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SILVIA MESSIAS BUENO
BACTÉRIAS PRODUTORAS DE BIOSSURFACTANTES:
ISOLAMENTO, PRODUÇÃO, CARACTERIZAÇÃO E
COMPORTAMENTO NUM SISTEMA MODELO
Tese apresentada para a obtenção do título de
doutor em Engenharia e Ciência de Alimentos,
área de Ciência e Tecnologia de Alimentos
junto ao programa de pós-graduação Engenharia
e Ciência de Alimentos do Instituto de
Biociências, Letras e Ciências Exatas da
Universidade Estadual Paulista “Júlio de
Mesquita Filho”, Campus de São José do Rio
Preto, SP.
Orientador: Prof. Dr. Crispin Humberto Garcia-Cruz
SÃO JOSÉ DO RIO PRETO
2008
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ii
SILVIA MESSIAS BUENO
BACTÉRIAS PRODUTORAS DE BIOSSURFACTANTES:
ISOLAMENTO, PRODUÇÃO, CARACTERIZAÇÃO E
COMPORTAMENTO NUM SISTEMA MODELO
BANCA EXAMINADORA
Orientador: Prof. Dr. Crispin Humberto Garcia-Cruz ...................................................
1
o
. Examinador: Prof
a
. Dr
a
. Iracema de Oliveira Moraes ..............................................
2
o
. Examinador: Prof. Dr. Alexandre Rodrigo Coelho...................................................
3
o
. Examinador: Prof
a
. Dr
a
. Eleni Gomes ......................................................................
4
o
. Examinador: Prof. Dr. Fernando Leite Hoffmann ....................................................
5
o
.
Examinador: Prof. Dr. Hamilton Cabral ...................................................................
6
o
. Examinador: Prof. Dr. Maurício Boscolo..................................................................
7
o
. Examinador: Prof. Dr. Vanildo Luiz Del Bianchi ....................................................
São José do Rio Preto, 02 de junho de 2008.
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iii
DADOS CURRICULARES
SILVIA MESSIAS BUENO
NASCIMENTO 08.12.1974 - GUARULHOS/SP
FILIAÇÃO Lourival Messias Bueno
Alice Coelho Bueno
1993/1996 Curso de Graduação
Química (Bacharelado)
Faculdade de Filosofia Ciências e Letras
de Ribeirão Preto - USP
1997/1998 Bolsista de aperfeiçoamento do CNPq no
Departamento de Engenharia e
Tecnologia de Alimentos no Instituto de
Biociências, Letras e Ciências Exatas -
UNESP
1998/2000 Curso de Pós-graduação – Mestrado em
Engenharia e Ciência de Alimentos
Departamento de Engenharia e
Tecnologia de Alimentos no Instituto de
Biociências, Letras e Ciências Exatas -
UNESP
2005/2008 Curso de Pós-graduação – Doutorado em
Engenharia e Ciência de Alimentos
Departamento de Engenharia e
Tecnologia de Alimentos no Instituto de
Biociências, Letras e Ciências Exatas -
UNESP
iv
Aos meus pais por estarem sempre
presentes.
Ao Tony por sempre me apoiar.
A minha filha Eloá.
v
AGRADECIMENTOS
Ao Prof. Dr. Crispin Humberto Garcia-Cruz por ajudar na realização deste
trabalho.
Aos colegas de laboratório pelo apoio e paciência durante a execução desta
pesquisa, especialmente as amigas Adriana Navarro da Silva, Fernanda Maria
Pagane Guereschi Ernandes e Paloma Regina Micheleto Nogueira.
Ao Departamento de Química do IBILCE-UNESP por ter permitido a
utilização de alguns equipamentos para esta pesquisa.
Ao Prof. Dr. Gil Valdo José da Silva - USP- Ribeirão Preto-SP, pela
determinação da análise de RMN.
Ao Prof. Dr. Hamilton Cabral - USP- Ribeirão Preto-SP, pelas valiosas
sugestões na discussão dos resultados.
Ao Prof. Dr. Antônio Carlos de Araújo pela revisão ortográfica.
A Fundação de Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pelo apoio para a
manutenção dos equipamentos do laboratório.
vi
Se conheces o inimigo e te conheces a ti mesmo, não
precisas temer o resultado de cem batalhas. Se te
conheces a ti mesmo, mas não conheces o inimigo, por
cada vitória sofrerás também uma derrota. Se não te
conheces a ti mesmo nem conheces o inimigo, perderás
todas as batalhas.
Sun Tzu
vii
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS
viii
LISTA DE TABELAS ix
LISTA DE FOTOGRAFIAS x
RESUMO 1
ABSTRACT 3
1. INTRODUÇÃO
5
2. OBJETIVOS
6
3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
7
3.1. BIOTECNOLOGIA
7
3.2. SURFACTANTES
8
3.3. BIOSSURFACTANTES 17
3.4. MICRORGANISMOS PRODUTORES 25
3.5. APLICAÇÕES DOS BIOSSURFACTANTES 31
4. MATERIAL E MÉTODOS 35
4.1. Isolamento e caracterização das bactérias produtoras 35
4.2. Manutenção das bactérias produtoras 35
4.3. Identificação das bactérias 35
4.4. Produção dos biossurfactantes 36
4.4.1. Microrganismos 36
4.4.2. Meio base 36
4.4.3. Meio de produção 36
4.4.4. Produção do biossurfactante 37
4.5. Determinação da presença de biossurfactantes 37
4.5.1. Determinação da tensão superficial 37
4.5.2. Índice de emulsificação (E
24
) 37
4.5.3. Determinação da atividade emulsificante 38
4.5.4. Determinação da concentração micelar critica (CMC) 38
4.5.5. Separação dos biossurfactantes 38
4.5.6. Determinação do crescimento celular 38
4.5.7. Purificação do biossurfactante 38
4.5.8. Atividade antimicrobiana 39
4.5.9. Fluidez do p
etróleo
39
4.6.
Determinação da composição do biossurfactante
40
4.7. Determinação do efeito do biossurfactante num sistema modelo
sal-vinagre-
azeite
40
5. RESULTADOS E DISCUSS
ÃO
41
5.1. Isolamento das bactérias produtoras de biossurfactantes
41
5.2. Identificação das bactérias
45
5.3. Determinação dos parâmetros de produção
50
5.4. Estudo da fluidez
do petróleo
64
5.5. Determinação da atividade anti
microbiana
67
5.6. Determinação do efeito do biossurfactante num sistema modelo
sal-vinagre-azeite
67
6. CONCLUSÕES
73
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 74
viii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Molécula de tensoativo (surfactante). 10
Figura 2 - Organização das moléculas de tensoativos. 10
Figura 3 - Diagrama da variação de tensão superficial, interfacial e
solubilidade do composto orgânico com relação a concentração
de tensoativo.
13
Figura 4 - Comportamento de composto orgânico antes (a) e após (b) adição
de tensoativo.
14
Figura 5 - Estruturas químicas de alguns biossurfactantes produzidos por:
(a) Pseudomonas aeruginosa, (b) Rhodococcus erythropolis (c)
Candida bombicola (d) Acinetobacter calcoaceticus e (e)
Bacillus subtilis.
27
Figura 6 -
Representação das principais etapas utilizadas durante a
identificação do gênero das bactérias selecionadas.
48
Figura 7 -
Determina
Determinação da tensão superficial no sobrenadante livre de
células em diferentes fontes de carbono e concentrações a 30
0
C e
72 horas
de incubação dos Bacillus sp selecionados.
56
Figura 8 - Porcentagem do índice de emulsificação dos Bacillus sp
selecionados em relação às diferentes fontes de carbono e
concentrações a 30
0
C e 72 horas de incubação.
57
Figura 9 - Determinação da concentração micelar crítica (CMC) no
sobrenadante livre de células do Bacillus sp (2C) em sacarose e
caldo de cana.
61
Figura 10 - Espectro de ressonância magnética nuclear (RMN) do
biossurfactante.
63
Figura 11 - Dados estatísticos do delineamento experimental num sistema
modelo sal-vinagre-azeite.
69
Figura 12 -
Superfície de resposta para a região ao redor dos valores ótimos
de azeite e vinagre para o índice de emulsificação (índice de
emulsificação (%) = 36,7436 + 2,6596*x – 7,6484*y –
0,2531*x*x – 0,1417*x*y + 0,5819*y*y).
70
Figura 13 -
Superfície de resposta para a região ao redor dos valores ótimos
de vinagre e sal para o índice de emulsificação (índice de
emulsificação (%) = 34,8059 + 273,5274*x – 7,6733*y –
1749,5199*x*x – 12,4259*x*y + 0,5819*y*y).
71
Figura 14 -
Superfície de resposta para a região ao redor dos valores ótimos
de azeite e sal para o índice de emulsificação (índice de
emulsificação (%) = 4,3607 + 360,6262*x – 3,5927*y –
1749,5199*x*x – 29,8457*x*y + 0,2531*y*y).
72
ix
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Tensão superficial e concentração micelar crítica dos
biossurfactantes e surfactantes sintéticos.
12
Tabela 2 - Diferentes valores de balanço hidrofílico-lipofílico
para
surfactantes não-iônicos.
14
Tabela 3 - Toxicidade dos biossurfactantes comparada aos surfactantes
sintéticos.
20
Tabela 4 - Principais classes de biossurfactantes e microrganismos
envolvidos.
26
Tabela 5 - Coloração de Gram das bactérias isoladas das cinco amostras de
solo e areia de praia.
42
Tabela 6 - Teste de hemólise em placas de Petri contendo ágar-sangue para
as colônias isoladas de solo e areia de praia.
44
Tabela 7 - Características bioquímicas das bactérias selecionadas. 46
Tabela 8 - Fontes de coleta das quatro bactérias selecionadas relacionadas
aos respectivos gêneros.
50
Tabela 9 - Leituras de tensão superficial (Din/cm), índice de emulsificação
(%) e peso celular seco (g) dos Bacillus sp em diferentes pH e
tempo de fermentação.
53
Tabela 10 -
Determinação do peso celular seco (g) dos Bacillus sp em 50 mL
do caldo de fermentação selecionadas em diferentes fontes de
carbono e concentrações.
58
Tabela 11 -
Determinação da atividade emulsificante no sobrenadante livre de
células a 610 nm dos Bacillus sp selecionados.
59
Tabela 12 -
Delineamento experimental dos ensaios para um sistema modelo
sal-vinagre-azeite.
68
x
LISTA DE FOTOGRAFIAS
Fotografia 1 -
Placas de ágar-sangue com halo de
-hemólise positiva.
43
Fotografia 2 - Testes bioquímicos: a) nitrato, b) motilidade, c) fermentação
de açúcares, d) amilase, e) urease e f) citrato.
47
Fotografia 3 - Representação microscópica das bactérias Gram +: a) 4D; b)
1G; c) 2C e d) 5A.
49
Fotografia 4 - Caldo de fermentação durante incubação a 30
o
C e 200 rpm
em “shaker” rotativo.
51
Fotografia 5 - Tensiômetro de Leconde Du Nouy. 52
Fotografia 6 - Determinação do índice de emulsificação por meio da
formação de uma coluna de tolueno.
52
Fotografia 7 - Biossurfactante obtido por precipitação com etanol a 4
o
C. 62
Fotografia 8 -
Efeito da
Diálise para a purificação do biossurfactante. 62
Fotografia 9 -
Determina
Análise macroscópica da fluidez do petróleo. 65
Fotografia 10 -
Análise macroscópica da fluidez do petróleo na presença dos
inóculos bacterianos.
66
BUENO, S. M. Bactérias Produtoras de Biossurfactantes: Isolamento, Produção,
Caracterização e Comportamento num Sistema Modelo. São José do Rio Preto.
RESUMO
Surfactantes são agentes ativos de superfície amplamente utilizados em vários
setores industriais. Estas moléculas, com propriedades anfifílicas, são produzidas
química ou biologicamente. A grande maioria dos surfactantes disponíveis
comercialmente é sintetizada a partir de derivados do petróleo. Em vista de suas
vantagens ecológicas, há um grande interesse comercial na substituição de
surfactantes sintéticos por naturais. Nesta pesquisa, foram coletadas cinco amostras
de solos contaminados e não contaminados por hidrocarbonetos designadas 1, 2, 3, 4
e 5 das quais foram isoladas vinte e oito colônias bacterianas pela técnica de diluição
decimal em tubos de ensaio e plaqueamento em placas de Petri contendo meio PCA
(Ágar Padrão para Contagem). As bactérias isoladas foram coradas pelo método de
Gram para observação das características morfológicas. Destas, apenas treze
apresentaram hemólise em placas de Ágar Sangue, o que indicou a presença de
biossurfactante. Posteriormente, estas foram cultivadas em meio de produção
contendo sais minerais e o caldo de cultura, sem a presença de células, foi utilizado
para a determinação da tensão superficial e do índice de emulsificação. As oito
bactérias cujos caldos (sem a presença de células) apresentaram diminuição de tensão
superficial de no mínimo 20% e índice de emulsificação estável após 24 horas foram
selecionadas para realização de testes bioquímicos para identificação. A análise dos
resultados destes testes mostrou que as bactérias pertencem ao gênero Bacillus. Foi
determinada a otimização da produção de biossurfactantes em caldo de fermentação
utilizando diferentes pH (5,0; 6,0; 7,0 e 8,0), tempo de fermentação (48, 72 e 96
horas) e diferentes fontes de carbono (glicose, sacarose, manitol, frutose, glicose +
frutose e caldo de cana) nas concentrações 1, 2, 3, 4 e 5%. Os resultados obtidos
mostraram que pH 5,0 e 7,0; tempo de fermentação de 72 horas e sacarose em baixas
concentrações tiveram a maior produção de biossurfactante. A bactéria 2C (Bacillus
sp) isolada de solo contaminado de posto de gasolina apresentou-se como a melhor
produtora de biossurfactante. Esta foi então selecionada para produção de
biossurfactante e para a determinação da concentração micelar crítica (CMC) e foi
observada uma baixa CMC, indicando ser um ótimo surfactante. Posteriormente, o
2
biossurfactante foi precipitado com 2 volumes de etanol e seco até peso constante,
obtendo-se o rendimento de 30,25% em relação à concentração da fonte de carbono.
O biossurfactante obtido foi dialisado durante 72 horas para purificação e submetido
à análise de ressonância magnética nuclear (RMN), além da determinação da
composição centesimal da molécula do biossurfactante (proteínas, carboidratos e
lipídeos). Constatou-se a presença de um biossurfactante tipo carboidrato-proteína-
lipídeo. A bactéria 2C foi identificada como Bacillus pumilus. Foi realizado também
o teste da degradação de petróleo utilizando as bactérias 1G, 2C, 4D e 5A cultivadas
em caldo nutriente e por análise macroscópica observou-se que todas degradam o
petróleo bruto deixando-o mais fluido. Não foi constatada atividade bactericida nem
fungicida e sim bacteriostática e fungistática nos sobrenadantes das bactérias
produtoras de biossurfactantes. Foi também estudado o comportamento do
biossurfactante obtido com a bactéria 2C (Bacillus pumilus) num sistema modelo sal-
vinagre-azeite e mostrou ser um ótimo emulsificante em molhos para salada.
Palavras chave: biossurfactantes, solo, bactérias produtoras e isolamento.
3
BUENO, S. M.
Bacteria Producers of Biosurfactants: Isolation, Production,
Characterization and Behavior in a Model System. São José do Rio Preto.
ABSTRACT
Surfactants are surface-active agents widely used in various industries. These
molecules, with amphiphilic properties, are produced chemical or biologically. The
vast majority of commercially available surfactants is synthesized from oil
derivatives. In view of its environmental benefits, there is a large commercial interest
in the replacement of natural by synthetic surfactants. In this survey, were collected
five samples of contaminated and not contaminated soil by hydrocarbons designated
1, 2, 3, 4 and 5 which were isolated twenty-eight bacterial colonies by the technique
of decimal dilution in test tubes, and plating in Petri dishes containing PCA medium
(Plate Count Agar) The bacteria isolated were stained by the method of Gram for
observation of morphological characteristics. Of these, only thirteen had haemolysis
in blood agar plates, which indicated the presence of biosurfactant. Later, they were
grown in a production medium containing minerals and the culture broth, without the
presence of cells was used to determine the surface tension and the emulsification
index. The eight bacteria whose broths (without the presence of cells) had reduction
of surface tension of at least 20% and emulsification index stable after 24 hours were
selected to carrying out biochemical test for identification. The results of these tests
showed the bacteria belong to the genus Bacillus. It was determined the optimization
of production of biosurfactants in fermentation broth using different pH (5.0, 6.0, 7.0
and 8.0), fermentation time (48, 72 and 96 hours) and different carbon sources
(glucose, sucrose, mannitol, fructose, glucose + fructose and cane juice) at
concentrations 1, 2, 3, 4 and 5%. The results showed that pH 5.0 and 7.0; time of 72
hours and fermentation of sucrose at low concentrations had the best production of
biosurfactant. The 2C bacteria (Bacillus sp) isolated from contaminated soil in place
of petrol presented itself as the best producer of biosurfactant. This was then selected
to the production of biosurfactant and for the determination the critical micellar
concentration (CMC) and was observed that showed a low CMC, stating be a great
surfactant. Subsequently, the biosurfactant was precipitated with 2 volumes of
ethanol and dry up until constant weight, resulting in the yield of 30.25% compared
to the concentration of carbon source. The biosurfactant obtained was dialysis for 72
4
hours to purification and submitted for analysis of nuclear magnetic resonance
(NMR), and the proximate composition of the molecule biosurfactant (proteins,
carbohydrates and lipids). We noticed the presence of a biosurfactant type
carbohydrate-protein-lipid. The bacterium 2C was identified as Bacillus pumilus. It
was also carried out the oil degradation test using the bacteria 1G, 2C, 4D and 5A
grown in nutrient broth and by macroscopic analysis was observed that all of them
degrade the crude oil leaving it more fluid. No activity fungicide or bactericide was
detected and only bacteriostatic and fungistatic supernatant of bacteria in producing
biosurfactants. It was also studied the behavior of biosurfactant obtained with the
bacterium 2C (Bacillus pumilus) system model salt-vinegar-oil proved a great
emulsifier in salad dressings.
Key word: biosurfactants, soil, producer bacteria and isolation.
5
1. INTRODUÇÃO
Os surfactantes constituem uma classe importante de compostos químicos
amplamente utilizados em vários setores de diferentes tipos de indústrias onde
encontram aplicação em uma larga variedade de processos industriais. Estas
moléculas possuem propriedades hidrofílicas e hidrofóbicas e são produzidas
química ou biologicamente. Os surfactantes reduzem a tensão superficial, formando
microemulsões, promovendo a dispersão de hidrocarbonetos nas soluções aquosas.
Tal característica é comercialmente interessante para a produção de detergentes,
emulsificantes e espumas para as indústrias de alimentos, cosmética, farmacêutica e
química.
Os tensoativos ou surfactantes têm sido utilizados industrialmente como
adesivos, floculantes, espumantes, desemulsificantes e penetrantes. Na indústria
petroquímica eles são tradicionalmente usados na extração de óleo. Nesse caso, os
tensoativos aumentam a solubilidade dos componentes do petróleo ou diminuem a
tensão interfacial, promovendo a sua mobilização.
A grande maioria dos surfactantes disponíveis comercialmente é sintetizada a
partir de derivados do petróleo. Nos países industrializados 70-75% dos surfactantes
consumidos são de origem petroquímica.
O aumento da preocupação ambiental combinado com as novas legislações de
controle do meio ambiente levou a procura por surfactantes naturais como alternativa
aos sintéticos existentes. A tendência de substituição dos surfactantes sintéticos pelos
naturais, é motivada pela necessidade da diminuição de produtos não biodegradáveis
por substâncias mais específicas e menos agressivas ao ambiente.
Os microrganismos sintetizam compostos com propriedades surfactantes
como subprodutos metabólicos, sendo neste caso denominados biossurfactantes.
Estes são também moléculas anfifílicas que atuam na interface das emulsões e em
termos de tensão superficial, estabilidade à temperatura e pH, são comparáveis aos
surfactantes sintéticos.
6
2. OBJETIVOS
- Isolar, selecionar e caracterizar microrganismos produtores de
biossurfactantes, a partir de amostras de solos não contaminados e
contaminados por hidrocarbonetos.
- Determinar os parâmetros de produção dos biossurfactantes em caldo de
fermentação.
- Realizar a caracterização físico-química dos biossurfactantes obtidos.
- Determinar a atividade antimicrobiana dos microrganismos produtores e
seus biossurfactantes.
- Determinar a capacidade emulsificante dos microrganismos produtores
em petróleo bruto.
- Determinar o efeito da aplicação do biossurfactante obtido num sistema
modelo sal-vinagre-azeite.
3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
7
3.1. BIOTECNOLOGIA
Biotecnologia é definida como o conjunto de princípios científicos aplicados
a procedimentos de produção material para obter bens e serviços mediante a
utilização de agentes biológicos. Está integrada por um conjunto de técnicas que
utilizam substâncias vivas (ou parte delas) para modificar ou fabricar um bem. As
aplicações da biotecnologia são múltiplas: vão desde o aumento da produtividade da
terra cultivável à produção de novos medicamentos, vacinas e materiais de
diagnóstico, passando pela conservação da biodiversidade genética e a restauração de
elementos como a água, o ar e o solo (OPAS, 1992).
De um modo geral, o conceito de biotecnologia pode incluir “qualquer
técnica que utilize organismos vivos (ou partes de organismos), com o objetivo de
produzir ou modificar produtos, aperfeiçoar plantas ou animais e descobrir
microrganismos para usos específicos” (ALBAGLI, 1998).
Biotecnologia refere-se também a disposição que permite às tecnologias
serem aplicadas em diversos setores industriais. Esta compreende três distintas
atividades as quais recebem o nome de engenharia genética, engenharia de proteínas
e engenharia de metabólitos (GAVRILESCU & CHISTI, 2005).
A exploração e a manipulação da natureza e de seus recursos, de início como
simples matéria-prima, utilizados na construção de uma base material para as
sociedades industrializadas, vem servindo como fonte para experimentação da
ciência e da tecnologia avançada, dando origem à fabricação de produtos de alta
sofisticação e de elevado valor agregado no mercado mundial (ALBAGLI, 1998).
Na nova era da industrialização global, muitas indústrias tradicionais estão
enfatizando um redirecionamento para o surgimento de novas tecnologias. A
biotecnologia tem uma missão desafiante que abre várias oportunidades de pesquisa.
Uma vez que, faz uso de diversos compostos com propriedades tensoativas, seja na
purificação de produtos biológicos ou em biocatálise e, esta também necessita dar
resposta (preventiva e curativa) aos problemas que os tensoativos domésticos e
industriais possam causar nas estações de tratamento de efluentes. Preocupações
ambientais têm orientado a seleção de tensoativos em que, testes de
biodegradabilidade e de toxicidade começaram a ter uma importância decisiva.
Assim, existe a tendência de aproximar-se a produção do natural, atendendo o
8
princípio, segundo o qual a natureza, por si só, não tem capacidade de desfazer o que
o homem faz (ROCHA, 1999, MULLER; RUSSEL; LUCASE, 1997).
A purificação do petróleo, água e solos contaminados, é um dos mais
importantes problemas a ser resolvido. Um método científico útil na degradação de
poluentes enfatiza o uso de microrganismos na indústria, mineração e recuperação do
ecossistema. A emulsificação é também um método já empregado para a purificação
de água contaminada com petróleo (CYBULSKY et al., 2003).
Do ponto de vista dos microrganismos, o estudo da biodiversidade tem
excepcional interesse científico. Só para se ter uma idéia, existe uma grande
variedade de espécies de bactérias nas florestas úmidas. Estima-se que um grama de
solo de uma floresta úmida possua inúmeras espécies de microrganismos e muitos
destes produzem metabólitos secundários biologicamente ativos. Centenas de
antibióticos descobertos nos últimos 50 anos são provenientes de bactérias. O
potencial do uso de microrganismos para os processos biotecnológicos em saúde já é
reconhecido. Os microrganismos contribuem para o equilíbrio de ecossistemas
atuando intermediariamente entre a biogeosfera e os constituintes atmosféricos
gasosos. Podem-se encontrar bactérias capazes de degradarem herbicidas, pesticidas,
inseticidas, óleos e esgotos poluidores. As bactérias participam da reciclagem de
compostos químicos na biosfera, incluindo a degradação de poluentes industriais.
Desta forma, os microrganismos podem participar ativamente da construção de
melhores condições de vida no planeta (GARCIA, 1995).
O uso de microrganismos em biotecnologia representa uma área em plena expansão. Entretanto,
pouco se conhece sobre a diversidade dos microrganismos que constituem os ecossistemas naturais
ou artificiais (ROSADO; DUARTE; MENDONÇA-HAGLER, 1999).
3.2. SURFACTANTES
Os surfactantes constituem uma importante classe de compostos químicos
amplamente utilizados em vários setores da indústria moderna. Durante a década de
80 a procura por surfactantes aumentou aproximadamente 300% dentro da indústria
química (GREEK, 1990) e sua produção no ano 2000 excedeu três milhões de
toneladas por ano gerando quatro bilhões de dólares (BANAT; MAKKAR;
CAMEOTRA, 2000).
Os surfactantes são agentes ativos de superfície que reduzem a energia livre do sistema por substituir a maior parte das
moléculas de alta energia na interface diminuindo a tensão superficial e interfacial dos líquidos. Eles contêm uma porção
9
hidrofóbica com pequena afinidade ao meio aquoso e um grupo hidrofílico que é fortemente atraído pelo meio aquoso
(MULLIGAN, 2005).
Os tensoativos ou surfactantes, por possuírem uma parte polar e outra apolar
(Figura 1), são também conhecidos como substâncias anfifílicas. A palavra anfifílica
tem origem latina: amphi significa dualidade e philos significa atração. As
substâncias tensoativas são classificadas em aniônicas (ex: éter sulfonado ou
sulfatos), não iônicas ou anfóteras e catiônicas (ex: sais quaternários de amônio), de
acordo com a carga exibida pela porção polar da molécula. A parte hidrofóbica é
composta geralmente por um hidrocarboneto linear ou ramificado, apresentando ou
não duplas ligações e/ou grupos aromáticos. Os íons têm uma forte afinidade pela
água devido às atrações eletrostáticas entre a carga do íon e os dipolos da água. Além
disso, são capazes de carregar longas cadeias carbônicas (parte apolar) para dentro da
solução (MESQUITA, 2004; BANAT
;
MAKKAR; CAMEOTRA
,
2000;
CHRISTOFI & IVSHINA, 2002; ROCHA, 1999; GEORGIOU; LIN; SHARMA,
1992).
Em função da presença de grupos anfifílicos, os surfactantes tendem a se distribuir nas interfaces fluídas com diferentes
graus de polaridade (óleo/água e água/óleo). A formação de um filme molecular, ordenado nas interfaces, a qual reduz a
tensão superficial e interfacial, é responsável pelas propriedades únicas dos surfactantes, como: detergência, emulsificação
(micro e macro), lubrificação, ação espumante e antiespumante, capacidade molhante, solubilização e dispersão de fases
(LIN, 1996; NITSCHKE & PASTORE, 2002).
Figura 1. Molécula de tensoativo (surfactante).
As moléculas surfactantes possuem duas propriedades fundamentais:
As moléculas saem da solução para se posicionar nas interfaces (ex:
ar/líquido, líquido/líquido) com orientação específica - também conhecida
como adsorção;
Formam agregados orientados, também conhecidos como micelas. A
formação de micelas em solução conferirá as propriedades de detergência e
solubilização.
10
Numa solução em que a concentração de tensoativo é baixa, as moléculas existem na forma de
monômeros, quando a concentração do tensoativo vai aumentando, os monômeros vão saturando a
interface. Cada vez que uma nova molécula é adicionada à solução, vai aumentando a interação
desfavorável entre a fração apolar e as moléculas de água até o ponto em que os monômeros vão-se
agregando formando micelas. Nestas, a fração apolar está orientada para o centro da estrutura e a
fração polar para o solvente. O tamanho da micela vai depender da natureza da parte apolar do
tensoativo (Figura 2) (MESQUITA, 2004; LIN, 1996).
Figura 2. Organização das moléculas de tensoativos.
A divisão interfacial existente entre duas fases imiscíveis (sólido/líquido,
líquido/líquido ou vapor/líquido) é devida ao fato de que a porção hidrofóbica está na
superfície enquanto a porção hidrofílica é orientada em direção à solução
(MULLIGAN, 2005). A concentração de tensoativos, na qual a termodinâmica do
sistema tensoativo-solvente favorece a formação de micelas, é chamada de
concentração micelar crítica (CMC). Em concentrações acima da CMC, o
surfactante consegue aumentar a solubilidade de compostos orgânicos cuja
solubilidade em água é baixa, uma vez que o composto orgânico é incorporado no
interior da micela (MESQUITA, 2004; MULLIGAN, 2005; LIN,
1996).
A eficácia de um surfactante é determinada pela sua capacidade de diminuir a
tensão superficial, que é uma medida da energia superficial livre (entalpia da
superfície livre) por unidade de área requerida para trazer a molécula para a
superfície, ou seja, a força que age na superfície de um líquido promovendo a
minimização da área superficial (ROSEN, 1978; MESQUITA, 2004; CHRISTOFI &
IVSHINA, 2002).
Devido à presença de um surfactante, requer-se pouco trabalho para trazer
uma molécula para a superfície e, conseqüentemente, a tensão superficial é reduzida,
pois esta pode levar a um aumento da concentração de compostos hidrofóbicos na
11
fase aquosa e isto é alcançado pela formação de uma emulsão e solubilização
óleo/água acima da CMC (CHRISTOFI & IVSHINA, 2002).
A tensão superficial está correlacionada com a concentração micelar crítica
(Tabela 1). Surfactantes eficientes possuem uma baixa CMC, isto é, menor
quantidade de surfactante é necessária para o decréscimo da tensão superficial
(MULLIGAN, 2005).
Tanto os surfactantes sintéticos como os biossurfactantes são capazes de
reduzir a tensão superficial da água (72 mN/m) para valores na faixa entre 47 e 27
mN/m e a tensão interfacial (tensão entre liquido polar e não polar) como água em n-
hexadecano de 40 para 1 mN/m (MULLIGAN, 2005; MESQUITA, 2004). Portanto a
efetividade dos tensoativos está relacionada com as tensões superficiais e interfaciais
as quais devem atingir respectivamente valores menores que 30 e 1 mN/m
(GOUVEIA et al.,
2003).
Tabela 1. Tensão superficial e concentração micelar crítica dos biossurfactantes e
surfactantes sintéticos.
Natureza do
surfactante
Surfactante
Tensão
superficial
(mN/m)
CMC
(mg/L)
biológico Rhodococcus rubber AC 235 - glicolipídeo 26,8 54
biológico Rhodococcus erythropolis - trealose
dicorinomicolato
36 4
biológico Rhodococcus erythropolis - trealose tetraester 26 15
biológico Pseudomonas aeruginosa - ramnolipídeo 29 50-200
biológico Torulopsis bombicola - soforolipídeos 33 82
biológico Bacillus subtilis - surfactina 27 23
sintético Dodecil Sulfonato de Sódio (DSS) 37 2120
sintético Brometo de Cetiltrimetilamônio 30 1300
sintético Tween 20 30 600
12
sintético n - Alquil Benzeno Sulfonato 47 590
mN/m = miliNewton/metro; fonte: MULLIGAN, 2005
A concentração micelar crítica varia na solução aquosa em função da
estrutura do tensoativo, temperatura da solução, pH, presença de eletrólitos e
compostos orgânicos. O tamanho da fração apolar da molécula de tensoativo é um
fator importante e geralmente a CMC decresce com o aumento da hidrofobicidade da
molécula isto é, quanto maior a cadeia carbônica da fração apolar do tensoativo,
maior a tendência das moléculas de se adsorverem entre a interfase ar-água,
diminuindo assim a tensão superficial da solução (MESQUITA, 2004).
A Figura 3 mostra os parâmetros que variam em função da concentração de
surfactante (tensoativo).
Figura 3. Diagrama da variação de tensão superficial, interfacial e solubilidade do
composto orgânico com relação a concentração de tensoativo.
Os tensoativos que se adsorvem nas interfaces sólido/água e óleo/água são os
melhores detergentes (MESQUITA, 2004). Alguns estudos têm relatado que os
surfactantes podem aumentar a desorção e disponibilidade de poluentes orgânicos
aos microrganismos degradativos (CHRISTOFI & IVSHINA, 2002).
Uma característica importante dos surfactantes está relacionada à abundância
relativa das frações polares e apolares. Os surfactantes podem ser classificados de
13
acordo com o balanço hidrofílico-hidrofóbico (HLB), pois essa relação afeta as
propriedades físico-químicas das moléculas. O valor de HLB é uma indicação da
solubilidade no óleo ou na água da solução e, quanto menor o valor de HLB maior é
a solubilidade no óleo da solução. Em geral, as moléculas com baixo HLB são
lipofílicas, enquanto as de HLB alto são mais solúveis em água. A Tabela 2
apresenta o emprego de surfactantes não-iônicos de acordo com os valores de HLB
(CHRISTOFI & IVSHINA, 2002; ROCHA, 1999).
Segundo Gouveia et al. (2003), surfactantes com HLB menor que 6 são mais
solúveis na fase oleosa, enquanto valores entre 10 e 18 exibem características
opostas.
Tabela 2. Diferentes valores de balanço hidrofílico-lipofílico para surfactantes não-
iônicos.
HLB Usos
< 3 Filmes de superfície
3-6 Emulsificantes água em óleo
7-9 Espalhamento de líquidos em superfícies sólidas
8-15 Emulsificantes óleo em água
13-15 Detergentes
15-18 Solubilizantes
O espalhamento da água sobre uma superfície sólida hidrofóbica pode ser melhorado pela ação de agentes tensoativos. A
maior parte dos contaminantes orgânicos é hidrofóbico, logo a sua remoção da matriz do solo deve ser considerada um
fenômeno do ângulo de contato
. A adição de tensoativos reduz este ângulo de contato na interface triplo solo/composto
orgânico/água; como resultado o composto orgânico se enrola podendo facilmente ser separado (Figura 4).
Figura 4. Comportamento de composto orgânico antes (a) e após (b) adição de
tensoativo.
14
A CMC do tensoativo é menor na água intersticial que na água pura, pois a
presença de sais dissolvidos na água aumenta a força iônica da solução. Contudo este
fenômeno provoca o aumento da adsorção do tensoativo na superfície do solo,
fazendo com que uma quantidade maior de tensoativo seja adicionada ao solo para
atingir a CMC (MESQUITA, 2004).
O grau de associação de poluentes orgânicos e inorgânicos é governado por
uma complexa interação físico-química nas interfaces, esta associação envolve
adsorção entre os constituintes do solo, seqüestrados pela matriz do solo (micro-
poros) e particionados na fase líquida não aquosa (NAPL) que controla o destino da
contaminação. A NAPL representa substâncias orgânicas que são relativamente
insolúveis em água sendo uma fonte de poluição (CHRISTOFI & IVSHINA, 2002).
A solubilização das NAPLs é um fenômeno que está diretamente ligado à formação
de micelas.
As áreas contaminadas representam uma ameaça ambiental, principalmente as
grandes áreas industriais. Por essa razão, muitas técnicas de descontaminação foram
desenvolvidas ao longo dos anos. Mais recentemente, os tensoativos têm sido
empregados nos processos de lavagem de solo para remoção de NAPLs. Uma das
grandes vantagens da utilização dessa técnica é o aumento da solubilidade das
NAPLs, acelerando o processo de biodegradação (MULLIGAN; YONG; GIBBS,
2001). Muitos fatores podem influenciar na eficiência desta lavagem com
tensoativos. Entre elas estão: a dureza da água subterrânea, adsorção em argilas e
biodegradabilidade muito alta. Esta última pode anular o efeito do tensoativo,
embora o fator biodegradabilidade seja importante para evitar acúmulo no solo.
Os principais fatores que devem ser considerados na escolha de um
tensoativo na lavagem de solo são: eficiência na remoção do contaminante, custo,
biodegradabilidade do composto e dos produtos de degradação, baixa dispersão no
solo, efeitos tóxicos em seres humanos, animais e plantas e reciclagem. Todos esses
devem ser estabelecidos previamente em laboratório antes de serem executados
ensaios de campo (MESQUITA, 2004).
Para reduzir o risco de contaminação, são usados tensoativos grau alimentar
(TMAZ, DOWFAX, Aerossol, Tween), todos aprovados pelo “Food and Drug
Administration” (FDA). A aprovação pelo FDA, contudo, não garante que o
tensoativo ou os produtos de degradação sejam seguros e dentro dos padrões da
legislação (BOVING & BRUSSEAU, 2000).
15
A baixa solubilidade em água e alta tensão interfacial na água são duas
características principais comumente encontradas nos contaminantes orgânicos do
solo. Esses fatores diminuem a eficiência da remediação in situ. Para resolver este
problema, podem ser usados diferentes surfactantes e, desta forma, aumentar a taxa
de remediação. Estes atuam sob dois mecanismos: primeiro reduzem a tensão
interfacial entre a água e os contaminantes e segundo, são capazes de formar
agregados conhecidos como micelas que solubilizam os compostos orgânicos
hidrofóbicos. Estes surfactantes também são ingredientes importantes para misturas
primárias de emulsificantes usados para manutenção de emulsões de polímeros,
estabilização de látex de polímeros e emulsificantes para emulsões agrícolas
(MULLIGAN & EFTEKHARI, 2003).
A eficiência da biodegradação de compostos oleosos tem sido limitada pela
fraca transferência de massa devido a alta hidrofobicidade destes compostos,
conduzindo a uma baixa solubilidade aquosa. Para aumentar sua biodegradação
usam-se surfactantes, os quais têm papel crucial para facilitar a biorremediação, pois
estes aumentam a solubilidade dos óleos em água aumentando a biodisponibilidade
destas substâncias hidrofóbicas, conduzindo para o aumento da taxa de degradação
dos óleos. Entretanto, surfactantes sintéticos não são apropriados para aplicações em
biorremediação, pois podem causar efeitos tóxicos ao meio ambiente ou resultar em
uma poluição secundária. Os biossurfactantes por não afetarem o meio ambiente são
uma alternativa aos surfactantes sintéticos convencionais (WEI; CHOU; CHANG,
2005).
Várias técnicas foram desenvolvidas e implementadas para a remediação do
solo e sedimentos contaminados com hidrocarbonetos e metais pesados. Contudo, a
remoção de compostos hidrofóbicos com baixa volatilidade e metais ligados ao solo
é ainda o maior problema. Uma solução potencial para a remediação do solo
contaminado por petróleo e metal é o emprego de surfactantes, os quais solubilizam e
dispersam os contaminantes, limpando o solo, retornando-o a seu estado original
(MULLIGAN; YONG; GIBBS, 1999).
A maioria dos surfactantes utilizados comercialmente é sintetizada a partir de
derivados do petróleo, entretanto, o interesse por surfactantes de origem microbiana
tem aumentado significativamente em decorrência de serem naturalmente
biodegradáveis diminuindo assim o impacto ambiental, ou seja, possuem
características amigáveis ao meio ambiente e ocorrem naturalmente no solo, além de
16
terem aplicações potenciais em diferentes setores industriais, como formulações
farmacêuticas e cosméticas, petroquímica e produtos alimentícios e nas áreas de
proteção ao meio ambiente (MAKKAR & CAMEOTRA, 2002; MAIER &
SOBERÓN-CHÁVEZ, 2000; FIECHTER, 1992; RUFINO; LUNA; SARUBBO,
2003, BANAT; MAKKAR; CAMEOTRA, 2000).
Os surfactantes produzidos a partir do petróleo requerem síntese e várias
etapas de purificação, tornando-se um processo de alto custo, além do que novas
aplicações aumentaram a sua demanda no mundo. A possibilidade do uso de agentes
mobilizantes de poluentes mais biocompatíveis que os surfactantes químicos
comerciais torna atrativo o uso dos surfactantes produzidos por microrganismos
(BODOUR & MILLER-MAIER, 1998; BERSELLI et al., 2006).
Sabendo que, os surfactantes precisam ter uma afinidade elevada para óleos e
poderem formar emulsões óleo/água estáveis para aplicações como líquidos de
limpeza para remoção eficaz de resíduos oleosos em tanques de armazenamento e
processos de limpeza em superfícies metálicas, também é desejável que tais
surfactantes sejam produzidos por recursos renováveis, com baixa ou nenhuma
toxicidade e biodegradáveis, pois os fatores ambientais são os principais guias dos
fabricantes que estão em busca de processos “verdes” com grande destaque aos
biossurfactantes (ZHANG et al., 1999).
3.3. BIOSSURFACTANTES
Os componentes microbianos que exibem alta atividade de superfície e
atividade emulsificante são classificados como biossurfactantes. Estes podem ser
sintetizados como produtos metabólicos por diferentes microrganismos como
bactérias, leveduras e fungos filamentosos utilizando vários substratos de baixo custo
incluindo açúcares, óleos, alcanos, resíduos industriais e agrícolas. Os
biossurfactantes podem ser obtidos por procedimentos relativamente simples como,
por exemplo, processos fermentativos e podem apresentar estruturas químicas
diversas (BANAT; MAKKAR; CAMEOTRA, 2000; RUFINO; LUNA; SARUBBO,
2003, MESQUITA, 2004; HABA et al., 2000). Em geral, os biossurfactantes que
atuam como emulsificantes são agentes que auxiliam na dispersão de um liquido em
outro, como óleo em água. Estes bioemulsificantes podem ser divididos em
17
moléculas de baixo peso molecular que reduzem a tensão interfacial e polímeros de
alto peso molecular como o bioemulsan, o qual auxilia na formação de emulsões
(ROSENBERG & RON, 1997, 1999). Um grande número de espécies bacterianas de
diferentes gêneros produz bioemulsificantes. Esta propriedade é particularmente
comum entre microrganismos que degradam compostos hidrofóbicos insolúveis em
água como o petróleo. Os bioemulsificantes são usados para melhorar a recuperação
de óleo nos derrames no mar e remediação de solos por poluição com óleo, além de
apresentarem também atividade antimicrobiana como, por exemplo, a surfactina
produzida por Bacillus subtilis (TOREN et al., 2002).
As moléculas anfifílicas são a espinha dorsal das membranas celulares,
garantindo o transporte e a troca de material na célula. Nas células de organismos
superiores as lecitinas e o ácido glicólico são os compostos mais conhecidos. Nos
microrganismos são os fosfolipídeos, glícolipídeos, lipopeptídeos e
lipopolissacarídeos. Como estrutura molecular eles possuem uma fração polar
(mono, oligo ou polissacarídeo, ou proteínas) e uma fração apolar (ácido graxo
hidroxilado e álcoois graxos que podem ser saturados ou insaturados).
Muitas vezes os microrganismos produzem substâncias anfifílicas que são
lançadas para fora da célula, a fim de facilitar a entrada de compostos pela membrana
celular ou para aumentar a biodisponibilidade de um substrato no meio. Também
existem situações em que a produção de biossurfactantes está associada à interação
das células com superfícies sólidas (SHAFI & KHANNA, 1995).
Em geral, a estrutura dos biossurfactantes inclui uma porção hidrofílica que
consiste de aminoácidos, peptídeos, ânions ou cátions; mono, di ou polissacarídeos e
uma porção hidrofóbica consistindo de ácidos graxos saturados ou insaturados
(SINGH & CAMEOTRA, 2004). Biossurfactantes produzidos por microrganismos
procariontes ou eucariontes possuem diversas estruturas químicas que podem ter
baixo ou alto peso molecular. Os de baixo peso molecular são geralmente
glicolipídeos contendo os açúcares ramnose, soforose e trealose e lipopeptídeos que
consistem de polipeptídios curtos e os de alto peso molecular como os biopolímeros
que incluem lipoproteínas, complexos lipopolissacarídeo-proteína e complexos
polissacarídeo-proteínas-ácidos graxos. Os biossurfactantes de alto peso molecular
estão associados à produção de emulsão (CHRISTOFI & IVSHINA, 2002; RON &
ROSENBERG, 2002, LANG, 2002; SULLIVAN, 1998).
18
A classificação dos surfactantes sintéticos tem como base os grupamentos
polares, já os biossurfactantes são classificados com base na natureza bioquímica do
composto e podem ser classificados em cinco categorias segundo, Mesquita (2004) e
Reis (1998):
- Glicolipídeos: são geralmente carboidratos combinados com ácidos alifáticos de
cadeia longa ou ácidos alifáticos hidroxilados (ex: trealolipídeos, soforolipídeos e
ramnolipídeo). Eles estão envolvidos na entrada de hidrocarbonetos de baixa
polaridade em células microbianas;
- Lipossacarídeos: um exemplo desse tipo de bioemulsifícante extracelular é o
emulsan com alto peso molecular e solúvel em água produzido pela bactéria
Acinetobacter calcoaceticus;
- Lipopeptídeos: são bastante eficazes na redução de tensão superficial e interfacial; a
surfactina, produzida pela Bacillus subtilis, é o biossurfactante mais potente já
relatado;
- Fosfolipídeos: embora estejam presentes em todos os microrganismos, existem
poucos exemplos de produção extracelular. Os mais conhecidos são produzidos por
Corynebacterium lepus;
- Ácidos graxos e lipídeos neutros: são proteínas hidrofóbicas, como o ácido
ustilágico e os ácidos corinomicólicos.
Há uma grande preocupação mundial relacionada à liberação de
hidrocarbonetos no ambiente decorrente da atividade industrial e do derrame
acidental de óleo e seus componentes relacionados. Os biossurfactantes com
estrutura anfipática atuam sobre os hidrocarbonetos emulsificando-os por meio da
formação de micelas, que se acumulam na interface entre líquidos de diferentes
polaridades. Isto disponibiliza poluentes hidrofóbicos do solo como os
hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (PAHs) e conferem a capacidade de
detergência, emulsificação, lubrificação, solubilização e dispersão de fases (KUIPER
et al., 2004; DESAI & BANAT, 1997, BICCA; FLECK; AYUB, 1999).
Os biossurfactante, por serem biodegradáveis na água e no solo, são
superiores aos surfactantes de origem química, demonstrando uma variedade de
aplicações potenciais incluindo aumento da recuperação de petróleo, auxílio da
biorremediação de poluentes insolúveis em água (organismos e metais), facilidade
em processos industriais (emulsificação, separação de fases, estabilização de
emulsão, formação de espuma, molhabilidade e redução da viscosidade), aumento do
19
transporte de bactérias, aditivos em cosméticos e controle biológico (SULLIVAN,
1998; LIN, 1996; POREMBA et al., 1992; BODOUR & MILLER-MAIER, 1998).
Os biossurfactantes devido à sua diversidade, quando comparados com os
surfactantes químicos convencionais possuem as seguintes vantagens: baixa
toxicidade (Tabela 3), baixa CMC; alta biodegradabilidade, maior habilidade para
complexar metais pesados, melhor compatibilidade ao meio ambiente, melhor
capacidade espumante, alta seletividade e atividade específica em extremos de
temperatura, pH e força iônica (ou seja, menos sensíveis a ambientes extremos),
atividade antibiótica, emulsificação e solubilização de hidrocarbonetos;
características estruturais e propriedades físicas distintas, o que os tornam
comparáveis ou superiores aos surfactantes sintéticos em termos de eficiência; além
de poder ser sintetizados a partir de substratos renováveis e terem a possibilidade de
produção em grande escala, fator importante à medida que o preço do petróleo
aumenta. Assim os biossurfactantes estão assumindo grande importância sobre os
surfactantes químicos (KIM et al., 2000; JENNINGS & TANNER, 2000; BANAT;
MAKKAR; CAMEOTRA, 2000; NITSCHKE & PASTORE, 2002; RAHMAN et
al., 2002b; LIN, 1996; POREMBA et al., 1992; HUDAK & CASSIDY, 2004).
Tabela 3. Toxicidade dos biossurfactantes comparada aos surfactantes sintéticos.
Natureza do surfactante
Surfactante
*CE
50
(mg/L)
biológico Rhodococcus rubber AC 235 - glicolipídeo 650
biológico Rhodococcus erythropolis - trealose
dicorinomicolato
49
biológico Pseudomonas aeruginosa - ramnolipídeo 50
sintético Acetato de nonilfenol - (óxido de etileno)
9
(EQ9)
78
sintético Estearato de sacarose (DK50) 67
sintético Finasol OSR-5 7
sintético Inipol EAP 22 0,004
*CE
50
- concentração efetiva onde 50% dos microrganismos morrem.
20
Os hidrocarbonetos de petróleo continuam sendo usados como principal fonte
de energia e daí um importante poluente global do meio ambiente. Tirando os
acidentes de contaminação do ecossistema, a vasta quantia de lamas de óleo geradas
em refinarias em sistemas de separação água-óleo e a acumulação e desperdício de
materiais engordurados com óleo cru estocados em tanques causam um grande
problema devido aos métodos caros disponíveis para sua remoção (RAHMAN et al.,
2003a). Os biossurfactantes aumentam a emulsificação de hidrocarbonetos, possuem
potencial para solubilizar hidrocarbonetos contaminantes e aumentar sua
disponibilidade aos microrganismos degradativos (RAHMAN et al., 2002b).
A biorremediação do petróleo pode ser realizada por microrganismos capazes
de utilizarem hidrocarbonetos como fonte de energia e carbono; esses
microrganismos são encontrados na natureza e podem degradar vários tipos de
hidrocarbonetos de cadeia curta, cadeia longa e inúmeros compostos aromáticos
como hidrocarbonetos aromáticos policíclicos de baixa solubilidade em água (RON
& ROSENBERG, 2002).
A contaminação marinha com hidrocarbonetos derivados de petróleo pode
causar perigo ao meio ambiente e problemas à saúde. Felizmente alguns gêneros de
bactérias degradantes de hidrocarbonetos produzem biossurfactantes que podem
emulsificar misturas água-hidrocarbonetos o qual também possibilita seu
crescimento em óleo. Esta propriedade emulsificante demonstra o aumento da
degradação de hidrocarbonetos no meio ambiente, sendo uma ferramenta potencial
para o controle da poluição ambiental causada por derramamento de óleo
(KREPSKY et al., 2007).
A contaminação acidental do solo com petróleo ocorre frequentemente devido
ao aumento de seu uso e demanda de seus produtos como óleo diesel. Diferentes
técnicas estão disponíveis para a remediação do solo contaminado como, por
exemplo, a biorremediação com a aplicação de processos ou agentes microbiológicos
(MATHEW et al., 2006, MOLINA-BARAHONA et al., 2005).
Os vazamentos de óleo constantes e os resíduos industriais derivados de
petróleo conduziram, nas últimas décadas, a um aumento na atividade de pesquisa
em biodegradação de petróleo bruto, diesel e outros derivados que são desperdiçados.
As companhias envolvidas têm interesse não só em encontrar maneiras biológicas
efetivas para a degradação do petróleo bruto e de seus derivados, mas também para a
fluidificação e recuperação de quantias significativas de hidrocarbonetos por meio de
21
processos de emulsificação e desemulsificação em sistemas de óleo/água. Igualmente
importante é a procura por estratégias biológicas focalizadas na melhoria da
qualidade dos derivados do petróleo (diesel, gasolina) com a adição de agentes
naturais de emulsificação. Os biossurfactantes promovem condições apropriadas para
a degradação, dispersão e emulsificação dos hidrocarbonetos, aumentam a
recuperação do petróleo pela alteração das características físico-químicas, facilitando
assim sua recuperação (PERFUMO; CANGANELLA; MANNA, 2003).
Devido à natureza extremamente tóxica em concentrações traços e a não-
biodegradabilidade dos poluentes orgânicos, metais pesados são uma ameaça
persistente ao meio ambiente. Resíduos de metais são produzidos por numerosas
atividades industriais: mineração, produção de baterias automobilísticas, emissão de
veículos, desperdício industrial, cinzas que voam nos processos de incineração,
aparelhos eletrônicos e outras manufaturas como pinturas, tubulações metálicas e
munição. Os biossurfactantes são usados para a remoção de metais pesados, pois eles
são capazes de formar biofilmes que absorvem e removem estes compostos
promovendo assim a biorremediação (SINGH & CAMEOTRA, 2004, HONG;
TOKUNAGA; KAJIUCHI, 2002; LE CLAINCHE et al., 2006; BRAUD et al.,
2006).
Os hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (PAHs), como o naftaleno, são
considerados um grande perigo ao ecossistema terrestre e marinho por apresentarem
propriedades tóxicas, mutagênicas e carcinogênicas, que podem interagir com metais
também presentes nestes sistemas. Muitas vezes, microrganismos capazes de
biodegradar estes compostos têm sua eficiência diminuída pela baixa solubilidade
destas substâncias, no meio onde estão presentes. Para aumentar a biodegradação,
tem sido observado que os biossurfactantes são capazes de solubilizar e
conseqüentemente disponibilizar estes PAHs para os microrganismos degradativos
(MARÇANO; VALDMAN; LEITE, 2003; RON & ROSENBERG, 2002; PRABHU
& PHASE, 2003, PALA, 2002; VOLKERING et al., 1995; STRELEC et al., 2003).
Para a remediação de solos contaminados é necessária a adição de agentes
químicos, tais como surfactantes, os quais atuam na mobilidade ou aumentam a
disponibilidade de tais contaminantes. Biossurfactantes possuem vantagens
comparadas aos sintéticos para uso na biorremediação do solo, pois estes são
compostos naturais que apresentam baixo impacto ao meio ambiente e são
22
biodegradáveis (NOORDMAN et al., 1998; TORRENS; HERMAN; MILLER-
MAIER, 1998).
A produção dos tensoativos biológicos não é economicamente vantajosa,
quando comparada com os equivalentes sintéticos, daí a aposta em substratos mais
baratos, como os resíduos agro-industriais (ROCHA, 1999). Os biossurfactantes têm
a vantagem de serem biodegradáveis e sua produção pode ser realizada utilizando
substratos de recursos renováveis e microrganismos; podendo eventualmente
substituir os obtidos quimicamente (FIECHTER, 1992).
A recuperação e concentração do biossurfactante do meio de cultura é que
vão determinar a viabilidade da produção em grande escala. Geralmente a baixa
concentração e a estrutura do biossurfactante limitam a extração. Diferentes métodos
são utilizados nos processos de isolamento como a ultrafiltração, ultracentrifugação,
precipitação com ácido ou sal, extração por solvente e adsorção em cromatografia.
Uma grande variedade de solventes (ex: metanol, etanol, éter etílico, acetona,
clorofórmio, diclorometano) tem sido usada na forma pura ou combinada nos
processos de extração. As misturas mais efetivas são aquelas que utilizam
clorofórmio e metanol, que facilitam no ajuste de polaridade da molécula que se
pretende extrair. Contudo, o uso destas substâncias em grande escala demanda
grandes volumes de solvente o que torna o processo caro e por outro lado, gera
resíduos clorados (KIM et al., 1997; KUYUKINA; IVSHINA; PHILP, 2001).
Devido ao alto custo dos processos de remediação e outras aplicações
potenciais, é necessário, e inevitável, aumentar o rendimento do biossurfactante.
Entretanto, o potencial para a produção de biossurfactante é determinado pela origem
do microrganismo, além de outros fatores como condições ambientais e a natureza do
substrato que também influenciam no nível de expressão. A otimização dessas
condições pode levar a uma alta e segura produção de biossurfactante (RAHMAN et
al., 2002a).
Óleo diesel é uma excelente fonte para se estudar a biodegradação de
hidrocarboneto. O Brasil é um produtor e consumidor em grande escala de óleo
diesel e este tem sido várias vezes reportado em problemas de poluição no meio
ambiente devido ao seu uso extensivo como combustível (BICCA; FLECK; AYUB,
1999).
Diversos óleos derivados de plantas nativas como babaçu, andiroba, cupuaçu
e buriti podem ser utilizados como fonte de carbono para obtenção de
23
biossurfactante. Costa et al. (2006), relataram a obtenção de ramnolipídeos de
Pseudomonas aeruginosa utilizando óleos de plantas nativas como substrato.
O sucesso para produção de biossurfactantes depende do desenvolvimento de
processos baratos e o uso de matérias-primas de baixo custo o qual diminui de 10-
30% o custo total do processo. Açúcares e óleos são fontes de carbono adequadas
para a produção de biossurfactantes ecologicamente seguros e com boas
propriedades surfactantes (SARUBBO; LUNA; CAMPOS-TAKAKI, 2006).
Os biossurfactantes são atualmente mais caros que seus sintéticos
equivalentes, mas seu potencial para produção in solo por espécies nativas pode
reduzir o custo comparado com biossurfactantes comprados ou cultivados em
bioreatores, particularmente solos contaminados por hidrocarbonetos ou a adição de
resíduos podem ser utilizados como substrato para o cultivo (HUDAK & CASSIDY,
2004). Resíduos agroindustriais com alto conteúdo de carboidratos e lipídeos são
necessários para o uso como substratos na produção de biossurfactantes
(NITSCHKE; FERRAZ; PASTORE, 2004).
O interesse na produção de surfactantes microbianos tem permitido o
desenvolvimento de métodos quantitativos e qualitativos rápidos e eficientes para
seleção e análise de organismos produtores de biossurfactantes (BODOUR &
MILLER-MAIER, 1998).
O comportamento dos biossurfactantes pode ser observado pela análise de
dados da tensão superficial e interfacial provenientes das características do caldo, do
sobrenadante livre de células e do produto cru e puro após a extração (LANG &
PHILP, 1998).
As medidas de tensão superficial são comumente usadas para monitorar o
crescimento microbiano e existe uma grande quantidade de informações na literatura
sobre tensão superficial e propriedades de emulsificação para alguns
microrganismos. Contudo, é difícil comparar os dados publicados para um
microrganismo específico, pois o crescimento e a produção de surfactante estão
associados ao meio de cultura, pH, fonte de carbono e aeração. Um dos fatores que
controlam a produção de biossurfactante é a quantidade da fonte de carbono (solúvel
em água, hidrocarbonetos ou óleos) e nitrogênio (NH
4
+
, NO
3
-
, uréia ou aminoácido)
no meio de cultura ou ambiente natural (MESQUITA, 2004).
As bactérias podem ser facilmente isoladas de áreas contaminadas por
hidrocarbonetos de petróleo e, provavelmente, algumas delas serão capazes de
24
produzir surfactantes. No isolamento utilizam-se hidrocarbonetos alifáticos e
aromáticos como única fonte de carbono mineral, estudos revelaram que um grande
número de microrganismos isolados por esta técnica, como as espécies de
Rhodococcus, Acinetobacter, Pseudomonas e outros gêneros capazes de produzir
biossurfactantes (ROY; KOMMALAPATI; MANDAVA, 1997; BARKAY et al.,
1999; CHRISTOFI & IVISHINA, 2002, SULLIVAN, 1998).
Outras vantagens dos biossurfactantes incluem: diversidade estrutural que
pode ligar a propriedades únicas, a possibilidade de custo-efetivo em produção ex
situ ou talvez uniforme em produção in situ e biodegradabilidade, essas propriedades
fazem do biossurfactante uma escolha promissora para aplicação no meio ambiente
(HUA et al., 2003).
A adição de hidrocarbonetos no ecossistema pode resultar em um aumento
seletivo de microrganismos capazes de utilizar os hidrocarbonetos como produtos
metabólicos (RAHMAN et al., 2002b). A literatura indica que as bactérias das
famílias Pseudomonadacea e Bacillacea são muito eficientes na remoção de petróleo
e seus derivados poluentes na água (CYBULSKI et al., 2003).
3.4. MICRORGANISMOS PRODUTORES
Com muita freqüência, a análise do solo está relacionada com o isolamento e
identificação de tipos fisiológicos específicos de microrganismos, bem como, com a
caracterização e a detecção de sua atividade (LYNCH, 1986). Microrganismos
produtores de biossurfactantes podem ser isolados de solos contaminados por
hidrocarbonetos e por bactérias de ecossistema marinho (COELHO et al., 2003;
JENNINGS & TANNER, 2000). Microrganismos isolados de materiais não
contaminados também podem ser capazes de produzir moléculas com propriedades
anfifílicas. Desta forma, é necessário de um maior conhecimento da fisiologia,
genética e bioquímica dos microrganismos produtores de biossurfactantes
(FIECHTER, 1992).
Segundo Georgiou; Lin; Sharma (1992), uma grande variedade de
microrganismos produz biossurfactantes, sendo que o tipo, a quantidade e a
qualidade do biossurfactante são influenciados pela natureza do substrato,
concentração de íons no meio de cultura, além das condições de cultivo.
25
Bactérias produtoras de surfactantes incluem: Pseudomonas aeruginosa
(mono- di-ramnolipídeos), Corynebacterium, Nocardia e Rhodococcus (fosfolipídeos
glicolipídeos, etc.) Bacillus subtilis (surfactina), Bacillus licheniformis
(lipopeptídeos) e Arthrobacter paraffineus (trealose e lipideos sucrose). Fungos
envolvidos na produção de surfactantes incluem as leveduras Torulopsis sp
(soforolipídeos) e Candida sp (liposan e fofolipídeos) (CHRISTOFI & IVSHINA,
2002).
Os microrganismos produtores de biossurfactantes mais conhecidos estão
listados nas Tabela 4, assim como alguns exemplos das estruturas estão apresentados
na Figura 5.
Tabela 4. Principais classes de biossurfactantes e microrganismos envolvidos.
Tipos de Biossurfactantes Microrganismos
Glicolipídeos
- ramnolipídeos
Pseudomonas
aeruginosa, Bacillus
sp
- soforolipídeos Torulopsis bombicola, T. apícola
- trehalolipídeos Rhodococcus erythropolis,
Mycobacterium sp
Lipopeptídeos e lipoproteínas
- Peptídeo-lipídeo
Bacillus
licheniformis
- Viscosina
Pseudomonas
fluorescens
2
6
- Ornitina
Pseudomonas sp
- Serrawetina
Serratia marcescens
- Surfactina
Bacillus subtilis
- Subtilisina
Bacillus subtilis
- Gramicidina
Bacillus brevis
- Polimixina
Bacillus polymyxa
Ácidos Graxos,lipídeos neutros,
e fosfolipídeos
- Ácidos graxos
Corynebacterium
lepus
- Lipídeos neutros
Nocardia
erythropolis,
Clostridium sp
- Fosfolipídeos
Thiobacillus
thiooxidans
Surfactantes poliméricos
- emulsan
Acinetobacter
calcoaceticus
- biodispersan
Acinetobacter
calcoaceticus
- liposan
Candida tropicalis
- Alasan
Acinetobacter
radioresistens
- carboidrato-lipídeo-proteína
Pseudomonas
fluorescens
- manana-lipídeo-proteína
Candida tropicalis
27
Ácidos corinemicólicos Corynebacterium sp
Surfactantes particulados
- vesículas
Acinetobacter
calcoaceticus
- células Várias bactérias
NITSCHKE & PASTORE (2002)
ramnolipídeo (a) trealose-lipídeo (b)
28
soforolipídeo (c) emulsan (d)
surfactina (e)
Figura 5. Estruturas químicas de alguns biossurfactantes produzidos por: (a)
Pseudomonas aeruginosa, (b) Rhodococcus erythropolis (c) Candida
bombicola (d) Acinetobacter calcoaceticus e (e) Bacillus subtilis.
Um estudo intensivo de grupos de biossurfactantes mostrou que os glicolipídeos, como os ramnolípideos produzidos por
Pseudomonas são os mais representativos. Lipopeptideos formam outro importante grupo de biossurfactantes, que são
produzidos por membros do gênero Bacillus, Lactobacillus, Streptococcus e Pseudomonas (KUIPER et al., 2004) e os
soforolipideos (SLPs) são produzidos por Candida bombicola, apicola e bogorensis. Estudos realizados por Hua; Chen;
Lun (1998), mostraram que uma linhagem de Candida antarctica foi capaz de produzir um biossurfactante utilizando como
substrato diferentes hidrocarbonetos e a sua produção foi acompanhada quanto a capacidade de reduzir a tensão superficial
sendo este biosurfactante chamado BS-UC. Outra espécie, a Candida lipolytica, produziu um biossurfactante extracelular
com atividade de emulsificação, pela fermentação do óleo de babaçu e glicose como fontes de carbono (VANCE-
HARROP; GUSMÃO; CAMPOS-TAKAKI, 2003; LANG, 2002; HUA et al., 2004; KIM et al., 2002).
Do ponto de vista ecológico, os soforolipídeos oferecem vantagens
significativas em relação aos detergentes tradicionais produzidos quimicamente, pois
nenhum produto químico perigoso tal como o óxido do etileno é envolvido, nem
mesmo alta temperatura ou pressão são requeridos durante a produção e o processo
inteiro é baseado em materiais recicláveis. Além disso, os soforolipideos
demonstraram ser pronta e inteiramente biodegradáveis, não tóxicos ao meio
aquático e com potencial para uso em formulações de lavagem e de limpeza
(FLEURACKERS, 2006).
O gênero Bacillus sp pode produzir surfactantes lipoprotéicos como iturina,
fengicina, liquenisina, micosubtilisina, bacilomicina e surfactina, os quais possuem
atividades antibióticas (BARROS et al., 2007).
Bacillus subtilis, uma bactéria comum de solo, produz um biossurfactante
lipopeptídeo cíclico conhecido como surfactina. A surfactina possui uma estrutura
29
anfifílica associada com uma alta atividade surfactante e tem a propriedade biológica
de afetar tumores, bactérias, fungos, vírus e micoplasmas, além de apresentar baixa
CMC e alto poder de redução da tensão superficial (VOLLENBROICH et al., 1997;
QUEIROGA; NASCIMENTO; SERRA, 2003; LANG, 2002; BARROS et al., 2007).
Os ramnolipídeos são formados por uma ou duas moléculas de ramnose, ligadas a uma ou duas moléculas de ácido ß-
hidroxidecanóico e são produzidos por Pseudomonas (DESAI & BANAT, 1997; HABA et al., 2003) (Figura 5).
Ramnolipídeos são biossurfactantes que reduzem a tensão superficial, estabilizam emulsões, promovem a formação de
espumas, são geralmente não-tóxicos, biodegradáveis e também possuem atividade anti-fúngica. Além disso a ramnose do
ramnolipídeo pode ser usada como transporte de drogas insolúveis em humanos e ainda, agir como um precursor para
componentes de flavor de alta qualidade (RAHMAN et al., 2002a). Pseudomonas aeruginosa produz um glicolipídeo
extracelular que atua como agente solubilizante de compostos hidrofóbicos como os alcanos e também apresenta eficiência
na remoção de metais pesados por complexação (DÉZIEL et al., 2003; LANG & PHILP, 1998; BRAUD et al., 2006). Este
ramnolipídeo tem sido aplicado em várias indústrias e processos de biorremediação devido a sua alta atividade
emulsificante e sua atuação na redução da tensão superficial (reduz a tensão superficial da água de 72 para 30 mN/m)
(WEI; CHOU; CHANG, 2005) e tem sido estudado por seu potencial para lavagem do solo (MAIER & SOBERÓN-
CHÁVEZ, 2000). Pseudomonas putida produz este mesmo bioemulsificante com alta atividade emulsificante (BONILLA
et al., 2005; LANG, 2002).
Os ramnolipídeos podem servir como fonte de ramnose, um produto químico
fino produzido comercialmente pela extração de plantas como o carvalho. O
processo emprega produtos químicos tóxicos, corrosivos e gera quantidades grandes
de resíduos aromáticos perigosos. Os ramnolipídeos produzidos por fermentação
podem ser facilmente hidrolisados para a obtenção da ramnose sendo uma alternativa
amigável ao meio ambiente (CHAYABUTRA; WU; JU, 2001).
Lipopeptídeos (viscosina) produzidos por Pseudomonas fluorescens, são
agentes de biocontrole de fungos fitopatógenos ou fitotóxicos (LANG, 2002;
KUIPER et al., 2004).
O gênero Rhodococcus é capaz de transformar, biodegradar ou utilizar como
fontes de carbono vários compostos hidrofóbicos (hidrocarbonetos, esteróides,
lignina, etc.), produzindo glicolipídeos contendo trealose como carboidrato. Seu
biossurfactante tem a capacidade de reduzir a tensão superficial e interfacial a níveis
observados nos surfactantes sintéticos, além de possuir baixa CMC. Esta capacidade
pode ser comercial e industrialmente importante. Rhodococcus erythropolis produz
glicolipídeos com propriedades antiviral e antifúngica (BICCA; FLECK;
AYUB,1999; LANG & PHILP, 1998).
Espécies de Acinetobacter produzem biossurfactantes, entre eles se destacam
o emulsan, produzido por Acinetobacter calcoaceticus, e o alasan, produzido por
Acinetobacter radioresistens, os quais são polissacarídeos de alto peso molecular que
atuam como bioemulsificantes (RON & ROSENBERG, 2002; LANG, 2002).
O emulsan produzido por Acinetobacter calcoaceticus é um
lipoheteropolissacarídeo aniônico que devido aos seus grupos hidrofóbicos é de
extremo interesse como agente emulsificante podendo remover resíduos oleosos e
30
estabilizar em 70% emulsões óleo/água de lavagem em oleodutos (ZHANG et al.,
1999).
Linhagens de Penicillium citrinum (fungo filamentoso) são capazes de
produzir uma lipase extracelular (glicolipídeo) com propriedades emulsificantes
(CAMARGO - DE - MORAIS et al., 2003).
Foi relatado que lipopeptídeos produzidos por Bacillus, Lactobacillus e
Streptococcus atuam na adesão das bactérias às superfícies. Esta adesão é essencial
para o desenvolvimento e manutenção do biofilme bacteriano. A formação deste
biofilme bacteriano é perigoso na área médica e na limpeza de equipamentos
tornando-se um problema importante, especialmente, aquelas bactérias nas quais os
biofilmes são altamente resistentes a antibióticos (KUIPER et al., 2004).
Espécies de Microbacterium produzem um glicoglicerolipídeo que possui a
propriedade de diminuir a tensão interfacial e superficial podendo ter aplicação em
processos de biorremediação do solo.
Nocardia sp produz dois biossurfactantes quando cultivadas em n-
hexadecano, o tipo I tem uma grande capacidade como agente emulsificante e o tipo
II reduz a tensão superficial da água a 28 mN/m (LANG, 2002).
A levedura Pseudozyma fusiformata produz um biossurfactante termoestável
de baixo peso celular com propriedade fungicida (LANG, 2002).
Macrocystis pyrifera e Azotobacter vinelandii produzem
heteropolissacarídeos usados como dispersantes na indústria de processamento de
cerâmica.
Biossurfactantes eficientes para a desorção de poluentes hidrofóbicos do solo
podem ser obtidos por uma variedade de microrganismos como: Acinetobacter
calcoaceticus, Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa e Rhodococcus
erythropolis. Este último, pode produzir material biofloculante que causa floculação
eficiente de suspensões sólidas (LANG & PHILP, 1998).
A manoproteína produzida por Saccharomyces cerevisiae pode estabilizar emulsões água/óleo para a produção de
maionese, biscoitos, bolos, produtos cárneos (salsichas), sorvetes e outros e a parede celular de Saccharomyces uvarum
hidrolisada e liofilizada é utilizada em margarinas (BARROS et al., 2007).
3.5. APLICAÇÕES DOS BIOSSURFACTANTES
Os biossurfactantes ou substâncias tensoativas dividem preferencialmente a
interfase entre fluídos com diferentes graus de polaridade e pontes de hidrogênio tais
31
como óleo/água ou ar/água interfacial. Estas propriedades rendem a estes, a
capacidade de reduzir a tensão superficial e interfacial e formam microemulsões nas
quais os hidrocarbonetos podem solubilizar-se em água ou a água solubilizar-se em
hidrocarbonetos. Portanto, estes podem ser utilizados em várias atividades industriais
que envolvam o uso de surfactantes sintetizados quimicamente como: a indústria de
petróleo, farmacêutica, médica, de cosméticos, na agricultura para a formulação de
herbicidas e pesticidas, na produção de produtos de higiene pessoal, detergentes,
processamento de alimentos (textura), tratamento e processamento de metais,
vestuário, processamento de polpas de papel, indústria de tinta, emulsões e
floculação (ANISZEWSKI et al., 2003; BANAT; MAKKAR; CAMEOTRA, 2000).
Devido as suas propriedades físico-químicas, os biossurfactantes são mais
adequados que a maioria dos surfactantes sintéticos para uso na indústria
petroquímica, o que explica porque a maior parte da produção de biossurfactante
(estimada entre 400 a 500 toneladas/ano) é usada em processos relacionados a
indústria petroquímica. As lamas e as frações de óleo pesado que se acumulam como
depósitos sólidos no fundo dos tanques de armazenagem de óleo são altamente
viscosas, não sendo possível a retirada pelo método convencional de bombeamento.
Normalmente este tipo de limpeza requer lavagem com solvente ou limpeza manual,
sendo ambos perigosos e caros. Uma alternativa para este processo de limpeza é a
formação de uma emulsão óleo/água pelo uso de surfactante, promovendo a remoção
da lama pelo processo de bombeamento e recuperação do resíduo após a quebra da
emulsão. A aplicação de biossurfactantes neste processo foi iniciada na década de 70
e, nos anos 80 foram relatados os primeiros estudos em pequena escala do uso do
emulsan (produzido pelo Acinetobacter calcoaceticus) na limpeza de vasos
contaminados por óleo (BOGNOLO, 1999).
Uma possibilidade de mercado para os biossurfactantes seria na indústria de
petróleo para biorremediação/dispersão, tanto no solo quanto no mar, durante os
derramamentos de óleo; remoção/mobilização de óleos incrustados em tanques de
estocagem, rochas e areia do mar, aumentando assim a sua recuperação (BANAT;
MAKKAR; CAMEOTRA, 2000).
Um segundo mercado para os biossurfactantes é na formação de emulsões
que utilizam polímeros nas indústrias de pinturas, revestimento, asfalto, cimento,
têxtil e de fibras, Além do emprego na remoção de metais pesados, no tratamento de
32
água, na mineração, em carvoarias e na proteção de madeira (BANAT; MAKKAR;
CAMEOTRA, 2000).
Em processos de remediação in situ não é necessário o uso de biossurfactante
purificado, uma vez que os nutrientes do meio de cultura e as bactérias produtoras de
surfactante auxiliam a promover a biodegradação. Por razões óbvias, se a fonte de
carbono for um hidrocarboneto é recomendável que seja feita a remoção dos
hidrocarbonetos do meio de cultura para que a solução possa ser utilizada na
recuperação de solo e/ou lençol freático contaminado (ROY; KOMMALAPATI;
MANDAVA, 1997).
Os poluentes orgânicos são um problema particular para processos de
remediação do solo. Os componentes hidrofóbicos são difíceis de remover e sua
disponibilidade para biodegradação é extremamente pequena. A aplicação de
biossurfactantes para a remoção de poluentes hidrofóbicos tem como objetivo
aumentar a biodisponibilidade e a biodegradabilidade destes compostos (LANG &
PHILP, 1998).
A indústria farmacêutica e de cosméticos utilizam grandes quantidades de
surfactantes numa variedade de produtos, tais como: repelentes de insetos, anti-
ácidos, pomadas para acne, produtos anti-caspa, soluções para lentes de contato,
tintura para cabelos, desodorantes, esmaltes para unhas, batom, sombra, máscaras,
pasta de dentes, produtos de limpeza de dentaduras, anti-transpirantes, lubrificantes
de preservativos, produtos para bebê, cremes para os pés, produtos de depilação e
hidratantes (LINHARDT et al., 1989).
Na indústria alimentícia, a emulsificação tem papel importante na formação
da consistência e textura, bem como na dispersão de fases e na solubilização de
aromas. Os biossurfactantes são utilizados como emulsificantes no processamento de
matérias-primas, na panificação e em produtos derivados de carne, onde influenciam
as características reológicas da farinha e a emulsificação de gorduras. Alguns
produzidos por microrganismos estão sendo utilizados comercialmente, como por
exemplo, o bioemulsificante produzido por Candida utilis que tem sido utilizado em
molhos prontos para saladas (NITSCHKE & PASTORE, 2002; BANAT;
MAKKAR; CAMEOTRA, 2000). Outra aplicação de biossurfactantes é na indústria
de laticínios, onde retardam a colonização de Streptococcus thermophilus,
responsável pelo cheiro ou gosto ruim durante a pasteurização (BANAT; MAKKAR;
CAMEOTRA, 2000).
33
De um modo geral, a função dos emulsificantes em alimentos é promover a
estabilidade da emulsão, controlando a aglomeração de glóbulos de gordura e
estabilizando sistemas aerados. Outras aplicações envolvem a melhoria da textura e
vida de prateleira de produtos contendo amido pela formação de complexos,
modificação das propriedades reológicas da farinha de trigo pela interação com o
glúten, melhor consistência e textura de produtos a base de gordura pelo controle do
polimorfismo e da estrutura cristalina das gorduras, além de promover a
solubilização de aromas (BARROS et al., 2007).
Os biossurfactantes também possuem aplicações terapêuticas, por exemplo,
os ramnolipídeos, lipopeptídeos e manosileritrolipídeos apresentam atividade
antimicrobiana e são capazes de diminuir a adesão de bactérias patogênicas entéricas
nas superfícies. Além disso, os ramnolipídeos possuem atividades pesticida,
antibacteriana, antifúngica e antiviral e podem servir como fonte do ramnose
(CHAYABUTRA; WU; JU, 2001, LANG & PHILP, 1998; BANAT; MAKKAR;
CAMEOTRA, 2000). Os lipopeptídeos incluem a surfactina, viscosina e polimixina,
as quais possuem efeitos antitumorais, antibióticos imunomoduladores ou inibidores
de enzimas e toxinas.
Alguns biossurfactantes podem também estimular a adesão de bactérias em
superfícies xenobióticas por influenciar a hidrofobicidade da superfície da célula
bacteriana ou da superfície do xenobiótico (KUIPER et al., 2004).
Na agricultura os biossurfactantes produzidos por Bacillus são utilizados para
emulsificar formulações de pesticidas organofosforados miscíveis (NITSCHKE &
PASTORE, 2002). Outra aplicação é no controle biológico de plantas patógenas
como, por exemplo, a Olpidium brassicae e Pythium aphanidermatum, onde o
biossurfactante ramnolipídeo demonstrou alta eficiência (MAIER & SOBERÓN-
CHAVÉZ, 2000; BANAT; MAKKAR; CAMEOTRA, 2000).
Os biossurfactantes do tipo soforolipídeos (SLPs) apresentam atividade anti-
cancerígena na inibição de tumores, ação desodorante e hidratante e biorremediação
do solo. O microrganismo produtor pode usar vários substratos renováveis, Candida
bombicola, por exemplo, utiliza carboidratos, óleos vegetais, gorduras animais, n-
alcanos, ácido oléico e resíduos de refinaria de petróleo (PEKIN; VARDAR-
SUKAN; KOSARIC, 2005).
A surfactina possui atividade bactericida, fungicida, antiviral, agente
antitumoral, atua como inibidor da formação de coágulos fibrinosos,
34
antimicoplasmático, veículo para a administração de drogas via pulmonar e é capaz
de inibir a formação de biofilmes de outras bactérias, incluindo a patógena
Salmonella. A surfactina pode ser usada para fins medicinais em aplicações
relacionadas ao aumento da segurança de produtos biotecnológicos e farmacêuticos,
tais como derivados de sangue e produtos obtidos de culturas de células, os quais
possuem risco de transmitir doenças, como o vírus da hepatite B, HIV ou herpes
simples; devido a sua baixa toxicidade pode ser também aplicada em alimentos e
cosméticos (BARROS et al., 2007).
Outros surfactantes produzidos por culturas de Pseudomonas sp, Alcaligenes
sp, Acinetobacter calcoaceticus A2 e Candida bombicola foram utilizados na
mineração para flotação, prevenção de floculação e solubilização de carvão
(NITSCHKE & PASTORE, 2002; BANAT; MAKKAR; CAMEOTRA, 2000).
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1. Isolamento e caracterização das bactérias produtoras
Amostras não contaminadas e contaminadas com hidrocarbonetos foram
coletadas em diferentes locais (solo de borracharia, solo de posto de gasolina, areia
do mar contaminada com petróleo, areia do mar sem contaminação e terra fértil),
escolhidos aleatoriamente. Para o isolamento de bactérias possíveis produtoras,
35
foram feitas diluições decimais seriadas em solução salina (0,85%) até 10
-15
e
plaqueadas em ágar padrão para contagem (PCA), seguido de incubação a 30
o
C por
24 e 48 horas. As bactérias obtidas foram replaqueadas em ágar-sangue por 24 e 48
horas a 30
o
C. A presença de halo de -hemólise sugeriu a produção de
biossurfactantes.
4.2. Manutenção das bactérias produtoras
As bactérias possíveis produtoras, ou seja, -hemolíticas, foram semeadas em
tubos inclinados de PCA durante 24 horas a 30
o
C e depois foram mantidas sob
refrigeração a 4
o
C.
4.3. Identificação das bactérias
Os gêneros bacterianos foram identificados através das características
morfológicas microscópicas e macroscópicas, além de serem submetidos a testes
bioquímicos de atividade enzimática (amilase, protease, lecitinase, gelatinase,
catalase, oxidase, urease), fermentação de açúcares (lactose, sacarose, frutose,
maltose, manitol, glicose), fenilalanina, citrato, ágar lisina ferro (LIA), ágar três
açúcar e ferro (TSIA), vermelho de metila (VM), Voges-Proskauer (VP), indol,
motilidade, nitrato de acordo com Bergey’s (1984). A espécie foi identificada pela
reação em cadeia da polimerase (PCR) por meio do gene RNA ribossomal 16S.
4.4. Produção dos biossurfactantes
4.4.1. Microrganismos
Para a produção dos biossurfactantes microbianos foram utilizadas as
bactérias previamente selecionadas e identificadas no item 4.3.
4.4.2. Meio base
36
O meio base empregado para a fermentação foi o proposto por Bicca; Fleck;
Ayub (1999) acrescentado da fonte de carbono selecionada. O meio constou de (g/L):
MgSO
4
.7H
2
O 0,5
KCl 0,1
KH
2
PO
4
0,5
CaCl
2
0,01
K
2
HPO
4
1,0
NaNO
3
7,0
FeSO
4
.7H
2
O 0,01
Extrato de levedura 0,1
Óleo diesel 1,0% (v/v)
4.4.3. Meio de produção
Foram utilizados frascos de Erlenmeyer de 250 mL contendo 50 mL do meio
base proposto por Bicca; Fleck; Ayub (1999), previamente esterilizado e foram
testados diferentes valores de pH (5,0; 6,0; 7,0 e 8,0), tempo de fermentação (48, 72
e 96 horas) e diferentes fontes de carbono (glicose, sacarose, manitol, caldo de cana,
glicose mais frutose e frutose) nas concentrações de 1 a 5%. As análises foram
realizadas em triplicata.
4.4.4. Produção do biossurfactante
Cada bactéria foi inoculada em tubos de ensaio contendo 5 mL de caldo
nutriente e incubada por 24 h. a 30
o
C. Após a incubação, foi feita a suspensão de
células de cada tubo e submetida à leitura de densidade óptica a 620 nm até 0,05 para
padronização do inóculo sendo então transferida para frascos de Erlenmeyer de 250
mL contendo 45 mL de meio de produção seguido de incubação a 30
o
C e 200 rpm. O
caldo de fermentação foi centrifugado a 13608 g a 4
o
C por 20 min. para separação
das células.
37
4.5. Determinação da presença de biossurfactantes
Os caldos fermentados livres de células foram submetidos à análise de tensão
superficial, índice de emulsificação, concentração micelar crítica (CMC), atividade
emulsificante, atividade antimicrobiana e degradação do petróleo.
4.5.1. Determinação da tensão superficial
A tensão superficial foi determinada em 10 mL do sobrenadante colocados
em uma placa de Petri (9,5 cm de diâmetro) e medida diretamente da superfície do
emulsificante com um tensiômetro de Leconde Du Nouy. Esta placa foi utilizada na
determinação de todas as leituras de todas as amostras (BICCA; FLECK; AYUB,
1999).
4.5.2. Índice de emulsificação (E
24
)
Foi determinado em tubos de ensaio com tampa de rosca pela adição de 2,0
mL de tolueno a 3,5 mL do sobrenadante, misturando em agitador de tubo por 2 min.
e deixado em repouso por 24 horas. O índice foi calculado como porcentagem da
altura da camada emulsificada (cm) dividida pela altura total da coluna do líquido
(cm) (BICCA; FLECK; AYUB, 1999).
4.5.3. Determinação da atividade emulsificante
A atividade emulsificante foi determinada em tubos de ensaio com tampa de
rosca misturando em agitador de tubo durante 2 min., 3,5 mL da solução do
biossurfactante com 2 mL de tolueno e realizando-se a leitura da densidade óptica
em espectrofotômetro a 610 nm (KIM et al., 2000).
4.5.4. Determinação da concentração micelar crítica (CMC)
A determinação da CMC foi realizada pela medida da tensão superficial do
sobrenadante (livre de células) diluindo-se sucessivamente (volumes iguais de água)
38
até o valor da tensão próximo ao valor da água. O valor da CMC foi dada pelo ponto
central da inflexão da curva do gráfico tensão superficial versus concentração de
sobrenadante contendo o biossurfactante (KIM et al., 2000).
4.5.5. Separação dos biossurfactantes
Os biossurfactantes foram separados do sobrenadante por precipitação com
etanol absoluto (1:2) à 4
o
C por 24 h. e secos em estufa a vácuo a 45
o
C até peso
constante.
4.5.6. Determinação do crescimento celular
O crescimento celular foi determinado pelo peso seco das células obtidas
durante a produção, as quais foram transferidas quantitativamente com água
destilada, para placas de Petri pré-pesadas e secas em estufa a vácuo a 45
o
C até peso
constante.
4.5.7. Purificação do biossurfactante
O biossurfactante precipitado do sobrenadante livre de células com etanol
(1:2) foi purificado por diálise usando uma membrana de diâmetro 2,5 cm e poro 10
kDa em água destilada. A diálise foi realizada durante 72 horas e a água da diálise
trocada três vezes ao dia.
4.5.8. Atividade antimicrobiana
A atividade antimicrobiana foi determinada utilizado dois métodos: em placas
de Petri e em tubos de ensaio.
Para os testes em placas, as bactérias selecionadas e seus sobrenadantes foram
introduzidos ao meio através da impregnação em discos estéreis, os quais foram
colocados nas placas de Petri contendo ágar padrão para contagem (PCA) que foram
previamente inoculadas por superfície com bactérias Gram positivas (Bacillus
cereus, Bacillus circulans e Bacillus polymyxa) e as Gram negativas (Escherichia
coli, Citrobacter diversus e Klebsiella pneumoniae). Também foram colocados
discos impregnados com as bactérias selecionadas e seus sobrenadantes em placas
39
contendo ágar dextrose batata (PDA) preveamente inoculados com Aspergillus
awamori para testar sua atividade antifúngica. As leituras dos halos de inibição
foram realizadas por 24, 48 e 72 horas para as bactérias e 5 dias para o fungo os
quais são um indicativo de atividade antimicrobiana. Todas as análises foram feitas
em triplicata.
Para os testes em tubos de ensaio 0,1 mL de cada sobrenadante produzido nos
caldos de fermentação foram adicionados em tubos contendo caldo nutriente que
foram previamente inoculados com com as bactérias Gram positivas e Gram
negativas e o fungo teste. O controle do crescimento destes microrganismos foi
acompanhado em tubos sem a presença de biossurfactante. As leituras foram
realizadas em espectrofotômetro a 620 nm por 24, 48 e 72 horas para as bactérias e 5
dias para o fungo. Todas as análises foram realizadas em triplicata.
4.5.9. Fluidez do petróleo
Placas de Petri contendo areia (10 g), inóculo das bactérias selecionadas (2%)
e petróleo (1%) foram incubadas a 30
o
C por 20 dias. O controle negativo não possuía
inóculo, após este período as placas foram submetidas a análise macroscópica para
observação da fluidez do petróleo (GOUVEIA et al. 2003).
4.6. Determinação da composição do biossurfactante
Para a determinação de sua composição o biossurfactante purificado foi
analisado por ressonância magnética nuclear (RMN) e foi realizada a análise da
presença de proteína pelo método de Kjeldahl, conforme Joslyn (1970), presença de
gordura por Bligh-Dyer (1959), açúcares redutores e açúcares totais por Somogy-
Nelson (1952; 1944) e Dubois; Gilles; Hamilton (1956).
4.7. Determinação do efeito do biossurfactante num sistema modelo sal-vinagre-
azeite
40
Foram realizados ensaios utilizando o biossurfactante purificado num sistema
modelo que imita um molho para salada. As leituras do índice de emulsificação (E
24
)
foram realizadas em misturas de várias proporções de vinagre, azeite e sal com a
concentração do biossurfactante constante (3,5 mL); estas foram homogeneizadas em
agitador de tubos por 2 min. e após deixadas em repouso por 24 horas. O índice de
emulsificação foi calculado como a porcentagem da altura da camada emulsificada
(cm) dividida pela altura total da coluna do líquido (cm). As proporções foram
determinadas usando o programa Statistica 7 planejamento fatorial completo 3** (3-
0).
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1. Isolamento das bactérias produtoras de biossurfactantes
Neste trabalho foram colhidas cinco amostras de diferentes origens: solo de
borracharia (amostra 1), de posto de gasolina (2), areia de praia não-contaminada por
hidrocarbonetos (3), areia de praia contaminada por hidrocarbonetos (4) e solo fértil
(5) para testes de produção de biossurfactantes.
41
Da amostra 1 foram selecionadas sete colônias, da 2 oito, da 3 uma, da 4 seis
e 5 seis, totalizando vinte e oito colônias. Nestas foi realizada a coloração de Gram
para identificação de suas características morfológicas e verificar sua pureza.
Na Tabela 5 pode-se observar que das vinte e oito colônias bacterianas
coradas, vinte e cinco são bastonetes Gram positivos, um cocobacilo Gram negativo
e dois cocos Gram positivos.
Tabela 5. Coloração de Gram das bactérias isoladas das cinco amostras de solo e
areia de praia.
Amostra 1 (borracharia) Gram
1A Bastonetes (+)
1B Bastonetes (+)
1C Bastonetes (+)
1D Bastonetes (+)
1E Bastonetes (+)
1F Bastonetes (+)
1G Bastonetes (+)
Amostra 2 (posto de gasolina) Gram
2A Bastonetes (+)
2B Bastonetes (+)
42
2C Bastonetes (+)
2D Bastonetes (+)
2E Bastonetes (+)
2F Bastonetes (+)
2G Bastonetes (+)
2H Cocos (+)
Amostra 3 (praia não-contaminada) Gram
3A Cocos (+)
Amostra 4 (praia contaminada) Gram
4A Bastonetes (+)
4B Bastonetes (+)
4C Bastonetes (+)
4D Bastonetes (+)
4E Bastonetes (+)
4F Coco bacilos (-)
Amostra 5 (solo não-contaminado) Gram
5A Bastonetes (+)
5B Bastonetes (+)
5C Bastonetes (+)
5D Bastonetes (+)
5E Bastonetes (+)
5F Bastonetes (+)
Segundo Bicca; Fleck; Ayub (1999) e Lin (1996), bactérias possíveis
produtoras de biossurfactantes apresentam atividade hemolítica, sendo esta uma
determinação rápida para reduzir o número de bactérias selecionadas para os testes
de produção de biossurfactante.
Atividade hemolítica é um fator exibido por microrganismos capazes de se
desenvolver usando proteínas ligadas a ferro como fonte de ferro. A hemoglobina é
uma importante fonte de ferro para estes microrganismos que realizam a hemólise
por meio de proteínas extracelulares que destroem as membranas dos eritrócitos
humanos. Portanto, as vinte e oito colônias foram submetidas ao teste em placas de
Petri contendo ágar-sangue (Fotografia 1, Tabela 6).
Na Fotografia 1 pode ser observada a presença do halo de -hemólise
formado pelas bactérias produtoras e a Tabela 6 mostra os resultados do teste de
hemólise em placas de Petri para as 28 colônias. Na Tabela 6 pode-se observar que
43
das vinte e oito colônias bacterianas testadas apenas treze apresentaram hemólise em
placas de ágar-sangue sendo estas selecionadas para as etapas seguintes.
Fotografia 1. Placas de ágar-sangue com halo de -hemólise positiva.
Tabela 6. Teste de hemólise em placas de Petri contendo ágar-sangue para as
colônias isoladas de solo e areia de praia.
Amostra 1 (borracharia) hemólise
1A (+)
1B (+)
1C (+)
1D (+)
1E (-)
1F (+)
1G (+)
Amostra 2 (posto de gasolina) hemólise
2A (-)
2B (-)
2C (+)
2D (-)
2E (-)
2F (-)
44
2G (-)
2H (-)
Amostra 3 (praia não-contaminada) hemólise
3A (-)
Amostra 4 (praia contaminada) hemólise
4A (+)
4B (+)
4C (-)
4D (+)
4E (-)
4F (+)
Amostra 5 (solo não-contaminado) hemólise
5A (+)
5B (+)
5C (-)
5D (-)
5E (-)
5F (-)
Segundo vários pesquisadores (MESQUITA, 2004; BANAT; MAKKAR;
CAMEOTRA, 2000, NITSCHKE & PASTORE, 2002) as bactérias com atividade
biossurfactante reduzem a tensão superficial do caldo de fermentação e produzem
emulsões estáveis após 24 horas (E
24
), pelo fato de que produzem substâncias
anfifílicas. Em nosso experimento foram realizados testes de tensão superficial e
índice de emulsificação no caldo de fermentação sem a presença de células das treze
bactérias -hemolíticas, as quais foram previamente inoculadas em meio sintético
proposto por Bicca; Fleck; Ayub (1999) e incubadas por 72 horas a 30
o
C a 200 rpm,
posteriormente centrifugadas a 13608 g a 4
o
C para a separação das células. Os
resultados mostraram que o meio sem inóculo apresentou uma tensão superficial de
66,1 Din/cm. As bactérias que provocaram uma redução de no mínimo 20% da
tensão superficial do meio básico e apresentaram índice de emulsificação estável
após 24 horas, foram selecionadas para a etapa de identificação por testes
bioquímicos. As selecionadas foram : 1B, 1C, 1D, 1F, 1G, 2C, 4D e 5A.
5.2. Identificação das bactérias
45
As oito bactérias selecionadas (1B, 1C, 1D, 1F, 1G, 2C, 4D e 5A) foram
submetidas aos testes bioquímicos para identificação a nível de gênero utilizando o
manual Bergey’s (1984). Os resultados estão apresentados na Tabelas 7 e a
Fotografia 2 ilustra alguns destes testes.
Estes mesmos testes para a identificação do gênero foram utilizados por
Rahman et al. (2002b) e Rahman et al., (2003b) em seus trabalhos com amostras de
solo contaminado por gasolina e óleo diesel utilizando também como auxilio o
manual Bergey’s (1984) para a descoberta dos gêneros bacterianos.
Tabela 7. Características bioquímicas das bactérias selecionadas.
Amostras 1B 1C 1D 1F 1G 2C 4D 5A
Gram + + + + + + + +
Esporo + + + + + + + +
Indol - - - - - - - -
VM - + - - + + + +
VP - - - + + + + -
TSIA - B: am.
S: ver.
- - B: am.
S: ver.
B: am.
S: ver.
B: am.
S: ver.
B: am.
S: ver.
LIA + + + + + + + +
Citrato + + + + - + + +
Motilidade - + - - - - - -
Fenilalanina
- - - - - - - -
Nitrato - + - - + + + +
Atividade
Enzimática
Amostras 1B 1C 1D 1F 1G 2C 4D 5A
Urease - + - - - - - -
Gelatinase - + - - + - + +
Amilase - + - - + + - +
Lecitinase + - + + + + - -
Protease - - - - - - - -
Catalase + + + + + + + +
Oxidase + - - + - - - -
Fermentação de Açúcares
Amostras 1B 1C 1D 1F 1G 2C 4D 5A
Sacarose + + + + + + + +
46
Frutose + + + + + + + +
Maltose - + - - + + + +
Glicose + + + + + + + +
Manitol + - + + + + + +
B: am (base amarela); S: ver. (superfície vermelha)
- Não houve presença de gás em nenhum dos tubos dos testes de fermentação de açúcares
a b c
d
e f
47
Fotografia 2. Testes bioquímicos: a) nitrato, b) motilidade, c) fermentação de
açúcares, d) amilase, e) urease e f) citrato.
Figura 6. Representação das principais etapas utilizadas durante a identificação do
gênero das bactérias selecionadas.
A análise dos resultados dos testes bioquímicos da Tabela 7 e Figura 6
demonstraram a presença dos gêneros Bacillus sp Este mesmo gênero foi
identificado por Rahman et al. (2002b e 2003b) em solos contaminados por
hidrocarbonetos, além de também observarem a presença de Pseudomonas sp,
Flavobacterium sp, Micrococcus sp, Acinetobacter sp e Corynebacterium sp.
GRAM
+
BASTONETES
ESPORULADOS
1B, 1C, 1D, 1F,
1G, 2C, 4D, 5A
TESTES
BIOQUÍMICOS
TAB. 7, 8 e 9
Bacillus sp
48
O gênero Bacillus é caracterizado por células em forma de bastonetes retos,
Gram positivos, a maior parte é móvel e forma endosporos. São quimiorganotróficos,
aeróbios ou anaeróbios facultativos, Voges-Proskauer (VP), reações de nitrato,
oxidase, urease, citrato e gelatinase positiva ou negativa, indol negativo e catalase
positiva. Fermentam vários carboidratos como a glicose e a sacarose sem produção
de gás e são comumente encontrados no solo, água e ar (BERGEY’S, 1984).
Das oito bactérias selecionadas, quatro foram escolhidas para a determinação
dos parâmetros de produção do biossurfactante e suas características morfológicas e
tintoriais à coloração de Gram podem ser observadas na Fotografia 3 assim como
suas fontes de coleta estão descritas na Tabela 8.
a b
c d
49
Fotografia 3. Representação microscópica das bactérias Gram +: a) 4D; b)
1G; c) 2C e d) 5A.
Tabela 8. Fontes de coleta das quatro bactérias selecionadas relacionadas aos
respectivos gêneros.
Amostras Designação Gênero
solo de borracharia 1G Bacillus sp
solo de posto de gasolina 2C Bacillus sp
areia da praia contaminada 4D Bacillus sp
solo fértil 5A Bacillus sp
5.3. Determinação dos parâmetros de produção
Para a produção de biossurfactante foi utilizado o meio M2 proposto por
Bicca; Fleck; Ayub (1999), pois testes preliminares realizados por estes autores
utilizando três meios de composição diferentes (M1, M2 e M3) mostraram que as
células bacterianas apresentaram um ótimo crescimento com alta produtividade de
biossurfactante, o qual está relacionado a redução da tensão superficial e altos E
24
,
utilizando o meio que possuía como um dos seus componentes principais o extrato de
levedura (M2).
O meio de produção composto de minerais, nitrogênio e óleo diesel foi
acrescido de uma fonte de carbono, inoculado com os Bacillus sp (1G, 2C, 4D e 5A)
e incubado a 30
o
C e 200 rpm em “shaker” rotativo (Fotografia 4), com posterior
centrifugação a 13608 g a 4
o
C por 20 minutos para a separação da célula. Todas as
análises foram realizadas em triplicata.
50
Fotografia 4. Caldo de fermentação durante incubação a 30
o
C e 200 rpm em
“shaker” rotativo.
Foram testados diferentes pH (5, 6, 7 e 8 ) e diferentes tempos de fermentação
(48, 72 e 96 horas) para escolha do melhor parâmetro de produção, para em seguida
serem testadas diferentes fontes de carbono (glicose, sacarose, manitol, caldo de
cana, frutose e glicose + frutose (p/p) em diferentes concentrações (1, 2, 3, 4 e 5%).
Como controle da produção de biossurfactante foi utilizada a bactéria Bacillus
subtilis que segundo Barros et al. (2007) é uma clássica produtora de biossurfactante.
Os testes realizados para determinar o melhor pH e tempo de fermentação
foram a determinação da tensão superficial, índice de emulsificação, além da
determinação do peso celular seco.
Para a determinação da tensão superficial foi utilizado o caldo de fermentação
sem a presença das células e as leituras foram realizadas em um tensiômetro de
Leconde Du Nouy (Fotografia 5). Os resultados estão apresentados na Tabela 9.
51
a b
Fotografia 5. Tensiômetro de Leconde Du Nouy.
Para a determinação do índice de emulsificação foi utilizado tolueno e o caldo
de fermentação pré-centrifugado (para a separação das células) na proporção 2:3,5
mL, a altura total da coluna foi de 4,5 cm. As leituras foram realizadas após 24 horas
e estas permaneceram constantes por 30 dias sem que ocorresse alteração na
porcentagem do índice como mostrado na Fotografia 6. Os resultados encontram-se
na Tabela 9.
52
Fotografia 6. Determinação do índice de emulsificação por meio da formação de uma
coluna de tolueno.
O peso celular seco dos Bacillus sp 1G, 2C, 4D e 5A a diferentes pH e tempo
de fermentação está apresentado na Tabela 9.
Tabela 9: Leituras de tensão superficial (Din/cm), índice de emulsificação (%) e peso
celular seco (g) dos Bacillus sp em diferentes pH e tempo de fermentação.
Tensão superficial
Amostras pH = 5,0 pH = 6,0 pH = 7,0 pH = 8,0
48 h. 72h. 96h.
48h. 72h. 96h. 48h. 72h. 96h.
48h. 72h. 96h.
1G 59,9 58,5 59,0 61,7 50,8 51,2 56,5 55,8 56,2
59,5 58,0 58,5
2C 57,8 56,0 56,0 60,5 57,8 58,0 57,0 54,0 55,0
60,0 57,5 58,4
4D 58,8 57,0 57,3 61,0 60,0 60,2 56,5 53,5 54,5 60,5 58,0
59,0
5A 57,2 55,8 56,0 62,0 59,8 60,0 56,1 54,0 55,3
59,0 56,4 58,0
B. subtilis 56,1 53,7 53,8 59,5 55,7 56,3 55,2 54,0 56,0
60,0 58,0 58, 5
Índice de emulsificação
Amostras pH = 5,0 pH = 6,0 pH = 7,0 pH = 8,0
48 h. 72h. 96h.
48h. 72h. 96h. 48h. 72h. 96h.
48h. 72h. 96h.
1G 28,8 44,4 33,3 0,0 0,0 0,0 11,1 33,3 22,2
4.4 15,5 4,4
2C 37,7 48,8 40,0 33,3 37,7 33,3 35,5 44,4 40,0
35,5 37,7 35,5
4D 22,2 44,4 33,3 0,0 17,7 0,0 33,3 28,8 33,3
3,3 17,7 4,4
5A 22,2 40,0 30,0 0,0 0,0 0,0 33,3 35,5 33,3
28,8 33,3 30,0
B. subtilis 11,1 15,5 12,2 0,0 8,8 0,0 11,1 11,1 11,1
11,1 11,1 11,1
Peso celular seco
Amostras pH = 5,0 pH = 6,0 pH = 7,0 pH = 8,0
48 h. 72h. 96
h.
48h. 72h. 96h. 48h. 72h. 96h.
48h. 72h. 96h.
1G 0,119 0,153 0,150
0,029 0,087 0,088 0,140 0,147 0,144
0,023 0,072 0,071
2C 0,106 0,177 0,176 0,068 0,120 0,121 0,161 0,170 0,169
0,030 0,070 0,071
53
4D 0,044 0,142 0,140 0,038 0,065 0,065 0,073 0,130 0,131
0,070 0,090 0,091
5A 0,070 0,148 0,145 0,065 0,120 0,121 0,110 0,127 0,127
0,035 0,037 0
B. subtilis 0,114 0,116 0,116 0,086 0,113 0,112 0,120 0,137 0,136
0,070 0,072 0,071
- Tensão superficial do meio base: 66,1 Din/cm, Din/cm=mN/m,
- Leituras do índice de emulsificação realizadas após 24 horas, 96 horas, 7 dias, 15 dias e 30 dias
De acordo com a Tabela 9 podemos observar que os melhores pH foram 5,0
e 7,0 e o tempo de fermentação de 72 horas (fase estacionária) onde ocorreram as
maiores porcentagens do índice de emulsificação e também a melhor redução da
tensão superficial. Com relação ao crescimento celular podemos observar que este é
diretamente proporcional a produção de biossurfactante que, por sua vez, está
relacionada a diminuição da tensão superficial e índice de emulsificação.
Rajeshware; Prakash; Ghosh (1995) identificou que a produção de biopolímeros
ocorre na fase estacionária e Bueno (2001) observou que a curva de crescimento de
bactérias do gênero Bacillus mostrou que o desenvolvimento máximo ocorre em 12
horas e permanece constante até 72 horas (fase estacionária) com posterior declínio.
Segundo Fleurackers (2006), a produção do biossurfactante soforolipídeo
produzido pelo gênero Candida ocorre na fase estacionária após a redução do
nitrogênio disponível e quando as fontes apropriadas de carbono e de energia
estiverem presentes e quando possível, estas fontes são incorporadas diretamente no
soforolipídeo.
Estas mesmas observações dos autores citados foram comprovadas em
relação aos Bacillus sp testadas (1G, 2C, 4D e 5A) onde a melhor produção do
biopolímero ocorreu após 72 horas de fermentação.
Para o estudo das diferentes fontes de carbono em diferentes concentrações
escolheu-se o pH = 7,0 devido a este ser neutro e tempo de fermentação de 72 horas.
A glicose foi usada como fonte de carbono por vários pesquisadores (HUA et
al., 2004; VANCE-HARROP; GUSMÃO; CAMPOS-TAKAKI, 2003; BICCA;
FLECK; AYUB, 1999; SARUBBO; LUNA; CAMPOS-TAKAKI, 2006;
FLEURACKERS, 2006, RAHMAN et al. 2003a). Neste trabalho foram estudadas
outras fontes de carbono inclusive a sacarose e o caldo de cana, por serem matérias-
primas abundantes e de baixo custo no mercado nacional.
As fontes de carbono testadas foram glicose, sacarose, manitol, frutose, caldo
de cana e glicose + frutose (p/p) nas concentrações de 1,0; 2,0; 3,0; 4,0 e 5,0%. As
análises realizadas para determinação da melhor fonte de carbono e concentração
54
consistiram de determinação da tensão superficial, índice de emulsificação, atividade
emulsificante (para estas análises foi utilizado o caldo de fermentação sem a
presença de células) e peso celular seco. O caldo de cana foi clarificado e
esterilizado em vapor fluente antes de seu uso.
Foram utilizadas estas análises, pois a melhor concentração e fonte de
carbono proporciona a melhor produção de biossurfactante e por sua vez, sua
presença e quantificação está relacionada a baixas leituras de tensão superficial,
índices de emulsificação altos e estáveis e alta atividade emulsificante.
A Figura 7 apresenta os resultados das medidas de tensão superficial em
relação às das fontes de carbono em diferentes concentrações. O meio base
apresentou uma tensão superficial de 66,1 Din/cm (Din/cm=mN/m).
Na Figura 8 está apresentada a variação do índice de emulsificação em coluna
de tolueno, em relação às fontes de carbono em diferentes concentrações. As leituras
foram realizadas após 24 horas e estas permaneceram constantes por 30 dias sem que
ocorresse alterações.
O peso celular seco dos Bacillus sp 1G, 2C, 4D e 5A nas fontes de carbono
em diferentes concentrações (1,0; 2,0; 3,0; 4,0 e 5,0%) estão apresentados na Tabela
10. Nesta pode-se observar novamente que o crescimento é diretamente proporcional
a produção de biossurfactante que está diretamente relacionado com a diminuição da
tensão superficial e o aumento do índice de emulsificação.
55
56
57
Figura 7. Determinação da tensão superficial no sobrenadante livre de células em
diferentes fontes de carbono e concentrações a 30
0
C e 72 horas
de
incubação dos Bacillus sp selecionados.
58
59
60
Figura 8. Porcentagem do índice de emulsificação dos Bacillus sp selecionados em
relação às diferentes fontes de carbono e concentrações a 30
0
C e 72 horas
de incubação.
Tabela 10. Determinação do peso celular seco (g) dos Bacillus sp em 50 mL do caldo
de fermentação selecionadas em diferentes fontes de carbono e
concentrações.
Glicose
Concentração (%) 1G 2C 4D 5A
1 0,0402 0,0522 0,0473 0,0426
2 0,0426 0,0572 0,0514 0,0590
3 0,0590 0,0672 0,0400 0,0405
4 0,0393 0,0789 0,0221 0,0393
5 0,0460 0,0352 0,0480 0,0357
Sacarose
Concentração (%) 1G 2C 4D 5A
1 0,0435 0,1250 0,0256 0,0240
2 0,0498 0,1508 0,0492 0,0626
3 0,0310 0,1057 0,0291 0,0608
4 0,0360 0,1203 0,0300 0,0480
61
5 0,0300 0,1699 0,0312 0,0504
Manitol
Concentração (%) 1G 2C 4D 5A
1 0,0452 0,0811 0,0275 0,0327
2 0,0598 0,0874 0,0437 0,0398
3 0,0540 0,0636 0,0356 0,0346
4 0,0430 0,0800 0,0350 0,0330
5 0,0450 0,0820 0,0432 0,0271
Caldo de cana
Concentração (%) 1G 2C 4D 5A
1 0,0852 0,1203 0,0360 0,0358
2 0,0939 0,1503 0,1560 0,0506
3 0,0845 0,8990 0,0425 0,0352
4 0,0662 0,1079 0,0507 0,0400
5 0,0630 0,1499 0,0499 0,0507
Frutose
Concentração (%) 1G 2C 4D 5A
1 0,0423 0,0876 0,0234 0,0324
2 0,0521 0,0920 0,0435 0,0435
3 0,0490 0,0891 0,0324 0,0324
4 0,0400 0,0903 0,0333 0,0400
5 0,0450 0,0945 0,0323 0,0398
Frutose + Glicose
Concentração (%) 1G 2C 4D 5A
1 0,0242 0,1123 0,0345 0,0432
2 0,0324 0,1203 0,0432 0,0546
3 0,0321 0,1201 0,0325 0,0436
4 0,0402 0,1190 0,0456 0,0567
5 0,0440 0,1123 0,0563 0,0546
Tabela 11. Determinação da atividade emulsificante no sobrenadante livre de células
a 610 nm dos Bacillus sp selecionados.
Glicose
Concentração (%) 1G 2C 4D 5A
1 0,024 0,370 0,200 0,150
2 0,520 0,404 0,430 0,300
3 0,100 0,430 0,100 0,160
4 0,200 0,630 0,200 0,300
5 0,030 0,555 0,150 0,050
Sacarose
Concentração (%) 1G 2C 4D 5A
1 0,435 0,490
*
0,280 0,256
2 0,540 0,630
*
0,420 0,430
3 0,450 0,600
*
0,253 0,350
4 0,430 0,700
*
0,340 0,300
5 0,430 0,720
*
0,298 0,312
Manitol
Concentração (%) 1G 2C 4D 5A
1 0,290 0,280
**
0,210 0,080
2 0,440 0,655
**
0,330 0,120
62
3 0,330 0,489
**
0,100 0,030
4 0,340 0,700
**
0,080 0,033
5 0,125 0,720
**
0,090 0,027
Caldo de cana
Concentração (%) 1G 2C 4D 5A
1 0,300
**
0,210
*
0,620 0,550
***
2 0,420
**
0,428
*
0,580
***
0,824
***
3 0,380
**
0,409
*
0,200 0,580
***
4 0,500
**
0,500
*
0,550 0,489
***
5 0,630
**
0,540
*
0,650 0,520
***
Frutose
Concentração (%) 1G 2C 4D 5A
1 0,320 0,290 0,650 0,450
2 0,450 0,498 0,570 0,724
3 0,388 0,489 0,280 0,480
4 0,560 0,550 0,520 0,489
5 0,670 0,590 0,658 0,620
Frutose +
Glicose
Concentração (%) 1G 2C 4D 5A
1 0,200
***
0,310
**
0,520 0,450
***
2 0,440
***
0,488
**
0,380
**
0,802
***
3 0,240
***
0,400
**
0,280 0,680
***
4 0,580
***
0,560
**
0,500 0,589
***
5 0,600
***
0,540
**
0,750 0,570
***
* diluição 1:10, ** diluição 1:7, *** diluição 1:1
Para a determinação da atividade emulsificante foi utilizado o caldo de
fermentação sem a presença de células (sobrenadante), onde foi adicionado tolueno
na proporção 2:3,5, esta mistura foi agitada para a formação da emulsão e as leituras
das densidades ópticas foram feitas em espectrofotômetro a 610 nm (o branco foi
preparado da mesma maneira com substituição do sobrenadante por água). Na Tabela
11 estão apresentadas as leituras da atividade emulsificante no sobrenadante obtido
das bactérias selecionadas. Nesta, pode ser observado que quanto maior a densidade
óptica maior é a atividade emulsificante. Segundo Lang (2002) o emulsan atinge uma
densidade óptica de 2,44 a 600 nm. Em nossos experimentos, resultados superiores
foram obtidos utilizando as fontes de carbono sacarose e caldo de cana e
principalmente a bactéria 2C (Bacillus sp) foi a melhor produtora do biossurfactante
(Tabela 11).
Dos resultados mostrados nas Figuras 8 e 9 e Tabelas 10 e 11 podemos
observar que a melhor fonte de carbono foi a sacarose. Concentrações baixas desta
fonte de carbono são suficientes para estimular alta produtividade de biossurfactante
63
e esta alta produtividade pode ser alcançada utilizando matérias-primas baratas e
regionais. Pode também ser observado que apesar do caldo de cana ter altos teores de
sacarose, a presença de outros componentes no caldo interferiu e não estimulou uma
produtividade tão alta quanto a sacarose pura. A mistura de frutose + glicose não
estimulou também uma boa produtividade, talvez pelo fato da presença de frutose
inibir a produção, pois quando esta foi utilizada sozinha houve baixa produtividade
do biossurfactante.
A melhor produtividade foi alcançada utilizando a bactéria 2C (Bacillus sp) e
esta foi selecionada para a determinação da concentração micelar crítica (CMC) em
meio contendo sacarose e caldo de cana nas concentrações de 2%, pH=7,0 e 72 horas
de fermentação, foram utilizados estes sobrenadantes pois apresentaram os melhores
parâmetros de produção de biossurfactante. Na Figura 9 estão apresentadas as curvas
de tensão superficial versus concentração de sobrenadante para o cálculo do CMC.
0 2 4 6 8 10 12
30
40
50
60
70
80
Tensão superficial (Din/cm)
C o ncentra çã o de biossurfactante (m g/100 m L )
Sacaro se
2 C
0 2 4 6 8 10 12
64
66
68
70
72
74
76
Tensão superficial (Din/cm)
Concentração de biossurfactante (mg/100mL)
Caldo de cana
2C
Figura 9. Determinação da concentração micelar crítica (CMC) no sobrenadante livre
de células do Bacillus sp (2C) em sacarose e caldo de cana.
CMC
CMC
C
64
A concentração micelar crítica (CMC) é a concentração do surfactante que
favorece a formação de micelas, uma agregação entre 50 e 100 moléculas de
surfactante formam micelas (CHRISTOFI & IVSHINA, 2002).
A Figura 9 mostra a determinação da CMC para o Bacillus sp 2C em sacarose
e caldo de cana, por meio desta é possível observar que a CMC é de 27-37 mg/L.
Segundo Mesquita (2004) quanto mais baixa a CMC melhor é o surfactante, a
surfactina produzida por Bacillus subtilis apresenta um CMC de 23 mg/L sendo
considerado um ótimo biossurfactante (CHRISTOFI & IVSHINA, 2002). Por este
motivo foi realizada a produção em maior escala utilizando o Bacillus sp 2C em
sacarose a 2% em pH = 7,0, 72 horas de incubação a 30
o
C e 200 rpm, pois estas
foram as melhores condições de produção de biossurfactante e a melhor bactéria
produtora. Após a retirada das células por centrifugação, o sobrenadante foi
submetido a precipitação com etanol na concentração 1:2 a 4
o
C (Fotografia 7) e foi
realizado o calculo do rendimento em relação a fonte de carbono. Para isto, o
biossurfactante foi seco em estufa a vácuo a 45
o
C e o rendimento foi calculado com
relação a 1 L de caldo de fermentação. O resultado mostrou que a produtividade foi
de 6,05 g/L correspondendo um rendimento de 30,25 %.
Fotografia 7. Biossurfactante obtido por precipitação com etanol a 4
o
C.
O biossurfactante foi purificado por meio de diálise (membrana de diâmetro
2,5 cm e poro de 10 kDA) por 72 horas na qual foi trocada a água três vezes ao dia
(Fotografia 8). O biossurfactante foi submetido a determinação de proteína, gordura e
carboidratos e enviado para análise de ressonância nuclear magnética (RMN).
65
A presença de proteína foi determinada pelo método de Kjeldahl, segundo
Joslyn (1970), a análise da presença de gordura por Bligh-Dyer (1959) e açúcares
redutores e açúcares redutores totais por Somogy-Nelson (1952; 1944) e Dubois;
Gilles; Hamilton (1956).
Fotografia 8. Diálise para a purificação do biossurfactante.
A RMN é uma técnica espectroscópica que usa radiação na região de
freqüência do rádio para a produção do espectro eletromagnético, que pode ser usado
na análise do surfactante para a determinação de seus componentes. O isótopo
dominante de hidrogênio,
1
H, é o mais ativo para a determinação e a análise se
denomina
1
H-NMR em 270 MHz. O TSP-d
4
(trimetilsililtetradeuteropropionato de
sódio) é utilizado como padrão interno para análise (CULLUM, 1994).
66
Figura 10. Espectro de ressonância magnética nuclear (RMN) do biossurfactante.
Da Figura 10 podem-se observar picos na região de 3,2-3,8 ppm indicando a
presença de (CH
2
-CH
2
-O)
n
e (CH
2
-CHO-CH
3
)
n
picos na região de 1,2 ppm indica a
presença de (CH
2
)
n
na estrutura do biossurfactante. O pico localizado na região de 2
ppm está correlacionado com o solvente. Entre os compostos presentes estão
carboidratos, lipídeos e proteínas.
Nas análises individuais de proteínas, lipídeos e carboidratos foram
constatadas as presenças de 5% de proteínas, 8% de lipídeos e 80,4% de açúcares
redutores totais indicando que a molécula de biopolímero tem alto peso molecular e
está formada por um complexo lipopolissacarídeo-proteína. Em geral, estes
tensoativos de alto peso molecular estão associados a produção de emulsão.
Camargo-de-Morais et al. (2003) utilizou estas mesmas análises de identificação em
seu trabalho para determinar a composição de um biossurfactante produzido por
Penicillium citronum.
Para a determinação da espécie do Bacillus sp identificado como 2C, o
mesmo foi encaminhado a um centro especializado onde foi identificado pela reação
em cadeia da polimerase (PCR) através do gene RNA ribossomal 16S e confirmou-se
a presença da espécie Bacillus pumilus.
67
A identificação do Bacillus pumilus como produtor de um biossurfactante
composto de carboidrato-lipídeo-proteína de alto peso molecular é extremamente
importante pois dados literários não indicam este tipo de composto produzido por
Bacillus sp e sim biossurfactantes lipoprotéicos como a surfactina, iturina e
bacilomicina e glicolipídeos como ramnolipídeos (NITSCHKE & PASTORE, 2002).
Além disso não foram encontrados dados literários sobre a produção de tensoativos
por Bacillus pumilus.
5.4. Estudo da fluidez do petróleo
Para o estudo da fluidez do petróleo, os quatro Bacillus sp selecionados (1G,
2C, 4D e 5A) foram incubados a 30
o
C por 20 dias em placas de Petri contendo 10 g
de areia, 2% de inóculo bacteriano e 1% de petróleo sendo o controle negativo
realizado sem inóculo. Após este período as placas foram analisadas
macroscopicamente para observação da degradação do petróleo e os resultados estão
mostrados nas Fotografias 9 e 10. Nestas pode-se observar que os Bacillus sp
testados (1G, 2C, 4D e 5A) atuam sobre o petróleo bruto deixando-o mais fluído,
sugerindo que os biossurfactantes produzidos poderiam ser utilizados na limpeza das
incrustações nos tanques de armazenamento e oleodutos nas empresas de petróleo e
nos derramamentos no meio ambiente. Este teste de degradação do petróleo também
foi realizado por Gouveia et al. (2003) que também obteve resultado semelhante com
inóculo bacteriano.
68
Fotografia 9. Análise macroscópica da fluidez do petróleo.
69
CONTROLE
2C
70
5A
1G
4D
Fotografia 10. Análise macroscópica da fluidez do petróleo na presença dos inóculos
bacterianos.
5.5. Determinação da atividade antimicrobiana
Vários biossurfactantes apresentam atividade antimicrobiana como os
ramnolipídeos produzidos por Pseudomonas aeruginosa, lipopeptídeos produzidos
71
por Bacillus subtilis e glicolipídeos produzidos por Rhodococcus erythropolis
(LANG & PHILP, 1998; BANAT; MAKKAR; CAMEOTRA, 2000). Neste trabalho
foi realizada a determinação da atividade antimicrobiana dos Bacillus sp.
Para a determinação desta atividade foram testados os Bacillus sp
selecionados e seus respectivos sobrenadantes (após fermentação por 72 horas, fonte
de carbono sacarose a 2% e separação das células) contendo o biossurfactante. Foram
utilizados os sobrenadantes produzidos nos caldos de fermentação com pH = 5 e 7,
pois estes dois pH foram os melhores para a produção de biossurfactantes.
Nenhuma dos quatro Bacillus sp e seus sobrenadantes, produzidos nos caldos
de fermentação com pH=5,0 e 7,0, inoculados nas placas de Petri, apresentaram
halos de inibição, indicando que não possuem atividade antibacteriana e antifúngica
sobre os microrganismos testados.
Com relação aos testes em tubos de ensaio, que é mais sensível, foi observada
atividade bacteriostática e fungistática dos sobrenadantes produzidos nos caldos de
fermentação a pH = 7,0 dos Bacillus sp 2C, 4D, 5A para todas as bactérias e o fungo
testados. Esta atividade foi observada pela diminuição da leitura de densidade óptica
quando esta foi comparada a leitura realizada nas soluções destes microrganismos
sem a presença de biossurfactante.
5.6. Determinação do efeito do biossurfactante num sistema modelo sal-vinagre-
azeite
Foram realizados ensaios práticos utilizando o biossurfactante purificado num
sistema modelo formado por sal, vinagre e azeite com intuito de imitar um molho
para salada. As proporções foram determinadas com base no planejamento fatorial
completo 3**(3-0), com auxílio do programa Statistica 7 mostrado na Tabela 12,
onde manteve-se constante o volume de 3,5 mL de biossurfactante.
Tabela 12. Delineamento experimental dos ensaios para um sistema modelo sal-
vinagre-azeite.
Ensaio
Sal (g)
Azeite (mL)
Vinagre (mL)
1
0,01
2
2
72
2
0,01
2
5
3
0,01
2
8
4
0,01
5
2
5
0,01
5
5
6
0,01
5
8
7
0,01
8
2
8
0,01
8
5
9
0,01
8
8
10
0,055
2
2
11
0,055
2
5
12
0,055
2
8
13
0,055
5
2
14
0,055
5
5
15
0,055
5
8
16
0,055
8
2
17
0,055
8
5
18
0,055
8
8
19
0,1
2
2
20
0,1
2
5
21
0,1
2
8
22
0,1
5
2
23
0,1
5
5
24
0,1
5
8
25
0,1
8
2
26
0,1
8
5
27
0,1
8
8
Os resultados estatísticos dos testes realizados estão apresentados na Figuras
11, 12, 13 e 14.
Regressão linear = 0,8368
73
Sal(g)
-20,00
18,022
60,000
Azeite (mL) Vinagre (mL) variação
0,
,5
1,
,30000
20,150
40,000
Índice de emulsificação (%)
,01 ,055 ,1
,44640
2, 5, 8, 2, 5, 8,
Figura
11. Dados estatísticos do delineamento experimental num sistema modelo sal-
vinagre-azeite.
De acordo com a Figura 11 pode-se observar que apenas o volume de vinagre
afeta o índice de emulsificação onde se encontrou um de 0,002058 indicando
elevada significância estatística. Assim observa-se que o índice de emulsificação
diminui significativamente com o aumento da concentração do vinagre e com relação
a variação da concentração de sal e de azeite, este permanece dentro da faixa, sendo
suas variações de volume estatisticamente não significativas.
74
Figura 12. Superfície de resposta para a região ao redor dos valores ótimos de azeite
e vinagre para o índice de emulsificação (índice de emulsificação (%) =
36,7436 + 2,6596*x – 7,6484*y – 0,2531*x*x – 0,1417*x*y +
0,5819*y*y).
75
Figura 13. Superfície de resposta para a região ao redor dos valores ótimos de
vinagre e sal para o índice de emulsificação (índice de emulsificação (%) =
34,8059 + 273,5274*x – 7,6733*y – 1749,5199*x*x – 12,4259*x*y +
0,5819*y*y).
Figura 14. Superfície de resposta para a região ao redor dos valores ótimos de azeite
e sal para o índice de emulsificação (índice de emulsificação (%) = 4,3607
+ 360,6262*x – 3,5927*y – 1749,5199*x*x – 29,8457*x*y +
0,2531*y*y).
As Figuras 12, 13 e 14 mostram os gráficos de superfícies de resposta. Nestes
observa-se que a variação de azeite e sal não interferiu significamente no índice de
emulsificação. Nestas Figuras pode-se também observar que o índice de
emulsificação é melhor em baixas concentrações de vinagre, na qual este interfere na
capacidade emulsificante do biossurfactante. Estes dados confirmam as observações
realizadas na Figura 11 com relação ao estudo de significância estatística do sistema
modelo.
76
Por meio dos dados experimentais foi possível mostrar que o biossurfactante
produzido pela bactéria 2C pertencente a espécie Bacillus pumilus apresenta índices
de emulsificações estáveis, sendo um ótimo emulsificante em molhos para salada,
ficando seu uso restrito apenas em temperos com altos índices de vinagre.
6. CONCLUSÕES
Foram isoladas quatro bactérias produtoras de biossurfactantes de solos
contaminados e não-contaminados com hidrocarbonetos os quais foram identificado
o gênero Bacillus sp.
A melhor produção de biossurfactantes foi obtida nos pH 5,0 e 7,0 após 72
horas de fermentação utilizando como fontes de carbono sacarose em baixas
concentrações. A melhor produtora foi a bactéria identificada como Bacillus
pumilus.
Na análise da composição centesimal do biossurfactante constatou a presença
de uma molécula de biopolímero de alto peso molecular formada por um complexo
lipopolissacarídeo-proteína.
Os quatro Bacillus sp testados foram capazes de atuarem sobre o petróleo
bruto fazendo com que este ficasse mais fluído, podendo ser utilizadas nas empresas
de petróleo e na biorremediação do meio ambiente.
Os quatro Bacillus sp estudados não apresentaram atividade antimicrobiana
ou antifúngica. Os Bacillus sp 2C, 4D e 5A apresentaram atividade bacteriostática e
fungistática sobre todas as bactérias e o fungo testados utilizando seus sobrenadantes
a pH = 7,0.
Os ensaios realizados num sistema modelo sal-vinagre-azeite, mostraram que
o biossurfactante obtido pode ser usado como emulsificante em molhos de salada
levando em consideração a concentração de vinagre.
77
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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