( PDF ) Avaliação do efeito citotóxico da lectina da esponja marinha Cliona varians contra células de leucemia mielóide crônica

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

CENTRO DE BIOCIÊNCIAS

DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA

GIOCONDA EMANUELLA DINIZ DE DANTAS MOURA

AVALIAÇÃO DO EFEITO CITOTÓXICO DA LECTINA DA

ESPONJA MARINHA Cliona varians CONTRA

CÉLULAS DE LEUCEMIA MIELÓIDE CRÔNICA

NATAL

2007

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GIOCONDA EMANUELLA DINIZ DE DANTAS MOURA

AVALIAÇÃO DO EFEITO CITOTÓXICO DA LECTINA DA

ESPONJA MARINHA Cliona varians CONTRA

CÉLULAS DE LEUCEMIA MIELÓIDE CRÔNICA

Dissertação apresentada ao Departamento

de Bioquímica da Universidade Federal do

Rio Grande do Norte como requisito parcial

para obtenção do título de Mestre em

Bioquímica.

Orientador: Dr. Maurício Pereira de Sales

NATAL

2007

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À Deus que me carregou em seus braços;

Aos meus amados pais, Neneo e Luzimar, pela

segurança, incenti

vo e apoio para por em

prática minhas escolhas, e que me

ensinaram a necessidade da luta, da

verdade

e da perseverança no decorrer

da vida;

Ao meu querido irmão, George, pela

paciência, presença e apoio nos momentos

do pesado caminhar. Pelas

lições de força,

encorajamento e por me mostrar que

mesmo que não encontremos o caminho

certo, sempre teremos pra onde voltar...

sempre teremos um ao outro.

AGRADECIMENTOS

"A gratidão é a memória do coração"

Antístenes

Agradeço ao profesor Dr. Maurício Pereira de Sales, meu orientador de

mestrado e iniciação científica. Obrigado pelos ensinamentos e por acreditar no

meu crescimento como pesquisadora. Agradeço profundamente pela paciência,

incentivo e dedicação na orientação dispensada durante estes cinco anos de

convivência em que me encaminhou na pesquisa científica.

Aos professores Elizeu Antunes dos Santos do Departamento de

Bioquímica e Alexandre Flávio Silva de Queiroz do Departamento de Biofísica e

Farmacologia pelas sugestões, incentivos, participação e colaboração durante as

inúmeras versões de minha tese, contribuindo para seu desenvolvimento e

concretização.

À professora Fabiana Bezerra de Lima do Departamento de Microbiologia e

Parasitologia pelo uso de seu laboratório, pela disponibilidade e ajuda nos

experimentos de versões anteriores do projeto de mestrado.

À Dra. Giselle Zenker Justo do Departamento de Bioquímica da UNICAMP

pelo auxílio na realização dos experimentos essenciais para a conclusão deste

trabalho.

À professora Adriana Uchôa do Departamento de Biologia Celular e

Genética pelas sugestões durante a banca de qualificação deste trabalho.

A todos aqueles que fazem parte do Departamento de Bioquímica, aos

quais reservo apreço e consideração, e que de alguma forma contribuíram para a

realização deste trabalho.

A CAPES pelo apoio financeiro com a manutenção de bolsa concedida ao

Programa de Pós-Graduação em Bioquímica da Universidade Federal do Rio

Grande do Norte

À melhor turma de mestrado, depois de tantas horas de artigos, de provas,

de experimentos. Torço por cada um...

À Celina pela amizade verdadeira, pelo apoio emocional e pela participação

na aquisição dos camundongos utilizados em versões anteriores do projeto.

A Augusto César, “meu nego”, por compreender minha ausência durante

este tempo acreditando no meu crescimento profissional.

Agradeço aos amigos de laboratório: Adeliana, Dani, Joelma, Rodrigo,

Cleysyvan, Sheyla, Luiza, Huguinho, Ju, Gabi, Deyse, Leozinho, Jannison, Ibson,

Fábio, Thales, Pedro, Dr. Jacy, Fabiano, Carlos, Shyrley e Raniere; aos meus

primeiros alunos Norberto e Vitinho pela compreensão e ajuda nos momentos de

desespero; e de maneira especial a Ludovico pela disponibilidade em montar

comigo as figuras da primeira versão da introdução (embora não tenha usado

todas). A presença de todos foi de extrema importância para a finalização desta

etapa!

Aos meus irmãos de laboratório, Leonardo Pepino, Ticiana Amorin e Katya

Anaya. E às minhas eternas amigas Virgínia, Ana Celly e Hayanne. Agradeço pela

alegria proporcionada nos momentos de descontração e pela presença nas horas

de incerteza e cansaço. Obrigado pelo companheirismo, pela cumplicidade, pelos

ombros durante a tristeza e pelos ouvidos nos momentos de decepções pessoais

e frustrações profissionais. Finalmente, chegou o fim!!! Vou levar vocês bem

protegidos, bem guardadinhos no meu coração... Amo vocês!!!

(...) Não quero perder o momento belo.

Quero vivê-lo mais,

com a intensidade que exige a vida:

desgarramento e fulguração.

Então me corto ao meio e me solto de mim:

a que se prende e a que voa,

a que vive e a que se inventa.

Duplo coração:

a que se contempla e a que nunca se

entende,

a que viaja sem saber se chega

- mas não desiste jamais.

Lya Luft – Rosto com dois perfis

RESUMO

Neste trabalho, a linhagem K562 de células de leucemia mielóide crônica,

expressando a proteína oncogênica BCR-ABL, foi usada como modelo para

investigar a atividade antitumoral da lectina CvL purificada da esponja marinha

Cliona varians. CvL inibiu o crescimento de células K562 com um IC

de 70

Pg/mL, mas não afetou a viabilidade celular de linfócitos normais de sangue

periférico humano no mesmo intervalo de concentrações testadas (1 – 80 Pg/mL).

A morte celular ocorreu após 72 horas de exposição à lectina e com alterações

nucleares típicas de apoptose como analisado pela fluorescência de DAPI.

Investigação dos possíveis efetores deste processo mostrou que a morte celular

ocorreu sem ativação de caspases e na presença de expressões aumentadas de

Bcl-2 e Bax. O fato de CvL desencadear a liberação de catepsina B, como

evidenciado pela microscopia de fluorescência, e do inibidor E-64 bloquear

completamente a morte celular induzida por CvL, sugerem papel central dessa

protease lisossomal na ativação de uma via alternativa de morte celular. CvL

também induziu o aumento de expressão do receptor de morte TNFR-1 e a

diminuição dos níveis de NFțB. Estes efeitos foram acompanhados pelo aumento

significativo na expressão de p21 e pela modulação negativa de pRb, mostrando

que CvL foi capaz de bloquear a progressão do ciclo celular. Juntos, estes dados

sugerem que catepsina B age como mediador da citotoxicidade induzida por CvL

possivelmente através de uma conexão ainda não caracterizada com a via dos

receptores de morte.

Palavras-chave: Lectina, Cliona varians, CvL, Leucemia, Apoptose, Catepsina B.

ABSTRACT

In this study, a BCR-ABL expressing human chronic myelogenous leukaemia cell

line (K562) was used to investigate the antitumoral potential of a novel lectin (CvL)

purified from the marine sponge Cliona varians. CvL inhibited the growth of K562

cells with an IC

value of 70 Pg/ml, but was ineffective to normal human peripheral

blood lymphocytes in the same range of concentrations tested (180 Pg/ml). Cell

death occurred after 72 h of exposure to the lectin and with sign of apoptosis as

analysed by DAPI staining. Investigation of the possible effectors of this process

showed that cell death occurred in the presence of Bcl-2 and Bax expression, and

involved a caspase-independent pathway. Confocal fluorescence microscopy

indicated a major role for the lysosomal protease cathepsin B in mediating cell

death. Accordingly, pre-incubation of K562 cells with the cathepsin inhibitor L-

trans-epoxysuccinyl-L-leucylamido-(4-guanidino)butane (E-64) abolished the

cytotoxic effect of CvL. Furthermore, we found upregulation of tumor necrosis

factor receptor 1 (TNFR1) and down-modulation of p65 subunit of nuclear factor

kappa B (NFNB) expression in CvL-treated cells. These effects were accompanied

by increased levels of p21 and downmodulation of pRb, suggesting that CvL is

capable of cell cycle arrest. Collectively, these findings suggest that cathepsin B

acts as death mediator in CvL-induced cytotoxicity possibly in a still

uncharacterized connection with the membrane death receptor pathway.

Key words: lectin; Cliona varians; CvL; leukemia; K562; apoptosis; cathepsin B.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Mecanismo de aglutinação.....................................................................16

Figura 2: Subdivisão da família das galectinas......................................................21

Figura 3: Esquema ilustrativo da organização corporal dos poríferos...................29

Figura 4: Número de compostos de origem marinha citados em publicações no

período de 1965 a 2005..........................................................................................33

Figura 5: Formação do cromossomo Ph (Philadelphia).........................................40

Figura 6: Esponja marinha Cliona varians.............................................................42

Figura 7: Citotoxicidade de CvL para células K562 e linfócitos de sangue

periférico avaliada pelo teste de redução de MTT..................................................53

Figura 8: Citotoxicidade de CvL para células K562 avaliada pelo método de

exclusão do azul de tripan......................................................................................54

Figura 9: Alterações morfológicas típicas de apoptose induzida por CvL em

células K562...........................................................................................................55

Figura 10: Determinação do índice de apoptose induzida por CvL em células K562

pela marcação com DAPI.......................................................................................56

Figura 11: Análise da marcação de catepsina B por imunofluorescência em

células K562 tratadas com CvL..............................................................................59

Figura 12: Efeito da Inibição de catepsina B sobre a morte celular induzida por

CvL em células K562..............................................................................................60

Figura 13: Efeito de CvL sobre a expressão de proteínas envolvidas na indução

de apoptose e bloqueio do ciclo celular em células K562......................................62

LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Classificação das lectinas......................................................................19

LISTA DE ABREVIATURAS

Bak: Proteína pro-apoptótica da família Bcl-2

Bcl-2 antagonist / killer

Bax: Proteína pro-apoptótica da família Bcl-2

Bcl-2 associated protein X

Bcl-2: Proteína anti-apoptótica da família Bcl-2

B – cell lymphoma 2

Bcl-X

: Proteína anti-apoptótica da família Bcl-2

isoforma da proteína Bcl-2

BCR-ABL: Proteína oncogênica tirosina-quinase

BSA: Albumina sérica bovina

Con A: Lectina do feijão Canavalia ensiformes

CvL: Lectina da esponja marinha Cliona varians

DAPI: Corante (4’-6’-diamidino-2-fenilindol)

DP: Desvio padrão

DRC: Domínio reconhecedor de carboidratos

DTT: Ditiotreitol

E-64: Inibidor irreversível de protease cisteínica

EGTA: Ácido etilenoglicol tetra acético

ESA: Lectina da alga marinha Euchema serra

FemX: Linhagem de células de melanoma

FmL: Lectina do camarão Fenneropenaeus

merguiensis

HeLa: Linhagen de células de câncer cervical

HRP: Peroxidase de raiz forte

IgG: Imunoglobulina G

K562: Linhagem de células mielóides leucêmicas

LLA: Leucemia linfóide aguda

LMC: Leucemia mielóide crônica

MTT: Brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-yl)-2,5-

difeniltetrazólio

NFțB: Fator transcricional anti-apoptótico

p21: Proteína regulatória do ciclo celular de

21 kDa

p65: Subunidade do fator transcricional NFțB

Ph: Cromossomo Philadelphia

PjLec:Lectina do crustáceo Penaeus japonicus

PmLec:Lectina do crustáceo Penaeus

monodon

PPL: Lectina da alga marinha Ptilota plumosa

pRb: Proteína de retinoblastoma

PVDF: Fluoreto de Polivinilideno

RBA: Aglutinina do farelo de arroz

RIP’s: Proteínas inativadoras de ribossomo

RPMI 1640: Meio de cultura para células

SDS: Dodecil sulfato de sódio

SDS-PAGE: Eletroforese em gel de

poliacrilamida com dodecil sulfato de

sódio

SFB: Soro fetal bovino

TNF: Fator de necrose tumoral

TNFR-1: Receptor do fator de necrose tumoral

WGA: Aglutinina de gérmen de trigo

SUMÁRIO

1.0- INTRODUÇÃO 14

1.1 – LECTINAS 14

1.2 – C

LASSIFICAÇÃO DAS LECTINAS 17

1.3 – D

ISTRIBUIÇÃO DE LECTINAS NOS ORGANISMOS 22

1.3.1– L

ECTINAS DE INVERTEBRADOS 25

1.3.2 – L

ECTINAS DE ESPONJAS MARINHAS 29

1.4 - C

OMPOSTOS BIOLÓGICOS COMO NOVOS AGENTES TERAPÊUTICOS 32

1.5 – LECTINAS DE ORIGEM MARINHA NO COMBATE DO CÂNCER 36

1.6 – L

EUCEMIA MIELÓIDE CRÔNICA 38

2.0- OBJETIVOS

3.0- MATERIAL E MÉTODOS 43

3.1 – MATERIAL 43

3.2 – M

ETODOLOGIA 45

3.2.1 – P

REPARAÇÃO DA LECTINA DE ESPONJA MARINHA CLIONA VARIANS (CVL) 45

3.2.2 – C

ULTURA DE CÉLULAS LEUCÊMICAS DA LINHAGEM K562 46

3.2.3 – C

ULTURA DE LINFÓCITOS DE SANGUE PERIFÉRICO HUMANO 46

3.2.4 – E

NSAIO DE VIABILIDADE CELULAR 47

3.2.5 – Q

UANTIFICAÇÃO DOS INDICADORES DE APOPTOSE POR INCUBAÇÃO COM DAPI 48

3.2.6 – I

NVESTIGAÇÃO DE ATIVAÇÃO DE CASPASES POR MONITORAMENTO DE P-NITROANILINA

3.2.7 – INVESTIGAÇÃO DE LIBERAÇÃO DE CATEPSINA B POR IMUNOFLUORESCÊNCIA 50

3.2.8 – A

NÁLISE POR IMUNOBLOTTING DOS NÍVEIS DE EXPRESSÃO DO TNFR-1, DO NFȀB E DAS

PROTEÍNAS DE REGULAÇÃO DO CICLO CELULAR P

21 E PRB EM CÉLULAS K562 TRATADAS COM

CVL 50

3.2.9 – A

NÁLISES ESTATÍSTICAS 52

4.0- RESULTADOS

4.1 – EFEITOS DE CVL SOBRE A VIABILIDADE CELULAR 53

4.2 – I

NDUÇÃO DE APOPTOSE POR CVL EM CÉLULAS K562 55

4.3 – I

NVESTIGAÇÃO DE ATIVAÇÃO DE CASPASES POR MONITORAMENTO DE P-NITROANILINA 58

4.4 – E

NVOLVIMENTO DE CATEPSINA B NA MORTE CELULAR DE K562 INDUZIDA POR CVL 58

4.5 –E

FEITO DE CVL NA MODULAÇÃO DOS NÍVEIS DE EXPRESSÃO DO TNFR-1, DO NFȀB E DAS

PROTEÍNAS DE REGULAÇÃO DO CICLO CELULAR P

21 E PRB EM CÉLULAS K562 61

5.0- DISCUSSÃO

6.0- CONCLUSÕES 70

7.0- REFERÊNCIAS 72

1.0- INTRODUÇÃO

1.1 – Lectinas

As lectinas foram detectadas pela primeira vez na Universidade de Dorpat

(Estônia) pelo estudante de medicina Hermann Stillmark (1888) quando trabalhava

em sua tese de doutorado com Ricinus communis. Naquela época, ele descreveu

a presença de um fator tóxico em extratos de mamona que aglutinava células

vermelhas do sangue. Este fato foi considerado o marco inicial da pesquisa de

lectinas (Rudiger, 1998).

Posteriormente, verificou-se que extratos de plantas não tóxicas, como

feijão (Phaseolus vulgaris), ervilha (Pisum sativum) e lentilha (Lens culinaris),

também causavam aglutinação de eritrócitos (Landsteiner & Raubitschek, 1907).

Em 1936, Summer e Howell sugeriram pela primeira vez que a aglutinação

de eritrócitos produzida pela Concanavalina A (ConA), lectina extraída do feijão-

de-porco (Canavalia ensiformes), seria devido interações entre a lectina e

açúcares presentes na superfície das hemácias, estabelecendo a principal

propriedade das lectinas, a afinidade por carboidratos (Summer & Howell, 1936).

Ao analisarem extratos de feijão lima (Phaseolus limensis), Boyd e Reguera

observaram a especificidade de aglutinação para hemácias do grupo sanguíneo A

(Boyd & Reguera, 1949). E em 1954, o termo lectina (do latim “legere” que

significa selecionar, escolher) foi criado por Boyd e Shapleigh para enfatizar a

habilidade de algumas hemaglutininas em diferenciar células sanguíneas do

sistema ABO (Boyd & Shapleigh, 1954).

Atualmente, o termo lectina é amplamente empregado para designar todas

as proteínas que possuem ao menos um domínio não-catalítico que se liga

reversivelmente e especificamente a mono ou oligossacarídeos (Peumans &

Vandamme, 1995; Vijayan & Chandra, 1999). Alternativamente, lectinas também

são definidas como proteínas ou glicoproteínas de origem não-imune, com um ou

mais sítios por subunidade, que pode ligar-se reversivelmente a segmentos

glicídicos específicos, através de pontes de hidrogênio e interações de Van Der

Waals (Lis & Sharon, 1998). Elas interagem com os segmentos glicídicos através

de uma região chamada domínio reconhecedor de carboidratos (DRC) que é

altamente conservada em cada tipo de lectina (Ni & Tizard, 1996).

Lectinas de origem animal têm sido detectadas concomitantemente às

lectinas de origem vegetal. A primeira atividade lectínica de origem animal foi

encontrada em serpentes, e descrita no trabalho de Flexner e Noguchi (1902), no

qual publicaram um estudo detalhado sobre a aglutinação e lise de eritrócitos e

leucócitos por complexos denominados por eles de “corpos intermediários”. No

entanto, Flexner e Noguchi admitiram que seus colegas Mitchell e Stewart tinham

previamente descrito a aglutinação de células vermelhas do sangue, por veneno

de serpente, há cinco anos em estudos com a cascavel da espécie Crotalus

durissus. Muitos anos mais tarde, a trombolectina de Bothrops atrox tornou-se a

primeira lectina animal a ser isolada em sua forma pura (Gartner et al., 1980).

Desde então, muitas outras têm sido purificadas, tornando-se úteis nos mais

diversos campos de pesquisa.

Ao interagirem com gliconjugados de superfície celular, as lectinas podem

promover a formação de ligações cruzadas entre células adjacentes,

desencadeando o processo denominado aglutinação (Alonso et al., 2001;

Peumans & Vandamme, 1995) (FIGURA 1). Ensaios da inibição de aglutinação,

em que as lectinas são incubadas com diversos tipos de carboidratos ou

glicoproteínas antes da adição das células modelo, constituem um meio de

estabelecer a especificidade das lectinas (Marques & Barracco, 2000).

Devido à interação específica das lectinas com glicoconjugados, seja em

solução ou em superfície celular, essas proteínas encontram-se envolvidas em

uma variedade de atividades biológicas, como: adesão celular, interações célula-

matriz, apoptose e citotoxicidade em células e organismos (Akahani et al., 1997;

Danguy et al., 2002; Sales et al., 2000). Propriedades como atividade mitogênica,

efeitos antibacterianos e antitumorais, também foram relatadas (Engering et al.,

2002; Hajto et al., 2005; Moura et al., 2006; Sharon & Lis, 2004; Tateno et al.,

2002). Essas propriedades marcam tais moléculas como poderosas ferramentas

biomédicas e biotecnológicas, com aplicações nos processos de isolamento,

caracterização e tipagem de macromoléculas, células e microrganismos; na

utilização em procedimentos de diagnóstico e estudo das funções do sistema

imune, tais como indução da proliferação de linfócitos e produção de

interferon/citocinas, asma e inflamação (Turner, 2003), na diferenciação de células

malignas e benignas e no nível de glicosilação associado à metástase (Arenas et

al., 1999; Gorelik et al., 2001; Opric et al., 1996). Além de todas essas citadas,

algumas lectinas têm mostrado induzir apoptose em diferentes linhagens de

células, dessa maneira destacando mais uma importante propriedade, a

citotoxicidade (Kim et al., 1993; Miyoshi et al., 2001; Ohba et al., 2004; Pajic et al.,

2002; Rao et al., 2005; Yoon et al., 1999).

Figura 1: Mecanismo de aglutinação. Formação de ligações cruzadas entre células adjacentes

devido interações de lectinas solúveis com gliconconjugados de superfície celular.

1.2 – Classificação das lectinas

Embora tenham sido inicialmente detectadas em vegetais superiores, as

lectinas são encontradas em muitos outros organismos, desde vírus e bactérias

até animais invertebrados e vertebrados (Lis & Sharon, 1998; Loris, 2002). O

reconhecimento de carboidratos ocorre nos mais variados contextos biológicos e

por isso as lectinas consistem em um grupo de proteínas altamente diverso,

formado por um grande número de famílias.

As lectinas de plantas foram agrupadas de acordo com sua estrutura

quaternária em pelo menos quatro grandes classes: (A) Merolectinas que são

proteínas de pequeno tamanho e que possuem um único domínio reconhecedor

de carboidratos, sendo, portanto, incapazes de precipitar glicoconjugados ou

aglutinar células; (B) Hololectinas que consistem de moléculas com, no mínimo,

dois domínios idênticos ou bastante homólogos que se ligam ao mesmo

carboidrato ou à açúcares de estrutura bastante similar. As hololectinas se

destacam por exercerem, mais frequentemente, a propriedade principal das

lectinas: aglutinar células e glicoconjugados, além de abrangerem a maioria das

lectinas estudadas atualmente; (C) Quimerolectinas, lectinas que possuem ao

menos dois domínios com atividades distintas: um capaz de se ligar a carboidratos

ou glicoconjugados, e outro domínio distinto e bem definido, capaz de exercer uma

atividade enzimática ou outra atividade biológica qualquer; e (D) Superlectinas

que correspondem a um tipo especial de quimerolectinas, onde ao menos dois

domínios são ligantes de carboidratos, no entanto, apresentam especificidades

distintas (Van Damme et al., 1998).

Embora as lectinas de plantas sejam consideradas um grupo muito

complexo e heterogêneo; levando em consideração suas sequências, informações

estruturais e clonagem de genes, foi possível subdividí-las em sete famílias

estruturalmente e evolutivamente relacionadas: Lectinas de leguminosas; Lectinas

ligadoras de quitina; Proteínas inativadoras de ribossomos (RIP’s) do tipo 2 e

lectinas relacionadas; Lectinas ligadoras de manose em monocotiledôneas;

Lectinas semelhantes à jacalina; Lectinas semelhantes à Amarantina e Lectinas

de Cucurbitáceas (Murdock & Shade, 2002) (TABELA 1).

Além da classificação acima, as lectinas em geral (seja de origem animal ou

vegetal) também são classificadas dentro de cinco grupos, de acordo com o

monossacarídeo pelo qual exibem maior afinidade. Esses monossacarídeos

inicialmente foram agrupados conforme a orientação das hidroxilas em C3 e C4 da

cadeia piranosídica (Makela, 1957). Assim as lectinas foram agrupadas

primeiramente em ligantes de L-fucose, D-glicose/D-mannose, D-galactose/N-

acetil-D-galactosamina, e posteriormente novos grupos foram criados levando em

conta substituições no anel, como no caso de N-acetil-D-glicosamina e ácido N-

acetilneuramínico (Rudiger, 1998). Assim dependendo da especificidade com

relação ao monossacarídeo, a lectina irá seletivamente ligar-se a um desses

açúcares acima citados, que são constituintes típicos de superfície de células

eucarióticas (Lis & Sharon, 1998).

Embora as lectinas de origem vegetal estejam com estudos mais

avançados, as lectinas de origem animal estão sendo detectadas desde a mesma

época. Provavelmente, durante algum tempo, essas proteínas de origem animal

não foram identificadas como moléculas ligadoras de carboidratos, ficando a sua

caracterização limitada às suas propriedades secundárias de aglutinação celular e

aplicações biomédicas.

Nos primeiros trabalhos sobre a estrutura primária de lectinas de animais foi

estabelecido que estas poderiam ser divididas em duas famílias: as Lectinas do

Tipo-C (que requerem a presença de Ca

para sua atividade), e as Lectinas do

Tipo-S (que reconhecem resíduos de galactose, hoje conhecidas como galectinas)

(Drickamer, 1988). A percepção atual sobre esta classificação foi modificada, já

que o espectro de estruturas conhecidas tornou-se bastante amplo (Gabius et al.,

2002; Loris, 2002). A definição atualmente mais aceita está baseada na

especificidade de ligação destas proteínas aos carboidratos, na homologia de

suas estruturas primárias, e na relação evolutiva entre elas, tornando possível

agrupá-las em pelo menos dez famílias de lectinas pertencentes ao reino animal:

Lectinas do Tipo-C, Tipo-I, Tipo-P, Tipo-L, Galectinas, Eglectinas, Pentraxinas,

Calreticulinas/Calnexinas, Anexinas, Discoidinas (TABELA 1).

Tabela 1: Classificação das lectinas baseada na especificidade de ligação aos

carboidratos, homologia de estruturas primárias e relação evolutiva.

Famílias de Lectinas

Lectinas de origem vegetal Lectinas de origem animal

Lectinas de leguminosas Lectinas do tipo-C

Lectinas de curcubitáceas Lectinas do tipo-I

Lectinas ligadoras de manose Lectinas do tipo-L

Lectinas ligadoras de quitina Lectinas do tipo-P

Lectinas semelhantes à jacalina Galectinas ou Lectinas do tipo-S

Lectinas semelhantes à amarantina Pentraxinas

RIP´s do tipo 2 Eglectinas

Calreticulinas/Calnexinas

Anexinas

Discoidinas

Esses grupos incluem a maioria das lectinas de animais conhecidas, no

entanto, existem ainda muitas lectinas que não se enquadram nas características

das famílias já estabelecidas, e futuras pesquisas acerca de suas estruturas e

propriedades bioquímicas, poderão levar essas lectinas a se encaixarem em

famílias já existentes, ou a formar novas famílias de lectinas animais (Kilpatrick,

2002).

As lectinas do Tipo-C e as Galectinas compreendem as duas maiores

famílias de lectinas do reino animal. A família de Lectinas do Tipo-C constitui o

grupo mais diversificado com relação à estrutura, localização celular e

especificidade de ligação com o monossacarídeo. Além disso, como já foi exposto,

é composta por proteínas dependentes do íon Cálcio (Ca

) para desempenharem

sua atividade biológica (Kilpatrick, 2002). As lectinas dessa família apresentam um

elevado nível de conservação na estrutura de seus domínios de reconhecimento

de carboidratos (DRC), geralmente composto por 120 resíduos de aminoácidos

(Drickamer, 1988). Os DRCs das Lectinas do Tipo-C encontram-se incorporados

em vários contextos de organização celular, o que permite classificá-las em duas

categoria de lectinas do Tipo-C: (A) lectinas do Tipo-C solúveis, também

chamadas de Colectinas e (B) lectinas do Tipo-C transmembrana, conhecidas

também por Selectinas (Kilpatrick, 2002).

As galectinas formam uma família de lectinas altamente conservadas que

se ligam a E-galactosídeos (Rabinovich et al., 2002). Sua atividade independe de

íons metálicos, não apresentam pontes dissulfeto e glicosilações. As galectinas

têm sido mencionadas em várias funções essenciais, estando envolvidas nos

processos de desenvolvimento e diferenciação celular, apoptose e metástase

tumoral. Elas podem ser encontradas no citosol, núcleo ou acumuladas em sítios

citosólicos (Danguy et al., 2002). Os membros da família das galectinas contêm no

mínimo um DRC com cerca de 130 aminoácidos. Com base na arquitetura

estrutural dos domínios de ligação, essas lectinas foram subdivididas em proto

(domínios idênticos), quimera (um domínio de galectina e um domínio não

lectínico) e tandem (com dois domínios distintos) (Arata et al., 1997; Liu et al.,

2002) (FIGURA 2).

Figura 2: Subdivisão da família das galectinas. Baseada na arquitetura estrutural dos domínios

reconhecedores de carboidratos e suas especificidades. Figura adaptada (Lis & Sharon, 1998).

1.3 – Distribuição de lectinas nos organismos

Abundantes na natureza, as lectinas são encontradas em quase todos os

organismos, sendo amplamente distribuídas entre vegetais, vírus, bactérias,

mamíferos e vários grupos de invertebrados (Gerlach et al., 2005; Kilpatrick,

2002). Embora sejam largamente estudadas com relação às suas potencialidades

biológicas, o papel fisiológico das lectinas ainda é obscuro para a ciência (Rudiger,

1998).

Em vírus, bactérias e protozoários há indícios de desempenharem um papel

auxiliar e/ou promoverem a adesão destes microrganismos às estruturas celulares

de seus hospedeiros, um pré-requisito para que a infecção ocorra. (Lis & Sharon,

1998). Em trabalho desenvolvido por Glick e colaboradores (1991), foi constatado

que na infecção causada pelo vírus da influenza, o processo de adesão viral à

célula alvo era mediado por uma lectina que se liga aos resíduos de ácido siálico

(ácido N-acetil-neuramínico) presentes na face externa da membrana celular

(Glick et al., 1991). Muitos membros de enterobactérias possuem lectinas na sua

parede que permitem o sucesso da adesão ao epitélio intestinal, conduzindo a

infecções no trato urinário e gastrointestinal (Ofek & Sharon, 1990). Da bactéria

da espécie Pseudomonas aeruginosa foi isolada uma lectina que se liga à

superfície das células do hospedeiro causando danos aos tecidos de pacientes

infectados (Gilboa-Garber & Sudakevitz, 1999).

Entre os numerosos protozoários que infectam humanos e animais, a

ocorrência de lectinas tem sido melhor documentada na ameba patogênica

Entamoeba histolytica, que causa disenteria em humanos pela invasão e

rompimento da mucosa do cólon (Saffer & Petri, 1991).

Peumans e Van Damme (1998) estudaram os relatos de ocorrência de

lectinas em plantas superiores e observaram que estas proteínas já haviam sido

detectadas em cerca de 500 espécies. Muitas das lectinas vegetais são

encontradas nas sementes, embora sua presença já tenha sido observada em

todos os tipos de tecidos vegetais, como casca, folha, caule, frutos e raízes

(Peumans & Vandamme, 1995).

Dentre as várias hipóteses propostas sobre as funções das lectinas em

plantas, três são atualmente mais aceitas. A primeira assume a possível

participação dessas proteínas nas relações simbióticas entre plantas fixadoras de

nitrogênio e bactérias, um processo de importância crucial no ciclo de nitrogênio

terrestre. Contanto, esta hipótese fica restrita apenas à família de lectinas de

leguminosas que representa a família melhor estudada, com mais de 100

representantes isolados e caracterizados (Lis & Sharon, 1998). A segunda

hipótese se enquadra de maneira mais geral e pressupõe que as lectinas vegetais

são agentes de defesa contra microrganismos fitopatogênicos, insetos fitófagos e

animais herbívoros (Harper et al., 1995; Rudiger, 1998). Tem sido mostrado,

também, que lectinas de plantas possuem propriedades citotóxica, antifúngica e

anti-nematoda tanto in vitro quanto in vivo e são tóxicas para animais superiores

(Oka et al., 1997; Oliveira et al., 1994; Ripoll et al., 2003). E a terceira hipótese

sugere que estas moléculas poderiam funcionar como substâncias de reserva,

uma vez que, em algumas sementes de plantas, as lectinas representam a

principal fração de proteínas solúveis (Peumans & Vandamme, 1995; Vandamme

et al., 1996). Obviamente, as lectinas são degradadas durante a germinação,

contribuindo, assim, para o seu conjunto nutricional.

Nos animais vertebrados distinguem-se duas categorias de lectina: as

citoplasmáticas, que são extraídas em soluções aquosas ou salinas, e as lectina

de membrana que requerem o uso de detergentes para sua solubilização. Muitas

das lectinas ligadas à membrana são receptores para ligantes fisiológicos, como o

receptor manose-6-fosfato que liga enzimas lisossomais (Kornfeld, 1987), e

receptores para asialoglicoproteínas, que ligam asialoglicoproteínas do soro

(Ashwell & Harford, 1982).

Embora as lectinas presentes nos animais apresentem uma incontestável

variedade de funções, a maioria delas é considerada molécula de reconhecimento,

uma vez que age no processo de defesa contra patógenos e participa do tráfego

celular (Kilpatrick, 2002). O papel biológico destas proteínas tem sido alvo de

estudos já há muitas décadas. Esta situação é totalmente compreensível devido à

enorme quantidade de interações nas quais as lectinas podem engajar-se. É muito

improvável que um papel fisiológico geral para todas as lectinas possa ser

encontrado. Mesmo lectinas que são muito similares em suas estruturas primárias

e conformações podem servir a diferentes propósitos. Provavelmente, as lectinas

encontrem-se empregadas na natureza em diferentes funções, dependentes de

sua localização, especificidade e do momento de sua síntese.

1.3.1– Lectinas de invertebrados

Os invertebrados não possuem um sistema imune adaptativo baseado na

magnitude de anticorpos altamente específicos e receptores de antígenos como

aqueles que ocorrem em vertebrados (Marques & Barracco, 2000).

Na ausência de imunoglobulinas, mediadoras da imunidade adquirida,

lectinas presentes em tecidos de organismos invertebrados agem de maneira

semelhante aos anticorpos, fornecendo a primeira linha de defesa, podendo

desencadear um importante mecanismo efetor na eliminação potencial de

patógenos (Bayne et al., 1985; Kilpatrick, 2002).

Devido ao fato das lectinas terem a habilidade de ligar-se a carboidratos e

promover a aglutinação de diferentes células, é razoável assumir que essas

moléculas possuem um considerável papel nas reações de reconhecimento do

não-próprio nos invertebrados. Assim como as imunoglobulinas dos vertebrados,

as lectinas dos invertebrados podem aglutinar microrganismos e favorecer sua

fagocitose, por mediar a ligação entre a superfície do hemócito e o corpo estranho

(Opsonização). Existem três diferentes rotas para o reconhecimento de partículas

estranhas, nas quais as lectinas podem interagir: a primeira é através da interação

da lectina da membrana do invertebrado com o carboidrato de membrana do

microrganismo; a segunda ocorre pela ligação entre a lectina da membrana do

patógeno e o açúcar presente na membrana das células do invertebrado; e a

terceira rota, ocorre através da ligação de lectinas humorais com glicoconjugados

presentes nos microrganismos, formando um complexo que se une ao receptor de

opsonina da célula de defesa dos invertebrados (Renwrantz, 1983).

Nos invertebrados, já foram detectadas e estudadas lectinas nos diversos

filos. O mais antigo exemplo nessa categoria, provavelmente, é a lectina da

hemolinfa do artrópode Limulus, também conhecido como caranguejo-ferradura.

Apesar do nome, esta espécie está mais próxima das aranhas e escorpiões que

dos caranguejos propriamente ditos. O lisado dos amebócitos deste animal, após

preparação por fracionamento e coagulação de enzimas, têm sido utilizado em

ensaios cromogênicos no desenvolvimento de testes específicos para endotoxinas

(Obayashi et al., 1985).

Entre os cnidários, a anêmona Bunodeopsis antillienis apresenta duas

aglutininas específicas para eritrócitos humanos com características bem distintas

uma da outra (Fenton-Navarro et al., 2003). Na espécie de anelídeo marinho

Chaetopterus variopedatus, pertencente à classe poliqueta, foi isolada uma lectina

específica para galactose e com atividade anti-HIV-I (Wang et al., 2006). Lectinas

com especificidade para D-galactosídeos também foram purificadas da parede

corporal do equiuróide, Urechis unicinctus e de dois anelídeos, Neanthes japonica

e Marphysa sanguinea (Ozeki et al., 1997).

Uma grande variedade de lectinas também tem sido isolada da hemolinfa e

órgãos sexuais de exemplares do filo Mollusca, como as lectinas de Helix pomatia

(Hammarstrom et al., 1977), Limax flavus (Miller et al., 1982), e Tridacna maxima

(Baldo & Uhlenbruck, 1975). Ainda no filo Mollusca, as lectinas isoladas do

bivalve Ruditapes philippinarum, popularmente conhecido como mexilhão,

exibiram forte atividade anti-bacteriana, indicando que essas proteínas participam

do mecanismo de defesa promovendo a eliminação do microrganismo (Bulgakov

et al., 2004). Na hemolinfa da espécie Belamya bengalensis, pertencente à classe

Gastropoda, foi purificada uma lectina com forte especificidade para a

glicoproteína mucina. A proteína isolada apresentou uma potente atividade

mitogênica, estimulando a proliferação de linfócitos T, especificamente do tipo Th1

(Banerjee et al., 2004). A Aplysia dactylomela é uma espécie de molusco que

contém, em sua glândula púrpura, uma lectina com atividade hemaglutinante para

eritrócitos de coelhos, a qual é inibida pela glicoproteína fetuína (Melo et al.,

2000).

Em artrópodes, o subfilo Crustacea tem sido alvo de muitos trabalhos.

Lectinas já foram detectadas nas seguintes espécies: Penaeus indicus (Maheswari

et al., 1997), Penaeus japonicus (Kondo et al., 1998) e Penaeus paulensis

(Marques & Barracco, 2000). Ainda no gênero Penaeus, a espécie Penaeus

monodon possuiu uma lectina purificada, denominada PmLec, que mostrou

dependência por Ca

e especificidade por lipopolissacarídeos (componentes de

superfície em bactérias gram-negativas) (Luo et al., 2006). Na hemolinfa da

espécie Penaeus japonicus foi detectada e purificada uma lectina (PjLec), capaz

de aglutinar eritrócitos de humanos, camundongos, ratos e coelhos, independente

da presença do íon Ca

nos ensaios (Yang et al., 2007). Já na espécie

Litopenaeus schimitti foi detectada a presença de uma lectina aparentemente

multimérica que aglutina eritrócitos de diferentes animais e possui especificidade

para açúcares acetilados, particularmente o ácido siálico e diferentes tipos de

lipopolissacarídeos, sugerindo um possível papel no reconhecimento de

microrganismos (Cominetti et al., 2002).

Mais recentemente, pesquisadores da Tailândia purificaram e

caracterizaram uma lectina do camarão banana Fenneropenaeus merguiensis. A

lectina foi denominada FmL e teve sua massa molecular nativa determinada em

316,2 kDa. Por análise em SDS-PAGE foi mostrado que a proteína consistia de

um oligômero com subunidades de 30,9 e 32,3 kDa. A FmL foi capaz de aglutinar

várias espécies do gênero Vibrio indicando contribuir para a resposta de defesa de

camarões contra bactérias potencialmente patogênicas (Rittidach et al., 2007).

1.3.2 – Esponjas marinhas e lectinas

Com origem no período cambriano, o filo Porifera contém, atualmente

descritas, cerca de 6.000 espécies. As esponjas são organismos aquáticos

primitivos, na maioria marinhos, que não possuem tecidos bem definidos, nem

órgãos estabelecidos. Sua organização é muito simples e apresentam um

crescimento assimétrico, com grande diversidade de cores e tamanhos. São

animais filtradores, que realizam digestão intracelular, e cuja respiração e

excreção ocorrem por difusão direta entre as células e a água circulante através

dos canais do corpo (Bell & Barnes, 2001).

A parede do seu corpo é formada pela epiderme (revestimento externo),

pelo mesênquima e pelo revestimento interno de células flageladas, chamadas

coanócitos, que realizam a digestão do alimento que chega ao interior do animal.

No mesênquima, encontram-se os amebócitos que distribuem o alimento pelas

diversas células do corpo. Existem poros inalantes (óstios), por onde a água entra

no organismo, e um poro exalante (ósculo), por onde a água sai do animal. A

cavidade central, forrada de coanócitos, é deniminada átrio (Bell & Barnes, 2001)

(FIGURA 3).

Esponjas marinhas apresentam-se como um reservatório biológico de

moléculas bioativas. Possivelmente, esse fato decorre do período evolucionário

que esses animais percorreram, ao longo de seus 800 milhões de anos de

existência, convivendo com uma ampla diversidade de ambientes e outros seres

vivos, numa luta incessante pela conquista do habitat. As esponjas produzem uma

ampla variedade de toxinas e outros componentes moleculares com o objetivo de

repelir predadores (Pawlik et al., 2002), competir por espaço com outros

organismos sésseis e para comunicação e proteção contra infecções (Becerro et

al., 1997). O interesse de estudar esponjas marinhas intensificou-se após o

isolamento e caracterização de um componente anti-HIV chamado niphatevirin

presente na esponja Niphates erecta (Okeefe et al., 1997).

Figura 3: Esquema ilustrativo da organização corporal dos poríferos.

Fonte adaptada (Calixto & Biagioni, 2007).

Historicamente, o primeiro registro de lectinas isoladas de esponja foi feito

por Dodd e colaboradores em 1968 (Dodd et al., 1968). No ano de 2000, Miarons

e Fresno investigaram 22 espécies de 12 famílias de esponjas tropicais. Dentre

elas, 10 apresentaram atividade hemaglutinante para eritrócitos de vários animais,

inclusive quando esses foram submetidos a variados tratamentos enzimáticos.

Dessas, três espécies do gênero Aplysina se destacaram, e duas espécies tiveram

suas lectinas purificadas. As lectinas de A. lawnosa e A. archeri exibiram massa

molecular de 63 kDa (em sua forma nativa), e quando submetidas a condições

redutoras, apresentava massa molecular em torno de 16 kDa, sugerindo

homotetrâmeros. Elas apresentavam dependência de cátions divalentes e

afinidade para galactosideos (Miarons & Fresno, 2000).

Da espécie Axinella polypoides foram isoladas quatro lectinas com

especificidade para galactose (lectina-I, -II, -III e V) e uma com especificidade para

ácido hexurônico (lectina-IV) (Buck et al., 1992). Posteriormente Buck e

colaboradores em 1998 observaram que as lectina I e lectina II dessa espécie

apresentavam 65% de homologia em sua região N-terminal, massa molecular

muito similar, pontes dissulfeto entre os resíduos 4 e 46 e ausência de

glicosilações (Buck et al., 1998). Em um trabalho realizado por Bretting e

colaboradores usando métodos imunohistoquímicos, foi observado que as lectinas

I e II encontravam-se distribuídas em todos os tecidos da esponja e participavam

da formação de fibras de espongina, responsáveis pela sustentação da esponja

(Bretting & Konigsmann, 1979).

Em esponjas do gênero Suberites domuncula foi encontrada uma lectina de

27 kDa, com atividade bactericida (Schroder et al., 2003). Na espécie

Aphrocallistes vastus foram encontradas duas lectinas do tipo-C com afinidade

para galactose e com atividade de adesão celular (Gundacker et al., 2001). Xiong

e seus colaboradores isolaram da esponja Craniella australiensis uma lectina com

massa molacular de 54 kDa (nativa), trimérica, com subunidades de 18 kDa unidas

por pontes dissulfeto, especifidade para a glicoproteína mucina e independência

de íons divalentes para a aglutinação de eritrócitos (Xiong et al., 2006).

1.4 - Compostos biológicos como novos agentes terapêuticos

A natureza constitui uma fonte inesgotável de produtos naturais

biologicamente ativos com propriedades promissoras. Este fato se justifica não

apenas pela imensurável diversidade de espécies, mas principalmente pela

variedade de metabólitos sintetizados por estes organismos (Ferreira et al., 2006).

Tais metabólitos são produzidos por vários organismos, em resposta aos

estímulos externos, tais como mudanças nutricionais, infecções e competições

para a sobrevivência.

Na sociedade pré-industrializada e em sociedades agrárias, compostos

naturais derivados de plantas foram usados por populações indígenas como

forma de terapia para uma grande diversidade de patologias. Atualmente, muitos

desses compostos, produzidos por plantas, fungos, bactérias, protozoários,

insetos e outros organismos, terrestres e marinhos, já foram isolados, identificados

e caracterizados biologica e farmacologicamente (Nielsen, 2002; Strohl, 2000).

Aproximandamente um terço das drogas mais vendidas no mundo são

produtos naturais ou seus derivados. Esses produtos são bem reconhecidos pela

indústria farmacêutica por sua ampla diversidade estrutural, assim como pela

grande variedade de atividades farmacológicas. Exemplos bem conhecidos de

produtos naturais usados extensamente na indústria incluem lovastatina (agente

anti-colesterolêmico), ciclosporina A e tacrolimos (agentes imunosupressores),

paclitaxel e doxorrubicina (agentes antitumorais), eritromicina (antibiótico), e

anfotericina B (agente fungicida) (Strohl, 2000).

O ponto de partida para a utilização de produtos naturais, como entidades

farmacêuticas, foi a descoberta da penicilina em 1928, com sua subseqüente

industrialização durante a segunda guerra mundial. O inacreditável sucesso no

desenvolvimento de agentes antibacterianos no período pós-guerra desencadeou

o surgimento de programas de prospecção de produtos naturais e solidificou o

avanço desses compostos no campo de combate contra o câncer e infecções.

Estas descobertas, juntamente com a elucidação dos mecanismos

biológicos e bioquímicos da ação terapêutica, para utilização como base para o

desenvolvimento de novas drogas, têm se tornado alvo de trabalho para a

indústria e laboratórios acadêmicos desde a metade do século passado (Newman

et al., 2000). Entre 1981 e 2002, os compostos de origem natural perfizeram 55%

das novas entidades químicas aprovadas para utilização como drogas pela FDA

(Food and Drug Administration), e moléculas biologicamente ativas derivadas

destes compostos foram responsáveis por 23% das autorizações de uso cedidas

por esta instituição (Newman et al., 2003).

A pesquisa de produtos naturais marinhos representa uma grande parcela

do número total de publicações nesta temática. Muitos compostos isolados de

origem marinha possuem estruturas químicas únicas e bem diferentes daquelas

encontradas em fontes naturais terrestres, apresentando as mais diversas

atividades biológicas. Este fato motiva as pesquisas que levam ao

desenvolvimento de novos métodos de isolamento, síntese orgânica e

compreensão das atividades farmacológicas, bem como da importância ecológica

dos compostos isolados. Conseqüentemente, o interesse pela busca de novos

compostos de origem marinha tem crescido nas últimas décadas (Blunt et al.,

2007) (FIGURA 4).

Figura 4: Número de compostos naturais de origem marinha citados em publicações

no período de 1965 a 2005. Figura adaptada (Blunt et al., 2007).

A costa brasileira, com 8.000 Km de extensão, possui uma fauna marinha

praticamente desconhecida e inexplorada, representando uma fonte promissora e

de grande potencial para descoberta de novos agentes naturais

farmacologicamente ativos (Berlinck et al., 2004).

A viabilidade para o desenvolvimento comercial de compostos marinhos

como fármacos é um fator limitante na área de produtos naturais e depende de

vários fatores. Dentre eles sua obtenção em larga escala, sua atividade in vivo e

sua seletividade (Cragg et al., 2006). Geralmente, estes compostos são isolados

em pequenas quantidades, tendo em vista a difícil obtenção dos organismos

marinhos em seus ambientes naturais, e grande parcela do material isolado é

utilizado, quase que totalmente, no processo de sua elucidação química e

estrutural. Todavia, recentemente, estão surgindo estratégias para contornar esta

situação, focadas na química de produtos naturais para a obtenção de compostos

semelhantes de origem sintética (Blunden, 2001; Strohl, 2001)

Por esses motivos, os compostos bioativos, isolados de origem marinha,

têm ganhado especial atenção devido sua potencial aplicação como ferramentas

farmacológicas no campo do diagnóstico e da terapia de diversas doenças, como

infecções, desordens lipídicas, distúrbios imunomodulatórios e no combate de

vários tipos de câncer (Altmann, 2001; Strohl, 2000).

Embora nenhuma droga com ação antitumoral originada de organismos

marinhos tenha sido ainda aprovada para uso comercial, existe um número

significante de agentes naturais em processos de triagem clínica. Destes, é

possível citar a aplidina extraída do tunicado mediterrâneo Aplidium albicans

(Depenbrock et al., 1998); briostatina do briozoa do golfo da Califórnia Bugula

neritina (Newman et al., 2000); discodermolida, isolado da esponja de águas

profundas do Caribe Discodermia dissoluta (Gunasekera et al., 1990); dolostatina

10, isolada do nudibrânquio Dolabella auricularia (Pettit et al., 1995); e

ecteinascidina 743 do tunicado coletado no Caribe Ecteinascidia turbinata (Gajate

et al., 2001).

1.5 – Lectinas de origem marinha no combate do câncer

A morte celular é uma estratégia essencial para o controle do equilíbrio

dinâmico em seres vivos, removendo células com os mais diversos problemas. Ela

pode ter papel destacado na patogênese de muitas doenças. Existem doenças

ligadas à supressão de morte celular como o câncer, ateroesclerose e desordens

autoimunes. Outras, ligadas ao aumento do índice de morte celular como

infecções virais, infecções bacterianas, desordens neurodegenerativas, desordens

autoimunes, desordens hematológicas e ainda doenças induzidas por toxinas

(Fadeel et al., 1999).

Tratamentos bem-sucedidos contra o câncer, utilizando quimioterápicos,

são dependentes de sua habilidade em desencadear a morte celular nas células

transformadas. Muitos dos agentes citotóxicos disparam o mecanismo de morte

celular pela indução de apoptose. A susceptibilidade celular para estes agentes

pode ser influenciada por fatores genéticos que regulam a apoptose, pelo aumento

da expressão ou atividade de proteínas anti-apoptóticas, assim como pela

expressão insuficiente dos membros pro-apoptóticos (Amarante-Mendes et al.,

1998; Brimmell et al., 1998; Evan & Vousden, 2001; Rampino et al., 1997).

O entendimento aperfeiçoado dos diversos mecanismos de morte celular e

da resistência a estes processos, ainda parece ser a peça chave para o

desenvolvimento de novos agentes terapêuticos, mais ativos e/ou menos tóxicos

que os usados atualmente no tratamento de diversas doenças, incluindo o câncer.

Existem poucos trabalhos na literatura que relacionam propriedades de

lectinas de organismos marinhos com efeitos citotóxicos ou com a indução de

apoptose em linhagem de células malignas para combate do câncer. Em trabalhos

realizados por Wang e seus colaboradores (2000) uma lectina da alga marinha

Ptilota plumosa (PPL), com especificidade para resíduos de D-galactose, mostrou

fraca atividade citotóxica contra linhagens de células de hepatocarcinoma,

coriocarcinoma (tumores das vilosidades coriônicas da placenta), osteosarcoma

(Wang et al., 2000). Da esponja marinha Haliclona cratera foi isolada uma lectina

de 29 kDa, dependente de íons metálicos, sem pontes dissulfeto e com

especificidade para galactose. Esta lectina apresentou atividade citotóxica sobre

linhagens de células tumorais de câncer cervical (HeLa) e melanoma (FemX).

Concentrações de 9 mg/mL e 11 mg/mL causaram 50% de diminuição da

sobrevivência celular (IC

) em HeLa e FemX, respectivamente. Mas o mecanismo

do efeito citotóxico causado nessas células ainda não foi desvendado (Pajic et al.,

2002). A lectina extraída da alga marinha vermelha Euchema serra (ESA), com

especificidade para resíduos de manose, demonstrou a habilidade de induzir

morte celular e apoptose em muitos tipos de células cancerosas humanas

(Sugahara et al., 2001). Estudos têm mostrado que ESA inibiu o crescimento e

induziu a morte celular em células de adenocarcinoma de cólon em camundongos,

pela expressão de caspase-3 e translocação de fosfatidilserina, sugerindo a

indução de morte celular através da via de apoptose dependente de caspases.

Demonstrando que esta lectina foi efetiva in vitro e in vivo podendo ser

potencialmente utilizada como uma droga contra o câncer (Fukuda et al., 2006).

Recentemente, nosso grupo de pesquisa purificou e caracterizou uma

lectina da esponja marinha Cliona varians, que possui atividade hemaglutinante

dependente de Ca

contra eritrócitos do tipo A, tratados com papaína. Esta

lectina, chamada CvL, é uma glicoproteína com massa molecular de 106 kDa,

formada por quatro subunidades de 28 kDa ligadas por pontes dissulfeto. CvL

mostrou especificidade preferencial para D-galactose, efeitos antibacterianos

contra bactérias patogênicas gram positivas e atividade aglutinante sobre

promastigotas de Leishmania chagasi (Moura et al., 2006). Todas essas

características e propriedades sugerem uma potencial aplicação farmacológica.

Tornando-se mais uma molécula bioativa de origem natural que pode ser testada

e utilizada posteriormente no combate de diversos tipos de câncer.

1.6 – Leucemia mielóide crônica

A leucemia mielóide crônica (LMC) é uma doença mieloproliferativa que se

caracteriza por distúrbios relativos à transformação neoplásica do clone de células

mielóides (granulócitos e seus precursores) do sistema hematopoiético (Faderl et

al., 1999). A palavra leucemia vem do grego ‘leukaemia’ que significa sangue

branco e foi adotada para descrever a natureza neoplásica da substância

purulenta observada no sistema sanguíneo periférico destes pacientes.

Atualmente, essa doença é responsável por 15-20% das leucemias humanas

(Cuiffo & Ren, 2006), com incidência de um ou dois casos por ano em cada

100.000 pessoas. A LMC é mais comum em indivíduos de idade avançada, com

diagnóstico em idade média de 65 anos. O sexo masculino é freqüentemente mais

acometido que o feminino, e as mulheres parecem apresentar uma vantagem no

tempo de sobrevida (Berger et al., 2005). Não existem diferenças étnicas ou

geográficas significantes para o estabelecimento da doença, mas podem surgir

diferenças nas estratégias de combate entre os países, dependendo da

disponibilidade de drogas e tecnologias modernas de diagnóstico (Hehlmann et

al., 2007; Ries et al., 2006)

A LMC pode evoluir em duas ou três fases. Inicialmente, uma fase lenta

chamada de fase crônica na qual ocorre uma expansão clonal maciça de células

mielóides que continuam mantendo a capacidade de diferenciação e que são bem

controladas com terapias convencionais. Cerca de 90% dos pacientes são

diagnosticados nesta fase (Quintas-Cardama & Cortes, 2006). Entretanto, com o

avanço do tempo, a doença progride e entra em um estágio intermediário, a fase

acelerada, que leva entre 1 e 1,5 anos. Em seguida, este clone perde a

capacidade de diferenciação e a doença passa invariavelmente para uma

leucemia aguda denominada de crise blástica, com fenótipo agressivo, altamente

resistente à quimioterápicos e que leva à morte do paciente em no máximo 6

meses. Em muitos casos o estágio intermediário não é observado (Cortes et al.,

1996; Kantarjian et al., 1993).

A marca característica dessa leucemia é a presença do cromossomo

Philadelphia (Ph) nas células mielóides precursoras e suas descendentes (Nowell

& Hungerford, 1960). Essa anormalidade genética origina-se de uma translocação

recíproca entre os braços longos dos cromossomos 9q34 e 22q11 (Daley et al.,

1990; Rowley, 1973). Essa translocação conduz à justaposição do gene abl do

cromossomo 9 e o gene bcr do cromossomo 22, resultando em um gene

fusionado bcr-abl que expressa uma proteína tirosina-quinase híbrida e

constitutivamente ativa BCR-ABL de 210 kDa (p210) presente em 90% dos casos

de LMC (Ren, 2005). Translocações diferentes desse padrão podem gerar outras

proteínas oncogênicas, como em 20 – 30% dos casos de leucemia linfóide aguda

(LLA) com a produção de uma proteína de menor peso molecular, 190 kDa (p190)

(Lemes et al., 1999) e em leucemia neutrofílica com uma proteína de 230 kDa

(p230) (Advani & Pendergast, 2002) (FIGURA 5). A atividade da proteína

oncogênica p210 é necessária e suficiente para o desenvolvimento maligno da

fase crônica da LMC, pois parece conferir uma vantagem proliferativa para as

células malignas através do recrutamento de efetores responsáveis pelo

crescimento celular e defesas anti-apoptóticas.

Terapias paliativas têm envolvido o uso de bissulfano ou hidroxiuréia, e em

alguns casos, de citarabina. O uso de interferon-alfa tem conduzido a taxas altas

de resposta, variando no intervalo de 70-80% (Cragg et al., 2006); mas,

recentemente o inibidor de proteína quinase mesilato de imatinib tem se tornado a

primeira linha de tratamento para LMC. Apesar da eficácia e tolerância

comprovada do imatinib, o desenvolvimento da resistência à droga pelos

pacientes ainda é uma preocupação (Druker et al., 2001).

A linhagem de células mielóides leucêmicas K562 tem mostrado ser

particularmente resistente à inibição seletiva de proliferação ou morte celular, e

extratos que demonstrem seletividade para leucemia com ênfase na inibição desta

linhagem, em especial, deve oferecer boas oportunidades para o desenvolvimento

de novos agentes no tratamento de LMC (Cragg et al., 2006).

Figura 5: Formação do cromossomo Ph (Philadelphia). Translocação recíproca dos cromossomos

9 e 22, com a produção do gene fusionado bcr-abl que expressa três tipos de proteínas

oncogênicas tirosina-quinase com atividade constitutivamente ativa. TK = tirosina quinase. Figura

adaptada (Hehlmann et al., 2007).

2.0- OBJETIVOS

x Avaliar o efeito da lectina de Cliona varians (CvL) sobre a linhagem de

células leucêmicas K562;

x Propor um mecanismo de ação desta lectina no combate da leucemia

mielóide crônica.

3.0- MATERIAL E MÉTODOS

3.1 – Material

3.1.1 - Material biológico

3.1.1.1 – Esponja marinha Cliona varians

A esponja marinha da espécie Cliona varians foi coletada na praia de Santa

Rita, localizada no litoral norte do Estado do Rio Grande do Norte. O material foi

acondicionado em água marinha durante seu transporte até o laboratório de

química e função de proteínas biotivas da Universidade Federal do Rio Grande do

Norte, onde foi armazenado em temperaturas inferiores a -20ºC.

Figura 6 – Esponja marinha Cliona varians.

3.1.1.2 – Linfócitos de sangue periférico humano

Os linfócitos foram obtidos de amostras de sangue periférico humano

coletado por punção venosa em doadores adultos saudáveis.

3.1.1.3 – Linhagem de células leucêmicas K562

A linhagem de células K562 foi obtida da American Type Culture Collection

(ATCC, Rockville, MD, USA).

3.1.2 – Reagentes

x Anticorpos contra receptor do fator de necrose tumoral (TNFR-1), Bax, Bcl-

2, p21 e ȕ-actina (Santa Cruz Biotechnology - Santa Cruz, CA, USA);

x Anticorpos policlonais contra a subunidade p65 do fator transcricional NFțB

e proteína do retinoblastoma (pRb) (Cell Signaling Technology - Beverly,

MA, USA);

x Anticorpos policlonais anti-IgG de coelho e anti-IgG de camundongo

conjugados com peroxidase de raiz forte (HRP) (Cell Signaling Technology -

Beverly, MA, USA);

x Anticorpos anti-IgG de coelho conjugados com os fluorocromos Alexa Flúor

488 e DAPI (Molecular Probes Inc. - Eugene, OR, USA);

x Kits de ensaio colorimétrico para Caspase – 3, caspase – 8 e caspase – 9 e

anticorpos contra catepsina B (R&D Systems - Minneapolis, MN, USA);

x Cell-Tak (células e tecido adesivo) (BD Biosciences - Bedford, MA, USA);

x Fitohemaglutinina e Inibidor de protease cisteínica E-64 [L-trans-

epoxisuccinil-L-leucilamino-(4-guanidino)butano] (Sigma Chemical Co. - St.

Louis, MO, USA).

3.2 – Metodologia

3.2.1 – Preparação da lectina de esponja marinha Cliona varians (CvL)

A esponja Cliona varians foi triturada em liquidificador com tampão Tris-HCl

50 mM, pH 7,5, na proporção de 1:2 (p/v) em temperatura ambiente. O material foi

mantido sob agitação por duas horas e em seguida, centrifugado a 12000 x g por

30 minutos a 4

C. O precipitado foi descartado e o sobrenadante recolhido foi

designado de extrato bruto. O extrato bruto foi fracionado em três etapas de

precipitação com acetona: 0,5 vol., 1,0 vol. e 2,0 vol. Em cada etapa, após a

adição da acetona, a solução permaneceu em repouso a 4

C por, no mínimo,

quatro horas. Após esse período, as frações foram centrifugadas a 12000 x g por

30 minutos a 4

C. Os precipitados foram recolhidos, dissolvidos em tampão Tris-

HCl 50 mM pH 7,5 e armazenados a -20

C. As frações obtidas foram

denominadas de F0,5; F1,0 e F2,0, respectivamente. A fração F1,0 apresentou

maior atividade hemaglutinante específica e foi submetida à cromatografia de

afinidade em Sepharose CL 4B. A coluna foi equilibrada em tampão Tris-HCl 50

mM, CaCl

20 mM, pH 7,5 e o pico retido correspondente à CvL foi eluído com

tampão Tris-HCl 50 mM, EDTA 20 mM, pH 7,5. Os eluatos foram monitorados por

espectrofotometria a 280 nm, a lectina CvL foi reunida, dialisada contra água,

liofilizada e sua atividade hemaglutinante foi analisada.

Os ensaios de atividade hemaglutinante foram realizados em microplacas

com fundo em “V” por meio de diluição seriada das amostras testes (1/2, 1/4, 1/8,

etc...) (Debray et al., 1981). Em cada poço foram adicionados 25PL de NaCl

0,15M, 25PL da amostra e 25PL da suspensão de eritrócitos humanos a 4%

tratados enzimaticamente com papaína (Benevides et al., 1998). A reação foi

incubada à temperatura ambiente. Após 1 hora a aglutinação foi observada, e o

título expresso em unidades de hemaglutinação (UH), que foi definido como

inverso da maior diluição da amostra que tenha apresentado nítida aglutinação

(Moreira & Perrone, 1977).

3.2.2 – Cultura de células leucêmicas da linhagem K562

A linhagem de células K562 foi cultivada em meio RPMI 1640

suplementado com 10% de SFB, 100 U/mL de penicilina, e 100 ȝg/mL de

estreptomicina a 37ºC em atmosfera úmida de 5% de CO

. As células foram

semeadas (2 x 10

células/mL) em microplacas de cultivo de 96 poços com fundo

chato e incubadas por um período de 72 horas com concentrações de CvL que

variaram de 1 a 80 ȝg/mL. Para inibição da atividade, as células K562 (2 x 10

cels/mL) foram incubadas com 5ȝM do inibidor irreversível de protease cisteínica

E-64 por 2 horas antes do tratamento de 72 horas com as diferentes

concentrações de CvL.

3.2.3 – Cultura de linfócitos de sangue periférico humano

Após coleta do sangue, o volume total foi diluído com adição de volume

equivalente de meio RPMI 1640. A população de células mononucleares do

sangue foi separada por centrifugação a 300 x g em gradiente de Ficoll-Hypaque

por 20 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, foram removidas, lavadas

duas vezes em meio RPMI 1640 e ressuspendidas em meio RPMI 1640

suplementado com 2 mM de glutamina, 10% de SFB e antibióticos. Para cultivo,

os linfócitos, na densidade de 1 x 10

células/mL, foram transferidos para

microplacas de cultivo de 96 poços com 5 ȝg/mL de fito-hemaglutinina e então,

incubados por um período de 72 horas com concentrações de CvL que variaram

de 1 a 80 ȝg/mL a 37ºC em atmosfera úmida de 5% de CO

. Para controle

negativo, os linfócitos também foram incubados na ausência de CvL sob as

mesmas condições de crescimento.

3.2.4 – Ensaio de viabilidade celular

A viabilidade celular foi determinada pelo teste de redução do brometo de 3-

(4,5-dimetiltiazol-2-yl)-2,5-difeniltetrazólio (MTT) e pelo ensaio de exclusão com

Azul de Tripan (Bromberg et al., 2005; Ferreira et al., 2004). O teste do MTT avalia

a integridade mitocondrial das células testadas baseado na redução enzimática do

corante até o produto chamado formazan pelas desidrogenases mitocondriais.

Após o período de tratamento de 72 horas com as diferentes concentrações de

CvL, as células foram incubadas em meio de cultura contendo 1 mg/mL de MTT

por 3 horas e posteriormente lavadas com etanol por cinco minutos para

solubilização do formazan. A absorbância das amostras foi monitorada a 570 nm.

Já no segundo ensaio, a solução de Azul de Tripan penetra nas células não

viáveis deixando-as coradas em azul, enquanto as células íntegras permanecem

sem coloração. Alíquotas dos diferentes tratamentos celulares foram misturadas a

uma solução de 0,05% (v/v) de azul de tripan. As células viáveis que excluíram

este corante foram contadas na câmara de Neubauer (0,100 mm).

Foram realizados três diferentes experimentos em quatro replicatas para

cada concentração de CvL testada, tanto para a linhagem K562, como para os

linfócitos de sangue periférico. A viabilidade das células tratadas com CvL foi

expressa como porcentagem da viabilidade das células controle não tratadas.

3.2.5 – Quantificação dos indicadores de apoptose por incubação com DAPI

Mudanças na morfologia nuclear indicativas de apoptose (condensação de

cromatina e fragmentação nuclear) foram avaliadas usando o corante DAPI (4’-6’-

diamidino-2-fenilindol) (De Carvalho et al., 2006; Guicciardi et al., 2000). Após o

tratamento com as concentrações de CvL a 50 e 70Pg/mL, as células foram

lavadas com tampão fosfato gelado (PBS), fixadas com 2% de paraformaldeído

em PBS gelado por 30 minutos e permeabilizadas em PBS contendo 0,1% de

saponina e 1% de albumina sérica bovina (BSA) por 10 minutos. Posteriormente

as células foram lavadas novamente em PBS e incubadas com DAPI na

concentração de 1 ȝg/mL por 30 minutos, protegidas da luz, em temperatura

ambiente. Após a incubação com o corante, as células foram colocadas sobre

lamínulas de vidro tratadas com Cell-Tak para adesão celular, lavadas com PBS e

mantidas em Fluoromount-G/PBS na proporção de 2:1 v/v. As células foram

visualizadas por microscopia de fluorescência usando o filtro de fluorescência 330-

380 nm. O índice de apoptose foi determinado pela contagem de 100 células por

campo de visão em três diferentes campos por amostra. O experimento foi

realizado em duplicata para cada amostra e o número de células apoptóticas foi

expresso como porcentagem do número total de células.

3.2.6 – Investigação de ativação de caspases por monitoramento de p-

nitroanilina

A ativação da caspase – 3, caspase – 8 e caspase – 9 foi averiguada em

células K562 expostas aos tratamentos com CvL nas concentrações de 50 e

70Pg/mL, a partir de kits colorimétricos para estas proteases. Inicialmente, as

células foram centrifugadas e o precipitado foi incubado com 25 ȝL de tampão de

lise em banho de gelo por 10 minutos. Em seguida, o lisado celular foi

centrifugado a 10000 x g por 1 minuto, o sobrenadante foi coletado e a

concentração protéica ajustada para 2 mg/mL. Para a reação foram utilizados 50

ȝL da amostra, 50 ȝL de tampão de reação e 5 ȝL do substrato colorimétrico. As

microplacas foram incubadas a 37ºC por 2 horas e a atividade das caspases foi

determinada pela medida de p-nitroanilina (pNA) liberada da clivagem dos

substratos de caspase-3 (DEVD-pNA), caspase-8 (IETD-pNA) e caspase-9

(LEHD- pNA). A liberação de p-nitroanilina foi monitorada a 405 nm. As atividades

enzimáticas foram expressas em relação ao controle.

3.2.7 – Investigação de liberação de catepsina B por imunofluorescência

Após exposição aos tratamentos com CvL, as células foram fixadas com

2% de paraformaldeído em PBS gelado por 30 minutos, permeabilizadas em PBS

contendo 0,1% de saponina e 1% de BSA por 10 minutos. Em seguida, as células

foram lavadas com PBS, incubadas por 1 hora com anticorpo monoclonal anti-

catepsina B na diluição de 1:50 e então marcadas com anticorpo anti-IgG de

coelho conjugado com o fluorocromo Alexa Fluor 488 por 30 minutos, protegidas

da luz, em temperatura ambiente. Para visualização, as células foram colocadas

sobre lamínulas de vidro tratadas com Cell-Tak para adesão celular, lavadas com

PBS e mantidas em Fluoromount-G/PBS na proporção de 2:1 v/v. As células

foram então analisadas usando microscopia confocal de varredura com

comprimentos de onda de emissão em 515 nm e excitação em 491 nm.

3.2.8 – Análise por imunoblotting dos níveis de expressão do TNFR-1, do

NFțB e das proteínas de regulação do ciclo celular p21 e pRb em células

K562 tratadas com CvL

As células K562 tratadas com CvL nas concentrações de 50 e 70 Pg/mL de

foram lisadas em 200 ȝL de tampão de lise [50 mM Tris-HCl pH 7,4 , 1% de

Tween20, 0,25% de desoxicolato de sódio, 150 mM de NaCl, 1 mM de EGTA,

1mM de Na

, 1 mM de NaF e inibidores de proteases: 1 ȝg/mL de aprotinina,

10 ȝg/mL de leupeptina e 1 mM de fluoreto de fenilmetanosulfonila] por 2 horas

em banho de gelo. Os extratos protéicos foram separados dos restos

membranares por centrifugação a 1200 x g e as concentrações protéicas foram

determinadas pelo método de Lowry (Hartree, 1972). Alíquotas equivalentes

(50ȝg) dos extratos protéicos dos diferentes tratamentos foram adicionadas

separadamente ao tampão de amostra [100 mM Tris-HCl pH6,8, 200 mM de DTT,

4% de SDS, 0,1% de azul de bromofenol e 20% de glicerol], fervidas por 10

minutos e submetidas a SDS-PAGE.

O gel de poliacrilamida, na presença de SDS, foi produzido seguindo

metodologia já estabelecida (Laemmli, 1970). O gel de separação foi preparado a

12%, enquanto que o gel de concentração a 4% de acrilamida. A eletroforese foi

processada em uma amperagem constante de 20 mA durante 2horas.

Os extratos protéicos resolvidos eletroforeticamente foram transferidos para

a membrana de PVDF (Pluskal et al., 1986). Após transferência, a membrana foi

submetida ao bloqueio de seus sítios inespecíficos com tampão bloqueador

(Tampão Tris-HCl 50 mM pH 7,4 , 1% de leite desnatado em pó ou 2% de BSA, e

0,05% de Tween20) permanecendo nessa solução por 1 hora; e então, foi

incubada com o anticorpo primário diluído em tampão bloqueador na proporção de

1:1000 v/v por 12 horas a 4ºC. Após este período, a membrana foi lavada com

tampão Tris-HCl 50 mM pH7,4 e incubada com os anticorpos secundários anti-IgG

de coelho e anti-IgG de camundongo conjugados com peroxidase diluídos em

tampão bloqueador na proporção de 1:2000 v/v por 1 hora. Após nova etapa de

lavagens a detecção do anticorpo foi realizada pelo aumento da

quimioluminescência (Ferreira et al., 2004).

3.2.9 – Análises estatísticas

Todos os dados representam pelo menos três experimentos independentes

e foram expressos com média ± DP (Desvio Padrão) exceto fosse indicado de

outra maneira. As diferenças entre os grupos foram comparadas pelo teste

ANOVA e pelo teste de Tukey. Foram consideradas diferenças significativas

quando o valor de p foi inferior a 0,05.

4.0- RESULTADOS

4.1 – Efeitos de CvL sobre a viabilidade celular

A viablidade celular da linhagem de células K562 e dos linfócitos de sangue

periférico foi analisada após incubação por 72 horas com concentrações

crescentes de CvL (1 a 80 ȝg/mL). Após este período foi possível observar a

diminuição da viabilidade das células K562 de maneira dose dependente em

resposta a aumentos na concentração de CvL. O valor de IC

(a dose que diminui

a viabilidade celular em 50%) foi obtido com a concentração de CvL em 70 ȝg/mL

(FIGURA 7).

Em seguida, com auxílio do método de exclusão do azul de tripan, foi

analisado o efeito de CvL sobre a viabilidade das células K562 após incubação por

72 horas com concentrações crescentes da lectina (1 a 80 ȝg/mL). As células

tratadas com concentrações inferiores ou igual a 20 ȝg/mL de CvL revelaram

porcentagens de viabilidade celular iguais ou superiores a 80%. Decréscimos

acentuados só foram observados a partir dos tratamentos com a concentração de

50 ȝg/mL de CvL. Da mesma maneira, a maior diminuição da viabilidade celular foi

observada após tratamento com 80 ȝg/mL, atingindo o valor de apenas 25%

quando comparados ao grupo controle (FIGURA 8). Em contraste, nenhuma

citotoxicidade de CvL foi observada para linfócitos normais de sangue periférico

humano no mesmo intervalo de concentrações testadas e sob as mesmas

condições experimentais. Isto pode ser constatado para ambos os ensaios, de

MTT e azul de tripan (FIGURA 7 e 8). Juntos, estes dados indicam a presença de

uma atividade seletiva de CvL contra células leucêmicas da linhagem K562.

Figura 7: Citotoxicidade de CvL para células K562 e linfócitos de sangue periférico avaliada pelo

teste de redução de MTT. Células K562 (2 x 10

células/mL) foram tratadas com diferentes

concentrações de CvL (180 Pg/mL) por 72 h em microplacas de cultura. Linfócitos (1 x 10

células/mL) foram cultivados com 5 μg/mL de fito-hemaglutinina em microplacas de cultura, na

presença e ausência de diferentes concentrações de CvL (180 Pg/mL) por 72 h. A viabilidade das

células tratadas com CvL foi expressa como porcentagem da viabilidade das células controle não

tratadas.

Figura 8: Citotoxicidade de CvL para células K562 avaliada pelo método de exclusão do azul de

tripan. As células K562 (2 x 10

/mL) foram tratadas com diferentes concentrações de CvL (180

Pg/mL) por 72 h em microplacas de cultura. Os resultados representam a média ± desvio padrão

de três experimentos realizados em quatro replicatas (comparação entre as células tratadas e as

células controle foi determinada pelo teste ANOVA e Tukey com significância quando p < 0.05)

4.2 – Indução de apoptose por CvL em células K562

Para verificar se o efeito de CvL sobre a viabilidade celular de K562

determinaria a indução de apoptose nas células, as mudanças na morfologia

nuclear foram monitoradas pela coloração com DAPI (De Carvalho et al., 2006;

Guicciardi et al., 2000) (FIGURA 9). Como pode ser visto na FIGURA 9A, as

células do grupo controle exibem organização nuclear normal com a cromatina

dispersa e íntegra. Em contrapartida, as células tratadas com CvL na

concentração de 70Pg/mL por 72 horas mostraram núcleos com diferentes níveis

de condensação de cromatina e fragmentação nuclear, como demonstrado pelo

florescente DAPI (FIGURA 9B).

A B

Figura 9: Alterações morfológicas típicas de apoptose induzida por CvL em células K562. (A)

Micrografia das células controle marcadas com DAPI mostrando organização nuclear normal. (B)

células da linhagem K562 (2 x 10

/mL) tratadas com 70 Pg/mL de CvL por 72 horas mostrando

núcleos apoptóticos (Destaque pelas setas). As fotomicrografias são representativas de dois

experimentos independentes. Barras: 20 ȝm.

Para quantificar os indicadores de apoptose foram utilizadas células K562

incubadas com as concentrações de CvL que demonstraram diminuições

acentuadas nos ensaios de viabilidade celular. O índice apoptótico foi determinado

para os tratamentos celulares com 50 e 70 Pg/mL de CvL. A concentração de 70

Pg/mL de CvL foi capaz de aumentar significativamente (p<0,05) o número de

células apoptóticas, alcançando 43 ± 5% do total da população celular após 72

horas. Entretanto, o tratamento com 50 Pg/mL de CvL mostrou apenas uma leve

tendência de crescimento na quantidade de apoptose observada, apresentando

um índice apoptótico de 14 ± 5%, contudo sem promover alteração significativa

quando comparado com as células K562 controle não tratadas com CvL (FIGURA

10).

Figura 10: Determinação do índice de apoptose induzida por CvL em células K562 por marcação

com DAPI. O índice apoptótico foi determinado para os tratamentos de CvL nas concentrações de

50 e 70 Pg/mL pela contagem de 100 células por campo de visão em três diferentes campos por

amostra. (*) Indica aumento significante do índice apoptótico quando comparado com o controle (p

< 0.05). As barras de erro representam o desvio padrão.

4.3 – Investigação de ativação de caspases por monitoramento de p-

nitroanilina

Muitos indutores de apoptose podem disparar a morte celular pela ativação

de caspases, por essa razão foi examinado os efeitos de CvL sobre a ativação de

caspases após 72 horas de tratamento. Surpreendentemente, CvL não foi capaz

de induzir a atividade das caspases iniciadoras, caspase – 8 (IETDase) e caspase

– 9 (LEHDase). E com relação a caspase efetora, caspase – 3, nenhuma atividade

significante foi detectada em células K562 quando tratadas com concentrações de

50 e 70 Pg/mL de CvL.

4.4 – Envolvimento de Catepsina B na morte celular de K562 induzida por

CvL

Os resultados anteriores motivaram investigar se a ação indutora de

apoptose de CvL poderia ser devido a atividade de outras proteases que não as

caspases. Em particular, a catepsina B, que contribui para indução de morte

celular por vias alternativas (Fehrenbacher & Jaattela, 2005; Foghsgaard et al.,

2001). Dessa maneira, esta possibilidade foi investigada pela análise da

compartimentalização celular de catepsina B em células K562 tratadas com a

lectina, com auxílio da imunoflorescência e da microscopia confocal de varredura.

Em células controle, não tratadas com CvL, foi possível visualizar a proteína

catepsina B distribuída de maneira mais pontual e localizada somente dentro dos

limites do citosol (FIGURA 11 A e B). Após tratamento das células K562 com 70

Pg/mL por 72 horas, ficou constatado a distribuição dispersa da fluorescência não

apenas no citoplasma, mas também em regiões nucleares, sugerindo uma

possível translocação de catepsina B dos compartimentos vesiculares dentro do

citoplasma para o interior do núcleo durante a exposição ao tratamento com CvL

(FIGURA 11 C e D).

Para testar, definitivamente, se catepsinas cisteínicas poderiam explicar o

efeito citotóxico de CvL, as células da linhagem K562 foram previamente

incubadas com o inibidor de catepsinas de amplo espectro E-64 por 2 horas antes

do tratamento com as diferentes concentrações da lectina. A partir da redução

enzimática de MTT, foi possível constatar a inibição completa de morte celular por

E-64 (FIGURA 12). Este efeito foi evidente e significativo sempre que as

concentrações mais altas de CvL (iguais ou superiores a 50 Pg/mL) foram usadas

no período de 72 horas. Estas observações indicam que a catepsina B poderia

ser, ao menos em parte, um dos efetores implicados na morte celular mediada por

CvL.

Figura 11: Análise da marcação de catepsina B por imunofluorescência em células K562 tratadas

com CvL. (A e B) Células controle mostrando localização pontual da marcação fluorescente de

catepsina B no citoplasma. (C e D) Células tratadas com 70 Pg/mL de CvL por 72 horas mostrando

a marcação fluorescente de catepsina B dispersa. As células tratadas com CvL e as células

controle foram incubadas com anticorpo anti-catepsina B e marcadas com anticorpo anti-IgG de

coelho conjugado ao fluorocromo Alexa Fluor 488. As células foram analisadas usando

microscópio confocal de varredura com comprimentos de onda de emissão e excitação 515 e 491

nm, respectivamente. Barras: 20 ȝm.

Figura 12: Efeito da Inibição de catepsina B sobre a morte celular induzida por CvL em células

K562. As células (2 x 10

/mL) foram pré-tratadas com 5 PM do inibidor E-64 por 2 horas, e então

incubadas com diferentes concentrações de CvL (5080 Pg/mL) por 72 horas em microplacas de

cultura. A viabilidade celular foi averiguada pelo teste de redução do MTT. Os resultados

representam a média ± desvio padrão de três experimentos realizados em triplicatas (comparação

entre as células tratadas e as células controle foi determinada pelo teste ANOVA e Tukey com

significância quando p < 0.05).

4.5 –Efeito de CvL na modulação dos níveis de expressão do TNFR-1, do

NFțB e das proteínas de regulação do ciclo celular p21 e pRb em células

K562

Para investigar o envolvimento de TNFR-1 na morte celular induzida por

CvL. Um Western blotting foi realizado com as proteínas do lisado de células K562

tratadas com as concentrações de 50 e 70 Pg/mL de CvL. A análise revelou que a

expressão de TNFR-1 aumentou de maneira dose-dependente após 72 horas de

tratamento (FIGURA 13 A).

Um dos eventos associados com a sinalização de membros da família de

receptores TNF é a ativação do fator transcricional anti-apoptótico NFțB

(Nakanishi & Toi, 2005). Para verificar se o aumento da expressão de TNFR-1

induzida pelo tratamento com CvL afetou a cascata NFțB, a expressão da

subunidade p65 de NFțB foi detectada por análise das amostras de proteínas das

células K562 através de Western blotting. O tratamento de células K562 com 70

Pg/mL de CvL resultou na diminuição de expressão da subunidade p65, embora a

concentração de 50 Pg/mL quase não tenha afetado os níveis da subunidade de

NFțB (FIGURA 13 A).

Muitos estudos têm citado o fator transcricional NFțB como um modulador

dos níveis de expressão de membros da classe de proteínas Bcl-2 (Heckman et

al., 2002; Karin & Lin, 2002; Sanchez-Garcia & Grutz, 1995). Embora os

tratamentos com CvL resultem no aumento dos níveis do membro anti-apoptótico

Bcl-2, este efeito foi acompanhado pela expressão acentuada do membro pro-

apoptótico Bax (FIGURA 13 B), indicando que a atividade de CvL pode estar

envolvida na ativação de uma via alternativa de morte celular mediada por

receptores de morte ou na ativação de múltiplas vias alternativas.

Finalmente, foi investigado o efeito de CvL sobre proteínas envolvidas na

regulação do ciclo celular (FIGURA 13 C). Análise por Western blotting mostrou

um aumento significativo na expressão da proteína p21 e consequente modulação

negativa de pRb, evento determinante no bloqueio da duplicação de DNA durante

a fase S, indicando a suspensão do ciclo celular devido o tratamento com CvL.

Figura 13: Efeito de CvL sobre a expressão de proteínas envolvidas na indução de apoptose e

bloqueio do ciclo celular em células K562. Quantidades equivalentes de proteína total (50 Pg) do

lisado celular foram submetidas a western blotting e marcadas com anticorpos anti-TNFR1 e anti-

p65 de NFNB (A); anti-Bcl-2 e anti-Bax (B); e anti-p21 and anti-pRb (C). Controle positivo de

expressão foi mostrado por ȕ-actina, proteína constitutivamente expressa. Um imunoblotting

representativo de três experimentos independentes foi apresentado.

5.0- DISCUSSÃO

Nas últimas décadas, grande número de pesquisas têm desvendado os

caminhos da transdução de sinais no controle da morte celular e da maquinaria

molecular responsável por estes processos, conduzindo a numerosas

possibilidades de intervenção farmacológica e delineamento de drogas (Green &

Kroemer, 2005). Entre as novas drogas, utilizadas na terapia contra o câncer, com

potencialidade para interferir no mecanismo de regulação do crescimento de

tumores celulares, os produtos naturais têm chamado devida atenção como

importantes fontes de agentes quimioterápicos e/ou de modelos químicos e

estruturais para o desenvolvimento de uma infinidade de compostos (Clardy &

Walsh, 2004; Cragg et al., 2006; Ferreira et al., 2006; Justo & Ferreira, 2005;

Strohl, 2000). As lectinas constituem uma classe de proteínas largamente

distribuídas entre os organismos vivos, e têm atraído atenção como potenciais

ativadoras de morte celular em tecidos tumorais por desencadear cascatas de

sinalização apoptótica (Bantel et al., 1999; Hajto et al., 2005; Kim et al., 2003;

Lavastre et al., 2002; Miyoshi et al., 2001; Ohba et al., 2004; Park et al., 2000; Rao

et al., 2005).

No presente trabalho, com intuito de investigar a atividade antitumoral de

CvL, a linhagem K562 de células de leucemia mielóide crônica, expressando a

proteína oncogênica BCR-ABL, foi usada como um modelo de sistema resistente a

apoptose pelos quimioterápicos comuns (Bedi et al., 1995; Bedi et al., 1994;

Martins et al., 1997; Mcgahon et al., 1994; Skorski, 2002). Os resultados obtidos

mostraram que CvL é citotóxica para células da linhagem leucêmica K562 com o

de 70 Pg/mL, mas não causou nenhum efeito em linfócitos normais de sangue

periférico humano no mesmo intervalo de concentrações testadas (1 – 80 Pg/mL).

A morte celular ocorreu após 72 horas de exposição à lectina e com sinais típicos

de apoptose. Estes resultados são particularmente importantes já que muitos dos

agentes quimioterápicos tradicionais exibem toxicidade severa contra células

normais, causando efeitos colaterais indesejáveis e dessa forma limitando sua

aplicação no campo clínico. Além disso, muitos dos agentes terapêuticos

ministrados na prática clínica ou não conduzem à cura, ou possibilitam a

sobrevivência, em longo prazo, de muitos tipos de câncer, provavelmente

permitindo o desenvolvimento de mecanismos de resistência da doença. Por essa

razão, fica clara a necessidade de novos agentes com diferentes mecanismos de

ação que possam ser utilizados no tratamento direto dessas doenças e/ou como

adjuvantes no aperfeiçoamento da terapia do câncer (Cragg et al., 2006; Ren,

2005).

Ainda de maior relevância, é o fato da morte celular induzida por CvL ser

claramente diferente das demais formas de indução de outras lectinas, que na

maioria dos casos é mediada principalmente pela via de ativação de caspases,

uma família de proteases capaz de clivar outras cadeias polipeptídicas em

resíduos específicos de ácido aspártico. Esta família de proteínas propaga o sinal

de morte celular através da clivagem de outras proteínas chaves no processo

(Nicholson & Thornberry, 1997). O fato de CvL não induzir a ativação das

caspases – 3, - 8, e – 9 levanta a possibilidade do envolvimento de outras

proteases, diferentes das caspases, na indução de morte celular em células K562

por CvL. Embora as caspases estejam bem estabelecidas como a principal via de

ativação de apoptose, outras proteases como calpaínas, catepsinas e proteases

serínicas devem ser necessárias para o desencadear de tipos alternativos de

morte celular programada (Broker et al., 2005). Os achados de que CvL

desencadeia a liberação de catepsina B, como evidenciado pela microscopia

confocal, e de que o inibidor irreversível E-64 bloqueia completamente a morte

celular induzida por CvL, sugerem um papel central da participação da protease

lisossomal catepsina B no efeito citotóxico mediado por CvL. Isto corrobora com

trabalhos anteriores que ligam a ação de proteases lisossomais, em particular

catepsinas cisteínicas, com a morte celular programada independente de

caspases (Broker et al., 2004; Broker et al., 2005; Foghsgaard et al., 2001;

Guicciardi et al., 2004; Nylandsted et al., 2000). Foi possível esclarecer ainda, que

os possíveis eventos relacionados aos efeitos citotóxicos do tratamento com CvL

para células K562 induziram o aumento de expressão de TNFR-1 e a diminuição

dos níveis de NFțB. Apesar da visão original que relaciona ativação de receptores

de morte com a direta ativação da cascata das caspases, muitos trabalhos têm

relatado o envolvimento de TNFR-1 com mecanismos de morte celular que

ocorrem na completa ausência de caspases. Além do mais, evidências indicam

que catepsina B é um efetor crucial neste processo de morte celular induzida por

ativação do receptor de morte e independente de caspases (Broker et al., 2005;

Fehrenbacher & Jaattela, 2005; Foghsgaard et al., 2001; Mathiasen et al., 2001;

Mathiasen et al., 1999). Desta maneira, catepsina B pode ser responsável pela

função de protease efetora dominante nesta via altenativa de morte. Os dados

sugerem que a ativação do receptor de morte da membrana deve ter uma relação

íntima na morte celular mediada por liberação de catepsina B lisossomal induzida

por CvL em células leucêmicas da linhagem K562. Em outros estudos, a

permeabilização lisossomal com subseqüente liberação de catepsina B no citosol

têm sido implicada na ativação de cascatas apoptóticas (Barbosa et al., 2006;

Broker et al., 2004; Foghsgaard et al., 2001; Vancompernolle et al., 1998;

Werneburg et al., 2002), reforçando que a via de morte celular por lisossomo pode

ser uma estratégia terapêutica que venha superar a via de morte celular

dependente de caspases (Fehrenbacher & Jaattela, 2005).

Células tumorais, freqüentemente, bloqueiam os mecanismos de morte

celular programada em benefício de uma vantagem seletiva nos mecanismos de

crescimento e proliferação. Um dos eventos associados com a sinalização de

receptores de morte da família de TNF é a ativação do fator transcricional NFțB,

que têm sido relacionado à supressão de apoptose, na sobrevivência celular,

proliferação, e resistência a agentes quimioterápicos (Nakanishi & Toi, 2005;

Wang et al., 2000). Estudos extensivos em culturas de células e modelos de

animais revelam o papel crucial da subunidade p65 de NFțB na tumorigênese e

transformação de células hematopoiéticas mediada por BCR-ABL (Finco et al.,

1997; Hamdane et al., 1997; Karin & Lin, 2002). Também foi relatado que

proteínas anti-apoptóticas como Bcl-2 e Bcl-X

teriam seus níveis de expressão

aumentados por ação do fator transcricional NFțB (Heckman et al., 2002; Karin &

Lin, 2002; Pahl, 1999). Estes membros da família de proteínas BcL-2 sequestram

proteínas pro-apoptóticas da subfamília Bax, prevenindo a ativação de Bax ou Bak

e consequentemente inibe a cascata de eventos mitocondriais pro-apoptóticos

(Borner, 2003; Turk & Stoka, 2007). Em adição, as proteínas oncongênicas BCR-

ABL previnem a morte apoptótica induzida por quimioterápicos convencionais pela

indução da expressão de Bcl-2 (Mcgahon et al., 1994; Sanchez-Garcia & Grutz,

1995; Skorski, 2002). A diminuição dos níveis de expressão da subunidade p65 de

NFțB em células tratadas com lectina poderia também contribuir para o efeito pro-

apoptótico de CvL. Devido a observação do aumento dos níveis de ambas as

proteínas Bax e Bcl-2 após o tratamento, parece possível que CvL afete o balanço

entre a indução e a inibição de morte favorecendo o aumento da taxa de morte

celular em células da linhagem K562. Estas observações reforçam a idéia que

catepsina B pode desempenhar uma função primordial neste processo.

A BCR-ABL é membro de um seleto grupo de proteínas oncogênicas

capazes de inibir apoptose e interferir na proliferação celular. A combinação

destas atividades provavelmente é importante para a progressão de LMC (Cortez

et al., 1997). Várias linhas de evidências reforçam a existência de um papel

associado à interferência do ciclo celular para ativação de NFțB por BCR-ABL

(Joyce et al., 2001). Estudos têm demonstrado que NFțB é requerido para induzir

expressão de ciclina D1 e hiperfosforilação de pRb, promovendo a progressão da

fase G1 para S (Bours et al., 2000; Guttridge et al., 1999). Neste estudo, análises

por western blotting revelaram que CvL causou aumento da expressão de p21. O

aumento de expressão desta proteína reguladora bloqueia a atividade dos

complexos quinases dependentes de ciclina, impedindo a fosforilação de pRb e

consequentemente as transições G1/S e G2/M do ciclo celular. (Niculescu et al.,

1998). Trabalhos anteriores já mostraram que o bloqueio da progressão do ciclo

celular contribui para o processo apoptótico induzido por lectinas como a

Concanavalina A (Con A), aglutinina de farelo de arroz (RBA) e aglutinina de

gérmen de trigo (WGA) em diferentes sistemas celulares (Desrivieres et al., 1997;

Kulkarni & Mcculloch, 1995; Miyoshi et al., 2001).

6.0- CONCLUSÕES

x CvL mostrou efeito citotóxico para células K562 com o IC

de 70 Pg/mL,

mas não afetou a viabilidade celular de linfócitos normais de sangue

periférico humano nas mesmas concentrações testadas (1 - 80Pg/mL).

Juntos, estes dados indicam a presença de uma atividade seletiva de CvL

contra células leucêmicas da linhagem K562.

x As células K562 tratadas com CvL na concentração de 70Pg/mL mostraram

núcleos com diferentes níveis de condensação de cromatina e

fragmentação nuclear, sinais típicos de morte celular por apoptose; e a

quantificação do índice apoptótico mostrou aumento significativo do número

de células apoptóticas, alcançando o valor de 43 ± 5% do total da

população celular (p<0,05).

x CvL não foi capaz de induzir a atividade das caspases – 8 , – 9 e – 3 em

células K562 quando tratadas com concentrações de 50 e 70 Pg/mL.

x A exposição de células K562 ao tratamento com CvL na concentração de

70 Pg/mL desencadeou a liberação de catepsina B dos compartimentos

vesiculares dentro do citoplasma com subseqüente translocação para o

interior do núcleo.

x A incubação prévia das células K562 com o inibidor de catepsinas E-64 foi

responsável pela inibição completa da morte celular mediada por CvL.

x Análise por Western blotting revelou que as células K562 tratadas com CvL

nas concentraçãoes de 50 e 70 Pg/mL aumentaram a expressão do

receptor de morte TNFR-1 de maneira dose-dependente, diminuíram a

expressão da subunidade p65 do fator transcricional NFțB, e aumentarem

os níveis de expressão das proteínas Bcl-2 e Bax.

x CvL ainda induziu um aumento significativo na expressão da proteína p21 e

a consequente modulação negativa de pRb, indicando que o bloqueio do

ciclo celular contribuiu para o processo apoptótico induzido pela lectina.

x Baseado em todos estes resultados, foi proposto que CvL induz a morte

seletiva de células K562 na presença de proteínas da família Bcl-2 via um

mecanismo independente de caspases, possivelmente através de uma

conexão ainda não caracterizada com a via de ativação de receptores de

morte, e com a participação efetiva de catepsina B nesta via de morte

celular programada.

7.0- REFERÊNCIAS

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