( PDF ) Avaliação da mutagenicidade dos extratos de folha e raiz da planta medicinal coccoloba mollis (polygonaceae) em diferentes sistemas

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Marcela Stefanini Ferreira Tsuboy

AVALIAÇÃO DA MUTAGENICIDADE DOS EXTRATOS DE FOLHA E

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AVALIAÇÃO DA MUTAGENICIDADE DOS EXTRATOS DE FOLHA E

RAIZ DA PLANTA MEDICINAL

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RAIZ DA PLANTA MEDICINAL

COCCOLOBA MOLLIS

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COCCOLOBA MOLLIS

(POLYGONACEAE)

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(POLYGONACEAE)

EM DIFERENTES SISTEMAS

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EM DIFERENTES SISTEMAS-

-TESTE.

TESTE.TESTE.

TESTE.

Londrina

2008

Universidade Estadual de Londrina

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Marcela Stefanini Ferreira Tsuboy

AVALIAÇÃO DA MUTAGENICIDADE DOS EXTRATOS DE FOLHA E

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COCCOLOBA MOLLIS

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EM DIFERENTES SISTEMAS

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Londrina

2008

Instituto Agronômico do Paraná

Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária

Universidade Estadual de Londrina

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Marcela Stefanini Ferreira Tsuboy

Marcela Stefanini Ferreira TsuboyMarcela Stefanini Ferreira Tsuboy

Marcela Stefanini Ferreira Tsuboy

AVALIAÇÃO DA MUTAGENICIDADE DOS

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EXTRATOS DE FOLHA E EXTRATOS DE FOLHA E

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RAIZ DA PLANTA MEDICINAL

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COCCOLOBA MOLLIS

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COCCOLOBA MOLLIS

(POLYGONACEAE)

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EM DIFERENTES SISTEMAS

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TESTE.

Dissertação apresentada ao Programa de

Pós–Graduação em Genética e Biologia

Molecular, da Universidade Estadual de

Londrina, como requisito parcial para a

obtenção do título de Mestre.

Orientador: Prof. Dr. Mário Sérgio Mantovani

Londrina

2008

Marcela Stefanini Ferreira Tsuboy

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Marcela Stefanini Ferreira Tsuboy

AVALIAÇÃO DA MUTAGENICIDADE DOS EXTRATOS DE FOLHA E

AVALIAÇÃO DA MUTAGENICIDADE DOS EXTRATOS DE FOLHA E AVALIAÇÃO DA MUTAGENICIDADE DOS EXTRATOS DE FOLHA E

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RAIZ DA PLANTA MEDICINAL

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EM DIFERENTES SISTEMAS

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TESTE.

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Genética e Biologia Molecular

da Universidade Estadual de Londrina como

requisito parcial para obtenção do título de

Mestre.

COMISSÃO EXAMINADORA

Prof. Dr. Mário Sérgio Mantovani

Universidade Estadual de Londrina, UEL.

Profa. Dra. Lúcia Regina Ribeiro

Universidade Estadual Paulista, UNESP.

Profa. Dra. Sílvia Helena Sofia

Universidade Estadual de Londrina, UEL.

Londrina, 22 de julho de 2008.

Dedico

Dedico Dedico

Dedico

esta dissertação aos

maiores responsáveis por sua realização: meus pais Ruy e

Silvana, meus avós maternos Inês e Nino e meus avós paternos

(in memorian) Haruzo e Esmeralda.

Agradecimentos

AgradecimentosAgradecimentos

Agradecimentos

Gostaria de agradecer imensamente ao Prof. Dr. Mário Sérgio Mantovani, pela

oportunidade oferecida. Por ter me recebido tão bem em seu laboratório, sem ao menos

conhecer-me, quando ainda terminava minha graduação e quando começaria então nosso

convívio e amizade. Obrigada pelos conselhos, pelos momentos de estresse e de descontração,

pelas palavras serenas e otimistas nos meus dias de desespero e incertezas, mas, sobretudo,

obrigada por acreditar em mim e fazer com que minha insegurança, muitas vezes exarcebada,

se transformasse em segurança e confiança. Espero ter correspondido às suas expectativas e

ter colaborado para o progresso do laboratório.

Agradeço imensamente também à Profa. Dra. Lúcia Regina Ribeiro, a verdadeira “culpada”

pela minha vinda à Londrina. Obrigada por ter sido sempre tão prestativa e por ter acreditado

em mim desde o primeiro momento, quando ainda nos conhecíamos apenas por email ou

telefone. Obrigada pelo incentivo e pela oportunidade de ter realizado uns dos meus maiores

desejos acadêmicos, estudar fora do país. Espero ter correspondido à altura naquela ocasião, e

que ainda possamos passar mais alguns anos juntas, trabalhando para a realização de mais um

desejo, o doutorado.

Aos membros titulares e suplentes da comissão examinadora, Profa. Dra. Sílvia Helena

Sofia, Profa. Dra. Ilce Mara de Syllos Cólus e Prof. Dr. Edson Luís Maistro, pela

colaboração e sugestões para a melhoria da redação final.

Ao Programa de Mestrado em Genética e Biologia Molecular da Universidade Estadual

de Londrina, pela oportunidade concedida.

A todos os docentes do programa, pela atenção, paciência e ensinamentos.

Aos funcionários Dário e Melissa, pela atenção e auxílio cotidiano no laboratório e,

especialmente à Sueli, pela atenção, paciência, conselhos e auxílio burocrático mesmo antes

do meu ingresso no programa.

Aos amigos de mestrado das turmas 2006/01, 2007 e, principalmente da turma 2006/02:

Ilara, Selma e Éverson. Obrigada pela amizade, preocupação e pelos momentos de

descontração e estudo conjunto. Amigos, tenho um palpite: a “turma esquecida do meio do

ano” sempre será lembrada!

Obrigada a todos os amigos e colegas do Laboratório de Genética Toxicológica,

especialmente à Ju, Josi, Zé, meus “estagiários queridos” Andressa, Diogo, Natália, Simone e

Vander, à Sandra, aos “Rodrigos” e à “Li” e “Rô”.

Ju e Josi: Praticamente meus anjos-da-guarda em Londrina! Obrigada pela amizade,

pela presença constante, por todos os dias e noites (cansativas, mas felizes) de experimentos

no lab. Obrigada pela dedicação, pelo ombro amigo, pelo ouvido atento, pelas risadas e

lágrimas compartilhadas, pelos conselhos, pelas palavras de incentivo, pela torcida, e também

pelo carinho e cuidado nos dias de indisposição física.

Zé: Obrigada pela amizade e pelas palavras incentivadoras que você vem nos trazer

toda vez que volta à Londrina. Obrigada pela lembrança quando surgem estudos em

colaboração, demonstrando que você tem confiança e acredita no nosso trabalho. Obrigada

também pelas dicas com as culturas de células, e pela ajuda com o Alemão quando o Inglês

não foi suficiente, na nossa temporada de estágio em Viena!

“Estagiários queridos”: Obrigada pelos momentos de alegria no lab, pelos poucos

almoços no RU e por nossos divertidos encontros extra-lab. Espero ter contribuído pelo

menos um pouquinho com o trabalho de vocês. Além disso, espero ter despertado um maior

interesse de vocês pela Mutagênese, para que todos continuem por aqui ano que vem!

“Rodrigos”: Obrigada pelos conselhos, incentivo e auxílio no início e término da

dissertação.

À Profa. Dra. Dalva Trevisan Ferreira e ao Iuri, do Laboratório de Pesquisas em

Moléculas Bioativas, pela atenção, paciência e auxílio com os extratos.

À Profa. Dra. Rosa Elisa C. Linhares e ao Prof. Dr. Carlos Nosawa, do Laboratório de

Virologia, pelo auxílio na implantação da técnica de análise de indução da apoptose.

À Profa. Dra. Danielle P. de Oliveira e às mais novas amigas Elisa e Farah, do

Departamento de Análises Clínicas, Toxicológicas e Bromatológicas (USP, Ribeirão Preto),

pela atenção, amizade e pela colaboração na avaliação dos extratos pelo Teste de Ames.

Ao pessoal de Assis, meus amigos biólogos, inesquecíveis e sempre presentes, por todos os

momentos de felicidade, tristezas, incertezas e conquistas que vivemos e viveremos em Assis

e região ou onde quer que estejamos. Pela confiança, amizade, carinho, conselhos e admiração

que temos um pelo outro. Muito obrigada Leandro, Davi, Ligiana, Giselli, Camila, Ágatha,

Fernanda e Lilian.

Aos amigos de Londrina, Ivan; Dalita, Juliana Mara, Ronaldo e pessoal de outras turmas e

outros programas; pessoal do Espanhol e do NAFI; Ana, Camila, Aline e Vanessa e; em

especial ao pessoal da “colônia nipônica londrinense”: Alexandre, Márcia, Adriana, Rodrigo e

Fernando, pela calorosa acolhida, pelos momentos hilários e descontraídos, pelo carinho e

preocupação e pelos inúmeros passeios pela cidade!

Ao pessoal de Marília, amigos de longa data. Crescemos juntos e compartilhamos muitas

alegrias e tristezas. Passamos pela adolescência, vestibular, faculdade, deixamos a casa de

nossos pais, arranjamos o primeiro emprego, alguns se casaram, outros foram para o outro

lado do mundo. Mas o laço que nos une ainda permanece intacto, mesmo que às vezes nos

esquecemos de mandar notícias. Obrigada a todos os amigos de mais uma grande “colônia

japonesa”, principalmente à Ju, Elis, Luciene, Mel, Dani, Melina, Zi.

À minha família, principalmente meus pais e avós. Obrigada novamente pelo apoio

incondicional, pela preocupação em investir em minha educação desde a infância, pela

confiança, pela segurança, pelo incentivo e por toda a dedicação e amor. Foram muitos os

sacrifícios para se chegar até aqui, e certamente eu não conseguiria se não fosse por vocês,

meus pais! Obrigada também aos avós, tios e tias que sempre demonstraram preocupação e

admiração e que se prontificaram em ajudar materialmente e psicologicamente.

A todos aqueles que participaram de forma direta ou indireta para o êxito deste trabalho. Aos

que ajudaram, muito obrigada. Aos que atrapalharam, obrigada também, pois vocês me

mostraram o quanto posso ser forte e o quanto Deus me abençôou ao colocar tantas outras

pessoas boas em minha vida!

TSUBOY, Marcela Stefanini Ferreira. Avaliação da mutagenicidade dos extratos de folha

e raiz da planta medicinal Coccoloba mollis (Polygonaceae) em diferentes sistemas-teste.

2008. 100p. Dissertação (Mestrado em Genética e Biologia Molecular). Universidade

Estadual de Londrina (UEL), Londrina, PR.

RESUMO

O uso das plantas medicinais pela população é uma prática antiga e ainda bastante difundida,

o que faz com que estudos sobre uma possível atividade mutagênica sejam essenciais. A

Coccoloba mollis Casaretto (Polygonaceae) é uma espécie vegetal popularmente pouco

conhecida, mas que tem sido utilizada como fitoterápico em Londrina, PR., sendo registrada

no “Guia Homeopático da Farmácia Q. curatun” com o nome de “Erva da memória”. Este

fitoterápico tem sido relatado como benéfico principalmente em casos de falta de memória e

estresse. No presente estudo, os extratos etanólicos de folha e raiz da Coccoloba mollis foram

avaliados quanto a um possível efeito mutagênico, citotóxico e indutor de apoptose em

sistemas-teste in vitro e in vivo. Para a avaliação in vitro foi utilizada a linhagem hepática de

Rattus novergicus (HTC) nos ensaios de citotoxicidade (MTT) e mutagenicidade (Cometa e

Micronúcleo com bloqueio de citocinese - MNCtB) e; as linhagens TA98 e TA100 de

Salmonella typhimurium no ensaio Salmonella/microssoma. In vivo, a mutagenicidade foi

avaliada em sangue periférico de camundongos, também através dos ensaios do Cometa e

Micronúcleo. Com os resultados obtidos em todos os experimentos pode-se dizer que o

extrato preparado a partir das raízes da C. mollis possui maior toxicidade. Esta toxicidade

mostrou-se extremamente alta às linhagens de Salmonella investigadas, TA100 e TA98,

especialmente quando acrescido a esta última metabolização exógena (S9). No ensaio MTT,

em células HTC, o extrato da raiz mostrou-se citotóxico em concentração dez vezes inferior (a

partir de 200 µg/mL) a concentração do extrato obtido das folhas da C. mollis (a partir de

2000 µg/mL). À medida que as concentrações de ambos os extratos aumentam mais células

entram em apoptose, sendo a maior concentração testada (200 µg/mL) estatisticamente

significativa. Os resultados dos experimentos de mutagenicidade in vitro mostram que

nenhuma das concentrações empregadas, de ambos os extratos, foi mutagênica às células

HTC no ensaio MNCtB, embora tenha sido detectada genotoxicidade na maior concentração

avaliada no ensaio Cometa, sugerindo a indução de danos reparáveis. Praticamente, o mesmo

ocorreu no ensaio Salmonella/microssoma, no qual nenhuma das concentrações analisadas do

extrato da raiz foi capaz de aumentar significativamente o número de revertentes/placa.

Entretanto, o extrato da folha foi capaz de induzir danos no DNA da linhagem TA98, na

ausência de S9 na maior concentração testada, embora em potência mutagênica muito baixa.

Os experimentos realizados in vivo demonstraram que houve um aumento no número de

cometas e micronúcleos observados, porém estes resultados não foram significativos

estatisticamente. Os dados obtidos sugerem que apesar da baixa capacidade de indução de

danos ao DNA nas condições experimentais realizadas, os extratos da C. mollis,

especialmente o obtido das raízes, possuem alta toxicidade e capacidade de indução de

apoptose. Assim, o conhecimento dos fitoquímicos presentes nestes extratos aliado à

investigação mais detalhada sobre efeitos biológicos da Coccoloba mollis seria importante

para a comprovação científica dos efeitos propostos popularmente e para proporcionar uma

maior segurança aos usuários desta planta medicinal.

Palavras-chave: plantas medicinais, Coccoloba mollis, mutagenicidade, citotoxicidade, in

vitro, in vivo.

TSUBOY, Marcela Stefanini Ferreira. Mutagenic evaluation of the leaf and root extracts

from the medicinal plant Coccoloba mollis (Polygonaceae) in different test-systems. 2008.

100p. Dissertação (Mestrado em Genética e Biologia Molecular). Universidade Estadual de

Londrina (UEL), Londrina, PR.

ABSTRACT

The use of medicinal plants by population is an ancient and widespread practice, which makes

researches about its potential mutagenic activity essential. Coccoloba mollis Casaretto

(Polygonaceae) is a vegetal specie not very popularly known, but it has been used as

phytotherapic in Londrina, PR, being registred in the “Guia Homeopático da Farmácia Q.

curatun” under the name “Erva da memória”. This phytotherapic has been reported as

beneficial mainly in cases of lacking of memory and stress. In the present study, the ethanolic

extracts from the leaf and root from Coccoloba mollis were investigated in relation to their

potential mutagenic, cytotoxic and apoptosis inductor effects in in vitro and in vivo test-

systems. The in vitro evaluation was made using the hepatic lineage of Rattus novergicus

(HTC) in the cytotoxicity (MTT) and mutagenicity (Comet and Micronucleus with

cytokinesis block –MNCtB) assays and; the strains TA98 and TA100 of Salmonella

typhimurium in the Salmonella/microsome assay. In vivo, mutagenicity was evaluated in

peripheral blood erythrocytes of mice, also using Comet and Micronucleus assays. The results

obtained with all experiments showed that the extract prepared with the roots of C. mollis

possesses greater toxicity. The toxicity was extremely high to the investigated Salmonella

strains, TA100 and TA98, especially when added to the latter exogenous metabolization (S9).

In MTT assay, with HTC cells, the root extract showed cytotocity in concentration ten times

lower (since 200 µg/mL) than the concentration of the extract obtained from the leaves of C.

mollis (since 2000 µg/mL). With the increase of the concentration of both extracts more cells

undergo apoptosis, being the highest concentration tested (200 µg/mL) which is statistically

significant. The results of the in vitro mutagenicity experiments demonstrate that none of the

evaluated concentration, of both extracts, were mutagenic to HTC cells in MNCtB assay,

instead of the genotoxicity detected in the highest concentration of the Comet assay,

suggesting induction of repairable damage. Almost the same occurred in

Salmonella/microsome, where none of the concentrations analysed of the roots extracts were

able to increase the number of revertents/plate significantly. Nevertheless, leaf extract induced

DNA damage in TA98 strain in the absence of S9, in the highest concentration evaluated,

although in very low mutagenic potency. The in vivo experiments demonstrated that there was

an increase in the number of comets and micronuclei observed, however, they were not

statistically significant. The data obtained suggested that in spite of the low response in the

induction of DNA damage in the experimental tested conditions, the extracts from C. mollis,

especially the root one, possesses high toxicity and potential to induce apoptosis. Thus, the

knowledge of the phytochemicals present in these extracts ally with a deeper investigation

about the biological effects of Coccoloba mollis would be important to the scientific

confirmation of the popularly proposed effects and to provide greater security to people that

have being used this medicinal plant.

Keywords: medicinal plants; Coccoloba mollis, mutagenicity, cytotoxicity, in vitro, in vivo.

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO..............................................................................................................

1.1. PLANTAS MEDICINAIS

..................................................................................................

1.2. MUTAGÊNESE

................................................................................................................

1.2.1. SISTEMAS-TESTE

........................................................................................................

1.2.2. ENSAIO DE CITOTOXICIDADE MTT

..........................................................................

1.2.3. ENSAIO DE DETECÇÃO DE APOPTOSE IN SITU

........................................................

1.2.4. ENSAIOS DE GENOTOXICIDADE/MUTAGENICIDADE

.............................................

1.2.4.1. ENSAIO SALMONELLA/MICROSSOMA OU TESTE DE AMES

................................

1.2.4.2. ENSAIO DO COMETA OU SINGLE CELL GEL ELECTROPHORESIS (SCGE)

..........

1.2.4.3. TESTE DO MICRONÚCLEO

.......................................................................................

1.3. COCCOLOBA MOLLIS, FAMÍLIA POLYGONACEAE

......................................................

2. JUSTIFICATIVA.............................................................................................................

3. OBJETIVOS.....................................................................................................................

3.1. OBJETIVOS GERAIS

........................................................................................................

3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

...............................................................................................

4. ARTIGO 1.........................................................................................................................

5. ARTIGO 2.........................................................................................................................

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................................................

ANEXOS................................................................................................................................

1. Introdução

1. Introdução1. Introdução

1. Introdução

1.1. Plantas medicinais

As plantas medicinais sempre tiveram um importante papel terapêutico na história da

humanidade. Provavelmente a utilização das plantas como medicamento é tão antiga quanto o

próprio aparecimento do homem sendo, portanto difícil determinar com exatidão as

numerosas etapas na evolução desta arte de curar. Além de sua utilidade como agentes

terapêuticos, os benefícios proporcionados pelos vegetais ao longo da história vão desde a sua

utilização como corantes, inseticidas, fragrâncias, entre outros, até seu importante papel na

nutrição humana, onde muitos dos fitoquímicos presentes nas plantas estão sendo

cientificamente reportados como capazes de alterar a expressão gênica (MILNER, 2002; GO

et al., 2005). De acordo com a Empresa Brasileira de Pesquisas Agropecuárias, EMBRAPA

(2004), as plantas medicinais podem ser definidas como aquelas que apresentam uma ou mais

substâncias químicas com ação medicamentosa capazes de interagir com o organismo humano

e de outros animais, restabelecendo sua saúde e equilíbrio.

A fitoterapia é uma prática mundialmente significativa. HOSTETTMANN &

MARSTON (2002) mostraram que mais de 80% da população de países em desenvolvimento

são totalmente dependentes das plantas na atenção primária à saúde e, mais de 25% dos

medicamentos prescritos mundialmente derivam direta ou indiretamente das plantas.

No Brasil, as plantas medicinais são amplamente utilizadas na área rural e urbana

(RATES, 2001). Em muitas regiões do território nacional, desde as menos favorecidas até as

grandes cidades, as plantas medicinais são comercializadas em feiras livres, mercados

populares e encontradas em quintais residenciais.

O interesse pela fitoterapia geralmente é motivado pelo seu uso tradicional e por sua

origem natural. Os próprios usuários são os responsáveis pela validação das informações

terapêuticas acumuladas ao longo dos séculos. As observações populares sobre o uso e a

eficácia das plantas medicinais contribuem de forma relevante para a divulgação das virtudes

terapêuticas dos vegetais prescritos com maior freqüência e dos efeitos medicinais que

produzem, mesmo sem o conhecimento dos seus constituintes químicos (MACIEL et al.,

2002).

Até mesmo em países industrializados, onde a medicina convencional é predominante,

o uso das plantas como medicina complementar e alternativa cresce rapidamente (WHO,

2002). De acordo com CAPASSO et al. (2000), o aumento considerável na venda de

fitoterápicos nestes países tem sido promovido por fatores como: (1) desenvolvimento de

novas doenças, com complicações severas e que ainda não possuem um tratamento adequado;

(2) a crença de que os fitoterápicos são inócuos, em contraste com as drogas convencionais;

(3) a idéia de que sendo natural só pode ser bom; (4) a atenção especial dada aos fitoterápicos

nos países ocidentais por movimentos ecológicos; e (5) a crença de que os fitoterápicos são

naturalmente superiores às drogas sintéticas.

Apesar da comprovação científica dos efeitos benéficos das plantas medicinais, seu

uso pela população deve ser realizado de maneira cautelosa. Efeitos adversos podem surgir

devido à toxicidade intrínseca, à adulteração, substituição, contaminação, identificação

errônea do material vegetal, falta de fiscalização e interações com outras drogas (RATES,

2001; ZHOU et al., 2004). Provavelmente, a deficiência de relatos sobre os efeitos adversos é

reflexo da combinação de pouca divulgação e da natureza benigna da maioria das plantas

utilizadas (FUGH-BERMAN, 2000).

Entretanto, a literatura nos apresenta também uma grande variedade de estudos com

resultados muitas vezes contraditórios (CHAVEZ et al., 2006). Especial atenção tem sido

dada à investigação de compostos naturais que atuam na prevenção do câncer. Contudo,

alguns constituintes derivados de espécies medicinais, ou mesmo os preparados vindos destas

espécies, podem ser bio-ativados para promover o desenvolvimento de tal doença (ZHOU et

al., 2004, ROMERO-JIMÉNEZ et al., 2005).

Para garantir a eficácia terapêutica de um agente farmacológico, natural ou sintético,

deve ser comprovado por meio de estudos farmacológicos, histo-patológicos e toxicológicos

que o seu uso não traz agravos à saúde humana, sendo então necessário a avaliação de uma

possível atividade genotóxica e/ou mutagênica deste agente. Esta prática é de especial

importância no caso de produtos derivados das plantas medicinais, pois estas sintetizam

substâncias tóxicas que, na natureza, possuem o papel de defesa contra a herbivoria e outros

agentes patogênicos (KRICHER, 1997). Além disso, as plantas contêm inúmeros constituintes

e seus extratos, quando testados, podem apresentar efeitos sinérgicos entre os diferentes

princípios ativos devido a presença de compostos de classes ou estruturas diferentes

contribuindo para a mesma atividade (MACIEL et al., 2002). A fitoterapia deve, então, ser

acompanhada de estudos científicos que levem em consideração e correlacionem pesquisas de

qualidade, eficácia e segurança (KHAN, 2006).

Deste modo, estudos de genotoxicidade e anti-genotoxicidade ajudam na avaliação da

segurança e efetividade dos produtos naturais (BAST et al., 2002). A avaliação da

genotoxicidade/mutagenicidade dos agentes terapêuticos, naturais ou sintéticos, é

recomendada por órgãos reguladores nacionais e internacionais (CNS, RESOLUÇÃO Nº

251/97; OECD, 2001). A agência norte-americana Food and Drug Administration, FDA,

sugere uma bateria de testes in vitro e in vivo para a compreensão do potencial

genotóxico/mutagênico de um composto em questão: um teste para mutação gênica em

bactéria; um teste citogenético in vitro para avaliação de danos cromossômicos em células de

mamíferos ou um sistema que detecta mutações gênicas e efeitos clastogênicos (Mouse

Lymphoma tk Assay); e, finalmente, um teste in vivo para detecção de danos cromossômicos

em células hematopoiéticas de roedores (FDA, 1997). Os testes de

genotoxicidade/mutagenicidade são, portanto, de particular importância, pois são capazes de

detectarem compostos que induzem danos genéticos diretamente ou indiretamente por

diversos mecanismos.

1.2. Mutagênese

A Mutagênese ou também denominada Genética Toxicológica corresponde à ciência

que estuda o processo de indução de danos no DNA pela ação de agentes químicos, físicos e

biológicos. Este dano é usualmente medido como mutações, aberrações cromossômicas,

quebras de fitas do DNA, aductos ou por interferências no sitema de reparo do dano

(ZEIGER, 2001). Os estudos nesta área têm sido usados no acesso da mutagenicidade de

agentes ambientais, farmacêuticos e químicos há mais de trinta anos, sendo muitas de suas

atividades focadas no desenvolvimento de novos testes, padronização de protocolos, geração

de base de dados e estudos inter-laboratoriais de validação de resultados.

A avaliação da mutagenicidade ganha cada vez mais importância à medida que a

sociedade se desenvolve e o número de substâncias estranhas ao organismo humano cresce.

Esses xenobióticos podem interagir de diversas formas com o homem, sendo benéficos,

prejudiciais ou indiferentes frente ao contato. Por isso é imprescindível identificar os agentes

potencialmente mutagênicos, teratogênicos ou carcinogênicos e estabelecer normas para o seu

uso (REIFFERSCHEID & HEIL, 1996). Observações epidemiológicas e estudos adicionais

em animais e outros sistemas-teste mostram que inúmeros agentes aos quais estamos

constantemente expostos são capazes de induzir danos no DNA (WOGAN et al., 2004).

Evidências crescentes sugerem que o dano no DNA, expresso principalmente como mutações,

está envolvido na indução de muitos tipos de câncer (BARTSCH & TOMATIS, 1983;

SARASIN, 2003). Além de seu papel na carcinogênese, as mutações podem ainda possuir

papel crítico no processo de envelhecimento e no desenvolvimento de doenças auto-imune e

crônico-degenerativas (MORLEY & TURNER, 1999; FENECH, 2000; DE FLORA &

FERGUNSON, 2005).

O processo de carcinogênese é resultante da acumulação de múltiplas mutações que

culminam na insensibilidade de controle da célula cancerígena pelo ambiente celular local e

pelo organismo como um todo (SARASIN, 2003). De acordo com HANAHAN &

WEINBERG (2000), a progressão para o tumor maligno é governada por seis alterações

essenciais na fisiologia celular: auto-suficiência nos sinais de fatores de crescimento,

insensibilidade aos sinais de fatores inibitórios de crescimento, evasão da apoptose, potencial

replicativo ilimitado, sustento da angiogênese, e invasão tecidual e metástase. Esses eventos

são tradicionalmente separados em três fases: iniciação, promoção e progressão. Na fase de

iniciação ocorre o dano ao DNA. A fase de promoção é aquela onde promotores de tumor

agem como mitógenos, induzindo a expansão de clones das células iniciadas. A progressão é

caracterizada pelo desenvolvimento irreversível de mudanças macroscópicas e microscópicas

pelas células já alteradas genotipica e fenotipicamente (GESCHER et al., 2001). Alguns

autores sugerem ainda uma quarta fase, a invasão, onde os tumores evoluem com aumento

nos níveis de malignidade (ALBERTS et al., 1999).

De acordo com as informações acima, podemos dizer que o mecanismo de mutagênese

(e a conseqüente instabilidade genômica) na fase de iniciação está intrinsecamente ligado ao

processo carcinogênico das fases seguintes. Dados publicados mostram que a maioria dos

tumores sólidos são geneticamente instáveis em pelo menos uma das fases do processo de

carcinogênese (SARASIN, 2003). Mutações de ponto, aberrações cromossômicas como

translocações, deleções e amplificações, metilação aberrante do DNA, modificações das

histonas (NELSON et al., 2004), instabilidade em regiões de microssatélite, silenciamento

e/ou perda de heterozigosidade de genes supressores de tumor e aneuploidia têm sido

propostos como possíveis importantes passos iniciadores (FENECH, 2002).

Estudos de mutagenicidade e carcinogênese apresentam grande correlação positiva,

mostrando que a maioria dos carcinógenos são mutagênicos (McCANN et al., 1975).

Entretanto, mecanismos indiretos de genotoxicidade também existem e podem ser definidos

como interações com alvos diferentes do DNA, que resultam em efeitos genotóxicos

(KIRSCH-VOLDERS et al., 2003). Os carcinógenos não-genotóxicos podem ainda ser

definidos como aqueles que não apresentam mutagenicidade em teste de avaliação da

toxicidade genética (CHOY, 2001). Considerando esta definição, a metilação do DNA pode

ser considerada um processo não-genotóxico, que causa alterações na expressão gênica, na

ausência de mutação (CHOY, 2001). Segundo este mesmo autor, o desencadeamento

acentuado da proliferação celular (por encurtar o tempo de carcinogênese) e da proliferação

dos peroxissomos (resultando em aumento dos níveis de H

e conseqüentemente dos danos

oxidativos) também são exemplos destes mecanismos.

1.2.1. Sistemas-teste

Diversos ensaios são utilizados para a avaliação da genotoxicidade/mutagenicidade de

um agente e estes podem ser aplicados em uma grande variedade de organismos-teste, desde

microrganismos até plantas, animais experimentais e humanos, bem como em sistemas de

cultura de células.

Nos últimos anos, o uso da cultura de células e de tecidos na pesquisa e na indústria

vem crescendo rapidamente, principalmente devido à tendência de evitar o uso de animais

para experimentação (JONES & STACEY, 2001). A cultura de células é amplamente

utilizada em laboratórios de todo o mundo para examinar vias metabólicas e elucidar

mecanismos envolvendo a transdução de sinais, regulação da expressão gênica, proliferação e

morte celular (HALLIWELL, 2003). Os estudos in vitro com células de mamíferos são

amplamente utilizados na detecção de agentes mutagênicos ou anti-mutagênicos e apresentam

diversas vantagens tais como a facilidade de padronização das condições experimentais

(densidade populacional, pH, temperatura, composição do meio de cultivo, entre outras), a

possibilidade de aplicação do tratamento em qualquer fase do ciclo celular, além de serem

ensaios econômicos e de boa reprodutibilidade (RABELLO-GAY & RODRIGUES, 1991).

Em especial, linhagens celulares hepáticas, tais como HTC, HepG2 e culturas primárias de

hepatócitos são de grande utilidade em estudos de genotoxicidade e mutagenicidade, uma vez

que o fígado é o principal sítio de metabolização de xenobióticos (MERSH-SUNDERMANN

et al., 2004) e muitos desses necessitam ser metabolizados para originar compostos

mutagênicos (ZEIGER, 2001). Assim sendo, tais células, mesmo em condições de cultura e

em níveis de expressão variáveis, apresentam ainda enzimas de fase I e fase II do

metabolismo de drogas (CASTELL et al., 1997; WILKENING et al., 2003; VALENTIN-

SEVERIN et al., 2003).

Apesar da alternativa do uso de células metabolizadoras, da adição de metabolização

exógena aos sistemas in vitro e embora estes mostrem alta concordância com estudos em

animais (McCANN et al., 1975), os ensaios in vitro ainda apresentam algumas limitações

quando comparados ao sistema in vivo como a dificuldade de simular a farmacocinética de

absorção, distribuição, metabolismo e excreção in vivo, perda de interações célula-matriz

necessárias para a manutenção do fenótipo diferenciado, além de que a estabilidade

metabólica in vitro depende somente da atividade das células-alvo enquanto que a distribuição

sistêmica que ocorre in vivo coloca o composto sob a influência de diferentes tecidos

(FRESHNEY, 2001). De acordo com KRISHNA & HAYASHI (2000), os sistemas in vivo

são especialmente relevantes no acesso ao perigo genético, uma vez que permitem considerar

fatores do metabolismo in vivo, farmacocinética e processos de reparo do DNA.

1.2.2. Ensaio de citotoxicidade MTT

A citotoxicidade pode ser considerada como o potencial de um composto de induzir a

morte celular (EISENBRAND et al., 2002). A resposta celular a um efeito tóxico pode ser

reversível, quando resultante de privação de nutrientes ou fatores de crescimento ou regulada

positiva ou negativamente por um regulador de crescimento; ou irreversível, quando as

células entram em apoptose, senescência ou se diferenciam (FRESHNEY, 2001). Os testes de

citotoxicidade in vitro são úteis e necessários para definir a citotoxicidade basal e permitem o

controle do ambiente físico-químico e fisiológico, além de darem consistência à amostra e

resultados reproduzíveis quando linhagens celulares bem caracterizadas são empregadas

(FRESHNEY, 2001; EISENBRAND et al., 2002). Ainda segundo EISENBRAND et al.

(2002) os testes de citotoxicidade também são de grande valia para definir os limites de

concentrações a serem testadas em experimentos de indução de mutações ou apoptose. De

acordo com HONMA & SOFUNI (2001), para avaliar o potencial mutagênico de uma

substância apropriadamente, é necessário testar doses variadas e estar ciente de que a

citotoxicidade excessiva pode levar a resultados falso-positivos, uma vez a citotoxicidade

pode estar, eventualmente, associada à indução de danos cromossômicos (MULLER et al.,

2001).

Diferentes parâmetros podem ser utilizados na avaliação da citotoxicidade.

Geralmente esses testes examinam endpoints que indicam efeitos em membranas celulares de

organelas, colapso da barreira de permeabilidade celular, função mitocondrial reduzida,

alterações na morfologia e replicação das células (HODGSON et al., 2004).

Um exemplo destes testes é o ensaio MTT. Proposto por Mosmann em 1983, ele é um

dos mais empregados e um dos mais sensíveis testes para a detecção de citotoxicidade após a

exposição das células a substâncias tóxicas (FOTAKIS & TIMBRELL, 2006). Testes

colorimétricos como este, apresentam vantagens como sua rapidez e precisão (MOSMANN,

1983).

O método envolve a conversão, pelas células, do MTT [3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-

2,5-diphenyltetrazolium bromide] um sal tretrazolium de coloração amarela em um formazan

de coloração roxa. Tal reação geralmente é atribuída à atividade das mitocôndrias, porém o

exato mecanismo da redução do MTT ainda não está bem esclarecido (VELLONEN et al.,

2004). Como o produto formado é impermeável às membranas celulares, este se acumula nas

células vivas. Após a exposição das células ao composto teste e ao período de incubação das

mesmas em contato com o MTT, as amostras passam pelo leitor de ELISA, onde são medidas

espectrofotometricamente.

1.2.3. Ensaio para detecção de apoptose in situ

Como descrito anteriormente, a resposta da célula a um efeito tóxico pode ser

reversível ou irreversível. A distinção entre a citotoxicidade e danos celulares reversíveis deve

ser apropriadamente avaliada para que a interpretação dos dados de estudos in vivo seja

facilitada (VALENTIN et al., 2000). Para isso, a indução da apoptose, por exemplo, pode ser

investigada através de diversos parâmetros: alterações na morfologia celular, rearranjos na

membrana, fragmentação do DNA, ativação de caspases, liberação do citocromo c da

mitocôndria, entre outros (EISENBRAND et al., 2002).

O termo apoptose foi utilizado pela primeira vez em 1972 por Kerr e seus

colaboradores para descrever uma forma de morte celular morfologicamente distinta

(ELMORE, 2007). A morte celular por apoptose foi inicialmente identificada com base nas

mudanças fisiológicas reproduzidas com grande fidelidade em diferentes tipos celulares

quando expostas a um estímulo de morte. Essas mudanças incluem condensação do citosol e

da cromatina nuclear, fragmentação celular em corpúsculos que são fagocitados pelas células

vizinhas e exposição do resíduo de fosfatidilserina na superfície externa da membrana

plasmática (PLENCHETTE et al., 2004). Embora a apoptose possua importante papel durante

o processo de desenvolvimento dos organismos, esta se não regulada corretamente pode

resultar em patologias associadas ao seu desencadeamento excessivo ou diminuído:

anormalidades no desenvolvimento, doenças auto-imunes, neurodegenerativas e câncer

(ELMORE, 2007).

A identificação da apoptose por análise das alterações morfológicas, por exemplo,

ainda constitui um procedimento padrão devido a sua simplicidade, baixo custo e precisão

(PLENCHETTE et al., 2004). A técnica faz uso de corantes tais como Hoechst 33342 ou

Acridine Orange, que penetram na célula e coram seu DNA. Em contraste com as células

normais, as células apoptóticas terão a cromatina condensada e fragmentada uniformemente

coradas por estes corantes (PLENCHETTE et al., 2004; WYLLIE, 2008) (Figura 1).

Como dito anteriormente, existe uma grande variedade de testes para a detecção da

apoptose. Estes envolvem métodos relativamente simples e baratos que utilizam apenas

microscopia, até métodos mais onerosos, que fazem uso de kits próprios e aparelhagem mais

sofisticada, todos com suas vantagens e desvantagens. É, portanto de responsabilidade do

pesquisador avaliar qual a melhor combinação de testes que será útil à sua pesquisa.

Figura 1. Células HTC após tratamento com os extratos da C. mollis. Coloração: Acridine Orange.

Microscopia de fluorescência, objetiva de 100x. Setas indicam células apoptóticas.

1.2.4. Ensaios de genotoxicidade/mutagenicidade

Um grande número de testes in vitro e in vivo tem sido desenvolvido para a detecção

de danos no DNA. Os principais objetivos destes testes é a detecção de mutações em

linhagens celulares germinativas, devido ao seu possível envolvimento no desempenho

reprodutivo e futura geração de doenças genéticas; e a identificação de mutações somáticas,

devido à sua já estabelecida relação com o desenvolvimento de doenças como o câncer

(EISENBRAND et al., 2002).

Dentre os testes mais empregados e amplamente aceitos para investigação de

substâncias que causam dano genético estão os ensaios Salmonella/microssoma ou Teste de

Ames (MORTELMANS & ZEIGER, 2000), o Ensaio do Cometa (WITTE et al., 2007;

BURLINSON et al., 2007); e o Teste do Micronúcleo (FENECH, 1999; KRISHNA &

HAYASHI, 2000).

1.2.4.1. Ensaio Salmonella/microssoma ou Teste de Ames

Entre os ensaios microbianos que utilizam bactérias, o mais comumente utilizado tem

sido o Teste de Ames, principalmente por sua simplicidade, baixo custo, sensibilidade,

reprodutibilidade, versatilidade e alto valor preditivo para carcinogenicidade em roedores

quando uma resposta mutagênica é obtida (RABELLO-GAY & RODRIGUES, 1991;

MORTELMANS & ZEIGER, 2000). O teste Salmonella/microssoma pode ser aplicado para a

avaliação da qualidade do ar, esgoto, sedimentos, efluentes do processo industrial, água para

consumo humano, tecidos animais, solos, além de produtos químicos, naturais, sintéticos,

fitoterápicos (SBMCTA, 2004). É parte das baterias de ensaios internacionalmente propostas

para registro de medicamentos, outras drogas, formulações químicas, incluindo as substâncias

ou misturas com ampla utilização na agricultura, além de ser utilizado em estudos para

elucidação de mecanismos de mutagênese e anti-mutagênese e na avaliação de efeitos

sinérgicos de misturas de compostos (UMBUZEIRO & VARGAS, 2003).

O teste Salmonella/microssoma ou teste de Ames, desenvolvido por Bruce Ames e

seus colaboradores no final dos anos de 1960 e início de 1970, é um dos mais reconhecidos e

executados na área de genética toxicológica. Durante mais de vinte anos os procedimentos do

ensaio foram firmemente estabelecidos e os resultados extensivamente validados (CHOY,

2001). O teste avalia a capacidade de indução de dano genético que leva a mutações gênicas

através da reversão do fenótipo histidina negativo (his

) para histidina positivo (his

) das

diferentes linhagens de Salmonella

typhimurium

na presença e ausência de sistema de

metabolização (fração microssomal S9) (JOSEPHY, 1997).

As linhagens de Salmonella usadas no ensaio pertencem ao grupo de enterobactérias

capazes de produzir azoredutase e nitroredutase, especialmente construídas para detectar

mutações do tipo deslocamento de quadro de leitura ou substituição de pares de base no DNA

(UMBUZEIRO et al., 2005). As linhagens sofrem mutações nos genes responsáveis pela

biossíntese da histidina e como resultado não conseguem produzir este aminoácido, sendo que

cada uma dessas mutações é projetada para responder aos mutágenos que agem por

mecanismos diferentes, o que torna a combinação de linhagens de Salmonella uma ferramenta

importante na elucidação do mecanismo de ação mutagênica de diversos compostos

(MORTELMANS & ZEIGER, 2000). As linhagens TA98 e TA100 são comumente utilizadas

para estudos de triagem, mostrando eficiência na detecção de grande número de agentes

mutagênicos (SBMCTA, 2004). A mutação hisD3052, presente em TA98 ocorre na

codificação do gene para histidinol desidrogenase e afeta a leitura correta de uma seqüência

próxima constituída de oito resíduos CG -CGCGCGCG- repetitivos (UMBUZEIRO &

VARGAS, 2003). A reversão desta mutação é induzida por vários mutágenos que ocasionam

erros de leitura como o 2-nitrofluoreno e vários derivados aromáticos nitrosos

(MORTELMANS & ZEIGER, 2000). Já a mutação hisG46, presente em TA100, codifica o

gene para a primeira enzima da biossíntese da histidina. A mutação é resultante da

susbstituição de uma leucina (GAG/CTC) por uma prolina (GGG/CCC) sendo, portanto,

revertida por mutações que causam substituição de pares de bases em um dos pares GC

(MORTELMANS & ZEIGER, 2000).

Diversos protocolos podem ser utilizados para a realização do teste, sendo os mais

empregados os métodos de incorporação em placas, o de pré-incubação e o de

microssuspensão (UMBUZEIRO & VARGAS, 2003). Estes diferentes protocolos e a

construção de novas linhagens de Salmonella, com mutações adicionais àquelas no operon da

histidina, aumentaram a sensibilidade do teste, permitindo que este avalie uma maior

quantidade de agentes, incluindo gases e compostos voláteis. Em revisão feita por

MORTELMANS & ZEIGER (2000), os autores descrevem detalhadamente os protocolos

para execução do ensaio e interpretação dos resultados:

• O método de incorporação em placas consiste em adicionar as linhagens de

Salmonella e a amostra a ser testada em uma placa de ágar mínimo

(suplementado com biotina e traços de histidina) na presença e ausência de

sistema de ativação metabólica (fração S9);

• O método de pré-incubação é uma modificação do ensaio de incorporação em

placas e envolve a exposição das linhagens, da substância teste, do tampão ou

da mistura S9 por um curto período de tempo (usualmente 30 minutos) a 37°C

em um pequeno volume de mistura (0,5 mL) antes do plaqueamento em ágar

mínimo. Acredita-se que os metabólitos mutagênicos de vida curta têm uma

maior possibilidade de interagir com as linhagens em um pequeno volume de

mistura pré-incubada se comparado com o plaqueamento imediato. Além

disso, o menor volume possibilita maior concentração de S9 e co-fatores;

• No protocolo de microssuspensão, também denominado teste de Kado, as

culturas são concentradas 10 vezes, para uso no teste de pré-incubação. Esta

metodologia é interessante quando se dispõe de pouca quantidade de amostra,

pois se acredita que o maior número de bactérias aumente a detecção dos

metabólitos mutagênicos.

Os resultados do ensaio devem ser submetidos à análise de variância (ANOVA),

seguida de análise de regressão linear, preferencialmente em programa estatístico próprio

(exemplo Salanal

) (UMBUZEIRO & VARGAS, 2003). Para todos os protocolos, o número

de revertentes no controle negativo é a taxa de reversão espontânea obtida nas condições do

ensaio e normalmente os resultados são expressos em número de revertentes por placa. Uma

amostra é considerada positiva quando apresenta ANOVA e efeito dose-resposta significativo

(SBMCTA, 2004). A figura abaixo ilustra a resposta observada no ensaio para o controle

negativo e por mutagênese induzida.

Figura 2. Resposta observada no teste de Ames. À esquerda, controle negativo; à direita mutagênese

induzida por agente químico, apresentando maior número de colônias revertentes (Fonte:

MORTELMANS & ZEIGER, 2000).

1.2.4.2. Ensaio do Cometa ou Single Cell Gel Electrophoresis (SCGE)

O Ensaio do Cometa ou Single Cell Gel Electrophoresis (SCGE) é um método rápido

e sensível para a detecção de danos primários no DNA que tem sido amplamente utilizado na

Genética Toxicológica por ser um teste relativamente barato, simples, flexível, de rápidos

resultados, no qual um pequeno número de células por amostra e pequenas quantidades da

substância teste são suficientes para conduzir um experimento (COLLINS et al., 1996; TICE

et al., 2000; WITTE et al., 2007). Além do seu amplo uso na investigação genotóxica in vitro

e in vivo, biomonitoramento humano, epidemiologia molecular, ecogenotoxicologia, o teste

do cometa constitui uma valiosa ferramenta para a investigação dos aspectos fundamentais de

danos no DNA e seus mecanismos de reparo (COLLINS, 2004). O SCGE vem sendo

considerado uma técnica útil no biomonitoramento humano, pois este pode ser aplicado em

células não-proliferativas e em células de tecidos considerados como o primeiro sítio de

contato das substâncias mutagênicas, ao contrário dos testes citogenéticos, muitas vezes

limitados aos linfócitos circulantes e dependentes de populações celulares proliferativas

(KASSIE et al., 2000). WITTE et al., (2007) propõem que o ensaio seja utilizado como uma

alternativa aos ensaios citogenéticos na triagem de drogas, por ter as vantagens já descritas

acima, pela menor ocorrência de resultados falso-positivos associados com o excesso de

toxicidade e pela possibilidade de automatização de alguns passos da técnica. O teste do

cometa também está sendo bastante usado em estudos nutricionais, especialmente na

investigação do efeito protetor de componentes da dieta frente a danos oxidativos e por isso é

considerado por alguns pesquisadores como um biomarcador ideal para estudos de efeitos da

nutrição sobre o câncer (WASSON et al., 2008).

RYDBERG & JOHANSON, em 1978, foram os primeiros pesquisadores que

quantificaram danos diretamente no DNA de células individuais, ao lisarem as células

embebidas em agarose em condições alcalinas (GONTIJO & TICE, 2003; WITTE et al.,

2007). Anos mais tarde, ÖSTLING & JOHANSON (1984) descreveram uma versão

modificada de detecção de danos em células individuais, com a introdução da eletroforese e

sob pH neutro, onde as células com aumento de danos (neste caso, quebras de fita dupla)

apresentam aumento na migração de fragmentos do DNA em direção ao ânodo. Em 1988,

SINGH et al. introduziram a eletroforese em pH alcalino (pH >13), o que tornaria a técnica

mais sensível e a mais utilizada pelos pesquisadores da área (TICE et al., 2000). Nestas

condições, a técnica permite detectar o mais amplo espectro de dano ao DNA - quebras de fita

simples e dupla, danos em sítios álcali-lábeis e ainda, sob certas condições crosslinks DNA-

DNA, DNA-proteína, que (na ausência de outras lesões) aparecem como uma diminuição da

migração do DNA quando comparado aos controles (HARTMANN et al., 2003). A

introdução de tratamentos enzimáticos torna o ensaio ainda mais específico e sensível. Neste

caso, é introduzida uma etapa extra de digestão dos nucleóides com enzimas que reconhecem

tipos particulares de danos e ocasionam uma quebra (COLLINS, 2004). Pirimidinas oxidadas

podem ser detectadas com o uso da endonuclease III (COLLINS et al., 1993), a oxidação de

purinas é normalmente detectada com o uso da formamidopirimidina DNA-glicosilase (FPG),

enquanto que os dímeros de pirimidina induzidos por UV são detectados com a endonuclease

V do bacteriófago T4 (TICE et al., 2000; COLLINS, 2004). É importante ressaltar que o

ensaio detecta lesões genômicas que após processadas podem ou não resultar em mutações,

ou seja, o dano detectado pelo teste do cometa é passível de reparo (GONTIJO & TICE,

2003).

O Ensaio do Cometa pode ser conduzido em qualquer tecido desde que as células

possam ser isoladas. É mais comumente aplicado em células animais, entretanto alguns

métodos têm sido desenvolvidos para aplicação do teste em células vegetais (GICHNER &

PLEWA, 1998).

Muitas variáveis técnicas podem afetar a sensibilidade do teste, tais como a

natureza química e o mecanismo de ação do agente mutagênico, a concentração e quantidade

de agarose de baixo ponto de fusão, composição da solução de lise, tempo de lise, tempo de

desnaturação alcalina do DNA, composição e temperatura do tampão de eletroforese, as

condições de corrida, a coloração do DNA, entre outros (SPEIT & HARTMANN, 1999;

SPEIT et al., 1999).

A análise dos cometas gerados pode ser feita visualmente ou de maneira

automatizada, com programas computacionais próprios. De acordo com COLLINS (2004),

existe grande concordância entre os resultados obtidos pelas duas maneiras de análise.

A classificação visual dos cometas normalmente é feita de acordo com o descrito por

KOBAYASHI, (1995). Estes são divididos em quatro classes, de acordo com a extensão do

dano gerado, em: cometa classe 0 – nucleóides que não apresentam cauda; cometa classe 1 –

nucleóides com cauda menor que o diâmetro do nucleóide; cometa classe 2 – nucleóides com

cauda de tamanho entre 1 a 2 vezes o diâmetro do nucleóide; e cometa classe 3 – nucleóides

com cauda 2 vezes maior que o diâmetro do nucleóide (Figura 3).

Figura 3. Critério de classificação para a análise do Ensaio do Cometa. Da esquerda para direita,

cometas de classe 0, 1, 2 e 3. Coloração: Brometo de Etídeo. Microscopia de fluorescência, objetiva de

40x. Foto de Luiz, 2002.

1.2.4.3. Teste do Micronúcleo

O Teste do Micronúcleo foi originalmente desenvolvido por SCHMID et al. em 1971

e então modificado por HEDDLE (1973) como uma alternativa aos ensaios citogenéticos

tradicionais. O método apresenta vantagens como a simplicidade, rapidez e baixo custo

(SCHIMID, 1975). O ensaio foi desenvolvido primeiramente em sistema-teste in vivo, em

células de medula óssea de camundongos, porém atualmente é aplicado em vários tipos

celulares, em sistemas in vitro, in vivo e ex vivo. A versão in vivo do ensaio é considerado o

teste mais amplamente utilizado para a detecção de agentes clastogênicos e aneugênicos,

sendo internacionalmente aceito como parte da bateria de testes recomendados para avaliação

do potencial mutagênico, para o registro de novos produtos químicos que entram no mercado

mundial (CHOY, 2001; SBMCTA, 2004).

A formação do micronúcleo é amplamente usada na epidemiologia molecular como

um biomarcador de danos cromossômicos e instabilidade genômica (IARMARCOVAI et al.,

2008). Além de sua aplicação em estudos de ecotoxicologia, na avaliação de novos fármacos,

no monitoramento de indivíduos expostos ocupacionalmente a agentes potencialmente

mutagênicos, no estudo dos mecanismos de ação do agente mutagênico estudado

(SALVADORI et al., 2003), diversos laboratórios o utilizam como uma ferramenta para a

avaliação de fatores ambientais, genéticos e estilo de vida sobre a estabilidade genômica das

populações humanas, com especial atenção na avaliação de risco para o câncer (FENECH et

al., 1999).

Os micronúcleos são resultantes de dois fenômenos básicos nas células mitóticas:

quebra cromossômica (clastogênese) e disfunção do aparelho mitótico (aneugênese), sendo

formados pelos cromossomos acêntricos ou fragmentos cromatídicos e cromossomos inteiros

ou cromátides que se atrasam na anáfase e são excluídos do núcleo-filho na telófase

(FENECH, 2000) (Figuras 4 e 5). A distinção do micronúcleo contendo cromossomos inteiros

de um contendo fragmentos cromossômicos acêntrico pode ser feita utilizando-se hibridização

in situ fluorescente (FISH) com sondas de regiões pericentroméricas (MATEUCA et al.,

2006).

Figura 4. Formação de célula micronucleada por clastôgenese, contendo fragmento cromatídico

acêntrico. Fonte: AARDEMA & KIRSCH-VOLDERS, 2001.

Figura 5. Formação de célula micronucleada por aneugênese, contendo cromossomo inteiro. Fonte:

AARDEMA & KIRSCH-VOLDERS, 2001.

O ensaio do micronúcleo in vitro com bloqueio de citocinese (MNCtB), desenvolvido

por FENECH & MORLEY em 1985, tornou-se um dos testes citogenéticos padrão para a

análise da freqüência de micronúcleos em células humanas (FENECH, 2006a) e agências

reguladoras já o incorporaram na bateria de testes recomendados para o acesso ao potencial

mutagênico de novos agentes (OECD, 2007). Além da análise do micronúcleo, outros

parâmetros podem ser investigados na mesma cultura, na mesma lâmina. A viabilidade celular

pode ser mensurada através da análise das células necróticas e apoptóticas; a condição

mitótica através da contagem das células mono, bi e multinucleadas e posterior cálculo do

índice de divisão nuclear; e finalmente, a instabilidade cromossômica ou extensão do dano,

através da análise da presença de micronúcleo, ponte nucleoplasmática e brotos nucleares

(FENECH, 2006a).

O MNCtB permite a análise dos micronúcleos após a primeira divisão celular,

certificando que o dano ocorrido é decorrente do tratamento experimental à que as células

foram submetidas. A adição de citocalasina-B (Cyt-B) à cultura permite identificar tais células

devido à presença dos dois núcleos (FENECH, 2000). Esta substância inibe os

microfilamentos de actina e impede a polimerização dos mesmos na placa equatorial formada

no final da telófase; desta forma observa-se uma cariocinese com ausência de citocinese. O

uso da Cyt-B já foi motivo de debate entre os pesquisadores. Alguns já evidenciaram que seu

uso pode interferir na indução de micronúcleos por agentes que afetariam o fuso mitotótico

(AARDEMA & KIRSCH-VOLDERS, 2001), entretanto, os resultados de um estudo inter-

laboratorial revelaram que o uso da Cyt-B é a maneira mais eficiente de minimizar resultados

falso-negativos (FENECH, 2006b).

Alguns critérios devem ser seguidos para a seleção das células binucleadas e para a

identificação do micronúcleo (Figura 6) (FENECH, 2000): as células devem ser binucleadas;

os dois núcleos devem ter a membrana intacta e devem estar situados dentro do mesmo limite

citoplasmático; os dois núcleos devem ter tamanhos aproximadamente iguais e mesma

intensidade de coloração; os micronúcleos devem possuir morfologia idêntica a do núcleo

principal e mesma coloração (porém ocasionalmente é mais intensa); os micronúcleos são

não-refringentes; não devem estar ligados a um dos núcleos principais; não podem estar

sobrepostos a um dos núcleos principais; e o diâmetro deve variar de 1/16 até 1/3 do diâmetro

do núcleo principal.

Figura 6. Células binucleadas sem micronúcleo (esquerda) e com micronúcleo (seta) (direita).

Coloração: Giemsa 5%. Microscopia óptica, aumento de 400x. Foto de Luiz, 2002.

Como descrito anteriormente, o ensaio do micronúcleo in vivo é amplamente utilizado

na detecção de agentes clastogênicos e aneugênicos. O dano cromossômico é mensurado em

células de medula óssea por constituir uma população celular de rápida proliferação e ser mais

suscetível à indução de danos (ZEIGER, 2001). Os micronúcleos são avaliados em hemáceas

jovens, pois quando os eritroblastos expelem seus núcleos e se transformam em eritrócitos,

estes permanecem no citoplasma, onde são facilmente identificados devido à sua morfologia

arredondada e coloração característica (SCHIMID, 1975).

A freqüência de micronúcleos também é usualmente verificada no sangue periférico

dos animais. Neste caso, os reticulócitos são as células indicadas para a análise. Segundo

HAYASHI et al (1990), a população celular é mais uniforme e fácil de analisar e uma

pequena quantidade de células sanguíneas pode ser retirada repetidamente da cauda do roedor

sem a necessidade de sacrificá-lo. A coloração feita com acridina orange permite a distinção

dos reticulócitos sem micronúcleo, ricos em RNA e que emitem fluorescência vermelha, dos

reticulócitos com micronúcleo, que além da coloração vermelha, apresentarão em seu

citoplasma o DNA contido no micronúcleo, com coloração amarelo-esverdeado (Figura 7).

Figura 7. Reticulócito sem micronúcleo (a) e com micronúcleo (b). Coloração: laranja de acridina.

Microscopia de fluorescência; aumento de 400x. Foto de Marcarini, 2005.

(a)

(b)

1.3. Coccoloba mollis, Família Polygonaceae

A Coccoloba mollis Casaretto (Polygonaceae) é uma espécie vegetal popularmente

pouco conhecida, mas que tem sido utilizada como fitoterápico em Londrina, PR. Esta espécie

está registrada no “Guia Homeopático da Farmácia Q. curatun” com o nome de “Erva da

memória”, e tem sido utilizada em casos de falta de memória, estresse, insônia, anemias,

queda de visão e impotência sexual.

O gênero Coccoloba distribui-se desde o México, sul dos Estados Unidos até o sul da

América do Sul. No Brasil estão presentes 45 espécies, 23 das quais ocorrem na Amazônia

(MELO, 2004).

A Coccoloba mollis (Figura 8), popularmente conhecida como folha-de-bolo ou falso-

novateiro, cauaçu ou pau-de-vassoura, ocorre em cerradões e mata semidecídua da bacia do

Paraná, desde o estado de Goiás até o Triângulo Mineiro e Paraná (MORS et al., 2000;

LORENZI, 2002).

Figura 8. Coccoloba mollis. Fonte: LORENZI, 2002.

A pesquisa bibliográfica realizada até o momento no Chemical Abstract (CA) e no

National Center for Biotechnology Information (NCBI) indica a ausência de literatura

científica sobre esta espécie.

As espécies do gênero Coccoloba têm sido popularmente usadas no Brasil como

adstringente, no tratamento da febre, diarréia, gonorréia, hemorróidas, problemas menstruais e

hemorragias uterinas (MORS et al., 2000; COTA et al., 2003). Os principais constituintes

químicos já identificados em espécies deste gênero são:

triterpenos (acetato de lupeol,

betulina, taraxenona, ácido betúlico, fridelina, α-amirina, lupeol); flavonóides (miricetina-3-

ramnosídeo, quercetina, quercetina-3-ramnosídeo, campferol); antraquinonas (éter 3-metílico

da emodina, crisofanol, reina, emodina); esteróides (estigmasterol); aromáticos e derivados

(ácido gálico, catequinas, éster etílico do ácido gálico, roileanona) (FERREIRA

; COTA et

al., 2003).

Coccoloba uvifera L. apresenta como principais constituintes ácidos carboxílicos,

ésteres e aldeídos (SHAW et al., 1992 apud COTA et al., 2003). Ácido gálico,

epigalocatequina galato, mircetina-3-o-ramnosídeo e triterpenos já foram isolados de

Coccoloba dungandiana, e β-sitosterol, β-lupeol, taraxerona, ácido ursólico e betúlico de

Coccoloba excoriata L. (COMPAGNONE et al., 1995 apud COTA et al., 2003; DAN &

DAN apud COTA et al., 2003).

A caracterização dos constituintes químicos dos extratos etanólicos obtidos das folhas

e raízes da Coccoloba mollis aqui testados ainda estão em andamento. Resultados

preliminares demonstraram a presença de duas antraquinonas (emodina e fissiona; Figura 9)

no extrato da raiz, enquanto que hidrocarbonetos, ésteres de cadeia longa e o triterpeno

taraxerona (Figura 10) foram caracterizados no extrato da folha (de BARROS et al., 2007;

FERREIRA et al., 2007).

OMe

emodin

10a

Fission

Figura 9. Estrutura química das antraquinonas identificadas no extrato etanólico da raiz de C. mollis.

FERREIRA DT (comunicação pessoal). Profa. Dra. Dalva Trevisan Ferreira, responsável pelo Laboratório de

Pesquisas em Moléculas Bioativas, pertencente ao Departamento de Química da Universidade Estadual de

Londrina, UEL e coordenadora do estudo fitoquímico dos extratos da Coccoloba mollis.

Figura 10. Estrutura química do triterpeno identificado no extrato etanólico da folha de C. mollis.

Fonte: NCBI, 2008

A atividade antimicrobiana destes extratos também foi investigada. O extrato obtido

das folhas da C. mollis inibiu o crescimento de Escherichia coli, Candida albicans, Candida

krusei e Candida tropicalis enquanto que o extrato obtido das raízes apresentou atividade

contra Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis

Candida albicans

e Candida krusei (de BARROS et al., 2008), concordando assim com dados da literatura

sobre a atividade antimicrobiana das plantas pertencentes à família Polygonaceae (COTA et

al., 2003; FALKENBERG, 2004; SHAN et al., 2008;).

Algumas espécies desta família apresentam também atividade antiviral. O extrato

etanólico de Polygonum cuspidatum Siebold & Zucc., apesar da citotoxicidade às células

hospedeiras, inibiu eficientemente a proliferação do vírus da hepatite B (CHANG et al.,

2005). Já o extrato etanólico de Rumex bequaertii De Wild. possui atividade contra o HIV,

apresentando a maior taxa de proteção em comparação com os extratos das outras plantas

estudadas (COS et al., 2002).

Alguns estudos relatam também a atividade tranqüilizante de extratos derivados de

plantas da família Polygonaceae (GOSH et al., 2002), além do efeito protetor da emodina

frente a distúrbios cerebrais (GU et al., 2000) e na consolidação da memória (LU et al., 2007).

As antraquinonas são compostos ativos de muitas drogas derivadas de plantas,

principalmente as laxativas, e ocorrem principalmente em membros das famílias Liliaceae,

Rhamnaceae, Caesalpinioideae, Rubiaceae, Verbenaceae, Asphodelaceae e Polygonaceae

(WINKER & SHIMMER, 2000; FALKENBERG, 2004). A exposição humana à emodina,

por exemplo, ocorre predominantemente via oral através da ingestão de fitomedicamentos e

da alimentação, chegando a ser de 3mg/Kg/dia para uma pessoa de 70 Kg (GO et al., 2007).

In vivo, a biotransformação das antraquinonas (1,8 diidroxiantraquinonas) parece ocorrer nas

células epiteliais do intestino e nas células hepáticas (MUELLER et al., 1998), sendo a

biotransformação da emodina, a 1,8 diidroxiantraquinona mais estudada, mediada pelas

enzimas do citocromo P450 (TANAKA et al., 1987; GO et al., 2007). De acordo com

MOROOKA e colaboradores (1990), a biotransformação da emodina gera seis metabólitos

principais: 4-hidroxiemodina (4-OHEM); 5-hidroxiemodina (5-OHEM); 7-hidroxiemodina

(7-OHEM); 2-hidroxiemodina (2-OHEM); ω-hidroxiemodina (ω-OHEM) e ácido emódico

(EA) (Figura 11). Dentre estes, 4-OHEM, 5-OHEM e 7-OHEM são considerados pró-

mutágenos; 2-OHEM um mutágeno de ação direta e, ω-OHEM e EA detoxificados

(MOROOKA et al., 1990).

Figura 11. Estrutura química dos principais metabólitos da emodina. Fonte: MOROOKA et al., 1990.

Com relação à investigação da atividade genotóxica/mutagênica das antraquinonas,

mais especificamente da emodina e fissiona, pouco ainda é descrito na literatura e os

resultados parecem ser ainda controversos. MUELLER e seus colaboradores atribuem

atividade mutagênica à emodina (MUELLER et al., 1998; MUELLER & STOPPER, 1999;

MUELLER et al, 1999), outros sugerem que ela seja antimutagênica (SUN et al., 2000; LEE

et al., 2005). Estes mesmos estudos mostram ainda que a emodina apresenta maior atividade

citotóxica e antimutagênica que a fissiona, esta por sua vez, não genotóxica e citotóxica

apenas em altas concentrações (MUELLER et al, 1999).

De acordo com os estudos realizados por Mueller, a mutagenicidade apresentada pela

emodina pode ser explicada pela formação de metabólitos mais ativos (2-OHEM) na indução

de danos via CYP1A2 e CYP2B e pela inibição da topoisomerase II devido a capacidade da

emodina (que possui estrutura planar) de se intercalar ao DNA. Vários estudos conduzidos

nas décadas de 1980 e 1990 investigaram o possível efeito mutagênico das antraquinonas e de

seus metabólitos em diferentes linhagens de Salmonella typhimurium (TIKKANEN et al.,

1983; MASUDA & UENO, 1984; MASUDA et al., 1985; MURAKAMI et al., 1987;

WESTENDORF et al., 1990; KRIVOBOK et al., 1992). Na maior parte desses estudos, a

mutagenicidade foi observada na linhagem TA1537.

No estudo conduzido por SUN et al. (2000), a antimutagenicidade de diversos extratos

foi investigada pelo Teste de Ames na linhagem de Salmonella TA98. Os extratos derivados

de Rheum officinale e Polygonum cuspidatum (ambas pertencentes à família Polygonaceae)

foram os que apresentaram maior atividade antimutagênica frente ao Trp-P-2 (3-amino-1-

methyl-5H-pyrido[4,3-b]indole). Segundo os autores, a antimutagenicidade ocorreu devido à

inibição de CYP1A1 pela emodina, promovida pela interação de certa região da sua estrutura

com a enzima. A emodina apresentou também atividade antimutagênica nas linhagens de

Salmonella TA98 e TA100 e Escherichia coli PQ37 no trabalho realizado por LEE et al.,

2005. Ainda segundo estes pesquisadores, o grupo hidroxila (-OH) presente no carbono 6

(C6) desta antraquinona pode ter importante papel na citotoxicidade verificada. Segundo GO

et al. (2007), a razão para os efeitos variados encontrados para a emodina ainda não está clara,

não havendo, portanto, consenso sobre a mutagenicidade desta antraquinona nos estudos

realizados.

A relação entre a estrutura das antraquinonas e a promoção de uma resposta biológica

mais ou menos acentuada, ou mesmo presente ou ausente também já foi observada por outros

autores (TIKKANEN et al., 1983; WESTENDORF et al., 1990; KRIVOBOK et al., 1992;

SHAN et al., 2008). Por exemplo, de acordo com SHAN et al. (2008), a presença e posição

do grupamento hidroxila influencia a eficácia microbiana. TIKKANEN et al. (1983)

concluíram que os grupos hidroxilas parecem ser necessários para indução de mutagenicidade

das antraquinonas estudadas, uma vez que todas aquelas que apresentaram resposta positiva

no Teste de Ames (linhagem TA2637) possuíam de um a três grupos –OH. Pela comparação

da atividade estrogênica de antraquinonas isoladas do extrato de Polygonum cuspidatum,

MATSUDA et al. (2001) concluiu que o grupo 6-OH parace ser essencial para a obtenção de

uma resposta mais eficiente. Os autores também demonstraram a capacidade de ligação da

emodina aos receptores de estrogênio (Er

α e ERβ) em células MCF-7.

Outra atividade bastante relatada na literatura sobre a emodina é sua capacidade de

indução da apoptose (SHIEH et al., 2004; YANG et al., 2004; WANG et al., 2007; ZONG-

YAN et al., 2007). Segundo OLSEN et al. (2007), este talvez seja o principal mecanismo pela

qual ela exerce o efeito anti-proliferativo nas diferentes linhagens tumorais humanas. Estudos

conduzidos em células de hepatoma humano (Mahlavu, PCL/PRF/5, HepG2; HepG2/C3A,

SK-HEP-1) demonstraram que a emodina exerce seu efeito de inibição da proliferação celular

através da indução de apoptose (JING et al., 2002; SHIEH et al., 2004). Os resultados obtidos

por JING e colaboradores mostraram que a geração de espécies reativas de oxigênio (ROS), o

rompimento da permeabilidade da membrana mitocondrial e a ativação de caspases devem

estar envolvidos na via apoptótica induzida pela emodina. Já SHIEH e colaboradores

concluíram que a indução de apoptose nas células HepG2/C3A foi mediada pela ativação de

p53, p21, Fas/APO-1 e caspase-3, sugerindo que tal antraquinona pode vir a se tornar um

agente quimioterapêutico útil no tratamento do carcinoma hepatocelular.

Com relação a fissiona identificada nos extratos da C. mollis, pouco ainda é descrito

na literatura científica até o momento. Geralmente são estudos fitoquímicos de extratos de

plantas medicinais, porém poucos apresentam algum estudo adicional sobre os efeitos

biológicos desses dois compostos, principalmente sobre sua possível atividade mutagênica.

Em alguns dos estudos descritos acima, a fissiona foi considerada mutagênica em linhagem

TA1537 de Salmonella após metabolização, não mutagênica nas linhagens TA100, TA98 e

TA2638 na ausência e presença de metabolização, citotóxica em células L5178Y quando em

altas concentrações e ativa contra danos induzidos por 4-nitroquinolina-1-óxido (NQO) no

ensaio SOS cromoteste em E. coli (KRIVOBOK et al., 1992; MUELLER et al, 1999; LEE et

al., 2005).

Outro grupo de compostos identificados nos extratos da Coccoloba são os triterpenos,

que pertencem à classe de hidrocarbonetos denominada terpenos ou terpenóides e está

presente em inúmeras famílias do reino vegetal. Os terpenóides, geralmente presente como

óleos voláteis, constituem uma grande variedade de substâncias vegetais, sendo esse termo

empregado para designar as substâncias derivadas de unidades do isopreno (SIMÕES &

SPITZER, 2004).

Várias atividades têm sido atribuídas para as diversas classes de terpenos: analgésica

(VILLASEÑOR et al., 2004), antifúngica (ABAD et al., 2007), antibactericida (VALENTE et

al., 2004), antioxidante (ASSIMOPOULOU et al., 2005), antiinflamatória e anti-hepatotóxica

(AHMED et al., 2006), anti-malárico (CUNHA et al., 2003), entre outros. Grande número de

estudos tem sido realizado para investigação dos efeitos e mecanismos de ação do ácido

ursólico e oleanólico devido aos muitos efeitos atribuídos a estes, mas principalmente devido

ao seu potencial anti-tumoral e quimioprotetor (OVESNÁ et al., 2004). A taraxerona, o

triterpeno identificado no extrato obtido das folhas de C. mollis, geralmente é citada nos

trabalhos científicos como resultado do isolamento e identificação fitoquímica de extratos de

plantas medicinais. Por exemplo, SETZER et al. (2000) identificaram diversos triterpenos no

extrato de Alchornea latifolia, dentre eles a taraxerona e uma forma modificada desta

molécula (3,4-seco-taraxerona), a qual mostrou-se citotóxica às células HepG2,

aparentemente por inibição da topoisomerase II.

2. Justifica

2. Justifica2. Justifica

2. Justificativa

tivativa

tiva

A exposição do homem a agentes mutagênicos tem aumentado consideravelmente

desde a revolução industrial, principalmente devido ao aumento de poluentes lançados no

meio ambiente, e pela modificação dos hábitos alimentares.

A interação desses agentes aliada à suscetibilidade genética de cada indivíduo

apresenta-se como um fator importante na indução de mutações no DNA. Portanto, conhecer

os processos mutacionais e os fatores que os induzem possibilita administrar e contribuiu para

a diminuição dos riscos dos efeitos indesejados decorrentes das mutações: malformações

congênitas, envelhecimento celular e orgânico, câncer, bem como doenças crônico-

degenerativas.

Outro aspecto importante da Pesquisa em Produtos Naturais é que esta influencia

diretamente a sociedade em muitos domínios. Ainda, contribui com a investigação científica

das plantas medicinais tradicionalmente utilizadas pela população e ajuda a levantar

informações que, futuramente, poderão contribuir para o registro e validação dos

fitoterápicos, garantindo assim maior segurança aos seus usuários. Além disso, os estudos

nesta área também são importantes para o desenvolvimento dos fitomedicamentos nacionais,

tendo, portanto, um impacto positivo na economia das nações, especialmente naquelas

consideradas países em desenvolvimento.

3. Objetivos

3. Objetivos3. Objetivos

3. Objetivos

3.1. Objetivos Gerais

Avaliar a citotoxicidade, mutagenicidade e potencial de indução de apoptose dos

extratos etanólicos de folha (EF) e raiz (ER) da planta medicinal Coccoloba mollis Casar.

(Polygonaceae) em sistemas-teste in vitro e in vivo utilizando-se os seguintes ensaios:

Salmonella/microssoma (teste de Ames), ensaio do cometa, teste do micronúcleo, ensaio de

citotoxicidade (MTT) e ensaio de detecção de apoptose in situ.

3.2. Objetivos Específicos

• Avaliar, através do ensaio de citotoxicidade MTT, o efeito citotóxico dos

extratos etanólicos de folha e raiz da Cocoloba mollis em células HTC e

determinar as concentrações dos EF e ER a serem utilizadas nos experimentos

de genotoxicidade e mutagenicidade in vitro.

• Investigar, in vitro, a taxa de revertentes/placa das linhagens TA98 e TA100 de

Salmonella typhimurium na ausência e presença de metabolização exógena

(fração S9) após tratamento realizado com os extratos etanólicos de folha e raiz

da Cocoloba mollis.

• Investigar, in vitro, o potencial de indução da apoptose pelo tratamento das

células HTC com os extratos etanólicos de folha e raiz da Cocoloba mollis

através da análise do padrão de fragmentação do DNA nuclear após coloração

com acridina orange.

• Investigar, in vitro, a indução de cometas e micronúcleos (ensaio do

micronúcleo com bloqueio de citocinese) pelo tratamento das células HTC com

os extratos etanólicos de folha e raiz da Cocoloba mollis.

• Investigar, in vivo, o potencial de indução de cometas e micronúcleos (em

células de sangue periférico) do tratamento com os extratos etanólicos de folha

e raiz da Cocoloba mollis, em camundongos Swiss machos.

4. Artigo 1

4. Artigo 14. Artigo 1

4. Artigo 1

Artigo a ser submetido ao Periódico Toxicology in vitro

Avaliação in vitro da atividade mutagênica dos extratos de folha e raiz da planta

medicinal Coccoloba mollis (Polygonaceae).

M.S. Tsuboy

, J.C. Marcarini

, D.T. Ferreira

; M.S. Mantovani

Departamento de Biologia Geral, Universidade Estadual de Londrina, Londrina, PR, Brasil.

Departamento de Química, Universidade Estadual de Londrina, Londrina, PR, Brasil.

* Dr. M. S. Mantovani

Departamento de Biologia Geral – CCB

Universidade Estadual de Londrina – Campus Universitário

P.O. Box 6001, Londrina, Paraná, Brazil.

CEP: 86051-990

e-mail: [email protected]

Phone: 55 43 3371-4977

Fax: 55 43 3371-4207

RESUMO

A Coccoloba mollis é uma planta medicinal usada popularmente como fitoterápico em casos

de falta de memória, estresse, insônia, anemias, queda de visão e impotência sexual, porém a

pesquisa bibliográfica realizada até o momento aponta ausência de estudos científicos sobre

os efeitos biológicos da espécie, principalmente os referentes a indução de danos no DNA. O

presente trabalho teve por objetivo avaliar, in vitro (células hepáticas - HTC), a

citotoxicidade, mutagenicidade e indução de apoptose dos extratos etanólicos de folha e raiz

da C. mollis. Os resultados mostraram que as concentrações do extrato obtido da raiz de C.

mollis são mais citotóxicas que as obtidas a partir de suas folhas, sendo a redução da

viabilidade celular observada no ensaio MTT resultante, pelo menos em parte, da indução de

apoptose. Ambos os extratos mostraram-se indutores de danos no DNA na concentração de

20µg/mL no ensaio Cometa, entretanto, não foi detectada mutagenicidade em nenhum dos

tratamentos realizados no ensaio do Micronúcleo.

Keywords: herbal extract; Coccoloba mollis; HTC; citotoxicity; mutagenicity; apoptosis.

1. Introdução

As plantas medicinais constituem uma fonte de matéria bruta para a medicina

tradicional e moderna (BANDARANAYAKE, 2006). Atualmente, elas são empregadas

mundialmente como remédios caseiros, podem ser vendidas diretamente ao consumidor sem

receita médica, e ainda, fornecem compostos para a indústria farmacêutica. Em 1985,

FARNSWORTH et al. mostraram que 25% de todos os medicamentos prescritos aos

americanos entre os anos de 1959 e 1980 eram derivados das plantas. No Brasil, as plantas

medicinais são amplamente utilizadas na área rural e urbana (RATES, 2001), porém, pouco é

conhecido e registrado sobre a cultura popular envolvendo as plantas medicinais (GURIB-

FAKIM, 2006).

O interesse da população e comunidade científica em torno dos benefícios trazidos

pelos produtos naturais ou por seus componentes ativos tem aumentado nas últimas décadas

(CALAPAI & CAPUTI, 2007). Triagens em larga escala com extratos de plantas medicinais

já identificaram inúmeros fitocompostos benéficos à saúde humana (MUSARRAT, 2006),

porém fatores como a falta de fiscalização e interações com outras drogas pode resultar em

efeitos adversos (PHILLIPSON, 2007). Por isso, especial atenção deve ser dada à avaliação

da segurança, efetividade e qualidade dos produtos naturais, sendo a avaliação da

genotoxicidade/mutagenicidade dos agentes terapêuticos naturais, recomendada por órgãos

regulatórios nacionais e internacionais (CNS, RESOLUÇÃO Nº 251/97; OECD, 2001).

A Coccoloba mollis Casar. (Polygonaceae) é uma espécie que está sendo receitada

como fitoterápico com o nome de “Erva da memória”. A espécie, popularmente conhecida

como folha-de-bôlo ou falso-novateiro, possui porte arbóreo com 4-12m de altura e ocorre em

cerradões e mata semidecídua da bacia do Paraná, na região centro-sul do Brasil (LORENZI,

2002). O insumo desta planta tem sido relatado como benéfico nos casos de falta de memória,

estresse, insônia, anemias, queda de visão e impotência sexual. As espécies deste gênero têm

sido utilizadas pela população brasileira como adstringente, no tratamento da febre, diarréia,

gonorréia, hemorróidas, problemas menstruais e hemorragias uterinas (MORS et al., 2000;

COTA et al., 2003), porém ainda são pouco estudadas, não existindo literatura científica até o

presente momento sobre os efeitos biológicos que estas espécies possam ter em sistemas in

vitro e in vivo. Em vista disso, o presente trabalho tem por objetivo avaliar a citotoxicidade,

mutagenicidade e indução de apoptose dos extratos etanólicos de folha e raiz da Coccoloba

mollis em sistema-teste in vitro (células HTC), visando contribuir com a investigação

científica das plantas medicinais tradicionalmente utilizadas pela população.

2. Materiais e Métodos

2.1. Extratos da Coccoloba mollis

Para o preparo dos extratos, as folhas e raízes da C. mollis foram submetidas à

extração exaustiva com etanol e as soluções obtidas foram concentradas em evaporador

rotatório produzindo os respectivos extratos.

Para o uso em cultura, cada um dos extratos brutos foi dissolvido em DMSO

(Dimetilsulfóxido) e PBS (Phosphate Buffer Saline) ou meio de cultura DMEM/F12 (Gibco)

sem soro (no ensaio MTT), sendo que a concentração de DMSO não ultrapassou 10% do

volume total da solução mãe a ser preparada. Após, os mesmos foram filtrados e esterilizados

utilizando-se uma unidade filtrante descartável de 22 µm de porosidade (Millex

- Millipore).

As concentrações dos extratos de folha (EF) e raiz (ER) testadas no Ensaio do MTT

foram as seguintes: 0,2 µg/mL; 2 µg/mL; 20 µg/mL; 200 µg/mL; 2000 µg/mL de meio de

cultura.

Para avaliação da genotoxicidade (ensaio Cometa) e mutagenicidade (ensaio do

micronúcleo) foram utilizadas três concentrações definidas pelo MTT.

2.2. Agentes indutores de dano no DNA

Os agentes indutores de dano no DNA empregados para controle positivo dos

experimentos foram os seguintes: benzo[a]pireno (CAS 50-32-8; Fluka) e cisplatina (CAS

15663-27-1; Sigma Aldrich). Para a indução de danos nos ensaios do Cometa e Micronúcleo

foi utilizado benzo[a]pireno em concentração final de 25 µg/mL de meio de cultura, por 24 h

e 26 h respectivamente. No teste de avaliação da indução de apoptose, a cisplatina foi

utilizada em concentração final de 20 µM por 24 horas.

2.3. Linhagem celular

As células HTC (proficientes em metabolização) foram adquiridas no Banco de

Células do Rio de Janeiro (UFRJ), Brasil. Estas foram cultivadas em estufa BOD a 37ºC em

frascos de cultura de 25 cm

contendo 5 mL de meio DMEM/F12 (Gibco) suplementado com

10% de soro bovino fetal (Gibco) e antibiótico/antimicótico. Para conduzir os testes de

genotoxicidade e mutagenicidade, foram semeadas aproximadamente 10

células por frasco

de cultura experimental. Nos experimentos para avaliação da indução de apoptose, as células

(aproximadamente 2,5 x 10

)

foram cultivadas em lamínula de 20 x 20 mm de tamanho em

tubos de cultura de 10 cm

de superfície contendo 3 mL de meio de cultura.

2.4. Ensaio de citotoxicidade MTT

O ensaio de citotoxicidade foi realizado de acordo com o protocolo descrito por

MOSMANN (1983) com algumas modificações. Em cada um dos poços da placa de cultivo

celular foram semeadas aproximadamente 2,5 x 10

células HTC. Estas foram expostas ao

tratamento com os extratos por 24, 48 e 72 horas. Ao final deste período, as células foram

incubadas com MTT (CAS 298-93-1; Sigma Aldrich; 0,005g de MTT; 5 mL de PBS; 10 mL

de meio de cultura sem soro) por 4h. A leitura foi realizada em espectrofotômetro de leitor de

placas (Uniscience) a 550 nm.

2.5. Ensaio do Cometa (SCGE)

O teste do Cometa foi realizado de acordo com as premissas de TICE et al., 2000.

Brevemente, após 24 horas de tratamento das células HTC com o agente indutor de danos ou

com EF e ER (concentrações citadas no item 2.1), as células foram tripsinizadas (500 µL de

tripsina-EDTA 0,025%; 37ºC), a suspensão celular centrifugada (5 minutos, 1000 rpm) e

ressuspendida em 500 µL de meio de cultura. Em seguida, esta recebeu 120 µL de agarose

baixo ponto de fusão (LMP – 0,5%), sendo este material depositado em lâminas pré-

gelatinizadas (agarose de ponto de fusão normal; 1,5%) e levadas para solução de lise por

pelo menos 1h. Após desnaturação (20 minutos) e eletroforese alcalinas (25 V, 300 mA, 20

minutos), as lâminas foram neutralizadas, fixadas e mantidas sob refrigeração até o momento

da análise. A coloração das lâminas foi feita com de brometo de etídeo e a análise foi feita

visualmente (KOBAYASHI, 1995) em microscopia de fluorescência (filtro de excitação de

420-490 nm e filtro de barreira de 520 nm) e aumento de 400x. Os cometas foram

classificados em: classe 0 – nucleóides que não apresentam cauda; classe 1 – nucleóides com

cauda menor que o diâmetro do nucleóide; classe 2 – nucleóides com cauda de tamanho entre

1 a 2 vezes o diâmetro do nucleóide; classe 3 – nucleóides com cauda 2 vezes maior que o

diâmetro do nucleóide. Os experimentos foram feitos em triplicata, sendo analisadas 300

células por tratamento. A análise da viabilidade celular foi realizada pelo método de exclusão

por azul de trypan, sendo considerados somente os tratamentos com índice superior a 80%.

2.6. Teste do Micronúcleo com bloqueio de citocinese (MNCtB)

A avaliação da mutagenicidade dos EF e ER da Coccoloba mollis ocorreu após 26h de

exposição das células aos extratos e à citocalasina-B (3 µg/mL). A colheita das células foi

feita de acordo com o protocolo de OLIVEIRA (2002). Resumidamente, as células foram

tripsinizadas (500 µL de tripsina-EDTA 0,025%; 37ºC), centrifugadas (5 minutos, 1000 rpm),

hipotonizadas (citrato de sódio 1%) e fixadas (3metanol: 1ácido acético). Os experimentos

foram feitos em triplicata e três mil células binucleadas foram analisadas por tratamento. Os

critérios de seleção das células binucleadas, de identificação do micronúcleo e o cálculo do

índice de divisão nuclear (IDN) seguiu o descrito por FENECH, 2000.

2.7. Teste para avaliação da indução de apoptose in situ

A identificação das células apoptóticas foi feita por análise do padrão de fragmentação

do DNA nuclear após coloração com acridina orange. Neste ensaio, o tratamento das células

foi realizado posteriormente a sua estabilização em cultura (24h), com as concentrações de EF

e ER previamente testadas no SCGE e no MNCtB, além da concentração de 200 µg/mL. Após

as 24h de tratamento, a colheita foi feita de acordo com o descrito por ROVOZZO, 1973.

Brevemente, após lavagem com PBS, a lamínula é retirada do tubo de cultura e fixada em

fixador de Carnoy por 5 minutos. A lamínula é então mergulhada rapidamente em cada uma

das placas contendo concentrações decrescentes de etanol (95% a 25%), seguida de lavagem

com Tampão McIlvaine por 5 minutos, coloração com acridina orange (0,01%, 5 minutos) e

nova lavagem com o tampão. Os experimentos foram feitos em triplicata e 1500 células foram

analisadas por tratamento.

2.8. Análise Estatística

Os dados obtidos no teste de citotoxicidade MTT foram submetidos à análise de

variância (ANOVA) seguida de Teste de Tukey. Para análise dos dados obtidos no SCGE, no

MNCtB, na análise do IDN e no teste de avaliação da indução de apoptose foi utilizado o

Teste-t de Student em comparação feita com o controle negativo. Em todos os testes foi

considerado α = 0,05. As análises foram realizadas com auxílio do programa GrafPad Instat

versão 3.02.

3. Resultados

3.1. Ensaio de citotoxicidade MTT

As Figuras 1 e 2 mostram os resultados obtidos no teste MTT. A análise dos dados

revelou que somente concentrações a partir de 2000 µg/mL do EF são citotóxicas às células

HTC. Para o ER, concentrações a partir de 200 µg/mL já se apresentaram citotóxicas.

3.2. Ensaio do Cometa (SCGE)

Podemos observar na Figura 3 que, além do tratamento com benzo[a]pireno, somente

a exposição das células à EF e ER na maior concentração testada (20 µg/mL) foi capaz de

aumentar a indução de cometas de maneira estatisticamente significativa. Pode-se notar ainda,

pelos valores do escore médio, que o tratamento com os extratos, induziu a formação de

cometas pertencentes somente à classe 1, enquanto que no controle positivo, os cometas

resultantes se distribuíram entre as classes 1 e 2 (dados não apresentados). A viabilidade

celular permaneceu em torno de 90% em todos os tratamentos (Figura 3).

3.3. Teste do Micronúcleo com bloqueio de citocinese (MNCtB)

Os resultados obtidos no MNCtB revelaram que não houve aumento estatisticamente

significativo no número de células binucleadas micronucleadas ou tratamentos com índeice de

divisão nuclear (IDN) estatisticamente diferente frente à exposição das células com os EF e

ER. Houve somente uma diferença estatisticamente significativa no número de células

binucleadas com micronúcleo nas culturas tratadas com a menor concentração (0,2 µg/mL) de

ambos os extratos (Figura 4).

3.4. Teste para avaliação da indução de apoptose in situ

Podemos observar na Figura 5 que à medida que as concentrações de ambos os

extratos aumentam mais células entram em apoptose (r = 0,966 para ER e r = 0,885 para EF),

sendo o resultado obtido na maior concentração EF e ER empregada (200 µg/mL)

estatisticamente significativo em relação ao controle negativo.

4. Discussão

O ensaio MTT é um dos mais empregados e mais sensíveis testes para a detecção de

citotoxicidade in vitro (FOTAKIS & TIMBRELL, 2006). Testes como este, apresentam

vantagens como sua rapidez e precisão (MOSMANN, 1983). Dentre os testes mais

empregados e amplamente aceitos para investigação de substâncias que causam dano genético

estão o ensaio do cometa (WITTE et al., 2007; BURLINSON et al., 2007); e o teste do

micronúcleo (FENECH, 1999; KRISHNA & HAYASHI, 2000). Segundo WASSON et al.

(2008), o ensaio do Cometa, além de ser um teste simples, barato e rápido para a avaliação de

danos e reparo do DNA, consiste em um biomarcador ideal para o estudo dos efeitos da

nutrição sobre o câncer, e vem sendo extensivamente empregado em estudos de avaliação de

compostos naturais. A agência norte-americana Food and Drug Administration recomenda

que seja feito um teste citogenético em células de mamíferos, entre outros, para a

compreensão da genotoxicidade/mutagenicidade de seu objeto de estudo (FDA, 1997).

Portanto, o MNCtB aqui realizado, em células de hepatoma de Rattus novergicus, atende essa

exigência. Além disso, linhagens celulares hepáticas, tais como HTC, HepG2 e culturas

primárias de hepatócitos são importantes ferramentas em estudos de genotoxicidade e

mutagenicidade, uma vez que o fígado é o principal sítio de metabolização de xenobióticos

(MERSH-SUNDERMANN et al., 2004).

Os resultados obtidos com os testes de genotoxicidade e mutagenicidade dos extratos

etanólicos de folha e raiz da Coccoloba mollis, nas condições experimentais descritas

anteriormente, apontam genotoxicidade apenas na maior concentração testada e ausência de

mutagenicidade. Pela análise do IDN, podemos dizer que esta ausência de mutagenicidade ou

a redução das células binucleadas micronucleadas encontrada em EF1 e ER1 em relação ao

controle, não pode explicada pelo atraso da divisão celular, uma vez que o IDN foi

semelhante em todos os tratamentos (Figura 4) e a formação do micronúcleo é dependente do

ciclo celular (FENECH 2006; MATEUCA et al., 2006). Segundo ZEIGER (2007) a resposta

obtida em EF1 e ER1 poderia ser considerada como antimutagênica, uma vez que os danos

observados neste tratamento foram menores que a frequência de danos basais (ou seja, aquela

observada no controle) e que este não apresentou evidências de citotoxicidade. Com relação a

EF3 e ER3, observamos que estes tratamentos foram genotóxicos, porém não mutagênicos. O

aumento não significativo na freqüência de micronúcleos nesta concentração pode ser em

parte devido à ação do sistema de reparo de danos no DNA, uma vez que os danos induzidos

foram pequenos (somente cometas de classe 1), provavelmente desaparecendo durante o ciclo

celular e impedindo sua visualização na forma de micronúcleo.

Em recente estudo, ainda não finalizado, sobre os constituintes químicos presentes nos

extratos etanólicos de folha e raiz da Coccoloba mollis aqui testados, duas antraquinonas

foram isoladas do ER (emodina e fissiona), enquanto que hidrocarbonetos, ésteres de cadeia

longa e o triterpeno 3-taraxerona foram caracterizados no EF (de BARROS et al., 2007).

As antraquinonas são compostos ativos de muitas drogas derivadas de plantas,

principalmente as laxativas, e ocorrem em membros de diversas famílias do reino vegetal,

inclusive na família Polygonaceae (WINKER & SHIMMER, 2000). A emodina é o principal

composto ativo presente em várias espécies medicinais e exibe atividades biológicas tais

como antiinflamatória, antibiótica, antiviral, imunossupressora, hepatoprotetora (COS et al.,

2002; JING et al., 2002), além de inibir a proliferação de uma grande variedade de linhagens

celulares tumorais (KUO et al., 1997; OLSEN et al., 2007). Alguns estudos relatam também a

atividade tranqüilizante de extratos derivados de plantas da família Polygonaceae (GOSH et

al., 2002), além do efeito protetor da emodina frente a distúrbios cerebrais (GU et al., 2000) e

na consolidação da memória (LU et al., 2007), fundamentando assim o uso da Coccoloba

mollis como modulador da memória e tranqüilizante.

Quanto à investigação da atividade genotóxica/mutagênica das antraquinonas, mais

especificamente da emodina e fissiona, pouco ainda é descrito na literatura. MUELLER e seus

colaboradores atribuem atividade genotóxica à emodina (MUELLER et al., 1998; MUELLER

& STOPPER, 1999; MUELLER et al, 1999), outros sugerem que ela seja antimutagênica

(SUN et al., 2000; LEE et al., 2005). Segundo GO et al. (2007), a razão para os efeitos

variados encontrados para a emodina ainda não está clara, não havendo, portanto, consenso

sobre a mutagenicidade desta antraquinona nos estudos realizados.

De acordo com os estudos realizados por MUELLER e colaboradores (MUELLER et

al., 1998; MUELLER & STOPPER, 1999; MUELLER et al, 1999), a mutagenicidade

apresentada pela emodina pode ser explicada pela formação de metabólitos mais ativos (2-

hidroxiemodina) na indução de danos via CYP1A2 e CYP2B ou pela inibição da

topoisomerase II devido a capacidade da emodina (que possui estrutura planar) de se

intercalar ao DNA. A antimutagenicidade frente ao Trp-P-2 observada por SUN et al. (2000)

seria devido à inibição de CYP1A1 pela emodina, promovida pela interação de certa região da

sua estrutura com a enzima, impedindo assim a N-hidroxilação do agente indutor de danos. A

emodina apresentou também atividade antimutagênica nas linhagens de Salmonella TA98 e

TA100 e Escherichia coli PQ37 no trabalho realizado por LEE et al., 2005. Ainda segundo

estes pesquisadores, o grupo hidroxila (-OH) presente no carbono 6 (C6) desta antraquinona

pode ter importante papel na citotoxicidade verificada nas diferentes linhagens tumorais que

foram utilizadas no estudo. Estes mesmos estudos mostram ainda que a emodina apresenta

maior atividade citotóxica e antimutagênica que a fissiona, esta por sua vez, não genotóxica e

citotóxica apenas em altas concentrações (MUELLER et al, 1999).

A fissiona, outra antraquinona identificada em ER, foi considerada mutagênica em

linhagem TA1537 de Salmonella após metabolização, não mutagênica nas linhagens TA100,

TA98 e TA2638 na ausência e presença de metabolização, citotóxica em células L5178Y

quando em altas concentrações e ativa contra danos induzidos por 4-nitroquinolina-1-óxido

(NQO) no ensaio SOS cromoteste em E. coli (KRIVOBOK et al., 1992; MUELLER et al,

1999; LEE et al., 2005).

Outra atividade bastante relatada na literatura sobre a emodina é sua capacidade de

indução da apoptose (SHIEH et al., 2004; YANG et al., 2004; WANG et al., 2007; ZONG-

YAN et al., 2007). Segundo OLSEN et al. (2007), este talvez seja o principal mecanismo pela

qual ela exerce o efeito anti-proliferativo nas células tumorais.

Os resultados experimentais obtidos em nosso estudo demonstram que o ER apresenta

maior toxicidade que o EF, provavelmente devido à presença da emodina. Os dados obtidos

no teste para detecção da apoptose indicam que a redução das células viáveis encontrada no

ensaio MTT, é em parte resultante da indução da apoptose nas células HTC, uma vez que EF4

e ER4 apresentaram maior número de células apoptóticas. Os resultados de ER3 no MNCtB e

no teste de indução de apoptose in situ, apesar de não significativos estatisticamente, podem

sugerir também que pode estar havendo uma maior indução de apoptose do que a detectada

pelo teste in situ, uma vez que a fragmentação do DNA nuclear é um evento tardio do

processo de apoptose (ELMORE, 2007), porém sem comprometimento da formação de

micronúcleos (IDN não significativo).

Com relação aos experimentos com o EF é difícil afirmarmos ou mesmo sugerir a

razão destes resultados, uma vez que pouco se sabe sobre sua composição. Talvez o triterpeno

identificado possa contribuir para a citotoxicidade encontrada, pois sabe-se que outros

triterpenos (ácido ursólico e oleanólico) possuem efeito anti-tumoral (OVESNÁ et al., 2004)

e que uma forma modificada da 3-taraxerona (3,4-seco-taraxerona), apresentou atividade

citotóxica às células HepG2 (SETZER et al., 2000).

Nosso estudo é o primeiro a investigar a possível mutagenicidade dos extratos da

Coccoloba mollis. Tais resultados podem contribuir para o registro e validação deste

fitoterápico, proporcionando assim, uma maior segurança para os usuários desta planta

medicinal.

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Citotoxicidade EF de

C. mollis

***

0,5

1,5

2,5

Controle 0.2 µg/mL 2.0 µg/mL 20 µg/mL 200 µg/mL 2000 µg/mL

Absorbância cia

24H 48H 72H

Figura 1. Absorbância média observada no Ensaio MTT após tratamento de 24, 48 e 72 horas

com o extrato etanólico da folha (EF) de C. mollis.

** Diferença estatisticamente significativa em relação ao controle negativo (p < 0,01)

*** Diferença estatisticamente significativa em relação ao controle negativo (p < 0,001)

Citotoxicidade ER de

C. mollis

***

0,5

1,5

2,5

Controle 0.2 µg/mL 2.0 µg/mL 20 µg/mL 200 µg/mL 2000 µg/mL

Absorbância cia

24H 48H 72H

Figura 2. Absorbância média observada no Ensaio MTT após tratamento de 24, 48 e 72 horas

com o extrato etanólico da raiz (ER) de C. mollis.

** Diferença estatisticamente significativa em relação ao controle negativo (p < 0,01)

*** Diferença estatisticamente significativa em relação ao controle negativo (p < 0,001)

Genotoxicidade

in vitro

dos extratos de

C. mollis

22,0

21,66

12,0

28,33

9,0

***

100,66

6,33

24,66

100

120

Controle B[a]P ER1 ER2 ER3 EF1 EF2 EF3

Tratamentos

Escore Médio o

100

Viabilidade

Celular (%)

Figura 03. Escore médio de cometas observado em células HTC (barras) e viabilidade celular

(%) (linha) encontrada após tratamento de 24 horas com os extratos de C. mollis. B[a]P.:

Benzo[a]pireno – 25 µg/mL; ER1: 0,2 µg/mL; ER2: 2,0 µg/mL; ER3: 20 µg/mL; EF1: 0,2

µg/mL; EF2: 2,0 µg/mL; EF3: 20 µg/mL ER = Extrato etanólico da raiz da C. mollis; EF =

Extrato etanólico da folha da C. mollis. Média de três culturas; 100 células avaliadas em cada

cultura para análise dos cometas.

*p = 0,0382 ; **p = 0,0057 ; ***p = 0,0001.

Mutagenicidade

in vitro

dos extratos de

C.mollis

8,33

4,33

3,0

8,0

5,33

2,66

15,33

5,66

Controle B[a]P ER1 ER2 ER3 EF1 EF2 EF3

Tratamentos

fi MN

1,6

1,65

1,7

1,75

1,8

1,85

IDN

Figura 04. Freqüência média de células binucleadas com micronúcleo (barras) e Índice de

Divisão Nuclear (IDN) (linha) encontrado após tratamento de 26 horas com os extratos de C.

mollis. B[a]P.: Benzo[a]pireno – 25 µg/mL; ER1: 0,2 µg/mL; ER2: 2,0 µg/mL; ER3: 20

µg/mL; EF1: 0,2 µg/mL; EF2: 2,0 µg/mL; EF3: 20 µg/mL ER = Extrato etanólico da raiz

da C. mollis; EF = Extrato etanólico da folha da C. mollis. Média de três culturas; 1000

células binucleadas contabilizadas em cada cultura para análise da freqüência de

micronúcleos e 500 células avaliadas por cultura para análise do IDN.

# p = 0,0031; ## p = 0,0161; ** p = 0,0093.

Análise Indução de Apoptose

1,33

10,33

11,0*

7,33

5,0

2,66

26,0*

3,33

12,33*

1,0

Controle Cispl. ER1 ER2 ER3 ER4 EF1 EF2 EF3 EF4

Tratamento

Células apoptóticasas

Figura 05. Freqüência média de células apoptóticas encontradas após tratamento de 24 horas

com os extratos de C. mollis. Cispl.: Cisplatina 20µM; ER1: 0,2 µg/mL; ER2: 2,0 µg/mL;

ER3: 20 µg/mL; ER4: 200 µg/mL; EF1: 0,2 µg/mL; EF2: 2,0 µg/mL; EF3: 20 µg/mL;

EF4: 200 µg/mL. ER = Extrato etanólico da raiz da C. mollis; EF = Extrato etanólico da

folha da C. mollis. Média de três culturas; análise de 500 células por cultura.

*p (C.pos) = 0,0175 *p (ER4) = 0,0107; *p (EF4) = 0,0036.

5. Artigo 2

5. Artigo 25. Artigo 2

5. Artigo 2

Artigo a ser submetido ao Periódico Archives of Toxicology

Investigação da mutagenicidade dos extratos etanólicos de folha e raiz da planta

medicinal Coccoloba mollis (Polygonaceae) no ensaio Salmonella/microssoma e

testes in vivo.

Marcela S. Tsuboy

, Juliana C. Marcarini

, Dalva T. Ferreira

, Elisa R. A. Ferraz

, Farah M.

D. Chequer

, Danielle P. de Oliveira

, Mário S. Mantovani

Departamento de Biologia Geral, Universidade Estadual de Londrina, Londrina, PR, Brasil.

Departamento de Química, Universidade Estadual de Londrina, Londrina, PR, Brasil.

Departamento de Análises Clínicas, Toxicológicas e Bromatológicas, Faculdade de Ciências

Farmacêuticas de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, SP, Brasil.

* Dr. M. S. Mantovani

Departamento de Biologia Geral – CCB

Universidade Estadual de Londrina – Campus Universitário

P.O. Box 6001, Londrina, Paraná, Brazil.

CEP: 86051-990

e-mail: [email protected]

Phone: 55 43 3371-4977

Fax: 55 43 3371-4207

RESUMO

O uso das plantas medicinais pela população é uma prática antiga e ainda bastante difundida,

o que faz com que estudos sobre sua possível atividade genotóxica/mutagênica sejam

essenciais. A Coccoloba mollis é uma espécie que está sendo receitada como fitoterápico,

principalmente em casos de falta de memória e estresse. Para a investigação de seu potencial

mutagênico, os extratos etanólicos de folha e raiz foram submetidos ao ensaio

Salmonella/microssoma e aos testes do cometa e micronúcleo in vivo. Somente o extrato da

folha foi capaz de induzir danos no DNA da linhagem TA98 na ausência de S9 na maior

concentração testada, embora em potência mutagênica muito baixa. Os tratamentos realizados

nos camundongos Swiss também não induziram aumento estatisticamente significativo de

danos no DNA. Os dados obtidos demonstram pela primeira vez que os extratos de folha e

raiz da Coccoloba mollis, nas condições experimentais descritas, não apresentam

mutagenicidade.

Keywords: medicinal plant, Coccoloba mollis, Ames test, in vivo mutagenicity.

1. Introdução

O uso das plantas com fins medicinais é uma das formas mais antigas de prática

medicinal da humanidade. Além de esta prática ser importante nos cuidados de saúde

primários da população menos favorecida dos países em desenvolvimento, a procura pelos

medicamentos de origem natural nos países desenvolvidos tem aumentado consideravelmente

nas últimas décadas (WHO 2000). Por isso, especial atenção deve ser dada à avaliação da

segurança, efetividade e qualidade dos produtos naturais, sendo a avaliação da

genotoxicidade/mutagenicidade dos agentes terapêuticos naturais, recomendada por órgãos

regulatórios nacionais e internacionais (CNS 1997; OECD 2001).

Embora exista comprovação científica de inúmeros benefícios trazidos pelas plantas

medicinais, seu uso pela população deve ser realizado de maneira cautelosa. Efeitos adversos

podem surgir devido à toxicidade intrínseca, à adulteração, substituição, contaminação,

identificação errônea do material vegetal, falta de fiscalização e interações com outras drogas

(Rates 2001; Zhou et al. 2004).

A Coccoloba mollis Casar. (Polygonaceae) é uma espécie que está sendo receitada

como fitoterápico com o nome de “Erva da memória”. O insumo desta planta tem sido

relatado como benéfico nos casos de falta de memória, estresse, insônia, anemias, queda de

visão e impotência sexual. A espécie é popularmente conhecida como folha-de-bolo ou falso-

novateiro e ocorre em cerradões e mata semidecídua da bacia do Paraná, na região centro-sul

do Brasil (Lorenzi 2002). As espécies do gênero Coccoloba têm sido utilizadas pela

população brasileira como adstringente, no tratamento da febre, diarréia, gonorréia,

hemorróidas, problemas menstruais e hemorragias uterinas (Mors et al. 2000; Cota et al.

2003), porém ainda são pouco estudas, não existindo literatura até o presente momento sobre

os efeitos biológicos que estas espécies possam ter em sistemas in vitro e in vivo.

Considerando a falta de estudos envolvendo o gênero Coccoloba e a importância da avaliação

científica das plantas medicinais popularmente utilizadas, o presente trabalho tem por objetivo

analisar a genotoxicidade/mutagenicidade dos extratos etanólicos de folha e raiz da

Coccoloba mollis através do ensaio Salmonella/microssoma (Teste de Ames) e em sistema-

teste in vivo utilizando os testes do cometa e micronúcleo.

2. Materiais e Métodos

Extratos da Coccoloba mollis

As folhas e raízes da C. mollis foram submetidas à extração exaustiva com etanol e as

soluções obtidas foram concentradas em evaporador rotatório produzindo os respectivos

extratos, extrato etanólico da folha de C. mollis (EF) e extrato etanólico da raiz de C. mollis

(ER).

No ensaio de mutagenicidade com Salmonella/microssoma, os extratos foram

ressuspendidos em dimetilsulfóxido (DMSO), obedecendo ao limite de concentração

recomendado pela literatura (Mortelmans e Zeiger 2000; SBMCTA, 2004). De acordo com

essa recomendação, substâncias puras ou extratos devem ser testados até uma dose máxima de

5 mg/placa ou até seus respectivos limites de dissolução. Sendo assim, o ER foi testado na

concentração de 5 mg/placa e o EF teve menor poder de dissolução, sendo a dose máxima de

3 mg/placa. Primeiramente o ensaio foi feito com cinco doses seguindo uma escala

logarítmica a fim de visualizar a faixa de mutagenicidade caso esta se apresentasse. A partir

desse ensaio preliminar, novas doses foram escolhidas.

Para a administração aos animais experimentais, cada um dos extratos (EF e ER) foi

dissolvido em DMSO (Dimetilsulfóxido) e PBS (Phosphate Buffer Saline) sendo que a

concentração de DMSO não ultrapassou 10% do volume total da solução mãe a ser preparada.

Após, estas foram filtradas e esterilizadas utilizando-se uma unidade filtrante descartável de

22 µm de porosidade (Millex

- Millipore). A administração dos extratos aos animais ocorreu

via gavage.

Animais experimentais

Cinqüenta e seis camundongos Swiss (Mus musculus) machos, com aproximadamente

30g de massa corporal, foram distribuídos em grupos controle e grupos experimentais,

contendo sete animais por tratamento (totalizando oito grupos). Os mesmos foram mantidos

no Biotério de Pequenos Mamíferos do Departamento de Biologia Geral do Centro de

Ciências Biológicas da Universidade Estadual de Londrina (CCB/UEL), em condições de

temperatura (22 ± 2ºC) e umidade controladas (55 ± 10%), e 12 horas de ciclo claro/escuro.

Os animais receberam ração sólida e água ad libitum durante todo o período do experimento.

Protocolos experimentais e procedimentos para o Ensaio Salmonella/microssoma (Teste de

Ames)

O protocolo utilizado foi o da pré-incubação segundo Maron e Ames (1983) e

Mortelmans e Zeiger (2000), resumidamente: em tubos previamente esterilizados foram

colocados 100 µL de cultura de cada linhagem (10

células/mL), 100 µL da solução de cada

extrato em diferentes concentrações e 500 µL de tampão fosfato 0,2 M para o ensaio na

ausência de ativação metabólica ou o mesmo volume da mistura S9 para o ensaio na presença

de ativação metabólica. Os tubos foram homogeneizados e incubados a 37°C por 30 minutos.

Após esse tempo foram adicionados 2,0 mL de ágar de superfície, a mistura foi então

homogeneizada e vertida em placa de Petri com 20 mL de ágar mínimo. As placas foram

incubadas invertidas, por 66 horas em temperatura de 37°C (±0,5). O teste foi feito em

triplicata. Para este estudo foram escolhidas as linhagens TA98 e TA100, que detectam a

maioria dos compostos mutagênicos, sendo que a primeira detecta mutágenos que agem por

deslocamento do quadro de leitura do DNA e a segunda identifica substâncias que causam

substituição de pares de bases do material genético (Maron e Ames 1983).

DMSO foi usado como controle negativo. Como controle positivo nos testes sem S9

foi utilizado o 4-nitroquinolina-1-óxido (4NQO) em concentração de 0,5 µg/placa. Para os

testes realizados na presença de S9, o controle positivo foi o 2-aminoantraceno (2AA) em

concentração de 2,5 µg/placa.

Os resultados foram submetidos à análise estatística utilizando o programa Salanal,

um programa desenvolvido pelo Integrated Laboratory Systems, Research Triangle Park,

N.C. USA para análise estatística do teste de Ames, usando o modelo de Bernstein, que utiliza

tanto a ANOVA quanto a regressão linear para fornecer a potência mutagênica das amostras

analisadas (Bernstein et al. 1982; Umbuzeiro e Vargas 2003).

Protocolos experimentais e procedimentos para os Ensaios do Cometa e do Micronúcleo

Os animais experimentais foram distribuídos em oito grupos: (1) controle negativo; (2)

controle positivo (ciclofosfamida - 50 mg/Kg de peso corpóreo); (3/4) [EF1]/[ER1] (dose 1

dos EF e ER – 6,6x10

-3

mg/Kg de peso corpóreo); (5/6) [EF2]/[ER2] (dose 2 dos EF e ER –

6,6x10

-2

mg/Kg de peso corpóreo) e (7/8) [EF3]/[ER3] (dose 3 dos EF e ER – 6,6x10

-1

mg/Kg

de peso corpóreo).

Os camundongos do grupo 1 (controle negativo) receberam PBS via gavage e via

intraperitoneal. Aos animais do grupo 2 (controle positivo) foi administrado PBS via gavage e

ciclofosfamida (50 mg/Kg) intraperitonealmente. Os animais pertencentes aos grupos de

avaliação da genotoxicidade e mutagenicidade dos extratos (3 a 8) receberam EF ou ER

oralmente e PBS via intraperitoneal.

O teste do Cometa foi realizado de acordo com as premissas de Tice et al. 2000.

Para a realização do teste, 20 µL de sangue periférico foi coletado de cada animal por punção

da veia caudal após 24 horas de aplicação dos tratamentos. Este material foi homogeneizado

cuidadosamente com 120 µL de agarose de baixo ponto de fusão (LMP 0,5%) a 37ºC e

depositado sobre uma lâmina pré-gelatinizada. Em seguida, as lâminas foram levadas para

solução de lise por pelo menos 1h. Após desnaturação (20 minutos) e eletroforese alcalinas

(25V, 300mA, 20 minutos), as lâminas foram neutralizadas, fixadas e mantidas sob

refrigeração até o momento da análise. A coloração das lâminas foi feita com de brometo de

etídeo e a análise foi feita visualmente em microscopia de fluorescência (filtro de excitação de

420-490 nm e filtro de barreira de 520 nm), de acordo com Kobayashi 1995. Cem células

foram analisadas por lâmina/animal. Os cometas foram classificados em: classe 0 –

nucleóides que não apresentam cauda; classe 1 – nucleóides com cauda menor que o diâmetro

do nucleóide; classe 2 – nucleóides com cauda de tamanho entre 1 a 2 vezes o diâmetro do

nucleóide; classe 3 – nucleóides com cauda 2 vezes maior que o diâmetro do nucleóide.

Para o teste do micronúcleo, lâminas pré-coradas com laranja de acridina receberam

algumas gotas de sangue coletado pela veia caudal dos animais e foram rapidamente cobertas

com lamínula (Hayashi et al. 1990). Este procedimento foi feito depois de 48 horas da

aplicação dos tratamentos aos animais (de acordo com resultados do controle positivo de

nosso laboratório, onde o maior pico de indução de micronúcleos é encontrado). Foram

avaliados 2000 reticulócitos por lâmina/animal em microscopia de fluorescência.

Os dados obtidos nos experimentos in vivo foram submetidos à análise de variância

não paramétrica (Kruskall-Wallis) seguida de teste de Dunn, com α = 0,05 utilizando o

programa GrafPad Instat

versão 3.02.

3. Resultados

No teste de Ames os resultados sugerem que somente o EF apresentou resposta

mutagênica, mesmo assim, com uma potência muito baixa, 0,004 rev/µg. Este resultado foi

observado com a linhagem TA98 na ausência de S9. Nas outras condições testadas o extrato

não mostrou mutagenicidade (Tabela 1). Para a confirmação da resposta negativa, outras

linhagens de Salmonella devem ser empregadas (Mortelmans e Zeiger 2000). Já o ER não

apresentou potência mutagênica em nenhuma das condições testadas. Entretanto, com a

linhagem TA98 na presença de S9, esta substância foi altamente tóxica para a Salmonella em

todas as concentrações testadas (p~1) (Tabela 2).

Os resultados obtidos nos testes do Cometa e Micronúcleo sugerem que o tratamento

dos animais com os extratos de folha e raiz da Coccoloba mollis, nas condições experimentais

acima descritas, não apresentaram genotoxicidade e mutagenicidade.

A Figura 1 mostra os dados obtidos no Ensaio do Cometa. Nela podemos observar que

houve aumento estatisticamente significativo apenas nos animais tratados com o agente

indutor de danos no DNA, ciclofosfamida. O mesmo ocorreu na análise de micronúcleos em

reticulócitos. Somente nos animais tratados com ciclofosfamida foi encontrado aumento

estatisticamente significativo na freqüência de micronúcleos (Tabela 3).

Uma relação dose-resposta pode ser estabelecida na genotoxicidade induzida por EF,

porém o mesmo não ocorre nos grupos tratados com ER e nem quando consideramos os

dados relativos à mutagenicidade dos extratos. No teste do micronúcleo, os animais tratados

com EF2 e ER2 apresentaram freqüência de micronúcleos maior que aqueles tratados com

EF3 e ER3, o que pode ser indicativo de citotoxicidade dos extratos nesta dose.

4. Discussão

O interesse pela fitoterapia geralmente é motivado pelo seu uso tradicional e por sua

origem natural. Embora muitas atividades biológicas benéficas já tenham sido cientificamente

comprovadas, o uso das plantas medicinais deve ser feito de maneira cautelosa pela

população. Apesar da maioria dos fitoterápicos serem seguros se usados em doses

recomendadas, efeitos advesos podem surgir (Phillipson 2007). Por isso, os testes de

genotoxicidade/mutagenicidade como os aqui empregados são importantes na avaliação da

segurança e efetividade dos produtos naturais (Bast et al. 2002). Testes in vivo e o ensaio

Salmonella/microssoma são os mais frequentemente utilizados e recomendados na avaliação

do perigo genético pelas agências reguladoras (FDA 1997; OECD 2001), uma vez que

permitem considerar fatores do metabolismo in vivo, farmacocinética e processos de reparo do

DNA (Krishna e Hayashi, 2000) e que o ensaio Salmonella/microssoma possui alto valor

preditivo para carcinogenicidade em roedores quando uma resposta mutagênica é obtida

(Mortelmans e Zeiger, 2000).

A análise preliminar dos extratos de C. mollis pelo ensaio Salmonella/microssoma

mostra que estes não apresentam mutagenicidade, exceto pela maior concentração testada do

EF na linhagem TA98, na ausência de metabolização. Nestas condições, portanto, é possível

que EF induza, embora com uma potência muito baixa, mudança de quadro de leitura do

DNA, visto que este é o tipo de mutação detectada pela a linhagem TA98. O teste permitiu

concluir também que o ER apresenta maior toxicidade que EF, devido à alta toxicidade

apresentada na linhagem TA98, na presença de metabolização. Este resultado está em

concordância com outros dados de citotoxicidade de nosso laboratório, onde o ER mostrou-se

mais tóxico às células HTC do que o EF (dados não apresentados). Deste modo, a

biotransformação dos compostos presentes em ER parece ser importante para sua toxicidade

in vitro. Embora a migração do DNA e a freqüência de reticulócitos micronucleados

(MNRETs) tenham aumentado nos animais tratados com o EF e ER, estes não atingiram

significância estatística.

Estudos ainda em andamento estão sendo realizados para detecção dos constituintes

químicos presentes nos extratos etanólicos de folha e raiz da Coccoloba mollis aqui testados.

Até o momento, duas antraquinonas foram isoladas do ER (emodina e fissiona), enquanto que

hidrocarbonetos, ésteres de cadeia longa e o triterpeno 3-taraxerona foram caracterizados no

EF (de Barros et al. 2007).

O uso da C. mollis como modulador da memória e tranqüilizante parece ter

fundamento científico. Alguns estudos relatam a atividade tranqüilizante de extratos derivados

de plantas da família Polygonaceae (Gosh et al. 2002), além do efeito protetor da emodina

frente a distúrbios cerebrais (Gu et al. 2000) e na consolidação da memória (Lu et al. 2007),

porém pouco ainda é descrito sobre a atividade genotóxica/mutagênica das antraquinonas,

principalmente in vivo. Mueller e seus colaboradores atribuem atividade genotóxica à

emodina (Mueller et al. 1998; Mueller e Stopper 1999; Mueller et al 1999), outros sugerem

que ela seja antimutagênica (Sun et al. 2000; Lee et al. 2005). De acordo com os estudos

realizados por Mueller e colaboradores (Mueller et al. 1998; Mueller e Stopper 1999; Mueller

et al 1999), a mutagenicidade apresentada pela emodina pode ser explicada pela formação da

2-hidroxiemodina via CYP1A2 e CYP2B ou pela inibição da topoisomerase II devido a

capacidade da emodina (que possui estrutura planar) de se intercalar ao DNA. A maior parte

dos estudos conduzidos para investigação do possível efeito mutagênico das antraquinonas e

de seus metabólitos em diferentes linhagens de Salmonella typhimurium mostraram

mutagenicidade na linhagem TA1537 (Tikkanen et al. 1983; Masuda e Ueno 1984; Masuda et

al. 1985; Murakami et al. 1987; Westendorf et al. 1990; Krivobok et al. 1992). Apesar dos

metabólitos da emodina e fissiona apresentarem mutagenicidade em linhagem TA1537 de

Salmonella após metabolização, estas mesmas antraquinonas não foram mutagênicas nas

linhagens TA100, TA98 e TA2638 na ausência e presença de metabolização (Krivobok et al.

1992; Mueller et al 1999; Lee et al. 2005).

Embora muitos estudos de mutagenicidade in vitro apresentem resposta positiva, um

longo estudo realizado pelo National Toxicological Program (NTP) do Instituto Nacional do

Câncer americano concluiu que não há evidências de que a emodina possua atividade

carcinogênica em ratos machos F344/N e fêmeas de camundongos B6C3F (NTP 2001).

Mengs et al. (1997) também não observaram resposta mutagênica e citotóxica após única

administração da maior dose permitida (2 mg/Kg b.w.) de emodina em células de medula

óssea dos camundongos NMRI, reforçando assim a importância de estudos em diversos

sistemas-testes para a obtenção de conclusões mais confiáveis. In vivo, a biotransformação

das 1,8 diidroxiantraquinonas parece ocorrer nas células epiteliais do intestino e nas células

hepáticas (Mueller et al. 1998), sendo a biotransformação da emodina mediada pelas enzimas

do citocromo P450 (Tanaka et al. 1987; Go et al. 2007). Longo et al. (2000), ao estudar os

efeitos de diversas antraquinonas sobre as enzimas de metabolização no fígado e intestino de

ratos observou que as 1,8 diidroxiantraquinonas são as que possuem a resposta mais fraca na

indução da CYP1A2, sendo esta indução significativa somente no fígado. Esta observação,

juntamente com a possibilidade de os constituintes dos extratos ou de seus metabólitos serem

isentos de mutagenicidade ou serem excretados antes de causarem dano pode explicar em

parte os resultados não significativos encontrados in vivo. Por outro lado, é difícil afirmar ou

mesmo sugerir a razão destes resultados, principalmente com relação ao EF, uma vez que

pouco ainda é conhecido sobre a composição dos extratos.

Estudos adicionais seriam necessários para uma maior compreensão das atividades

biológicas dos extratos de C. mollis. No entanto, os resultados preliminares apresentados pela

primeira vez por nosso estudo podem ajudar a direcionar tais investigações e, contribuir

futuramente para o registro e validação deste fitoterápico.

Agradecimentos

Agradecemos ao Ms. Rodrigo Juliano Oliveira, da Universidade Estadual de Londrina

(UEL), pela valiosa assistência durante os experimentos realizados in vivo.

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Tabela 01. Dados brutos da avaliaçã

o da mutagenicidade do extrato da folha de C. mollis (EF)

com as linhagens de Salmonella typhimurium TA98 e TA100 na ausência e presença de

ativação metabólica (S9).

Doses

(µg/placa)

TA98 – S9

TA 98+ S9

Doses

(µg/placa)

TA100 – S9

TA 100 + S9

18 ± 3,0 33,33 ± 6,11

139 ± 3,0 102,33 ± 2,89

0,3

16,67 ± 1,53 32 ± 2,65

140,33 ± 5,03 101,67 ± 6,66

17,67 ± 1,53 34 ± 3,61

142 ± 9,54 107,33 ± 4,51

19 ± 2,0 33,67 ± 4,16

300

138,33 ± 5,86 104,67 ± 8,02

300

23,67 ± 1,15 35,67 ± 2,08

1000

140 ± 11,36 116,33 ± 15,37

3000

31,33* ± 4,16* 41 ± 5,57

2000

148,67 ± 16,26 114,33 ± 9,71

* significante a 1%

Tabela 02. Dados brutos da avaliaçã

o da mutagenicidade do extrato da raiz de C. mollis (ER)

com as linhagens Salmonella typhimurium TA98 e TA100 na ausência e presença de ativação

metabólica (S9).

Doses

(µg/placa)

TA98– S9

Doses

(µg/placa)

TA 98+ S9

Doses

(µg/placa)

TA100 – S9

TA 100 + S9

24,33 ± 4,51

33,33 ± 6.11

139 ± 3,0 102,33 ± 2,89

19 ± 2,65

0,005

139,33 ± 4,51 108 ± 5,57

17,67 ± 2,08

0,05

142 ± 4,36 116,67 ± 7,09

500

21,67 ± 2,52

0,1

100

144 ± 6,0 117 ± 7,0

3000

19,67 ± 2,08

0,25

200

140,33 ± 4,51 116 ± 9,85

4000

21,33 ± 1,53

0,5

300

151 ± 9,54 114 ± 8,89

T = Tóxico

Genotoxicidade

in vivo

dos extratos de

C. mollis

47,4

25,6

9,8

45,4

33,0

46,6

15,4

65,0

Controle Ciclof. ER1 ER2 ER3 EF1 EF2 EF3

Tratamentos

Escore médio

Figura 01. Escore médio de cometas observado em células de sangue periférico de

camundongos Swiss machos após tratamento de 24 horas com os extratos de C. mollis.

Controle: PBS; Ciclof.: ciclofosfamida – 50 mg/Kg; ER1: 6,6x10

-3

mg/Kg; ER2: 6,6x10

-2

mg/Kg; ER3: 6,6x10

-1

mg/Kg; EF1: 6,6x10

-3

mg/Kg; EF2: 6,6x10

-2

mg/Kg; EF3: 6,6x10

-1

mg/Kg. ER = Extrato etanólico da raiz da C. mollis; EF = Extrato etanólico da folha da C.

mollis. ** p < 0,01

Tabela 03. Avaliação da mutagenicidade dos extratos de C. mollis após 48h de

tratamento dos animais. Número de animais tratados, total de células contabilizadas,

número total de MNRETs e freqüência de micronúcleos encontrada.

Tratamento n

Total de

células

Analisadas*

Total de células

com MN

(MNRETs)

fi MN

Média ± Desvio

Padrão

Controle

7 10.000 37 7,4 ± 2,88

Ciclofosfamida

7 8.000 132 33,0 ± 5,29 **

ER1

7 14.000 66 9,42 ± 3,73

ER2

7 10.000 67 13,4 ± 7,23

ER3

7 14.000 82 11,71 ± 6,1

EF1

7 14.000 82 11,71 ± 3,49

EF2

7 14.000 126 18,0 ± 7,07

EF3

7 14.000 88 12,57 ± 5,85

Ciclofosfamida 50 mg/Kg

* Número variável devido à perda de material e não por morte dos animais durante o

experimento.

p<0,01

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FERREIRA DT (comunicação pessoal). Profa. Dra. Dalva Trevisan Ferreira, responsável

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Anexos

AnexosAnexos

Anexos

Tabela 01. Valores médios ± desvio padrão da absorbância obtida no teste de

citotoxicidade MTT, após 24 horas de tratamento.

Absorbância

Média ±

±±

± Desvio Padrão

Parâmetros

Extrato Raiz Extrato Folha

Controle

0,4264 ± 0,092 0,5114 ± 0,080

0,2 µg/mL

0,474 ± 0,0849 0,506 ± 0,096

2,0 µg/mL

0,505 ± 0,0909 0,5986 ± 0,08

20 µg/mL

0,5151 ± 0,131 0,5704 ± 0,076

200 µg/mL

0,2163 ±

0,022*** 0,5016 ± 0,049

2000 µg/mL

0,2783 ±

0,050** 0,2247 ± 0,046***

ANOVA seguida de Teste de Tukey; α = 0.05

** Diferença estatisticamente significativa em relação ao controle negativo (p < 0,01)

*** Diferença estatisticamente significativa em relação ao controle negativo (p < 0,001)

Tabela 02. Valores médios ± desvio padrão da absorbância obtida no teste de

citotoxicidade MTT, após 48 horas de tratamento.

Absorbância

Média ±

±±

± Desvio Padrão

Parâmetros

Extrato Raiz Extrato Folha

Controle

1,274 ± 0,143 1,137 ± 0,582

0,2 µg/mL

1,229 ± 0,213 1,289 ± 0,532

2,0 µg/mL

1,458 ± 0,127 1,081 ± 0,44

20 µg/mL

1,55 ± 0,261 1,347 ± 0,585

200 µg/mL

0,464 ±

0,072*** 1,305 ± 0,372

2000 µg/mL

0,179 ±

0,015*** 0,336 ± 0,165**

ANOVA seguida de Teste de Tukey; α = 0.05

* Diferença estatisticamente significativa em relação ao controle negativo (p < 0,05)

** Diferença estatisticamente significativa em relação ao controle negativo (p < 0,01)

*** Diferença estatisticamente significativa em relação ao controle negativo (p < 0,001)

Tabela 03. Valores médios ± desvio padrão da absorbância obtida no teste de

citotoxicidade MTT, após 72 horas de tratamento.

Absorbância

Média ±

±±

± Desvio Padrão

Parâmetros

Extrato Raiz Extrato Folha

Controle

1,471 ± 0,297 1,723 ± 0,171

0,2 µg/mL

1,246 ± 0,145 1,706 ± 0,153

2,0 µg/mL

1,249 ± 0,183 1,558 ± 0,371

20 µg/mL

1,608 ± 0,360 1,715 ± 0,371

200 µg/mL

0,991 ±

0,264*** 1,390 ± 0,232

2000 µg/mL

0,219 ±

0,038*** 0,264 ± 0,095***

ANOVA seguida de Teste de Tukey; α = 0.05

** Diferença estatisticamente significativa em relação ao controle negativo (p < 0,01)

*** Diferença estatisticamente significativa em relação ao controle negativo (p < 0,001)

Tabela 04. Freqüência de células com dano, distribuição das classes de danos e escore referente ao teste de genotoxicidade in vitro

(Média ± Desvio Padrão).

Tratamento Total de células

com dano

Classes do Cometa Escore

0 I II III

Controle

6,33 ± 3,51 93,66 ± 3,51 5,66 ± 3,055 0,66 ± 0,5774

0,00 ± 0,00

6,33 ± 3,51

C. positivo

87,66 ± 2,08 12,33 ± 2,08 74,66 ± 8,08 13,0 ± 8,88 0,00 ± 0,00

100,66 ± 10,06

ER1 – 0,2 µg/mL

9,0 ± 2,64 91,00 ± 2,64 9,00 ± 2,646 0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00

9,0 ± 2,64

ER2 – 2,0 µg/mL

22,00 ± 11,26 78,00 ± 11,26 19,33 ± 7,572 2,66 ± 3,786 0,00 ± 0,00

24,66 ± 15,01

ER3 – 20 µg/mL

28,33 ± 6,11 71,66 ± 6,11 28,33 ± 6,110 0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00

28,33 ± 6,11

EF1 – 0,2 µg/mL

12,0 ± 2,64 88,00 ± 2,64 12,00 ± 2,646 0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00

12,0 ± 3,34

EF2 – 2,0 µg/mL

21,00 ± 9,16 79,00 ± 9,16 20,00 ± 8,544 1,00 ± 1,00 0,00 ± 0,00

21,66 ± 10,26

EF3 – 20 µg/mL

22,0 ± 8,18 78,00 ± 8,18 22,00 ± 8,185 0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00

22,0 ± 8,18

C. positivo: Benzo[a]pireno – 25 µg/mL

Tabela 05. Total de células com dano e escore referente ao teste de genotoxicidade in

vitro e os respectivos níveis de significância (p) obtidos no teste-t.

Tratamento Total de células

com dano

p Escore p

Controle

6,33 ± 3,51 - 6,33 ± 3,51

C. positivo

87,66 ± 2,08 < 0,0001 100,66 ± 10,06 0,0001

ER1 – 0,2 µg/mL

9,0 ± 2,64 0,3528 9,0 ± 2,64 0,3528

ER2 – 2,0 µg/mL

22,00 ± 11,26 0,0830 24,66 ± 15,01 0,1085

ER3 – 20 µg/mL

28,33 ± 6,11 0,0057 28,33 ± 6,11 0,0057

EF1 – 0,2 µg/mL

12,0 ± 2,64 0,0894 12,0 ± 3,34 0,0894

EF2 – 2,0 µg/mL

21,00 ± 9,16 0,0608 21,66 ± 10,26 0,0706

EF3 – 20 µg/mL

22,0 ± 8,18 0,0382 22,0 ± 8,18 0,0382

C. positivo: Benzo[a]pireno – 25 µg/mL

Tabela 06. Avaliação da mutagenicidade dos extratos de C. mollis em células HTC. Total de

células binucleadas analisadas, total de células binucleadas com micronúcleo, valor médio

encontrado de células micronucleadas, valor médio do Índice de Divisão Nuclear (IDN) e

respectivo nível de significância (p) obtido no Teste-t.

Tratamento Total de

céls.

analisadas

Total

céls.

c/ MN

X ± S p IDN

(X ± S)

Controle

3000 17 5,6 ± 0,57 - 1,764 ± 0,070 -

C. positivo

3000 46 15,33 ± 3,51 0,0093 1,712 ± 0,012 0,2794

ER1- 0.2µg/mL

3000 08 2,66 ± 0,57 0,0031 1,794 ± 0,142 0,7593

ER2- 2.0µg/mL

3000 16 5,33 ± 1,52 0,7415 1,762 ± 0,117 0,9810

ER3- 20.0µg/mL

3000 24 8,0 ± 1,73 0,0913 1,698 ± 0,130 0,4805

EF1- 0.2µg/mL

3000 09 3,0 ± 1,0 0,0161 1,829 ± 0,145 0,5214

EF2- 2.0µg/mL

3000 13 4,3 ± 2,08 0,3453 1,792 ± 0,155 0,7907

EF3- 20.0µg/mL

3000 25 8,33 ± 3,78 0,2943 1,757 ± 0,148 0,6923

C. positivo: Benzo[a]pireno – 25 µg/mL

Tabela 07. Avaliação da indução de apoptose após tratamento das células HTC por 24 horas

com os extratos de C. mollis. Número total de células analisadas, número de células

apoptóticas encontradas, média ± desvio padrão de células apoptóticas e freqüência de

células apoptóticas.

Tratamento Total de céls.

analisadas

Total céls.

Apoptóticas

X ± S p* fi

(%)

Controle

1500 3 1,0 ± 1,0 - 0,2

C. positivo

1500 37 12,33 ± 4,93 0,0175

2,46

ER1- 0,2µg/mL

1500 4 1,33 ± 1,15 0,7247

0,26

ER2- 2,0µg/mL

1500 10 3,33 ± 2,51 0,2099

0,66

ER3- 20µg/mL

1500 31 10,33 ± 5,85 0,0530

2,06

ER4- 200µg/mL

1500 78 26,0 ± 9,53 0,0107

5,2

EF1- 0,2µg/mL

1500 8 2,66 ± 1,52 0,1890

0,53

EF2- 2,0µg/mL

1500 15 5,0 ± 3,6 0,1377

1,0

EF3- 20µg/mL

1500 22 7,33 ± 4,0 0,0579

1,46

EF4-200µg/mL

1500 33 11,0 ± 2,64 0,0036

2,2

* Teste-t de Student em relação ao controle negativo.

C. positivo: Cisplatina 20µM

** (A/T x 100), onde A = total de células apoptóticas; T = total de células analisadas

Tabela 08. Freqüência de células com dano, distribuição das classes de danos e escore referente ao teste de genotoxicidade

in vivo (Média ± Desvio Padrão).

Tratamento Total de células

com dano

Classes do Cometa Escore

0 I II III

Controle

15,4 ± 3,97 84,6 ± 3,97 15,4 ± 3,97 0,00 ± 0,00

0,00 ± 0,00 15,4 ± 3,97

C. positivo

63,8 ± 6,97 36,2 ± 6,97 62,6 ± 5,85 1,2 ± 1,64 0,00 ± 0,00 65,0 ± 8,27

ER1 (6,6x10

-3

mg/Kg)

46,6 ± 3,78 53,4 ± 3,78 46,6 ± 3,78 0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00 46,6 ± 3,78

ER2 (6,6x10

-2

mg/Kg)

33,0 ± 6,04 67,00 ± 6,04 33,00 ± 6,04 0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00 33,0 ± 6,04

ER3 (6,6x10

-1

mg/Kg)

43,8 ± 10,42 56,2 ± 10,42 42,2 ± 9,2 1.6 ± 3.57 0,00 ± 0,00 45,4 ± 12,58

EF1 (6,6x10

-3

mg/Kg)

9,8 ± 5,58 90,2 ± 5,58 9,8 ± 5,58 0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00 9,8 ± 5,58

EF2 (6,6x10

-2

mg/Kg)

25,6 ± 5,54 74,4 ± 5,54 25,6 ± 5,54 0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00 25,6 ± 5,54

EF3 (6,6x10

-1

mg/Kg)

43,6 ± 20,1 56,4 ± 20,1 40,2 ± 16,19 3,00 ± 4,79 0,4 ± 0,89 47,4 ± 25,33

C. positivo: Ciclofosfamida 50 mg/Kg

100

Tabela 09. Total de células com dano e escore referente ao teste de

genotoxicidade in vivo e os respectivos níveis de significância (p) obtidos na

análise estatística (Kruskall-Wallis seguida de teste de Dunn).

Tratamento Total de células

com dano

p Escore p

Controle

15,4 ± 3,97 - 15,4 ± 3,97 -

C. positivo

63,8 ± 6,97 <0,01 65,0 ± 8,27 <0,01

ER1 (6,6x10

-3

mg/Kg)

46,6 ± 3,78 >0,05 46,6 ± 3,78 >0,05

ER2 (6,6x10

-2

mg/Kg)

33,0 ± 6,04 >0,05 33,0 ± 6,04 >0,05

ER3 (6,6x10

-1

mg/Kg)

43,8 ± 10,42 >0,05 45,4 ± 12,58 >0,05

EF1 (6,6x10

-3

mg/Kg)

9,8 ± 5,58 >0,05 9,8 ± 5,58 >0,05

EF2 (6,6x10

-2

mg/Kg)

25,6 ± 5,54 >0,05 25,6 ± 5,54 >0,05

EF3 (6,6x10

-1

mg/Kg)

43,6 ± 20,1 >0,05 47,4 ± 25,33 >0,05

C. positivo: Ciclofosfamida 50 mg/Kg

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