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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO – UFRJ
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE – CCS
INSTITUTO DE MICROBIOLOGIA PROF. PAULO DE GÓES – IMPPG
Análise molecular de amostras clínicas e ambientais de micobactérias não
associadas à tuberculose
Simone Gonçalves Senna
Rio de Janeiro, junho de 2008
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ii
Simone Gonçalves Senna
Análise molecular de amostras clínicas e ambientais de micobactérias não
associadas à tuberculose
Orientadores: Profa. Leila de Souza Fonseca
Dr. Philip Noel Suffys
Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Ciências (Microbiologia), Instituto de
Microbiologia Prof. Paulo de Góes da Universidade Federal do
Rio de Janeiro, como parte dos requisitos necessários à
obtenção do título de Doutor em Ciências Biológicas
(Microbiologia).
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO
INSTITUTO DE MICROBIOLOGIA PROF PAULO DE GÓES
RIO DE JANEIRO
JUNHO DE 2008
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iii
FICHA CATALOGRÁFICA
Senna, Simone Gonçalves
Análise molecular de amostras clínicas e ambientais de
micobactérias não associadas à tuberculose/Simone Gonçalves
Senna – Rio de Janeiro: UFRJ/IMPPG, 2008.
xvii, 155 f.
Tese [Doutorado em Ciências (Microbiologia)]
Universidade Federal do Rio de Janeiro/Instituto de Microbiologia
Prof. Paulo de Góes, 2008.
Orientadores: Leila de Souza Fonseca e Philip Noel Suffys
Referências bibliográficas: f. 108.
1. Micobactérias não causadoras de tuberculose. 2. Biologia
Molecular. 3. Gênero Mycobacterium. 4. PRA. 5. Seqüenciamento. I
Fonseca, Leila de Souza e Suffys, Philip Noel. II Universidade
Federal do Rio de Janeiro, Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de
Góes, Doutorado em Ciências (Microbiologia). Análise molecular de
amostras clínicas e ambientais de micobactérias não associadas à
tuberculose.
iv
FICHA DE APROVAÇÃO
Simone Gonçalves Senna
Análise molecular de amostras clínicas e ambientais de micobactérias não
associadas à tuberculose
Rio de Janeiro, 30 de junho de 2008.
(Dra. Leila de Souza Fonseca, Instituto de Microbiologia – IMPPG/UFRJ)
(Dr. Rafael Silva Duarte, Instituto de Microbiologia – IMPPG/UFRJ)
(Dra. Lucy Seldin, Instituto de Microbiologia – IMMPG/UFRJ)
(Dra. Fernanda C. Q. Mello, Faculdade de Medicina – HUCFF/UFRJ)
(Dra Maria Helena Feres Saad, Fundação Oswaldo Cruz – IOC/FIOCRUZ)
v
O presente trabalho foi realizado no Laboratório de Micobactérias, Departamento de
Microbiologia Médica, Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes, Centro de
Ciências da Saúde (CCS), Universidade Federal do Rio de Janeiro, sob a orientação
da Profa. Leila de Souza Fonseca e do Dr. Philip Noel Suffys.
vi
AGRADECIMENTOS
À Deus, pelas experiências, por estar sempre comigo, pela Sua Luz que me ilumina
todos os dias, me mostrando que tudo é sempre possível se for para o bem!
À Profa. Leila, pela pessoa maravilhosa que ela é! Pela oportunidade de trabalho em
seu laboratório e sua orientação, pelo exemplo de profissional ética e disposta, como poucos, e
que não me deixou desistir nunca! Este exemplo e admiração eu vou levar para sempre!
Obrigada por tudo!
Ao Dr. Philip Suffys pela orientação, ensinamentos, companheirismo, pela ajuda, por
me entender sempre, por me permitir conviver com ele e me mostrar que é na diferença que
crescemos e aprendemos, muito obrigada!
Ao Prof. Maurício Bogo pela prazerosa experiência no seu laboratório e ajuda no
momento em que eu mais precisei, obrigada!
À Dra. Geane Ribeiro da Silveira pelos momentos incansáveis de incentivo, conversas,
aprendizado, apoio e por acreditar em mim, mas do que eu mesma muitas vezes acreditei,
muito obrigada!
À grande amiga Marta Osório Ribeiro pelo companheirismo e amizade incondicionais,
pela ajuda, momentos de conversa, consolos e, principalmente, pelos momentos de alegria,
muito obrigada!
À amiga Juliana Cordeiro da Costa pelo companheirismo, longas conversas, amizade
e, principalmente, pela paciência, muito obrigada amiga!
Às amigas Jacqueline Piccoli e Jaqueline Battilana pelo companheirismo,
ensinamentos, por acreditarem no trabalho e por me incentivarem sempre, muito obrigada!
Ao meu mestre Marlei, por tudo! Pelos ensinamentos sempre bem vindos, disposição,
alegria, esperança, paciência, amizade e por ter me permitido a convivência maravilhosa, muito
obrigada!
Às amigas Ana Carolina, Paula, Carla, Juliana e Silvana pela amizade,
companheirismo, alegria, por me ajudarem sempre, muito obrigada!
vii
À Dra. Érica Chimara pelos ensinamentos, paciência, ajuda e pelo exemplo de pessoa
que ela é, obrigada!
Ao Rafael Duarte pelos conselhos e considerações na tese, muito obrigada!
Aos colegas do Laboratório de Micobactérias – Instituto Professor Paulo de Góes pela
prazerosa convivência e disposição de todos sempre!
Aos colegas do Laboratório de Biologia Molecular Aplicada a Micobactérias –
FIOCRUZ/IOC, eternos e admiráveis companheiros!
Aos colegas do Laboratório de Biologia Genômica e Molecular da PUCRS, pela
convivência e ensinamentos.
Aos colegas do Laboratório de Biologia Molecular – Laboratório Central do Rio Grande
do Sul – FEPPS/LACEN-RS em especial à Irina Becker, Daniela Becker e Marilda Rosa.
Aos colegas do Laboratório de Tuberculose – Laboratório Central do Rio Grande do Sul
– FEPPS/LACEN-RS em especial a Ludmila Baethgen, Rosa Maria Castro, Simone David e
Gessy.
Ao Prof. Diógenes dos Santos, à Profa. Cristina Jeckel e ao Prof. Homero Dewes pelo
apoio, indicações e por acreditarem em mim, muito obrigada!
À minha amada irmã Mariane Senna pela amizade incondicional, carinho,
companheirismo, alegrias e paciência, sem ela, certamente esta conquista não teria a mesma
graça, muito obrigada!
Aos meus amados pais Nelson Senna e Zilda Senna, pelo carinho, dedicação,
paciência e exemplo de vida, pois graças a eles eu consegui chegar até aqui, muito obrigada!
Devo tudo a vocês!
A todos que de alguma maneira contribuíram para realização deste trabalho.
Muito Obrigada!
viii
Dedico este trabalho à minha amada avó Elfrida Jass (in memorian), por todo seu amor e
carinho, pelo exemplo de vida e por todos os ensinamentos, mas, principalmente por sempre
ter estado ao meu lado, em todos os momentos!
Muito obrigada!
ix
“A alegria está na luta, na tentativa, no sofrimento envolvido, não na vitória propriamente dita”
Mahatma Gandhi
x
RESUMO
Simone Gonçalves Senna
Análise molecular de amostras clínicas e ambientais de micobactérias não
associadas à tuberculose
Orientadores: Profa. Leila de Souza Fonseca
Dr. Philip Noel Suffys
Resumo da Tese de Doutorado submetida ao Programa de Pós-Graduação em Ciências
(Microbiologia), Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes da Universidade Federal do Rio
de Janeiro, como parte dos requisitos necessários para a obtenção do título de Doutor em
Ciências (Microbiologia).
O gênero Mycobacterium compreende uma vasta gama de microrganismos,
incluindo os agentes patogênicos oportunistas e espécies saprófitas. As micobactérias
não causadoras de tuberculose (MNT) têm sido associadas com uma variedade de
doenças incluindo, infecções pulmonares, de linfonodos, pele e infecções
nosocomiais, incluindo surtos. O diagnóstico preciso é um desafio devido à crescente
dificuldade de determinar com precisão a espécie. A identificação fenotípica das MNT
é baseada nos testes bioquímicos, que são laboriosos e, muitas vezes, proporcionam
resultados errados ou inconclusivos. Os métodos moleculares mostram-se rápidos e
precisos na identificação das espécies. A identificação das espécies de MNT de
amostras clínicas é essencial para o tratamento do paciente. No presente estudo
foram analisadas 177 amostras ambientais (43) e clínicas (134) através do método
molecular PCR com análise por enzimas de restrição (PRA-hsp65) e pelo
seqüenciamento do gene hsp65. Os resultados do PRA-hsp65 e os métodos
tradicionais foram concordantes em 70%. A identificação da MNT usando PRA-hsp65
mostrou-se confiável para ser utilizado como a metodologia de identificação de rotina
no laboratório. As análises filogenéticas revelaram uma diversidade genética de
0,06590 entre as espécies isoladas das amostras clínicas e ambientais.
Palavras-chave: Mycobacterium, MNT, Biologia Molecular, PRA-hsp65, Seqüenciamento,
gene hsp65.
Rio de Janeiro, junho de 2008.
xi
ABSTRACT
Simone Gonçalves Senna
Análise molecular de amostras clínicas e ambientais de micobactérias não
associadas à tuberculose
Orientadores: Profa. Leila de Souza Fonseca
Dr. Philip Noel Suffys
Resumo da Tese de Doutorado submetida ao Programa de Pós-Graduação em Ciências
(Microbiologia), Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes da Universidade Federal do Rio
de Janeiro, como parte dos requisitos necessários para a obtenção do título de Doutor em
Ciências (Microbiologia).
The genus Mycobacterium comprises a wide range of microorganisms,
including opportunistic pathogens and saprophytic species. The nontuberculous
mycobacteria (NTM) have been associated with a variety of diseases including
pulmonary, lymph node, skin and disseminated infections as well as including during
nosocomial outbreaks. The precise diagnosis has been a challenge in recent years due
to the increasingly difficulty to accurately determine the species. Identification of NTM
based on phenotypic tests is time-consuming, labor-intensive, expensive and often
provides erroneous or inconclusive results. DNA-based methods offer the promise of
rapid and accurate species identification. The identification of mycobacterial species in
clinical isolates is essential for patient care decisions. We present a total of 177
environmental (43) and clinical (134) isolates studied for restriction fragment length
polymorphism analysis (PRA) and sequencing hsp65 gene. The results of PRA - hsp65
and traditional methods were concordant in 70%. The identification of NTM using PRA-
hsp65 was sufficiently reliable to serve as the methodology in laboratory.
Phylogenetically analysis showed a genetic diversity of 0.06590 between clinical and
ambiental species.
Kew-words: Non tuberculous mycobacteria, Mycobacterium, Molecular Biology, Sequencing,
hsp65 gene.
Rio de Janeiro, junho de 2008.
xii
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO............................................................................................................ 16
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA........................................................................................ 19
2.1. Taxonomia............................................................................................................... 19
2.2. Ácidos Micólicos ...................................................................................................... 23
2.3. Complexo Mycobacterium tuberculosis.................................................................... 25
2.4. Micobactérias não causadoras de tuberculose (MNT).............................................. 26
2.5. Biofilmes.................................................................................................................. 29
2.6. Infecção e Doença................................................................................................... 31
2.7. Epidemiologia .......................................................................................................... 33
2.8. Genética das MNT................................................................................................... 37
2.9. Identificação das MNT ............................................................................................. 39
2.10. Identificação Fenotípica......................................................................................... 39
2.11. Identificação Genotípica......................................................................................... 40
3. JUSTIFICATIVA.......................................................................................................... 47
4. OBJETIVOS................................................................................................................ 48
4.1. Objetivo Geral.......................................................................................................... 48
4.2. Objetivos Específicos............................................................................................... 48
5. METODOLOGIA......................................................................................................... 49
5.1. Amostragem ............................................................................................................ 49
5.2. Número Amostral..................................................................................................... 49
5.3. Cultivo das Micobactérias ........................................................................................ 50
5.4. Identificação Fenotípica........................................................................................... 50
5.5. Identificação Genotípica........................................................................................... 51
5.5.1. Extração de DNA.................................................................................................. 51
5.5.2. Amplificação do DNA pela PCR (Polimerase Chain Reaction).............................. 53
5.5.2.1. Oligonucleotídeos para reação da PCR............................................................. 53
5.5.2.2. Reação da PCR................................................................................................. 53
5.5.2.3. Controle de Qualidade da reação da PCR ......................................................... 53
5.5.2.4. Condições da reação da PCR............................................................................ 54
5.5.2.5. Detecção do produto amplificado....................................................................... 54
5.5.3. PCR com análise por enzimas de restrição (PRA)................................................ 54
5.5.3.1. Digestão pelas enzimas de restrição.................................................................. 54
5.5.3.2. Análise da digestão............................................................................................ 55
xiii
5.6. Seqüenciamento do gene hsp65.............................................................................. 57
5.6.1. Purificação do produto amplificado ....................................................................... 57
5.6.2. Seqüenciamento................................................................................................... 57
5.6.3. Espécies de referência.......................................................................................... 57
5.6.4. Análise do seqüenciamento.................................................................................. 60
6. RESULTADOS ........................................................................................................... 61
6.1. Identificação Fenotípica........................................................................................... 61
6.2. Identificação molecular ............................................................................................ 68
6.2.1. PCR...................................................................................................................... 68
6.2.2. PRA-hsp65 ........................................................................................................... 69
6.2.3. Comparação dos resultados de identificação entre o PRA-hsp65 e as Provas
Bioquímicas.................................................................................................................... 72
6.2.4. Seqüenciamento do gene hsp65........................................................................... 75
6.2.5. Seqüenciamento e análise filogenética................................................................. 77
6.2.6. Seqüenciamento e Identificação ........................................................................... 84
7. DISCUSSÃO............................................................................................................... 85
8. CONSIDERAÇÕES FINAIS.......................................................................................104
9. LIMITAÇÕES DO ESTUDO.......................................................................................106
10. PERSPECTIVAS .....................................................................................................107
11. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.........................................................................108
12. ANEXOS..................................................................................................................121
xiv
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Desenho esquemático da estrutura da parede celular
micobacteriana (adaptada de PARSONS et al., 1997).
24
Figura 2. Ácidos micólicos: R1 e R2 representam as cadeias de
carbono de tamanhos variáveis (adaptada de PARSONS et al., 1997).
25
Figura 3. Regiões específicas de clivagem das enzimas de restrição
utilizadas no método PRA.
54
Figura 4. Chave de identificação de espécies de MNT pelo método
molecular PRA-hsp65.
56
Figura 5. Seqüência parcial do gene hsp65 de uma amostra de escarro
ilustrando os iniciadores e o produto amplificado.
68
Figura 6. Gel de agarose 1% corado com brometo de etídio visualizado
em transluminador U.V. com as amostras de amplificação de 441pb do
gene hsp65.
68
Figura 7. Gel de agarose 3% corado com brometo de etídio e
visualizado em transluminador U.V. Clivagem do produto amplificado de
7 amostras com as enzimas BstEII e HaeIII.
69
Figura 8. Gel de agarose 3% corado com brometo de etídio e
visualizado em transluminador U.V. Clivagem do produto amplificado de
8 amostras com as enzimas BstEII e HaeIII.
70
Figura 9. Eletroferograma de uma seqüência de nucleotídeos da região
parcial de 441 pb do gene hsp65.
76
Figura 10. Árvore filogenética ilustrando a análise da seqüência parcial
do gene hsp65 das amostras ambientais e clínicas comparadas com as
seqüências das espécies de referência retiradas do GenBank.
82
xv
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Micobactérias de acordo com os grupos de risco de infecção
em humanos.
29
Tabela 2. Relação das amostras utilizadas no estudo, incluindo período,
local de isolamento e espécime.
49
Tabela 3. Resultado das Provas Bioquímicas das amostras clínicas de
crescimento rápido.
62
Tabela 4. Resultado das Provas Bioquímicas das amostras clínicas de
crescimento lento.
64
Tabela 5. Resultado das Provas Bioquímicas das amostras ambientais
de crescimento lento.
65
Tabela 6. Relação de amostras clínicas e ambientais de crescimento
rápido sem identificação pelas provas bioquímicas.
66
Tabela 7. Relação de amostras clínicas e ambientais de crescimento
lento sem identificação pelas provas bioquímicas.
66
Tabela 8: Relação dos padrões de PRA-hsp65 obtidos no estudo de
acordo com a análise das clivagens pelas enzimas de resrição.
72
Tabela 9. Discordância na identificação das amostras entre o PRA e as
provas bioquímicas.
74
Tabela 10. Resumo da análise dos resultados obtidos entre as provas
bioquímicas e o PRA.
75
Tabela 11. Informações sobre os polimorfismos na seqüência parcial do
gene hsp65 das amostras analisadas.
78
Tabela 12. Comparação da variabilidade genética das amostras
analisadas pelo seqüenciamento parcial do gene hsp65.
79
xvi
LISTA DE QUADROS
Quadro 1. Classificação das micobactérias de acordo com tempo de
crescimento e pigmentação das colônias.
22
Quadro 2. Variedade de espécies existente no gênero Mycobacterium. 23
Quadro 3. Esquemas de tratamento recomendado para as espécies de
MNT mais conhecidas que causam doença, considerando os fármacos
disponíveis.
33
xvii
LISTA DE ABREVIATURAS SÍMBOLOS E UNIDADES
AIDS Acquired Immunodeficiency Syndrome
BAAR Bacilo Ácido Ácool Resistente
BCG Bacille Calmette-Guérin
BIC Bayesian Information Criterion
BLAST Basic Local Aligment Search Tool
ºC Graus Celsius
CMT Complexo Mycobacterium tuberculosis
CTAB Brometo de cetiltrimetilamônio
DNA Ácido desoxirribonucléico
dNTPs Deoxirribonucleotídeo trifosfato
EMB Etambutol
HAART Highly Active Anti-Retroviral Therapy
HCl Ácido clorídrico
HIV Human Immunodeficiency Virus
HPLC High-Performance Liquid Chromatography
hsp65 Gene codificado pela proteína de choque térmico 65-KDa
INH Isoniazida
ITS Internal Transcribed Spacer
Kb Quilobase
KCl Cloreto de potássio
kDa Quilodalton
M Molaridade
MAC Mycobacterium avium complex
MgCl
2
Cloreto de magnésio
Min Minutos
mM Micromolaridade
ML Maximum-Likelihood
mL Mililitro
mm
3
Milímetro cúbico
MNT Micobactérias não causadoras de tuberculose
MOTT Mycobacteria other then tuberculosis
NaCl Cloreto de sódio
ng Nanograma
NJ Neighbour-Joining
pb Pares de base
PCR Polymerase Chain Reaction
pmol Picomol
PRA PCR restriction analysis
PZA Pirazinamida
RFLP Restriction Fragment Length Polymorphisms
RGM Rapidly Growing Mycobacteirum
RMP Rifampicina
RNA Ácido ribonucléico
Rpm Rotações por minuto
SDS Dodecilsulfato de sódio
Seg. Segundos
SM Estreptomicina
TB Tuberculose
TBE Tris borato + EDTA
TE Tris+ EDTA
Tris Tris(hdroxi-metil) aminometano
U Unidade
U.V. Radiação ultravioleta
V Volts
µL Microlitro
INTRODUÇÃO
16
1. INTRODUÇÃO
O gênero Mycobacterium, único da família Mycobacteriaceae, é
constituído por espécies do complexo Mycobacterium tuberculosis e outras que
atualmente são denominadas micobactérias não tuberculosas ou não
causadoras de tuberculose (MNT) (BROSCH et al., 2002). Devido a muitas
semelhanças bioquímicas, as micobactérias, são agrupadas com os gêneros
Corynebacterium, Nocardia, e Rhodococcus, dentro da ordem Actinomycetales.
O gênero Mycobacterium é composto por organismos aeróbios e
imóveis, não esporulados, com forma de bastonetes delgados, retos ou
ligeiramente encurvados. As micobactérias raramente são ramificadas e
dispostas isoladamente, estão geralmente aos pares ou em pequenos grupos
(WRIGHT & WALLACE, 1994). Os organismos pertencentes ao gênero
Mycobacterium são definidos pela sua forma de bacilos álcool-ácido resistentes
(BAAR). A coloração de Ziehl-Neelsen é normalmente utilizada para esfregaços
clínicos provenientes de indivíduos com suspeita de infecções por
micobactérias, mas é limitado pela sua falta de sensibilidade. Além do BAAR
outros critérios são aplicados para a identificação deste gênero, tais como:
conteúdo GC (guanina, citosina) do genoma, perfil de ácidos micólicos,
morfologia e pigmentação. O diagnóstico das doenças pulmonares (mais
comuns) causadas por micobactérias é realizado através da avaliação clínica e
radiológica do paciente, dos testes intradérmicos (PPD/Mantoux), baciloscopia
e cultura. Estudos bioquímicos e de tempo de crescimento, são utilizados para
identificação de espécie, contudo são demorados e, muitas vezes, não
permitem diferenciar as espécies dificultando o diagnóstico (MINISTÉRIO DA
SAÚDE, 2005). Métodos de identificação mais modernos auxiliam o
INTRODUÇÃO
17
diagnóstico, estes incluem o método de análise dos ácidos micólicos por
cromatografia através de High Perfomance Liquid Chromatography (HPLC), o
uso de sondas de DNA e a reação em cadeia da polimerase (polymerase chain
reaction – PCR) para análise de genes específicos, mostrando-se mais
específicos e rápidos para identificação de micobactérias (BUTLER &
GUTHERTZ, 2001).
As espécies mais importantes do gênero são as micobactérias
patogênicas estritas como as pertencentes ao complexo Mycobacterium
tuberculosis e o Mycobacterium leprae. As micobactérias não causadoras de
tuberculose são amplamente distribuídas no ambiente e algumas espécies,
consideradas saprófitas, estão associadas a doenças em humanos,
especialmente em indivíduos imunologicamente comprometidos. Outro grupo
de espécies de importância médica está relacionado ao complexo
Mycobacterium avium-intracellulare (MAC), o qual consiste em patógenos
oportunistas e o M. avium se tornou importante agente etiológico de
aproximadamente 90% das doenças provenientes de micobactérias em
pacientes imunologicamente comprometidos (WAYNE SRAMEK, 1992;
SHINNICK & GOOD, 1994).
O diagnóstico micobacteriológico é atualmente um desafio. Com a
descrição de novas espécies de micobactérias nos últimos anos tem sido
complexa a identificação precisa das espécies. A identificação de espécies é
baseada em uma série de testes bioquímicos e em características fenotípicas,
como a velocidade de crescimento e pigmentação, contudo, estes testes são
laboriosos, e muitas vezes chegam a uma idenficação de espécie pouco
precisa, o que pode trazer conseqüências para a disseminação e controle das
INTRODUÇÃO
18
micobacterioses (CHIMARA et al., 2008). Nos últimos anos a descrição e
identificação de novas espécies micobacterianas, assim como estudos de
taxonomia e de filogenética estão sendo realizados através de metodologias
baseadas em biologia molecular. Estudos genotípicos são baseados nas
regiões conservadas de genes específicos como o 16S rRNA, hsp65 e rpoB. A
European Comission International Co-operation (INCO) for Developing
Countries (DEV) Concerted Action (CA) na Bélgica desenvolveu um projeto de
ação visando o melhoramento do diagnóstico e detecção de resistência aos
fármacos na América Latina, para isso foi elaborado um Manual de
Identificação de Micobactérias (Practical handbook for the phenotipic and
genotypic identification of mycobacteria) descrevendo todas as técnicas
fenotípicas e moleculares ideais para identificação e diagnóstico das
micobacterioses (LEÃO et al., 2004).
O estudo da taxonomia do gênero Mycobacterium e métodos seguros de
identificação contribuem para melhorar o diagnóstico de infecções causadas
por micobactérias, possibilitando um tratamento correto e rápido, aumentando
as chances de cura dos pacientes. Além de ser extremamente importante para
elucidar novas espécies, subespécies e entender o comportamento destes
organismos no meio ambiente e nos seus hospedeiros.
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
19
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1. Taxonomia
A família Mycobacteriaceae, pertencente à ordem Actinomycetales e
classe Actinomycetes, possui um único gênero, o Mycobacterium que é
composto por mais de 130 espécies já descritas e distribuídas pelos diversos
ambientes. Grande parte (1/3) destas espécies está associada a doenças
causadas no homem e nos animais (KATOCH, 2004). Os bacilos dessa família
possuem alto conteúdo lipídico na parede celular, podendo atingir até 60% do
peso seco da célula, responsável por profundos efeitos biológicos no
hospedeiro. São resistentes à ação de agentes químicos, mas sensíveis a
agentes físicos, como radiação ultravioleta e calor.
O nome genérico Mycobacterium foi introduzido por Lehmann e
Neumann na primeira edição do “Atlas de Bacteriologia” em 1896, para incluir
as espécies causadoras da hanseníase e da tuberculose (TB), que haviam sido
classificadas respectivamente como Bacterium leprae e Bacterium tuberculosis
(WRIGHT & WALLACE, 1994). O significado do nome Mycobacterium se
originou do Bacterium-fungus, devido ao modo crescimento do bacilo da
tuberculose, parecido com uma película de mofo na superfície de meio líquido.
O nome não pode e não deve relacionar as micobactérias aos fungos. A
primeira descrição de micobactérias ocorreu em 1873, quando o norueguês G.
A. Hansen descreveu alguns corpos em forma de haste a partir de material de
biópsia de paciente com hanseníase (GOODFELLOW & WAYNE, 1982). Em
1882, o alemão Robert Koch isolou o bacilo da TB humana e, logo depois,
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
20
foram identificados bacilos bovino e aviário. Em 1935 Pinner aplicou o termo
“microrganismos com ácidos graxos atípicos” para bactérias que causavam
doenças em humanos e que não eram o Mycobacterium tuberculosis, mas não
conseguiam ser diferenciados pela morfologia, pigmentação e virulência em
animais (PINNER, 1935). Já em 1938 da Costa Cruz descreveu e nomeou o
Mycobacterium fortuitum como uma espécie de micobactéria de crescimento
rápido que coloniza humanos (DA COSTA CRUZ, 1938). Uma década mais
tarde MacCallum e colaboradores descreveram sérias doenças de pele
causadas por nova espécie de micobactéria, mais tarde denominada de
Mycobacterium ulcerans (MACCALLUM et al., 1948). Várias outras descrições
de micobactérias foram realizadas no decorrer dos anos, provavelmente
relacioandas à introdução da quimioterapia específica para tuberculose. Cuttino
e MacCabe descreveram uma infecção disseminada que era fatal em crianças
causada por um novo microrganismo denominado de Nocardia intracellularis
(CUTTINO & MCCABE, 1949), mais tarde renomeado de Mycobacterium
intracellulare por Runyon (RUNYON, 1965). Mason & Prissick em 1956
descreveram uma espécie pigmentada que causava adenite cervical em
crianças, que mais tarde foi denominada de Mycobacterium scrofulaceum
(MASSON & PRISSICK, 1956). Em 1953 Buhler e Pollak descreveram uma
doença pulmonar em humanos que era causada por uma nova espécie
chamada de Mycobacterium kansasii (BUHLER & POLLAK, 1953). Estas
descrições de novas espécies micobacterianas patogênicas para o homem
foram baseadas em poucos casos descritos na literatura da época. Neste
mesmo período, Timpe e Runyon reuniram uma coleção de amostras clínicas
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
21
de micobactérias que não o bacilo da tuberculose e aplicaram o termo
“atípicas” que Pinner, anteriormente, utilizou quando descreveu outra
micobacteria diferente do M. tuberculosis (TIMPE & RUNYON, 1954).
O gênero Mycobacterium foi definido pela sua característica morfológica
e a propriedade de coloração álcool-ácido resistente, mas devido ao pequeno
número de características morfológicas, havia dificuldade em classificar e
distinguir o gênero Mycobacterium dos gêneros Corynebacterium,
Rhodococcus e Nocardia, que fazem parte de outras famílias (GARRITY,
WINTERS & SEARLES, 2001). Em 1950 outros critérios de identificação foram
criados e introduziram as micobactérias no mundo da taxonomia moderna,
definindo uma variedade de testes bioquímicos em micobactérias de
crescimento rápido para classificá-las (KENT & KUBICA, 1985). Em 1954,
Timpe e Runyon refinaram a identificação dividindo as micobactérias em quatro
grupos com base na morfologia da colônia, temperatura, velocidade de
crescimento e a pigmentação, sugerindo uma correlação entre a importância
clínica e pigmentação (TIMPE & RUNYON, 1954). As micobactérias foram
definidas em quatro grupos de acordo com a velocidade de crescimento e
pigmentação, são eles: grupo I fotocromogênicas de crescimento lento; grupo II
escotocromogênicas de crescimento lento; grupo III acromógenas de
crescimento lento; grupo IV produtoras ou não de pigmento de crescimento
rápido conforme o Quadro 1 (HADDAD et al., 2005).
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
22
Quadro 1. Classificação das micobactérias de acordo com tempo de
crescimento e pigmentação das colônias.
Grupo Característica da cultura
I Fotocromógenas
Caracteriza-se pelo crescimento lento das colônias (30 dias).
As culturas desenvolvem pigmento amarelo somente quando
expostas à luz
II Escotocromógenas
Caracteriza-se pelo crescimento lento das colônias. As
culturas desenvolvem pigmento tanto na presença da luz
como no escuro.
III Acromógenas
Caracteriza-se pelo crescimento lento das colônias. As
culturas não produzem pigmento.
IV Crescimento rapido
Caracteriza-se pelo crescimento rápido das colônias (7 a 12
dias). Aa culturas podem ser pigmentadas ou não.
(adaptada do MINISTÉRIO DA SAÚDE – BRASIL, 2005)
Ainda na década de 50, foi incluído um número elevado de
características bioquímicas para identificação, melhorando a classificação das
espécies (GORDON & SMITH, 1955). Em conseqüência do aumento do
número de espécies novas identificadas, ficou mais difícil a determinação da
grande quantidade de características fenotípicas para associar a relação
taxonômica entre as espécies. Posteriormente, os agrupamentos fenotípicos
foram comparados com os obtidos através de estudos filogenéticos. Em 1986,
54 espécies de micobactérias estavam descritas na 9ª edição do Manual
Bergey’s de Sistemática Bacteriológica. Aproximadamente metade destas
espécies estava associada a doenças humanas, as demais eram saprófitas ou
associadas somente a doenças em animais (WOLINSKY, 1979; WRIGHT &
WALLACE, 1994). Desde então muitas outras espécies têm sido descritas e
atualmente se tem conhecimento de mais de 100 espécies, exemplificadas no
quadro 2 (MCNABB et al., 2004), que estão divididas em dois grandes grupos:
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
23
as micobactérias que fazem parte do complexo Mycobacterium tuberculosis
(CMTB) e as micobactérias não causadoras de tuberculose (MNT).
Quadro 2. Variedade de espécies existente no gênero Mycobacterium
Espécies
M. abscessus
M. africanum*
M. agri
M. aichiense
M. album
M. alvei
M. asiaticum
M. aurum
M. austroafricanum
M. avium
M. bohemicum
M. bonickei
M. bovis*
M. branderi
M. brisbanense
M. brumae
M. canariense
M. canettii*
M. caprae*
M. celatum
M. chelonae
M. chitae
M. chlorophenolicum
M. chubuense
M. confluentis
M. conspicuum
M. cookii
M. diernhoferi
M. doricum
M. duvalii
M. elephantis
M. engbaekii
M. fallax
M. farcinogenes
M. flavescens
M. fortuitum
M. frederiksbergense
M. fuerthensis
M. gadium
M. gastri
M. genavense
M. gilvum
M. goodii
M. gordonae
M. haemophilum
M. hassiacum
M. heckeshornense
M. heidelbergense
M. hiberniae
M. hodleri
M. holsaticum
M. houstonense
M. immunogenum
M. interjectum
M. intermedium
M. intracellulare
M. kansasii
M. komossense
M. kubicae
M. lacticota
M. lacus
M. lentiflavum
M. leprae
M. lepraemurium
M. madascariense
M. malmoense
M. margeritense
M. marium
M. monacense
M. moriokaense
M. mucogenicum
M. murale
M. nebraskiae
M. neoaurum
M. neworleanese
M. nonchromogenicum
M. novocastrense
M. obuense
M. palustre
M. paraffinicum
M. parafortuitum
M. parmense
M. peregrinum
M. petroleophilum
M. phlei
M. pinnipedii
M. porcinum
M. poriferae
M. pulveris
M. rhodesiae
M. scrofulaceum
M. senegalense
M. septicum
M. seriolae
M. sherrisii
M. shimoidei
M. shottsii
M. simiae
M. smegmatis
M. sphagni
M. szulgai
M. terrae
M. thermoresistible
M. tokaiense
M. triplex
M. triviale
M. tuberculosis*
M. tusciae
M. ulcerans
M. vaccae
M. visibilis
M. wolinskyi
M. xenopi
114 espécies
(adaptada de MCNABB et al., 2004) * Micobactérias do complexo M. tuberculosis
2.2. Ácidos Micólicos
Actinomicetos têm uma variedade de tipos de ácidos graxos decorrente
da diversidade de vias biossintéticas nos diferentes gêneros. Os ácidos
micólicos são ácidos graxos 3-hidroxi de cadeia longa, ramificados,
encontrados apenas em actinomicetos com quimiotipo de parede tipo IV
pertencentes aos gêneros Corynebacterium, Gordona, Mycobacterium,
Nocardia, Rhodococcus e Tsukamurella. Logo, estes organismos podem ser
diferenciados com base na diversidade estrutural apresentada pelos ácidos
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
24
micólicos. Os ácidos micólicos são importantes componentes da parede
micobacteriana e estão ligados ao peptidoglicano (Figura 1). Estes se
encontram também sob forma de ésteres de trealose (fator corda) somente no
M. tuberculosis que é possível observar em meio líquido (DAVID, BRUM &
PRIETO, 1994).
Figura 1. Desenho esquemático da estrutura da parede celular micobacteriana.
(adaptada de PARSONS et al., 1997)
Os ácidos micólicos (Figura 2) podem apresentar entre 60 a 90 átomos
de carbono na sua cadeia; isso varia de acordo com as espécies. Os
actinomicetos possuem ácidos micólicos relativamente simples, compostos por:
difosfatiglicerol, fosfatidiletanolamina, fosfatidilinositol e mannosideo. Os ácidos
micólicos produzem longas cadeias de ácidos graxos do tipo metil ésteres que,
nas micobactérias, encontram-se geralmente nos C
22
e C
26
(GANGADHARAM
& JENKINS, 1998). A composição da cadeia dos ácidos micólicos pode
contribuir para identificação da micobactéria, devido às peculiaridades das
cadeias entre as diferentes espécies.
arabinoglicana
ácidos micólicos
parede glicopeptídica com proteínas
proteína
Lipoarabinaman
(LAM)
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
25
Figura 2. Ácidos micólicos: R1 e R2 representam as cadeias de carbono de
tamanhos variáveis.
(adaptada de PARSONS et al., 1997)
2.3. Complexo Mycobacterium tuberculosis
O Complexo Mycobacterium tuberculosis é composto pelas espécies
Mycobacterium africanum (agente da tuberculose humana encontrada mais
freqüentemente na África), Mycobacterium bovis subsp. bovis (agente
etiológico da tuberculose bovina), Mycobacterium bovis BCG, cepa vacinal
BCG (Bacille Calmette-Guérin), Mycobacterium caprae (associado à
tuberculose em caprinos), “Mycobacterium canettii” (encontrado na região da
Somália), Mycobacterium microti (infecta roedores), Mycobacterium pinnipedii
(causadora de tuberculose em leões marinhos e no homem) e Mycobacterium
tuberculosis (associado à tuberculose humana). Estas micobactérias
agrupadas no complexo são caracterizadas por 99,9% de similaridade em seu
DNA e possuem seqüências de 16S rDNA idênticas. No entanto elas diferem
em sua epidemiologia, patogenicidade, ocorrência geográfica e preferência de
hospedeiro (BROSCH et al., 2002; COUSINS et al., 2003). A diferenciação dos
membros do complexo de outras micobactérias depende basicamente das
características de crescimento, produção de pigmento, morfologia de colônia, e
testes bioquímicos (produção de niacina, atividade da nitrato-redutase,
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
26
sensibilidade a pirazinamida e a hidrazida do ácido 2-tiofeno-carboxílico –
TCH). A morfologia das colônias exibe diferenças significativas, como
observada entre o M. tuberculosis com colônias rugosas e “M. canettii” com
colônias lisas. As espécias M. microti e M. bovis necessitam de piruvato de
sódio como suplemento nutricional (PFYFFER et al., 1998; NIEMANN,
RICHTER & RUSCH-GERDES, 2002; COUSINS et al., 2003).
2.4. Micobactérias não causadoras de tuberculose (MNT)
As MNT encontram-se dispersas na natureza e apresentam
patogenicidade variável (patógenos não obrigatórios). A capacidade das MNT
em produzir doença está claramente documentada na literatura e sua
importância vem aumentando progressivamente, sendo isoladas diferentes
espécies nos laboratórios clínicos de micobactérias (FALKINHAM, 1996;
TORTOLI, 2003; ATS, 2007). São microrganismos que vivem em diversas
partes do meio ambiente, muitas delas colonizam humanos e animais, podendo
ser ou não patogênicas. Por isso, a determinação clínica para detectar uma
MNT patogênica não é muito simples e deve seguir critérios específicos de
identificação (ATS, 2007). São geralmente encontradas em ambientes naturais,
habitam o solo e podem estar presentes em águas doces e águas marinhas. O
homem tem regularmente contato com ambientes em que habitam as
micobactérias, inalando-as ou até mesmo ingerindo-as. Conseqüentemente é
colonizado por elas, temporariamente ou permanentemente pelo trato
respiratório ou digestivo, é possível encontra-las também na pele (PORTAELS,
1995). É importante diferenciar ambientes naturais, onde ainda não houve
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
27
interferência humana, de ambientes de águas urbanas (esgotos), chuveiros,
piscinas, tanques de criadouros de peixe, lodos, etc. todos influenciados pelo
homem. Certamente há muitas espécies comuns na natureza, enquanto outras
são comuns no meio ambiente artificial influenciado pelo homem, contudo o
meio artificial é colonizado por um considerável espectro de espécies que
vivem exclusivamente no habitat influenciado pelo homem (COLLINS,
GRANGE & YATES, 1984). Um exemplo são as espécies M. kansasii e M.
xenopi, nunca encontradas em ambientes naturais, mas freqüentemente
isoladas na água de abastecimento de cidades, entretanto seu reservatório
natural não é conhecido (TACQUET, LECLERC & DEVULDER, 1973;
SCHUZLE-ROBBECKE, 1993). A ocorrência de muitas espécies de MNT na
água dos sistemas de abastecimento pode ser explicada pela adaptação da
espécie ao meio e por sua elevada resistência aos biocidas utilizados nos
tratamento de água (PRIMM, LUCERO & FALKINHAM, 2004). Outras espécies
raramente são encontradas em condições naturais, mas freqüentemente em
ambientes artificiais, este é o caso de M. marinum, M. chelonae e M. avium.
Espécies como M. haemophilum e M. genavense, nunca foram isoladas no
ambiente, embora epidemiologicamente apareçam como agentes causadores
de doenças.
As micobactérias podem ser divididas em três grupos em relação à
patogenicidade: o primeiro grupo inclui as micobactérias que são patogênicas
exclusivamente para o homem e os animais, são elas o Complexo M.
tuberculosis, M. leprae, M. avium subp. paratuberculosis e M. lepraemurium.
Estes patógenos não são encontrados no ambiente. O segundo grupo consiste
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
28
das micobactérias que são potencialmente patogênicas para o homem ou para
os animais e a grande maioria destes microrganismos é encontrada no meio
ambiente, e em circunstâncias especiais podem vir a causar doenças, por isso
são chamadas de “micobactérias oportunistas” ou “patógenos ocasionais”,
diferenciando-os dos patógenos estritos. Alguns destes microrganismos foram
excepcionalmente isolados no ambiente como o Mycobacterium malmoense e
o Mycobacterium ulcerans. Outros como o Mycobacterium haemophilum nunca
foram isolados no ambiente, mas estudos epidemiológicos sugerem que estes
organismos vivem no meio ambiente. O terceiro grupo compreende espécies
normalmente saprófitas que não são patogênicas ou raramente patogênicas.
As espécies saprófitas e as potencialmente patogênicas são referidas como
micobacterias não causadoras de tuberculose (MNT), bacilo MOTT
(Mycobacteria Other Then Tuberculosis) ou ainda, mais comumente chamadas
de atípicas (WAYNE et al., 1985). A classificação de microrganismos baseados
em grupos de risco também é utilizada para as micobactérias como mostra a
Tabela 1 (COLLINS, GRANGE & YATES, 1997). A principal preocupação da
clínica nas infecções causadas pelas espécies de MNT é a resistência que elas
têm aos agentes anti-micobacterianos.
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
29
Tabela 1. Micobactérias de acordo com os grupos de risco de infecção em
humanos.
Risco I Risco II Risco III
M. agri M. komossense M. abscessus M. tuberculosis
M. aichiense M. lentiflavum M. asiaticum M. bovis
M. alvei M. lepraemurium M. avium M. africanum
M. culum M. madagascariense M. celatum M. microti
M. austroafricanum M. margeritense M. chelonae
M. branderi M. moriokaense M. fortuitum
M. brumae M. mucogenicum M. haemophilum
M. chitae M. neoaurum M. intracellulare
M. clorophenolicum M. nonchromogenicum M. kansasii
M. chubuense M. obuense M. malmoense
M. conflluentis M. parafortuitum M. genavense
M. conspicuum M. phlei M. marinum
M. cookii M. porcinum M. peregrinum
M. diernhoferi M. poriferae M. paratuberculosis
M. duvalli M. pulveris M. shimoidei
M. fallax M. rhodesiae M. simiae
M. farcinogenes M. senegalense M. scrofulaceum
M. flavescens M. smegmatis M. szulgai
M. gilvum M. sphagni M. ulcerans
M. gordonae M. terrae M. xenopi
M. hassiacum M. thermoresistible
M. hiberniae M. tokaiense
M. holderi M. triplex
M. interjectum M. triviale
M. vaccae
(adaptada de LEÃO et al., 2004)
2.5. Biofilmes
O biofilme é uma reunião de células microbianas que são
irreversivelmente associadas com a superfície e cercadas por uma matriz. Esta
matriz é primeiramente composta por polissacarídeos e alguns materiais não
celulares, como por exemplo, proteínas e outros materiais do meio ambiente
em que o biofilme pode ser desenvolvido (DONLAN, 2002). O papel dos
biofilmes é proteger o ambiente micobacteriano contra fatores agressivos do
meio e, em alguns casos promover o crescimento da micobactéria.
Micobactérias em biofilmes se adaptam ao ambiente do homem, principalmente
em biofilmes de sistemas de água potável (SCHUZLE-ROBBECKE &
BUCHHOLTZ, 1992; IIVANAINEN et al., 1999; FALKINHAN, 2002;
ZAMBRANO & KOLTER, 2005). Biofilmes formados em ambientes naturais
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
30
ainda não foram documentados (MARSOLLIER et al., 2003). A alta
hidrofobicidade da micobactéria permite a formação de biofilmes em diversas
superfícies orgânicas, como exemplo os plásticos, PVC, silicone, celulose e
borracha e superfícies inorgânicas como o cobre e o vidro (SCHUZLE-
ROBBECKE & BUCHHOLTZ, 1992; FALKINHAN, 2002). A presença de
micobactérias ambientais em biofilmes pode causar impactos na saúde
humana, pois são responsáveis por problemas de contaminação de
equipamentos médicos e podem ser contraídas pela água (SEPTEMBER,
BRÖZEL & VENTER, 2004).
As espécies M. avium, M. abscessus, M. gilvum, M. gordonae e M.
scrofulaceum encontram-se no ambiente, principalmente na água, mas através
de bioflimes são capazes de colonizar uma variedade de superfícies do sistema
urbano de água potável. Esta adaptação está relacionada ao pH do ambiente,
a temperatura, aos nutrientes, a resistência ao cloro utilizado no tratamento da
água e aos outros microrganismos presentes no local que competem com as
micobactérias de crescimento lento, mas principalmente aos fatores químicos
relacionados à membrana plamástica da micobactéria (STEED & FALKINHAM,
2006; GEIER et al., 2008).
Falkinham vem estudando o processo de adaptação e aderência do M.
avium em cateter, onde ele analisa o tempo de crescimento da micobactéria na
estrutura do cateter, a temperatura, o pH e outros fatores que podem estar
envolvidos na formação do biofilme. Geralmente as células de M. avium
envovildas na formação de biofilmes em cateter são resistentes a claritromicina
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
31
e a rifampicina e em duas semanas há um número de crescimento exponencial
de células significativo para infecção do paciente (FALKINHAM, 2007).
2.6. Infecção e Doença
As micobactérias presentes no meio ambiente podem colonizar um
hospedeiro e determinar ou não o aparecimento de infecção ou doença.
(WOLINSKY, 1981). Até o momento, 130 espécies e 11 subespécies de
micobactérias estão registradas na lista de nomes bacterianos aprovados
(EUZÉBY, 2008). As espécies potencialmente patogênicas podem causar uma
variedade de doenças em humanos e animais que diferem em importância na
saúde pública. Geralmente as doenças disseminadas em pacientes portadores
de AIDS estão associadas a espécies de crescimento lento (BARRETO et al.,
1993; ATS, 2007). Por outro lado, as infecções pós-traumáticas são causadas
por espécies de crescimento rápido (FREITAS et al., 2003). As micobactérias
não associadas à tuberculose podem causar infecções nosocomiais devido à
contaminação das soluções utilizadas como veículos de medicamentos
injetados formando abscessos (PORTAELS, 1995). Agentes como M.
abscessus, M. chelonae e M. fortuitum são patógenos que causam infecções
subcutâneas ou abscessos intramusculares no sítio onde foi aplicada a injeção
ou a vacina (WALLACE et al., 1983; CAMARGO et al., 1996; VILLANEUVA et
al., 1997; TIWARI et al., 2003). Há relatos de infecções causadas por M.
abscessus, M. chelonae e M. fortuitum transmitidas através de sessões de
mesoterapia, intervenções como liposucção e acupuntura, que é considerada a
infecção mais emergente entre elas (NAGORE et al., 2001; WOO et al., 2002).
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
32
A infecção causada pelo M. chelonae também está associada com
procedimentos médicos específicos como diálises peritoniais ou hemodiálises
(LOWRY et al., 1990; HAKIM, HISAN & REUMAN, 1993). Devido à
esterilização inadequada dos equipamentos e soluções, M. chelonae, M.
fortuitum e M. xenopi podem causar infecções cirúrgicas. A transmissão
através broncoscópios tem sido relatadas para M. tuberculosis e M. chelonae
(CLEGG et al., 1983; PAPPAS et al., 1983; SAFRENECK et al., 1987; SOTO et
al., 1991; ASTAGNEAU et al., 2001).
As MNT de crescimento lento são geralmente responsáveis por doenças
que não as adquiridas em hospitais, mas adquiridas depois do contato com a
água das tubulações urbanas, elas sobrevivem e se multiplicam dentro dos
biofilmes em piscinas, moinhos de água e aquários. Em geral estas infecções
acometem pacientes que ficam expostos ou em contato prolongado com
ambientes aquáticos, causando ferimentos ou micro-traumas na pele. Casos de
granulomas na pele foram descritos em pacientes infectados pelo M. marinum
através da manipulação com peixes e águas contaminadas (STAMM &
BROWN, 2004).
O tratamento das MNT mais conhecidas, que causam doença é baseado
em fármacos diferentes do utilizados no tratamento da TB (Quadro 3), e o
tempo de tratamento deve ser no mínimo de 12 a 18 meses, com culturas
negativas por mais de 12 meses. Em pacientes HIV positivos, em uso do
HAART (Highly Active Anti-retroviral Therapy), o esquema de tratamento só
deverá ser interrompido com no mínimo seis meses da contagem de linfócitos
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
33
CD4 ter ultrapassado >100 cel/mm
3
(WAGNER & YOUNG, 2004; HADDAD et.
al., 2005; ATS, 2007).
Quadro 3. Esquemas de tratamento recomendado para as espéceis de MNT
mais conhecidas que causam doença, considerando os fármacos disponíveis.
Espécie Droga/Condulta Duração
M. avium
M. intracellulare
Macrolídeos
Etambutol
Rifampicina
Claritromicina ou Azitromicina
Estreptomicina
Amicacina
12 a 18 meses
M. kansasii
Macrolídeos
Moxifloxacina
Rifampicina
12-18 meses e
12 meses de culturas neg.
M. marinum
Rifampicina
Etambutol
Estreptomicina
Claritromicina
Sulfonamida
3 a 4 meses
M. fortuitum
Amicacina
Ciprofloxaxina
Sulfonamida
Claritromicina
Imipenem
12 meses
M. abscessus
M. chelonae
Claritromicina
Amicacina
Imipenem
12 meses
(adaptado da ATS, 2007)
2.7. Epidemiologia
Doenças causadas por MNT, principalmente doença pulmonar,
acometem geralmente pacientes com história de tabagismo e aqueles tratados
recentemente de tuberculose, fibrose cística, algum tipo de pneumonia, ou que
tenham alguma doença sistêmica crônica, tais como câncer e artrite
reumatóide. A ocorrência de novas doenças associadas às micobactérias,
provavelmente, reflete o aumento de infecções com organismos ambientais
envolvendo indivíduos que tenham seu sistema imunológico comprometido
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
34
pela Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (SIDA ou AIDS) ou por estarem
usando algum tipo de agente imunossupressor devido a transplante ou
tratamento de outra doença (WRIGHT & WALLACE, 1994).
As doenças causadas pelas MNT antes da epidemia do HIV/AIDS eram
pulmonares, confinadas a nódulos linfáticos cervicais, limitados à pele e com
raros casos de infecção disseminada. Era ausente a evidência da transmissão
pessoa a pessoa e a maioria das infecções era causada por M. kansasii e MAC
(FALKINHAM, 1996). A importância das MNT em patologias humanas
aumentou drasticamente nos últimos anos, principalmente devido à epidemia
causada pelo vírus da AIDS, onde as MNT são um dos principais
microrganismos responsáveis por infecções oportunistas em pacientes
imunossuprimidos. Após a epidemia do HIV/AIDS, a infecção se tornou
generalizada. A infecção de pele, por exemplo, em pacientes
imunocompetentes está relacionada a traumas ou uso de corticóides; já em
pacientes com HIV/AIDS, a infecção está associada à redução da população
de linfócitos T CD4+ e, conseqüentemente, à imunossupressão. Nos EUA e
Europa a incidência de tuberculose é menor do que a de MNT em pacientes
HIV positivo. As infecções por MAC são a segunda causa de mortes em
pacientes HIV positivo. As micobactérias do complexo MAC estão envolvidas
em infecções gastrintestinais e do trato genitourinário, infecções crônicas da via
respiratória, osteomielites e artrites sépticas (COVERT et al., 1999; COOK et
al., 2003). O M. kansasii, assim como o MAC e o M. xenopi importantes
patógenos envolvidos nas infecções pulmonares. Pacientes infectados pelo
HIV apresentam infecções pulmonares e infecções generalizadas causadas
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
35
pelo M. kansasii (PICARDEAUM et al., 1997). Espécies como o M. simiae e o
M. terrae são potencialmente patogênicas para o homem. Há relatos do
envolvimento dessas micobactérias em infecções que acometem
principalmente pacientes imunocomprometidos e infecções pulmonares e
cutâneas em pacientes imunocompetentes (WAYNE & SRAMEK, 1992;
TORTOLI, 2003).
A distribuição das micobactérias varia entre as diferentes regiões
geográficas. O Brasil é um país de dimensão continental com um território de
8.547.404 Km
2
e grande parte do país apresenta clima quente e úmido, o que
proporciona uma condição favorável para o crescimento das micobactérias
(associadas a ambientes com água, solos úmidos e alimentos). A grande
maioria dos trabalhos realizados no Brasil está relacionada ao complexo M.
tuberculosis, são poucos os centros hospitalares e de pesquisa que realizam
identificação de MNT. Entretanto, no trabalho realizado por Rocha et al. (2002),
foram analisadas 358 amostras clínicas obtidas de 16 estados brasileiros, onde
foi possível estudar a freqüência relativa das micobactérias: 55% M. avium-
intracellulare; 1,4% M. scrofulaceum; 5,7% M. kansassi; 3,4% M. chelonae/
abscessus; 3,2% M. fortuitum/perigrinum; 5,4% M. gordonae; 0,6% M.
flavescens; 0,6% M. lentiflavum, 0,3% M. triviale; 0,8% M. szulgai; 0,8% M.
leprae, 0,3% M. marinum; 1,1% M. simiae; 0,8% M. terrae; 0,6% não
identificadas. Mas, o número de amostras coletadas não foi equiparado para
todos os estados; a maioria das amostras analisadas era proveniente dos
estados do RJ e SP. Estes resultados confirmaram estudos anteriores
mostrando a prevalência de isolamento de MAC em espécimes clínicos. Em
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
36
estudo realizado no Hospital Clementino Fraga Filho no Rio de Janeiro, no
período de 1996-1997, a freqüência das MNT foi de 57% M. avium (MAC);
7,2% M. scrofulaceum; 3,6% M. terrae; 2,4% M. gordonae; 1,2% M. chelonae e
1,2% M. fortuitum (FERREIRA et al., 2002). Em São Paulo foram estudadas 76
amostras de micobactérias, que foram identificados como: Complexo M.
tuberculosis (34%), M. avium (31%), M. kansasii (18,4%), M. fortuitum (5,2%),
M. gordonae (3,9%), M. intracellulare (2,6%), M. nonchromogenicum (1,3%), M.
chelonae/abscessus (1,3%) e M. szulgai (1,3%) (SILVA et al., 2001).
Nos EUA, o M. avium e o M. kansasii são as MNT mais freqüentemente
isoladas. Entretanto, na Austrália, as infecções por M. kansasii são raras. Em
alguns países europeus, o M. kansasii e o M. xenopi eram as MNT mais
diagnosticadas, sendo mais comum do que o M. avium antes da epidemia do
HIV/AIDS (PICARDEAUM et al., 1997). Em estudos realizados no Sudoeste da
Irlanda (KENNEDY et al., 2003) foi observada a incidência das MNT de
0,4/100.000 habitantes, no período de 1987 a 2000, sendo a incidência de M.
tuberculosis 97/100.000 habitantes e de M. bovis de 0,5/100.000 habitantes. No
Hospital Universitário Geral da Espanha das 19.723 amostras clínicas
analisadas 203 eram MNT, sendo que 20% eram MAC, seguida por M. kansasii
(RODRIGUEZ et al., 2003). Na Itália foram estudadas pelo método PRA e
seqüenciamento do gene hsp65 54 amostras de micobactérias de espécimes
clínicos de pacientes de um hospital local. Destas: 4,4% foram identificadas
como pertencentes ao Complexo M. tuberculosis; 26,4% M. gordonae; 20,5%
M. chelonae subsp. abscessus; 13,2% M. avium; 11,7% M. chelonae subsp.
chelonae; 5,8% M. fortuitum; 5,8% M. xenopi; 4,4% M. kansasii; 2,9% M.
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
37
marinum; 1,4% M. intracellulare; 1,4% M. terrae e 1,4% M. simiae (BRUNELLO
et al., 2001).
2.8. Genética das MNT
O processo de evolução biológica de todo organismo é produto das
alterações de seu genoma. Atualmente, progressos têm ocorrido para melhor
compreensão da base genética responsável pela variabilidade das
micobactérias. A maioria dos estudos tem sido realizado com MAC e
micobactérias de crescimento rápido. Informações contidas no genoma, a
presença de DNA extra-cromossômico, a presença de elementos de inserção e
a interação entre micobacteriófagos e célula do hospedeiro têm sido avaliados
(KELLER et at., 2002). Os estudos genotípicos têm fornecido importante
contribuição para taxonomia e sistemática, baseados em características
genotípicas das micobactérias, uma vez que as análises moleculares estão
relacionadas à detecção de regiões altamente conservadas, abrigando
seqüências hipervariáveis em que deleções, inserções ou substituição de um
único nucleotídeo estão presentes (WOLINSKY, 1979; WAYNE & SRAMEK,
1992). As mais de 100 espécies de micobactérias já têm pelo menos um
fragmento de gene seqüenciado, e estes fragmentos estão depositados no
GenBank para que todos tenham acesso e possam compará-los em estudos de
biologia molecular. As micobactérias têm um conteúdo de Citosina (C) e
Guanina (G) entre 61 a 71%. Os estudos moleculares incluem os genes 16S
rRNA, rpoB, hsp65 e gyrB, todos envolvidos em estudos de taxonomia e
filogenética, que contribuem para identificação mais rápida das micobactérias
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
38
auxiliando o diagnóstico clínico. Um exemplo da importância dos estudos
moleculares é a descrição do Mycobacterium visibilis, espécie responsável por
três casos de micobacterioses em gatos na América do Norte. Este
microrganismo foi identificado apenas pelos métodos genéticos, através da
biologia molecular. Seu DNA foi extraído em 2002 e até o momento não foi
possível isolar este organismo e fazê-lo crescer em meio de cultura. Sua
caracterização fenotípica não é conhecida e sua posição taxonômica ainda é
discutida na comunidade científica, contudo esta micobactéria apresentou
similaridade nos três casos pelos estudos filogenéticos (TORTOLI, 2003).
Desde o final da década de 80 vários trabalhos vêm sendo publicados,
descrevendo e avaliando sistemas de detecção e identificação de
micobactérias, utilizando métodos mais ou menos específicos para uma ou
poucas espécies micobacterianas. Sistemas baseados na hibridização do rRNA
do microrganismo com sondas marcadas com I
125
estão disponíveis no
mercado desde o fim da década de 80 para identificação de amostras
pertencentes aos Complexos MTB e MAC (Gen-Probe Rapid Diagnostic
System, USA) e a utilização destes sistemas tornou a identificação destas
espécies mais rápida. Recentemente, o sistema foi modificado, utilizando
sondas marcadas não radioativamente (AccuProbe, USA) e, além das espécies
mencionadas acima, foram incluídos o M. gordonae e o M. kansasii na
identificação (LEBRUN et al., 1992). Devido à variabilidade genética em certas
espécies, a sensibilidade da metodologia ainda não é 100% (DEVALLOIS,
GOH & RASTOGI, 1996; ALCAIDE et al.,1997) e relativamente poucos estudos
foram realizados (PICARDEAU et at., 1997).
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
39
2.9. Identificação das MNT
A notificação das doenças por MNT aumentou nos últimos anos, não
somente pela sua importância clínica, mas também pelos avanços das técnicas
de isolamento, cultura e identificação por biologia molecular. Com o aumento
da ocorrência das micobacterioses, houve a necessidade do desenvolvimento
de métodos mais simples, sensíveis e rápidos para a identificação das
espécies de micobactérias e patovariantes, uma vez que métodos tradicionais
são lentos para definição do diagnóstico e muitas vezes não identificam a
espécie (SHINNICK & GOOD, 1994; KOX et al., 1995). As metodologias de
identificação baseiam-se na análise de uma seleção de características
fenótipicas dos microrganismos; na detecção, visualização e eventual
modificação de determinados componentes da célula ou na composição
genética de determinadas seqüências. Portanto, as micobactérias podem ser
identificadas através de testes bioquímicos (provas bioquímicas para
identificação), testes químicos (cromatografias) e testes genotípicos
(metodologias moleculares de identificação). Novos estudos têm sido
desenvolvidos para melhor identificação das micobactérias (TORTOLI, 2003;
COOK et al., 2003).
2.10. Identificação Fenotípica
O método tradicional de identificação das espécies de MNT se baseia
nas características fenotípicas através dos testes bioquímicos, produção de
pigmentos, características de crescimento (tempo de crescimento) e morfologia
(KUBICA, 1973; COOK et al., 2003). Os testes bioquímicos, assim como a
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
40
avaliação do crescimento, apresentam como pontos positivos a simplicidade de
serem executados, pois utilizam poucos equipamentos. No entanto,
apresentam como pontos negativos, o longo período de incubação até que as
micobactérias cresçam para a identificação final e requerem experiência na
interpretação dos resultados, além de apresentarem baixa especificidade e a
possibilidade de comprometimento da identificação em organismos
bioquimicamente inativos (inertes). Esses testes identificam uma média de 15 a
20 espécies descritas na literatura, podendo haver erros na identificação. A
cultura também pode ser realizada através dos sistemas automatizados
BACTEC e MGIT, promovendo o crescimento das micobactérias em meio
líquido 7H9.
2.11. Identificação Genotípica
Nos últimos anos, foram desenvolvidos métodos rápidos de identificação
de micobactérias como alternativa para auxiliar no diagnóstico clínico e estudar
a sistemática destes microrganismos. Estes métodos incluem sondas de DNA
(testes comerciais), seqüenciamento de DNA, Microarray e testes baseados em
PCR.
Sondas de DNA
Teste de Identificação de Cultura AccuProbe
(Gen Probe, Inc.
SanDiego, Califórnia) inclui sondas para confirmar o resultado de culturas de
M. tuberculosis, M. kansasii, MAC (sondas individuais para M. avium e M.
intracellulare) e M. gordonae. São sondas de fita simples de DNA com um
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
41
componente quimioluminescente ligada à hidroxila terminal da fita, são
complementares ao RNA ribossomal (TORTOLI et al., 1996).
Micobacteria v. 2. INNO-LiPA (Inogenetics NV, Gent, Belgium) consiste
no método de hibridização reversa com sondas biotiniladas representando
seqüências 400-500 pb da região dos genes 16S e 23S rRNA. Os produtos
amplificados podem ser hibridizados com 14 sondas imobilizadas em
membranas de náilon que identificam as espécies M. intracellulare, M.
fortuitum, M. avium, M. celatum, M. gordonae, M. simiae, M. xenopi, M.
smegmatis, M. bohemicum, M. genavense, M. lentiflavum, M. terrae, complexo
M. tuberculosis, complexo M. chelonae, M. interjectum, M. kansasii, M.
malmoense, M. marinum. O resultado da hibridização é detectado através de
revelação colorimétrica (LEBRUN et al., 2005).
Testes baseados na PCR
PRA (PCR-Restriction Enzyme Analysis) é um sistema de
identificação que não requer hibridização por sonda ou uso de radioatividade,
além de rápido e com um custo compatível com a realidade dos laboratórios
clínicos, foi desenvolvido em 1992, para diferenciação de espécies de
micobactérias de crescimento lento por PCR e análise dos fragmentos com alto
polimorfismo utilizando enzimas de restrição (PILKAYTIS et al.,1992). Uma
metodologia similar foi utilizada por Telenti et al. em 1993, para rápida
identificação das espécies micobacterianas, baseado na avaliação do gene
codificado pela proteína choque térmico 65-KDa (hsp65) por PCR e tratamento
com enzimas de restrição. O gene hsp65 é variável dentro do gênero
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
42
Mycobacterium, bem conhecido pelos taxonomistas e está presente em todas
as micobactérias, além de fazer parte de algumas outras bactérias como
Nocardia spp (TELENTI et al., 1993; DEVALLOIS et al., 1997; TORTOLI,
2003). Este método analisa um fragmento de 441pb, seqüência situada na
porção amino terminal do gene, através de enzimas de restrição (BstEII e
HaeIII). A análise do gene hsp65 mostra-se eficaz na diferenciação das
espécies de micobactérias. O procedimento é rápido, fácil e identifica um
grande número de espécies de micobactérias em um único experimento. Os
perfis obtidos nas corridas eletroforéticas podem ser comparados com um
banco de dados universal já existente, disponível no PRASITE
(http://app.chuv.ch/prasite), um site desenvolvido pelo Instituto Pasteur que
disponibiliza diferentes perfis de corrida eletroforética referentes a cada espécie
de micobactérias e no site disponibilizado pela Fiocruz
(www.praonline.fiocruz.br). A literatura, apresenta um novo método PRA, que
analisa o gene rpoB (LEE et al., 2000). Este gene é conservado no genoma
das micobactérias e está ancorado na subunidade da RNA polimerase, além de
ser encontrado em todas as espécies de micobactérias. Contém informações
que possibilitam diferenciar as espécies do gênero Mycobacterium por
hibridização e através da análise da seqüência do DNA (SILVA et al., 2001;
ROCHA et al., 2002; COOK et al., 2003).
Amplificação específica: Os sistemas mais simples de PCR baseiam-
se na detecção do produto amplificado pela eletroforese, utilizado na maioria
das vezes para a identificação do M. tuberculosis através da seqüências
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
43
IS6110, embora sistemas parecidos tenham sido descritos para a identificação
de espécies do MAC, M. kansasii e o M. xenopi utilizado a sequência IS1245
(FAUVILLE-DUFAUX et al., 1995). Muitas vezes, os sistemas de PCR multiplex
(ou “nested”) permitem a identificação simultânea de um número pequeno de
espécies e são utilizados para a separação de espécies pertencentes ao
complexo MTB e ao MAC (KURABACHEW et al., 2004). Os testes moleculares
têm sido propostos e utilizados paralelamente aos métodos bioquímicos para
auxiliar na identificação das MNT (BRUNELLO et al., 2001).
Seqüenciamento de genes: Técnica mais sensível, considerada ”padrão
ouro” da biologia molecular para estudo e identificação das espécies de
micobactérias. Esta metodologia é baseada no seqüenciamento de fragmentos
de genes conservados como (ADÉKAMBI & DRANCOURT, 2004):
Gene 16S rRNA: O rDNA 16S é uma seqüência de aproximadamente
1.500 nucleotídeos ancorada pelo DNA ribossomal 16S (rDNA). É um gene
conservado, que apresenta uma região comum para todos os seres vivos,
sendo que existe uma variação de nucleotídeos que estão concentrados em
áreas específicas. Esta seqüência é composta por duas seqüências
hipervariáveis, conhecida como região A e B. Para identificação das
micobactérias a região A é suficiente. A região B pode ser considerada
confirmatória. As micobactérias de crescimento lento contém uma cópia do
gene rDNA 16S, entretanto as espécies de crescimento rápido, exceto o M.
abscessus e o M. chelonae, têm duas cópias (TORTOLI, 2003). Embora este
fragmento seja polimórfico e eficiente na diferenciação de espécies de
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
44
micobactérias, não permite a diferenciação de M. abscessus e M. chelonae. Os
genes codificantes para o RNA ribosomal são os alvos mais utilizados para o
seqüenciamento, pois estão presentes em todos os organismos. Em
micobactérias, o seqüenciamento do 16S rRNA revolucionou dois campos da
pesquisa: a taxonomia e a identificação. Foi verificado que o agrupamento feito
através de classificação numérica de características fenotípicas também se
mantém em árvores filogenéticas construídas após a comparação da
seqüência 16S rRNA ou parte dele. As espécies de crescimento rápido e lento
encontram-se em dois agrupamentos separados nesta árvore e a divisão
correspondente aos grupos propostos por Runyon também se reflete aqui
(ROGALL et al., 1990; STAHL & URBANCE, 1990; PITULLE et al., 1992).
Embora o 16S rRNA seja a seqüência alvo mais utilizada, outros genes,
geralmente conservados, foram utilizados como alvo de seqüenciamento.
Seqüências 16S-23S (ITS): seqüências vizinhas do 16S rRNA tais
como a seqüência 16S-23S rDNA “internal transcribed spacer” (ITS), uma
região hipervariável do promotor do 16S rRNA ou a região terminal 3’, também
permitem identificação da espécie, devido a variabilidade genética (PORTAELS
et al., 1996). Essas seqüências estão sendo utilizadas para estudos
epidemiológicos e filogenéticos em espécies complexas com significância
clínica (FROTHINGHAM, HILLS & WILSON, 1994). As seqüências ITS
representam um suplemento ao gene 16S rRNA para diferenciar as espécies
de micobactérias. Seqüências de M. avium, M. conspicum, M. gastri, M.
genavense, M. intracellulare, M. kansasii, M. malmoense, M. marinum, M. phlei,
M. shimoidei, M. simiae, M. smegmatis, M. szulgai, M. triplex, M. tuberculosis,
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
45
M. ulcerans e M. xenopi mostraram divergências de até 2% (ROTH et al.,
1998).
Gene gyrB: este gene codifica a subunidade B da DNA girase
(topoisomerase II) e tem mostrado grande utilidade para análises filogenéticas,
como marcadores filogenéticos de identificação de espécies. Seqüências de
gyrB pertencentes a 15 espécies (M. africanum, M. asiaticum, M. avium, M.
bovis, M. gastri, M. gordonae, M. intracellulare, M. kansasii, M. malmoense, M.
marinum, M. microti, M. scrofulaceum, M. simiae, M. szulgai, M. tuberculosis)
foram analisadas em 43 amostras e mostraram que as freqüências de bases
repetidas poderiam ser comparadas às seqüências ITS (KASAI, EZAKI &
HARAYAMA, 2000).
Gene rpoB: o seqüenciamento do gene rpoB, que codifica a subunidade
Beta de RNA-polimerase, é conservado no genoma das micobactérias e
também pode ser utilizado para identificação genotípica, já que este gene
possui pequenas variações genômicas de espécie para espécie. Seqüências
do gene rpoB de 342pb foram analisadas em 44 espécies de micobactérias em
107 amostras clínicas (KIM et al., 1999), dos grupos de crescimento lento e
rápido, mas apenas poucas seqüências tiveram divergências entre si.
Adékambi e colaboradores identificou 20 espécies patogências de crescimento
rápido através do seqüenciamento de 723pb do gene rpoB (ADÉKAMBI,
COLSON & DRACOURT, 2003) Existem alguns estudos de análise por
restrição deste gene, RFLP e dot-blot, mas nenhum com resultados seguros
para identificação molecular (LEE et al., 2003).
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
46
Gene hsp65: gene codificado pela proteína de choque térmico 65-KDa,
permite a identificação ao nível de espécie e subespécie, e foi utilizado para a
construção de um banco de seqüências de 24 espécies de micobactérias
(KAPUR et al., 1995). Este gene pode ser seqüenciado para confirmar o
resultado obtido no PRA (ITOH et al., 2003). A seqüência parcial de 441pb do
gene hsp65 foi utilizada para identificação de micobactérias de crescimento
rápido por Rinquet e colaboradores, contudo muitas seqüências não
apresentaram mais que 2% de diferenças entre si (RINQUET et al., 1999).
Outros genes: como o codificante para superoxido dismutase, o gene
dnaJ e o gene codificante para uma proteína de 32 kDa foram seqüenciados
para identificação de micobactérias (TAKEWAKI et al., 1993; ZOLG &
PHILIPPI-SCHULZ, 1994; SOINI, BÖTTGER & VILJANEN, 1994; SOINI &
VILJANEN, 1997).
PCR em tempo real: método que realiza quantificações dos ácidos
nucléicos, marcados com moléculas fluerescentes, de maneira precisa e com
maior reprodutibilidade, pois determinina quantificações durante a fase
exponencial da reação. A PCR em tempo real é utilizado, principalmente, na
identificação de espécies do complexo M. tuberculosis através da sequência
IS6110, mas pode ser utilizado na identificação de 18 espécies de MNT
através da amplificação do gene rpoB (LIM et al., 2008).
JUSTIFICATIVA
47
3. JUSTIFICATIVA
As MNT presentes no meio ambiente podem colonizar um hospedeiro e
determinar ou não o aparecimento de infecção ou doença. As
infecções/doenças causadas por MNT são adquiridas de fontes como água e
solo, a partir dos quais podem ser isoladas. As micobacterioses mais comuns
são infecções extrapulmonares com adenopatia cervical (linfadenopatia)
benigna em crianças, lesões na pele e doenças disseminadas em pessoas
imunocomprometidas, além de infecção óssea, artrite e bursite.
A implementação de técnicas moleculares para a identificação de
micobactérias em rotinas laboratoriais tem sido alternativa tecnológica e
operacional. A técnica molecular PCR-Restriction Enzyme Analysis (PRA-
hsp65), é um método baseado na análise de fragmentos do gene hsp65,
presente em todas as micobactérias e permite ampla diferenciação entre as
espécies (inclusive às espécies de difícil distinção, como M. chelonae e M.
abscessus) além de variantes alélicas dos microrganismos, é um método
rápido, de baixo custo e com alta sensibilidade.
Considerando o exposto acima, este estudo se propôs implantar a
metodologia do PRA-hsp65 (PCR-Restriction Enzyme Analysis) para
identificação de MNT no Laboratório de Micobactérias do Instituto Prof. Paulo
de Góes – IMPPG, além da realização de análises filogenéticas e taxonômicas
das espéceis de MNT para melhor entendimento do gênero.
OBJETIVOS
48
4. OBJETIVOS
4.1. Objetivo Geral
- Análise da seqüencia parcial do gene hsp65 como instrumento para estudos
taxonômicos, filogenéticos e de diagnóstico de micobactérias não causadoras
de tuberculose de origem clínica e ambiental.
4.2. Objetivos Específicos
- Identificação de amostras ambientais e clínicas seguindo os métodos
tradicionais: provas bioquímicas, tempo de crescimento e pigmentação;
- Identificação das espécies de MNT utilizando a metodologia molecular PRA-
hsp65 para o diagnóstico laboratorial;
- Seqüenciamento parcial de 441pb do gene hsp65 das micobactérias não
causadoras de tuberculose;
- Análise filogenética molecular de micobactérias não causadoras de
tuberculose utilizando a seqüencia parcial de 441pb do gene hsp65;
- Comparação dos métodos bioquímicos com o método molecular PRA-hsp65 e
o seqüenciamento para avaliação da concordância.
METODOLOGIA
49
5. METODOLOGIA
5.1. Amostragem
Este estudo foi composto por uma amostragem de conveniência não
mascarada, onde as amostras, isoladas do ambiente e clínicas (Hospital
Universitário Clementino Fraga Filho – HUCFF), faziam parte do banco
amostral do Laboratório de Micobactérias do Instituto Professor Paulo de Góes
da Universidade Federal do Rio de Janeiro – IMPPG/UFRJ. Os experimentos
foram realizados no Laboratório de Micobactérias do Centro de Ciências da
Saúde da Universidade Federal do Rio de Janeiro (CCS – IMPPG – UFRJ) e
no Laboratório do Centro de Biologia Genômica e Molecular da Pontifícia
Universidade Católica do Rio Grande do Sul (PUCRS), com a colaboração do
Laboratório de Biologia Molecular Aplicada a Micobactérias do Instituto
Oswaldo Cruz do Rio de Janeiro (FIOCRUZ).
5.2. Número Amostral
Foram utilizadas 177 amostras, sendo 134 amostras clínicas do
Laboratório de Micobatérias do Hospital Universitário (HUCFF/UFRJ) e 43
amostras coletadas do ambiente do estado do Rio de Janeiro (Tabela 2).
METODOLOGIA
50
Tabela 2. Relação das amostras utilizadas no estudo, incluindo período, local
de isolamento e espécime.
Amostras Local de Isolamento
Período
(ano)
- Pulmonares (108)
Clínicas
(134)
- Extra-pulmonares (26)
(sítios estéreis)
Hospital Universitário Clementino
Fraga Filho (HUCFF/UFRJ)
2000 a
2005
- Água (9)
Sistema de tubulação de água da
cidade do Rio de Janeiro
- Solo (11) Solo do campus da UFRJ
- Fezes bovinas (9)
Fazendas de bovinos de leite raça
girolando em Resende, no estado do
Rio de Janeiro
Ambientais
(43)
- Linfonodo de suínos (14)
Abate clandestino de suínos da
periferia do município do Rio de
Janeiro*
2000 a
2002
* Suínos adultos sem raça definida, de ambos os sexos, sem sinais aparente ou histórico de tuberculose
ou outra alteração clínica digna de nota.
5.3. Cultivo das Micobactérias
A cultura primária das micobactérias foi realizada a partir de espécimes
clínicos de pacientes e de amostras do meio ambiente. O material foi semeado
em meio Löwestein-Jensen (LJ) (Difco, Becton, Dickinson and Company-BD,
USA), sendo cultivado a 37ºC de 1 a 8 semanas. As amostras foram
submetidas ao esquema simplificado de Provas Bioquímicas para Identificação
(KENT & KUBICA, 1985; MINISTÉRIO DA SAÚDE – BRASIL, 2005).
5.4. Identificação Fenotípica
Testes foram realizados tomando como base: o tempo de crescimento, a
produção de pigmentos (GOODEFELLOW & WAYNE, 1982). Para isso, as
micobactérias foram semeadas em dois tubos: 1 – envolvido com papel
alumínio (evitando a exposição do microrganismo à luz); e 2 – tubo controle
exposto à luz.
METODOLOGIA
51
Após o crescimento as micobactérias foram submetidas aos testes
bioquímicos clássicos para identificação da espécie. As provas bioquímicas
realizadas foram: produção de niacina, catalase a 68ºC, redução do nitrato,
crescimento em meio MacConkey, crescimento em 5% de NaCl, hidrólise do
Tween 80, urease, arilsulfatase em 3 dias e redução do telurito de potássio
(MINISTÉRIO DA SAÚDE – BRASIL, 2005).
5.5. Identificação Genotípica
5.5.1. Extração de DNA
Foram utilizados dois tipos de extração de DNA: o método enzimático
CTAB para as amostras seqüenciadas e o método de choque térmico para as
amostras submetidas ao PRA-hsp65.
Extração pelo método CTAB: as amostras semeadas na cultura foram
submetidas à extração do DNA conforme técnica descrita por van Soolingen et
al. (1994). Neste processo a massa bacteriana (uma alçada) foi transferida
para um tubo de microcentrífuga com 400 L de TE 1X e em seguida colocada
em banho-maria a 80ºC por 20 min. para eliminação da viabilidade de todas as
células. A lise bacteriana aconteceu através da adição de 50 L de lisozima a
10 mg/mL, agitação (agitador automático) e incubação de 12 horas, a 37ºC.
Depois da incubação foram adicionados 75 L da solução SDS 10%/Proteinase
K (Quiagen, USA), 100 L de NaCl 5M (Merck, Germany) e 100 L de
CTAB/NaCl (solução pré-aquecida a 65ºC) e a mistura foi incubada no banho-
METODOLOGIA
52
maria a 65ºC por 10 min. A mistura foi agitada e incubada em banho-maria a
65ºC por 10 min. Nesta etapa a mistura assumiu uma forma leitosa e
adicionou-se 750 L da solução de clorofórmio álcool isoamílico 24:1 (Merck,
Germany), seguido de homogeneização e centrifugação por 5 min. a 12.000
rotações por minuto (rpm). Depois da centrifugação, transferiu-se o
sobrenadante para um novo tubo de microcentrífuga, foram adicionados 0,6
volumes de isopropanol para precipitação dos ácidos nucléicos, e a mistura
incubada a -20ºC por 30 min. Após a incubação, a mistura foi centrifugada por
15 min. a 12.000 rpm e o sobrenadante foi removido, seguido da adição de 1
mL de etanol 70% (Merck, Germany) gelado para lavagem do resíduo de DNA.
Depois uma nova centrifugação de 5 min. a 12.000 rpm e o etanol foi removido.
O resíduo de DNA foi colocado para secar por 30 min. a temperatura ambiente.
Depois de seco, adicionou-se 30 L de TE 1X. O DNA extraído foi incubado a
4ºC pelo menos dois dias, para ressuspensão completa dos resíduos, e
estocado a –20ºC. O produto da extração foi checado em gel de agarose 0,8%,
corado com brometo de etídio e visualizado em translunimador com U.V.
Extração pelo método de choque térmico: foram retiradas de 2 a 3 alçadas
do crescimento micobacteriano da cultura sendo suspendidas num microtubo
em 500µL de água ultrapura esterilizada. A mistura foi agitada no vórtex. Em
seguida a mistura foi submetida ao banho-maria por 20 min. a 99°C. Depois do
banho-maria as amostras foram congeladas a -20°C durante 12 a 14 horas. No
momento do uso os extratos foram descongelados e submetidos à
METODOLOGIA
53
centrifugação a 12.000 rpm por 60 seg. Para a reação de PCR foram utilizados
10 µL da extração (CHIMARA et al., 2004).
5.5.2. Amplificação do DNA pela PCR (Polimerase Chain Reaction)
5.5.2.1. Oligonucleotídeos para reação da PCR
Os oligonucleotídeos (iniciadores) foram construídos baseados na região
de interesse do gene hsp65. Foram utilizados os iniciadores: Tb 11 (5’-
ACCAACGATGGTGTGTCCAT) e Tb 12 (5’- CTTGTCGAACCGCATACCCT)
que amplifica um fragmento de 441pb (TELENTI et al., 1993).
5.5.2.2. Reação da PCR
A reação da cadeia de polimerase para amplificar o fragmento de 441pb
entre a posição 398 e 836, foi padronizada utilizando 20 ng de DNA de
micobactérias, 40 pmol dos iniciadores Tb 11 e Tb 12, tampão 10X (10 mM
Tris-HCl pH 8,1; 5 mM MgCl
2
; 50mM KCl); 0,2 mM de cada
deoxirribonucleotídeo trifosfato (dNTPs) 10% de glicerol, 10% de solução
enhancer (Invitrogen, USA) e 1,5 U de Taq DNA polimerase em 50 L de
reação (TELENTI et al.,1993).
5.5.2.3. Controle de Qualidade da reação da PCR
Para o controle de qualidade foram utilizados dois controles de reação
da PCR: o controle positivo (DNA de M. tuberculosis H37Rv) e o controle
negativo (água Milliq).
METODOLOGIA
54
5.5.2.4. Condições da reação da PCR
A reação da PCR foi realizada em termociclador automático (MiniCycler
TM
, M.J. Research Inc) utilizando as seguintes condições: 1 min. a 94ºC (pré-
desnaturação), depois 1 min. a 94ºC (desnaturação), 1 min. a 65ºC
(anelamento), 1 min. a 72ºC (extensão), totalizando 45 ciclos, e mais um ciclo
de 7 min. a 72ºC, para extensão final do fragmento.
5.5.2.5. Detecção do produto amplificado
Os produtos amplificados na PCR foram submetidos à eletroforese
(100V) em gel de agarose 1% preparado com TEB 0,5X, corado com brometo
de etídio e visualizados no transluminador de U.V. Utilizou-se o marcador de
peso molecular 1Kb Ladder (Invitrogen, USA) para comprovar o tamanho do
fragmento amplificado durante as corridas eletroforéticas. Quando positivos, os
produtos foram digeridos por enzimas de restrição.
5.5.3. PCR com análise por enzimas de restrição (PRA)
5.5.3.1. Digestão pelas enzimas de restrição
O produto amplificado, depois de comprovado o tamanho do fragmento,
foi submetido à digestão por enzimas de restrição. Foram utilizadas duas
enzimas de restrição: a BstEII e a HaeIII (Promega, USA). Para digestão do
fragmento com a BstEII foram utilizados 10µL de produto do PCR contendo 6U
da enzima, o mesmo foi feito para enzima HaeIII, contendo 10U submetidas a
incubação em banho-maria a 65ºC por 1 hora para enzima BstEII e a 37ºC por
METODOLOGIA
55
1 hora para enzima HaeIII. As enzimas clivaram o fragmento parcial do gene
hsp65 nas regiões específicas C e G como ilustrado na Figura 3.
Figura 3. Regiões específicas de clivagem das enzimas de restrição utilizadas
no método PRA-hsp65.
Enzima BsteII
5’ ...G↓GTNAC C...3’
3’ ...C CANTG↑G...5’
Enzima HaeIII
5’ ... GG↓CC ... 3’
3’ ... CC↑GG ... 5’
5.5.3.2. Análise da digestão
A análise dos produtos digeridos foi realizada em gel de agarose 3% (D-
1 LE – Bioamerica,
USA), utilizando o marcador de peso molecular de 50pb e
25 bp Ladder (Promega, USA) para comprovar os fragmentos obtidos. A
corrida eletroforética foi fotografada e a imagem analisada pela comparação
dos padrões já existentes no banco de espécies do programa disponível no
PRASITE (http://app.chuv.ch/prasite) ou na chave de identificação de acordo
com a Figura 4.
METODOLOGIA
56
Figura 4. Chave de identificação de espécies de MNT pelo método molecular
PRA-hsp65 (adaptada de CHIMARA et. al., 2008).
METODOLOGIA
57
5.6. Seqüenciamento do gene hsp65
O fragmento de 441pb do gene hsp65 foi amplificado pela PCR e
detectado em gel de agarose 1% como descrito no item 4.7.2.
5.6.1. Purificação do produto amplificado
Os produtos amplificados foram purificados com colunas comerciais do
kit MicroSpin
TM
S-400 (Amersham Biosciences), específicas para fragmentos
maiores que 200pb.; e também pelo kit QiAquick
R
Spin (QIAGEN, Germany).
5.6.2. Seqüenciamento
Para o seqüenciamento foram utilizados 30 ng (3-4L) do produto
amplificado, 1,75L de água Milliq, 0,25L de primer (3,2pmol), completando a
mistura com DYEnamic ET Dye Terminator Kit (MegaBACE, Amersham
Biosciences) totalizando um volume de 20 L por reação. O seqüenciamento
foi realizado no seqüenciador automático Mega Bace 1000 DNA Analysis
System (Amersham Life Science).
5.6.3. Espécies de referência
Foram utilizadas 115 seqüências parciais do gene hsp65 de espécies de
referência obtidas no Genbank incluindo: M. abscessus (AY498743), M.
africanum KIT 77710 (AY299176), M. agri (AY438080), M. aichiense ATCC
27280 (AY299147), M. arupense FI-05354 (DQ986513), M. asiaticum ATCC
25276 (AY299133), M. aurum (AY438081), M. austroafricanum (AJ310221), M.
avium subsp. paratuberculosis (DQ414422), M. boenickei CIP 107829
METODOLOGIA
58
(AY943195), M. bohemicum CIP 105811 (AF547811), M. bolletii CIP 108541
(AY859675), M. botniense DSM 44537 (AF547812), M. bovis ATCC 19210
(AY299178), M. branderi CIP 104592 (AF547815), M. brisbanense .CIP 107830
(AY943196), M. brumae (AF071129), M. canettii CIPT 140060005 (AJ749923),
M. caprae CIP 105776 (AF547884), M. celatum (AJ310225), M. chelonae
(DQ869272), M. chelonae subsp. abscessus (AJ310215), M. chimaera CIP
107892 (AY943198), M. chitae ATCC 19627 (AY299149), M. chlorophenolicum
CIP 104189 (AF547820), M. chubuense K237Y (DQ184957), M. columbiae
(AM062765), M. conspicuum CIP 105165 (AF547823), M. cookii CIP 105396
(AF547824), M. cosmeticum 2003-11-06 (AY449731), M. diernhoferi CIP
105384 (AF547825), M. doricum DSM 44339 (AF547826), M. duvalii
(AJ310229), M. elephantis CIP 106831 (AF547828), M. fallax (AJ310230), M.
farcinogenes ATCC 35753 (AY299150), M. fortuitum ATCC 13756 (DQ866789),
M. frederiksbergense OA128Y (DQ184963), M. fuerthensis DSM 44567
(AY550238), M. gadium CIP 105388 (AF547835), M. gastri ATCC 15754
(AY299182), M. genavense ATCC 51233 (AY299183), M. gilvum DSM 44503
(AF547838), M. goodii ATCC 700504 (AY458071), M. gordonae ATCC 14470
(AY299184), M. gordonae variant MS460 (AY550237), M. habana (AF129011),
M. haemophilum (AJ307630), M. hassiacum ATCC 700660 (AY373456), M.
heckeshornense DSM 44428 (AF547843), M. heidelbergense CIP 105424
(AF547844), M. hiberniae (AJ307631), M. hodleri CIP 104909 (AF547845), M.
holsaticum (AJ310469), M. houstonense ATCC 49403 (AY458077), M.
immunogenum (AY498741), M. interjectum ATCC 51457 (AY299186), M.
intermedium ATCC 51848 (AY299187), M. intracellulare (AY299188), M.
METODOLOGIA
59
intracellulare X variant DO69 (AY550235), M. jacuzzii (DQ137415), M. kansasii
(AY299191), M. komossense (AY438649), M. kubicae ATCC 700732
(AY373458), M. kumamotonense CST7247 (AB239920), M. lacus (AY438090),
M. lentiflavum ATCC 51985 (AY373453), M. lepraemurium variant TS130
(AY550232), M. malmoense ATCC 29571 (AY299193), M. marinum
(DQ985339), M. massiliense (AY596465), M. monacense FI-00234
(DQ381731), M. montefiorense DSM 44602 (AY943204), M. moriokaense CIP
105393 (AY859680), M. mucogenicum MUCO_06-606 (EF551425), M. murale
CIP 105980 (AF547859), M. nebraskense SM 44803 (DQ124110), M.
neoaurum ATCC 25795 (AY299156), M. nonchromogenicum ATCC 19530
(AY299136), M. novocastrense CIP 105546 (AF547862), M. obuense CIP
106803 (AF547863), M. palustre DSM 44572 (AY943200), M. paraffinicum
MAIS-34 (AY859015), M. parafortuitum ATCC 19686 (AY299157), M.
parascrofulaceum CIP 108112 (AY943201), M. parmense CIP 107385
(AY943202), M. peregrinum ATCC 14467 (AY299159), M. petroleophilum DSM
44182 (DQ350156), M. phlei ATCC 11758 (AY299158), M. phocaicum
MUCO_06-708 (EF551431), M. piscinum DSM 43272 (DQ350155), M.
septicum ATCC 700731 (AY496142), M. poriferae (AJ307645), M.
pseudoshottsii (AY571788), M. pulveris (MPU17953), M. rhodesiae (AJ307647),
M. salmoniphilum (DQ866782), M. saskatchewanense CIP 108114
(AY943203), M. scrofulaceum ATCC 19981 (AY299138), M. senegalense
ATCC 35796 (AY299160), M. septicum ATCC 700731 (AY373457), M. sherrisii
(AY365190), M. shimoidei ATCC 25275 (AY299140), M. shottsii ATCC 700981
(AY550225), M. simiae CIP 104531 (AF547875), M. smegmatis ATCC 35796
METODOLOGIA
60
(AY299161), M. sphagni (AJ307655), M. szulgai ATCC 35799 (AY299141), M.
terrae ATCC 15755 (AY299142), M. thermoresistibile ATCC 19527
(AY299162), M. tokaiense CIP 106807 (AF547881), M. triplex variant MS418
(AY550210), M. triplex (AY027786), M. triviale ATCC 23292 (AY299143), M.
tusciae CIP 106367 (AF547887), M. visibile 94-2864 (AY550208) e M. wolinskyi
ATCC 700010 (AY299164).
5.6.4. Análise do seqüenciamento
As seqüências obtidas foram analisadas pelo programa Chromas
TM
,
versão 2.3 Technelsyium (www.technelsyium.com) através dos cromatogramas
fornecidos após o seqüenciamento. O alinhamento das seqüências foi feito no
programa BioEdit Sequence Aligment Editor (www.bioedit.com) e a análise
comparativa foi realizada pelo BLAST (“Basic Local Alignment Search Tool”)
(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST), comparando com as seqüências referência
depositadas no GenBank. As árvores filogenéticas foram construídas baseadas
nos métodos maximum-likelihood (ML) e neighbour-joining (NJ) utilizando o
programa PAUP* 4.0b10 (Swofford 2002 Sunderland, Massachusetts, USA).
Os modelos de substituição para as reconstruções filogenéticas foram
estimados com Modelt Estt 3.7 usando o “Minimum Theoretical Information
Criterion” (AIC) e o “Bayesian Information Criterion” (BIC) (POSADA &
CRANDALL, 1998; POSADA & BUCKLEY, 2004). Foram utilizados os gêneros
Nocardia sp. e Corynebacterium sp. como espécies dos grupos externos e
Mycobacterium tuberculosis H37Rv como espécie intimamente relacionada
com as MNT.
RESULTADOS
61
6. RESULTADOS
6.1. Identificação Fenotípica
As amostras foram submetidas à análise de provas bioquímicas e a
observação do tempo de crescimento e pigmentação. Das 177 amostras 58
(33%) apresentaram crescimento rápido, sendo 81% clínicos e 19%
ambientais; e 119 (67%) apresentaram cresimento lento, onde 67% eram
clínicos e 33% ambientais. Entre as amostras, 123 (69,5%) não apresentaram
pigmentação (acromógenas), 34 (19,2%) foram identificadas como
escotocromógenas e 10 (5,6%) como fotocromógenas.
Os métodos bioquímicos identificaram 115 (65%) amostras, sendo 40
amostras clínicas de crescimento rápido e 63 de crescimento lento e 12
amostras ambientais de crescimento lento como mostram as tabelas 3, 4 e 5.
Contudo, não foi possível chegar à identificação da espécie com os métodos
bioquímicos em 62 (35%) amostras. A maior dificuldade de identificação
bioquímica ocorreu com as amostras ambientais, onde foi possível identificar a
espécie somente em 28% (12) das 43 amostras analisadas. Nestes casos os
resultados dos testes foram inconclusivos, houve problemas no crescimento
bacteriano, que muitas vezes foi insuficiente para a realização de determinada
prova bioquímica (Tabelas 6 e 7). Mas, nas amostras clínicas de crescimento
rápido de número 138-c (amostra de escarro identificada como M. fortuitum),
140-c (amostra de escarro identificada como M. flavescens) e 141-c (amostra
de escarro identificada como M. fortuitum), as espéceis foram identificadas
apenas através dos métodos bioquímicos, pois o DNA dessas amostras não
RESULTADOS
62
amplificou o que inviabilizou a realização da identificação molecular. Estas 3
amostras foram as únicas das 177 identificadas somente pela bioquímica.
A observação do tipo de crescimento e pigmentação das micobactérias
foi muito importante para identificação da espécie como complemento na
identificação molecular pelo método PRA-hsp65, auxiliando na confirmação do
perfil de PRA-hsp65 e, principalmente, nos casos confusos onde o padrão de
bandas era igual para mais de uma espécie.
Tabela 3. Resultado das Provas Bioquímicas das amostras clínicas de
crescimento rápido.
Número Amostra
Catalase
Nitrato
Urease
Arilsulfatase
NaCl 5%
CFA
MacConkey
Pigmento
Espécie
101-c Escarro + + + - + - - E M. flavescens
103-c Escarro + + + - + - - E M. flavescens
104-c Escarro induzido + + + + + + + A M. fortuitum
108-c Escarro + + + + + + + A M. fortuitum
111-c Escarro - + + - + + - E M. phlei
112-c Escarro + + + + + + + A M. fortuitum
117-c Escarro + + + - + - - E M. flavescens
126-c Escarro - + + - + - - A M. fortuitum
127-c Escarro + + + - + - - A M. flavescens
128-c Escarro + + + - + - - A M. flavescens
130-c Escarro + + + - + - - A M. flavescens
131-c Escarro + + + - + - - A M. flavescens
132-c Escarro + + + + + + + A M. fortuitum
135-c Escarro + + + + + + + A M. fortuitum
137-c Escarro + + + - + - - A M. flavescens
138-c Escarro - + + - + - - A M. fortuitum
140-c Escarro + + + - + - - E M. flavescens
141-c Escarro - + + - + - - A M. fortuitum
230-c Escarro + + + - + - - A M. flavescens
231-c Escarro + + + + + + + A M. fortuitum
232-c Escarro + + + + + + + A M. fortuitum
234-c Escarro + + + - + - - A M. flavescens
235-c Escarro + + + - + - - A M. flavescens
237-c Escarro + + + - + - - A M. flavescens
238-c Escarro + + + + + + + A M. fortuitum
239-c Escarro + + + - + - - A M. flavescens
A=acromógena; E=escotocromógena, F=fotocromógena, C=cromógena
* não definido
RESULTADOS
63
Continuação da tabela 3.
Número Amostra
Catalase
Nitrato
Urease
Arilsulfatase
NaCl 5%
CFA
Mackonkey
Pigmento
Espécie
242-c Escarro + + - + + + + A M. fortuitum
244-c Escarro + + - + - - + A M. chelonae
245-c Escarro + + + + + + + A M. fortuitum
246-c Escarro + + + + + + + A M. fortuitum
248-c Escarro + + - - + + + A M. fortuitum
249-c Escarro + + + + + + + A M. fortuitum
251-c Escarro + + + + + + + A M. fortuitum
252-c Escarro + + + + + + + A M. fortuitum
253-c Escarro + + + + + + + A M. fortuitum
254-c Escarro + - + + + - + A M.chelonae
3172 Líquor + +
*
-
*
+
*
C M. flavescens
1590 Líquido ascítico + +
*
+
*
+
*
A M. fortuitum
1141 Vávula tricúspide + -
*
+
*
-
*
A Comp. M.cheloneae/abscessus
1142 Vávula aórtica + -
*
+
*
-
*
A Comp. M.cheloneae/abscessus
40 amostras
A=acromógena; E=escotocromógena, F=fotocromógena, C=cromógena
* não definido
RESULTADOS
64
Tabela 4. Resultado das Provas Bioquímicas das amostras clínicas de
crescimento lento.
Número Amostra
Catalase
Niacina
Redução do
telurito de K
Nitrato
Hidrólise do
Tween 80
Urease
Pigmento
Espécie
102-c Escarro + - - + + + E M. szulgai
105-c Escarro + - - + + + E M. szulgai
106-c Escarro + - - + + + F M. kansasii
107-c Escarro + - + - - - A MAC
109-c Escarro + - + - - - A MAC
116-c Escarro + - + - - - A MAC
118-c Escarro + - - + + + F M. kansasii
129-c Escarro + - - + + + F M. kansasii
133-c Escarro + - - + + + F M. kansasii
139-c Escarro + - - + + + F M. kansasii
229-c Escarro induzido + - - + + + F M. kansasii
236-c Escarro + - + - - - A MAC
241-c Escarro + - - + + + F M. kansasii
243-c Escarro - - - - + - A M. gastri
250-c Escarro + - - + + + F M. kansasii
427-c Escarro induzido + - - - - - E M. xenopi
432-c Escarro induzido + - - - + + E M. gordonae
446-c Escarro induzido + - - - + + E M. gordonae
450-c Escarro induzido + - - - - - E M. xenopi
451-c Escarro induzido + - - - - + E M. scrofulaceum
461-c Escarro + - - - - + E M. scrofulaceum
462-c Escarro induzido + - + - - - A MAC
465-c Escarro induzido + - - - - + E M. scrofulaceum
532-c Escarro + - - - + + E M. gordonae
527-c Escarro + - - - - - E M. xenopi
546-c Escarro + - - - + + E M. gordonae
550-c Escarro + - - - - - E M. xenopi
551-c Escarro + - - - - + E M. scrofulaceum
565-c Escarro + - - - - + E M. scrofulaceum
3683 Escarro + - + - - - A MAC
3684 Escarro + - + - - - A MAC
3807 Escarro + - + - - - A MAC
4226 Escarro + - + - - - A MAC
3736 Escarro + - + - - + A MAC
4183 Escarro induzido + - + - - + A MAC
4673 Escarro induzido + - + - - - A MAC
1157 Escarro induzido + - + - - - A MAC
4728 Escarro induzido + - + - - - A MAC
1277 Escarro induzido + - + - - - A MAC
1449 Escarro induzido + - + - - - A MAC
2722 Escarro induzido + - + - - - A MAC
1231 Sangue + - + - - - A MAC
1386 Sangue + - + - - - A MAC
A=acromógena; E=escotocromógena, F=fotocromógena, C=cromógena
RESULTADOS
65
Continuação da tabela 4.
Número Amostra
Catalase
Niacina
Redução do
telurito de K
Nitrato
Hidrólise do
Tween 80
Urease
Pigmento
Espécie
762 Biopsia linfonodo + - + - - - A MAC
1529 LBA + - + - - - A MAC
3425 Biopsia pleural + - + - - - A MAC
3168 Biopsia linfonodo + - + - - - A MAC
1937 Sangue + - - + + + A MAC
5488 Sangue + - + - - - A MAC
4408 Sangue + - + - - + A MAC
4615 Biopsia linfonodo + - + - - + A MAC
1019 LBA + - + - - - A MAC
2836 Diversos + - + - - - A MAC
3423 Linfonodo + - + - - - A MAC
3742 Sangue + - + - - - A MAC
649 Sangue + - + - - - A MAC
111 Líquido pleural + - + - - - A MAC
1320 Sangue + - + - - - A MAC
3757 Biopsia linfonodo + - + - - - A MAC
2847 Medula óssea + - + - - - A MAC
1275 Sangue + - + - - - A MAC
2098 Sangue + - - + + + F M. kansasii
3149 LBA + - + - - - A MAC
63 amostras
A=acromógena; E=escotocromógena, F=fotocromógena, C=cromógena
Tabela 5. Resultado das Provas Bioquímicas das amostras ambientais de
crescimento lento.
Nùmero Amostra
Catalase
Redução do
telurito de K
Hidrólise do
Tween 80
Urease
Pigmento
Espécie
255-a
Linfonodo de suíno
+ + - -
A
MAC
258-a
Linfonodo de suíno
+ + - -
A
MAC
259-a
Linfonodo de suíno
+ + - -
A
MAC
260-a
Linfonodo de suíno
+ + - -
A
MAC
261-a
Linfonodo de suíno
+ + - -
A
MAC
262-a
Água
+ + - -
A
MAC
267-a
Linfonodo de suíno
+ + - -
A
MAC
268-a
Água
+ + - -
A
MAC
655-a
Linfonodo de suíno
+ + - -
A
MAC
659-a
Linfonodo de suíno
+ + - -
A
MAC
660-a
Linfonodo de suíno
+ + - -
A
MAC
662-a
Água
+ + - -
A
MAC
12 amostras
RESULTADOS
66
Tabela 6. Relação de amostras clínicas e ambientais de crescimento rápido
sem identificação pelas provas bioquímicas.
Número Amostra
Catalase
Nitrato
Urease
Arilsulfatase
NaCl 5%
CFA
Mackonkey
Pigmento
115-c Escarro iduzido + * - * - - * A
119-c Escarro - * - * * - * A
125-c Escarro - * + * - * + A
136-c Escarro - + - * * * * A
233-c Escarro * + - * - - * A
240-c Escarro + - - * - * * A
247-c Escarro induzido + - - * * - * A
277-a Solo + + + + + - + A
279-a Solo + + + + + + + E
280-a Solo + + + + + - + A
284-a Solo + + + + + + + A
285-a Solo + + + + - - + A
286-a Solo + + - + + + + E
287-a Solo + + + + + - + A
289-a Solo + + + - + - - A
299-a Solo + + - + + + + A
301-a Solo + + - + + + + A
395-a Solo * - * + * + * A
18 amostras
A=acromógena; E=escotocromógena, F=fotocromógena, C=cromógena
* não definido
Tabela 7. Relação de amostras clínicas e ambientais de crescimento lento sem
identificação pelas provas bioquímicas.
Número Amostra
Catalase
Niacina
Redução do
telurito de K
Nitrato
Hidróli
se do
Tween 80
Urease
Pigmento
423-c Escarro induzido * * * + + + A
424-c Escarro induzido + - - * + + A
428-c Escarro induzido + * * - * * E
430-c Escarro induzido + * * * * * A
434-c Escarro induzido + * * * + + A
436-c Escarro induzido + * * - + + E
438-c Escarro induzido + * * * - + F
439-c Escarro + * * - - + A
440-c Escarro induzido + - * + * * A
442-c Escarro induzido + * * + + + A
445-c Escarro induzido + - - * * * E
A=acromógena; E=escotocromógena, F=fotocromógena, C=cromógena
* não definido
RESULTADOS
67
Continuação da tabela 7.
Número Amostra
Catalase
Niacina
Redução do
telurito de K
Nitrato
Hidrólise do
Tween 80
Urease
Pigmento
447-c Escarro induzido + * * - - + A
448-c Escarro induzido + - - * * *
A
452-c Escarro induzido + * - * * *
A
454-c Escarro induzido + * * * - +
E
456-c Escarro induzido + - - * * *
A
457-c Escarro induzido + * * - * *
A
458-c Escarro induzido + - - * * *
A
463-c Escarro induzido * * * + * *
A
466-c Escarro induzido + * * - * *
A
467-c Escarro induzido + - - * * *
A
468-c Escarro induzido + * * - - +
A
562-c Escarro + * * - * *
A
563-c Escarro + * * + * *
A
263-a Água + * + * + -
A
264-a Água + * + * + +
A
269-a Água + * + * + - A
308-a Fezes bovinas + * + * + +
A
314-a Fezes bovinas + * + * + +
E
315-a Fezes bovinas + * + * + -
E
318-a Fezes bovinas + * + * + -
E
328b-a Fezes bovinas + * + * + +
E
328c-a Fezes bovinas + * + * + -
A
345-a Fezes bovinas + * + * + +
A
346-a Fezes bovinas + * + * + -
E
358-a Linfonodo de suíno + * + * + -
A
359-a Linfonodo de suíno + * + * + +
A
369-a Linfonodo de suíno + * + * + -
A
370-a Linfonodo de suíno + * + * + -
E
371-a Linfonodo de suíno + * + * + -
E
417-a Fezes bovinas + * + * + +
A
663-a Água + * + * + -
A
664-a Água + * + * + +
A
669-a Água + * + * + -
A
44 amostras
A=acromógena; E=escotocromógena, F=fotocromógena, C=cromógena
* não definido
RESULTADOS
68
6.2. Identificação molecular
6.2.1. PCR
A reação em cadeia da polimerase (PCR) amplificou um produto de
441pb do gene hsp65 (Figura 5) com aproximadamente 200ng (Figura 6).
Figura 5. Seqüência parcial do gene hsp65 de uma amostra de escarro,
ilustrando os iniciadores e o fragmento do produto amplificado.
ATGGCCAAGACAATTGCGTACGACGAAGAGGCCCGTCGCGGCCTCGAGCGGGGGCTCAACGC
CCTCGCCGACGCGGTAAAGGTCACGTTGGGCCCCAAGGGTCGCAACGTCGTCCTGGAGAAGA
AGTGGGGTGCCCCCACGATCACCAACGATGGTGTGTCCATCGCCAAGGAGATCGAGCTGGAG
GACCCGTACGAGAAATCGGCGCCGAGCTGGTCAAGGAAGTCGCCAAGAAGACCGACGACGTC
GCCGGTGACGGCACGACGACGGCCACGGTGCTCGCCCAGGCGTTGGTCCGCGAGGGCCTGCG
CAACGTCGCGGCCGGCGCCAACCCGCTGGGTCTCAAGCGCGGCATCGAGAAGGCCGTCGAGA
AGGTCACCGAGACCCTGCTCAAGTCGGCCAAGGAGGTCGAGACCAAGGACCAGATCGCTGCC
ACCGCGGCCATCTCCGCGGGCGACCAGTCGATCGGCGACCTGATCGCCGAGGCGATGGACAA
GGTCGGCAACGAGGGCGTCATCACCGTCGAGGAGTCCAACACCTTCGGCCTGCAGCTCGAGC
TCACCGAGGGTATGCGGTTCGACAAGGGTTACATCTCGGGCTACTTCGTCACCGACGCCGAG
CGTCAGGAAGCCGTCCTCGAGGACCCGTTCATCCTGCTG
Figura 6. Gel de agarose 1% corado com brometo de etídio visualizado em
transluminador U.V. com marcador de peso molecular 1kb Ladder e amostras
de amplificação de 441pb do gene hsp65.
441pb →
M 1 2 3 CN
Legenda:
M: peso molecular de 1kb Ladder
1, 2, 3: amostras clínicas de escarro
CN: controle negativo da reação
RESULTADOS
69
6.2.2. PRA-hsp65
A diferenciação das amostras clínicas e ambientais pelo método PRA-
hsp65 foi feita comparando os padrões de restrição de clivagem (figuras 7 e 8).
Figura 7. Gel de agarose 3% corado com brometo de etídio e visualizado em
transluminador U.V. Clivagem do produto amplificado de 7 amostras com as
enzimas BstEII e HaeIII.
Legenda:
Linhas 1, 5, 6, 7 e 8: Amostras de escarro – Complexo MTB
Linhas 2 e 4: Amostras de escarro induzido – M. gordonae tipo 3.
Linha 3: Amostra de escarro – M. avium tipo 2.
200
175
150
125
100
75
50
25
RESULTADOS
70
Figura 8. Gel de agarose 3% corado com brometo de etídio e visualizado em
transluminador U.V. Clivagem do produto amplificado de 8 amostras com as
enzimas BstEII e HaeIII.
Legenda:
Linhas: 1, 2, 3, 5, 6, 7 e 8: Amostras de escarro – M. avium tipo 1.
Linhas: 4: Amostra de escarro –M. intracellulare tipo 3.
200
175
150
125
100
75
50
25
RESULTADOS
71
Os padrões de clivagem das amostras foram analisados utilizando o
programa PRASITE, disponibilizado na internet, que possui diferentes tipos de
padrões de clivagens para identificação de micobactérias. Das 177 amostras
174 foram analisadas pelo método molecular PRA-hsp65, já que o DNA de 3
amostras não amplificou, impossibiltando a realização da técnica.
Das 174 amostras analisadas pelo PRA-hsp65 35,6% (62) foram
identificadas como M. avium 1; 1,15% (2) M. avium 2; 1,15% (2) M. avium 3;
2,9% (5) M. intracellulare; 23,6% (41) M. fortuitum 1; 1,15% (2) M. fortuitum 2;
86,2% (15) M. gordonae 1; 0,6% (1) M. gordonae 3; 2,3% (4) M. gordonae 5;
0,6% (1) M. gordonae 6; 0,6% (1) M. kansasii 1; 1,7% (3) como M. kansasii 2;
1,15% (2) M. kansasii 3; 2,9% (5) M. scrofulaceum; 2,9% (5) M. chimera; 1,15%
(2) M. abscessus; 1,15% (2) M. paraffinicum; 1,15% (2) M. peregrinum; 1,15%
(2) M. xenope; 0,6% (1) M. lentiflavum 3; ,6% (1) M. gastri; 0,6% (1) como M.
diernhoferi; 0,6 % (1) M. monacense; 0,6% (1) M. boenickei; 0,6% (1) M.
intermedium; 0,6% (1) M. bohemicum; 0,6% (1) M. marinum e 5,2% (9)
Complexo M. tuberculosis (Tabela 8).
RESULTADOS
72
Tabela 8: Relação dos padrões de PRA-hsp65 obtidos no estudo de acordo
com a análise das clivagens pelas enzimas de resrição.
Nº de amostras BstEII HaeIII Espécie
61 235/210 130/105 M. avium 1
41 235/120/85 145/120/60 M. fortuitum 1
16 235/120/85 160/115/60 M. gordonae 1
9 235 / 120 / 85 150 / 130 / 70 Complexo MTB
5 235/115/100 145/130/60 M. intracellulare 1
5 235 / 210 145 / 130 / 95 M. scrofulaceum 1
5 235/120/100 145/130/60 M. chimera 1
4 235/210 125/110 M. gordonae 5
3 235/130/85 130/105 M. kansasii 2
2 235/210 130/105/60 M. avium 2
2 235/130/85 130/105/70 M. avium 3
2 235/115/85 140/120/60 M. fortuitum 2
2 235/130/85 130/105/70 M. kansasii 3
2 235/210 145/70/60/55 M. abscessus 1
2 235/210 145/140/100 M.peregrinum 1
1 235/115/100 125/110 M. gordonae 3
1 235/130/85 140/120/95 M. gordonae 6
1 235/210 130/105/80 M. kansasii 1
1 235/120/100 145/130 M. lentiflavum 3
1 235/120/85 130/105/70 M. gastri 1
1 320/115 145/140/60 M. diernhoferi
1 235/130/85 175/80 M. monacense
1 235/210 140/125/60 M. boenickei 1
1 235 / 210 145/130 M. intermedium 1
1 235/210 145/105 M. bohemicum 1
2 235 / 120 / 85 160/105/60 M. xenopi 1
1 235 / 210 145/105/80 M. marinum 1
174 amostras
6.2.3. Comparação dos resultados de identificação entre o PRA-hsp65 e
as Provas Bioquímicas
Das 177 amostras, 3 foram identificadas somente através da bioquímica,
pois o DNA não foi amplificado, e 62 foram identificadas somente pelo método
molecular PRA-hsp65, já que a bioquímica foi inconclusiva nestes casos.
Quando comparados os resultados do método PRA-hsp65 com as provas
bioquímicas foi possível observar que das 112 amostras analisadas pelos dois
RESULTADOS
73
métodos de identificação 71,4% (80) foram concordantes entre o método PRA-
hsp65 e as provas bioquímicas e 28,6% (32) foram discordantes entre os
métodos de identificação (Tabelas 9 e 10).
RESULTADOS
74
Tabela 9. Discordância na identificação das amostras clínicas entre o PRA-
hsp65 e as provas bioquímicas.
Provas Bioquímicas PRA
Número Amostra
Espécie Crescimento Espécie
101-c Escarro M. flavescens R M. fortuitum 1
103-c Escarro M. flavescens R M. fortuitum 1
111-c Escarro M. phlei L M. avium 1
117-c Escarro M. flavescens R M. fortuitum 1
127-c Escarro M. flavescens R M. fortuitum 1
128-c Escarro M. flavescens R M. fortuitum 1
130-c Escarro M. flavescens R M. fortuitum 1
131-c Escarro M. flavescens R M. fortuitum 1
137-c Escarro M. flavescens R M. fortuitum 1
230-c Escarro M. flavescens R M. fortuitum 1
234-c Escarro M. flavescens R M. fortuitum 1
235-c Escarro M. flavescens R M. fortuitum 1
237-c Escarro M. flavescens R M. fortuitum 1
239-c Escarro M. flavescens R M. fortuitum 2
244-c Escarro M. chelonae R M. peregrinum 2
245-c Escarro M. fortuitum R M. diernhoferi
3172 Líquor M. flavescens R M. monacense
102-c Escarro M. szulgai L M. gordonae 1
105-c Escarro M. szulgai L M. gordonae 1
118-c Escarro M. kansasii L M. gordonae 6
129-c Escarro M. kansasii L M. lentiflavum 3
241-c Escarro M. kansasii L M. gordonae 5
250-c Escarro M. kansasii L M. fortuitum 1
451-c Escarro induzido M. scrofulaceum L M. gordonae 1
461-c Escarro M. scrofulaceum L M. gordonae 3
465-c Escarro induzido M. scrofulaceum L M. kansasii 2
427-c Escarro induzido M. xenopi L M. gordonae
450-c Escarro induzido M. xenopi L M. gordonae
527-c Escarro M. xenopi L M. gordonae
550-c Escarro M. xenopi L M. gordonae
551-c Escarro M. scrofulaceum L M. gordonae
565-c Escarro M.scrofulaceum L M. avium
32 amostras
Pelo método PRA-hsp65 foi possível identificar 174 (98%) amostras
clínicas (131) e ambientais (43), apenas em 3 (1,7%) amostras não foi possível
amplificar o DNA, um baixo percentual em comparação com a identificação
bioquímica, que foi inconclusiva na identificação de 35% das amostras.
RESULTADOS
75
Tabela 10. Resumo da análise dos resultados obtidos entre as provas
bioquímicas e o PRA-hsp65.
PRA X Provas Bioquímicas
Concordantes Discordantes
Provas Bioquímicas
(inconclusivas)
PRA
(não amplificou)
80 (71,4%) 32 (29%) 62 (35%) 3 (1,7%)
6.2.4. Seqüenciamento do gene hsp65
O objetivo foi realizar um estudo de análise e correlação entre amostras
clínicas e ambientais observando o agrupamento das amostras do estudo com
as espécies de referência já descritas na literatura. O gene hsp65 tem sido
muito utilizado em análises filogenéticas e também no diagnóstico de MNT de
rotina, através do PRA-hsp65.
Foram seqüenciados os DNAs de 52 amostras (28 amostras clínicas e
24 ambientais) utilizadas para a análise filogenética, sendo comparadas com
151 seqüências de diferentes espécies de micobactérias de referência
disponíveis no GenBank, da mesma região parcial de 441pb do gene hsp65.
As análises basearam-se na comparação da seqüência de 368pb do
gene hsp65. Devido à qualidade das seqüências não foi possível analisar os
441pb amplificados pelos iniciadores. (Figura 9).
RESULTADOS
76
Figura 9. Eletroferograma de uma seqüência de nucleotídeos da região parcial de 441 pares de base do gene hsp65.
RESULTADOS
77
6.2.5. Seqüenciamento e análise filogenética
A construção das árvores filogenéticas seguiu os métodos do “critério
otimizado” (máxima parcimônia-MP e máximo likelihood-ML), já que se
trabalhou com caracteres discretos (seqüências nucleotídicas), e Neighbor-
joining (NJ). O método MP escolhe a árvore que requer as menores mudanças
evolutivas, e o ML, escolhe a árvore que, de todas, é a que mais comumente
produziu o dado observado. O NJ é um algoritmo usado para construir a árvore
mais curta (mínima evolução).
O nível de confiança de cada árvore construída (hipóteses filogenéticas)
foi testado através do método de re-amostragem chamado Bootstrap.
Os modelos de substituição nucleotídica, necessários para as
reconstruções filogenéticas, foram estimados com o programa “Model Test 3.7”
(POSADA & CRANDALL, 1998) usando o “minimum theoretical information
criterion” (AIC) e o “Bayesian information criterion” (BIC) como sugerido por
Posada & Buckley (2004). Foram utilizados os gêneros Nocardia sp. e
Corynebacterium sp. Como grupos externos e Mycobacterium tuberculosis
H37RV como espécie intimamente relacionada com as MNT.
A variablidade genética das seqüências obtidas através do
seqüenciamento parcial do gene hsp65 das amostras clínicas e ambientais foi
significativa, pois foram encontrados 95 sítios variáveis somando as amostras
clínicas e ambientais e a diversidade nucleotidica (pi), que é o número médio
de diferenças por sítio entre pares de seqüências de uma amostra, foi de 0,065
para as amostras clínicas e 0,062 nos amostras ambientais, valores médios
semelhantes, mas considerados com variações significativas (Tabelas 11 e 12).
RESULTADOS
78
Tabela 11. Informações sobre os polimorfismos na seqüência parcial do gene
hsp65 das amostras analisadas.
Amostras Clínicas Ambientais Clínicas + Ambientais
Número de seqüências 28 24 52
Número de sítios variáveis 73 85 95
Número total de mutações 91 106 128
Número de haplótipos 19 17 34
Diversidade de haplótipos 0,947 0,920 0,963
Diversidade nucleotidica (Pi) 0,06508 0,06221 0,06590
Média de diferença nucleotídica (K) 23,88360 22,82971 24,18627
A sequência padrão utilizada foi do M. tuberculosis e dentre as 52
sequências analisadas foram encontradas 128 mutações pontuais, inserções e
deleções, sendo que as amostras ambientais mostraram um maior número de
mutações (106) na região parcial do gene hps65 em relação às amostras
clínicas. Das amostras analisadas surgiram 34 haplótipos diferentes e a
diversidade nucleotídica foi de 0,6590 mostrando significativa e indicando
varibailidade genética entre as espécies.
RESULTADOS
79
Tabela 12. Comparação variabilidade genética das amostras analisadas pelo seqüenciamento parcial do gene hsp65.
M_tuberculosis CCGAGAGAAT CCTCGGCCGG CGTGTCGCGC CCCGCCCGTC ACACGGGCCG GACCGCAAGG GCGGCCGTGC ACGTGGTCCT CGGCCTCCTG CGCCC
Ambiental_soil_299 .TC....C.C .GC.CC..T. ACC....TAT ...T....CG G.G.C..... ...G.G...A ....G..CT. CGTCCC.... .CCT.AG.CC ...G.
Ambiental_soil_395 .TC....C.C .GC.CC..T. ACC....TAT ...T....CG G.G.C..... ...G.G...A ....G..CT. CGTCCC.... .CCT.AG.CC ...G.
Ambiental_soil_301 .TC....C.C .GC.CC..T. ACC....TAT ...T....CG G.G.C..... ...G.G...A ....G..CT. CGTCCA.... .CCT.AG.CC ...G.
Ambiental_269 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .....
Clinical_424 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .....
Clinical_442 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .....
Clinical_448 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .....
Clinical_458 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .....
Clinical_463 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .....
Clinical_468 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .....
Clinical_447 .......... .........A .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .....
Clinical_467 .......... .........A .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .....
Clinical_440 .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... ........GC T....
Ambiental_369 T..C.TACCC ...G...G.C ....C..... ......G... G.G.C..... .........T CG....CCT. G.CCC.CG.C ..C.....CC .....
Clinical_452 T..G..AC.C ...G...G.C ....C..... ......G... G.G.C..... .........T CG....CCT. G.CCC.CG.C ..C.....CC .....
Ambiental_259 T..G..AC.C ...G...G.C ....C..... ......G... G.G.C..... .........T CG....CCT. G.CCC.CG.C ..C.....CC .....
Ambiental_bovine_328b ...G..AC.C ...G...G.C ....C..... ......G... G.G.C..... .........T CG....CCT. G.CCC.CG.C ..C.....CC .....
Ambiental_255 ...G..AC.C ...G...G.C ....C..... ......G... G.G.C..... .........T CG....CCT. G.CCC.CG.C ..C.....CC .....
Ambiental_263 ...G..AC.C ...G...G.C ....C..... ......G... G.G.C..... .........T CG....CCT. G.CCC.CG.C ..C.....CC .....
Ambiental_264 ...G..AC.C ...G...G.C ....C..... ......G... G.G.C..... .........T CG....CCT. G.CCC.CG.C ..C.....CC .....
Ambiental_bovine_345 ...G..AC.C ...G...G.C ....C..... ......G... G.G.C..... .........T CG....CCT. G.CCC.CG.C ..C.....CC .....
Ambiental_260 ...G..AC.C ...G...G.C ....C..... ......G... G.G.C..... .........T CG....CCT. G.CCC.CG.C ..C.....CC .....
Ambiental_262 ...G..AC.C ...G...G.C ....C..... ......G... G.G.C..... .........T CG....CCT. G.CCC.CG.C ..C.....CC ..A..
Ambiental_358 ...G..AC.C ...G...G.C ....C..... ......G... G.G.C..... .........T CG....CCT. G.CCC.CG.C ..C.....CC .....
Clinical_434 ...G..AC.C ...G...G.C ....C..... ....T.G... G.G.C..... .........T CG....CCT. G.CCC.CG.C ..C.....CC .....
RESULTADOS
80
M_tuberculosis CCGAGAGAAT CCTCGGCCGG CGTGTCGCGC CCCGCCCGTC ACACGGGCCG GACCGCAAGG GCGGCCGTGC ACGTGGTCCT CGGCCTCCTG CGCCC
Clinical_456 ...G..AC.C ...G...G.C ....C..... ....T.G... G.G.C..... .........T CG....CCT. G.CCC.CG.C ..C.....CC .....
Clinical_462 ...G..AC.C ...G...G.C ....C..... ....T.G... G.G.C..... .........T CG....CCT. G.CCC.CG.C ..C.....CC .....
Clinical_430 ...G..AC.C ...G...G.C ..C.C..... ....T.G... G.G.C..... .........T CG....CCT. G.CCC.CG.C ..C.....CC .....
Ambiental_359 ...G..AC.C ...G.....C ....C..... ......G... G.G.C..... .........T CG....CCT. G.CCC.CG.C ..C.....CC .....
Ambiental_bovine_308 ...G..AC.C T..G...GT. ....C..... ......G..G G.G.CC.... .........T CGA...CCT. G.CCC.CG.C ..C.....CC .....
Ambiental_bovine_417 ...G..AC.C T..G...GT. ....C..... ......G..G G.G.C..... .........T CGA...CCT. ..CCC.CG.C ..CT....CC .....
Clinical_466 ...G..AC.C T..G...GT. ....C..... ......G..G G.G.C..... .........T CGA..GCCT. G.CCC.CG.C ..C.....CC .....
Clinical_423 ...G..AC.C ...G...G.. ....C..... ...C..G..G G.G.C..... .........T CGA...CCT. G.CCC.CG.. ..C.....CC .....
Clinical_457 ...G..AC.C ...G...G.. ..C.G..T.T .T....T... GTG.C..... .........T CG....CCA. .......G.C ..C.....CC ...T.
Ambiental_bovine_318 ...G..AC.C ...G...G.. ..C.GAAGAT G.......CG GTG.C..... .....G...T CG....CC.. T...C.CG.C ..C.....CC .....
Clinical_450 ...GA.AC.C ...G...G.. ..C.CAAG.. ....G.GAC. G.GGC..... .........T CG....CCC. G...C.CG.C ..C.....CC .....
Clinical_436 ...G..AC.C G..G...G.C ..C.CAAG.. ....G.GAC. G.GGC..... .........T CG....CCC. G...C.CG.C ..T.....CC .....
Ambiental_bovine_314 ...G..AC.C ...G.....C G.C.CAAGAT T.....G.C. G.G.CA.G.. AGGTC.GC.A ...C...C.. CGCAC.CG.C ..C....GCC .A...
Clinical_445 ...G..AC.C ...G...G.. ..CCCAAG.. ...CGTG.C. G.G.C..... .GT......T C..C...C.. G...C.C..C ..C.....CC .....
Ambiental_bovine_328c ...G..AC.C T..G...G.. .CC.CAAG.. ...C..T... G.GGC..... .........T CG.C...C.. GGTAC.CG.C ..C.....CC .....
Ambiental_bovine_315 ...G..AC.C T......... G.C.CAAGAT ..TATTG.CG G.G.CAA..C .......GCT CG.C...... GGCCC.CG.. T.C.T...CC .....
Clinical_427 ...G..AC.C T...C.G... G.C.CAAG.. ...T.TG..G G.G.CAA..C .......GCT CG.C...C.. GGCCC.CG.. ..C.....CC .....
Ambiental_370 T..G..AC.C .......... G.C.CAAGA. ...A.TG.CG G.G.....GC ......TCCT CG.C...C.. GGCCCACG.. ..C.....CC .....
Ambiental_371 ...G..AC.C .......... G.C.CAAGA. ...A.TG.CG G.G.....GC ......TCCT CG.C...C.. GGCCCACG.. ..C.....CC .....
Clinical_432 T..G..AC.C .......... G.C.CAAGA. ...A.TG.CG G.G......C ......TCCT CG.C...C.. GGCCC.CG.. ..C.....CC .....
Clinical_454 T..G..AC.C .......... G.C.CAAGA. ...A.TG.CG G.G......C ......TCCT CG.C...C.. GGCCC.CGT. ..C.....CC .....
Clinical_428 ...G..AC.C .......... G.C.CAAGA. ...A.TG.CG G.G......C ......TCCT CG.C...C.. GGCCC.CG.. ..C.....CC .....
Clinical_465 ...G..AC.C .......... G.C.CAAGA. ...A.TG.CG G.G......C ......TCCT CG.C...C.. GGCCC.CG.. ..C.....CC .....
Clinical_446 ...C..AC.C .......... G.C.CAAGA. ...A.TG.CG G.G......C ......TCCT CG.C...C.. GGCCC.CG.. ..C.....CC .....
Clinical_451 .T.G..AC.C T.CG..G... GAC.CAAGA. ..AC..G.GG G.G......C .......GCT CG.C...C.. GGCCC..G.. ..C.....CC ....G
Ambiental_bovine_346 .T.G..AT.C G.C....... G.C.CAAG.. ..T...G... G.G.C....C .......GCT CG.T...C.. TGCCCC.G.C ..C.....CC .....
Clinical_438 .T.G..AT.C G..G...... ..C.CAAGA. ..T..T...G G.GAC..... .........T CGA....C.G ..CCCCCG.C ........CC .....
RESULTADOS
81
A Figura 10 ilustra a árvore consenso de 200 bootstrap (número de
rearranjos sufiente para análise filogenética), método para estimar a
variabilidade em estatística, mostrando a relação entre as amostras ambientais
e as clínicas e seqüências de espécies de referência de micobactérias. Os
valores de bootstrap superiores a 70% estão indicados na árvore filogenética e
a distância entre duas linhagens é a soma dos comprimentos dos ramos entre
elas.
RESULTADOS
82
Figura 10. Árvore filogenética ilustrando a análise da seqüência parcial do
gene hsp65 das amostras ambientais e clínicas comparadas com as espécies
de referência retiradas do Genbank.
Corynebacterium sp
Nocardia
sp.
M. diernhoferi
M. cosmeticum
M. frederiksbergense
M. parafortuitum
M. mucogenicum
M. phocaicum
M. murale
M. tokaiense
M. brisbanense
M. farcinogenes
M. houstonense
ambiental 299
ambiental 301
ambiental 395
M. fortuitum
M. jacuzzii
M. wolinskyi
M. lentiflavum
M. peregrinum
M. boenickei
M. septicum
M. goodii
M. piscinum
M. smegm atis
M. abscessus
M. bolletii
M. chelonae abscessus
subsp.
M. massiliense
M. arupense
M. hiberniae
M. chelonae
M. fuerthensis
M. immunogenum
M. salmoniphilum
M. rhodesiae
M. aichiense
M. petroleophilum
M. brumae
M. chitae
M. hodleri
M. doricum
M. monacense
M. agri
M. triviale
M. novocastrense
M. holsaticum
M. senegalense
M. aurum
M. gilvum
M. komossense
M. gadium
M. tusciae
M. austroafricanum
M. duvalii
M. poriferae
M. chlorophenolicum
M. chubuense
M. obuense
M. moriokaense
M. phlei
M. sphagni
M. hassiacum
M. thermoresistibile
M. elephantis
M. pulveris
M. kumamotonense
M. terrae
M. cookii
M. sherrisii
M. habana
M. genavense
M. shimoidei
M. simiae
M. malmoense
M. bohemicum
M. heckeshornense
M. xenopi
M. interjectum
M. saskatchewanense
92
97
70
82
97
99
97
99
86
90
100
88
88
70
94
85
95
100
70
100
72
91
86
Crescimento
lento
Crescimento
rápido
RESULTADOS
83
Continuação da árvore filogenética.
0.1
M. conspicuum
clínica 445
ambiental 314
ambiental 328c
ambiental 346
M. asiaticum
ambiental 315
clínica 427
clínica 428
clínica 446
clínica 465
clínica 432
clínica 454
ambiental 370
ambiental 371
clínica 451
M. gordonae
M. gordonae
type I
clínica 438
M. shottsii
M. marinum
M. pseudoshottsii
M. nebraskense
M. szulgai
M. montefiorense
M. triplex
M. parascrofulaceum
M. lacus
M. botniense
M. branderi
M. celatum
M. gastri
M. kansasii
clínica 440
ambiental 269
clínica 424
clínica 442
clínica 448
clínica 458
clínica 463
clínica 468
M. africanum
M. bovis
M. canetti
M. caprae
M. tuberculosis
clínica 447
clínica 467
M. haemophilum
M. lepraemurium
M. visibile
ambiental 318
M. heidelbergense
clínica 436
clínica 450
M. scrofulaceum
M. parmense
clínica 457
M. intermedium
M. kubicae
M. palustre
M. chimera
M. intracellulare
clínica 423
ambiental 308
ambiental 417
clínica 466
M. columbiae
M. paraffinicum
ambiental 255
ambiental 260
ambiental 262
ambiental 263
ambiental 264
ambiental 328b
ambiental 345
ambiental 358
ambiental 359
M. avium
M. avium paratuberculosis
subsp.
ambiental 259
ambiental 369
clínica 452
clínica 430
clínica 434
clínica 456
clínica 462
83
98
94
86
100
81
100
72
70
100
85
78
Crescimento
lento
RESULTADOS
84
6.2.6. Seqüenciamento e Identificação
A técnica de seqüenciamento permitiu a identificação das amostras e os
resultados foram concordantes com o método molecular PRA-hsp65, pois a
região do gene hsp65 utilizada para o seqüenciamento foi a mesma utilizada na
clivagem do PRA-hsp65. Não foram identificadas espécies novas nas amostras
analisadas.
Além da identificação, o seqüenciamento possibilitou análises de
interação entre amostras clínicas e do ambiente, sugerindo a ligação de
espécies ambientais com as infecções causadas em humanos.
DISCUSSÃO
85
7. DISCUSSÃO
As micobactérias não causadoras de tuberculose (MNT) encontram-se
dispersas na natureza e ao contrário das espécies do complexo Mycobacterium
tuberculosis e apresentam patogenicidade variável. A capacidade das MNT em
produzir doença está claramente documentada na literatura e sua importância
vem aumentando progressivamente, com isolamentos de diferentes espécies
nos laboratórios de micobactérias (FALKINHAM, 1996; TORTOLI, 2003; ATS,
2007; CHIMARA et al., 2008).
A identificação e o estudo da variabilidade genética são importantes para
o conhecimento das espécies, diagnóstico e delineamento do tratamento
correto. A biologia molecular tem proporcionado um grande avanço no
diagnóstico de MNT, já que os métodos bioquímicos são lentos, trabalhosos e
muitas vezes inconclusivos na diferenciação das espécies. Métodos
moleculares comerciais disponíveis no mercado permitem a identificação de
espécies de MNT nos laboratórios de microbiologia diminuindo o tempo da
espera pelo resultado, geralmente estes testes identificam as espécies
patogênicas mais conhecidas que causam infecção. Contudo, estes métodos
são importados e caros para a realidade dos países em desenvolvimento
(SUFFYS et al., 2001).
O diagnóstico de doença causada por MNT exige muita cautela, pois o
isolamento de espécimes clínicos (estéreis e não estéreis) do organismo pode
significar colonização transitória ou até contaminação da amostra. Por isso, a
correlação clínico-laboratorial é fundamental para o estabelecimento do
DISCUSSÃO
86
diagnóstico e para determinação da estratégia terapêutica (MINISTÉRIO DA
SAÚDE, 2005; ATS, 2007).
Devido a crescente importância das MNT na clínica surgiu a
necessidade de aprimorar a identificação e estudar a taxonomia deste gênero.
Muitos trabalhos têm sido realizados para melhorar o entendimento da
epidemiologia das infecções causadas por micobactérias e o conhecimento do
nicho ecológico das micobactérias ambientais. Nos últimos 10 anos surgiram
novos métodos não comerciais, como o PRA-hsp65 que tem sido utilizado para
identificar as espécies de MNT e, sem dúvida é o mais estudado (HÄFNER et
al., 2004). O método PRA-hsp65 foi padronizado pela primeira vez por Telenti
et al. (1993), desde então são utilizados os mesmos iniciadores que amplificam
uma região conservada de 441pb do gene hsp65, em todas as espécies do
gênero Mycobacterium (TELENTI et al., 1993).
Até o momento a American Thoracic Society não indicou um padrão-
ouro específico para identificação de MNT, sendo utilizados os métodos
moleculares combinados com as características da morfologia, crescimento e
pigmentação micobacteriana, e provas bioquímicas para complementar a
identificação (ATS, 2007).
Neste estudo foram analisadas 177 amostras clínicas e ambientais para
validar o método PRA-hsp65 como ferramenta de identificação e diagnóstico de
MNT. Este método molecular complementar de diagnóstico será implementado
na rotina no Laboratório de Micobactérias do Hospital Universitário Clementino
Fraga Filho–HUCFF/UFRJ. O PRA-hsp65 foi escolhido justamente pela eficácia
DISCUSSÃO
87
que têm demostrado em outros laboratórios de rotina do país e em diversos
estudos publicados pelo mundo.
No Brasil, Silva et al. (2001), utilizaram o método molecular PRA-hsp65
na identificação de amostras clínicas de MNT no Instituto Adolfo Lutz. Foram
analisadas 83 amostras da rotina do laboratório de micobactérias e o PRA-
hsp65 mostrou-se concordante em 91,5% com os métodos bioquímicos. Em
2002 o PRA-hsp65 foi utilizado para identificar MNT de amostras clínicas de
vários estados do Brasil, com o objetivo de avaliar o desempenho do método
nos diversos laboratórios do país. No estudo foram utilizadas mais de 50
espécies e comprovou-se que este método de identificação obteve melhores
resultados que os métodos tradicionais e os kits comerciais (ROCHA et al.,
2002).
No presente estudo foi considerado os resultados de identificação pelo
método molecular, as provas bioquímicas foram utilizadas como auxílio na
identificação da espécie. O método PRA-hsp65 identificou a espécie de 174
amostras clínicas e ambientais, mostrando um aproveitamento de 98%,
somente em 3 amostras o DNA extraído não foi amplificado, devido a inibidores
na reação e impossibilitando a identificação molecular. Contudo, o PRA-hsp65
foi mais específico que a identificação bioquímica, onde foi possível identificar a
espécie de 115 (65%) amostras.
Das 177 amostras ambos os testes (PRA-hsp65 e bioquímico) foram
realizados em 112 amostras. Nas demais 65 amostras, não foi possível chegar
a identificação nos dois testes, já que o PRA-hsp65 não amplificou 3 amostras
e as provas bioquímicas foram incoclusivas em 62 amostras.
DISCUSSÃO
88
Quando comparados os resultados de identificação das 112 amostras
pelo PRA-hsp65 e pela bioquímica observou-se 71,4% (80) de concordância
entre os métodos de identificação. Em 32 (29%) amostras clínicas houve
discordância na identificação das espécies, mas não houve discrepância em
relação ao tempo de crescimento. Resultados muito semelhantes com os
obtidos em recente trabalho realizado por Chimara et al. no Instituto Adolfo
Lutz, onde analisaram 434 amostras de MNT, neste estudo a concordância foi
de 74% entre os métodos bioquímicos e o PRA-hsp65 (CHIMARA et al., 2008).
Das 62 amostras inconclusivas no método bioquímico, 27 eram do
ambiente, ou seja, das 43 amostras ambientais o método bioquimico identificou
somente 12 (28%) amostras. Portanto, o método PRA-hsp65 mostrou-se mais
adequado para indetificação das espécies de MNT ambientais.
O PRA-hsp65 mostrou algumas limitações, em alguns casos houve
dificuldade na leitura do gel, já que a interpretação das bandas é subjetiva e
comparativa com o banco de padões. Em 2005, foi realizado um estudo
multicêntrico entre cinco países das Américas Central e do Sul (Argentina,
Brasil, Colombia, Chile e Caribe), este trabalho avaliou a acurácia do PRA-
hsp65 e os erros mais comuns de análise para identificação de MNT.
Observaram que na maioria dos laboratórios o método PRA-hsp65 identificou
em média em 75% a 83% das amostras clínicas e que os erros mais comuns
aconteciam na preparação do gel e na interpretação dos padrões de bandas
(LEÃO et al., 2005).
Dentre as 177 amostras analisadas e identificadas pelos dois testes
molecular e bioquímicos 65 foram identificadas como M. avium (37%) e 5
DISCUSSÃO
89
(2,8%) M. intracellulare, espécies que fazem parte do complexo M. avium-
intracellulare (MAC) e foi possível separá-las entre sí pelo método molecular. O
complexo M. avium-intracellulare tem grande incidência de infecções em seres
humanos, mas também é encontrada no meio ambiente, em bovinos, suínos e
na água. A identificação dos microrganismos pertencentes a este complexo
sempre foi complicada, e está ligada à história da descoberta das espécies e à
metodologia de identificação utilizada. Os critérios utilizados para diferenciação
são a morfologia das colônias, pigmentação e tempo de crescimento.
Historicamente, a identificação do M. avium e do M. intracellulare foi baseada
na virulência em aves, onde apenas o M. avium é virulento; esta divisão em
duas espécies diferentes foi confirmada posteriormente através de estudos de
similaridade de DNA total e através de utilização de sondas específicas
(BAESS et al., 1983). O complexo M. avium-intracelullare (MAC) contém
também o M. scrofulaceum (MAIS) e o M. avium possui subespécies. THOREL
et al. (1990), através de estudos genéticos de um grande número amostras
relacionadas ao MAC, sugeriram a divisão desta espécie em: M. avium subsp.
avium, M. avium subsp. paratuberculosis e M. avium subsp. silvaticum. A
taxonomia deste complexo continua complicada e o “International Working
Group on Mycobacterial Taxonomy” (IWGMT) tentou interligar a identificação
obtida com soro aglutinação, sondas genéticas e HPLC, devido à dificuldade de
classificação das subespécies pertencentes ao complexo (WAYNE et al.,
1993). O M. avium e o M. intracellulare não são identificados separadamente
nos laboratórios de análise clínica, normalmente identifica-se como MAC, uma
vez, que se considerava o M. avium clinicamente mais importante (INDERLIED,
DISCUSSÃO
90
KEMPER & BERMUDEZ, 1993). Mycobacterium avium subsp. avium é
frequentemente encontrado no meio ambiente e está associada a TB em ave,
embora tenha sido encontrado em outros animais. Contudo, foram descritas
infecções pulmonares em adultos e infecção disseminada em pessoas
imunodeprimidas. O M avium se tornou importante a partir do aparecimento da
AIDS, causando doença disseminada e linfadenites cervical em crianças e em
adultos (TURENE, WALLACE & BEHR, 2007).
O Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis é o agente da doença
de Johne’s em ruminantes, causando enterite crônica que infecta animais
domésticos e selvagens em todos os continentes, devido a isso é responsável
por grandes perdas na agropecuária. O M. avium subsp. paratuberculosis é
encontrado em solo, na superfície de plantas e na água. A análise por RFLP
sugeriu que a espécie isolada de pacientes com doença de Crohn’s é idêntica
ao M. paratuberculosis (RISTOW et al., 2007). Mycobacterium avium subsp.
silvaticum é obrigatoriamente patogênico para animais, tem sido isolado de
animais silvestres, de mamíferos (cervo), e aves (pombos selvagens) e causa
tuberculose em aves e paratuberculose em mamíferos (THOREL, BLOM-
POTAR & RASTOGI, 1990).
Entre os métodos de identificação, houve discordância em 1 amostra
identificada como M. avium 1 pelo PRA-hsp65 e como M. phlei pelas provas
bioquímicas. As duas espécies são de crescimento rápido, e neste caso o
resultado de identificação considerado foi M. avium 1, pois a amostra clínica
era escarro e o M. phlei é uma espécie ambiental, encontrada no solo e nas
DISCUSSÃO
91
plantas, raramente causando infecção em humanos (LEÃO et al., 2004;
SHIMIZU et al., 1986).
O M. fortuitum foi identificado em 45 amostras (25,4%), esta
micobactéria pode ser encontrada no solo e na água, além de estar associada
com doenças em humanos, incluindo peritonites em pacientes em diálise
constante, infecções em pacientes com câncer e infecção disseminada (DE
GROOTE & HUITT, 2006). É responsável por surtos, como o ocorrido no ano
2000 na Califórnia, onde 46 pessoas foram infectadas pela micobactéria pela
água utilizada em um salão de beleza (WINTHROP et al., 2002).
Em 13 amostras clínicas de escarro identificadas como M. fortuitum pelo
PRA-hsp65 houve discordância em relação às provas bioquímicas que
identificaram essas amostras como M. flavescens. Neste caso o resultado
considerado também foi o do PRA-hsp65, M. fortuitum. Ambas as espécies de
micobactérias são de crescimento rápido, mas o M. flavescens é encontrada no
ambiente, podendo eventualmente estar associada a infecções em humanos e
poucos casos foram realmente atribuídos ao M. flavescens (BOJALIL,
CERBON & TRUJILLO, 1962; LEÃO et al., 2004).
O M. fortuitum 1 foi identificado em uma amostra de escarro pelo PRA-
hsp65 e como M. kansasii pelo método bioquímico. Neste caso, as duas
espécies estão no ambiente, na água e no solo e também causam doença em
humanos. A principal discordância é que o M. kansasii é uma micobactéria de
crescimento lento, enquanto o crescimento do M. fortuitum é rápido. Por este
motivo foi considerado como resultado de agente causal de infecção o M.
DISCUSSÃO
92
kansasii, já que o crescimento é uma das principais características para
identificação.
A espécie M. gordonae foi identificada em 22 (12,4%). O M. gordonae
pode ser encontrado em ambiente aquoso, recebendo por isso a designação
alternativa de M. aquae ou de bacilo de água de torneira. Embora seja
freqüentemente encontrado como contaminante em amostras clínicas e é
considerado não patogênico, 23 casos de infecções causadas por M. gordonae
foram notificados em 1992 (WEINBERGER et al., 1992).
Entre as discordantes, 11 amostras de escarro foram identificadas como
M. gordonae pelo PRA-hsp65, mas pelo método bioquímico foram identificadas
4 amostras como M. xenopi, 3 amostras como M. scrofulaceum, 2 amostras
como M. kansasii e 2 amostras como M. szulgai, essas espécies são de
crescimento lento como o M. gordonae e são encontradas no ambiente,
principalmente na água podendo causar infecções em humanos
(NASCIMENTO & GONTIJO FILHO, 1991; PEREZ & CUERVO, 1999).
O M. kansasii foi identificado em 6 (3,4%) amostras. O M. kansasii foi
descrito pela primeira vez em 1953, como o causador da doença do bacilo
amarelo e foi um marco no reconhecimento do envolvimento de MNT em
infecções humanas. Em algumas áreas do mundo esta espécie é a principal
causadora de linfadenite cervical e doença pulmonar micobacteriana
(WOLINSKY, 1979; TORTOLI et al.,1996; SALLES et al., 2007). Embora o
reservatório natural de M. kansasii não seja conhecido, esta espécie é
encontrada quase que exclusivamente na água encanada, o que
provavelmente é a origem da infecção humana (WOLINSKY, 1979; WAYNE &
DISCUSSÃO
93
SRAMEK, 1992; WRIGHT & WALLACE, 1994; PICARDEAU et al., 1997;
ALCAIDE et al., 1997). Entre as amostras discordantes 1 amostra de escarro
foi identificada como M. kansasii 2 pelo PRA-hsp65 e pela biquímica foi
identificada como M. scrofulaceum, são espécies de crescimento lento e
podem ser encontradas na água, mas neste caso o resultado considerado foi
M. kansasii 2, pois esta espécie é encontrada na água potável e causa doença
pulmonar.
O M. scrofulaceum foi identificado em 5 amostras, este patógeno é uma
micobactéria oportunista que causa linfadenites cervical e infecção pulmonar,
mas também pode ser encontrado no ambiente sendo identificado no solo e na
água (SWANSON, PAN & MUSSER, 1996; RODRIGUEZ et al., 2004).
Foram identificadas 2 (1,1%) amostras extra-pulmonares de sítios
estéreis como M. abscsesus,. O M. abscessus é uma micobactéria ambiental
que é encontrada na água potável e no solo. Em humanos causa infecções de
pele e pulmão, há relatos de infecção adquirida por injeções intramusculares na
Colômbia envolvendo 297 pacientes e infecções pós-cirúrgicas após
lipoesculturas na Venezuela (VILLANUEVA et al., 1997). Além disso, o M.
abscessus foi identificado num surto de 5 pacientes nos Estados Unidos
submetidos a procedimentos cirúrgicos estéticos (NEWMAN, ALFONSO &
ASCHERMAN, 2005). No ano de 2006 foi descrito um surto de 40 casos de
infecção em pacientes submetidos à acupuntura na Coréia do Sul (SONG et
al., 2006).
O M. peregrinum foi identificado em 2 (1,1%) amostras uma de solo e
outra de escarro, esta espécie foi descrita pela primeira vez em 1992, está
DISCUSSÃO
94
associada com o M. fortuitum, ocorre no ambiente e desenvolve doença em
humanos, pode causar infecções disseminadas em adulto e crianças e
infecções em pacientes com AIDS (KUSUNOKI & EZAKI, 1992; BROWN-
ELLIOT & WALLACE, 2002). Em 1 amostra houve discordância entre PRA-
hsp65 e bioquímica, neste caso os métodos bioquímicos identificaram na
amostra de escarro o M. chelonae, que também é uma espécie de crescimento
rápido, encontrada na água potável, mas causa, principalmente doenças de
pele, por isso o resultado considerado foi M. peregrinum.
O M. chimera foi identificado em 5 (2,9%) amostras, esta espécie foi
descrita em 2004, está associada ao M. avium e causa doença pulmonar
(TORTOLI et al., 2004). E, 2 amostras foram identificadas como M. xenopi, que
é uma micobactéria encontrada na água e pode causar doença em humanos
(DAILLOUX et al., 2003).
Um pequeno número de amostras foi identificado como M. lentiflavum
(0,6%), M. gastri (0,6%), M. diernhoferi (0,6%), M. monacense (0,6%), M.
boenickei (0,6%), M. intermedium (0,6%) e M. bohemicum (0,6%). Entre essas
amostras, a bioquímica identificou o M. peregrinum 2, como M. chelonae, o M.
diernhoferi como M. fortuitum, e o M. monacense como M. flavescens que
também são micobactérias de crescimento rápido, são encontradas no
ambiente e causam doenças em humanos, nestes casos o resultado
considerado foi o obtido pelo método PRA-hsp65.
Essas micobactérias são consideradas patogênicas, causam doença
disseminada em crianças e adultos. O M. lentiflavum está relacionado ao M.
avium, e foi diferenciada desta espécie através da análise da seqüência do
DISCUSSÃO
95
RNAr 16S e do método PRA-hsp65 (SPRINGER et al. 1996). No ano de 2006
um grupo de pesquisadores detectou no Hospital Universitário Clementino
Fraga Filho – HUCFF/UFRJ do Rio de Janeiro uma infecção mista de M.
lentiflavum e M. avium em três amostras de sangue de um paciente de 27 anos
HIV-positivo. Para diferenciar as espécies foram utilizados os métodos
moleculares PRA-hsp65, análise da seqüência 16S-23S e um kit comercial
baseado em sondas de DNA (SUFFYS et al., 2006). Na Itália o M. lentiflavum
também foi identificado em amostras de sangue de uma paciente de 45 anos
como causador de uma infecção de linfadenite cervical e em uma paciente com
61 anos com infecção pulmonar (TORTOLI et al., 2002; PIERSIMONI et al.,
2004). O Mycobacterium gastri é encontrado no solo, mas foi isolado pela
primeira vez de uma lavagem gástrica e de escarro, ocasionalmente causa
infecções como peritonites e vesiculites (WAYNE, 1966; LEÃO et al., 2004).
Também foi relata como causadora de infecção peritoneal em uma paciente de
28 anos na Austrália e numa infecção de vesiculite seminal na Índia
(INDUDHARA et al., 1991). O M. monacense já foi isolado de diversos
espécimes clínicos em vários países, infecta pessoas em situação pós-
traumáticas devido as incisões cirúrgicas, está relacionada com o M. doricum,
espécie recém identificada causando infecção no fluído cerebroespinhal em um
paciente de 50 anos HIV positivo (TORTOLI et al., 2001; REISCHL et al.,
2006). Sobre o M. diernhoferi há poucos relatos na literatura, contudo sabe-se
que ela pode causar doença em humanos; e o M. bohemicum também causa
doença em humanos, principalmente linfadenite cervical em crianças
(TORTOLI et. al., 2000). O M. chimera é uma espécie associada ao complexo
DISCUSSÃO
96
M. avium, foi publicada como espécie nova em 2004 e causa doença em
humanos. O M. boenikei é uma espécie associada ao M. fortuitum, pode ser
encontrada na água e causa doença em humanos, já foram relatados casos de
infecções de pele, bacteremia e infecções pulmonares, além de infecções
disseminadas (TORTOLI et al., 2004; SCHINSKY et al., 2004).
As amostras citadas acima com resultados discordantes entre PRA-
hsp65 e bioquímica foram plaqueadas no meio Agar para isolamento das
colônias e estudo da possibilidade de infecção mista, com isso foi possível
isolar as espécies para realizar a identificação.
Um grupo de 9 amostras, inconclusivas nas provas bioquímicas, foi
identificado como pertencentes ao complexo MTB no PRA-hsp65, quando
seqüenciadas foi comprovado que estas amostras faziam parte do complexo,
agrupando com a espécie M. tuberculosis. Nestes casos houve um grave erro
de identificação pelos métodos bioquímicos e o método molecular elucidou as
espécies.
As micobatérias não causadoras de tuberculose, quando estão no
organismo humano podem ser reincidentes nas infecções em que estão
associadas, muitas vezes devido ao ambiente natural que fazem parte, por
exemplo, micobactérias que estão na água, podem ser causadoras de infecção
nos pacientes mais de uma vez. Isso dá origem aos surtos hospitalares e a
provável contaminação ocorre pelos biofilmes, que são importantes
mecanismos de adaptação dos microrganismos. Diagnosticar rapidamente os
casos de infecção e os surtos é fundamental, já que a erradicação não é fácil,
DISCUSSÃO
97
devido à resistência que estes microrganismos possuem contra os antibióticos
(PRIMM LUCERO & FALKINHAM, 2004).
Os biofilmes formados pelas micobactérias ainda são poucos estudados,
supõe-se que podem ser importantes origens de adaptação micobacteriana aos
diversos ambientes, principalmente nos ambientes urbanos, mais
especificamente em sistemas de água potável. O papel dos biofilmes é
proteger o ambiente micobacteriano contra fatores agressivos do meio e, em
alguns casos promover o crescimento da micobactéria (SCHUZLE-ROBBECKE
& FISCHEDER, 1989; SCHUZLE-ROBBECKE & BUCHHOTZ, 1992;
IIVANAINEN et al., 1999; FALKINHAN, 2002). Biofilmes formados em
ambientes naturais ainda não foram documentados (MARSOLLIER et al.,
2003). As micobactérias têm se mostrado capazes de formar biofilmes em
diversas superfícies orgânicas, como exemplo os plásticos, PVC, silicone,
celulose e borracha e superfícies inorgânicas como o cobre e o vidro. A
presença de micobactérias ambientais em biofilmes pode causar impactos na
saúde humana, pois são responsáveis por problemas de contaminação e
doenças (SCHUZLE-ROBBECKE & BUCHHOLTZ, 1992; FALKINHAN, 2002).
Por estas razões é muito importante a pesquisa e o entendimento sobre
as relações e os agrupamentos que as espécies micobacterianas mantêm
entre si. A variabilidade genética do gênero Mycobacterium é significativa e até
o momento foram descritas oficialmente 130 espécies, além disso, muitas
espécies que eram consideradas ambientais e não patogências estão se
adaptando ao ambiente artificial humano e colozinado as pessoas podendo
causar infecção.
DISCUSSÃO
98
Atualmente, do ponto de vista filogenético, o gênero Mycobacterium é
um dos mais, extensivamente, investigados. Os estudos sobre a variabilidade
genética e a relação entre ambiente e ser humano são necessários para o
conhecimento das espécies que podem ser possíveis agentes infecciosos (KIM
et al., 1999; MCNABB et al., 2004; ADÉKAMBI & DRANCOURT, 2004).
Análises filogenéticas do gênero Mycobacterium são recentes, por muitos anos
não foi importante estudar o gênero como um todo, já que os principais agentes
causadores de infecção eram o M. tuberculosis, o M. leprae e o M. avium, os
últimos somente em pacientes imunodeprimidos e com AIDS. As outras
espécies causavam doenças isoladas, mas nos 10 últimos anos a situação vem
mudando, as micobactérias se adaptaram e mais doenças causadas por MNT
vem sendo descritas, além dos surtos, que nos últimos 5 anos só no Brasil, já
ocorreram em mais de 5 estados (TELENTI et al., 1993; DOMENECH et al.,
1997; LEÃO et al., 2004).
Por isso, o estudo com 52 amostras do estado do Rio de Janeiro (Brasil)
foi um importante passo na análise de micobactérias do ambiente e clínica.
Foram gerados 73 sítios variáveis entre as amostras clínicas e 85 entre as
ambientais, no total foram 91 mutações nas amostras clinicas e 106 entre as
amostras ambientais, o que era esperado, já que no ambiente a variabilidade
genética é maior do que nas micobactérias de amostras clínicas, onde se
identificam geralmente as mesmas espécies. Observou-se que em comparação
com as espécies de referência não houve uma variabilidade significativa, pois
as amostras clínicas e ambientais se agruparam intimamente.
DISCUSSÃO
99
O gene hsp65 foi escolhido para análise filogenética, por ser uma
seqüência pequena e capaz de diferenciar a grande maioria das espécies do
gênero Mycobacterium. Em 1999, Rinquet et al. utilizou o seqüenciamento
deste gene para identificar micobactérias de crescimento rápido, foram
utilizadas 60 amostras clínicas comparadas com espécies de referência
depositada no GenBank. Neste estudo os autores apontaram as diferenças
nucleotídicas entre cada espécie, realizaram análise filogenética mostrando a
correlação entre as principais espécies e, principalmente, comprovaram que os
seqüenciamento do gene hps65 mostrou-se tão eficaz e discriminatório quanto
os outros genes que são utilizados para análises filogenéticas das
micobactérias, como o 16S, rpoB e seqüências ITS (RINQUET et al., 1999).
O gene rpoB e a região ITS 16S-23S (“transcribed spacer sequences”)
também são utilizados para análises filogenéticas de micobactérias. A região
ITS compreende uma seqüência de aproximadamente 480 pb, região de
tamanho similar ao gene hsp65, mas consiste numa região pouco
discriminatória entre as espécies apesar de ser uma seqüência conservada e
possível de identificar um número razoável de espécies (ROTH et al., 1998).
No estudo realizado por Häfner e colaboradores (2004) foi comparado o
método PRA-hsp65 com seqüenciamento do 16S, e concluíram que o PRA-
hsp65 é muito mais eficaz para identificar espécies, logo o gene hsp65 é tão
discriminatório quanto o 16S (BRISBANE & LADD, 1972; HÄFNER et al.,
2004).
O gene rpoB, muito utilizado nos estudos de resistência a rifampicina em
M. tuberculosis, também é estudado quanto a variabilidade genética de
DISCUSSÃO
100
micobactérias. Atualmente, está sendo utilizado como mais uma alternativa de
identificação e análises filogenéticas de MNT, por ser um gene altamente
conservado em todas as bactérias e bem conhecido. Häfner e colaboradores
(2004); realizaram um estudo onde foram seqüenciadas 44 espécies de
micobactérias. Utilizaram uma seqüência de 342pb da região hipervaríavel do
gene rpoB e obtiveram resultados satisfatórios e discriminatórios entre as
espécies, mostrando que este gene também pode ser utilizado para realizar
análises filogenéticas importantes. Contudo, estudos mais recentes, mostraram
que o ideal para discriminar um maior número de espécies é utilizar acima de
700pb de gene rpoB (KIM et al., 1999; ADÉKAMBI & DRANCOURT, 2004).
Adékambi e Drancourt (2004) realizaram uma cuidadosa análise dos
tipos de árvores filogenéticas entre os genes 16S rRNA, hsp65, sodA, recA e
rpoB, neste trabalho os autores utilizaram 19 espécies de crescimento rápido.
As espécies foram seqüenciadas e analisadas pelos 5 genes e os resultados
observados demostraram que as árvores filogenéticas foram praticamente
iguais, ou seja, independente do gene analisado as espécies ficaram
distribuídas da mesma maneira quando avaliada a variabilidade genética. Este
estudo foi importante para validar análises filogenéticas de micobactérias, pois
até então não existiam parâmetros de comparação de análises. (ADÉKAMBI &
DRANCOURT, 2004).
Contudo, o seqüenciamento é um método caro e requer experiência na
interpretação dos resultados, leitura das seqüências, não se mostrando
funcional para o diagnóstico. É uma técnica muito refinada que necessita de
um DNA purificado, além de uma pessoa experiente em análise genômica para
DISCUSSÃO
101
a interpretação dos eletroferogramas. Sugere-se utilizá-lo no diagnóstico
somente em casos extremos e esporádicos de dúvidas na identificação das
espécies e para pacientes muito graves, quando o método molecular PRA-
hsp65 e a bioquímica não são capazes de identificar a espécie.
Este estudo mostrou um resultado satisfatório da análise filogenética
com o seqüenciamento do gene hsp65. O gene possui uma região pequena, de
fácil análise e variabilidade nucleotídica, separou as espécies de micobactérias,
principalmente quando comparados com dados da literatura de
seqüenciamento dos outros genes. Esta foi uma das primeiras tentativas de
análise filogenética utilizando micobactérias coletadas do ambiente e de
amostras clínicas realizadas no Brasil. O número de amostras coletadas do
ambiente deve ser aumentado e melhores critérios de coleta devem ser
estabelecidos, as amostras clínicas não possuem variação significativa entre as
espécies identificadas o que é normal, pois apesar da descrição na literatura de
diferentes infecções causadas por diversas espécies de MNT, cada região tem
seu perfil de infecção. Contudo, o surgimento dos surtos hospitalares está
trazendo diferentes perfis de espécies causadoras de infecção, podendo mudar
o quadro de infecção nos próximos anos.
O estudo contribuiu para avaliação do método molecular PRA-hsp65
como ferramenta de diagnóstico na identificação de micobactérias não
causadoras de tuberculose. Mostrou a deficiência das provas bioquímicas
como método diagnóstico, pois foram pouco sensíveis e muito discordantes. E
através das análises filogenéticas foi possível observar a variabilidade genética
que separa as espécies do gênero. A vantagem do método molecular PRA-
DISCUSSÃO
102
hsp65 é a rapidez e fácil execução, com este método foi possível realizar a
identificação em 48 horas ao contrário das provas bioquímicas, que levaram de
60 a 120 dias, devido ao trabalho para montar o conjunto de provas, incluindo
meios de cultura e reagentes e principalmente pelo tipo de crescimento das
amostras, que têm que estar num estado exponencial ótimo de crescimento
(grande quantidade de massa bacteriana) para realização das provas
bioquímicas.
Os estudos sobre micobactérias não causadoras de tuberculose são
muito importantes no momento atual, por uma série de motivos: a falta de
entedimento na identificação das espécies, a liberação de resultados errados
devido a falta de conhecimento do procedimento da cultura e identificação das
espécies, para esclarecimentos dos médicos que muitas vezes não conhecem
os microrganismos e não sabem como proceder e pela ocorrência dos surtos
hospitalares e nas clínicas de estética. Muitos laboratórios liberam resultados
positivos com identificação de espécies de MNT que não são o agente causal
da infecção no paciente, pois apesar da cultura ter sido positiva não teve um
crescimento significativo, então são tratados com antibióticos desnecessários
para o paciente.
A identificação da espécie de MNT causadora de doença é importante
para o tratamento da infecção, pois as espécies são tratadas com diferentes
combinações de antibióticos, de acordo com o local e o agente causador da
infecção, logo a especificidade de um método diagnóstico é fundamental.
Por estas razões este estudo contribuiu para o melhor entendimento das
micobactérias não causadoras de tuberculose. É interessante estudar as
DISCUSSÃO
103
adaptações das micobactérias e suas interações com o ambiente, a formação
de biofilmes que podem estar relacionados com os surtos hospitalares, mas
para isso é preciso conhecer o comportamento destes microrganismos.
CONCLUSÕES FINAIS
104
8. CONSIDERAÇÕES FINAIS
Os resultados obtidos no estudo demonstram que o método molecular
PRA-hsp65 é eficiente na identificação molecular de micobactérias não
causadoras de tuberculose como diagnóstico de rotina. Este método mostrou-
se discriminatório, eficiente e preciso na identificação das espécies. Entretanto,
as características fenotípicas das micobactérias precisam ser consideradas
para identificação, pois observações como o tipo de crescimento (rápido e
lento) e pigmentação foram importantes para chegar ao resultado.
As provas biquímicas mostraram-se inespecíficas, ocasionando muitas
falhas e resultados inconclusivos, além do dispendioso tempo de execução
para cada bateria. Contudo, o método PRA-hsp65 possui a limitação da
extração e amplificação do DNA micobacteriano, pois nas amostras em que
não foi possível a amplificação, não houve resultado, sendo necessário recorrer
aos métodos bioquímicos. Estes resultados sugerem a execussão de ambos os
métodos na identificação das micobactérias, mas utilizando as provas
bioquímicas como complemento em casos duvidosos ou quando o DNA não
seja amplificado pelo método molecular (casos raros).
Através do seqüenciamento do gene hsp65 foi possível realizar a
identificação das espécies. As análises filogenéticas foram discriminatórias na
separação das espécies e a escolha do gene hsp65 para as análises foi
satisfatória pelo tamanho e variabilidade das seqüências. As análises
filogenéticas foram importantes para o estudo das relações de amostras
CONCLUSÕES FINAIS
105
ambientais e clínicas, na medida em que elas agruparam-se entre si, sugerindo
a influência do ambiente nas infecções causadas por micobactérias no homem.
Contudo, houve problemas de operacionalidade, leitura e Interpretação
dos perfis do gel no método do PRA-hsp65, o que restringe seu uso aos
laboratórios melhores equipados e com pessoal especializado, não sendo
adequado seu emprego na demanda pública.
LIMITAÇÕES DO ESTUDO
106
9. LIMITAÇÕES DO ESTUDO
Isolamento das micobactérias – O crescimento das MNT isoladas da
natureza ou de espécimes clínicos em meio Löwestein-Jensen (LJ), por serem
paucibacilares, dificultou a realização das provas bioquímicas, dos repiques e
até mesmo da metodologia molecular. Grande parte das amostras foi perdida
nos repiques durante a realização das metodologias de identificação. Por isso,
o número amostral do estudo ficou reduzido, visto que o banco compreendia
357 amostras de isolados de MNT. Este foi o principal fator limitante para o
êxito dos resultados do estudo.
Separação das colônias – As colônias mistas também limitaram a
identificação das espécies, tanto em relação às provas bioquímicas como
através do método molecular PRA-hsp65. Nem sempre foi possível separar as
colônias através do método de plaqueamento ocasionando a perda das
amostras.
PRA-hsp65 – A leitura dos resultados da metodologia molecular mostrou-
se subjetiva, mesmo com o auxílio do programa PRA ONLINE. A
determinação do padrão de bandas das amostras foi realizada através da
análise das fotos dos géis de agarose. Por isso, se faz necessário o
treinamento da leitura e interpretação dos resultados obtidos na clivagem pelo
técnico responsável do diagnóstico.
PERSPECTIVAS
107
10. PERSPECTIVAS
Será interessante a realização de estudos adicionais de coleta e
identificação de amostras ambientais nos diferentes estados do Brasil, para
melhor conhecimento das espécies que fazem parte do nosso meio. Estudos
de isolamento de micobactérias em água potável, em tubulação urbana, em
soluções de esterilização como o gluteraldeído entre outros, também são
importantes, já que ocorreu anteriormente uma explosão de surtos no Brasil
relacionados à contaminação de instrumentos cirúrgicos por micobactérias.
Em paralelo seria importante colocar o método PRA-hsp65 na rotina do
laboratório do Hospital Universitário – HUCFF, já que são identificadas MNT e
os resultados são fundamentais para o tratamento eficaz e menos demorado.
Este método é simples e rápido, além de possibilitar a descentralização de
identificação dos centros de referência, pois muitas vezes devido a demanda
de amostras, o resultado pode levar até 5 meses. Metodologias moleculares in
house possibilitam o diagnóstico mais rápido e menos oneroso, com vantagens
para o paciente e para o Sistema de Saúde Pública do país.
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11. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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ANEXOS
121
12. ANEXOS
ANEXOS
122
ANEXOS
123
Identification of atypical Mycobacterium species isolated from clinical sterile
sites sources in patients from University Hospital in Rio de Janeiro, Brazil
Simone G. Senna
1
, Anna Grazia Marsico
2
, Gisele B. O. Vieira
2
, Luciana Fonseca
Sobral
2
, Rafael S. Duarte
1
, Philip Noel Suffys
3
, Leila de Souza Fonseca
1*
.
1. Universidade Federal do Rio de Janeiro – Centro de Ciências da Saúde –
Instituto de Microbiologia Professor Paulo de Góes – IMPPG/CCS/UFRJ.
2. Universidade Federal do Rio de Janeiro – Hospital Universitário Clementino
Fraga Filho – HUCFF/UFRJ.
3. Fundação Oswaldo Cruz – Instituto Oswaldo Cruz – Laboratório de Biologia
Molecular Aplicada a Micobactérias – FIOCRUZ/IOC
* Corresponding authors.
Tel.: 55-21-2562.6746.
E-mail: lsfonseca@micro.ufrj.br and simonesenna@hotmail.com
Financial support: CNPq and FAPERJ
ANEXOS
124
ABSTRACT
A selection of biochemical tests for species identification of
Mycobacterium were used in combination with restriction fragment length
polymorphism analysis of a 441 bp PCR fragment of hsp65 (PRA) on isolates
present in 50 L-J cultures. The isolates were mainly obtained from sterile clinical
samples of mainly HIV-positive patients that had been attended with suspicion of
mycobacteriosis in University Hospital between 2001 and 2006. The majority of
these isolates (n = 43; 86%) were identified as M. avium, while 6 isolates,
including two isolates each, were identified as M. kansasii, as M. abscessus and as
M. monacense. M. fortuitum was simultaneously isolated with M. avium from one
patient. The overall concordance between the two methods was very high, 98%.
We conclude that identification by PRA, combined with evaluation of a small
number of phenotypic characteristics, is adequate for routine identification of
mycobacteria in clinical laboratories.
Key words: Non - tuberculous mycobacteria, molecular biology and PRA.
ANEXOS
125
INTRODUCTION
Tuberculosis (TB) is the most prevalent human mycobacteriosis, but
during the last decades, the contribution of non-tuberculous mycobacteria (NTM)
to disease has increased, partly due to opportunistic infections related to
immunosuppression. Because different Mycobacterium species differ in their drug
susceptibility pattern, identification to the species level is crucial for application
of adequate drug therapy schemes (Silva et al. 2001). Traditionally, diagnosis of
mycobacteriosis is confirmed by culture and identification to the species level, by
using a set of physiological and biochemical tests (Kent & Kubica 1985).
Identification of mycobacteria by PCR restriction digest analysis (PRA) of part of
hsp65 gene has been considered an accurate tool for species-specific identification
(Telenti et al. 1993). PCR products of these genotyping procedures generated
species-specific DNA patterns and electrophoretic analysis of part of the hsp65
gene by PRA has been used for diagnosis (Devallois et al. 1997). In this study, we
present the identification of atypical mycobacterial isolates from clinical sterile
sites of in patients of the University Hospital of Rio de Janeiro city between 2001
and 2006, by using PRA method and phenotypic tests.
MATERIALS AND METHODS
Patients and sample collection. Retrospective analysis of clinical records
of inpatients of the University Hospital Clementino Fraga Filho, Rio de Janeiro,
Brazil, who had atypical mycobacteria identified in the period 2001 to 2006 was
carried out and forty nine mycobacteria isolates from different biological
specimens, being at least one from sterile site previously recovered from 14
ANEXOS
126
patients were selected. The patients are in treatment for HIV, except patients 6,
and 14 (each not determined).
Identification of Mycobacterial isolates. The phenotypic identification
such as standard biochemical tests, comprise pigment product, growth rate and
colony characteristics. Isolates were cultured on solid medium Lowenstein-Jensen
and were submitted to biochemical testing including arylsufatase, catalase, tween
hydrolysis, tellurite reduction, niacin production, urease and nitrate reduction
(Kent & Kubica 1985).
DNA extraction. Nucleic acid extraction was performed by suspending a
loopful of bacterial mass from the L-J cultures in 50 µl of ultra pure water and
vortexing. The suspensions was boiled for 10 min and stored at -20ºC.
Polymerase chain reaction. After thawing the samples at room
temperature and a brief centrifugation, 10 µl of the supernatant was added to the
50ul PCR mixture containing 50 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH8.3), 1.5 mM
MgCl
2
, 50% glycerol, 200 uM deoxynucleotide triphosphate, 20 pmol of the
primers Tb11 (5’ACCAACGATGGTGTGTCCAT) and Tb12
(5’CTTGTCGAACCGCATACCCT) (Telenti et al. 1993) and 1.5 U of Taq
polymerase (Invitrogen, Brazil). Amplification consisted by incubation at 94ºC for
1 min, followed by 45 cycles of 94ºC for 1 min, 60ºC for 1 min and 72ºC for
1min, and ended with 72ºC for 7 min. Amplification products were verified on 1%
agarose gels and ethidium bromide staining.
Digestion with restriction enzymes and fragment analysis. When PCR
product were of good quality and sufficient yield, two 15 µl fractions of the
amplicon were submitted to digestion with the restriction enzymes BstEII and
ANEXOS
127
HaeIII, by incubating for two hours at respectively 60ºC and at 37ºC, according to
the manufacturer’s instructions (Promega, USA, 2005). Digestion products were
visualized by electrophoresis at 5V/cm in 3% ultra pure agarose (Bioamerica,
USA) gels in TBE (Tris 89mM, boric acid 89 mM, EDTA 2 mM, pH 8.0)
containing ethidium bromide were visualized on UV transluminator and
photographed. Fragment sizes were determined by comparison with molecular
weight markers of 50 and 25-bp ladders, applied at the two extremes and in the
centre of the gel.
RESULTS
The 49 isolates from 14 patients were examined by biochemical testing
(Table) and PRA analysis according Figure. The isolates were submitted to a
complementary speciation by conventional biochemical test and the majority
showed the classic Mycobacterium avium complex (MAC) biochemical pattern.
PRA and biochemical identification showed concordant, however one isolate were
discordant between PRA and phenotypic identification. The isolates from patient
1 (cerebrospinal fluid) was identified as M. flavescens by biochemical test while
PRA pattern determined M. monacense. M. monacense is a novel species within
the genus Mycobacterium. It is pigmented and grows in less than a week on solid
medium, different from M. flavescens by using phenotypic methods it is easy to
differentiate by PRA method, because the PRA band patterns of M. flavescens and
M. monacense are respectively, BstEII 440/0/0, HaeIII 150/85/55/0 and BstEII
235/130/85, HaeIII 140/55/50/0. The patient 6 was colonized by two species, M.
avium (blod, sputum and lymph node specimens) and M. fortuitum (ascitic fluid
ANEXOS
128
specimen), respectively HaeIII130/105 and BstEII 235/210, HaeIII 235/120/85
and BstEII145/120/60. The overall concordance between the two methods was
95.9% (47/49 isolates). Mycobacterium avium was isolated from blood, liquor,
lymph nodes and biopsy specimens.
DISCUSSION
In immunocompromised individuals infections due to NTM have been
observed to be an important cause of morbidity and mortality (Falkinham 1996).
In the present study, non-tuberculous mycobacteria isolated from sterile sources in
the 2001-2006 period from inpatients were identified by phenotypic and
molecular techniques. Most of these patients were HIV positive submitted to
treatment, except patient 6 and 14. The PRA method was selected in this
investigation due to its ease and rapidity and because it traditionally helps the
phenotypic identification of numerous species of mycobacteria within a single
experiment. This broader spectrum of the PRA method, as compared to other
molecular methods, is based on the amplification of a conserved hsp65 gene
present in all mycobacteria and in some other bacteria such as Nocardia spp.
Mycobacteria are ubiquitous in nature and can be found in soil, dust,
rocks, bioaerosols, and water (De Groote 2006). These organisms have been
increasingly identified at environments with harsh conditions (i.e., low nutrients,
low pH, and temperature extremes). Biofilm formation is a successful survival
strategy for these very hydrophobic organisms. In this study two isolated from
cardiac valves were identified in patient 11 as M. abscessus, probably due to
contamination during the cardiac surgery. Reported disease outbreaks caused by
ANEXOS
129
rapidly growing mycobacteria have included surgical wound infections (Wallace
et al. 1998, Wallace et al. 1989, Freitas et al. 2003, Vijayaraghavan et al. 2006)
and postinjection abscesses (Galil et al. 1999, Villaneuva et al. 1997). Catheter
infections also have been associated with the rapid growing mycobacteria
(Wallace et al. 1983). Pseudo-outbreaks of disease, defined as clusters of false
infections or artifactual clustering of real infections, have been associated with
contaminated bronchoscopes and automated endoscopic cleaning machines with
tap water as the source of the organism (Fraser et al. 1992, Fraser et al. 1996). The
patient 14, HIV positive develop a M. kansasii disseminate infection. This
pathogen has been frequently isolated from tap water, showers or distribution
networks, and can be acquired from the environment rather than human-to-human
transmission (Collins et al. 1984, Falkinham 1996). M. kansasii commonly causes
pulmonary infection, similar to pulmonary tuberculosis, with highest incidence on
patients suffering of chronic obstructive pulmonary disease; however, these
mycobacteria can infect also blood leading to patient the death (Martinez-
Moragon et al. 2001, Koh et al. 2002).
The identification of the strains from patient 1 it was not precise. Both
isolates from cerebrospinal fluid were identified as M. flavescens by biochemical
tests and as M. monacense by PRA method. M. monacense is a recently described
species, it is yellow-pigmented, non-photochromogenic and grows in less than a
week on solid medium. Based on phenotypic investigations alone, distinction of
this species from known scotochromogenic rapidly growing strains is problematic.
However, it differs from any other mycobacterium in each of the molecular
species markers investigated. One strain of M. monacense was reported be
ANEXOS
130
responsible for a severe, post-traumatic wound infection in a healthy boy (Reischl
et al. 2006).
The patient 6 was infected by M. avium and M. fortuitum, these species
had been isolated of different clinical samples. The M. fortuitum is a mycobacteria
of fast growth that can be found in the water and cause pulmonary infections and
abscesses. Already the Mycobacterium avium complex (MAC) behave as
opportunistic pathogens and can be isolated from environmental, animal, and
human sources. M. avium particularly causes disseminated bacterial infections in
patients with AIDS (Gadelha et al. 2002). The mixing infection common, however
in patient with AIDS can develop illness due the infection for mycobacteria. The
M. fortuitum can have entered in contact with the patient through water.
We obtained 29 M. avium isolates infecting the majority of patients, all
HIV positive. Before the acquired immunodeficiency syndrome (AIDS)
pandemic, the Mycobacterium avium complex (MAC) was responsible in most
cases for the pneumopathies in patients with basic chronic pulmonary diseases
such as emphysema and chronic bronchitis. In 1981, with the advent of AIDS,
MAC started to represent one of the most frequent bacterial diseases among AIDS
patients, with the disseminated form of the disease being the major clinical
manifestation of the infection. In 1997, Gadelha and collaborators (2002)
evaluated the incidence of mycobacterial disease and the colonization of the
respiratory and gastrointestinal and respiratory tracts by M. avium complex in
AIDS patients, in Rio de Janeiro, in this case blood cultures were negative, but the
patients were under treatment with highly active antiretroviral therapy (HAART).
In São Paulo, Silva and collaborators isolated 103 strains from blood, lymph node
ANEXOS
131
and biopsy and identify 24 isolates by PRA method as M. avium (Silva et al.
2001). Ferreira and collaborators determined the prevalence of NTM isolates in
University Hospital, Reference for AIDS in Rio de Janeiro during one year. They
obtained 83 specimens from 35 patients before HAART era and used biochemical
tests to determined species and IS1245 amplification to identification M. avium. In
this study M. avium seemed to be predominant in blood site sterile isolates from
hospitalized patients (Ferreira et al. 2002). The present paper described NTM
isolates from sterile sites in the HAART era, at the same University Hospital, as
studied by Ferreira and collaborators (2002), during 6 years and found 14 patients
and 49 isolates, a media of 2.3 patients/year, what point out the impact of HAART
on the NTM infections. In the present study all strains identified as MAC by
phenotypic characteristics showed a PRA band pattern of M. avium tipo I. Silva
and collaborators (2001) compared PRA and phenotypical identification in a
routine setting, among the 24 M. avium isolates, only six belonging to PRASITE
type I. In our work PRA was compared to biochemical identification and the
results showed that PRA method is also a valid alternative to substitute
conventional non-molecular identification methods. Time needed to complete
PRA was less than one week, thus reducing time for final diagnosis. Differences
between measuring sizes of restriction fragments and published patterns have
been reported, and can be related to differences in running conditions, type of
agarose used, or computer programs (Devallois et al. 1997, Rocha et al. 1999).
Additionaly, identification of these species by PRA was performed by simple
visualization on agarose gels. This confirms the usefulness of this technique, even
if computer facilities are not available. In our experience, taking together
ANEXOS
132
phenotypic characteristics and PRA pattern should pass over the problem of PRA
identification. For instance, M. gordonae type 5 and M. avium type I have very
similar PRA patterns, BstEII 235/210/0, HaeIII 130/115/0/0 and BstEII 235/210/0,
HaeIII 130/105/0/00, respectively, however M. gordonae is yellow-pigmented
and M. avium is non-pigmented.
In a routine setting, quick identification of M. tuberculosis complex, M.
avium, M. kansasii, M. fortuitum and M. abscessus is important, due to the
different treatment of diseases caused by each of these species. In conclusion, the
present study demonstrated that PRA is a fast, cheap and accurate method for
identification of pathogenic and potentially pathogenic mycobacteria. For final
identification, the PRA should be performed together with few phenotypic
characteristics such as pigment production and growth rate for best speciation of
non tuberculous mycobacteria.
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ANEXOS
136
Figure. hsp65 PRA patterns obtained using BstEII and HaeIII. Different genetic
patterns. Samples 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8: M. avium type I and sample 4: M.
intracellulare.
ANEXOS
137
Table. Patients characteristics and identification of non-tuberculous mycobacteria isolated from sterile sites at University Hospital in Rio de
Janeiro, Brazil, 2001-2006.
Identification
Patient Age (years) HIV status
Nº of
strains
Clinical specimens
Biochemical PRA
1
26 + 2 cerebrospinal fluid Mycobacterium. flavescens M. monacense
2
30 + 3 blood Mycobacterium avium complex M. avium I
3
32 + 2 induced sputum Mycobacterium avium complex M. avium I
2 pleural fluid Mycobacterium avium complex M. avium I
4
33 + 1 lymph node Mycobacterium avium complex M. avium I
1 bronchio alveolar lavage
Mycobacterium avium complex M. avium I
5
25 + 1 pleural biopsy Mycobacterium avium complex M. avium I
2 blood Mycobacterium avium complex M. avium I
6
15 + 2 sputum Mycobacterium avium complex M. avium I
1 lymph node Mycobacterium avium complex M. avium I
1 ascitic fluid Mycobacterium fortuitum M. fortuitum I
1 blood Mycobacterium avium complex M. avium I
7
41 + 1 sputum Mycobacterium avium complex M. avium I
1 lymph node Mycobacterium avium complex M. avium I
ANEXOS
138
Table continuation
Identification
Patient Age (years) HIV status
Nº of
strains
Clinical specimens
Biochemical PRA
8
39 NF 4 lymph node Mycobacterium avium complex M. avium I
9 33 + 1 blood Mycobacterium avium complex M. avium I
2 sputum Mycobacterium avium complex M. avium I
5 blood Mycobacterium avium complex M. avium I
10
26 + 1 lymph node Mycobacterium avium complex M. avium I
4 induced sputum Mycobacterium avium complex M. avium I
11
50 _ 2 cardiac valves M. chelonae/abscessus complex M. abscessus I
12
52 + 1 bone marrow Mycobacterium avium complex M. avium I
13
33 + 2 blood Mycobacterium avium complex M. avium I
4 induced sputum Mycobacterium avium complex M. avium I
14
35 + 2 blood Mycobacterium kansasii M. kansasii I
ANEXOS
139
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ANEXOS
140
Sequencing of hsp65 gene for identification of Mycobacterium species isolated from
environmental and clinical sources in Rio de Janeiro, Brazil
Simone G. Senna
1*
, Jaqueline Battilana
2
, Juliana C. Costa
2
, Marlei G. Silva
1
, Rafael S.
Duarte
1
, Leila S. Fonseca
1
, Philip N.Suffys
3
and Mauricio R. Bogo
2*
.
1. Universidade Federal do Rio de Janeiro – Centro de Ciências da Saúde – Instituto de
Microbiologia Professor Paulo de Góes – IMPPG/CCS/UFRJ.
2. Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul – Faculdade de Biociências –
Laboratório de Biologia Genômica e Molecular – PUCRS.
3. Fundação Oswaldo Cruz – Instituto Oswaldo Cruz – Laboratório de Biologia Molecular
Aplicada a Micobactérias – FIOCRUZ/IOC
*Corresponding authors:
E-mails address: mbogo@pucrs.br and simon[email protected]
ANEXOS
141
ABSTRACT
This study evaluated the biodiversity of 28 clinical and 24 environmental Mycobacterium
isolates from Rio de Janeiro, Brazil using hsp65 sequences, aiming to contribute to the better
understanding of its genetic diversity and the usefulness of this marker. Were determined and
compared to 118 reference strains sequences retrieved from GenBank. The nucleotide
diversity (Pi) was similar between clinical (0.06508) and environmental (0.06221) isolates.
ANEXOS
142
Nontuberculous mycobacteria (NTM) are ubiquitous environmental microorganisms
that can be found in a variety of ecosystems (2).The genus Mycobacterium comprises a wide
range of organisms, including obligate parasites which cause serious human and animal
diseases, opportunistic pathogens and saprophytic species (1). Human activities are likely
influencing the distribution and prevalence of mycobacteria. Mycobacteria are capable to
induce biofilm formation, what help them to persist in a flowing system in spite of their slow
growing. Biofilms may be important sources of NTM and may be responsible for pseudo-
infections, pseudo-outbreaks as well as diseases and disease outbreaks. A rapid detection of
pseudo-infections and diseases due to NTM is important and requires the use of molecular
techniques. Telenti, et al. (15) developed a rapid method based on the evaluation of gene
encoding for the 65-kDa heat shock protein by polymerase chain reaction. The 65-kDa protein
contains epitopes that are common to various species of mycobacteria (13). Therefore, we
assessed the viability of using hsp65 sequencing to identify mycobacteria and analyze the
genetic variability. In this study we report a phylogenetically analysis from the clinical
mycobacteriology laboratory and environmental isolates.
The clinical isolates used in this study were provided by Laboratory of Mycobacteria
from the Universidade Federal do Rio de Janeiro and were isolated from different places.
Fifty two isolates were investigated to determine the species (28 clinical isolates and 24
environmental isolates) (Table 1). Isolates were cultured on solid medium Lowenstein-Jensen
and the conventional identification procedures were done according by Kent and Kubicae (4).
The DNA samples were extracted according to CTAB protocol from Van Embeden (17), and
PCR assays were prepared containing 2ul of genomic extracted and hsp65-specific primers
tb11 and tb12 according Telenti et al.(15). The samples were purifed by MicroSpin Colums S-
ANEXOS
143
400 (Amersham Biosciences) and QIAquick PCR purification Kit (Qiagen). Sequencing was
performed with the DYEnamic ET Dye Terminator Kit (MegaBACE, Amersham
Biosciences) as recommended, and read in a MegaBace1000 (Amersham Biosciences)
automated system. All chromatograms were checked using the CHROMAS 1.45 program and
the sequences were aligned using Clustal_X 1.83 (16) with manual adjustments using
BIOEDIT 7.0.5.3. The substitution model used for the phylogenetic reconstructions was
estimated with modeltest 3.7 (11) using the minimum theoretical information criterion (AIC)
and the Bayesian information criterion (BIC) as suggested by Posada & Buckley (10). Isolates
were identified by comparing unknown sequences using a FASTA BLAST search (Table 2).
Genetic diversity parameters such as haplotype and nucleotide diversity (6) were obtained
(all) employing the DnaSP 4.0 software. Phylogenetic trees were constructed by the
maximum-likelihood (ML) and neighbour-joining (NJ) methods by using the program PAUP*
4.0b10 (Swofford 2002 Sunderland, Massachusetts). We estimated by 200 bootstrap replicate
using the (NNI) heuristic search option NJ analysis using the ML distance under the
evolutionary model selected by model test. Nocardia sp. and Corynebacterium sp. were used
as out group species and Mycobacterium tuberculosis as the more closely related species
(Figure 1).
The clinical isolates are reference in mycobacteria diagnose with a great number of
long time interns HIV positive patients. No incidences of hsp65 gene amplification or
sequencing failure, neither interprimer sequence variation were encountered from 368 sites
studied. The genetic variability of the hsp65 gene sequence between clinical and
environmental samples were similar which suggests an increasing relationship among some
species from environment and those from the artificial way of man. The clinical sample 451
clearly was identified as M. gordonae, being grouped 100% with M. gordonae ATCC 14470.
ANEXOS
144
Another clinical sample 438 was identified as M. shottsii because it was grouped 100%
homology with M. shottsii ATCC 700981. The sampling here studied have a good variability,
since we found many isolated ones of slow growth, but also isolated of rapidly growth
between the clinical and ambient samples, but the great majority of the samples, in general,
are of slow growth. Many isolates were grouped with M. avium, M. intracellulare, M.
scrofulaceum ATCC 19981 and M. tuberculosis complex. A possible explanation to this fact
is that environmental mycobacteria are normal inhabitants of a wide variety of environmental
reservoirs, including natural and municipal water, soil aerosol, protozoans, animals and
humans. Environmental mycobacteria also have extraordinary starvation survival, persisting
despite of low nutrient levels in the tap water (8, 14, 12).
Although water does not represent the only source of M. avium complex in humans, it
is possible that it might be the primary source (3). Human activities probably have great
influence in the distribution and prevalence of mycobacteria. The treatment of drinking water
supplies with chlorine or other disinfectants (e.g., ozone) leads to selection for environmental
mycobacteria (7). This fact could explain why many clinical and environmental species that
we studied are grouped with M. avium. In this investigation, two clinical isolates grouped with
M. scrofulaceum, maybe because an implementation of a clean water method, as well as
occurred in the United States in 1975 when the increased chlorination rates may have led to a
strong reduction of M. scrofulaceum in water. Additionally, the epidemiology of infection by
environmental mycobacteria is poorly understood due to a lack of data regarding the primary
reservoirs of different mycobacterial species (5, 12).
The great number of the environmental collected, were identified by slow growth, and
it appeared grouped with clinical isolates. It can be related with the question about adaptive
value previously discussed. There are a variety of situations which human and mycobacterial
ANEXOS
145
distribution can overlap geographic and environmentally that results in exposure of humans as
well as impacting mycobacterial ecology. Humans are exposed to mycobacteria in water
through drinking, swimming, and bathing. It has been facilitating the contamination mainly in
hospitals, where the patients are more exposed and with their immunity reduced. Previous
studies which correlate environmental parameters to isolation of environmental mycobacteria
were performed in acidic, organic, rich material and stagnant water reservoirs (1). However,
we could see that the infection by MNT can be almost exclusively associated with the
environmental mycobacteria that have been adapted at human way. Our investigation
provides evidence that hsp65 sequencing has the potential of being an accurate, reliable and
effective means for identifying clinical and environmental Mycobacterium isolates. It has the
advantages over biochemical test profiles of being rapid and trustful. Moreover, the results of
sequencing can be used to correlate the specimens between themselves and to give support in
its identification.
Our results showed that the hsp65 sequences from reference strains of mycobacteria
provide basis for determining systematic phylogenetic relationships. The phylogenetic
analysis suggests that slow growth is of recent evolution in mycobacteria and, as discussed
above, possibly of great adaptive value (9). This study also showed the possibility of the
species correlate with to each other, and moreover, the possible entry ports of mycobacteria in
the artificial human environmental. In relation to the information about DNA polymorphism
obtained to the clinical and environmental individually, we can see that it was larger in
clinical than in the environmental samples. It could be explained by an adaptation of the
environment species to the artificial human ambience, probably through biofilms. It can help
us to understand why so many infections caused by mycobacteria have been appeared at this
moment. Today is very important understand the associations between species of
ANEXOS
146
mycobacteria in Brazil because infections by these microorganisms has been increasing and
causing outbreaks hospital, where the port of entry for infection occurs mainly in surgery
patients, becoming a serious and delicate problem of public health.
REFERENCES
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ANEXOS
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ANEXOS
148
Figure 1. Consensus tree of 200 bootstrap showing the phylogenetic relationship among
environmental and clinical isolates from several places of Rio de Janeiro surrounding region,
and sequences of known mycobacterial species. The tree is based on a comparison of a 368-
bp sequence from the mycobacterial hsp65 gene, using neighbor joining method. Bootstrap
values greater than 70% are indicated. The distance between two strains is the sum of the
branch lengths between them.
ANEXOS
149
Fig1.
Corynebacterium sp
Nocardia
sp.
M. diernhoferi
M. cosmeticum
M. frederiksbergense
M. parafortuitum
M. mucogenicum
M. phocaicum
M. murale
M. tokaiense
M. brisbanense
M. farcinogenes
M. houstonense
Environmental 299
Environmental 301
Environmental 395
M. fortuitum
M. jacuzzii
M. wolinskyi
M. lentiflavum
M. peregrinum
M. boenickei
M. septicum
M. goodii
M. piscinum
M. smegmatis
M. abscessus
M. bolletii
M. chelonae abscessus
subsp.
M. massiliense
M. arupense
M. hiberniae
M. chelonae
M. fuerthensis
M. immunogenum
M. salmoniphilum
M. rhodesiae
M. aichiense
M. petroleophilum
M. brumae
M. chitae
M. hodleri
M. doricum
M. monacense
M. agri
M. triviale
M. novocastrense
M. holsaticum
M. senegalense
M. aurum
M. gilvum
M. komossense
M. gadium
M. tusciae
M. austroafricanum
M. duvalii
M. poriferae
M. chlorophenolicum
M. chubuense
M. obuense
M. moriokaense
M. phlei
M. sphagni
M. hassiacum
M. thermoresistibile
M. elephantis
M. pulveris
M. kumamotonense
M. terrae
M. cookii
M. sherrisii
M. habana
M. genavense
M. shimoidei
M. simiae
M. malmoense
M. bohemicum
M. heckeshornense
M. xenopi
M. interjectum
M. saskatchewanense
92
97
70
82
97
99
97
99
86
90
100
88
88
70
94
85
95
100
70
100
72
91
86
ANEXOS
150
0.1
M. conspicuum
Clinical 445
Environmental 314
Environmental 328c
Environmental 346
M. asiaticum
Environmental 315
Clinical 427
Clinical 428
Clinical 446
Clinical 465
Clinical 432
Clinical 454
Environmental 370
Environmental 371
Clinical 451
M. gordonae
M. gordonae
type I
Clinical 438
M. shottsii
M. marinum
M. pseudoshottsii
M. nebraskense
M. szulgai
M. montefiorense
M. triplex
M. parascrofulaceum
M. lacus
M. botniense
M. branderi
M. celatum
M. gastri
M. kansasii
Clinical 440
Environmental 269
Clinical 424
Clinical 442
Clinical 448
Clinical 458
Clinical 463
Clinical 468
M. africanum
M. bovis
M. canetti
M. caprae
M. tuberculosis
Clinical 447
Clinical 467
M. haemophilum
M. lepraemurium
M. visibile
Environmental 318
M. heidelbergense
Clinical 436
Clinical 450
M. scrofulaceum
M. parmense
Clinical 457
M. intermedium
M. kubicae
M. palustre
M. chimera
M. intracellulare
Clinical 423
Environmental 308
Environmental 417
Clinical 466
M. columbiae
M. paraffinicum
Environmental 255
Environmental 260
Environmental 262
Environmental 263
Environmental 264
Environmental 328b
Environmental 345
Environmental 358
Environmental 359
M. avium
M. avium paratuberculosis
subsp.
Environmental 259
Environmental 369
Clinical 452
Clinical 430
Clinical 434
Clinical 456
Clinical 462
83
98
94
86
100
81
100
72
70
100
85
78
ANEXOS
151
Table 1. Environmental and clinical strains GenBank access.
Environmental Clinical
*
Strains GenBank access Strains GenBank access
swine 255 EU343669 423 EU343693
swine 259 EU343670 424 EU343694
swine 260 EU343671 427 EU343695
water 262 EU343672 428 EU343696
water 263 EU343673 430 EU343697
water 264 EU343674 432 EU343698
water 269 EU343675 434 EU343699
soil 299 EU343676 436 EU343700
soil 301 EU343677 438 EU343701
bovine faeces 308 EU343678 440 EU343702
bovine faeces 314 EU343679 442 EU343703
bovine faeces 315 EU343680 445 EU343704
bovine faeces 318 EU343681 446 EU343705
bovine faeces 328b EU343682 447 EU343706
bovine faeces 328c EU343683 448 EU343707
bovine faeces 345 EU343684 450 EU343708
bovine faeces 346 EU343685 451 EU343709
swine 358 EU343686 452 EU343710
swine 359 EU343687 454 EU343711
swine 369 EU343688 456 EU343712
swine 370 EU343689 457 EU343713
swine 371 EU343690 458 EU343714
soil 395 EU343691 462 EU343715
bovine faeces 417 EU343692 463 EU343716
465 EU343717
466 EU343718
467 EU343719
468 EU343720
*
induced sputum
ANEXOS
152
Table 2. The reference hsp65 sequences were obtained in Genbank.
hsp65 sequence of reference strains
M. abscessus (AY498743) M. gadium CIP 105388 (AF547835) M. nonchromogenicum ATCC 19530 (AY299136)
M. africanum KIT 77710 (AY299176) M. gastri ATCC 15754 (AY299182) M. novocastrense CIP 105546 (AF547862)
M. agri (AY438080) M. genavense ATCC 51233 (AY299183) M. obuense CIP 106803 (AF547863)
M. aichiense ATCC 27280 (AY299147) M. gilvum DSM 44503 (AF547838) M. palustre DSM 44572 (AY943200)
M. arupense isolate FI-05354 (DQ986513) M. goodii ATCC 700504 (AY458071) M. paraffinicum MAIS-34 (AY859015)
M. asiaticum ATCC 25276 (AY299133) M. gordonae ATCC 14470 (AY299184) M. parafortuitum ATCC 19686 (AY299157)
M. aurum (AY438081) M. gordonae variant MS460 (AY550237) M. parascrofulaceum CIP 108112 (AY943201)
M. austroafricanum (AJ310221) M. habana (AF129011) M. parmense CIP 107385 (AY943202)
M. avium subsp. paratuberculosis (DQ414422) M. haemophilum (AJ307630) M. peregrinum ATCC 14467 (AY299159)
M. boenickei CIP 107829 (AY943195) M. hassiacum ATCC 700660 (AY373456) M. petroleophilum DSM 44182 (DQ350156)
M. bohemicum CIP 105811 (AF547811) M. heckeshornense DSM 44428 (AF547843) M. phlei ATCC 11758 (AY299158)
M. bolletii CIP 108541 (AY859675) M. heidelbergense CIP 105424 (AF547844) M. phocaicum MUCO_06-708 (EF551431)
M. botniense DSM 44537 (AF547812) M. hiberniae (AJ307631) M. piscinum DSM 43272 (DQ350155)
M. bovis ATCC 19210 (AY299178) M. hodleri CIP 104909 (AF547845) M. septicum ATCC 700731 (AY496142)
M. branderi CIP 104592 (AF547815) M. holsaticum (AJ310469) M. poriferae (AJ307645)
M. brisbanense .CIP 107830 (AY943196) M. houstonense ATCC 49403 (AY458077) M. pseudoshottsii (AY571788)
M. brumae (AF071129) M. immunogenum (AY498741) M. pulveris (MPU17953)
M. canettii CIPT 140060005 (AJ749923) M. interjectum ATCC 51457 (AY299186) M. rhodesiae (AJ307647)
M. caprae CIP 105776 (AF547884) M. intermedium ATCC 51848 (AY299187) M. salmoniphilum (DQ866782)
M. celatum (AJ310225) M. intracellulare (AY299188) M. saskatchewanense CIP 108114 (AY943203)
M. chelonae (DQ869272) M. intracellulare X variant DO69 (AY550235) M. scrofulaceum ATCC 19981 (AY299138)
M. chelonae subsp. abscessus (AJ310215) M. jacuzzii (DQ137415) M. senegalense ATCC 35796 (AY299160)
M. chelonae subsp. abscessus (AJ310216) M. kansasii (AY299191) M. septicum ATCC 700731 (AY373457)
M. chimaera CIP 107892 (AY943198) M. komossense (AY438649) M. sherrisii (AY365190)
M. chitae ATCC 19627 (AY299149) M. kubicae ATCC 700732 (AY373458) M. shimoidei ATCC 25275 (AY299140)
M. chlorophenolicum CIP 104189 (AF547820) M. kumamotonense CST7247 (AB239920) M. shottsii ATCC 700981 (AY550225)
M. chubuense K237Y (DQ184957) M. lacus (AY438090) M. simiae CIP 104531 (AF547875)
M. columbiae (AM062765) M. lentiflavum ATCC 51985 (AY373453) M. smegmatis ATCC 35796 (AY299161)
M. conspicuum CIP 105165 (AF547823) M. lepraemurium variant TS130 (AY550232) M. sphagni (AJ307655)
M. cookii CIP 105396 (AF547824) M. malmoense ATCC 29571 (AY299193) M. szulgai ATCC 35799 (AY299141)
M. cosmeticum 2003-11-06 (AY449731) M. marinum (DQ985339) M. terrae ATCC 15755 (AY299142)
M. diernhoferi CIP 105384 (AF547825) M. massiliense (AY596465) M. thermoresistibile ATCC 19527 (AY299162)
M. doricum DSM 44339 (AF547826) M. monacense FI-00234 (DQ381731) M. tokaiense CIP 106807 (AF547881)
M. duvalii (AJ310229) M. montefiorense DSM 44602 (AY943204) M. triplex variant MS418 (AY550210)
M. elephantis CIP 106831 (AF547828) M. moriokaense CIP 105393 (AY859680) M. triplex (AY027786)
M. fallax (AJ310230) M. mucogenicum MUCO_06-606 (EF551425) M. triviale ATCC 23292 (AY299143)
M. farcinogenes ATCC 35753 (AY299150) M. murale CIP 105980 (AF547859) M. tusciae CIP 106367 (AF547887)
M. fortuitum ATCC 13756 (DQ866789) M. nebraskense SM 44803 (DQ124110) M. visibile 94-2864 (AY550208)
M. frederiksbergense OA128Y (DQ184963) M. neoaurum ATCC 25795 (AY299156) M. wolinskyi ATCC 700010 (AY299164)
M. fuerthensis DSM 44567 (AY550238)
ANEXOS
153
Table 3. Genetic diversity parameters.
Samples categories Clinical Environmental
Clinical +
Environmental
Number of sequences 28 24 52
Number of variable sites 73 85 95
Total number of mutations 91 106 128
Number of haplotypes 19 17 34
Haplotype diversity 0,947 0,920 0,963
Nucleotide diversity (Pi) 0,06508 0,06221 0,06590
Average number of nucleotide
differences (K)
23,88360 22,82971 24,18627
Livros Grátis
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