DO
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Volum e Norm alizado
(
DO
)
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CP
Estado
Volum e Norm alizado
(
DO
)
Figura 17 – Continuação - Média aritmética (± erro padrão da média) do volume normalizado de
proteínas que apresentaram efeito de estado, tipo de lavado ou interação estado x tipo
de lavado (P<0,05), em lavados uterinos coletados por sonda de folley (---○---) ou
post-mortem (●) de animais cíclicos (C) ou prenhes (P) no dia 18 pós-estro
Resultados 73
P168
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CP
Estado
Volume Normalizado (DO)
P209
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CP
Estado
Volume Normalizado (DO)
P243
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CP
Estado
Volume Nornalizado (DO)
P253
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Volume Normalizado
(
DO
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P304
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Volum e Norm alizado
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DO
)
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CP
Estado
Volum e N orm alizado
(
DO
)
Figura 17 – Continuação - Média aritmética (± erro padrão da média) do volume normalizado de
proteínas que apresentaram efeito de estado, tipo de lavado ou interação estado x tipo
de lavado (P<0,05), em lavados uterinos coletados por sonda de folley (---○---) ou
post-mortem (●) de animais cíclicos (C) ou prenhes (P) no dia 18 pós-estro
Resultados 74
P361
0
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0,3
0,4
0,5
CP
Estado
Volume Normalizado (DO)
P128
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Estado
Volume Normalizado
(
DO
)
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Volume Normalizado (DO)
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Volume Normalizado
(
DO
)
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Volum e Norm alizado
(
DO
)
P737
0
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CP
Estado
Volum e N orm alizado
(
DO
)
Figura 17 – Continuação - Média aritmética (± erro padrão da média) do volume normalizado de
proteínas que apresentaram efeito de estado, tipo de lavado ou interação estado x
tipo de lavado (P<0,05), em lavados uterinos coletados por sonda de folley (---○---) ou
p
ost-mortem
(
●
)
de animais cíclicos
(
C
)
ou
p
renhes
(
P
)
no dia 18
p
ós-estro
Resultados 75
P764
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
CP
Estado
Volume Normalizado (DO)
P824
0
0,5
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2
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Estado
Volume Normalizado
(
DO
)
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0,1
0,2
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CP
Estado
Volume Normalizado (DO)
P907
0
0,5
1
1,5
2
CP
Estado
Volum e Norm alizado
(
DO
)
Figura 17 – Continuação - Média aritmética (± erro padrão da média) do volume normalizado de
proteínas que apresentaram efeito de estado, tipo de lavado ou interação estado x tipo
de lavado (P<0,05), em lavados uterinos coletados por sonda de folley (---○---) ou post-
mortem (●) de animais cíclicos (C) ou prenhes (P) no dia 18 pós-estro
Discussão
Discussão 77
5 DISCUSSÃO
O perfil protéico bi-dimensional dos lavados uterinos obtidos por sonda de
folley ou post-mortem apresentou grande variabilidade entre as diferentes amostras.
Para reduzir tal variabilidade, foram selecionadas apenas as proteínas presentes em
pelo menos dois animais em um mesmo grupo ou ausentes em todos os animais de
um determinado grupo. Dada a quantidade limitada de amostra de cada lavado,
apenas foi realizada uma análise de cada lavado (i.e., não houve replicatas de cada
lavado). Deste modo, a presença de uma determinada proteína em pelo menos dois
lavados em um mesmo grupo diminui a probabilidade de que spots presentes nos
géis por artefatos da técnica tenham sido considerados proteínas.
Seguindo esse critério, foram selecionadas 178 proteínas. Roncoletta (2003)
analisou o plasma seminal bovino utilizando a 2D-EF. Esse fluido apresentou um
perfil protéico de 225 proteínas no gel escolhido como referência para o
experimento. Kayser et al. (2006) utilizando 2D-EF, analisou lavados uterinos de
suínos entre os dias 10 e 13 do ciclo estral ou prenhez e obteve um perfil contendo
280 proteínas.
Em relação à distribuição das proteínas de acordo com o ponto isoelétrico,
74% (132/178) apresentaram PI entre 5,5 e 8. Esse resultado era esperado devido
ao fato de Mather (1975) ter relatado que o pH fisiológico do ambiente uterino é 7,3
entre os dias 17 e 18 do ciclo estral.
Entre as 178 proteínas selecionadas para compor o perfil protéico dos
lavados uterinos apenas duas estiveram presentes em todos os grupos (FP, FC,
PMP e PMC). Uma dessas proteínas, a P079 apresentou PM de 79,16 KDa (± 7,16),
Niemeyer et al. (2007) analisando as mesmas amostras por eletroforese
unidimensional, semelhantemente encontrou um proteína com PMR de 79KDa em
todas as amostras analisadas. Entretanto, esse número é menor que o valor
encontrado por Roncoletta (2003) que analisou o plasma seminal bovino utilizando a
2D-EF e apresentou um perfil de 225 proteínas no gel escolhido como referência
para o experimento, sendo que dessas, 40 proteínas apresentaram-se em todas as
amostras.
Em relação à presença e ausência das proteínas nos diferentes grupos, foram
encontradas cinco proteínas comuns entre os lavados de animais ciclando (FC e
PMC). Sugere-se que tais proteínas sejam exclusivas do ambiente uterino de vacas
Discussão 78
ciclando.
Os lavados realizados por sonda de folley (FC ou FP) apresentaram um
número de proteínas bastante superior aos lavados realizados post-mortem (PMC
ou PMP), 151 e 54 respectivamente. Concluiu-se que há evidente efeito do método
utilizado para obtenção do lavado sobre a composição do perfil protéico.
A metodologia utilizada para obtenção de lavados uterinos por sonda de folley
é conveniente, pois como é realizado in vivo preserva o animal, permitindo que
futuras análises sejam realizadas utilizando o mesmo animal, descartando efeitos
genéticos nos resultados obtidos. Entretanto, existe a hipótese de que a
manipulação do aparelho reprodutivo necessária para a obtenção dos lavados altere
a composição do meio e impeça a identificação das proteínas específicas da fase ou
estado do animal.
Segundo Bartol et al. (1985) e também proposto por Niemeyer et al. (2007) a
manipulação do aparelho reprodutivo pode causar inflamação, edema e influxo de
proteínas séricas para o lúmen uterino. Uma possível explicação para a composição
similar entre os lavados estudados, é que a maioria das proteínas encontradas são
de origem plasmática, como a albumina e as globulinas (LEE et al., 1998; ALAVI-
SHOUSHTARI et al., 2006). Este fator pode explicar a similaridade entre o perfil
protéico de lavados obtidos por sonda de folley em vacas ciclando e prenhes.
Dezoito proteínas foram encontradas em ambos lavados de animais prenhes
(FP e PMP). Supõe-se que essas sejam proteínas específicas do ambiente uterino
de animais prenhes ao redor do 18º dia da gestação. Esses resultados foram obtidos
devido a uma maior sensibilidade da 2D-EF na separação de proteínas em relação à
eletroforese unidimensional, uma vez que Niemeyer et al. (2007) analisando as
mesmas amostras não encontraram diferenças entre os perfis protéicos dos lavados
uterinos de vacas ciclando ou prenhes.
Foram encontradas 31 proteínas semelhantes presentes em lavados
realizados por sonda de folley (FC e FP). Supõe-se que essas proteínas sejam de
origem sérica e sua presença nesse método de lavado deva-se ao extravasamento
das mesmas pela manipulação dos cornos uterinos durante a obtenção do lavado.
Essa suposição pode ser confirmada pela presença da proteína P223 que
apresentou PMR de 60,66 (± 5,65). Esse PMR corresponde à albumina, a principal
proteína sérica. Esse resultado foi semelhante ao encontrado por Niemeyer et al.
(2007) que destacou uma proteína com PMR de 59KDa, sendo a proteína de maior
Discussão 79
abundancia entre os lavados. Da mesma forma a proteína P223 apresentou uma
densidade óptica média de 1,70 (±1,23) para o grupo FC e 2,37 (±2,19) no grupo FP.
Esses resultados estão de acordo com Berendt et al. (2005) que verificou que o
excesso de albumina encontrado nos lavados uterinos são de origem sérica e
passaram para o lúmen pelos capilares presentes na parede do endométrio
altamente vascularizado. Entretanto, segundo Alavi-Shoushtari et al. (2006) a
albumina esta presente no ambiente uterino durante o ciclo estral, porém acredita-se
que em concentrações menores do que as possivelmente detectáveis nos lavados
post-mortem por 2D-EF.
Entre as amostras obtidas nos lavados post-mortem (PMC e PMP), foram
selecionadas seis proteínas semelhantes neste método de lavagem. Tais proteínas
devem ser constituintes do ambiente uterino de animais prenhes e cíclicos, pois sua
representatividade exclusiva neste método de lavado seria devido a uma menor
concentração relativa de proteínas séricas nesses lavados em comparação ao que
ocorre nos lavados obtidos por sonda de folley, o que permite que as proteínas
específicas do ambiente uterino tenham maior representatividade no perfil protéico
uterino, em relação ao perfil dos lavados realizados por sonda de folley onde a
diluição com outras proteínas é maior. Essa conclusão é confirmada por Niemeyer et
al. (2007) que concluíram que as proteínas secretadas pelo útero e pelo concepto
estão presentes nos lavados coletados por sonda de folley, porém em
concentrações abaixo do limite de detecção da técnica utilizada por eles.
As proteínas que estiveram presentes apenas nos lavados FC e PMP ou nos
lavados FP e PMC, 15 e 6 respectivamente, sugere que houve uma falha na
detecção desta proteínas nos outros grupos, nos quais elas estiveram ausentes,
pois não se encontrou uma explicação plausível fisiologicamente para explicar esse
fenômeno.
Foram selecionadas 19 proteínas presentes nos lavados FC e 18 proteínas
presentes nos lavados FP. Devido à ausência dessas proteínas nos respectivos
estados nos lavados post-mortem, conclui-se que essas proteínas são de origem
sérica, oriundas da manipulação do útero durante a obtenção dos lavados.
Entretanto as proteínas que estavam presentes no grupo FC e não estavam
presentes no grupo FP, sugere que houve uma falha na detecção destas proteínas
durante as analises, assim como das proteínas presentes no grupo FP e ausentes
Discussão 80
no grupo FC.
Destacam-se 10 proteínas selecionadas apenas entre os lavados PMP, o que
as caracteriza como proteínas exclusivas do ambiente uterino de animais no dia 18
da gestação. Essas proteínas apresentaram valores da densidade óptica média
baixas, com exceção da proteína P936 que apresentou densidade óptica média de
4,05 (±4,03). Julga-se que essas proteínas, com exceção da P936, não foram
encontradas nos lavados FP devido a uma maior diluição com outras proteínas
provavelmente de origem séricas. Entretanto, a não identificação da proteína P936
nos lavados por sonda de folley, pode ser devido a uma falha na sua detecção no
grupo FP, uma vez que seu volume nos lavados post-mortem foi alto.
Justificando a ausência de determinadas proteínas entre os grupos, atribui-se
aos lavados FC e FP, que a presença de uma grande quantidade de proteínas de
origem sérica, devido a manipulação do útero no momento da obtenção dos lavados,
tenha impedido a recuperação e a identificação das mesmas proteínas selecionadas
nos lavados post-mortem.
Entretanto obteve-se uma grande quantidade de proteínas ausentes nos
lavados realizados PM, em ambos estados cíclico e prenhe. Essa ausência
possivelmente é devido ao fato de a maior parte das proteínas selecionadas serem
oriundas dos lavados realizados por sonda de folley, e provavelmente originadas da
circulação sangüínea. Entretanto, questiona-se se os lavados post-mortem
apresentam realmente uma menor concentração de proteínas em relação aos
lavados coletados por sonda de folley, ou houve alguma falha no processamento
das amostras.
Entre as proteínas que apresentaram efeito significativo (P < 0,05) na análise
de variância das médias da densidade óptica entre os diferentes grupos, as
proteínas P044, P105, P163, P253, P304, P310, P361, P369, P718, P764
apresentaram efeito de estado, tipo de lavado e interação estado x lavado. Esse
efeito foi pelo fato dessas proteínas estarem presentes apenas nos lavados FP.
Supõe-se que essas proteínas sejam características da gestação, porém de origem
sérica, por estarem presentes nos lavados FC com densidade óptica muito baixa. A
ausência dessas proteínas nos lavados PMP pode ser devido a falhas na detecção
devido a sua baixa concentração.
Da mesma forma as proteínas P827 e P907 apresentaram efeito de estado,
lavado e interação estado x lavado, porém essas estavam presentes apenas nos
Discussão 81
lavados PMP. Essas proteínas também podem ser caracterizadas como exclusivas
de animais prenhes, sintetizadas in situ. Sua ausência nos lavados FP seria devido
ao efeito de diluição das proteínas séricas extravasadas no lúmen uterino no
momento da coleta do lavado.
As proteínas P050, P052, P053, P054 e P168 apresentaram efeito de estado,
pois estavam presentes apenas nos lavados de animais prenhes (FP e PMP).
Apesar dessas proteínas não apresentarem efeito de lavado, todas apresentaram
maior média do volume normalizado nos lavados post-mortem em relação aos
lavados por sonda de folley. Supõe-se que essas proteínas estejam envolvidas com
o processo de reconhecimento materno da gestação, por estarem presentes apenas
nos lavados de animais prenhes. A densidade óptica média de todas essas
proteínas estiveram maiores nos lavados post-mortem em relação aos por sonda de
folley, embora a diferença não tenha sido significativa, atribui-se o menor valor da
densidade óptica nos lavados por sonda de folley a uma maior diluição dessas
proteínas por outras de origem sérica presentes no lavado.
As proteínas P072, P088, P128, P209 e P243 apresentaram efeito de lavado,
pois estavam presentes apenas nos lavados realizados por sonda de folley.
Caracterizando-as como proteínas séricas presentes no lavado devido a
manipulação do aparelho reprodutivo durante a obtenção dos lavados.
As proteínas P398, P431 e P737 apresentaram apenas efeito da interação
estado x lavado, pois elas estavam presentes alternadamente nos lavados folley
cíclico e post-mortem prenhe ou folley prenhe e post-mortem cíclico. Essa interação
é resultado da ausência dessas proteínas nos outros grupos do mesmo método de
lavagem ou estado fisiológico, sugerindo que houve falha na detecção destas
proteínas, pois não se encontrou outra explicação plausível fisiologicamente para
esse fenômeno.
A proteína P079 foi a única que apresentou efeito de lavado e interação
estado x lavado, estando presente em todos os grupos de lavados (FC, FP, PMC e
PMP), apresentando média do volume normalizado maior nos lavados realizados por
sonda de folley em relação as realizados post-mortem. Com isso concluí-se que
essa proteína é integrante do ambiente uterino, e por apresentar média do volume
normalizado maior nos lavados por sonda de folley sugere que seja de origem
sérica.
A proteína P077 esteve presente nos lavados por sonda de folley (FC e FP) e
Discussão 82
nos lavados post-mortem de vacas prenhez. Apresentou efeito de lavado por possuir
densidade óptica média maior nos lavados por sonda de folley. Com isso, conclui-se
que essa seja também uma proteína integrante do ambiente uterino de origem
sérica, e a sua ausência nos lavados PMC seja por falhas na detecção da proteína.
A proteína P824 apresentou efeito de lavado, por que esteve presente
somente nos lavados realizados post-mortem (PMC e PMP). Esse resultado sugere
que assim como a P079, essa proteína seja integrante do ambiente uterino, porém
sintetizada in situ, uma vez que nos lavados por sonda de folley que apresentaram
uma diluição por proteínas séricas, não foi possível a sua identificação.
Foi detectado um número de proteínas bastante superior ao descrito por
Niemeyer et al. (2007) que analisaram as mesmas amostras utilizando a eletroforese
unidimensional. A separação das proteínas pelo ponto isoelétrico é uma ferramenta
importante na separação das proteínas, o que explica a diferença no número de
proteínas encontradas na 2D-EF em relação a eletroforese unidimensional.
Entretanto obteve-se um número de proteínas abaixo do esperado nos
lavados realizados post-mortem. Possivelmente houve menor infiltração de proteinas
do soro no momento da realização do lavado. Outra explicação seria por uma falha
no processamento das amostras ou durante a 2D-EF.
Houve a detecção de proteínas presentes apenas nos lavados de vacas
prenhes, que podem estar envolvidas no dialogo materno-embrionário durante o
processo de estabelecimento da gestação. Após seqüenciamento e identificação, a
presença das mesmas deve ser confirmada e sua função testada em experimento
delineados especificamente para esse fim.
Conclusão
Conclusões 84
6 CONCLUSÕES E IMPLICAÇÕES
O lúmen uterino é um ambiente distinto, que possui função específica, e a
determinação de seus componentes, assim como a sua função depende da coleta,
processamento e analise desse meio.
Na presente dissertação, confirmou-se a hipótese postulada inicialmente, uma
vez que de fato ocorreram diferenças no perfil de proteínas presentes em lavados
uterinos de vacas ciclando ou gestantes no período crítico.
Embora o perfil protéico dos lavados uterinos realizados por sonda de folley
seja influenciado por proteínas do soro sanguíneo, devido à manipulação do
aparelho reprodutivo durante a obtenção dos lavados, existem varias proteínas
específicas capazes de serem detectadas nesse método de lavado.
Esperava-se uma maior efetividade dos lavados realizados post-mortem em
relação aos realizados por sonda de folley. Entretanto os lavados obtidos por sonda
de folley foi melhor por identificar um maior numero de proteínas, o que permitiu
identificarmos diferenças maiores entre os lavados de animais ciclando e prenhes.
Devido a baixa concentração de proteínas presentes nos lavados post-
mortem, são necessários ajustes na sensibilidade durante a análises dos resultados.
A 2D-EF é uma técnica capaz de caracterizar o perfil protéico do ambiente
uterino de fêmeas bovinas, assim como identificar alterações nesse perfil de acordo
com a fase ou estado fisiológico do animal. Entretanto são necessários ajustes para
uma maior sensibilidade na identificação e quantificação das proteínas. A análise
dos lavados, embora que computadorizada, ainda é muito subjetiva, sendo
importante a repetibilidade das análises para fundamentar os resultados. Isso
explica o maior numero de proteínas com freqüência diferente em relação ao
numero de proteínas com diferença estatística.
Uma vez definido o perfil protéico e a origem das proteínas presentes no
ambiente uterino, é necessário relaciona-las à fertilidade do animal, sendo a melhora
deste índice o objetivo final desse estudo. Para tanto, faz-se extremamente
necessária o sequenciamento das proteínas e estudos específicos sobre as
mesmas.
Conclusões 85
Contudo conclui-se que o perfil protéico do ambiente uterino pode ser
influenciado pelo método utilizado para obtenção dos lavados, alterando a
composição, predominantemente por proteínas não especificas da fase ou do estado
reprodutivo do animal, entretanto comparações entre diferentes métodos pode
selecionar proteínas especificas do ambiente uterino.
Referências
Referências 87
REFERÊNCIAS
AEBERSOLD, R.; MANN, M. Protein identification by mass spectrometry, Nature, v.
422, p. 198–207, 2003.
ALAVI-SHOUSHTARI, S. M.; ASRI-REZAI, S.; ABSHENAS, J. A study of the uterine
protein variations during the estrus cycle in the cow: A comparison with the serum
proteins. Animal Reproduction Science, v. 96, n. 1-2, p. 10-20, 2006.
ALAVI-SHOUSHTARI, S. M.; ASRI-REZAI, S.; ABSHENAS, J. A study of the uterine
protein variations during the estrus cycle in the cow: Molecular weights
determination. Animal Reproduction Science, In Press, Corrected Proof, Available
online 27 March 2007. Disponivel em: doi:10.1016/j.anireprosci.2007.03.018. Acesso
em: 17/08/2007.
ALEXENKO A.P.; EALY A.D.; BIXBY J.A.; ROBERTS R.M. A classification of
interferon-τ. Journal Interferon Research, v. 20, p. 817-822, 2000.
ALEXENKO A.P.; LEAMAN D.W.; LI L.; ROBERTS R.M. The antiproliferative and
antiviral activities of IFN-τ variants in human cells. Journal Interferon Research, v.
17, p. 769-779, 1997.
ANTHONY, R. V.; LIANG, R.; KAYL, E. P.; PRATT S. L. The growth
hormone/prolactin gene family in ruminant placentae. Journal Reproduction
Fertility(Suppl), v. 49, p. 83–95, 1995.
ASSELIN, E.; DROLET, P.; FORTIER, M.A. In vitro response to oxytocin and
interferon-tau in bovine endometrial cells from caruncular and inter-caruncular areas.
Biology of Reproduction, v. 59, p. 241-247, 1998.
ASSELIN, E.; FORTIER, M. A. Detection and regulation of the messenger for a
putative bovine endometrial 9-keto-prostaglandin E2 reductase: effect of oxytocin
and interferon-tau. Biology of Reproduction, v. 62, p. 125-131, 2000.
BADINGA, L.; DRIANCOURT, M. A.; SAVIO, J. D.; WOLFENSON, D.; DROST, M.;
DE LA COSTA, R. L.; THATCHER, W. W. Endocrine and ovarian responses
associated with the first-wave dominant follicle in cattle. Biology of Reproduction, v.
47, p. 871-883. 1992.
BANU, S. K.; AROSH, J. A.; CHAPDELAINE, P.; FORTIER, M. A. Molecular cloning
and spatio-temporal expression of the prostaglandin transporter: A basis for the
action of prostaglandins in the bovine reproductive system. PNSA, v. 30, n. 20, p.
11747-11752, 2003.
Referências 88
BARTOL, F. F.; ROBERTS, R. M.; BAZER, F. W.; THATCHER, W. W.
Characterization of proteins produced in vitro by bovine endometrial explants.
Biology of Reproduction, v. 33, p. 745-759, 1985.
BATHGATE R. A. D.; TILLMANN G.; IVELL R. Molecular mechanism of the bovine
oxytocin receptor gene regulation. Biology of Reproduction, v. 58, 1998.
Supplement, 160,
BAZER, F. W.; ROBERTS, R. M.; ZAVY, M. T; CATON, D.; BARRON, D. H. Method
for obtaining ovine uterine secretions from unilaterally pregnant ewes. Journal of
Animal Science, v. 49, n. 6, p. 1522- 1527, 1975.
BEIER, H. M. Physiology of uteroglobulins. In: SPILMAN, C. H.; WILKS, J. W. (Ed.).
Novel aspects of reproductive physiology. New York: Spectrum Pub. Inc., 1978.
p. 220–248.
BINELLI, M.; THATCHER, W. W. Conceptus stimulated signal transduction pathway
in the endometrium to maintain pregnancy. Annual Review of Biomedical
Sciences. v. 1, p. 59- 85. 1999.
BINELLI, M.; GUZELOGLU A.; BADINGA L.; ARNOLD, D. R.; SIROIS, J.; HANSEN,
T. R.; THATCHER, W. W. Interferon-t modulates phorbol ester-induced production of
prostaglandin and expression of cyclooxygenase-2 and phospholipase α2 from
bovine endometrial cells. Biology Reproduction, v. 63, p. 417-424, 2000.
BINELLI, M.; SUBRAMANIAM, P.; DIAZ, T.; JOHNSON, G. A.; HANSEN, T. R.;
BADINGA, L.; THATCHER, W. W. Bovine interferon-tau stimulates the janus kinase-
signal transducer and activator of transcription pathway in bovine endometrial
epithelial cells. Biology Reproduction, v. 64, p. 654-665, 2001.
BOTTARI, S. P.; VOKAER, A.; KAIVEZ, E.; LESCRAINER, J. P.; VAUQUELIN, G. P.
Differential regulation of alpha-adrenergic receptor subclasses by gonadal steroids in
human myometrium. Journal Clinical Endocrinology Metabolism, v. 57, p. 937–
941, 1983.
BRADFORD, M. M. A rapid and sensitive method for the quantification of microgram
quantities of proteins utilizing the principle of protein-dye binding. Anal
Biochemistry, v. 72, p. 248-254, 1976.
BREUEL, K. F.; LEWIS, P. E.; SCHRICK, F. N.; LISHMAN, A. W.; INSKEEP, E. K.;
BUTCHER, R. L. Factors affecting fertility in the postpartum cow: role of the oocyte
and follicle in conception rate. Biology Reproduction, v. 48, p. 655–661, 1993.
BUTLER, W. R. Nutritional interactions with reproductive performance in dairv cattle.
Animal Reproduction Science, v. 60-61, p. 449-457, 2000.
BUTLER, W. R. Effect of protein nutrition on ovarian and uterine physiology in dairy
cattle. Journal of Dairy Science, v. 81, n. 9, p. 2533-2539, 2001.
Referências 89
CARRIÈRE, P.D.; LEE, B. Direct Radioimmunoassay of Progesterone in Bovine
Plasma using Danazol (17-α-2,4-pregnadien-20-yno(2,3-d)isoxazol-17-ol) as a
Displacing Agent. Canadian Journal Veterinary Research, v. 58, p. 230-233. 1994.
CHARPIGNY, G.; REINAUD, P.; TAMBY, J. P.; CREMINON, C.; MARTAL, J.;
MACLOUF, J.; GUILLMOT, M. Expression of cyclooxygenase-1 and -2 in ovine
endometrium during the estrous cycle and early pregnancy. Endocrinology, v. 138,
p. 2163-2171, 1997.
CHEW, B. P.; ERB, R. E.; FESSLER, J. F.; CALLAHAN, C. J.; MALVEN, P. V.
Effects of ovariectomy and of prematurely induced parturition on progesterone,
estrogens, and calving traits. Journal of Dairy Science, v. 62, p. 557–566, 1979.
COMMITTEE ON BOVINE REPRODUCTIVE NOMENCLATURE. Recommendations
for standardizing bovine reproductive terms. Comell Veterinary, v. 62, p. 216-237,
1972.
CRISTIANSON, W. T. Stillbirths mummies, abortions and early embryonic death. The
Veterinary Clinics of North America, Food Animal Practice, v. 8, p. 623-639,
1992.
CUMMINGS, A. M.; YOCHIM, J. M. Differentiation of the uterus in preparation for
gestation: a model for the action of progesterone. Journal of theriogenology and
biology, v. 106, p. 353–374, 1984.
CURRIE, W. B.; CARD, C. E.; MICHEL, F. J.; IGNOTZ, G. Purification, partial
characterization, and development of a specific radioimmunoassay for goat placental
lactogen. Reproduction Fertility, v. 90, p. 25–26, 1990.
DANET-DESNOYERS, C.; WETZELS, C.; THATCHER, W. W. Natural and
recombinant bovine interferon-tau regulate basal and oxytocin-induced secretion of
prostaglandins F2α and E2 by epithelial and stromal cells in the endometrium.
Reproduction Fertility Development, v. 6, p. 193-202, 1994.
DARNELL, J.E. STATs and gene regulation. Science, v. 277, p. 1630-1635, 1997.
DEMMERS, K. J.; DERECKA, K.; FLINT, A. Trophoblast interferon and pregnancy.
Reproduction, v. 121, p. 41-49, 2001.
DISKIN, M. G.; SREENAN, J. M. Fertilization and embryonic mortality rates in beef
heifers after artificial insemination. Journal of reproduction and fertility, v. 59, p.
463-468, 1980.
DUNN, M. J. Gel electrophoresis: proteins. Oxford: England: BIOS, 1993. p. 41–
127.
DUNN, M. J.; GÖRG, A. In: PENNINGTON, S. R.; DUNN, M. J. (Ed.). Proteomics –
from protein sequence to function. Oxford; England: BIOS, 2001. p. 43–63.
Referências 90
DUNNE, L. D.; DISKIN, M. G.; SREENAN, J. M. Embryo and fetal loss in beef heifers
between day 14 of gestation and full term. Animal Reproduction Science, v. 58, p.
39-44, 2000.
EALY, A. D.; GREEN, J. A.; ALEXENKO, A. P.; KEISLER, D. H.; ROBERTS, R. M.
Different ovine interferon-tau genes are not expressed identically and their protein
products display different activities. Biology Reproduction, v. 58, p. 566-573, 1998.
EALY, A. D.; LARSON, S. F.; LIU, L.; WILKELMANN, G. L.; KUBISH, H. M.; BIXBY,
J. A.; ROBERTS, R. M. Polymorphic forms of expressed bovine interferon-τ genes:
relative transcript abundance during early placental development, promoter
sequences of genes and biological activity of protein products. Endocrinology, v.
142, p. 2906-2915, 2001.
EALY, A. D.; WAGNER, S. K.; SHEILS, A. E.; WHITLEY, N. C.; KIESLING, D. O.;
JOHNSON, S. E.; BARBATO, G. F. Identification of interferon-τ isoforms expressed
by the peri-implantation goat (Capra hircus) conceptus. Domestic Animal
Endocrinology, v. 27, p. 39-49, 2004.
EVANS, M. J.; HAMER, J. M.; GASON, L. M.; GRAHAM, C. S.; ASBURY, A. C.;
IRVINE, C. H. G. Clearance of bacteria and non-antigenic markers following intra-
uterine inoculation into maiden mares: effects of steroid hormone environment.
Theriogenology, v. 26, n. 1, p. 37–50, 1986.
FARIN, C. E.; IMAKAWA, K.; ROBERTS, R. M. In situ localization of mRNA for the
interferon, ovine trophoblast protein-1, during embryonic development of the sheep.
Molecular Endocrinology, v. 3, p. 1099-1107, 1989.
FLEMING, J. A.; CHOI, Y.; JOHNSON, G. A.; SPENCER, T. E.; BAZER, F. W.
Cloning of the ovine estrogen receptor-alpha promoter and functional regulation by
ovine interferon-tau. Endocrinology, v. 142, p. 2879–2887, 2001.
FORD, S. P.; CHRISTENSON, R.K; CHENAULT, J. R. Pattern of blood flow to the
uterus and ovaries of ewes during the period of luteal regression. Journal of Animal
Science, v. 49, p. 1510–1516, 1979.
FREIRE, A. F. Desenvolvimento de um método de microlavagem para estudo do
microambiente uterino em bovinos: efeitos na função luteínica, crescimento folicular
e manutenção da prenhez inicial. 123 f. Dissertação (Mestrado em Medicina
Veterinária) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São
Paulo, São Paulo, 2006.
FUCHS, A. R.; BEHRENS, O.; HELMER, H.; LIU, C-H.; BARROS, C. M.; FIELDS, L.
J. Oxytocin and vasopressin receptor in bovine endometrium and myometrium during
the oestrous cycle and early pregnancy. Endocrinology, v. 12, p. 629–636, 1990.
Referências 91
GANDOLFI, F.; BREVINI, S.; MODINA, S.; PASSONI, L. Early embryonic signals:
embryo-maternal interactions before implantation. Animal Reproduction Science, v.
28, p. 269–276. 1992.
GARRETT, J. E.; GEISERT, R. D.; ZAVY, M. T.; MORGAN, G. L. Evidence for
maternal regulation of early conceptus growth and development in beef cattle.
Journal Reproduction Fertility, v. 84, p. 437–46, 1988.
GEISERT, R. D.; ZAVY, M. T.; BIGGERS, B. G. Effect of heat stress on conceptus
and uterine secretion in the bovine. Theriogenology, v. 10, p. 82–75, 1988.
GEISERT, R. D.; PRATT, T. N.; BAZER, F. W.; MAYES, J. S.; WATSON, G. H.
Immunocytochemical localization and changes in endometrial progestin receptor
protein during the porcine oestrous cycle and early pregnancy. Reproduction
Fertility Development, v. 6, p. 749-760, 1994.
GERTLER, A.; DJIANE, J. Mechanism of ruminant placental lactogen action:
molecular and in Vivo studies. Molecular genetics and metabolism, v. 63, p. 189–
201, 2002.
GUILLOMOT, M.; MICHEL, C.; GAYE, P.; CHARLIER, M.; TROJAN, J.; MARTAL, J.
Cellular localization of an embryonic interferon, ovine trophoblastin and its mRNA in
sheep embryos during early pregnancy. Biology Cellular, v. 68, p. 205-211, 1990.
GUILLOMOT, M. Cellular interactions during implantation in domestic ruminants.
Journal Reproduction Fertility Suppl, v. 49, p. 39–51. 1995.
GODKIN, J.D.; BAZER, F.W.; ROBERTS, R.M. Ovine trophoblast protein 1, an early
secreted blastocyst protein, binds specifically to uterine endometrium and affects
protein synthesis. Endocrinology, v. 114, p. 120-130, 1984.
GODKIN, K. D.; LIFSEY, B. J.; GILLESPIE, B. E. Characterization of bovine
conceptus proteins produced during the peri- and postattachement periods of early
pregnancy. Biology of reproduction, v. 38, p. 703-711, 1988.
GODKIN, J. D.; SMITH, S. E.; JOHNSON R. D.; DORE, J. J. E. The role of
trophoblast interferons in the maintenance of early pregnancy in ruminants.
American Journal Reproduction Immunology, v. 37, p. 137-143, 1997.
GOOF, A.K. Embryonic signals and survival. Reproduction of Domestic Animals,
v. 37, p. 133-139, 2002.
GÖRG, A.; POSTEL, W.; GÜNTHER, S. Electrophoresis. Proteomics, v. 9, p. 531–
546. 1988.
GÖRG, A.; WEISS, W.; Two-Dimensional Electrophoresis and Identification Methods,
em: RABILLOUD, T. (Ed.). Proteome research: Berlin, Germany: Springer, 2000. p.
57–106.
Referências 92
GORG, A.; WEISS, W.; DUNN, M. J. Current two-dimensional electrophoresis
technology for proteomics. Proteomics, v. 4, p. 3665-3685, 2004.
HAFEZ, E. S. E. Fisiologia da reprodução. In: HAFEZ, E. S. E.(Ed.). Reprodução
animal. 7th ed. São Paulo: Ed. Manole, 2004.
HANK, H.W. Infertility in dairy cattle. Animal Reproduction, v. 3, p. 19-29, 1979.
HANSEN, P. J.; BAZER, F. W.; SEGERSON, E. C. Skin graft survival in the uterine
lumen of ewes treated with progesterone. American Journal Reproduction
Immunology Microbiology, v. 12, p. 48–54. 1986.
HARDA H.; FUJITA T.; MYIAMOTO M.; KIMURA Y.; MARUYAMA M.; FURIA A.;
MIYATA T.; TANIGUCHI T. Strucuturally similar but functionally distinct factors, IRF-1
and IRF-2, bind to the same regulatory elements of IFN and IFN-inducible genes.
Cell, v. 58, p. 729-739, 1989.
HELMER, S. D.; HANSEN, P. J.; ANTHONY, R. V.; THATCHER, W. W.; BAZER, F.
W.; ROBERTS, R. M. Identification of bovine trophoblast protein-1, a secretory
protein immunologically related to ovine trophoblast protein-1. Journal
Reproduction Fertility, v. 79, n. 1, p. 83-91, 1987.
HELMER, S. D.; HANSEN, P. J.; THATCHER, W. W.; JOHNSON, J. W.; BAZER, F.
W. Intrauterine infusion of highly enriched bovine trophoblast protein-1 complex
exerts an antiluteolytic effect to extend corpus luteum lifespan in cyclic cattle.
Journal Reproduction Fertility, v. 87, p. 89-101, 1989.
HERNANDEZ-LEDEZMA, J. J.; SIKES, J. D.; MURPHY, C. N.; WATSON, A. J.;
SCHULTZ, G. A.; ROBERTS, R. M. Expression of bovine trophoblast interferon in
conceptuses derived by in vitro techniques. Biology Reproduction, v. 47, p. 374-
380, 1992.
HORN, S.; BATHGATE, R.; LIOUTAS, C.; BRACKEN, K.; IVELL, R. Bovine
endometrial epithelial cells as a model system to study oxytocin receptor regulation.
Human Reproduction Update, v. 4, p. 605–614, 1998.
HUMBLOT, P. Use of pregnancy specific proteins and progesterone assays to
monitor pregnancy and determine the timing, frequencies and sources of embryonic
mortality in ruminants. Theriogenology, v. 56, n. 9, p. 1413-1433, 2001.
HUMBLOT, P.; DALLA PORTA, M. A. Effect of conceptus removal and intra-uterine
administration of conceptus tissue on luteal function in the cow. Reproduction
Nutrition Development, v. 24, p. 529-541. 1984.
IMAKAWA, K.; ANTHONY, R. V.; KAZEMI, M.; MAROTTI, K. R.; POLITES, H. G.;
ROBERTS, R. M. Interferon-like sequence of ovine trophoblast protein secreted by
embryonic trophectoderm. Nature (London), v. 330, p. 377-379, 1987.
Referências 93
ISSAQ, H. J. The role of separation science in proteomics research. Eletrophoresis,
v. 22, p. 3629-3638, 2001.
JENNER, L. J.; PARKINSON, T. J.; LAMMING, G. E. Uterine oxytocin receptors in
cyclic and pregnant cows. Journal Reproduction Fertility, v. 91, p. 49-58, 1991.
JOHNSON, G. A.; BURGHARDT, R. C.; BAZER, F. W.; SPENCER, T. E.
Osteopontin: roles in implantation and placentation. Biology Reproduction, v. 69, p.
1458-1471, 2003
KALUZ, S.; FISHER, P. A.; KALUZOVA, M.; SHELDRICK, E. L.; FLINT, A. P. F.
Structure of an ovine interferon receptor and its expression in endometrium. Journal
Molecular Endocrinology, v. 17, p. 207-215, 1996.
KAYSER, J. R.; KIM, J. G.; CERNY, R. L.; VALLET, J. L. Global characterization of
porcine intrauterine proteins during early pregnancy. Reproduction, v. 132, p. 379-
388, 2006.
KERBLER, T. L.; BUHR, M. M.; JORDAN, L. T.; LESLIE, K. E.; WALTON, J. S.
Relationship between maternal plasma progesterone concentration and interferon-
tau synthesis by conceptus in cattle. Theriogenology, v. 47, p. 703-714, 1997.
KIM, J. J; FORTIER, M. A. A cell type specificity and protein kinase C dependency on
the stimulation of prostaglandin E2 and prostaglandin F2α production by oxytocin
andplatelet-activating factor in bovine endometrial cells. Journal Reproduction
Fertility, v. 103, p. 239-247, 1995.
KIM, S.; CHOI, Y.; SPENCER, T. E.; BAZER, F. W. Effects of the estrous cycle,
pregnancy and interferon t on expression of cyclooxygenase two (COX-2) in ovine
endometrium. Reproductive Biology and Endocrinology, v. 58, p. 1, 2003.
KIMMINS, S.; MACLAREN, L. A. Oestrous cycle and pregnancy effects on the
distribution of estrogen and progesterone receptors in bovine endometrium.
Placenta, v. 22, p. 742-748, 2001.
KUBISCH, H. M.; LARSON, M. A.; ROBERTS, R. M. Relationship between age of
blastocyst formation and interferon-tau secretion by in vitro-derived bovine embryos.
Molecular Reproduction Development, v. 49, p. 254-260, 1998.
KUNZ, T. L.; GAMBARINI, M. L.; OLIVEIRA FILHO, B. D.; GALINDO, A. D. S.
Mortalidade embrionária em bovinos: inter-relações embrião patôgeno. Revista
CFMV, v. 8, p. 26, 27-36, 2002.
LAFRANCE, M.; GOFF A. K. Control of bovine uterine prostaglandin F2 alpha
release in vitro. Biology Reproduction, v. 42, p.188-193, 1990.
Referências 94
LEAMAN, D. W.; ROBERTS, R. M. Genes for the trophoblast interferons in sheep,
goat and musk ox, and distribution of related genes among mammals. Journal
Interferon Research, v. 12, p. 1-11, 1994.
LEBLANC, S. P.; DUFFIELD, T. F.; LESLIE, K. E, BATEMAN, K. G.; KEEFE, G. P.;
WALTON, J. S.;JOHNSON, W. H. Defining and Diagnosing Postpartum Clinical
Endometritis and its Impact on Reproductive Performance in Dairy Cows. American
Dairy Science Association, v. 85, p. 2223 – 2236, 2002.
LEE, R. S. F.; WHEELER, T. T.; PETERSON, A. J. Large-format, two-dimensional
polyacrilamide gel electrophoresis of ovine periimplantation uterine luminal proteins:
Identification of aldose reductase, cytoplasmic actin and transferrin as conceptus-
synthesized proteins. Biology Reproduction, v. 59, p. 743-752. 1998.
LEUNG, S. T.; CHENG, Z.; SHELDRICK, E. L.; DERECKA, K.; FLINT, A. P. F.;
WHATES, D. C. The effects of lipopolysaccharide and interleukins -1α -2 and -6 on
oxytocin receptor expression and prostaglandin production in bovine endometrium.
Journal Endocrinology, v. 168, p. 497-508, 2001.
LI, J.; ROBERTS, R. M. Structure-function relationships in the interferon-τ (IFN-τ)
Changes in receptor binding and in antiviral and antiproliferative activities resulting
from site-directed mutagenesis performed near the carboxyl terminus. Journal
Biology Chemistry, v. 269, p. 24826-24833, 1994.
LI, J.; ROBERTS, R. M. Interferon-τ and interferon-α interact with the same receptors
in uterine endometrium: use of readily iodinatable form of recombinant interferon-τ for
binding studies. Journal Biology Chemistry, v. 269, p. 13544-13550, 1994.
LIMA, M. C. Desenvolvimento de uma técnica cirúrgica para o monitoramento
do microambiente uterino em bovinos. 2006. 153 f. Dissertação (Mestrado em
Ciências) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São
Paulo, São Paulo, 2006.
LYNETTE, B. C.; BANDURANT, R. H. Immunity to bovine reproductive infections.
Veterinary. Clinical. American. Food Animal. Practice, v. 17, n. 3, p. 504–583,
2001.
LIU, A; JIN, F.; ZHANG, W.; ZHOU, T.; ZHOU, C.; YAO, W.; QIAN, Y.; HUANG, A.
Proteomics Analysis on the alteration of protein expression in the placental villous
tissue of early pregnancy loss. Biology of reproduction, v. 75. p. 414-420, 2006.
LÓPEZ-GATIUS, F.; SANTOLARIA, P.; YÁNIZ, J.; RUTTLANT, J.; LÓPEZ-BÉJAR,
M. Persistent Ovarian follicles in dairy cows: a therapeutic approach.
Theriogenology, v. 56, p. 649-659, 2002.
Referências 95
MANN, G. E.; ROBISON, R. S.; WHATES, D. C. The regulation of interferon -τ.
Production and uterine receptors during early pregnancy. Journal of Reproduction
and Fertility, v. 54, p. 317-328. 1999.
MARINOV, U.; LOVELL, J. E. Cytology of the bovine uterine epithehium during the
estrous cycle. American Journal Veterinary Research, v. 19, p. 13-29. 1968.
MARTAL, J.; LACROIX, M. C.; LOUDES, C. Trophoblastin, an antiluteolytic protein
present in early pregnancy in sheep. Journal Reproduction Fertility, v. 56, p. 63-
73, 1979.
MARTAL, J; DEGRYSE, E.; CHARPIGNY, G.; ASSAL, N.; REINAULD, P.;
CHARLIER, M.; GAYE, P.; LECOCQ, J. P. Evidence for extended maintenance of
the corpus luteum by uterine infusion of a recombinant trophoblast α-interferon
(trophoblastin) in sheep. Journal Endocrinology, v. 127, p. 5-8, 1990.
MARTIAL, J.; DJIANE, J. The production of chorionic somatomammotrophin in sheep
placenta. Biochemistry Biophysics Research Community, v. 65, p. 770–778,
1975.
MASLAR, I. A.; POWERS-CRADDOCK P.; ANSBACHER, R. Decidual prolactin
production by organ cultures of human endometrium: effects of continuous and
intermittent progesterone treatment. Biology Reproduction, v. 34, p. 741–750,
1986.
MATHER, E. C. “In vivo” uterino lumen pH values of the bovine. Theriogenology, v.
3, p. 113-119, 1975.
MAURER, R.R.; CHENAULT, J.R. Fertilization failure and embryonic mortality in
parous and nonparous beef cattle. Journal Animal Science, v. 56, p. 1186–1189.
1993.
MCCRACKEN, J. A.; SCHRAMM, W.; OKULICZ, W. C. Hormone receptor control of
secretion of PGF2α from ovine uterus during luteolysis and its abrogation in early
pregnancy. Animal Reproduction, v. 7, p. 31-55, 1984.
MCCRACKEN, J. A.; CUSTER, E. E; LAMSA, J. C. Luteolysis: a neuroendocrine
mediated event. Physiology Review, v. 79, n. 2, p. 263-323, 1999.
MEYER, M. D.; HANSEN, P. J.; THATCHER, W. W.; DROST, M.; BADINGA, L.;
ROBERSTS, R. M.; LI, J.; OTT, T. L.; BAZER, F. W. Extension of corpus luteum
lifespan and reduction of uterine secretionof prostaglandin F2α of cows in response
to recombinant interferon-τ. Journal Dairy Science, v. 78, p. 1921-1931, 1995.
MOGENSEN, K. E.; LEWERENZ, M.; REBOUL, J.; LUTFALLA, G., UZĖ, G. The type
I interferon receptor: structure, function and evolution of a family business. Journal
Interferon Cytokine Research
, v. 19, p. 1069, 1999.
Referências 96
MOOR, R. M.; ROWSON, L. E. A .The corpus luteum of the sheep: functional
relationship between the embryo and the corpus luteum. Journal of Endocrinology,
v. 34, p. 233–239, 1996.
MURTHY, G. S.; SCHELLENBERG, C.; FRIESEN, H. G. Purification and
characterization of bovine placental lactogen. Endocrinology, v. 111, p. 2117–2124,
1982.
NIEMEYER, C.; SIQUEIRA, A. F. P.; GIASSETTI, M. I.; PONTES, E. O.; FEDOZZI,
F.; LIMA, M. C.; BERTAN, C. M.; ARRUDA, R. P.; MIGLINO, M. A.; BINELLI, M.
Protein profile of uterine washings of cyclic and pregnant cows from Days 14 to 18
post-estrus. Animal. Reproduction, v.4, n. 3/4, Jul./Dec, 2007.
OCNO-GROVE, O.M.; COOKE, F. N. T.; ALVAREZ, I. M.; JOHNSON, S. E.; OTT, T.
L.; EALY, A. D. Ovine endometrial expression of fibroblast growth factor (FGF) 2 and
conceptus expression of FGF receptors during early pregnancy. Domestic animal
endocrinology, v. 34, p.135-145, 2008.
OTT, T. L.; YIN, J.; WILLEY, A. A.; KIM, H. T.; GERAMI-NAINI, B.; SPENCER, T. E.;
BARTOL, F. F.; BURGHARDT, R. C.; BAZER, F. W. Effects of the estrous cycle and
early pregnancy on the uterine expression of Mx protein in sheep (Ovis aries).
Biology Reproduction, v. 59, p. 784-794, 1998.
PARKINGTON, H. C. Electrical properties of the costo-uterine muscle of the guinea-
pig. Journal Physiology, v. 335, p. 15–27, 1983.
PELTIER, M. R.; HANSEN, P. J. Immunoregulatory activity, biochemistry, and
phylogeny of ovine uterine serpin. American Journal Reproduction Immunology,
v. 45, p. 266-272. 2001.
PRIEDKALNS, B. Female reproductive system. In: DELLMANN H. D.; BROWN, E.
M. (Ed.).Textbook of veterinary histology. Philadelphia: Lea and Febiger, 1976. p.
319-349.
REID, L. E.; BRASNETT, A. H.; GILBERT, C. S.; PORTER, A. C. G.; GEWERT, D.
R.; STARK, G. R.; KERR, I. M. A single DNA response element can confer
inducibility by both α- and γ-interferons. Proceeding National Academic Science, v.
84, p. 840-844, 1989.
ROBERTS, G. P.; PARKER, J. M. Fractionation and comparison of proteins from
bovine uterine fluid and bovine allantoic fluid. Biochemistry. Biophysics. Acta, v.
446, p. 69-76, 1976
ROBERTS, R. M.; CROSS, J. C.; LEAMAN, D. W. Interferons as hormones of
pregnancy. Endocrinology Review, v. 13, p. 432-452, 1992.
ROBERTS, R. M.; EALY, A. D.: ALEXENKO, A. P.; HAN, C. S.; EZASHI, T.
Trophoblast interferons. Placenta, v. 20, p. 259-264, 1999.
Referências 97
ROBINSON, R. S.; MANN, G. E.; LAMMING, G. E.; WHATES, D. C. Expression of
oxytocin, oestrogen and progesterone receptors in uterine biopsy samples
throughout the oestrous cycle and early pregnancy in cows. Reproduction, v. 122, p.
965-979, 2001.
RONCOLLETA, M.; MORANI, E. S. C.; ESPER, C. R.; BARNABE, V. H.;
FRANCESCHINI, P. H. Fertility-associated proteins in nelore bull sperm membranes.
Animal Reproduction Science, v. 91, p. 77-87, 2006.
SANTOS, J. E. P.; CERRI, R. L. A.; BALLOU, M. A.; HIGGINBOTHAM, G. E.; KIRK,
J. H. Effect of timing of first clinical mastitis occutence on lactational and reproductive
performance of holstein dairy cows. Animal Reproduction Science, v. 80, p. 31-45,
2004.
SARTORI, R.; SARTOR-BERGFELT, R.; MERTENS, S. A.; GUENTHER, J. N.;
PARRISH, J. J.; WILTBANK, M. C. Fertilization and early embryonic development in
heifers and lactating cows in summer and lactating and dry cows in winter. Journal
Dairy Science, v. 85, p. 2803–2812, 2002.
SAS. SAS/STATTM user’s guide (release 9.1). Cary, NC: SAS Institute Inc; 2002.
SCHÄFER-SOMI, S. Cytokines during early pregnancy of mammals: a review.
Animal Reproduction Science, v. 75, p. 73-94, 2003.
SEN, G. C.; LENGYEL, P. The interferon system: a bird’s eye view of the
biochemistry. Journal Biologic Chemistry, v. 267, p. 5017, 1992.
SEOW, G. E.; ONG, S. E.; LIANG, R. C. M.; REN, E. C.; CHAN, L.; OU, K.; CHUNG,
M.C.M. Electrophoresis. Proteomics, v. 21, p. 1787–1813, 2000.
SHEMESH M. Production and regulation of progesterone in bovine corpus luteum
and placenta in mid and late gestation: a personal review. Reproduction Fertility
Development, v. 2, p. 129-135. 1990.
SHOLL, S. A.; ORSINI, M. W.; HITHINS D. J. Estrogen synthesis and metabolism in
the hamster blastocyst, uterus, and liver near the time of implantation. Journal.
Steroid Biochemistry, v. 19, p. 1153, 1983.
SHIPP, S. A.; SEGERSON, E. C. Endometrial suppressor cells in beef cattle.
Theriogenology, v. 50, p. 779-791, 1998.
SILKE, V.; DISKIN, M. G.; KENNY; BOLAND, M. P.; DILLON, P. M. E. E. J. F.;
SREENAN, J. M. Extent, pattern and factors associetd with late embryonic losses in
dairy cows. Animal reproduction Science, v. 71, p. 1-12, 2002.
SIMPSON, R. J.; CONNOLLY, L. M.; EDDES, J. S.; PEREIRA, J. J.; MORITZ, R. L.;
REID, G. E. Electrophoresis. Proteomics, v. 21, p. 1707–1732, 2000.
Referências 98
SKOPETS, B.; HANSEN, P. J. Identification of predominant proteins in uterine fluids
of unilaterally pregnant ewes that inhibit lymphocyte proliferation. Biology of
Reproduction, v. 49. p. 997-1007, 1993.
SOARES M. The prolactin and growth hormone families: pregnancy-specific
hormones/cytokines at the maternal-fetal interface. Reproduction Biology
Endocrinology, v. 2, p. 51. 2004.
SPENCER, T. E.; JOHNSON, G. A.; BAZER, F. W.; BURGHARDT, R. C. Fetal-
maternal interactions during the establishment of pregnancy in ruminants. In:
INTERNATIONAL SYMPOSIUM ON REPRODUCTION IN DOMESTIC
RUMINANTS, 7. 2006, Wellington, New Zealand. Proceedings of the Seventh
International Symposium on Reproduction in Domestic Ruminants, 2006, p.
379-396.
SPENCER, T. E.; BAZER, F. W. Conceptus signals for establishment and
maintenance of pregnancy. Reproduction Biology Endocrinology, v. 2, p. 49,
2004.
SPENCER, T. E.; BAZER, F. W. Temporal and spacial alterations in uterine estrogen
receptor and progesterone receptor gene expression during the estrous cycle and
early pregnancy in the ewe. Biology Reproduction, v. 53, p.1527-1543, 1995.
SPENCER, T. E.; BECKER, W. C.; GEORGE, P.; MIRANDO, M. A.; OGLE, T. F.;
BAZER, F. W. Ovine interferon-τ inhibits estrogen receptor up-regulation and
estrogen-induced luteolysis in cyclic ewes. Endocrinology, v. 136, p. 4932-4944,
1995.
SPENCER, T. E.; OTT, T. L.; BAZER, F.W. Expression of interferon regulatory
factors one and two in the ovine endometrium: effects of pregnancy and ovine
interferon tau. Biology Reproduction, v. 58, p. 1154-1162, 1998.
SREENAN, J. M. Non-surgical embryo transfer in cattle. Theriogenology, v. 9, p. 69-
83. 1978.
STARK, G. R.; KERR, I. M.; WILLIAMS, B. R.; SILVERMAN, R. H.; SCHREIBER, R.
D. How cells respond to interferons. Annual Review Biochemistry, v. 67, p. 227,
1998.
STENSBALLE, A.; JENSEN, O. N. Simplified sample preparation method for protein
identification by matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry:In-gel
digestion on the probe surface. Proteomics, v. 1, p. 955-966, 2001.
STEWART, W. E. The interferon system. Vienna. New York: Springer-Verlag, 1979.
Referências 99
TEZUKA, N.; ALI, M.; CHWALISZ, K.; GARFIELD, R. E. Changes in the transcripts
encoding calcium channel subunits of rat myometrium during pregnancy. American
Journal Physiology, v. 269, p. C1008—C1017, 1995. (Cell Physiol. 38)
THATCHER, W. W.; BINELLI, M.; BURKE, J.; STAPLES, C.; AMBROSE, J. D.;
COELHO, S. Antiluteolytic signals between the conceptus and endometrium.
Theriogenology, v. 47, p. 131-140, 1997.
THATCHER, W. W.; MACMILLAN, K. L.; HANSEN, P. J. Embrionic losses:, cause
and prevention. In: FIELDS, M. J.; SANDS, R. S. (Eds.) Factors affeting calf crop,
Boca Ratib: CRC Press, 1994. p. 135–153.
THATCHER, W. W.; GUZELOGLU, A.; MATTOS, R.; BINELLI, M.; HANSEN, T. R.;
PRU, J. K. Uterine-conceptus interactions and reproductive failure in cattle.
Theriogenology, v. 56, p. 1435-1450, 2001.
THOMAS, P. G. A.; LESLIE, M. V.; HANSEN, P. J. Retinol binding protein is
produced by the bovine endometrium and accumulates in uterine secretions in a
progesteronedependent manner. Animal Reproduction Science, v. 27, p. 55-66.
1992.
UENO, I.; SAKAL, T.; YAMAOKA, M.; YOSHIDA, R.; TSUGITA, A. Electrophoresis.
Proteomics, v. 21, p. 1832–1845. 2000.
WARREN, W. C.; LIANG, R.; KRIVI, G. G.; SIEGEL, N. R..; ANTHONY, R. V.
Purification and structural characterization of ovine placental lactogen. Journal
Endocrinology, v. 126, p.141–149, 1990.
WEISE, D. W.; NEWTON, G. R.; EMESIH, G. C. Effects of day of the estous cycle or
pregnancy on protein secretion by caprine endometrial tissues. Biology of
Reproduction, v. 49, p. 522-527, 1993.
WHATHES, D. C.; ROBINSON, R. S; MANN, G. E.; LAMMING, G. E. The
establishment of early pregnancy in cows. Reproduction of Domestic Animals, v.
33, p. 279-284, 1998.
WINGFIELD, D. N. S.; RICKEITS, S. W. Results of concurrent bacteriological and
cytological examination of the endometrium of the mare. Journal Reproduction
Fertility Suppl, v. 32, p. 181–185. 1982.
WINKELMANN, G. L.; ROBERTS, R. M.; JAMES PETERSON, A.; ALEXENKO, A.
P.; EALY, A. D. Identification of the expressed forms of ovine interferon-tau in the
perimplantation conceptus: sequence relationships and comparative biological
activities. Biology Reproduction, v. 61, p. 1592-1600, 1999.
XIAO, C.; LIU, W. J. M.; SIROIS, J.; GOFF, A. K. Regulation of cycloxigenase-2 and
prostaglandin F synthase gene expression by steroid hormones and interferon-τ in
Referências 100
endometrium of postpartum cows expected to have a short or normal oestrus cycle.
Journal Reproduction Fertility, v. 97, p. 329-337, 1993.
YATES, J. Eletrophoresis and Proteomics. Journal of Mass Spectrometry, v. 33, p.
1–19. 1998.
YATES, J. Bovine epithelial cells. Endocrinology, v. 139, p. 2293-2299, 2001.
YAVAS, Y.; WALTON, J. S. Induction of ovulation in postpartum suckled beef cows:
a review. Theriogenology, v. 54, p. 1-23, 2000.
ZAVY, M. T. Embryonic mortality in cattle. In: ZAVY, M. T.; GEISERT, R. D. (Ed.).
Embryonic mortality in domestic species. Boca Raton: CRC Press, 1994. p. 99–140.
Apêndices
APÊNDICES
Apêndice A - Peso molecular, ponto isoelétrico e freqüência de ocorrência de
proteínas identificadas em lavados uterinos coletados por sonda de
folley (F) ou post-mortem (PM) de vacas ciclando (C) ou prenhes (P)
18 dias pós-estro.
ID
a
Proteína
Peso Molecular
b
(kD)
Ponto
c
isoelétrico
FC
(n=4)
FP
(n=3)
PMC
(n=4)
PMP
(n=3)
P003 95,80 ±16,70 6,75 ±0,24 0 2 3 0
P015 98,31 ±18,15 6,25 ±0,08 2 2 0 0
P021 97,30 ±18,35 6,01 ±0,07 2 3 0 0
P029 108,32 ±34,63 6,14 ±0,11 0 2 0 0
P044 95,21 ±28,10 7,90 ±0,34 0 2 0 0
P045 94,80 ±27,44 7,22 ±0,25 0 2 0 0
P046 94,75 ±27,50 7,54 ±0,33 0 2 0 0
P049 94,38 ±26,97 7,05 ±0,25 0 2 0 0
P050 95,10 ±15,07 6,57 ±0,11 0 2 0 2
P052 84,25 ±15,74 6,70 ±0,09 0 2 0 3
P053 75,11 ±16,53 6,95 ±0,10 0 2 0 2
P054 88,86 ±12,99 6,76 ±0,08 0 3 0 2
P067 73,18 ± 9,21 6,44 ±0,12 3 3 0 0
P072 82,95 ±10,35 5,83 ±0,06 4 2 0 0
P073 81,14 ±10,18 6,29 ±0,08 2 3 0 2
P076 86,00 ± 8,80 5,87 ±0,06 3 3 0 2
P077 82,18 ± 8,48 5,92 ±0,06 4 3 0 2
P079 79,16 ± 7,16 6,07 ±0,07 4 3 2 2
P084 81,26 ± 8,59 6,23 ±0,07 2 3 0 2
P087 86,76 ±13,81 6,64 ±0,16 2 2 0 0
P088 73,67 ±12,74 3,59 ±0,12 2 2 0 0
P089 72,07 ± 7,42 6,19 ±0,09 3 3 2 2
P091 86,45 ±24,41 3,71 ±0,14 0 2 0 0
P093 85,62 ±24,65 4,42 ±0,38 0 2 0 0
P095 72,59 ±12,22 3,48 ±0,11 2 2 0 0
P101 83,83 ±23,93 6,99 ±0,27 0 2 0 0
P103 83,71 ±23,60 3,77 ±0,36 0 2 0 0
P105 84,65 ±22,65 7,18 ±0,34 0 2 0 0
P111 84,55 ±12,07 5,31 ±0,10 0 2 0 2
P128 71,58 ±10,80 3,50 ±0,09 2 2 0 0
P133 67,85 ± 8,42 3,51 ±0,09 3 2 0 0
P134 70,71 ±10,13 3,84 ±0,10 2 2 0 0
P146 77,93 ±20,36 6,24 ±0,35 0 2 0 0
P151 76,62 ± 7,25 6,22 ±0,12 2 2 2 0
P153 74,19 ± 9,32 6,67 ±0,14 3 2 0 0
P161 78,86 ±10,30 6,07 ±0,15 0 2 0 2
P163 75,26 ±17,56 3,51 ±0,20 0 2 0 0
P168 74,47 ± 9,14 6,05 ±0,10 0 2 0 2
P176 71,33 ± 6,73 6,46 ±0,08 3 2 0 2
P180 66,98 ±11,59 6,65 ±0,21 0 3 0 0
a
identificação da proteína
b
média aritmética ±erro padrão da media do peso molecular relativo de cada proteína
c
média aritmética ±erro padrão da media do ponto isoelétrico de cada proteína
ID
a
Proteína
Peso Molecular
b
(kD)
Ponto
c
isoelétrico
FC
(n=4)
FP
(n=3)
PMC
(n=4)
PMP
(n=3)
P181 62,21 ± 9,50 5,65 ±0,09 2 2 0 0
P186 71,00 ±16,79 6,47 ±0,36 0 2 0 0
P209 65,92 ± 7,03 6,14 ±0,11 3 2 0 0
P213 64,39 ±14,23 6,31 ±0,34 0 2 0 0
P223 60,66 ± 5,65 5,72 ±0,06 3 3 0 0
P231 56,66 ± 5,93 6,22 ±0,15 2 2 0 0
P232 61,09 ±12,94 6,31 ±0,34 0 2 0 0
P234 62,22 ± 6,04 5,78 ±0,05 2 2 0 2
P240 57,60 ± 6,01 6,08 ±0,09 2 2 2 0
P243 60,84 ± 7,39 6,15 ±0,16 2 2 0 0
P250 58,49 ±11,70 6,24 ±0,36 0 2 0 0
P253 58,09 ±10,32 5,75 ±0,07 0 2 0 0
P257 58,90 ± 8,18 6,41 ±0,25 0 2 0 0
P270 53,12 ± 3,44 5,88 ±0,08 4 2 0 2
P288 48,04 ± 6,33 5,27 ±0,12 0 2 0 0
P297 43,02 ± 3,95 7,27 ±0,33 0 2 0 0
P302 38,81 ± 6,38 7,77 ±0,13 0 2 0 0
P304 41,95 ± 3,10 6,67 ±0,06 0 2 0 0
P306 41,51 ± 3,39 6,47 ±0,13 0 2 0 0
P307 42,25 ± 1,62 5,13 ±0,06 0 2 0 0
P310 38,74 ± 0,49 5,65 ±0,11 0 2 0 0
P317 34,82 ± 1,75 5,63 ±0,10 0 2 0 0
P322 30,42 ± 1,34 6,11 ±0,35 0 2 0 0
P326 31,89 ± 1,85 6,54 ±0,19 0 2 0 2
P328 27,80 ± 4,21 6,48 ±0,12 0 2 0 0
P329 25,70 ± 7,85 6,86 ±0,16 0 2 0 0
P330 25,59 ± 2,96 5,47 ±0,07 2 2 0 0
P335 22,35 ± 8,95 6,10 ±0,14 0 2 0 0
P347 29,10 ± 0 5,41 ±0,21 0 2 0 0
P353 24,22 ± 0 8,15 ±0,23 0 2 0 0
P361 15,25 ± 3,29 5,45 ±0,21 0 2 0 0
P368 8,66 ± 0 6,58 ±0,12 0 2 0 0
P369 10,49 ± 0 5,86 ±0,14 0 2 0 0
P372 8,23 ± 0 5,60 ±0,18 0 2 0 0
P375 2,12 ± 0 5,37 ±0,14 0 2 0 0
P380 83,61 ± 2,30 6,26 ±0,10 2 0 0 0
P388 89,95 ±20,29 7,01 ±0,15 2 0 0 0
P389 87,47 ±20,83 5,11 ±0,09 2 0 0 0
P390 87,20 ±20,55 5,18 ±0,09 2 0 0 0
P391 74,76 ±12,82 3,77 ±0,05 3 0 0 0
P398 63,24 ±14,13 7,67 ±0,10 3 0 0 2
P400 80,36 ±18,67 3,58 ±0,11 2 0 0 0
P405 63,34 ± 9,24 5,44 ±0,03 3 0 0 0
P406 64,58 ± 6,63 6,30 ±0,07 2 0 0 2
P408 54,51 ± 6,16 6,47 ±0,08 2 0 0 0
P411 30,54 ± 4,93 6,46 ±0,08 2 0 3 2
P412 35,93 ± 2,51 5,16 ±0,07 2 0 0 0
P413 36,45 ± 1,13 5,54 ±0,11 2 0 0 0
a
identificação da proteína
b
média aritmética ±erro padrão da media do peso molecular relativo de cada proteína
c
média aritmética ±erro padrão da media do ponto isoelétrico de cada proteína
ID
a
Proteína
Peso Molecular
b
(kD)
Ponto
c
isoelétrico
FC
(n=4)
FP
(n=3)
PMC
(n=4)
PMP
(n=3)
P415 33,45 ± 2,68 5,87 ±0,06 2 0 0 0
P418 32,04 ± 2,37 5,18 ±0,07 2 0 0 0
P420 32,10 ± 2,09 8,01 ±0,07 2 0 0 0
P422 27,33 ± 2,61 5,56 ±0,04 3 2 0 0
P426 22,30 ± 4,47 5,59 ±0,07 3 0 0 0
P428 5,038 ± 2,58 8,35 ±0,04 2 0 0 0
P429 4,68 ± 2,19 8,49 ±0,06 2 0 0 0
P430 6,58 ± 0 8,43 ±0,14 2 0 0 0
P431 82,11 ±10,83 6,25 ±0,08 2 0 0 2
P433 19,77 ± 5,21 5,56 ±0,07 2 0 0 0
P435 82,69 ± 2,36 5,99 ±0,09 2 0 0 0
P437 77,54 ± 6,98 6,37 ±0,13 2 0 0 2
P445 110,39 ±35,03 6,58 ±0,18 2 0 0 0
P451 90,39 ±21,58 6,03 ±0,12 2 0 0 0
P452 97,89 ±30,36 6,27 ±0,01 2 0 0 0
P453 97,65 ±30,18 7,05 ±0,17 2 0 0 0
P454 96,16 ±31,53 6,56 ±0,17 2 0 0 0
P456 93,43 ±23,88 7,19 ±0,16 2 0 0 0
P457 84,56 ±24,85 3,45 ±0,04 2 0 0 0
P465 75,24 ±20,74 5,62 ±0,22 2 0 0 0
P466 70,44 ±13,49 6,73 ±0,10 2 0 0 0
P479 37,53 ±2,92 5,49 ±0,21 2 0 0 0
P480 35,93 ±1,85 5,70 ±0,11 3 0 0 0
P481 31,31 ±6,93 5,94 ±0,16 2 0 0 0
P482 34,62 ±2,23 6,21 ±0,20 2 0 0 0
P483 33,69 ± 0,11 7,72 ±0,01 2 0 0 0
P484 31,21 ± 0,41 6,24 ±0,04 2 0 0 0
P486 29,87 ± 0,34 5,09 ±0,26 2 0 0 0
P488 31,13 ± 3,28 5,51 ±0,13 2 0 0 0
P495 11,69 ± 0,32 7,23 ±0,33 2 0 0 0
P500 18,04 ± 1,21 5,59 ±0,12 3 0 0 0
P504 12,44 ± 9,48 5,37 ±0,18 3 0 0 0
P506 12,72 ± 0,87 5,11 ±0,10 3 0 0 0
P507 12,08 ± 1,04 5,28 ±0,10 3 0 0 0
P510 ................... 5,76 ±0,45 2 0 0 0
P529 82,26 ±21,61 5,63 ±0,02 2 0 0 0
P532 51,69 ± 1,40 5,68 ±0,05 2 0 0 0
P535 42,70 ± 0,23 5,40 ±0,15 2 0 0 0
P549 31,90 ± 0,17 5,70 ±0,13 2 0 0 0
P561 18,07 ± 1,02 7,20 ±0,17 2 0 0 0
P564 14,13 ± 4,28 5,35 ±0,04 2 0 0 0
P566 11,57 ± 1,12 7,00 ±0,13 2 0 0 0
P570 8,04 ± 0 5,98 ±0,00 2 0 0 0
P573 4,90 ± 0,48 8,14 ±0,08 2 2 0 0
P591 82,69 ± 2,30 6,14 ±0,08 2 0 0 0
P609 85,71 ±15,70 6,99 ±0,11 3 0 0 0
a
identificação da proteína
b
média aritmética ±erro padrão da media do peso molecular relativo de cada proteína
c
média aritmética ±erro padrão da media do ponto isoelétrico de cada proteína
ID
a
Proteína
Peso Molecular
b
(kD)
Ponto
c
isoelétrico
FC
(n=4)
FP
(n=3)
PMC
(n=4)
PMP
(n=3)
P614 68,18 ± 2,33 4,99 ±0,02 2 0 0 0
P616 68,34 ± 2,60 4,75 ±0,07 2 0 0 0
P626 63,17 ± 1,54 5,04 ±0,00 2 0 0 0
P627 63,09 ± 1,46 5,12 ±0,00 2 0 0 0
P630 71,29 ± 6,94 6,36 ±0,10 3 2 0 2
P648 47,16 ± 6,17 4,04 ±0,33 2 0 0 0
P658 32,56 ± 2,11 6,79 ±0,15 2 0 0 0
P659 35,47 ± 3,06 5,45 ±0,08 3 0 0 0
P683 59,68 ± 0,26 6,38 ±0,24 0 2 0 0
P697 34,09 ± 0,22 6,79 ±0,21 0 2 0 0
P705 30,51 ± 1,95 5,51 ±0,05 0 2 0 0
P712 20,09 ± 1,34 5,35 ±0,11 0 2 0 0
P718 5,58 ± 0,88 7,39 ±0,10 0 2 0 0
P737 43,49 ± 3,02 6,64 ±0,24 0 2 2 0
P764 14,92 ± 4,20 6,22 ±0,11 0 2 0 0
P769 4,42 ± 0 8,52 ±0,11 0 2 0 0
P774 77,53 ±12,75 6,28 ±0,08 0 0 2 2
P778 ..................... 6,95 ±0,11 0 0 2 0
P780 64,23 ±11,45 6,02 ±0,03 0 0 2 2
P782 31,34 ± 4,08 5,68 ±0,26 0 0 2 0
P785 7,60 ± 0,22 6,62 ±0,01 0 0 2 0
P795 94,91 ±24,23 5,79 ±0,05 0 0 0 2
P806 70,93 ±12,99 6,07 ±0,17 0 0 2 0
P810 49,00 ± 0,88 5,56 ±0,17 2 0 0 0
P812 45,87 ±15,60 5,27 ±0,07 0 0 2 0
P815 19,24 ± 0,70 7,89 ±0,17 0 0 2 0
P820 6,57 ± 2,75 5,79 ±0,09 0 0 2 0
P823 71,94 ± 1,36 7,59 ±0,14 0 0 2 0
P824 81,03 ±14,79 7,29 ±0,08 0 0 2 2
P826 50,40 ± 7,65 6,00 ±0,13 0 0 2 0
P827 76,54 ±16,21 6,36 ±0,03 0 0 0 2
P834 35,51 ± 8,74 5,53 ±0,27 0 0 2 0
P838 31,20 ± 8,64 5,74 ±0,17 0 0 2 0
P841 30,35 ± 0 5,21 ±0,17 0 0 2 0
P855 18,04 ± 0 5,37 ±0,19 0 0 2 0
P876 4,08 ± 0 7,22 ±0,23 0 0 2 0
P890 58,04 ±14,95 7,90 ±0,11 0 0 0 2
P907 72,23 ±14,56 6,20 ±0,00 0 0 0 2
P925 28,58 ±14,29 7,20 ±0,04 0 0 0 2
P932 25,42 ±13,64 7,05 ±0,05 0 0 0 2
P936 21,02 ±13,94 6,55 ±0,09 0 0 0 2
P942 17,35 ±14,31 6,45 ±0,07 0 0 0 2
P969 98,69 ±25,87 7,40 ±0,02 0 0 0 2
P977 19, 80 ±5,57 7,24 ±0,03 0 0 0 3
a
identificação da proteína
b
média aritmética ±erro padrão da media do peso molecular relativo de cada proteína
c
média aritmética ±erro padrão da media do ponto isoelétrico de cada proteína
Média (±EPM) do volume normalizado
ID Proteína
a
FC FP PMC PMP
P003 0,00 ±0,00 0,21 ±0,11 0,32 ±0,15 0,00 ±0,00
P015 0,01 ±0,01 0,12 ±0,07 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00
P021 0,05 ±0,04 0,02 ±0,01 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00
P029 0,00 ±0,00 0,01 ±0,01 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00
P044 0,00 ±0,00 0,30 ±0,15 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00
P045 0,00 ±0,00 0,28 ±0,16 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00
P046 0,00 ±0,00 0,26 ±0,20 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00
P049 0,00 ±0,00 0,42 ±0,25 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00
P050 0,00 ±0,00 0,29 ±0,20 0,00 ±0,00 0,62 ±0,34
P052 0,00 ±0,00 0,36 ±0,20 0,00 ±0,00 0,87 ±0,32
P053 0,00 ±0,00 0,41 ±0,23 0,00 ±0,00 0,82 ±0,55
P054 0,00 ±0,00 0,47 ±0,26 0,00 ±0,00 1,06 ±0,54
P067 6,32 ±5,67 1,25 ±0,96 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00
P072 0,60 ±0,21 0,77 ±0,49 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00
P073 2,95 ±1,83 2,90 ±0,80 0,00 ±0,00 0,86 ±0,85
P076 0,67 ±0,46 1,17 ±0,62 0,00 ±0,00 0,61 ±0,37
P077 1,44 ±0,34 1,35 ±0,47 0,00 ±0,00 0,76 ±0,39
P079 3,97 ±0,31 2,41 ±0,77 0,42 ±0,34 1,47 ±0,88
P084 3,75 ±2,91 4,29 ±1,41 0,00 ±0,00 6,86 ±3,68
P087 0,36 ±0,35 0,02 ±0,01 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00
P088 0,06 ±0,04 0,10 ±0,05 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00
P089 4,77 ±1,98 4,85 ±1,52 0,17 ±0,10 3,96 ±2,20
P091 0,00 ±0,00 0,07 ±0,04 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00
P093 0,00 ±0,00 0,12 ±0,12 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00
P095 0,07 ±0,04 0,08 ±0,06 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00
P101 0,00 ±0,00 0,04 ±0,04 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00
P103 0,00 ±0,00 0,25 ±0,17 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00
P105 0,00 ±0,00 0,16 ±0,09 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00
P111 0,00 ±0,00 0,13 ±0,11 0,00 ±0,00 0,20 ±0,16
P128 0,11 ±0,06 0,15 ±0,10 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00
P133 0,08 ±0,05 0,10 ±0,07 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00
P134 0,15 ±0,09 0,08 ±0,07 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00
P146 0,00 ±0,00 0,02 ±0,02 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00
P151 0,29 ±0,18 0,07 ±0,04 0,11 ±0,08 0,00 ±0,00
P153 0,17 ±0,12 0,05 ±0,04 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00
P161 0,00 ±0,00 0,02 ±0,01 0,00 ±0,00 0,09 ±0,08
P163 0,00 ±0,00 0,07 ±0,04 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00
P168 0,00 ±0,00 0,30 ±0,16 0,00 ±0,00 0,41 ±0,32
P176 0,79 ±0,43 0,29 ±0,21 0,00 ±0,00 0,13 ±0,08
P180 0,00 ±0,00 0,33 ±0,28 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00
P181 0,05 ±0,04 0,08 ±0,06 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00
P186 0,00 ±0,00 1,28 ±1,25 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00
P209 1,51 ±0,90 3,73 ±2,24 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00
P213 0,00 ±0,00 0,08 ±0,04 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00
P223 1,70 ±1,23 2,37 ±2,19 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00
A
pêndice B - Média aritmética (± erro padrão da média) do volume
normalizado de proteínas presentes em lavados uterinos
coletados por sonda de Folley (F) ou Post-mortem (PM) de
animais cíclicos (C) ou prenhes (P) no dia 18 pós-estro.
a
identificação da proteína
Média (±EPM) do volume normalizado
ID Proteína
a
FC FP PMC PMP
P231 0,03 ±0,02 0,33 ±0,31 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00
P232 0,00 ±0,00 0,18 ±0,15 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00
P234 0,30 ±0,17 0,08 ±0,05 0,00 ±0,00 0,21 ±0,19
P240 0,32 ±0,31 0,06 ±0,03 0,14 ±0,10 0,00 ±0,00
P243 0,03 ±0,02 0,30 ±0,15 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00
P250 0,00 ±0,00 0,27 ±0,26 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00
P253 0,00 ±0,00 0,06 ±0,03 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00
P257 0,00 ±0,00 0,08 ±0,06 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00
P270 0,23 ±0,08 0,17 ±0,08 0,00 ±0,00 0,44 ±0,36
P288 0,00 ±0,00 0,02 ±0,01 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00
P297 0,00 ±0,00 0,07 ±0,05 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00
P302 0,00 ±0,00 0,08 ±0,05 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00
P304 0,00 ±0,00 0,06 ±0,03 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00
P306 0,00 ±0,00 0,07 ±0,04 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00
P307 0,00 ±0,00 0,16 ±0,15 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00
P310 0,00 ±0,00 0,06 ±0,03 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00
P317 0,00 ±0,00 0,14 ±0,10 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00
P322 0,00 ±0,00 0,31 ±0,26 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00
P326 0,00 ±0,00 1,56 ±1,26 0,00 ±0,00 0,31 ±0,16
P328 0,00 ±0,00 0,31 ±0,26 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00
P329 0,00 ±0,00 0,30 ±0,26 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00
P330 0,84 ±0,72 0,41 ±0,41 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00
P335 0,00 ±0,00 2,28 ±2,04 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00
P347 0,00 ±0,00 0,45 ±0,31 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00
P353 0,00 ±0,00 0,08 ±0,05 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00
P361 0,00 ±0,00 0,06 ±0,01 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00
P368 0,00 ±0,00 0,15 ±0,09 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00
P369 0,00 ±0,00 0,03 ±0,02 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00
P372 0,00 ±0,00 0,05 ±0,03 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00
P375 0,00 ±0,00 0,05 ±0,03 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00
P380 0,02 ±0,01 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00
P388 0,61 ±0,36 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00
P389 0,06 ±0,04 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00
P390 0,06 ±0,04 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00
P391 0,09 ±0,04 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00
P398 0,10 ±0,06 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00 0,13 ±0,08
P400 0,02 ±0,01 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00
P405 0,07 ±0,04 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00
P406 0,03 ±0,02 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00 0,24 ±0,16
P408 0,07 ±0,06 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00
P411 0,03 ±0,02 0,00 ±0,00 1,67 ±1,46 0,91 ±0,48
P412 0,04 ±0,04 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00
P413 0,05 ±0,03 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00
P415 0,31 ±0,24 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00
P418 0,06 ±0,05 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00
P420 0,49 ±0,30 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00
a
identificação da proteína
Média (±EPM) do volume normalizado
ID Proteína
a
FC FP PMC PMP
P422 0,34 ±0,22 0,02 ±0,01 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00
P426 0,10 ±0,05 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00
P428 0,34 ±0,21 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00
P429 0,41 ±0,36 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00
P430 0,18 ±0,16 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00
P431 0,05 ±0,03 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00 0,44 ±0,22
P433 0,02 ±0,02 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00
P435 0,01 ±0,01 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00
P437 0,01 ±0,01 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00 0,47 ±0,38
P445 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00
P451 0,08 ±0,03 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00
P452 0,07 ±0,04 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00
P453 0,19 ±0,18 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00
P454 0,01 ±0,01 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00
P456 0,09 ±0,09 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00
P457 0,13 ±0,10 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00
P465 0,08 ±0,08 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00
P466 0,03 ±0,02 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00
P479 0,04 ±0,03 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00
P480 0,11 ±0,06 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00
P481 0,15 ±0,09 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00
P482 0,38 ±0,37 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00
P483 0,06 ±0,05 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00
P484 2,36 ±2,34 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00
P486 0,08 ±0,07 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00
P488 0,14 ±0,14 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00
P495 0,10 ±0,07 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00
P500 0,27 ±0,15 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00
P504 0,13 ±0,06 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00
P506 0,16 ±0,11 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00
P507 0,50 ±0,26 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00
P510 0,30 ±0,20 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00
P529 0,15 ±0,11 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00
P532 0,09 ±0,06 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00
P535 0,06 ±0,04 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00
P549 0,07 ±0,05 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00
P561 0,05 ±0,03 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00
P564 0,26 ±0,21 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00
P566 0,03 ±0,02 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00
P570 0,02 ±0,01 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00
P573 1,36 ±1,20 0,98 ±0,92 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00
P591 0,01 ±0,01 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00
P609 0,26 ±0,14 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00
P614 0,04 ±0,04 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00
P616 0,16 ±0,10 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00
P626 0,18 ±0,12 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00
P627 0,06 ±0,05 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00
a
identificação da proteína
Média (±EPM) do volume normalizado
ID Proteína
a
FC FP PMC PMP
P630 0,27 ±0,21 0,05 ±0,03 0,00 ±0,00 0,31 ±0,30
P648 0,03 ±0,02 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00
P658 0,49 ±0,30 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00
P659 0,24 ±0,13 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00
P683 0,00 ±0,00 0,06 ±0,05 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00
P697 0,00 ±0,00 0,44 ±0,43 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00
P705 0,00 ±0,00 0,38 ±0,32 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00
P712 0,00 ±0,00 0,12 ±0,08 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00
P718 0,00 ±0,00 0,09 ±0,05 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00
P737 0,00 ±0,00 0,22 ±0,13 1,08 ±0,41 0,00 ±0,00
P764 0,00 ±0,00 0,10 ±0,05 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00
P769 0,00 ±0,00 0,12 ±0,07 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00
P774 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00 0,29 ±0,17 0,27 ±0,26
P778 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00 0,23 ±0,17 0,00 ±0,00
P780 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00 0,46 ±0,35 0,06 ±0,04
P782 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00 0,33 ±0,31 0,00 ±0,00
P785 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00 3,08 ±1,78 0,00 ±0,00
P795 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00 0,48 ±0,40
P806 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00 0,11 ±0,06 0,00 ±0,00
P810 0,10 ±0,06 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00
P812 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00 0,15 ±0,13 0,00 ±0,00
P815 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00 0,40 ±0,35 0,00 ±0,00
P820 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00 0,07 ±0,04 0,00 ±0,00
P823 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00 0,22 ±0,14 0,00 ±0,00
P824 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00 0,24 ±0,16 1,03 ±0,56
P826 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00 0,23 ±0,19 0,00 ±0,00
P827 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00 0,12 ±0,06
P834 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00 0,26 ±0,22 0,00 ±0,00
P838 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00 0,42 ±0,39 0,00 ±0,00
P841 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00 0,09 ±0,08 0,00 ±0,00
P855 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00 0,04 ±0,02 0,00 ±0,00
P876 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00 0,26 ±0,19 0,00 ±0,00
P890 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00 0,16 ±0,09
P907 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00 0,38 ±0,19
P925 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00 0,19 ±0,13
P932 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00 0,12 ±0,09
P936 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00 4,05 ±4,03
P942 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00 0,51 ±0,40
P969 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00 0,56 ±0,40
P977 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00 0,00 ±0,00 0,43 ±0,25
a
identificação da proteína
P < F
ID Proteína
a
Estado Lavado Lavado x Estado
P003 0,60 0,60 0,02
P015 0,10 0,06 0,10
P021 0,60 0,20 0,60
P029 0,10 0,10 0,10
P044 0,04 0,04 0,04
P045 0,07 0,07 0,07
P046 0,15 0,15 0,15
P049 0,08 0,08 0,08
P050 0,02 0,3 0,30
P052 0,01 0,14 0,14
P053 0,03 0,4 0,40
P054 0,01 0,3 0,30
P067 0,47 0,29 0,47
P072 0,73 0,02 0,73
P073 0,74 0,06 0,71
P076 0,20 0,16 0,90
P077 0,33 0,01 0,22
P079 0,66 0,01 0,04
P084 0,15 0,81 0,21
P087 0,43 0,38 0,43
P088 0,49 0,03 0,49
P089 0,26 0,12 0,28
P091 0,07 0,07 0,07
P093 0,23 0,23 0,23
P095 0,83 0,06 0,83
P101 0,17 0,17 0,17
P103 0,11 0,11 0,11
P105 0,05 0,05 0,05
P111 0,07 0,68 0,68
P128 0,67 0,04 0,67
P133 0,82 0,06 0,82
P134 0,57 0,08 0,57
P146 0,18 0,18 0,18
P151 0,20 0,33 0,68
P153 0,41 0,15 0,41
P161 0,15 0,3 0,30
P163 0,04 0,04 0,04
P168 0,04 0,7 0,70
P176 0,51 0,11 0,28
P180 0,19 0,19 0,19
P181 0,57 0,07 0,57
P186 0,25 0,25 0,25
P209 0,33 0,04 0,33
P213 0,06 0,06 0,06
Apêndice C - Análise de variância do volume normalizado de proteínas
presentes em lavados uterinos coletados por sonda de Folley ou
Post-mortem (efeito de tipo de lavado) de animais cíclicos ou
gestantes (efeito de estado) no dia 18 pós-estro.
a
Identificação da proteína
P < F
ID Proteína
a
Estado Lavado Lavado x Estado
P223 0,78 0,11 0,78
P231 0,27 0,19 0,27
P232 0,19 0,19 0,19
P234 0,97 0,53 0,14
P240 0,32 0,55 0,75
P243 0,06 0,03 0,06
P250 0,24 0,24 0,24
P253 0,05 0,05 0,05
P257 0,13 0,13 0,13
P270 0,26 0,89 0,16
P288 0,07 0,07 0,07
P297 0,16 0,16 0,16
P302 0,12 0,12 0,12
P304 0,05 0,05 0,05
P306 0,07 0,07 0,07
P307 0,25 0,25 0,25
P310 0,04 0,04 0,04
P317 0,15 0,15 0,15
P322 0,18 0,18 0,18
P326 0,11 0,27 0,27
P328 0,18 0,18 0,18
P329 0,21 0,21 0,21
P330 0,65 0,2 0,65
P335 0,21 0,21 0,21
P347 0,11 0,11 0,11
P353 0,07 0,07 0,07
P361 0,01 0,01 0,01
P368 0,07 0,07 0,07
P369 0,05 0,05 0,05
P372 0,12 0,12 0,12
P375 0,11 0,11 0,11
P380 0,27 0,27 0,27
P388 0,18 0,18 0,18
P389 0,29 0,29 0,29
P390 0,22 0,22 0,22
P391 0,12 0,12 0,12
P398 0,72 0,72 0,04
P400 0,19 0,19 0,19
P405 0,19 0,19 0,19
P406 0,16 0,16 0,08
P408 0,38 0,38 0,38
P411 0,66 0,18 0,69
P412 0,41 0,41 0,41
P413 0,18 0,18 0,18
P415 0,31 0,31 0,31
P418 0,33 0,33 0,33
P420 0,20 0,20 0,20
a
Identificação da proteína
P < F
ID Proteína
a
Estado Lavado Lavado x Estado
P422 0,24 0,19 0,24
P426 0,16 0,16 0,16
P428 0,19 0,19 0,19
P429 0,36 0,36 0,36
P430 0,36 0,36 0,36
P431 0,07 0,07 0,03
P433 0,22 0,22 0,22
P435 0,24 0,24 0,24
P437 0,19 0,19 0,16
P445 0,38 0,38 0,38
P451 0,07 0,07 0,07
P452 0,21 0,21 0,21
P453 0,39 0,39 0,39
P454 0,21 0,21 0,21
P456 0,38 0,38 0,38
P457 0,27 0,27 0,27
P465 0,40 0,40 0,40
P466 0,27 0,27 0,27
P479 0,23 0,23 0,23
P480 0,15 0,15 0,15
P481 0,18 0,18 0,18
P482 0,41 0,41 0,41
P483 0,38 0,38 0,38
P484 0,41 0,41 0,41
P486 0,36 0,36 0,36
P488 0,39 0,39 0,39
P495 0,27 0,27 0,27
P500 0,17 0,17 0,17
P504 0,09 0,09 0,09
P506 0,23 0,23 0,23
P507 0,14 0,14 0,14
P510 0,23 0,23 0,23
P529 0,27 0,27 0,27
P532 0,22 0,22 0,22
P535 0,31 0,31 0,31
P549 0,28 0,28 0,28
P561 0,19 0,19 0,19
P564 0,32 0,32 0,32
P566 0,22 0,22 0,22
P570 0,21 0,21 0,21
P573 0,82 0,18 0,82
P591 0,23 0,23 0,23
P609 0,15 0,15 0,15
P614 0,36 0,36 0,36
P616 0,19 0,19 0,19
P626 0,23 0,23 0,23
a
Identificação da proteína
P < F
ID Proteína
a
Estado Lavado Lavado x Estado
P627 0,28 0,28 0,28
P630 0,82 0,96 0,17
P648 0,25 0,25 0,25
P658 0,19 0,19 0,19
P659 0,16 0,16 0,16
P683 0,16 0,16 0,16
P697 0,25 0,25 0,25
P705 0,19 0,19 0,19
P712 0,12 0,12 0,12
P718 0,04 0,04 0,04
P737 0,11 0,11 0,03
P764 0,04 0,04 0,04
P769 0,06 0,06 0,06
P774 0,95 0,08 0,95
P778 0,28 0,28 0,28
P780 0,35 0,24 0,35
P782 0,39 0,39 0,39
P785 0,17 0,17 0,17
P795 0,18 0,18 0,18
P806 0,17 0,17 0,17
P810 0,19 0,19 0,19
P812 0,35 0,35 0,35
P815 0,35 0,35 0,35
P820 0,18 0,18 0,18
P823 0,24 0,24 0,24
P824 0,15 0,03 0,15
P826 0,34 0,34 0,34
P827 0,05 0,05 0,05
P834 0,35 0,35 0,35
P838 0,38 0,38 0,38
P841 0,35 0,35 0,35
P855 0,18 0,18 0,18
P876 0,28 0,28 0,28
P890 0,07 0,07 0,07
P907 0,04 0,04 0,04
P925 0,10 0,10 0,10
P932 0,14 0,14 0,14
P936 0,26 0,26 0,26
P942 0,16 0,16 0,16
P969 0,12 0,12 0,12
P977 0,07 0,07 0,07
a
Identificação da proteína
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