Download PDF
ads:
LETÍCIA DO NASCIMENTO ANDRADE DE ALMEIDA REGO
Análise cariotípica em espécies dos gêneros Solanum,
Lycianthes e Vassobia
Londrina
2008
Universidade Estadual de Londrina
ads:
Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
LETÍCIA DO NASCIMENTO ANDRADE DE ALMEIDA REGO
Análise cariotípica em espécies dos gêneros Solanum,
Lycianthes e Vassobia
Londrina
2008
Instituto Agronômico do Paraná
Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária
Universi
ads:
LETÍCIA DO NASCIMENTO ANDRADE DE ALMEIDA REGO
Análise cariotípica em espécies dos gêneros Solanum,
Lycianthes e Vassobia
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós–Graduação, em Genética e Biologia
Molecular, da Universidade Estadual de
Londrina, como requisito parcial para a
obtenção do título de Mestre.
Orientador: Prof
o
. Dr. André Luis Laforga
Vanzela
Londrina
2008
Catalogação na publicação elaborada pela Divisão de Processos Técnicos da
Biblioteca Central da Universidade Estadual de Londrina.
Dados Internacionais de Catalogação-na-Publicação (CIP)
R343a Rego, Letícia do Nascimento Andrade de Almeida.
Análise cariotípica em espécies dos gêneros Solanum, Lycianthes e Vassobia
/ Letícia do Nascimento Andrade de Almeida Rego. – Londrina, 2008.
60f. : il.
Orientador: André Luis Laforga Vanzela.
Dissertação (Mestrado em Genética e Biologia Molecular) − Universidade
Estadual de Londrina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação
em Genética e Biologia Molecular, 2008.
Inclui bibliografia.
1. Citogenética vegetal – Teses. 2. Genética vegetal –
Teses. I. Vanzela, André
Luis Laforga. II. Instituto Agronômico do Paraná. III. EMBRAPA. IV. Universidade
Estadual de Londrina. Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-
Graduação
em Genética e Biologia Molecular. V. Título.
CDU 631.52
LETÍCIA DO NASCIMENTO ANDRADE DE ALMEIDA REGO
Análise cariotípica em espécies dos gêneros Solanum,
Lycianthes e Vassobia
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em
Genética e Biologia Molecular da Universidade Estadual de Londrina
como requisito parcial para obtenção do título de Mestre.
COMISSÃO EXAMINADORA
Prof
o
. Dr. André Luis Laforga Vanzela
Universidade Estadual de Londrina
Prof
a
. Dra. Ana Lúcia Dias
Universidade Estadual de Londrina
Prof
a
. Dra. Maria Angélica Maciel Martinho Ferreira
Universidade Federal do Mato Grosso do Sul
Londrina, 27 de fevereiro de 2008
Aos meus pais Bimbo e Lila e aos meus irmãos Felipe,
Hugo, Mariana e Vitor, pelo carinho, confiança e apoio
que sempre me dedicaram.
AGRADECIMENTOS
Ao Prof. Dr. André Luís Laforga Vanzela por acolher, orientar, sugerir, confiar, informar,
compreender, auxiliar, ter paciência e por me tratar com afeto, sempre me incentivando e
tornando possível a realização deste trabalho.
Aos meus pais e irmãos pelo exemplo e por sempre terem me apoiado em todas as minhas
decisões.
À Universidade Estadual de Londrina, em especial ao Programa de Pós-graduação em
Genética e Biologia Molecular, pelo suporte na realização desta dissertação.
Aos colegas do Laboratório de Biodiversidade e Restauração de Ecossistemas (LABRE) pela
agradável convivência, paciência, disposição e companheirismo, em especial à Mari, Priscila,
Carlão, Marquim, Thiaguim, Carol e Carolzinha por auxiliarem, serem prestativos e acima de
tudo amigos.
Aos professores José Marcelo, Rogério, Ana Lúcia e à bióloga Alba Lúcia pela orientação,
auxílio, sugestões e boas conversas.
Aos funcionários do LABRE pela colaboração nas coletas e pelos momentos de
descontração.
À professora. Lilian Auler Mentz pela identificação das espécies utilizadas neste trabalho e
pela disposição no esclarecimento de dúvidas.
À professora Ana Odete S. Vieira e à bióloga Natália S. Cervigne pelo auxílio na inclusão das
espécies no herbário da UEL.
À secretária do programa Suely pela simpatia, paciência, ajuda e disposição.
Às queridas Stela, Renata, Letícia e Débora por participarem de alguma forma da realização
deste trabalho, compartilhando bons e maus momentos e tornando minha vida mais
interessante.
Ao CNPq pela bolsa de estudos, Fundação Araucária e CAPES pelo auxílio financeiro ao
LABRE-Genética.
REGO, Letícia do Nascimento Andrade de Almeida. Análise cariotípica em espécies dos gêneros
Solanum, Lycianthes e Vassobia. 2008. Dissertação (Mestrado em Genética e Biologia Molecular) -
Universidade Estadual de Londrina, Londrina.
RESUMO
O gênero Solanum possui cerca de 1.400 espécies arbóreo-arbustivas e trepadeiras, encontradas
preferencialmente nas regiões tropicais, algumas com interesse econômico, como a batata. Em relação
às características citogenéticas, este grupo é interessante devido ao fato dos cariótipos serem bastante
conservados em número e forma dos cromossomos, com diversidade nos DNAs repetitivos. O objetivo
deste estudo foi caracterizar espécies de Solanum e duas espécies de gêneros próximos, Lycianthes
australe e Vassobia breviflora, utilizando parâmetros citogenéticos (coloração convencional,
bandamento C-CMA
3
/DAPI e FISH com sondas DNAr 45S e 5S). Foi observado que todas as espécies
apresentaram 2n = 24, confirmando a contagem para a maioria das espécies estudadas aqui. Para
Solanum scuticum, S. gemellum, S. amygdalifolium e Lycianthes australe a contagem foi inédita. Todas
as espécies apresentaram núcleos arreticulados com condensação profásica proximal e pouca variação
na simetria cariotípica, sendo que S. corymbiflorum mostrou cromossomos aproximadamente três vezes
maiores em relação às outras espécies. Regiões de heterocromatina ricas em GC (banda C-CMA
3
+
)
foram encontradas na região terminal de todos os cromossomos de algumas espécies de Solanum. Na
maioria das espécies, incluindo as dos gêneros próximos, apenas um par foi marcado, enquanto em S.
corymbiflorum 2 pares foram marcados. Regiões de heterocromatina ricas em AT (banda C-DAPI
+
)
foram evidenciadas nas regiões centroméricas de todos os cromossomos em L. australe e região
centromérica dos dois maiores pares em S. amygdalifolium. Sítios de DNAr 45S coincidentes com
banda C-CMA
3
+
(satélites) foram vistos em apenas um par, havendo variação no par portador. No
entanto, S. corymbiflorum apresentou dois pares cromossômicos com DNAr 45S. A FISH com DNAr
5S mostrou sinais na região pericentromérica de um par cromossômico, geralmente nos braços curtos
dos menores cromossomos de cada complemento, com exceção de S. trachytrichium que apresentou
dois pares marcados. Os resultados indicam que os mecanismos de diferenciação cariotípica envolvem
mudanças nos pares portadores dos sítios de DNAr, posição e número de bandas ricas em GC e AT,
bem como alterações na forma e no tamanho dos cromossomos e cariótipos. Os resultados em S.
corymbiflorum, que já fora considerada Cyphomandra corymbiflora, podem sugerir que os gêneros
Cyphomandra e Solanum representam dois grupos distintos, ao contrário do que sugerem alguns
taxonomistas, quando consideram estes um único grupo taxonômico.
Palavras-chave: bandamento cromossômico, Cyphomandra, DNAr 45S e 5S, Lycianthes, Vassobia.
ABSTRACT
The Solanum genus comprises about 1.400 species of shrubs, trees and wines, found
preferentially in the tropical regions. Some of these with economic interests, as the potato. In relation to
the cytogenetical features, this group is interesting by the fact of the karyotypes be sufficiently
conserved in chromosome number and shape, with diversity in the repetitive DNA. The objective of this
study was to characterize species of Solanum and two species of next genera, Lycianthes australe and
Vassobia breviflora, using cytogenetic parameters (conventional staining, C-CMA
3
/DAPI banding and
FISH with 45S and 5S rDNA. We have been seen that all the species had presented 2n = 24, confirming
the counting for the majority of the species study here. In Solanum scuticum, S. gemellum, S.
amygdalifolium and Lycianthes australe the counting was new. All the species had presented
arreticulated nuclei with early condensed proximal in prophase and little variation in the karyotype
symmetry. However, S. corymbiflorum exhibited chromosomes approximately three bigger times in
relation to the other species. GC-rich heterochromatin had been found in the terminal region of all the
chromosomes in the majority of the species of Solanum. In the other species, including related genera,
only the one pair was detected, while in S. corymbiflorum two pairs had been found. AT-rich regions
had been evidenced in the centromerics regions of all the chromosomes in L. australe and centromerics
regions of the two largest pairs in S. amygdalifolium. 45S rDNA sites were coincident with C/CMA
3
+
regions (satellites) which were found in just one pair, but with variation in the carrier pair. Solanum
corymbiflorum presented two chromosomic pairs with 45S rDNA. The FISH with 5S rDNA showed
signals in the pericentromeric region of one chromosome pair, generally in the short arms of the smaller
chromosomes of each complement, with exception of S. trachytrichium that it presented two marked
pairs. The results indicates that the mechanisms of karyotype differentiation involve changes in the pairs
carrier rDNA sites, location and number of GC- and AT-rich bands, as well as changes in the shape and
size of chromosomes and karyotypes. The results in S. corymbiflorum, that already it was considered
Cyphomandra corymbiflora, can suggests that the Cyphomandra and Solanum genera represent two
distinct groups in contrast of that they suggest some taxonomical studies, when its consider a just one
taxonomic group.
Key words: chromosome banding, Cyphomandra, 45S and 5S rDNA, Lycianthes, Vassobia.
LISTA DE FIGURAS
INTRODUÇÃO
FIGURA 1: Representantes de Solanaceae…………………………………….…………..6
Capítulo 1: Análise cariotípica em espécies dos gêneros Solanum, Lycianthes e Vassobia.
FIGURA 1: Coloração convencional (Giemsa)...................................................................39
FIGURA 2: Bandamento C-CMA
3
/DAPI...........................................................................40
FIGURA 3: Bandamento C-CMA
3
/DAPI...........................................................................41
FIGURA 4: FISH com a sonda de DNAr 45S ....................................................................42
FIGURA 5: FISH com as sondas de DNAr 45S e 5S..........................................................43
FIGURA 6: Idiogramas e mapeamento físico dos cromossomos de Solanum, Lycianthes e
Vassobia................................................................................................................................44
FIGURA 7: Gráfico de Simetria Cariotípica em Solanum, Lycianthes e Vassobia..............45
LISTA DE TABELAS
INTRODUÇÃO
TABELA 1: Classificação de cariótipos de acordo com Stebbins (1971)………………………9
Capítulo 1: Evolução cariotípica em espécies dos gêneros Solanum, Lycianthes e Vassobia.
TABELA 1: Características cariotípicas de espécies de Solanum, Lycianthes australe e Vassobia
breviflora.......................................................................................................................................46
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO.............................................................................................................................1
1.1 Família Solanaceae.......................................................................................................................1
1.2 Gênero Solanum L........................................................................................................................2
1.3 Gênero Lycianthes (Dunal) Hassler...............................................................................................4
1.4 Gênero Vassobia Rusby................................................................................................................4
1.5 Problema taxonômico de Chyphomandra Mart. Ex Sendtn............................................................7
1.6 Aspectos citogenéticos de Solanaceae e do gênero Solanum..........................................................8
1.7 Localização de DNAs repetitivos na família Solanaceae.................................................................10
2 JUSTIFICATIVA........................................................................................................................12
3 OBJETIVOS................................................................................................................................13
3.1 Objetivos Específicos..................................................................................................................14
Capítulo 1............................................................................................................................................15
Introdução...........................................................................................................................................16
Materiais e métodos.............................................................................................................................19
Resultados...........................................................................................................................................22
Discussão.............................................................................................................................................27
Referências................................................................................................................................................47
CONCLUSÕES...................................................................................................................................52
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..................................................................................................54
1
1 INTRODUÇÃO
1.1 Família Solanaceae
A família Solanaceae é reconhecida dentro da ordem Solanales pela ocorrência
de frutos com óvulos e sementes numerosos, dois carpelos obliquamente orientados,
ausência de látex, estilete simples e estigma único, pouco ou nada lobado (Cronquist
1988). Muitas espécies de Solanaceae são de grande importância econômica para o
homem, como a batata (Solanum tuberosum L.), a berinjela (Solanum melogena L.), o
tomate (Lycopersicum esculentum Mill.) e vários tipos de pimenta (gênero Capsicum
L.).
A família Solanaceae possui 2.800 espécies organizadas em 92 gêneros e em 6
subfamílias: Cestroideae, Juanulloideae, Solanoideae, Salpiglossoideae,
Schizanthoideae e Anthocercidoideae (Hunziker 2001). Somente as três primeiras
subfamílias têm representantes nativos na região sul do Brasil (Mentz e Oliveira 2004).
De acordo com Hunziker (2001), a subfamília Solanoideae possui 9 tribos. Destas, a
tribo Solaneae Miers é a maior delas em número de representantes (Figura 1). A
subtribo Solanineae Hunz. caracteriza-se pela presença de anteras com deiscência
poricida, anel entre os filetes e adjacente à porção basal da corola, e pela ausência de
disco nectarífero. De acordo com D’Arcy (1991), os dois maiores gêneros da tribo
Solaneae que possuem antera poricida terminal, Solanum L. e Lycianthes (Dunal)
Hassler, têm distribuição ampla. O primeiro ocorre em quase todo o mundo e o segundo
na América tropical e no leste da África. Os demais gêneros de Solaneae possuem
2
deiscência longitudinal da antera e tendem a ter distribuição restrita em um único
continente ou região.
1.2 Gênero Solanum
O gênero Solanum é um dos maiores e mais diversos das angiospermas, sendo
economicamente o mais importante da família Solanaceae. Possui cerca de 1.400
espécies desde ervas a pequenas árvores, distribuídas por todo o mundo. No Novo
Mundo ocorrem cerca de 850 espécies. O gênero ocorre predominantemente nas
Américas Central e do Sul, África, Austrália, mas também podem ocorrer espécies na
América do Norte, Eurásia e Oceania (Nee 1999; Child e Lester 2001; Bohs 2005).
Hipóteses filogenéticas para a relação entre os grupos infragenéricos de Solanum
foram propostas (Olmstead e Palmer 1997; Bohs e Olmstead 1997, 1999; Spooner et al.
2003; Bohs 2004, 2005). Neste contexto, o gênero Solanum foi dividido por Nee (1999)
em três subgêneros: Leptostemonum (Dunal) Bitter, Solanum L. e Bassovia (Aubl.)
Bitter. O subgênero Leptostemonum constitui o maior subgênero de Solanum, com cerca
de 450 espécies. Cerca de 180 destas ocorrem na América do Sul. Essas espécies se
diferenciam dos outros dois gêneros principalmente pela presença de espinhos (Bohs
2005; Levin et al. 2006), sendo um dos poucos grupos de Solanaceae com marcas
adaptativas para calor e habitats secos e sazonais (D’Arcy 1991; Nee 1999). O
subgênero Solanum possui cerca de 370 espécies encontradas principalmente na
América do Sul. Elas se diferenciam dos outros subgêneros principalmente por
possuírem anteras poricidas terminais, oblongas e sem conectivo (Bohs 2005). O
subgênero Bassovia está confinado às Américas, com maior diversidade na América do
Sul. Possui espécies que se diferenciam das demais principalmente por possuírem
3
anteras poricidas oblongas terminais e com conectivo (Nee 1999; Child e Lester 2001;
Bohs 2005).
São reconhecidas cerca de 60 seções para o gênero Solanum (D’Arcy, 1991; Nee
1999; Bohs 2004). Dentro do subgênero Leptostemonum, a seção Acanthophora Dunal
possui cerca de 40 espécies herbáceas e arbustivas, distribuídas do México à Argentina
e com centro de diversidade no sudeste brasileiro (Nee 1999; Levin et al. 2005). Além
disso, essa seção exibe grande variação na morfologia de seus frutos, onde S.
palinacanthum Dunal e S. mammosum L. produzem os maiores frutos dentro desse
grupo de plantas com cerca de 5 cm de diâmetro. A seção Torva Nee possui 42 espécies
arbustivas a pequenas árvores distribuídas do México à Argentina. (D’Arcy 1991; Levin
et al. 2006).
Dentro do subgênero Solanum, a seção Solanum possui cerca de 50 espécies de
ervas a arbustos, enquanto a seção Brevantherum (Seithe) D’Arcy possui 83 espécies de
distribuição neotropical. Já a seção Extensum D’Arcy possui de quatro a cinco espécies
de arbustos ou trepadeiras, encontradas principalmente na América Central e Venezuela
(D’Arcy 1991; Bohs 2005). A seção Dulcamara tem cerca de 40 espécies estando
proximamente relacionada à seção Petota (Bohs 2005). Para Nee (1991) e Bohs (2005)
a seção Geminata G. Don. possui cerca de 140 espécies arbustivas ou pequenas árvores,
tendo os dois maiores centros de diversidade no leste Andino e nas cordilheiras
costeiras da Venezuela.
Conforme Nee (1999), a seção Cyphomandropsis e mais outras três seções,
Pachyphylla, Allophylla e Pteroidea pertencem ao subgênero Bassovia. A seção
Pachyphylla Dunal abriga as espécies anteriormente aceitas como pertencentes ao
gênero Cyphomandra, como por exemplo, Solanum corymbiflorum (Sendtn.) Bohs (=
Cyphomandra corymbiflora Sendtn.). As espécies de Solanum estudadas até o momento
4
apresentaram 2n = 2x = 24, embora séries poliplóides com 2n = 4x = 48, 2n = 6x = 72,
2n = 8x = 96 sejam frequentes (Hunziker 2001).
1.3 Gênero Lycianthes (Dunal) Hassler
O gênero Lycianthes já foi considerado um subgênero de Solanum, mas é
atualmente reconhecido como gênero independente por estudos com filogenia molecular
(Olmstead e Palmer 1992, 1997; Bohs e Olmstead 1997, 1999; Olmstead et al. 1999;
Nee 1999; Bohs 2004, 2005). Compreende cerca de 150 espécies com distribuição
américo-asiática, sendo que dez crescem no sudeste do Brasil. Todas possuem frutos do
tipo baga e a maioria de cor brilhante. As poucas espécies de Lycianthes estudadas
citogeneticamente (L. lycioides (L.) Hassler, L. moziana (Dunal) Bitter, L. jalicensis E.
Dean e L. rantonnei (Carr.) Bitter) possuem 24 cromossomos (Moscone 1992; Hunziker
2001; Acosta et al. 2005).
1.4 Gênero Vassobia Rusby
Solaneae é a maior tribo da subfamília Solanoideae com aproximadamente 1.500
espécies. Esta é subdividida em cinco subtribos de acordo com Hunziker (2001). A
subtribo Capscinae possui nove gêneros, dentre eles, Capsicum e Vassobia. Este último
é caracterizado por possuir espécies arbustivas ou pequenas árvores, com flores
pequenas e inodoras. Vassobia dichotoma (Rusby) Bitter, por exemplo, cresce na
Bolívia a 1.900 a 2.100 m de altitude, enquanto V. breviflora (Sendtn.) Hunz. possui
5
ampla distribuição geográfica, entre 300m e 2.700m de altitude e é encontrada nas
montanhas da Bolívia, no nordeste da Argentina, Leste do Paraguai, sudeste do Brasil e
noroeste do Uruguai. Por conta de seu polimorfismo, essa planta já recebeu 30 nomes e
foi incluída em sete gêneros diferentes (Hunziker 2001).
A única espécie estudada citogeneticamente até o momento é Vassobia
breviflora, a qual apresentou 2n = 24 cromossomos (Xifreda et al. 1985 apud in:
Hunziker 2001).
6
Figura 1. Representantes de Solanaceae. (A)
Solanum viarum
, (B)
S. artropurpur
eum,
(C)
S. sisymbriifolium,
(D)
S. guaraniticum,
(E) S. paniculatum, (F) S. mauritianum, (G) S. granulosoleprosum, (H) S. gemellum, (I) S. pseudocapsicum, (J) S. trachytrichium,
(K) S. americanum, (L) S. palinacanthum e (M) Vassobia breviflora
7
1.5 Problema taxonômico de Chyphomandra Mart. Ex Sendtn.
As espécies consideradas na circunscrição de Cyphomandra são neotropicais e
ocorrem do México ao norte da Argentina, habitando clareiras e bordas de formações
florestais ou ambientes antropizados (Soares e Mentz 2006). A circunscrição de
Cyphomandra e suas relações intergenéricas sempre foram discutidas, dada a estreita
relação com os gêneros Solanum e Lycopersicon (Olmstead e Palmer 1992; Spooner et
al. 1993; Bohs 1994, 1995; Bohs e Olmstead 1997, 1999; Child e Lester 2001; Soares e
Mentz 2006). Estas espécies são distinguidas das outras solanáceas pela presença de
conectivo, formando uma protuberância no lado dorsal da antera e, geneticamente, por
possuírem grande quantidade de DNA e grandes cromossomos, maiores que 12 µm
(Bernadello e Anderson 1990; Bohs 1989, 1994; Pringle e Murray 1991, 1993). Embora
esses caracteres possam definir Cyphomandra como um gênero independente, as
relações filogenéticas entre Cyphomandra, Solanum e Lycopersicon foram recentemente
reavaliadas em estudos de sistemática molecular utilizando genes conservados de
cloroplasto (Olmstead e Palmer 1992; Bohs 1995; Olmstead e Palmer 1997; Bohs e
Olmstead 1997, 1999; Olmstead et al. 1999; Bohs 2004, 2005).
As transferências das espécies de Lycopersicon (Spooner et al. 1993) e
Cyphomandra (Bohs 1995) para o gênero Solanum geraram impacto, uma vez que estas
propostas não foram aceitas de imediato e muitos as contestaram, por discordarem dos
princípios nas quais estavam fundamentadas (Soares e Mentz 2006). Concordando
parcialmente com as modificações propostas pela biologia molecular na taxonomia do
gênero Solanum, Nee (1999) aderiu à transferência dos táxons de Cyphomandra para
Solanum. No entanto, preferiu manter a autonomia do gênero Lycopersicon. Conforme
Nee (1999), a seção Pachyphylla abriga as espécies anteriormente aceitas como
8
pertencentes ao gênero Cyphomandra, como por exemplo, Solanum corymbiflorum
(Sendtn.) Bohs (= Cyphomandra corymbiflora Sendtn. In Flora 28:174. 1845).
1.6 Aspectos citogenéticos de Solanaceae e do gênero Solanum
Dados citogenéticos são extremamente importantes na sistemática vegetal, por
auxiliarem na determinação das relações entre diferentes táxons, bem como na
compreensão de mecanismos genéticos envolvidos na diferenciação e especiação de
grupos de plantas (Guerra 1986). A combinação de caracteres como fórmula cariotípica,
presença de satélites, tamanho total do cariótipo (µm), tamanho relativo dos pares
cromossômicos (%) e índices de assimetria (TF %, por exemplo) também permitem que
espécies sejam distinguidas umas das outras (Stebbins 1971; Bernardello e Anderson
1990; Bernardello et al. 1994, Acosta et al. 2005; Chiarini e Bernardello 2006).
Comparações entre assimetrias cariotípicas são mais fáceis de fazer se as
categorias de assimetria são bem estabelecidas. De acordo com Stebbins (1971), um
cariótipo simétrico é aquele cujos cromossomos são todos aproximadamente do mesmo
tamanho, possuindo centrômero mediano ou submediano. Assim, o aumento da
assimetria pode ocorrer tanto por meio de mudanças na posição do centrômero, como
por variações nos tamanhos relativos dos cromossomos do complemento. A
classificação de cariótipos de acordo com o grau de assimetria de Stebbins (1971)
utiliza, além do resultado da divisão do par cromossômico maior pelo par
cromossômico menor, a análise da proporção de cromossomos dos tipos
subtelocêntricos e telocêntricos em relação aos outros tipos cromossômicos de cada lote
haplóide (Tabela 1). As categorias de classificação são baseadas em dois aspectos: 1)
9
Freqüência de cromossomos dos tipos subtelo e telocêntricos em relação ao restante do
lote haplóide, sendo a categoria 1 considerada mais simétrica em relação à categoria 4 e
2) Relação de tamanho entre o cromossomo maior e o menor, isto é, quanto o
cromossomo maior é maior que o cromossomo menor, sendo a categoria A considerada
mais simétrica em relação à categoria C. Podemos assim assumir o cariótipo do tipo 1A
como mais simétrico e o cariótipo do tipo 4C como mais assimétrico.
Tabela 1. Classificação de cariótipos de acordo com o grau de assimetria, segundo
Stebbins (1971).
Proporção de cromossomos com razão de braços < 2:1
Par maior/par menor
0.0 0.02 – 0.5 0.51 – 0.99 1.0
< 2:1 1A 2A 3A 4A
2 :1 – 4:1 1B 2B 3B 4B
> 4:1 1C 2C 3C 4C
De uma maneira geral, espécies de Solanaceae têm exibido cariótipos simétricos,
com cromossomos metacêntricos e submetacêntricos, independente do gênero e do
tamanho dos cromossomos. Nos gêneros Solanum (Stebbins 1971; Bernardello e
Anderson 1990; Moscone 1992; Bernardello et al. 1994; Acosta et al. 2005; Obute et al.
2006; Chiarini e Bernardello 2006) e Lycianthes (Acosta et al. 2005) os cariótipos são
compostos por cromossomos semelhantes em tamanho (menos de 4 µm) e forma (meta
e submetacêntricos). Os cariótipos de Capsicum (Moscone 1993; Moscone et al. 1993),
de Cestrum L. (Fregonezi et al. 2006) e de Nicotiana L. (Nakamura et al. 2001;
Kitamura et al. 2001) também são simétricos com cromossomos meta e
submetacêntricos.
10
Estudos citogenéticos na família Solanaceae mostram que esta exibe números
cromossômicos básicos variando de x = 7 a x = 13, sendo x = 12 o mais comum, embora
essa amplitude cromossômica não seja encontrada em todas as subfamílias (Moscone
1992). Estudos feitos em Capsicum (Moscone 1993; Moscone et al. 1993) e em
Nicotiana L. (Nakamura et al. 2001; Kitamura et al. 2001) mostraram que a maioria das
espécies possui 2n = 2x = 24. A maioria das espécies de Solanum estudadas até o
momento também apresentou 2n = 2x = 24, embora séries poliplóides com 2n = 4x = 48,
2n = 6x = 72, 2n = 8x = 96 sejam frequentes (Stebbins 1971; Bernardello e Anderson
1990; Moscone 1992; Bernardello et al. 1994; Acosta et al. 2005; Obute et al. 2006;
Chiarini e Bernardello 2006).
1.7 Localização de DNAs repetitivos na família Solanaceae
Seqüências repetitivas de DNA representam uma fração substancial do genoma
nuclear das plantas superiores (Flavell 1986; Heslop-Harrison 2000). Contudo, os
cariótipos de angiospermas exibem grande variação tanto na quantidade quanto na
localização de bandas heterocromáticas, sendo comuns polimorfismos no tamanho e
posição das bandas. A quantidade de heterocromatina em uma espécie pode variar
independentemente da quantidade de eucromatina e do conteúdo de DNA. De acordo
com Guerra (2000), a heterocromatina é formada de sequências repetitivas que variam
em natureza, tamanho e distribuição e as diferentes sequências parecem não ter o
mesmo significado funcional e evolutivo para todas as espécies de angiospermas.
Dentre as técnicas mais empregadas, o bandamento C-Giemsa (Schwarzacher et
al. 1980) e o bandamento com fluorocromos DAPI (4'- 6 diamidino - 2 fenilindol) e
11
CMA
3
(cromomicina A
3
) são usados para localizar regiões heterocromáticas ricas em
AT ou GC, respectivamente (Schweizer 1980). Estas técnicas são extremamente úteis
em estudos de caracterização cromossômica e evolução cariotípica, bem como para o
entendimento da evolução das sequências de DNA repetitivo dentro de um grupo e entre
diferentes espécies (Sharma e Sen 2002).
Em Nicotiana kawakamii estudada por Nakamura et al. (2001) a coloração com
DAPI revelou bandas positivas em todos os grandes cromossomos do complemento,
permitindo a divisão destes em grupos quanto à posição: (i) terminal do braço longo; (ii)
terminal do braço curto e na região subterminal do braço longo e (iii) terminal e
intercalar do braço longo. Moscone et al. (1993) observaram que em Capsicum, todos
os cromossomos dos complementos das espécies estudadas exibiam bandas C
centroméricas e uma grande variação em relação às bandas terminais. Em algumas
espécies de Solanum da seção Petota, a heterocromatina foi localizada bem adjacente ao
centrômero (Pijnaker e Ferwerda 1984), diferentemente das espécies do gênero
Cyphomandra (agora circunscritas dentro de Solanum). Estas não apresentaram bandas
C proximais, mas bandas terminais e intersticiais em alguns cromossomos de cada
complemento. Segundo Pringle e Murray (1993), isto mostra que diferenças nas
proporções de heterocromatina podem refletir diferenças na dispersão ou agregação de
elementos repetitivos dentro desse grupo de plantas.
O grande número de cópias e a tendência à formação de blocos fazem dos DNAs
repetitivos alvos ideais para experimentos de hibridação in situ, pois são mais fáceis de
serem localizados tanto por bandamento quanto por FISH. As principais sequências de
DNA repetitivo utilizadas na citogenética molecular são as que codificam os genes
ribossômicos, os segmentos de telômeros e microssatélites, além de alguns grupos de
DNAs satélites (Snowdon et al. 2001; Sumner 2003). Genes que codificam os RNAs
12
ribossomais 18S-5,8S-26S (também chamado de DNAr 45S) representam uma das
maiores e mais bem estudadas famílias de sequências repetitivas em eucariotos, assim
como os que codificam o RNAr 5S (DNAr 5S). Ambos ocorrem em repetições em
tandem em um ou mais sítios cromossômicos, porém ocorrem separados fisicamente
nos cromossomos (Lapitan 1992).
As sequências de DNAr 45S e 5S são altamente conservadas, permitindo que
sondas originalmente isoladas de diferentes espécies, como trigo, por exemplo (Gerlach
e Bedbrook 1979; Gerlach e Dyer 1980), possam ser utilizadas na localização desses
segmentos em diferentes espécies de eucariontes. Um bom exemplo para Solanaceae foi
publicado por Fregonezi et al. (2006), os quais utilizaram hibridação in situ com
fluorocromos (FISH) com as sondas de DNAr 45S e 5S em espécies de Cestrum e
encontraram que o DNAr 45S variou em número e localização, aparecendo mais
comumente nas regiões terminais dos braços curtos dos cromossomos, enquanto que o
DNAr 5S apareceu sempre na região proximal do braço longo do menor par
cromossômico. Dessa forma, por serem sequências evolutivamente conservadas e por
estarem presentes em um ou mais sítios cromossômicos, os DNAr 45S e 5S se tornaram
importantes marcas cromossômicas para estudos citogenéticos e evolutivos (Heslop-
Harrison 2000).
2 JUSTIFICATIVA
Apesar das metodologias convencionais de análise cariotípica fornecerem
informações valiosas para comparar populações e espécies, estas são limitadas para a
definição da organização dos cromossomos em cada cariótipo em determinados grupos
de plantas. Isto acontece principalmente para espécies tropicais onde a biodiversidade é
13
grande, os estudos citogenéticos são escassos e os cariótipos são similares. Assim
sendo, nem sempre o número cromossômico é suficientemente útil como característica
diagnóstica micromorfológica. A aplicação de técnicas citogenéticas mais apuradas, tais
como bandamento C-CMA
3
/DAPI e FISH com sondas de DNAs repetitivos são muito
úteis para estudar grupos com cariótipos tão constantes, como os de Solanum e grupos
próximos. Neste contexto, estas técnicas citogenéticas podem ser aplicadas à resolução
de problemas taxonômicos e biossistemáticos, bem como para a compreensão dos
mecanismos evolutivos envolvidos na diferenciação cariotípica dentro da família
Solanaceae e do gênero Solanum.
A escolha desse grupo de plantas justifica-se pelo fato dos cariótipos de
Solanum, Lycianthes e Vassobia serem similares, numericamente estáveis e com
algumas famílias de DNA repetitivos já identificadas. Além deste grupo possuir
espécies com interesse econômico indiscutível, há um elevado número de espécies em
nossa região com reconhecida importância para a restauração ambiental.
3 OBJETIVOS
Análises de filogenia molecular têm alterado substancialmente a organização
taxonômica de grupos acerca de Solanum, como por exemplo, a inclusão de
Cyphomandra como uma seção de Solanum, ao mesmo tempo em que grupos
morfologicamente mais próximos como Lycianthes encontram-se fora da circunscrição
em Solanum. Contudo, a análise citogenética parece ir à contramão dos trabalhos
filogenéticos que empregam poucos genes extra-genômicos. Para entender e contribuir
melhor com estas relações taxonômicas, este trabalho teve como objetivo geral a
caracterização cariotípica de espécies de Solanum, Lycianthes australe e Vassobia
14
breviflora, utilizando metodologias de coloração convencional, técnicas de bandamento
cromossômico (bandamento C-CMA
3
/DAPI), bem como a localização de segmentos
repetidos de DNA (DNAr 45S e 5S) pela técnica de hibridação in situ com
fluorocromos.
3.1 Objetivos Específicos
1. Definir e confirmar o número, a forma e o tamanho dos cromossomos de 18 espécies,
sendo 16 de Solanum, Lycianthes australe e Vassobia breviflora.
2. Comparar a organização estrutural dos cariótipos das espécies utilizando a técnica de
bandamento cromossômico C-CMA
3
/DAPI.
3. Comparar a organização estrutural dos cariótipos utilizando a técnica de hibridação in
situ fluorescente com sondas de DNAr 45S e 5S.
4. Utilizar os resultados obtidos pela caracterização cariotípica das espécies para gerar
mapas físicos. Estes, por sua vez, serão empregados em uma análise comparativa entre
espécies, a fim de entender os processos evolutivos envolvidos na diferenciação
cromossômica destas espécies e de gêneros proximamente relacionados.
15
Capítulo 1
Análise cariotípica em espécies dos gêneros Solanum,
Lycianthes e Vassobia
Este capítulo será enviado para publicação na revista Plant Systematics and Evolution
Fator de Impacto: 1,239 (JCR-2006), Springer, ISSN: 0378-2697 e ISSN: 1615-6110
16
Análise cariotípica em espécies dos gêneros Solanum, Lycianthes e
Vassobia
Letícia do Nascimento Andrade de Almeida Rego
1,2
, Carlos Roberto Maximiano da
Silva
1
e André Luís Laforga Vanzela
1,2
1. Laboratório de Biodiversidade e Restauração de Ecossistemas, Departamento de
Biologia Geral, Centro de Ciências Biológicas, Universidade Estadual de Londrina,
Londrina, Paraná, Brasil, CEP: 86051-990, Caixa Postal 6001.
2. E-mail para correspondência: avanzela@uel.br, letbio@gmail.com
O gênero Solanum possui cerca de 1.400 espécies arbóreo-arbustivas e trepadeiras,
encontradas preferencialmente nas regiões tropicais, algumas com interesse econômico,
como a batata. Em relação às características citogenéticas, este grupo é interessante
devido ao fato dos cariótipos serem bastante conservados em número e forma dos
cromossomos, com diversidade nos DNAs repetitivos. O objetivo deste estudo foi
caracterizar 16 espécies de Solanum e duas espécies de gêneros próximos, Lycianthes
australe e Vassobia breviflora, utilizando parâmetros citogenéticos (coloração
convencional, bandamento C-CMA
3
/DAPI e FISH com sondas DNAr 45S e 5S). Foi
observado que todas as espécies apresentaram 2n = 24, confirmando a contagem para as
espécies estudas aqui. Em Solanum scuticum, S. gemellum, S. amygdalifolium e
Lycianthes australe a contagem foi inédita. Todas as espécies apresentaram núcleos
arreticulados com condensação profásica proximal e pouca variação na simetria
cariotípica, sendo que S. corymbiflorum mostrou cromossomos aproximadamente três
vezes maiores em relação às outras espécies. Regiões de heterocromatina ricas em GC
(banda C-CMA
3
+
) foram encontradas na região terminal de todos os cromossomos de
algumas espécies de Solanum. Na maioria das espécies, incluindo as dos gêneros
próximos, apenas um par foi marcado, enquanto em S. corymbiflorum 2 pares foram
marcados. Regiões de heterocromatina ricas em AT (banda C-DAPI
+
) foram
evidenciadas nas regiões centroméricas de todos os cromossomos em L. australe e
região centromérica dos dois maiores pares em S. amygdalifolium. Sítios de DNAr 45S
coincidentes com banda C-CMA
3
+
(satélites) foram vistas em apenas um par, havendo
variação no par portador. No entanto, S. corymbiflorum apresentou dois pares
cromossômicos com DNAr 45S. A FISH com DNAr 5S mostrou sinais na região
pericentromérica de um par cromossômico, geralmente nos braços curtos dos menores
cromossomos de cada complemento, com exceção de S. trachytrichium que apresentou
dois pares marcados. Os resultados indicam que os mecanismos de diferenciação
cariotípica envolvem mudanças nos pares portadores dos sítios de DNAr, posição e
número de bandas ricas em GC e AT, bem como alterações na forma e no tamanho dos
cromossomos e cariótipos. Os resultados em S. corymbiflorum, que já fora considerada
Cyphomandra corymbiflora, podem sugerir que os gêneros Cyphomandra e Solanum
representam dois grupos distintos ao contrário do que sugerem alguns taxonomistas,
quando consideram estes um único grupo taxonômico.
Palavras-chave: bandamento cromossômico, Cyphomandra, DNAr 45S e 5S,
Lycianthes, Vassobia.
17
Introdução
O gênero Solanum é um dos maiores e mais diversos das angiospermas, sendo
economicamente o mais importante da família Solanaceae. Possui cerca de 1.400
espécies desde ervas a pequenas árvores, distribuídas por todo o mundo, sendo que no
Novo Mundo ocorrem cerca de 850 espécies (Nee 1999, Child e Lester 2001, Bohs
2005). Estudos citogenéticos em Solanaceae mostram que esta família exibe números
cromossômicos básicos variando de x = 7 a x = 13, sendo x = 12 o mais comum.
Contudo, essa amplitude em número cromossômico parece não ser encontrada em todas
as subfamílias de Solanaceae (Moscone 1992).
De uma maneira geral, espécies de Solanaceae têm exibido cariótipos simétricos,
com cromossomos metacêntricos a submetacêntricos, independente do gênero e do
tamanho dos cromossomos. Estudos feitos em Capsicum (Moscone 1993, Moscone et
al. 1993) e em Nicotiana L. (Nakamura et al. 2001, Kitamura et al. 2001) mostraram
que a maioria das espécies possui 2n = 2x = 24 e que os cariótipos são simétricos com
cromossomos meta a submetacêntricos. As espécies de Solanum estudadas até o
momento também apresentam 2n = 2x = 24, embora séries poliplóides com 2n = 4x =
48, 2n = 6x = 72, 2n = 8x = 96 sejam frequentes (Hunziker 2001). Além disso, possuem
cariótipos compostos por cromossomos semelhantes em tamanho (menores que 4 µm) e
forma (Stebbins 1971, Bernardello e Anderson 1990, Moscone 1992, Bernardello et al.
1994, Acosta et al. 2005, Obute et al. 2006, Chiarini e Bernardello 2006).
Estudos com sequências repetitivas de DNA em Solanaceae têm mostrado
diferentes padrões de comportamento em diferentes grupos. Nakamura et al. (2001),
mostraram que em Nicotiana kawakamii ocorrem blocos ricos em AT nos maiores
cromossomos submetacêntricos do complemento, permitindo a divisão destes em
18
grupos quanto à posição: (i) terminal do braço longo; (ii) terminal do braço curto e na
região subterminal do braço longo e (iii) terminal e intercalar do braço longo. Moscone
et al. (1993) observaram que em Capsicum, todos os cromossomos dos complementos
exibiam bandas C centroméricas e uma grande variação em relação às bandas terminais.
Sequências repetitivas de DNA são reconhecidamente uma fração substancial do
genoma nuclear das plantas superiores, o que explicaria a maioria da variação do
conteúdo de DNA entre as espécies (Flavell 1986, Heslop-Harrison 2000).
Um fato interessante é que as sequências de DNAr 45S e 5S, umas das maiores e
mais bem estudadas famílias de sequências repetitivas em eucariotos e amplamente
localizadas nos cromossomos de diferentes grupos de plantas (Lapitan 1992), não foram
mapeadas em espécies nativas de Solanum, sendo utilizadas apenas espécies cultivadas
como Solanum lycopersicon (Vallejos et al. 1986, Lapitan et al. 1991, Komarova et al.
2004), S. bulbocastanum (Dong et al. 2000) e S. tuberosum (Volkov et al. 2001,
Srebniak et al. 2002, Komarova et al. 2004). Fregonezi et al. (2006) fizeram hibridação
in situ com as sondas de DNAr 45S e 5S no gênero Cestrum e mostraram que estes
segmentos (genes) evolutivamente conservados são agrupados em tandem, porém, o
conjunto varia em tamanho, posição e par cromossômico entre as espécies, sendo
considerados importantes marcadores cromossômicos para estudos citogenéticos e
evolutivos, como anteriormente sugerido por Heslop-Harrison (2000).
Análises de filogenia molecular têm alterado substancialmente a organização
taxonômica de grupos acerca de Solanum, como por exemplo, a inclusão de
Cyphomandra como uma seção de Solanum ao mesmo tempo em que grupos
morfologicamente mais próximos como Lycianthes encontram-se fora da circunscrição
em Solanum (Olmstead e Palmer 1992, 1997; Bohs e Olmstead 1997, 1999; Olmstead et
al. 1999; Bohs 2004, 2005). Contudo, a análise citogenética parece ir à contramão dos
19
trabalhos filogenéticos que empregam poucos genes extra-genômicos. Para entender e
contribuir melhor com estas relações taxonômicas, este trabalho teve como objetivo
geral a caracterização cariotípica de algumas espécies de Solanum, Lycianthes australe
e Vassobia breviflora (como grupo externo), utilizando metodologias de coloração
convencional e técnicas de bandamento cromossômico (bandamento C-CMA
3
/DAPI),
bem como a localização de segmentos repetidos de DNA (DNAr 45S e 5S) pela técnica
de hibridação in situ. Estas informações também são úteis para avaliar o nível de
organização cariotípica, bem como as diferenças e similaridades cariotípicas entre as
espécies aqui relacionadas.
Materiais e métodos
Material botânico
Os exemplares de Solanum, Lycianthes, Vassobia e as sementes de cada espécie
estudada foram coletados em diferentes localidades nos estados do Mato Grosso do Sul,
Paraná e Rio Grande do Sul, e cultivados em tubetes e vasos no viveiro de mudas do
Laboratório de Biodiversidade e Restauração de Ecossistemas – LABRE. Foram
utilizados pelo menos três indivíduos de cada espécie para as análises citogenéticas.
Amostras herborizadas encontram-se registradas no Herbário FUEL, da Universidade
Estadual de Londrina (Tabela 1). As espécies foram arranjadas em seções de acordo
com a classificação taxonômica de Nee (1999).
20
Análise convencional
Para a obtenção de lâminas foram utilizados meristemas radiculares, pré-tratados
com 8-hidroxiquinoleína 2 mM por uma hora a temperatura ambiente, seguido de quatro
horas a 14
o
C. As amostras foram, fixadas em etanol:ácido acético (3:1, v:v), à
temperatura ambiente, por até 12 horas. Em seguida, as raízes foram diretamente
utilizadas no preparo de lâminas ou mantidas a –20
o
C até o uso. Para a coloração
convencional as raízes foram digeridas em uma solução enzimática contendo celulase
4% e pectinase 40% por uma hora à 37
o
C. Em seguida, foram hidrolisadas em HCl 1M
por 10 min à 60
o
C, dissecadas em uma gota de ácido acético 45% e esmagadas. As
lamínulas foram retiradas após congelamento em nitrogênio líquido. A coloração das
lâminas foi feita em Giemsa 2% e as lâminas permanentes montadas com Entellan
(Merck).
A caracterização dos cariótipos foi determinada utilizando os seguintes
parâmetros: relação de braços, fórmula cariotípica haplóide (FCH), tamanho do lote
haplóide (TLH) em µm e dois índices de simetria, sendo o TF% calculado de acordo
com Huziwara (1962) (Tabela 1) e o R, obtido pela razão entre o comprimento absoluto
(µm) do maior par cromossômico dividido pelo menor par. Os tipos cromossômicos
foram classificados conforme a nomenclatura proposta por Guerra (1986) e as
categorias de simetria foram determinadas de acordo com Stebbins (1971).
Bandamento cromossômico
21
A heterocromatina foi detectada de acordo com o protocolo descrito por
Schwarzacher et al. (1980), com modificações. Para tal, lâminas envelhecidas por três
dias, sofreram três tratamentos: (i) ácido acético 45% à 60
o
C por 10 min, (ii) solução
saturada de hidróxido de bário 5% à temperatura ambiente por 10 min e (iii) 2×SSC à
60
o
C por 80 minutos. Após um novo envelhecimento de três dias, as lâminas foram
coradas com CMA
3
(0,5 µg/µL) por 90 minutos e em seguida com DAPI 2 µg/µL por
meia hora. Em seguida as lâminas foram lavadas em água destilada, secas com ar e
montadas com um meio composto por glicerol/tampão McIlvaine (pH 7.0) 1:1,
contendo MgCl
2
2.5 mM.
Hibridação in situ com fluorocromos (FISH)
A hibridação in situ foi realizada de acordo com Heslop-Harrison et al. (1991) e
Cuadrado e Jouve (1994), com modificações. Foram utilizadas as sondas de trigo:
pTa71 contendo a seqüência de DNAr 45S e pTa794 contendo a sequência de DNAr 5S,
marcadas com biotina ou digoxigenina por nick translation. As lâminas foram tratadas
com uma solução de RNAse (100 µg/mL) por 1 hora, lavadas com 2×SSC, pós-fixadas
com paraformaldeído 4% por 10 minutos e desidratadas em uma série alcoólica (70% -
100%), todos a temperatura ambiente. Sobre cada lâmina foram aplicados 32 µL de uma
mistura de hibridação contendo 100 a 200 ng de cada sonda marcada (3 µL), formamida
100% (15 µL), polietilenoglicol 50% (6 µL), 3 µL de 20×SSC (pH 7,0), 1 µL de DNA
de timo de bezerro fragmentado (100 ng) e SDS a 10% (1 µL). A mistura de hibridação
foi desnaturada a 70
o
C por 10 min e imediatamente colocada no gelo por cinco minutos.
Os cromossomos e a sonda foram desnaturados simultaneamente em um termociclador
a 90
o
C por 10 min, 50
o
C por 10 min e 38
o
C por 5 min. Em seguida, as lâminas foram
22
colocadas em uma câmara úmida a 37
o
C por pelo menos 12 horas. As lavagens pós-
hibridação foram feitas em 2xSSC, formamida 20% em 0,1×SSC, 0,1×SSC, 2×SSC e
4×SSC/Tween20 0,2%, todos a 37
o
C por 5 min sob agitação. As sondas foram
detectadas com uma solução contendo avidina/FITC (verde) 1:99 em BSA 5%, quando
apenas uma das sondas foi empregada na FISH ou então com uma mistura contendo
avidina/FITC (verde) 1:98 e anti-digoxigenina/rodamina (vermelho) 1:98 em BSA 5%,
para a detecção dupla. Em seguida foram feitas duas lavagens pós-detecção com
4×SSC/Tween20 2%, por 10 min à temperatura ambiente. Por fim, as lâminas foram
contra-coradas e montadas simultaneamente com antifade: 23 µL de antifade (1,4-diaza-
bicyclo (2.2.2)-octane (2,3%), Tris HCl 20 mM, pH 8.0 (2%) e Glicerol (90%), em água
destilada), 1 µL de DAPI (2 µg/mL) e 1 µL de MgCl
2
(50mM).
Todas as imagens foram adquiridas em um microscópio de epifluorescência
Leica DM 4500 B, equipado com uma câmera DFC 300FX e com o programa IM50
4.0, também da Leica. As cinco melhores metáfases de cada preparação foram utilizadas
na montagem dos idiogramas, utilizando o programa Micro Measure 3.3
(http://www.biology.colostate.edu/MicroMeasure/). Os idiogramas foram construídos
com o auxílio do programa Corel Draw 12.
Resultados
Análise convencional
A análise citogenética por coloração convencional mostrou que as espécies de
Solanum, Lycianthes australe e Vassobia breviflora possuem núcleos interfásicos
arreticulados e com condensação proximal (Figuras 1E, 1I e 1Q). Todas as espécies
23
apresentaram número cromossômico constante (2n = 2x = 24) e cariótipo com
cromossomos pequenos, medindo em torno de 2 µm (Figuras 1 e 6; Tabela 1). Além
disso, houve a predominância de cromossomos dos tipos meta e submetacêntricos. Uma
exceção em relação ao tamanho foi Solanum corymbiflorum, que mostrou cromossomos
maiores em relação às outras espécies (cerca de 6 µm), porém, com simetria cariotípica
bem parecida às demais espécies (Tabela 1, Figuras 1R e 6I).
Análise citogenética mostrou que não há uma correlação clara entre
características cariotípicas e os agrupamentos dentro e entre as seções de Nee (1999),
portanto, a descrição dos dados segue um agrupamento de espécies pelas similaridades
entre as fórmulas cariotípicas independente das seções. Nos subgêneros Leptostemonum
e Solanum houve a predominância de cromossomos metacêntricos em relação aos
submetacêntricos (Figura 6; Tabela 1). Entretanto, a fórmula cariotípica mais frequente
foi de 6m + 6sm, observada em S. artropurpureum, S. sisymbriifolium, S.
trachytrichium, S. granulosoleprosum, S. corymbiflorum e Lycianthes australe (Figuras
6C, 6D, 6L, 6M, 6I e 6Q; Tabela 1). Apesar de possuírem formas cromossômicas
semelhantes, estas espécies apresentaram diferenças no tamanho do lote haplóide,
variando de 13,5 µm em S. granulosoleprosum a 77,88 µm em S. corymbiflorum
(Tabela 1).
A fórmula cariotípica 7m + 5sm foi observada em S. paniculatum, S.
pseudocapsicum e S. mauritianum (Figuras 6E, 6K e 6N) variando de 19,32 µm a 21,07
µm (Tabela 1) e a fórmula 8m + 4sm foi observada em S. guaraniticum, S. scuticum e S.
amygdalifolium (Figuras 6F, 6G e 6P). A variação no tamanho do complemento
haplóide entre essas últimas espécies foi de 13,08 µm em S. amygdalifolium a 25,87 µm
em S. scuticum (Tabela 1). Duas espécies não foram agrupadas com as demais por
possuírem fórmulas bastante distintas. Solanum viarum (Figura 6A) exibiu 11m + 1sm e
24
complemento haplóide com 18,14 µm (Tabela 1). Solanum americanum (Figura 6J)
apresentou 10m + 2sm e complemento haplóide com 22,39 µm (Tabela 1).
As duas únicas espécies que apresentaram a maioria dos cromossomos
submetacêntricos foram S. gemellum com 5m + 7sm (Figura 6O) e S. palinacanthum
com 3m + 9sm (Figura 6B), além do tamanho de seus complementos haplóides estarem
dentre os maiores entre as espécies estudadas (25,74 µm e 27,9 µm, respectivamente).
Por fim, a espécie analisada como grupo externo, Vassobia breviflora, apresentou a
maioria dos cromossomos metacêntricos (9m + 3sm) e tamanho do complemento
haplóide igual a 19,63 µm (Figura 6R; Tabela 1), sendo mais similar a S. americanum.
Dessa forma, considerando a posição do centrômero e a variação no tamanho
cromossômico, os cariótipos das espécies estudadas se mostraram simétricos, com a
maioria classificada nas categorias 1A e 2A de índice de assimetria proposta por
Stebbins (1971), como pode ser visto na Tabela 1. A espécie S. palinacanthum, em
particular, foi a única classificada na categoria 3A, por possuir a maioria dos
cromossomos de seu complemento do tipo submetacêntrico com razão de braços e razão
entre os pares maior e menor, menor que a proporção 2:1 (Tabela 1; Figuras 1F, 6B e
7).
Bandamento C-CMA
3
/DAPI
O bandamento cromossômico mostrou dois principais padrões de distribuição da
heterocromatina, quando comparados o número, a posição e a composição de bases. Em
Vassobia breviflora (Figuras 2Q e 6R) e dentro dos subgêneros Leptostemonum e
Solanum, algumas das espécies estudadas (S. sisymbriifolium, S. guaraniticum, S.
25
scuticum, S. variabile, S. pseudocapsicum e S. americanum) mostrou bandas C-CMA
3
+
na região terminal de todos os cromossomos do complemento, além de um bloco maior
associado ao satélite (Figuras 2E, 2I, 2K, 2O, 2S e 6A-R), enquanto que nas outras
espécies (S. viarum, S. artropurpureum, S. amygdalifolium, S. trachytrichium, S.
granulosoleprosum, S. mauritianum, S. gemellum e Lycianthes australe) as bandas C-
CMA
3
+
foram observadas apenas como um bloco associado ao satélite (Figuras 2A, 2C,
2G, 2U, 2W, 2Y, 3C, 3E e 6A, C, L, M, N, O, P, Q). Solanum palinacanthum e S.
paniculatum mostraram uma distribuição diferenciada da heterocromatina. Solanum
palinacanthum exibiu banda terminal C-CMA
3
+
associada ao satélite no par 10, dots
proximais centroméricos nos braços longos e terminais nos braços curtos dos pares
submetacêntricos (com exceção dos pares 4 e 5 que possuem apenas dots proximais nos
braços longos), além de dots intersticiais nos dois braços cromossômicos dos pares
metacêntricos 1, 2 e 9 (Figuras 3G e 6B). Solanum paniculatum exibiu todos os
cromossomos metacêntricos com bandas C-CMA
3
+
terminais e todos os cromossomos
submetacêntricos (pares 3, 6, 8, com exceção do par 11) com bandas C-CMA
3
+
terminais nos braços curtos, além de dots proximais nos braços longos (Figuras 2M e
6E). Dentro da seção Pachyphylla, Solanum corymbiflorum, apresentou dois pares
cromossômicos contendo bandas C-CMA
3
+
terminais, no primeiro par metacêntrico
associado ao satélite e no braço curto do décimo par submetacêntrico (Figuras 3A e 6I).\
Com exceção de Lycianthes australe que apresentou bandas C-DAPI
+
na região
centromérica de todos os cromossomos (Figuras 3F e 6Q), e S. amygdalifolium que
mostrou bandas C-DAPI
+
na região centromérica dos dois maiores pares
cromossômicos (Figuras 2H e 6P), todas as outras espécies não apresentaram bandas C-
DAPI (Figuras 2B, 2D, 2F, 2J, 2L, 2N, 2P, 2R, 2T, 2V, 2X, 2Z, 3B, 3D, 3H e 6).
26
FISH com as sondas de DNAr
A hibridação in situ com a sonda de DNAr 45S mostrou que em Solanum e em
Lycianthes australe a sonda localizou dois sítios terminais de hibridação (Figuras 4A-H,
5A-H, 6A-H e 6J-Q). Contudo, tais sinais diferiram em localização entre os cariótipos.
Os sítios de hibridação com DNAr 45S coincidiram com os satélites e com as bandas C-
CMA
3
+
(Figura 6). Das espécies de Solanum, apenas em S. corymbiflorum a sonda de
DNAr 45S hibridou em dois pares cromossômicos. Um sítio foi localizado na região do
satélite no par 1 metacêntrico, e o outro na região terminal do braço curto do par 10
submetacêntrico (Figuras 5I e 6I). Da mesma maneira, Vassobia breviflora exibiu dois
pares cromossômicos contendo sítios de DNAr 45S, associado ao satélite do par 11 e na
região proximal/centromérica do par 9 (Figuras 4I e 6R).
FISH com a sonda de DNAr 5S mostrou sinais de hibridação variáveis em
tamanho e localização nas diferentes espécies. Em S. palinacanthum, S. guaraniticum,
S. scuticum e S. pseudocapsicum a hibridação in situ evidenciou sinais sempre no par 9,
o qual variou quanto ao tipo cromossômico (Figuras 6B, 6F, 6G e 6K). Solanum
palinacanthum exibiu o sinal na região intersticial (Figuras 5G e 6B) e em S.
guaraniticum, o sinal foi visto na região intersticial mais próxima do centrômero do par
metacêntrico (Figuras 5F e 6F). Solanum scuticum e S. pseudocapsicum apresentaram
os sinais de hibridação nas regiões proximal de pares submetacêntricos, sendo no braço
longo (Figuras 5E e 6G) e no braço curto (Figuras 5B e 6K), respectivamente. Em S.
paniculatum, a hibridação com sonda de DNAr 5S evidenciou um sinal proximal no
braço curto do par 8 submetacêntrico (Figuras 5D e 6E). Solanum corymbiflorum e S.
mauritianum mostraram sinais na região proximal do par 8 (Figuras 5I e 6I) e do par 12
(Figuras 5C e 6N), respectivamente, sendo ambos metacêntricos. Lycianthes australe,
27
por sua vez, mostrou estes mesmos sinais na região intersticial do par 7 metacêntrico
(Figuras 5A e 6Q). Diferentemente de todas as espécies aqui estudadas, Solanum
trachytrichium apresentou quatro sinais de hibridação com a sonda de DNAr 5S. Estes
sítios de DNAr 5S foram localizados na região intersticial do braço longo do par 5 e na
região terminal do par 8 (Figuras 5H e 6L).
Discussão
Análise citogenética convencional
A análise convencional mostrou que as espécies de Solanum, Lycianthes
australe e Vassobia breviflora apresentaram 2n = 24 cromossomos, concordando com
os números disponíveis no Index to Plant Chromosome Numbers
(http://mobot.mobot.org/W3T/Search/ipcn.html), do Missouri Botanical Garden, U.S.A,
para o gênero Solanum. Este número foi confirmado para a maioria das espécies
estudadas aqui. Para Solanum scuticum, S. gemellum, S. amygdalifolium e Lycianthes
australe a contagem foi inédita. Cerca de 50% das espécies de Solanaceae apresentam
números múltiplos de x = 12, o qual é considerado o número básico para o grupo
(Hunziker 2001, Randell e Symon 1976). Este número básico também é predominante
na subfamília Solanoideae para os gêneros Triguera, Lycopersicon, Lycianthes e
Vassobia (Hunziker 2001), assim como para Solanum (Olmstead et al. 1999, Hunziker
2001, Acosta et al. 2005). Somente duas espécies da seção Acanthophora apresentaram
2n = 22, Solanum mammosum e S. platense (Chiarini e Bernardello 2006). Números
diferentes de x = 12 foram descritos em grupos como Petunia, com x = 7 (Raven 1975)
e Fabiana, com x = 9 (Hunziker 2001) bem como na subfamília Cestroideae, onde x = 8
predomina (Olmstead et al. 1999; Hunziker 2001).
28
A análise convencional também mostrou que os núcleos são invariavelmente
arreticulados e que a condensação profásica é proximal em todas as espécies de
Solanum, Lycianthes australe e Vassobia breviflora. Geralmente, espécies com
cromossomos pequenos, menores que 3 µm, possuem núcleos arreticulados e com
condensação proximal em prófase (Guerra 2000). Nossos resultados mostraram que,
com exceção de S. corymbiflorum, onde o tamanho do lote haplóide foi de 77,8 µm, as
demais espécies apresentaram cromossomos pequenos, cerca de três vezes menores que
em S. corymbiflorum, com o tamanho do lote haplóide variando entre 13,08 µm e 27,9
µm (Tabela 1). Uma análise superficial dos idiogramas (Figura 6) dá a falsa impressão
de que os cariótipos aqui estudados têm tamanhos similares. No entanto, nossos dados
bem como a literatura descrita para outras espécies de Solanum e Lycianthes mostram
que há uma clara variação neste tamanho como 12,14 µm a 18,84 µm (Bernardello e
Anderson 1990), 24,8 µm a 35,05 µm (Bernardello et al. 1994), 16,30 µm a 38,75 µm
(Acosta et al. 2005) e 17, 08 µm a 33,71 µm (Chiarini e Bernardello 2006). Apesar de
não ter sido feito nenhum teste estatístico com os nossos dados e os da literatura para
comprovar se tal variação é significativa, nossos resultados sugerem que os cariótipos
das diferentes espécies de Solanum, Lycianthes australe e Vassobia breviflora se
diferenciaram por perdas e/ou ganhos de segmentos de DNA, já que o número não
variou.
Diferenças no tamanho cromossômico têm sido usadas para delimitar alguns
grupos de solanáceas. A seção Pachyphylla Dunal do subgênero Bassovia (Aubl.) Bitter
de Solanum possui cromossomos muito grandes em relação às demais espécies do
gênero, além de possuir anteras com conectivos espessados e glandulosos. Estas
características morfológicas e cariotípicas levaram alguns autores a considerar tal grupo
como um gênero independente, Cyphomandra Mart. ex Sendtn. (Bohs 1989, 1994;
29
Hunziker 2001; Child e Lester 2001). Contudo, análises de filogenia molecular
utilizando genes conservados de cloroplasto, ndhF e rbcL, com enfoque em Solanum e
gêneros relacionados, estabeleceram que Chyphomandra encontra-se filogeneticamente
dentro do gênero Solanum (Olmstead e Palmer 1992; Bohs 1995; Olmstead e Palmer,
1997; Bohs e Olmstead, 1997, 1999; Olmstead et al. 1999; Bohs 2004, 2005).
Nee (1999) adotou as modificações propostas pela filogenia molecular e aderiu à
transferência dos táxons de Cyphomandra para Solanum, como previamente
estabelecida por Bohs (1995). Solanum corymbiflorum, anteriormente chamada de
Cyphomandra corymbiflora Sendtn. e agora pertencente à seção Pachyphylla de
Solanum, exibiu cromossomos grandes (6 µm, em média) e o maior tamanho de lote
haplóide (77,88 µm), como descrito anteriormente. A análise citogenética convencional
sustenta que as espécies da seção Pachyphylla poderiam ser mantidas no gênero
Cyphomandra, como proposto por Child e Lester (2001) e Hunziker (2001). Contudo,
se tais espécies realmente pertencerem a Solanum, como indicam os estudos de
filogenia molecular acima citados, teremos que admitir que os cariótipos da seção
Pachyphylla se diferenciaram das demais espécies do gênero por acúmulo substancial
de DNA, sem mudanças substanciais no número e na forma dos cromossomos (veja a
Figura 6I).
Este conjunto de informações contrastantes levanta dúvidas sobre o valor das
características diagnósticas utilizadas para alocar Chyphomandra dentro do gênero
Solanum. Dessa maneira, nosso trabalho permite levantar a seguinte questão: será que
esta análise filogenética baseada no sequenciamento de genes conservados de
cloroplasto não deveria levar em consideração a reunião de características morfológicas
exclusivas, como anteras com conectivos espessados e glandulosos e cariótipos com
cromossomos muito grandes em relação aos do gênero Solanum?
30
Todos os cariótipos das espécies de Solanum, de Lycianthes australe e de
Vassobia breviflora mostraram cromossomos metacêntricos e submetacêntricos, sendo
os menores cromossomos dos complementos geralmente submetacêntricos, exceto para
Solanum variabile e S. americanum que apresentaram os menores cromossomos
metacêntricos. Isto implica que a diminuição do tamanho cromossômico dentro do
complemento foi acompanhada por uma mudança na posição do centrômero, quando
comparado com os outros cromossomos. Tal tendência também pode ser observada nos
idiogramas apresentados por Bernardello e Anderson (1990), Pringle e Murray (1991),
Bernardello et al. (1994), Acosta et al. (2005) e Chiarini e Bernardello (2006).
As únicas espécies estudadas neste trabalho que apresentaram a maioria dos
cromossomos do tipo submetacêntricos foram Solanum gemellum da seção Extensum e
S. palinacanthum da seção Acanthophora. Casos similares foram descritos por Acosta et
al. (2005) para S. tucumanense e por Chiarini e Bernardello (2006) para S. aenictum.
Lycianthes australe e Vassobia breviflora também seguem a tendência de possuir a
maioria dos cromossomos do complemento do tipo metacêntrico. Cariótipos com
cromossomos telocêntricos ou acrocêntricos são atípicos em espécies de Solanum,
sendo reportados somente para S. muricatum e S. basendopogon da seção Basarthrum
(Bernardello e Anderson 1990). Pringle e Murray (1991) também observaram que os
cariótipos de espécies anteriormente descritas como Cyphomandra possuem, ao menos,
um par acrocêntrico em seus complementos.
Embora pequenas variações sejam encontradas na composição cariotípica em
relação ao tamanho e morfologia cromossômica, os cariótipos das espécies de Solanum,
Lycianthes australe e Vassobia breviflora foram classificados nas categorias 1A ou 2A
de assimetria de Stebbins (1971), por serem altamente simétricos assim como em outras
espécies de Solanum (Bernardello e Anderson 1990, Bernardello et al. 1994, Acosta et
31
al. 2005, Chiarini e Bernardello 2006). Dentro do subgênero Leptostemonum, Acosta et
al. (2005) observaram que espécies da seção Acanthophora mostraram os cariótipos
mais assimétricos, concordando com nossos resultados, uma vez que S. palinacanthum,
também da seção Acanthophora, foi a única classificada na categoria 3A.
A análise dos índices de simetria TF % e R mostrou que dentre as espécies
analisadas aqui, S. guaraniticum e S. variabile possuem os cariótipos mais simétricos,
com um alto valor de TF %, devido a maioria dos cromossomos ser metacêntricos, e
um baixo R, ou seja, com o primeiro par aproximadamente do mesmo tamanho do
último par (Figura 7). Solanum viarum, S. americanum, S. pseudocapsicum, S.
paniculatum e S. scuticum da seção Torva, Lycianthes australe e Vassobia breviflora se
destacaram por possuírem a maioria dos cromossomos metacêntricos, porém, o primeiro
par consideravelmente maior que o último par. Solanum palinacanthum e S. gemellum
apresentaram os cariótipos mais assimétricos com os menores valores de TF%, pois
pesar de possuírem os primeiros e últimos pares cromossômicos de tamanhos
aproximados, a maioria dos cromossomos foi do tipo submetacêntrico (Figura 7).
A presença de um par cromossômico com satélite é comum na maioria das
espécies de Solanum (Bernardello e Anderson 1990, Bernardello et al. 1994, Acosta et
al. 2005). Essa tendência também foi observada nas espécies do presente estudo, que
apresentaram apenas um par de cromossomos com satélite. A mesma situação foi vista
na seção Leptostemonum, exceto para S. pseudolulo Heiser, que possui dois pares
cromossômicos com satélites e as espécies do complexo S. indicum com um máximo de
três pares com satélites (Bernardello et al. 1994). Com relação ao tipo cromossômico, os
satélites em Solanum se localizam em cromossomos metacêntricos (Acosta et al. 2005),
enquanto no subgênero Leptostemonum se localizam em cromossomos metacêntricos e
no braço curto de cromossomos submeta e subtelocêntricos (Bernardello et al. 1994,
32
Chiarini e Bernardello 2006). Da mesma maneira, a maioria das espécies estudadas aqui
apresentou os satélites em braços curtos de cromossomos submetacêntricos. Além disso,
o par portador do satélite está entre os quatro últimos do complemento, com exceção de
S. corymbiflorum (par 1), Lycianthes australe (par 2), S. americanum (par 3) e S.
gemellum (par 6). Ao contrário do que foi visto na maioria das espécies aqui estudadas,
Acosta et al. (2005) e Chiarini e Bernardello (2006) observaram que o par com satélite
está entre os cinco maiores cromossomos do complemento das espécies de Solanum.
FISH com as sondas de DNAr 45S e 5S
A aplicação da hibridação in situ com a sonda pTa71 (DNAr 45S de trigo)
confirmou os sítios de satélites observados pelas técnicas convencional e de
bandamento C-CMA
3
nas espécies estudadas aqui. Esta localização segue o padrão de
distribuição comum à maioria das espécies vegetais, ocorrendo sempre nas regiões
terminais dos cromossomos (Lima de Faria 1976). A localização terminal dos sítios de
DNAr 45S também foi vista em outras solanáceas como Solanum bulbocastanum (Dong
et al. 2000), Capsicum (Moscone et al. 1995), Nicotiana (Yong Lim et al. 2000) e
Cestrum (Fregonezi et al. 2006), bem como em outros grupos vegetais como Hordeum
L. (Leitch e Heslop-Harrison 1992), Sorghum Moench (Sang e Liang 2000) Helianthus
L. (Vanzela et al. 2002) e Maxillaria Ruiz & Pav. (Cabral et al. 2006). Apesar da
localização terminal do DNAr 45S ter sido comum a muitas espécies de plantas, o
número de sítios foi variável. A maioria das espécies de Capsicum estudada por
Moscone et al. (1995) possui dois sítios de hibridação assim como as espécies do
presente estudo, com exceção de S. corymbiflorum e Vassobia breviflora. Em Cestrum
(Fregonezi et al. 2006) e Hordeum vulgare L. cv Sultan (Leitch e Heslop-Harrison
33
1992) foram observados quatro sítios de hibridação, enquanto em Sorghum (Sang e
Liang 2000) e Maxillaria (Cabral et al. 2006) variou de dois a quatro sítios em
diferentes espécies.
Embora a FISH não seja uma técnica totalmente quantitativa, a intensidade do
sinal pode estar relacionada com o número de cópias dos genes de estruturas similares
(Leicht e Heslop-Harrison 1992). O tamanho dos sítios em Solanum, Lycianthes
australe e Vassobia breviflora se manteve constante com exceção de S. corymbiflorum
que apresentou o sinal de DNAr 45S do par 1 metacêntrico maior que o sinal do par
submetacêntrico. Assim, diferenças nos tamanhos dos sítios podem refletir diferenças
intraespecíficas no número de repetições por cístrons, assim como acontece em Cestrum
(Fregonezi et al. 2006).
A hibridação com a sonda pTa794 (DNAr 5S de trigo) mostrou sinais na região
pericentromérica, geralmente nos braços curtos dos menores cromossomos de cada
complemento. A localização pericentromérica do DNAr 5S também ocorre em S.
bulbocastanum, porém, no maior cromossomo do complemento (Dong et al. 2000). Em
outros gêneros como Nicotiana (Yong Lim et al. 2000, Kitamura et al. 2001),
Lycopersicon (Lapitan et al. 1991) e Cestrum (Fregonezi et al. 2006) sítios de DNAr 5S
também foram localizados preferencialmente na região pericentromérica, porém nos
braços longos e curtos dos cromossomos. Estas informações indicam que estas
sequências possuem uma localização conservada nestes cariótipos, seguindo a teoria do
campo cromossômico de Lima-de-Faria (1976) para regiões preferenciais de ocorrência
e funcionamento de alguns segmentos de DNA. Independente do número de sítios de
DNAr 5S localizados pela sonda, já que S. trachytrichium exibiu quatro sítios, estes
também seguem o mesmo padrão descrito acima.
34
Bandamento C-CMA
3
-DAPI
O bandamento cromossômico nas espécies de Solanum, Lycianthes australe e
Vassobia breviflora mostrou dois principais padrões de distribuição da heterocromatina,
quando comparados o tamanho, o número, a posição e a composição de bases: (i)
bandas C-CMA
3
+
na região terminal de todos os cromossomos do complemento, além
de um bloco maior associado ao satélite e (ii) bandas C-CMA
3
+
apenas como um bloco
associado ao satélite. Esta distribuição da heterocromatina segue o modelo de dispersão
equilocal/equidistante proposto por Schweizer e Loidl (1987). Esses autores observaram
que em muitas espécies de plantas há uma predominância de bandas equilocais
generalizadas, isto é, bandas que ocorrem na mesma região em pelo menos 80% dos
cromossomos de cada cariótipo. Assim, o padrão de distribuição da heterocromatina
observado nas espécies do presente estudo foi equilocal uma vez que os dots C-CMA
3
+
apareceram preferencialmente na região terminal dos cromossomos.
Esta distribuição equilocal da heterocromatina foi vista em algumas espécies de
Solanum da seção Petota (Pijnaker e Ferwerda 1984), porém na região
pericentromérica, assim como em outros gêneros de Solanaceae, como em Capsicum
(Moscone et al. 1993) e em Lycopersicon (Peterson et al. 1996), que exibiram a maioria
dos cromossomos com bandas C pericentroméricas. Em Nicotiana, Merrit (1974) e
Nakamura et al. (2001) encontraram bandas C principalmente terminais. Contudo,
Fregonezi et al. (2006) encontraram diferentes famílias de heterocromatina em Cestrum,
porém, algumas equilocais e equidistantes e outras não. Em gêneros de outras famílias
como Helianthus (Vanzela et al. 2002) e Hordeum (Leitch e Heslop-Harrison 1992) a
distribuição equilocal da heterocromatina ocorre principalmente nas regiões proximais
dos cromossomos de cada complemento, enquanto diferentes espécies de Maxillaria
35
apresentaram bandas com distribuições proximal, intersticial e terminal (Cabral et al.
2006). Schweizer e Loidl (1987) mostraram que em alguns grupos os blocos de
heterocromatina tendem a se distribuir nos braços de diferentes cromossomos a uma
distância igual a partir do centrômero (bandas equidistantes). Isto fica bastante evidente
quando comparamos a localização física dos blocos C-CMA
3
+
em Solanum
palinacanthum. Tal distribuição simétrica foi atribuída à amplificação e à transposição
de heterocromatina que ocorre entre heterólogos durante a intérfase de acordo com a
disposição de Rabl (veja Guerra 2000). Dessa forma, os dois modelos de dispersão da
heterocromatina, (i) bandas C-CMA
3
+
na região terminal de todos os cromossomos do
complemento, além de um bloco maior associado ao satélite (ii) bandas C-CMA
3
+
apenas como um bloco maior associado ao satélite, foram observados nas espécies aqui
estudadas.
Guerra (2000) comparou os padrões de distribuição de bandas C em mais de 100
espécies de angiospermas, a fim de identificar padrões gerais de distribuição de
heterocromatina ou locais preferenciais em que esta pode ocorrer. Ele concluiu que a
distribuição das bandas C, além de ser predominantemente equilocal, parece depender,
ao menos em parte, do tamanho do cromossomo. Isto porque as bandas proximais, em
geral, foram mais comuns nos cariótipos com cromossomos pequenos, como visto em
espécies de Solanum da seção Petota (Pijnaker e Ferwerda 1984). Nossos resultados
contradizem isso em parte, já que a maioria dos cromossomos de Solanum e Vassobia
breviflora são considerados pequenos por medirem em média 2 µm, e apresentaram
distribuição equilocal da heterocromatina na região terminal.
Guerra (2000) também observou que em cariótipos com cromossomos pequenos,
a heterocromatina localizada na região telomérica e intersticial são geralmente ricas em
36
GC, enquanto a heterocromatina proximal é geralmente rica em AT, concordando com o
tipo heterocromático encontrado nas espécies do presente estudo.
Em conclusão, o mapeamento físico dos diferentes tipos de DNAs repetitivos
gerados neste trabalho, quando comparados a outros idiogramas e medidas realizadas
para outras espécies do gênero, reforçam a hipótese de que nas espécies de Solanum e
Lycianthes australe as alterações cariotípicas ocorrem principalmente por mudanças nos
padrões de amplificação/dispersão de diferentes segmentos de DNAs repetitivos.
Contudo, as diferenças no tamanho dos cariótipos encontradas aqui, exceto para S.
corymbiflorum, de 13,08 µm em S. amygdalifolium a 27,90 µm em S. palinacanthum,
bem como aquelas descritas na literatura, de 12,14 µm (Bernardello e Anderson 1990) a
38,75 µm (Acosta et al. 2005), sugerem duas possibilidades: (i) acúmulo ou perda de
outras famílias DNAs repetitivos (como por exemplo retrotransposons, SSRs, etc) não
estudados nos artigos citados e/ou (ii) discrepâncias quanto aos critérios utilizados nas
medições para montagem dos idiogramas empregados pelos diferentes autores.
Um último aspecto a ser ressaltado, é que neste trabalho consideramos o
cariótipo de Vassobia breviflora como um elemento externo, pois mesmo possuindo
características citogenéticas convencionais semelhantes a Solanum e Lycianthes
australe, esta espécie apresenta aspectos morfológicos evidentemente distintos, como a
presença de antera com deiscência longitudinal e ovário com nectário. Já Lycianthes e
Solanum apresentam características morfológicas muito similares, como antera poricida
e ovário sem nectário, porém, são taxonomicamente distintos pelo fato de Lycianthes
apresentar o cálice não dividido em lobos como em Solanum (Hunziker 2001). Contudo,
Solanum e Lycianthes australe compartilham das mesmas características citogenéticas
como: 2n = 24, núcleos arreticulados com condensação proximal em prófase,
cromossomos pequenos, cariótipos de tamanhos semelhantes e simétricos com
37
cromossomos meta e submetacêntricos e presença de dois sítios de hibridação com
sonda de DNAr 45S coincidentes com a banda C/CMA
3
+
em seus satélites. Se
tomarmos como exemplo a circunscrição de Cyphomandra dentro de Solanum, onde
existem mais diferenças morfológicas e citogenéticas contrastantes, do que quando
comparado com Solanum e Lycianthes australe, por que não considerar outras
características diagnósticas em novos estudos filogenéticos envolvendo Lycianthes,
Cyphomandra e Solanum?
38
Agradecimentos
Os autores agradecem ao CNPq e à Fundação Araucária pelo apoio financeiro.
39
Figura 1. Coloração convenci
onal (Giemsa) em (A)
Solanum americanum,
(B)
S. gemellum,
(C)
S. atropurpureum
, (D)
S. viarum,
(E)
S. granulosoleprosum,
(F)
S. palinacanthum,
(G)
S.
pseudocapsicum, (H) S. scuticum, (I) S. variabile, (J) S. trachytrichium, (K) S. paniculatum, (L) S. mauritianum, (M) S. sisymbriifolium, (N) Vassobia breviflora, (O) S. guaraniticum, (P) S.
amygdalifolium, (Q) Lycianthes australe e (R) S. corymbiflorum. Barra corresponde a 5 µm.
40
Figura 2.
Bandamento C
-
CMA
3
/DAPI em (A
-
B)
Solanum viarum,
(C
-
D
) S. artropurpureum,
(E
-
F)
S. sisymbriifolium,
(G
-
H)
S. amygdalifolium,
(I
-
J)
S. guar
anticum,
(K
-
L)
S.
variabile, (M-N) S. paniculatum, (O-P) S. pseudocapsicum, (Q-R) Vassobia breviflora , (S-T) S. americanum, (U-V) S. trachytrichium, (W-X) S. granulosoleprosum e (Y-Z) S.
mauritianum. Barra corresponde a 5 µm.
41
Figura 3. Bandamento C-CMA
3
/DAPI em (A-B) Solanum corymbiflorum, (C-D) S. gemellum, (E-F) Lycianthes australe e (G-H) S. palinacanthum. Barra corresponde a 5
µ
m.
42
Figura 4. FISH com a sonda de DNAr 45S mostrando dois sítios de hibridação, coincidentes com os satélites em (A)
Solanum viarum,
(B)
S. artropurpureum,
(C)
S. sisymbriifolium,
(D) S. variabile, (E) S. americanum, (F) S.. amygdalifolium, (G) S. gemellum e (H) S. granulosoleprosum. Exceção foi (I) Vassobia breviflora, com quatro sinais. Barra corresponde a
5 µm.
43
Figura 5. FISH com as sondas de DNAr 45S d
etectadas com biotina
-
FITC (verde) e a sonda de DNAr 5S detectada com anti
-
digoxigenina
-
rodamina (vermelho) em
(A)
Lycianthes australe,
(B) Solanum pseudocapsicum, (C) S. mauritianum, (D) S. paniculatum, (E) S. scuticum, (F) S. guaraniticum, (G) S. palinacanthum, (H) S. trachytrichium e (I) S. corymbiflorum. Barra
corresponde a 5
µ
m.
44
Figura 6. Idiogramas de (
A
)
Solanum viarum
, (
B
)
S. palinacanthum,
(
C
)
S. artropurpureum,
(
D
)
S. sisymbriifolium,
(
E
)
S. paniculatum,
(
F
)
S.
guaraniticum, (G) S. scuticum, (H) S. variabile, (I) S. corymbiflorum, (J) S. americanum, (K) S. pseudocapsicum, (L) S. trachytrichium, (M) S.
granulosoleprosum, (N) S. mauritianum, (O) S. gemellum, (P) S. amygdalifolium, (Q) Lycianthes australe e (R) Vassobia breviflora.
45
Figura 7. Simetria cariotípica.
(
1
)
Solanum viarum
, (
2
)
S. palinacanthum
, (
3
)
S. artropurpureum
, (
4
)
S.
sisymbriifolium, (5) S. paniculatum, (6) S. guaraniticum, (7) S. scuticum, (8) S. americanum, (9) S.
pseudocapsicum, (10) S. trachytrichium, (11) S. granulosoleprosum, (12) S. mauritianum, (13) S. gemellum, (14)
S. amygdalifolium, (15) S. corymbiflorum, (16) S. variabile, (17) Lycianthes australe e (18) Vassobia breviflora.
Simetria cariotípica
2
17
13
9
6
16
4
7
18
1
8
5
15
12
3
14
10
11
1,30
1,40
1,50
1,60
1,70
1,80
1,90
34,00 36,00 38,00 40,00 42,00 44,00 46,00 48,00
TF%
PM/Pm
46
Tabela 1. Características cariotípicas de espécies de Solanum, Lycianthes australe e Vassobia breviflora.
Espécies 2n
FCH TLH (µm) R TF%
AC Localidades e Registro
Subgênero Leptostemonum Dunal (bitter)
Seção Acanthophora Dunal
S. viarum Dunal 24 11m + 1sm 18,14 1,62 43,65 1A Ibiporã, PR, 41933
S. palinacanthum Dunal 24 3m + 9sm 27,90 1,45 34,38 3A Jataizinho, PR, 41938
S. artropurpureum Schrank 24 6m + 6sm 23,04 1,49 41,69 2A Tibagi, PR, 41937
Seção Cryptocarpum Dunal
S. sisymbriifolium Lam. 24 6m + 6sm 27,41 1,53 41,28 2A Londrina, PR, 41949
Seção Torva Nees
S. paniculatum L. 24 7m + 5sm 19,32 1,55 42,63 1A Londrina, PR, 41950
S. guaraniticum A. St. Hil. 24 8m + 4sm 19,90 1,37 44,75 2A Faxinal, PR, 41935; Londrina, PR, 41936
S. scuticum M. Nee 24 8m + 4sm 25,87 1,69 42,67 2A Londrina, PR, 41934
S. variabile Mart. 24 12m 20,50 1,51 44,63 1A Londrina, PR, 41084
Subgênero Solanum L.
Seção Solanum
S. americanum Mill. 24 10m + 2sm 22,39 1,67 43,57 2A Londrina, PR, 41939; Ibiporã, PR, 41940
Seção Geminata G. Don.
S. pseudocapsicum L. 24 7m + 5sm 20,99 1,72 41,12 2A Londrina, PR, 41941
S. trachytrichium Bitter 24 6m + 6sm 15,47 1,62 41,71 1A Londrina, PR, 41942
Seção Brevantherum (Seithe) D’Arcy
S. granulosoleprosum Dunal 24 6m + 6sm 13,50 1,60 41,40 1A Sapopema, PR, 41943
S. mauritianum Martius ex Sendtn. 24 7m + 5sm 21,04 1,46 41,70 2A Porto Alegre, RS, 41952
Seção Extensum D’Arcy
S. gemellum Martius ex Sendtn. 24 5m + 7sm 25,74 1,47 39,61 2A Londrina, PR, 41953
Seção Dulcamara (Moench) Dumort
S. amygdalifolium Steud. 24 8m + 4sm 13,08 1,62 41,37 2A Aquidauana, MS, 42116
Subgênero Bassovia (Aubl.) Bitter
Seção Pachyphylla Dunal
S. corymbiflorum (Sendtn.) Bohs 24 6m + 6sm 77,88 1,43 41,50 2A Sapopema, PR, 41947
Lycianthes australe (Morton) A.T.Hunz.
24 6m + 6sm 20,02 1,81 41,38 1A Londrina, PR, 41951
Vassobia breviflora (Sendtn.) Hunz.
24 9m + 3sm 19,63 1,63 43,45 1A Londrina, PR, 42117
FCH = fórmula cariotípica haplóide; TLH = tamanho do lote haplóide; R = razão entre o maior e o menor par cromossômico, AC = Tipo de assimetria cariotípica de acordo
com Stebbins (1971)
comprimento
braços curtos
comprimento cromossômico total
∑
X 100
TF%
47
Referências
Acosta M. C., Bernardello G., Guerra M., Moscone E. A. (2005) Karyotype analysis in several South
American species of Solanum and Lycianthes rantonnei (Solanaceae). Taxon. 54: 713-723.
Bernardello L. M., Anderson G. J. (1990) Karyotype studies in Solanum section Basarthrum
(Solanaceae). Amer. J. Bot. 77: 420-431.
Bernardello L. M., Heiser C. B., Piazzano M. (1994) Karyotype studies in Solanum section Lasiocarpa
(Solanaceae). Amer. J. Bot. 81: 95-103.
Bohs L. (1989) Solanum allophyllum (Miers) Standl. and the generic delimitation of Cyphomandra and
Solanum (Solanaceae). Ann. Missour. Bot. Gard. 76: 1129-1140.
Bohs L. (1994) Cyphomandra (Solanaceae). Flora Neotropica, New York, Monograph. 63: 1-175.
Bohs L. (1995) Transfer of Cyphomandra (Solanaceae) and its species to Solanum. Taxon. 44: 583-587.
Bohs L. (2004) A Chloroplast DNA Phylogeny of Solanum Section Lasiocarpa. Syst. Bot. 29: 177–187.
Bohs L. (2005) Major clades in Solanum based on ndhF sequences. In Keating R. C., Hollowell V. C.,
Croat T. B (eds.) A festschrift for William G. D’Arcy: the legacy of a taxonomist. Monographs in
Systematic Botany from the Missouri Botanical Garden, Vol. 104. Missouri Botanical Garden Press,
St. Louis. pp 27-49.
Bohs L., Olmstead R. (1997) Phylogenetic Relationships in Solanum (Solanaceae) Based on ndhF
Sequences. Syst. Bot. 22: 5-17.
Bohs L., Olmstead R. (1999) Solanum phylogeny inferred from chloroplast DNA sequence data. In: Nee
M., Symon D. E., Lester R. N. e Jessop J. P. (Eds.) Solanaceae IV: advances in biology and
utilization. Kew, The Royal Botanic Gardens. pp 97-109.
Cabral J. S., Felix P. L., Guerra M. (2006) Heterochromatin diversity and its co-localization with 5S and
45S rDNA sites in chromosomes of four Maxillaria species (Orchidaceae). Gen. Mol. Biol. 29: 659-
664.
48
Chiarini F., Bernardello G. (2006) Karyotype Studies in South American Species of Solanum subgen.
Leptostemonum (Solanaceae). Plant biol (Stott). 8:486-493.
Child A., Lester R. N. (2001) Synopsis of the genus Solanum L. and its infrageneric taxa. In: van der
Berg R. G., Barendse G. W. N., van der Weeden e Mariani C. (Eds.). Solanaceae V: Advances in
Taxonomy and Utilization. Nijmegen, Nijmegen University Press, pp 39-52.
Cuadrado A., Jouve N. (1994) Highly repetitive sequences in B chromosomes of Secale cereale
revealed by fluorescence in situ hybridization. Genome. 37:709-712.
Dong F., Song J., Naess S.K., Helgeson J.P., Gebhardt C., Jiang J. (2000). Development and
applications of a set of chromosome-specific cytogenetic DNA markers in potato. Theor Appl Genet.
101:1001–1007.
Flavell R. B. (1986) Repetitive DNA and chromosome evolution in plants. Phylosophical Transcriptions
of the Royal Society of London Series B. 312: 227-242.
Fregonezi J. N., Fernandes T., Torezan J. M. D., Vieira A. O., Vanzela A. L. L. (2006) Karyotype
differentiation of four Cestrum species (Solanaceae) based on physical mapping of repetitive DNA.
Gen. Mol Biol. 29: 97-104.
Guerra M. (1986) Reviewing the chromosome nomenclature of Levan et al. Rev. Bras. Gen. 9: 741-743.
Guerra M. (2000) Patterns of heterochromatin distribution in plant chromosomes. Gen. Mol. Biol. 23(4):
1029-1041.
Heslop-Harrison J. S. (1991) The Molecular cytogenetics of plants. J. Cell Scien. 100: 15-21.
Heslop-Harrison J. S. (2000) Comparative Genome Organization in Plants: From Sequence and Markers
to Chromatin and Chromosomes. Pl. Cell. 12: 617-635.
Hunziker, A. T. (2001) Genera Solanacearum. The genera of Solanaceae illustrade, arranged according
to a new system. Ruggell: A. R.G. Gantner Verlag. 500p. 136 fig.
49
Huziwara Y. (1962) Karyotype analysis in some genera of Compositae. VIII. Further studies on
chromosome of Aster. Amer. J. Bot. 49: 116-119.
Kitamura S., Inoue M., Shikazono N., Tanaka A. (2001) Relationship among Nicotiana species revealed
by the 5S rDNA spacer sequence and fluorescence in situ hybridization. Theor Appl Genet. 103: 678-
686.
Komarova N. Y., Grabe1 T., Huigen D. J., Hemleben1 V., Volkov R. A. (2004) Organization,
differential expression and methylation of rDNA in artificial Solanum allopolyploids. Pl. Mol. Biol.
56: 439–463.
Lapitan N. L. V., Ganal M. W., Tanksley S. D. (1991) Organization of the 5S ribosomal RNA genes in
the genome of tomato. Genome. 34: 509-514.
Lapitan N. L. V. (1992) Organization and evolution of higher plant nuclear genomes. Genome. 35:171-
181.
Lima de Faria A. (1976) The chromosome field I. Prediction of the location of ribosomal cistrons
Hereditas. 83: 1-22.
Leicht I. J., Heslop-Harrison J. S. (1992) Physical mapping of the 18S-5,8S-26S rRNA genes in barley
by in situ hybridization. Genome. 35:1013-1018.
Merritt J. F. (1974) The distribution of heterochromatin in the genus Nicotiana (Solanaceae). Amer. J.
Bot. 61(9): 982-994.
Moscone E. A. (1992) Estudios de cromosomas meióticos en Solanaceae de Argentina. Darwiniana. 31:
261-297.
Moscone E. A. (1993) Estudios cromosomicos em Capsicum (Solanaceae) II. Analisis cariotipico de C.
parvifolium y C. annum var. annum. Kurtiziana. 22: 9-18.
Moscone E. A., Lambrou M., Hunziker A. T., Ehrendorfer F. (1993) Giemsa C-banded karyotypes in
Capsicum (Solanaceae). Pl. Syst. Evol. 186: 213-229.
50
Moscone E. A., Loidl J., Ehrendorfer F., Hunziker A. T. (1995) Analysis of active nucleolus organizing
regions in Capsicum (Solanaceae) by silver staining. Amer. J. Bot. 82: 276–287.
Nakamura R., Kitamura S., Inoue M., Ohmido N. (2001) Karyotype analysis of Nicotiana kawakamii Y.
Ohashi using DAPI banding and rDNA FISH. Theor Appl Genet. 102: 810-814.
Nee M. (1999) Synopsis of Solanum in the New World. In: Nee M., Symon D. E., Lester R. N., Jessop
J. P. (Eds.). Solanaceae IV: Advances in biology and utilization. The Royal Botanic Gardens, Kew.
pp. 285-333.
Obute G. C., Ndukwu B. C., Okoli B. E. (2006) Cytogenetic studies on some Nigerian species of
Solanum L. (Solanacaeae). Afr. J. Biotec. 5: 689-692.
Olmstead R., Palmer J. (1992) A chloroplast DNA phylogeny of the Solanaceae: subfamilial
relationships and character evolution. Ann. Miss. Bot. Gard. 79 (2): 346-360.
Olmstead R., Palmer J. (1997) Implications for the phylogeny, classification and biogeography of
Solanum from cpDNA restriction-site variation. Syst. Bot. 22: 19-29.
Olmstead R., Sweere J. A., Spangler R. E., Bohs L., Palmer J. D. (1999) Phylogeny and provisional
classification of the Solanaceae based on chloroplast DNA. In: Nee M., Symon D. E., Lester R. N.,
Jessop J. P. (Eds.). Solanaceae IV: Advances in biology and utilization. The Royal Botanic Gardens,
Kew. pp. 111-137.
Peterson D. G., Price H. J., Johnston J. S, Stack S. M. (1996) DNA content of heterochromatin and
euchromatin in tomato (Lycopersicon esculentum) pachytene chromosomes. Genome. 39: 77-82.
Pijnaker L. P., Ferwerda M. A. (1984) Giemsa C-banding of potato chromosomes. Can. J. Gen. Cyt. 26:
415-419.
Pringle G. J., Murray B. G. (1991) Karyotype diversity and nuclear DNA variation in Cyphomandra. In:
Hawkes J. G., Lester R. N., Nee M., Estrada N. (Eds) Solanaceae III – Taxonomy, chemistry,
evolution. The Royal Botanic Garden and The Linnean Society of London, Kew, pp. 247-252.
51
Randell B. R., Symon D. E. (1976) Chromosome numbers in Australian Solanum species. Austr. J. Bot.
24: 369–379.
Raven P. H. (1975) The bases of angiosperm phylogeny. Ann. Missouri Bot. Gard. 62:724-764.
Sang Y., Liang G. H. (2000) Comparative physical mapping of the 18S-5,8S-26S rDNA in three
sorghum species. Genome. 43:918-922.
Schwarzacher T. P., Ambros P., Schweizer D. (1980) Application of Giemsa banding to orchid
karyotype analysis. Pl. Syst. Evol. 134: 293-297.
Schweizer D., Loidl J. (1987) A model for heterochromatin dispersion and the evolution of C-band
patterns. Chrom. Today. 9: 61-74.
Srebniak M., Rasmussen O., Ma£uszyñska J. (2002) Cytogenetic analysis of an asymmetric potato
hybrid. J. Appl. Genet. 43(1): 19-31.
Stebbins G L (1971) Chromosomal Evolution in Higher Plants. Addison-Wesley Publishing Company,
216p.
Vallejos C. E., Tanksley S. D., Bernatzky R. (1986) Localization in the tomato genome of DNA
restriction fragments containing sequences homologous to the rRNA (45S), The major chlorophyll
a/b binding polypeptide and the ribulose bisphosphate carboxylase genes. Genetics. 112: 93-105.
Vanzela A. L. L., Ruas C. F., Oliveira M. F., Ruas P. M. (2002) Characterization of diploid, tetraploid
and hexaploid Helianthus species by chromosome banding and FISH with 45S rDNA probe.
Genetica. 114: 105-111.
Volkov R. A., Zanke C., Panchuk I. I., Hemleben V. (2001) Molecular evolution of 5S rDNA of
Solanum species (sect. Petota): application for molecular phylogeny and breeding. Theo. Appl.
Genet. 103:1273-1282.
Yoong Lim K, Matyasek R, Lichtenstein C P, Leitch A R (2000) Molecular cytogenetic analyses and
phylogenetic studies in the Nicotiana section Tomentosae. Chromosoma. 109: 245-258.
52
CONCLUSÕES
1. A análise convencional reforçou que as espécies de Solanum, Lycianthes australe e Vassobia
breviflora possuem estabilidade cromossômica numérica com 2n = 24, confirmando a contagem
para a maioria das espécies estudas aqui. Para Solanum scuticum, S. gemellum, S. amygdalifolium e
Lycianthes australe a contagem é inédita.
2. Todas as espécies apresentaram núcleos arreticulados com condensação profásica proximal,
cariótipos simétricos com cromossomos pequenos (cerca de 2 µm) e predominância dos tipos meta e
submetacêntricos.
3. A análise por bandamento cromossômico mostrou dois principais padrões de distribuição da
heterocromatina: (i) bandas C-CMA
3
+
na região terminal de todos os cromossomos do
complemento, além de um bloco maior associado ao satélite (ii) bandas C-CMA
3
+
apenas como um
bloco maior associado ao satélite.
4. Os blocos heterocromáticos ricos em GC exibiram distribuição equilocal e equidistante, com sítios
preferenciais de ocorrência, como por exemplo, região terminal de todos os cromossomos e/ou
blocos CMA
3
+
associados aos satélites.
5. Com exceção de Lycianthes australe que apresentou bandas C-DAPI
+
na região centromérica de
todos os cromossomos e S. amygdalifolium que mostrou bandas C-DAPI
+
na região centromérica
dos dois maiores pares cromossômicos, todas as outras espécies não apresentaram bandas C-DAPI,
mostrando que as regiões ricas em GC são mais dinâmicas que aquelas ricas em AT.
6. A hibridação in situ com a sonda de DNAr 45S mostrou dois sítios coincidentes com os satélites e
com as bandas C-CMA
3
+
, ocorrendo preferencialmente nas regiões terminais dos braços curtos de
tipos submetacêntricos, com variações nos cromossomos de ocorrência. Exceções foram S.
53
corymbiflorum e Vassobia breviflora que apresentaram quatro sinais marcados com a sonda de
DNAr 45S.
7. O DNAr 5S ocorreu preferencialmente nas regiões pericentroméricas dos braços curtos dos menores
pares cromossômicos de cada complemento, com exceção de Solanum trachytrichium, que
apresentou quatro sinais de hibridação.
8. Solanum corymbiflorum, antiga Chyphomandra corymbiflora, é citogeneticamente diferente dos
demais grupos aqui estudados, sugerindo que o sistema de classificação proposto por Bohs (1995),
juntamente com aqueles trabalhos com filogenia molecular baseados na sequência de poucos genes
extragenômicos, deveria levar em consideração um número maior de características diagnósticas
antes de propor reformulações sistemáticas tão significativas.
54
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Acosta M. C., Bernardello G., Guerra M., Moscone E. A. (2005) Karyotype analysis in several South
American species of Solanum and Lycianthes rantonnei (Solanaceae). Taxon. 54: 713-723.
Bernardello L. M., Anderson G. J. (1990) Karyotype studies in Solanum section Basarthrum
(Solanaceae). Amer. J. Bot. 77: 420-431.
Bernardello L. M., Heiser C. B., Piazzano M. (1994) Karyotype studies in Solanum section Lasiocarpa
(Solanaceae). Amer. J. Bot. 81: 95-103
Bohs L. (1989) Solanum allophyllum (Miers) Standl. and the generic delimitation of Cyphomandra and
Solanum (Solanaceae). Ann. Missouri Bot. Gard. 76: 1129-1140.
Bohs L. (1994) Cyphomandra (Solanaceae). Flora Neotropica, New York, Monograph. 63: 1-175.
Bohs L. (1995) Transfer of Cyphomandra (Solanaceae) and its species to Solanum. Taxon. 44: 583-587.
Bohs L. (2004) A Chloroplast DNA Phylogeny of Solanum Section Lasiocarpa. Syst. Bot. 29: 177–187.
Bohs L. (2005) Major clades in Solanum based on ndhF sequences. In Keating R. C., Hollowell V. C.,
Croat T. B (eds.) A festschrift for William G. D’Arcy: the legacy of a taxonomist. Monographs in
Systematic Botany from the Missouri Botanical Garden, Vol. 104. Missouri Botanical Garden Press,
St. Louis. pp. 27-49.
Bohs L., Olmstead R. (1997) Phylogenetic Relationships in Solanum (Solanaceae) Based on ndhF
Sequences. Syst. Bot. 22: 5-17.
Bohs L., Olmstead R. (1999) Solanum phylogeny inferred from chloroplast DNA sequence data. In: Nee
M., Symon D. E., Lester R. N. e Jessop J. P. (Eds.) Solanaceae IV: advances in biology and
utilization. Kew, The Royal Botanic Gardens. pp. 97-109.
55
Cabral J. S., Felix P. L., Guerra M. (2006) Heterochromatin diversity and its co-localization with 5S and
45S rDNA sites in chromosomes of four Maxillaria species (Orchidaceae). Gen. Mol. Biol. 29: 659-
664.
Chiarini F., Bernardello G. (2006) Karyotype Studies in South American Species of Solanum subgen.
Leptostemonum (Solanaceae). Plant biol (Stott). 8:486-493.
Child A., Lester R. N. (2001) Synopsis of the genus Solanum L. and its infrageneric taxa. In: van der
Berg R. G., Barendse G. W. N., van der Weeden e Mariani C. (Eds.). Solanaceae V: Advances in
Taxonomy and Utilization. Nijmegen, Nijmegen University Press, pp. 39-52.
Cronquist A. (1988) The Evolution and Classification of Flowering Plants. New York: The New York
Botanical Garden. pp. 423-424.
Cuadrado A., Jouve N. (1994) Highly repetitive sequences in B chromosomes of Secale cereale
revealed by fluorescence in situ hybridization. Genome. 37: 709-712.
D’arcy W. G. (1991) The Solanaceae since 1976, with a review of its biogeography. In: Hawkes J. G.,
Lester R. N., Nee M., Estrada N. (Eds) Solanaceae III – Taxonomy, chemistry, evolution. The Royal
Botanic Garden and The Linnean Society of London, Kew, pp. 75-137.
Dong F., Song J., Naess S.K., Helgeson J.P., Gebhardt C., Jiang J. (2000). Development and
applications of a set of chromosome-specific cytogenetic DNA markers in potato. Theor Appl Genet.
101:1001–1007.
Flavell R. B. (1986) Repetitive DNA and chromosome evolution in plants. Phylosophical Transcriptions
of the Royal Society of London Series B. 312: 227-242.
Fregonezi J. N., Fernandes T., Torezan J. M. D., Vieira A. O., Vanzela A. L. L. (2006) Karyotype
differentiation of four Cestrum species (Solanaceae) based on physical mapping of repetitive DNA.
Gen. Mol Biol. 29: 97-104.
Gerlach W. L., Bedbrook J. R. (1979) Cloning and characterization of ribosomal RNA genes from
wheat and barley. Nucl. Ac. Res. 7: 1869-1885.
56
Gerlach W. L., Dyer T.A. (1980) Sequence organization of the repeated units in the nucleus of wheat
which contain 5S-rRNA genes. Nucl. Ac. Res. 8: 4851-4865.
Guerra M. (1986) Reviewing the chromosome nomenclature of Levan et al. Rev. Bras.Gen.. 9: 741-743.
Guerra M. (2000) Patterns of heterochromatin distribution in plant chromosomes. Gen. Mol. Biol. 23(4):
1029-1041.
Heslop-Harrison J. S. (1991) The molecular cytogenetics of plants. J. Cell Sci. 100: 15-21.
Heslop-Harrison J. S. (2000) Comparative Genome Organization in Plants: From Sequence and Markers
to Chromatin and Chromosomes. Pl.Cell. 12: 617-635.
Hunziker, A. T. (2001) Genera Solanacearum. The genera of Solanaceae illustrade, arranged according
to a new system. Ruggell: A. R.G. Gantner Verlag. 500p. 136 fig.
Huziwara Y. (1962) Karyotype analysis in some genera of Compositae. VIII. Further studies on
chromosome of Aster. Amer. Jour. Bot. 49: 116-119.
Kitamura S., Inoue M., Shikazono N., Tanaka A. (2001) Relationship among Nicotiana species revealed
by the 5S rDNA spacer sequence and fluorescence in situ hybridization. Theor Appl Genet. 103:678-
686.
Komarova N. Y., Grabe1 T., Huigen D. J., Hemleben1 V., Volkov R. A. (2004) Organization,
differential expression and methylation of rDNA in artificial Solanum allopolyploids. Pl. Mol. Biol.
56: 439–463.
Lapitan N. L. V., Ganal M. W., Tanksley S. D. (1991) Organization of the 5S ribosomal RNA genes in
the genome of tomato. Genome. 34: 509-514.
Lapitan N. L. V. (1992) Organization and evolution of higher plant nuclear genomes. Genome. 35: 171-
181.
57
Lima de Faria A. (1976) The chromosome field I. Prediction of the location of ribosomal cistrons.
Hereditas. 83: 1-22.
Leicht I. J., Heslop-Harrison J. S. (1992) Physical mapping of the 18S-5,8S-26S rRNA genes in barley
by in situ hybridization. Genome. 35: 1013-1018.
Levin R. A., Watson K., Bohs L. (2005) A Four-Gene Study of Evolutionary Relationships in Solanum
section Acanthophora. Amer. J. Bot. 92: 603-612.
Levin R. A., Myers N. R., Bohs L. (2006) Phylogenetic relationships among the “spiny Solanums”
(Solanum subgenus Leptostemonum, Solanaceae). Amer. J. Bot. 93(1): 157-169.
Mentz L. A., Oliveira P. L. (2004) Solanum (Solanaceae) na região sul do Brasil. Pesquisas 2004,
Botânica n° 5, 327p.
Merritt J. F. (1974) The distribution of heterochromatin in the genus Nicotiana (Solanaceae). Amer. J.
Bot. 61(9): 982-994.
Moscone E. A. (1992) Estudios de cromosomas meióticos en Solanaceae de Argentina. Darwiniana. 31:
261-297.
Moscone E. A. (1993) Estudios cromosomicos em Capsicum (Solanaceae) II. Analisis cariotipico de C.
parvifolium y C. annum var. annum. Kurtiziana. 22: 9-18.
Moscone E. A., Lambrou M., Hunziker A. T., Ehrendorfer F. (1993) Giemsa C-banded karyotypes in
Capsicum (Solanaceae). Pl. Syst. Evol. 186: 213-229.
Moscone E. A., Loidl J., Ehrendorfer F., Hunziker A. T. (1995) Analysis of active nucleolus organizing
regions in Capsicum (Solanaceae) by silver staining. Amer. J. Bot. 82: 276–287.
Nakamura R., Kitamura S., Inoue M., Ohmido N. (2001) Karyotype analysis of Nicotiana kawakamii Y.
Ohashi using DAPI banding and rDNA FISH. Theor Appl Genet. 102: 810-814.
58
Nee M. (1991) The Systematics of Lesser Known Edible Solanaceae of the New World. In: Hawkes J.
G., Lester R. N., Nee M., Estrada N (Eds) Solanaceae III – Taxonomy, chemistry, evolution. The
Royal Botanic Garden and The Linnean Society of London, Kew, pp. 365-368.
Nee M. (1999) Synopsis of Solanum in the New World. In: Nee M., Symon D. E., Lester R. N., Jessop
J. P. (Eds.). Solanaceae IV: Advances in biology and utilization. The Royal Botanic Gardens, Kew.
pp. 285-333.
Obute G. C., Ndukwu B. C., Okoli B. E. (2006) Cytogenetic studies on some Nigerian species of
Solanum L. (Solanacaeae). Afr. J. Biotec. 5: 689-692.
Olmstead R., Palmer J. (1992) A chloroplast DNA phylogeny of the Solanaceae: subfamilial
relationships and character evolution. Ann. Missouri Bot. Gard. 79 (2): 346-360.
Olmstead R., Palmer J. (1997) Implications for the phylogeny, classification and biogeography of
Solanum from cpDNA restriction-site variation. Syst. Bot. 22: 19-29.
Olmstead R., Sweere J. A., Spangler R. E., Bohs L., Palmer J. D. (1999) Phylogeny and provisional
classification of the Solanaceae based on chloroplast DNA. In: Nee M., Symon D. E., Lester R. N.,
Jessop J. P. (Eds.). Solanaceae IV: Advances in biology and utilization. The Royal Botanic Gardens,
Kew. pp. 111-137.
Peterson D. G., Price H. J., Johnston J. S, Stack S. M. (1996) DNA content of heterochromatin and
euchromatin in tomato (Lycopersicon esculentum) pachytene chromosomes. Genome. 39: 77-82.
Pijnaker L. P., Ferwerda M. A. (1984) Giemsa C-banding of potato chromosomes. Can. J. Gen. Cyt. 26:
415-419.
Pringle G. J., Murray B. G. (1991) Karyotype diversity and nuclear DNA variation in Cyphomandra. In:
Hawkes J. G., Lester R. N., Nee M., Estrada N. (Eds) Solanaceae III – Taxonomy, chemistry,
evolution. The Royal Botanic Garden and The Linnean Society of London, Kew, pp. 247-252.
59
Pringle G. J., Murray B. G. (1993) Karyotypes and C-banding patterns in species of Cyphomandra
Mart. ex Sendtn. (Solanaceae). Bot. J. Linn. Soc. 111: 331-342.
Randell B. R., Symon D. E. (1976) Chromosome numbers in Australian Solanum species. Austr. J. Bot.
24: 369–379.
Raven P. H. (1975) The bases of angiosperm phylogeny. Ann. Missouri Bot. Gard. 62: 724-764.
Sang Y., Liang G. H.( 2000) Comparative physical mapping of the 18S-5,8S-26S rDNA in three
sorghum species. Genome. 43: 918-922.
Schwarzacher T. P., Ambros P., Schweizer D. (1980) Application of Giemsa banding to orchid
karyotype analysis. Pl. Syst Evol. 134: 293-297.
Schweizer D. (1980). Simultaneous fluorescent staining of R bands and specific heterochromatic
regions (DA/DAPI) in human chromosomes. Cyt. Cell Gen. 77: 190-193.
Schweizer D., Loidl J. (1987) A model for heterochromatin dispersion and the evolution of C-band
patterns. Chrom. Today. 9: 61-74.
Sharma A., Sen S. (2002) Chromosome Botany Science. Calcutá, Índia, Science Publishers, Inc, 115 p.
Snowdon R., Kusterer B., Horn R (2001) Strutural genome analysis using molecular cytogenetic
techniques. Prog. Bot. 63: 55-79.
Soares E. L. C., Mentz L. A. (2006) As espécies de Solanum subgênero Bassovia seção Pachyphylla (=
Cyphomandra Mart. Ex Sendtn. - Solanaceae) no Rio Grande do Sul, Brasil. Pesquisas 2006
Botânica .57: 231-253.
Spooner D., Anderson G., Jansen R. (1993) Chloroplast DNA evidence for the interrelationships of
tomatoes, potatoes, and pepinos (Solanaceae). Amer. J. Bot. 80: 676-688.
Srebniak M., Rasmussen O., Ma£uszyñska J. (2002) Cytogenetic analysis of an asymmetric potato
hybrid. J. Appl. Genet. 43(1): 19-31.
60
Stebbins G. L. (1971) Chromosomal Evolution in Higher Plants. Addison-Wesley Publishing Company,
216p.
Sumner A. T. (2003) Chromosomes – Organization and Function. North Berwick, United Kingdom,
Blackwell Publishing. 287 p.
Vallejos C. E., Tanksley S. D., Bernatzky R. (1986) Localization in the tomato genome of DNA
restriction fragments containing sequences homologous to the rRNA (45S), The major chlorophyll
a/b binding polypeptide and the ribulose bisphosphate carboxylase genes. Genetics. 112: 93-105.
Vanzela A. L. L., Ruas C. F., Oliveira M. F., Ruas P. M. (2002) Characterization of diploid, tetraploid
and hexaploid Helianthus species by chromosome banding and FISH with 45S rDNA probe.
Genetica. 114: 105-111.
Volkov R. A., Zanke C., Panchuk I. I., Hemleben V. (2001) Molecular evolution of 5S rDNA of
Solanum species (sect. Petota): application for molecular phylogeny and breeding. Theo. Appl.
Genet. 103:1273-1282.
Yoong Lim K, Matyasek R, Lichtenstein C P, Leitch A R (2000) Molecular cytogenetic analyses and
phylogenetic studies in the Nicotiana section Tomentosae. Chromosoma. 109: 245-258.
Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download:
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas
Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo