( PDF ) Estudos de Expressão do HBsAg: Hepatite B oculta, genótipos do HBV e quimeras de HBV e HCV

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INSTITUTO OSWALDO CRUZ

PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA CELULAR E MOLECULAR

NATALIA MOTTA DE ARAUJO

Estudos de Expressão do HBsAg: Hepatite B Oculta,

Genótipos do HBV e Quimeras de HBV e HCV.

RIO DE JANEIRO

2008

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Ficha catalográfica elaborada pela

Biblioteca de Ciências Biomédicas/ ICICT / FIOCRUZ - RJ

A663

Araújo, Natalia Motta de

Estudos de expressão do HBsAg: hepatite B oculta, genótipos do

HBV e quimeras de HBV e HCV / Natalia Motta de Araújo. – Rio de

Janeiro, 2008.

ix, 138 f. : il. ; 30 cm.

Tese (doutorado) – Instituto Oswaldo Cruz, Biologia Celular e

Molecular, 2008.

Bibliografia: f. 117-137

1. Vírus da hepatite B. 2. Antígeno de superfície. 3. Hepatite B

oculta. 4. Mutação. 5. Transfecção. I. Título.

CDD 616.3623

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Ministério da Saúde

FIOCRUZ

Fundação Oswaldo Cruz

INSTITUTO OSWALDO CRUZ

PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA CELULAR E MOLECULAR

Natalia Motta de Araujo

Estudos de Expressão do HBsAg: Hepatite B Oculta,

Genótipos do HBV e Quimeras de HBV e HCV.

Tese apresentada ao Instituto Oswaldo Cruz como

parte dos requisitos para obtenção do título de

Doutor em Ciências.

Orientadora: Dra. Selma de Andrade Gomes

Rio de Janeiro

2008

iii

Ministério da Saúde

FIOCRUZ

Fundação Oswaldo Cruz

INSTITUTO OSWALDO CRUZ

PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA CELULAR E MOLECULAR

Natalia Motta de Araujo

Estudos de Expressão do HBsAg: Hepatite B Oculta,

Genótipos do HBV e Quimeras de HBV e HCV.

Orientadora: Dra. Selma de Andrade Gomes

EXAMINADORES:

Dra. Mariza Gonçalves Morgado (IOC-FIOCRUZ)

Dra. Cristiane Alves Villela Nogueira (UFRJ)

Dr. Alan Kay (INSERM)

Suplentes:

Dr. Christian Niel (IOC-FIOCRUZ)

Dra. Elisabeth Lampe (IOC-FIOCRUZ)

Rio de Janeiro, 11 de julho de 2008.

“De tudo ficaram três coisas:

a certeza de que estamos sempre a começar,

a certeza de que é preciso continuar,

e a certeza de que seremos interrompidos antes de terminar”.

(Fernando Sabino)

AGRADECIMENTOS

À minha orientadora, Dra. Selma de Andrade Gomes, por me ajudar a percorrer

novos caminhos e ouvir com interesse e paciência todas as minhas questões,

dúvidas e problemas que surgiram ao longo desses anos. Pela coragem de ousar

trabalhar com novas idéias e conceitos, correndo os riscos inerentes a esta atitude.

Por sua amizade e carinho, principalmente, os meus mais sinceros agradecimentos.

Ao Dr. Christian Niel, por incentivar constantemente o meu interesse científico, pelas

valiosas sugestões e críticas oferecidas durante o meu trabalho e pela excelente

ajuda na preparação dos artigos.

À amiga Monique Branco Vieira, que durante o seu estágio de iniciação científica,

me forneceu uma ajuda preciosa no trabalho de bancada.

Ao meu querido amigo Chico, por essa amizade que prezo tanto e que tenho certeza

que será para sempre.

Aos meus amigos de laboratório, Bárbara, Carlos Augusto, Caroline, Fátima,

Leonardo e Sylvie, por todo o companheirismo no dia-a-dia do trabalho e pelos

muitos momentos alegres que passamos juntos.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) por

financiar a minha bolsa de doutorado sanduíche de quatro meses na França.

Ao Convênio FIOCRUZ/INSERM, pelo financiamento das viagens Brasil-França e

França-Brasil durante os anos de 2006 e 2007 e pelos próximos anos de 2008 e

2009.

A toda equipe da unidade 871 do INSERM em Lyon, França, principalmente ao Dr.

Alan Kay e ao Prof. Christian Trepo, pelos valiosos ensinamentos e por todo o

carinho e atenção dedicados a mim. “Je vous adresse mes plus sincères

remerciements”.

Ao Instituto de Pesquisa Clínica Evandro Chagas (IPEC-FIOCRUZ), principalmente à

Dra. Anita Mendonça Silva, Dra. Jussara Árabe, Dr. José Henrique Pilotto e Dra.

Beatriz Grinsztejn, pelo fornecimento dos pacientes e coleta de dados, para a

realização do estudo sobre hepatite B oculta.

Um especial agradecimento a todos os pacientes do IPEC que decidiram participar

deste estudo, pois sem a colaboração deles o trabalho não teria sido possível.

À coordenação e secretaria da Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular IOC-

FIOCRUZ pela atenção dedicada nos momentos em que precisei.

À Plataforma de Sequenciamento PDTIS/FIOCRUZ por realizar o sequenciamento

de todas as amostras analisadas nesta tese.

A todos os meus queridos colegas do Laboratório de Desenvolvimento Tecnológico

e do Laboratório de Hepatites Virais, por toda a colaboração, apoio e amizade ao

longo desses anos.

Aos meus pais muito queridos, pelo estímulo do início ao fim, pela ajuda constante,

concreta e infatigável, ao longo de minha vida. Eu espero poder ter lhes dado uma

pequena retribuição à educação que sempre se esforçaram para me proporcionar.

Ao Guilherme, por me incentivar nos momentos de desânimo, por se alegrar comigo

a cada bom resultado conquistado, pela vida linda que temos juntos, pelos planos

que já realizamos e os muitos outros que pretendemos ainda realizar...

vii

RESUMO

Introdução: O vírus da hepatite B (HBV) é classificado em oito genótipos (A-H), que

apresentam uma distribuição geográfica característica nas diferentes regiões do

mundo. No Brasil, são encontrados principalmente os genótipos A, D e F. A infecção

pelo HBV é comumente diagnosticada pela presença do antígeno de superfície viral

(HBsAg) no soro de indivíduos infectados. Mutações no HBsAg podem afetar os

níveis de secreção deste antígeno, bem como, alterar a sua conformação, e

conseqüentemente, inibir a sua detecção pelos testes imunoenzimáticos. A detecção

do DNA viral em pacientes com sorologia negativa para o HBsAg caracteriza a

ocorrência de infecção oculta pelo HBV. Partículas híbridas de HBsAg, também

denominadas quimeras, têm sido utilizadas com bastante eficiência na apresentação

de epítopos exógenos. Objetivos: Realizar estudos de expressão in vitro do HBsAg

em células eucarióticas visando (i) associar infecção oculta pelo HBV com mutações

de aminoácidos no HBsAg; (ii) avaliar possíveis diferenças na detecção do HBsAg

relacionadas aos diferentes genótipos do HBV; e (iii) possibilitar a construção de

quimeras de HBV e do vírus da hepatite C (HCV) para produção de proteínas

híbridas imunizantes. Metodologia: A clonagem das regiões genômicas do envelope

do HBV foi realizada utilizando-se os vetores de expressão em células eucarióticas

pcDNA3 e/ou pCI. Para a inserção do segmento de HCV no HBsAg, foi utilizado um

sítio de restrição natural localizado na região do epítopo neutralizante do HBsAg.

Ensaios de transfecção transitória foram realizados em células CHO e/ou HuH7. O

meio de cultura e os extratos celulares foram analisados quanto à detecção de

HBsAg por ensaios imunoenzimáticos. Ensaios de imunofluorescência, utilizando um

anticorpo monoclonal anti-HBs, foram realizados para detectar a localização

intracelular do HBsAg. Resultados: 1) A infecção oculta pelo HBV foi detectada em

6/43 (14%) pacientes infectados pelo HIV. A ocorrência de hepatite B oculta não

teve relação com a elevação dos níveis de transaminases, porém foi

significativamente associada à presença de infecção pelo HCV. Todos os pacientes,

exceto um, apresentaram baixa carga viral para o HBV. O sequenciamento da região

S revelou mutações em dois pacientes que podem ser responsáveis pela falta de

detecção do HBsAg pelos testes comerciais. 2) O genótipo A apresentou os maiores

níveis de detecção de HBsAg em comparação aos genótipos D (redução de 37%) e

F (redução de 30%). Entretanto, a presença de duas únicas substituições (T143M,

em um clone do genótipo A, e T125M, em um clone do genótipo D) alterou

consideravelmente os níveis de detecção do HBsAg. 3) Uma mutação identificada na

porção carboxi-terminal da proteína S do HBsAg no resíduo 215 (L215Q), em um

isolado de HBV do genótipo F, foi responsável pela inibição da secreção deste

antígeno. Através de microscopia de imunofluorescência, foi observada uma

localização intracelular do HBsAg mutante indicativa de retenção no retículo

endoplasmático. 4) A inserção de um segmento do HCV dentro do epítopo

neutralizante do HBsAg através de um sítio natural de restrição, não alterou os

padrões de secreção e a antigenicidade do HBsAg quimérico. Conclusões: A

detecção de mutações no HBsAg e a baixa viremia do HBV confirmam que

mecanismos multifatoriais estão envolvidos na infecção oculta pelo HBV. Mutações

únicas no HBsAg podem ter mais influência nos padrões de detecção e secreção do

HBsAg do que o conjunto total de variações características de cada genótipo. A

utilização do sítio de restrição natural identificado neste estudo para a inserção de

epítopos do HCV não alterou as propriedades antigênicas do HBsAg.

viii

ABSTRACT

Introduction: Hepatitis B virus (HBV) is classified into eight genotypes (A-H) that

have a distinct distribution in different geographical regions. In Brazil, genotypes A, D

and F are the most prevalent. HBV infection is commonly diagnosed by the presence

of the surface antigen (HBsAg) in serum. Amino acid mutations may affect HBsAg

secretion levels, as well as, alter HBsAg conformation, and thus, inhibit its detection

by immunoassays. The detection of HBV DNA in HBsAg negative patients

characterizes the occurrence of occult HBV infection. HBsAg hybrid particles, also

known as chimeras, have been successfully used as vectors for presentation of other

epitopes. Objectives: To conduct HBsAg expression assays in eukaryotic cells

aiming to (i) associate occult HBV infection with amino acid mutations in HBsAg; (ii)

analyze possible differences in the levels of HBsAg detection related to HBV

genotypes; and (iii) construct hybrid particles of HBsAg and hepatitis C virus (HCV)

epitopes to produce chimeric immunogenic proteins. Methods: Cloning procedures

of the coding regions for the HBV envelop proteins were done by using pcDNA3

and/or pCI eukaryotic expression vectors. A natural restriction site located at the

HBsAg neutralizing epitope was used for insertion of the HCV segment into the

HBsAg. Transient transfection assays were carried out in CHO and/or HuH7 cells.

Medium and extracts of transfected cells were analyzed for the presence of HBsAg

by immunoassays. The intracellular localization of HBsAg was observed by

immunofluorescence using a monoclonal anti-HBs antibody. Results: 1) Occult HBV

infection was detected in 6/43 (14%) HIV-infected patients. It was not associated with

alanine aminotransferase elevation but significantly correlated with the presence of

HCV infection. All except one patient, showed low HBV loads. S gene sequencing

revealed mutations in two patients that may inhibit HBsAg detection by commercial

assays. 2) HBV genotype A displayed the highest levels of HBsAg detection in

comparison with genotypes D (reduction of 37%) and F (reduction of 30%). However,

the presence of two single mutations (T143M, in a genotype A clone, and T125M, in

a genotype D clone) changed considerably HBsAg detection levels. 3) A unique

amino acid mutation in the carboxi-terminal region of the HBsAg at residue 215

(L215Q), from a genotype F isolate, that inhibits secretion of HBsAg, was identified.

By immunofluorescence microscopy, an intracellular localization of the HBsAg

mutant, indicating retention in the endoplasmic reticulum, was observed. 4) The

insertion of the HCV segment into the HBsAg neutralizing epitope by a natural

restriction site did not alter patterns of secretion and antigenicity of the chimeric

HBsAg. Conclusions: The detection of HBsAg mutants and low HBV loads confirm

that multifactorial mechanisms are involved in occult HBV infection. Single mutations

in HBsAg may have more influence on the patterns of HBsAg detection and secretion

than the set of variations characteristic of each genotype. The natural restriction site

identified in this study for insertion of HCV epitopes did not change HBsAg antigenic

characteristics.

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO 1

1.1

Histórico

1.2

Epidemiologia da Infecção pelo Vírus da Hepatite B

1.3

Classificação

1.4

Transmissão do HBV

1.5

Quadro Clínico

1.6

Patogênese

1.7

Diagnóstico Laboratorial da Hepatite B

1.8

Prevenção da Hepatite B

1.9

Tratamento

1.10

Características Biológicas do Vírus da Hepatite B

1.11

Organização Genômica

1.11.1

A Fase de Leitura Aberta Pre-S/S

1.11.2

A Fase de Leitura Aberta da Polimerase (P)

1.11.3

A Fase de Leitura Aberta Pre-C/C

1.11.4

A Fase de Leitura Aberta X

1.12

Replicação Viral

1.13

Variabilidade do HBV

1.13.1

Subtipos do HBV

1.13.2

Genótipos do HBV

1.14

A Proteína S do HBsAg

1.14.1

Estrutura da Proteína S do HBsAg

1.14.2

Variabilidade Genética da Proteína S do HBsAg

1.14.3

Hepatite B Oculta

1.14.4

HBsAg como Apresentador de Epítopos Exógenos - Enfoque HCV

2 JUSTIFICATIVA 32

3 OBJETIVOS 34

3.1

Objetivo Geral

3.2

Objetivos Específicos

4 RESULTADOS 36

5 DISCUSSÃO 106

6 CONCLUSÕES 115

7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 117

ANEXOS 138

1 – INTRODUÇÃO

1.1 – Histórico

Relatos da ocorrência de icterícia epidêmica são encontrados desde o

período anterior à Era Cristã, e foram descritos inicialmente por Hipócrates (400 AC).

Entretanto, somente no final do século XIX, após a vacinação contra a varíola

(vacina preparada com linfa humana) de 1.289 trabalhadores do estaleiro de

Bremen, Alemanha, dos quais 15% se tornaram ictéricos, tornou-se evidente a

associação desta enfermidade a um agente de transmissão parenteral (Lurman,

1885).

Durante a primeira metade do século XX, surtos de hepatite de “período de

incubação longo” (50 a 180 dias) foram observados em muitos países e foram

associados às transfusões de sangue, ao uso de medicação injetável com seringas

e agulhas não esterilizadas e à administração de vacina, como por exemplo, o surto

de hepatite/icterícia ocorrido entre os militares que foram vacinados contra a febre

amarela durante a Segunda Guerra Mundial (Krugman, 1989).

A década de 1940 foi o período no qual se distinguiu a presença de mais de

um agente viral para as epidemias de icterícia. Em 1947, MacCallum designou os

termos “vírus da hepatite A” (HAV) e “vírus da hepatite B” (HBV), referindo-se aos

supostos agentes etiológicos das hepatites de período de incubação curto ou

infecciosa (18 a 37 dias) e de período de incubação longo ou soro-homóloga (50 a

180 dias), respectivamente. Esta terminologia foi adotada pelo comitê das hepatites

virais da Organização Mundial de Saúde, permanecendo até os dias atuais

(Hollinger, 1991).

Em 1965, Blumberg e colaboradores publicaram o que viria a ser uma das

mais importantes revelações sobre as hepatites virais. Com o objetivo de estudar

características polimórficas hereditárias, Blumberg e sua equipe examinaram

milhares de amostras de soro de diferentes áreas geográficas do mundo. Durante o

curso da investigação, a equipe descobriu que uma amostra de soro de um

aborígine da Austrália continha um antígeno que reagia especificamente com um

anticorpo presente no soro de um paciente hemofílico dos Estados Unidos. Estudos

subseqüentes revelaram que este “antígeno Austrália” era relativamente raro na

população da América do Norte e Oeste Europeu, porém prevalente em algumas

regiões Africanas e Asiáticas e entre pacientes com leucemia, síndrome de Down e

hepatite aguda (Blumberg et al., 1967; Bayer et al., 1968). Em 1968, a correlação do

antígeno Austrália (agora designado antígeno de superfície do vírus da hepatite B ou

HBsAg) com a infecção pelo HBV, pôde ser estabelecida (Okochi & Murakami, 1968;

Prince, 1968). Posteriormente, a purificação do HBV foi realizada a partir do soro de

portadores do antígeno Austrália e a partícula completa ou vírion foi detectada por

microscopia eletrônica (Dane et al., 1970).

Atualmente é conhecida uma série de vírus hepatotrópicos humanos, sendo o

HBV o primeiro deles a ter sido identificado (1970), seguido pelo vírus da hepatite A

(HAV) (Feinstone et al., 1973), vírus da hepatite D (HDV) (Rizzeto et al., 1977), vírus

da hepatite E (HEV) (Balayan et al., 1983) e vírus da hepatite C (HCV) (Choo et al.,

1989). Outros novos agentes foram identificados em indivíduos com hepatite pós-

transfusional não A-E, porém uma relação causal entre infecção por estes vírus e

hepatopatias ainda não pôde ser confirmada. Dentre eles, destacam-se o vírus da

hepatite G (HGV) (Simons et al., 1995), Torque Teno vírus (TTV) (Nishizawa et al.,

1997), Torque Teno Mini virus (TTMV) (Takahashi et al., 2000) e Torque Teno Midi

vírus (TTMDV) (Ninomiya et al., 2007).

1.2 – Epidemiologia da Infecção pelo Vírus da Hepatite B

A OMS calcula que mais de 350 milhões de pessoas estão cronicamente

infectadas pelo HBV no mundo. Os portadores crônicos de hepatite B apresentam

um maior risco de falecer por complicações relacionadas à hepatite crônica, como

cirrose e carcinoma hepatocelular (CHC), com relato de 500 mil a 1,2 milhões de

óbitos por ano. Estes portadores crônicos servem como fonte de infecção para

outros indivíduos (Zuckerman, 1999).

A infecção pelo HBV exibe alta prevalência para o HBsAg (8 a 15%) no

Sudeste asiático, China, Filipinas, África, bacia amazônica e Oriente Médio. Uma

prevalência intermediária (2-7%) é observada no Leste Europeu, Ásia Central,

Japão, Israel e ex-União Soviética, enquanto, uma baixa prevalência (<2%), é

encontrada na América do Norte, Europa Ocidental, Austrália e Sul da América

Latina (Margolis et al., 1991) (Figura 1).

O Brasil é considerado uma área de prevalência intermediária para a infecção

pelo HBV, porém observam-se taxas variáveis de ocorrência da infecção em

diferentes regiões do país, inclusive em nível de sub-regiões, uma vez que

localidades vizinhas podem apresentar graus distintos de endemicidade (Souto,

1999) (Figura 2). A região Sul, que sempre apresentou os menores índices de

hepatite B do país, teve caracterizada sub-regiões, mais precisamente as regiões de

Francisco Beltrão (PR), Cascavel (PR) e Chapecó (SC), com prevalência moderada

a elevada do HBsAg. A mesma situação é observada na região Sudeste, onde a

prevalência é baixa, porém há a presença de sub-áreas com altos índices de

infecção pelo HBV, localizadas nos estados do Espírito Santo e Minas Gerais

(Souto, 1999). Ao contrário, na região Norte, que é a principal área de alta

prevalência do HBV no Brasil e que tem recebido maior atenção dos estudiosos e

das autoridades sanitárias, verificou-se uma sub-região (em Barcellos) no Norte do

Estado do Amazonas, cuja prevalência para o HBsAg é baixa (1,6%) (Arboleda et

al., 1995). Na região Nordeste, os poucos estudos de soroprevalência da hepatite B

que foram realizados, apontam índices baixos na cidade de Salvador e nos estados

do Ceará e Rio Grande do Norte (Lyra et al., 1986; Souto, 1999). Para a região

Centro-Oeste, os números conhecidos sugerem que a região pode ser dividida em

duas grandes áreas quanto ao padrão epidemiológico da hepatite B: a primeira mais

ao Sul, englobando o Mato Grosso do Sul, Goiás e Sul do Mato Grosso, com

prevalência baixa a moderada, e a região Norte do Mato Grosso, correspondendo à

Amazônia, com comportamento semelhante ao da região Norte (Souto, 1999).

Prevalência do HBsAg

≥8% - Alta

2-7% - Intermediária

rtM204I

Figura 1: Distribuição Mundial do HBV.

Disponível em http://www.cdc.gov/ncidod/diseases/hepatitis/slideset/hep_b/slide_9.htm

[acesso em 10 abril 2008] (Figura adaptada para o português).

Figura 2: Distribuição do HBV no Brasil (Fonte: Adaptada de Souto, 1999).

1.3 – Classificação

O HBV é o protótipo de um grupo de vírus DNA hepatotrópicos, classificados

na família Hepadnaviridae, os quais compartilham características comuns, tais como,

tamanho, ultraestrutura do vírion, organização da molécula de DNA e um mecanismo

exclusivo de replicação por transcrição reversa. Esta família é dividida em dois

gêneros, Orthohepadnavirus e Avihepadnavirus, representando os vírus cujos

hospedeiros são mamíferos e aves, respectivamente. Os representantes do primeiro

gênero são encontrados em humanos (HBV), marmotas (WHV) (Summers et al.,

1978), esquilos (GSHV) (Marion et al., 1980) e primatas não humanos (HBV) (Vaudin

et al., 1988; Hu et al., 2000; Robertson, 2001). Em 1998, Lanford e colaboradores

isolaram de um primata do Novo Mundo (Lagothrix lagotricha), um novo

representante deste gênero, denominado de “WMHBV – Woolly Monkey Hepatitis B

Virus”. Os vírus pertencentes ao gênero Avihepadnavirus infectam patos (DHBV)

(Mason et al., 1980; Zhou, 1980), garças (HHBV) (Sprengel et al., 1988) e cegonhas

(STHBV) (Pult et al., 2001).

1.4 – Transmissão do HBV

O HBV é principalmente encontrado no sangue de indivíduos infectados. A

carga viral pode ser maior que dez bilhões de vírions por mililitro de sangue em

portadores com sorologia positiva para o HBeAg (antígeno indicador de replicação

do HBV). Além disso, o HBV pode ser detectado em outros fluidos corporais, como

na urina, saliva, fluido nasofaringeano, sêmen e fluido menstrual (Alter et al., 1977;

Davison et al., 1987). O HBV não foi ainda detectado em fezes, provavelmente

devido à inativação e degradação do vírion na mucosa intestinal ou pela flora

bacteriana (Grabow et al., 1975).

A transmissão do HBV ocorre pela exposição perinatal, através da relação

sexual, pela exposição a sangue ou derivados, pelo transplante de órgãos ou

tecidos, através de seringas compartilhadas por usuários de drogas endovenosas,

por lesões de pele, por picadas de agulhas ou através de outras exposições de

origens desconhecidas (Gonçales, 1997). Nas áreas de alta incidência de infecção

pelo HBV, a disseminação ocorre principalmente na infância, seja ao nascer

(perinatal), ou nos primeiros anos de vida por transmissão horizontal entre familiares

(Margolis et al., 1991). Na exposição perinatal, a transmissão mãe-filho pode se

fazer durante o parto pela exposição do recém-nascido ao sangue ou líquido

amniótico (onde está presente o HBV), durante a passagem pelo canal vaginal, ou

pela amamentação (Gonçales, 1997). O próprio contato familiar continuado de

crianças com mães reativas para os antígenos HBsAg/HBeAg nos anos seguintes ao

nascimento, levará ao um risco considerável de aquisição do HBV, se as crianças

não forem vacinadas (Beasley & Hwang, 1987). Em áreas de baixa prevalência, a

infecção ocorre principalmente em indivíduos adultos, sendo a via de transmissão

dependente de padrões ambientais e comportamentais, tais como, o

compartilhamento de seringas ou agulhas na utilização de drogas injetáveis (Alter,

1993; Oliveira et al., 1999), relações sexuais com múltiplos parceiros (homossexuais

ou heterossexuais) (Piot et al., 1990), profissionais de saúde através de acidentes

com materiais perfurocortantes contaminados com sangue (Beltrami et al., 2000) e

pacientes politransfundidos e/ou submetidos à cirurgia ou a outros procedimentos

invasivos (Teles et al., 1998).

1.5 – Quadro Clínico

Acredita-se que o HBV não exerça um efeito citopático direto sobre os

hepatócitos (Alberti et al., 1983). A hepatite B pode, no entanto, variar desde uma

doença aguda auto-limitada, até uma forma grave como a hepatite fulminante. Pode,

ainda, apresentar um curso crônico com evolução para a cirrose hepática e

hepatocarcinoma. Cerca de 90-95% dos pacientes adultos infectados evoluem para

a cura, e menos de 1% dos indivíduos desenvolvem uma hepatite fulminante.

Entretanto, crianças infectadas através de transmissão perinatal, apresentam mais

de 90% de chance de se tornarem portadores crônicos.

O período de incubação da hepatite B é de 50 a 180 dias, com média de 75

dias. Decorrido este tempo, inicia-se o chamado período prodrômico (pré-ictérico),

que dura vários dias e se caracteriza pelo aparecimento de fraqueza, anorexia e

mal-estar geral. Nesta fase, os doentes podem referir dores abdominais difusas,

náuseas, intolerância a vários alimentos, distúrbios gustativos, desconforto

abdominal e vômitos. A ocorrência de artrites, artralgias e mialgias é descrita nos

casos de hepatite B, bem como a observação de exantemas cutâneos rubeoliformes

ou lembrando urticárias (McIntyre, 1990). O exame físico pode revelar

hepatomegalia dolorosa. O aparecimento de icterícia, com colúria e hipocolia fecal

(período ictérico), ocorre em somente 20% dos doentes, sendo a hepatite B uma

doença assintomática no restante dos casos. Quando aparece a icterícia, os

sintomas gerais, como febre e mialgias, diminuem de intensidade. Neste momento

se elevarão os níveis séricos das bilirrubinas, principalmente da fração direta. As

transaminases estarão muito elevadas no soro, expressando a ocorrência de lesões

hepatocíticas. Este quadro ictérico costuma durar cerca de 20 dias ou mais, e pode,

às vezes, provocar pruridos cutâneos. Os demais sinais observados nas icterícias

hepatocelulares, como hipocolia ou acolia fecal e colúria, tornam-se bastante

evidentes no período ictérico da hepatite B. Com a evolução da doença, a

hepatomegalia dolorosa e a esplenomegalia, se presentes, vão diminuir

paulatinamente, bem como todos os sintomas dispépticos e aqueles relacionados

com a icterícia. Este período de convalescença dura, em média, 20 a 30 dias

(Gonçales, 1997).

1.6 – Patogênese

Como o HBV não é diretamente citopático, existem evidências consideráveis

de que a hepatite B se inicia por uma resposta imune-celular dirigida contra

antígenos virais específicos que levarão ao dano hepático. Acredita-se que a

participação dos dois componentes da resposta imune (celular e humoral) seja

necessária para que ocorra a eliminação do vírus, além da inativação viral

intracelular produzida por citocinas liberadas pelas células linfomononucleares, tais

como interferon-gama e o fator de necrose tumoral (TNF) (Rapicetta et al., 2002).

Durante a fase aguda da hepatite viral, os hepatócitos expressam na sua superfície

um complexo formado por peptídeos do core (HBcAg) do HBV e proteínas de classe

I do HLA. O linfócito T citotóxico reconhece este complexo de peptídeos do

core/MHC classe I e ao atacar este hepatócito infectado produz a lise hepatocítica.

Sem dúvida a resposta das células T às proteínas do HBV, que se expressam

associadas a antígenos HLA de classe I na superfície dos hepatócitos infectados,

representa o maior determinante da lise destas células. Quando este mecanismo é

totalmente eficiente, leva à recuperação da infecção (Rapicetta et al., 2002). Esta

lise imunológica dos hepatócitos infectados é, portanto, a base histopatológica da

enfermidade aguda produzida pelo HBV. O indivíduo poderá desenvolver hepatite B

crônica porque não ocorre expressão da classe I do HLA, ou porque o linfócito T

citotóxico não é apropriadamente estimulado ou, ainda por algum outro mecanismo

desconhecido (Thomas, 1991).

A integração do DNA do HBV no genoma do hospedeiro pode acarretar no

desenvolvimento de hepatocarcinoma celular. Esta alteração cromossômica,

freqüentemente envolvendo o cromossomo 17, leva a transformações celulares, que

produzem, após alguns anos, o carcinoma de células primárias do fígado (Hino et

al., 1986; Zhou et al., 1988). Através de técnicas de biologia molecular, pôde-se

inserir o gene que produz o antígeno X (HBxAg) do HBV em ratos, e os animais

produziram este antígeno e desenvolveram carcinoma hepatocelular, mesmo na

ausência de lesão hepatocítica (Kim et al., 1991). Estes fatos apontam para a

participação do HBV no desenvolvimento de neoplasias hepáticas.

1.7 – Diagnóstico Laboratorial da Hepatite B

Do ponto de vista clínico, as hepatites virais apresentam um quadro bastante

similar. O diagnóstico etiológico consiste em identificar o agente causador da

infecção e pode ser realizado através de técnicas sorológicas, imunohistoquímicas

ou moleculares, onde pesquisam-se os marcadores sorológicos, teciduais e o ácido

nucléico viral, respectivamente (Brasil, Ministério da Saúde, 1995).

O HBV inicia a replicação no hepatócito na semana que antecede as suas

manifestações clínicas. Nesta fase, o HBsAg pode ser determinado sem que o

indivíduo tenha ainda sintomas ou evidências de necrose hepatocelular (Hoofnagle

& Di Bisceglie, 1991). Ao iniciar a sintomatologia e a elevação de aminotransferases,

aparecem o anticorpo anti-HBc da classe IgM, com o marcador anti-HBc total. O

anti-HBc IgM, juntamente com o HBsAg, constituem a chave do diagnóstico da

infecção aguda, uma vez que a fração IgG deste anticorpo serve apenas como

evidência de memória imunológica. Apesar de ser um anticorpo de longa duração, o

anti-HBc, não confere imunidade ao indivíduo, pois não possui capacidade

neutralizante (Sjogren, 1994). Na fase inicial da doença os marcadores de replicação

(HBeAg e o HBV-DNA) são encontrados em títulos altos. À medida que a infecção

se instala, a resposta imunológica do hospedeiro modula a infecção, diminuindo

progressivamente a replicação viral. Os indivíduos que apresentam resposta

imunológica satisfatória conseguem debelar a replicação viral, geralmente até o 3º

mês da doença, fazendo com que o HBeAg desapareça dando lugar ao anticorpo

anti-HBe, que está associado a uma baixa replicação do HBV. A ausência da

soroconversão HBeAg/anti-HBe até o 3º mês da doença aguda é sinal de mau

prognóstico, pois indica falha do sistema imunológico e tendência para cronificação

do processo. Cessando a replicação viral, ocorrerá o desaparecimento progressivo

do HBsAg e, algumas semanas após, surgirá o anti-HBs, anticorpo neutralizante e

indicativo de cura da infecção. Os indivíduos que se tornam crônicos, permanecem

como portadores do vírus por tempo variado. A hepatite crônica é determinada pela

persistência do HBsAg no soro por mais de seis meses após o início da infecção.

Nestes pacientes, os marcadores de replicação viral e as manifestações clínicas

serão dependentes da interação “vírus x hospedeiro” (Sjogren, 1994). A Figura 3

apresenta as curvas dos marcadores sorológicos nas infecções aguda e crônica,

respectivamente.

Provas bioquímicas de função hepática, tais como a dosagem das

transaminases (alanina aminotransferase - ALT e aspartato aminotransferase – AST)

e bilirrubina são também realizadas para fins de diagnóstico, pois seus níveis

aumentam no soro durante os episódios de lesão ou necrose hepatocelular em

decorrência da infecção viral (Sjogren, 1994).

Figura 3: Curvas Sorológicas nas Infecções Aguda e Crônica.

Disponível em <http://www.cdc.gov/ncidod/diseases/hepatitis/slideset/hep_b/slide_3.htm> e <http://www.cdc.gov

/ncidod/diseases/hepatitis/slideset/hep_b/slide_4.htm> [acesso em 16 Jan. 2008] (Figuras adaptadas para o

português).

1.8 – Prevenção da Hepatite B

A primeira vacina contra o HBV foi licenciada em 1981 e era derivada de

plasma humano de portadores crônicos do HBV (Heptavax-B, Merck & Co).

Entretanto, o risco de transmissão de outros agentes infecciosos presentes no

plasma, impulsionou o desenvolvimento de vacinas recombinantes compostas de

HBsAg produzido por engenharia genética (Engerix-B, SmithKline e Recombivax,

Merck & Co). Para a produção destas vacinas, utiliza-se a tecnologia do DNA

recombinante para expressão do HBsAg em leveduras (Assad & Francis, 2000). A

vacina apresenta uma boa imunogenicidade contra o HBV, cerca de 90% dos

indivíduos imunocompetentes, quando vacinados, desenvolvem uma adequada

resposta de anticorpos. Além disso, a vacina tem um potencial para reduzir as taxas

de incidência e mortalidade do hepatocarcinoma celular (Blumberg, 1997). O

esquema atualmente recomendado com as vacinas recombinantes disponíveis é de

3 doses por via intramuscular, no músculo deltóide, com intervalos de 1 mês (entre

1ª e 2ª dose) e de 5 meses (entre 2ª e 3ª dose) - esquema 0,1,6 meses (Assad &

Francis, 2000). No nosso país, a vacina está disponível nas unidades básicas de

saúde e em algumas maternidades. A recomendação do Ministério da Saúde

(Programa Nacional de Imunizações – PNI) é de vacinar todos os recém-nascidos,

de preferência nas primeiras doze horas de vida ou na ocasião da vacina BCG-ID.

Em todo o país, a vacina está disponível para os grupos de risco (indivíduos que se

expõem ao contato direto com sangue humano, seus derivados ou secreções

humanas) desde a década de 90 e, mais recentemente, foi estendida a indivíduos

com idade inferior ou igual a 19 anos (FUNASA, 2001). A eficácia protetora da

vacina é diretamente relacionada ao nível de anticorpos anti-HBs produzidos, sendo

considerado necessário para proteção, título igual ou maior que 10 mUI/ml (CDC,

1991).

A imunoprofilaxia através do uso de gamaglobulina hiperimune específica

(HBIG

.9 – Tratamento

O tratamento da hepatite B crônica visa suprimir a replicação viral e reduzir a

as têm sido utilizadas no tratamento da infecção

pelo H

) é utilizada para conferir proteção passiva imediata a indivíduos que tenham

sido expostos recentemente ao HBV, como por exemplo, após uma puntura

acidental, contato sexual com portador ou, durante o parto de neonatos em mães

HBsAg positivas (Perrillo et al., 1984).

lesão hepática, prevenindo a evolução para cirrose e carcinoma hepatocelular. São

considerados objetivos do tratamento: 1) soroconversão de HBeAg para anti-HBe; 2)

desaparecimento do DNA do vírus do soro; 3) normalização do nível de ALT; e 4)

melhora da histologia hepática.

Duas condutas terapêutic

BV: moduladores do sistema imune e agentes antivirais na forma de análogos

de nucleos(t)ídeos. Na primeira categoria, encontra-se o interferon alfa (IFN-α), que

foi a primeira droga licenciada pelo FDA ("Food and Drug Administration") para

utilização na terapêutica da hepatite B. O IFN apresenta-se na forma convencional

ou peguilada (peginterferon). O processo de peguilação, que consiste em ligar

covalentemente uma molécula de interferon a uma molécula de polietilenoglicol

(PEG), permite que o medicamento atue por mais tempo no organismo. Dessa

forma, a administração do IFN peguilado é feita uma única vez por semana,

enquanto que o IFN convencional é administrado três vezes por semana. A dose

recomendada de IFN em adultos é de 5 milhões de unidades (MU) por dia ou de 10

MU três vezes por semana, por via subcutânea, durante um período de 16 semanas.

Em crianças, recomenda-se 6 MU/m

, 3 vezes por semana durante 16 semanas.

Aproximadamente 20% dos pacientes HBeAg positivos tratados com IFN fazem a

soroconcersão para anti-HBe (Karayiannis, 2004). O tratamento com IFN apresenta

como vantagens uma curta duração do tratamento, ausência de resistência antiviral

e excelente duração e qualidade de resposta. Como desvantagens, têm-se

principalmente os efeitos colaterais, tais como, sintomas gripais e reações

hematológicas, neuropsiquiátricas, dermatológicas, endocrinológicas,

pneumológicas, oftalmológicas e cardio-vasculares (Fattovich et al., 1996).

A segunda categoria de agentes antivirais para o tratamento da hepatite B

crônic

o primeiro análogo de

nucleo

a são os análogos de nucleos(t)ídeos. Um total de quatro agentes são

atualmente licenciados: lamivudina (3TC), adefovir dipivoxil (ADV), entecavir (ETV),

e telbivudina (LdT). Além desses, o tenofovir disoproxil fumarato (TDF), que faz parte

da terapia antiretroviral altamente ativa (HAART) usada no tratamento da infecção

pelo HIV, tem também atividade contra o HBV. Estes agentes são bem tolerados

pelo organismo, entretanto a ocorrência de cepas mutantes de resistência tem sido o

principal fator limitante para a eficácia destas drogas. A Figura 4 mostra um

esquema das mutações localizadas na polimerase do HBV que levam à resistência

das cepas mutantes aos análogos de nucleos(t)ídeos.

A lamivudina (2’-3’-dideoxi-3’-thiacitidina) foi

sídeo licenciado em 1998 pelo FDA para uso no tratamento da hepatite B

crônica. A lamivudina também tem atividade contra o HIV e é um dos componentes

da HAART. A absorção da lamivudina após administração via oral é rápida, com

poucos efeitos colaterais e a droga é amplamente distribuída no organismo (Johnson

et al., 1999). A dose diária recomendada é de 100 mg por um período mínimo de 1

ano. Dados de ensaios clínicos têm mostrado uma taxa de soroconversão de HBeAg

para anti-HBe de 17% em 1 ano de tratamento a 27, 36 e 47% em 2, 3 e 4 anos,

respectivamente (Liaw et al., 2000; Karayiannis, 2004). A atividade antiviral dos

análogos de nucleosídeos incluindo a lamivudina encontra explicação pela

competição que esta droga faz aos outros nucleosídeos naturais para ligar-se ao

sítio ativo da polimerase viral. A lamivudina incorpora-se no DNA do vírus inibindo a

sua síntese, e consequentemente, a replicação viral. A principal desvantagem do

tratamento com lamivudina é o surgimento de cepas mutantes resistentes à droga. A

resistência à lamivudina ocorre em até 32% dos pacientes HBeAg positivos após 1

ano de tratamento, podendo chegar a até 70% após 5 anos (Karayiannis, 2004). A

mutação primária de resistência à lamivudina ocorre no códon 204 gerando uma

substituição de uma metionina para uma valina ou isoleucina (rtM204V/I) no motivo

Tyr-Met-Asp-Asp (YMDD) que é essencial para a atividade de transcrição reversa da

polimerase viral (Mutimer, 2001). Cepas contendo esta mutação apresentam uma

capacidade de replicação reduzida (Melegari et al., 1998). Mutações

compensatórias, tais como rtV173L e rtL180M, parcialmente restauram a capacidade

replicativa do mutante resistente à lamivudina (Delaney et al., 2003). Na terapia de

resgate em pacientes com resistência viral a lamivudina, a co-administração com

adefovir dipivoxil ou tenofovir tem sido indicada (Lok et al., 2007).

Figura 4: Fase de Leitura da Polimerase do HBV Mostrando os Domínios

.10 – Características Biológicas do Vírus da Hepatite B

O HBV apresenta um mecanismo único entre os vírus que infectam o homem,

Conservados e a Localização das Mutações de Resistência aos Análogos de

Nucleos(t)ídeos. LAM, lamivudina; ADV, adefovir dipivoxil; ETV, entecavir; LdT,

telbivudina

(Fonte: Lok et al., 2007 - Figura adaptada para o português).

o qual permite a produção de diferentes tipos de partículas virais. Em preparações

para a microscopia eletrônica de soro de indivíduos infectados, três formas de

partículas são observadas: partículas completas infecciosas, partículas incompletas

não infecciosas esféricas e partículas incompletas não infecciosas filamentosas

Proteína

Terminal

Região

Espaçadora

Polimerase/

Transcriptase Reversa

Resistência LAM

Resistência ADV

Resistência ETV

rtL80V/I rtV173L rtM204V/I/S

rtL180M rtA181T

rtA181T/V rtN236T

rtI169T rtL180M rtS202G/I rtM204V rtM250V

rtT184S/A/I/L/F/G

rtM204I

Resistência Ldt

(Figura 5-A). A concentração da partícula viral completa, também chamada partícula

de Dane, em soro de pessoas infectadas, pode ultrapassar a 10

partículas/ml, e

possui uma densidade de flutuação de 1,22 g/cm

em gradiente de equilíbrio de

cloreto de césio. As partículas incompletas são compostas exclusivamente de

HBsAg e são encontradas em excesso (em torno de 10

por ml) no soro de

indivíduos infectados.

Ambas as partículas subvirais (esféricas e filamentosas),

apresentam um diâmetro de 22 nm, sendo as filamentosas de comprimento variável.

Estas partículas apresentam uma densidade de aproximadamente 1,18 g/cm

cloreto de césio. As partículas virais infecciosas são esféricas com diâmetro de

aproximadamente 42 nm. Estes vírions apresentam um envelope lipídico externo,

composto pelas proteínas S (“small”), M (“middle”) e L (“large”), o qual constitui o

antígeno de superfície do HBV (HBsAg). O nucleocapsídeo possui simetria

icosaédrica e é constituído pela proteína do core (HBcAg) e pelo genoma viral

(Tiollais et al., 1985) (Figura 5-B).

“Large”

“Small”

“Middle”

Core

Genoma

Polimerase

Figura 5: A – Micrografia eletrônica mostrando as partículas completas e subvirais

do HBV. Disponível em <http://web.uct.ac.za/depts/mmi/stannard/hepb.html> [acesso em 10 abril 2008].

B – Estrutura do vírion. Disponível em <http://www.globalserve.net/~harlequin/HBV/hbvparts.htm>

[acesso em 11 nov. 2002] (Figura adaptada para o português).

O HBV não se replica em linhagens celulares, sendo necessária a utilização

de células primárias humanas. Porém, a indisponibilidade de tais culturas dificulta o

cultivo do HBV (Galle et al., 1994). Algumas linhagens humanas de hepatomas, tais

como, HepG2, HuH6 e HuH7, são permissivas a replicação do HBV somente quando

Partículas

Subvirais

Partícula

Completa

transfectadas com o genoma viral clonado (Tsurimoto et al., 1987; Sells et al., 1988).

Recentemente, foi desenvolvida uma linhagem celular de hepatoma humano,

denominada HepaRG, que é suscetível à infecção pelo HBV (Gripon et al., 2002).

Entretanto, o cultivo desta linhagem celular é ainda bastante laborioso.

A utilização de modelos animais em infecções experimentais é restrita, uma

vez q

.11 – Organização Genômica

O genoma do HBV é um dos menores entre os vírus que infectam o homem,

é totalmente codificante e apresenta quatro fases de

ue o HBV infecta, além do homem, apenas primatas não humanos. A

imunogenicidade e antigenicidade são mantidas em pH 2,4 por 6 horas ou a 98°C

por 1 minuto ou 60°C por 10 horas. A infecciosidade do HBV, após estocagem a 30 -

32°C por seis meses ou a –20ºC por quinze anos, também é conservada. Entretanto,

a exposição do HBsAg ao hipoclorito de sódio na concentração de 0,25% por 3

minutos destrói a antigenicidade do vírus e provavelmente a infecciosidade. Outros

agentes como álcool isopropílico, álcool etílico ou combinações desses, inativam o

HBV. Além disso, a exposição direta à ebulição por 2 minutos e autoclavação em

121°C por 20 minutos, pode inativar os vírions em amostras de soro (Bond et al.,

1983; Hollinger, 1996).

abrangendo aproximadamente 3.200 pares de bases (pb). É composto por uma

molécula de DNA circular parcialmente fita dupla. A fita maior é complementar aos

RNAs virais e por convenção possui polaridade negativa (fita negativa). Nesta fita

existe uma proteína covalentemente ligada à sua extremidade 5’ (Gerlish &

Robinson, 1980). Na fita de polaridade positiva, a posição da extremidade 5’ terminal

é fixa, enquanto que a posição da extremidade 3’ terminal é variável. Desta forma, o

comprimento da fita positiva é variável, correspondendo entre 50 a 90% do

comprimento da fita complementar (Figura 6). Próxima às extremidades 5’ de ambas

as fitas, há duas pequenas seqüências de 11 nucleotídeos, que são diretamente

repetidas e chamadas de “direct repeats” (DR1 e DR2). Estas seqüências são

importantes para a inicialização da replicação do HBV (Seeger et al., 1986, Lien et

al., 1987, Will et al., 1987).

O genoma do HBV

leitura aberta designadas de pre-S/S, pre-C/C, P e X (Figura 6). Através de um

engenhoso sistema que sobrepõe as fases de leitura aberta, todos os genes do vírus

estão intimamente ligados e o HBV pode produzir aproximadamente 50% mais

proteínas do que o esperado para o tamanho do seu genoma (Ganem & Varmus,

1987). A região genômica pre-S/S codifica as proteínas de superfície viral que

compõem o HBsAg; pre-C/C é responsável pela síntese do HBcAg e do antígeno e

(HBeAg); o gene P codifica a polimerase viral; a região X sintetiza uma proteína

regulatória, chamada de proteína X (HBxAg). A numeração dos pares de bases do

genoma do HBV mais comumente utilizada, se inicia a partir de um sítio único para a

enzima de restrição EcoRI, localizado na região pre-S2 ou em sítios homólogos,

caso o sítio EcoRI esteja ausente.

Figura 6: Modelo Esquemático do Genoma do HBV. O esquema mostra as quatro

.11.1 – A Fase de Leitura Aberta Pre-S/S

O gene pre-S/S, inclui as regiões pre-S1, pre-S2 e S, com três códons de

iniciaç

fases de leitura aberta pre-S/S, pre-C/C, P e X, e as respectivas coordenadas do

início e final de cada região; os pontilhados indicam a região do genoma que possui

fita simples (Fonte: Gomes, 2003).

ão na mesma fase de leitura. A proteína de maior tamanho, L “large“ (400 aa),

é codificada a partir do códon de iniciação localizado no começo da região pre-S1, e

a síntese desta proteína se estende pelas regiões pre-S1, pre-S2 e S. A proteína de

tamanho intermediário, M “middle” (281 aa), é codificada pelas regiões pre-S2 e S,

enquanto que a proteína de menor tamanho, S “small” (226 aa) é sintetizada a partir

do terceiro códon de iniciação localizado no início da região S. Todas estas

proteínas possuem o mesmo códon de terminação localizado no final da região S.

Estas proteínas são encontradas nas formas glicosiladas e não glicosiladas, sendo

que a proteína M pode se apresentar diglicosilada (Seeger & Mason, 2000).

Os três tipos de proteínas não são distribuídos uniformemente entre as

diferen

proteína M também atua como elemento de ligação para a adsorção do

HBV.

g, é capaz de

induzir

.11.2 – A Fase de Leitura Aberta da Polimerase (P)

O gene P cobre aproximadamente 3/4 do genoma e codifica uma enzima de

832 am

tes formas de partículas virais (Heermann et al., 1984). Partículas subvirais de

22 nm são compostas predominantemente por proteínas S, apresentando

quantidades variáveis de proteína M e poucas cadeias L. Entretanto, as partículas

completas (vírions) são enriquecidas de proteínas L. Uma vez que sabe-se que as

proteínas L contém os sítios de ligação do HBV aos receptores específicos nos

hepatócitos (Neurath et al., 1986; Klingmuller & Schaller 1993), este enriquecimento

de proteínas L poderia prevenir as partículas subvirais, que são mais numerosas, de

competir com os vírions pelos receptores presentes na superfície celular (Ganem,

1996).

Esta proteína possui uma região de ligação com a albumina sérica humana e

esta ligação permite que o HBV penetre via receptores celulares de albumina no

citoplasma do hepatócito (Thung & Gerber, 1984; Dash et al., 1991).

A proteína S, que é a principal proteína que forma o HBsA

resposta imunológia protetora (anti-HBs) contra o HBV, e é o antígeno

utilizado na formulação de vacinas (Grob, 1998). Mutações em epítopos específicos,

ocorrendo dentro do gene S, podem interferir na proteção vacinal, na análise de

resultados sorológicos, bem como prejudicar a terapia baseada na utilização de

anticorpos específicos para suprimir a infecção em indivíduos transplantados (Blum,

1993; Wallace & Carman, 1994).

inoácidos, com atividade de DNA polimerase, transcriptase reversa e RNAse

H. A fase de leitura aberta do gene P está decalada de dois nucleotídeos em relação

a fase de leitura pre-S/S. Existem quatro domínios na polimerase viral: o domínio

amino-terminal, que atua como proteína terminal ou primase, necessário para o

início da síntese da fita de DNA de polaridade negativa; uma região chamada de

“espaçadora”, que parece não ter nenhuma função em particular; o domínio de

transcriptase reversa; e o domínio C-terminal que exibe atividade de RNAse H.

Existe homologia entre a polimerase viral e outras transcriptases reversas, em

particular estas enzimas compartilham o motivo Tyr-Met-Asp-Asp (YMDD) que é

essencial para a atividade de transcrição reversa (Toh et al., 1983). Pacientes

submetidos à terapia com drogas antivirais, como a lamivudina, podem apresentar

mutações no motivo YMDD que causam resistência à droga (François et al., 2001).

1.11.3 – A Fase de Leitura Aberta Pre-C/C

A região pre-C/C possui dois códons de iniciação na mesma fase de leitura

aberta

polipeptídeo de 185 aminoácidos. O

o descritas por vários autores

. O HBeAg é traduzido a partir do único códon de iniciação da região pre-C.

Inicialmente, é produzido um polipeptídeo precursor de 214 aminoácidos

compreendendo os 29 aminoácidos da região pre-C e os demais aminoácidos do

gene C. O produto é então translocado para o retículo endoplasmático rugoso onde

é clivado nas duas extremidades, resultando na formação do HBeAg com 159

aminoácidos. O HBeAg é então secretado na circulação sanguínea, usualmente

ligado a proteínas do soro, sendo um indicador de replicação viral (Garcia et al.,

1988; Nassal & Rieger, 1993). A correlação entre a expressão do HBeAg e o

estabelecimento da infecção crônica em crianças de mães portadoras do HBV,

demonstra que este antígeno tem uma provável função de induzir tolerância

imunológica, uma vez que é capaz de atravessar a placenta e atingir a circulação

sanguínea do feto (Milichi et al., 1990).

O HBcAg corresponde a um

nucleocapsídeo viral é formado por 180 monômeros desta proteína que

espontâneamente se ligam para formar uma partícula icosaédrica (Nassal &

Schaller, 1996). O HBcAg é ainda capaz de induzir a produção de anticorpos (anti-

HBc) independentemente de células T, tanto na infecção natural pelo HBV quanto

em animais imunizados (Milich & Mclachlam, 1986).

Diversas mutações na região pre-C/C têm sid

(Carman et al., 1989; Fiordalisi et al., 1990; Maruyama et al., 2000; de Castro et al.,

2001). Uma das mutações mais freqüentes é a troca de uma guanina, no

nucleotídeo 1896, por uma adenina, alterando o códon 28 da proteína HBeAg,

inicialmente UGG, em um códon de terminação (UAG) para a tradução protéica.

Com a presença do códon de terminação, a expressão do HBeAg é interrompida. A

ocorrência desta mutação depende da presença de uma uracila no nucleotídeo

1858, o qual vai parear com o nucleotídeo 1896 na estrutura ε do sinal de

encapsidação do RNA pré-genômico. Os genótipos B, C, D e E apresentam uma

uracila nesta posição, explicando assim, a alta prevalência de mutantes A1896 na

Ásia e no Mediterrâneo onde os três primeiros genótipos são encontrados. A

infecção pelo HBV mutante na região do pre-core, incapaz de secretar HBeAg, tem

sido associada com hepatite fulminante (Sato et al., 1995), hepatite crônica severa

(Brunetto et al., 1989) e também tem sido descrita em pacientes assintomáticos

(Okamoto et al., 1990).

1.11.4 – A Fase de Leitura Aberta X

O gene X é a menor região genômica do HBV e é responsável pela síntese da

pesar da determinação dos sítios de integração do genoma do HBV no

proteína HBxAg de 154 aminoácidos. Este gene está presente somente nos vírus do

gênero Orthohepadnavirus. A função exata desta proteína na infecção pelo HBV

ainda não foi completamente definida. Porém, sabe-se que o HBxAg estimula a

replicação e a expressão de genes virais, o que pode ser importante para o

estabelecimento e manutenção do estado de portador crônico (Feitelson & Duan,

1997).

genoma do hospedeiro pareça ser aleatória, existem regiões de preferência dentro

do genoma viral. Durante a replicação do HBV, a origem de replicação para cada fita

de DNA consiste em uma seqüência de 11 pares de bases repetidas e invertidas

(“direct repeats”) (Dejean et al., 1984). Uma vez que estas seqüências estão

sobrepostas ao gene X, este gene se torna a seqüência mais freqüentemente

integrada ao genoma do hepatócito. A maioria dos tumores primários apresentam

produtos de RNA do gene X, e apenas poucos apresentam RNAs de outras regiões

genômicas do HBV. (Diamantis et al., 1992; Paterlini et al., 1995). Muitos desses

fragmentos integrados codificam HBxAg que atua como trans-ativador de promotor

tanto in vitro (Wollersheim et al., 1988) como in vivo (Balsano et al., 1994). Além

disso, a proteína X pode interferir na atividade da p53, uma proteína supressora de

tumor e ativadora da apoptose celular. Estas propriedades parecem contribuir para o

desenvolvimento de cirrose e carcinoma hepatocelular em portadores crônicos do

HBV (Feitelson et al., 1993; Truant et al., 1995).

1.12 – Replicação Viral

O sítio primário de replicação do HBV é a célula hepática, embora não se

tenha ainda informações detalhadas sobre os mecanismos de adsorção e

penetração do HBV nesta célula. Muitos estudos têm sido realizados sobre os

componentes do envelope viral e o seu envolvimento nas interações com a célula

hospedeira. Para o HBV, há muitas evidências que indicam que as proteínas L, M e

S participam da ligação a receptores celulares. Anticorpos contra epítopos

codificados pela região pre-S1, bloqueiam a adsorção de partículas do HBV a

frações de membrana plasmática de hepatócitos humanos e a células HepG2

(Neurath et al., 1986; Pontisso et al., 1989).

A Figura 7 apresenta as principais etapas do ciclo replicativo do HBV. Após

adsorção, o nucleocapsídeo viral penetra no hepatócito e libera o DNA do HBV no

núcleo da célula hospedeira. Primeiramente, o DNA viral é convertido na forma

circular dupla fita covalentemente ligada (cccDNA). Para isto, a fita positiva é

completada pela DNA polimerase celular. A RNA polimerase II celular transcreve o

genoma do HBV a partir da forma cccDNA em RNAs genômicos e subgenômicos.

Todos os produtos de transcrição são capeados na extremidade 5’ e compartilham o

mesmo sinal de poliadenilação (AATAAA) na extremidade 3’.

Ao longo de todo o genoma viral, existem quatro promotores (pre-S1, pre-S2,

pre-C/C e X) e dois elementos “enhancer” (EnhI e EnhII). O promotor pre-C/C

controla a transcrição de diferentes RNAs de tamanho em torno de 3,5 kb, que

possuem heterogeneidade na extremidade 5’. Entre estes RNAs, o chamado de

RNA pré-genômico (pgRNA) é o molde para a síntese do DNA genômico, através de

um complexo sistema de transcrição reversa. O pgRNA serve também de molde

para a síntese da proteína do core e da polimerase viral. Os RNAs de 3,5 kb com

extremidade 5’ localizada acima do códon de iniciação da região pre-C, moldam a

síntese do HBeAg.

No caso das proteínas de envelope que compõem o HBsAg, são conhecidos

dois promotores, promotor pre-S1 e promotor pre-S2/S. O promotor pre-S1 controla

a transcrição de um único RNA subgenômico de 2,4 kb, que perfaz toda a região

pre-S/S e é o único RNA mensageiro para a proteína “large”. O promotor pre-S2/S

controla uma família de RNAs subgenômicos de 2,1 kb possuindo

microheterogeneidade da extremidade 5’, de modo que um destes transcritos se

inicia imediatamente antes do AUG da região pre-S2 e os demais após este códon

de iniciação. Desta forma, um dos transcritos de 2,1 kb origina a proteína “middle”,

enquanto os demais RNAs mensageiros de 2,1 kb originam a proteína “small”.

O promotor X controla a transcrição de um RNA subgenômico de 0,9 kb que é

traduzido na proteína HBxAg.

Após a tradução dos RNAs no citoplasma, o pgRNA é encapsidado

juntamente com a polimerase viral. Acredita-se que o empacotamento do pgRNA

dependa da interação entre a polimerase, proteínas do core e o sinal de

encapsidação (ε), localizado na extremidade 5’ do pgRNA (Bartenschlager &

Schaller, 1992). No interior do nucleocapsídeo ocorre a transcrição reversa do

pgRNA em DNA. Inicialmente é sintetizada a fita de DNA de polaridade negativa.

Paralelamente, a atividade de RNAse H da polimerase viral degrada o molde de

RNA. Com o término da polimerização da fita negativa, inicia-se a síntese da fita de

polaridade positiva, a qual não é formada completamente. Uma vez que a síntese da

fita positiva começa, o nucleocapsídeo adquire o envelope lipoprotéico viral. Este

processo ocorre no retículo endoplasmático rugoso, seguindo depois no complexo

de Golgi, onde finalmente os vírions são secretados (Figura 7) (Ganem, 1996).

Figura 7: Modelo esquemático do ciclo replicativo do HBV (Fonte: Ganem & Prince, 2004

- Figura adaptada para o português)

1.13 – Variabilidade do HBV

1.13.1 – Subtipos do HBV

Os primeiros relatos de variabilidade do HBV vieram de Le Bouvier (1971),

que descreveu dois determinantes antigênicos mutuamente exclusivos, d e y. Estes

determinantes residem na proteína de superfície do vírus, juntamente com o

principal determinante antigênico a, localizado entre os aminoácidos 124 a 147 da

região S (Levene & Blumberg, 1969). Dois determinantes adicionais, w e r, foram

descritos por Bancroft e colaboradores (1972), que observaram que cada cepa de

HBV poderia ser caracterizada como pertencendo a um dos subtipos adw, adr, ayw

ou ayr. Em um amplo estudo, subtipos adicionais foram caracterizados por

Couroucé-Pauty e colaboradores (1983). Os dez subtipos descritos foram ayw1,

ayw2, ayw3, ayw4, ayr, adw2, adw3, adw4, adrq– e adrq+ (Tabela 1). Através de

técnicas moleculares, foi possível demonstrar que substituições de aminoácidos

(lisina por arginina) nas posições 122 e 160 da proteína S estão associadas às

variações alélicas “d/y” e “w/r”, respectivamente, enquanto que no resíduo 127, estão

relacionadas as subespecificidades do subdeterminante w, sendo prolina (w1/w2),

treonina (w3) ou leucina (w4) (Okamoto et al., 1987a; Norder et al., 1992a). Os

demais determinantes têm sido mapeados em aminoácidos localizados nas posições

134, 159, 177 e 178 (Okamoto et al., 1989; Norder et al., 1992a) (Tabela 1). A

subtipagem de cepas do HBV pode ser utilizada para estudos epidemiológicos e, em

alguns casos, para verificar a possibilidade de infecção nosocomial.

Tabela 1: Subtipos do HBV e seus correspondes aminoácidos no HBsAg (Fonte:

Adaptado de Kay & Zoulim, 2007).

Subtipo Aminoácidos HBsAg

ayw1

122R+160K+127P+(134F e/ou 159A)

ayw2

122R+160K+127P

ayw3

122R+160K+127T

ayw4

122R+160K+127L

Ayr

122R+160R

adw2

122K+160K+127P

adw3

122K+160K+127T

adw4q-

122K+160K+127L+178Q

adrq+

122K+160R+177V+178P

adrq-

122K+160R+177ª

1.13.2 – Genótipos do HBV

Em 1988, Okamoto e colaboradores sugeriram que os subtipos tradicionais

poderiam ser complementados ou substituídos por uma classificação de cepas do

HBV em subgrupos genéticos. Um total de 18 seqüências completas de HBV,

incluindo três genomas de origem asiática do subtipo adw clonadas neste estudo,

bem como quinze seqüências oriundas de diferentes países (seis adw, quatro adr,

quatro ayw, e um ayr) foram analisadas. Através da comparação da seqüência

nucleotídica, observou-se que estas seqüências se agrupavam em quatro grupos,

denominados de A a D, com mais de 8% de divergência intergenotípica. Esta

porcentagem de divergência na seqüência nucleotídica passou a ser utilizada para

distinguir os genótipos. Comparações de seqüências do gene S foram feitas por

Norder e colaboradores (1992b) e mais outros dois genótipos (E e F) foram

descritos. Em um amplo estudo, eles compararam seqüências da região S de 122

cepas e confirmaram a existência destes dois novos genótipos (Norder et al., 1993).

Neste mesmo ano, Naumann e colaboradores (1993), descreveram uma cepa do

Brasil bastante divergente das demais cepas, com relação à seqüência genômica

(15%). Esta cepa expressava o subtipo adw4, e pertencia ao genótipo F. Ela tem

sido freqüentemente utilizada como um grupo externo em estudos filogenéticos do

HBV, uma vez que o genótipo F é o mais divergente entre os já relatados em

humanos. Um novo genótipo, designado G, foi descrito em 2000 em um estudo com

doadores de sangue na França e nos Estados Unidos (Stuyver et al., 2000). Mais

recentemente, um estudo evidenciou um novo subgrupo de isolados muito

relacionado filogeneticamente ao genótipo F que foi denominado como genótipo H

(Arauz-Ruiz et al., 2002).

Não há uma correlação direta entre os genótipos e subtipos, pois alguns

subtipos podem ser encontrados em mais de um genótipo diferente. É o caso do

subtipo adw2, que é encontrado nos genótipos A, B, C e G, e o subtipo ayw1, que é

encontrado nos genótipos A e B. O subtipo adw4, que, até recentemente, era

exclusivo do genótipo F, foi observado, através da análise de aminoácidos da região

S, em cepas pertencentes ao genótipo H.

Os genótipos do HBV apresentam diferentes tamanhos de genoma. As cepas

dos genótipos B, C, F e H possuem um genoma de 3.215 pb. Os isolados do

genótipo D possuem um genoma de 3.182 pb devido a uma deleção de 33

nucleotídeos na região pre-S1. Os genótipos E e G, cujos genomas correspondem a

3.212 pb e 3.248 pb, respectivamente, possuem uma deleção de três nucleotídeos

no gene da polimerase. Além disso, o genótipo G apresenta uma inserção de 36

nucleotídeos na porção N-terminal do gene do core, fazendo com que este seja o

maior genoma dentre os isolados de HBV (Stuyver et al., 2000). O genótipo A varia

dos demais genótipos por uma inserção de seis nucleotídeos na porção N-terminal

do gene da polimerase (inserção que afeta também o gene do core sobreposto).

Devido a uma grande diversidade intra-genotípica, alguns genótipos foram

mais recentemente divididos em subgenótipos. Foi o caso dos genótipos A

(subgenótipos A1, A2 e A3) (Bowyer et al., 1997; Kramvis et al., 2002, Kurbanov et

al., 2005), B (B1, B2, B3 e B4) (Sugauchi et al., 2004a), C (C1, C2 e C3) (Huy et al.,

2004), D (D1, D2, D3 e D4) (Norder et al., 2004) e F (F1a, F1b, F2, F3, F4) (Devesa

et al., 2004).

Os genótipos do HBV apresentam uma distribuição geográfica característica

nas diferentes regiões do mundo (Figura 8). Os genótipos A e D são bastante

difundidos no mundo, embora o genótipo D seja relativamente raro no Norte da

Europa e EUA. Pouco se sabe sobre a distribuição do genótipo G, tendo sido este já

encontrado na Europa, EUA e no Japão. Os genótipos B e C são encontrados

essencialmente na Ásia. O genótipo E é encontrado na África subsaariana e em

casos raros, na França e Grã-Bretanha, devido provavelmente à imigração. O

genótipo F é encontrado principalmente nas Américas do Sul e Central, sendo

originário das populações ameríndias. O genótipo H é encontrado na América

Central e no Sul dos EUA. Os subgenótipos do HBV também apresentam uma

distribuição global diferenciada. O subgenótipo A1 (ou Aa) é encontrado

principalmente na África e Ásia enquanto que o subgenótipo A2 (ou Ae) se encontra

distribuído pela Europa e América do Norte (Sugauchi et al., 2004b). Já o

subgenótipo B1 (Bj) é encontrado somente no Japão e B2 (Ba) está distribuído no

restante da Ásia (Sugauchi et al., 2004a). A Tabela 2 apresenta a correlação entre

os genótipos, subgenótipos, subtipos e as regiões geográficas onde estes grupos

são encontrados.

; D

F; H

A; D

B; C; D

D; A

Figura 8: Distribuição Global dos Genótipos e Subgenótipos do HBV.

Disponível em

<http://web.ucsf.edu/sfhbc/elective/2005/fall/Virology_Bass.ppt> [acesso em 21 junho 2008].

Tabela 2: Características dos Genótipos do HBV (Fonte: Adaptado de Kay & Zoulim, 2007).

Genótipo Subgenótipo Subtipo Distribuição Geográfica Genoma (pb)

A A1 (Aa)

adw2, ayw1

África, Ásia, Brasil 3221

A2 (Ae)

adw2, ayw1

Norte da Europa e EUA

B B1 (Bj)

Adw2

Japão 3215

B2 (Ba)

adw2, adw3

Ásia

adw2, ayw1

Indonésia, China

ayw1, adw2

Vietnam, Cambodia

C C1

adrq+, ayr, adw2, ayw1

Leste Asiático 3215

adrq+, ayr

Leste Asiático

adrq-, adrq+

Ilhas do Pacífico

D D1

ayw2, adw1, ayw1

Europa, Egito, Índia, Ásia 3182

ayw3, ayw1

Europe, Japão

ayw3, ayw2, ayw4

Europa, Ásia, África do Sul, EUA

ayw2, ayw3

Austrália, Japão, Nova Guiné

ayw4, ayw2

África subsaariana, Reino Unido, França 3212

F FIa

adw4, ayw4

América Central 3215

FIb

Adw4

Argentina, Japão, Venezuela, EUA

FII

Adw4

Brasil, Venezuela, Nicarágua

FIII

Adw4

Venezuela, Panamá, Colômbia

FIV

Adw4

Argentina, Bolívia, França

Adw2

EUA, Alemanha, Japão, França 3248

Adw4

EUA, Japão, Nicarágua 3215

No Brasil, um país com dimensões continentais e com uma população

altamente miscigenada, os genótipos mais prevalentes são A, D e F (Moraes et al.,

1996; Teles et al., 1999; de Castro et al., 2001; Araujo et al., 2004). Recentemente,

Mello e colaboradores analisaram amostras de soro HBsAg positivas de 303

doadores de sangue das cinco regiões geográficas do Brasil (Mello et al., 2007).

Este estudo mostrou uma maior prevalência no país do genótipo A (48,5%), com um

predomínio do subgenótipo de origem africana A1 (138/153; 90.2%), corroborando

os resultados obtidos em um estudo anterior (Araujo et al., 2004) (Figura 9).

A presença destes três genótipos é um reflexo da formação da população

brasileira. O subgenótipo de origem africana A1, foi provavelmente introduzido no

Brasil através do tráfico de escravos africanos, ocorrido entre os séculos XVI e XIX.

A alta prevalência do genótipo D no Sul do Brasil, bem como a presença do

subgenótipo de origem européia A2, podem ser relacionados ao fluxo de imigrantes

europeus, provenientes principalmente da Itália e Alemanha, ocorrido no início do

século XX. Por fim, o genótipo F, característico das populações ameríndias, seria

originário da população nativa do Brasil [Mello et al., 2007].

Genótipo

Genótipo D

Genótipo F

Figura 9: Distribuição dos Genótipos do HBV nas Cinco Regiões do Brasil

(Fonte:

Mello et al., 2007- Figura adaptada para o português)

1.14 – A Proteína S do HBsAg

1.14.1 – Estrutura da Proteína S do HBsAg

A proteína S é uma glicoproteína de 226 aminoácidos e é o principal

componente do HBsAg. Ela se encontra ancorada à membrana do retículo

endoplasmático, provavelmente através de quatro segmentos transmembrânicos

(Figura 10). O primeiro segmento (TM1), localizado na porção amino-terminal da

proteína (resíduos 4 a 24), é seguido por (i) um “loop” citosólico (resíduos 24 a 80)

englobando um epítopo para células T (Chisari & Ferrari, 1995), (ii) o segmento TM2

(resíduos 81 a 100), e (iii) um “loop” antigênico (resíduos 101 a 164), voltado para o

lúmen do retículo endoplasmático, que contém o principal epítopo para células B,

denominado determinante a (resíduos 124 à 147) (Gavilanes et al., 1982). A

topologia da porção carboxi-terminal da proteína S (resíduos 165 a 226) não é ainda

precisamente conhecida. Acredita-se que este domínio possua dos segmentos

transmembrânicos (TM3 e TM4) localizados nas posições 173 a 193 e 202 a 222,

respectivamente, sendo separados por um segundo “loop” citosólico (resíduos 194 a

201) (Persson & Argos, 1994).

C I

100

110

120

130

140

150

160

170

180

190

200

210

220

226

COOH

TM1

TM2

TM3

TM4

Lúmen

Membrana

Citoplasma

Figura 10: Esquema da estrutura do HBsAg. Os aminoácidos marcados em cinza

correspondem ao determinante antigênico a. (Fonte: Jeantet et al., 2002 - Figura adaptada

para o português)

1.14.2 – Variabilidade Genética da Proteína S do HBsAg

O primeiro estudo com o objetivo de estimar a taxa de mutação do HBV foi

realizado por Okamoto e colaboradores (1987b). Através da comparação de

diferentes clones isolados do soro de uma mulher de 54 anos, infectada pela via de

transmissão vertical, a taxa de mutação do HBV foi estimada entre 1,4 e 3,2 x 10

-5

substituições por sítio/ano. Esta taxa de mutação é mais alta do que em vírus de

DNA e mais próxima a certos vírus de RNA.

A taxa de substituições in vivo depende de vários fatores, relativos ao HBV

(genoma compacto e replicação por transcrição reversa), ao seu hospedeiro

(resposta imune) e a fatores externos (tratamentos antivirais) (Kidd-Ljunggren et al.,

2002). O genoma compacto do HBV, onde as quatro fases de leitura estão

parcialmente sobrepostas, restringe o número de mutações que ocorrem

naturalmente durante a replicação viral. A ocorrência de uma mutação em uma

determinada fase de leitura, por exemplo, na pre-S/S, pode gerar uma mutação na

fase de leitura sobreposta, no caso o gene da polimerase, que poderá afetar a

viabilidade da replicação viral (Chen & Oon, 1999). Por um outro lado, a estratégia

de replicação através de transcrição reversa, utilizando-se uma RNA polimerase que

não possui atividade de reparação de erro (“proof reading”), como as DNA

polimerases, contribui para um aumento nas taxas de mutação do genoma do HBV.

As vacinas contra o HBV disponíveis são compostas exclusivamente de

HBsAg recombinante. O HBsAg possui uma região antigênica denominada

determinante a (resíduos 124 a 147), que tem a capacidade de induzir resposta

imunológica protetora contra o HBV, e contra a qual os anticorpos neutralizantes são

direcionados. Além disso, o determinante a é o principal alvo dos testes de detecção

para o HBsAg.

Algumas variações específicas de aminoácidos dentro ou próximas desta

região do HBsAg estão associadas aos genótipos do HBV. A influência dos

diferentes genótipos na sensibilidade de ensaios sorológicos de detecção do HBsAg

tem sido pouco investigada, sobretudo com respeito ao genótipo F, o qual é

encontrado somente nas Américas do Sul e Central. Entretanto, dados mostrando

uma influência dos diferentes genótipos na sensibilidade dos ensaios de detecção

do HBsAg, têm sido relatados (Weber, 2005).

Mutações não relacionadas aos genótipos na região do determinante a

podem resultar em alterações na antigenicidade do HBsAg, dificultando o

reconhecimento de tais mutantes pelos anticorpos neutralizantes (anti-HBs). Em um

estudo realizado por Oon e colaboradores (1995) em Singapura, foram identificadas

mutações em várias posições do determinante antigênico a do HBsAg, em 41

crianças infectadas pelo HBV, que tinham sido vacinadas previamente para o HBV.

Estas mutações incluem a G145R (primeira mutação descrita de escape da vacina –

Carman et al., 1990), D144A, M133L, Q129H e I/T126A. Estas mutações resultam

em uma mudança de antigênicidade do HBsAg, diminuindo a afinidade deste

antígeno ao anticorpo neutralizante anti-HBs. A emergência de cepas mutantes de

escape à vacina também foi confirmada no Japão (Miyake et al., 1996), China (He et

al., 1998), Espanha (Wallace et al., 1994), Gâmbia (Fortuin et al., 1994) e Alemanha

(Zuckerman et al., 1994).

Por um outro lado, algumas mutações de aminoácidos na proteína S têm sido

relacionadas à inibição ou diminuição da secreção de vírions (G145R, Kalinina et al.,

2003), de partículas incompletas de HBsAg (R79K, Blanchet and Sureau, 2006) ou

de ambos (L77R, Chua et al., 2005; R169P, Khan et al., 2004). Resíduos de cisteína

localizados nas posições 48, 65, 69 e 107 do HBsAg têm sido descritas como

essenciais para a secreção de partículas incompletas de HBsAg (Mangold &

Streeck, 1993). Além disso, Jenna & Sureau (1999) mostraram que deleções na

porção carboxi-terminal do HBsAg também geram uma inibição da secreção dessas

partículas.

1.14.3 – Hepatite B Oculta

O desenvolvimento de ensaios de PCR mais sensíveis tem permitido a

detecção do DNA do HBV no soro e/ou fígado de pacientes negativos para o HBsAg.

A detecção do DNA do HBV em pacientes com sorologia negativa para o HBsAg

caracteriza a ocorrência de infecção oculta pelo HBV (Hu et al., 2002). A hepatite B

oculta é um tema que preocupa pesquisadores do mundo inteiro. Este tipo de

infecção é freqüentemente observado em pacientes de hemodiálise e pacientes

infectados pelo HCV (Torbenson & Thomas, 2002). Muitas questões são levantadas,

como o impacto clínico da infecção oculta e o impacto da infecção oculta na

transmissão do vírus. A possibilidade de contaminação e disseminação destes vírus

causadores de infecções ocultas não pode ser desprezada. As seguintes causas

para a falta de detecção do HBsAg podem ser: a) Ocorrência de baixos níveis de

replicação do vírus ocasionando produção insuficiente de HBsAg para a detecção

em ensaios sorológicos; b) Presença de mutações que possam diminuir a afinidade

do HBsAg pelos testes comerciais de diagnóstico; c) Possível inibição da secreção

do HBsAg em cultura de células e a identificação de mutações que possam ser

responsáveis por esta retenção intracelular do antígeno (Carman, 1997; Kalinina et

al., 2003; Jeantet et al., 2004).

Por terem as mesmas vias de transmissão, a co-infecção HBV/HIV é comum.

Evidência sorológica de infecção presente ou passada pelo HBV é encontrada em

até 90% dos indivíduos infectados pelo HIV e cerca de 10% destes pacientes estão

cronicamente infectados pelo HBV (Twu et al., 1993; Thio & Locarnini, 2007). A co-

infecção com o HIV resulta em uma considerável modificação da história natural da

infecção pelo HBV, principalmente através do impacto que esta infecção causa ao

sitema imune. A co-infecção HIV/HBV está associada com o aumento da taxa de

cronicidade da hepatite B, com altos níveis de replicação do HBV, uma baixa taxa de

soroconversão para anti-HBe e anti-HBs e com níveis mais baixos de ALT. A

atividade necro-inflamatória nestes pacientes é mais baixa, entretanto, a progressão

para cirrose é mais rápida e a mortalidade relacionada à doença hepática é mais alta

do que na monoinfecção pelo HBV (Puoti et al., 2006; Thio & Locarnini, 2007). Além

disso, três medicamentos que fazem parte da HAART (lamivudina, tenofovir e

emtricitabina) são potentes inibidores da replicação do HBV.

Os dados sobre a hepatite B oculta em pacientes HIV positivos são bastante

divergentes, com relatos de prevalência variando de 0 a 89% (Hofer et al., 1998;

Núñez et al., 2002; Nebbia et al., 2007). Diferenças na composição das populações

estudadas, bem como na sensibilidade dos ensaios utilizados, podem ser a razão

para tal divergência nos valores. Estudos realizados no Brasil, mostraram uma

prevalência de infecção oculta em pacientes infectados pelo HIV e com sorologia

positiva para anti-HBc de 16% e 19% (Santos et al., 2003; Sucupira et al., 2006).

1.14.4 – HBsAg como Apresentador de Epítopos Exógenos - Enfoque HCV

O HBsAg é expresso em altos níveis pelas células infectadas e tem a capacidade

de se auto-organizar formando partículas virais sem nucleocapsídeo (partículas

subvirais ou incompletas), contendo apenas o envelope lipoprotéico (Laub et al.,

1983). Cada partícula de HBsAg é composta por 100 a 150 sub-unidades da

proteína S. Devido ao seu alto potencial imunogênico, partículas de HBsAg estão

sendo empregadas para carrear e apresentar epítopos de diversos agentes

infecciosos, tais como o Clostridium tetani (Chengalvala et al., 1999), a glicoproteína

D do Herpex simplex (Valenzuela et al., 1985), proteína do capsídeo do poliovírus

(Delpeyroux, et al., 1986), antígenos derivados do parasito da malária (Von Brunn et

al., 1991), vírus da dengue (Bisht, et al., 2002) e HIV (Michel et al., 2007).

A infecção pelo HCV atinge cerca de 2 a 3% da população mundial. Mais de

70% das infecções pelo HCV se tornam crônicas, sendo que destas, 5 a 20%

progride para cirrose e carcinoma hepatocelular (Jin et al., 2002). Sendo um vírus

identificado apenas em 1989 (Choo et al., 1989), acredita-se que um considerável

número de indivíduos ainda desconheça o seu estado de portador crônico para esta

infecção. Até o momento, não existe uma vacina disponível contra a infecção pelo

HCV e o tratamento com drogas antivirais, são eficazes em apenas 40% dos

pacientes (Fried & Sambrook, 1995).

O HCV é um vírus que apresenta semelhanças em relação à sua estrutura e

organização genômica, como os pestivírus e flavivírus, sendo classificado como um

novo gênero Hepacivirus, dentro da família Flaviviridae (Robertson et al., 1998).

O HCV é entre os vírus de importância clínica que infectam o homem, um dos

que possuem a maior taxa de mutação, existindo dentro de um indivíduo como

quasiespecies (Martell et al., 1992). Atualmente o HCV é dividido em seis genótipos

(1 a 6) e múltiplos subtipos, os quais apresentam diferenças significativas com

relação à prevalência global, alguns com distribuição mundial, outros mais restritos a

certas regiões (Bukh et al., 1997). No Brasil, os poucos estudos realizados nesta

área têm demonstrado uma maior prevalência para os genótipos 1, 2 e 3 (Bassit et

al., 2000; Espírito-Santo et al., 2007).

O HCV é um vírus envelopado cujo genoma é formado por um filamento simples

de RNA de polaridade positiva, contendo aproximadamente 9.400 nucleotídeos. O

RNA viral possui uma longa fase de leitura aberta que codifica para uma poliproteína

precursora de cerca de 3.000 aminoácidos (Choo et al., 1991). Mais de 10 proteínas

diferentes são codificadas a partir do genoma do HCV, como resultado do

processamento proteolítico co- e pós-traducional da poliproteína precursora. Este

processamento depende de enzimas codificadas pelo genoma viral (proteinases

NS3 e NS2-NS3) e da célula hospedeira (signalase ou peptidase-sinal). As proteínas

estruturais – proteína do capsídeo ou core (C), glicoproteínas do envelope 1 (E1) e

envelope 2 (E2) – estão localizadas na extremidade amino-terminal, e as proteínas

não-estruturais – NS2, NS3, NS4a, NS4b, NS5a e NS5b – estão localizadas na

extremidade carboxi-terminal da poliproteína (Grakoui et al., 1993).

Em estudos com o HCV, mostrou-se que a apresentação de epítopos da região

do core (Major et al., 1995; Geissler et al., 1998) e do envelope E2 (Netter et al.,

2001; Jin et al., 2002) é muito mais eficiente quando estas se encontram fusionadas

ao HBsAg. As glicoproteínas do envelope E1 e E2 do HCV apresentam domínios

altamente variáveis em suas seqüências quando comparados entre diferentes

isolados. Na extremidade N-terminal da proteína E2 há uma região caracterizada por

um elevado grau de variabilidade chamada região hipervariável 1 (HVR1),

importante na neutralização do HCV (Bukh et al., 1997; Drazan, 2000). Contudo, a

alta variabilidade deste fragmento antigênico desempenha um papel fundamental no

mecanismo de escape viral da resposta imune do hospedeiro e representa o maior

obstáculo no desenvolvimento de uma vacina contra o HCV (Forns et al., 2002).

2 – JUSTIFICATIVA

O HBsAg tem um papel fundamental no diagnóstico e prevenção da hepatite

B. Este antígeno é o marcador sorológico indicativo de infecção presente pelo HBV,

bem como, o único componente da vacina contra o HBV. A presente tese consiste

em quatro estudos nos quais a expressão do HBsAg in vitro e a sua detecção por

ensaios imunoenzimáticos são avaliados em diferentes contextos.

O primeiro artigo aborda a questão da infecção oculta pelo HBV em pacientes

infectados pelo HIV. A hepatite B oculta é um tema que preocupa pesquisadores do

mundo inteiro. Muitas questões são levantadas, como o impacto clínico da infecção

oculta e o impacto da infecção oculta na transmissão do vírus. A importância clínica

da hepatite B oculta em pacientes infectados pelo HIV se deve principalmente a

possibilidade de reativação da infecção pelo HBV após baixa da imunidade ou após

interrupção do tratamento com lamivudina. Dados sobre a prevalência da hepatite B

oculta em pacientes HIV positivos são bastante divergentes, com valores variando

de 0 a 89%.

O segundo e o terceiro artigo analisam a influência de variações de

aminoácidos relacionadas ou não aos genótipos do HBV nos níveis de detecção e

secreção do HBsAg. O principal epítopo para células B do HBsAg, o determinante a,

engloba um total de 24 aminoácidos, e é o alvo dos testes de detecção para o

HBsAg. Algumas variações específicas de aminoácidos nesta região da proteína

estão associadas aos genótipos do HBV. A influência dos diferentes genótipos na

sensibilidade de ensaios sorológicos de detecção do HBsAg tem sido pouco

investigada, sobretudo com respeito ao genótipo F, o qual é encontrado somente

nas Américas do Sul e Central. Por um outro lado, tem sido demonstrado que

mutações não relacionadas aos genótipos na região do determinante a podem

resultar em alterações na antigenicidade do HBsAg, dificultando o reconhecimento

de tais mutantes pelos testes comerciais de detecção. Além disso, mutações no

HBsAg relacionadas à inibição ou diminuição da secreção deste antígeno pelas

células infectadas têm sido também descritas.

O quarto estudo desta tese, consiste em uma minuta de pedido de patente,

que se refere à construção de plasmídeos recombinantes que permitem a obtenção

de um alto rendimento de HBsAg expresso in vitro, bem como a inserção de

antígenos exógenos para a obtenção de imunógenos bivalentes. O estudo

contempla ainda a construção e expressão de partículas quiméricas de HBsAg

fusionadas a um peptídeo do envelope do HCV. Partículas híbridas de HBsAg,

também denominadas quimeras, têm-se revelado em diferentes experimentos de

imunização como proteínas bastante eficientes na apresentação de epítopos virais.

Em estudos com o HCV, mostrou-se que a apresentação de epítopos da região do

core e do envelope E2 é muito mais eficiente quando estas se encontram fusionadas

ao HBsAg. Até o momento, não existe uma vacina disponível contra a infecção pelo

HCV e o tratamento com drogas antivirais, é eficaz em apenas 40% dos pacientes.

3 – OBJETIVOS

3.1 – Objetivo Geral

 Realizar estudos de expressão in vitro do HBsAg de casos de infecção oculta

pelo HBV; de diferentes genótipos; e de partículas quiméricas de HBsAg e

HCV.

3.2 – Objetivos Específicos

Artigo 1:

 Avaliar a prevalência de infecção oculta pelo HBV em amostras sorológicas

de pacientes infectados pelo HIV, do Instituto de Pesquisa Clínica Evandro

Chagas (IPEC – FIOCRUZ), com sorologia negativa para o HBsAg e sorologia

positiva para anti-HBc.

 Investigar as possíveis causas de infecção oculta para o HBV nestes

pacientes através de ensaios de transfecção transitória em células

eucarióticas que expressam o HBsAg produzido por estas variantes.

Artigo 2:

 Construir plasmídeos de expressão contendo as regiões genômicas das

proteínas M e S do envelope do HBV dos genótipos A, D e F circulantes no

Brasil.

 Comparar os níveis de detecção do HBsAg entre os genótipos A, D e F e

entre as formas protéicas M e S.

Artigo 3:

 Avaliar a influência de uma mutação, identificada no HBsAg de um isolado do

genótipo F, nos níveis de secreção deste antígeno por células transfectadas.

 Comparar os níveis de expressão e secreção do HBsAg entre duas células

eucarióticas amplamente utilizadas em ensaios de expressão do HBsAg.

Minuta de Patente:

 Caracterizar a seqüência nucleotídica e produtos de expressão de isolados do

HBV e identificar formas de HBsAg adequadas para serem utilizadas como

agentes imunogênicos.

 Construir partículas híbridas de HBsAg para apresentação de antígenos do

HCV utilizando-se sítios naturais de restrição no gene do HBsAg como sítios

de inserção para os fragmentos do HCV.

4 – RESULTADOS

Os resultados obtidos na presente tese serão apresentados sob forma de

artigos científicos ou minuta de pedido de patente, e serão listados a seguir na

ordem em que serão discutidos.

1. Araujo NM, Branco-Vieira M, Silva AC, Pilotto JH, Grinsztejn B, de Almeida

AJ, Trepo C, Gomes SA 2008. Occult Hepatitis B Virus Infection in HIV-

Infected Patients: Evaluation of Biochemical, Virological and Molecular

Parameters. Hepatology Research. Artigo aceito para publicação.

2. Araujo NM, Vianna COA, Moraes MTB, Gomes SA. Influence of amino acid

variations linked or not to hepatitis B virus genotypes on the detection of

hepatitis B virus surface antigen. Manuscrito submetido para publicação.

3. Araujo NM, Vianna COA, Soares CC, Gomes SA 2008. A Unique Amino Acid

Substitution, L215Q, in the Hepatitis B Virus Small Envelope Protein of a

Genotype F Isolate That Inhibits Secretion of Hepatitis B Virus Subviral

Particles. Intervirology 51: 81–86.

4. Vetores de expressão do gene de superfície do vírus da hepatite B (HBsAg)

que permitem a inserção de epítopos de outros agentes infecciosos em região

estratégica do HBsAg: Modelo – Produção de quimeras do HBsAg com a

região hipervariável 1 da proteína E2 do vírus da hepatite C.

Artigo 1. Araujo NM, Branco-Vieira M, Silva AC, Pilotto JH, Grinsztejn B, de Almeida

AJ, Trepo C, Gomes SA 2008. Occult Hepatitis B Virus Infection in HIV-Infected

Patients: Evaluation of Biochemical, Virological and Molecular Parameters.

Hepatology Research. Artigo aceito para publicação.

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/v2451/blackwell/journals/hep_v0_i0/hep_392

Original Article

Occult hepatitis B virus infection in HIV-infected patients:

Evaluation of biochemical, virological and

molecular parameters

Natalia M. Araujo,

Monique Branco-Vieira,

Anita C.M. Silva,

José H. Pilotto,

Beatriz Grinsztejn,

Adilson José de Almeida,

Christian Trepo

and Selma A. Gomes

Laboratório de Virologia Molecular, Instituto Oswaldo Cruz,

Unidade de Ensaios Clínicos em HIV/AIDS, Instituto

de Pesquisa Clínica Evandro Chagas, FIOCRUZ, and

Hospital Universitário Gaffrée e Guinle, Escola de Medicina

e Cirurgia da Universidade Federal do Estado do Rio de Janeiro (UNIRIO), Rio de Janeiro, RJ, Brazil; and

U871

INSERM, Lyon, France

Aim: To determine the prevalence of occult hepatitis B virus

(HBV) infection in a group of human immunodeﬁciency virus

(HIV)-infected Brazilian patients and to investigate its associa-

tion with biochemical, virological and molecular features.

Methods: Sera from 43 patients positive for HBV core anti-

body and negative for HBV surface antigen (HBsAg) were

tested for HBV DNA positivity by semi-nested PCR. HBV loads

were assessed by real-time PCR. S gene was cloned and

sequenced for HBV isolates from 3 patients. HBsAg expres-

sion of these cases was performed in HuH7 cells.

Results: HBV DNA was found in 6/43 (14%) samples, all

except one associated with low viral loads. Occult HBV

infection was further correlated with anti-hepatitis C virus

(anti-HCV) antibodies positivity, but not with alanine ami-

notransferase (ALT) elevated levels. S gene sequences derived

from three patients were determined. Two of them displayed

mutations that may explain HBsAg negativity. In the

ﬁrst one, a stop codon mutation was found at position 216 in

the C-terminal end of HBsAg. In the second patient, E164D

and I195M substitutions in HBsAg, associated with

lamivudine-resistance mutations in the polymerase were

identiﬁed. As expected, all clones showing those mutations

displayed undetectable or very low levels of HBsAg.

Conclusion: Occult HBV infection was frequent in HIV-

infected patients, was not associated with ALT elevation but

signiﬁcantly correlated with HCV seropositivity. The low

viremia and the detection of HBsAg mutants conﬁr m that

multifactorial mechanisms are involved in occult HBV infec-

tion. HBV molecular monitoring should be employed for an

adequate management of HBV/HIV co-infected patients.

Key words: hepatitis B virus

, mutations, occult infection,

surface antigen, transfection

INTRODUCTION

HRONIC HEPATITIS B virus (HBV) infection is a

global health problem, affecting more than 350

million individuals worldwide.

These people are at an

increased risk of developing liver cirrhosis and hepato-

cellular carcinoma over the years and constitute a poten-

tial reservoir of infection. HBV surface antigen (HBsAg)

is the established serological marker for the diagnosis of

acute or chronic HBV infection, and the absence of

HBsAg in serum has been used as a surrogate marker

for the absence of DNA and active viral replication.

However, the development of highly sensitive molecu-

lar biology techniques has allowed detection of low

levels of HBV DNA in the serum and/or liver of patients

without detectable HBsAg.

2–4

This peculiar form of

chronic viral infection has been termed occult HBV

infection.

5–7

Individuals with occult HBV infection

usually have serological evidence of previous exposure

to the virus, mainly antibodies to core antigen (anti-

HBc), although the absence of any serological marker

related to HBV has also been described.

Occult HBV

infection has been documented in a variety of clinical

Correspondence: •• Natalia M. Araujo, Laboratório de Virologia

Molecular, Instituto Oswaldo Cruz, FIOCRUZ, Av. Brasil 4365,

21045-900 Rio de Janeiro, RJ, Brazil.

Email: nmaraujo@ioc.ﬁocruz.br

Received 5 March 2008; revision 25 April 2008; accepted 28 April

2008.

Hepatology Research 2008 doi: 10.1111/j.1872-034X.2008.00392.x

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/v2451/blackwell/journals/hep_v0_i0/hep_392

situations, most commonly among patients with hepa-

titis C virus (HCV) infection, in which the highest preva-

lence of occult HBV has been observed, especially in

those who are positive for anti-HBc.

6,9

Several possible explanations for HBV DNA persis-

tence in the absence of HBsAg have been proposed. Low

rate of HBV replication due to host’s immune response

or co-infection with other infectious agents may account

for occult status in the majority of the cases.

However,

occult HBV infection may also be due to mutations that

inhibit HBsAg expression

or change HBsAg antigenic-

ity, thus preventing detection by commercial assays.

11–13

Among human immunodeﬁciency virus (HIV)-

infected patients, occult HBV infection prevalence is

widely divergent, ranging from 0% to 89%.

14–17

Data on

the clinical impact of occult HBV infection in HIV-

infected patients are still controversial. An association

between occult HBV infection and ﬂares of hepatic tran-

saminases has been reported,

14,18

which was not con-

ﬁrmed in other studies.

17,19

The virological and clinical

reactivation of the occult HBV infection following severe

immunosuppression has been described in HIV-infected

patients.

20,21

Three anti-retroviral drugs, namely lamivu-

dine, tenofovir and emtricitabine, used as components

of the highly active anti-retroviral therapy (HAART)

inhibit both HIV and HBV replication.

Lamivudine is a

nucleoside analogue that inhibits the reverse tran-

scriptase activity of both viruses but its efﬁcacy has been

limited by the emergence of resistant strains containing

mutations that typically occur in the tyrosine-

methionine-aspartate-aspartate (YMDD) motif of the

HBV DNA polymerase.

23,24

Mutations at this site of HBV

polymerase gene are of particular signiﬁcance as some

of which are associated with amino acid alterations

in HBsAg, due to overlapping of genes.

In this study, the biochemical, virological and

molecular aspects associated with occult HBV infection

in a group of HIV-infected patients were investigated.

METHODS

Patients

ETWEEN JANUARY AND March 2006, a total of 43

HIV-1-infected patients followed up at Evandro

Chagas Hospital, Brazil, and were prospectively studied.

Patients were included in this study if they had anti-HBc

antibodies, in the absence of HBsAg. The protocol was

approved by the Local Ethics Committee (IPEC/

FIOCRUZ) and informed consent was obtained from all

patients. Demographic, laboratory and clinical informa-

tion including age, gender, alanine aminotransferase

(ALT) levels, HIV positivity period, HIV load, CD4 cell

count, HBV and HCV antibody status and antiretroviral

treatment were collected by accessing the electronic

database and the patient’s charts.

Serological assays

Serum samples from all 43 patients were retested for

HBsAg, anti-HBc and anti-HBs to conﬁrm the HBV sero-

logical status. Absence of HBsAg in serum samples

was conﬁrmed by enzyme-linked immunosorbent assay

(ELISA) using AxSYM HBsAg V2 test (Abbott Diagnos-

tics, Germany). Reactivity for anti-HBc and anti-HBs was

determined by AxSYM CORE and AxSYM AUSAB tests

(Abbott Diagnostics), respectively. HBV DNA positive

samples were tested one more time for HBsAg reactivity

using BioELISA HBsAg colour assay (Biokit, Spain).

DNA extraction and molecular assays

Viral DNA was extracted using phenol/chloroform after

treatment of 250 ml of serum with 0.5 mg/mL of pro-

teinase K in the presence of 0.2 M NaCl, 0.25% SDS, for

4 h at 37°C.

After precipitation with ethanol, the pellet

was dried and resuspended in 30 ml of distilled water.

The region coding for the small HBV surface protein

(S-HBsAg) was ampliﬁed by semi-nested PCR assay. The

ﬁrst round of ampliﬁcation was performed with a

mixture of one sense primer (PS1 5′-CCATATTCTT

GGGAACAAG A-3′, nt positions 2826–2845) and two

antisense primers (S2, 5′-GGGTTTAAATGTAT ACCCA

AAGA-3′, 819–841, and S22, 5′-GTATTTAAATGGAT

ACCCACAGA-3′, 819–841) to facilitate the ampliﬁca-

tion of all HBV genotypes.

The second round of ampli-

ﬁcation was performed with 1 ml of the ﬁrst round PCR

product, sense primer S1 (5′-CTTCTC GAGGACTGG

GGACC-3′, 124–143) and antisense primers S2 and

S22. Negative and positive controls were added in both

extraction and PCR procedures, and a sample was con-

sidered positive when HBV DNA was repeatedly found

after ampliﬁcation of newly extracted material. The PCR

conditions for both rounds were: 94°C, 3 min; 30 cycles

at 95°C for 30 s, 52°C for 40 s, and 72°C for 2 min,

followed by a ﬁnal elongation at 72°C for 7 min. Serum

samples that were positive by semi-nested PCR were

subjected to real-time PCR, in the conditions described

previously.

The limit of detection for both qualitative

and quantitative assays was approximately 100

copies/mL of serum.

3,28

Semi-nested PCR products were

cloned into the pCR4 cloning vector (TOPO TA cloning

kit for sequencing; Invitrogen, CA, USA) and recombi-

nant plasmids were puriﬁed using Plasmid Mini kit

100

2 K. Korenaga et al. Hepatology Research 2008

JOBNAME: No Job Name PAGE: 3 SESS: 9 OUTPUT: Fri Jun 13 17:47:49 2008 SUM: 7D04E281

/v2451/blackwell/journals/hep_v0_i0/hep_392

(QIAGEN, Germany). For construction of the expres-

sion plasmids, inserts cloned into pCR4 vector were

excised using EcoRI restriction enzyme, gel-puriﬁed

using Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System

(Promega, WI, USA), and inserted into the mammalian

cell expression vector pcDNA3 (Invitrogen). The correct

orientation of the inserts was checked by nucleotide

sequencing. Selected expression plasmids were puriﬁed

using S.N.A.P. Midiprep kit (Invitrogen). HBV nucle-

otide sequences from puriﬁed PCR fragments and

recombinant plasmids were determined using BigDye

Terminator kit (Applied Biosystems, CA, USA).

Sequencing reactions were analyzed on an ABI3730

automated sequencer (Applied Biosystems). Bioinfor-

matics analysis of the sequences was performed using

MEGA version 3.1 and BioEdit version 7.0.9.0. A phy-

logenetic tree of HBV isolates was obtained using the

Neighbor Joining Method (500 bootstrap replicates).

Cell culture and transfection assays

Transient transfection assays were performed using

human hepatoma HuH7 cells maintained in Dulbecco’s

modiﬁed Eagle medium supplemented with 10% fetal

bovine serum. Cells were plated at a density of 5 ¥ 10

cells per well of 6-well plates and transfected with 2 mg

of HBsAg expressing plasmid using FuGENE 6 (Roche

Diagnostics, Germany), according to the manufacturer’s

instructions. Culture supernatants were collected on day

5 after transfection and clariﬁed by centrifugation at

1500 g for 5 min. To evaluate HBsAg levels inside cells,

cell monolayers were washed twice with phosphate

buffered saline (PBS), scraped with 1 mL of PBS and

centrifuged at 2500 g for 5 min. Cell pellets were

freezed/thawed three times and resuspended in 0.4 mL

of PBS. Medium and cell extracts were tested for the

presence of HBsAg by a commercial immunoassay

(BioELISA HBsAg colour; Biokit). Mock-transfected

HuH7 cells were used as negative control.

Statistical analysis

Categorical data were expressed as frequencies and sta-

tistical analysis was performed using the c

test for

trend, or Fisher’s exact test to compare proportions.

Homoscedasticity was tested by the Levene’s test for

continuous variables with normal distribution (age, HIV

positivity period, log HIV-1 load). The unpaired Stu-

dent’s t-test was used to compare means. The nonpara-

metric statistics (Mann–Whitney U-test) was used to

compare medians of continuous variable (ALT) that did

not pass normality test (Kolmogorov–Smirnov test).

Two-tailed P value < 0.05 was considered statistically

signiﬁcant. All calculations were performed using the

GraphPad InStat version 3.05 (GraphPad Software, CA,

USA).

RESULTS

Demographic and laboratory features of

the patients

F THE 43 HBsAg negative, anti-HBc positive, HIV-

1-infected patients included in this study, 35

(81%) were male. The mean age was 48 (range 32–67)

years. Mean ALT level was 45.4 U/L (range 10–293 U/

L). The mean period of HIV infection was 12.1 years

(range 4–20 years) and the mean HIV load was 10

3.3

(range 10

–10

4.5

) copies/mL. A total of 32 (74%)

patients were positive for anti-HBs and 11 (26%)

patients had anti-HBc as the only serological marker for

HBV infection. The overall prevalence of HCV seroposi-

tivity was 9%. Thirty-nine (91%) patients were receiving

HAART, including 23 (53%) patients under lamivudine-

based regimen and 15 (35%) others under lamivudine

and tenofovir therapy. Only seven (16%) patients had

CD4 levels lower than 200 ¥ 10

/l (Table 1).

HBV DNA was detected in serum samples of 6 (14%)

patients. Five of them showed low titers ranging from

5.1 ¥ 10

to 1.6 ¥ 10

copies/mL. Patient P36 had HBV

load of 1.2 ¥ 10

copies/mL (Table 2). Among the HBV

DNA positive patients, ﬁve (83%) were anti-HBs posi-

tive. Anti-HBs levels were 3100 IU/mL in four (67%)

patients (Table 2). HCV seroprevalence was much

higher in the group of patients with detectable HBV

DNA (3/6, 50%) than among HBV DNA negative

patients (1/37, 3%). In bivariate analysis, a statistically

signiﬁcant association was found between the detection

of anti-HCV antibodies and occult HBV infection

(P = 0.006). The other parameters analyzed in this study

did not differ signiﬁcantly between patients with and

without occult HBV infection (Table 1).

Molecular characterization and

HBsAg expression

PCR products (S gene, 681 bp) derived from the

three occult HBV infected patients showing an HBV

load 310

copies/mL were successfully cloned and

sequenced. Phylogenetic analysis based on S region

showed that the three isolates belonged to genotype A,

two of them (P36 and P51) being classiﬁed as subgeno-

type A1 and the remaining one (P65) as subgenotype A2

(Fig. 1). Five to ten clones derived from each patient

were sequenced. HBV sequences of all clones were very

100

Hepatology Research 2008 Occult HBV infection in HIV-infected patients 3

JOBNAME: No Job Name PAGE: 4 SESS: 9 OUTPUT: Fri Jun 13 17:47:49 2008 SUM: A4C2E687

/v2451/blackwell/journals/hep_v0_i0/hep_392

similar to their respective directly sequenced PCR

product. The deduced amino acid sequences were com-

pared with a consensus sequence of genotype A (Fig. 2).

HBV sequences obtained from patient P65 were identi-

cal to consensus sequence, except for two substitutions,

N207S and L209V, which are characteristics of subgeno-

type A2. The R79H substitution, accompanied by a stop

codon mutation at amino acid position 216 (L216*)

that leads to expression of a truncated HBsAg, were

detected in all HBV sequences deriving from patient

P36. All clones derived from patient P51, as well as the

directly sequenced PCR product, showed the lamivu-

dine resistance mutation rtM204V within the YMDD

motif of HBV DNA polymerase, intrinsically associated

to I195M substitution in the HBsAg gene. The two com-

pensatory mutations associated with lamivudine resis-

tance, rtL180M and rtV173L, the latter generating the

E164D substitution in HBsAg, were also found in all

HBV sequences derived from the P51 patient. In addi-

tion, Y100C substitution was detected in P36 and P51

HBV sequences (Fig. 2).

In order to evaluate the detection by ELISA of

expressed HBsAgs, two representative clones from each

patient, carrying the above mentioned mutations

(Fig. 2), were used for transfection assays. A wild type S

gene fragment from subgenotype A1 cloned into

pcDNA3 vector (WT-A) was used as a positive control.

Medium and extracts of cells transfected with P65-1,

P65-2 and WT-A plasmids were tested at a dilution of

1/25. Extracellular and intracellular mean levels of

HBsAg are shown in Table 3. High levels of HBsAg were

detected in both medium and extracts of cells trans-

fected with P65-1 and P65-2 clones in all transfection

assays. In contrast, values of HBsAg expressed by P36

and P51 clones were considered negative according to

the commercial assay, except for plasmid P51-1 that

showed very low detectable levels of HBsAg in cell

extracts.

DISCUSSION

UE TO SHARED modes of transmission,

co-infection with HBV and HIV is common. Sero-

logical evidence of HBV infection is found in up to 90%

of HIV-positive individuals.

In Brazil, information on

HBsAg seropositivity among HIV-infected patients is

still limited. Available data have reported prevalence of

HIV-HBV co-infection ranging from 3.7 to 24.3%.

30–34

HIV co-infection is associated with higher chronicity

rate of HBV infection,

higher levels of HBV replica-

tion,

milder necro-inﬂammatory activity,

and a more

rapid progression to cirrhosis.

In previous studies, the

Table 1 Clinical and laboratory data of the patients

Mean (range) value or number (%) P value

Total group

(n = 43)

Occult HBV infection

positive (n = 6)

Occult HBV infection

negative (n = 37)

Age (years) 48 (32–67) 47 (32–52) 48 (35–67) 0.700

Sex (female:male) 8:35 2:4 6:31 0.308

ALT† (U/L) 45.4 (10.0–293.0) 33.1 (10.0–67.0) 47.4 (18.0–293.0) 0.189

HIV positivity period (years) 12.1 (4.0–20.0) 11.8 (6.0–16.0) 12.2 (4.0–20.0) 0.803

HIV load‡ (log

copies/mL) 3.3 (2.0–4.5) 3.1 (3.1–3.1) 3.3 (2.0–4.5) –§

CD4 cell count (10

/L), n (%) 0.637

<200 7 (16) 0 (0) 6 (16)

200–499 15 (35) 3 (50) 12 (32)

>500 21 (49) 3 (50) 19 (51)

HCV seropositivity, n (%) 4 (9) 3 (50) 1 (3) 0.006

Anti-HBs positivity, n (%) 32 (74) 5 (83) 27 (73) 1.000

Isolated anti-HBc IgG, n (%) 11 (26) 1 (17) 10 (27) 1.000

Receiving HAART, n (%) 39 (91) 5 (83) 34 (92) 0.465

3TC-based HAART, n (%) 23 (53) 3 (50) 20 (54) 1.000

3TC- and TDF-based HAART, n (%) 15 (35) 1 (17) 14 (38) 0.403

†Reference alanine aminotransferase (ALT) values at 37°C were up to 41 U/L for male and up to 31 U/L for female. ‡HIV-1 loads less

than 80 copies/mL were undetectable by the assay and not included in the analysis. §Parameter with a single value. HAART, highly

active anti-retroviral therapy; HBsAg, hepatitis B virus surface antigen; HCV, hepatitis C virus; HIV, human immunodeﬁciency virus;

TDF, tenofovir; 3TC, lamivudine.

4 K. Korenaga et al. Hepatology Research 2008

JOBNAME: No Job Name PAGE: 5 SESS: 9 OUTPUT: Fri Jun 13 17:47:49 2008 SUM: 65457B8B

/v2451/blackwell/journals/hep_v0_i0/hep_392

Table 2 Clinical and laboratory data of the patients with occult hepatitis B virus (HBV) infection

Patient

P36 P65 P51 P49 P23 P37

HBV DNA load (copies/

mL)

1.2 ¥ 10

1.6 ¥ 10

1.2 ¥ 10

7.9 ¥ 10

5.3 ¥ 10

5.1 ¥ 10

HBsAg (U/mL)† Neg Neg Neg Neg Neg Neg

Anti-HBs (IU/L) 118.0 947.6 Neg 376.0 374.6 14.5

Anti-HBc (S/CO)‡ 0.133 0.142 0.193 0.106 0.163 0.148

Genotype/sub-genotype A/A1 A/A2 A/A1 ND ND ND

Age (years) 43 32 52 50 52 51

Sex Female Male Male Male Female Male

ALT (U/L) 31 17 33 41 67 10

HIV positivity period

(years)

12 12 6 16 10 15

HIV load (log

copies/

mL)

3.1 Undetectable Undetectable Undetectable Undetectable Undetectable

CD4 cell count (10

/L) 200–499 >500 200–499 >500 200–499 >500

Anti-HCV Neg Pos Pos Neg Pos Neg

HCV RNA Neg Pos Pos Neg Pos Neg

HAART regimen 3TC; EFV; AZT No therapy 3TC; D4T; EFV AZT; AMP; Ddi 3TC; D4T; EFV 3TC; TDF; AZT; RTV

†Absence of HBsAg was conﬁrmed by two commercial assays. ‡Values of the ratio of the sample rate (S) to the cut-off rate (CO) between 0.001 to 0.800 are positive

according to the manufacturer’s instructions. ALT, alanine aminotransferase; AMP, Ampligen; AZT, Zidovudine; D4T, Stavudine; Ddi, Didanosine, EFV, Efavirenz; HAART,

highly active anti-retroviral therapy; HBsAg, hepatitis B virus surface antigen; HCV, hepatitis C virus; ND, not done; Neg, Negative; Pos, positive; RTV, Ritonavir; TDF,

Tenofovir; 3TC, Lamivudine.

Hepatology Research 2008 Occult HBV infection in HIV-infected patients 5

JOBNAME: No Job Name PAGE: 6 SESS: 9 OUTPUT: Fri Jun 13 17:47:49 2008 SUM: 50333AA4

/v2451/blackwell/journals/hep_v0_i0/hep_392

prevalence of occult HBV infection in persons infected

with HIV ranged from 0% to 89%.

14,15

Differences in the

composition of the study population and in the sensi-

tivity of the assays may be the reason for such a great

divergence. In this study, 6/43 (14%) of the HIV-

infected patients showed evidence of occult HBV infec-

tion. This prevalence was similar to those (16% and

19%) previously observed among anti-HBc-positive,

HIV-infected patients from Rio de Janeiro, Brazil.

16,28

Recently, the prevalence of 14% of occult HBV infection

was also reported in HIV-infected patients with anti-HBc

positivity, from two British cohorts.

The HBV samples

genotyped in the present study belonged to genotype A,

which is the genotype most frequently found in

Brazil

39,40

and has been prevalent among HIV-infected

patients.

41,42

The clinical signiﬁcance of occult HBV infection in

HIV-infected patients is still controversial, but reactiva-

tion of HBV infection following immune depletion

and/or lamivudine withdrawal seems to be the major

problem.

21,43

Some studies have demonstrated a correla-

tion between occult HBV infection and increased levels

of ALT in HIV-positive subjects.

14,18

However, in our

study and in two others,

17,19

such a correlation was not

found. HCV is known to inhibit HBV replication

and

may thus lead to absence of detectable HBsAg in serum.

HCV infection has been signiﬁcantly associated with

occult HBV infection in HIV-negative cohorts.

Herein, a

highly signiﬁcant association (P = 0.006) between HCV

seropositivity and occult HBV infection in HIV-positive

patients was observed.

A variety of explanations for persistence of HBV DNA

in HBsAg-negative samples have been proposed, includ-

ing low levels of HBV replication

and occurrence of

amino acid substitutions in HBsAg.

11–13

A weak HBV

replication, leading to levels of viral particles in serum

insufﬁcient to allow HBsAg detection by diagnostic

assays, may be the cause of HBsAg seronegativity in

Figure 1 Phylogenetic tree inferred by

using the neighbor-joining method.

Isolates represented in bold are from

this study. The other isolates are desig-

nated by their GenBank accession

numbers. Letters A–H on the branches

refer to HBV genotypes. Subgenotypes

A1 to A3 are indicated in parentheses.

Values at internal nodes indicate per-

centage of 500 bootstrap replicates that

support the branch. The horizontal bar

indicates the number of nucleotide sub-

stitutions per site.

P51

P36

M57663 (A1)

P65

AY707087 (A2)

AB194951 (A3)

AF160501

AB056515

AF100308

AB014366

V00867

AY123424

X75657

AB205191

X65257

AB104712

X69798

AY311369

AY090457

AB059659

100

0.01

6 K. Korenaga et al. Hepatology Research 2008

JOBNAME: No Job Name PAGE: 7 SESS: 9 OUTPUT: Fri Jun 13 17:47:49 2008 SUM: 53B47269

/v2451/blackwell/journals/hep_v0_i0/hep_392

most of the patients analyzed here. Five out of six

patients with occult HBV infection showed serum HBV

DNA titers 210

copies/mL. The highest HBV load

observed was 1.2 ¥ 10

copies/mL that is substantial but

still low when compared to titers of 10

to 10

copies/mL usually encountered in HBsAg chronic carri-

ers.

In the case of patient P65, HBsAg expressed in

transfection assays was detected using an immunoassay

that was unable to detect HBsAg in the serum. This

ﬁnding was not surprising while no potentially impor-

tant amino acid mutation was observed. In fact, patient

P65 was HBsAg-negative probably due to low HBV load

(1.6 ¥ 10

copies/mL). The low titer of HBV may be

caused by the HCV co-infection observed in this patient.

However, the low HBV replication may be also due to a

kind of balancing between a minute (and undetectable)

production of antigen and an efﬁcient host’s immune

system.

In patient P36, who had the highest HBV DNA

load (1.2 ¥ 10

copies/mL), HBV sequences exhibited

10 20 30 40 50 60 70 80

Consensus A MENITSGFLGPLLVLQAGFFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNFLGGSPVCLGQNSQSPTSNHSPTSCPPICPGYRWMCLRRF

P65-PCR product ................................................................................

P65-clone 1 ................................................................................

P65-clone 2 ................................................................................

P51-PCR product ............................................................................P...

P51-clone 1 ............................................................................P...

P51-clone 2 .....................................P......................................P...

P36-PCR product ..............................................................................H.

P36-clone 1 ..............................................................................H.

P36-clone 2 ..............................................................................H.

90 100 110 120 130 140 150 160

Consensus A IIFLFILLLCLIFLLVLLDYQGMLPVCPLIPGSTTTSTGPCKTCTTPAQGNSMFPSCCCTKPTDGNCTCIPIPSSWAFAK

P65-PCR product ................................................................................

P65-clone 1 ................................................................................

P65-clone 2 ................................................................................

P51-PCR product ...................C............................................................

P51-clone 1 ...................C............................................................

P51-clone 2 ...................C............................................................

P36-PCR product ...................C............................................................

P36-clone 1 ...................C............................................................

P36-clone 2 ...................C............................................................

170 180 190 200 210 220

Consensus A YLWEWASVRFSWLSLLVPFVQWFVGLSPTVWLSAIWMMWYWGPSLYNILSPFIPLLPIFFCLWVYI

P65-PCR product ..............................................S.V.................

P65-clone 1 ..............................................S.V.................

P65-clone 2 ..............................................S.V.................

P51-PCR product ...D..............................M...............................

P51-clone 1 ...D..............................M...............................

P51-clone 2 ...D..............................M...............................

P36-PCR product .......................................................*........D.

P36-clone 1 .......................................................*..........

P36-clone 2 .......................................................*..........

Figure 2 Comparison of HBsAg sequences, deduced from directly sequenced PCR products and recombinant plasmids, with a

consensus sequence of genotype A. Consensus was originated from an alignment of 100 HBV complete genome sequences from

genotype A available in GenBank. The clones shown on the ﬁgure were those used in transfection assays.

Table 3 Detection of extracellular and intracellular hepatitis B

virus surface antigen (HBsAg) in HuH7 transfected cells

Sample Medium Cell extracts

WT-A 1.428 0.239

P65-1 1.415 0.220

P65-2 1.550 0.244

P51-1 0.076 0.112

P51-2 0.080 0.098

P36-1 0.080 0.094

P36-2 0.079 0.092

Mean values of the optical density (OD) at 450 nm from three

independent experiments. Medium and extracts of cells

transfected with WT-A, P65-1 and P65-2 plasmids were tested at

a dilution of 1/25. OD values considered positive for HBsAg,

according to the manufacturer’s instructions, are in bold type.

Hepatology Research 2008 Occult HBV infection in HIV-infected patients 7

JOBNAME: No Job Name PAGE: 8 SESS: 9 OUTPUT: Fri Jun 13 17:47:49 2008 SUM: 244A4F82

/v2451/blackwell/journals/hep_v0_i0/hep_392

the R79H substitution and a stop codon mutation at

amino acid position 216 (L216*), in the C-terminal end

of HBsAg. Neither extracellular nor intracellular HBsAg

was detected by ELISA after transfection of plasmids

containing these two mutations. Both mutations have

been described previously in an immunosuppressed

renal transplant recipient who developed end-stage liver

disease. After transfection of HBV full-length genome,

no secreted HBsAg was detected by ELISA, and low levels

of S-HBsAg were detected in cell lysate by Western blot.

It has been demonstrated that carboxyl-terminal trunca-

tions may prevent HBsAg expression and/or secre-

tion.

45,46

Therefore, the occurrence of L216* stop codon

mutation may explain the occult HBV status in patient

P36. A third patient from this study, P51, has been

under HIV therapy since October 2003 with stavudine,

efavirenz and lamivudine. This patient showed the

rare triple lamivudine resistance mutation rtV173L,

rtL180M, and rtM204V in the HBV DNA polymerase.

Lamivudine-resistant strains have previously been

detected in 50% of patients with occult HBV infection

co-infected with HCV

and in 31% of occult HBV/HIV

co-infected patients.

It has been demonstrated that

rtM204V/I mutants have a markedly decreased replica-

tion phenotype compared with wild-type HBV,

whereas both rtV173L and rtL180M substitutions act as

compensatory changes that partially restore the replica-

tion ﬁtness of the virus.

50,51

The low viral load observed

in P51 (1.2 ¥ 10

copies/mL) is in agreement with these

observations. The triple lamivudine resistance mutation

causes the concomitant amino acid substitutions E164D

and I195M in the HBsAg as a result of the overlapping

reading frames of the envelope and polymerase genes.

It has been shown that both E164D and I195M substi-

tutions reduce in vitro afﬁnity of HBsAg to anti-HBs

antibodies, similar to the HBV vaccine escape mutant

G145R.

These ﬁndings are corroborated in this study,

since E164D/I195M mutated HBsAg levels were very

low or not detected by the commercial assay used in our

experiments. In addition, the Y100C mutation, found in

all HBV sequences derived from patients P36 and P51,

had been previously found in 4/10 Venezuelan blood

donors with occult HBV infection.

In conclusion, occult HBV infection was frequent in

the group of HIV-infected patients analyzed here, was

not associated with ALT elevation but signiﬁcantly cor-

related with the presence of anti-HCV antibodies. The

detection of HBsAg mutants and low HBV titers conﬁrm

the multifactorial nature of occult HBV infection. The

high prevalence of occult HBV infection and increased

rates of lamivudine resistance, emphasize the need for

HBV DNA testing with sensitive assays and identiﬁca-

tion of genotypic resistance proﬁles in HBV/HIV

co-infected individuals for an adequate management of

these patients.

ACKNOWLEDGMENTS

E THANK DR. Jussara Árabe for collecting

patients’ data, Cleber Ferreira Genuíno for per-

forming the AxSYM immunoassays, Dr Christian Niel

for manuscript revision and the Genomic Platform-

DNA Sequencing PDTIS/FIOCRUZ. This work was

supported by CNPq and FAPERJ grants.

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Hepatology Research 2008 Occult HBV infection in HIV-infected patients 9

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Journal Code: HEP Proofreader: Mony

Article No: 392 Delivery date: 13 June 2008

Page Extent: 10

Artigo 2. Araujo NM, Vianna COA, Moraes MTB, Gomes SA. Influence of Amino

Acid Variations Linked or not to Hepatitis B Virus Genotypes on the Detection of

Hepatitis B Virus Surface Antigen. Manuscrito submetido para publicação na revista

Virus Genes.

Influence of amino acid variations linked or not to hepatitis

B virus genotypes on the detection of hepatitis B virus

surface antigen.

Natalia M. Araujo

1§

, Carlos O. A. Vianna

, Marcia T. B. Moraes

, Selma A. Gomes

Laboratório de Virologia Molecular, Instituto Oswaldo Cruz, FIOCRUZ, Av. Brasil 4365,

21040-900 Rio de Janeiro, RJ, Brazil.

Vice Diretoria de Desenvolvimento Tecnológico, Bio-Manguinhos, FIOCRUZ, Av.

Brasil 4365, 21040-900 Rio de Janeiro, RJ, Brazil.

Departamento de Reativos, Bio-Manguinhos, FIOCRUZ, Av. Brasil 4365, 21040-900

Rio de Janeiro, RJ, Brazil.

Corresponding author: Natalia M. Araujo

Tel.: +55 21 2562 1847; fax: +55 21 2260 4866

E-mail address: [email protected]

Address: Laboratório de Virologia Molecular, Instituto Oswaldo Cruz, FIOCRUZ, Av.

Brasil 4365, 21045-900 Rio de Janeiro, RJ, Brazil.

ABSTRACT

The impact of amino acid differences characteristic of each hepatitis B virus (HBV)

genotype on the sensitivity of the surface antigen (HBsAg) detection has been poorly

investigated. The aim of this study was to examine whether or not the amino acid

sequence heterogeneity of HBV surface proteins from genotypes A, D and F may

affect HBsAg detection by a commercial polyclonal-based assay. Three eukaryotic

expression plasmids, carrying consensus sequences for middle (M) surface protein

from genotypes A, D and F, were constructed. Additionally, M and small (S) plasmids

carrying natural point variations were also constructed. HBsAg levels were evaluated

in medium and extracts of transfected CHO cells by immunoassay. Higher levels of

HBsAg were obtained with plasmids coding for M protein than their respective S

forms. Among the consensus M plasmids, genotypes D and F displayed a reduction

of 37% and 30%, respectively on HBsAg detection values in comparison with those

obtained by genotype A. However, the presence of two single variations in S region

(T143M in genotype A, and T125M, genotype D) produced a decrease of 44% and

an increase of 34%, respectively, on HBsAg mean values than their consensus

forms. In conclusion, HBsAg detection levels varied among HBV genotypes.

However, single substitutions, such as T125M and T143M, may have more influence

on the patterns of HBsAg detection than the set of variations characteristic of each

HBV genotype.

Key words: hepatitis B virus, surface antigen, variations, transfection

INTRODUCTION

Hepatitis B virus (HBV), the prototypic member of the family Hepadnaviridae, is

an enveloped hepatotropic virus that causes acute and chronic human liver diseases,

including cirrhosis and hepatocellular carcinoma. HBV has been classified into eight

genotypes, designated A to H, based upon genetic divergence of 8% or more in the

complete nucleotide sequence [1-3]. HBV genotypes have a distinct prevalence in

different geographical regions [4, 5]. In Brazil, a country whose population is

miscigenated, HBV strains from genotypes A, D, and F are the most prevalent [6-8].

Genotype F, indigenous to South and Central Americas, is the most divergent

genotype. Due to their restricted geographical area of prevalence, HBV isolates from

genotype F have not been extensively studied with regard to immunological

characteristics.

HBV surface antigen (HBsAg) consists of three structurally related envelope

proteins: 1) small (S) protein (226 amino acid residues), the major constituent of HBV

envelope protein; 2) middle (M) protein, containing additional 55 amino acid residues

at the N-terminus of S protein; 3) large (L) protein, containing a further 108 or 119

residues (according to genotype) at the N-terminus of M protein. All three forms,

encoded by a unique open reading frame on the HBV genome, are cotranslationally

inserted into the endoplasmic reticulum (ER) as transmembrane proteins. Virions and

the abundant form of non-infectious 22 nm-particles found in infected sera possess

high quantities of S protein and lower quantities of M and L surface proteins [9-11].

The HBsAg main antigenic determinant (a determinant) is encoded by amino

acid residues from 124 to 147 within the major hydrophilic loop of HBsAg (amino

acids 101 to 164) [12]. The a determinant is the major immune target for antibodies

either used for immuno-prophylaxis or in assays for detection of HBsAg [13]. It has

been demonstrated that some specific mutations in and around the a determinant

may change HBsAg antigenicity leading to escape detection by certain commercial

HBsAg assays [14, 15]. The most relevant mutations seem to be the G145R, K141E

and T131I, since they markedly affect the antigenic structure of HBsAg [16]. On the

other hand, some natural amino acid variations in and around the a determinant are

linked to genotypes, as substitutions in non-conserved residues from positions 110,

114, 118, 122, 127, 131, 134, 140, 143, 158, 159 and 161 [12, 17]. The impact of

HBV genotypes on HBsAg detection has so far been poorly investigated. It has been

related that HBV genotypes may influence the sensitivity of some HBsAg commercial

assays [18].

Herein, recombinant plasmids coding consensus sequences for M protein from

genotypes A, D and F were constructed. Additionally, M and S plasmids carrying

natural point variations within the a determinant were also constructed. We

investigated whether or not the genetic heterogeneity of these genotypes, may

influence HBsAg detection by a commercial polyclonal-based assay. We also

analyzed the influence of the different forms of HBV surface proteins on the patterns

of HBsAg detection. Unique amino acid variations of a specific HBV isolate seem to

have more influence on detection of surface proteins than the set of natural specific

replacements characteristic of the genotypes studied here.

METHODS

Construction of HBsAg Expression Plasmids

HBV DNA was extracted from 250 µl of serum using phenol/chloroform [19].

PreS2/S and S genomic regions were PCR amplified in two independent assays.

Sense oligonucleotide primers PS4H (5’-CCCAAGCTTACACTCATCCTCAGGCCAT

GCAGTG-3’, nt positions 3194-3218) and S1H (5’-CCCAAGCTTCTTCTCGAGGAC

TGGGGACC-3’, nt positions 124-143) were designed with a HindIII restriction site at

their 5’ end and used to amplify preS2/S and S regions, respectively. Two reverse

primers, located at the same position (nt 819-841) in the HBV genome and designed

with an EcoRV restriction site at their 5’ ends, were utilized: S2E (5’- ATGGATATCG

GGTTTAAATGTATACCCAAAGA-3’) for amplification of HBV DNA from genotypes A

and D, and S22E (5’-ATGGATATCGTATTTAAATGGATACCCACAGA-3’) for

genotype F. PCR products were digested with HindIII and EcoRV and cloned into the

polylinker region of the mammalian cell expression vector pcDNA3 (Invitrogen, San

Diego, CA).

Nucleotide Sequencing of Cloned HBV DNA

Recombinant plasmids were purified by using S.N.A.P. Midiprep kit

(Invitrogen). HBV nucleotide sequences were determined using BigDye Terminator

kit (Applied Biosystems, Foster City, CA) with T7 and SP6 primers, flanking the

vector cloning site, as well as specific internal HBV primers. Sequencing reactions

were analyzed on ABI3730 automated sequencer (Applied Biosystems).

Bioinformatics analysis of the sequences was performed using MEGA version 3.1

and BioEdit version 7.0.9.0.

Transient Transfection Assays

Transient transfection assays were performed using Chinese hamster ovary

(CHO) cells grown in 199 Earle’s medium supplemented with 10% fetal bovine

serum. Cells were plated at a density of 5 x 10

cells per well of 6-well plates and

transfected with 2 μg of HBsAg expressing plasmid using FuGENE 6 (Roche

Diagnostics, Mannheim, Germany), according to the manufacturer’s instructions.

Culture supernatants were collected on day 5 after transfection and clarified by

centrifugation at 1,500g for 5 min. To evaluate HBsAg levels inside cells, cell

monolayers were washed twice with phosphate buffered saline (PBS), scraped with 1

ml of PBS and centrifuged at 2,500g for 5 min. Cell pellets were freezed/thawed

three times and resuspended in 0.4 ml of PBS. Medium and cell extracts were tested

for the presence of HBsAg by a commercial immunoassay that uses polyclonal

antibodies for both capture and detection (BioELISA HBsAg colour, Biokit, Barcelona,

Spain). Mock-transfected CHO cells were used as negative control.

RESULTS

Amino Acid Sequence Variations of the HBV Expression Plasmids

HBV DNA was extracted from a number of serum samples and preS2/S region

was amplified and sequenced. The genotypes of the HBV isolates were determined

by the construction of a phylogenetic tree, comparing the PCR sequences to DNA

database sequences from genotypes A, D and F (not shown). Three sera that

showed HBV DNAs identical to consensus sequences from genotypes A, D and F,

respectively, were selected for plasmid construction.

A total of eight recombinant plasmids designated as M-Acons, M-A, S-A, M-

Dcons, M-D, S-D, M-Fcons, and S-Fcons, were constructed. Among plasmids coding

the HBV surface M protein, plasmids M-Acons, M-Dcons and M-Fcons carry

consensus sequences of genotypes A, D and F, respectively. Plasmids M-A and M-D

encode variant M sequences of genotypes A and D that were also detected after

sequencing of the clones. Plasmids that carry S protein sequences are S-A (variant S

protein of genotype A), S-D (variant S protein, genotype D) and S-F (consensus S

protein, genotype F). Plasmids M-Acons, M-A and S-A, as well as, M-Dcons, M-D

and S-D, have identical S regions, with the exception of the amino acid substitutions

T143M, found in plasmids M-A and S-A, and T125M, in plasmids M-D and S-D.

The comparison of M and S amino acid sequences deduced from recombinant

plasmids, with a consensus sequence from genotype A, is shown in Fig. 1.

Additionally, two consensus sequences, one representing genotype D and other

representing genotype F, were added into the alignment for identification of genotype

linked substitutions. Most of the amino acid variations occurring in HBV sequences of

the expression plasmids were genotype-specific replacements. However, amino acid

substitutions T125M and T143M, both located within the a determinant of HBsAg,

were specific variations of each HBV isolate (shaded in Fig. 1).

HBsAg Detection by ELISA

Fig. 2 shows the levels of HBsAg detected in culture medium of CHO cells after

transient transfection assays with the recombinant plasmids. Among plasmids coding

the consensus sequences of M protein, plasmid M-Acons displayed the highest

values of HBsAg in all transfection assays in comparison with genotypes D and F

(Fig. 2a). The mean values of four independent assays showed a reduction of 30%

and 37% in HBsAg detection values for genotypes F and D, respectively, in

comparison with genotype A (Fig. 2a). Median values were very similar to mean

values, indicating that results did not vary considerably from one experiment to

another (Fig. 2a).

Interestingly, the presence of the single amino acid variation T125M in plasmid

M-D conferred an increase of 34% in mean values of HBsAg in comparison with

plasmid M-Dcons. In addition, plasmid M-A that had the unique substitution T143M,

displayed a reduction of 44% in mean values of HBsAg in comparison with plasmid

M-Acons (Fig. 2b).

The comparison between M and S surface proteins, showed higher HBsAg

detection levels for M constructs than their respective S plasmids. The mean values

of HBsAg detection observed for M-A, M-D and M-Fcons plasmids were 5%, 22%

and 43% higher than their S forms, respectively (Fig. 2c).

Although the values of HBsAg detected in cell extracts were lower than in

medium, all the results obtained for extracellular HBsAg were also observed for

intracellular HBsAg (not shown).

DISCUSSION

Due to the lack of proofreading activity of reverse transcriptase, HBV exhibits a

mutation rate more than 10-fold higher than other DNA viruses. The evolutionary rate

for the HBV genome in chronic hepatitis B is about 1.4 x 10

-5

to 3.2 x 10

-5

substitutions/site per year [20]. The different HBV genotypes are stable forms of the

virus, which are the result of random changes selected over years of population

pressure. On the other hand, HBV mutants arise in individuals under medically or

naturally (chronic hepatitis B) induced immune pressure [18]. It is known that some

specific mutations at the critical positions within HBsAg, most of them located in and

around the a determinant, may change the antigenicity of HBsAg [14, 21-24].

Zuckerman and Zuckerman, 1999]. However, the influence of amino acid variations

that are genotype-specific replacements of each genotype, on the sensitivity of

HBsAg commercial assays, is a matter that needs to be further investigated.

In the present study, plasmids containing genomic regions that express the two

(M and S) surface proteins of HBV strains from the three (A, D and F) genotypes

found in Brazil, were constructed and transfected into mammalian CHO cells. The

extracellular and intracellular HBsAg levels produced by these constructs were

evaluated by a commercial detection assay that uses polyclonal antibodies for both

capture and detection. A previous work that analyzed the ability of seven commercial

diagnostic assays, including the one used in our study, to detect HBsAg variants,

demonstrated that the samples were better detected by polyclonal than monoclonal

antibodies based assays [14]. Herein, detectable levels of HBsAg were observed in

both medium and extracts of cells transfected with all constructed plasmids.

However, the detection values of HBsAg varied among the different constructs.

Plasmids coding M protein from genotypes A, D and F displayed higher levels of

HBsAg detection than their respective S constructs. This may be explained by the

presence of polyclonal antibodies in the commercial immunoassay used here.

Therefore, M proteins were captured and detected by antibodies generated against

both preS2 and S regions, while S proteins were only detected by anti-S antibodies.

The possible influence of HBV genotypes on HBsAg detection assays may be

due to the presence in and around the a determinant of several amino acid variations

that are linked to each genotype. The set of amino acid variations T131N, S143T and

G159A; T114S, K122R, P127T, F134Y and Y161F; and I110L, P127L, T140S and

F158L are natural substitutions linked to genotypes A, D and F, respectively. Among

the consensus forms of M protein, the highest value of HBsAg, detected by the

immunoassay used here, was for genotype A, followed by F (reduction of 30% in

comparison with genotype A) and finally by D (reduction of 37% in comparison with

genotype A). Recently, one study has suggested a correlation between HBV

genotypes (A-D) and differential levels of extracellular HBsAg [25]. In this study,

levels of secreted HBsAg were most abundant for genotype A and remotely for D,

which was attributed to a higher transcription efficiency of preS/S mRNA by genotype

A than genotype D. However, in this case, HBsAg expression was performed by

plasmids carrying the entire HBV genome, and thus, the HBV natural promoters were

used in transcription process. Herein, HBsAg expression was under the strong CMV

promoter and it is expected the same efficiency of transcription for all constructs. In

our study, the sets of amino acid variations linked to genotypes D and F may have

influenced HBsAg detection levels, at least by the commercial assay used here. In

fact, the sensitivity of four commercial immunoassays for the detection of HBsAg

from genotypes A to F has been previously tested. The results showed that in the

concentration range between 0.1 and 0.5 ng/ml, one test failed to detect genotypes A

to D and F, and other test failed to detect genotype F [18].

Interestingly, the presence of the natural amino acid variations T125M in

plasmid M-D and T143M in plasmid M-A changed considerably the detection values

of HBsAg in comparison with their consensus plasmids. These results indicate that a

single variation may have more influence on HBsAg detection levels than the set of

amino acids characteristic of each HBV genotype. T143M variation, that promoted a

reduction of 44% on HBsAg mean values of M protein from genotype A, has been

previously detected in vaccinated and non-vaccinated children [26] and in three

asymptomatic individuals (one HBsAg negative, vaccinated person, and two HBsAg

positive, non-vaccinated subjects) [27]. In the latter study, T143M substitution was

detected along with the vaccine escape mutation G145R. Furthermore, it has been

reported failure of some commercial assays to detect mutants with an amino acid

substitution at position 143 [28, 29].

The other amino acid variation within the a determinant of HBsAg observed

here, was T125M. From a total of 91 HBV complete genome sequences from

genotype D available in GenBank, 16 (17,6%) sequences exhibited a Met residue at

position 125, whereas the remaining 75 (82,4%) sequences had a Thr residue at this

position. This variation represents a nonconservative amino acid substitution and

therefore, it may influence the conformation of HBsAg a determinant and the binding

of HBsAg-specific antibodies. A previous study has shown that the presence of the

single T125M substitution within the HBsAg did not inhibit the binding with polyclonal

and monoclonal antibodies [30]. In our study, T125M substitution led to an increase

of 34% on HBsAg mean values of M protein from genotype D in comparison with its

consensus form. Therefore, the presence of T125M substitution may influence

HBsAg conformation, leading to an improvement on HBsAg detection levels by the

commercial assay used here. Further studies should be conducted using plasmids

carrying the complete HBV genome, as well as, different expression systems and

commercial assays to analyze the influence of these substitutions on HBsAg

detection levels.

In conclusion, the detection by a commercial immunoassay of HBsAg produced

by recombinant plasmids, carrying the coding regions for HBV surface proteins M

and S from genotypes A, D and F, showed an influence of HBV genotypes on HBsAg

detection levels. However, unique amino acid substitutions not linked to genotypes,

such as T125M and T143M described here, should have more implications in HBV

immunological diagnostics than the natural amino acid variations characteristic of

each HBV genotype.

ACKNOWLEDGEMENTS

We thank the Genomic Platform-DNA Sequencing PDTIS/FIOCRUZ. This work was

supported by Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico

(CNPq) and by Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do

Rio de Janeiro (FAPERJ).

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Fig. 1: Differences in amino acid sequence alignment of M and S regions between

constructed plasmids and a consensus sequence of genotype A. Consensus

sequence of genotype A was originated from an alignment of 100 HBV complete

genome sequences from genotype A available in GenBank. Two other consensus

sequences, one of genotype D and other from genotype F, originated from 35 and 44

GenBank complete genome sequences, respectively, were used to identify

substitutions linked to genotypes. Shaded amino acids indicate variations specific for

each HBV isolate. Amino acid positions corresponding to a determinant are

underlined.

Fig. 2: Extracellular HBsAg levels detected by ELISA after transfection of CHO cells

with the constructed plasmids. HBsAg detection values are shown relative to M-

Acons values. (a) – HBsAg values obtained in each transfection assay for M

plasmids carrying consensus sequences, and the mean and median values from the

four independent experiments; (b) – HBsAg mean values of consensus and variant M

plasmids; (c) – HBsAg mean values of M plasmids and their respective S constructs.

Fig. 1

PreS2 S

10 20 30 40 50 10 20

Consensus A MQWNSTAFHQALQDPRVRGLYFPAGGSSSGTVNPAPNIASHISSISARTGDPVTNMENITSGFLGPLLVLQAGFFLLTRI

M-Acons ................................................................................

M-A ................................................................................

S-A .........................

Consensus D ......T...T.......................V.TT..PL...FS.I...AL..........................

M-Dcons ......T...T.......................V.TT..PL...FS.I...AL..........................

M-D ......T...T.......................V.TT..PL...FS.I...AL..........................

S-D .........................

Consensus F ......Q.....L.....A............Q....T...LT...FSK..G.AM..D.....L.........VC....K.

M-Fcons ......Q.....L.....A............Q....T...LT...FSK..G.AM..D.....L.........VC....K.

S-Fcons .D.....L.........VC....K.

30 40 50 60 70 80 90 100

Consensus A LTIPQSLDSWWTSLNFLGGSPVCLGQNSQSPTSNHSPTSCPPICPGYRWMCLRRFIIFLFILLLCLIFLLVLLDYQGMLP

M-Acons ................................................................................

M-A ................................................................................

S-A ................................................................................

Consensus D ...................TT.....................T.....................................

M-Dcons ...................TT.....................T.....................................

M-D ...................TT.....................T.....................................

S-D ...................TT.....................T.....................................

Consensus F ...................L.G.P...........L......T.....................................

M-Fcons ...................L.G.P...........L......T.....................................

S-Fcons ...................L.G.P...........L......T.....................................

110 120 130 140 150 160 170 180

Consensus A VCPLIPGSTTTSTGPCKT

CTTPAQGNSMFPSCCCTKPTDGNCTCIPIPSSWAFAKYLWEWASVRFSWLSLLVPFVQWFVG

M-Acons ................................................................................

M-A .....................................M..........................................

S-A .....................................M..........................................

Consensus D ........S.......R....T...T..Y........S...............G.F......A.................

M-Dcons ........S.......R....T...T..Y........S...............G.F......A.................

M-D ........S.......R..M.T...T..Y........S...............G.F......A.................

S-D ........S.......R..M.T...T..Y........S...............G.F......A.................

Consensus F ....L................L...T........S..S..............LG........A.........Q....C..

M-Fcons ....L................L...T........S..S..............LG........A.........Q....C..

S-Fcons ....L................L...T........S..S..............LG........A.........Q....C..

190 200 210 220

Consensus A LSPTVWLSAIWMMWYWGPSLYSIVSPFIPLLPIFFCLWVYI

M-Acons .........................................

M-A .........................................

S-A .........................................

Consensus D ........V..............L...L.............

M-Dcons ........V..............L...L.............

M-D ........V..............L...L.............

S-D ........V..............L...L.............

Consensus F .......LV...I.....N.C..L..........CY...S.

M-Fcons .......LV...I.....N.C..L..........CY...S.

S-Fcons .......LV...I.....N.C..L..........CY...S.

Fig. 2

(a)

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

T1 T2 T3 T4 Mean

Value

Median

Values Relative to M-Acons

M-Acons

M-Dcons

M-Fcons

(b)

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

M-Acons M-A M-Dcons M-D

Mean Values Relative to M-Acons

(c)

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

M-Acons M-A S-A M-D S-D M-Fcons S-Fcons

Mean Values Realtive to M-Acons

Artigo 3. Araujo NM, Vianna COA, Soares CC, Gomes SA 2008. A Unique Amino

Acid Substitution, L215Q, in the Hepatitis B Virus Small Envelope Protein of a

Genotype F Isolate That Inhibits Secretion of Hepatitis B Virus Subviral Particles.

Intervirology 51: 81–86.

Fax +41 61 306 12 34

E-Mail karger@karger.ch

www.karger.com

Short Communication

Intervirology 2008;51:81–86

DOI: 10.1159/000127430

A Unique Amino Acid Substitution, L215Q,

in the Hepatitis B Virus Small Envelope Protein

of a Genotype F Isolate That Inhibits Secretion

of Hepatitis B Virus Subviral Particles

Natalia M. Araujo

Carlos O.A. Vianna

Caroline C. Soares

Selma A. Gomes

Laboratório de Virologia Molecular, Instituto Oswaldo Cruz, and

Vice Diretoria de Desenvolvimento Tecnológico,

Bio-Manguinhos, FIOCRUZ, Rio de Janeiro , Brazil

Hepatitis B virus (HBV), the prototypic member of the

family Hepadnaviridae , is an enveloped hepatotropic vi-

rus that causes acute and chronic human liver disease,

including cirrhosis and hepatocellular carcinoma. HBV

surface antigen (HBsAg) consists of three structurally re-

lated envelope proteins named small (S), middle (M) and

large (L), due to the different sizes of their respective ami-

no-terminal ends. All three forms, encoded by a unique

open reading frame on the HBV genome, are cotransla-

tionally inserted into the endoplasmic reticulum (ER) as

transmembrane proteins

[1] . S-HBsAg is a 226-amino

acid glycoprotein that anchors into the ER membrane,

probably through four transmembrane (TM) segments.

The first segment (TM1), located in the amino-terminal

end of the protein (residues 4–24), is followed by (1) a cy-

tosolic loop (residues 24–80) comprising a T cell epitope

[2] , (2) segment TM2 (residues 81–100), and (3) an anti-

genic loop (residues 101–164), facing the ER lumen and

including the major B cell epitopes ( a determinant, resi-

dues 124–147)

[3] . The topology of the HBsAg carboxyl-

terminal domain (residues 165–226) is not precisely

known. This domain has been suggested to contain TM3

and TM4 segments (positions 173–193 and 202–222, re-

spectively), with a second cytosolic loop (residues 194–

201) separating them

[4] .

S-HBsAg is the main component of the HBV envelope,

is expressed at high levels in HBV infected cells, and has

the capacity to self-assemble into empty S-HBsAg-coated

Key Words

Hepatitis B virus surface antigen ؒ Secretion

Abstract

The small (S) envelope protein is the major component of

hepatitis B virus surface antigen (HBsAg). Some mutations in

the S-HBsAg coding region may cause deficiency in the se-

cretion of both viral and empty subviral particles (SVPs) and

lead to accumulation of HBsAg inside the cells. In this study,

we identified a unique amino acid substitution (L215Q) in

the carboxyl-terminal end of S-HBsAg of an HBV genotype F

isolate that provoked an inhibitory effect on secretion of

SVPs. HBsAg levels were measured daily by enzyme-linked

immunosorbent assay in the medium and cell extracts of

HuH7 and CHO cells transiently transfected with plasmids

containing wild-type or mutated S-HBsAg gene. Wild-type

HBsAg was detectable in both medium and cell extracts of

transfected cells. In contrast, extracellular levels of mutant

HBsAg were not higher than cut-off values. By immunofluo-

rescence with monoclonal antibody, it was shown that wild-

type HBsAg was distributed throughout the cytoplasm,

whereas mutant HBsAg was concentrated around the nucle-

us, suggesting retention in the endoplasmic reticulum. Ami-

no acid substitutions that inhibit HBsAg secretion, such as

that characterized in this study (L215Q), should have implica-

tions in HBV immunological diagnostics.

Received: November 6, 2007

Accepted: March 4, 2008

Published online: April 22, 2008

Natalia M. Araujo

Laboratório de Virologia Molecular

Instituto Oswaldo Cruz, FIOCRUZ, Av. Brasil 4365

21045-900 Rio de Janeiro, RJ (Brazil)

Tel. +55 21 2598 4374, Fax +55 21 2270 6397, E-Mail nmaraujo@ioc.fiocruz.br

0300–5526/08/0512–0081$24.50/0

Accessible online at:

www.karger.com/int

Araujo /Vianna /Soares /Gomes

Intervirology 2008;51:81–86

subviral particles (SVPs), without participation of nu-

cleocapsids

[5] . Due to their high immunogenicity, SVPs

have been used worldwide for hepatitis B vaccination

[6,

. Secretion of SVPs is independent of L-HBsAg and M-

HBsAg. However, secretion of mature virions needs both

L-HBsAg and S-HBsAg, while M-HBsAg is dispensable

[8, 9] . Some amino acid substitutions, most of them lo-

cated in the amino-terminal end of the S-HBsAg or in the

antigenic loop, have been found to lead to reduced secre-

tion levels of virions (G145R

[10] ), SVPs (R79K [11] ) or

both (L77R

[12] ; R169P [13] ). By mutational analysis, cys-

teine residues located at positions 48, 65, 69 and 107 have

been shown to be essential for SVP secretion

[14] . More-

over, Jenna and Sureau

[15] have shown that truncations

and combined deletion and insertion mutations in the

carboxyl-terminal end of HBsAg inhibit secretion of

SVPs.

In this study, we identified a unique substitution in the

putative S-HBsAg TM4 segment of an HBV genotype F

isolate that showed an inhibitory effect on SVP secre-

tion.

HBV DNA was extracted from a serum sample of a

hepatitis B e antigen (HBeAg), HBsAg positive patient.

The corresponding HBV isolate was previously charac-

terized as belonging to genotype F

[16] . The region cod-

ing for S-HBsAg was amplified by PCR using sense

oligonucleotide primer S1H (5-CCCAAGCTTCTTCT-

CGAGGACTGGGGACC-3 ؅ , nt positions 124–143) de-

signed with a Hin dIII restriction site at its 5 ؅ end, and

antisense primer S22E (5 ؅ -ATGGATATCGTATTTA-

AATGGATACCCACAGA-3 ؅ , nt positions 819–841), de-

signed with an Eco RV restriction site at its 5 ؅ end. PCR

products were digested with Hin dIII and Eco RV and

cloned into the polylinker region of the mammalian cell

expression plasmid vector pcDNA3 (Invitrogen, San

Diego, Calif., USA). Insert nucleotide sequences were de-

termined using BigDye Terminator kit (Applied Biosys-

tems, Foster City, Calif., USA) with T7 and SP6 primers,

as well as with specific internal HBV primers. Sequenc-

ing reactions were analyzed on an ABI3730 automated

sequencer (Applied Biosystems). Bioinformatics analysis

of the sequences was performed using MEGA version 3.1

and BioEdit version 7.0.9.0.

Transient transfection assays were performed using

(1) human hepatoma HuH7 cells maintained in Dulbec-

co’s modified Eagle medium supplemented with 10% fe-

tal bovine serum, and (2) Chinese hamster ovary (CHO)

cells grown in 199 Earle’s medium supplemented with

10% fetal bovine serum. Cells were plated at a density of

5 ! 10

per well of 6-well plates and transfected with

2 ␮ g of HBsAg expressing plasmid using FuGENE 6

(Roche Diagnostics, Mannheim, Germany), following

the manufacturer’s instructions. Medium and cell ex-

tracts were daily collected up to 6 days post-transfection.

Culture supernatants were clarified by centrifugation at

1,500 g for 5 min. To evaluate HBsAg levels retained in-

side cells, cell monolayers were washed twice with phos-

phate-buffered saline (PBS), scraped with 1 ml of PBS and

centrifuged at 2,500 g for 5 min. Cell pellets were freezed/

thawed three times and resuspended in 0.4 ml of PBS.

Medium and cell extracts were tested for the presence of

HBsAg by a commercial enzyme-linked immunosorbent

assay (BioELISA HBsAg color, Biokit, Barcelona, Spain).

Mock-transfected HuH7 and CHO cells were used as

negative controls.

Furthermore, cells were seeded into 8-well LAB-TEK

chamber slide (Nalge Nunc International, Naperville, Ill.,

USA) at a density of 10

cells/well and transfected the

next day with 0.2 ␮ g of plasmid DNA for immunofluo-

rescence assays. Two days after transfection, cells were

washed twice with PBS and fixed with 100% methanol for

5 min at room temperature. Cells were washed 5-fold for

2 min with PBS and air-dried. Fixed cells were then incu-

bated for 1 h at 37

° in a humid chamber with AG9, a mu-

rine monoclonal anti-HBs antibody

[17] , at a final con-

centration of 0.1 ␮ g/ ␮ l in PBS. After three washings with

PBS, the slide was incubated for 1 h 30 min at 37

° in the

dark in a humid chamber with Alexa fluor 488 chicken

anti-mouse IgG (H+L) antibody (Invitrogen), at a final

concentration of 5 ␮ g/ml in PBS-Evans blue. After four

washings with PBS, coverslips were mounted on buffered

glycerol and examined by immunofluorescence micros-

copy.

Fourteen of 15 sequenced clones displayed deduced

amino acid sequences identical to the consensus sequence

of HBV genotype F. The remaining one, however, showed

a unique amino acid variation (L215Q) in the carboxyl-

terminal end of S-HBsAg ( fig. 1 ). Plasmids SF-wt, con-

taining an amino acid sequence identical to the consen-

sus, SF-mut, and SD, encoding the S-HBsAg coding re-

gion of a genotype D isolate, were selected for trans-

fection.

Extracellular and intracellular levels of HBsAg pro-

duced up to 6 days after transfection of HuH7 and CHO

cells are shown in figure 2 . CHO cells were used addition-

ally to human hepatoma HuH7 cells because that cell line

has been shown to express recombinant HBV envelope

proteins

[18, 19] and a licensed vaccine [20] . In a general

manner, HBsAg detection levels were considerably higher

in HuH7 cells than in CHO cells. Maximum HBsAg levels

Detection of an Amino Acid Substitution

That Inhibits Secretion of HBV SVPs

Intervirology 2008;51:81–86

10 20 30 40 50 60 70 80

Consensus MDNITSGLLG PLLVLQAVCF LLTKILTIPQ SLDSWWTSLN FLGGLPGCPG QNSQSPTSNH LPTSCPPTCP GYRWMCLRRF

SFwt .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........

SFmut .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........

SD .E........ .......GF. ...R...... .......... ....TTV.L. .......... S......... ..........

90 100 110 120 130 140 150 160

Consensus IIFLFILLLC LIFLLVLLDY QGMLPVCPLL PGSTTTSTGP CKTCTTLAQG TSMFPSCCCS KPSDGNCTCI PIPSSWALGK

SFwt .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........

SFmut .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ..........

SD .......... .......... .........I ...S...... .R..M.T... ...Y.....T .......... .......F..

170 180 190 200 210 220

Consensus YLWEWASARF SWLSLLVQFV QWCVGLSPTV WLLVIWMIWY WGPNLCSILS PFIPLLPIFC YLWVSI*

SFwt .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......

SFmut .......... .......... .......... .......... .......... ....Q..... .......

SD F......... .......P.. ..F....... ..S....M.. ...S.Y.... ..L......F C...Y..

Fig. 1. Comparison of amino acid sequences of S-HBsAg deduced from recombinant plasmids SF-wt, SF-mut

and SD with a consensus sequence of genotype F. Consensus was originated from an alignment of 88 HBV

genotype F sequences 1 400 nt available in GenBank

[28] . Shaded residue represents the amino acid substitution

L215Q described in this study.

23456

Days posttransfectiona

HBsAg per 5 × 10

cells

HBsAg per 2.5 × 10

cells

HBsAg per 5 × 10

cells

HBsAg per 2.5 × 10

cells

HuH7 (1:50 dilution)

Extracellular

23456

Days posttransfection

HuH7 (1:50 dilution)

Intracellular

23456

Days posttransfection

CHO (undiluted)

Extracellular

23456

Days posttransfection

CHO (undiluted)

Intracellular

Fig. 2. HBsAg levels detected by ELISA after transfection of HuH7 and CHO cells. Values represent the ratio of

optical density (OD) at 450 nm and cut-off (CO) value. Values considered negative for HBsAg, according to the

manufacturer’s instructions, are under the dashed line. HBsAg levels after transfection of plasmids SD ( d ), SF-

wt ( + ) and SF-mut ( j ) are shown.

Araujo /Vianna /Soares /Gomes

Intervirology 2008;51:81–86

were reached 6 days post-transfection with plasmid SD.

HBsAg levels observed with plasmid SD were 99- and 26-

fold higher in HuH7 when compared to CHO cells in me-

dium and cell extracts, respectively. HBsAg was detect-

able in both medium and cell extracts of HuH7 ( fig. 2 a, b)

and CHO ( fig. 2 c, d) cells transfected with SF-wt and SD

plasmids. In contrast, HBsAg coded by SF-mut only gave

clearly positive values in HuH7 cell extracts ( fig. 2 b). In

medium of HuH7 and CHO cells ( fig. 2 a, c), values of HB-

sAg expressed by SF-mut plasmid were considered nega-

tive according to the commercial ELISA assay, showing a

strong deficiency in the secretion of SVPs.

To investigate the intracellular localization of HBsAg,

HuH7 and CHO cells transfected with plasmids, SF-wt

and SF-mut were examined by immunofluorescence mi-

croscopy using an anti-HBs monoclonal antibody. In

cells transfected with SF-wt, HBsAg showed a diffuse dis-

tribution throughout the entire cytoplasm ( fig. 3 b, e). In

contrast, HBsAg staining was predominantly found in

the perinuclear region of cells transfected with SF-mut

plasmid, with extensions into cytoplasm ( fig. 3 c, f), indi-

cating retention in the ER.

The influence of HBV genotype on HBsAg detection

has been poorly investigated so far. Recently, one study

has suggested a correlation between HBV genotypes (A–

D) and differential detection of extracellular levels of

HBsAg

[21] . Due to their restricted geographic area of

prevalence (South and Central Americas), HBV isolates

from genotype F have not been extensively studied with

regard to immunological characteristics. Here, HBsAg

levels produced after transfection were higher with SD

plasmid than with SF-wt in both HuH7 and CHO cells.

20.0 μm 20.0 μm

20.0 μm20.0 μm 20.0 μm

20.0 μm

Fig. 3. Immunofluorescence microscopy of HBsAg in HuH7 and CHO cells using a monoclonal anti-HBs an-

tibody.

a Mock-transfected HuH7 cells; b HuH7 transfected with SF-wt plasmid; c HuH7 transfected with SF-

mut plasmid;

d Mock-transfected CHO cells; e CHO transfected with SF-wt plasmid; f CHO transfected with

S F - m u t p l a s m i d .

Detection of an Amino Acid Substitution

That Inhibits Secretion of HBV SVPs

Intervirology 2008;51:81–86

The unique amino acid variation observed here, from

leucine to glutamine (L215Q) in the carboxyl-terminal

end of S-HBsAg of an HBV genotype F isolate, was re-

sponsible for a considerable inhibition of SVP secretion.

It is well known that mutated proteins that are not se-

creted can cause stress in the ER, affecting cellular tran-

scription via intracellular signaling pathways

[22, 23] . In

transgenic mice, inhibition of HBsAg secretion has been

related to the occurrence of cell injury mediated by inter-

feron- ␥

[24] . Furthermore, an association has been pro-

posed between HBsAg secretion inhibition and occult

HBV infection

[25] . Among 1,220 HBV sequences avail-

able in databanks, only two (sequence accession numbers

AY311358 [genotype F] and AF090842 [genotype A]) ex-

hibited an amino acid variation at residue 215. In both of

them, however, the substitution, from leucine to valine,

was conservative. The presence of charged or polar ami-

no acids in a TM segment has been shown to be crucially

involved in ER retention

[26, 27] . A previous study has

shown that a deletion of amino acid residues 214–218, and

replacement by a positively charged Lys residue, resulted

in deficient secretion of SVPs

[15] . Here, the substitution

of a nonpolar Leu residue by the strongly polar Gln at the

center (position 215) of TM4 segment may affect the con-

formation of HBsAg, possibly leading to defective inser-

tion into the ER membrane and intracellular retention.

Our present findings highlight the effect on SVP secre-

tion of amino acid substitutions in the carboxyl-terminal

end of S-HBsAg, other than those previously described

in the amino-terminal end of the protein as well as in the

antigenic loop

[11, 12, 14] .

Acknowledgements

We gratefully acknowledge Prof. C. Trepo and Dr. A. Kay for

providing HuH7 cells and Dr. C. Niel for helpful discussions. This

work was supported by Conselho Nacional de Desenvolvimento

Científico e Tecnológico (CNPq).

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Minuta para pedido de patente: Vetores de expressão do gene de superfície do

vírus da hepatite B (HBsAg) que permitem a inserção de epítopos de outros agentes

infecciosos em região estratégica do HBsAg: Modelo – Produção de quimeras do

HBsAg com a região hipervariável 1 da proteína E2 do vírus da hepatite C.

Projeto para Depósito de Patente

Título da Invenção: Vetores de expressão do gene de superfície do vírus da hepatite

B (HBsAg) que permitem a inserção de epítopos de outros agentes infecciosos em região

estratégica do HBsAg: Modelo – Produção de quimeras do HBsAg com a região

hipervariável 1 da proteína E2 do vírus da hepatite C.

Impacto: Desenvolvimento de vacinas bivalentes através da produção de antígenos

quiméricos do HBsAg com peptídeos de agentes de doenças relevantes.

Inventor(es):

FIOCRUZ

a) Nome: Selma de Andrade Gomes

Lotação (Laboratório/Unidade): Laboratório de Virologia Molecular/IOC

Vínculo com a instituição: (x) Empregado ( ) Bolsista ( ) Contratado

( ) Autônomo ( ) Outros _____________________

b) Nome: Natalia Motta de Araujo

Lotação (Laboratório/Unidade): Laboratório de Virologia Molecular/IOC

Vínculo com a instituição: (x) Empregado ( ) Bolsista ( ) Contratado

( ) Autônomo ( ) Outros _____________________

c) Nome: Elisabeth Lampe

Lotação (Laboratório/Unidade): Laboratório de Hepatites Virais/IOC

Vínculo com a instituição: (x) Empregado ( ) Bolsista ( ) Contratado

( ) Autônomo () Outros _____________________

Externos à FIOCRUZ

a) Nome: Alan Kay

Lotação (Laboratório/Unidade): INSERM U871

Vínculo com a instituição: ( ) Empregado ( ) Bolsista ( ) Contratado

( ) Autônomo (x) Outros:

Colaborador Convênio FIOCRUZ/INSERM

RESUMO:

O gene de superfície do vírus da hepatite B (HBsAg) organiza-se em partículas

do tipo-viral “virus-like particles” (VLPs) em células eucarióticas. Esta estrutura

particulada do HBsAg foi utilizada como o primeiro antígeno recombinante

imunizante, que é ainda hoje, o produto inoculado na maioria das vacinas

disponíveis no mercado para a hepatite B. O gene “S” do HBsAg pode também ser

utilizado como uma estrutura carreadora de peptídeos imunogênicos para o

desenvolvimento de quimeras. As partículas de HBsAg quiméricas purificadas

podem ser utilizadas para o desenvolvimento de vacinas bivalentes. Uma outra

possibilidade é a utilização da estrutura genômica das quimeras para o

desenvolvimento de vacinas bivalentes pela técnica de DNA desnudo. No presente

trabalho, foram obtidos plasmídeos recombinantes contendo a região small S (S) de

um isolado brasileiro do subgenótipo A1 do HBV com a característica de possuir um

sítio único para EcoNI na posição 128 da proteína S. Posição esta que se encontra

dentro do principal determinante antigênico do HBV, o determinante “a” do HBsAg.

Dois vetores HBsAg (pSAa-VM1 e pSAa-VM2), permitindo um alto rendimento de

HBsAg, foram engendrados para expressão do HBsAg em células de mamíferos. Em

ambos, o produto clonado do HBsAg (aproximadamente 680 pb), está sob o

controle do promotor do CMV e diferem principalmente pela presença de um íntron

quimérico localizado abaixo do promotor do CMV, que possibilita um aumento dos

níveis de expressão viral. Para exemplificar a aplicação destes vetores HBsAg de

inserção de genes exógenos, construímos recombinantes quiméricos HBV-HCV.

Foram obtidos plasmídeos, denominados (pSAaHCV-VM1 e pSAaHCV-VM2)

contendo um fragmento de 127 pares de bases da região HVR1 do gene E2 do HCV

fusionados ao HBsAg pela inserção no sítio único EcoNI. A obtenção de plasmídeos

que codificam o gene S do HBV, nos quais é possível se inserir fragmentos de

outros genes, como o do envelope do HCV, torna estes vetores ferramentas valiosas

para produção de antígenos recombinantes que permitam, no futuro, o

desenvolvimento de vacinas duplas, contra o HBV e no caso o HCV.

BACKGROUND DA INVENÇÃO

A Organização Mundial de Saúde (OMS) calcula que mais de 350 milhões de

indivíduos no mundo sejam portadores crônicos do HBV e mais de 10% destes

pacientes têm risco de desenvolver cirrose e carcinoma hepatocelular (Jin et al.,

2002).

As variantes do HBV estão classificadas atualmente em oito genótipos (A-H)

através da comparação de seqüências nucleotídicas do gene S ou do genoma

completo (Magnius & Norder, 1995; Arauz-Ruiz et al., 2002; Stuyver et al., 2000). Os

genótipos do HBV não estão uniformemente distribuídos pela população mundial.

Sendo assim, o genótipo A é pandêmico e o seu genoma possui 3.221 pares de

bases (pb); os genótipos B e C são encontrados na Ásia e os seus genomas

possuem 3.215 pb; o genótipo D é encontrado no Mediterrâneo, possuindo 3.182 pb

no seu genoma, o genótipo E somente é encontrado na África com um genoma de

3.212 pb; o genótipo F é encontrado entre os ameríndios e na Polinésia com um

genoma de 3.215 pb, enquanto que o genótipo G é encontrado nos Estados Unidos

e na Europa, possuindo um genoma de 3.248 pb. Apresentando grande semelhança

com o genótipo F, o genótipo H foi encontrado em duas amostras: uma na Nicarágua

e uma na Califórnia e estaria relacionado às populações ameríndias. No Brasil,

devido à miscigenação da população, três genótipos majoritários (A, D e F) são

encontrados. Recentemente, foi demonstrado que a maioria dos isolados que

circulam no Brasil são do genótipo A, subgenótipo Aa (ou A1) com origem

provavelmente africana (Araujo et al., 2004).

O HBV apresenta um mecanismo único entre os vírus que infectam o homem,

o qual permite a produção de diferentes tipos de partículas virais. Em preparações

para a microscopia eletrônica de soro de indivíduos infectados, três formas de

partículas são observadas: partículas completas infecciosas (42 nm), partículas

incompletas não infecciosas esféricas (22 nm) e partículas incompletas não

infecciosas filamentosas (22 nm).

O genoma do HBV é um dos menores entre os vírus que infectam o homem,

abrangendo aproximadamente 3.200 pb. Este genoma é composto por uma

molécula de DNA circular parcialmente fita dupla. A fita maior é complementar aos

RNAs virais e por convenção possui polaridade negativa (fita negativa). O genoma

do HBV é totalmente codificante e apresenta quatro fases de leitura aberta

designadas de pre-S/S, pre-C/C, P e X. Através de um engenhoso sistema que

sobrepõe as fases de leitura aberta, todos os genes do vírus estão intimamente

ligados e o HBV pode produzir aproximadamente 50% mais proteínas do que o

esperado para o tamanho do seu genoma (Ganem & Varmus, 1987).

A região genômica pre-S/S codifica as proteínas de superfície viral que

compõem o HBsAg; pre-C/C é responsável pela síntese do antígeno do core

(HBcAg) e do antígeno e (HBeAg); o gene P codifica a polimerase viral; a região X

sintetiza uma proteína regulatória, chamada de proteína X.

A região pre-S/S, inclui as regiões pre-S1, pre-S2 e S, com três códons de

iniciação na mesma fase de leitura. A proteína de maior tamanho, L “large“ (400 aa),